JP2006504408A - パントテン酸の高生産のための微生物及び方法 - Google Patents
パントテン酸の高生産のための微生物及び方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2006504408A JP2006504408A JP2004520007A JP2004520007A JP2006504408A JP 2006504408 A JP2006504408 A JP 2006504408A JP 2004520007 A JP2004520007 A JP 2004520007A JP 2004520007 A JP2004520007 A JP 2004520007A JP 2006504408 A JP2006504408 A JP 2006504408A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- pantothenic acid
- deregulated
- microorganism
- gene
- biosynthetic pathway
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
本出願は米国仮特許出願第60/393,826「パントテン酸の高生産のための微生物及び方法」(出願日2002年7月3日)に基づく優先権を主張するものである。本出願は、国際特許出願第/PCT/US02/00925「パントテン酸の高生産のための微生物及び方法」(出願日2002年1月18日(係属中))に関連し、該国際特許出願は順に、先の出願に係る、仮特許出願第60/347,638「パントテン酸の高生産のための微生物及び方法」(出願日2002年1月11日(係属中))、仮特許出願第60/263,053(出願日2001年1月19日(期間経過))、及び仮特許出願第60/262,995(出願日2001年1月19日(期間経過))、の利益を主張するものである。本出願はまた、米国特許出願第09/667,569(出願日2000年9月21日(係属中))にも関連し、該米国特許出願は米国特許出願第09/400,494(出願日1999年9月21日(放棄))の一部係属出願である。米国特許出願第09/667,569も先の出願に係る米国仮特許出願第60/210,072(出願日2000年6月7日(期間経過))、米国仮特許出願第60/221,839(出願日2000年7月28日(期間経過))、及び米国仮特許出願第60/227,860(出願日2000年8月24日(期間経過))の利益を主張するものである。上述の各関連出願全体の内容は、参照により本明細書中に組み込まれている。
パントテン酸(pantothenic acid)又はビタミンB5としても知られるパントテン酸(pantothenate)は、ビタミンB複合体の一員であり、家畜類及びヒトを含む哺乳類にとって必要な栄養物質である(例えば、水溶性のビタミンサプリメント、あるいは飼料添加物といった食料源からもたらされる)。細胞において、パントテン酸は主として補酵素A(CoA)やアシルキャリアータンパク(ACP)の生合成に利用される。これらの補酵素は、これらの分子の4'-ホスホパンテテイン部分のスルフヒドリル基と一緒にチオエステルを形成するアシル部分の代謝において機能する。これらの補酵素は全ての細胞で不可欠であり、細胞内物質代謝における100以上の異なる中間反応に関与する。
しかし、依然としてパントテン酸の生産方法、特に所望の生産物をより高い収量で得るための最適化された微生物法の改良に対する重大なニーズがある。
本発明はパント化合物(例えば、ケトパントエート、パントエート及び/又はパントテン酸)を生産するための改良法及び該改良法に使用するために操作された微生物に関する。50g/l以上のパントテン酸を生産することが可能な株は、国際特許出願第WO01/21772及び米国特許出願第60/262,995に教示されるとおりに構築することができる。panB、panC、panD、panEl遺伝子発現の増加及びilvBNC、ilvD遺伝子発現の増加により、グルコース(ピルビン酸)を商業的に魅力ある量のパントテン酸に変換する株(例えばBacillus株)の設計が可能である。
1つの実施形態において、本発明は、パントテン酸生合成経路及び/又はイソロイシン−バリン(ilv)生合成経路及び/又はメチレンテトラヒドロフォレート(MTF)生合成経路の種々の生合成酵素の量(レベル)を、改変又は増加させることを特徴とする。特に、本発明は、前記の生合成酵素をコードする遺伝子を改変又は変化させることによって、前記生合成経路に関連する様々な酵素活性を改変することを特徴とする。
本発明はさらに、本明細書に記載の遺伝子(例えば単離遺伝子)、好ましくはBacillus遺伝子、さらに好ましくはBacillus subtilis遺伝子、なお一層好ましくはBacillus subtilisのパントテン酸生合成遺伝子及び/又はイソロイシン−バリン(ilv)生合成遺伝子及び/又はメチレンテトラヒドロフォレート(MTF)生合成遺伝子、を含む組換え核酸分子(例えば組換えDNA分子)を特徴とする。「組換え核酸分子」という用語には、組換え核酸分子が由来する本来の又は天然の核酸分子とヌクレオチド配列において異なるように変化された、改変された、又は操作された(例えば1又はそれ以上のヌクレオチドの付加、欠失又は置換による)核酸分子(例えばDNA分子)が含まれる。好ましくは、組換え核酸分子(例えば組換えDNA分子)には、調節配列に機能するような形で結合された本発明の単離遺伝子が含まれる。「調節配列に機能するような形で結合された」という用語は、目的の遺伝子のヌクレオチド配列が、遺伝子の発現(例えば、高められた、増加された、構成的な、基底の、弱められた、減少された、抑制された発現)、好ましくは(例えば組換え核酸分子が本明細書に記載の組換えベクターに組み込まれ、微生物に導入された時に)該遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現、を可能にする手法で調節配列に結合されることを意味する。
GCCTACCTAGCTTCCAAGAAAGATATCCTAACAGCACAAGAGCGGAAAGATGTTTTGTTCTACATCCAGAACAACCTCTGCTAAAATTCCTGAAAAATTTTGCAAAAAGTTGTTGACTTTATCTACAAGGTGTGGTATAATAATCTTAACAACAGCAGGACGC (配列番号2)、及び
