CN116096738A - 可活化il-12多肽及其使用方法 - Google Patents

可活化il-12多肽及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本文提供了IL‑12多肽复合物和/或IL23多肽复合物，其包含IL‑12或IL‑23、半衰期延长元件、IL‑12或IL‑23阻断元件以及蛋白酶可裂解接头。本文还提供了其药物组合物，以及用于制备此类多肽复合物的核酸、重组表达载体、宿主细胞。还公开了使用所述多肽复合物治疗疾病、病状和病症的方法。

Description

可活化IL-12多肽及其使用方法
本申请要求2020年5月19日提交的美国临时申请号63/027,276的权益，其以引用方式整体并入本文。
序列表
本申请含有已经以ASCII格式电子递交的序列表，并且该序列表据此以引用方式整体并入。所述ASCII拷贝创建于2021年5月18日，名为761146_02320_SL.txt且大小为1,294,403字节。
背景技术
白细胞介素-12(IL-12)是一种异二聚体70kDa细胞因子，其由两个共价连接的糖基化亚基(p35和p40)组成(Lieschke等人,1997；Jana等人,2014)。它是一种有效的免疫拮抗剂并且已被认为是一种有前景的肿瘤学治疗剂。然而，IL-12已显示出具有很窄的治疗窗口，因为它们高度有效且血清半衰期短。因此，IL-12的治疗性施用产生不期望的全身作用和毒性。为了在预期的细胞因子作用位点(例如，肿瘤微环境)处达到所期望的细胞因子水平需要施用大量细胞因子(即，IL-12)，这加剧了这一问题。不幸的是，由于细胞因子的生物学特性以及不能有效地靶向并控制其活性，因此细胞因子在肿瘤的治疗中尚未达到所希望的临床优势。
可诱导的IL-12蛋白构建体已在国际申请号PCT/US2019/032320和PCT/US2019/032322中有所描述，用以克服限制了IL-12在肿瘤学中的临床使用的毒性和半衰期短的问题。先前描述的可诱导的IL-12多肽构建体包含含有IL-12、阻断元件和半衰期延长元件的单一多肽。
本发明的发明人惊奇地发现，包含两种或更多种多肽的IL-12多肽复合物具有某些优点，诸如较少的聚集和改善的表达，从而导致更高的产率。
发明内容
本公开涉及可诱导的IL-12多肽复合物，其含有减弱的IL-12并且与天然存在的IL-12相比具有长半衰期。如果期望，IL-12可以是突变蛋白(mutein)。IL-12突变蛋白可以是非糖基化的或部分非糖基化的。本文公开的多肽复合物包含两条或更多条多肽链，并且所述复合物包括IL-12亚基p35和p40、半衰期延长元件、IL-12阻断元件和蛋白酶可裂解接头。
可诱导的IL-12多肽复合物可以包含两种不同的多肽。第一多肽可以包含IL-12亚基，以及任选的IL-12阻断元件。IL-12阻断元件在存在时通过第一蛋白酶可裂解接头可操作地连接至IL-12亚基。第二多肽链可以包含通过第二蛋白酶可裂解接头可操作地连接至半衰期延长元件的IL-12亚基，以及任选的IL-12阻断元件。IL-12阻断元件在存在时可以通过蛋白酶可裂解接头可操作地连接至IL-12亚基，或者可以通过任选地蛋白酶可裂解的接头可操作地连接至半衰期延长元件。第一和第二多肽中仅一者包含IL-12阻断元件。当第一多肽中的IL-12亚基为p35时，第二多肽中的IL-12亚基为p40，并且当第一多肽中的IL-12亚基为p40时，第二多肽中的IL-12亚基为p35。该复合物的优选阻断元件为结合IL-12的单链抗体或其抗原结合片段。该复合物中的可裂解接头可以是相同或不同的。
可诱导的IL-12多肽复合物可以包含三种不同的多肽。通常，一条多肽链包含p35或p40 IL-12亚基，但不是两者，并且第二多肽包含另一个IL-12亚基，并且第三多肽包含阻断元件的至少一部分(组分)。第一多肽可以包含IL-12亚基，以及任选的半衰期延长元件。半衰期延长元件在存在时通过蛋白酶可裂解接头可操作地连接至IL-12亚基。
第二多肽可以包含IL-12亚基、抗体轻链的至少抗原结合部分或抗体重链的抗原结合部分，以及任选的半衰期延长元件。当半衰期延长元件存在时，其通过蛋白酶可裂解接头可操作地连接至IL-12亚基，并且抗体重链或轻链a)通过第二蛋白酶可裂解接头可操作地连接至IL-12亚基，或b)通过任选可裂解接头可操作地连接至半衰期延长元件。
第三多肽可以包含与第二多肽中的轻链互补的抗体重链或与第二多肽中的重链互补并与所述轻链一起形成IL-12结合位点的抗体轻链的抗原结合部分。当第一多肽中的IL-12亚基为p35时，第二多肽中的IL-12亚基为p40，并且当第一多肽中的IL-12亚基为p40时，第二多肽中的IL-12亚基为p35。在该复合物中，IL-12阻断元件优选为抗体的抗原结合片段。抗原结合片段包含作为单独组分的抗体轻链的至少抗原结合部分和互补的抗体重链的至少抗原结合部分。该可诱导的IL-12多肽复合物中的蛋白酶可裂解接头可以是相同或不同的。
可诱导的多肽复合物可以包含两种不同的多肽，其中p35和p40位于同一多肽链上。第一多肽链可以包含p35、p40、半衰期延长元件和抗体轻链的至少抗原结合部分。p35和p40可以可操作地连接，并且半衰期延长元件可以通过第一蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p40，并且抗体轻链的抗原结合部分可以通过蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p35。可替代地，半衰期延长元件可以通过蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p35，并且抗体轻链的抗原结合部分通过蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p40。第二多肽包含与第二多肽中的轻链互补并且与所述轻链一起形成IL-12结合位点的抗体重链的至少抗原结合部分。该复合物中的蛋白酶可裂解接头可以是相同或不同的。
在替代形式中，第一多肽链可以包含p35、p40、半衰期延长元件和抗体重链的至少抗原结合部分。p35和p40可以可操作地连接，并且半衰期延长元件可以通过蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p40，并且抗体重链的抗原结合部分可以通过蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p35。可替代地，半衰期延长元件可以通过蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p35，并且抗体重链的抗原结合部分可以通过第二蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p40。第二多肽包含与第二多肽中的重链互补并且与所述轻链一起形成IL-12结合位点的抗体轻链的至少抗原结合部分。该复合物中的蛋白酶可裂解接头可以是相同或不同的。
在一个实例中，IL-12多肽复合物包含不包含阻断元件的第一多肽，并且第二多肽具有下式：[A]-[L1]-[B]-[L3]-[D]或[D]-[L3]-[B]-[L1]-[A]或[B]-[L1]-[A]-[L2]-[D]或[D]-[L1]-[A]-[L2]-[B]，其中，A为IL-12亚基；L1为第一蛋白酶可裂解接头；L2为第二蛋白酶可裂解接头；L3为任选可裂解接头；B为半衰期延长元件；并且D为阻断元件。
在另一个实例中，第一多肽包含下式：[A]-[L1]-[D]或[D]-[L1]-[A]；并且第二多肽具有下式：[A’]-[L2]-[B]或[B]-[L2]-[A’]，其中A为p35或p40，其中当A为p35时，A’为p40，并且当A为p40时，A’为p35；A’为p35或p40；L1为第一蛋白酶可裂解接头；L2为第二蛋白酶可裂解接头；B为半衰期延长元件；并且D为阻断元件。
在实施方案中，IL-12多肽复合物包含选自由SEQ ID NO:95-110、SEQ ID NO:119-126和SEQ ID NO:135-143组成的组的第一多肽，或与SEQ ID NO:95-110、SEQ ID NO:119-126和SEQ ID NO:135-143具有至少80％同一性的氨基酸序列。优选的IL-12多肽复合物包含含有SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:136的第一多肽。优选的IL-12多肽复合物包含含有SEQID NO:104的氨基酸序列的第一多肽链和含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的第二多肽链。另一优选多肽复合物包含含有SEQ ID NO:136的氨基酸序列的第一多肽链和含有SEQ IDNO:18的氨基酸序列的第二多肽链。
如上所述，如果期望，IL-12可以是突变蛋白。IL-12突变蛋白保留IL-12活性，例如固有的IL-12受体激动剂活性。IL-12亚基p35和/或p40可以是突变蛋白。优选地，IL-12突变蛋白具有改变的糖基化模式。例如，IL-12突变蛋白可以是部分非糖基化的或完全非糖基化的。
p35和/或p40亚基可以包含一个或多个氨基酸修饰，例如取代。例如，p35和/或p40亚基可以包含约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约7个或更多个氨基酸取代。虽然通常，p35和/或p40亚基包含约一个至约七个氨基酸取代。取代可以是保守取代或非保守取代，但优选是保守取代。典型的修饰改变了p35和/或p40亚基的糖基化模式，使得p35和/或p40亚基是部分或完全非糖基化的。优选地，氨基酸修饰包括替换天冬酰胺氨基酸。例如，天冬酰胺到谷氨酰胺。在特定实例中，SEQ ID NO:434的IL-12p35上的氨基酸位置16、75、85、133、151、158、201、206、221、250、267、280、282、326、400、404、425、555、572、575、582或602处的天冬酰胺可以突变。在特定实例中，SEQ ID NO:18的IL-12p40的氨基酸位置103、114、163、219、227或282处的天冬酰胺可以突变。
例如，部分或完全非糖基化的IL-12多肽可以包含选自由SEQ ID NO:104、434或442-445组成的组的多肽，或与SEQ ID NO:104、434或442-445具有至少80％同一性的氨基酸序列。
本公开还涉及单链IL-12可诱导多肽。单链IL-12多肽优选地包含选自由SEQ IDNO:7、9、10、18、24-94、SEQ ID NO:110-118和SEQ ID NO:127-134组成的组的氨基酸，或与SEQ ID NO:7、9、10、18、24-94、SEQ ID NO:110-118和SEQ ID NO:127-134具有至少约80％同一性的氨基酸序列。
本公开还涉及可诱导的IL-23多肽复合物，其含有减弱的IL-23并且与天然存在的IL-23相比具有长半衰期。如果期望，IL-23可以是突变蛋白。IL-23突变蛋白可以非糖基化的或部分非糖基化的。本文公开的多肽复合物包含一条或多条多肽链，并且所述复合物包括IL-23亚基p19和p40、半衰期延长元件、IL-23阻断元件和蛋白酶可裂解接头。
可诱导的IL-23多肽复合物可以包含两种不同的多肽。第一多肽可以包含IL-23亚基，以及任选的IL-23阻断元件。IL-23阻断元件在存在时通过第一蛋白酶可裂解接头可操作地连接至IL-23亚基。第二多肽链可以包含通过第二蛋白酶可裂解接头可操作地连接至半衰期延长元件的IL-23亚基，以及任选的IL-23阻断元件。IL-23阻断元件在存在时可以通过蛋白酶可裂解接头可操作地连接至IL-23亚基，或者可以通过任选地蛋白酶可裂解的接头可操作地连接至半衰期延长元件。第一和第二多肽中仅一者包含IL-23阻断元件。当第一多肽中的IL-23亚基为p19时，第二多肽中的IL-23亚基为p40，并且当第一多肽中的IL-23亚基为p40时，第二多肽中的IL-23亚基为p40。该复合物的优选阻断元件为结合IL-23的单链抗体或其抗原结合片段。该复合物中的可裂解接头可以是相同或不同的。
可诱导的IL-23多肽复合物可以包含三种不同的多肽。通常，一条多肽链包含p19或p40 IL-23亚基，但不是两者，并且第二多肽包含另一个IL-23亚基，并且第三多肽包含阻断元件的至少一部分(组分)。第一多肽可以包含IL-23亚基，以及任选的半衰期延长元件。半衰期延长元件在存在时通过蛋白酶可裂解接头可操作地连接至IL-23亚基。
第二多肽可以包含IL-23亚基、抗体轻链的至少抗原结合部分或抗体重链的抗原结合部分，以及任选的半衰期延长元件。当半衰期延长元件存在时，其通过蛋白酶可裂解接头可操作地连接至IL-23亚基，并且抗体重链或轻链a)通过第二蛋白酶可裂解接头可操作地连接至IL-23亚基，或b)通过任选可裂解接头可操作地连接至半衰期延长元件。
第三多肽可以包含与第二多肽中的轻链互补的抗体重链或与第二多肽中的重链互补并与所述轻链一起形成IL-23结合位点的抗体轻链的抗原结合部分。当第一多肽中的IL-23亚基为p19时，第二多肽中的IL-23亚基为p40，并且当第一多肽中的IL-23亚基为p40时，第二多肽中的IL-23亚基为p19。在该复合物中，IL-23阻断元件优选为抗体的抗原结合片段。抗原结合片段包含作为单独组分的抗体轻链的至少抗原结合部分和互补的抗体重链的至少抗原结合部分。该可诱导的IL-23多肽复合物中的蛋白酶可裂解接头可以是相同或不同的。
可诱导的多肽复合物可以包含两种不同的多肽，其中p19和p40位于同一多肽链上。第一多肽链可以包含p19、p40、半衰期延长元件和抗体轻链的至少抗原结合部分。p19和p40可以可操作地连接，并且半衰期延长元件可以通过第一蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p40，并且抗体轻链的抗原结合部分可以通过蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p19。可替代地，半衰期延长元件可以通过蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p19，并且抗体轻链的抗原结合部分通过蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p40。第二多肽包含与第二多肽中的轻链互补并且与所述轻链一起形成IL-23结合位点的抗体重链的至少抗原结合部分。该复合物中的蛋白酶可裂解接头可以是相同或不同的。
在替代形式中，第一多肽链可以包含p19、p40、半衰期延长元件和抗体重链的至少抗原结合部分。P19和p40可以可操作地连接，并且半衰期延长元件可以通过蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p40，并且抗体重链的抗原结合部分可以通过蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p19。可替代地，半衰期延长元件可以通过蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p19，并且抗体重链的抗原结合部分可以通过第二蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p40。第二多肽包含与第二多肽中的重链互补并且与所述轻链一起形成IL-23结合位点的抗体轻链的至少抗原结合部分。该复合物中的蛋白酶可裂解接头可以是相同或不同的。
在一个实例中，IL-23多肽复合物包含不包含阻断元件的第一多肽并且第二多肽具有下式：[A]-[L1]-[B]-[L3]-[D]或[D]-[L3]-[B]-[L1]-[A]或[B]-[L1]-[A]-[L2]-[D]或[D]-[L1]-[A]-[L2]-[B]，其中，A为IL-23亚基；L1为第一蛋白酶可裂解接头；L2为第二蛋白酶可裂解接头；L3为任选可裂解接头；B为半衰期延长元件；并且D为阻断元件。
在另一个实例中，第一多肽包含下式：[A]-[L1]-[D]或[D]-[L1]-[A]；并且第二多肽具有下式：[A’]-[L2]-[B]或[B]-[L2]-[A’]，其中A为p19或p40，其中当A为p19时，A’为p40，并且当A为p40时，A’为p19；A’为p19或p40；L1为第一蛋白酶可裂解接头；L2为第二蛋白酶可裂解接头；B为半衰期延长元件；并且D为阻断元件。
在实施方案中，IL-23多肽复合物包含选自由SEQ ID NO:423-428组成的组的第一多肽，或与SEQ ID NO:423-428具有至少80％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，IL-23多肽复合物包含选自由SEQ ID NO:18或433组成的组的第二多肽。
如上所述，如果期望，IL-23可以是突变蛋白。IL-23突变蛋白保留IL-23活性，例如固有的IL-23受体激动剂活性。IL-23亚基p19和/或p40可以是突变蛋白。优选地，IL-23突变蛋白具有改变的糖基化模式。例如，IL-23突变蛋白可以是部分非糖基化的或完全非糖基化的。
p19和/或p40亚基可以包含一个或多个氨基酸修饰，例如取代。例如，p19和/或p40亚基可以包含约1个、约2个、约3个、约4个、约5个或更多个氨基酸取代。虽然通常，p19和/或p40亚基包含一个或两个氨基酸取代。取代可以是保守取代或非保守取代，但优选是保守取代。典型的修饰改变了p19和/或p40亚基的糖基化模式，使得p19和/或p40亚基是部分或完全非糖基化的。优选地，氨基酸修饰包括替换天冬酰胺氨基酸。例如，天冬酰胺到谷氨酰胺。
本公开还涉及单链IL-23可诱导多肽。单链IL-23多肽优选包含选自由SEQ ID NO:422或429-432组成的组的氨基酸，或与SEQ ID NO:422或429-432具有至少约80％同一性的氨基酸序列。
本文公开的半衰期延长元件优选为人血清白蛋白、结合人血清白蛋白的抗原结合多肽，或免疫球蛋白Fc或其片段。
蛋白酶可裂解接头包含能够被选自以下的蛋白酶裂解的序列：激肽释放酶、凝血酶、糜酶、羧肽酶A、组织蛋白酶、弹性蛋白酶、PR-3、颗粒酶M、钙蛋白酶、基质金属蛋白酶(MMP)、ADAM、FAP、纤溶酶原激活物、半胱天冬酶、类胰蛋白酶或肿瘤蛋白酶。蛋白酶优选地选自组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶K、组织蛋白酶L或组织蛋白酶G。可替代地，蛋白酶优选地选自基质金属蛋白酶(MMP)，所述基质金属蛋白酶为MMP1、MMP2、MMP3、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13或MMP14。
在实施方案中，蛋白酶可裂解接头包含至少两个能够独立地被蛋白酶裂解的序列。蛋白酶可裂解接头可以包含合成序列。在实施方案中，蛋白酶可裂解接头中的每一个被两种或更多种不同的蛋白酶裂解。
本文所述的阻断元件可以是与IL-12或IL-23结合的任何元件。本文公开的阻断元件可以结合p35、p40，或p35p40异二聚体复合物。本文公开的阻断元件可以结合p19、p40，或p19p40异二聚体复合物。阻断元件优选地为单链可变片段(scFv)或Fab。
本公开还涉及编码本文所述的IL-12多肽复合物的核酸。本公开还涉及编码本文所述的IL-23多肽复合物的核酸。编码本文所述的IL-12多肽复合物或IL-23多肽复合物的核酸组合物可以包含环状载体、DNA或RNA。本文还提供了一种包含编码如本文所述的IL-12多肽复合物或IL-23多肽复合物的核酸的表达载体。在实施方案中，本文提供了一种包含载体的宿主细胞。本公开还涉及制备药物组合物的方法，其包括在用于表达多肽复合物的合适条件下培养分离的宿主细胞。
本文还提供了包含如本文所公开的IL-12多肽复合物的药物组合物。本文还提供了包含IL-23多肽复合物的药物组合物。
本公开还涉及用于***的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的本文公开的IL-12多肽复合物、编码IL-12多肽复合物的核酸，或其药物组合物。本公开还涉及用于***的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的本文公开的IL-23多肽复合物、编码IL-23多肽复合物的核酸，或其药物组合物。可以根据本文公开的方法治疗任何合适的肿瘤，例如黑素瘤或乳腺癌。
附图说明
附图未必按比例或详尽地绘制。相反，重点通常放在说明本文所述的本发明的原理上。构成本说明书一部分的附图阐明与本公开一致的若干实施方案，并且连同说明书一起用来解释本公开的原理。在附图中：
图1A-1J是示出包含两条或三条多肽链的各种可诱导的IL-12复合物的示意图。
图2A-2S是示出融合蛋白异二聚体在HEKBlue IL-12报告基因测定中的活性的一系列图表。与嵌合IL-12(小鼠p35/人p40))或重组IL-12(对照)相比，通过异二聚体IL-12多肽实现的IL-12/STAT4激活。方形示出未切割的可诱导异二聚体的IL-12活性，并且三角形示出切割的异二聚体的IL-12活性。圆圈示出对照的活性。每一个的EC50值在表中示出。
图3A-3F是示出融合蛋白异二聚体在IL-12荧光素酶报告基因测定中的活性的一系列图表。示出与重组人IL-12(对照)相比，异二聚体IL-12多肽的IL-12信号传导的激活。实心方形示出未切割的可诱导异二聚体IL-12多肽(完整)的活性，并且空心方形示出切割的可诱导异二聚体(裂解)的活性。圆圈示出对照重组人IL-12的活性。每一个的EC50值在表中示出。
图4A-4G是示出融合蛋白异二聚体在IL-12T-Blast测定中的活性的一系列图表。示出与IL-12(对照)相比，通过异二聚体IL-12多肽实现的IL-12信号传导的激活。方形示出未切割的可诱导异二聚体IL-12多肽(完整)的活性，并且三角形示出切割的可诱导异二聚体IL-12多肽的活性。圆圈示出对照(IL-12)的活性。EC50值在表中示出。
图5是一系列SDS-PAGE凝胶，比较了WW0663(SEQ ID NO:18)(其中IL-12亚基使用被设计为不可裂解的接头连接的单个多肽链)并且在哺乳动物宿主细胞系中产生并通过蛋白A色谱法纯化。比较了还原和非还原条件。分析显示WW0663在连接p35和p40的接头处或附近发生非预期裂解。相比之下，异二聚体WW0750/WW0636当在相同的哺乳动物宿主细胞系中产生时，仅显示出预期产物。
图6是示出在同基因MC38小鼠肿瘤模型中分析WW0749/636的结果的图表。其示出用43μg WW0749/636(三角形)、170μg WW0749/636(倒三角形)、340μg WW0749/636(菱形)和510μg WW0749/636(方形)治疗的小鼠随时间推移的平均肿瘤体积。单独的媒介物通过圆圈指示。
图7A-7E示出与图6所示的数据相对应的一系列蜘蛛图，其示出可诱导的IL-12融合蛋白在MC38小鼠异种移植模型中的活性。图中的每条线是单只小鼠随时间推移的肿瘤体积。
