CN101341253A

CN101341253A - 用于转化木质素纤维素生物质为乙醇的嗜热有机体

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Publication number: CN101341253A
Application number: CNA2006800408762A
Authority: CN
Inventors: 苏尼尔·G·德赛; 亚瑟·约瑟夫斯·肖四世; 李·R·林德; 米哈伊尔·V·秋林
Original assignee: Dartmouth College
Current assignee: Dartmouth College
Priority date: 2005-10-31
Filing date: 2006-10-31
Publication date: 2009-01-07
Also published as: ZA200803554B

Abstract

本发明公开了消耗多种来自生物质的底物的突变嗜热有机体。本发明公开了消除乙酸激酶和磷酸转乙酰酶表达的解糖热厌氧杆菌菌株。另外，通过定点同源重组以敲除乙酸和乳酸产生从而将菌株ALK1工程化。涉及底物浓度激发的连续培养使得ALK1演化并形成更强健的命名为ALK2的菌株。所述两种有机体都产生接近理论的乙醇产率而不表达丙酮酸脱羧酶。

Description

用于转化木质素纤维素生物质为乙醇的嗜热有机体

相关技术描述

生物质代表了便宜且容易获得的纤维素分解底物，可由其生产糖类。这些糖类可单独用于生产或发酵生产醇类和其他产物。生物转化产物中，最另人感兴趣的是乙醇，这是因为它可用作可再生的民用燃料。

在反应器设计、预处理方案和分离技术领域已进行了有意义的研究，因此生物转化处理经济上将与石油燃料技术竞争。然而，估计当两个或更多个处理步骤组合时可获得成本的最大节约。例如，同步糖化发酵(SSF)与同步糖化共发酵(SSCF)方法在单一反应器或连续加工仪器中将酶促糖化步骤与发酵组合。除了与较短反应时间和降低的资金成本相关的节约外，共发酵处理还可提供改进的产物产率，这是因为通过共发酵有机体消耗了在抑制代谢或水解的水平另外产生的某些化合物。在一个这样的实施例中，在存在葡萄糖的情况下β-葡糖苷酶停止水解纤维二糖，而纤维二糖的积累又阻止纤维素降解。涉及共发酵纤维素和半纤维素水解产物的SSCF方法可通过将葡萄糖转化为不抑制β-葡糖苷酶水解活性的一种或多种产物而缓解了这个问题。

联合生物加工(CBP)涉及四个生物介导的事件：(1)酶生成、(2)底物水解、(3)己糖发酵和(4)戊糖发酵。这些事件可在单一步骤中进行。该策略需要利用纤维素和半纤维素的微生物。与在专门的加工步骤中生产解糖酶的较常用方法相比，开发CBP有机体可能使得成本大大降低。利用多于一种的有机体完成四个生物介导事件的CBP方法被称为联合生物加工共培养发酵。

一些细菌具有如下能力：将戊糖糖类转化成为己糖糖类，并且通过糖酵解将己糖糖类发酵成为有机酸和其他产物的混合物。糖酵解途径从六碳葡萄糖分子转化成为两个三碳丙酮酸分子开始。接着丙酮酸通过乳酸脱氢酶(“ldh”)的作用转化为乳酸，或者通过丙酮酸脱氢酶或丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶的作用转化为乙酰辅酶A(“乙酰基-CoA”)。乙酰基-CoA进一步通过磷酸转乙酰酶和乙酸激酶转化为乙酸，或者通过乙醛脱氢酶(“AcDH”)和乙醇脱氢酶(“adh”)还原为乙醇。总的来说，生成乙醇的有机体的特性被生成除乙醇以外的有机产物抵消，尤其是ldh-介导的丙酮酸转化为乳酸和通过磷酸转乙酰酶和乙酸激酶乙酰基-CoA转化为乙酸。

最近细菌代谢工程使得在嗜热厌氧革兰氏阳性菌解糖热厌氧杆菌(T.saccharolyticum)中产生乳酸脱氢酶敲除。参见Desai，S.G.；Guerinot，M.L.；Lynd，L.R.“Cloning of L-lactate dehydrogenase and elimination oflactic acid production via gene knockout in Thermoanaerobacteriumsaccharolyticum JW/SL-YS485(克隆L-乳酸脱氢酶并通过基因敲除在解糖热厌氧杆菌JW/SL-YS485中O消除乳酸产生)”Appl.Microbiol。Biotechnol.65：600-605，2004。

尽管敲除ldh在本领域中取得进展，但由于该解糖热厌氧杆菌菌株持续产生有机酸尤其是乙酸，对于所述有机体的一些应用尚有疑问。

发明概述

通过提供消耗多种来自生物质的底物和生成接近理论产率乙醇的嗜热厌氧菌，本方法发展了本领域，并克服了上述所列的问题。还公开了采用所述有机体生产乙醇的方法。

本文报导的方法使得单一或者组合敲除多种基因，其中天然有机体的这种基因另外导致生成有机酸。例如，在解糖热厌氧杆菌JW/SL-YS485中可敲除：(a)乙酸激酶和/或磷酸转乙酰酶和(b)乳酸脱氢酶(ldh)、乙酸激酶(ack)和磷酸转乙酰酶(pta)。尽管本文报导的结果针对解糖热厌氧杆菌，但所述方法和材料也应用于热厌氧杆菌属的其他成员，包括热产硫热厌氧杆菌(Thermoanaerobacteriumthermosulfurigenes)、Thermoanaerobacterium aotearoense、解多糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium polysaccharolyticum)、玉米热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium zeae)、热解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)和解木聚糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium xylanolyticum)。所述方法和材料通常用于代谢上工程化的嗜热革兰氏阳性菌领域。

