CN102433293A - 一种可利用木糖发酵生产光学纯l-乳酸的工程菌及其构建 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可利用木糖发酵生产光学纯L-乳酸的工程菌及其构建方法与应用，该工程菌由以下步骤构建得到：合成卡那抗性基因，并将其***到大肠杆菌和嗜热厌氧杆菌穿梭载体中；扩增乙酸激酶编码基因的某一段序列，为pta-up序列；再将pta-up序列***到大肠杆菌和嗜热厌氧杆菌穿梭载体中，构建得到***载体1；扩增磷酸转乙酰酶编码基因的某一段序列，为ack-down序列；再将ack-down序列***到***载体1中，获得***载体pPuKAd；将***载体pPuKAd转化入嗜热厌氧杆菌，并经抗性筛选后得到可利用木糖发酵生产光学纯L-乳酸的工程菌。用本发明的工程菌进行乳酸的发酵生产，不产生乙酸，碳代谢流进行了重新分配，促进了目标产物L-乳酸的大量积累，所得L-乳酸的光学纯度达99.5％以上。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵及基因工程领域，具体涉及一种乙酸代谢途径缺失的、可利用木糖发酵生产光学纯L-乳酸的工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
乳酸在食品、医药、化妆品、皮革制造业、纺织工业等领域有着广泛的应用。乳酸还是一种重要的化工平台化合物。并且由于近年对可生物降解的聚乳酸的关注，乳酸的廉价获得再次引起研究者的重视。相比于化学合成方法，微生物发酵生成乳酸具有低温、低能耗和低成本等优点(Datta，R.and M.Henry.，Lactic acid：recent advances in products，processes and technologies-a review.Journal of Chemical Technology and Biotechnology，2006，81(7)：1119-1129)。且生物发酵所获得的多为光学纯L型或D型乳酸，而L型乳酸的光学纯度对制备高品质聚乳酸是至关重要的。
随着化石能源危机的不断加重，研究者希望以廉价生物质能源如糖蜜、淀粉或纤维素类废弃物为原料发酵生产乳酸，从而进一步降低乳酸发酵的生产成本。上述的各类廉价生物质能源，因为纤维类生物质具有廉价、来源广泛和不会影响粮食安全等优点，而更加受到研究者的青睐(Tan，T.W.，F.Shang，et al.Current development of biorefinery in China.Biotechnology Advances，2010，28(5)：543-555)。纤维素类生物质主要由葡萄糖和木糖构成。但传统的乳酸发酵菌株通常不能利用木糖为碳源发酵。因此如何获得可有效利用木糖发酵高产乳酸的菌株，是纤维素类生物质生产乳酸工业中至为关键的一点(Wang，L.M.，B.Zhao，etal.，Efficient production of L-lactic acid from corncob molasses，a waste by-productin xylitol production，by a newly isolated xylose utilizing Bacillus sp strain.Bioresource Technology，2010，101(20)：7908-7915)。一些如Bacillus sp.(Wang，L.M.，B.Zhao，et al.，Efficient production of L-lactic acid from corncob molasses，awaste by-product in xylitol production，by a newly isolated xylose utilizing Bacillussp strain.Bioresource Technology，2010，101(20)：7908-7915)，Lactobacilluspentosus，Lactobacillus brevis and Pichia stipitis(Ilmen，M.，K.Koivuranta，et al.，Efficient production of L-lactic acid from xylose by Pichia stipitis.Applied AndEnvironmental Microbiology，2007，73(1)：117-123)Rhizopus(Skory，C.D.Lacticacid production by Rhizopus oryzae transformants with modified lactatedehydrogenase activity.Applied Microbiology and Biotechnology，2004，64(2)：237-242.Skory，C.D.Isolation and expression of lactate dehydrogenase genes fromRhizopus oryzae.Applied And Environmental Microbiology，2000，66(6)：2343-2348)，Saccharomyces(Hetenyi，K.，A.Nemeth，et al.Role of pH-regulation inlactic acid fermentation：Second steps in a process improvement.ChemicalEngineering And Processing，2011，50(3)：293-299)等相继被报道能够以木糖为底物发酵生产乳酸。
嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium aotearoence SCUT27)具有可减少原料前处理过程纤维素酶添加量、能够有效利用木糖、代谢产物简单等优点，而受到研究者的青睐(O-Thong，S.，P.Prasertsan，et al.Thermophilic fermentativehydrogen production by the newly isolated Thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum PSU-2.International Journal of Hydrogen Energy，200833(4)：1204-1214.，Sommer，P.，T.Georgieva，et al.Potential for using thermophilicanaerobic bacteria for bioethanol production from hemicellulose.Biochem ical SocietyTransactions，2004，32：283-289.，Li，S.，C.Lai，et al.High efficiency hydrogenproduction from glucose/xylose by the ldh-deleted Thermoanaerobacterium strain.Bioresource Technology，2010，101(22)：8718-8724.)。特别的，因Thermoanaerobacterium aotearoence SCUT27的最适发酵温度为55℃，能够抑制绝大部分常温微生物的生长，因此该菌株可对发酵工艺过程无菌要求不高，能够大幅度降低生产成本。该菌株的野生型液相代谢产物包括乳酸、乙酸和乙醇，虽然乳酸为其主要代谢产物，但乳酸转化率尚有提高空间。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种可利用木糖发酵生产光学纯L-乳酸的工程菌。
本发明的另一目的在于提供上述可利用木糖发酵生产光学纯L-乳酸的工程菌的构建方法，该方法的关键是将嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacteriumaotearoence SCUT27)丙酮酸代谢生成乙酸的代谢支路阻断，实现碳代谢流重新分配，促进L-乳酸大幅度积累。
本发明的再一目的在于提供上述可利用木糖发酵生产光学纯L-乳酸的工程菌的用途。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种可利用木糖发酵生产光学纯L-乳酸的工程菌，是将嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium aotearoence SCUT27)丙酮酸代谢生成乙酸过程的两个关键酶——磷酸转乙酰酶(phosphotransacetylase，pta)和乙酸激酶(acetatekinase，ack)做基因敲除(knock-out)后得到的。
一种可利用木糖发酵生产光学纯L-乳酸的工程菌，具体是由以下步骤构建得到的：
(1)合成卡那抗性基因(aph基因)，并将其***到大肠杆菌和嗜热厌氧杆菌穿梭载体中；
(2)PCR扩增乙酸激酶编码基因的某一段序列，为pta-up序列；再将pta-up序列***到步骤(1)的已***卡那抗性基因的大肠杆菌和嗜热厌氧杆菌穿梭载体中，构建得到携带有乙酸激酶基因部分同源序列的***载体1；
(3)PCR扩增磷酸转乙酰酶编码基因的某一段序列，为ack-down序列；再将ack-down序列***到***载体1中，获得携带有磷酸转乙酰酶和乙酸激酶部分同源序列的***载体pPuKAd；
(4)将***载体pPuKAd转化入嗜热厌氧杆菌，并经抗性筛选后得到可利用木糖发酵生产光学纯L-乳酸的工程菌。
根据同源重组的原理，所述步骤(2)和(3)中扩增磷酸转乙酰酶和乙酸激酶的哪一部分序列并不重要，只要是其同源序列即可。优选地，步骤(2)所述的某一段序列为乙酸激酶编码基因的N端部分序列；步骤(3)所述的某一段序列为磷酸转乙酰酶编码基因的C端部分序列；