图8是示出在同基因MC38小鼠肿瘤模型中分析WW0749/636的结果的图表。其示出用43μg WW0749/636(三角形)、170μg WW0749/636(倒三角形)、340μg WW0749/636(菱形)和510μg WW0749/636(方形)治疗的小鼠随时间推移的平均百分比体重。单独的媒介物通过圆圈指示。
图9A-9E示出与图8所示的数据相对应的一系列蜘蛛图，其示出可诱导的IL-12融合蛋白(WW0749/636)在MC38小鼠异种移植模型中对体重的影响。图中的每条线是单只小鼠随时间推移的体重。
图10是示出在同基因MC38小鼠肿瘤模型中分析WW0751/636的结果的图表。其示出用43μg WW0751/636(三角形)、170μg WW0751/636(倒三角形)、340μg WW0751/636(菱形)和510μg WW0751/636(方形)治疗的小鼠随时间推移的平均肿瘤体积。单独的媒介物通过圆圈指示。数据显示肿瘤体积在用所有浓度的WW0751/636治疗的小鼠中均随着时间的推移而减小。
图11A-11E示出与图10中所示的数据相对应的一系列蜘蛛图，其示出融合蛋白(WW0751/636)在MC38小鼠异种移植模型中的活性。图中的每条线都是单只小鼠随时间推移的肿瘤体积。
图12是示出在同基因MC38小鼠肿瘤模型中分析WW0751/636的结果的图表。其示出用43μg WW0751/636(三角形)、170μg WW0751/636(倒三角形)、340μg WW0751/636(菱形)和510μg WW0751/636(方形)治疗的小鼠随时间推移的平均百分比体重。单独的媒介物通过圆圈指示。
图13A-13E示出与图12中所示的数据相对应的一系列蜘蛛图，其示出融合蛋白在MC38小鼠异种移植模型中对体重的影响。图中的每条线都是单只小鼠随时间推移的体重。
图14是示出在同基因MC38小鼠肿瘤模型中分析WW0753/636/727的结果的图表。其示出用52μg WW0753/636/727(三角形)、207μg WW0753/636/727(倒三角形)、414μgWW0753/636/727(菱形)和621μg WW0753/636/727(方形)治疗的小鼠随时间推移的平均肿瘤体积。单独的媒介物通过圆圈指示。数据显示肿瘤体积随着时间的推移在用更高浓度的WW0753/636/727治疗的小鼠中以剂量依赖性方式减小。
图15A-15E示出与图14中所示的数据相对应的一系列蜘蛛图，其示出融合蛋白(WW0753/636/727)在MC38小鼠异种移植模型中的活性。图中的每条线都是单只小鼠随时间推移的肿瘤体积。
图16是示出在同基因MC38小鼠肿瘤模型中分析WW0753/636/727的结果的图表。其示出用52μg WW0753/636/727(三角形)、207μg WW0753/636/727(倒三角形)、414μgWW0753/636/727(菱形)和621μg WW0753/636/727(方形)治疗的小鼠随时间推移的平均百分比体重。单独的媒介物通过圆圈指示。
图17A-17E示出与图16中所示的数据相对应的一系列蜘蛛图，其示出融合蛋白(WW0753/636/727)在MC38小鼠异种移植模型中对体重的影响。图中的每条线都是单只小鼠随时间推移的体重。
图18是示出在同基因MC38小鼠肿瘤模型中分析WW0755/636/727的结果的图表。其示出用52μg WW0753/636/727(三角形)、207μg WW0755/636/727(倒三角形)、414μgWW0755/636/727(菱形)和621μg WW0755/636/727(方形)治疗的小鼠随时间推移的平均肿瘤体积。单独的媒介物通过圆圈指示。
图19A-19E示出与图18中所示的数据相对应的一系列蜘蛛图，其示出融合蛋白(WW0755/636/727)在MC38小鼠异种移植模型中的活性。图中的每条线都是单只小鼠随时间推移的肿瘤体积。
图20是示出在同基因MC38小鼠肿瘤模型中分析WW0755/636/727的结果的图表。其示出用52μg WW0755/636/727(三角形)、207μg WW0755/636/727(倒三角形)、414μgWW0755/636/727(菱形)和621μg WW0753/636/727(方形)治疗的小鼠随时间推移的平均百分比体重。单独的媒介物通过圆圈指示。
图21A-21E示出与图20中所示的数据相对应的一系列蜘蛛图，其示出融合蛋白(WW0755/636/727)在MC38小鼠异种移植模型中对体重的影响。图中的每条线都是单只小鼠随时间推移的体重。
图22是示出在同基因MC38小鼠肿瘤模型中分析WW0749/636的结果的图表。其示出用3.5μg WW0749/636(菱形)、14μg WW0749/636(方形)和43μg WW0749/636(蓝色圆圈)治疗的小鼠随时间推移的平均肿瘤体积。单独的媒介物通过黑色圆圈指示。
图23A-23D示出与图22中所示的数据相对应的一系列蜘蛛图，其示出融合蛋白(WW0749/636)在MC38小鼠异种移植模型中的活性。图中的每条线都是单只小鼠随时间推移的肿瘤体积。
图24是示出在同基因MC38小鼠肿瘤模型中分析WW0749/636的结果的图表。其示出用3.5μg WW0749/636(菱形)、14μg WW0749/636(方形)和43μg WW0749/636(蓝色圆圈)治疗的小鼠随时间推移的平均百分比体重。单独的媒介物通过黑色圆圈指示。
图25A-25D示出与图24中所示的数据相对应的一系列蜘蛛图，其示出融合蛋白(WW0749/636)在MC38小鼠异种移植模型中对体重的影响。图中的每条线都是单只小鼠随时间推移的体重。
图26是示出在同基因MC38小鼠肿瘤模型中分析WW0753/636/727的结果的图表。其示出用4.3μg WW0753/636/727(菱形)、17μg WW0753/636/727(方形)和52μg WW0753/636/727(蓝色圆圈)治疗的小鼠随时间推移的平均肿瘤体积。单独的媒介物通过黑色圆圈指示。
图27A-27D示出与图26中所示的数据相对应的一系列蜘蛛图，其示出融合蛋白(WW0753/636/727)在MC38小鼠异种移植模型中的活性。图中的每条线都是单只小鼠随时间推移的肿瘤体积。
图28是示出在同基因MC38小鼠肿瘤模型中分析WW0753/636/727的结果的图表。其示出用4.3μg WW0753/636/727(菱形)、17μg WW0753/636/727(方形)和52μg WW0753/636/727(蓝色圆圈)治疗的小鼠随时间推移的平均百分比体重。单独的媒介物通过黑色圆圈指示。
图29A-29D示出与图28中所示的数据相对应的一系列蜘蛛图，其示出融合蛋白(WW0753/636/727)在MC38小鼠异种移植模型中对体重的影响。图中的每条线都是单只小鼠随时间推移的体重。
图30是示出在同基因MC38小鼠肿瘤模型中分析WW0757/636的结果的图表。其示出用14μg WW0757/636(菱形)、43μg WW0757/636(方形)、86μg WW0757/636(圆圈)、170μgWW0757/636(正三角形)、510μg WW0757/636(倒三角形)、765μg WW0757/636(星形)和1,020μg WW0757/636(星号)治疗的小鼠随时间推移的平均肿瘤体积。单独的媒介物通过圆圈指示。
图31A-31H示出与图30中所示的数据相对应的一系列蜘蛛图，其示出融合蛋白(WW0757/636)在MC38小鼠异种移植模型中的活性。图中的每条线都是单只小鼠随时间推移的肿瘤体积。1,020μg的WW0757/636由于耐受性差而在第7天和第11天有两个给药假期。
图32是示出在同基因MC38小鼠肿瘤模型中分析WW0757/636的结果的图表。其示出用14μg WW0757/636(菱形)、43μg WW0757/636(方形)、86μg WW0757/636(圆圈)、170μgWW0757/636(正三角形)、510μg WW0757/636(倒三角形)、765μg WW0757/636(星形)和1,020μg WW0757/636(星号)治疗的小鼠随时间推移的平均百分比体重。单独的媒介物通过黑色圆圈指示。
图33A-33H示出与图31中所示的数据相对应的一系列蜘蛛图，其示出融合蛋白(WW0757/636)在MC38小鼠异种移植模型中对体重的影响。图中的每条线都是单只小鼠随时间推移的体重。
图34是示出在同基因MC38小鼠肿瘤模型中分析WW0804/636的结果的图表。其示出用42μg WW0804/636(菱形)、168μg WW0804/636(方形)、505μg WW0804/636(圆圈)、757μgWW0804/636(正三角形)和1,010μg WW0804/636(倒三角形)治疗的小鼠随时间推移的平均肿瘤体积。单独的媒介物通过圆圈指示。
图35A-35F示出与图33中所示的数据相对应的一系列蜘蛛图，其示出融合蛋白(WW0804/636)在MC38小鼠异种移植模型中的活性。图中的每条线都是单只小鼠随时间推移的肿瘤体积。767μg和1,020μg的WW0804/636由于耐受性差而在第11天有一个给药假期。
图36是示出在同基因MC38小鼠肿瘤模型中分析WW0804/636的结果的图表。其示出用42μg WW0804/636(菱形)、168μg WW0804/636(方形)、505μg WW0804/636(圆圈)、757μgWW0804/636(正三角形)和1,010μg WW0804/636(倒三角形)治疗的小鼠随时间推移的平均百分比体重。单独的媒介物通过黑色圆圈指示。
图37A-37F示出与图35中所示的数据相对应的一系列蜘蛛图，其示出融合蛋白(WW0804/636)在MC38小鼠异种移植模型中对体重的影响。图中的每条线都是单只小鼠随时间推移的体重。757μg和1,010μg的WW0804/636分别在第11天有一个给药假期。
图38是非糖基化的IL-12多肽构建体的SDS-PAGE凝胶图像。凝胶在第一列中示出WW0924(SEQ ID NO:442)/WW0925(SEQ ID NO:443)。凝胶在第二列中示出WW0935(SEQ IDNO:444)/WW0936(SEQ ID NO:445)。凝胶在第三列中示出WW0924(SEQ ID NO:442)/WW0636(SEQ ID NO:18)。凝胶在第四列中示出WW0758(SEQ ID NO:104)/WW0925(SEQ ID NO:SEQID NO:443)。
图39A-39D示出来自衍生自CHO细胞的非糖基化的IL-12多肽构建体的SEC分析的一系列图表。图39A示出完全非糖基化的WW0924(SEQ ID NO:442)/WW0925(SEQ ID NO:443)。图39B示出部分非糖基化的WW0935(SEQ ID NO:444)/WW0936(SEQ ID NO:445)。图39C示出完全非糖基化的WW0924(SEQ ID NO:442)/WW0636(SEQ ID NO:18)。图39D示出完全WW0758(SEQ ID NO:104)/WW0925(SEQ ID NO:SEQ ID NO:443)。
图40A和40B是示出融合蛋白在HEKBlue IL-23报告基因测定中的活性的一系列图表。图40A示出在不存在白蛋白的情况下WW50009(半衰期延长的小鼠IL23融合蛋白(方形))与小鼠IL23(对照(圆圈))的比较中的IL-23/STAT3激活。图40B示出在存在白蛋白的情况下WW50009(半衰期延长的小鼠IL23融合蛋白(方形))与小鼠IL23(对照(圆圈))的比较中的IL-23/STAT3激活。每一个的EC50值在表中示出。基于使用试剂
Figure BDA0004048574510000151
(InvivoGen)对分泌型碱性磷酸酶(SEAP)活性进行定量来进行分析。结果证实半衰期延长的小鼠IL23融合蛋白具有活性，与白蛋白的存在无关。
图41是示出在同基因CT26小鼠肿瘤模型中分析WW0757/636的结果的图表。其示出用50μg WW0757/636(菱形)和100μg WW0757/636(方形)治疗的小鼠随时间的平均肿瘤体积。单独的媒介物通过圆圈指示。数据显示肿瘤体积增加随着时间的推移在用更高浓度的WW0757/636治疗的小鼠中以剂量依赖性方式受到抑制。
图42A-42C示出与图41中所示的数据相对应的一系列蜘蛛图，其示出融合蛋白在CT26小鼠异种移植模型中的活性。图中的每条线都是单只小鼠随时间推移的肿瘤体积。
图43是示出在同基因B16F10小鼠肿瘤模型中分析WW0757/636的结果的图表。其示出用50μg WW0757/636(菱形)和100μg WW0757/636(方形)治疗的小鼠随时间的平均肿瘤体积。单独的媒介物通过圆圈指示。数据显示肿瘤体积增加随着时间的推移在用更高浓度的WW0757/636治疗的小鼠中以剂量依赖性方式受到抑制。
图44A-44C示出与图43中所示的数据相对应的一系列蜘蛛图，其示出融合蛋白在B16F10小鼠异种移植模型中的活性。图中的每条线都是单只小鼠随时间推移的肿瘤体积。
图45是示出在同基因EMT6小鼠肿瘤模型中分析WW0757/636的结果的图表。其示出用50μg WW0757/636(菱形)和100μg WW0757/WW0636(方形)治疗的小鼠随时间推移的平均肿瘤体积。单独的媒介物通过圆圈指示。数据显示肿瘤体积增加随着时间的推移在用更高浓度的WW0757/WW0636治疗的小鼠中以剂量依赖性方式受到抑制。
图46A-46C示出与图45中所示的数据相对应的一系列蜘蛛图，其示出融合蛋白在EMT6小鼠异种移植模型中的活性。图中的每条线都是单只小鼠随时间推移的肿瘤体积。
图47A-47I是示出用WW0757/WW0636处理的MC38小鼠肿瘤提取物的免疫谱(immuneprofiling)和纳米串(nanaostring)分析的一系列图表。图47A-47C示出总CD8+T细胞、四聚体+CD8+T细胞和NK细胞的IFNg产生增加。图47D和47E示出四聚体+CD8+T细胞的CD25和Tbet表达被激活。图47F-47I示出CD4+非Treg的CD25、Tbet、IFNg和TNF产生。P值代表未配对学生T检验。*＝p<0.05；**＝p<0.01；***＝p<0.001；****＝p<0.0001。
图48A-48H是示出IL-12多肽复合物WW0757/WW0636驱动向免疫激活的转录移位(transcriptional shift)的一系列图表。图48A示出媒介物与WW0757/WW000636治疗的动物之间的转录物表达的统计学显著变化的热图分析。图48B-48E示出媒介物与WW0757/0636治疗的肿瘤之间的干扰素信号传导(图48B)和免疫细胞功能(图48C-48E)差异的通路评分分析。图48F-48H示出媒介物与WW0757/0636治疗的肿瘤之间的树突状细胞功能差异的通路评分分析。
图49A-49B是示出在同基因MC38小鼠肿瘤模型中分析WW5009的结果的图表。图49A示出用1μg WW5009(实心圆圈)、10μg WW5009(方形)和100μg WW5009(星形)治疗的小鼠随时间推移的平均肿瘤体积。单独的媒介物通过空心圆圈指示。数据显示在10和100μg的2个最高剂量组中，肿瘤体积随时间的推移而减小。图49B示出WW5009给药对动物平均体重的影响。
图50A-50D是示出与图49A-49B中所示的数据相对应的一系列蜘蛛图，其示出WW5009在MC38小鼠异种移植模型中的活性。图中的每条线都是单只小鼠随时间推移的肿瘤体积。
具体实施方式
本公开涉及可诱导的IL-12多肽复合物，其含有减弱的IL-12并且与天然存在的IL-12相比具有长半衰期。本文公开的IL-12多肽复合物包含两条或更多条多肽链，并且复合物包括IL-12亚基p35和p40、半衰期延长元件、IL-12阻断元件和蛋白酶可裂解接头。复合物中的IL-12的活性(例如，受体结合活性和/或受体激动剂活性)因通过蛋白酶可裂解接头拴系至复合物的阻断元件的作用而减弱。在一个或多个蛋白酶可裂解接头裂解时，阻断元件和半衰期延长元件与IL-12分开并且可以扩散远离IL-12，从而产生活性IL-12。所述活性IL-12通常具有与天然存在的IL-12基本上相似的生物活性和半衰期。图1A-1J示出如本文所公开的IL-12多肽复合物的非限制性实例。本公开还涉及包含可诱导的IL-12多肽复合物的药物组合物，以及编码多肽的核酸，以及用于制备此类多肽和复合物的重组表达载体和宿主细胞。本文还提供了使用所公开的IL-12多肽复合物治疗疾病、病状和病症的方法。
本文公开的IL-12多肽复合物克服了严重限制IL-12的临床使用(特别是在肿瘤学领域中)的毒性和半衰期短的问题。IL-12多肽复合物包含具有受体激动剂活性的IL-12多肽。但是在IL-12多肽复合物的上下文中，IL-12受体激动剂活性减弱，并且循环半衰期延长。
本文公开的IL-12多肽复合物包含至少两条多肽链并且如果期望可以包含三条或更多条多肽链。
本公开还涉及可诱导的IL-23多肽复合物，其含有减弱的IL-23并且与天然存在的IL-23相比具有长半衰期。本文公开的IL-23多肽复合物包含一条或多条多肽链，并且复合物包括IL-23亚基p19和p40、半衰期延长元件、IL-23阻断元件和蛋白酶可裂解接头。复合物中的IL-23的活性(例如，受体结合活性和/或受体激动剂活性)因通过蛋白酶可裂解接头拴系至复合物的阻断元件的作用而减弱。在一个或多个蛋白酶可裂解接头裂解时，阻断元件和半衰期延长元件与IL-23分开并且可以扩散远离IL-23，从而产生活性IL-23。所述活性IL-23通常具有与天然存在的IL-23基本上相似的生物活性和半衰期。本公开还涉及包含可诱导的IL-23多肽复合物的药物组合物，以及编码多肽的核酸，以及用于制备此类多肽和复合物的重组表达载体和宿主细胞。本文还提供了使用所公开的IL-23多肽复合物治疗疾病、病状和病症的方法。
本文公开的IL-23多肽复合物克服了严重限制IL-23的临床使用(特别是在肿瘤学领域中)的毒性和半衰期短的问题。IL-23多肽复合物包含具有受体激动剂活性的IL-23多肽，但在IL-23多肽复合物的上下文中，IL-23受体激动剂活性减弱，并且循环半衰期延长。
本文公开的IL-23多肽复合物包含至少一条多肽链，并且如果期望可以包含两条或更多条多肽链。
本文详细描述了某些说明性和优选的实施方案。本说明书内的实施方案不应解释为限制本公开的范围。
本公开引用的所有出版物和专利均以引用方式整体并入。在以引用方式并入的材料与本说明书相矛盾或不一致的情况下，本说明书将取代任何此类材料。任何参考文献在本文的引用并不承认此类参考文献是本公开的现有技术。当表示值的范围时，其包括使用该范围内的任何特定值的实施方案。另外，对范围中说明的值的引用包括该范围内的各个和每一个值。所有范围都是包括其端值在内的且可组合的。在通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，应了解具体值形成另一个实施方案。对特定数值的引用包括至少该特定值，除非上下文另外明确规定。“或”的使用将意指“和/或”，除非其使用的具体上下文另外规定。
在整个说明书和权利要求书中使用了与说明书的方面相关的各种术语。除非另外指明，否则此类术语将被赋予其在本领域中的普通含义。其他具体定义的术语将以与本文提供的定义一致的方式解释。本领域技术人员一般能充分理解本文所描述或引用的技术和程序，并通常使用常规方法对其进行利用，例如像，Sambrook等人,Molecular Cloning:ALaboratory Manual第4版(2012)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY中描述的广泛利用的分子克隆方法。适当地，除非另外说明，否则通常根据制造商定义的方案和条件进行涉及使用可商购获得的试剂盒和试剂的程序。
除非上下文另外明确指出，否则如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数形式。除非另外具体指出，否则术语“包括”、“诸如”等旨在表达无限制地包括。
除非另外指出，否则在一系列元素或范围之前的术语“至少”、“少于”和“约”或类似术语应理解为指代该系列或范围中的每个元素。本领域技术人员仅使用常规实验将认识到或能够确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等效方案。此类等效方案旨在由以下权利要求书所涵盖。
如本文所用，术语“可活化的”、“活化”、“诱导”和“可诱导的”是指具有减弱的活性形式(例如，减弱的受体结合和/或激动剂活性)和活化形式的多肽复合物。多肽复合物通过接头的蛋白酶裂解被活化，这导致阻断元件和半衰期延长元件从多肽复合物中解离。诱导/活化的多肽复合物可以增加的亲和力/亲合力与IL-12受体结合。诱导/活化的多肽复合物可以增加的亲和力/亲合力与IL-23受体结合。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文可互换使用。如本文所用，抗体或免疫球蛋白旨在指由两条重(H)链组成的免疫球蛋白分子。通常，哺乳动物(例如，人、啮齿动物和猴子)中的抗体包含四条多肽链，即通过二硫键相互连接的两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链由重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域CHI、CH2和CH3构成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其中穿插有更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，以下列顺序从氨基端至羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。抗体可以包括，例如，单克隆抗体、重组产生的抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、免疫球蛋白、合成抗体，或包含两个重链和两个轻链分子的四聚体抗体。本领域技术人员将认识到存在其他形式的抗体(例如骆驼和鲨鱼抗体)。
如本文所用的术语“减弱的”是与IL-12受体或IL-23受体的天然存在的激动剂相比，具有降低的受体激动剂活性的IL-12受体激动剂或IL-23受体激动剂。与受体的天然存在的激动剂相比，减弱的IL-12激动剂或减弱的IL-23激动剂可以具有至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约250倍、至少约500倍、至少约1000倍或更低的激动剂活性。当如本文所述的包含IL-12的IL-12多肽复合物被描述为“减弱的”或具有“减弱的活性”时，其意指IL-12多肽复合物是减弱的IL-12受体激动剂。当如本文所述的包含IL-23的IL-23多肽复合物被描述为“减弱的”或具有“减弱的活性”时，其意指IL-23多肽复合物是减弱的IL-23受体激动剂。