在一个实施方案中，不表达丙酮酸脱羧酶的分离的有机体发酵分解纤维素的底物以至少90％理论产率的浓度生产乙醇。

在一个实施方案中，在天然状态下包含至少一种基因的革兰氏阳性菌被转化以消除所述至少一种基因的表达，所述至少一种基因赋予革兰氏阳性菌生成乙酸发酵产物的能力。所述细菌可以是诸如解糖热厌氧杆菌的热厌氧杆菌属。使得革兰氏阳性菌具有生成乙酸发酵产物能力的基因可编码乙酸激酶和/或磷酸转乙酰酶的表达。

在另一个实施方案中，所述革兰氏阳性菌可进一步被转化以消除赋予所述革兰氏阳性菌生成乳酸发酵产物的能力的一种或多种基因的表达。例如，赋予生产乳酸能力的基因可以是乳酸脱氢酶。

在一个实施方案中，生产乙醇的方法包括：转化天然有机体以产生如下革兰氏阳性菌：已被转化消除了使得革兰氏阳性菌具有生成有机酸发酵产物能力的所有基因的表达，以及产生转化的细菌宿主；在适合条件下经足以使得糖化和发酵底物的时段，在含有包括选自葡萄糖、木糖、纤维二糖、蔗糖、木聚糖、淀粉及其组合的物质的底物的培养基中培养转化的细菌宿主。

在一个实施方案中公开了命名为ALK1并以专利保藏命名号PTA-7206在ATCC保藏的微生物的生物纯培养物。

在一个实施方案中，分离的多核苷酸包括：(a)SEQ ID NO：10的序列，或(b)SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的序列，或(c)与(a)或(b)的序列具有至少约90％序列一致性的序列。本文公开了包括分离的多核苷酸(a)、(b)或(c)的载体，以及遗传上工程化为表达多核苷酸(a)、(b)或(c)互补序列的宿主细胞。在一个实施方案中，分离的多核苷酸包括与序列(a)或(b)具有至少约95％序列一致性的序列。

在一个实施方案中，生产乙醇的方法包括：在适合条件下经足以使得发酵底物为乙醇的时段，在含有选自葡萄糖、木糖、纤维二糖、蔗糖、木聚糖、淀粉及其组合的底物的培养基中培养表达分离的多核苷酸(a)、(b)或(c)互补序列的突变细菌。

附图简述

图1显示了糖酵解途径的反应。

图2显示了与解糖热厌氧杆菌的各种敲除菌株相比，野生型解糖热厌氧杆菌中的氢产生。

图3显示了整合到解糖热厌氧杆菌基因组中的***载体pSGD9(SEQ ID NO：9)中ldh区的实验性多核苷酸序列和期望的多核苷酸序列的比较。

图4显示了整合到解糖热厌氧杆菌基因组中的***载体pSGD8-Erm(SEQ ID NO：10)中pta/ack区的实验性多核苷酸序列和期望的多核苷酸序列的比较。

图5-7显示了ALK1生长过程中不同时间间隔发酵液的高效液相色谱(HPLC)描绘图。

图8显示了菌株ALK1发酵过程中木糖、有机酸和乙醇的浓度。

图9显示了野生型解糖热厌氧杆菌发酵过程中木糖、有机酸和乙醇的浓度。

图10显示了ALK1连续培养激发过程中木糖、有机酸和乙醇的浓度。

图11显示了菌株ALK2发酵过程中木糖、有机酸和乙醇的浓度。

详细描述

现在我们来说明和描述工程化和利用嗜热厌氧革兰氏阳性菌转化生物质为乙醇的方法。

如本文用到的，如果没有以有意改变有机体遗传和/或表型结构的方式遗传工程或人工另外地操作有机体，那么有机体处于“天然状态”。例如，野生型有机体被认为处于天然状态。

采用两个定点DNA同源重组事件实现完全消除天然状态解糖热厌氧杆菌的有机酸产生。在温度范围约30-66℃、pH范围约3.85-6.5的分批培养中突变菌株解糖热厌氧杆菌JW/SL-YS485 ALK1(“ALK1”)以低底物补料产生接近理论量的乙醇。在一个实施方案中，乙醇产率为至少约90％的理论最高限度。由于在同步糖化共发酵(SSCF)加工中ALK1及其子代的生长条件对纤维素酶活性大体上是最佳的，所以它们在木质素纤维素生物质到乙醇的转化中可能有助于显著的节约。例如，最佳的纤维素酶活性参数包括pH 4-5和40-50℃的温度。另外，当采用无生成有机酸能力的敲除的有机体时，不必要调节发酵液的pH。ALK1和相似的有机体也适合用于联合生物加工共培养发酵，其中敲除的有机体转化戊糖类为乙醇，以及纤维素被诸如热纤梭菌(C.thermocellum)的分解纤维素的有机体降解。

在嗜热温度比30-37℃的常规嗜温发酵温度进行SSCF或者CBP加工具有一些重要的益处。尤其是，专用于纤维素酶产生的加工步骤的成本对于嗜热SSCF大体上降低(例如2倍或更多)，对于CBP则消除。预期与发酵罐冷却以及发酵前后热交换相关的成本对于嗜热SSCF和CBP都降低。最后，与特征为常规嗜温生物催化剂的方法相比，特征为嗜热生物催化剂的方法对微生物污染具有较小的敏感性。

