JP2009065982A - エタノール産生 - Google Patents

Abstract

【課題】エタノール産生に関する、相同的組換えに基づいた遺伝子不活性化および遺伝子発現の新規の方法を提供する。
【解決手段】プラスミドおよび天然乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子内の挿入因子（ＩＥ）配列の相同的組換えに基づくプラスミド組込み方法を用いた乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子突然変異の安定化により、エタノール産生特性が強化されたグラム陽性細菌を用いる。
【選択図】なし

Description

本発明は、細菌発酵の産物としてのエタノールの産生に関する。特に本発明は、相同的組換えに基づいた遺伝子不活性化および遺伝子発現の新規の方法に関する。

多くの細菌は、解糖の過程を介して単一糖を酸性および中性発酵産物の混合物に代謝する自然能力を有する。解糖は、六炭素であるグルコース分子が、多数の中間体を経て、２分子の三炭素化合物であるピルビン酸に分解する一連の酵素系である。多数の細菌の解糖経路は、共通の中間体としてピルビン酸を生成する。ピルビン酸がさらに代謝されると、発酵産物として一般的に既知である最終産生物ＮＡＤＨおよびＡＴＰ、ならびに老廃物を生じる。好気性条件下では、解糖から産生されたピルビン酸の約９５％が、酸化代謝を介してＮＡＤ⁺を再生するよう作用する多数の短い代謝経路において消費されるが、この場合、ＮＡＤＨは典型的には酸化され、酸素への一連の段階を経て水素等価物を供与し、それにより、連続解糖およびＡＴＰ産生のための必須要件である水を生成する。

嫌気性条件下では、ほとんどのＡＴＰが解糖により生成される。その他のＡＴＰも、有機酸、例えば酢酸の産生中に再生され得る。ＮＡＤ⁺は、有機基質、例えばピルビン酸またはアセチルＣｏＡの還元中にＮＡＤＨから再生される。したがって解糖およびピルビン酸代謝の発酵産物としては、有機酸、例えば乳酸、ギ酸および酢酸、ならびに中性産物、例えばエタノールが挙げられる。

大多数の通性嫌気性細菌は、好気性または嫌気性条件下のいずれにおいてもエタノールを高収率で産生しない。ほとんどの通性嫌気性生物は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）およびトリカルボン酸回路（ＴＣＡ）を経て好気的にピルビン酸を代謝する。嫌気性条件下では、ピルビン酸を代謝するための主エネルギー経路は、ピルビン酸−ギ酸−リアーゼ（ＰＦＬ）経路を介して、ギ酸およびアセチル−ＣｏＡを生じる。次にアセチル−ＣｏＡは、ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）および酢酸キナーゼ（ＡＫ）により酢酸に変換されるとともに、ＡＴＰを同時産生し、あるいはアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡｃＤＨ）およびアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）によりエタノールに還元される。還元等価物の平衡を維持するために、ピルビン酸の乳酸への還元中に、解糖から産生される余分量のＮＡＤＨがＮＡＤ⁺に、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）により再酸化される。ＮＡＤＨは、アセチル−ＣｏＡのエタノールへの還元中に、ＡｃＤＨおよびＡＤＨによっても再酸化され得るが、これは機能性ＬＤＨを有する細胞中では重要でない反応である。したがって、ほとんどのアセチルＣｏＡが酢酸に変換されてＡＴＰを再生し、解糖中に産生される余分量のＮＡＤＨはＬＤＨにより酸化されるため、エタノールの理論的収率は達成されない。

エタノール産生性微生物、例えばザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）および酵母は、一般的にアルコール発酵と呼ばれる第二の種類の嫌気性発酵をし得るが、この場合、ピルビン酸は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）によりアセトアルデヒドとＣＯ₂に代謝される。アセトアルデヒドは次に、ＡＤＨによりエタノールに還元されて、ＮＡＤ⁺を再生する。アルコール発酵は、１分子のグルコースを２分子のエタノールおよび２分子のＣＯ₂へ代謝させる。ザイモモナス・モビリスにおいてこれらの酵素の両方をコードするＤＮＡが単離され、該ＤＮＡは上記の合成経路によりエタノールを高収率で産生することができる宿主中にクローニングされ、組換え的に発現される。例えば米国特許第５，０００，０００号およびIngram et al (1997) Biotechnology and Bioengineering 58, Nos. 2 and 3は、ザイモモナス・モビリス由来のＰＤＣ（ｐｄｃ）およびＡＤＨ
（ａｄｈ）の両方をコードする遺伝子が「ｐｅｔ」オペロン中に組み込まれ、これは、Ｅ．ｃｏｌｉ株を形質転換するのに使用することができ、ザイモモナス・モビリスｐｄｃおよびａｄｈを同時発現することができる組換えＥ．ｃｏｌｉの生成をもたらすことを示した。これは、好気性および嫌気性両条件下での増殖中に、Ｅ．ｃｏｌｉの代謝の中心をピルビン酸からエタノールに再誘導する合成経路の形成をもたらす。同様に、米国特許第５，５５４，５２０号は、ザイモモナス・モビリス由来のｐｄｃおよびａｄｈがともに、ｐｅｔオペロンの使用により組み込まれ、グラム陰性組換え宿主を生成することができ、これらの例としてはエルウィニア（Erwina）種、クレブシエラ（Klebsiella）種およびキサントモナス（Xanthomonas）種が挙げられ、その各々がザイモモナス・モビリスの異種遺伝子を発現して、ピルビン酸からエタノールへの合成経路によりエタノールを高収率で産生できることを開示する。

米国特許第５４８２８４６号は、ＰＤＣ酵素およびＡＤＨ酵素の両方をコードする異種遺伝子を用いて中温性グラム陽性バシラスエスピーを同時形質転換し、該形質転換した細菌が一次発酵産物としてエタノールを産生することを開示する。ｐｄｃ遺伝子単独で形質転換された細菌がエタノールを産生するという示唆はない。