GAGGAATCATAGAATTTTGTCAAAATAATTTTATTGACAACGTCTTATTAACGTTGATATAATTTAAATTTTATTTGACAAAAATGGGCTCGTGTTGTACAATAAATGTAGTGAGGTGGATGCAATG (配列番号3)
さらなる好適なプロモーターには、Bacillus(例えばBacillus subtilis)において高レベルの発現を促進するtef(翻訳伸張因子(TEF)プロモーター)及びpyc(ピルビン酸カルボキシラーゼ(PYC)プロモーター)が含まれる。例えばグラム陽性微生物で用いるためのさらなる好適なプロモーターには、amy及びSPO2プロモーターが含まれるが、それらに限定されない。例えばグラム陰性微生物で用いるためのさらなる好適なプロモーターには、cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, lacIQ, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, λ-PR 又はλ-PLが含まれるが、それらに限定されない。
AGAAAGGAGGTGA (配列番号6),
TTAAGAAAGGAGGTGANNNNATG (配列番号7),
TTAGAAAGGAGGTGANNNNNATG (配列番号8),
AGAAAGGAGGTGANNNNNNNATG (配列番号9), 及び
AGAAAGGAGGTGANNNNNNATG (配列番号10)
が含まれるが、それらに限定されない。人工RBSは特定の遺伝子と結合された天然又は本来のRBSと置換するために用いることができる。人工RBSは、好ましくは特定遺伝子の翻訳を増加する。好適な人工RBS(例えばpanB、例えばB.subtilis のpanBの翻訳を増加するためのRBS)には、
CCCTCTAGAAGGAGGAGAAAACATG (配列番号11) 、及び
CCCTCTAGAGGAGGAGAAAACATG (配列番号12)
が含まれる。好適な人工RBSには(例えばpanD、例えばB.subtilisの panDの翻訳を増加するためのRBS)には、
TTAGAAAGGAGGATTTAAATATG (配列番号13),
TTAGAAAGGAGGTTTAATTAATG (配列番号14),
TTAGAAAGGAGGTGATTTAAATG (配列番号15),
TTAGAAAGGAGGTGTTTAAAATG (配列番号16),
ATTCGAGAAAGGAGG TGAATATAATATG (配列番号17),
ATTCGAGAAAGGAGGTGAATAATAATG (配列番号18), 及び
ATTCGTAGAAAGGAGGTGAATTAATATG (配列番号19)
が含まれる。
本発明はさらに、本明細書中に記載するようなベクター又は遺伝子(例えば、野生型及び/又は変異遺伝子)を含む微生物、すなわち組換え微生物を特徴とする。本明細書で用いられる「組換え微生物」という用語には、それが由来する天然の微生物と比較して、遺伝子型及び/又は表現型と比較して、変化した、改変された、又は異なる遺伝子型及び/又は表現型を示すように遺伝子的に変化した、改変された、又は操作(例えば遺伝子操作)された微生物(例えば細菌、酵母菌、真菌細胞など)が含まれる。
「培養」という用語には、本発明の生きた微生物の維持及び/又は増殖(例えば培養物又は株の維持及び/又は増殖)が含まれる。1つの実施形態において、本発明の微生物は液体培地で培養される。別の実施形態において、本発明の微生物は固体培地あるいは半固体培地で培養される。好適な実施形態において、本発明の微生物は、微生物の維持及び/又は増殖に不可欠あるいは有益な栄養素(例えば炭水化物、炭化水素、油、脂肪、脂肪酸、有機酸、及びアルコールなどの炭素源あるいは炭素基質、例えばペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、大豆ミール、大豆粉、大豆粗粒、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム及び燐酸アンモニウムといった窒素源、例えば燐酸、そのナトリウム及びカリウム塩などのリン源;例えばマグネシウム、鉄、マンガン、カルシウム、銅、亜鉛、ホウ素、モリブデン、及び/又はコバルト塩などの微量元素;並びにアミノ酸、ビタミン、増殖促進剤などの増殖因子など)を含む培地(例えば滅菌液体培地)中で培養される。
パントテン酸生産のためのBacillus属の株を開発する際には、種々の遺伝子操作が、米国特許出願第09/400,494及び09/667,569に記載されるパントテン酸生合成経路及びイソロイシン−バリン(ilv)経路(図1)に関連した遺伝子及び酵素に対し行われる。例えば、脱調節されたpanBCDオペロンを有する株及び/又は脱調節されたpanE1を有する株は、(β−アラニン及びα−ケトイソ吉草酸(α−KIV)の存在下で培養したとき)パントテン酸の高生産を示す。ilvBNC及びilvDについてさらに脱調節された株は、β−アラニンのみの存在下でパントテン酸の高生産を示す。さらにまた、さらにpanDを脱調節することによってβ−アラニン非依存性を達成することが可能である。
HAMBAは[R]-α-ヒドロキシイソ吉草酸(α-HIV)とβ-アラニンが、PanC酵素により触媒され、縮合した産物である。α-HIVはα-KIVの還元によって形成され、その反応はα-ケトレダクターゼPanE(例えばPanE1及び/又はPanE2)及び/又はIlvCによって触媒される。それゆえ、微生物には、生合成酵素PanB、すなわちパントテン酸生合成経路及びHMBPA生合成経路の基質となるα-KIVについて拮抗する経路が少なくとも2つ存在することが提案されている。(α-KIVについて拮抗する第3及び第4の経路は、α-KIVからのバリン又はロイシンの生産をもたらす経路である、例えば図1参照。)少なくともパントテン酸生合成経路及びHMBPA生合成経路はさらに、PanC酵素の競合的な基質、すなわちα-HIV及びパントエートを生産する。HMBPA生産はパントテン酸生産に重要な影響を及ぼし得る。例えば、HMBPA経路は前駆物質(α-KIV及びβ-アラニン)及びいくつかの酵素(PanC、PanD、PanE1、及び/又はIlvC)についてパントテン酸経路と拮抗し得る。さらにHMBPAの構造がパントテン酸の構造と類似しているために、HMBPAの構造は、パントテン酸経路における1以上の段階を負に調節する望ましくない性質を有する可能性がある。HMBPAの識別に基づいて、米国仮特許出願第60/262,995は、パントテン酸生合成法では、HMBPA生合成法と比べて、パントテン酸生産が、基質(α-KIV及びβ-アラニン)及び/又は酵素(PanC、PanD、PanE1、及び/又はIlvC)の使用を有利にするあらゆる手段によって改良又は最適化され得ることを教示している。