术语“癌症”是指哺乳动物的生理状况，其中细胞群的特征是不受控制的增殖、永生、转移潜能、快速生长和增殖速率和/或某些形态特征。通常，癌症可以是肿瘤或肿块的形式，但可单独存在于受试者体内，或可作为独立细胞诸如白血病细胞或淋巴瘤细胞在血流中循环。术语癌症包括所有类型的癌症和转移，包括血液***恶性肿瘤、实体瘤、肉瘤、癌以及其他实体和非实体瘤。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、***、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌)、骨肉瘤、黑素瘤、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌(例如，浆液性)或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、***癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌，以及各种类型的头颈癌。三阴性乳腺癌是指***受体(ER)、孕酮受体(PR)和Her2/neu的基因表达均为阴性的乳腺癌。
如本文所用，“保守”氨基酸取代通常是指一个氨基酸残基被来自可以改变肽结构但基本上保留肽的生物活性的公认组内的另一个氨基酸残基取代。氨基酸的保守取代是本领域技术人员已知的。氨基酸的保守取代可以包括但不限于在以下组内的氨基酸之间进行的取代：(a)M、I、L、V；(b)F、Y、W；(c)K、R、H；(d)A、G；(e)S、T；(f)Q、N；以及(g)E、D。例如，本领域普通技术人员合理地预期用异亮氨酸或缬氨酸单独替换亮氨酸、用谷氨酸单独替换天冬氨酸、用丝氨酸单独替换苏氨酸，或用结构相关的氨基酸类似地替换氨基酸将不对所得分子的生物活性产生重大影响。
如本文所用，术语“半衰期延长元件”在本文公开的多肽复合物的上下文中是指化学元件，优选地为多肽，其例如通过改变其大小(例如，使其高于肾脏滤过界限(kidneyfiltration cutoff))、形状、流体动力学半径、电荷、或吸收、生物分布、代谢和消除的参数来增加血清半衰期并改善pK。
如本文所用，术语“可操作地连接”在多肽复合物的上下文中是指允许组分以其预期方式起作用的多肽复合物的组分的取向。例如，当IL-12阻断元件能够抑制IL-12多肽的IL-12受体激活活性，但在蛋白酶可裂解接头裂解时，IL-12阻断元件对IL-12多肽的IL-12受体激活活性的抑制降低或消除(例如因为IL-12阻断元件可以扩散远离IL-12)时，包含IL-12亚基的多肽和IL-12阻断元件在多肽复合物中通过蛋白酶可裂解接头可操作地连接。
如本文所用，术语“肽”、“多肽”或“蛋白质”广泛地用于指由肽键连接的两个或更多个氨基酸。蛋白质、肽和多肽在本文中也可互换使用，以指氨基酸序列。应当认识到，术语多肽在本文中并不用于暗示构成所述分子的氨基酸的特定大小或数量，并且本发明的肽可以包含最多至几个氨基酸残基或更多。
本文中的术语“受试者”是指任何动物，诸如任何哺乳动物，包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿动物等。在一些实施方案中，哺乳动物是小鼠。在一些实施方案中，哺乳动物是人。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指在施用条件下足以实现期望的药理学或生理学效果的本文所述化合物(即，IL-12多肽复合物)的量。例如，“治疗有效量”可以是足以减少疾病或病状(例如，肿瘤)的体征或症状的量。本领域技术人员将理解，治疗效果不必是完全的或治愈性的，只要为受试者提供一些益处即可。药物组合物的治疗有效量可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及药物组合物在个体中引发期望应答的能力等因素而变化。基于这些和其他考虑，普通的熟练临床医生可以确定施用以实现期望治疗益处的适当量。
A.IL-12多肽复合物
本公开涉及包含至少两条多肽链并且如果期望，可以包含三条多肽链或更多条多肽链的可诱导的IL-12多肽复合物。本文公开的两条或更多条多肽链是不同的，即复合物可以是异二聚体、异三聚体等。可诱导的IL-12多肽复合物包含p35 IL-12亚基、p40 IL-12亚基、半衰期延长元件、IL-12阻断元件和蛋白酶可裂解接头。p35亚基和p40亚基缔合形成具有固有的IL-12受体激动剂活性的IL-12异二聚体。在IL-12多肽复合物的上下文中，IL-12受体激动剂活性减弱并且循环半衰期延长。IL-12受体激动剂活性通过阻断元件减弱。半衰期延长元件也可以有助于减弱，例如通过空间效应。阻断元件能够通过空间阻断和/或非共价地结合IL-12(例如，p35、p40或p35p40复合物)来阻断IL-12的全部或一些受体激动剂的活性。在蛋白酶可裂解接头裂解时，从IL-12多肽复合物中释放出一种IL-12形式，其具有活性(例如，比IL-12多肽复合物更具活性)。通常，释放的IL-12的活性比IL-12多肽复合物高至少10倍。优选地，释放的IL-12的活性比IL-12多肽复合物高至少20倍、至少30倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少300倍、至少500倍、至少1000倍、至少约10,000倍或更高。
在IL-12多肽复合物裂解时释放的IL-12形式通常具有短半衰期，其通常与天然存在的IL-12的半衰期基本上类似。即使IL-12多肽复合物的半衰期延长，毒性也降低或消除，因为循环的IL-12多肽复合物被减弱并且活性IL-12靶向至期望位点(例如，肿瘤微环境)。
本领域技术人员将理解，多肽链的数量，以及p35和p40亚基、半衰期延长元件、一个或多个蛋白酶可裂解接头和阻断元件(以及此类元件的组分，诸如VH或VL结构域)在多肽链上的位置可以变化并且通常是设计偏好的问题。所有此类变化都涵盖在本公开中。
在实施方案中，IL-12多肽复合物包含两条不同的多肽链。通常，第一多肽链包含p35并且第二多肽链包含p40。p35和p40亚基缔合形成具有生物活性的异二聚体。p35p40异二聚体复合物可以共价连接，例如通过二硫键。
在实施方案中，第一或第二多肽中的任一者可以包含IL-12阻断元件(例如，结合IL-12的scFV)，其通过蛋白酶可裂解接头可操作地连接至IL-12亚基。另一多肽链可以进一步包含半衰期延长元件，其通过蛋白酶可裂解接头可操作地连接至IL-12亚基。优选地，该复合物包括一种功能性阻断元件和一种功能性半衰期延长元件。例如，当第一多肽链包含IL-12阻断元件时，第二多肽链不包含IL-12阻断元件。在其他实施方案中，一条多肽链包括p35或p40，并且进一步包括半衰期延长元件和阻断元件，它们中的每一个通过蛋白酶可裂解接头(例如，一个或多个蛋白酶可裂解接头)可操作地连接至p35或p40，并且另一多肽包括互补的IL-12亚基(例如，p40或p35)。第二多肽上的IL-12阻断元件可以通过蛋白酶可裂解接头可操作地连接至IL-12亚基。可替代地，IL-12阻断元件可以通过任选的蛋白酶可裂解接头可操作地连接至半衰期延长元件。第一和第二多肽链上的蛋白酶可裂解接头可以相同或可以不同。优选地，第一和第二多肽链上的蛋白酶可裂解接头是相同的。该IL-12多肽复合物中的阻断元件可以是单链抗体。对IL-12具有结合特异性的任何单链抗体都可以是阻断元件。优选地，阻断元件是scFv。
虽然本文公开的复合物优选包含一种半衰期延长元件和一种阻断元件，但此类元件可以包含两种或更多种存在于相同多肽链或不同多肽链上的组分。对此进行说明，并且如本文所公开和举例说明的，阻断元件的组分可以存在于单独的多肽链上。例如，第一多肽链可以包括抗体轻链(VL+CL)或轻链可变结构域(VL)并且第二多肽可以包括与第一多肽上的VL+CL或VL互补的抗体重链Fab片段(VH+CH1)或重链可变结构域(VH)。在此类情况下，这些组分可以在肽复合物中缔合形成抗原结合位点，诸如结合IL-12并减弱IL-12活性的Fab。
在实施方案中，p35和p40亚基可以位于同一多肽链上，并且通过任选的蛋白酶可裂解接头连接。在双链或多链复合物的此类实施方案中，半衰期延长元件、阻断元件或半衰期延长或阻断元件的组分中的至少一者处于单独的多肽上。例如，第一多肽可以包括通过任选可裂解多肽链连接的p35和p40，并且IL-12多肽复合物的其他元件位于第二多肽链上。在另一个实例中，第一多肽链包含p35亚基、p40亚基、半衰期延长元件，以及抗体轻链的一部分。第二多肽包含与抗体轻链互补的抗体重链的一部分。抗体轻链的部分与互补重链一起在复合物中缔合形成IL-12的结合位点。在另一个实例中，第一多肽包含p35亚基、p40亚基、半衰期延长元件，以及抗体重链的一部分。在该实例中，第二多肽包含与抗体重链互补的抗体轻链的一部分。抗体重链的部分与互补轻链一起在复合物中缔合形成IL-12的结合位点。在这些复合物中，p35亚基和p40亚基可以通过任选的蛋白酶可裂解接头可操作地连接。优选地，p35亚基和p40亚基通过不可裂解的接头可操作地连接。
在本文公开的复合物中，半衰期延长元件优选通过蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p35亚基或p40亚基。例如，复合物可以包括第一多肽，其中p35或p40通过蛋白酶可裂解接头可操作地连接至半衰期延长元件。在另一个实例中，复合物可以包括第一多肽，其中p35或p40通过蛋白酶可裂解接头可操作地连接至半衰期延长元件，并且半衰期延长元件通过任选的蛋白酶可裂解接头进一步可操作地连接至阻断元件(或阻断元件的组分)。在此类示例性实施方案中，复合物包含至少一个另外的多肽，其包括第一多肽上不存在的IL-12亚基(p40或p35)。本公开设想并涵盖复合物的元件的另外布置。例如，阻断元件可以通过蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p35亚基或p40亚基。半衰期延长元件或阻断元件中的一者可以可操作地连接至p35亚基，并且半衰期延长元件或阻断元件中的另一者可以可操作地连接至p40亚基。当半衰期延长元件可操作地连接至p35亚基时，阻断元件可以可操作地连接至p40亚基。当半衰期延长元件可操作地连接至p40亚基时，阻断元件可以可操作地连接至p35亚基。该复合物中的阻断元件优选是Fab。
可诱导的IL-12多肽复合物可以包含三条多肽链。通常，一条多肽链包含p35或p40IL-12亚基，但不是两者，并且第二多肽包含另一个IL-12亚基，并且第三多肽包含阻断元件的至少一部分(组分)。当第一多肽上的IL-12亚基为p35时，第二多肽上的IL-12亚基为p40。当第一多肽上的IL-12亚基为p40时，第二多肽上的IL-12亚基为p35。当多肽表达并折叠时，p35和p40亚基可以缔合形成具有生物活性的异二聚体。p35p40异二聚体复合物可以共价连接，例如通过二硫键。
在一些实施方案中，第一多肽可以另外包含半衰期延长元件，其在存在时通过蛋白酶可裂解接头可操作地连接至IL-12亚基。第二多肽进一步包含阻断元件的一部分，并且第三多肽可以包含阻断元件的其余部分。在这样的复合物中，IL-12阻断元件可以是通过多肽二和多肽三的相互作用形成的抗体的抗原结合片段，例如Fab片段。在实施方案中，第二多肽可以包含抗体轻链的至少抗原结合部分。可替代地，第二多肽可以包含抗体重链的至少抗原结合部分。抗体轻链的抗原结合部分或重链的抗原结合部分可以通过蛋白酶可裂解接头可操作地连接至IL-12亚基。在一些实施方案中，第二多肽可以包含半衰期延长元件。当第二多肽包含半衰期延长元件时，第一多肽不包含半衰期延长元件。半衰期延长元件可以通过蛋白酶可裂解接头可操作地连接至IL-12亚基。可替代地或除此之外，半衰期延长元件可以通过任选蛋白酶可裂解接头可操作地连接至阻断元件的一部分(例如，抗体轻链的抗原结合部分或重链的抗原结合部分)。当半衰期延长元件存在并且可操作地连接至IL-12亚基时，抗体重链或轻链可以通过蛋白酶可裂解接头可操作地连接至IL-12亚基。可替代地，当半衰期延长元件存在并且可操作地连接至IL-12亚基时，抗体重链或轻链可以通过任选可裂解接头可操作地连接至IL-12亚基。第一、第二和/或多肽链上的蛋白酶可裂解接头可以相同或可以不同。
在一些实施方案中，IL-12多肽复合物包含含有选自SEQ ID NO:95-110、SEQ IDNO:119-126和SEQ ID NO:135-143的氨基酸的第一多肽链。某些优选的IL-12多肽复合物包含SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:136的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-12多肽复合物包含含有选自SEQ ID NO:119-126和SEQ ID NO:135-143的氨基酸序列的第一多肽序列和含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的第二多肽。优选的IL-12多肽复合物包含含有SEQ ID NO:104的氨基酸序列的第一多肽链和含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的第二多肽链。另一优选的IL-12多肽包含含有SEQ ID NO:136的氨基酸序列的第一多肽链和含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的第二多肽链。
在一些实施方案中，IL-12多肽复合物的第一多肽链包含与选自SEQ ID NO:95-110、SEQ ID NO:119-126和SEQ ID NO:135-143的氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-12多肽复合物的第二多肽链包含与SEQID NO:18的氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
如上所述，如果期望，IL-12可以是突变蛋白。IL-12突变蛋白保留IL-12活性，例如固有的IL-12受体激动剂活性。IL-12亚基p35和/或p40可以是突变蛋白。优选地，IL-12突变蛋白具有改变的糖基化模式。例如，IL-12突变蛋白可以是部分非糖基化的或完全非糖基化的。例如，部分或完全非糖基化的IL-12多肽可以包含选自由SEQ ID NO:104、434或442-445组成的组的多肽，或与SEQ ID NO:104、434或442-445具有至少80％同一性的氨基酸序列。
p35和/或p40亚基可以包含一个或多个氨基酸修饰，例如取代。例如，p35和/或p40亚基可以包含约1个、约2个、约3个、约4个、约5个或更多个氨基酸取代。虽然通常，p35和/或p40亚基包含一个或两个氨基酸取代。取代可以是保守取代或非保守取代，但优选是保守取代。典型的修饰改变了p35和/或p40亚基的糖基化模式，使得p35和/或p40亚基是部分或完全非糖基化的。优选地，氨基酸修饰包括替换天冬酰胺氨基酸。例如，天冬酰胺到谷氨酰胺。在特定实例中，SEQ ID NO:434的IL-12p35上的氨基酸位置16、75、85、133、151、158、201、206、221、250、267、280、282、326、400、404、425、555、572、575、582或602处的天冬酰胺可以突变。在特定实例中，SEQ ID NO:18的IL-12p40的氨基酸位置103、114、163、219、227或282处的天冬酰胺可以突变。
本发明还涉及某些单链IL-12可诱导多肽。本文公开的单链IL-12多肽包含IL-12、阻断元件、半衰期延长元件和蛋白酶可裂解接头。IL-12对其同源IL-12受体具有受体激动剂活性。当阻断元件与IL-12结合时，IL-12受体激活活性减弱。在蛋白酶可裂解接头裂解时，活性IL-12多肽释放。单链可诱导IL-12多肽已公开于国际申请号：PCT/US2019/032320和国际申请号：PCT/US2019/032322中。
本文公开的单链IL-12可诱导多肽包含选自SEQ ID NO:7、9、10、18、24-94、SEQ IDNO:110-118和SEQ ID NO:127-134的氨基酸序列。在一些实施方案中，单链IL-12可诱导多肽包含与SEQ ID NO:7、9、10、18、24-94、SEQ ID NO:110-118和SEQ ID NO:127-134具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少99％同一性的序列。
B.IL-23多肽复合物
本公开涉及包含至少两条多肽链并且如果期望，可以包含三条多肽链或更多条多肽链的可诱导的IL-23多肽复合物。本文公开的两条或更多条多肽链是不同的，即复合物可以是异二聚体、异三聚体等。可诱导的IL-23多肽复合物包含p19 IL-23亚基、p40 IL-23亚基、半衰期延长元件、IL-23阻断元件和蛋白酶可裂解接头。p19亚基和p40亚基缔合形成具有固有的IL-23受体激动剂活性的IL-23异二聚体。如本领域技术人员将充分理解的，IL-23和IL-12共享相同的p40亚基。在IL-23多肽复合物的上下文中，IL-23受体激动剂活性减弱并且循环半衰期延长。IL-23受体激动剂活性通过阻断元件减弱。半衰期延长元件也可以有助于减弱，例如通过空间效应。阻断元件能够通过空间阻断和/或非共价地结合IL-23(例如，p19、p40或p19p40复合物)来阻断IL-23的全部或一些受体激动剂的活性。在蛋白酶可裂解接头裂解时，从IL-23多肽复合物中释放出一种IL-23形式，其具有活性(例如，比IL-23多肽复合物更具活性)。通常，释放的IL-23的活性比IL-23多肽复合物高至少10倍。优选地，释放的IL-23的活性比IL-23多肽复合物高至少20倍、至少30倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少300倍、至少500倍、至少1000倍、至少约10,000倍或更高。
在IL-23多肽复合物裂解时释放的IL-23形式通常具有短半衰期，其通常与天然存在的IL-23的半衰期基本上类似。即使IL-23多肽复合物的半衰期延长，毒性也降低或消除，因为循环的IL-23多肽复合物被减弱并且活性IL-23靶向至期望位点(例如，肿瘤微环境)。
本领域技术人员将理解，多肽链的数量，以及p19和p40亚基、半衰期延长元件、一个或多个蛋白酶可裂解接头和阻断元件(以及此类元件的组分，诸如VH或VL结构域)在多肽链上的位置可以变化并且通常是设计偏好的问题。所有此类变化都涵盖在本公开中。
在实施方案中，IL-23多肽复合物包含两条不同的多肽链。通常，第一多肽链包含p19并且第二多肽链包含p40。p19和p40亚基缔合形成具有生物活性的异二聚体。p19p40异二聚体复合物可以共价连接，例如通过二硫键。
在实施方案中，第一或第二多肽中的任一者可以包含IL-23阻断元件(例如，结合IL-23的scFV)，其通过蛋白酶可裂解接头可操作地连接至IL-23亚基。另一多肽链可以进一步包含半衰期延长元件，其通过蛋白酶可裂解接头可操作地连接至IL-23亚基。优选地，该复合物包括一种功能性阻断元件和一种功能性半衰期延长元件。例如，当第一多肽链包含IL-23阻断元件时，第二多肽链不包含IL-23阻断元件。在其他实施方案中，一条多肽链包括p19或p40，并且进一步包括半衰期延长元件和阻断元件，它们中的每一个通过蛋白酶可裂解接头(例如，一个或多个蛋白酶可裂解接头)可操作地连接至p19或p40，并且另一多肽包括互补的IL-23亚基(例如，p40或p19)。第二多肽上的IL-23阻断元件可以通过蛋白酶可裂解接头可操作地连接至IL-23亚基。可替代地，IL-23阻断元件可以通过任选的蛋白酶可裂解接头可操作地连接至半衰期延长元件。第一和第二多肽链上的蛋白酶可裂解接头可以相同或可以不同。优选地，第一和第二多肽链上的蛋白酶可裂解接头是相同的。该IL-23多肽复合物中的阻断元件可以是单链抗体。对IL-23具有结合特异性的任何单链抗体都可以是阻断元件。优选地，阻断元件是scFv。
虽然本文公开的复合物优选包含一种半衰期延长元件和一种阻断元件，但此类元件可以包含两种或更多种存在于相同多肽链或不同多肽链上的组分。对此进行说明，并且如本文所公开和举例说明的，阻断元件的组分可以存在于单独的多肽链上。例如，第一多肽链可以包括抗体轻链(VL+CL)或轻链可变结构域(VL)并且第二多肽可以包括与第一多肽上的VL+CL或VL互补的抗体重链Fab片段(VH+CH1)或重链可变结构域(VH)。在此类情况下，这些组分可以在肽复合物中缔合形成抗原结合位点，诸如结合IL-23并减弱IL-23活性的Fab。
在实施方案中，p19和p40亚基可以位于同一多肽链上，并且通过任选的蛋白酶可裂解接头连接。在双链或多链复合物的此类实施方案中，半衰期延长元件、阻断元件或半衰期延长或阻断元件的组分中的至少一者处于单独的多肽上。例如，第一多肽可以包括通过任选可裂解多肽链连接的p19和p40，并且IL-23多肽复合物的其他元件位于第二多肽链上。在另一个实例中，第一多肽链包含p19亚基、p40亚基、半衰期延长元件，以及抗体轻链的一部分。第二多肽包含与抗体轻链互补的抗体重链的一部分。抗体轻链的部分与互补重链一起在复合物中缔合形成IL-23的结合位点。在另一个实例中，第一多肽包含p19亚基、p40亚基、半衰期延长元件，以及抗体重链的一部分。在该实例中，第二多肽包含与抗体重链互补的抗体轻链的一部分。抗体重链的部分与互补轻链一起在复合物中缔合形成IL-23的结合位点。在这些复合物中，p19亚基和p40亚基可以通过任选的蛋白酶可裂解接头可操作地连接。优选地，p19亚基和p40亚基通过不可裂解的接头可操作地连接。
在本文公开的复合物中，半衰期延长元件优选通过蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p19亚基或p40亚基。例如，复合物可以包括第一多肽，其中p19或p40通过蛋白酶可裂解接头可操作地连接至半衰期延长元件。在另一个实例中，复合物可以包括第一多肽，其中p19或p40通过蛋白酶可裂解接头可操作地连接至半衰期延长元件，并且半衰期延长元件通过任选的蛋白酶可裂解接头进一步可操作地连接至阻断元件(或阻断元件的组分)。在此类示例性实施方案中，复合物包含至少一个另外的多肽，其包括第一多肽上不存在的IL-23亚基(p40或p19)。本公开设想并涵盖复合物的元件的另外布置。例如，阻断元件可以通过蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p19亚基或p40亚基。半衰期延长元件或阻断元件中的一者可以可操作地连接至p19亚基，并且半衰期延长元件或阻断元件中的另一者可以可操作地连接至p40亚基。当半衰期延长元件可操作地连接至p19亚基时，阻断元件可以可操作地连接至p40亚基。当半衰期延长元件可操作地连接至p40亚基时，阻断元件可以可操作地连接至p19亚基。该复合物中的阻断元件优选是Fab。
可诱导的IL-23多肽复合物可以包含三条多肽链。通常，一条多肽链包含p19或p40IL-23亚基，但不是两者，并且第二多肽包含另一个IL-23亚基，并且第三多肽包含阻断元件的至少一部分(组分)。当第一多肽上的IL-23亚基为p19时，第二多肽上的IL-23亚基为p40。当第一多肽上的IL-23亚基为p40时，第二多肽上的IL-23亚基为p19。当多肽表达并折叠时，p19和p40亚基可以缔合形成具有生物活性的异二聚体。p19p40异二聚体复合物可以共价连接，例如通过二硫键。
