BRPI0618074A2

BRPI0618074A2 - organismos termofìlicos para conversão de biomassa lignocelulósica em etanol

Info

Publication number: BRPI0618074A2
Application number: BRPI0618074-4A
Authority: BR
Inventors: Sunil G Desai; Arthur Josephus Shaw Iv; Lee R Lynd; Mikhail V Tyurin
Original assignee: Dartmouth College
Priority date: 2005-10-31
Filing date: 2006-10-31
Publication date: 2011-08-16
Also published as: WO2007130984A9; CA2627191A1; JP2012187121A; WO2007053600A3; US10066217B2; WO2007130984A3; EP1948813A2; US20090221049A1; US20090239277A1; WO2007130984A8; US20100015678A1; EP2392663A1; US20120077239A9; WO2007053600A2; JP2009513145A; WO2007130984A2

Abstract

<b>ORGANISMOS TERMOFILICOS PARA CONVERSãO DE BIOMASSA LIGNOCELULóSICA EM ETANOL<d>. A presente invenção refere-se a organismos termofílicos mutantes que consomem uma variedade de substratos derivados de biomassa. São descritas aqui, cepas de Thermoanaerobacterium saccharolyticum com expressão eliminada de fosfotransacetilase e acetato quinase. Adicionalmente, a cepa ALK1 foi produzida por recombinação homóloga sítio-dirigida para arrasar tanto a produção de ácido acético quanto a de ácido láctico. Cultura contínua envolvendo um estímulo da concentração de substrato leva a evolução de ALK1, e a formação de uma cepa mais robusta designada ALK2. Ambos os organismos produzem rendimentos de etanol quase teóricos sem expressar piruvato decarboxilase.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ORGANISMOSTERMOFÍLICOS PARA CONVERSÃO DE BIOMASSA LIGNOCELULÓSICAEM ETANOL".

Requerimentos Relacionados

Este requerimento reivindica prioridade para o Requerimento dePatente U.S. Nº 60/731.674, arquivado em 31 de outubro de 2005, e para oRequerimento de Patente U.S. Nº 60/796.380, arquivado em 1 de maio de2006, cada um dos quais é incorporado aqui, por meio de referência.

Interesses do Governo

O Governo dos Estados Unidos podem ter certos direitos napresente invenção uma vez que pesquisa relevante para seu desenvolvi-mento foi financiada pelo National Institute of Standards and Technology sobo número de contrato 60NANB1D0064.

Antecedentes

1. Campo da Invenção

A presente invenção pertence ao campo de processamento debiomassa para produzir etanol. Em particular, são descritos novos organis-mos termofílicos que consomem uma variedade de substratos derivados debiomassa e produzem etanol em alto rendimento, bem como processos paraa produção e uso dos organismos.

2. Descrição da Técnica Relacionada

Biomassa representa um substrato celulolítico econômico eprontamente disponível a partir do qual podem ser produzidos açúcares. Es-tes açúcares podem ser usados sozinhos ou fermentados para produzir ál-coois e outros produtos. Entre os produtos de bioconversão, o interesse noetanol é elevado porque este pode ser usado como um combustível domés-tico renovável.

Importante pesquisa tem sido realizada nas áreas de design dereator, protocolos de pré-tratamento e tecnologias de separação, de modoque os processos de bioconversão estão se tornando economicamentecompetitivos com as tecnologias de combustíveis de petróleo. No entanto,estima-se que podem ser obtidas as maiores economias de custo quandosão combinadas duas ou mais etapas do processo. Por exemplo, processossimultâneos de sacarificação e fermentação (SSF) e simultâneos de sacarifi-cação e co-fermentação (SSCF) combinam uma etapa de sacarificação en-zimática com fermentação em um único reator ou equipamento de processocontínuo. Além da economia associada com tempos de reação mais curtos ereduzidos custos de capital, os processos de co-fermentação também po-dem proporcionar aprimoradas produções de produtos porque alguns com-postos que de outro modo se acumulariam em níveis que inibem metabóliseou hidrólise são consumidos pelos organismos de co-fermentação. Em umexemplo similar, a β-glucosidase pára de hidrolisar celobiose na presença deglicose e, por sua vez, o desenvolvimento de celobiose impede a degrada-ção da celulose. Um processo de SSCF envolvendo co-fermentação de celu-lose e produtos da hidrólise da hemicelulose podem aliviar este problemaconvertendo glicose em um ou mais produtos que não inibem a atividadehidrolítica da β-glucosidase.

O bioprocessamento consolidado (CBP) envolve quatro eventosmediados biologicamente: (1) produção de enzimas, (2) hidrólise de substra-to, (3) fermentação de hexose e (4) fermentação de pentose. Estes eventospodem ser realizados em uma única etapa. Esta estratégia requer um micro-organismo que utiliza celulose e hemicelulose. O desenvolvimento de orga-nismos de CBP potencialmente pode resultar em reduções de custo muitograndes comparado com a abordagem mais convencional para produzir en-zimas sacarolíticas em uma etapa de processo dedicada. Os processos deCBP que utilizam mais de organismo para realizar os quatro eventos media-dos biologicamente são referidos como fermentações de co-cultura por bio-processamento consolidado.

Algumas bactérias têm a capacidade de converter açúcares depentose em açúcares de hexose, e de fermentar os açúcares de hexose emuma mistura de ácidos orgânicos e outros produtos por glicólise. O caminhoglicolítico inicia com conversão de uma moléculas de glicose de seis carbo-nos em duas molécula de piruvato de três carbonos. Piruvato pode ser entãoconvertido em Iactato pela ação de Iactato deidrogenase ("Idh"), ou em acetilcoenzima A ("acetil-CoA") pela ação de piruvato deidrogenase ou piruvato-ferredoxina oxidorredutase. AcetiI-CoA é adicionalmente convertida em ace-tato por fosfotransacetilase e acetato quinase, ou reduzida para etanol poracetaldeído deidrogenase ("AcDH") e álcool deidrogenase ("adh").

Especialmente, o desempenho de organismos produtores deetanol é comprometido pela produção de produtos orgânicos diferentes deetanol, e particularmente por conversão de piruvato em Iactato mediada porIdh1 e por conversão de acetil-CoA em acetato por fosfotransacetilase e ace-tato quinase.

A engenharia metabólica de bactérias recentemente resultou nacriação de um nocaute de Iactato deidrogenase na bactéria Gram-positivatermofílica, anaeróbica T. saccharolyticum. Vide, Desai, S.G.; Guerinot, M.L.;Lynd1 L.R. "Cloning of L-Iactate dehydrogenase and elimination of Iactic acidproduction via gene knockout in Thermoanaerobacterium saccharolyticumJW/SL-YS485" Appl. Microbiol. Biotechnol. 65: 600-605, 2004.