パントテン酸生産を最適化する少なくとも1つの方法は、微生物培養におけるセリンの利用率を調節することを含む。特にセリンの利用率の増加が(例えばHMBPAと比例して)パントテン酸の生産増加に導くのに対して、セリンの利用率の減少はHMBPAに対してパントテン酸生産の減少に導くことが実証できる。この方法はセリンから誘導される化合物、メチレンテトラヒドロフォレート(MTF)が、パントテン酸生合成反応の間に、ヒドロキシメチル基をα-KIVに与えてケトパントエートを生成するという理解に基づくものである(例えば図1及び2を参照)。それゆえに、セリン量の調節は効果的にケトパントエート量を調節し、続いて適切に操作された微生物におけるパントエート及び/又はパントテン酸生産を調節する1つの手段である。この調節を実証するため、PA824をSVYグルコース+5g/Lβ-アラニン及び±5g/Lセリンを加えた試験管培養で、43℃で48時間培養した。
セリン供給に代わる方法として、パントテン酸生産量を調節するためのセリン量及び/又はセリン利用量(及び、従ってメチレンテトラヒドロフォレート量)をの増加する他の方法は、3-ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼあるいはセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ(それぞれserA及びglyA遺伝子産物)の合成又は活性を増加することであり、これによって、適切に操作された微生物においてセリン及びメチレンテトラヒドロフォレート生合成が増加する。
serA遺伝子産物である3-ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼは、セリン生合成への経路において最初に関わる酵素である(図2参照)。セリンはMTF合成の基質の1つであるため、本発明者らは、その細胞中のセリン量を増加するため、serA遺伝子の過剰発現を企てた。serA遺伝子発現は、上述のglyA遺伝子について実施例IIIで説明されたのと同様の方法で、すなわち強力な構成性プライマーの下流にクローン化されたB.subtilis serA遺伝子を含む発現カセットでB.subtilisの細胞を形質転換することによって増加された。発現カセットを構築するためのプライマーに、表5に示されたRY405及びRY406を用いて、B.subtilis PY79から単離された染色体DNAからPCRによってserA遺伝子を増幅した。増幅されたDNAはその後XbaIとBamHIで切断され、これらはpAN393プラスミド(図7;配列番号25)を生成するため、pAN004ベクター(図5)中のBamHI部位とXbaI部位の間にクローン化された。B.subtilisを形質転換するため、P26serAカセット及びcat遺伝子を含むNotI DNA断片を、pAN393から単離し、自己連結し、そしてB.subtilis PY79のコンピテント細胞中に形質転換した。数個のクロラムフェニコール耐性形質転換体を選別し、PA1004及びPA1005と名付けた。染色体DNAをこれらの株のそれぞれから単離し、これらはPA1010及びPA1013株を得るため、それぞれPA721B-39及びPA824のコンピテント細胞を形質転換するために用いられた。PA1010及びPA1013の単離株の細胞抽出液のSDSポリアクリルアミド電気泳動によって、これらの株がそれらの親株であるPA721B-39及びPA824と比較して、増加した量のserA遺伝子を含むことが確認された。
試験管での実施に基づいて、2種の親株PA824及びPA721B-39から各々1つずつ、増幅可能なserAカセットを含む2種の株と、増幅可能なglyAカセットを含む2種の株とを選別した。4種の株を、親株とともに、振とうフラスコ中で増殖した(表8)。大豆粉MOPSグルコース(SMG)培地で、4種全ての株はそれらの親株よりも多くのパントテン酸を生産した。大豆粉MOPSマルトース(SMM)培地で、4種の株のうち1つが親株より優れているように思われた。
実施例III及びVに記載されているように、glyA遺伝子の発現は、強力な構成性プロモーターによってglyA遺伝子が駆動されるカセットの1以上のコピーを付加することによって増加され得る。glyA遺伝子発現を増加させる代替的な方法は、その制御を変化させることである。文献が記載しているglyA::lacZ融合を記載する文献は、glyAプロモーターは通常の条件下では中程度の強さ(およそ400ミラー単位)であるが、もしその負のレギュレーターであるpurR遺伝子が欠失された場合、このプロモーターは比較的高レベル(1800ミラー単位)に誘導されることが可能である(Saxildら(2001)J.Bacteriol.183:6175-6183)。それゆえ、実験は、glyA発現、及びその結果生じるパントテン酸生産が、パントテン酸生産株からpurRの欠失によって増加され得るかを決定するために行われた。
この実施例はセリン生産を増加するための別の方法を説明する。この方法では2段階の手順により、強力な構成性プロモーター(P26)を染色体serA遺伝子の前に配置する。天然serA遺伝子のすぐ上流の領域から、およそ700bpのDNA配列を含む2種のプラスミドを構築した。第1のプラスミドであるpAN821もまた、serAをコードする領域の3'側半分を、前述した2つの配列(カナマイシン耐性遺伝子(図10 、配列番号30))の間に含む。B.subtilis中に形質転換し、カナマイシン耐性について選別すると、pAN821はserA遺伝子の破壊を生じ、セリン栄養要求性となる。これはΔserA::kan対立遺伝子と名付けた遺伝子配列を形成する。
