MX2014016038A - Anticuerpos de reaccion cruzada anti - jagged 1 / jagged 2, anticuerpos anti - jagged activables y metodos para uso de los mismos. - Google Patents

Anticuerpos de reaccion cruzada anti - jagged 1 / jagged 2, anticuerpos anti - jagged activables y metodos para uso de los mismos.

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MX
Mexico
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jagged
antibody
activatable
sequence
antibodies
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Henry Bernard Lowman
James William West
Jason Gary Sagert
Olga Vasiljeva
Paul H Bessette
Nancy E Stagliano
Elizabeth-Edna Mary Menendez
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Cytomx Therapeutics Inc
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Abstract

Esta invención se relaciona en general con la generación de anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales incluyendo anticuerpos monoclonales completamente humanos, que reconocen Jgged 1 y/o 2 Jagged, a anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, incluyendo anticuerpos completamente humanos que reconocen Jagger 1 y/o Jagger 2, y moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos, por ejemplo, moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos monoclonales incluyendo anticuerpos reacción cruzada completamente humana que reconoce tanto Jagged 1 y 2 Jagged, a y a métodos de fabricación de los anticuerpos anti-Jagged y métodos de utilización de los anticuerpos anti-Jagged como agentes terapéuticos, profilácticos y diagnósticos. La invención también se refiere en general a anticuerpos activables que incluyen un radical de enmascaramiento (MM), un radical escindible (CM), y un anticuerpo (AB) que se unen específicamente a Jagged 1 y Jagged 2, y a métodos de fabricación y uso de estos anticuerpos anti-Jagged activables en una diversidad de indicaciones terapéuticas, de diagnóstico y de profilaxis.

Description

ANTICUERPOS DE REACCIÓN CRUZADA ANTI-JAGGED 1/JAGGED 2, ANTICUERPOS ANTI-JAGGED ACTIVABLES Y MÉTODOS PARA USO DE LOS MISMOS SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de E.U.A. No.61/633,307, de fecha del 22 de Junio del 2012; Solicitud Provisional de E.U.A. No. 61/749,212, de fecha del 4 de Enero del 2013; Solicitud Provisional de E.U.A. No.61/749.486, de fecha del 7 de Enero del 2013, y Solicitud Provisional de E.U.A. No.61/755,810, de fecha del 23 de Enero del 2013; cada uno de los cuales está incorporado aquí por referencia en su totalidad.
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se encuentra relacionada de forma general a la generación de anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales incluyendo anticuerpos monoclonales completamente humanos, que reconocen Jagged 1 y/o Jagged 2, a anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales que incluyen anticuerpos completamente humanos que reconocen Jagged 1 y/o Jagged 2, y moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos, por ejemplo, moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos monoclonales incluyendo anticuerpos completamente humanos de reacción cruzada que reconocen Jagged 1 y Jagged 2, y a métodos de producción de anticuerpos Anti-Jagged y métodos de uso de los anticuerpos anti-Jagged como terapias, profilaxis y diagnósticos. La invención también se relaciona de forma general a los anticuerpos activadles que se unen específicamente a Jagged 1 y Jagged 2, y a métodos de producción y uso de estos anticuerpos activadles anti-Jagged en una variedad de indicaciones terapéuticas, diagnósticas y profilácticas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION La ruta de señalización Notch regula una amplia variedad de tipos celulares y procesos celulares. La ruta de señalización Notch está regulada mediante la unión de ligandos, que incluyen ligandos como Jagged 1 y Jagged 2. De acuerdo a esto, existe una necesidad de terapias y diagnósticos que apunten a la ruta de señalamiento Notch, incluyendo Jagged 1 y/o Jagged 2.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención describe las composiciones para el diagnóstico y/o tratamiento del cáncer o enfermedad fibrótica. Específicamente, la presente invención proporciona anticuerpos que se unen a Jagged 1 y Jagged 2 e inhiben su unión y señalización a través de los receptores Notch. La invención proporciona anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a Jagged 1 y Jagged 2. Los anticuerpos de la invención modulan, por ejemplo, bloquean, inhiben, reducen, antagonizan, neutralizan o de alguna manera interfieren con la unión del Jagged 1 a los receptores Notch, la unión de Jagged 2 a los receptores Notch, la unión de Jagged 1 y Jagged 2 a los receptores Notch, la señalización a través de la interacción entre Jagged 2 y los receptores Notch, y/o la señalización mediante la interacción entre Jagged 1, Jagged 2 y los receptores Notch. Estos anticuerpos son mencionados aquí como "anticuerpos anti-Jagged". Los anticuerpos anti-Jagged de la invención incluyen anticuerpos monoclonales, tal como, por ejemplo, anticuerpos monoclonales completamente humanos, así como anticuerpos monoclonales humanizados y anticuerpos quiméricos. En algunas realizaciones, los anticuerpos son isotipo IgG. En algunas realizaciones, los anticuerpos son isotipo IgGl. En algunas realizaciones, los anticuerpos tienen uno de cualquier isotipo descrito en este documento.
Jagged 1, inicialmente identificado como Jagged y también denominado como JAG1, JAGL1 y/o HJ1, ha mostrado ser un ligando transmembrana para Notch. Jagged 2 es otro ligando de Notch que está relacionado a Jagged 1. Ambos, Jagged 1 y Jagged 2, son ligandos para los receptores Notch-1, Notch-2, Notch-3 y Notch-4. (Ver, por ejemplo, Shimizu K et al., "Binding of Deltal, Jagged 1, and Jagged 2 to Notch2 rapidly induces cleavage, nuclear translocation, and hyperphosphorylation of Notch2". Molecular Cellular Biology 20(18): 6913-6922 (2000); Shimizu K et al., Physical interaction of Deltal, Jagged 1, and Jagged 2 with Notchl and Notch3 receptors. Biochemical and Biophysical Research Communications 276(1): 385-389 (2000); Microvasc Res. 60(2):91-103 (2000)). Las proteínas Jagged fueron mencionadas originalmente como proteínas Aserradas.
Ejemplos de anticuerpos monoclonales de la invención incluyen, por ejemplo, el anticuerpo 4D11, el anticuerpo 4B2, el anticuerpo 4E7, el anticuerpo 4E11, el anticuerpo 6B7, y el anticuerpo 6F8. Otros anticuerpos adecuados incluyen un anticuerpo que se une al mismo epítope del anticuerpo 4D11, el anticuerpo 4B2, el anticuerpo 4E7, el anticuerpo 4E11, el anticuerpo 6B7 y/o el anticuerpo 6F8.
Estos anticuerpos muestran una especificidad por Jagged 1 y Jagged 2 humano, y han mostrado inhibir o de otro modo interferir con la señalización Jagged 1 y/o Jagged 2 a través de los receptores Notch. Estos anticuerpos también muestran especificidad por Jagged 1 de ratón y rata. En algunas realizaciones, estos anticuerpos también muestran especificidad por Jagged 2 de ratón o rata.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Jagged de la descripción pueden internalizarse tras la unión a Jagged 1 y/o Jagged 2 expresados en una célula enferma, por ejemplo, sobre una célula cancerosa o una célula involucrada en un desorden fibrótico.
Los anticuerpos anti-Jagged de la invención incluyen anticuerpos que contienen una combinación de una secuencia VH CDR1, una secuencia VH CDR2, una secuencia VH CDR3, una secuencia VL CDR1, una secuencia VL CDR2 y una secuencia VL CDR3 seleccionada de las combinaciones mostradas en la tabla 2. Los anticuerpos anti-Jagged de la invención incluyen anticuerpos que contienen una combinación de una secuencia VH CDR1, una secuencia VH CDR2, y una secuencia VH CDR3, una secuencia VL CDR1, una secuencia VL CDR2 y una secuencia VL CDR3 que son al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idénticas a las secuencias mostradas en la tabla 2.
Los anticuerpos anti-Jagged de la invención incluyen anticuerpos que contienen una combinación de una secuencia VH CDR1, una secuencia VH CDR2, una secuencia VH CDR3, una secuencia VL CDR1, una secuencia VL CDR2 y una secuencia VL CDR3 de al menos un anticuerpo seleccionado del grupo consistente del anticuerpo 4D11, el anticuerpo 4B2, el anticuerpo 4E7, el anticuerpo 4E11, el anticuerpo 6B7 y el anticuerpo 6F8. Los anticuerpos anti-Jagged de la invención incluyen anticuerpos que contienen una combinación de una secuencia VH CDR1, una secuencia VH CDR2, una secuencia VH CDR3, una secuencia VL CDRl, una secuencia VL CDR2 y una secuencia VL CDR3 que son al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idénticas a las secuencias CDR respectivas de al menos un anticuerpo seleccionado del grupo consistente del anticuerpo 4D11, el anticuerpo 4B2, el anticuerpo 4E7, el anticuerpo 4E11, el anticuerpo 6B7 y el anticuerpo 6F8.
Los anticuerpos anti-Jagged de la invención incluyen anticuerpos que contienen una combinación de una secuencia VH CDRl, una secuencia VH CDR2, una secuencia VH CDR3, una secuencia VL CDRl, una secuencia VL CDR2 y una secuencia VL CDR3, donde al menos una secuencia CDR se seleccionó del grupo consistente de una secuencia VH CDRl que incluye al menos la secuencia de aminoácidos SYAMS (SEQ ID NO: 200); una secuencia VH CD2 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos SIDPEGRQTYYADSVKG (SEQ ID NO: 208); una secuencia VH CDR3 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos DIGGRSAFDY (SEQ ID NO: 209); una secuencia VL CDRl que incluye al menos la secuencia de aminoácidos RASQSISSY (SEQ ID NO: 210); una secuencia VL CDR2 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos AASSLQS (SEQ ID NO: 211); y una secuencia VL CDR3 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos QQTVVAPPL (SEQ ID NO: 212).
Los anticuerpos anti-Jagged de la invención incluyen anticuerpos que contienen una combinación de una secuencia VH CDRl, una secuencia VH CDR2, una secuencia VH CDR3, una secuencia VL CDRl, una secuencia VL CDR2, y una secuencia VL CDR3, donde al menos una secuencia CDR es seleccionada a partir del grupo consistente de una secuencia VH CDRl que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos SYAMS (SEQ ID NO: 200); una secuencia VH CD2 que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos SIDPEGRQTYYADSVKG (SEQ ID NO: 208); una secuencia VH CDR3 que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos DIGGRSAFDY (SEQ ID NO: 209); una secuencia VL CDRl que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos RASQSISSY (SEQ ID NO: 210); una secuencia VL CDR2 que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos AASSLQS (SEQ ID NO: 211); y una secuencia VL CDR3 que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos QQTVVAPPL (SEQ ID NO: 212).
Los anticuerpos anti-Jagged de la invención incluyen anticuerpos que contienen una secuencia VH CDR1 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos SYAMS (SEQ ID NO: 200); una secuencia VH CD2 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos SIDPEGRQTYYADSVKG (SEQ ID NO: 208); una secuencia VH CDR3 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos DIGGRSAFDY (SEQ ID NO: 209); una secuencia VL CDRl que incluye al menos la secuencia de aminoácidos RASQSISSY (SEQ ID NO: 210); una secuencia VL CDR2 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos AASSLQS (SEQ ID NO: 211); y una secuencia VL CDR3 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos QQTVVAPPL (SEQ ID NO: 212).
Los anticuerpos anti-Jagged de la invención incluyen anticuerpos que contienen una secuencia VH CDRl que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos SYAMS (SEQ ID NO: 200); una secuencia VH CD2 que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos SIDPEGRQTYYADSVKG (SEQ ID NO: 208); una secuencia VH CDR3 que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos DIGGRSAFDY (SEQ ID NO: 209); una secuencia VL CDR1 que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos RASQSISSY (SEQ ID NO: 210); una secuencia VL CDR2 que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos AASSLQS (SEQ ID NO: 211); y una secuencia que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos QQTVVAPPL (SEQ ID NO: 212).