在一些实施方案中，第一多肽可以另外包含半衰期延长元件，其在存在时通过蛋白酶可裂解接头可操作地连接至IL-23亚基。第二多肽进一步包含阻断元件的一部分，并且第三多肽可以包含阻断元件的其余部分。在这样的复合物中，IL-23阻断元件可以是通过多肽二和多肽三的相互作用形成的抗体的抗原结合片段，例如Fab片段。在实施方案中，第二多肽可以包含抗体轻链的至少抗原结合部分。可替代地，第二多肽可以包含抗体重链的至少抗原结合部分。抗体轻链的抗原结合部分或重链的抗原结合部分可以通过蛋白酶可裂解接头可操作地连接至IL-23亚基。在一些实施方案中，第二多肽可以包含半衰期延长元件。当第二多肽包含半衰期延长元件时，第一多肽不包含半衰期延长元件。半衰期延长元件可以通过蛋白酶可裂解接头可操作地连接至IL-23亚基。可替代地或除此之外，半衰期延长元件可以通过任选蛋白酶可裂解接头可操作地连接至阻断元件的一部分(例如，抗体轻链的抗原结合部分或重链的抗原结合部分)。当半衰期延长元件存在并且可操作地连接至IL-23亚基时，抗体重链或轻链可以通过蛋白酶可裂解接头可操作地连接至IL-23亚基。可替代地，当半衰期延长元件存在并且可操作地连接至IL-23亚基时，抗体重链或轻链可以通过任选可裂解接头可操作地连接至IL-23亚基。第一、第二和/或多肽链上的蛋白酶可裂解接头可以相同或可以不同。
在实施方案中，IL-23多肽复合物包含选自由SEQ ID NO:423-428组成的组的第一多肽，或与SEQ ID NO:423-428具有至少80％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，IL-23多肽复合物包含选自由SEQ ID NO:18或433组成的组的第二多肽。
在一些实施方案中，IL-23多肽复合物的第一多肽链包含与选自SEQ ID NO:423-428的氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-23多肽复合物的第二多肽链包含与SEQ ID NO:18或433的氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
如上所述，如果期望，IL-23可以是突变蛋白。IL-23突变蛋白保留IL-23活性，例如固有的IL-23受体激动剂活性。IL-23亚基p19和/或p40可以是突变蛋白。优选地，IL-23突变蛋白具有改变的糖基化模式。例如，IL-23突变蛋白可以是部分非糖基化的或完全非糖基化的。
p19和/或p40亚基可以包含一个或多个氨基酸修饰，例如取代。例如，p19和/或p40亚基可以包含约1个、约2个、约3个、约4个、约5个或更多个氨基酸取代。虽然通常，p19和/或p40亚基包含一个或两个氨基酸取代。取代可以是保守取代或非保守取代，但优选是保守取代。典型的修饰改变了p19和/或p40亚基的糖基化模式，使得p19和/或p40亚基是部分或完全非糖基化的。优选地，氨基酸修饰包括替换天冬酰胺氨基酸。例如，天冬酰胺到谷氨酰胺。例如，天冬酰胺到谷氨酰胺。在特定实例中，SEQ ID NO:424的IL-12p19上的氨基酸位置47或66处的天冬酰胺可以突变。在特定实例中，SEQ ID NO:18的IL-12p40的氨基酸位置103、114、163、219、227或282处的天冬酰胺可以突变。
本发明还涉及某些单链IL-23可诱导多肽。本文公开的单链IL-23多肽包含IL-23、阻断元件、半衰期延长元件和蛋白酶可裂解接头。IL-23对其同源IL-23受体具有受体激动剂活性。当阻断元件与IL-23结合时，IL-23受体激活活性减弱。在蛋白酶可裂解接头裂解时，活性IL-23多肽释放。
本文公开的单链IL-23可诱导多肽包含选自SEQ ID NO:422或429-432的氨基酸序列。在一些实施方案中，单链IL-23可诱导多肽包含与SEQ ID NO:422或429-432具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少99％同一性的序列。
C.半衰期延长元件
本文设想了延长IL-12多肽复合物的半衰期的结构域。本文还设想了延长IL-23多肽的半衰期的结构域。增加天然具有短半衰期的治疗分子的体内半衰期允许更可接受且可管理的给药方案而不牺牲有效性。
半衰期延长元件增加体内半衰期并提供IL-12多肽复合物或IL-23多肽复合物的改变的药效动力学和药代动力学。不受理论的束缚，半衰期延长元件改变药效动力学特性，包括改变IL-12多肽复合物或IL-23多肽复合物的组织分布、穿透和扩散。在一些实施方案中，与不具有半衰期延长元件的蛋白质相比，半衰期延长元件可以改善组织靶向、组织穿透、组织内的扩散和增强的功效。不受理论的束缚，改善多肽的药代动力学的示例性方式是通过在多肽链中表达与受体结合的元件，所述受体再循环到细胞质膜而不是在溶酶体中降解，诸如内皮细胞上的FcRn受体和转铁蛋白受体。三种类型的蛋白质(例如，人IgG、HSA(或片段)和转铁蛋白)在人血清中的存留时间比仅由其大小预测的时间长得多，这是它们与再循环而不是在溶酶体中降解的受体结合的能力的功能。这些蛋白质或片段保留FcRn结合并且通常与其他多肽连接，以延长其血清半衰期。HSA也可直接结合至药物组合物或通过短接头结合。也可使用HSA的片段。HSA及其片段可以用作阻断元件和半衰期延长元件。人IgG和Fc片段也可以执行类似功能。
血清半衰期延长元件也可以为与具有长血清半衰期的蛋白质诸如血清白蛋白、转铁蛋白等结合的抗原结合多肽。此类多肽的实例包括抗体及其片段，包括多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、单链可变片段(scFv)、单域抗体(诸如重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和骆驼型纳米抗体的可变结构域(VHH))、dAb等。其他合适的抗原结合结构域包括模拟抗体结合和/或结构的非免疫球蛋白蛋白，诸如anticalin、affilin、亲和体分子、亲和性多聚体(affimer)、affitin、α体、高亲合性多聚体(avimer)、DARPin、菲诺体(fynomer)、库尼茨型结构域肽、单体，以及基于其他工程化支架诸如SpA、GroEL、纤维连接蛋白、脂质运载蛋白和CTLA4支架的结合结构域。抗原结合多肽的另外的实例包括所期望受体的配体、受体的配体结合部分、凝集素以及与一种或多种靶抗原结合或缔合的肽。
如本文所提供的半衰期延长元件优选为人血清白蛋白(HSA)结合结构域和结合人血清白蛋白的抗原结合多肽，或免疫球蛋白Fc或其片段。
IL-12多肽复合物或IL-23多肽复合物的半衰期延长元件将IL-12多肽复合物或IL-23多肽复合物的半衰期延长至少约两天、约三天、约四天、约五天、约六天、约七天、约八天、约九天、约10天或更长时间。在一些实施方案中，半衰期延长元件将IL-12多肽复合物或IL-23多肽复合物的半衰期延长到至少2-3天、3-4天、4-5天、5-6天天、6-7天、7-8天或更长时间。
D.阻断元件
阻断元件可以是与IL-12或IL-23结合并抑制IL-12多肽复合物或IL-23多肽复合物结合和激活其受体的能力的任何元件。阻断元件可以抑制IL-12或IL-23结合和/或激活其受体的能力，例如通过在空间上阻断和/或通过非共价结合IL-12多肽复合物。本文公开的阻断元件可以结合p19、p35、p40、p35p40异二聚体复合物或p19p40异二聚体复合物。
合适的阻断元件的实例包括IL-12的同源受体的全长或IL-12结合片段或突变蛋白。合适的阻断元件的其他实例包括IL-23的同源受体的全长或IL-23结合片段或突变蛋白。也可以使用结合IL-12或IL-23的抗体及其抗原结合片段，包括多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、单链可变片段(scFv)、单域抗体(诸如重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和骆驼型纳米抗体的可变结构域(VHH))、dAb等。也可以使用结合IL-12或IL-23的其他合适的抗原结合结构域，包括模拟抗体结合和/或结构的非免疫球蛋白蛋白，诸如anticalin、affilin、亲和体分子、亲和性多聚体、affitin、α体、高亲合性多聚体、DARPin、菲诺体、库尼茨型结构域肽、单体，以及基于其他工程化支架诸如SpA、GroEL、纤维连接蛋白、脂质运载蛋白和CTLA4支架的结合结构域。合适的阻断多肽的另外的实例包括在空间上抑制或阻断IL-12或IL-23与其同源受体的结合的多肽。有利地，此类部分也可以用作半衰期延长元件。例如，通过与水溶性聚合物诸如PEG缀合而修饰的肽可以在空间上抑制或阻止细胞因子与其受体的结合。还可以使用具有长血清半衰期的多肽或其片段，诸如血清白蛋白(人血清白蛋白)、免疫球蛋白Fc、转铁蛋白等，以及此类多肽的片段和突变蛋白。
优选的IL-12阻断元件是单链可变片段(scFv)或Fab片段。优选的IL-23阻断元件是单链可变片段(scFv)或Fab片段。scFv阻断元件包含如SEQ ID NO:145-188所示的氨基酸序列。可替代地，Fab阻断元件包含如SEQ ID NO:189-194所示的氨基酸序列。SEQ ID NO:145-194所涵盖的IL-12抗体片段已经过优化以增强本文公开的IL-12多肽复合物的可开发性。
优选的抗体轻链阻断元件包含SEQ ID NO:192-193。这些优选组分可以位于一条多肽链上，并且重链的互补抗原结合部分可以位于第二多肽链上。优选的重链阻断元件包含SEQ ID NO:189-191和194。这些优选组分可以位于一条多肽链上，并且互补轻链位于第二多肽链上。抗体轻链和抗体重链一起形成IL-12的结合位点。
在一些实施方案中，IL-12阻断元件包含例如在SEQ ID No:145-194的全长上，与SEQ ID NO:145-194具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％同一性的氨基酸序列。通常，CDR的氨基酸序列没有改变，并且氨基酸取代存在于框架区中。
本公开还涉及包含SEQ ID NO:145-194的IL-12阻断元件的功能变体。包含SEQ IDNO:145-194的IL-12阻断元件的功能变体通常与SEQ ID NO:145-194有一个或几个氨基酸不同(包括取代、缺失、***或其任何组合)，并且基本上保留其与IL-12多肽(例如，p35亚基、p40亚基或p35p40复合物)结合并抑制IL-12与其同源受体结合的能力。
相对于包含SEQ ID NO:145-194的IL-12阻断元件，功能变体可以包含至少一个或多个氨基酸取代、缺失或***。与包含SEQ ID NO:145-194的IL-12阻断元件相比，功能变体可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸改变。在一些优选实施方案中，功能变体与包含SEQ ID NO:145-194的IL-12阻断元件的差异少于10个、少于8个、少于5个、少于4个、少于3个、少于2个或一个氨基酸改变，例如氨基酸取代或缺失。在其他实施方案中，与SEQ ID NO:145-194相比，功能变体可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代。氨基酸取代可以是保守取代或非保守取代，但优选是保守取代。
在其他实施方案中，与包含SEQ ID NO:145-194的IL-12阻断元件相比，IL-12阻断元件的功能变体可包含1、2、3、4或5个或更多个非保守氨基酸取代。本领域技术人员可以认识到非保守氨基酸取代。分离部分(separation moiety)的功能变体优选包含不超过1、2、3、4或5个氨基酸缺失。
本文还公开了一种可诱导的IL-12多肽，其包含对IL-12具有特异性的阻断元件并包含半衰期延长元件。本文还公开了一种可诱导的IL-12多肽，其包含对IL-23具有特异性的阻断元件并包含半衰期延长元件。阻断元件是抗体或抗原结合片段，其对本文公开的IL-12，特别是如SEQ ID NO:421所定义的IL-12亚基β前体(p40)具有结合特异性。抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:421的表1所示残基结合的抗原结合结构域。本公开涉及一种结合由表1所示的氨基酸残基定义的IL-12表位的抗体或抗原结合片段，以及一种包含此类抗体或抗原结合片段的可诱导的IL-12多肽复合物，以及此类抗体或抗原结合片段用于制备可诱导的IL-12多肽复合物或包含此类可诱导的IL-12多肽复合物的药物的用途。
表1.IL-12亚基β前体中的表位结合残基
Figure BDA0004048574510000351
Figure BDA0004048574510000361
E.蛋白酶可裂解接头
如本文所公开，IL-12多肽复合物或IL-23多肽复合物包含一个或多个接头序列。接头序列用于提供多肽之间的柔性，使得例如阻断元件能够抑制IL-12或IL-23的活性。接头可以位于IL-12亚基或IL-23亚基、半衰期延长元件和/或阻断元件之间。如本文所述，IL-12多肽复合物包含蛋白酶可裂解接头。如本文所述，IL-23多肽复合物包含蛋白酶可裂解接头。蛋白酶可裂解接头可以包含用于一种或多种期望蛋白酶的一个或多个裂解位点。优选地，期望的蛋白酶在IL-12或IL-23活性的期望靶位点(例如，肿瘤微环境)处富集或选择性地表达。因此，IL-12多肽复合物或IL-23多肽复合物在期望的IL-12活性或IL-23活性的靶位点处被优先或选择性地裂解。
合适的接头通常少于约100个氨基酸。此类接头可以具有不同的长度，诸如1个氨基酸(例如，Gly)至30个氨基酸、1个氨基酸至40个氨基酸、1个氨基酸至50个氨基酸、1个氨基酸至60个氨基酸、1至70个氨基酸、1至80个氨基酸、1至90个氨基酸，以及1至100个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为至少约1、约2、约3、约4、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95或约100个氨基酸。优选的接头通常为约5个氨基酸至约30个氨基酸。
优选地，接头的长度从2到30个氨基酸变化，针对每种条件进行优化，使得接头不对所连接的结构域的构象或相互作用施加任何限制。在一个优选实施方案中，接头可被裂解剂例如酶裂解。优选地，分离部分包含蛋白酶裂解位点。在一些情况下，分离部分包含一个或多个裂解位点。分离部分可以包含单个蛋白酶裂解位点。分离部分还可以包含2个或更多个蛋白酶裂解位点。例如，2个裂解位点、3个裂解位点、4个裂解位点、5个裂解位点或更多。在分离部分包含2个或更多个蛋白酶裂解位点的情况下，裂解位点可以被相同的蛋白酶或不同的蛋白酶裂解。包含两个或更多个裂解位点的分离部分被称为“串联接头”。两个或更多个裂解位点可以以任何期望取向排列，包括但不限于一个裂解位点与另一个裂解位点相邻、一个裂解位点与另一个裂解位点重叠，或一个裂解位点后接另一个裂解位点，其中在两个裂解位点之间插置氨基酸。
本发明特别感兴趣的是疾病特异性蛋白酶可裂解接头。还优选的是蛋白酶可裂解接头，相对于外周循环，其在体内期望位置，诸如肿瘤微环境中优先裂解。例如，与外周循环(例如，血浆中)相比，在体内的期望位置，例如肿瘤微环境中，蛋白酶可裂解接头在肿瘤微环境中的裂解速率可以快至少约10倍、至少约100倍、至少约1000倍或至少约10,000倍。
已知与患病细胞或组织相关的蛋白酶包括但不限于丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、天冬酰胺肽裂解酶、血清蛋白酶、组织蛋白酶、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶G、组织蛋白酶K、组织蛋白酶L、激肽释放酶、hKl、hK10、hK15、纤溶酶、胶原酶、IV型胶原酶、溶基质素、Xa因子、糜蛋白酶样蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、弹性蛋白酶样蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶、猕猴桃蛋白酶、菠萝蛋白酶、钙蛋白酶、半胱天冬酶、半胱天冬酶-3、Mir1-CP、木瓜蛋白酶、HIV-1蛋白酶、HSV蛋白酶、CMV蛋白酶、凝乳酶、肾素、胃蛋白酶、蛋白裂解酶、豆荚蛋白、纤溶酶、猪笼草蛋白酶、金属外肽酶、金属内肽酶、基质金属蛋白酶(MMP)、MMP1、MMP2、MMP3、MMP8、MMP9、MMP13、MMP11、MMP14、尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)、肠激酶、***特异性抗原(PSA，hK3)、白细胞介素-1β转化酶、凝血酶、FAP(FAPα)、二肽基肽酶、跨膜肽酶、颗粒酶和二肽基肽酶IV(DPPIV/CD26)。能够裂解接头氨基酸序列(其可以由本文所提供的嵌合核酸序列编码)的蛋白酶可以例如选自由以下组成的组：***特异性抗原(PSA)、基质金属蛋白酶(MMP)、A双歧蛋白和金属蛋白酶(ADAM)、纤溶酶原激活物、组织蛋白酶、半胱天冬酶、肿瘤细胞表面蛋白酶和弹性蛋白酶。MMP可以为例如基质金属蛋白酶2(MMP2)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、基质金属蛋白酶14(MMP14)。此外或可替代地，接头可以被组织蛋白酶裂解，诸如组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶G、组织蛋白酶K和/或组织蛋白酶L。优选地，接头可以被MMP14或组织蛋白酶L裂解。
表2列出了可用于裂解接头并且用于在本文所公开的IL-12多肽复合物中使用的蛋白酶，并且表3列出了示例性蛋白酶及其裂解位点。
表2.与炎症和癌症相关的蛋白酶
Figure BDA0004048574510000381
Figure BDA0004048574510000391
Figure BDA0004048574510000401
表3.示例性蛋白酶和蛋白酶识别序列
Figure BDA0004048574510000402
Figure BDA0004048574510000411
Figure BDA0004048574510000421
示例性蛋白酶可裂解接头包括但不限于激肽释放酶可裂解接头、凝血酶可裂解接头、糜酶可裂解接头、羧肽酶A可裂解接头、组织蛋白酶可裂解接头、弹性蛋白酶可裂解接头、FAP可裂解接头、ADAM可裂解接头、PR-3可裂解接头、颗粒酶M可裂解接头、钙蛋白酶可裂解接头、基质金属蛋白酶(MMP)可裂解接头、纤溶酶原激活物可裂解接头、半胱天冬酶可裂解接头、类胰蛋白酶可裂解接头或肿瘤细胞表面蛋白酶。具体地，MMP9可裂解接头、ADAM可裂解接头、CTSL1可裂解接头、FAPα可裂解接头和组织蛋白酶可裂解接头。一些优选的蛋白酶可裂解接头被MMP和/或组织蛋白酶裂解。
本文公开的分离部分通常少于100个氨基酸。此类分离部分可以具有不同的长度，诸如1个氨基酸(例如，Gly)至30个氨基酸、1个氨基酸至40个氨基酸、1个氨基酸至50个氨基酸、1个氨基酸至60个氨基酸、1至70个氨基酸、1至80个氨基酸、1至90个氨基酸，以及1至100个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为至少约1、约2、约3、约4、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95或约100个氨基酸。优选的接头通常为约5个氨基酸至约30个氨基酸。
优选地，接头的长度从2到30个氨基酸变化，针对每种条件进行优化，使得接头不对所连接的结构域的构象或相互作用施加任何限制。
在一些实施方案中，分离部分包含序列GPAGLYAQ(SEQ ID NO:195)；GPAGMKGL(SEQID NO:196)；PGGPAGIG(SEQ ID NO:197)；
ALFKSSFP(SEQ ID NO:198)；ALFFSSPP(SEQ ID NO:199)；
LAQRLRSS(SEQ ID NO:200)；LAQKLKSS(SEQ ID NO；201)；
GALFKSSFPSGGGPAGLYAQGGSGKGGSGK(SEQ ID NO:202)；
RGSGGGPAGLYAQGSGGGPAGLYAQGGSGK(SEQ ID NO:203)；
KGGGPAGLYAQGPAGLYAQGPAGLYAQGSR(SEQ ID NO:204)；
RGGPAGLYAQGGPAGLYAQGGGPAGLYAQK(SEQ ID NO:205)；
KGGALFKSSFPGGPAGIGPLAQKLKSSGGS(SEQ ID NO:206)；
SGGPGGPAGIGALFKSSFPLAQKLKSSGGG(SEQ ID NO:207)；
RGPLAQKLKSSALFKSSFPGGPAGIGGGGK(SEQ ID NO:208)；
GGGALFKSSFPLAQKLKSSPGGPAGIGGGR(SEQ ID NO:209)；
RGPGGPAGIGPLAQKLKSSALFKSSFPGGG(SEQ ID NO:210)；
RGGPLAQKLKSSPGGPAGIGALFKSSFPGK(SEQ ID NO:211)；
RSGGPAGLYAQALFKSSFPLAQKLKSSGGG(SEQ ID NO:212)；
GGPLAQKLKSSALFKSSFPGPAGLYAQGGR(SEQ ID NO:213)；
GGALFKSSFPGPAGLYAQPLAQKLKSSGGK(SEQ ID NO:214)；
RGGALFKSSFPLAQKLKSSGPAGLYAQGGK(SEQ ID NO:215)；
RGGGPAGLYAQPLAQKLKSSALFKSSFPGG(SEQ ID NO:216)；
SGPLAQKLKSSGPAGLYAQALFKSSFPGSK(SEQ ID NO:217)；
KGGPGGPAGIGPLAQRLRSSALFKSSFPGR(SEQ ID NO:218)；
KSGPGGPAGIGALFFSSPPLAQKLKSSGGR(SEQ ID NO:219)；或
SGGFPRSGGSFNPRTFGSKRKRRGSRGGGG(SEQ ID NO:220)。
某些优选的分离部分包含序列GPAGLYAQ(SEQ ID NO:195)或ALFKSSFP(SEQ IDNO:198)。本文公开的分离部分可以包含一个或多个相同或不同的裂解基序或功能变体。分离部分可以包含1、2、3、4、5或更多个裂解基序或功能变体。包含30个氨基酸的分离部分可以包含2个裂解基序或功能变体、3个裂解基序或功能变体或更多。分离部分的“功能变体”保留了在靶位点(例如，表达高水平蛋白酶的肿瘤微环境)处被高效裂解并且在外周(例如，血清)不被裂解或被低效裂解的能力。例如，功能变体保留了包含SEQ ID NO:195-220或447-448中的任一者的分离部分的裂解效率的至少约50％、约55％、约60％、约70％、约80％、约85％、约95％或更多。