serAに組み込まれた非増幅性P26 serAカセットはより高いパントテン酸合成をもたらし(例えば表12を参照)、また、glyAに組み込まれたクロラムフェニコール増幅性P26 glyAカセットは高いパントテン酸合成をもたらすので、これら2つを組み合わせると相乗的であるかもしれないことが提案された。serAに組み込まれた非増幅性P26 serAカセットを含むPA824の派生株であるPA1028-4株を、PA1014-3由来の染色体DNAを用いて5mg/lでクロラムフェニコール耐性に形質転換し、クロラムフェニコール増幅性P26 glyAカセットを含むPA1038と名付けられた1組の株を得た。PA1038単離株は、β−アラニンを含むSVY中で増殖された標準試験管培養を用いて、パントテン酸生産について試験された(表13)。予想されたように、PA1038は、PA824による約4.2g/lからPA1038株の組による6.6〜7.5g/lへと劇的なパントテン酸生産の増加を示した。単離株PA1038-3及びPA1038-12はさらに、表12で示されるような振とうフラスコ中で試験された。どちらもPA824の7.4g/lというパントテン酸生産に対して、平均13.6g/lのパントテン酸を生産した。
上の実施例で実施されたように、細菌におけるMTF生産増加は、panBCD及び/又はpanE遺伝子の操作によってより多くのパントテン酸が生産されるように操作された株において、パントテン酸生産を増加する。パントテン酸生産が、glyA遺伝子あるいはserA遺伝子の発現増加によって、増加され得ることが実証された。実施例III〜実施例V及びVII〜VIIIで実証されたように、より強力なプロモーター又はリボソーム結合部位を用いて、glyA又はserA発現を増加させることができる。あるいは、glyA遺伝子の発現は、実施例IVで説明されたように、purRリプレッサー遺伝子の破壊によってBacillusにおいて脱調節され得る。
当業者は、通常の実験法を用いるだけで上述の本発明の特定の実施形態に対する多くの均等を確認することができるし又は認識するであろう。そのような均等は特許請求の範囲に含まれることを意図するものである。
Claims (49)
- パントテン酸の生産が高まるような条件下で、脱調節されたメチレンテトラヒドロフォレート(MTF)生合成経路を有する微生物を培養することを含む、パントテン酸の高生産方法。
- パントテン酸の生産が高まるような条件下で、
(i)脱調節されたパントテン酸生合成経路、及び
(ii)脱調節されたメチレンテトラヒドロフォレート(MTF)生合成経路
を有する微生物を培養することを含む、パントテン酸の高生産方法。 - 前記微生物が脱調節された少なくとも2種類のパントテン酸生合成酵素を有する、請求項2に記載の方法。
- 前記微生物が脱調節された少なくとも3種類のパントテン酸生合成酵素を有する、請求項2に記載の方法。
- 前記微生物が脱調節された少なくとも4種類のパントテン酸生合成酵素を有する、請求項2に記載の方法。
- 前記微生物が、脱調節されたケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、脱調節されたケトパントエートレダクターゼ、脱調節されたパントテン酸シンテターゼ、及び脱調節されたアスパラギン酸−α−デカルボキシラーゼを有する、請求項5に記載の方法。
- 前記微生物がさらに、脱調節されたイソロイシン−バリン(ilv)生合成経路を有する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記微生物が、脱調節された少なくとも2種類のイソロイシン−バリン(ilv)生合成酵素を有する、請求項7に記載の方法。
- 前記微生物が、脱調節された少なくとも3種類のイソロイシン−バリン(ilv)生合成酵素を有する、請求項7に記載の方法。
- 前記微生物が、脱調節されたアセトヒドロキシ酸シンテターゼ、脱調節されたアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ、及び脱調節されたジヒドロキシ酸デヒドラターゼを有する、請求項9に記載の方法。
- 前記微生物が、脱調節された少なくとも1種類のMTF生合成酵素を有する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記微生物が脱調節されたglyA遺伝子を有する、請求項11に記載の方法。
- 前記微生物が脱調節されたserA遺伝子を有する、請求項11に記載の方法。
- 前記微生物が脱調節されたglyA遺伝子及び脱調節されたserA遺伝子を有する、請求項11に記載の方法。
- 前記微生物が変異された、欠失された、又は破壊されたpurR遺伝子を有する、請求項12又は14に記載の方法。
- パントテン酸の生産が高まるように、脱調節されたパントテン酸生合成経路、脱調節されたイソロイシン−バリン(ilv)生合成経路、及び脱調節されたメチレンテトラヒドロフォレート(MTF)生合成経路を有する微生物を培養することを含む、パントテン酸の高生産方法。
- 36時間の培養後少なくとも50g/Lのパントテン酸が生産されるように、脱調節されたパントテン酸生合成経路、脱調節されたイソロイシン−バリン(ilv)生合成経路、及び脱調節されたメチレンテトラヒドロフォレート(MTF)生合成経路を有する微生物を培養することを含む、パントテン酸の生産方法。
- 36時間の培養後少なくとも60g/Lのパントテン酸が生産されるように微生物を培養することを含む、請求項17に記載の方法。
- 36時間の培養後少なくとも70g/Lのパントテン酸が生産されるように微生物を培養することを含む、請求項17に記載の方法。
- 48時間の培養後少なくとも60g/Lのパントテン酸が生産されるように、脱調節されたパントテン酸生合成経路、脱調節されたイソロイシン−バリン(ilv)生合成経路、及び脱調節されたメチレンテトラヒドロフォレート(MTF)生合成経路を有する微生物を培養することを含む、パントテン酸の生産方法。
- 48時間の培養後少なくとも70g/Lのパントテン酸が生産されるように微生物を培養することを含む、請求項20に記載の方法。
- 48時間の培養後少なくとも80g/Lのパントテン酸が生産されるように微生物を培養すること含む、請求項20に記載の方法。
- パントテン酸キナーゼ活性の調節によってパントテン酸の生産がさらに高められる、請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法。
