CN104017064B - 一种制备特立帕肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种制备特立帕肽的方法，本发明具体步骤为：A）在活化剂***的存在下，由树脂固相载体和Fmoc‑Phe‑OH偶联得到Fmoc‑Phe‑树脂；B）通过固相合成法，按特立帕肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中肽序16‑17位氨基酸采用假脯氨酸二肽Fmoc‑Asn(Trt)‑Ser(ψMe,Me Pro)‑OH代替原16‑17位置两个氨基酸进行偶联；C）肽树脂裂解采用含NH4I/Me2S的TFA体系的裂解液，粗品经HPLC纯化、冻干得到特立帕肽，其工艺杂质Met8(O)‑特立帕肽含量小于0.1%。本发明提供了一种纯度高、成本低，适合规模化生产的特立帕肽制备工艺，此工艺既有效控制Met8(O)‑特立帕肽含量又不影响特立帕肽的总收率。

Description

一种制备特立帕肽的方法
技术领域
本发明涉及一种多肽类药物的制备方法，是一种具有可调节钙、磷代谢，促进骨形成而用于骨质疏松治疗的药物-特立帕肽的制备方法。
背景技术
特立帕肽，英名为：Teriparatide，为一直链34肽，结构式如下：
肽序列为：
H-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-OH
特立帕肽Forteo (Teriparatide)是第一种获得美国食品及药物管理局FDA批准的骨形成剂类新药，用于原发性骨质疏松及性腺功能减退性骨质疏松、绝经后骨质疏松。特立帕肽[hPTH(1-34)]是一种合成的多肽激素，为人甲状旁腺素PTH的1-34氨基酸片段，该片段是含有84个氨基酸的内源性甲状旁腺素PTH具有生物活性的N-末端区域。本药的免疫学和生物学特性与内源性甲状旁腺素PTH以及牛甲状旁腺素PTH(bPTH)完全相同。本药刺激骨形成和骨吸收，可减少绝经后妇女骨折的发生率，根据给药方式的不同，还能提高或降低骨密度。连续输注可导致甲状旁腺素PTH浓度持续增高，因此比仅引起血清甲状旁腺素PTH浓度短暂增高的每日注射法产生的骨吸收作用更强。
关于特立帕肽制备方法，国内外已经有所报道。专利CN1198644涉及特立帕肽组合物，专利CN1281467涉及其结晶专利。 CN101134963、CN1706947、CN102304518等专利涉及特立帕肽的基因工程方法制备。中国专利CN102731643涉及特立帕肽的合成方法，其采用2-CTC树脂，通过片段法合成。CN103467595固相法合成特立帕肽，其应用了Ser的O-N酰基迁移反应。
通过基因工程法合成特立帕肽工作量大，三废严重。而纯粹的液相化学合成特立帕肽由于操作繁杂、合成周期长而暂时未见报道。固相合成特立帕肽具有其优势，操作简单、生产周期短。CN102731643通过片段法合成特立帕肽，总收率32%。
特立帕肽序列中存在Asn-Ser结构，因此合成过程可以采用假脯氨酸二肽结构片段进行。由于假脯氨酸二肽结构的存在，可以破坏β结构稳定性，减轻肽链间聚集的倾向，从而提高肽链的溶剂化程度，最终提高后续氨基酸的偶联效率。通过引入假脯氨酸二肽结构，使得本工艺合成特立帕肽总收率达到35%。
Met易被氧化成Met(O)，因此，导致氧化杂质的生成，即：Met8(O)-特立帕肽。
Met8(O)-特立帕肽的结构如下：
H-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met(O)-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-OH
该杂质的存在严重影响特立帕肽含量以及使用安全。因此需要找到有效的方法将其去除并使其达到优质标准级别0.1 %以下。本发明人研究发现，裂解试剂采用含NH4I/Me2S体系，可将合成过程中残基Met氧化副产物Met(O)还原为Met，提高了粗肽纯度，降低了HPLC纯化难度。经HPLC纯化后，杂质Met8(O)-特立帕肽含量降低到0.1 %以下。
本发明人对特立帕肽的制备方法进行了研究，提供了一种纯度高、成本低，适合规模化生产的特立帕肽制备工艺，此工艺既有效控制Met8(O)-特立帕肽含量又不影响特立帕肽的总收率。
发明内容
本发明人用现有的合成方法，制备特立帕肽，发现现有技术存在的技术问题是：合成纯度偏低、成本高，特别是杂质Met8(O)-特立帕肽含量较大，不适合规模化生产的问题。为此，本发明人对特立帕肽的合成方法进行了研究，从而得到了本发明的技术方案。
本发明的合成路线如图1所示：A）在活化剂***的存在下，由树脂固相载体和Fmoc-Phe-OH偶联得到Fmoc- Phe-树脂；B）通过固相合成法，按特立帕肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中肽序16-17位氨基酸采用假脯氨酸二肽Fmoc-Asn(Trt)-Ser(ψ Me, Me Pro)-OH代替原16-17位置两个氨基酸进行偶联；C）肽树脂裂解采用含NH4I/Me2S的TFA体系的脂裂解，粗品经HPLC纯化、冻干得到特立帕肽，其工艺杂质Met8(O)-特立帕肽含量小于0.1 %。