Embora o nocaute de Idh constitua um avanço na técnica, é pro-blemático para alguns usos deste organismo em que esta cepa de T. saccha-rolyticum continua a produzir ácido orgânico - em particular, ácido acético.Sumário

Os presentes meios representam um avanço na técnica e supe-ram os problemas descritos acima em linhas gerais, proporcionando bacté-rias termofílicas, anaeróbicas que consomem uma variedade de substratosderivados de biomassa e produzem etanol em produções quase teóricas.Também são descritos métodos para produzir etanol usando os organismos.

Os meios reportados aqui, resultam no nocaute de vários genesou unicamente ou em combinação, onde os referidos genes no organismonativo resultariam de modo diverso na formação de ácidos orgânicos. Porexemplo, pode haver nocautes de: (a) acetato quinase e/ou fosfotransaceti-lase e (b) Iactato deidrogenase (Idh), acetato quinase (ack) e fosfotransaceti-lase (pta) em T. saccharolyticum JW/SL-YS485. Embora os resultados reporta-dos aqui, sejam para T. saccharolyticum, os métodos e materiais também seaplicam a outros membros do gênero Thermoanaerobacter incluindo Thermoa-naerobacterium thermosulfurigenes, Thermoanaerobacterium aotearoense,Thermoanaerobacterium poiysaccharoiyticum, Thermoanaeróbacterium zea-e, Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum, e Thermoanaerobaeteri-um xyianolyticum. Os métodos e materiais são úteis de modo geral no cam-po de bactérias Gram-positivas termofílicas produzidas metabolicamente.

Em uma modalidade, um organismo isolado, o qual não expressapiruvato decarboxilase, fermenta um substrato celulolítico para produzir eta-nol em uma concentração que é no mínimo 90% de uma produção teórica.

Em uma modalidade, uma bactéria Gram-positiva, que em umestado nativo contém no mínimo um gene o qual confere à bactéria Gram-positiva a capacidade de produzir ácido acético como um produto de fermen-tação, é transformado para eliminar a expressão do no mínimo um gene. Abactéria pode ser um Thermoanaerobacter, tal como Thermoanaerobaeteri-um saccharolyticum. O gene o qual confere à bactéria Gram-positiva umacapacidade de produzir ácido acético como um produto de fermentação po-de codificar para expressão de acetato quinase e/ou fosfotransacetilase.

Em outra modalidade, a bactéria Gram-positiva pode ser adicio-nalmente transformada para eliminar a expressão de um ou mais genes queconferem à bactéria Gram-positiva a habilidade de produzir ácido láctico co-mo um produto de fermentação. Por exemplo, o gene que confere a capaci-dade de produzir ácido láctico pode ser Iactato deidrogenase.

Em uma modalidade, um método para produzir etanol incluitransformar um organismo nativo para produzir uma bactéria Gram-positivaque tenha sido transformada para eliminar a expressão de todos os genesque conferem à bactéria Gram-positiva a capacidade de produzir ácidos or-gânicos como produtos de fermentação, para produzir um hospedeiro bacte-riano transformado, e cultivar o hospedeiro bacteriano transformado em meioque contém um substrato incluindo um material selecionado entre o grupoconsistindo em glicose, xilose, celobiose, sacarose, xilano, amido, e combi-nações dos mesmos sob condições adequadas por um período de temposuficiente para possibilitar a sacarificação e fermentação do substrato.

Em uma modalidade, é descrita uma cultura biologicamente purade um microorganismo designado ALK1 e depositado junto à ATCC sob aDesignação de Depósito de Patente N- PTA-7206.

Em uma modalidade um polinucleotídeo isolado compreende (a)uma seqüência de SEQ ID NO: 10, ou (b) uma seqüência de SEQ ID NO: 9e SEQ ID NO: 10, ou (c) uma seqüência tendo no mínimo cerca de 90% deidentidade de seqüência com a seqüência de (a) ou (b). É descrito um vetorcompreendendo o polinucleotídeo isolado de (a), (b), ou (c), bem como umacélula hospedeira produzida por engenharia genética para expressar umcomplemento do polinucleotídeo de (a), (b), ou (c). Em outra modalidade, umpolinucleotídeo isolado compreende uma seqüência tendo no mínimo cercade 95% de identidade de seqüência com a seqüência de (a) ou (b).

Em uma modalidade, um método para produzir etanol inclui cul-tivar uma bactéria mutante expressando um complemento do polinucleotídeoisolado de (a), (b), ou (c) em meio contendo um substrato selecionado entreo grupo consistindo em glicose, xilose, celobiose, sacarose, xilano, amido, ecombinações dos mesmos sob condições adequadas por um período detempo suficiente para possibilitar fermentação do substrato para etanol.Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1 mostra reações do caminho glicolítico.

A figura 2 mostra produção de hidrogênio em T. saccharolyticumselvagem comparada com várias cepas de nocaute de T. saccharolyticum.

A figura 3 mostra uma comparação de seqüências de polinucleo-tídeos experimentais e esperadas para a região Idh do vetor suicida pSGD9(SEQ ID NO: 9) integrado no genoma de T. saccharolyticum.

A figura 4 mostra uma comparação de seqüências de polinucleo-tídeos experimentais e esperadas para a região pta/ack do vetor suicidapSGD8-Erm (SEQ ID NO: 10) integrado no genoma de T. saccharolyticum.

As figuras 5-7 mostram traços de cromotografia líquida de altaperformance (HPLC) de um caldo de fermentação em vários intervalos detempo durante crescimento de ALK1.

A figura 8 mostra as concentrações de xilose, ácido orgânico eetanol durante fermentação por cepa ALK1.A figura 9 mostra as concentrações de xilòse, ácido orgânico eetanol durante fermentação por T. saccharolyticum selvagem.

A figura 10 mostra as concentrações de xilose, ácido orgânico eetanol durante um estímulo de cultura contínua de ALK1.

A figura 11 mostra as concentrações de xilose, ácido orgânico eetanol durante fermentação para cepa ALK2.Descrição Detalhada

Agora serão mostrados e descritos métodos para produzir e utili-zar bactérias Gram-positivas termofílicas, anaeróbicas, na conversão de bi-omassa em etanol.

Conforme usado aqui, um organismo está em "um estado nativo"se não tiver sido produzido por engenharia genética ou manipulado de mododiverso pela mão do homem em uma maneira que altera intencionalmente aconstituição genética e/ou fenotípica dos organismo. Por exemplo, organis-mos selvagens podem ser considerados como estando em um estado nati-vo.