Los anticuerpos anti-Jagged de la invención incluyen anticuerpos que contienen una combinación de una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera que se seleccionan a partir de las combinaciones mostradas en la tabla 4. Los anticuerpos anti-Jagged de la invención incluyen anticuerpos que contienen una combinación de una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera que son al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idénticas a las combinaciones mostradas en la tabla 4.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged incluye una secuencia de cadena ligera que incluye SEQ ID NO: 74. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged incluye una secuencia de cadena ligera que incluye una secuencia de aminoácidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 74. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged incluye una secuencia de cadena pesada que incluye SEQ ID NO: 76. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged incluye una secuencia de cadena pesada que incluye una secuencia de aminoácidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 76. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged incluye una secuencia de cadena ligera que incluye SEQ ID NO: 74, una secuencia de cadena pesada que incluye SEQ ID NO: 76. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged incluye una secuencia de cadena ligera que incluye una secuencia de aminoácidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 76.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged incluye una secuencia de cadena ligera que incluye SEQ ID NO: 54. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged incluye una secuencia de cadena ligera que incluye una secuencia de aminoácidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged incluye una secuencia de cadena pesada que incluye SEQ ID NO: 56. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged incluye una secuencia de cadena pesada que incluye una secuencia de aminoácidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged incluye una secuencia de cadena ligera que incluye SEQ ID NO: 54 y una secuencia de cadena pesada que incluye SEQ ID NO: 56. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged incluye una secuencia de cadena ligera que incluye una secuencia de aminoácidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:56.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged también incluye un agente conjugado a la AB. En algunas realizaciones, el agente es un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el agente es un agente antineoplásico. En algunas realizaciones, el agente es una toxina o un fragmento de la misma. En algunas realizaciones, el agente está conjugado al anticuerpo anti-Jagged a través de un enlazador. En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador escindible. En algunas realizaciones, el agente es un agente seleccionado del grupo mostrado en la tabla 30. En algunas realizaciones, el agente es una dolastatina. En algunas realizaciones, el agente es una auristatina o un derivado de esta. En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina E (MMAE). En algunas realizaciones, el agente es DM1 o DM4. En algunas realizaciones, el agente es una duocarmicina o un derivado de esta. En algunas realizaciones, el agente es una calicheamicina o un derivado de esta.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged también incluye una fragmento detectable. En algunas realizaciones, el fragmento detectable es un agente de diagnóstico.
En algunas realizaciones, el agente anti-Jagged contiene naturalmente uno o más puentes disulfuro. En algunas realizaciones, el agente anti-Jagged puede ser diseñado para incluir uno o más puentes disulfuro.
La invención también proporciona una molécula de ácido nucleico aislada codificando un anticuerpo anti-Jagged aquí descrito, asi como vectores que incluyen estas secuencias de ácido nucleico aisladas. La invención brinda métodos de producción de un anticuerpo anti-Jagged por cultivo de células bajo condiciones que lleven a la expresión del anticuerpo anti-Jagged, donde la célula dispone de tal molécula de ácido nucleico. En algunas realizaciones, la célula dispone de tal vector.
La invención también proporciona anticuerpos activables y composiciones de anticuerpos activables que incluyen un anticuerpo o fragmento de unión al antigeno del mismo que se une específicamente a Jagged 1 y Jagged 2 acoplados o adosados a un fragmento enmascarante (MM), aquel acople de la MM reduce la capacidad del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo para unirse a Jagged 1 y Jagged 2. Estos anticuerpos activables son mencionados colectivamente en este documento como anticuerpos anti-Jagged activables, también mencionados como anticuerpos activables anti-Jagged o anticuerpos Jagged activables. En algunas realizaciones, el MM se encuentra acoplado por medio de una secuencia que incluye un sustrato para una proteasa, por ejemplo, una proteasa que está colocalizada con Jagged 1 y/o Jagged 2 en un sitio de tratamiento o un sitio de diagnóstico en un sujeto. Los anticuerpos anti-Jagged activables proporcionados aquí son estables en circulación, activados en los sitios destinados de terapia y/o diagnóstico pero no en tejido normal, por ejemplo, tejido sano, y cuando se activan, muestran una unión a Jagged 1 y Jagged 2 que es comparable al menos al anticuerpo correspondiente no modificado.
Los anticuerpos anti-Jagged activables de la invención incluyen anticuerpos que contienen una combinación de una secuencia VH CDRl, una secuencia VH CDR2, una secuencia VH CDR3, una secuencia VL CDRl, una secuencia VL CDR2 y una secuencia VL CDR3 que se seleccionan a partir de las combinaciones mostradas en la tabla 2. Los anticuerpos anti-Jagged de la invención incluyen anticuerpos que contienen una combinación de una secuencia VH CDR1, una secuencia VH CFR2k una secuencia VH CDR3, una secuencia VL CDRl, una secuencia VL CDR2 y una secuencia VL CDR3 que son al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idénticas a las secuencias mostradas en la tabla 2.
Los anticuerpos anti-Jagged activables de la invención incluyen anticuerpos que contienen una combinación de una secuencia VH CDRl, una secuencia VH CDR2, una secuencia VH CDR3, una secuencia VL CDRl, una secuencia VL CDR2 y una secuencia VL CDR3 de al menos un anticuerpo seleccionado del grupo consistente del anticuerpo 4D11, el anticuerpo 4B2, el anticuerpo 4E7, el anticuerpo 4E11, el anticuerpo 6B7, y el anticuerpo 6F8. Los anticuerpos anti-Jagged de la invención incluyen anticuerpos que contienen una combinación de una secuencia VH CDRl, una secuencia VH CDR2, una secuencia VH CDR3, una secuencia VL CDRl, una secuencia VL CDR2 y una secuencia VL CDR3 que son al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idénticas a las secuencias CDR respectivas de al menos un anticuerpo seleccionado del grupo consistente del anticuerpo 4D11, el anticuerpo 4B2, el anticuerpo 4E7, el anticuerpo 4E11, el anticuerpo 6B7, y el anticuerpo 6F8.
Los anticuerpos anti-Jagged de la invención incluyen anticuerpos que contienen una combinación de una secuencia VH CDR1, una secuencia VH CDR2, una secuencia VH CDR3, una secuencia VL CDRl, una secuencia VL CDR2 y una secuencia VL CDR3, donde al menos una secuencia CDR es seleccionada a partir del grupo consistente de una secuencia VH CDR1 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos SYAMS (SEQ ID NO: 200); una secuencia VH CD2 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos SIDPEGRQTYYADSVKG (SEQ ID NO: 208); una secuencia VH CDR3 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos DIGGRSAFDY (SEQ ID NO: 209); una secuencia VL CDRl que incluye al menos la secuencia de aminoácidos RASQSISSY (SEQ ID NO: 210); una secuencia VL CDR2 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos AASSLQS (SEQ ID NO: 211); y una secuencia VL CDR3 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos QQTVVAPPL (SEQ ID NO: 212).
Los anticuerpos anti-Jagged de la invención incluyen anticuerpos que contienen una combinación de una secuencia VH CDRl, una secuencia VH CDR2, una secuencia VH CDR3, una secuencia VL CDR 1, una secuencia VL CDR2, y una secuencia VL CDR 3, donde al menos una secuencia CDR es seleccionada a partir del grupo consistente de una secuencia VH CDRl que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos SYAMS (SEQ ID NO: 200); una secuencia VH CDR2 que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos SIDPEGRQTYYADSVKG (SEQ ID NO: 208); una secuencia VH CDR3 que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos DIGGRSAFDY (SEQ ID NO: 209); una secuencia VL CDR1 que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos RASQSISSY (SEQ ID NO: 210); una secuencia VL CDR2 que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos AASSLQS (SEQ ID NO: 211); y una secuencia VL CDR3 que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos QQTVVAPPL (SEQ ID NO: 212).
Los anticuerpos anti-Jagged de la invención incluyen anticuerpos que contienen una secuencia VH CDR1 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos SYAMS (SEQ ID NO: 200); una secuencia VH CDR2 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos SIDPEGRQTYYADSVKG (SEQ ID NO: 208); una secuencia VH CDR3 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos DIGGRSAFDY (SEQ ID NO: 209); una secuencia VL CDR1 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos RASQSISSY (SEQ ID NO 210); una secuencia VL CDR2 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos AASSLQS (SEQ ID NO: 211); y una secuencia VL CDR3 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos QQTVVAPPL (SEQ ID NO: 212).
Los anticuerpos anti-Jagged de la invención incluyen anticuerpos que contienen una secuencia VH CDR1 que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos SYAMS (SEQ ID NO: 200); una secuencia VH CD2 que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos SIDPEGRQTYYADSVKG (SEQ ID NO: 208); una secuencia VH CDR3 que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos DIGGRSAFDY (SEQ ID NO: 209); una secuencia VL CDRl que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos RASQSISSY (SEQ ID NO: 210); una secuencia VL CDR2 que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos AASSLQS (SEQ ID NO: 211); y una secuencia VL CDR3 que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos QQTVVAPPL (SEQ ID NO: 212).
Los anticuerpos anti-Jagged activables de la invención incluyen anticuerpos que contienen una combinación de una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera que se seleccionan a partir de las combinaciones mostradas en la tabla 4. Los anticuerpos anti-Jagged de la invención incluyen anticuerpos que contienen una combinación de una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera son al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idénticas a las combinaciones mostradas en la tabla 4.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged del anticuerpo activable incluye una secuencia de cadena ligera que incluye SEQ ID NO: 74. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged incluye una secuencia de cadena ligera que incluye una secuencia de aminoácidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged incluye una secuencia de cadena pesada que incluye SEQ ID NO: 76. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged incluye una secuencia de cadena pesada que incluye una secuencia de aminoácidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 76. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged incluye una secuencia de cadena ligera que incluye SEQ ID NO: 74 y una secuencia de cadena pesada que incluye SEQ ID NO: 76. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged incluye una secuencia de cadena ligera que incluye una secuencia de aminoácidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74 y una secuencia de cadena pesada que incluye una secuencia de aminoácidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 76.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged incluye una secuencia de cadena ligera que incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo consistente de SEQ ID NO: 74, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144 y 146. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged incluye una secuencia de cadena ligera que incluye una secuencia de aminoácidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo consistente de SEQ ID NO: 74, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144 y 146. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged incluye una secuencia de cadena pesada que incluye una secuencia una secuencia de aminoácidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo consistente de SEQ ID NO: 74, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144 y 146 y una secuencia de cadena pesada que incluye SEQ ID NO: 76 y SEQ ID NO: 148. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged incluye una secuencia de cadena ligera que incluye una secuencia de aminoácidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo consistente de SEQ ID NO: 74, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144 y 146 y una secuencia de cadena pesada que incluye una secuencia de aminoácidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 76 o SEQ ID NO: 148.
Los anticuerpos activables descritos aquí en un estado activado se unen a Jagged 1 y Jagged 2 e incluyen (i) un anticuerpo o un fragmento de unión al antigeno donde (AB) se une específicamente a Jagged 1 y Jagged 2; (ii) una fragmento enmascarante (MM) que inhibe la unión del AB a Jagged 1 y Jagged 2 cuando el anticuerpo activable está en un estado no escindido; y (c) un fragmento escíndible (CM) acoplado al AB, donde el CM es un polipéptido que funciona como sustrato para una proteasa. En algunas realizaciones, el MM está acoplado al AB por medio del CM En algunas realizaciones, el anticuerpo activable tiene el arreglo estructural de N-término a C-término en el estado no escindido como sigue: MM-CM-AB o AB-CM-MM.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable comprende un péptido de enlace entre el MM y el CM.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable comprende un péptido de enlace entre el CM y el AB.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable comprende un primer péptido de enlace (LP1) y un segundo péptido de enlace (LP2), donde el anticuerpo activable tiene el arreglo estructural desde N-término a C-término en el estado no escindido como sigue: MM-LP1-CM-LP2-AB o AB-LP2-CM-LP1-MM. En algunas realizaciones, los dos péptidos de enlace no necesitan ser idénticos entre si.