包含多于一个裂解基序的分离部分可以选自SEQ ID NO:195-201或447-448以及其组合。包含多于一个裂解基序的优选的分离部分包含选自SEQ ID NO:202-220的氨基酸。
分离部分可以包含ALFKSSFP(SEQ ID NO:198)和GPAGLYAQ(SEQ ID NO:195)。分离部分可以包含两个裂解基序，其各自具有序列GPAGLYAQ(SEQ ID NO:195)。可替代地或另外，分离部分可以包含两个裂解基序，其各自具有序列ALFKSSFP(SEQ ID NO:198)。分离部分可以包含相同或不同的第三裂解基序。
在一些实施方案中，分离部分包含在SEQ ID NO:195-220或SEQ ID NO 447-448的全长上与SEQ ID NO:195至SEQ ID NO:220或447-448具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
本公开还涉及包含SEQ ID NO:195-220或447-448的分离部分的功能变体。包含SEQ ID NO:195-220或447-448的分离部分的功能变体通常与SEQ ID NO:195-220或447-448有一个或几个氨基酸不同(包括取代、缺失、***或其任何组合)，并且基本上保留了它们被蛋白酶裂解的能力。
相对于包含SEQ ID NO:195-220或447-448的分离部分，功能变体可以包含至少一个或多个氨基酸取代、缺失或***。与包含SEQ ID NO:195-220或447-448的分离部分相比，功能变体可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸改变。在一些优选的实施方案中，功能变体与包含SEQ ID NO:195-220的分离部分的差异少于10个、少于8个、少于5个、少于4个、少于3个、少于2个或一个氨基酸改变，例如氨基酸取代或缺失。在其他实施方案中，与SEQID NO:195-220或447-448相比，功能变体可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代。氨基酸取代可以是保守取代或非保守取代，但优选是保守取代。
在其他实施方案中，与包含SEQ ID NO:195-220或447-448的分离部分相比，分离部分的功能变体可包含1、2、3、4或5个或更多个非保守氨基酸取代。本领域技术人员可以认识到非保守氨基酸取代。分离部分的功能变体优选包含不超过1、2、3、4或5个氨基酸缺失。
分离部分中公开的氨基酸序列可以通过分离部分中相对于易裂键(sissilebond)的相对线性位置来描述。如本领域技术人员将充分理解的，包含8个氨基酸蛋白酶底物的分离部分(例如，SEQ ID No:195-201或447-448)在位置P4、P3、P2、P1、P1’、P2’、P3’、P4’处包含氨基酸，其中易裂键介于P1与P1’之间。例如，包含序列GPAGLYAQ(SEQ ID NO:195)的分离部分的氨基酸位置可以描述如下：
G P A G L Y A Q
P4 P3 P2 P1 P1’ P2’ P3’ P4’
包含序列ALFKSSFP(SEQ ID NO:198)的分离部分的氨基酸位置可以描述如下：
A L F K S S F P
P4 P3 P2 P1 P1’ P2’ P3’ P4’
优选地，裂解位点(例如，SEQ ID NO:195-201或447-448的位置P1和P1’)周围的氨基酸未被取代。
在实施方案中，分离部分包含序列GPAGLYAQ(SEQ ID NO:195)或ALFKSSFP(SEQ IDNO:198)或者SEQ ID NO:195的功能变体或SEQ ID NO:198的功能变体。如本文所述，PAGLYAQ(SEQ ID NO:447)或ALFKSSFP(SEQ ID NO:198)的功能变体可以包含一个或多个氨基酸取代，并且基本上保留了它们被蛋白酶裂解的能力。具体地，GPAGLYAQ(SEQ ID NO:195)的功能变体被MMP14裂解，并且ALFKSSFP(SEQ ID NO:198)的功能变体被组织蛋白酶L(CTSL1)裂解。功能变体还保留了它们在靶位点(例如，表达高水平蛋白酶的肿瘤微环境)处被高效裂解的能力。例如，GPAGLYAQ(SEQ ID NO:195)或ALFKSSFP(SEQ ID NO:198)的功能变体保留了分别包含氨基酸序列GPAGLYAQ(SEQ ID NO:195)或ALFKSSFP(SEQ ID NO:198)的分离部分的裂解效率的至少约50％、约55％、约60％、约70％、约80％、约85％、约95％或更多。
优选地，与GPAGLYAQ(SEQ ID NO:195)或ALFKSSFP(SEQ ID NO:198)相比，GPAGLYAQ(SEQ ID NO:195)或ALFKSSFP(SEQ ID NO:198)的功能变体包含不超过1、2、3、4或5个保守氨基酸取代。优选地，位置P1和P1’处的氨基酸未被取代。SEQ ID NO:195中的位置P1和P1’处的氨基酸为G和L，并且SEQ ID NO:198中的位置P1和P1’处的氨基酸为K和S。
GPAGLYAQ(SEQ ID NO:195)的功能变体可以优选地包含以下中的一者或多者：a)位置P4处的精氨酸氨基酸取代，b)位置P3处的亮氨酸、缬氨酸、天冬酰胺或脯氨酸氨基酸取代，c)位置P2处的天冬酰胺氨基酸取代，d)位置P1处的组氨酸、天冬酰胺或甘氨酸氨基酸取代，e)位置P1’处的天冬酰胺、异亮氨酸或亮氨酸氨基酸取代，f)位置P2’处的酪氨酸或精氨酸氨基酸取代，g)位置P3’处的甘氨酸、精氨酸或丙氨酸氨基酸取代，h)或位置P4’处的丝氨酸、谷氨酰胺或赖氨酸氨基酸取代。以下氨基酸取代在GPAGLYAQ(SEQ ID NO:195)的功能变体中是不利的：a)位置P3处的精氨酸或异亮氨酸，b)位置P2处的丙氨酸，c)位置P1处的缬氨酸，d)位置P1’处的精氨酸、甘氨酸、天冬酰胺或苏氨酸，e)位置P2’处的天冬氨酸或谷氨酸，f)位置P3’处的异亮氨酸，g)位置P4’处的缬氨酸。在一些实施方案中，GPAGLYAQ(SEQ IDNO:195)的功能变体在位置P1和/或P1’处不包含氨基酸取代。
GPAGLYAQ(SEQ ID NO:195)的功能变体的氨基酸取代优选地包括位置P4和/或P4’处的氨基酸取代。例如，GPAGLYAQ(SEQ ID NO:195)的功能变体可以在位置P4处包含亮氨酸，或在位置P4处包含丝氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸或苯丙氨酸。可替代地或另外，GPAGLYAQ(SEQ ID NO:195)的功能变体可以在位置P4’处包含甘氨酸、苯丙氨酸或脯氨酸。
在一些实施方案中，GPAGLYAQ(SEQ ID NO:195)的位置P2或P2’处的氨基酸取代不是优选的。
在一些实施方案中，GPAGLYAQ(SEQ ID NO:195)的功能变体包含选自SEQ ID NO:221-295的氨基酸序列。GPAGLYAQ(SEQ ID NO:195)的特定功能变体包括GPLGLYAQ(SEQ IDNO:259)和GPAGLKGA(SEQ ID NO:249)。
LFKSSFP(SEQ ID NO:448)的功能变体优选地包含疏水性氨基酸取代。LFKSSFP(SEQ ID NO:448)的功能变体可以优选地包含以下中的一者或多者：(a)位置P4处的赖氨酸、组氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、脯氨酸或苯丙氨酸；(b)位置P3处的赖氨酸、组氨酸、甘氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸；(c)位置P2处的精氨酸、亮氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺或组氨酸；(d)位置P1处的苯丙氨酸、组氨酸、苏氨酸、丙氨酸或谷氨酰胺；(e)位置P1’处的组氨酸、亮氨酸、赖氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酸或甘氨酸，(f)位置P2’处的苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺或脯氨酸；(g)位置P3’处的苯丙氨酸、亮氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、组氨酸、丙氨酸或天冬酰胺；以及苯丙氨酸、组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸或亮氨酸。
在SEQ ID NO:448的功能变体中包含天冬氨酸和/或谷氨酸通常是不利的且被避免的。以下氨基酸取代在LFKSSFP(SEQ ID NO:448)的功能变体中也是不利的：(a)位置P3处的丙氨酸、丝氨酸或谷氨酸；(b)位置P2处的脯氨酸、苏氨酸、甘氨酸或天冬氨酸；(c)位置P1处的脯氨酸；(d)位置P1’处的脯氨酸；(e)位置P2’处的甘氨酸；(f)位置P3’处的赖氨酸或谷氨酸；(g)位置P4’处的天冬氨酸。
LFKSSFP(SEQ ID NO:448)的功能变体的氨基酸取代优选地包括位置P4和/或P1处的氨基酸取代。在一些实施方案中，LFKSSFP(SEQ ID NO:448)的功能变体在位置P4’处的氨基酸取代不是优选的。
在一些实施方案中，LFKSSFP(SEQ ID NO:448)的功能变体包含选自SEQ ID NO:296-374的氨基酸序列。LFKSSFP(SEQ ID NO:448)的特定功能变体包括ALFFSSPP(SEQ IDNO:199)、ALFKSFPP(SEQ ID NO:346)、ALFKSLPP(SEQ ID NO:347)；ALFKHSPP(SEQ ID NO:335)；ALFKSIPP(SEQ ID NO:348)；ALFKSSLP(SEQ ID NO:356)；或SPFRSSRQ(SEQ ID NO:297)。
本文公开的分离部分可以在生理条件下与它们连接的氨基酸序列(例如结构域)形成稳定的复合物，同时能够被蛋白酶裂解。例如，分离部分在循环中是稳定的(例如，不被裂解或被低效裂解)并且在靶位点(即肿瘤微环境)处以更高的效率被裂解。因此，如果期望，包含本文公开的接头的融合多肽与作为单独分子实体的融合多肽的组分相比可以具有延长的循环半衰期和/或在循环中的较低生物活性。然而，当处于期望位置(例如，肿瘤微环境)时，接头可以被有效裂解以释放通过接头连结在一起的组分，并恢复或几乎恢复作为单独分子实体的组分的半衰期和生物活性。
分离部分理想地在循环中保持稳定至少2小时、至少5小时、至少10小时、至少15小时、至少20小时、至少24小时、至少30小时、至少35小时、至少40小时、至少45小时、至少50小时、至少60小时、至少65小时、至少70小时、至少80小时、至少90小时或更长时间。
在一些实施方案中，与靶位置相比，分离部分在循环中被裂解少于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、20％、5％或1％。在不存在能够裂解接头的酶的情况下，分离部分也是稳定的。然而，在暴露于合适的酶(即，蛋白酶)时，分离部分被裂解，从而导致所连接的结构域的分离。
F.药物组合物
本文还提供了药物组合物，其包含本文所述的IL-12多肽复合物或IL-23多肽复合物、包含编码IL-12多肽复合物或IL-23多肽复合物的多核苷酸的载体或由所述载体转化的宿主细胞以及至少一种药学上可接受的载剂。
本文提供了包含如本文所述的IL-12多肽复合物或IL-23多肽复合物和药学上可接受的载剂的药物制剂或组合物。包含如本文所述的IL-12多肽复合物或IL-23多肽复合物的组合物适用于体外或体内施用。术语“药学上可接受的载剂”包括但不限于不干扰成分的生物活性的有效性并且对所施用的受试者无毒的任何载剂。合适的药物载剂的实例是本领域众所周知的并且包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液，诸如油/水乳液、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。此类载剂可以通过常规方法配制并且可以以合适的剂量施用于受试者。优选地，组合物是无菌的。这些组合物也可包含佐剂，诸如防腐剂、乳化剂和分散剂。对微生物作用的预防可通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂来确保。
合适的载剂及其制剂描述于Remington:The Science and Practice ofPharmacy,第21版,David B.Troy编,Lippicott Williams&Wilkins(2005)中。通常，在制剂中使用适当量的药学上可接受的盐以使制剂等渗，尽管在期望时制剂可以为高渗或低渗的。药学上可接受的载剂的实例包括但不限于无菌水、盐水、缓冲溶液(如林格氏溶液)和右旋糖溶液。溶液的pH通常为约5至约8或约7至7.5。其他载剂包括持续释放制剂，诸如包含免疫原性多肽的固体疏水性聚合物的半透性基质。基质呈成形制品的形式，例如膜、脂质体或微粒。根据例如施用途径和所施用组合物的浓度，某些载剂可以是更优选的。载剂是适合于将IL-12或IL-23多肽复合物或编码IL-12或IL-23多肽复合物的核酸序列施用于人或其他受试者的那些载剂。
在药物组合物的一些实施方案中，本文所述的IL-12多肽复合物或IL-23多肽复合物封装在纳米颗粒中。在一些实施方案中，纳米颗粒是富勒烯、液晶、脂质体、量子点、超顺磁性纳米颗粒、树状物或纳米棒。在药物组合物的其他实施方案中，IL-12多肽复合物或IL-23多肽复合物附接于脂质体。在一些情况下，IL-12多肽复合物或IL-23多肽复合物缀合至脂质体表面。在一些情况下，IL-12多肽复合物或IL-23多肽复合物封装在脂质体的外壳内。在一些情况下，脂质体是阳离子脂质体。
本文所述的IL-12多肽复合物或IL-23多肽复合物预期用作药物。施用通过不同的方式实现，例如通过静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部或皮内施用。在一些实施方案中，施用途径取决于疗法的种类和药物组合物中所包含的化合物的种类。给药方案将通过主治医师和其他临床因素确定。任何一位患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、性别、待施用的特定化合物、施用的时间和途径、疗法的种类、一般健康状况和同时施用的其他药物。“有效剂量”是指足以影响疾病的病程和严重程度，从而导致此类病理的减少或缓解的活性成分的量，并且可使用已知方法确定。
任选地，IL-12多肽复合物或编码IL-12多肽复合物的核酸序列通过载体施用。任选地，IL-23多肽复合物或编码IL-23多肽复合物的核酸序列通过载体施用。有许多组合物和方法可以用于通过例如表达载体在体外或体内将核酸分子和/或多肽递送至细胞。这些方法和组合物主要可以分为两类：基于病毒的递送***和基于非病毒的递送***。此类方法是本领域中熟知的，并且易于适用于与本文所述的组合物和方法一起使用。此类组合物和方法可以用于体外或体内转染或转导细胞，例如以产生表达并优选地分泌所编码的嵌合多肽的细胞系或将核酸治疗性地递送至受试者。本文所公开的IL-12多肽或IL-23多肽的组分通常在框架内可操作地连接以编码融合蛋白。
如本文所用，质粒或病毒载体是将所公开的核酸运输到细胞中而不降解的剂，并且包括使核酸分子和/或多肽在其所递送到的细胞中产生表达的启动子。病毒载体为例如腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒、辛德毕斯(Sindbis)和其他RNA病毒，包括具有HIV骨架的这些病毒。还优选共享这些病毒的特性而使其适合用作载体的任何病毒家族。一般来讲，逆转录病毒载体及其制备方法由Coffin等人,Retroviruses,ColdSpring Harbor Laboratory Press(1997)描述。已经描述了复制缺陷型腺病毒的构建(Berkner等人,J.Virol.61:1213-20(1987)；Massie等人,Mol.Cell.Biol.6:2872-83(1986)；Haj-Ahmad等人,J.Virol.57:267-74(1986)；Davidson等人,J.Virol.61:1226-39(1987)；Zhang等人,BioTechniques 15:868-72(1993))。这些病毒作为载体的益处和用途是它们可以扩散到其他细胞类型上的程度受到限制，因为它们可以在初始感染的细胞内复制，但不能形成新的感染性病毒颗粒。重组腺病毒已显示在直接体内递送至气道上皮、肝细胞、血管内皮、CNS实质和许多其他组织部位之后实现高效率。其他有用的***包括例如复制型和宿主限制性非复制型牛痘病毒载体。
所提供的IL-12多肽复合物和/或核酸分子可以通过病毒样颗粒递送。所提供的IL-23多肽复合物和/或核酸分子可以通过病毒样颗粒递送。病毒样颗粒(VLP)由衍生自病毒结构蛋白的一种或多种病毒蛋白组成。用于制备和使用病毒样颗粒的方法描述于例如Garcea和Gissmann,Current Opinion in Biotechnology 15:513-7(2004)。
本文公开的IL-12多肽复合物或IL-23多肽复合物可以通过亚病毒致密体(DB)递送。DB通过膜融合将蛋白质运输到靶细胞中。用于制备和使用DB的方法描述于例如Pepperl-Klindworth等人,Gene Therapy 10:278-84(2003)。所提供的多肽可以通过外皮聚集体递送。用于制备和使用外皮聚集体的方法描述于国际公布号WO 2006/110728中。
基于非病毒的递送方法可以包括包含核酸分子和编码多肽的核酸序列的表达载体，其中核酸可操作地连接至表达控制序列。合适的载体骨架包括例如本领域常规使用的那些，诸如质粒、人工染色体、BAC、YAC或PAC。许多载体和表达***可从诸如Novagen(Madison,Wis.)、Clonetech(Pal Alto,Calif.)、Stratagene(La Jolla,Calif.)和Invitrogen/Life Technologies(Carlsbad,Calif.)的公司商购获得。载体通常含有一个或多个调控区域。调控区域包括但不限于启动子序列、增强子序列、应答元件、蛋白质识别位点、诱导型元件、蛋白质结合序列、5'和3'非翻译区(UTR)、转录起始位点、末端序列、聚腺苷酸化序列和内含子。此类载体还可以用于通过在合适的宿主细胞诸如CHO细胞中表达来制备IL-12多肽复合物或IL-23多肽复合物。
控制从哺乳动物宿主细胞中的载体转录的优选启动子可获自各种来源，例如病毒的基因组，诸如多瘤病毒、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和最优选的巨细胞病毒(CMV)；或获自异源哺乳动物启动子，例如，β-肌动蛋白启动子或EF1α启动子；或获自杂合或嵌合启动子(例如，融合至β-肌动蛋白启动子的CMV启动子)。当然，来自宿主细胞或相关物种的启动子也可用于本文。
增强子通常是指DNA中在距转录起始位点不固定的距离处起作用的序列，并且可以位于转录单元的5'或3’。此外，增强子可以位于内含子内以及在编码序列本身内。它们的长度通常在10与300个碱基对(bp)之间，并且它们以顺式起作用。增强子通常起到增加从附近启动子转录的作用。增强子还可以包含介导转录调控的应答元件。虽然已知许多增强子序列来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)，但人们通常将使用来自真核细胞病毒的增强子进行一般表达。优选实例为复制起点后侧的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧的多瘤病毒增强子，以及腺病毒增强子。
启动子和/或增强子可以是诱导型的(例如，化学或物理调控的)。化学调控的启动子和/或增强子可以例如通过醇、四环素、类固醇或金属的存在来调控。物理调控的启动子和/或增强子可以例如通过环境因素诸如温度和光来调控。任选地，启动子和/或增强子区域可以充当组成型启动子和/或增强子，以最大化待转录的转录单元区域的表达。在某些载体中，启动子和/或增强子区域可以细胞类型特异性方式具有活性。任选地，在某些载体中，启动子和/或增强子区域可以在所有真核细胞中具有活性，而与细胞类型无关。这种类型的优选启动子为CMV启动子、SV40启动子、β-肌动蛋白启动子、EF1α启动子和逆转录病毒长末端重复序列(LTR)。
载体还可以包含例如复制起点和/或标志物。标志物基因可以在细胞上赋予可选择表型，例如抗生素抗性。标志物产物用于确定载体是否已被递送至细胞，并且一旦递送就被表达。用于哺乳动物细胞的可选择标志物的实例为二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶、新霉素、新霉素类似物G418、潮霉素、嘌呤霉素和杀稻瘟菌素。当此类可选择标志物成功地转移到哺乳动物宿主细胞中时，如果置于选择压力下，则转化的哺乳动物宿主细胞可以存活。其他标志物的实例包括例如大肠杆菌(E.coli)lacZ基因、绿色荧光蛋白(GFP)和荧光素酶。另外，表达载体可以包含被设计来促进所表达的多肽的操纵或检测(例如，纯化或定位)的标签序列。标签序列诸如GFP、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、聚组氨酸、c-myc、血凝素或FLAGTM标签(Kodak；New Haven,Conn.)序列通常表达为与所编码的多肽的融合体。此类标签可以***多肽内的任何位置，包括羧基端或氨基端。
G.治疗应用
本文还提供了用于治疗与靶抗原相关的疾病、病症或病状的方法和用途，包括向有需要的受试者施用如本文所述的IL-12多肽复合物或IL-23多肽复合物。疾病、病症或病状包括但不限于癌症、炎症性疾病、免疫病症、自身免疫疾病、感染性疾病(即，细菌、病毒或寄生虫病)。优选地，疾病、病症或病状为癌症。