A completa eliminação da produção de ácido orgânico de uma 7".saccharolyticum em um estado nativo foi obtida usando dois eventos de re-combinação homóloga de DNA sítio-dirigida. A cepa mutante, Thermoanae-robacterium saccharolyticum JW/SL-YS485 ALKI ("ALK1") produz quantida-des quase teóricas de etanol em baixas alimentações de substrato em cultu-ra em lotes com uma temperatura em uma faixa de cerca de 30 a 66°C e umpH em uma faixa de cerca de 3,85 a 6,5. Em uma modalidade, a produçãode etanol é de no mínimo cerca de 90% do máximo teórico. ALK1, e seusdecendentes, têm o potencial de contribuir com significativas economias nabiomassa lignocelulósica para conversão de etanol devido a suas condiçõesde crescimento, as quais são substancialmente otimizadas para a atividadeda celulase em um processo simultâneo de sacarificação e co-fermentação(SSCF) . Por exemplo, parâmetros de ótima atividade da celulase incluemum pH entre 4 e 5 e temperatura entre 40 e 50°C. Adicionalmente, não énecessário ajustar o pH do caldo de fermentação quando são usados orga-nismos de nocaute, os quais carecem da habilidade de produzir ácidos or-gânicos. ALK1, e organismos similares, também podem ser adequados parauma fermentação de co-cultura de bioprocessamento consolidado onde oorganismo de nocaute converteria pentoses em etanol, e a celulose seriadegradada por um organismo celulolítico tal como C. thermocellum.

Operando ou um processo SSCF ou CBP em temperaturas ter-mofílicas oferece vários benefícios importantes em relação às temperaturasde fermentação mesofílicas convencionais de 30 a 37°C. Em particular, oscustos para uma etapa de processo dedicada para produção de celulase sãosubstancialmente reduzidos (por exemplo, 2 vezes ou mais) para SSCF ter-mofílicas e são eliminados para CBP. Também se espera que os custos as-sociados com resfriamento do fermentador e também com permuta térmicaantes e depois da fermentação sejam reduzidos tanto para SSCF quantopara CBP termofílicas. Finalmente, processos caracterizando biocatalisado-res termofílicos podem ser menos suscetíveis a contaminação microbianacomparados com processos caracterizando biocatalisadores mesofílicosconvencionais.

Em contraste com microorganismos "de fermentação de homoe-tanol" conhecidos, tais como Saccharomyces cerevisiae e Zymomonas mobi-Iis naturais, e cepas recombinantes de Escherchia coli e Klebsiella oxytoca,os organismos presentemente descritos não dependem da conversão depiruvato em acetaldeído atravéss da ação da piruvato decarboxilase (figura1, 9). De fato, bactérias pertencentes ao gênero Thermoanaerobacter nãoexpressam piruvato decarboxilase no estado nativo. A partida das reaçõesdo caminho glicolítico mostrado na figura 1, pode ser observado que o piru-vato pode ser metabolizado para acetil-CoA, dióxido de carbono, e ferredo-xina reduzida pela enzima piruvato-ferredoxina oxidorredutase, 2. No entan-to, de modo a produzir etanol como o único produto de fermentação, os elé-trons carregados pels ferredoxina reduzida devem ser todos transferidos pa-ra NAD através da NAD.ferredoxina oxidorredutase, 3, para formar NADH.NADH é subseqüentemente oxidado de volta para NAD no curso da reduçãoem duas etapas da acetil-CoA em etanol por acetaldeído deidrogenase, 7, eálcool deidrogenase, 8. Evidência da eficiente utilização de NADH pode serobservada na figura 2 como uma redução na produção de H2 tanto pelo or-ganismo de nocaute de acetato, o qual é útil para expressar acke pta, quan-to pelo organismo de duplo nocaute (ALK1), o qual é útil para expressar ack,pta e Idh. Estes organismos proporcionam a primeira demonstração detransferência de elétrons estequiométrica de ferredoxina reduzida para NAD,e subseqüentemente para etanol.

O caminho descrito acima, o qual produz produções de etanolestequiométricas em organismos que não possuem a capacidade de ex-pressar PDC1 está em contraste com o caminho empregado em todas ascepas de fermentação de homoetanol previamente descritas. As cepas pre-viamente descritas utilizam piruvato decarboxilase (PDC) endógena, ou sãoproduzidas para expressar PDC endógena. Como a expressão da PDC érara no mundo microbiano, a capacidade para redirecionar o fluxo de elé-trons em virtude de modificações para fluxo de carbono tem amplas implica-ções. Por exemplo, esta abordagem pode ser usada para produzir altas pro-duções de etanol em cepas diferentes de T. saccharolyticum e/ou para pro-duzir solventes diferentes de etanol. Em particular, bactérias Gram-positivas,tais como membros do gênero Thermoanaerober; Clostridium thermocellume outros Clostrídios termofílicos e mesofílicos; espécies de Bacillus termofíli-cos e mesofílicos; bactérias Gram-negativas, tais como Escherichia coii eKlebsiella oxytoca\ Fibrobacter succinogenes e outras espécies Fibrobacter;Thermoga neopolitana e outras espécies Thermotoga; e fungos anaeróbicosincluindo as espécies Neocallimatix e Piromyces carecem da capacidadepara expressar PDC, e podem se beneficiar dos meios descritos.

Será reconhecido que o material lignocelulósico pode ser qual-quer matéria-prima que contém um ou mais entre glicose, xilose, manose,arabinose, galactose, frutose, celobiose, sacarose, maltose, xilano, mananoe amido. Em várias modalidades, a biomassa lignocelulósica compreendemadeira, palha de milho, serragem, casca de árvore, folhas, resíduos agríco-las e de regiões florestais, gramíneas tais como "switchgrass" produtos dadigestão de ruminantes, refugos municipais, efluentes de fábricas de papel,jornal, papelão, ou combinações dos mesmos.Exemplo 1

Produção da cepa ALK1Materiais e Métodos

Thermoanaerobacterium saccharolyticum cepa JW/SL-YS485(DSM 8691) é uma bactéria termofílica, anaeróbica isolada do West ThumbBasin in Yellowstone National Park, Wyoming (Lui, S.Y; Gherardini, F.C.;Matuschek, M.; Bahl, H.; Wiegel, J. "Cloning, sequencing, and expression ofthe gene encoding a Iarge S-layer-associated endoxylanase from Thermoa-naerobacterium sp strain JW/SL-YS485 in Escherichia colf J. Bacteriol. 178:1539-1547, 1996; Mai, V.; Wiegel, J. "Advances in development of a geneticsystem for Thermoanaerobacterium spp: Expression of genes encoding hy-drolytic enzymes, development of a second shuttle vector, and integration ofgenes into the chromosome" Appl. Environ. Microbiol. 66: 4817-4821, 2000).Cresce em uma faixa de temperatura de 30 a 66°C e em uma faixa de pH de3,85 a 6,5. Consome uma variedade de substratos derivados da biomassaincluindo os monossacarídeos glicose e xilose, os dissacarídeos celobiose esacarose, e os polissacarídeos xilano e amido, mas não celulose. O orga-nismo produz etanol bem como os ácidos orgânicos, ácido láctico e ácidoacético como produtos de fermentação primária.Clonagem e Seqüenciamento