欧州特許第Ａ−０７６１８１５号は、胞子形成遺伝子をバシラス・ツレンギエンシス（Bacillus thurengiensis）中に挿入する相同的組換え方法を記載する。

欧州特許第Ａ−０６０３４１６号は、任意の遺伝子をデルブリュック乳酸桿菌（Lactobacillus delbrueckii）中に挿入する相同的組換え方法を開示する。

欧州特許第Ａ−０４１５２９７号は、突然変異プロテアーゼを発現するバシラス属株の産生方法を記載する。

Biwas等（J. Bacteriol., 175, 3628-3635, 1993）は、相同的組換え方法により、プラスミドを保持する改変コピーにより置換された染色体遺伝子を有するラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）を記載する。本方法は熱感受性プラスミドを使用するため、好熱性細菌を形質転換するために用いることはできない。

生物触媒を用いたエタノールの産生における重要な改良は、高温で機能する好熱性微生物を用いることにより達成され得る。炭水化物のエタノールへの変換速度は、より速くなる。例えば好熱性バシラス属におけるエタノール産生性は、３０℃で機能する従来の酵母発酵プロセスより１０倍まで速くなる。したがって、所定の容量の生産性に必要な製造プラントはより小規模であり、それによりプラント構築コストを低減することができる。高温では、他の微生物が発酵槽中に夾雑する危険性が低減して、非稼動時間が減少し、プラント生産性が増大し、供給原料を滅菌するためのエネルギー必要量が低減しうる。さらに、発酵冷却は必要でなく、作業コストをさらに低減することができる。発酵熱は、エタノールを蒸発させるのに用いることができ、ほとんどの細菌発酵に伴う共通の問題である、高エタノール濃度により増殖が阻害される可能性を低減する。発酵槽ヘッドスペースでのエタノール蒸発は生成物の回収も容易にする。

本発明者等の菌株は、天然コンポスト（composting）生物体である天然型単離物から生じ、伝統的中温性微生物よりも、農業的原料中に見出される糖をエタノールに変換することに、はるかに適している。基礎となる菌株は、ヘキソースおよびペントース糖ならびにセロビオースをエタノールに変換するためのすべての遺伝子機構を保持する。本発明者等
は、エタノール収率を増大するために、単にＬＤＨ経路を遮断した。このプロセスは自己クローニングと呼ばれ、外来性ＤＮＡの発現を含まない。したがってその結果生じる生物体は、遺伝的改変生物体（ＧＭＯ）の使用に課せられる安全性のための規制を受けない。

対照的に、慣用的生物触媒は、ペントース糖を利用することはできないがエタノール産生性は良好である株、またはペントース糖を利用することができるがエタノール産生性は悪い株である。これらの生物体を、複雑な遺伝子技法を用いて遺伝的に改変し、ヘキソースおよびペントース糖の両方をエタノールに変換できるようにした。しかしながら、これらの組換え生物体の安定性については疑いがあり、かつこのような生物体はＧＭＯ安全性規制を受けるため、安全性に関する懸念がある。さらに、組換え中温菌は高価な栄養要求性を有し、高塩濃度および原料阻害剤に対して感受性である。

乳酸生成をもたらす代謝反応（ＬＤＨ経路）は化学的突然変異誘発により遮断され、その結果生じるＴＮ株は乳酸陰性であり、高収率でエタノールを産生する。しかしながら突然変異株は不安定で、自発的に乳酸産生天然型に復帰する。復帰体は、低ｐＨかつ高糖濃度の条件下において突然変異体より速く増殖するため、連続培養をしている間に、急速に「乗っ取り（take-over）」をする。「乗っ取り」が起こると、主発酵産物はエタノールから乳酸に変わる。

本発明者等は、安定性の問題に取り組み、エタノール産生に関与する遺伝子系へのより良好な洞察を得るために、分子生物学プログラムを用いた。本発明者等はまず、生物体を特定的に操作するための遺伝子技法、さらに連続培養で選択された遺伝子操作を受け入れる胞子形成欠陥性突然変異体を開発した。本発明者等は次に、いくつかの重要な代謝遺伝子、即ち乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈ）、乳酸パーミアーゼ（ｌｐ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈ）およびｌｄｈ遺伝子内に位置する新規の挿入配列をシーケンシングした。化学的に突然変異した菌株由来のｌｄｈ遺伝子のＤＮＡ配列分析は、遺伝子のコード領域において天然に存在する挿入配列因子（ＩＥ）（ＩＳ因子とも称する）を挿入することにより遺伝子が不活性化されていたことを明らかにした。ｌｄｈ遺伝子への（からの）転位およびそれに続く遺伝子不活性化は、それ自体不安定であり、復帰する。

ｌｄｈ遺伝子内のＩＥ配列は相同的組換えのための大領域を提供することを本発明者等は確定した。したがって、ｌｄｈ突然変異の安定性は、ＴＮ株のｌｄｈ遺伝子内の既存のＩＥ配列中にプラスミドＤＮＡを組込むことにより改良され得ることが提唱された。

ｌｄｈ遺伝子の安定性は、ｌｄｈ遺伝子内のプラスミドおよび挿入配列の間における特定の相同的組換えにより改良された。その結果生じた菌株は、連続培養においてエタノール産生特性の改良を示す胞子形成欠陥性株であって、通性嫌気性のグラム陽性バシラス属である。結果として、この新規の種類の突然変異体は完全に安定であり、化学的突然変異誘発により生成される一次突然変異体より優れた増殖特性およびエタノール産生性を有することを示す。

菌株の改良は、相同的組換えに基づいた新規の遺伝子組込み方法により達成された。組込みの部位および組換えのためのプラスミドは、天然遺伝子または異種遺伝子を組込みかつ過剰発現するためにも用いられ得る。