不同于诸如天然存在的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、大肠杆菌(Escherchia coli)的重组菌株和产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)的重组菌株的已知的“同型乙醇发酵”微生物，本文公开的有机体不依赖通过丙酮酸脱羧酶的作用转化丙酮酸为乙醛(图1、9)。实际上，属于热厌氧杆菌属的细菌在天然状态不表达丙酮酸脱羧酶。从图1所示的糖酵解途径反应中可观察到丙酮酸可被丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶2代谢为乙酰基-CoA、二氧化碳和还原的铁氧还蛋白。然而，为了生成作为唯一发酵产物的乙醇，由还原的铁氧还蛋白携带的电子必须通过NAD：铁氧还蛋白氧化还原酶3转移到NAD形成NADH。随后在通过乙醛脱氢酶7和乙醇脱氢酶8两步还原乙酰基-CoA为乙醇的过程中，NADH被氧化回NAD。在图2中可观察到NADH的有效利用，这是因为不能表达ack和pta的乙酸敲除有机体和不能表达ack、pta和ldh的双敲除有机体(ALK1)的H₂产生都降低。这些有机体提供了化学当量的电子从还原的铁氧还蛋白转移到NAD并随后到乙醇的第一个证据。

在不具有表达PDC能力的有机体中产生化学当量乙醇的上述途径不同于所有先前描述的同型乙醇发酵菌株中所采用的途径。先前描述的菌株采用内源丙酮酸脱羧酶(PDC)，或被工程化为表达外源PDC。由于PDC的表达在微生物界是稀少的，因此根据碳流的修改来更改电子流的能力具有广泛的含义。例如，在除解糖热厌氧杆菌以外的菌株中采用该方法生产高产率乙醇和/或生产除乙醇外的溶剂。尤其是革兰氏阳性菌，如热厌氧杆菌属的成员、热纤梭菌(Clostridium thermocellum)和其他嗜热与嗜温梭菌(Clostridia)、嗜热与嗜温芽孢杆菌属(Bacillus)；革兰氏阴性菌，如大肠杆菌和产酸克雷伯氏菌、产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)和其他丝状杆菌属、那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)和其他栖热袍菌属；以及包括Neocallimatix和Piromyces的厌氧真菌没有表达PDC的能力，可从公开的方法中获益。

应理解木质素纤维素物质可以为包含葡萄糖、木糖、甘露糖、***糖、半乳糖、果糖、纤维二糖、蔗糖、麦芽糖、木聚糖、甘露聚糖和淀粉的一种或多种的任意原料。在各种实施方案中，木质素纤维素生物质包括木材、玉米秸、锯屑、树皮、树叶、农业和林业残渣、诸如柳叶稷的草、反刍动物消化产物、城市垃圾、造纸厂流出物、报纸、纸板或其组合。

实施例1

生成ALK1菌株

材料和方法

解糖热厌氧杆菌菌株JW/SL-YS485(DSM 8691)是从怀俄明州黄石国家公园西拇指盆地(the West Thumb Basin in Yellowstone NationalPark，Wyoming)分离的嗜热厌氧菌(Lui，S.Y；Gherardini，F.C.；Matuschek，M.；Bahl，H.；Wiegel，J.“Cloning，sequencing，and expressionof the gene encoding a large S-layer-associated endoxylanase fromThermoanaerobacterium sp strain JW/SL-YS485 in Escherichia coli(在大肠杆菌中克隆、测序和表达编码来自热厌氧杆菌sp菌株JW/SL-YS485的大S层相关的木聚糖内切酶)”J.Bacteriol.178：1539-1547，1996；Mai，V.；Wiegel，J.“Advances in development of a genetic system forThermoanaerobacterium spp：Expression of genes encoding hydrolyticenzymes，development of a second shuttle vector，and integration of genesinto the chromosome(热厌氧杆菌spp遗传***开发的进展：编码水解酶的基因的表达、开发第二穿梭载体和整合基因到染色体中)”Appl.Environ.Microbiol.66：4817-4821，2000)。该菌株在30-66℃的温度范围和3.85-6.5的pH范围生长。它消耗多种来自生物质的底物，包括单糖类葡萄糖和木糖、双糖类纤维二糖和蔗糖以及多糖类木聚糖和淀粉，但没有纤维素。所述有机体生成作为主发酵产物的乙醇和有机酸乳酸与乙酸。

克隆和测序

采用标准技术鉴定和测序乳酸脱氢酶(L-ldh)、磷酸转乙酰酶(pta)和乙酸激酶(ack)基因，如先前对L-ldh的(Desai，2004)的报导。采用CODE-HOP算法(Rose，T.；Schultz，E.；Henikoff，J.；Pietrokovski，S.；McCallum，C；Henikoff，S.“Consensus-degenerate hybrid oligonucleotideprimers for amplification of distantly-related sequences(用于扩增间隔相关的序列的共有序列简并杂交寡核苷酸引物)”Nucleic Acids Research，26(7)：1628-1635，1 Apr 1998)获得简并引物，进行PCR反应获得保守区之间的DNA序列。用BigDye Terminator试剂盒v3.1(ABI，Foster CityCA)采用ThermoFidelase(Fidelity Systems，Gaithersburg，MD)酶直接从基因组DNA测序保守区之外的基因片段。