Os genes de Iactato deidrogenase (L-ldh), fosfotransacetilase(pia), e acetato quinase (ac/c) foram identificados e seqüenciados usandotécnicas padronizadas, conforme reportado previamente para L-Idh (Desai,2004). Iniciadores degenerados foram preparados usando o algoritmo CO-DE-HOP (Rose, T.; Schultz, E.; Henikoff, J.; Pietrokovski, S.; McCaIIum, C.;Henikoff, S. "Consensus-degenerate hybrid oligonucleotide primers for ampli-fication of distantly-related sequences" Nuclèic Acids Research, 26(7): 1628-1635, 1 Apr 1998) e reações de PCR foram realizadas para obter a seqüên-cia de DNA entre regiões conservadas. Os fragmentos genéticos fora dasregiões conservadas foram seqüenciados diretamente a partir do DNA ge-nômico usando enzima ThermoFideIase (Fidelity Systems, Gaithersburg,MD) com kit v3.1 de BigDye Terminator (ABI, Foster City CA).Construção de Vetores Suicidas

Vetor de nocaute de acetato guinase e fosfotransacetilase, pSGD9

Foram seguidas técnicas de clonagem de rotina (Sambrook). Ovetor suicida de 6,2 kb pSGD9 foi à base de pBLUESCRIPT II SK (+) (Stra-tagene) usando uma abordagem de design similar à reportada anteriormente(Desai, 2004; Mai1 2000). Fragmentos genéticos da seqüência pta/ack, pta-up (~1,2 kb) e ack-down (~0,6 kb), foram amplificados a partir de DNA ge-nômico usando os pares de iniciadores SEQ ID NOS: 1-2, e SEQ ID NOS: 3-4. Foi feita amplificação por PCR com pfu DNA polimerase e os fragmentosforam extraídos de um gel de eletroforese a 1%. Os fragmentos pta-up eac/c-down foram em seguida A-tailed com Taq polimerase e clonados emTOPO pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Um fragmento de 1,5 kb contendoo marcador de canamicina foi obtido de uma digestão por Pstl/Xbal deplKM1 e subclonado em pBLUESCRIPT Il SK (+). TOPO contendo pta-up foidigerido com Xhol/BsiHKAI e subclonado em pBLUESCRIPT Il SK (+) dige-rido com Xhol/Pstl, a montante do marcador de canamicina previamentesubclonado. TOPO contendo ac/c-down foi digerido com Xbal/Sphl e subclo-nado em pUC19 (Invitrogen). O fragmento Xbal/Afllíl contendo ac/c-down foidigerido e subclonado a jusante do marcador de canamicina para obter oconstructo final pSGD9.

Vetor de nocaute de Iactato deidrogenase com resistência a eritromicina.pSGD8-Erm

O vetor suicida de 5,5 kb pSGD8-Erm foi à base do plasmídeopSGD8 conforme produzido por Desai et al. 2004. Ao invés do marcador deantibiótico de canamicina aph, foram usados um gene de fusão à base dopromotor aph do plasmídeo plKM1 e o gene de adenina metilase conferindoresistência a eritromicina do plasmídeo pCTC1 (Klapatch, T.R.; Guerinot,M.L.; Lynd, L.R. "Electrotransformation of Ciostridium thermosaccharolyti-cum" J. Ind. Microbiol. 16(6): 342-7, June 1996) foram usadas para seleção.Fragmentos genéticos de PCR foram criados usando pfu polimerase (State-gene) e os iniciadores SEQ ID NOS: 5-6 para o promotor aph e SEQ IDNOS: 7-8 para a fase de leitura aberta de adenina metilase. Os fragmentosforam digeridos com Xbal/BamH1 (fragmento aph) e BamHI/EcoRI (aderiinametilase) e ligados no sítio de clonagem múltipla de plKM1. Este gene defusão foi em seguida excisado com BseRI/Ecofíl e ligado em pSGD8 digeri-do de modo similar.

Transformação de T. saccharolvticum

A transformação de T. saccharolyticum foi realizada de modointercambiável com dois métodos, o primeiro conforme previamente descrito(Mai, V.; Lorenz, W.; Weigel, J. "Transformation of Thermoanaerobacteriumsp. strain JW/SL-YS485 with plasmid PIKM1 conferring kanamycin resistan-ce" FEMS Microbiol. Lett. 148: 163-167, 1997) e o segundo com várias modi-ficações depois da coleta celular e baseado no método desenvolvido paraClostridium thermocellum (Tyurin, Μ. V.; Desai, S. G.; Lynd, L. R. "Electro-transformation of Clostridium thermocellum" Appl. Environ. Microbiol. 70(2):883-890, 2004). As células foram cultivadas de um dia para o outro usandomeio pré-reduzido DSMZ 122 em tubos de cultura descartáveis estéreis den-tro de uma câmara anaeróbica em uma incubadora mantida a 55°C. Depoisdisso, as células foram subcultivadas com 4 μg/ml de hidrazida de ácido iso-nicotônico (isoniacina), um agente de enfraquecimento da parede celular(Hermans, J.; Boschloo, J.G.; de Bont, J.A.M. "Transformation of M. aurumby electroporation: the use of glycine, Iysozyme and isonicotinic acid hydra-zide in enhancing transformation efficiency" FEMS Microbiol. Lett. 72, 221-224, 1990), adicionado ao meio depois da fase Iag inicial. Células da faseexponencial foram colhidas e lavadas com solução estéril fria pré-reduzidade celobiose a 200 mM, e ressuspendidas na mesma solução e mantidassobre gelo. Foi tomado cuidado extremo depois da coleta das células paramantê-las frias (aproximadamente 4°C) o tempo todo inclusive durante otempo de centrifugação.