- パントテン酸キナーゼ活性が減少される、請求項23に記載の方法。
- CoaAが欠失され、及びCoaXがダウンレギュレーションされる、請求項24に記載の方法。
- CoaXが欠失され、及びCoaAがダウンレギュレーションされる、請求項24に記載の方法。
- CoaX及びCoaAがダウンレギュレーションされる、請求項24に記載の方法。
- 前記微生物が過剰セリンの条件下で培養される、請求項1〜27のいずれか1項に記載の方法。
- パントテン酸が生産されるように過剰セリンの条件下で、脱調節されたパントテン酸生合成経路を有する微生物を培養することを含む、パントテン酸の生産方法。
- 前記微生物が、パントテン酸の生産がβ−アラニン供給と無関係であるように脱調節されたパントテン酸生合成経路を有する、請求項1〜29のいずれか1項に記載の方法。
- 前記微生物がグラム陽性微生物である、請求項1〜30のいずれか1項に記載の方法。
- 前記微生物がBacillus属に属する、請求項1〜31のいずれか1項に記載の方法。
- 前記微生物がBacillus subtilisである請求項1〜32のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜33のいずれか1項に記載の方法に従って合成された生産物。
- 請求項1〜34のいずれか1項に記載の方法に従って生産されたパントテン酸を含む組成物。
- 脱調節されたパントテン酸生合成経路、及び脱調節されたメチレンテトラヒドロフォレート(MTF)生合成経路を有する、パントテン酸の高生産のための組換え微生物。
- 脱調節されたパントテン酸生合成経路、脱調節されたメチレンテトラヒドロフォレート(MTF)生合成経路、及び脱調節されたイソロイシン−バリン(ilv)生合成経路を有する、パントテン酸の高生産のための組換え微生物。
- さらに、パントテン酸キナーゼ活性が低減された請求項36又は37に記載の微生物。
- グラム陽性微生物である、請求項36〜38のいずれか1項に記載の微生物。
- Bacillus属に属する、請求項36〜38のいずれか1項に記載の微生物。
- Bacillus subtilisである、請求項36〜38のいずれか1項に記載の微生物。
- 36時間の培養後少なくとも30g/Lのパントテン酸が生産されるような条件下で、
脱調節されたpanB遺伝子、
脱調節されたpanD遺伝子、及び
少なくとも1種類の、脱調節されたイソロイシン−バリン(ilv)生合成酵素をコードする遺伝子
を有する組換え微生物を培養することを含むパントテン酸の生産方法。 - 前記微生物がさらに、脱調節されたメチレンテトラヒドロフォレート(MTF)生合成経路を有し、かつ36時間の培養後少なくとも50g/Lのパントテン酸を生産するような条件下で前記微生物を培養する、請求項42に記載の方法。
- 36時間の培養後少なくとも50g/Lのパントテン酸が生産されるように、過剰セリンの条件下で、
脱調節されたpanB遺伝子、及び
脱調節されたpanD遺伝子
を有する組換え微生物を培養することを含む、パントテン酸の生産方法。 - 36時間の培養後少なくとも50g/Lのパントテン酸が生産されるように、過剰バリンの条件下で、
脱調節されたpanB遺伝子、
脱調節されたpanD遺伝子、及び
脱調節されたメチレンテトラヒドロフォレート(MTF)生合成経路
を有する組換え微生物を培養することを含む、パントテン酸の生産方法。 - 36時間の培養後少なくとも50g/Lのパントテン酸が生産されるように、バリン過多の条件下で、
脱調節されたpanB遺伝子、
脱調節されたpanD遺伝子、及び
脱調節されたglyA遺伝子
を有する組換え微生物を培養することを含む、パントテン酸の生産方法。 - 36時間の培養後少なくとも50g/Lのパントテン酸が生産されるように、過剰バリンの条件下で、
脱調節されたpanB遺伝子、
脱調節されたpanD遺伝子、及び
変異された、欠失された、又は破壊されたpurR遺伝子
を有する組換え微生物を培養することを含む、パントテン酸の生産方法。 - 36時間の培養後少なくとも50g/Lのパントテン酸が生産されるように、過剰バリンの条件下で、
脱調節されたpanB遺伝子、
脱調節されたpanD遺伝子、及び
脱調節されたserA遺伝子
を有する組換え微生物を培養することを含む、パントテン酸塩の生産方法。 - 36時間の培養後少なくとも50g/Lのパントテン酸が生産されるように、過剰バリンの条件下で、
脱調節されたpanB遺伝子、
脱調節されたpanD遺伝子、
脱調節されたserA遺伝子、及び
脱調節されたglyA遺伝子
を有する組換え微生物を培養することを含む、パントテン酸の生産方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US39382602P | 2002-07-03 | 2002-07-03 | |
PCT/US2003/021305 WO2004005525A2 (en) | 2002-07-03 | 2003-07-03 | Microorganisms and processes for enhanced production of pantothenate |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2006504408A true JP2006504408A (ja) | 2006-02-09 |
Family
ID=30115652
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2004520007A Pending JP2006504408A (ja) | 2002-07-03 | 2003-07-03 | パントテン酸の高生産のための微生物及び方法 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US7989187B2 (ja) |
EP (1) | EP1660667A4 (ja) |
JP (1) | JP2006504408A (ja) |
CN (1) | CN1788089A (ja) |
AU (1) | AU2003251792A1 (ja) |
CA (1) | CA2491145A1 (ja) |
IN (2) | IN2004CH03051A (ja) |