可用本文提供的IL-12多肽复合物或IL-23多肽复合物治疗任何合适的癌症。例示性的合适的癌症包括，例如，急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、肾上腺皮质癌、***癌、阑尾癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、脑肿瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳腺癌、支气管肿瘤、原发病灶不明癌(carcinoma of unknown primary origin)、心脏肿瘤、***、脊索瘤、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、导管癌、胚胎肿瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、嗅神经母细胞瘤、纤维性组织细胞瘤、尤文肉瘤、眼癌、生殖细胞肿瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤、妊娠滋养细胞疾病、神经胶质瘤、头颈癌、肝细胞癌、组织细胞增多症、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞瘤、卡波西肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、喉癌、唇癌和口腔癌、肝癌、小叶原位癌、肺癌、巨球蛋白血症、恶性纤维性组织细胞瘤、黑素瘤、默克尔细胞癌、间皮瘤、隐匿性原发性转移性鳞状颈癌(metastaticsquamous neck cancer with occult primary)、涉及NUT基因的中线道癌、口腔癌、多发性内分泌腺瘤综合征、多发性骨髓瘤、蕈样肉芽肿、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增殖性肿瘤、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非小细胞肺癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、***状瘤病、副神经节瘤、甲状旁腺癌、***癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经***淋巴瘤、***癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌样瘤、唾液腺癌、塞扎里综合征(Sezary syndrome)、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、脊髓肿瘤、胃癌、T细胞淋巴瘤、畸胎瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、***癌、外阴癌和肾母细胞瘤。在实施方案中，癌症为黑素瘤或乳腺癌。
在一些实施方案中，本文提供了一种增强有需要的受试者的免疫应答的方法，其通过向受试者施用有效量的本文提供的IL-12多肽复合物或IL-23多肽复合物来实现。增强的免疫应答可预防、延迟或治疗癌症、肿瘤或病毒性疾病的发作。不受理论的束缚，IL-12多肽复合物或IL-23多肽复合物通过激活先天性和适应性免疫来增强免疫应答。在一些实施方案中，本文所述的方法增加自然杀伤细胞和T淋巴细胞的活性。在一些实施方案中，本文提供的IL-12多肽复合物或IL-23多肽复合物可以诱导从自然杀伤细胞以及CD4+和CD8+T细胞中释放IFNγ。
所述方法还可包括施用一种或多种另外的剂来治疗癌症，所述一种或多种另外的剂诸如化学治疗剂(例如，阿霉素(Adriamycin)、柔红霉素(Cerubidine)、博莱霉素(Bleomycin)、马法兰(Alkeran)、长春碱(Velban)、长春新碱(Oncovin)、氟尿嘧啶、噻替派、甲氨蝶呤、比生群(Bisantrene)、米托蒽醌(Noantrone)、硫鸟嘌呤(Thiguanine)、阿糖胞苷(Cytaribine)、丙卡巴肼(Procarabizine))、免疫肿瘤剂(例如，抗PD-L1、抗CTLA4、抗PD-1、抗CD47、抗GD2)、细胞疗法(例如，CAR-T、T细胞疗法)、溶瘤病毒等。可以使用的抗癌剂的非限制性实例包括阿西维辛(acivicin)；阿柔比星；盐酸阿考达唑(acodazolehydrochloride)；阿克罗宁(acronine)；阿多来新(adozelesin)；阿地白介素；六甲蜜胺；安波霉素(ambomycin)；醋酸阿美蒽醌(ametantrone acetate)；氨鲁米特(aminoglutethimide)；安吖啶(amsacrine)；阿那曲唑(anastrozole)；安曲霉素(anthramycin)；天冬酰胺酶；曲林菌素(asperlin)；阿扎胞苷；阿扎替派(azetepa)；阿佐霉素(azotomycin)；巴马司他(batimastat)；苯佐替派(benzodepa)；比卡鲁胺(bicalutamide)；盐酸比生群(bisantrene hydrochloride)；二甲磺酸双奈法德(bisnafide dimesylate)；比折来新(bizelesin)；硫酸博来霉素；布喹那钠(brequinarsodium)；溴匹立明(bropirimine)；白消安；放线菌素；卡鲁睾酮(calusterone)；卡醋胺(caracemide)；卡贝替姆(carbetimer)；卡铂；卡莫司汀(carmustine)；盐酸卡柔比星(carubicin hydrochloride)；卡折来新(carzelesin)；西地芬戈(cedefingol)；苯丁酸氮芥；西罗霉素(cirolemycin)；顺铂；克拉屈滨(cladribine)；甲磺酸克立那托(crisnatolmesylate)；环磷酰胺；阿糖胞苷；达卡巴嗪(dacarbazine)；放线菌素D(dactinomycin)；盐酸柔红霉素；地西他滨(decitabine)；右奥马铂(dexormaplatin)；地扎胍宁(dezaguanine)；甲磺酸地扎胍宁；地吖醌(diaziquone)；多西他赛(docetaxel)；多柔比星；盐酸多柔比星；屈洛昔芬(droloxifene)；柠檬酸屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮(dromostanolonepropionate)；达佐霉素(duazomycin)；依达曲沙(edatrexate)；盐酸依氟鸟氨酸(eflornithine hydrochloride)；依沙芦星(elsamitrucin)；恩洛铂(enloplatin)；恩普氨酯(enpromate)；依匹哌啶(epipropidine)；盐酸表柔比星；厄布洛唑(erbulozole)；盐酸依索比星(esorubicin hydrochloride)；雌莫司汀；雌莫司汀磷酸钠；依他硝唑(etanidazole)；依托泊苷(etoposide)；磷酸依托泊苷；氯苯乙嘧胺(etoprine)；盐酸法曲唑(fadrozole hydrochloride)；法扎拉滨(fazarabine)；芬维A胺(fenretinide)；氟尿苷；磷酸氟达拉滨(fludarabine phosphate)；氟尿嘧啶；氟西他滨(flurocitabine)；磷喹酮(fosquidone)；福司曲星钠(fostriecin sodium)；吉西他滨(gemcitabine)；盐酸吉西他滨；羟基脲；盐酸伊达比星(idarubicin hydrochloride)；异环磷酰胺；伊莫福新(ilmofosine)；白细胞介素II(包括重组白细胞介素II，或rIL2)、干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α-nl干扰素α-n3；干扰素β-Ia；干扰素γ-Ib；异丙铂(iproplatin)；盐酸伊立替康(irinotecan hydrochloride)；醋酸兰瑞肽(lanreotide acetate)；来曲唑(letrozole)；醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)；盐酸利阿唑(liarozole hydrochloride)；洛美曲索钠(lometrexol sodium)；洛莫司汀(lomustine)；盐酸洛索蒽醌(losoxantronehydrochloride)；马索罗酚(masoprocol)；美登素(maytansine)；盐酸氮芥(mechlorethamine hydrochloride)；醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)；醋酸美仑孕酮(melengestrol acetate)；美法仑(melphalan)；美诺立尔(menogaril)；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；甲氨蝶呤钠；美托普林(metoprine)；美妥替哌(meturedepa)；米丁度胺(mitindomide)；米托卡星(mitocarcin)；米托罗明(mitocromin)；米托洁林(mitogillin)；米托马星(mitomalcin)；丝裂霉素；米托司培(mitosper)；米托坦(mitotane)；盐酸米托蒽醌；霉酚酸；诺考达唑(nocodazole)；诺加霉素(nogalamycin)；奥玛铂(ormaplatin)；奥昔舒仑(oxisuran)；紫杉醇；培门冬酶；佩里霉素(peliomycin)；奈莫司汀(pentamustine)；硫酸培洛霉素(peplomycin sulfate)；培磷酰胺(perfosfamide)；哌泊溴烷(pipobroman)；哌泊舒凡(piposulfan)；盐酸吡罗蒽醌(piroxantrone hydrochloride)；普卡霉素(plicamycin)；普洛美坦(plomestane)；卟吩姆钠(porfimer sodium)；泊非霉素(porfiromycin)；泼尼莫司汀(prednimustine)；盐酸丙卡巴肼(procarbazine hydrochloride)；嘌呤霉素；盐酸嘌呤霉素；吡唑呋喃菌素(pyrazofurin)；利波腺苷(riboprine)；罗谷亚胺(rogletimide)；沙芬戈(safingol)；盐酸沙芬戈；司莫司汀(semustine)；辛曲秦(simtrazene)；磷乙酰天冬氨酸钠(sparfosate sodium)；司帕霉素(sparsomycin)；盐酸锗螺胺(spirogermaniumhydrochloride)；螺莫司汀(spiromustine)；螺铂(spiroplatin)；链黑霉素(streptonigrin)；链脲佐菌素(streptozocin)；磺氯苯脲(sulofenur)；他利霉素(talisomycin)；替可加兰钠(tecogalan sodium)；替加氟(tegafur)；盐酸替洛蒽醌(teloxantrone hydrochloride)；替莫泊芬(temoporfin)；替尼泊苷(teniposide)；替罗昔隆(teroxirone)；睾内酯；硫咪嘌呤(thiamiprine)；硫鸟嘌呤；噻替哌(thiotepa)；噻唑呋林(tiazofurin)；替拉扎明(tirapazamine)；柠檬酸托瑞米芬(toremifene citrate)；醋酸曲托龙(trestolone acetate)；磷酸曲西立滨(triciribine phosphate)；三甲曲沙(trimetrexate)；三甲曲沙葡糖醛酸盐；曲普瑞林(triptorelin)；盐酸妥布氯唑(tubulozole hydrochloride)；乌拉莫司汀(uracil mustard)；乌瑞替派(uredepa)；伐普肽(vapreotide)；维替泊芬(verteporfin)；硫酸长春碱；硫酸长春新碱；长春地辛(vindesine)；硫酸长春地辛；硫酸长春匹定(vinepidine sulfate)；硫酸长春甘酯(vinglycinate sulfate)；硫酸长春罗新(vinleurosine sulfate)；酒石酸长春瑞滨(vinorelbine tartrate)；硫酸长春利定(vinzolidine sulfate)；硫酸长春利定；伏氯唑(vorozole)；折尼铂(zeniplatin)；净司他丁(zinostatin)；盐酸佐柔比星(zorubicinhydrochloride)。
在本文所述方法的一些实施方案中，IL-12多肽复合物或IL-23多肽复合物与用于治疗特定疾病、病症或病状的剂组合施用。剂包括但不限于涉及抗体、小分子(例如，化疗剂)、激素(甾体、肽等)的疗法、放射疗法(γ-射线、C-射线、和/或放射性同位素、微波、UV辐射等的定向递送)、基因疗法(例如，反义、逆转录病毒疗法等)以及其他免疫疗法。在一些实施方案中，IL-12多肽复合物或IL-23多肽复合物与止泻剂、止吐剂、镇痛剂和/或非甾体抗炎剂组合施用。
等效方案
对于本领域技术人员来说将显而易见的是，本文所述的本发明的方法的其他合适的修改和调整是明显的并且可使用合适的等效方案来进行而不脱离本公开或实施方案的范围。现已详细描述某些化合物和方法，通过参考以下实施例将使其得到更清楚的理解，引入所述实施例只是为了说明而不旨在为限制性的。
实施例
本发明通过以下实施例进一步描述，所述实施例不旨在以任何方式进行限制。
实施例1：HEK-Blue测定
将HEK-Blue IL-12细胞(InvivoGen)以50,000个细胞/孔的密度悬浮铺板在含有或不含15或40mg/ml人血清白蛋白(HSA)的培养基中，并在37℃和5％ CO2下用系列稀释的重组hIL-12、嵌合IL-12(小鼠p35/人p40)、可活化的嵌合IL-12或可活化hIL-12刺激20-24小时。测试未裂解和裂解的可活化hIL-12的活性。通过用活性MMP9或CTSL-1孵育产生裂解的可诱导hIL-12。通过使用试剂QUANTI-Blue(InvivoGen)对分泌型碱性磷酸酶(SEAP)活性进行定量(即基于比色的测定)来评估IL-12活性。结果证实IL-12融合蛋白具有活性并且是可诱导的。结果在图2A-2S中示出。
实施例2：IL-12荧光素酶报告基因测定
将以“解冻并使用”形式从制造商处购买的IL-12荧光素酶报告基因细胞(Promega)按照制造商的说明进行铺板，并在37℃和5％ CO2下用系列稀释的重组hIL-12或可活化hIL-12刺激6小时。测试未裂解和裂解的可活化IL-12的活性。通过用活性MMP9或CTSL-1孵育产生裂解的可诱导IL-12。通过使用Bio-GloTM试剂(Promega)对荧光素酶活性进行定量来评估IL-12活性，所述试剂允许通过发光读数测量荧光素酶活性。结果证实IL-12蛋白融合蛋白具有活性并且是可诱导的。结果在图3A-3F中示出。
实施例3：人T-Blast测定
通过PHA刺激72小时从人PBMC诱导T-Blast。然后洗涤T-blast并在使用之前冷冻。为进行测定，将T-Blast解冻并且以100,000个细胞/孔悬浮铺板在含有人血清白蛋白的培养基中，并在37℃和5％CO2下用系列稀释的重组hIL-12或嵌合的可活化IL-12(小鼠p35/人p40)或可活化的人IL-12刺激72小时。测试未裂解和裂解的IL-12融合蛋白的活性。通过用活性MMP9或CTSL-1酶孵育产生裂解的可诱导hIL-12。通过使用hIFNγAlpha-LISA试剂盒对上清液中的IFNγ产生进行定量来评估IL-12活性。结果证实IL-12融合蛋白具有活性并且是可诱导的。结果在图4A-4G中示出。
实施例4：通过MMP9蛋白酶对融合蛋白进行蛋白酶裂解
本领域技术人员将熟悉建立蛋白质裂解测定的方法。用1μg活性MMP9(Sigma目录号SAE0078-50或Enzo目录BML-SE360)裂解1xPBS pH7.4中的100μg蛋白质，并在室温下孵育最多至16小时。随后将消化的蛋白质用于功能测定或在测试之前储存于-80℃下。使用本领域中熟知的方法通过SDS PAGE监测裂解的程度。观察到MMP9完全裂解融合蛋白。
实施例5：哺乳动物宿主细胞系中的表达比较
将WW0663(其中人p40和p35亚基通过不可裂解的接头连接的IL-12融合蛋白)的表达质粒瞬时转染于哺乳动物表达宿主细胞系中，并通过蛋白A色谱法从细胞上清液中纯化。类似地，将WW0750和WW0636的表达质粒瞬时共转染于与上述相同的亲代哺乳动物宿主细胞系中以表达IL-12融合蛋白，其中人p40和p35亚基不通过接头序列连接，而是通过天然二硫键组装。通过蛋白A色谱法从细胞上清液中纯化WW0750/WW0636。将WW0663和WW0750/WW0636在非还原和还原SDS-PAGE凝胶上跑样，以比较正确的组装和任何非预期的裂解产物(图5)。WW0663具有两个非预期分子量片段(裂解产物)。此外，在还原条件下，WW0663的完整条带减弱，表明在p40与p35亚基之间的接头处或附近存在非预期裂解，从而生成两个相同大小的产物(泳道4中所示的最低分子量)，其中p40和p35已通过p40/p35二硫键的还原而解偶联(decouple)。WW0750/WW0636的还原和非还原条件(分别为泳道6和7)显示出预期大小。
实施例6：MC38实验(研究MC38-e493)
使用快速生长的结肠腺癌细胞系MC38细胞系。使用此肿瘤模型，检查融合蛋白影响肿瘤生长和体重的能力。
表4.剂和治疗方案
Figure BDA0004048574510000591
用异氟烷麻醉小鼠以植入细胞以减少溃疡。将326只CR雌性C57BL/6小鼠的侧腹皮下建立0％ Matrigel中的5x105个MC38肿瘤细胞。细胞注射体积为0.1mL/小鼠。开始日期的小鼠年龄为8至12周。当肿瘤的平均大小达到100-150mm3并开始治疗时，进行配对。这是研究开始的第1天。在开始时测量体重，并且然后每两周测量一次直到结束。每两周进行一次卡尺测量直到结束。任何不良反应立即报告。对单次观察体重减轻>25％或连续三次测量体重减轻>20％的任何个体动物实施安乐死。平均体重减轻>20％或死亡率>10％的任何组均停止给药；该组并不实施安乐死，并且使其恢复。在体重减轻>20％的组中，对达到个体体重减轻终点的个体实施安乐死。如果组治疗相关的体重减轻恢复到原始体重的10％以内，则以较低剂量或较不频繁的给药方案恢复给药。非治疗体重％恢复的例外在个案基础上是允许的。终点是肿瘤生长延迟(TGD)。单独地监测动物。实验的终点是肿瘤体积达到1500mm3或40天，以先到者为准。当达到终点时，对动物实施安乐死。
实施例7：MC38实验(研究MC38-e495)
使用快速生长的结肠腺癌细胞系MC38细胞系。使用此肿瘤模型，检查融合蛋白影响肿瘤生长和体重的能力。
表5.剂和治疗方案
组 N 剂 剂量 途径 方案
1 8 媒介物 - ip biwk x 2
2 8 WW0662 3.5μg/动物 ip biwk x 2
3 8 WW0662 14μg/动物 ip biwk x 2
4 8 WW0662 43μg/动物 ip biwk x 2
5 8 WW0749/636 3.5μg/动物 ip biwk x 2
6 8 WW0749/636 14μg/动物 ip biwk x 2
7 8 WW0749/636 43μg/动物 ip biwk x 2
8 8 WW0753/636/727 4.3μg/动物 ip biwk x 2
9 8 WW0753/636/727 17μg/动物 ip biwk x 2
10 8 WW0753/636/727 52μg/动物 ip biwk x 2
11 8 WW0773/636 14μg/动物 ip biwk x 2
12 8 WW0773/636 42μg/动物 ip biwk x 2
13 8 WW0773/636 168μg/动物 ip biwk x 2
14 8 WW0773/636 505μg/动物 ip biwk x 2
15 8 WW0777/636/727 17μg/动物 ip biwk x 2
16 8 WW0777/636/727 51μg/动物 ip biwk x 2
17 8 WW0777/636/727 204μg/动物 ip biwk x 2
18 8 WW0777/636/727 613μg/动物 ip biwk x 2
用异氟烷麻醉小鼠以植入细胞以减少溃疡。将326只CR雌性C57BL/6小鼠的侧腹皮下建立0％ Matrigel中的5x105个MC38肿瘤细胞。细胞注射体积为0.1mL/小鼠。开始日期的小鼠年龄为8至12周。当肿瘤的平均大小达到100-150mm3并开始治疗时，进行配对。这是研究开始的第1天。在开始时测量体重，并且然后每两周测量一次直到结束。每两周进行一次卡尺测量直到结束。任何不良反应立即报告。对单次观察体重减轻>25％或连续三次测量体重减轻>20％的任何个体动物实施安乐死。平均体重减轻>20％或死亡率>10％的任何组均停止给药；该组并不实施安乐死，并且使其恢复。在体重减轻>20％的组中，对达到个体体重减轻终点的个体实施安乐死。如果组治疗相关的体重减轻恢复到原始体重的10％以内，则以较低剂量或较不频繁的给药方案恢复给药。非治疗体重％恢复的例外在个案基础上是允许的。终点是肿瘤生长延迟(TGD)。单独地监测动物。实验的终点是肿瘤体积达到1500mm3或40天，以先到者为准。当达到终点时，对动物实施安乐死。
实施例8：MC38实验(研究MC38-e503)
使用快速生长的结肠腺癌细胞系MC38细胞系。使用此肿瘤模型，检查融合蛋白影响肿瘤生长和体重的能力。
表6.剂和治疗方案
Figure BDA0004048574510000611
Figure BDA0004048574510000621
用异氟烷麻醉小鼠以植入细胞以减少溃疡。将326只CR雌性C57BL/6小鼠的侧腹皮下建立0％ Matrigel中的5x105个MC38肿瘤细胞。细胞注射体积为0.1mL/小鼠。开始日期的小鼠年龄为8至12周。当肿瘤的平均大小达到100-150mm3并开始治疗时，进行配对。这是研究开始的第1天。在开始时测量体重，并且然后每两周测量一次直到结束。每两周进行一次卡尺测量直到结束。任何不良反应立即报告。对单次观察体重减轻>25％或连续三次测量体重减轻>20％的任何个体动物实施安乐死。平均体重减轻>20％或死亡率>10％的任何组均停止给药；该组并不实施安乐死，并且使其恢复。在体重减轻>20％的组中，对达到个体体重减轻终点的个体实施安乐死。如果组治疗相关的体重减轻恢复到原始体重的10％以内，则以较低剂量或较不频繁的给药方案恢复给药。非治疗体重％恢复的例外在个案基础上是允许的。终点是肿瘤生长延迟(TGD)。单独地监测动物。实验的终点是肿瘤体积达到1500mm3或40天，以先到者为准。当达到终点时，对动物实施安乐死。
实施例9：Octet结合动力学测定
使用多浓度动力学，利用scFv进行KD测量。使用Octet QKe仪器(ForteBio)测量对人IL-12的结合亲和力。使用以下策略：在传感器上捕获带有6x His标签(SEQ ID NO:446)的scFv，接着是IL-12的缔合/解离。BLI分析在30℃下使用1X动力学缓冲液(ForteBio)作为测定缓冲液进行。首先将Ni-NTA(NTA)生物传感器(ForteBio)在测定缓冲液中预浸泡5分钟以上。将测试scFv(5μg/mL)在传感器上捕获300秒。然后将传感器浸入测定缓冲液中，持续120秒，以建立基线，然后测量与IL-12的结合。然后将传感器浸入不同浓度的IL-12(50至0.78nM，在测定缓冲液中的2倍稀释液)和空白缓冲液孔中以进行基准减法(referencesubtraction)，持续300秒，以测量缔合。然后通过将传感器浸入测定缓冲液中持续300秒来测量IL-12的解离。所有步骤的搅拌均为1000rpm。使用基准减法(scFv“结合”至缓冲液)、基于解离的步间校正、1对1结合模型和全局拟合(Rmax与传感器不相关)，利用Octet数据分析软件8.2版生成动力学参数。KD值在表7中示出。
表7.汇总scFv IL-12阻断剂动力学
Figure BDA0004048574510000631
Figure BDA0004048574510000641