En algunas realizaciones, al menos una de LPl o LP2 incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo consistente de (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 123) y (GGGS)n (SEQ ID NO: 124), donde n es un entero de al menos uno. En algunas realizaciones, al menos uno de LPl o LP2 incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo consistente de GGSG (SEQ ID NO: 125), GGSGG (SEQ ID NO: 126), GSGSG (SEQ ID NO: 127), GSGGG (SEQ ID NO: 128), GGGSG (SEQ ID NO: 129), y GSSSG (SEQ ID NO: 130).
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable incluye un anticuerpo o fragmento de unión al antigeno del mismo que se une específicamente a Jagged 1 y Jagged 2. En algunas realizaciones, el anticuerpo o el fragmento inmunológicamente activo del mismo que se une a Jagged 1 y Jagged 2 es un anticuerpo monoclonal, anticuerpo de dominio, cadena única, fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un scFv, un scAB, un dAb, un anticuerpo de cadena pesada de dominio único, o un anticuerpo de cadena ligera de dominio único. En algunas realizaciones, como un anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo del mismo que se une a Jagged 1 y Jagged 2 es un anticuerpo monoclonal de roedor (ratón o rata), quimérico, humanizado o completamente humano.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Jagged activados de la descripción (por ejemplo, en estado escindido) pueden ser internalizados luego de la unión a Jagged 1 y/o Jagged 2 expresados en una célula enferma, por ejemplo, en una célula cancerosa o en una célula involucrada en un desorden fibrótico.
En algunas realizaciones, el AB tiene una equilibrio constante de disociación de alrededor de 100 nM o menos para la unión a Jagged 1 y Jagged 2.
En algunas realizaciones, el MM tiene un equilibrio constante de disociación para la unión al ?B que es mayor que el equilibrio constante de disociación del AB para Jagged 1 y Jagged 2.
En algunas realizaciones, el MM tiene un equilibrio constante de disociación para la unión al AB que no es mayor al equilibrio constante de disociación del AB para Jagged 1 y Jagged 2.
En algunas realizaciones, el MM no interfiere o compite con el AB para unirse a Jagged 1 y Jagged 2 cuando el anticuerpo activable está en estado escindido.
En algunas realizaciones, el MM es un polipéptido de alrededor de 2 a 40 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el MM es un polipéptido de no más de 40 aminoácidos de longitud.
En algunas realizaciones, la secuencia de polipéptidos MM es diferente de la del Jagged 1 y Jagged 2, donde la secuencia de polipéptidos MM no es más del 50% idéntico a cualquier compañero de unión natural del AB. En algunas realizaciones, la secuencia de polipéptidos MM es diferente del de Jagged 1 y Jagged 2, donde la secuencia de polipéptidos MM no es más del 25% idéntico a cualquier compañero de unión natural al AB. En algunas realizaciones, la secuencia de polipéptidos MM es diferente del de Jagged 1 y Jagged 2 y donde la secuencia de polipéptidos MM no es más del 10% idéntica a cualquier compañero de unión natural del AB.
En algunas realizaciones, el acoplamiento del MM reduce la capacidad del AB para unirse a Jagged 1 y Jagged 2, de tal modo que la constante de disociación (Kd) del AB al estar acoplado al MM hacia Jagged 1 y Jagged 2 es al menos 20 veces mayor que el Kd del AB cuando no está acoplado al MM hacia Jagged 1 y Jagged 2.
En algunas realizaciones, el acoplamiento del MM reduce la capacidad del AB para unirse a Jagged 1 y Jagged 2, de tal modo que la constante de disociación (Kd) del AB al acoplarse al MM hacia Jagged 1 y Jagged 2 es al menos 40 veces mayor que el Kd del AB cuando no está acoplado al MM hacia Jagged 1 y Jagged 2.
En algunas realizaciones, el acoplamiento del MM reduce la capacidad del AB para unirse a Jagged 1 y Jagged 2, de tal modo que la constante de disociación (Kd) del AB al acoplarse al MM hacia Jagged 1 y Jagged 2 es al menos 100 veces mayor que el Kd del AB cuando no está acoplado al MM hacia Jagged 1 y Jagged 2.
En algunas realizaciones, el acoplamiento del MM reduce la capacidad del AB para unirse a Jagged 1 y Jagged 2, de tal modo que la constante de disociación (Kd) del AB al acoplarse al MM hacia Jagged 1 y Jagged 2 es al menos 1000 veces mayor que el Kd del AB cuando no está acoplado al MM hacia Jagged 1 y Jagged 2.
En algunas realizaciones, el acoplamiento del MM reduce la capacidad del AB para unirse a Jagged 1 y Jagged 2, de tal modo que la constante de disociación (Kd) del AB al acoplarse al MM hacia Jagged 1 y Jagged 2 es al menos 10,000 veces mayor que el Kd del AB cuando no está acoplado al MM hacia Jagged 1 y Jagged 2.
En algunas realizaciones, en presencia de Jagged 1 y Jagged 2, el MM reduce la capacidad del AB para unirse a Jagged 1 y Jagged 2 en al menos 90% cuando el CM no está escindido, comparado a cuando el CM está escindido al ensayar in vitro usando un ensayo de desplazamiento de blanco como, por ejemplo, el ensayo descrito en Documentos PCT de Nos. de publicación. WO 2009/025846 y WO 2010/081173, los contenidos de cada uno de ellos están incorporados en este medio por referencia en su totalidad.
En algunas realizaciones, el MM no interfiere o compite con el AB del anticuerpo activable en un estado escindido para su unión al Jagged objetivo.
En algunas realizaciones, el MM es una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo mencionado en las tablas 9, 11-14, y 20-23.
En algunas realizaciones, la proteasa está co-localizada con Jagged 1 y/o Jagged 2 en un tejido, y la proteasa escinde el CM en el anticuerpo activable cuando el anticuerpo activable es expuesto a la proteasa.
En algunas realizaciones, el CM está posicionado en el anticuerpo activable, de tal forma que en el estado no escindido, la unión del anticuerpo activable a Jagged 1 y Jagged 2 se reduce en ocurrencia con un equilibrio constante de disociación que es al menos 20 veces mayor que el equilibrio constante de disociación de una unión AB no modificado unido a Jagged 1 y Jagged 2, y donde, en estado escindido, el AB se une a Jagged 1 y Jagged 2.
En algunas realizaciones, el CM está posicionado en el anticuerpo activable, de tal forma que en estado no escindido, la unión del anticuerpo activable a Jagged 1 y Jagged 2 se reduce en ocurrencia con un equilibrio constante de disociación que es al menos 40 veces mayor que el equilibrio constante de disociación de un AB no modificado unido a Jagged 1 y Jagged 2, y donde en estado escindido, el AB se une a Jagged 1 y Jagged 2.
En algunas realizaciones, el CM está posicionado en el anticuerpo activable, de tal forma que en estado no escindido, la unión del anticuerpo activable a Jagged 1 y Jagged 2 se reduce en ocurrencia con un equilibrio constante de disociación que es al menos 50 veces mayor que el equilibrio constante de disociación de un AB no modificado unido a Jagged 1 y Jagged 2, y donde en estado escindido, el AB se une a Jagged 1 y Jagged 2.
En algunas realizaciones, el CM está posicionado en el anticuerpo activable, de tal forma que en estado no escindido, la unión del anticuerpo activable a Jagged 1 y Jagged 2 se reduce en ocurrencia con un equilibrio constante de disociación que es al menos 100 veces mayor que el equilibrio constante de disociación de un AB no modificado unido a Jagged 1 y Jagged 2, y donde en estado escindido, el AB se une a Jagged 1 y Jagged 2.
En algunas realizaciones, el CM está posicionado en el anticuerpo activable, de tal forma que en estado no escindido, la unión del anticuerpo activable a Jagged 1 y Jagged 2 se reduce en ocurrencia con un equilibrio constante de disociación que es al menos 200 veces mayor que el equilibrio constante de disociación de un AB no modificado unido a Jagged 1 y Jagged 2, y donde en estado escindido, el AB se une a Jagged 1 y Jagged 2.
En algunas realizaciones, el CM es un polipéptido de más de 15 aminoácidos de longitud.
En algunas realizaciones, el CM incluye la secuencia de aminoácidos LSGRSDNH (SEQ ID NO: 213). En algunas realizaciones, la fragmento escindible es seleccionada para su uso con una proteasa especifica, por ejemplo una proteasa conocida por estar co-localizada con el blanco del anticuerpo activable. Por ejemplo, las porciones escindibles apropiadas para ser usadas en los anticuerpos anti-Jagged activables del reporte son escindidas por al menos una proteasa como urokinasa, legumaina, y/o MT-SP1 (matriptasa) e incluye la secuencia TGRGPSWV (SE Q ID NO: 214); SARGPSRW (SEQ ID NO: 215); TARGPSFK (SEQ ID NO: 216); LSGRSDNH (SEQ ID NO: 213); GGWHTGRN (SEQ ID NO: 217); HTGRSGAL (SEQ ID NO: 218); PLTGRSGG (SEQ ID NO: 219); AARGPA1H (SEQ ID NO: 220); RGPAFNPM (SEQ ID NO: 221); SSRGPAYL (SEQ ID NO: 222); RGPATPIM (SEQ ID NO: 223); RGPA (SEQ ID NO: 224); GGQPSGMWGW (SEQ ID NO: 225); FPRPLGITGL (SEQ ID NO: 226); VHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 227); SPLTGRSG (SEQ ID NO: 228); SAGFSLPA (SEQ ID NO: 229); LAPLGLQRR (SEQ ID NO: 230); SGGPLGVR (SEQ ID NO: 231); y/o PLGL (SEQ ID NO: 232).
En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para una proteasa seleccionada a partir del grupo consistente en los mostrados en la tabla 33. En algunas realizaciones, la proteasa es seleccionada a partir del grupo consistente de uPA, legumaina, MT-SP1, ADAM17, BMP-1, TMPRSS3, TMPRSS4, MMP-9, MMP-12, MMP-13, y MMP-14. En algunas realizaciones, la proteasa es una catepsina. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para una proteasa seleccionada a partir del grupo consistente de uPA (activador del plasminógeno urokinasa), legumaina y MT-SP1 (matriptasa). En algunas realizaciones, la proteasa comprende uPA. En algunas realizaciones, la proteasa comprende legumaína. En algunas realizaciones, la proteasa comprende MT-SP1. En algunas realizaciones, la proteasa comprende una matriz de metaloproteinasa (MMP).