MX (1) | MXPA04012812A (ja) |
WO (1) | WO2004005525A2 (ja) |
ZA (1) | ZA200500948B (ja) |
Families Citing this family (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8232081B2 (en) * | 1999-09-21 | 2012-07-31 | Basf Se | Methods and microorganisms for production of panto-compounds |
CA2491145A1 (en) * | 2002-07-03 | 2004-01-15 | Basf Aktiengesellschaft | Microorganisms and processes for enhanced production of pantothenate |
UA96928C2 (ru) | 2005-10-26 | 2011-12-26 | Э.И. Дю Пон Де Немур Энд Компани | Ферментативное продуцирование спиртов с четырьмя атомами углерода |
US8273558B2 (en) | 2005-10-26 | 2012-09-25 | Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc | Fermentive production of four carbon alcohols |
US9303225B2 (en) | 2005-10-26 | 2016-04-05 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Method for the production of isobutanol by recombinant yeast |
US8956850B2 (en) | 2008-06-05 | 2015-02-17 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Enhanced pyruvate to acetolactate conversion in yeast |
BRPI0618074A2 (pt) * | 2005-10-31 | 2011-08-16 | Dartmouth College | organismos termofìlicos para conversão de biomassa lignocelulósica em etanol |
US20070280489A1 (en) * | 2006-03-28 | 2007-12-06 | Numark Industries, Llc | Docking system and mixer for portable media devices with graphical interface |
WO2007131750A1 (en) | 2006-05-16 | 2007-11-22 | Dsm Ip Assets B.V. | Process for the production of panthenol |
MY147186A (en) * | 2007-02-09 | 2012-11-14 | Univ California | Biofuel production by recombinant microorganisms |
US8455239B2 (en) * | 2007-12-23 | 2013-06-04 | Gevo, Inc. | Yeast organism producing isobutanol at a high yield |
ES2563040T3 (es) * | 2007-12-23 | 2016-03-10 | Gevo, Inc. | Organismo de levadura que produce isobutanol a un alto rendimiento |
WO2009086391A2 (en) | 2007-12-27 | 2009-07-09 | Gevo, Inc. | Recovery of higher alcohols from dilute aqueous solutions |
KR101985153B1 (ko) | 2009-10-26 | 2019-05-31 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 글리코실화된 면역글로불린의 제조 방법 |
US20130316364A1 (en) * | 2012-05-23 | 2013-11-28 | Lanzatech New Zealand Limited | Selection Method and Recombinant Microorganisms and uses Therefor |
EP3655537A1 (en) | 2017-08-23 | 2020-05-27 | Danisco US Inc. | Methods and compositions for efficient genetic modifications of bacillus licheniformis strains |
CN111088206A (zh) * | 2020-01-07 | 2020-05-01 | 江南大学 | 一种酶法生产d-泛酸的方法 |
CN115109736B (zh) * | 2021-03-23 | 2024-05-07 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种产泛解酸的微生物及其构建方法和应用 |
CN115595314A (zh) * | 2022-03-07 | 2023-01-13 | 中国科学院微生物研究所(Cn) | 表达天冬氨酸脱氢酶的工程菌及发酵生产维生素b5的方法 |
CN115595328A (zh) * | 2022-03-07 | 2023-01-13 | 中国科学院微生物研究所(Cn) | 天冬氨酸脱羧酶在发酵生产维生素b5中的应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001021772A2 (en) * | 1999-09-21 | 2001-03-29 | Basf Aktiengesellschaft | Methods and microorganisms for production of panto-compounds |