构建***载体

乙酸激酶和磷酸转乙酰酶敲除的载体，pSGD9

标准克隆技术如下(Sambrook)。采用类似于早先报导的设计方法(Desai，2004；Mai，2000)获得基于pBLUESCRIPT II SK(+)(Stratagene)的6.2kb***载体pSGD9。采用引物对SEQ ID NO：1-2和SEQ ID NO：3-4从基因组DNA扩增pta/ack序列、pta上游(约1.2kb)和ack下游(约0.6kb)的基因片段。采用pfu DNA聚合酶进行PCR扩增，从1％电泳凝胶中提取片段。接着采用Taq聚合酶对片段pta上游和ack下游加A尾，并将其克隆到TOPO pCR2.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。由PstI/XbaI酶切pIKM1获得含有卡那霉素标记的1.5kb片段，并将其亚克隆到pBLUESCRIPT II SK(+)。采用XhoI/BsiHKAI酶切含有pta上游的TOPO，并将其亚克隆到XhoI/PstI酶切的pBLUESCRIPT II SK(+)、先前亚克隆的卡那霉素标记的上游区。采用XbaI/SphI酶切含有ack下游的TOPO，并将其亚克隆到pUC19(Invitrogen)。酶切含有ack下游的XbaI/AflIII片段并将其亚克隆到卡那霉素标记的下游获得最终构建体pSGD9。

具有红霉素抗性的乳酸脱氢酶敲除的载体，pSGD8-Erm

5.5kb***载体pSGD8-Erm基于质粒pSGD8，如Desai et al.2004所生产的。采用基于来自质粒pIKM1的aph启动子和来自质粒pCTC1的赋予红霉素抗性的腺嘌呤甲基化酶基因的融合基因(Klapatch，T.R.；Guerinot，MX.；Lynd，L.R.“Electrotransformation of Clostridiumthermosaccharolyticum(电转化热解糖梭菌(Clostridiumthermosaccharolyticum))”J.Ind.Microbiol.16(6)：342-7，June 1996)代替aph卡那霉素抗生素标记用于选择。采用pfu聚合酶(Stategene)和aph启动子的引物SEQ ID NO：5-6以及腺嘌呤甲基化酶开放读码框的引物SEQ ID NO：7-8产生PCR基因片段。采用XbaI/BamH1(aph片段)和BamHI/EcoRI(腺嘌呤甲基化酶)酶切片段，并连接到pIKM1的多克隆位点。随后用BseRI/EcoRI切断该融合基因，并连接到类似酶切的pSGD8。

转化解糖热厌氧杆菌

可替换地采用如下两种方法转化解糖热厌氧杆菌：第一种如先前所描述的(Mai，V.；Lorenz，W.；Weigel，J.“Transformation ofThermoanaerobacterium sp.strain JW/SL-YS485 with plasmid PIKM1conferring kanamycin resistance(用赋予卡那霉素抗性的PIKM1质粒转化热厌氧杆菌sp菌株JW/SL-YS485)”FEMS Microbiol.Lett.148：163-167，1997)，第二种在细胞收集后有一些改良，基于针对热纤梭菌(Clostridium thermocellum)开发的方法(Tyurin，M.V.；Desai，S.G.；Lynd，L.R.“Electrotransformation of Clostridium thermocellum(热纤梭菌的电转化)”Appl.Environ.Microbiol.70(2)：883-890，2004)。在保温箱维持55℃的厌氧培养室内的无菌一次性培养管中采用预先还原的培养基DSMZ 122使得细胞生长过夜。其后用4μg/ml异烟酸酰肼(异烟酸)亚培养细胞，停滞期开始后添加细胞壁弱化剂(Hermans，J.；Boschloo，J.G.；de Bont，J.A.M.“Transformation of M.aurum by electroporation：the useof glycine，lysozyme and isonicotinic acid hydrazide in enhancingtransformation efficiency(通过电穿孔转化金色分枝杆菌(M.aurum)：甘氨酸、溶菌酶和异烟酸酰肼在增强转化效率中的用途)”FEMSMicrobiol.Lett.72，221-224，1990)到培养基中。收集指数生长期的细胞，用预先还原的冷却无菌200mM纤维二糖溶液洗涤，在相同溶液中再悬浮，置于冰上。在收集细胞后的所有时间(包括离心过程中的时间)极小心地保持其冷却(约4℃)。

将由90μl细胞悬浮液和仅在脉冲应用前添加的2-6μl pSGD9或pSGD8-Erm(1-3μg)组成的样品放入用作电转化电转杯的无菌2ml一次性聚丙烯微量离心管中。采用定制的脉冲发生器/钛电极***应用设置为10ms脉冲长度的方波。当脉冲电压以200V增量线性增加时，以非线性电流变化评价对应于细胞样品中电穿孔形成的电压阈值。采用在给定DNA浓度时提供转化产率与细胞存活率的最佳比率的特定电压，在这种特定情况下为25kV/cm。最初用500μl DSM 122培养基稀释脉冲细胞，置于冰上10分钟，接着在55℃恢复4-6小时。恢复之后，将pSGD9转化的细胞与含有75μg/ml卡那霉素的2％琼脂培养基混合，倒入培养皿，在厌氧培养罐中孵育4天。使得pSGD8-Erm转化的细胞在48℃恢复4-6小时，在含有5μg/ml红霉素的pH6.0的2％琼脂培养基或相似的液体培养基中铺板，在厌氧培养罐中于48℃孵育6天。可采用任一转化的细胞系，无需进一步操作。然而，通过进行第二次(连续的)转化获得了消除所有赋予生成有机酸能力的基因表达的有机体。采用初级转化细胞取代非转化的细胞悬浮液如上所述进行第二次转化。在含有卡那霉素和红霉素的培养基上培养次级转化细胞ALK1。