サザンハイブリダイゼーション試験によって、転位性挿入配列因子（ＩＥ）の３つのコピーがバシラス菌種ＬＬＤ−Ｒの染色体上に存在することが明らかになった。挿入配列は３．２ｋｂ長であり、潜在的にタンパク質に翻訳可能である３つのＤＮＡオープンリーディングフレーム配列（ＯＲＦ）を含む。ＯＲＦ１は、National Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）データベース（www.ncbi.nlm.nih.gov/）中のいかなるタンパ
ク質とも相同性を示さないが、ｉｓｔＡおよびｉｓｔＢは既知のトランスポゼース酵素のファミリーと有位の相同性を示す。バシラス属株ＴＮを、化学突然変異誘発により得られるＬＬＤ−Ｒから開発し（図９Ａおよび図９Ｂ）、挿入配列の１つのコピーが構造ｌｄｈ遺伝子内に見出され、ｌｄｈ遺伝子の不活性化および乳酸陰性表現型を生じ、それにより発酵の主要代謝産物が乳酸からエタノールに変わった。ｌｄｈ遺伝子のＤＮＡ配列およびバシラス属株ＴＮからのＩＥ配列（下線）を、図１に示す。Ｌ−ＬＤＨのアミノ酸配列を図１１に示す。

しかしながらこの挿入は比較的不安定であることが明らかであり、突然変異株ＴＮは機能的ｌｄｈ遺伝子を保持する菌株ＴＮ−Ｒに自発的に復帰する。図２に示すようにバシラス属突然変異株ＴＮは遺伝的不安定性を有するため、発酵の主要代謝産物はエタノールから乳酸に変わる。

ＰＣＲにより、ＴＮ染色体ＤＮＡからＩＥ配列を増幅した。挿入配列と隣接したｌｄｈ遺伝子配列からプライマーを選択し、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を上流プライマー中に導入し、かつＸｂａＩ制限部位を下流プライマー中に導入して、プラスミドｐＵＢＵＣ中へのその後のクローニングにとって都合のよい制限部位を作製した。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて、挿入配列を含む３．２ｋｂのＰＣＲ断片をトリミングし、その後、プラスミドｐＵＢＵＣ中にクローニングして、プラスミドｐＵＢＵＣ−ＩＥを得た（図５）。

バシラスエスピーを形質転換した後のプラスミドＤＮＡの制限を妨げるためのプラスミドＤＮＡのｉｎ ｖｉｖｏメチル化は、プラスミドｐＭＥＴＨを保有するＥ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０細胞中での形質転換及び増殖、ならびにそれからの精製をした後に行った。次にメチル化したｐＵＢＵＣ−ＩＥを用いて、バシラス属株ＴＮを形質転換した。５２℃でＴＧＰ寒天プレート（カナマイシン）上で、形質転換体をまず単離した。次に、ｌｄｈ遺伝子のＰＣＲ増幅を用いて、形質転換体をスクリーニングした。ＬＤＨプライマーを用いたＰＣＲ産物（設定ＰＣＲ条件を用いた場合１０ｋｂより大きい）の増幅ができないことは、プラスミドの少なくとも１つのコピーが染色体中に組み込まれたことを示唆した。

菌株安定性に関して検査するために、カナマイシン選択を伴わない連続培養において、ｐＨ制御条件下で、新規の菌株ＴＮ−Ｔ９を増殖した。残留糖が発酵培地内に存在するような、復帰を促進する条件である最適下限の発酵条件下で、菌株ＴＮ−Ｔ９の安定性を確証した。発酵培地内の残留糖の存在、ピルビン酸排出ならびに設定条件からの多くの逸脱にもかかわらず、乳酸産生のいかなる痕跡もなく、発酵が７５０時間続いた。エタノールは発酵を通して比較的大量に産生された（図４）が、これは、菌株ＴＮ−Ｔ９におけるｌｄｈ遺伝子突然変異が提供された実験条件下での連続培養において安定であることを示す。

本発明者等は、バシラス属株ＴＮ−９に関する細胞増殖およびエタノール産生のための発酵条件も最適化した。

要約すると、任意にｐｄｃ／ａｄｈオペロンを用いてｐｄｃおよびａｄｈ遺伝子を発現しながら、ｌｄｈ突然変異体の安定性を改良するための二重系を、本発明者等は開発した。さらに本発明者等は、新規のｌｄｈ遺伝子および挿入配列因子、ならびに新規の乳酸パーミアーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を単離し、シーケンシングした。さらに本発明者等は、染色体中へのプラスミドＤＮＡの組込み、および組換えバシラスエスピーを選択するための技法を開発し、細菌発酵によるエタノール産生のための一組の最適化条件を開発した。

したがって、本発明の第１の態様は、遺伝子突然変異を安定化し、かつ発現可能遺伝子を挿入するための相同的組換え方法を用いて形質転換された、組換え好熱性グラム陽性細菌に関する。

本発明は、プラスミドおよび細菌の染色体ＤＮＡとの間の相同的組換えにより、ｌｄｈ突然変異の安定性が高められている組換え好熱性グラム陽性細菌であって、細菌発酵の産物としてエタノールを産生する菌株を生じさせる組換え好熱性グラム陽性細菌も提供する。

好ましくは、グラム陽性細菌はバシラス・サーモグルコシダシウスの菌株である。

好ましくはグラム陽性細菌は、図１に記述されたようなＩＥ配列、またはその機能的部分もしくは変異体を保持するプラスミドによって形質転換されている。好適には、図１のＩＥ配列、またはその機能的変異体もしくは一部分は、相同的組換えにより、組換え細菌の染色体中に安定的に組み込まれる。

好ましくは、組換え細菌の染色体中へのＩＥ配列の組込みは、自然ｌｄｈ遺伝子の不活性化を生じる。

好ましくはグラム陽性細菌は、バシラス属株ＴＮ−Ｔ９（ＮＣＩＭＢ受託番号ＮＣＩＭＢ４１０７５（ブダペスト条約の約定に従って２０００年９月８日に寄託された））である。