Family Cites Families (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5242821A (en) * | 1989-07-10 | 1993-09-07 | Valio, Finnish Co-Operative Dairies' Association | Lactococcus promoter and signal sequences for expression in bacteria |
EP0493060A3 (en) | 1990-12-25 | 1993-04-14 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Production method of d-pantothenic acid and plasmids and microorganisms thereof |
JP3710497B2 (ja) | 1992-09-25 | 2005-10-26 | ビーエーエスエフ アクチェンゲゼルシャフト | D−パント酸、d−パントテン酸およびそれらの塩の製造法 |
ATE264392T1 (de) * | 1995-09-13 | 2004-04-15 | Basf Ag | Verfahren zur herstellung von d-pantoinsäure und d-pantothensäure oder deren salze |
US5834259A (en) | 1996-10-28 | 1998-11-10 | Monsanto Company | Process and composition for preparing D-aspartic acid |
DE19846499A1 (de) * | 1998-10-09 | 2000-04-20 | Degussa | Verfahren zur Herstellung von Pantothensäure durch Verstärkung von für Ketopantoat-Reduktase kodierenden Nukleotidsequenzen |
US6787334B1 (en) * | 1998-10-09 | 2004-09-07 | Degussa Ag | Process for the preparation of pantothenic acid by amplification of nucleotide sequences which code for the ketopantoate reductase |
DE19855314A1 (de) * | 1998-12-01 | 2000-06-08 | Degussa | Verfahren zur fermentiven Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
DE19855313A1 (de) * | 1998-12-01 | 2000-06-08 | Degussa | Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure durch Verstärkung des panD-Gens in Mikroorganismen |
DE19855312A1 (de) * | 1998-12-01 | 2000-06-08 | Degussa | Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung coryneformer Bakterien |
DE10021515A1 (de) | 2000-05-03 | 2001-11-08 | Degussa | Verfahren zur Herstellung von Erdalkalisalzen der D-Pantothensäure |
JP2005503758A (ja) | 2001-01-19 | 2005-02-10 | ビーエーエスエフ アクチェンゲゼルシャフト | 3−(2−ヒドロキシ−3−メチル−ブチリルアミノ)−プロピオン酸(hmbpa)の製造方法及び微生物 |
US7244593B2 (en) * | 2001-01-19 | 2007-07-17 | Basf Aktiengesellschaft | Microorganisms and processes for enhanced production of pantothenate |
JP4217070B2 (ja) | 2001-01-19 | 2009-01-28 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | パントテネートの産生増強法 |
DE10106460A1 (de) * | 2001-02-13 | 2002-08-14 | Degussa | Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen |
AU2002316575A1 (en) | 2002-07-03 | 2004-01-23 | Basf Aktiengesellschaft | Microorganisms and processes for enhanced production of pantothenate |
CA2491145A1 (en) * | 2002-07-03 | 2004-01-15 | Basf Aktiengesellschaft | Microorganisms and processes for enhanced production of pantothenate |
KR101357443B1 (ko) * | 2003-02-25 | 2014-02-06 | 메디뮨 엘엘씨 | 인플루엔자 백신 조성물의 제조 방법 |
-
2003
- 2003-07-03 CA CA002491145A patent/CA2491145A1/en not_active Abandoned