敲除区的测序

采用Taq聚合酶(New England Biolabs)和基因组与***载体之间同源重叠区之外的引物通过PCR从基因组DNA中测序定点敲除区。PCR产物内的引物与BigDye Terminator试剂盒v3.1(ABI，Foster City，CA)一起用于测序。采用CAP3软件程序(Huang，X.“An improvedsequence assembly program(改进的序列汇编程序)”Genomics 33：21-31，1996)配置区域，并采用CLUSTALW算法(Higgins，D.G.；Bleasby，A.J.；Fuchs，R.“CLUSTAL V：improved software for multiple sequencealignment(CLUSTAL V：改进的多序列比对软件)”ComputerApplications in the Biosciences(CABIOS)，8(2)：189-191，1992)与期望的DNA序列比较。基于已知的野生型和***载体序列，实验性编译的序列与期望的序列之间存在高度同源性(百分比一致性)(图3和图4)。

“一致性”指核酸分子对或氨基酸分子对之间的比较。测定序列一致性的方法是已知的。参见，例如出于这个目的通常采用的计算机程序，如Gap程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8 forUnix，Genetics Computer Group，University Research Park，MadisonWisconsin)，它采用了Smith and Waterman，1981，Adv.Appl.Math.2：482-489的算法。

验证突变菌株

通过DNA测序，来自突变菌株解糖热厌氧杆菌JW/SL-YS485ALK1(“ALK1”)的基因组DNA显示在L-ldh和pta/ack基因座中期望的定点同源重组。两个整合事件都为双重整合，为遗传上更加稳定的基因型。

实施例2

比较的数据显示ALK1和野生型解糖热厌氧杆菌生成乙醇

在含有2.5g/L酵母抽提物的部分限定的MTC培养基中(Zhang，Y.；Lynd，L.R.“Quantification of cell and cellulase mass concentrationsduring anaerobic cellulose fermentation：development of anenzyme-linked immunosorbent assay-based method with application toClostridium thermocellum batch cultures(在厌氧纤维素发酵过程中定量细胞和纤维素酶的质量浓度：开发基于酶联免疫吸附剂测定的应用于热纤梭菌分批培养物的方法)”Anal.Chem.75：219-222，2003)培养解糖热厌氧杆菌。于55℃在Aminex 87H柱子(BioRad Laboratories，Hercules，CA)上通过HPLC分析葡萄糖、木糖、乙酸、乳酸和乙醇。移动相包含5mM硫酸，流速为0.7ml/分钟。采用Waters 410折射计(Milford，MA)通过折射率检测。乙酸的最小检测水平为1.0mM。图5显示了含有5g/L木糖、5g/L乳酸、5g/L乙酸和5g/L乙醇的标准描绘图。

菌株ALK1仅产生乙醇和达17g/L的木糖或5g/L的木糖和5g/L的葡萄糖，不产生有机酸或通过HPLC检测到的其他产物。图6显示0小时时的ALK1菌株发酵，图7显示72小时时的相同发酵。菌株ALK1和野生型在用8g/L MES缓冲的木糖培养基中于起始pH 6.0、55℃和100rpm的时间过程发酵图显示菌株ALK1能转化超过99％的木糖为乙醇(图8)，而在相似条件下，野生型由于有机酸产生而受pH限制且不能消耗所有存在的木糖(图9)。野生型有机体产生0.15mM乙醇，而ALK1产生0.46mM乙醇。

实施例3

ALK1的演化

如图10所示，采用随时间增加补料底物浓度的连续培养以激发ALK1。图10显示连续培养过程中木糖、木酮糖和乙醇的浓度。暴露在这种应激-演化循环超过1000小时后，从发酵液中分离改良的菌株ALK2。在分批培养中ALK2能够启动在50g/L木糖的生长。图11显示菌株ALK2发酵过程中木糖、有机酸、光密度(OD)和乙醇的浓度。

ALK1的保藏

ALK1保藏在美国典型培养物保藏中心(the American Type CultureCollection，Manassas，VA 20110-2209)。2005年11月1日进行保藏，获得专利保藏号PTA-7206。该保藏按照布达佩斯条约的要求，保藏期间为从保藏日起30年，或最后请求在保藏处的保藏物之后5年或从该申请中批准的美国专利有效期，其中以较久的期限为准。如果ALK1在保藏处不能存活时应重新保藏。

具体实施方案的描述显示一般概念，在不偏离一般概念的情况下可修改和/或改变以用于各种应用或用途。因此，这种修改和改变应当并意欲包括在公开实施方案的等同物的含义和范围内。应理解本文所采用的用语或术语出于说明的目的，并不是限制。

可适当地修改前述实施例以用于任意革兰氏阳性菌，尤其是热厌氧杆菌属的成员，包括热产硫磺热厌氧杆菌、Thermoanaerobacteriumaotearoense、解多糖热厌氧杆菌、玉米热厌氧杆菌、热解糖热厌氧杆菌和解木聚糖热厌氧杆菌。