Amostras compostas de 90 μΙ da suspensão celular e 2 a 6 μΙ depSGD9 ou pSGD8-Erm (1 a 3 μg) adicionados logo antes da aplicação depulso, foram colocadas dentro de tubos descartáveis de microcentrífuga depolipropileno estéreis de 2 ml serviram como cuvetas de eletrotransforma-ção. Foi aplicada uma onda quadrada com duração da pulsação ajustada em10 ms usando um sistema gerador de pulso / de eletrodo de titânio persona-lizado. Um limiar de voltagem correspondente à formação de eletroporos emuma amostra celular foi avaliado como uma alteração de corrente não linearquando a voltagem do pulso foi aumentada linearmente em incrementos de200 V. Foi usada uma voltagem particular que proporcionou a melhor pro-porção de produção de transformação versus índice de viabilidade celularem uma dada concentração de DNA, a qual neste caso em particular foi de25 kV/cm. Células pulsadas foram inicialmente diluídas com 500 μΙ de meioDSM 122, mantidas sobre gelo por 10 minutos e em seguida recuperadasem 55°C por 4 a 6 horas. Depois da recuperação, células transformadascom pSGD9 foram misturadas com 2% de meio agar contendo canamicinaem 75 μg/ml e vertidas sobre placas de petri e incubadas em jarras anaeró-bicas por 4 dias. Células transformadas com pSGD8-Erm foram deixadaspara recuperar em 48°C por 4 a 6 horas e foram ou laminadas em 2% demeio agar em pH 6,0 contendo eritromicina em 5 μg/ml ou meio líquido simi-lar e incubadas em jarras anaeróbicas em 48°C por 6 dias. Quaisquer daslinhagens celulares transformadas podem ser usadas sem manipulação adi-cional. No entanto, um organismo onde a eliminação da expressão de todosos genes que conferem a capacidade de produzir ácidos orgânicos foi obtidarealizando uma segunda transformação (seqüencial). A segunda transforma-ção foi realizada conforme descrito acima com o mutante primário substituí-do pela suspensão celular não-transformada. O mutante secundário, ALK1,foi cultivado sobre meio contendo tanto canamicina quanto eritromicina.

Seqüenciamento de Regiões de Nocaute

O seqüenciamento das regiões de nocaute sítio dirigido foi feitopor PCR a partir de DNA genômico usando Taq polymerase (New EnglandBiolabs) e iniciadores fora das regiões de sobreposição homóloga entre ogenoma e os vetores suicidas. Iniciadores dentro dos produtos de PCR fo-ram usados para seqüenciamento com o kit BigDye Terminator v3.1 (ABI,Foster City, CA). As regiões foram dispostas usando o programa de softwareCAP3 (Huang, X. "An improved sequence assèmbly program" Genomics 33:21-31, 1996) e comparadas com a seqüência de DNA esperada usando oalgoritmo CLUSTALW (Higgins, D. G.; Bleasby, A. J.; Fuchs, R. "CLUSTALV: improved software for multiple sequence alignment" Computer Applicati-ons in the Biosciences (CABIOS), 8(2): 189-191, 1992). Existiu um alto graude homologia (percentagem de identidade) entre a seqüência compilada ex-perimentalmente e a seqüência esperada com base nas seqüências conhe-cidas selvagens e de vetores suicidas (figuras 3 e 4).

"Identidade" refere-se a uma comparação entre pares de molé-culas de aminoácido ou ácido nucléico. São conhecidos métodos para de-terminar identidade de seqüência. Vide, por exemplo, programas de compu-tador comumente empregados para este fim, tais como o programa Gap(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Com-puter Group, University Research Park, Madison Wisconsin), que usa o algo-ritmo de Smith e Waterman, 1981, Adv. Appi Math. 2:482-489.Verificação de Cepa Mutante

DNA genômico da cepa mutante Thermoanaerobacterium sac-charolyticum JW/SL-YS485 ALK1 ("ALK1") apresentou a recombinação ho-móloga sítio-dirigida esperada nos Ioci L-Idh e pta/ack através de seqüenci-amento de DNA. Ambos os eventos de integração foram integrações duplas,a qual é um genótipo mais geneticamente estável.Exemplo 2

Dados Comparativos Mostrando a Produção de Etanol por ALK1 E T. Sac-charolvticum Selvagem

T. saccharolyticum foi cultivado em meio parcialmente definidoMTC contendo 2,5 g/L de extrato de levedura (Zhang, Y.; Lyndl L. R. "Quan-tification of cell and cellulase mass concentrations during anaerobic cellulosefermentation: development of an enzyme-linked immunosorbent assay-basedmethod with application to Clostridium thermocellum batch cultures" Anal.Chem. 75: 219-222, 2003). Glicose, xilose, acetato, Iactato e etanol foramanalisados por HPLC sobre uma coluna Aminex 87H (BioRad Laboratories,Hercules, CA) a 55°C. A fase móvel consistiu em 5 mM de ácido sulfúrico emum índice de fluxo de 0,7 ml/min. A detecção foi através de índice refrativousando um refractômetro Waters 410 (Milford, MA). O nível de detecção mí-nimo para acetato foi de 1,0 mM. Um traço padrão contendo 5 g/L de xilose,5 g/L de ácido láctico, 5 g/L de ácido acético e 5 g/L de etanol é mostrado nafigura 5.

A cepa ALK1 produziu somente etanol com até 17 g/L de xilose,ou com 5 g/L de xilose e 5 g/L de glicose, sem ácidos orgânicos ou outrosprodutos detectados por HPLC. A figura 6 mostra a fermentação da cepaALK1 no momento 0 horas e a figura 7 mostra a mesma fermentação em 72horas. Gráficos de curso de tempo-fermentação da cepa ALK1 e selvagemsobre meio dé xilose tamponado com 8 g/L de MES em um pH inicial de 6,0,55°C e 100 rpm mostram que a cepa ALK1 é capaz de converter mais de99% de xilose em etanol (figura 8), enquanto a selvagem sob condições si-milares se torna limitada pelo pH devido à produção de ácido orgânico e éincapaz de consumir toda a xilose presente (figura 9). O organismo selva-gem produziu 0,15 mM de etanol, ao passo que ALK1 produziu 0,46 mM deetanol.

Exemplo 3

Evolução de ALK1

Conforme mostrado na figura 10, uma cultura contínua na qual aconcentração da alimentação do substrato foi aumentada com o tempo foiutilizada para testar ALK1. A figura 10 mostra as concentrações de xilose,xilulose e etanol durante a cultura contínua. Depois de mais de 1000 horasde exposição a este ciclo de stress-evolução, uma cepa aprimorada, ALK2,foi isolada do caldo de fermentação. ALK2 foi capaz de iniciar o crescimentoem 50 g/L de xilose em cultura por lotes. A figura 11 mostra as concentra-ções de etanol e densidade ótica (DO) de xilose, ácido orgânico, e durantefermentação pela cepa ALK2.