步骤(1)所述的大肠杆菌和嗜热厌氧杆菌穿梭载体为pUC18、pUC19、pBluescript II SK(+)(Li，S.Yang XF.，et al.Engineering of a thermophilic anaerobicbacterium to produce optically pure L-lactic acid through non-sterilized fermentation，unpublished results)、pSGD8(Shaw，A.J.，K.K.Podkaminer，et al.Metabolicengineering of a thermophilic bacterium to produce ethanol at high yield.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2008，105(37)：13769-13774)或pSGD9(US20100015678A1)，优选pBluescriptII SK(+)；
步骤(4)所述转化的方法为热激法、电转化法、结合转化、双亲本杂交等现有方法；
步骤(4)所述的嗜热厌氧杆菌为能够发酵代谢生成乙酸和乳酸的革兰氏阳性菌，优选嗜热厌氧杆菌属Thermoanaerobacterium sp.或梭菌属Clostridium sp.；特别优选嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium aotearoence SCUT27)。
上述的可利用木糖发酵生产光学纯L-乳酸的工程菌可应用于发酵生产光学纯L-乳酸。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明利用同源重组的方法，使丙酮酸产乙酸的代谢支路关键酶磷酸转乙酰酶和乙酸激酶沉默，从而得到高产乳酸的工程菌。
2、用本发明的工程菌进行乳酸的发酵生产，不产生乙酸，碳代谢流进行了重新分配，促进了目标产物乳酸的大量积累。而且由于副产物种类减少，也可简化后提取工艺。
3、将本发明的工程菌分别以50g/L葡萄糖或木糖为底物，按常规发酵72小时，乳酸浓度可达47g/L和38g/L，底物转化率达0.94g/g和0.76g/g，L-乳酸的光学纯度达99.5％以上。当以50g/L的葡萄糖和木糖混合糖(1∶1)为底物，培养基不经灭菌直接发酵72h，乳酸产量可达45g/L，底物转化率达0.89g/g。
4、本发明对在利用纤维素类生物质发酵生产光学纯L-乳酸的工业化生产中降低生产成本发挥重要作用，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为乙酸代谢支路阻断原理示意图；其中，A为pta/ack基因簇示意图，pta/ack基因簇1-904bp为磷酸转乙酰酶(phosphotransacetylase，pta)编码基因，pta/ack基因簇1005-2217bp为乙酸激酶(acetate kinase，ack)编码基因，用于同源重组的两个同源臂pta-up和ack-down分别位于基因簇的-275-904bp和1358-1984bp，图中probe所示位置为Southern blotting过程中使用的探针位置，位于pta/ack基因簇389-874bp；B为同源重组载体pPuKAd示意图，在同源臂pta-up和ack-down之间***卡那抗性基因表达盒。
图2为实施例1工程菌PCR扩增产物电泳图；泳道M：1 kb DNA marker，泳道1：野生型菌株；泳道2：工程菌。
图3为实施例1工程菌Southern blotting电泳图；泳道1：野生型菌株；泳道2：工程菌。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中有未注明具体条件的实验方法，则是按照常规的分子克隆手册所述的条件进行操作。
实施例1
一种可利用木糖发酵生产光学纯L-乳酸的工程菌的构建
一种可利用木糖发酵生产光学纯L-乳酸的工程菌的构建是通过在编码乙酸激酶和磷酸转乙酰酶的基因中间，***耐热的卡那抗性编码基因，实现乙酸激酶和磷酸转乙酰酶编码基因的敲除，从而阻断乙酸代谢支路，且可通过卡那抗性筛选，初步鉴定阳性重组子。具体阻断过程原理如图1所示，具体操作包括以下步骤：
(1)构建携带有卡那抗性表达盒的大肠杆菌和嗜热厌氧杆菌穿梭载体pBlue-aph：根据卡那抗性基因(GenBank：V01547)进行全基因合成aph基因，***到大肠杆菌和嗜热厌氧杆菌穿梭载体pBluescript II SK(+)的EcoR I和BamHI位点中。
(2)构建携带有乙酰激酶同源序列的pBlue-pta-aph载体
以嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium aotearoence SCUT27)基因组DNA(SEQ ID No.5)为模板，PCR扩增乙酰激酶编码基因(GenBank：HM802208，pta)同源序列约1.2kb。引物序列如下：
Primer 1(正向引物)：5′-AACTAGGTACCAGCGCTGTACGAAATTGCCACTC-3′。下划线碱基为限制性内切酶Kpn I识别位点。
Primer 2(反向引物)：5′-GTACTGAATTCCACCCATTCCTTGTGTTATAGG-3′下划线碱基为限制性内切酶EcoR I识别位点。