本发明中一些常用的缩写具有以下含义：
Fmoc ：芴甲氧羰基
Fmoc-AA ：芴甲氧羰基保护的氨基酸
DIC ：N，N′-二异丙基碳化二亚胺
DCC ：N，N′-二环己基碳二亚胺
PyBOP : 六氟磷酸苯并***-1-基-氧基三吡咯烷基磷
HATU : 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
HOBt ：1- 羟基苯骈***
DIEA : N，N′-二异丙基乙胺
Ac2O：乙酸酐
tBu ：叔丁基
Trt ：三苯甲基
Boc : 叔丁氧羰基
Pbf ： 2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基
Phe：苯丙氨酸
Asn ：天冬酰胺
His ：组氨酸
Val ：缬氨酸
Asp ：天冬氨酸
Gln ：谷氨酰胺
Leu ：亮氨酸
Lys ： 赖氨酸
Arg ：精氨酸
Trp ：色氨酸
Glu ：谷氨酸
Met : 甲硫氨酸
Ser ：丝氨酸
Gly ：甘氨酸
Ile ：异亮氨酸
DMF ：N，N′-二甲基甲酰胺
MeOH ：甲醇
DCM ：二氯甲烷
NMP ：N-甲基吡咯烷酮
DMSO ：二甲基亚砜
TFA ：三氟醋酸
EDT ：乙二硫醇
PhSMe ：苯甲硫醚
PhOMe ：苯甲醚
TIS ：三异丙基硅烷
NH4 I ：碘化铵
Me2S ：二甲硫醚
Piperidine ：六氢吡啶
Et2O ：***
MTBE ：甲基叔丁基醚
EA ：乙酸乙酯
DCM ：二氯甲烷 ACN ：乙腈
MeOH ：甲醇
为此本发明提供一种制备特立帕肽的方法，其步骤如下：
步骤1，在活化剂***的存在下，由树脂固相载体和Fmoc-Phe-OH偶联得到Fmoc-Phe-树脂；
步骤2，通过固相合成法，按特立帕肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中肽序16-17位氨基酸采用假脯氨酸二肽Fmoc-Asn(Trt)-Ser(ψ Me, MePro)-OH代替原16-17位置两个氨基酸进行偶联；
步骤3，肽树脂裂解采用含NH4I/Me2S的TFA体系的裂解液，粗品经HPLC纯化、冻干得到特立帕肽，其工艺杂质Met8(O)-特立帕肽含量小于0.1 %。
其中，步骤1所述的固相合成方法，所述树脂固相载体采用2-CTC树脂，所述活化剂***选自DIEA、TMP或NMM，所述Fmoc-Phe-树脂为0.40~0.90mmol/g取代度的Fmoc-Phe-CTC树脂。
其中，步骤1所述的固相合成方法，所述树脂固相载体采用王树脂，所述活化剂***由DIC、HOBt和DMAP组成，所述Fmoc-Phe-树脂为0.40~0.90mmol/g取代度的Fmoc-Phe-王树脂。
本发明中，所述的树脂的取代度是采用紫外吸光光度法测定的树脂的取代度，用20%哌啶/DMF溶液将偶联Fmoc保护型氨基酸的树脂上的Fmoc保护基脱保护下来，用紫外吸光光度法测定其浓度，然后采用含Fmoc的氨基酸标准化合物例如Fmoc-Leu-OH，以外标法标定树脂上的Fmoc的mmol数值，除以树脂重量，即得到树脂的取代度或称之为替代度。
其中，步骤2所述的固相合成方法，1）采用由体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液脱除Fmoc-Phe-树脂上的Fmoc保护基，得到H-Phe-树脂；
2）在偶联剂***的存在下，H-Phe-树脂和Fmoc保护且侧链保护的精氨酸偶联得到Fmoc-Asn(Trt)-Phe-树脂；
3）重复步骤1）、2），按照特立帕肽主链肽序依次进行氨基酸的偶联，肽序16-17位氨基酸采用假脯氨酸二肽Fmoc-Asn(Trt)-Ser(ψ Me, Me Pro)-OH代替原16-17位置两个氨基酸进行偶联，重复偶联氨基酸顺序为： Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asn(Trt)-Ser(ψ Me, MePro)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH；所述偶联剂***包括缩合剂和反应溶剂，所述缩合剂选自DIC/HOBt、PyBOP/HOBt/DIEA或HATU/HOBt/DIEA；所述反应溶剂选自DMF、DCM、NMP、DMSO或他们之间的任意组合。
其中，由于假脯氨酸二肽结构的存在，可以破坏β结构稳定性，减轻肽链间聚集的倾向，从而提高肽链的溶剂化程度，最终提高后续氨基酸的偶联效率。
其中，步骤3所述采用了含NH4I/Me2S的TFA体系的裂解液，其TFA体系的裂解液为：TFA、苯甲硫醚、苯甲醚、乙二硫醇、三异丙基硅烷、水、二甲硫醚、碘化铵一种或多种的组合。
本发明的方法是经过筛选获得的，筛选过程如下：