本申请提及的所有参考文献通过引用并入本申请，达到如同在此全部复制的程度。

序列表

<110>达特默斯大学托管会

李·R·林德

亚瑟·约瑟夫斯·肖

苏尼尔·G·德赛

米哈伊尔·V·秋林

<120>用于转化木质素纤维素生物质为乙醇的嗜热有机体

<130>454555

<140>尚未指定

<141>2006-10-31

<150>US 60/731,674

<151>2005-10-31

<150>US 60/796,380

<151>2006-05-01

<160>10

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pta引物

<400>1

acatgcatgc ccatttgtct ataatagaag gaag 34

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pta引物

<400>2

cgtcaacaat atctctatag ctgc 24

<210>3

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>ack引物

<400>3

gctctagagc atagaattag ctccactgc 29

<210>4

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>ack引物

<400>4

acatgcatgc cgacgcctcc catagctgct gcat 34

<210>5

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>aph引物

<400>5

tggatccgcc atttattatt tccttcctct tttc 34

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>aph引物

<400>6

ttctagatgg ctgcaggtcg ataaacc 27

<210>7

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>腺嘌呤甲基化酶引物

<400>7

gcggatccca tgaacaaaaa tataaaatat tctc 34

<210>8

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>腺嘌呤甲基化酶引物

<400>8

gcgaattccc tttagtaacg tgtaactttc c 31

<210>9

<211>2778

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>解糖热厌氧杆菌L-ldh基因座的敲除

<400>9

ggaaacgaat agtaaaggaa tggaggcgaa ttaatgagta atgtcgcaat gcaattaata 60

gaaatttgtc ggaaatatgt aaataataat ttaaacataa atgaatttat cgaagacttt 120

caagtgcttt atgaacaaaa gcaagattta ttgacagatg aagaaatgag cttgtttgat 180

gatatttata tggcttgtga atactatgaa caggatgaaa atataagaaa tgaatatcac 240

ttgtatattg gagaaaatga attaagacaa aaagtgcaaa aacttgtaaa aaagttagca 300

gcataataaa ccgctaaggc atgatagcta aagcggtatt tttatgcaat taaaaggatg 360

aaatgatatc tgataaactg cgaaaaagta ttttagaaaa taactataaa gataatattt 420

caaatcaata aggacaaaat aagattaaaa tttagacaat ttcatcaaaa ctatgttata 480

atattattaa aggaaaatac atattattta ggaggcgatg taatgagcaa ggtagcaata 540

ataggatctg gttttgtagg tgcaacatcg gcatttacgc tggcattaag tgggactgtg 600

acagatatcg tgctggtgga tttaaacaag gacaaggcta taggcgatgc actggacata 660

agccatggca taccgctaat acagcctgta aatgtgtatg caggtgacta caaagatgtg 720

aaaggcgcag atgtaatagt tgtgacagca ggtgctgctc aaaagccggg agagacacgg 780

cttgaccttg taaagaaaaa tacagccata tttaagtcca tgatacctga gcttttaaag 840

tacaatgaca aggccatata tttgattgtg acaaatcccg tagatatact gacgtacgtt 900

acatacaaga tttctggact tccatggggc agagtttttg gttctggcac cgttcttgac 960

agctcaaggt ttagatacct tttaagcaag gactgctgca ggtcgataaa cccagcgaac 1020

catttgaggt gataggtaag attataccga ggtatgaaaa cgagaattgg acctttacag 1080

aattactcta tgaagcgcca tatttaaaaa gctaccaaga cgaagaggat gaagaggatg 1140

aggaggcaga ttgccttgaa tatattgaca atactgataa gataatatat cttttatata 1200

gaagatatcg ccgtatgtaa ggatttcagg gggcaaggca taggcagcgc gcttatcaat 1260

atatctatag aatgggcaaa gcataaaaac ttgcatggac taatgcttga aacccaggac 1320

aataacctta tagcttgtaa attctatcat aattgtggtt tcaaaatcgg ctccgtcgat 1380

actatgttat acgccaactt tgaaaacaac tttgaaaaag ctgttttctg gtatttaagg 1440

ttttagaatg caaggaacag tgaattggag ttcgtcttgt tataattagc ttcttggggt 1500

atctttaaat actgtagaaa agaggaagga aataataaat ggcggatccc atgaacaaaa 1560

atataaaata ttctcaaaac tttttaacga gtgaaaaagt actcaaccaa ataataaaac 1620

aattgaattt aaaagaaacc gataccgttt acgaaattgg aacaggtaaa gggcatttaa 1680

cgacgaaact ggctaaaata agtaaacagg taacgtctat tgaattagac agtcatctat 1740

tcaacttatc gtcagaaaaa ttaaaactga atactcgtgt cactttaatt caccaagata 1800

ttctacagtt tcaattccct aacaaacaga ggtataaaat tgttgggagt attccttacc 1860

atttaagcac acaaattatt aaaaaagtgg tttttgaaag ccatgcgtct gacatctatc 1920

tgattgttga agaaggattc tacaagcgta ccttggatat tcaccgaaca ctagggttgc 1980

tcttgcacac tcaagtctcg attcagcaat tgcttaagct gccagcggaa tgctttcatc 2040

ctaaaccaaa agtaaacagt gtcttaataa aacttacccg ccataccaca gatgttccag 2100

ataaatattg gaagctatat acgtactttg tttcaaaatg ggtcaatcga gaatatcgtc 2160

aactgtttac taaaaatcag tttcatcaag caatgaaaca cgccaaagta aacaatttaa 2220

gtaccgttac ttatgagcaa gtattgtcta tttttaatag ttatctatta tttaacggga 2280

ggaaataatt ctatgagtcg cttttgtaaa tttggaaagt tacacgttac taaagggaat 2340

tctctagaca gagtttgcag catggagcat aacaaacata tcgggtatat catttaatga 2400

gtactgcagc atatgcggac gcgtctgcaa cacaaatttc agaaaggaag tagaagaaga 2460

agtcgtaaat gctgcttaca agataataga caaaaaaggt gctacatact atgctgtggc 2520

agttgcagta agaaggattg tggagtgcat cttaagagat gaaaattcca tcctcacagt 2580

atcatctcca ttaaatggac agtacggcgt gaaagatgtt tcattaagct tgccatctat 2640

cgtaggcagg aatggcgttg ccaggatttt ggacttgcct ttatctgacg aagaagtgga 2700

gaagtttagg cattcagcaa gtgtcatggc agatgtcata aaacaattag atatataatc 2760

aaattatgtt gggaggct 2778

<210>10

<211>3355

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>解糖热厌氧杆菌pta/ack基因座的敲除

<220>

<221>misc_feature

<222>(2632)..(2634)