Depósito de ALK1

ALK1 foi depositado junto à American Type Culture Collection,Manassas, VA 20110-2209. O depósito foi feito em 1- de novembro de 2005e recebeu o Número de Designação do Depósito de Patente PTA-7206. Estedepósito foi feito de acordo com os requisitos do Tratado de Budapeste deque a duração do depósito deve ser por trinta (30) anos a partir da data dedepósito ou por cinco (5) anos depois da última solicitação para o depósitono depositário ou pelo tempo vigente de uma Patente U.S. que vence a partirdeste requerimento de patente, o que for mais longo. ALK1 será reposto ca-so se torne não viável no depositário.

A descrição das modalidades específicas revela conceitos geraisque outros podem modificar e/ou adaptar para várias aplicações ou usos quenão se afastam dos conceitos gerais. Portanto, as adaptações e modifica-ções referidas devem ser e pretende-se que sejam incluídas dentro do signi-ficado e da faixa de equivalentes das modalidades descritas. Deve ser en-tendido que a fraseologia ou terminologia empregada aqui, neste requeri-mento de patente, é para os fins de descrição e não limitação.

Os exemplos precedentes podem ser modificados conveniente-mente para uso em qualquer bactéria Gram-positiva, e especialmente mem-bros do gênero Thermoanaerobacter incluindo Thermoanaerobacteriumthermosulfurigenes, Thermoanaerobacterium aotearoense, Thermoanaero-bacterium polysaccharolyticum, Thermoanaerobacterium zeae, Thermoanae-robacterium thermosaccharolyticum, e Thermoanaerobacterium xylanolyti-cum.

Todas as referências mencionadas neste requerimento são in-corporadas por meio de referência na mesma extensão como se plenamentereproduzidas aqui, neste requerimento de patente.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> The Trustees of Dartmouth CollegeLynd, Lee R.,Shaw, Arthur JosephusDesai, Sunil G.Tyurin, Mikhail V.

<120> ORGANISMOS TERMOFÍLICOS PARA CONVERSÃO DE BIOMASSA LIGNOCELU-LÓSICA EM ETANOL

<130> 454555

<140> Ainda não determinado

<141> 2006-10-31

<150> US 60/731,674

<151> 2005-10-31

<150> US 60/796,380

<151> 2006-05-01

<160> 10

<170> Versão de patente 3.2

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Iniciador pta

<400> 1

acatgcatgc ccatttgtct ataatagaag gaag 34

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Iniciador pta

<400> 2

cgtcaacaat atctctatag ctgc 24

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> iniciador ack

<400> 3

gctctagagc atagaattag ctccactgc 29

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador ack

<400> 4

acatgcatgc cgacgçctcc catagctgct gcat

34

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador aph

<400> 5

tggatccgcc atttattatt tccttcctct tttc 34

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador aph

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador adenina metilase

<400> 7

gcggatccca tgaacaaaaa tataaaatat tctc 34

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador adenina metilase

<210> 9

<211> 2778

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Locus L-Idh de termoanaerobacterium Saccharolyticum nocaute

<400> 6

ttctagatgg ctgcaggtcg ataaacc

27

<400> 8

gcgaattccc tttagtaacg tgtaactttc c

31

<400> 9

ggaaacgaat agtaaaggaa tggaggcgaa ttaatgagta atgtcgcaat gcaattaata 60gaaatttgtc ggaaatatgt aaataataat ttaaacataa atgaatttat cgaagacttt 120caagtgcttt atgaacaaaa gcaagattta ttgacagatg aagaaatgag cttgtttgat 180gatatttata tggcttgtga atactatgaa caggatgaaa atataagaaa tgaatatcac 240ttgtatattg gagaaaatga attaagacaa aaagtgcaaa aacttgtaaa aaagttagca 300gcataataaa ccgctaaggc atgatagcta aagcggtatt tttatgcaat taaaaggatg 360aaatgatatc tgataaactg cgaaaaagta ttttagaaaa taactataaa gataatattt 420caaatcaata aggacaaaat aagattaaaa tttagacaat ttcatcaaaa ctatgttata 480atattattaa aggaaaatac atattattta ggaggcgatg taatgagcaa ggtagcaata 540ataggatctg gttttgtagg tgcaacatcg gcatttacgc tggcattaag tgggactgtg 600acagatatcg tgctggtgga tttaaacaag gacaaggcta taggcgatgc actggacata 660agccatggca taccgctaat acagcctgta aatgtgtatg caggtgacta caaagatgtg 720aaaggcgcag atgtaatagt tgtgacagca ggtgctgctc aaaagccggg agagacacgg 780cttgaccttg taaagaaaaa tácagcçata tttaagtcca tgatacctga gcttttaaag 840tacaatgaca aggccatata tttgattgtg acaaatcccg tagatatact gacgtacgtt 900acatacaaga tttctggact tccatggggc agagtttttg gttctggcac cgttcttgac 960agctcaaggt ttagatacct tttaagcaag gactgctgca ggtcgataaa cccagcgaac 1020catttgaggt gataggtaag attataccga ggtatgaaaa cgagaattgg acctttacag 1080aattactcta tgaagcgcca tatttaaaaa gctaccaaga cgaagaggat gaagaggatg 1140aggaggcaga ttgccttgaa tatattgaca atactgataa gataatatat cttttatata 1200gaagatatcg ccgtátgtaa ggatttcagg gggcaaggca taggcagcgc gcttatcaat 1260atatctatag aatgggcaaa gcataaaaac ttgcatggac taatgcttga aacccaggac 1320aataacctta tagcttgtaa attctatcat aattgtggtt tcaaaatcgg ctccgtcgat 1380actatgttat acgccaactt tgaaaacaac tttgaaaaag ctgttttctg gtatttaagg 1440ttttagaatg caaggaacag tgaattggag ttcgtcttgt tataattagc ttcttggggt 1500atctttaaat actgtagaaa agaggaagga aataataaat ggcggatccc atgaacaaaa 1560atataaaata ttctcaaaac tttttaacga gtgaaaaagt actcaaccaa ataataaaac 1620aattgaattt aaaagaaacc gataccgttt acgaaattgg aacaggtaaa gggcatttaa 1680cgacgaaact ggctaaaata agtaaacagg taacgtctat tgaattagac agtcatctat 1740tcaacttatc gtcagaaaaa ttaaaactga atactcgtgt cactttaatt caccaagata 1800ttctacagtt tcaattccct aacaaacaga ggtataaaat tgttgggagt attccttacc 1860atttaagcac acaaattatt aaaaaagtgg tttttgaaag ccatgcgtct gacatctatc 1920tgattgttga agaaggattc tacaagcgta ccttggatat tcaccgaaca ctagggttgc 1980tcttgcacac tcaagtctcg attcagcaat tgcttaagct gccagcggaa tgctttcatc 2040ctaaaccaaa agtaaacagt gtcttaataa aacttacccg ccataccaca gatgttccag 2100ataaatattg gaagctatat acgtactttg tttcaaaatg ggtcaatcga gaatatcgtc 2160