1、假脯氨酸二肽片段法偶联和逐一法偶联的比较：以Wang树脂或2-CTC树脂载体上进行特立帕肽合成，其中16-17位的Asn16-Ser17的偶联分别通过假脯氨酸二肽片段法偶联和逐一法偶联得到特立帕肽肽树脂。裂解后，通过对所得粗肽和精品的纯度进行比较来评价两种方式的偶联效果。
2、裂解液添加NH4I/Me2S产生效果的比较：分别对不同起始树脂、不同偶联方式合成得到的特立帕肽肽树脂进行两种两种裂解液条件下进行裂解。对所得粗肽、精品进行纯度以及精品中杂质Met8(O)-特立帕肽含量进行比较以确定裂解液的优劣。
为此进行了以下8种条件实验，实验过程和结果如下：
实验1：1）取4.0 g取代度为0.25 mmol/g
Fmoc-Met-Glu(OtBu)-Arg(pbf)-Val-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-His(Trt)-Asn(Trt)-Phe-Wang树脂(1.0mmol)加入固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DCM溶胀30分钟后；2）体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液反应5分钟，DMF洗涤1次，体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液反应10分钟，DMF洗涤6次；3）称取2.17g Fmoc-Asn(Trt)-Ser(ψ Me, Me Pro)-OH（3 mmol）、 0.41g HOBt（3 mmol）加入溶剂中（DMF/DCM/NMP=1/1/1），冰水浴下加入0.48 ml DIC（3 mmol）活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，室温下反应2小时；然后重复2）和3）的操作，依次偶联剩下的氨基酸，偶联氨基酸顺序为：Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH。偶联完毕，用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，抽干得到11.82 g 特立帕肽Wang树脂；7）将上述树脂平均分成2份，分别加入到100 mL的三口圆底烧瓶中，分别加入以下两种裂解液60mL进行裂解：TFA: PhSMe:PhOMe:EDT=90:5:3:2（条件1）和TFA:TIS:PhOH:PhSMe:H2O: Me2S:NH4I=70:8:6:4:4:4:4(mL/ mL/ g/ mL/ mL/ mL/ g)，(条件2）。室温反应2小时，过滤，用少量TFA洗涤裂解后的树脂3次，合并滤液，浓缩，将浓缩后的液体加入到冰***中沉淀1小时，离心，无水***离心洗涤6次，真空干燥，分别得到特立帕肽粗肽2.05 g和2.11g。HPLC纯度分别为61.32%和66.29%；8）粗肽纯化、冻干后分别得到特立帕肽醋酸盐精肽0.61 g和0.67g，HPLC纯度分别为99.09 %和99.68%，Met8(O)-特立帕肽含量分别为0.16%和0.03%，总收率分别为33%和36%。
实验2：1）取4.0 g取代度为0.25 mmol/g
Fmoc-Met-Glu(OtBu)-Arg(pbf)-Val-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-His(Trt)-Asn(Trt)-Phe-Wang树脂(1.0mmol)加入固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DCM溶胀30分钟后；2）体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液反应5分钟，DMF洗涤1次，体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液反应10分钟，DMF洗涤6次；3）称取1.15g Fmoc-Ser(tBu)-OH（3 mmol）、 0.41 g HOBt（3 mmol）加入溶剂中（DMF/DCM/NMP = 1/1/1），冰水浴下加入0.48 ml DIC（3 mmol）活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，室温下反应2小时；然后重复2）和3）的操作，依次偶联剩下的氨基酸，偶联氨基酸顺序为：Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH。偶联完毕，用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，抽干得到11.82 g 特立帕肽Wang树脂；7）将上述树脂平均分成2份，分别加入到100 mL的三口圆底烧瓶中，分别加入以下两种裂解液60mL进行裂解：TFA:PhSMe:PhOMe:EDT=90:5:3:2（条件3）和TFA:TIS:PhOH:PhSMe:H2O: Me2S:NH4I=70:8:6:4:4:4:4 (mL/ mL/ g/ mL/ mL/ mL/ g)（条件4）。室温反应2小时，过滤，用少量TFA洗涤裂解后的树脂3次，合并滤液，浓缩，将浓缩后的液体加入到冰***中沉淀1小时，离心，无水***离心洗涤6次，真空干燥，分别得到特立帕肽粗肽1.95 g和2.01g。HPLC纯度分别为55.74%和56.21%；所得粗肽纯化、冻干后得到特立帕肽醋酸盐精肽0.50 g和0.53g，HPLC纯度分别为98.86 %和99.48%，Met8(O)-特立帕肽含量分别为0.15%和0.04%，总收率分别为27%和29%。