あるいは、グラム陽性細菌は、バシラス属株ＴＮ−ＴＫ（ＮＣＩＭＢ受託番号ＮＣＩＭＢ４１１１５（ブダペスト条約の約定に従って２００１年９月２７日に寄託された））であるのが好ましい。

本発明は、カナマイシン感受性であるＴＮ−Ｔ９の突然変異体を選択することにより得られるグラム陽性細菌にも関する。このような菌株を得るための適切な方法は、併記の実施例に記載されている。

好ましくは、グラム陽性細菌は胞子形成欠陥性である。

本発明の第２の態様によれば、天然ｌｄｈ遺伝子が相同的組換えにより不活性化され、かつ１つまたは複数の発現可能遺伝子が細菌の染色体ＤＮＡ中に挿入されたグラム陽性細菌が提供される。さらに、遺伝子発現は、１回または反復回の組込みの結果として、挿入配列中にプラスミドを多重挿入した後、遺伝子コピー数を増大することにより増大され得る。

１つまたは複数の発現可能遺伝子は、細菌の染色体ＤＮＡ中に存在する１つまたは複数のＩＥ配列中に挿入することができる。例えば、菌株ＴＮ−Ｔ９およびＴＮ−ＴＫの染色体上には３つのＩＥ配列が存在する。

発現される遺伝子は、アルコールデヒドロゲナーゼのようにバシラスにとって天然遺伝子でも、あるいは外来性遺伝子（即ちザイモモナス・モビリス由来のピルビン酸デカルボキシラーゼおよびバシラス・ステアロサーモフィルスからのα−アミラーゼのような異種遺伝子）でもよい。遺伝子は、同一転写制御下で１のオペロン中に配列され得る。遺伝子発現は、遺伝子のコピー数を操作することにより、かつ異なる転写プロモーター配列を用いることにより調節することができる。

好ましくは、１つまたは複数の遺伝子はｐｄｃおよび／またはａｄｈである。

ａｄｈのアミノ酸配列は、図１２に示されている。

本発明の第３の態様によれば、相同的組換えにより、天然ｌｄｈ遺伝子を不活性化し、かつ１つまたは複数の発現可能遺伝子を細菌の染色体中に挿入する方法が提供される。

好ましくは、細菌は好熱性グラム陽性細菌である。

好ましくは、不活性化される遺伝子は天然ｌｄｈ遺伝子であり、１つまたは複数の発現可能遺伝子はｐｄｃ遺伝子およびａｄｈ遺伝子である。

好ましくは、ｐｄｃ遺伝子およびａｄｈ遺伝子は、同一プラスミド上で、図１のＩＥ配列に作動的に連結されたＰＤＣオペロンの一部を形成する。

好ましくは、ｐｄｃ遺伝子は、細胞に対して異種である。

好ましくは、図１のＩＥ配列、およびＰＤＣオペロンまたはその一部分はともに、細菌の染色体中に安定的に組み込まれる。

好適には、遺伝子の不活性化および発現の方法は、５４℃までの温度でＥ．ｃｏｌｉおよびバシラス属株中で複製することができる、図５に記載されるようなシャトルベクターの使用を含む。

本発明の第４の態様によれば、バシラス属株ＴＮ由来のシャトルベクターであって、５４℃までの温度でＥ．ｃｏｌｉおよびバシラスエスピーの両方において複製することができ、アンピシリンおよびカナマイシンに対する耐性を付与し、図１に記載されたＩＥ配列またはその一部分を保持するシャトルベクターが提供される。

好ましくは、シャトルベクターは、図５に記載されたｐＵＢＵＣ−ＩＥである。

好ましくは、シャトルベクターは、ｌｄｈプロモーターの制御下にあるｐｄｃ遺伝子およびａｄｈ遺伝子を含み、かつ図１に記載されたＩＥ配列に作動可能に連結されたＰＤＣオペロンを含む。

本発明の第５の態様によれば、相同的組換えによりプラスミドＤＮＡが組換え細菌のｌｄｈ遺伝子中に安定的に組み込まれた組換えバシラスエスピーを高温にて選択する方法であって、ＰＣＲを用いて天然ｌｄｈ遺伝子およびＩＥ配列を含まない組換え体を選択するための選択方法が提供される。

好ましくは、ｌｄｈ遺伝子中に挿入配列が組込まれたことが、組換え細菌のｌｄｈ遺伝子からＰＣＲ産物を増幅できないことにより明らかにされる。

本発明は、図１に示されたヌクレオチド６５２〜ヌクレオチド３８００までの配列、またはその機能的変異体もしくは一部分によりコードされる１つまたは複数のポリペプチドであって、トランスポゼースの生物学的活性を有する１つまたは複数のポリペプチドも提供する。

１つまたは複数のポリペプチドは、単独でまたは他のポリペプチドと組み合わされた場合に、トランスポゼースの生物学的活性を有し得る。

好ましくは、１つまたは複数のポリペプチドは、図１３、図１４または図１５に示されるアミノ酸配列、あるいはその機能的部分または変異体を有する。

機能的部分または変異体は、図１３、図１４または図１５に示されるポリペプチドのトランスポゼース機能の少なくとも一部分を保持する。好ましくは、その部分は少なくとも２０アミノ酸長、より好ましくは少なくとも５０アミノ酸長である。さらに、変異体は、図１３、図１４または図１５に示されるポリペプチドと少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、もっとも好ましくは少なくとも９５％の配列相同性を有するのが好ましい。相同性は、好ましくはＢＬＡＳＴプログラムを用いて測定される。

本発明の第６の態様によれば、酵素乳酸デヒドロゲナーゼの生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、図６に記載されたＤＮＡ配列またはその機能的変異体が提供される。

本発明の第７の態様によれば、酵素乳酸パーミアーゼの生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、図７Ｂに記載されたＤＮＡ配列またはその機能的変異体が提供される。

本発明の第８の態様によれば、酵素アルコールデヒドロゲナーゼの生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、図８に記載されたＤＮＡ配列またはその機能的変異体が提供される。

