JP2009513145A - リグノセルロース系バイオマスをエタノールに変換する好熱性生物 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、米国特許出願第60/731,674号(2005年10月31日出願)および米国特許出願第60/796,380号(2006年5月1日出願)に対する優先権を主張し、これら特許出願の各々は、本明細書中に参考として援用される。
本発明の進展に関する研究がNational Institute of Standards and Technology(NIST)契約番号60NANB1D0064によって資金援助されたので、米国政府は、本発明において一定を権利を有し得る。
(1.発明の分野)
本発明は、エタノールを生成するためのバイオマス処理の分野に関する。特に、種々のバイオマス由来の基質を消費しかつ高収量でエタノールを生成する新規な好熱性生物、ならびに上記生成のプロセスおよび上記生物の使用が開示される。
バイオマスは、安価でかつ容易に入手可能なセルロース分解基質の代表であり、この基質から糖が生成され得る。これら糖は、単独で使用されてもよいし、アルコールおよび他の生成物を生成するために醗酵されてもよい。生物変換生成物の中で、エタノールにおける関心は高い。なぜなら、エタノールは、再生可能家庭用燃料(renewable domestic fuel)として使用され得るからである。
Desai,S.G.;Guerinot,M.L.;Lynd,L.R.「Cloning of L−lactate dehydrogenase and elimination of lactic acid production via gene knockout in Thermoanaerobacterium saccharolyticum JW/SL−YS485」Appl.Microbiol.Biotechnol.65:600−605,2004
ここで、バイオマスのエタノールへの変換において好熱性嫌気性グラム陽性細菌を操作および利用するための方法が示され、かつ記載される。
(材料および方法)
Thermoanaerobacterium saccharolyticum株であるJW/SL−YS485(DSM 8691)は、West Thumb Basin in Yellowstone National Park, Wyomingから単離された好熱性嫌気性細菌である(Lui,S.Y.;Gherardini,F.C.;Matuschek,M.;Bahl,H.;Wiegel,J.「Cloning,sequencing,and expression of the gene encoding a large S−layer−associated endoxylanase from Thermoanaerobacterium sp strain JW/SL−YS485 in Escherichia coli」J.Bacteriol.178:1539−1547,1996;Mai,V.;Wiegel,J.「Advances in development of a genetic system for Thermoanaerobacterium spp:Expression of genes encoding hydrolytic enzymes,development of a second shuttle vector,and integration of genes into the chromosome」Appl.Environ.Microbiol.66:4817−4821,2000)。この株は、30℃〜66℃の範囲の温度および3.85〜6.5の範囲のpHにおいて増殖する。この株は、単糖類であるグルコースおよびキシロース、二糖類であるセロビオースおよびスクロース、ならびに、多糖類であるキシランおよび澱粉を含めた、種々のバイオマス由来の基質を消費するが、セルロースは消費しない。この生物は、エタノール、ならびに、有機酸である乳酸および酢酸を、一次醗酵生成物として生成する。
乳酸デヒドロゲナーゼ(L−ldh)遺伝子、ホスホトランスアセチラーゼ(ptd)遺伝子およびアセテートキナーゼ(ack)遺伝子を、L−ldhについてこれまでに報告されたような標準的な方法(Desai、2004)を用いて、同定および配列決定した。CODE−HOPアルゴリズム(Rose,T.;Schultz,E.;Henikoff,J.;Pietrokovski,S.;McCallum,C.;Henikoff,S.「Consensus−degenerate hybrid oligonucleotide primers for amplification of distantly−related sequences」Nucleic Acids Research,26(7):1628−1635,1998年4月1日)を用いて変質プライマーを作製し、そして、PCR反応を行って、保存された領域の間のDNA配列を得た。この保存された領域の外側の遺伝子フラグメントを、BigDye Terminatorキットv3.1(ABI,Foster City,CA)と共にThermoFidelase(Fidelity Systems,Gaithersburg,MD)酵素を用いて、ゲノムDNAから直接配列決定した。