实验3：1）取3.57 g取代度为0.28 mmol/g
Fmoc-Met-Glu(OtBu)-Arg(pbf)-Val-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-His(Trt)-Asn(Trt)-Phe-2-CTC树脂(1.0mmol)按实验1的操作进行。所得肽树脂采用条件TFA:PhSMe:PhOMe:EDT=90:5:3:2（条件5）和TFA:TIS:PhOH:PhSMe:H2O: Me2S:NH4I=70:8:6:4:4:4:4 (mL/ mL/ g/ mL/ mL/ mL/ g)（条件6），裂解后分别得到特立帕肽粗肽2.18 g和2.25g。HPLC纯度分别为72.74%和75.50%。粗肽纯化、冻干后得到特立帕肽醋酸盐精肽0.66 g和0.72g，HPLC纯度分别为99.11 %和99.86%，Met8(O)-特立帕肽含量分别为0.17%和0.02%，总收率分别为35%和38%。
实验4：1）取3.57 g取代度为0.28 mmol/g
Fmoc-Met-Glu(OtBu)-Arg(pbf)-Val-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-His(Trt)-Asn(Trt)-Phe-2-CTC树脂(1.0mmol)按实验2的操作进行。所得肽树脂采用条件TFA:PhSMe:PhOMe:EDT=90:5:3:2（条件7）和TFA:TIS:PhOH:PhSMe:H2O: Me2S:NH4I=70:8:6:4:4:4:4 (mL/ mL/ g/ mL/ mL/ mL/ g)（条件8）裂解后分别得到特立帕肽粗肽2.03 g和2.21g。HPLC纯度分别为66.03%和69.48%。粗肽纯化、冻干后得到特立帕肽醋酸盐精肽0.60 g和0.67g，HPLC纯度分别为98.99 %和99.64%，Met8(O)-特立帕肽含量分别为0.17%和0.03%，总收率分别为32%和36%。
实验条件1―8的实验结果如下面的表1所示：
表1实验条件1-8及实验结果如下：
以上结果表明，实验条件6的效果最优，即以2-CTC树脂为起始树脂，采用假脯氨酸二肽法偶联和添加NH4I/Me2S的裂解液裂解所得的粗肽和精品的纯度都最佳，同时精品中杂质Met8(O)-特立帕肽含量较低。
本发明的方法和现有技术相比具有明显的优势，有关对比实验如下表2所示：
表2 对比实验结果
总收率 纯度 Met8(O)-特立帕肽
专利CN102731643 32% 99.30% 不详
本发明技术 38% 99.86% 0.02%
从表中数据可以判定，本工艺不管从成品的纯度还是总收率数据上都比专利CN102731643所得结果更好。
本发明的有益效果是：选用假脯氨酸二肽Fmoc-Asn(Trt)-Ser(ψ Me, Me Pro)-OH和在采用含NH4I/Me2S的TFA体系的裂解液制备得到特立帕肽，解决了现有技术存在的合成纯度偏低、成本高，特别是杂质Met8(O)-特立帕肽含量较大，不适合规模化生产的问题；本发明提供了一种纯度高、成本低，适合规模化生产的特立帕肽的制备工艺，此工艺既能有效控制Met8(O)-特立帕肽又提高特立帕肽的收率问题。
附图说明
图1本发明的合成路线；
图2特立帕肽精品的HPLC谱图；
图3特立帕肽质谱图。
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明。
实施例一：Fmoc-Phe-Wang树脂的合成
称取5.00 g取代度为0.80 mmol/g的Wang树脂（4 mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DCM溶胀树脂30分钟后，抽干备用。另称取7.7g Fmoc-Phe-OH(20mmol)，2.02g HOBt(15mmol)加入烧杯，用DMF 50mL溶解，室温下加入3.0mL DIC(20mmol)，搅拌反应30min后，将此反应液加入上述溶胀后的树脂中进行反应。室温下反应24小时后，抽滤并用DMF洗涤6遍后，再加入DMF洗涤6遍，再依次加入1.95mL Ac2O（20mmol）、3.2mLDIEA（20mmol），反应1小时。抽干，用DMF洗涤6遍，再用DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，干燥后得到6.05 g Fmoc-Phe-Wang树脂。检测后替代度为0.45mmol/g。