本明細書中では、機能的変異体とは、配列付加、欠失もしくは置換の結果として、または遺伝暗号の縮重によって、乳酸デヒドロゲナーゼ、乳酸パーミアーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドとハイブリダイズするＤＮＡ配列および／または該ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む。好ましくは変異体は、図に示される配列と少なくとも８０％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは９５％の配列相同性を有する。相同性は、好ましくはＢＬＡＳＴプログラムを用いて測定される。

本発明の第９の態様は、ｌｄｈ突然変異体の安定性を改良する方法であって、ｐｄｃ／ａｄｈオペロンを用いて遺伝子を発現することを含む改良方法も提供する。

本発明の第１０の態様は、本発明による組換えバシラスエスピーの組込み、および選択のための技法に関する。

本発明の最後の第１１の態様によれば、本発明に係るグラム陽性細菌の細菌発酵によるエタノールの産生方法であって、細胞増殖およびエタノール産生のためのｐＨ、温度、酸化還元値および特定希釈速度の最適化発酵条件を含む産生方法が提供される。好ましくは発酵条件は、ｐＨ５．５〜７．５のｐＨ範囲、４０〜７５℃の温度範囲、−３６０〜−４００ｍＶである酸化還元値、ならびに０．３〜０．８ｈ^-1の希釈速度を包含する。

ここで、本発明による組換え細菌の産生を、図面を参照しながら、例示のみの目的で記載する。

材料および方法
プラスミドｐＵＢＵＣの構築
プラスミドｐＵＣ１８およびｐＵＢ１１０を融合することにより、Ｅ．ｃｏｌｉ、および本発明に係る好熱性バシラス属株の間でＤＮＡを転移することができるシャトルベクタ
ーを開発した。プラスミドｐＵＢ１１０は、カナマイシンに対する耐性を付与し、５４℃までの温度で、バシラス・ステアロサーモフィルス中で複製することができ、黄色ブドウ球菌（Staphyloccocus aureus）から単離された、広範に用いられるベクターである（Narumi et al., 1992, Biotechnology Techniques 6, No.1）。プラスミドｐＵＢ１１０およびｐＵＣ１８を、ＥｃｏＲ１およびＢａｍＨ１を用いて線状化し、次に一緒に連結して、ｐＵＢＵＣ（６．４ｋｂ）を作製した。プラスミドｐＵＢＵＣは温度感受性レプリコンを有し、５４℃より高い温度では複製することができず、このことがプラスミドｐＵＢＵＣを、高温での相同的組換えによる遺伝子組込みのための理想的宿主にしている。

プラスミドｐＭＥＴＨの構築
ＰＣＲにより、エジプトヘモフィルス（Haemophilus aeygptius）染色体ＤＮＡから、ｍｅｔ遺伝子を含む１．１ｋｂ断片を増幅した。ＤＮＡシーケンシングにより遺伝子を確認した。ｍｅｔ遺伝子をＢａｍＨＩおよびＸｂａＩを用いてトリミングし、次に、あらかじめＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで線状化しておいた発現プラスミドｐＣＬ１９２０中でサブクローニングした。その結果生じたプラスミドｐＭＥＴＨを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０中に形質転換させた。Tang et al(1994) Nuc. Acid Res. 22(14)に記載された方法を用いて、ｐＭＥＴＨを保持するＥ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０細胞を増殖させ、その後の形質転換およびｉｎ ｖｉｖｏメチル化するために培養を収集した。形質転換する前に、コンピテント細胞を−７０℃で適宜に、アリコート中に保存した。

ＰＣＲ増幅
プライマーＬＤＨ７およびＬＤＨ８を用いて、ＰＣＲにより、ＴＮ染色体ＤＮＡからＩＥ配列を増幅した。使用した反応体の濃度、およびＰＣＲ手法は、Expand（登録商標） High Fidelity PCR System(Roche Diagnostics)で推奨されたものであった。凍結乾燥細胞からのＰＣＲ増幅は、Ｇｅｎｉｕｓサーモサイクラー（Techne, Ltd., Cambridge）で、３０サイクルした後に達成された。上流プライマーＬＤＨ７の配列は、５’−ＡＡＧＣＴＴ ＧＡＴ ＧＡＡ ＡＴＣ ＣＧＧ ＡＴＴ ＴＧＡ ＴＧＧ−３’であり、下流プライマーＬＤＨ８の配列は、５’−ＴＣＴＡＧＡ ＧＣＴ ＡＡＡ ＴＴＴ ＣＣＡ ＡＧＴ ＡＧＣ−３’であった。これらのプライマーは、挿入配列と隣接するｌｄｈ遺伝子配列から選択した。ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を上流プライマー中に導入し、ＸｂａＩ制限部位を下流プライマーに導入して、その後のクローニングに都合のよい制限部位を作製した（導入部位に下線を付した）。

プラスミドｐＵＢＵＣ−ＩＥの構築
標準手法（Maniatis）を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプラスミドＤＮＡの操作、形質転換および単離を実施した。挿入配列を含む３．２ｋｂＰＣＲ断片を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩでトリミングし、次にプラスミドｐＵＢＵＣ中にクローニングした。その結果生じたｐＵＢＵＣ−ＩＥと称するシャトルプラスミド（図５）は、５４℃までの温度でＥ．ｃｏｌｉおよびバシラス属株中で複製することができ、アンピシリンおよびカナマイシンに対する耐性を付与し、バシラス属株ＴＮ由来のＩＥ配列を保持し得る

ＰＤＣオペロンの構築
バシラス属株ＴＮは、ＰＦＬまたはＰＤＨ経路を介して、細胞内代謝物質であるピルビン酸をアセチル−ＣｏＡに変換する。次にアセチル−ＣｏＡは、ＡｃＤＨによる触媒反応によってアセトアルデヒドに、さらにＡＤＨによる触媒反応によって、エタノールに還元される。外来ＰＤＣ酵素を導入することによって、ＰＤＣによるピルビン酸の脱カルボキシル化が起こり、アセトアルデヒドが生成し、さらにアセトアルデヒドが天然ＡＤＨ酵素によりエタノールに還元されることを含む、エタノール産生のための代替的経路を細胞に提供する。ＰＤＣおよびＡＤＨはともに、ピルビン酸のエタノールへの変換に含まれる。