En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para al menos dos proteasas. En algunas realizaciones, cada proteasa es seleccionada a partir del grupo consistente de aquellas que se muestran en la tabla 33. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para al menos dos proteasas, donde una de las proteasas es seleccionada a partir del grupo consistente de uPA, legumaína y MT-SP1 y la otra proteasa es seleccionada a partir del grupo mostrado en la tabla 33. En algunas realizaciones, el CM es un sustrato para al menos dos proteasas seleccionadas del grupo consistente de uPA, legumaína y MT-SP1.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable incluye al menos un primer CM y un segundo CM. En algunas realizaciones, el primer CM y el segundo CM son ambos polipéptidos de no más de 15 aminoácidos de largo. En algunas realizaciones, el primer CM y el segundo CM en el anticuerpo activable tienen el arreglo estructural desde el N-terminal al C-terminal en el estado no escindido como sigue: MM-CM1-CM2-AB o AB-CM2-CM1-MM. En algunas realizaciones, al menos uno del primer CM y el segundo CM es un polipéptido que funciona como sustrato para una proteasa seleccionada a partir del grupo consistente de uPA, legumaína y MT-SPl. En algunas realizaciones, el primer CM es escindido por un primer agente de escisión en un tejido blanco. En algunas realizaciones, la otra proteasa es seleccionada a partir del grupo consistente de aquellos mostrados en la tabla 33. En algunas realizaciones, el primer agente de escisión y el segundo agente de escisión son la misma proteasa seleccionada a partir del grupo consistente de uPA, legu aina y MT-SPl, y el primer CM y el segundo CM son sustratos diferentes para la enzima. En algunas realizaciones, el primer agente de escisión y el segundo agente de escisión son la misma proteasa seleccionada a partir del grupo consistente de aquellas mostradas en la tabla 33. En algunas realizaciones, el primer agente de escisión y el segundo agente de escisión son diferentes proteasas. En algunas realizaciones, el primer agente de escisión y el segundo agente de escisión están colocalizadas en el tejido blanco. En algunas realizaciones, el primer CM y el segundo CM están escindidos por al menos un agente de escisión en el tejido blanco.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable está expuesto a y escindido por una proteasa de tal forma que, en estado activado o escindido, el anticuerpo activado incluye una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que incluye al menos un fragmento de LP2 y/o secuencia CM después de que la proteasa ha escindido la CM.
En algunas realizaciones, el MM y el CM incluyen una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo consistente de SEQ ID NO: 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, y 196.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activadle también incluye un péptido señal. En algunas realizaciones, el péptido señal está conjugado con el anticuerpo activadle por intermedio de un espaciador. En algunas realizaciones, el espaciador está conjugado con el anticuerpo activadle en ausencia de un péptido señal. En algunas realizaciones, el espaciador está unido directamente al MM del anticuerpo activable.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable en estado no escindido comprende un espaciador que está unido directamente al MM y tiene el arreglo estructural desde N-terminal hasta C-terminal del espaciador-MM-CM-AB. En algunas realizaciones, el espaciador incluye al menos la secuencia de aminoácidos QGQSGQ (SEQ ID NO: 233). En algunas realizaciones, el MM y el espaciador incluyen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 180. En algunas realizaciones, el MM y el espaciador incluyen la secuencia de aminoácidos QGQSGQCNIWLVGGDCRGWQG (SEQ ID NO: 234).
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable también incluye un agente conjugado con el AB. En algunas realizaciones, el agente es un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el agente es un agente antineoplásico. En algunas realizaciones, el agente es una toxina o un fragmento de ésta. En algunas realizaciones, el agente está conjugado con el AB por medio de un enlazador. En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador escindible. En algunas realizaciones, el agente es un agente seleccionado del grupo mostrado en la tabla 30. En algunas realizaciones, el agente es una dolastatina. En algunas realizaciones, el agente es una auristatina o un derivado de ésta. En algunas realizaciones, el agente es auristatina E o un derivado de ésta. En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina E (MMAE). En algunas realizaciones, el agente es un maitansinoide o un derivado de maitansinoide. En algunas realizaciones, el agente es DM1 o DM4. En algunas realizaciones, el agente es una duocarmicina o un derivado de ésta. En algunas realizaciones, el agente es una calicheamicina o un derivado de ésta.
En algunas realizaciones, el anticuerpo activable también incluye un fragmento detectable. En algunas realizaciones, el fragmento detectable es un agente de diagnóstico.
En algunas realizaciones, el AB del anticuerpo activable contiene naturalmente uno o más puentes disulfuro. En algunas realizaciones, el AB puede ser diseñado para incluir uno o más puentes disulfuro.
En algunas realizaciones, la vida media sérica del anticuerpo activable es al menos 5 dias cuando es administrada a un organismo. En algunas realizaciones, la vida media sérica del anticuerpo activable es de al menos 4 dias al administrarse a un organismo. En algunas realizaciones, la vida media sérica del anticuerpo activable es de al menos 4 dias al administrarse a un organismo. En algunas realizaciones, la vida media sérica del anticuerpo activable es de al menos 3 dias al administrarse a un organismo. En algunas realizaciones, la vida media sérica del anticuerpo activable es de al menos 2 dias al administrarse a un organismo. En algunas realizaciones, la vida media sérica del anticuerpo activa le es de al menos 24 horas al administrarse a un organismo. En algunas realizaciones, la vida media sérica del anticuerpo activable es de al menos 20 horas al administrarse a un organismo. En algunas realizaciones, la vida media sérica del anticuerpo activable es de al menos 18 horas al administrarse a un organismo. En algunas realizaciones, la vida media sérica del anticuerpo activable es de al menos 16 horas al administrarse a un organismo. En algunas realizaciones, la vida media sérica del anticuerpo activable es de al menos 14 horas al administrarse a un organismo. En algunas realizaciones, la vida media sérica del anticuerpo activable es de al menos 12 horas al administrarse a un organismo. En algunas realizaciones, la vida media sérica del anticuerpo activable es de al menos 10 horas al administrarse a un organismo. En algunas realizaciones, la vida media sérica del anticuerpo activable es de al menos 8 horas al administrarse a un organismo. En algunas realizaciones, la vida media sérica del anticuerpo activable es de al menos 6 horas al administrarse a un organismo. En algunas realizaciones, la vida media sérica del anticuerpo activable es de al menos 4 horas al administrarse a un organismo. En algunas realizaciones, la vida media sérica del anticuerpo activable es de al menos 3 horas al administrarse a un organismo.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged activable y/o el anticuerpo anti-Jagged activable conjugado es monoespecifico. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged activable y/o el anticuerpo anti-Jagged activable conjugado es multiespecifico, por ejemplo, por vía de un ejemplo no limitante, biespecifico o trifuncional. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged activable y/o el anticuerpo anti-Jagged activable conjugado es formulado como parte de una molécula acopladora pro-Biespecifica de células T (BITE). En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged activable y/o el anticuerpo anti-Jagged activable conjugado es formulado como parte de un receptor de antígeno pro-quimérico (CAR) modificado de célula T u otro receptor diseñado.
El reporte también proporciona las composiciones y métodos que incluyen un anticqerpo anti-Jagged activadle que incluye un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (AB) que se une específicamente a un Jagged blanco (por ejemplo Jagged 1 y/o Jagged 2), donde el AB está acoplado a una fragmento enmascarante (MM) que disminuye la capacidad del AB para unirse a su blanco. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged activable incluye adicionalmente un fragmento escindible (CM) que es un sustrato para una proteasa. Las composiciones y métodos proporcionados aquí permiten el endose de uno o más agentes a uno o más residuos de cisteína en el AB sin comprometer la actividad (por ejemplo, el enmascarado, la activación o la actividad de unión) del anticuerpo anti-Jagged activable. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos proporcionados aquí permiten el endose de uno o más agentes a uno o más residuos de cisteína en el AB sin reducir o alterar uno o más puentes disulfuro dentro del MM. Las composiciones y métodos proporcionados aquí producen un anticuerpo anti-Jagged activable que es conjugado a uno o más agentes, por ejemplo, cualquiera de una variedad de agentes terapéuticos, diagnósticos y/o profilácticos, preferiblemente sin los agentes estando conjugados al MM del anticuerpo anti- Jagged activable. Las composiciones y métodos proporcionados aquí producen anticuerpo anti-Jagged activables en los cuales el MM retiene la capacidad de enmascarar efectiva y eficientemente el AB del anticuerpo activable en un estado no escindido. Las composiciones y métodos proporcionados aquí producen anticuerpos anti-Jagged activables conjugados en los que el anticuerpo activable sigue activado, por ejemplo, escindido, en presencia de una proteasa que puede escindir el CM.
Los anticuerpos anti-Jagged activables tienen al menos un punto de conjugación para un agente, pero en los métodos y composiciones proporcionados aqui, menos que todos los posibles puntos de conjugación están disponibles para la conjugación a un agente. En algunas realizaciones, uno o más puntos de conjugación son átomos de azufre involucrados en puentes disulfuro. En algunas realizaciones, uno o más puntos de conjugación son átomos de azufre involucrados en enlaces disulfuro entre cadenas. En algunas realizaciones, uno o más puntos de conjugación son átomos de azufre de cisteina u otro residuo de aminoácido conteniendo un átomo de azufre. Tales residuos pueden presentarse naturalmente en la estructura del anticuerpo o pueden ser incorporados en el anticuerpo por medio de mutagénesis sitio-dirigida, conversión química o incorporación errónea de aminoácidos no naturales.
También se proporcionan métodos para preparar un conjugado de un anticuerpo anti-Jagged activable teniendo uno o más puentes disulfuro entre cadena en el AB y uno o más puentes disulfuro entre cadena en el MM, y se proporciona un fármaco reactivo con tioles libres. El método incluye generalmente puentes disulfuro entre cadena parcialmente reductores en el anticuerpo activable con un agente reductor, como por ejemplo TCEP, y conjugando el fármaco reactivo con tioles libres al anticuerpo activable parcialmente reducido. Como se usó aquí, el término reducción parcial se refiere a situaciones donde un anticuerpo anti-Jagged activable entra en contacto con un agente reductor, y menos de todos los puentes disulfuro, por ejemplo, menos de todos los sitios posibles de conjugación son reducidos. En algunas realizaciones, menos del 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% o menos del 5% de todos los sitios posibles de conjugación están reducidos.
En otras realizaciones, se proporciona un método para reducir y conjugar un agente, por ejemplo, un fármaco, a un anticuerpo anti-Jagged activable, resultando en la selectividad en la ubicación del agente. El método incluye generalmente anticuerpos anti-Jagged activables parcialmente reductores con un agente reductor de tal forma que cualquier sitio de conjugación en la fragmento enmascarante u otra fragmento no-AB del anticuerpo activable no es reducida, y conjugando el agente con tioles intracatenarios en el AB. Los sitios de conjugación son seleccionados para permitir la ubicación deseada de un agente y para permitir que ocurra la conjugación en un sitio deseado. El agente reductor es, por ejemplo, TCEP. Se determinaron las condiciones de la reacción de reducción como, por ejemplo, la tasa de agente reductor para el anticuerpo activable, la duración de la incubación, la temperatura durante la incubación, el pH de la solución de reacción reductora, etc, identificando las condiciones que producen un anticuerpo conjugado activable en el que el MM retiene la capacidad de enmascarar efectiva y eficientemente el AB del anticuerpo activable en un estado no escindido. La tasa de agente e reducción para el anticuerpo anti-Jagged activable variará dependiendo del anticuerpo activable. En algunas realizaciones, la tasa de agente reductor para el anticuerpo anti-Jagged activable estará en el rango de alrededor de aproximadamente 20:1 a 1:1, de aproximadamente 10:1 a 1:1, de aproximadamente 9:1 a 1:1, de aproximadamente 8:1 a 1:1, de aproximadamente 7:1 a 1:1, de aproximadamente 6:1 a 1:1, de aproximadamente 5:1 a 1:1, de aproximadamente 4:1 a 1:1, de aproximadamente 3:1 a 1:1, de aproximadamente 2:1 a 1:1, de aproximadamente 20:1 a 1:1.5, de aproximadamente 10:1 a 1:1.5, de aproximadamente 9:1 a 1:1.5 de aproximadamente 8:1 a 1:1.5, de aproximadamente 7:1 a 1:1.5, de aproximadamente 6:1 a 1:1.5, de aproximadamente 5:1 a 1:5, de aproximadamente 4:1 a 1:1.5, de aproximadamente 3:1 a 1:1.5, de aproximadamente 2:1 a 1:1.5, de aproximadamente 1.5:1 a 1:1.5 o de aproximadamente 1:1 a 1:1.5. En algunas realizaciones, la tasa se encuentra en un rango de aproximadamente 5:1 a 1:1. En algunas realizaciones, la tasa se encuentra en un rango de aproximadamente 5:1 a 1.5:1. En algunas realizaciones, la tasa se encuentra en un rango de aproximadamente 4:1 a 1:1. En algunas realizaciones, la tasa se encuentra en un rango de aproximadamente 4:1 a 1.5:1.