<223>nisa，c，gort

<220>

<221>misc_feature

<222>(3262)..(3265)

<223>nisa，c，g，ort

<400>10

agcgctgtac gaaattgcca ctcattacag ctacgacaaa gtctgctttt gtcatttcca 60

tagacttttt tatgtgatat acgtgcccat tgtgaagtgg attgtattct acaattaaac 120

ctaatacgct cataatatgc gcctttctaa aaaattatta attgtactta ttattttata 180

aaaaatatgt taaaatgtaa aatgtgtata caatatattt cttcttagta agaggaatgt 240

ataaaaataa atattttaaa ggaagggacg atcttatgag cattattcaa aacatcattg 300

aaaaagctaa aagcgataaa aagaaaattg ttctgccaga aggtgcagaa cccaggacat 360

taaaagctgc tgaaatagtt ttaaaagaag ggattgcaga tttagtgctt cttggaaatg 420

aagatgagat aagaaatgct gcaaaagact tggacatatc caaagctgaa atcattgacc 480

ctgtaaagtc tgaaatgttt gataggtatg ctaatgattt ctatgagtta aggaagaaca 540

aaggaatcac gttggaaaaa gccagagaaa caatcaagga taatatctat tttggatgta 600

tgatggttaa agaaggttat gctgatggat tggtatctgg cgctattcat gctactgcag 660

atttattaag acctgcattt cagataatta aaacggctcc aggagcaaag atagtatcaa 720

gcttttttat aatggaagtg cctaattgtg aatatggtga aaatggtgta ttcttgtttg 780

ctgattgtgc ggtcaaccca tcgcctaatg cagaagaact tgcttctatt gccgtacaat 840

ctgctaatac tgcaaagaat ttgttgggct ttgaaccaaa agttgccatg ctatcatttt 900

ctacaaaagg tagtgcatca catgaattag tagataaagt aagaaaagcg acagagatag 960

caaaagaatt gatgccagat gttgctatcg acggtgaatt gcaattggat gctgctcttg 1020

ttaaagaagt tgcagagcta aaagcgccgg gaagcaaagt tgcgggatgt gcaaatgtgc 1080

ttatattccc tgatttacaa gctggtaata taggatataa gcttgtacag aggttagcta 1140

aggcaaatgc aattggacct ataacacaag gaatgggtgc aggtcgataa acccagcgaa 1200

ccatttgagg tgataggtaa gattataccg aggtatgaaa acgagaattg gacctttaca 1260

gaattactct atgaagcgcc atatttaaaa agctaccaag acgaagagga tgaagaggat 1320

gaggaggcag attgccttga atatattgac aatactgata agataatata tcttttatat 1380

agaagatatc gccgtatgta aggatttcag ggggcaaggc ataggcagcg cgcttatcaa 1440

tatatctata gaatgggcaa agcataaaaa cttgcatgga ctaatgcttg aaacccagga 1500

caataacctt atagcttgta aattctatca taattgtggt ttcaaaatcg gctccgtcga 1560

tactatgtta tacgccaact ttgaaaacaa ctttgaaaaa gctgttttct ggtatttaag 1620

gttttagaat gcaaggaaca gtgaattgga gttcgtcttg ttataattag cttcttgggg 1680

tatctttaaa tactgtagaa aagaggaagg aaataataaa tggctaaaat gagaatatca 1740

ccggaattga aaaaactgat cgaaaaatac cgctgcgtaa aagatacgga aggaatgtct 1800

cctgctaagg tatataagct ggtgggagaa aatgaaaacc tatatttaaa aatgacggac 1860

agccggtata aagggaccac ctatgatgtg gaacgggaaa aggacatgat gctatggctg 1920

gaaggaaagc tgcctgttcc aaaggtcctg cactttgaac ggcatgatgg ctggagcaat 1980

ctgctcatga gtgaggccga tggcgtcctt tgctcggaag agtatgaaga tgaacaaagc 2040

cctgaaaaga ttatcgagct gtatgcggag tgcatcaggc tctttcactc catcgacata 2100

tcggattgtc cctatacgaa tagcttagac agccgcttag ccgaattgga ttacttactg 2160

aataacgatc tggacgatgt ggattgcgaa aactgggaag aagacactcc atttaaagat 2220

ccgcgcgagc tgtatgattt tttaaagacg gaaaagcccg aagaggaact tgtcttttcc 2280

cacggcgacc tgggagacag caacatcttt gtgaaagatg gcaaagtaag tggctttatt 2340

gatcttggga gaagcggcag ggcggacaag tggtatgaca ttgccttctg cgtccggtcg 2400

atcagggagg atatcgggga agaacagtat gtcgagctat tttttgactt actggggatc 2460