プラスミドｐＺＰ−１由来のザイモモナス・モビリスｐｄｃの発現が、突然変異株ＴＮの細胞増殖、および安定性を改良することを、本発明者らは明らかにした。しかしながらエタノール産生の有意の増大は全く観察されなかった。そこで、ｐｄｃ遺伝子の発現を増大させ、かつバシラス属ＴＮ由来の天然ａｄｈ遺伝子を同時発現させることを本発明者らは決定した。

プラスミドｐＺＰ−１においては、ｐｄｃ遺伝子を、バシラス・ステアロテルモフィルスＮＣＡ１５０３由来のｌｄｈプロモーター配列の制御下に置いていたが、プロモーターをバシラスＬＮ由来のｌｄｈプロモーターに変更することを決定した（構築物１）。本発明者らは次に、バシラスＬＮ株由来のａｄｈ遺伝子をｌｄｈプロモーターの制御下に置いた（構築物２）。最後にｐｄｃ（ザイモモナス・モビリス由来）およびａｄｈ（バシラスＬＮ由来）の両方を、ｌｄｈプロモーター配列の制御下に置いた（構築物３）。遺伝子はすべて、ザイモモナス・モビリス（ｐｄｃ）およびバシラスＬＮ株（ｌｄｈプロモーターおよびｐｄｃ）からＰＣＲにより増幅し、適切な制限酵素でトリミングして、一緒に連結し、Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドベクター中にクローニングした。この３つの構築物を、複製可能シャトルベクターｐＵＢＵＣ、ｐＦＣ１、または染色体組込みのための組込みシャトルベクターｐＵＢＵＣ−ＩＥ中にクローニングした。

実施例１
ＴＮの形質転換
プラスミドｐＭＥＴＨを保有するＥ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０細胞での形質転換、増殖、および該細胞からの精製後に、プラスミドｐＵＢＵＣ−ＩＥをｉｎ ｖｉｖｏでメチル化した。次にメチル化したｐＵＢＵＣ−ＩＥを用いて、バシラス属株ＴＮを形質転換した。６００ｎｍでの吸光度（Ａ₆₀₀）が０．５〜０．６に達するまで、バシラス属株ＴＮ細胞を５０ｍｌのＴＧＰ培地中、６５℃で増殖させた。培養を氷上で１５〜３０分間冷却させた。遠心分離により細胞を収集し、１０ｍｌの冷ＴＨ緩衝液（２７２ｍＭのトレハロースおよび８ｍＭのＨＥＰＥＳ；ＫＯＨを用いてｐＨ７．５）中で１回、５ｍｌの冷ＴＨ緩衝液中で２回洗浄した。細胞ペレットを４００μｌのＴＨ緩衝液中に再懸濁して、電気穿孔する前に４℃で保存した。Narumi et al.(1992) Biotechnology Techniques 6(1)による上記の方法に基づいた電気穿孔により、メチル化プラスミドＤＮＡを用いてＴＮ株を形質転換した。コンピテント細胞を９０μｌのアリコート中に分配し、２μｌのメチル化プラスミドＤＮＡ（２５０ｎｇ／μｌ）と混合した。混合物を冷電気穿孔キュベット（０．２ｃｍ電極ギャップ）に移して、氷上で５分間インキュベートした。次に懸濁液に２５μＦコンデンサからの２．５ｋＶ放電を施して、EquiBio EasyJect電気穿孔機を用いてパルス制御を２０１オームに設定した（時間定数、τ＝５ｍｓ）。細胞を直ちに５ｍｌの予熱ＴＧＰに移して、５２℃で１時間インキュベートし、ＴＧＰ寒天（１０μｇ／ｍｌカナマイシン）上で平板培養した。プレートを５２℃で２４〜４８時間インキュベートした。

組換え体の選択
以下の方法を用いて、相同的組換えによる温度感受性プラスミドｐＵＢＵＣ−ＩＥの染色体組込みに関して選択した。
１．５２℃で２４時間、５ｍｌのＴＧＰ（カナマイシン）培地中で、形質転換体を増殖させた。
２．５０ｍｌの新鮮なＴＧＰ（カナマイシン）培地に、Ｏ／Ｎ培養からの１ｍｌを接種して、ＯＤ₆₀₀が〜０．５に達するまで、５２℃の振盪水浴中でインキュベートした。
３．１５ｍｌの上記培養を、４１００ｒｐｍで５℃で５分間遠心分離し、ペレットを１５０μｌのＴＧＰ（１０：ｇ／ｍｌカナマイシン）培地中に再懸濁して、ＴＧＰ（カナマイシン）プレート上に展着させた。
４．プレートを６８℃で１６時間インキュベートした。
５．単離コロニーを採取して、ＰＣＲにより挿入配列部位中へのプラスミド組込みに関
して分析した。

ＴＮ組込み体のスクリーニング
ＴＮ組込み体を６８℃で単離した。ＴＮ組込み体中のＬＤＨプライマーを用いてＰＣＲ産物を増幅できなかったことは、プラスミドｐＵＢＵＣ−ＩＥの少なくとも１つのコピーが染色体中に組み込まれたことを示す。組込まれた結果、親菌株ＴＮより、ｌｄｈ復帰および「乗っ取り」に関して安定である新規の菌株ＴＮ−Ｔ９が見出された。