实施例二：Fmoc-Phe-2-CTC树脂的合成
称取5.00 g取代度为0.940 mmol/g的2-CTC树脂（4.7 mmol），加入到固相反应柱中备用。另称取1.82g Fmoc-Phe-OH（4.7mmol），用干燥过的DCM50mL溶解，再加入0.62 mLDIEA(0.83mmol)，搅拌5min后，将此溶液加入树脂中进行反应，反应5min后，再往反应体系中加入1.24 mL DIEA(1.65mmol)，继续反应40min。再加入无水甲醇4mL，反应10min。抽干，用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，干燥后得到6.0 gFmoc-Phe-2-CTC树脂。替代度为0.48mmol/g/。
实施例三：特立帕肽Wang树脂的制备
称取2.22 g取代度为0.45 mmol/g的Fmoc-Phe-Wang树脂（1 mmol），加入固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DCM溶胀30分钟后，采用体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液反应5分钟，DMF洗涤1次，采用体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液反应10分钟，DMF洗涤6次，称取1.79 g Fmoc-Asn(Trt)-OH（3 mmol）、0.41 g HOBt（3 mmol）加入体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入0.48 ml DIC（3 mmol）活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，室温下反应2小时，以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需要再反应1小时，此判断标准适用于后续氨基酸偶联中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照特立帕肽主链肽序，依次完成Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asn(Trt)-Ser(ψ Me, Me Pro)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH。偶联完毕，用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，抽干得到7.52g 特立帕肽Wang树脂。
实施例四：特立帕肽2-CTC树脂的制备
称取2.08 g取代度为0.48 mmol/g的Fmoc-Phe-2-CTC树脂（1 mmol），加入固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DCM溶胀30分钟后，采用体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液反应5分钟，DMF洗涤1次，采用体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液反应10分钟，DMF洗涤6次，称取1.79 g Fmoc-Asn(Trt)-OH（3 mmol）、0.41 g HOBt（3 mmol）加入体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入0.48 ml DIC（3 mmol）活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，室温下反应2小时，以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需要再反应1小时，此判断标准适用于后续氨基酸偶联中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照特立帕肽主链肽序，依次完成Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asn(Trt)-Ser(ψ Me, Me Pro)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH。偶联完毕，用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，抽干得到7.44g特立帕肽-2-CTC树脂。
实施例五：特立帕肽2-CTC树脂的规模化制备