aactgtttac taaaaatcag tttcatcaag caatgaaaca cgccaaagta aacaatttaa 2220

gtaccgttac ttatgagcaa gtattgtcta tttttaatag ttatctatta tttaacggga 2280

ggaaataatt ctatgagtcg cttttgtaaa tttggaaagt tacacgttac taaagggaat 2340

tctctagaca gagtttgcag catggagcat aacaaacata tcgggtatat catttaatga 2400

gtactgcagc atatgcggac gcgtctgcaa cacaaatttc agaaaggaag tagaagaaga 2460

agtcgtaaat gctgcttaca agataataga caaaaaaggt gctacatact atgctgtggc 2520

agttgcagta agaaggattg tggagtgcat cttaagagat gaaaattcca tcctcacagt 2 580

atcatctcca ttaaatggac agtacggcgt gaaagatgtt tcattaagct tgccatctat 2 640

cgtaggcagg aatggcgttg ccaggatttt ggacttgcct ttatctgacg aagaagtgga 2700

gaagtttagg cattcagcaa gtgtcatggc agatgtcata aaacaattag atatataatc 2760

aaattatgtt gggaggct 2778

<210> 10

<211> 3355

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Locus pta/ack de termoanaerobacterium Saccharolyticum nocaute

<220>

<221> propriedades mistas

<222> (2632)..(2634)

<223> η is a, c, g ou t

<22 0>

<221> propriedades mistas

<222> (3262)..(3265)

<223> η is a, c, g, ou t

<400> 10

agcgctgtac gaaattgcca ctcattacag ctacgacaaa gtctgctttt gtcatttcca 60

tagacttttt tatgtgatat acgtgcccat tgtgaagtgg attgtattct acaattaaac 120

ctaatacgct cataatatgc gcctttctaa aaaattatta attgtactta ttattttata 180

aaaaatatgt taaaatgtaa aatgtgtata caatatattt cttcttagta agaggaatgt 240

ataaaaataa atattttaaa ggaagggacg atcttatgag cattattcaa aacatcattg 300

aaaaagctaa aagcgataaa aagaaaattg ttctgccaga aggtgcagaa cccaggacat 360

taaaagctgc tgaaatagtt ttaaaagaag ggattgcaga tttagtgctt cttggaaatg 420

aagatgagat aagaaatgct gcaaaagact tggacatatc caaagctgaa atcattgacc 480

ctgtaaagtc tgaaatgttt gataggtatg ctaatgattt ctatgagtta aggaagaaca 540

aaggaatcac gttggaaaaa gccagagaaa caatcaagga taatatctat tttggatgta '600

tgatggttaa agaaggttat gctgatggat tggtatctgg cgctattcat gctactgcag 660atttattaag acctgcattt cagataatta aaacggctcc aggagcaaag atagtatcaa 720

gcttttttat aatggaagtg cctaattgtg aatatggtga aaatggtgta ttcttgtttg 780

ctgattgtgc ggtcaaccca tcgcctaatg cagaagaact tgcttctatt gccgtacaat 840

ctgctaatac tgcaaagaat ttgttgggct ttgaaccaaa agttgccatg ctatcatttt 900

ctacaaaagg tagtgcatca catgaattag tagataaagt aagaaaagcg acagagatag 960

caaaagaatt gatgccagat gttgctatcg acggtgaatt gcaattggat gctgctcttg 1020

ttaaagaagt tgcagagcta aaagcgccgg gaagcaaagt tgcgggatgt gcaaatgtgc 1080

ttatattccc tgatttacaa gctggtaata taggatataa gcttgtacag aggttagcta 1140

aggcaaatgc aattggacct ataacacaag gaatgggtgc aggtcgataa acccagcgaa 1200

ccatttgagg tgataggtaa gattataccg aggtatgaaa acgagaattg gacctttaca 1260

gaattactct atgaagcgcc atatttaaaa agctaccaag acgaagagga tgaagaggat 1320

gaggaggcag attgccttga atatattgac aatactgata agataatata tcttttatat 13 80

agaagatatc gccgtatgta aggatttcag ggggcaaggc ataggcagcg cgcttatcaa 1440

tatatctata gaatgggcaa agcataaaaa cttgcatgga ctaatgcttg aaacccagga 1500

caataacctt atagcttgta aattctatca taattgtggt ttcaaaatcg gctccgtcga 1560

tactatgtta tacgccaact ttgaaaacaa ctttgaaaaa gctgttttct ggtatttaag 1620

gttttagaat gcaaggaacà gtgaattgga gttcgtcttg ttataattag cttcttgggg 1680

tatctttaaa tactgtagaa aagaggaagg aaataataaa tggctaaaat gagaatatca 1740

ccggaattga aaaaactgat cgaaaaatac cgctgcgtaa aagatacgga aggaatgtct 1800

cctgctaagg tatataagct ggtgggagaa aatgaaaacc tatatttaaa aatgacggac 1860

agccggtata aagggaccac ctatgatgtg gaacgggaaa aggacatgat gctatggctg 1920

gaaggaaagc tgcctgttcc aaaggtcctg cactttgaac ggcatgatgg ctggagcaalt 1980

ctgctcatga gtgaggccga tggcgtcctt tgctcggaag agtatgaaga tgaacaaagc 2040

cctgaaaaga ttatcgagct gtatgcggag tgcatcaggc tctttcactc catcgacata 2100

tcggattgtc cctatacgaa tagcttagac agccgcttag ccgaattgga ttacttactg 2160

aataacgatc tggacgatgt ggattgcgaa aactgggaag aagacactcc atttaaagat 2220

ccgcgcgagc tgtatgattt tttaaagacg gaaaagcccg aagaggaact tgtcttttcc 2280

cacggcgacc tgggagacag caacatcttt gtgaaagatg gcaaagtaag tggctttatt 2340

gatcttggga gaagcggcag ggcggacaag tggtatgaca ttgccttctg cgtccggtcg 2400

atcagggagg atatcgggga agaacagtat gtcgagctat tttttgactt actggggatc 2460

aagcctgatt gggagaaaat aaaaaaatat attttactgg atgaattgtt ttagtaccta 2520

gatttagatg tctaaaaagc tttaactaca agctttttag acatctaatc ttttctgaag 2580

tacatccgca actgtccata ctctgatgtt ttatatcttt tctaaaagtt cgnctàgata 264Òggggtcccga gcgcctacga ggaatttgta tcgactctag agcatagaat atagctccaç 2700