菌株ＴＮ−Ｔ９の安定性
残留糖が培地中に存在するよう、復帰を容易にする条件である、最適下限の条件下において発酵を実行した。残留糖、ピルビン酸排出、ならびに設定条件からの多くの逸脱にもかかわらず、乳酸産生のいかなる痕跡も伴わずに、発酵が７５０時間続いた。エタノールは発酵を通して比較的大量に産生された。全発酵を通して、組込み体を選択するためにカナマイシンを用いなかった。これらの結果は、ＴＮ−Ｔ９におけるｌｄｈ遺伝子突然変異が、実験条件（ｐＨ７．０、６５℃、２％糖供給）下における連続培養において安定であることを示す。

エタノール収率および産生性
グルコース、キシロースおよびグルコース／キシロースベースの原料からのエタノール産生のために、発酵条件を最適化した。
培養型： 連続
温度： ６５℃
ｐＨ： ６．８
供給する糖濃度： ２〜１０％
散布気体： 空気
酸化還元： ＞−３５０ｍＶ（空気流量により制御）
希釈速度： ０．３６〜０．６ｈ^-1
これらの条件下において達成されたエタノール収率は、糖１ｇ当たり０．４〜０．５ｇであった。エタノール産生性は、０．５ｈ^-1の希釈速度を用いた場合、２％および４％糖供給に関して、それぞれ約４ｇおよび８ｇエタノール／リットル／時間であった。

実施例２
カナマイシン感受性株−ＴＮ−ＴＫの選択
バシラス属ＴＮ−ＴＫは、ＴＮ−Ｔ９のカナマイシン感受性誘導体である。この菌株は、ｌｄｈ突然変異に関して完全に安定しており、選択マーカーとしてカナマイシンを含むプラスミド産生発現のための理想的宿主である。

ＴＮ−Ｔ９をまず、カナマイシン（１０μｇ／ｍｌ）を補充したＴＧＰ ５ｍｌ中、６８℃で２４時間増殖させた。約１００ｍｌの培養を２つのＴＧＰ（Ｋｍ）寒天プレート上で展着させて、６８℃で終夜インキュベートした。数百個のコロニーを得て、滅菌した爪楊枝を用いて１００個のコロニーを新鮮なＴＧＰ（Ｋｍ）プレートに移した。６８℃で終夜増殖後、コロニーを新鮮なＴＧＰプレートおよびＴＧＰ（Ｋｍ）プレートに移して（レプリカ平板法により）、６８℃で終夜増殖させた。

２個のカナマイシン感受性コロニーがＴＧＰ上では得られたが、対応するＴＧＰ（Ｋｍ）プレート上では得られなかった。これらのコロニー由来のｌｄｈ遺伝子領域をＰＣＲにより増幅し、ＴＮ−Ｔ９（親菌株）由来の崩壊ｌｄｈ遺伝子とサイズが匹敵することを明らかにした。ＰＣＲを用いて、その菌株はカナマイシンに対する耐性を付与する遺伝子を失っていたことを実証した。ＴＮ−ＴＫと称する一誘導体をさらなる増殖実験のために選択した。これらの実験は、カナマイシン感受性およびｌｄｈ突然変異が完全に安定してい
るということを確証した。

挿入因子（ＩＥ）を含むＤＮＡ配列のヌクレオチド配列を示す図である。ここで、ＩＥ配列には下線を付してある。 挿入因子（ＩＥ）を含むＤＮＡ配列のヌクレオチド配列を示す図である。ここで、ＩＥ配列には下線を付してある。 挿入因子（ＩＥ）を含むＤＮＡ配列のヌクレオチド配列を示す図である。ここで、ＩＥ配列には下線を付してある。 挿入因子（ＩＥ）を含むＤＮＡ配列のヌクレオチド配列を示す図である。ここで、ＩＥ配列には下線を付してある。 菌株ＴＮの遺伝子的不安定性を示す模式図である。 バシラス属突然変異株ＴＮにおける単一交差組換えによる、ＬＤＨ遺伝子不活性化のための方法を示す模式図である。 ７５０時間に及ぶ連続培養におけるバシラス属突然変異株ＴＮ−Ｔ９の安定性を示すグラフである。 シャトルベクターｐＵＢＵＣ−ＩＥの模式図である。 バシラス属株ＬＮ由来の新規の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のＤＮＡ配列および翻訳アミノ酸配列を示す図である。 （Ａ）バシラス属株ＬＮ由来の新規の乳酸パーミアーゼ遺伝子の部分ＤＮＡ配列および翻訳アミノ酸配列を示す図である。 （Ｂ）バシラス属株ＬＮ由来の新規の乳酸パーミアーゼ遺伝子の全ＤＮＡ配列および翻訳アミノ酸配列を示す図である。 （Ｂ）バシラス属株ＬＮ由来の新規の乳酸パーミアーゼ遺伝子の全ＤＮＡ配列および翻訳アミノ酸配列を示す図である。 バシラス属株ＬＮ由来の新規のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（下線）のＤＮＡ配列を示す図である。 バシラス属株ＬＮ由来の新規のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（下線）のＤＮＡ配列を示す図である。 （Ａ）バシラス属株ＴＮ−Ｔ９の開発を示す模式図である。 （Ｂ）バシラス属株ＴＮ−Ｔ９およびＴＮ−ＴＫの開発を示す模式図である。 人工ＰＤＣオペロンの構築を示す図である。 ＴＮ株由来のＬ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈ）のアミノ酸配列を示す図である。 ＴＮ株由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈ）のアミノ酸配列を示す図である。 ＩＥ配列によりコードされるトランスポゼースのアミノ酸配列を示す図である。 ＩＥ配列によりコードされるトランスポゼースのアミノ酸配列を示す図である。 ＩＥ配列によりコードされるトランスポゼースのアミノ酸配列を示す図である。

Claims (38)