称取2083.33 g取代度为0.48 mmol/g的Fmoc-Phe-2-CTC树脂（1000 mmol），加入固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DCM溶胀30分钟后，采用体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液反应5分钟，DMF洗涤1次，采用体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液反应10分钟，DMF洗涤6次，称取1790.01 g Fmoc-Asn(Trt)-OH（3000 mmol）、405.36 g HOBt（3000mmol）加入体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入480 ml DIC（3000 mmol）活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，室温下反应2小时，以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需要再反应1小时，此判断标准适用于后续氨基酸偶联中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照特立帕肽主链肽序，依次完成Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asn(Trt)-Ser(ψ Me, Me Pro)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH。偶联完毕，用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，抽干得到754.52g 特立帕肽-2-CTC树脂。
实施例六：特立帕肽粗肽的制备
取实施例5所得特立帕肽-2-CTC-树脂10.0g加入到250 mL的三口圆底烧瓶中，按TFA:TIS:PhOH:PhSMe:H2O: Me2S:NH4I=70:8:6:4:4:4:4比例配置裂解液100 mL，将裂解液加入上述树脂中，室温反应2小时，过滤，用少量TFA洗涤裂解后的树脂3次，合并滤液，浓缩，将浓缩后的液体加入到冰***中沉淀1小时，离心，无水***离心洗涤6次，真空干燥，得到特立帕肽粗肽5.93 g。HPLC纯度75.50%。
实施例七：特立帕肽精肽醋酸盐的制备
称取实施例八所得粗肽4.0 g特立帕肽粗肽用200 mL水溶解后，第一次用C18柱纯化，纯化条件：流动相为：A相：0.1 %TFA；B相：乙腈；梯度程序为：15 ％B，60min内至60％B；检测波长220 nm；收集目的峰馏分。第二次用阴离子交换柱(UniDEAE-10)；流动相：A为缓冲液I溶液（10 mmol/L醋酸铵水溶液用稀氨水调节其pH 值为7.30±0.20):乙腈=90:10; B为缓冲液Ⅱ溶液（10 mmol/L醋酸铵+100 mmol/L氯化钠水溶液用醋酸调节其pH 值为4.50±0.20):乙腈=90:10；梯度程序为：100 ％A，60 min内至100 ％B；检测波长为220 nm；收集目的峰馏分。脱盐的条件：流 动 相：A相：20 mmol/L乙酸铵的水溶液:乙腈=95:5；B相：水:乙腈=95:5；C相：0.03 %醋酸的水溶液:乙腈=95:5；D相：0.03 %醋酸的水溶液:乙腈=50:50；梯度程序为：以流动相A等梯度洗脱15分钟，转换成流动相B等梯度洗脱10分钟, 转换成流动相C等梯度洗脱10分钟, 转换成流动相D等梯度洗脱25分钟；检测波长220 nm；收集目的峰馏分；旋蒸浓缩，冻干得到特立帕肽醋酸盐精肽1.28 g，HPLC谱图如图2所示，纯度99.86 %，总收率36 %。Met8(O)-特立帕肽含量为0.03 %，杂质Met8(O)-特立帕肽的含量测定方法：面积归一化法。

Claims (1)

1.一种制备特立帕肽的方法，提供了一种纯度高、成本低，适合规模化生产的特立帕肽制备工艺，此工艺既有效控制Met8(O)-特立帕肽含量又不影响特立帕肽的总收率，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1，在活化剂***的存在下，由树脂固相载体和Fmoc-Phe-OH偶联得到Fmoc-Phe-树脂；所述树脂固相载体采用2-CTC树脂，所述活化剂***选自DIEA、TMP或NMM，所述Fmoc-Phe-树脂为0.40~0.90mmol/g取代度的Fmoc-Phe-CTC树脂；
步骤2，通过固相合成法，按特立帕肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中肽序16-17位氨基酸采用假脯氨酸二肽Fmoc-Asn(Trt)-Ser(ψ Me, MePro)-OH代替原16-17位置两个氨基酸进行偶联；
步骤3，肽树脂裂解采用含NH4I/Me2S的TFA体系的裂解液，粗品经HPLC纯化、冻干得到特立帕肽，其工艺杂质Met8(O)-特立帕肽含量小于0.1 %。
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