(アセテートキナーゼおよびホスホトランスアセチラーゼノックアウトベクター、pSGD9)
標準的なクローニング技術に従った(Sambrook)。6.2kbの自殺ベクターpSGD9は、pBLUESCRIPT II SK(+)(Stratagene)に基づき、これまでに報告されたものに類似する設計アプローチを用いた(Desai、2004;Mai、2000)。pta/ack配列の遺伝子フラグメント(pta−上流(約1.2kb)およびack−下流(約0.6kb))を、配列番号1〜2および配列番号3〜4のプライマー対を用いて、ゲノムDNAから増幅した。pfu DNAポリメラーゼを用いてPCR増幅を行い、そして、このフラグメントを、1%電気泳動ゲルから抽出した。次いで、このフラグメント(pta−上流およびack−下流)に、Taqポリメラーゼを用いてAテイルを付加し、そして、TOPO pCR2.1(Invitrogen,Carlsbad,CA)にクローニングした。pIKM1のPstI/XbaI消化からカナマイシンマーカーを含む1.5kbフラグメントを得て、これをpBLUESCRIPT II SK(+)にサブクローニングした。pta−上流を含むTOPOを、XhoI/BsiHKAIで消化し、そしてこれを、PstI/XbaI消化したpBLUESCRIPT II SK(+)の、先にサブクローニングしたカナマイシンマーカーの上流にサブクローニングした。ack−下流を含むTOPOを、XbaI/SphIで消化し、そしてこれを、pUC19(Invitrogen)にサブクローニングした。ack−下流を含むXbal/AflIIIフラグメントを消化し、そしてこれをカナマイシンマーカーの下流にサブクローニングして、最終構築物であるpSGD9を得た。
5.5kbの自殺ベクターpSGD−Ermは、Desaiら、2004によって生成されたようなプラスミドpSGD8に基づいた。aphカナマイシン抗生物質マーカーの代わりに、pIKM1に由来するaphプロモーターと、プラスミドpCTC1(Klapatch,T.R.;Guerinot,M.L.;Lynd,L.R.「Electrotransformation of Clostridium thermosaccharolyticum」、J.Ind.Microbiol.16(6):342−7,1996年6月)に由来するエリスロマイシン耐性を付与するアデニンメチラーゼ遺伝子とに基づく融合遺伝子を選択のために使用した。pfuポリメラーゼ(Stategene)と、aphプロモーターについては配列番号5〜6のプライマーとを、そして、アデニンメチラーゼオープンリーディングフレームについては配列番号7〜8のプライマーとを用いて、PCR遺伝子フラグメントを作製した。このフラグメントを、XbaI/BamHI(aphフラグメント)およびBamHI/EcoRI(アデニンメチラーゼ)を用いて消化し、そして、pIKM1のマルチプルクローニングサイトにライゲーションした。次いで、この融合遺伝子を、BseRI/EcoRIで切除し、そして、同様に消化したpSGD8内にライゲーションした。
交換可能な2つの方法(第一の方法は、以前に記載された方法(Mai,V.;Lorenz,W.;Weigel,J.「Transformation of Thermoanaerobacterium sp.strain JW/SL−YS485 with plasmid PIKM1 conferring kanamycin resistance」FEMS Microbiol.Lett.148:163−167,1997)であり、第二の方法は、細胞の収穫後にいくつかの改変を加えたものであり、Clostridium thermocellumについて開発された方法に基づくもの(Tyurin,M.V.;Desai,S.G.;Lynd,L.R.「Electrotransformation of Clostridium thermocellum」Appl.Environ.Microbiol.70(2):883−890,2004)であった)を用いて、T.saccharolyticumの形質転換を行った。予め還元した培地DSMZ 122を用いて、55℃に維持したインキュベーター内の嫌気性の区画の内側に置いた滅菌の使い捨て培養チューブにおいて、細胞を一晩増殖させた。その後、細胞を、分けて、4μg/mlのイソニコチン酸ヒドラジド(イソニナイアシン)と共に培養し、最初の遅延期の後に、この培地に、細胞壁細胞壁弱化剤(cell wall weakening agent)(Hermans,J.;Boschloo,J.G.;de Bont,J.A.M.「Transformation of M. aurum by electroporation:the use of glycine,lysozyme and isonicotinic acid hydrazide in enhancing transformation efficiency」FEMS Microbiol.Lett.72,221−224,1990)を加えた。指数増殖期の細胞を収穫し、そして、予め還元し冷やした滅菌の200mMセロビオース溶液で洗浄し、そして、同じ溶液中に再懸濁して、氷上に維持した。細胞を収穫した後は、遠心分離の間の時間を含めていつ何時も、細胞を冷やした状態(約4℃)に維持することに最大の注意を払った。