En algunas realizaciones, se proporciona un método para reducir los puentes disulfuro intracatenarios en el AB de un anticuerpo anti-Jagged activable y conjugando un agente, por ejemplo, un agente conteniendo tiol como un fármaco, con los tioles intracatenarios resultantes para ubicar selectivamente a los agentes sobre el AB. El método generalmente incluye la reducción parcial del AB con un agente reductor para formar al menos dos tioles intracatenarios sin formar todos los tioles intracatenarios posibles en el anticuerpo activable, y conjugando el agente a los tioles intracatenarios del AB parcialmente reducido. Por ejemplo, el AB del anticuerpo activable está parcialmente reducido durante 1 hora aproximadamente a 37°C en una tasa deseada de agente reductor: anticuerpo activable. En algunas realizaciones, La tasa de agente reductor para el anticuerpo activable estará en el rango de aproximadamente 20:1 a 1:1, de aproximadamente 10:1 a 1:1, de aproximadamente 9:1 a 1:1, de aproximadamente 8:1 a 1:1, de aproximadamente 7:1 a 1:1, de aproximadamente 6:1 a 1:1, de aproximadamente 5:1 a 1:1, de aproximadamente 4:1 a 1:1, de aproximadamente 3:1 a 1:1, de aproximadamente 2:1 a 1:1, de aproximadamente 20:1 A 1:1.5, de aproximadamente 10:1 a 1:1.5, de aproximadamente 9:1 a 1:1.5, de aproximadamente 8:1 a 1:1.5, de aproximadamente 7:1 a 1:1.5, de aproximadamente 6:1 a 1:1.5, de aproximadamente 5:1 a 1:1.5, de aproximadamente 4:1 a 1:1.5, de aproximadamente 3:1 a 1:1.5, de aproximadamente 2:1 a 1:1.5, de aproximadamente 5:1 a 1:1. En algunas realizaciones, La tasa se encuentra en un rango de aproximadamente 5:1 a 1.5:1. En algunas realizaciones, La tasa se encuentra en el rango de aproximadamente 4:1 a 1:1. En algunas realizaciones, La tasa se encuentra en un rango de aproximadamente 4:1 a 1.5:1.
El reactivo conteniendo tiol puede ser, por ejemplo, cisteina o N-acetil cisteina. El agente reductor puede ser, por ejemplo, TCEP. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable reducido puede ser purificado antes de la conjugación usando, por ejemplo, cromatografía por columnas, diálisis o diafiltración. Alternativamente, el anticuerpo reducido no es purificado después de la reducción parcial y antes de la conjugación.
La invención también proporciona anticuerpos anti-Jagged activables parcialmente reducidos en los cuales al menos un puente disulfuro intracatenario en el anticuerpo activable ha sido reducido con un agente reductor sin alterar cualquier puente disulfuro intracatenario en el anticuerpo activable, en el que el anticuerpo activable incluye un anticuerpo o un fragmento de unión al antigeno del mismo (AB) que se une específicamente al Jagged objetivo (por ejemplo Jagged 1 y/o Jagged 2), una fragmento de enmascaramiento (MM) que inhibe la unión del AB del anticuerpo activable en un estado no escindido al Jagged objetivo, y un fragmento escindible (CM) acoplada al AB, en el que el CM es un polipéptido que funciona como un sustrato para una proteasa. En algunas realizaciones, el MM es acoplado al AB por medio del CM. En algunas realizaciones, uno o más puentes disulfuro intracatenarios del anticuerpo activable no está alterado por el agente reductor. En algunas realizaciones, uno o más puentes disulfuro del MM dentro del anticuerpo activable no está alterado por el agente reductor. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable en el estado no escindido tiene el arreglo estructural desde N-terminal a C-terminal como sigue: MM-CM-AB o AB-CM-MM. En algunas realizaciones, el agente reductor es el TCEP.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Jagged y/o los anticuerpos anti-Jagged activables descritos aquí son usados en conjunto con uno o más agentes adicionales o una combinación de agentes adicionales. Los agentes adicionales apropiados incluyen terapias farmacéuticas y/o quirúrgicas actuales para una solicitud prevista como, por ejemplo, cáncer. Por ejemplo, los anticuerpos anti-Jagged y/o anticuerpos anti-Jagged activables pueden usarse junto con un agente adicional quimioterapéutico o anti-neoplásico. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el agente quimioterapéutico adicional es la gemcitabina.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged y/o anticuerpo anti-Jagged activable y un agente adicional son formulados en una composición terapéutica única, y el anticuerpo anti-Jagged y/o anticuerpo anti-Jagged activable y el agente adicional son administrados simultáneamente. Alternativamente, el anticuerpo anti-Jagged y/o el anticuerpo anti-Jagged activable y el agente adicional están separados uno del otro, por ejemplo, cada uno está formulado en una composición terapéutica separada, y el anticuerpo anti-Jagged y/o el anticuerpo anti-Jagged activable y el agente adicional son administrados simultáneamente, o el anticuerpo anti-Jagged y/o anticuerpo anti-Jagged activable y el agente adicional son administrados en momentos diferentes durante un régimen de tratamiento. Por ejemplo, el anticuerpo anti-Jagged y/o anticuerpo anti-Jagged activable es administrado antes de la administración del agente adicional, el anticuerpo anti-Jagged y/o anticuerpo anti-Jagged activable es administrado luego de la administración del agente adicional, o el anticuerpo anti-Jagged y/o anticuerpo anti-Jagged activable y el agente adicional son administrados de manera alternada. Como aquí se describe, el anticuerpo anti-Jagged y/o anticuerpo anti-Jaged activable y el agente adicional son administrados en dosis únicas o en dosis múltiples.
La invención también provee una molécula aislada de ácido nucleico codificando un anticuerpo anti-Jagged activable descrito aquí, asi como los vectores que incluyen estas secuencias aisladas de ácido nucleico. La invención proporciona métodos de producción de un anticuerpo activable por cultivo celular bajo condiciones que propician la expresión del anticuerpo activable, donde la célula incluye aquella molécula de ácido nucleico. En algunas realizaciones, la célula incluye tal vector.
La invención también proporciona un método de producir anticuerpos activadles que unen Jagged 1 y Jagged 2 en un estado activado mediante (a) cultivos celulares incluyendo un constructo de ácido nucleico que codifica el anticuerpo activable bajo condiciones que llevan a la expresión del anticuerpo activable, donde el anticuerpo activable comprende una fragmento enmascarante (MM), un fragmento escindible (CM), y un anticuerpo o un fragmento de unión de tal antigeno (AB) que une específicamente Jagged 1 y Jagged 2, y (b) recuperando el anticuerpo activable.
La invención también proporciona un método de producción de anticuerpos activables que unen Jagged 1 y Jagged 2 en un estado activado mediante (a) el cultivo celular que incluye un constructo de ácido nucleico que codifica el anticuerpo activable bajo condiciones que llevan a la expresión del anticuerpo activable, donde el anticuerpo activable incluye una fragmento enmascarante (MM), un fragmento escindible (CM) y un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo (AB) que une específicamente Jagged 1 y Jagged 2, (i) donde el CM es un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que funciona como un sustrato para una proteasa; y (íi) donde el CM está ubicado en el anticuerpo activable de tal forma que, en estado no escindido, el MM interfiere con la unión específica del AB a Jagged 1 y Jagged 2 y en un estado escindido el MM no interfiere o compite con la unión específica del AB a Jagged 1 y Jagged 2; y (b) recuperando el anticuerpo activable.
La presente invención también proporciona métodos para tratar, prevenir, retrasar la progresión o de otra manera mejorando un síntoma de patologías asociadas con actividad aberrante de Jagged 1 y/o Jagged 2 (por ejemplo, señalización aberrante, incluyendo señalización aberrante a través de los receptores Notch), o aliviando un síntoma asociado con aquellas patologías, administrando un anticuerpo y/o un anticuerpo activable de la invención a un individuo en el que se desee aquel tratamiento o prevención. La invención también proporciona métodos para reducir, inhibir o de otra manera modular la angiogénesis en un individuo usando los anticuerpos anti-Jagged y/o anticuerpos anti-Jagged activables descritos aquí. El individuo a ser tratado es, por ejemplo, humano u otro mamífero. En algunas realizaciones, el individuo es un mamífero no humano, como un primate no humano, animal de compañía (por ejemplo gato, perro, caballo), animal de granja, animal de trabajo, o animal de zoológico. En algunas realizaciones, el individuo es un roedor.
El anticuerpo anti-Jagged y/o anticuerpo anti-Jagged activable es administrado en una cantidad suficiente para tratar, prevenir o aliviar un síntoma asociado con la patología. La cantidad de anticuerpo y/o anticuerpo activable suficiente para tratar o prevenir la patología en el individuo es, por ejemplo, una cantidad suficiente para reducir la señalización de Jagged 1 y/o Jagged 2 (por ejemplo, la señalización mediada por Jagged 1 a través de los receptores Notch y/o señalización mediada por Jagged 2 a través de los receptores Notch). Como se usó aquí, el término "reducido" se refiere al descenso de la señalización a través de uno o más receptores Notch en la presencia de un anticuerpo monoclonal y/o un anticuerpo activadle de la invención. La señalización mediada por Jagged 1 y/o Jagged 2 disminuye cuando el nivel de señalización a través de uno o más receptores Notch en la presencia de un anticuerpo anti-Jagged y/o un anticuerpo activable de la invención es mayor a o igual al 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 99%, o 100% menor que un nivel de control de señalización a través de uno o más receptores Notch (por ejemplo, el nivel de señalización a través de uno o más receptores Notch en la ausencia del anticuerpo monoclonal). El nivel de señalización a través de uno o más receptores Notch es medido usando una variedad de téenicas estándar, tal como por medio de un ejemplo no limitante, la medición de la activación genética descendente como Hcy y Hes, y/o ensayos de reportero luciferasa sensible a la activación del receptor Notch. Los expertos pueden apreciar que el nivel de señalización a través de uno o más receptores Notch puede medirse usando una variedad de ensayos incluyendo, por ejemplo, kits comercialmente disponibles.