实施例10：HEKBlue IL-23报告基因测定
将HEK-Blue IL23细胞(InvivoGen)以50,000个细胞/孔的密度悬浮铺板在含有或不含15mg/ml人血清白蛋白(HSA)的培养基中，并在37℃和5％ CO2下用系列稀释的重组小鼠IL-23或半衰期延长的小鼠IL23(抗HSA-L-mIL23)刺激20-24小时。通过使用试剂QUANTI-Blue(InvivoGen)对分泌型碱性磷酸酶(SEAP)活性进行定量(即基于比色的测定)来评估IL-23活性。结果在图40A和40B中示出。
实施例11：使用半衰期延长的IL-23蛋白WW5009进行的MC38功效研究
使用快速生长的结肠腺癌细胞系MC38细胞系。使用此肿瘤模型，检查融合蛋白影响肿瘤生长的能力。
表8.剂和治疗方案
组 N 剂 剂量 途径 方案
1 8 媒介物 - ip biwk x 3
2 8 WW5009 1μg/动物 ip biwk x 3
3 8 WW5009 10μg/动物 ip biwk x 3
4 8 WW5009 100μg/动物 ip biwk x 3
用异氟烷麻醉小鼠以植入细胞以减少溃疡。将Charles River雌性C57BL/6小鼠的侧腹皮下建立0％ Matrigel中的5x105个MC38肿瘤细胞。细胞注射体积将为0.1mL/小鼠。开始日期的小鼠年龄将为8至12周。当肿瘤的平均大小达到100-150mm3并开始治疗时，进行配对。在开始时测量体重，并且然后每两周测量一次直到结束。每两周进行一次卡尺测量直到结束。任何不良反应立即报告。对单次观察体重减轻>30％或连续三次测量体重减轻>25％的任何个体动物实施安乐死。平均体重减轻>20％或死亡率>10％的任何组均停止给药；该组并不实施安乐死，并且使其恢复。在体重减轻>20％的组中，对达到个体体重减轻终点的个体实施安乐死。如果组治疗相关的体重减轻恢复到原始体重的10％以内，则以较低剂量或较不频繁的给药方案恢复给药。非治疗体重％恢复的例外在个案基础上是允许的。终点是肿瘤生长延迟(TGD)。单独地监测动物。实验的终点是肿瘤体积达到1500mm3或45天，以先到者为准。对应答者追踪更长时间。当达到终点时，对动物实施安乐死。结果在图49A、49B和50A-50D中示出。
实施例12：CT26实验(研究CT26-e676)
使用快速生长的结肠腺癌细胞系CT26细胞系。使用此肿瘤模型，检查融合蛋白影响肿瘤生长的能力。
表9.剂和治疗
Figure BDA0004048574510000651
Figure BDA0004048574510000661
将30只CR雌性BALB/c小鼠的侧腹皮下建立0％ Matrigel中的3x105个CT26肿瘤细胞。细胞注射体积为0.1mL/小鼠。开始日期的小鼠年龄为8至12周。当肿瘤的平均大小达到30-60mm3并开始治疗时，进行配对。这是研究开始的第1天。每两周进行一次卡尺测量直到结束。任何不良反应立即报告。对单次观察体重减轻>25％或连续三次测量体重减轻>20％的任何个体动物实施安乐死。平均体重减轻>20％或死亡率>10％的任何组均停止给药；该组并不实施安乐死，并且使其恢复。在体重减轻>20％的组中，对达到个体体重减轻终点的个体实施安乐死。如果组治疗相关的体重减轻恢复到原始体重的10％以内，则以较低剂量或较不频繁的给药方案恢复给药。非治疗体重％恢复的例外在个案基础上是允许的。终点是肿瘤生长延迟(TGD)。单独地监测动物。实验的终点是肿瘤体积达到2000mm3或22天，以先到者为准。当达到终点时，对动物实施安乐死。结果在图41和42A-42C中示出。
实施例13：B16F10实验(研究B16F10-ITAA-0215)
使用快速生长的黑素瘤细胞系B16F10细胞系。使用此肿瘤模型，检查融合蛋白影响肿瘤生长的能力。
表10.剂和治疗
Figure BDA0004048574510000662
将30只CR雌性C57BL/6小鼠的侧腹皮下建立50％ Matrigel中的1x105个B16F10肿瘤细胞。细胞注射体积为0.1mL/小鼠。开始日期的小鼠年龄为8至12周。当肿瘤的平均大小达到100mm3并开始治疗时，进行配对。这是研究开始的第1天。每两周进行一次卡尺测量直到结束。任何不良反应立即报告。对单次观察体重减轻>25％或连续三次测量体重减轻>20％的任何个体动物实施安乐死。平均体重减轻>20％或死亡率>10％的任何组均停止给药；该组并不实施安乐死，并且使其恢复。在体重减轻>20％的组中，对达到个体体重减轻终点的个体实施安乐死。如果组治疗相关的体重减轻恢复到原始体重的10％以内，则以较低剂量或较不频繁的给药方案恢复给药。非治疗体重％恢复的例外在个案基础上是允许的。终点是肿瘤生长延迟(TGD)。单独地监测动物。实验的终点是肿瘤体积达到2000mm3或22天，以先到者为准。当达到终点时，对动物实施安乐死。结果在图43和44A-44C中示出。
实施例14：EMT6实验(研究EMT6-ITAA-0216)
使用快速生长的乳腺腺癌细胞系EMT6细胞系。使用此肿瘤模型，检查融合蛋白影响肿瘤生长的能力。
表11.剂和治疗
组 N 剂 剂量 途径 方案
1 10 媒介物 - ip biwk x 2
2 10 WW0757/636 50ug/动物 ip biwk x 2
3 10 WW0757/636 100ug/动物 ip biwk x 2
将30只CR雌性BALB/c小鼠的侧腹皮下建立50％ Matrigel中的1x105个EMT6肿瘤细胞。细胞注射体积为0.1mL/小鼠。开始日期的小鼠年龄为8至12周。当肿瘤的平均大小达到100mm3并开始治疗时，进行配对。这是研究开始的第1天。每两周进行一次卡尺测量直到结束。任何不良反应立即报告。对单次观察体重减轻>25％或连续三次测量体重减轻>20％的任何个体动物实施安乐死。平均体重减轻>20％或死亡率>10％的任何组均停止给药；该组并不实施安乐死，并且使其恢复。在体重减轻>20％的组中，对达到个体体重减轻终点的个体实施安乐死。如果组治疗相关的体重减轻恢复到原始体重的10％以内，则以较低剂量或较不频繁的给药方案恢复给药。非治疗体重％恢复的例外在个案基础上是允许的。终点是肿瘤生长延迟(TGD)。单独地监测动物。实验的终点是肿瘤体积达到2000mm3或22天，以先到者为准。当达到终点时，对动物实施安乐死。结果在图45和46A-46C中示出。
实施例15：总肿瘤RNA的纳米串分析
收获来自经治疗动物的鼠肿瘤并将其解离成单细胞悬液。简单来说，将肿瘤切成<5mm3的块，然后进行酶消化。将样品与3mg/mL胶原酶IV一起在振荡的同时在37℃下孵育35分钟，然后通过70μM尼龙网过滤器进行机械解离。然后对样品进行洗涤和计数，并且将每个样品中的3-5e5个总活细胞离心沉淀(spun down)，并冷冻于RLT+缓冲液中以供后期RNA提取。RNA分离和纳米串处理由LakePharma进行。使用RNEasy Micro试剂盒，根据制造商的方案分离RNA，并且在nCounter***上使用Murine PanCancer Immune Profiling Codeset对100ng总RNA进行跑样。使用安装了Advanced Analysis模块的nSolver软件，由WerewolfTherapeutics进行数据分析。所有统计分析均源自nSolver软件(参见nCounter AdvancedAnalysis 2.0Plugin for nSolver Software,用户手册,NanoString Technologies,2018)。使用Prism软件生成热图和其他图表。
实施例16：鼠肿瘤处理和流式细胞术分析
将MC38肿瘤植入C57BL/6小鼠中并使其生长至150mm3的平均大小，然后将小鼠随机分为治疗组(第0天)。在第1天和第4天通过腹膜内注射用媒介物或减弱的IL-12治疗小鼠，并在第二次给药后24小时(第5天)收获肿瘤。收获肿瘤并切成<5mm3的块，然后在无酚RPMI中酶消化。将样品与3mg/mL胶原酶IV一起在振荡的同时在37℃下孵育35分钟，然后通过70μM尼龙网过滤器进行机械解离。然后对样品进行洗涤、计数和铺板以进行流式细胞术分析。在96孔圆底板中，每孔铺板最多5x106个细胞。对于细胞内细胞因子染色，在染色前将样品用佛波12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(Phorbol 12-myristate13-acetate，PMA)、离子霉素和布雷非德菌素A(Brefeldin A)刺激4小时。对于细胞染色，在细胞外标志物染色之前先阻断FC受体。在细胞外染色后，在对细胞内标志物染色之前对细胞进行洗涤、固定和透化。将样品在运行
Figure BDA0004048574510000681
软件的Cytek Aurora***上跑样，并使用FlowJoTM软件分析数据。所有图表和统计分析均使用GraphPad Prism软件进行。
构建体排列
表8中提供的多肽构建体的元件包含如下缩写：“L”、“X”、“LX”和“XL”各自指接头。“X”是指可裂解接头。“L”是指任选可裂解的接头。当L为多肽中的唯一接头时，L是可裂解的。“LX”或“XL”各自指具有与其相邻的延长的不可裂解序列的可裂解接头。接头1是指包含MMP9底物基序序列的接头，接头2是指包含MMP14底物基序序列的接头。接头3是指包含CTSL-1底物基序序列的接头。
表12.示例性IL-12多肽复合物构建体
Figure BDA0004048574510000691
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序列公开
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Claims (110)

1.一种多肽复合物，其包含IL-12、半衰期延长元件、IL-12阻断元件和蛋白酶可裂解接头，其中所述IL-12阻断元件是结合IL-12的单链抗体或其抗原结合片段，并且所述复合物包含：
i.第一多肽，其包含IL-12亚基和任选的所述IL-12阻断元件，其中所述IL-12阻断元件在存在时通过第一蛋白酶可裂解接头可操作地连接至所述IL-12亚基；
ii.第二多肽链，其包含通过第二蛋白酶可裂解接头可操作地连接至半衰期延长元件的IL-12亚基，以及任选的所述IL-12阻断元件，其中所述IL-12阻断元件在存在时通过第一蛋白酶可裂解接头可操作地连接至所述IL-12亚基或通过任选地蛋白酶可裂解的接头可操作地连接至所述半衰期延长元件；
其中所述第一和第二多肽中仅一者包含所述IL-12阻断元件；并且
其中当所述第一多肽中的所述IL-12亚基为p35时，所述第二多肽中的所述IL-12亚基为p40，并且当所述第一多肽中的所述IL-12亚基为p40时，所述第二多肽中的所述IL-12亚基为p35。
2.如权利要求1所述的多肽，其中所述第一蛋白酶可裂解接头和所述第二蛋白酶可裂解接头是相同的。
3.一种多肽复合物，其包含IL-12、半衰期延长元件、IL-12阻断元件和蛋白酶可裂解接头，其中所述IL-12阻断元件是抗体的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含作为独立组分的抗体轻链的至少抗原结合部分和互补的抗体重链的至少抗原结合部分，并且所述复合物包含：
i.第一多肽，其包含IL-12亚基和任选的半衰期延长元件，其中所述半衰期延长元件在存在时通过第一蛋白酶可裂解接头可操作地连接至所述IL-12亚基；
ii.第二多肽，其包含IL-12亚基、抗体轻链的至少抗原结合部分或抗体重链的抗原结合部分，以及任选的半衰期延长元件；其中当所述半衰期延长元件存在时，其通过第一蛋白酶可裂解接头可操作地连接至所述IL-12亚基，并且所述抗体重链或轻链a)通过第二蛋白酶可裂解接头可操作地连接至所述IL-12亚基，或b)通过任选可裂解接头可操作地连接至所述半衰期延长元件；以及
iii.第三多肽，其包含与所述第二多肽中的所述轻链互补的抗体重链或与所述第二多肽中的所述重链互补并与所述轻链一起形成IL-12结合位点的抗体轻链的至少抗原结合部分；
其中当所述第一多肽中的所述IL-12亚基为p35时，所述第二多肽中的所述IL-12亚基为p40，并且当所述第一多肽中的所述IL-12亚基为p40时，所述第二多肽中的所述IL-12亚基为p35。
4.如权利要求3所述的多肽，其中所述第一蛋白酶可裂解接头和所述第二蛋白酶可裂解接头是相同的。
5.一种多肽复合物，其包含IL-12、半衰期延长元件、IL-12阻断元件和蛋白酶可裂解接头，其中所述IL-12阻断元件是抗体的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含作为独立组分的抗体轻链的至少抗原结合部分和互补的抗体重链的至少抗原结合部分，并且所述复合物包含：
i.第一多肽链，其包含p35、p40、半衰期延长元件和抗体轻链的至少抗原结合部分，其中p35和p40可操作地连接，并且所述半衰期延长元件通过第一蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p40并且抗体轻链的所述抗原结合部分通过第二蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p35；或所述半衰期延长元件通过第一蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p35并且抗体轻链的所述抗原结合部分通过第二蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p40；以及
ii.第二多肽，其包含与所述第二多肽中的所述轻链互补并且与所述轻链一起形成IL-12结合位点的抗体重链的至少抗原结合部分。
6.一种多肽复合物，其包含IL-12、半衰期延长元件、IL-12阻断元件和蛋白酶可裂解接头，其中所述IL-12阻断元件是抗体的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含作为独立组分的抗体轻链的至少抗原结合部分和互补的抗体重链的至少抗原结合部分，并且所述复合物包含：
iii.第一多肽链，其包含p35、p40、半衰期延长元件和抗体重链的至少抗原结合部分，其中p35和p40可操作地连接，并且所述半衰期延长元件通过第一蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p40并且抗体重链的所述抗原结合部分通过第二蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p35；或所述半衰期延长元件通过第一蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p35并且抗体重链的所述抗原结合部分通过第二蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p40；以及
iv.第二多肽，其包含与所述第二多肽中的所述重链互补并且与所述轻链一起形成IL-12结合位点的抗体轻链的至少抗原结合部分。
7.如权利要求5或6所述的多肽，其中所述第一蛋白酶可裂解接头和所述第二蛋白酶可裂解接头是相同的。
8.如权利要求1或3所述的多肽复合物，其中所述第一多肽不包含阻断元件并且所述第二多肽具有下式：
[A]-[L1]-[B]-[L3]-[D]或[D]-[L3]-[B]-[L1]-[A]或[B]-[L1]-[A]-[L2]-[D]或
[D]-[L1]-[A]-[L2]-[B]，其中，
A为所述IL-12亚基；
L1为所述第一蛋白酶可裂解接头；
L2为所述第二蛋白酶可裂解接头；
L3为所述任选可裂解接头；
B为所述半衰期延长元件；并且
D为所述阻断元件。
9.如权利要求1所述的多肽复合物，其中所述第一多肽包含下式：
[A]-[L1]-[D]或[D]-[L1]-[A]；并且所述第二多肽具有下式：
[A’]-[L2]-[B]或[B]-[L2]-[A’]，其中
A为p35或p40，其中当A为p35时，A’为p40，并且当A为p40时，A’为p35；
A’为p35或p40；
L1为所述第一蛋白酶可裂解接头；
L2为所述第二蛋白酶可裂解接头；
B为所述半衰期延长元件；并且
D为所述阻断元件。
10.如权利要求3所述的多肽复合物，其中所述第一多肽包含下式：[A]-[L1]-[B]或[B]-[L1]-[A]；并且所述第二多肽具有式[A’]-[L2]-[D]或[D]-[L2]-[A’]，其中
A为p35或p40；
A’为p35或p40，其中当A为p35时，A’为p40，并且当A为p40时，A’为p35；
L1为所述第一蛋白酶可裂解接头；
L2为所述第二蛋白酶可裂解接头；
B为所述半衰期延长元件；并且
D为所述阻断元件。
11.如权利要求1-10中任一项所述的多肽复合物，其中所述半衰期延长元件是人血清白蛋白、结合人血清白蛋白的抗原结合多肽，或免疫球蛋白Fc或其片段。
12.如权利要求1-10中任一项所述的多肽复合物，其中所述蛋白酶可裂解接头包含能够被选自以下的蛋白酶裂解的序列：激肽释放酶、凝血酶、糜酶、羧肽酶A、组织蛋白酶、弹性蛋白酶、PR-3、颗粒酶M、钙蛋白酶、基质金属蛋白酶(MMP)、ADAM、FAP、纤溶酶原激活物、半胱天冬酶、类胰蛋白酶或肿瘤蛋白酶。
13.如权利要求1-10中任一项所述的多肽复合物，其中所述蛋白酶选自组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶K、组织蛋白酶L或组织蛋白酶G。
14.如权利要求1-10中任一项所述的多肽复合物，其中蛋白酶选自基质金属蛋白酶(MMP)，所述基质金属蛋白酶为MMP1、MMP2、MMP3、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13或MMP14。
15.如权利要求1-10中任一项所述的多肽复合物，其中所述蛋白酶可裂解接头包含至少两个能够独立地被蛋白酶裂解的序列。
16.如权利要求1-10中任一项所述的多肽复合物，其中所述蛋白酶可裂解接头包含合成序列。
17.如前述权利要求中任一项所述的多肽复合物，其中所述蛋白酶可裂解接头中的每一个被两种或更多种不同的蛋白酶裂解。
18.如权利要求1所述的多肽复合物，其中所述单链抗体是单链可变片段(scFv)。
19.如权利要求3、5或6所述的多肽复合物，其中抗体的所述抗原结合片段为Fab。
20.如权利要求1、3、5或6中任一项所述的多肽复合物，其中所述阻断元件结合所述IL-12。
21.如权利要求17或18所述的多肽复合物，其中所述阻断元件结合p35、p40或所述p35p40复合物。
22.一种核酸，其编码如权利要求1-21中任一项所限定的多肽。
23.如权利要求22所述的核酸，其中所述核酸不仅仅编码p35或p40。
24.一种核酸组合物，其包含编码多肽复合物的一个或多个核酸序列，所述多肽复合物包含IL-12、半衰期延长元件、IL-12阻断元件和蛋白酶可裂解接头，其中所述IL-12阻断元件是结合IL-12的单链抗体或其抗原结合片段，并且所述复合物包含：
iii.第一多肽，其包含IL-12亚基和任选的所述IL-12阻断元件，其中所述IL-12阻断元件在存在时通过第一蛋白酶可裂解接头可操作地连接至所述IL-12亚基；
iv.第二多肽链，其包含通过第二蛋白酶可裂解接头可操作地连接至半衰期延长元件的IL-12亚基，以及任选的所述IL-12阻断元件，其中所述IL-12阻断元件在存在时通过第一蛋白酶可裂解接头可操作地连接至所述IL-12亚基或通过任选地蛋白酶可裂解的接头可操作地连接至所述半衰期延长元件；
其中所述第一和第二多肽中仅一者包含所述IL-12阻断元件；并且
其中当所述第一多肽中的所述IL-12亚基为p35时，所述第二多肽中的所述IL-12亚基为p40，并且当所述第一多肽中的所述IL-12亚基为p40时，所述第二多肽中的所述IL-12亚基为p35。
25.一种核酸组合物，其包含编码多肽复合物的一个或多个核酸序列，所述多肽复合物包含IL-12、半衰期延长元件、IL-12阻断元件和蛋白酶可裂解接头，其中所述IL-12阻断元件是抗体的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含作为独立组分的抗体轻链的至少抗原结合部分和互补的抗体重链的至少抗原结合部分，并且所述复合物包含：
i.第一多肽，其包含IL-12亚基和任选的半衰期延长元件，其中所述半衰期延长元件在存在时通过第一蛋白酶可裂解接头可操作地连接至所述IL-12亚基；
ii.第二多肽，其包含IL-12亚基、抗体轻链的至少抗原结合部分，以及任选的半衰期延长元件；其中当所述半衰期延长元件存在时，其通过第一蛋白酶可裂解接头可操作地连接至所述IL-12亚基，并且所述抗体重链或轻链a)通过第二蛋白酶可裂解接头可操作地连接至所述IL-12亚基，或b)通过任选可裂解接头可操作地连接至所述半衰期延长元件；以及
iii.第三多肽，其包含与所述第二多肽中的所述轻链互补并且与所述轻链一起形成IL-12结合位点的抗体重链的至少抗原结合部分；
其中当所述第一多肽中的所述IL-12亚基为p35时，所述第二多肽中的所述IL-12亚基为p40，并且当所述第一多肽中的所述IL-12亚基为p40时，所述第二多肽中的所述IL-12亚基为p35。
26.一种核酸组合物，其包含编码多肽复合物的一个或多个核酸序列，所述多肽复合物包含IL-12、半衰期延长元件、IL-12阻断元件和蛋白酶可裂解接头，其中所述IL-12阻断元件是抗体的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含作为独立组分的抗体轻链的至少抗原结合部分和互补的抗体重链的至少抗原结合部分，并且所述复合物包含：
i.第一多肽链，其包含p35、p40、半衰期延长元件和抗体轻链的至少抗原结合部分，其中p35和p40可操作地连接，并且所述半衰期延长元件通过第一蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p40并且抗体轻链的所述抗原结合部分通过第二蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p35；或所述半衰期延长元件通过第一蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p35并且抗体轻链的所述抗原结合部分通过第二蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p40；以及
ii.第二多肽，其包含与所述第二多肽中的所述轻链互补并且与所述轻链一起形成IL-12结合位点的抗体重链的至少抗原结合部分。
27.一种核酸组合物，其包含编码多肽复合物的一个或多个核酸序列，所述多肽复合物包含IL-12、半衰期延长元件、IL-12阻断元件和蛋白酶可裂解接头，其中所述IL-12阻断元件是抗体的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含作为独立组分的抗体轻链的至少抗原结合部分和互补的抗体重链的至少抗原结合部分，并且所述复合物包含：