部位特定ノックアウト領域の配列決定を、Taqポリメラーゼ(New England Biolabs)、および、ゲノムと自殺ベクターとの間の相同性のオーバーラップ領域の外側のプライマーを用いる、ゲノムDNAからのPCRにより行った。BigDye Terminatorキットv3.1(ABI,Poster City,CA)を用いた配列決定のために、PCR生成物の内側のプライマーを用いた。CAP3ソフトウェアプログラム(Huang,X.「An improved sequence assembly program」Genomics 33:21−31,1996)を用いてこれらの領域を整え、そして、CLUSTALWアルゴリズム(Higgins,D.G.;Bleasby,A.J.;Fuchs,R.「CLUSTAL V:improved software for multiple sequence alignment」Computer Applications in the Biosciences(CABIOS),8(2):189−191,1992)を用いて予想されるDNA配列と比較した。実験的に編成した配列と、公知の野生型および自殺ベクターの配列を元にした予想配列との間には、高い程度の相同性(同一性%)が存在した(図3および4)。
変異株Thermoanaerobacterium saccharolyticum JW/SL−YS485 ALK1(「ALK1」)由来のゲノムDNAは、DNA配列決定により、L−ldhおよびpta/ack遺伝子座において予想された部位特定相同組換えを示した。両方の組込み事象は、二重組込みであり、これは、より遺伝的に安定な遺伝子型である。
T.saccharolyticumを、2.5g/Lの酵母抽出物を含有する部分的に規定されたMTC培地(Zhang,Y.;Lynd,L.R.「Quantification of cell and cellulase mass concentrations during anaerobic cellulose fermentation:development of an enzyme−linked immunosorbent assay−based method with application to Clostridium thermocellum batch cultures」Anal.Chem.75:219−222,2003)中で増殖させた。グルコース、キシロース、酢酸、乳酸およびエタノールを、55℃においてAminex 87Hカラム(BioRad Laboratories,Hercules,CA)上のHPLCにより分析した。移動相は、5mM スルホン酸から構成され、流速は0.7ml/分であった。Waters 410屈折計(Milford,MA)を用いて、屈折率により検出を行った。酢酸についての最小の検出レベルは1.0mMであった。5g/Lのキシロース、5g/Lの乳酸、5g/Lの酢酸および5g/Lのエタノールを含有する標準追跡物を、図5に示す。
図10に示されるように、補給する基質濃度を経時的に増加させる連続培養を利用して、ALK1に刺激を与えた。図10は、連続培養の間の、キシロース、キシルロースおよびエタノールの濃度を示す。このストレス−進化サイクルに対して1000時間を超えて曝露した後、改善された株ALK2を、醗酵培養液から単離した。ALK2は、大量培養中、50g/Lのキシロースにおいて増殖を開始し得た。図11は、ALK2株による醗酵の間のキシロース、有機酸、光学濃度(OD)およびエタノール濃度を示す。
ALK1は、American Type Culture Collection(Manassas,VA 20110−2209)に寄託されている。この寄託は、2005年11月1日になされ、特許寄託指定番号PTA−7206を受けた。この寄託は、ブダペスト条約の要件(寄託期間は、寄託の日から30年間、または最新の分譲請求後5年間、または、本願の出願から米国特許の強制力のある期間が満了するまで、のいずれか長い方であるべきである)に従ってなされた。ALK1は、寄託当局において生存できない状態となった場合には、補充される。
Claims (27)
- セルロース分解基質を醗酵して、理論収量の少なくとも90%である濃度においてエタノールを生成する単離された生物であって、該生物は、ピルビン酸デカルボキシラーゼを発現しない、単離された生物。
- エタノールを生成するための方法であって、該方法は、
ネイティブの生物を形質転換して、請求項1に記載の単離された生物を生成し、形質転換宿主を提供する工程;ならびに