aagcctgatt gggagaaaat aaaaaaatat attttactgg atgaattgtt ttagtaccta 2520

gatttagatg tctaaaaagc tttaactaca agctttttag acatctaatc ttttctgaag 2580

tacatccgca actgtccata ctctgatgtt ttatatcttt tctaaaagtt cgnctagata 2640

ggggtcccga gcgcctacga ggaatttgta tcgactctag agcatagaat atagctccac 2700

tgcacaatcc tgctaatata gaaggaatta aagcttgcca gcaaatcatg ccaaacgttc 2760

caatggtggc ggtatttgat acagcctttc atcagacaat gcctgattat gcatatcttt 2820

atccaatacc ttatgaatac tacacaaagt acaggattag aagatatgga tttcatggca 2880

catcgcataa atatgtttca aatagggctg cagagatttt gaataaacct attgaagatt 2940

tgaaaatcat aacttgtcat cttggaaatg gctccagcat tgctgctgtc aaatatggta 3000

aatcaattga cacaagcatg ggatttacac cattagaagg tttggctatg ggtacacgat 3060

ctggaagcat agacccatcc atcatttcgt atcttatgga aaaagaaaat ataagcgctg 3120

aagaagtagt aaatatatta aataaaaaat ctggtgttta cggtatttca ggaataagca 3180

gcgattttag agacttagaa gatgccgcct ttaaaaatgg agatgaaaga gctcagttgg 3240

ctttaaatgt gtttgcatat cgangtaaag aagacgattg gcgcttatgc agcagactat 3300

gggaggcgtc gatgtcattg tatttacagc aggtgtgggt tggaaaatgg gtcca 3355

Claims

1.分离的有机体，所述有机体发酵分解纤维素的底物以至少90％理论产率的浓度生产乙醇，其中所述有机体不表达丙酮酸脱羧酶。

2.生产乙醇的方法，所述方法包括：

转化天然有机体产生如权利要求1所述的分离的有机体以提供转化的宿主；和

在适合条件下经足以使得糖化和发酵底物的时段，在含有包括选自葡萄糖、木糖、甘露糖、***糖、半乳糖、果糖、纤维二糖、蔗糖、麦芽糖、木聚糖、甘露聚糖、淀粉及其组合的物质的所述底物的培养基中培养所述转化的宿主。

3.转化的有机体，所述有机体包括：

在天然状态下包含至少一种基因的革兰氏阳性菌，其中所述至少一种基因赋予革兰氏阳性菌生成乙酸发酵产物的能力；

被转化为消除所述至少一种基因表达的革兰氏阳性菌。

4.如权利要求3所述的革兰氏阳性菌，其中所述革兰氏阳性菌为热厌氧杆菌属的成员。

5.如权利要求3所述的革兰氏阳性菌，其中所述革兰氏阳性菌为解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium saccharolyticum)。

6.如权利要求3所述的革兰氏阳性菌，其中所述至少一种基因编码乙酸激酶的表达。

7.如权利要求3所述的革兰氏阳性菌，其中所述至少一种基因编码磷酸转乙酰酶的表达。

8.如权利要求3所述的革兰氏阳性菌，其中所述至少一种基因包括多种基因。

9.如权利要求8所述的革兰氏阳性菌，其中所述多种基因编码乙酸激酶和磷酸转乙酰酶的表达。

10.如权利要求9所述的革兰氏阳性菌，其中所述革兰氏阳性菌被进一步转化以消除赋予所述革兰氏阳性菌生成乳酸发酵产物的能力的一种或多种基因的表达。

11.如权利要求3所述的革兰氏阳性菌，其中所述革兰氏阳性菌被进一步转化以消除赋予所述革兰氏阳性菌生成乳酸发酵产物的能力的一种或多种基因的表达。

12.如权利要求11所述的革兰氏阳性菌，其中所述至少一种基因编码乳酸脱氢酶的表达。

13.生产乙醇的方法，所述方法包括：

转化天然有机体产生如权利要求11所述的革兰氏阳性菌以产生转化的细菌宿主；和

在适合条件下经足以使得糖化和发酵底物的时段，在含有包括选自葡萄糖、木糖、甘露糖、***糖、半乳糖、果糖、纤维二糖、蔗糖、麦芽糖、木聚糖、甘露聚糖、淀粉及其组合的物质的所述底物的培养基中培养所述转化的细菌宿主。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述细菌宿主为解糖热厌氧杆菌。

15.如权利要求13所述的方法，其中所述基因编码乳酸脱氢酶、乙酸激酶和磷酸转乙酰酶的表达。

16.命名为ALK1并以专利保藏命名号PTA-7206保藏的微生物的生物纯培养物。

17.分离的多核苷酸，所述多核苷酸包括：

(a)SEQ ID NO：10的序列；

(b)SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的序列；或

(c)与(a)或(b)的序列具有至少约90％序列一致性的序列。

18.如权利要求17所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸与(a)或(b)的序列具有约95％序列一致性。

19.包括如权利要求18所述的分离的多核苷酸的载体。

20.遗传上被工程化为表达如权利要求18所述的多核苷酸互补序列的宿主细胞。

21.如权利要求20所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为细菌细胞。

22.生产乙醇的方法，所述方法包括如下步骤：

在适合条件下经足以使得发酵底物为乙醇的时段，在含有选自葡萄糖、木糖、甘露糖、***糖、半乳糖、果糖、纤维二糖、蔗糖、麦芽糖、木聚糖、甘露聚糖、淀粉及其组合的所述底物的培养基中培养如权利要求21所述的突变细菌。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述突变细菌为解糖热厌氧杆菌。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述突变细菌为解糖热厌氧杆菌ALK1(JW/SL-YS485 ALK1)。

25.遗传构建体，所述遗传构建体包括可操作地连接到细菌中可表达的启动子上的SEQ ID NO：10。

26.包括如权利要求25所述的遗传构建体的重组细菌。

27.如权利要求26所述的重组细菌，其中所述细菌为解糖热厌氧杆菌。