1. プラスミドおよび天然乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子内の挿入因子（ＩＥ）配列の相同的組換えに基づくプラスミド組込み方法を用いた乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子突然変異の安定化により、エタノール産生特性が強化されたグラム陽性細菌。
2. 前記挿入因子（ＩＥ）配列が、配列番号１のヌクレオチド６５２〜３，８００、その機能的部分またはその変異体で表される、請求項１に記載のグラム陽性細菌。
3. 好熱性である、請求項１または２に記載のグラム陽性細菌。
4. バシラス・ステアロサーモフィルス（Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バシラス・カルボデロックス（Ｂ． ｃａｌｖｏｄｅｌｏｘ）、バシラス・カルドテナックス（Ｂ． ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ）、バシラス・サーモグルコシダシウス（Ｂ． ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ）、バシラス・コアグランス（Ｂ． ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシラス・リケニホルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシラス・サーモデニトリフィカンス（Ｂ． ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）およびバシラス・カルドリティクス（Ｂ． ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ）から選択されるバシラスエスピーである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のグラム陽性細菌。
5. 前記バシラスエスピーは、バシラス・サーモグルコシダシウス株ＴＮ−Ｔ９（ＮＣＩＭＢ受託番号ＮＣＩＭＢ４１０７５）である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のグラム陽性細菌。
6. 前記バシラスエスピーは、バシラス・サーモグルコシダシウス株ＴＮ−ＴＫ（ＮＣＩＭＢ受託番号ＮＣＩＭＢ４１１１５）である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のグラム陽性細菌。
7. 前記ＩＥ配列、その機能的部分またはその変異体を含むシャトルベクターで形質転換されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載のグラム陽性細菌。
8. 前記ＩＥ配列、その機能的部分またはその変異体は、相同的組換えにより組換え細菌の染色体中に安定的に組み込まれている、請求項１〜７のいずれか１項に記載のグラム陽性細菌。
9. 前記天然乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、相同的組換えにより不活性化されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載のグラム陽性細菌。
10. 胞子形成欠陥性である、請求項１〜９のいずれか１項に記載のグラム陽性細菌。
11. 前記天然乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は不活性化されており、かつ異種ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を発現する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のグラム陽性細菌。
12. 前記天然乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、不可逆的に不活性化されている、請求項９、１０または１１に記載のグラム陽性細菌。
13. 乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子中の挿入因子配列とピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子および挿入因子配列を含むプラスミドとの間の相同的組換えを含む、天然乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を不活性化して、発現可能遺伝子を乳
    酸デヒドロゲナーゼ遺伝子に挿入する方法。
14. 前記ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子および前記アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド６５２〜３，８００で表されるＩＥ配列に作動可能なように連結されたＰＤＣオペロンの一部を形成する、請求項１３に記載の方法。
15. 前記ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子は、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）エスピー由来である、請求項１３または１４に記載の方法。
16. 前記ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子は、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）由来である、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子は、バシラスＬＮ株由来である、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記挿入配列、ＰＤＣオペロンまたはその一部分は、前記組換え細菌の染色体中に安定的に組み込まれる、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
19. Ｅ．ｃｏｌｉおよびバシラス属株中で複製することができる、以下の開裂地図により表されるシャトルベクターを用いることを含む、請求項１３に記載の方法。
    
20. 配列番号１のヌクレオチド６５２〜３，８００で表されるＩＥ配列またはその機能的フラグメントを含有するシャトルベクター。
21. 前記ＩＥ配列に作動可能なように連結されたピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含有する、請求項２０に記載のシャトルベクター。
22. 前記ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子は、ＰＤＣオペロンの一部を形成する、請求項２１に記載のシャトルベクター。
23. プラスミドＤＮＡが相同的組換えにより細菌の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子中に安定的に組み込まれた乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を有する組換え細菌を選択する方法であって、前記乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を増幅するためにＰＣＲを使用することを含む方法。
24. 前記組換え細菌の前記乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子からＰＣＲ産物を増幅できないことは、前記組換え細菌の前記染色体中に、配列番号１のヌクレオチド６５２〜３，８００で表されるＩＥ配列またはその一部分が組込まれたこと示す、請求項２３に記載の方法。
25. トランスポゼースの生物学的活性を有する１つまたは複数のポリペプチドをコードし、かつ挿入配列として分類されている、配列番号１のヌクレオチド６５２〜３，８００で表される単離されたＤＮＡ分子、その一部分またはその機能的変異体。
26. 好熱性バシラス属株ＴＮ由来である、請求項２５に記載の単離されたＤＮＡ分子。
27. 配列番号１のヌクレオチド６５２〜３，８００で表される配列、その機能的変異体またはその一部によりコードされる１つまたは複数のポリペプチドであって、トランスポゼースの生物学的活性を有するポリペプチド。
28. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載のグラム陽性細菌の細菌発酵によるエタノールの
    製造方法であって、発酵培地のｐＨがｐＨ５．５〜７．５の範囲内である最適化発酵条件を用いることを含む製造方法。
29. 前記発酵培地のｐＨは、ｐＨ６．０〜７．０である、請求項２８に記載の製造方法。
30. 前記発酵培地のｐＨは、ｐＨ６．４〜６．９である、請求項２８または２９に記載の製造方法。
31. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載のグラム陽性細菌の細菌発酵によるエタノールの製造方法であって、発酵培地の温度が４０〜７５℃の範囲内である最適化発酵条件を用いることを含む製造方法。
32. 前記発酵培地の温度は、５２〜７０℃である、請求項３１に記載の製造方法。
33. 前記発酵培地の温度は、６０〜６８℃である、請求項３１または３２に記載の製造方法。
34. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載のグラム陽性細菌の細菌発酵によるエタノールの製造方法であって、培養内空気散布を用いて酸化還元電位が−３６０〜−４００ｍＶであるようにすることを含む製造方法。
35. 前記酸化還元電位は、−３７０〜−３８０ｍＶである、請求項３４に記載の製造方法。
36. 供給希釈速度が０．３〜０．８ｈ^-1である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のグラム陽性細菌の細菌発酵によるエタノールの連続製造方法。
37. 前記供給希釈速度は、０．４〜０．６ｈ^-1である、請求項３６に記載の製造方法。
38. 用いられる細菌がバシラス属株ＴＮである、請求項２８〜３７のいずれか１項に記載の製造方法。

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