tgcacaatcc tgctaatata gaaggaatta aagcttgcca gcaaatcatg ccaaacgttc 2760

caatggtggc ggtatttgat acagcctttc atcagacaat gcctgattat gcatatcttt 2 820

atccaatacc ttatgaatac tacacaaagt acaggattag aagatatgga tttcatggca 2 880

catcgcataa atatgtttca aatagggctg cagagatttt gaataaacct attgaagatt 2 940

tgaaaatcat aacttgtcat cttggaaatg gctccagcat tgctgctgtc aaatatggta 3000

aatcaattga cacaagcatg ggatttacac cattagaagg tttggctatg ggtacacgat 3060

ctggaagcat agacccatcc atcatttcgt atcttatgga aaaagaaaat ataagcgctg 3120

aagaagtagt aaatatatta aataaaaaat ctggtgttta cggtatttca ggaataagca 3180

gcgattttag agacttagaa gatgccgcct ttaaaaatgg âgatgaaaga gctcagttgg 3240

ctttaaatgt gtttgcatat cgangtaaag aagacgattg gcgcttatgc agcagactat 3300

gggaggcgtc gatgtcattg tatttacagc aggtgtgggt tggaaaatgg gtcca 3355

Claims

1. Organismo isolado que fermenta um substrato celulolítico paraproduzir etanol em uma concentração que é no mínimo 90% de uma produ-ção teórica, em que o organismo não expressa piruvato decarboxilase.

2. Método para produzir etanol, o referido método compreen-dendo:transformar um organismo nativo para produzir o organismo iso-lado como definido na reivindicação 1 para proporcionar um hospedeirotransformado; ecultivar o hospedeiro transformado em meio que contém umsubstrato incluindo um material selecionado entre o grupo consistindo emglicose, xilose, manose, arabinose, galactose, frutose, celobiose, sacarose,maltose, xilano, manano, amido, e combinações dos mesmos sob condiçõesadequadas por um período de tempo suficiente para possibilitar a sacarifica-ção e fermentação do substrato.

3. Organismo transformado compreendendo, uma bactériaGram-positiva que em um estado nativo contém no mínimo um gene o qualconfere à bactéria Gram-positiva a capacidade de produzir ácido acéticocomo um produto de fermentação, a bactéria Gram-positiva sendo transfor-mada para eliminar expressão do no mínimo um gene.

4. Bactéria Gram-positiva como definida na reivindicação 3, emque a bactéria Gram-positiva é um membro do gênero Thermoanaerobacter.

5. Bactéria Gram-positiva como definida na reivindicação 3, emque a bactéria Gram-positiva é um Thermoanaerobacterium saccharolyticum.

6. Bactéria Gram-positiva como definida na reivindicação 3, emque o no mínimo um gene codifica para expressão de acetato quinase.

7. Bactéria Gram-positiva como definida na reivindicação 3, emque o no mínimo um gene codifica para a expressão de fosfotransacetilase.

8. Bactéria Gram-positiva como definida na reivindicação 3, emque o no mínimo um gene inclui uma pluralidade de genes.

9. Bactéria Gram-positiva de acordo com a reivindicação 8, emque a pluralidade de genes codifica para expressão de acetato quinase efosfotransacetilase.

10. Bactéria Gram-positiva de acordo com a reivindicação 9, adi-cionalmente transformada para eliminar expressão de um ou mais genesque conferem à bactéria Gram-positiva a capacidade de produzir ácido lácti-co como um produto de fermentação.

11. Bactéria Gram-positiva como definida na reivindicação 3,adicionalmente transformada para eliminar expressão de um ou mais genesque conferem à bactéria Gram-positiva a capacidade de produzir ácido lácti-co como um produto de fermentação.

12. Bactéria Gram-positiva de acordo com a reivindicação 11,em que o no mínimo um gene codifica para a expressão de lactato deidro-genase.

13. Método para produzir etanol, o referido método compreen-dendo:transformar um organismo nativo para produzir a bactéria Gram-positiva de acordo com a reivindicação 11 para produzir um hospedeiro bac-teriano transformado; ecultivar o hospedeiro bacteriano transformado em meio que con-tém um substrato incluindo um material selecionado entre o grupo consistin-do em glicose, xilose, manose, arabinose, galactose, frutose, celobiose, sa-carose, maltose, xilano, manano, amido, e combinações dos mesmos sobcondições adequadas por um período de tempo suficiente para possibilitar asacarificação e fermentação do substrato.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que o referidohospedeiro bacteriano é um Thermoanaerobacterium saccharolyticum.

15. Método de acordo com a reivindicação 13, em que os genescodificam para a expressão de lactato deidrogenase, acetato quinase, e fos-fotransacetilase.

16. Cultura biologicamente pura de um microorganismo desig-nado ALK1 e depositado sob a Designação de Depósito de Patente N° PTA-7206.

17. Polinucleotídeo isolado compreendendo:(a) uma seqüência de SEQ ID NO: 10;(b) uma seqüência de SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10; ou(c) uma seqüência tendo no mínimo cerca de 90% de identidadede seqüência com a seqüência de (a) ou (b).

18. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 17, tendocerca de 95% de identidade de seqüência com a seqüência de (a) ou (b).

19. Vetor compreendendo o polinucleotídeo isolado como defini-do na reivindicação 18.

20. Célula hospedeira produzida por engenharia genética paraexpressar um complemento do polinucleotídeo como definido na reivindica-ção 18.

21. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 20, em quea célula hospedeira é uma célula bacteriana.

22. Método para produzir etanol compreendendo a etapa de:cultivar uma bactéria mutante como definida na reivindicação 21em meio contendo um substrato selecionado entre o grupo consistindo emglicose, xilose, manose, arabinose, galactose, frutose, celobiose, sacarose,maltose, xilano, manano, amido, e combinações dos mesmos sob condiçõesadequadas por um período de tempo suficiente para possibilitar fermentaçãodo substrato para etanol.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, em que a bactériamutante é Thermoanaerobacterium saccharolyticum.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, em que a bactériamutante é Thermoanaerobacterium saccharolyticum ALK1 (JW/SL-YS485ALK1).

25. Constructo genético compreendendo SEQ ID NO: 10 conec-tado operavelmente a um promotor expressível em uma bactéria.

26. Bactéria recombinante compreendendo o constructo genéti-co como definido na reivindicação 25.

27. Bactéria recombinante de acordo com a reivindicação 26, emque a referida bactéria é Thermoanaerobacterium saccharolyticum.