将上述PCR扩增产物经Kpn I和EcoR I双酶切后与同样双酶切的pBlue-aph载体连接，然后转入到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取转化子，通过菌落PCR和酶切验证阳性克隆，获得pBlue-pta-aph载体。
(3)构建同时携带乙酰基酶和磷酸转乙酰酶同源序列的重组载体pPuKAd
以嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium aotearoence SCUT27)基因组DNA(SEQ ID No.5)为模板，PCR扩增酸转乙酰酶编码基因(GenBank：HM802208，ack)同源序列约0.6kb。引物序列如下：
Primer 3(正向引物)：5′-TGAGCGGATCCGCATAGAATTAGCTCCACTGC-3′。下划线碱基为限制性内切酶BamH I识别位点。
Primer 4(反向引物)：5′-TGACTGCGGCCGCCGACGCCTCCCATAGCTG-3′。下划线碱基为限制性内切酶Not I识别位点。
将上述PCR扩增产物经BamH I和Not I双酶切后与同样双酶切的pBlue-pta-aph载体连接，然后转入到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取转化子，通过菌落PCR和酶切验证阳性克隆，获得pPuKAd载体。
(4)将构建好的pPuKAd载体，通过电转化方法转入到Thermoanaerobacterium aotearoence SCUT27感受态细胞中，涂布在含有50μg/ml的卡那抗生素平板培养基上，在50℃条件下培养2-3天。长出菌落后，通过PCR和Southern blotting杂交鉴定阳性克隆，鉴定方法和结果如下：
A、PCR鉴定
提取步骤(4)卡那抗生素平板上菌落的基因组DNA，以引物2(SEQ ID No.2)和引物3(SEQ ID No.3)作为扩增引物。对于野生型菌株(即Thermoanaerobacterium aotearoence SCUT27)，PCR产物片段约为2.2kb，而乙酸激酶和磷酸转乙酰酶编码基因敲除获得的重组菌的PCR产物片段应为3.3kb。PCR结果如图2所示。
B、Southern blotting
提取野生型(即Thermoanaerobacterium aotearoence SCUT27)和工程菌(即步骤(4)卡那抗生素平板上菌落)的基因组DNA，用Pst I酶切后，与探针(SEQID No.5)杂交(原理如图1所示)。野生型菌株杂交显色后在1.2kb处有条带，而突变株杂交显色后条带大小应为2.2kb(如图3所示)。
PCR和Southern blotting实验均表明，获得的工程菌中，乙酸激酶和磷酸转乙酰酶基因被成功敲除，所得阳性克隆即为可利用木糖发酵生产光学纯L-乳酸的工程菌。
1L卡那抗生素平板培养基含有NH4Cl(氯化铵)0.90g、NaCl(氯化钠)0.90g、MgCl2·6H2O(氯化镁)0.40g、KH2PO4(磷酸二氢钾)0.75g、K2HPO4(磷酸氢二钾)1.50g、胰酶2.00g、酵母粉1.00g、微量元素溶液1.00ml、FeCl3·6H2O(氯化铁)2.50mg、木糖5.00g、盐酸-半胱氨酸0.75g、Resazurin(刃天青)0.50mg、琼脂10g，余量为水，调pH至6.5。
1L微量元素溶液含有25％HCl(盐酸)10ml、FeCl2·4H2O(氯化亚铁)1.5g、ZnCl2(氯化锌)0.07g、MnCl2·4H2O(氯化锰)0.1g、H3BO3(硼酸)0.006g、CoCl2·6H2O(氯化钴)0.19g、CuCl2·2H2O(氯化铜)0.002g、NiCl2·6H2O(氯化镍)0.024g、Na2MoO4·2H2O(钼酸钠)0.036g，余量为水。
实施例2
可利用木糖发酵生产光学纯L-乳酸的工程菌与其野生型乳酸产量对比
(1)种子培养
将实施例1的工程菌接入到装有10ml种子培养基的20ml血清瓶中，55℃、150r/min培养12h，使OD值达到0.8以上。以1∶5比例接种到装有50ml种子培养基的125ml血清瓶中，55℃、150r/min培养12h，使OD值达到1.0以上。
(2)摇瓶培养
按10％接种量将步骤(1)培养的种子液接入装有50ml发酵培养基的125ml血清瓶中，充氮气至压力为0.04MPa。以10g/L木糖为底物连续培养24h。
野生型菌株的操作同上。
经HPLC检测代谢产物，比较结果如表1所示。结果表明，工程菌培养液中检测到乙酸，而乳酸产量较野生型菌株提高了1.8倍。
表1 T.aotearoense SCUT27乙酸代谢支路阳断前后代谢产物变化
1L种子培养基含有葡萄糖2g、木糖2g、柠檬酸三钾盐2g、一水柠檬酸1.25g、硫酸钠1g、磷酸二氢钾1g、碳酸氢钠2.5g、氯化铵1.5g、尿素5g、酵母抽提物1g、六水氯化镁1g、四水氯化亚铁0.1g、二水氯化钙0.2g、一水半胱氨酸盐酸盐1g、二盐酸吡哆胺0.02g、对氨基苯甲酸0.004g、D-生物素0.002g、维生素B120.002g、维生素B10.004g，余量为水。