iii.第一多肽链，其包含p35、p40、半衰期延长元件和抗体重链的至少抗原结合部分，其中p35和p40可操作地连接，并且所述半衰期延长元件通过第一蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p40并且抗体重链的所述抗原结合部分通过第二蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p35；或所述半衰期延长元件通过第一蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p35并且抗体重链的所述抗原结合部分通过第二蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p40；以及
iv.第二多肽，其包含与所述第二多肽中的所述重链互补并且与所述重链一起形成IL-12结合位点的抗体轻链的至少抗原结合部分。
28.如权利要求22-27中任一项所述的核酸组合物，其包含环状载体。
29.如权利要求22-27中任一项所述的核酸组合物，其包含DNA。
30.如权利要求22-27中任一项所述的核酸组合物，其包含RNA。
31.一种表达载体，其包含如权利要求22-27中任一项所述的核酸。
32.一种分离的宿主细胞，其包含如权利要求31所述的载体。
33.一种制备药物组合物的方法，其包括在用于表达所述多肽复合物的合适条件下培养如权利要求32所述的分离的宿主细胞。
34.如权利要求33所述的方法，其还包括分离所述多肽复合物。
35.一种药物组合物，其包含如权利要求1-21中任一项所述的蛋白质复合物或如权利要求22-31中任一项所述的核酸。
36.一种用于***的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的如权利要求1-21中任一项所述的多肽复合物、如权利要求22-30中任一项所述的核酸、如权利要求31所述的表达载体，或如权利要求34所述的药物组合物。
37.一种IL-12多肽复合物，其包含选自由SEQ ID NO:95-110、SEQ ID NO:119-126和SEQ ID NO:135-143组成的组的第一多肽，或与SEQ ID NO:95-110、SEQ ID NO:119-126和SEQ ID NO:135-143具有至少80％同一性的氨基酸序列。
38.一种IL-12多肽复合物，其包含含有SEQ ID NO:104或SEQ IDNO:136的第一多肽。
39.一种IL-12多肽复合物，其包含含有SEQ ID NO:104的氨基酸序列的第一多肽链和含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的第二多肽链。
40.一种多肽复合物，其包含含有SEQ ID NO:136的氨基酸序列的第一多肽链和含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的第二多肽链。
41.一种单链IL-12可诱导多肽，其包含选自由SEQ ID NO:7、9、10、18、24-94、SEQ IDNO:110-118和SEQ ID NO:127-134组成的组的氨基酸，或与SEQ ID NO:7、9、10、18、24-94、SEQ ID NO:110-118和SEQ ID NO:127-134具有至少约80％同一性的氨基酸序列。
42.一种可诱导的IL-12多肽，其包含p35、p40、阻断元件和半衰期延长元件，其中所述阻断元件是对IL-12上由表1中的氨基酸限定的表位具有结合特异性的抗体或抗原结合片段。
43.一种核酸，其编码如权利要求37-42中任一项所限定的多肽。
44.如权利要求37-42中任一项所述的核酸组合物，其包含环状载体。
45.如权利要求37-42中任一项所述的核酸组合物，其包含DNA。
46.如权利要求37-42中任一项所述的核酸组合物，其包含RNA。
47.一种表达载体，其包含如权利要求37-42中任一项所述的核酸。
48.一种分离的宿主细胞，其包含如权利要求47所述的载体。
49.一种制备药物组合物的方法，其包括在用于表达所述多肽复合物的合适条件下培养如权利要求48所述的分离的宿主细胞。
50.如权利要求49所述的方法，其还包括分离所述多肽复合物。
51.一种药物组合物，其包含如权利要求37-40或42中任一项所述的蛋白质复合物，或如权利要求41所述的多肽，或如权利要求43-47中任一项所述的核酸。
52.一种用于***的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的如权利要求37-40或42中任一项所述的多肽复合物、如权利要求43-47中任一项所述的核酸、如权利要求48所述的表达载体，或如权利要求51所述的药物组合物。
53.如权利要求1-10中任一项所述的多肽或如权利要求24-27中任一项所述的核酸组合物，其中所述IL-12是突变蛋白。
54.如权利要求53所述的多肽或如权利要求53所述的核酸组合物，其中所述IL-12是部分或完全非糖基化的。
55.如权利要求54所述的多肽或如权利要求54所述的核酸组合物，其中所述p35和/或p40是部分或完全非糖基化的。
56.如权利要求55所述的多肽或如权利要求55所述的核酸组合物，其中所述p35和/或p40是完全非糖基化的。
57.一种多肽复合物，其包含IL-23、半衰期延长元件、IL-23阻断元件和蛋白酶可裂解接头，其中所述IL-23阻断元件是结合IL-23的单链抗体或其抗原结合片段，并且所述复合物包含：
v.第一多肽，其包含IL-23亚基和任选的所述IL-23阻断元件，其中所述IL-23阻断元件在存在时通过第一蛋白酶可裂解接头可操作地连接至所述IL-23亚基；
vi.第二多肽链，其包含通过第二蛋白酶可裂解接头可操作地连接至半衰期延长元件的IL-23亚基，以及任选的所述IL-23阻断元件，其中所述IL-23阻断元件在存在时通过第一蛋白酶可裂解接头可操作地连接至所述IL-23亚基或通过任选地蛋白酶可裂解的接头可操作地连接至所述半衰期延长元件；
其中所述第一和第二多肽中仅一者包含所述IL-23阻断元件；并且
其中当所述第一多肽中的所述IL-23亚基为p19时，所述第二多肽中的所述IL-23亚基为p40，并且当所述第一多肽中的所述IL-23亚基为p40时，所述第二多肽中的所述IL-23亚基为p19。
58.如权利要求57所述的多肽，其中所述第一蛋白酶可裂解接头和所述第二蛋白酶可裂解接头是相同的。
59.一种多肽复合物，其包含IL-23、半衰期延长元件、IL-23阻断元件和蛋白酶可裂解接头，其中所述IL-23阻断元件是抗体的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含作为独立组分的抗体轻链的至少抗原结合部分和互补的抗体重链的至少抗原结合部分，并且所述复合物包含：
iv.第一多肽，其包含IL-23亚基和任选的半衰期延长元件，其中所述半衰期延长元件在存在时通过第一蛋白酶可裂解接头可操作地连接至所述IL-23亚基；
v.第二多肽，其包含IL-12亚基、抗体轻链的至少抗原结合部分或抗体重链的抗原结合部分，以及任选的半衰期延长元件；其中当所述半衰期延长元件存在时，其通过第一蛋白酶可裂解接头可操作地连接至所述IL-23亚基，并且所述抗体重链或轻链a)通过第二蛋白酶可裂解接头可操作地连接至所述IL-23亚基，或b)通过任选可裂解接头可操作地连接至所述半衰期延长元件；以及
vi.第三多肽，其包含与所述第二多肽中的所述轻链互补的抗体重链或与所述第二多肽中的所述重链互补并与所述轻链一起形成IL-23结合位点的抗体轻链的至少抗原结合部分；
其中当所述第一多肽中的所述IL-23亚基为p19时，所述第二多肽中的所述IL-23亚基为p40，并且当所述第一多肽中的所述IL-23亚基为p40时，所述第二多肽中的所述IL-23亚基为p19。
60.如权利要求59所述的多肽，其中所述第一蛋白酶可裂解接头和所述第二蛋白酶可裂解接头是相同的。
61.一种多肽复合物，其包含IL-23、半衰期延长元件、IL-23阻断元件和蛋白酶可裂解接头，其中所述IL-23阻断元件是抗体的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含作为独立组分的抗体轻链的至少抗原结合部分和互补的抗体重链的至少抗原结合部分，并且所述复合物包含：
v.第一多肽链，其包含p19、p40、半衰期延长元件和抗体轻链的至少抗原结合部分，其中p19和p40可操作地连接，并且所述半衰期延长元件通过第一蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p40并且抗体轻链的所述抗原结合部分通过第二蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p19；或所述半衰期延长元件通过第一蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p19并且抗体轻链的所述抗原结合部分通过第二蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p40；以及
vi.第二多肽，其包含与所述第二多肽中的所述轻链互补并且与所述轻链一起形成IL-23结合位点的抗体重链的至少抗原结合部分。
62.一种多肽复合物，其包含IL-23、半衰期延长元件、IL-23阻断元件和蛋白酶可裂解接头，其中所述IL-23阻断元件是抗体的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含作为独立组分的抗体轻链的至少抗原结合部分和互补的抗体重链的至少抗原结合部分，并且所述复合物包含：
vii.第一多肽链，其包含p19、p40、半衰期延长元件和抗体重链的至少抗原结合部分，其中p19和p40可操作地连接，并且所述半衰期延长元件通过第一蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p40并且抗体重链的所述抗原结合部分通过第二蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p19；或所述半衰期延长元件通过第一蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p19并且抗体重链的所述抗原结合部分通过第二蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p40；以及
viii.第二多肽，其包含与所述第二多肽中的所述重链互补并且与所述轻链一起形成IL-23结合位点的抗体轻链的至少抗原结合部分。
63.如权利要求61或62所述的多肽，其中所述第一蛋白酶可裂解接头和所述第二蛋白酶可裂解接头是相同的。
64.如权利要求57或59所述的多肽复合物，其中所述第一多肽不包含阻断元件并且所述第二多肽具有下式：
[A]-[L1]-[B]-[L3]-[D]或[D]-[L3]-[B]-[L1]-[A]或[B]-[L1]-[A]-[L2]-[D]或
[D]-[L1]-[A]-[L2]-[B]，其中，
A为所述IL-23亚基；
L1为所述第一蛋白酶可裂解接头；
L2为所述第二蛋白酶可裂解接头；
L3为所述任选可裂解接头；
B为所述半衰期延长元件；并且
D为所述阻断元件。
65.如权利要求57所述的多肽复合物，其中所述第一多肽包含下式：
[A]-[L1]-[D]或[D]-[L1]-[A]；并且所述第二多肽具有下式：
[A’]-[L2]-[B]或[B]-[L2]-[A’]，其中
A为p19或p40，其中当A为p19时，A’为p40，并且当A为p40时，A’为p19；
A’为p19或p40；
L1为所述第一蛋白酶可裂解接头；
L2为所述第二蛋白酶可裂解接头；
B为所述半衰期延长元件；并且
D为所述阻断元件。
66.如权利要求59所述的多肽复合物，其中所述第一多肽包含下式：[A]-[L1]-[B]或[B]-[L1]-[A]；并且所述第二多肽具有式[A’]-[L2]-[D]或[D]-[L2]-[A’]，其中
A为p19或p40；
A’为p19或p40，其中当A为p19时，A’为p40，并且当A为p40时，A’为p19；
L1为所述第一蛋白酶可裂解接头；
L2为所述第二蛋白酶可裂解接头；
B为所述半衰期延长元件；并且
D为所述阻断元件。
67.如权利要求57-66中任一项所述的多肽复合物，其中所述半衰期延长元件是人血清白蛋白、结合人血清白蛋白的抗原结合多肽，或免疫球蛋白Fc或其片段。
68.如权利要求57-66中任一项所述的多肽复合物，其中所述蛋白酶可裂解接头包含能够被选自以下的蛋白酶裂解的序列：激肽释放酶、凝血酶、糜酶、羧肽酶A、组织蛋白酶、弹性蛋白酶、PR-3、颗粒酶M、钙蛋白酶、基质金属蛋白酶(MMP)、ADAM、FAP、纤溶酶原激活物、半胱天冬酶、类胰蛋白酶或肿瘤蛋白酶。
69.如权利要求57-66中任一项所述的多肽复合物，其中所述蛋白酶选自组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶K、组织蛋白酶L或组织蛋白酶G。
70.如权利要求57-66中任一项所述的多肽复合物，其中蛋白酶选自基质金属蛋白酶(MMP)，所述基质金属蛋白酶为MMP1、MMP2、MMP3、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13或MMP14。
71.如权利要求57-66中任一项所述的多肽复合物，其中所述蛋白酶可裂解接头包含至少两个能够独立地被蛋白酶裂解的序列。
72.如权利要求57-66中任一项所述的多肽复合物，其中所述蛋白酶可裂解接头包含合成序列。
73.如前述权利要求中任一项所述的多肽复合物，其中所述蛋白酶可裂解接头中的每一个被两种或更多种不同的蛋白酶裂解。
74.如权利要求57所述的多肽复合物，其中所述单链抗体是单链可变片段(scFv)。
75.如权利要求59、61或62所述的多肽复合物，其中抗体的所述抗原结合片段为Fab。
76.如权利要求57、59、61或62中任一项所述的多肽复合物，其中所述阻断元件结合所述IL-23。
77.如权利要求73或74所述的多肽复合物，其中所述阻断元件结合p19、p40或p19p40复合物。
78.一种核酸，其编码如权利要求57-77中任一项所限定的多肽。
79.如权利要求78所述的核酸，其中所述核酸不仅仅编码p19或p40。
80.一种核酸组合物，其包含编码多肽复合物的一个或多个核酸序列，所述多肽复合物包含IL-23、半衰期延长元件、IL-23阻断元件和蛋白酶可裂解接头，其中所述IL-23阻断元件是结合IL-23的单链抗体或其抗原结合片段，并且所述复合物包含：
vii.第一多肽，其包含IL-23亚基和任选的所述IL-23阻断元件，其中所述IL-23阻断元件在存在时通过第一蛋白酶可裂解接头可操作地连接至所述IL-23亚基；
viii.第二多肽链，其包含通过第二蛋白酶可裂解接头可操作地连接至半衰期延长元件的IL-23亚基，以及任选的所述IL-23阻断元件，其中所述IL-23阻断元件在存在时通过第一蛋白酶可裂解接头可操作地连接至所述IL-23亚基或通过任选地蛋白酶可裂解的接头可操作地连接至所述半衰期延长元件；
其中所述第一和第二多肽中仅一者包含所述IL-23阻断元件；并且
其中当所述第一多肽中的所述IL-23亚基为p19时，所述第二多肽中的所述IL-23亚基为p40，并且当所述第一多肽中的所述IL-23亚基为p40时，所述第二多肽中的所述IL-23亚基为p19。
81.一种核酸组合物，其包含编码多肽复合物的一个或多个核酸序列，所述多肽复合物包含IL-23、半衰期延长元件、IL-23阻断元件和蛋白酶可裂解接头，其中所述IL-23阻断元件是抗体的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含作为独立组分的抗体轻链的至少抗原结合部分和互补的抗体重链的至少抗原结合部分，并且所述复合物包含：
iv.第一多肽，其包含IL-23亚基和任选的半衰期延长元件，其中所述半衰期延长元件在存在时通过第一蛋白酶可裂解接头可操作地连接至所述IL-23亚基；
v.第二多肽，其包含IL-12亚基、抗体轻链的至少抗原结合部分，以及任选的半衰期延长元件；其中当所述半衰期延长元件存在时，其通过第一蛋白酶可裂解接头可操作地连接至所述IL-23亚基，并且所述抗体重链或轻链a)通过第二蛋白酶可裂解接头可操作地连接至所述IL-23亚基，或b)通过任选可裂解接头可操作地连接至所述半衰期延长元件；以及
vi.第三多肽，其包含与所述第二多肽中的所述轻链互补并且与所述轻链一起形成IL-23结合位点的抗体重链的至少抗原结合部分；
其中当所述第一多肽中的所述IL-23亚基为p19时，所述第二多肽中的所述IL-23亚基为p40，并且当所述第一多肽中的所述IL-23亚基为p40时，所述第二多肽中的所述IL-23亚基为p19。
82.一种核酸组合物，其包含编码多肽复合物的一个或多个核酸序列，所述多肽复合物包含IL-23、半衰期延长元件、IL-23阻断元件和蛋白酶可裂解接头，其中所述IL-23阻断元件是抗体的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含作为独立组分的抗体轻链的至少抗原结合部分和互补的抗体重链的至少抗原结合部分，并且所述复合物包含：
v.第一多肽链，其包含p19、p40、半衰期延长元件和抗体轻链的至少抗原结合部分，其中p19和p40可操作地连接，并且所述半衰期延长元件通过第一蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p40并且抗体轻链的所述抗原结合部分通过第二蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p19；或所述半衰期延长元件通过第一蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p19并且抗体轻链的所述抗原结合部分通过第二蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p40；以及
vi.第二多肽，其包含与所述第二多肽中的所述轻链互补并且与所述轻链一起形成IL-23结合位点的抗体重链的至少抗原结合部分。
83.一种核酸组合物，其包含编码多肽复合物的一个或多个核酸序列，所述多肽复合物包含IL-23、半衰期延长元件、IL-23阻断元件和蛋白酶可裂解接头，其中所述IL-23阻断元件是抗体的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含作为独立组分的抗体轻链的至少抗原结合部分和互补的抗体重链的至少抗原结合部分，并且所述复合物包含：
vii.第一多肽链，其包含p19、p40、半衰期延长元件和抗体重链的至少抗原结合部分，其中p19和p40可操作地连接，并且所述半衰期延长元件通过第一蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p40并且抗体重链的所述抗原结合部分通过第二蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p19；或所述半衰期延长元件通过第一蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p19并且抗体重链的所述抗原结合部分通过第二蛋白酶可裂解接头可操作地连接至p40；以及
viii.第二多肽，其包含与所述第二多肽中的所述重链互补并且与所述重链一起形成IL-23结合位点的抗体轻链的至少抗原结合部分。
84.如权利要求78-83中任一项所述的核酸组合物，其包含环状载体。
85.如权利要求78-83中任一项所述的核酸组合物，其包含DNA。
86.如权利要求78-83中任一项所述的核酸组合物，其包含RNA。
87.一种表达载体，其包含如权利要求78-83中任一项所述的核酸。
88.一种分离的宿主细胞，其包含如权利要求87所述的载体。
89.一种制备药物组合物的方法，其包括在用于表达所述多肽复合物的合适条件下培养如权利要求88所述的分离的宿主细胞。
90.如权利要求89所述的方法，其还包括分离所述多肽复合物。
91.一种药物组合物，其包含如权利要求57-77中任一项所述的蛋白质复合物或如权利要求78-86中任一项所述的核酸。
92.一种用于***的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的如权利要求57-77中任一项所述的多肽复合物、如权利要求78-86中任一项所述的核酸、如权利要求87所述的表达载体，或如权利要求91所述的药物组合物。
93.一种IL-23多肽复合物，其包含选自由SEQ ID NO:423-428组成的组的第一多肽，或与SEQ ID NO:423-428具有至少80％同一性的氨基酸序列。
94.如权利要求93所述的IL-23多肽复合物，其还包含第二多肽链，所述第二多肽链包含SEQ ID NO:104、434或442-445的氨基酸序列或与SEQ ID NO:104、434或442-445具有至少80％同一性的氨基酸序列。
95.一种单链IL-23可诱导多肽，其包含选自由SEQ ID NO:422或429-432组成的组的氨基酸，或与SEQ ID NO:422或429-432具有至少约80％同一性的氨基酸序列。
96.一种可诱导的IL-23多肽，其包含p19、p40、阻断元件和半衰期延长元件，其中所述阻断元件是对IL-23上的表位具有结合特异性的抗体或抗原结合片段。
97.一种核酸，其编码如权利要求93-96中任一项所限定的多肽。
98.如权利要求93-97中任一项所述的核酸组合物，其包含环状载体。
99.如权利要求93-98中任一项所述的核酸组合物，其包含DNA。
100.如权利要求93-98中任一项所述的核酸组合物，其包含RNA。
101.一种表达载体，其包含如权利要求97-100中任一项所述的核酸。
102.一种分离的宿主细胞，其包含如权利要求101所述的载体。
103.一种制备药物组合物的方法，其包括在用于表达所述多肽复合物的合适条件下培养如权利要求102所述的分离的宿主细胞。
104.如权利要求103所述的方法，其还包括分离所述多肽复合物。
105.一种药物组合物，其包含如权利要求93-96中任一项所述的多肽复合物或如权利要求97-100中任一项所述的核酸。
106.一种用于***的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的如权利要求93-96中任一项所述的多肽复合物、如权利要求97-100中任一项所述的核酸、如权利要求101所述的表达载体，或如权利要求105所述的药物组合物。
107.如权利要求57-66中任一项所述的多肽或如权利要求80-86中任一项所述的核酸组合物，其中所述IL-23是突变蛋白。
108.如权利要求53所述的多肽或如权利要求107所述的核酸组合物，其中所述IL-23是部分或完全非糖基化的。
109.如权利要求108所述的多肽或如权利要求108所述的核酸组合物，其中所述p19和/或p40是部分或完全非糖基化的。
110.如权利要求109所述的多肽或如权利要求109所述的核酸组合物，其中所述p19和/或p40是完全非糖基化的。
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