Las patologías tratadas y/o prevenidas y/o para las que se retrasa la progresión y/ para las que un síntoma es mejorado usando los anticuerpos anti-Jagged, anticuerpos anti-Jagged activables y/o anticuerpos anti-Jagged activables conjugados de la invención incluyen, por ejemplo, el cáncer. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Jagged, anticuerpos anti-Jagged activables, y anticuerpos anti-Jagged activables de la invención son usados para tratar, prevenir, retrasar la progresión y/o mejorar un síntoma de una patología como por ejemplo leucemias, incluyendo la leucemia linfoblástica aguda de células T (T-ALL), enfermedades linfoblásticas incluyendo mieloma múltiple y tumores sólidos, incluyendo cáncer pulmonar, colorectal, de próstata, pancreático y de mamas, incluyendo cáncer de mama triple negativo. Además, debido a que la señalización Notch es importante para la sobrevivencia y crecimiento de las células madre cancerosas, la inhibición de la señalización Notch dependiente de Jagged impactaría el crecimiento de las células madre y su sobrevivencia.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Jagged, anticuerpos anti-Jagged activables y/o anticuerpos anti-Jagged activables conjugados de la invención son usados para tratar, prevenir, retrasar la progresión y/o mejorar un síntoma de una patología como por ejemplo enfermedades óseas o métastasis en cáncer, sin importar el origen primario del tumor.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Jagged, anticuerpos anti-Jagged activables y/o anticuerpos anti-Jagged activables conjugados de la invención son usados para tratar, prevenir, retrasar la progresión y/o mejorar un síntoma de una patología como por ejemplo cáncer de mama, por medio de un ejemplo no limitante, cáncer de mama ER/PR+, cáncer de mama Her2+, cáncer de mama triple negativo.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Jagged, anticuerpos anti-Jagged activadles y/o anticuerpos anti-Jagged activables conjugados de la invención son usados para tratar, prevenir, retrasar la progresión y/o mejorar un síntoma de una patología como por ejemplo cáncer colorectal.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Jagged, anticuerpos anti-Jagged activables y/o anticuerpos anti-Jagged activables conjugados de la invención son usados para tratar, prevenir, retrasar la progresión y/o mejorar un síntoma de una patología como, por ejemplo, cáncer gástrico.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Jagged, anticuerpos anti-Jagged activables y/o anticuerpos anti-Jagged activables conjugados de la invención son usados para tratar, prevenir, retrasar la progresión y/o mejorar un síntoma de una patología como, por ejemplo, glioblastoma.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Jagged, anticuerpos anti-Jagged activables y/o anticuerpos anti-Jagged activables conjugados de la invención son usados para tratar, prevenir, retrasar la progresión y/o mejorar un síntoma de una patología como, por ejemplo, cáncer en cabeza y cuello.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Jagged, anticuerpos anti-Jagged activables y/o anticuerpos anti-Jagged activables conjugados de la invención son usados para tratar, prevenir, retrasar la progresión y/o mejorar un síntoma de una patología como por ejemplo cáncer de pulmón, por medio de un ejemplo no limitante, cáncer de células no pequeñas de pulmón.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Jagged, anticuerpos anti-Jagged activables y/o anticuerpos anti-Jagged activables conjugados de la invención son usados para tratar, prevenir, retrasar la progresión y/o mejorar un síntoma de una patología como, por ejemplo, mieloma múltiple.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Jagged, anticuerpos anti-Jagged activables y/o anticuerpos anti-Jagged activables conjugados de la invención son usados para tratar, prevenir, retrasar la progresión y/o mejorar un síntoma de una patología como, por ejemplo, cáncer de ovario.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Jagged, anticuerpos anti-Jagged activables y/o anticuerpos anti-Jagged activables conjugados de la invención son usados para tratar, prevenir, retrasar la progresión y/o mejorar un síntoma de una patología como, por ejemplo, cáncer de páncreas.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Jagged, anticuerpos anti-Jagged activables y/o anticuerpos anti-Jagged activables conjugados de la invención son usados para tratar, prevenir, retrasar la progresión y/o mejorar un síntoma de una patología como, por ejemplo, cáncer de próstata.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Jagged, anticuerpos anti-Jagged activables y/o anticuerpos anti-Jagged activables conjugados de la invención son usados para tratar, prevenir, retrasar la progresión y/o mejorar un síntoma de una patología como, por ejemplo, sarcoma.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Jagged, anticuerpos anti-Jagged activables y/o anticuerpos anti-Jagged activables conjugados de la invención son usados para tratar, prevenir, retrasar la progresión y/o mejorar un síntoma de una patología como, por ejemplo, cáncer renal, por medio de un ejemplo no limitante, carcinoma de células renales.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Jagged, anticuerpos anti-Jagged activables y/o anticuerpos anti-Jagged activables conjugados de la invención son usados para tratar, prevenir, retrasar la progresión y/o mejorar un síntoma de una patología como, por ejemplo, cáncer de piel, por medio de un ejemplo no limitante, cáncer de células escamosas, carcinoma de células básales, melanoma.
En adición al cáncer, la señalización Notch dependiente de Jagged es crítica para la diferenciación epitelial y de fibroblastos para los miofibroblastos, células con un rol central en el desarrollo de la enfermedad fibrótica. La inhibición de la señalización Notch dependiente de Jagged, y por lo tanto, la inhibición de la emergencia de miofibroblastos, seria un efectivo tratamiento para las enfermedades fibróticas del riñón, hígado, pulmón y piel. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Jagger, anticuerpos anti-Jagged activables y/o anticuerpos anti-Jagged activables conjugados son usados para tratar un desorden fibrótico, como fibrosis pulmonar idiopática (IPF).
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Jagged, anticuerpos anti-Jagged activables y/o anticuerpos anti-Jagged activables conjugados de la invención son usados para tratar, prevenir, retrasar la progresión y/o mejorar un síntoma de una patología como, por ejemplo, enfermedad fibrótica.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Jagged, anticuerpos anti-Jagged activables y/o anticuerpos anti-Jagged activables conjugados de la invención son usados para tratar, prevenir, retrasar la progresión y/o mejorar un síntoma de una patología como, por ejemplo, fibrosis pulmonar idiopática, enfermedad fibrótica renal, enfermedad fibrótica hepática, fibrosis inducida por diálisis peritoneal, escleroderma.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Jagged, anticuerpos anti-Jagged activables y/o anticuerpos anti-Jagged activables conjugados de la invención son usados para tratar, prevenir, retrasar la progresión y/o mejorar un síntoma de una patología como, por ejemplo, pérdida de audición.
Un anticuerpo anti-Jagged, anticuerpo anti-Jagged activadle y/o anticuerpo anti-Jagged activable conjugado usado en cualquiera de las realizaciones de estos métodos y usos puede ser administrado en cualquier estadio de la enfermedad. Por ejemplo, tal anticuerpo anti-Jagged, anticuerpo anti-Jagged activable y/o anticuerpo anti-Jagged activable conjugado puede ser administrado a un paciente sufriendo de cáncer de cualquier estadio, desde temprano hasta metastásico. Los términos individuo y paciente aquí son usados de manera intercambiable.
Un anticuerpo anti-Jagged, anticuerpo anti-Jagged activable y/o anticuerpo anti-Jagged activable conjugado usado en cualquiera de las realizaciones de estos métodos y usos puede ser usado en un régimen de tratamiento comprendiendo terapia con neoadyuvantes.
Un anticuerpo anti-Jagged, anticuerpo anti-Jagged activable y/o anticuerpo anti-Jagged activable conjugado usado en cualquiera de las realizaciones de estos métodos y usos puede ser administrado sólo o en combinación con uno o más agentes quimioterapéuticos o biológicos.
La invención también proporciona métodos y kits para usar los anticuerpos anti-Jagged y/o anticuerpos anti-Jagged activables en una variedad de diagnósticos y/o indicaciones profilácticas. Por ejemplo, la invención proporciona métodos y kits para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión y un blanco de interés en un paciente o una muestra mediante (i) contacto con un individuo o muestra con un anticuerpo anti-Jagged activable, donde el anticuerpo anti-Jagged activable comprende una fragmento enmascarante (MM), un fragmento escindible (CM) que es escindida por el agente de escisión, y un dominio de unión al antigeno o fragmento de éste (AB) que se une específicamente al blanco de interés, donde el anticuerpo anti-Jagged activable en un estado no escindido, no activado incluye un arreglo estructural de N-terminal a C-terminal como sigue: MM-CM-AB o AB-CM-MM; (a) donde el MM es un péptido que inhibe la unión del AB al Jagged blanco, y donde el MM no tiene una secuencia de aminoácidos de un compañero de unión natural del AB y no es una forma modificada de un compañero de unión natural del AB; y (b) donde, en un estado no escindido y no activado, el MM no interfiere o compite con la unión específica del AB al Jagged blanco; y (ii) midiendo el nivel de anticuerpos anti-Jagged activables en el paciente o muestre, donde el nivel detectable de anticuerpo anti-Jagged activable activado en el paciente o muestra indica que el agente de escisión y un Jagged blanco están presentes en el paciente o muestra y donde el nivel no detectable de anticuerpos anti-Jagged actívables activados en el paciente o muestra, indica que el agente de escisión, un Jagged blanco o el agente de escisión y un Jagged blanco están ausentes y/o no suficientemente presentes en el paciente o la muestra.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged activable es un anticuerpo anti-Jagged activable al que se le ha conjugado un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged activable no está conjugado con un agente. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged activable comprende una marca detectadle. En algunas realizaciones, la marca detectable está ubicada sobre el AB. En algunas realizaciones, la medición del nivel de anticuerpos anti-Jagged actívables en el paciente o muestra es realizada usando un reactivo secundario que se une específicamente al anticuerpo activado, donde el reactivo incluye una marca detectable. En algunas realizaciones, el reactivo secundario es un anticuerpo incluyendo una marca detectable.
En algunas realizaciones de estos métodos y kits, el anticuerpo anti-Jagged activable incluye una marca detectable. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, la marca detectable incluye un agente de imagen, un agente de contraste, una enzima, una marca fluorescente, un cromoforo, un pigmento, uno o más iones metálicos, una marca basada en ligando. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, el agente de imagen comprende un radioisótopo. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, el agente contrastante comprende yodo, gadolinio u óxido de hierro. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, la enzima comprende peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina o b-galactosidasa. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, la marca fluorescente comprende proteina amarilla fluorescente (YPF), proteina cían fluorescente (CFP), proteina verde fluorescente (GFP), proteina modificada rojo fluorescente (mRFP), proteina rojo fluorescente tdimer2 (RFP tdimer2), HCRED, o un derivado de europio. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, la marca luminiscente comprende un derivado del N-metilacridium. En algunas realizaciones de estos métodos, la marca comprende una marca Alexa Fluor®, como Fluor® 680 o Alexa Fluor® 750. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, la marca basada en ligando comprende biotina, avidina, estreptavidina o uno o más haptenos.
En algunas realizaciones de estos métodos y kits, el paciente es un mamífero. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, el paciente es un humano. En algunas realizaciones, el paciente es un mamífero no humano, como un primate no humano, animal de compañía (por ejemplo gato, perro, caballo), animal de granja, animal de trabajo o animal de zoológico. En algunas realizaciones, el paciente es un roedor.
En algunas realizaciones de estos métodos, el método es un método in vivo. En algunas realizaciones de estos métodos, el método es un método in situ. En algunas realizaciones de estos métodos, el método es un método ex vivo. En algunas realizaciones de estos métodos, el método es un método in vi tro.
En algunas realizaciones de los métodos y kits, el método o kit es usado para identificar o de otra manera seleccionar una población de pacientes adecuados para el tratamiento con anticuerpos anti-Jagged activables del reporte. Por ejemplo, pacientes que dieron positivo para ambos blancos (por ejemplo Jagged 1 y/o Jagged 2) y una proteasa que escinde el sustrato en la fragmento escindible (CM) del anticuerpo anti-Jagged activable siendo evaluado en estos métodos son identificados como candidatos adecuados para el tratamiento con tal anticuerpo anti-Jagged activable comprendiendo tal CM. De la misma forma, los pacientes que dieron negativo para ambos blancos (por ejemplo Jagged 1 y/o Jagged 2) y la proteasa que escinde el sustrato en el CM en el anticuerpo activable siendo evaluado usando estos métodos deben ser identificados como candidatos adecuados para otra forma de terapia.