发酵培养基配方：除碳源(木糖)添加量为10g外，其余成分与种子培养基配方相同。
葡萄糖、木糖消耗量的检测采用Waters 2695高压液相色谱(HPLC)测定
色谱条件为：
色谱柱：Aminex HPX-87P(Biorad)
流动相：超纯水
流速：0.6ml/min
柱温：60℃
检测器温度：40℃
样品制备：2ml发酵液加入1g CaCO3，振荡1min，在16000g下离心5min，取上清用0.22μm膜过滤。用于检测残糖。
进样量：10μl
检测器：示差检测器。
代谢产物乳酸、乙醇、乙酸含量的检测采用Waters 2695高压液相色谱(HPLC)测定
色谱条件为：
色谱柱：Aminex HPX-87H(Biorad)
流动相：5mM H2SO4
流速：0.6ml/min
柱温：60℃
检测器温度：40℃
样品制备：1.9ml发酵液加入100μl 10％H2SO4，在16000g下离心5min，取上清用0.22μm膜过滤。用于检测酸和乙醇。进样量：10μl
检测器：示差检测器。
实施例3
培养基是否灭菌对本发明工程菌发酵产物的影响
按10％接种量，将实施例工程菌的种子液接入装有3L发酵培养基的NBS公司5L全自动反应釜中。在接种前，反应釜先通入氮气30min，接种后再通入氮气30min，以保证发酵环境无氧。发酵过程用5mol/L NaOH控制pH值为6.8。
测定发酵产物中的乳酸、乙酸、乙醇和糖浓度(表2)。
以50g/L葡萄糖为底物连续发酵72h，乳酸浓度可达47.2g/L，转化率达到0.95g/g，且L-乳酸光学纯度超过99.5％。
以50g/L的葡萄糖和木糖混合糖为底物发酵，培养基灭菌和不灭菌条件下的乳酸产量分别达到42g/L和44.8g/L。
结果表明，发酵过程中没有乙酸产生，表明本发明构建的工程菌乙酸代谢支路被成功阻断。另外，以阻断了乙酸代谢支路的嗜热厌氧杆菌突变株发酵，发酵过程培养基无需灭菌，从而降低对发酵工艺的要求，大幅度降低发酵成本，具有十分广阔的应用前景。
表2以不同底物发酵罐培养重组菌乳酸产量
乳酸光学纯度检测
乳酸光学纯度(e.e值)计算公式如下：
其中，L-乳酸用基于生物传感器原理的葡萄糖-乳酸分析仪(SBA-40C)测得。乳酸总量是采用HPLC检测获得。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种可利用木糖发酵生产光学纯L-乳酸的工程菌，其特征在于是由以下步骤构建得到：
(1)合成卡那抗性基因，并将其***到大肠杆菌和嗜热厌氧杆菌穿梭载体中；
(2)PCR扩增乙酸激酶编码基因的某一段序列，为pta-up序列；再将pta-up序列***到步骤(1)的已***卡那抗性基因的大肠杆菌和嗜热厌氧杆菌穿梭载体中，构建得到***载体1；
(3)PCR扩增磷酸转乙酰酶编码基因的某一段序列，为ack-down序列；再将ack-down序列***到***载体1中，获得***载体pPuKAd；
(4)将***载体pPuKAd转化入嗜热厌氧杆菌，并经抗性筛选后得到可利用木糖发酵生产光学纯L-乳酸的工程菌。
2.根据权利要求1所述的可利用木糖发酵生产光学纯L-乳酸的工程菌，其特征在于：步骤(2)所述的某一段序列为乙酸激酶编码基因的N端部分序列。
3.根据权利要求1所述的可利用木糖发酵生产光学纯L-乳酸的工程菌，其特征在于：步骤(3)所述的某一段序列为磷酸转乙酰酶编码基因的C端部分序列。
4.根据权利要求1所述的可利用木糖发酵生产光学纯L-乳酸的工程菌，其特征在于：步骤(1)所述的大肠杆菌和嗜热厌氧杆菌穿梭载体为pUC18、pUC19、pBluescript II SK(+)、pSGD8或pSGD9。
5.根据权利要求1所述的可利用木糖发酵生产光学纯L-乳酸的工程菌，其特征在于：步骤(1)所述的大肠杆菌和嗜热厌氧杆菌穿梭载体为pBluescript IISK(+)。
6.根据权利要求1所述的可利用木糖发酵生产光学纯L-乳酸的工程菌，其特征在于：步骤(4)所述转化的方法为热激法、电转化法、结合转化或双亲本杂交。
7.根据权利要求1所述的可利用木糖发酵生产光学纯L-乳酸的工程菌，其特征在于：步骤(4)所述的嗜热厌氧杆菌为嗜热厌氧杆菌属Thermoanaerobacterium sp.或梭菌属Clostridium sp.。
8.根据权利要求1所述的可利用木糖发酵生产光学纯L-乳酸的工程菌，其特征在于：步骤(4)所述的嗜热厌氧杆菌为嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium aotearoence SCUT27)。
9.权利要求1-8任一项所述的可利用木糖发酵生产光学纯L-乳酸的工程菌在发酵生产光学纯L-乳酸中的应用。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN115011536A (zh) * | 2022-06-14 | 2022-09-06 | 湖北工业大学 | 一株双厌氧启动子诱导产高光学纯d-乳酸的工程菌及其制备方法与应用 |
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