該形質転換宿主を、グルコース、キシロース、マンノース、アラビノース、ガラクトース、フルクトース、セロビオース、スクロース、マルトース、キシラン、マンナン、澱粉、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される物質を含む基質を含有する培地中で、該基質の糖化および醗酵を可能にするに十分な期間にわたって適した条件下で培養する工程、
を包含する、方法。 - 形質転換生物であって、該形質転換生物は、
ネイティブの状態において、醗酵生成物として酢酸を生成する能力を付与する少なくとも1種の遺伝子を含むグラム陽性細菌
を含み、
該グラム陽性細菌は、該少なくとも1種の遺伝子の発現を排除するように形質転換されている、
形質転換生物。 - 前記グラム陽性細菌は、Thermoanaerobacter属のメンバーである、請求項3に記載のグラム陽性細菌。
- 前記グラム陽性細菌は、Thermoanaerobacterium saccharolyticumである、請求項3に記載のグラム陽性細菌。
- 前記少なくとも1種の遺伝子は、アセテートキナーゼの発現をコードする、請求項3に記載のグラム陽性細菌。
- 前記少なくとも1種の遺伝子は、ホスホトランスアセチラーゼの発現をコードする、請求項3に記載のグラム陽性細菌。
- 前記少なくとも1種の遺伝子は、複数種の遺伝子を含む、請求項3に記載のグラム陽性細菌。
- 前記複数種の遺伝子は、アセテートキナーゼおよびホスホトランスアセチラーゼの発現をコードする、請求項8に記載のグラム陽性細菌。
- 前記グラム陽性細菌に醗酵生成物として乳酸を生成する能力を付与する1種以上の遺伝子の発現を排除するように、さらに形質転換されている、請求項9に記載のグラム陽性細菌。
- 前記グラム陽性細菌に醗酵生成物として乳酸を生成する能力を付与する1種以上の遺伝子の発現を排除するように、さらに形質転換されている、請求項3に記載のグラム陽性細菌。
- 前記少なくとも1種の遺伝子は、乳酸デヒドロゲナーゼの発現をコードする、請求項11に記載のグラム陽性細菌。
- エタノールを生成するための方法であって、該方法は、
ネイティブの生物を形質転換して、請求項11に記載のグラム陽性細菌を生成し、形質転換細菌宿主を生成する工程;ならびに
該形質転換細菌宿主を、グルコース、キシロース、マンノース、アラビノース、ガラクトース、フルクトース、セロビオース、スクロース、マルトース、キシラン、マンナン、澱粉、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される物質を含む基質を含有する培地中で、該基質の糖化および醗酵を可能にするに十分な期間にわたって適した条件下で培養する工程、
を包含する、方法。 - 前記細菌宿主は、Thermoanaerobacterium saccharolyticumである、請求項13に記載の方法。
- 前記遺伝子は、乳酸デヒドロゲナーゼ、アセテートキナーゼ、およびホスホトランスアセチラーゼの発現をコードする、請求項13に記載の方法。
- ALK1と称されかつ特許寄託指定番号PTA−7206の下で寄託されている微生物の生物学的に純粋な培養物。
- 単離されたポリヌクレオチドであって、
(a)配列番号10の配列;
(b)配列番号9および配列番号10の配列;または
(c)(a)もしくは(b)の配列に対して少なくとも約90%の配列同一性を有する配列
を含む、単離されたポリヌクレオチド。 - 前記(a)または(b)の配列に対して約95%の配列同一性を有する、請求項17に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項18に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、ベクター。
- 請求項18に記載のポリヌクレオチドの相補体を発現するように遺伝子操作された宿主細胞。
- 前記宿主細胞は細菌細胞である、請求項20に記載の宿主細胞。
- エタノールを生成するための方法であって、該方法は、
請求項21に記載の変異細菌を、グルコース、キシロース、マンノース、アラビノース、ガラクトース、フルクトース、セロビオース、スクロース、マルトース、キシラン、マンナン、澱粉、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される基質を含有する培地中で、該基質をエタノールへと醗酵させることを可能にするに十分な期間にわたって適した条件下で培養する工程、
を包含する、方法。 - 前記変異細菌は、Thermoanaerobacterium saccharolyticumである、請求項22に記載の方法。
- 前記変異細菌は、Thermoanaerobacterium saccharolyticum ALK1(JW/SL−YS485 ALK1)である、請求項23に記載の方法。
- 細菌において発現できるプロモーターに作動可能に連結された配列番号10を含む、遺伝子構築物。
- 請求項25に記載の遺伝子構築物を含む、組換え細菌。
- 前記細菌は、Thermoanaerobacterium saccharolyticumである、請求項26に記載の組換え細菌。
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