En algunas realizaciones, un método o kit es usado para identificar o de otra manera seleccionar una población de pacientes adecuados para el tratamiento con un anticuerpo anti- Jagged activable y/o anticuerpo anti-Jagged activable conjugado (por ejemplo, anticuerpo activable al cual se conjuga un agente terapéutico) del reporte, seguido por un tratamiento administrando tal anticuerpo anti-Jagged activable y/o anticuerpo anti-Jagged activable conjugado a un paciente en necesidad del mismo. Por ejemplo, pacientes que dan positivo para ambos blancos (por ejemplo, Jagged 1 y Jagged 2) y una proteasa que escinde el sustrato en la fragmento escindible (CM) del anticuerpo anti-Jagged activable y/o anticuerpo anti-Jagged activable conjugado siendo evaluado en estos métodos son identificados como candidatos adecuados para el tratamiento con tal anticuerpo y/o tal anticuerpo anti-Jagged activable conjugado comprendiendo tal CM, y el paciente es luego tratado con una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo anti-Jagged activable y/o anticuerpo anti-Jagged activable conjugado que fue evaluado. De la misma forma, los pacientes que dan negativo para ambos blancos (por ejemplo Jagged 1 y Jagged 2) y la proteasa que escinde el sustrato en el CM en el anticuerpo anti-Jagged activable siendo evaluado usando estos métodos deben ser identificados como candidatos adecuados para otra forma de terapia.
En algunas realizaciones, aquellos pacientes pueden evaluarse con otros anticuerpos y/o anticuerpos anti-Jagged activadles conjugados hasta que se identifique un anticuerpo o anticuerpo anti-Jagged activable conjugado adecuado comprendiendo una CM que es escindida por el paciente en el lugar de la enfermedad). En algunas realizaciones, el paciente es luego tratado con una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo anti-Jagged activable y/o anticuerpo anti-Jagged activable conjugado para el cual el paciente dio positivo.
En algunas realizaciones de estos métodos y kits, el MM es un péptido de una longitud de alrededor de 4 a 40 aminoácidos. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, el anticuerpo anti-Jagged activable comprende un péptido enlazador, en el que el péptido enlazador está posicionado entre el MM y el CM. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, el anticuerpo anti-Jagged activable comprende un péptido enlazador, donde el péptido enlazador está posicionado entre el AB y el CM. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, el anticuerpo anti-Jagged activable comprende un primer péptido enlazador (Ll) y un segundo péptido enlazador (L2), donde el primer péptido enlazador está posicionado entre el MM y el CM y el segundo péptido enlazador está ubicado entre el AB y el CM. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, Ll y L2 son péptidos de alrededor de 1 a 20 aminoácidos de longitud, y donde Ll y L2 no necesitan ser el mismo enlazador. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, uno o ambos Ll y L2 comprenden un polímero de glicina-serina. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, al menos uno de L1 y L2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionados del grupo consistente de (GS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 123) y (GGGS)n (SEQ ID NO: 124), donde n es un entero de al menos uno. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, al menos uno de Ll y L2 comprende una secuencia de aminoácidos con la fórmula (GGS)n, donde n es un entero de al menos uno. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, al menos uno de Ll y L2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo consistente de Gly-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 125), Gly-Gly-Ser-Gly-Gly (SEQ ID NO: 126), Gly-Ser-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 127), Gly-Ser-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 128), Gly-Gly-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 129), y Gly-Ser-Ser-Ser-Gly (SEQ ID NO: 130).
En algunas realizaciones de estos métodos y kits, el AB comprende un anticuerpo o fragmento de secuencia de anticuerpo seleccionado de las secuencias de anticuerpos anti-Jagged de reacción cruzada aquí presentados. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, el AB comprende un fragmento Fab, un scFv o anticuerpo de cadena única (scAb).
En algunas realizaciones de estos métodos y kits, el agente de escisión es una proteasa que está co-localizada en el individuo o muestra con el Jagged blanco y el CM es un polipéptido que funciona como sustrato para la proteasa, donde la proteasa escinde al CM en el anticuerpo anti-Jagged activable cuando el anticuerpo anti-Jagged activable está expuesto a la proteasa. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, el CM es un polipéptido de hasta 15 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, el CM es acoplado al N-terminal del AB. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, el CM es acoplado al C-terminal del AB. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, el CM es acoplado al N-terminal de una cadena VL del AB.
En algunas realizaciones de estos métodos y kits, el agente de escisión es una enzima y el CM es un sustrato para la enzima. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, la enzima es una proteasa aquí mostrada. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, la proteasa es una de las proteasas aquí mostradas. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, la proteasa es seleccionada a partir del grupo consistente de uPa, legumaina, MT-SPl, ADAM17, BMP-1, TMPRSS3, TMPRSS4, MMP-9, MMP-12, MMP-13, y MMP-14. En algunas realizaciones, la proteasa es una catepsina.
Las composiciones farmacéuticas de acuerdo a la invención pueden incluir un anticuerpo y/o un anticuerpo activable de la invención y un vehículo. Estas composiciones farmacéuticas pueden ser incluidas en kits, como por ejemplo, kits de diagnóstico.
Un experto en la materia apreciarla que los anticuerpos de la invención tienen una variedad de usos. Por ejemplo, las proteínas de la invención son usadas como agentes terapéuticos para prevenir la activación de la señalización mediada por Jagged a través de los receptores Notch en una variedad de desórdenes. Los anticuerpos de la invención también son usados como reactivos en kits de diagnóstico o como herramientas de diagnóstico, o estos anticuerpos se pueden usar en ensayos de competición para generar reactivos terapéuticos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS GRÁFICOS La figura 1 es un gráfico que ilustra la unión de los anticuerpos anti-Jagger que aquí se mencionas como anti-Jagged 13 y anti-Jagged 32 para humanos y Jagged 1 de ratón, y Jagged 2 humano.
La figura 2 es un gráfico que ilustra la capacidad del anti-Jagged 13 y anti-Jagged 32 para inhibir la unión de Jagged 1 al Notch 1 humano.
La figura 3 es un gráfico que ilustra la capacidad de un anticuerpo anti-Jagged que aquí se menciona como 4D11 (también mencionado como anti-Jagged 4D11, anticuerpo anti-Jagged 4D11, anticuerpo 4D11, o anticuerpo 4D11) para inhibir el crecimiento de los tumores de xenoinjerto BxPC3.
La figura 4 es un gráfico que ilustra la pérdida de peso de los ratones tratados con anticuerpo anti-Jagged 4D11.
La figura 5 es un gráfico que ilustra la concentración sérica del TSLP en ratones tratados con anticuerpo anti-Jagged 4D11.
La figura 6 es un gráfico que ilustra la capacidad del anticuerpo anti-Jagged 4D11 para inhibir el crecimiento de los tumores de xenoinjerto BxPC3 por más de 30 dias de postinoculación.
La figura 7 es un gráfico que ilustra la pérdida de peso de los ratones tratados con anticuerpo anti-Jagged 4D11.
La figura 8 es un gráfico que ilustra la capacidad del anticuerpo anti-Jagged 4D11 para inhibir la proliferación de la linea celular de mieloma RPMI 8226 en co-cultivos con médula ósea humana.
Las figuras 9A, 9B y 9C son una serie de fotografías ilustrando el efecto de los anticuerpos anti-Jagged sobre la línea celular de fibroblasto de ratas NRK-49F en presencia o ausencia de TGF 1. La figura 9A muestra que los cultivos de NRK-F49 retienen la monocapa característica cuando se cultivaron en presencia de anti-Jagged 4D11100 nM. La figura 9B muestra la formación de focos para NRK-F49 cultivados en presencia de T?RbI 10 ng/mL. La figura 9C demuestra que la formación de focos fibróticos estimulados con TGF 1 es completamente inhibida por anti-Jagged 4D11100 nM en cultivos tratados con TGFpi 10 ng/mL.
La figura 10 es una serie de ilustraciones mostrando los resultados de la selección aleatoria de una librería de péptidos en presencia del anticuerpo anti-Jagged 4D11 y un fragmento Fab. La selección consistió de una rondad e MACS y dos rondas de separación FACS. La población positiva de la segunda ronda FACS fue verificada como inhibida por la proteina Jagged recombinante a partir de la unión al anticuerpo anti-Jagged 4D11 y Fab.
La figura 11 es un gráfico que compara la unión del fragmento enmascarante anti-Jagged JS4896 para la unión de las porciones enmascarantes anti-Jagged de afinidad ya madura JS5340, JS5342, JS5347, y JS5358.
La figura 12 es una serie de gráficos ilustrando la capacidad de MM 5342 para inhibir la unión de los anticuerpos anti-Jagged activables y un anticuerpo enmascarado anti-Jagged para un blanco Jagged en una unión ELISA in vitro.
La figura 13 es una fotografía y una tabla ilustrando la activación proteolítica de anticuerpos anti-Jagged activables.
La figura 14 es un gráfico que ilustra que los anticuerpos anti-Jagged activables inhibieron el crecimiento de tumores de xenoinjerto BxPC-3 en ratones, como lo hizo el anticuerpo anti-Jagged 4D11 (anticuerpo parental). El gráfico está trazado como volumen del tumor versus el número de días después de la dosis inicial.
La figura 15 es un gráfico que ilustra una comparación de la pérdida de peso de los ratones que fueron tratados con anticuerpos anti-Jagged activables, anticuerpo enmascarado, o anticuerpo parental.
La figura 16A es un gráfico que ilustra los niveles séricos de TSLP de ratón, donde el nivel de TSLP sérico de ratón fue cuantificado para ratones individuales antes década dosis, y 10 días después de la dosis final de cada grupo, y entonces fue promediado. La figura 16B ilustra el curso de tiempo de las concentraciones de TSLP sérico para anticuerpo anti-Jagged 4D11 y anticuerpo anti-Jagged activable 5342-1204-4D11.
La figura 17 compara los niveles IgG humanos promedio en el tiempo en los sueros de ratones tratados con anticuerpos anti-Jagged activables 5342-1204-4D11 o anticuerpos anti-Jagged 4D11.
La figura 18 es un gráfico que muestra la unión normalizada de la expresión celular al anti-Jagged Fab 4D11.
La figura 19 es una revisión esquemática de la imagen in situ de un anticuerpo activable: 1. Una sección de tejido es colocada sobre la lámina.2. La lámina es cubierta con solución conteniendo anticuerpo activable marcado y es incubada. 3. Después de un extensivo lavado, se visualiza la unión del anticuerpo activado.
La figura 20 es una serie de imágenes ilustrando las capacidades de los anticuerpos anti-Jagged activables 5342-1204-4D11 y 5342-PLGL-4D11 para ser activados y para unirse al tejido de xenoinjerto BxPC3 como demostró el uso de la imagen in situ. Los anticuerpos activables fueron marcados con Alexa Fluor® 680 para producir anticuerpos activables marcados 5342-1204-4D11-AF680 y 5342-PLGL-4D11-AF680, también llamados aqui como 1204-4D11-AF680 y PLGL-4D11-AF680, respectivamente. También fue evaluado el anticuerpo parental anti-Jagged marcado 4D11-AF680. Cada 4D11-AF680 (columna 1, fila 1), 1204-4D11- AF680 (columna 2, fila 1) y PLGL-4D11-AF680 (columna 3, fila 1) fue incubado con una muestra congelada de tumor de tejido de xenoinjerto BxPC3. Los paneles en la fila 2 representan las imágenes fluorescentes obtenidas después de la incubación de 4D11-AF680 (col.l), 1204-4D11-AF680 (col.2) y PLGL-4D11-AF680 (col.3) con tejido congelado de tumor de xenoinjerto BxPC3 pre-tratado con un amplio espectro de cóctel inhibidor de proteasa.
La figura 21 es una serie de imágenes mostrando la activación de los anticuerpos anti-Jagged activables 5342-1204-4D11 y 5342-PLGL-4D11 como demostró la imagen in situ de tejido humano de cáncer pancreático. Tanto 4D11-AF680 (4D11) (columna 1, fila 1), 1204-4D11-AF680 (1204) (col.1, fila 2) y PLGL-4D11-AF680 (PLGL) (col.1, fila 3) fueron incubados con una muestra aislada de tejido congelado de un paciente humano con cáncer pancreático. Los paneles en las columnas 2, 3 y 4, respectivamente, representan las imágenes fluorescentes obtenidas después de la incubación de 4D11-AF680, 1204-4D11-AF680 y PLGL-4D11-AF680 con anticuerpo All pre-tratado del tejido congelado de un paciente con cáncer pancreático, un anticuerpo que se une específicamente al sitio activo de la Proteasa MT-SPl, también conocida como matriptasa; (col 2); con un inhibidor MMP (figura 21, col. 3); o con un coctel inhibidor de proteasa de amplio espectro (col.4).