- 2003-07-03 JP JP2004520007A patent/JP2006504408A/ja active Pending
- 2003-07-03 US US10/520,220 patent/US7989187B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-07-03 AU AU2003251792A patent/AU2003251792A1/en not_active Abandoned
- 2003-07-03 CN CNA038157845A patent/CN1788089A/zh active Pending
- 2003-07-03 EP EP03763335A patent/EP1660667A4/en not_active Withdrawn
- 2003-07-03 US US10/614,333 patent/US7291489B2/en active Active
- 2003-07-03 MX MXPA04012812A patent/MXPA04012812A/es active IP Right Grant
- 2003-07-03 WO PCT/US2003/021305 patent/WO2004005525A2/en active Search and Examination
-
2004
- 2004-12-31 IN IN3051CH2004 patent/IN2004CH03051A/xx unknown
- 2004-12-31 IN IN3053CH2004 patent/IN2004CH03053A/xx unknown
-
2005
- 2005-02-02 ZA ZA200500948A patent/ZA200500948B/en unknown
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001021772A2 (en) * | 1999-09-21 | 2001-03-29 | Basf Aktiengesellschaft | Methods and microorganisms for production of panto-compounds |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20060141585A1 (en) | 2006-06-29 |
CA2491145A1 (en) | 2004-01-15 |
IN2004CH03051A (en) | 2006-02-17 |
US20040146996A1 (en) | 2004-07-29 |
US7989187B2 (en) | 2011-08-02 |
MXPA04012812A (es) | 2005-02-24 |
AU2003251792A8 (en) | 2004-01-23 |
US7291489B2 (en) | 2007-11-06 |
WO2004005525A2 (en) | 2004-01-15 |
IN2004CH03053A (en) | 2006-02-17 |
ZA200500948B (en) | 2006-12-27 |
CN1788089A (zh) | 2006-06-14 |
AU2003251792A1 (en) | 2004-01-23 |
EP1660667A4 (en) | 2011-01-05 |
WO2004005525A3 (en) | 2006-02-02 |
EP1660667A2 (en) | 2006-05-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP1390519B1 (en) | Microorganisms and processes for enhanced production of pantothenate | |
EP1214420B1 (en) | Methods and microorganisms for production of panto-compounds | |
JP2006504408A (ja) | パントテン酸の高生産のための微生物及び方法 | |
AU2002243526A1 (en) | Microorganisms and processes for enhanced production of pantothenate | |
US7220561B2 (en) | Processes for enhanced production of pantothenate | |
US8232081B2 (en) | Methods and microorganisms for production of panto-compounds | |
JP2005531326A (ja) | パントテン酸の高生産のための微生物及び方法 | |
JP2005503758A (ja) | 3−(2−ヒドロキシ−3−メチル−ブチリルアミノ)−プロピオン酸(hmbpa)の製造方法及び微生物 | |
ZA200203116B (en) | Methods and microorgansims for production of panto-compounds. |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060628 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090616 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090916 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20091124 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20100222 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20100301 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100324 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20100608 |