La figura 22 es una imagen y un gráfico ilustrando la imagen in vivo de un anticuerpo anti-Jagged. La figura 22A es una imagen que proporciona una representación de la señal de fluorescenia del anticuerpo marcado 4D11 a las 48 horas postinyección en el modelo de tumor de xenoinjerto BxPC3 de ratón. La figura 22B es un gráfico que muestra la tasa promedio T/N de la eficacia radiante promedio para el grupo de dosis con el anticuerpo 4D11 ± DS.
La figura 23 es un gráfico que muestra el efecto del anticuerpo anti-Jagged 4D11 para inhibir el crecimiento de los tumores en el modelo de xenoinjerto de ratón BxPC3 cuando se administró sólo o en combinación con un agente anti-cancerigeno adicional, gemcitabina.
La figura 24 es un gráfico que muestra las curvas de inhibición del crecimiento de BxPX3, mostrando las actividades del conjugado anticuerpo anti-Jagged activado (+uPA) y no activado (sin tratar o +PBS); anticuerpo anti-Jagged activadle activado y no activado; anticuerpos anti-Jagged y Rituxan y conjugados anticuerpo-agente.
La figura 25 es un gráfico que muestra que el anticuerpo anti-Jagged 4D11-MMAE y el anticuerpo anti-Jagged activadle 5342-1204-4D11-MMAE inhibió el crecimiento del tumor de xenoinjerto BxPC-3 más efectivamente que sus contrapartes no conjugadas.
La figura 26 es un gráfico que muestra la pérdida de peso observada en los animales tratados con anticuerpo anti-Jagged 4D11, anticuerpo anti-Jagged-MMAE, anticuerpo anti-Jagged activadle 5342-1204-4D11 o conjugado del anticuerpo anti-Jagged activadle- agente 5342-1204-4D11.
Las figuras 27A - 27C son una serie de tablas y gráficos mostrando que los anticuerpos anti-Jagged del reporte se unen a Jagged 1 y Jagged 2 con alta afinidad y reactividad cruzada humano/roedor. La tabla en la figura 27 A demuestra que el anticuerpo anti-Jagged 4D11 tiene una alta afinidad para todos los cuatro ligandos Jagged: Jagged 1 humano (hJAGl), Jagged humano 2 (hJAG2), y Jagged 1 de rata (rJAGl) y Jagged 2 de rata (rJAG2). Los gráficos en la figura 27C demostraron que los fragmentos Fav maduros anti-Jagged del reporte (panel superior) y moléculas de IgG maduras del reporte (panel del fondo) inhiben la señalización Notch.
La figura 28 es un gráfico que muestra la internalización eficiente de un anticuerpo anti-Jagged del reporte mediante la linea celular pancreática BxPC3, graficada como el porcentaje de internalización sobre el tiempo, particularmente al compararse a la internalización mediante la linea celular H292, una linea celular de carcinoma de pulmón. La internalización se demostró usando un método similar al descrito en Gostring L et al, 2010, Int J Oncol 36, 757 - 763.
La figura 29 es un gráfico que ilustra la capacidad del anticuerpo anti-Jagged activable 5342-1204-4D11 en combinación con Gemcitabina para inhibir el crecimiento de tumores de xenoinjerto BxPC-3.
La figura 30 es un gráfico que ilustra que los animales tratados con dosis más altas de anticuerpo y Gemcitabina mostraron una significativa pérdida de peso, pero los animales tratados con un anticuerpo anti-Jagged activable y Gemcitabina no mostraron pérdida del peso sobre los de Gemcitabina sola.
La figura 31 es un gráfico que ilustra que sólo la administración de 20 mg/kg de anticuerpo anti-Jagged en combinación con Gemcitabina mostraron mTSLP elevado en suero.
La figura 32 es un gráfico que ilustra que el anticuerpo anti-Jagged 4D11 fue efectivo al limitar el crecimiento de tumores de próstata en ratones TRAMP.
La figura 33 es un gráfico que ilustra que el anticuerpo anti-Jagged 4D11 inhibió potentemente el crecimiento de tumores espontáneos en ratones transgénicos Her2/neu.
La figura 34 es una serie de imágenes ilustrando la factibilidad de conducir imágenes in situ usando anticuerpos activables no marcados y un reactivo secundario que consta de una marca detectable y que se une específicamente al AB del anticuerpo activadle.
La figura 35 es una serie de imágenes ilustrando la activación de anticuerpo anti-Jagged no marcado 5342-1204-4D11 por medio de tejidos de tumor de un modelo transgénico de cáncer de próstata (TRAMP).
La figura 36 es un gráfico que ilustra las capacidades del anticuerpo 4D11, anticuerpo activadle 5342-1204-4D11 y anticuerpo 5342-1204-4D11 activado por MT-SPl para unirse al Jagged 1 humano La figura 37 es un gráfico que ilustra que el anticuerpo anti-Jagged activable 5342-1204-4D11 inhibió el crecimiento de los tumores de xenoinjerto H292.
La figura 38 es un gráfico que ilustra que el anticuerpo anti-Jagged activable 5342-1204-4D11 no mostró elevación en el TSLP, mientras que los animales que fueron tratados con el anticuerpo a 6.7 y 20 mg/kg mostraron un incremento en el TSLP al compararse al grupo tratado con IVIg.
La figura 39 es una serie de imágenes ilustrando que se observó hiperqueratosis en el grupo tratado con anticuerpo, mientras que en el grupo tratado con anticuerpos activables mostró una queratosis limitada o inexistente.
DESCRIPCIÓN DETALLADA La presente invención describe composiciones nuevas para el diagnóstico y el tratamiento del cáncer. Específicamente, La presente invención proporciona anticuerpos que se unen a Jagged 1 y Jagged 2 e inhiben sus uniones y señalamiento a través de los receptores Notch. La presente invención proporciona anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a Jagged 1 y Jagged 2 (por ejemplo, anticuerpos monoclonares de reacción cruzada). Estos anticuerpos son colectivamente mencionados aquí como "anticuerpos anti- Jagged" Las indicaciones que se beneficiarían de la inhibición de Jagged incluirían cánceres. Por ejemplo, las indicaciones incluirían leucemias, incluyendo la leucemia linfoblástica aguda de células T (T-ALL), enfermedades linfoblásticas incluyendo mieloma múltiple, y tumores sólidos incluyendo cáncer de pulmón, colorectal, de próstata, pancreático y de mama, incluyendo cáncer de mama triple negativo. Adicionalmente, debido a que el señalamiento Notch es importante para la sobrevivencia y crecimiento de las células madre cancerosas, la inhibición del señalamiento Notch dependiente de Jagged impactaría el crecimiento y sobrevivencia de las células madre. Por ejemplo, las indicaciones incluyen enfermedades óseas o metástasis en cáncer, sin importar el origen primario del tumor; cáncer de mama incluyendo, por medio de un ejemplo no limitante, cáncer de mama ER/PR+, cáncer de mama Her2+, cáncer de mama triple negativo; cáncer colorectal, cáncer gástrico; glioblastoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón incluyendo, por medio de un ejemplo no limitante, cáncer de células no pequeñas de pulmón, cáncer de ovario, mieloma múltiple, cáncer pancreático, cáncer de próstata; sarcoma, cáncer renal como, por medio de un ejemplo no limitante, carcinoma de células renales y/o cáncer de piel como, por medio de un ejemplo no limitante, cáncer de células escamosas, carcinoma de células básales, melanoma.
En adición al cáncer, el señalamiento Notch Jagged-dependiente es critico para la diferenciación epitelial y diferenciación de fibroblastos a miofribroblastos, células con un rol central en el desarrollo de la enfermedad fibrótica. La inhibición del señalamiento Notch Jagged-dependiente y, por lo tanto, la inhibición de la emergencia de miofibroblastos, seria un tratamiento efectivo para las enfermedades fibróticas del riñón, hígado, pulmón y piel. Por ejemplo, las indicaciones incluirían un desorden fibrótico como la fibrosis pulmonar idiopática (IPF); enfermedad fibrótica renal, enfermedad fibrótica hepática, fibrosis peritoneal inducida por diálisis y/o escleroder a.
Otras indicaciones adecuadas incluyen, por ejemplo, una patología como la pérdida de oído.
Los anticuerpos de la presente invención se unen al epítope Jagged 1 y/o al epítope Jagged 2 con un equilibrio constante de unión (Kd) de £ 1 mM. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención se unen al epítope Jagged 1 y/o epítope Jagged 2 con un Kd de £ 100 nM, £ 10 nM o £ InM. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Jagged proporcionados aquí mostraron un Kd en el rango aproximado entre £ 1 nM hasta alrededor de 1 pM. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención se unieron al epítope Jagged 1 y/o al epítope Jagged 2 con una tasa constante de salida (Koff) de < 10-2, < 10-3, < 104, o < 10~5. En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados aquí mostraron un Koff de < 10-4. En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados aquí mostraron un Koff de < 10-5. En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente invención se une a un dominio EGF de Jagged 1 y/o Jagged 2. En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente invención se une a un dominio DSL de Jagged 1 y de Jagged 2.
Los anticuerpos anti-Jagged y/o un anticuerpo activable de la invención sirven para modular, bloquear, inhibir, reducir, antagonizar, neutralizar o de otra manera interferir con la actividad biológica de Jagged 1 y/o Jagged 2. Las actividades biológicas de Jagged 1 y/o Jagged 2 incluyen, por ejemplo, la señalización mediante uno o más receptores Notch. Por ejemplo, los anticuerpos anti-Jagged inhibieron completa o parcialmente la actividad biológica de Jagged 1 y/o Jagged 2 al modular parcial o completamente, bloquear, inhibir, reducir, antagonizar, neutralizar o de otra manera interferir con la unión de Jagged 1 y/o Jagged 2 a uno o más receptores Notch o, de otra manera, modulando parcial o completamente, bloqueando, inhibiendo, reduciendo, antagonizando, neutralizando la actividad de señalamiento mediada por Jagged 1 y/o Jagged 2.
Se considera que los anticuerpos anti-Jagged modulan, bloquean, inhiben, reducen, antagonizan, neutralizan o de otra manera interfieren completamente con la actividad biológica Jagged 1 y/o Jagged 2 cuando el nivel de Jagged 1 y/o Jagged 2 en presencia del anticuerpo anti-Jagged disminuye en al menos 95%, por ejemplo, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% al compararse al nivel de actividad en ausencia de un anticuerpo anti-Jagged aquí descrito. Se considera que los anticuerpos anti-Jagged modulan parcialmente, bloquean, inhiben, reducen, antagonizan, neutralizan o de otra manera interfieren con la actividad Jagged 1 y/o Jagged 2 cuando el nivel de actividad Jagged 1 y/o Jagged 2 en presencia el anticuerpo anti-Jagged disminuye a menos del 95%, por ejemplo: 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85% o 90% al compararse al nivel de actividad en ausencia de un anticuerpo anti-Jagged aquí descrito. Los ejemplos de actividad Jagged incluyen, pero no están limitados a, la división y diferenciación celular, sobrevivencia celular/apoptosis, transición epitelial-mesenquimal (EMT) e invasión, angiogénesis, auto renovación de las células madre cancerosas, y lesiones óseas osteoliticas. Mientras que no está asociado mediante teoría, se piensa que el rol de Jagged en la angiogénesis es diferente a la de VEGF.
Definiciones A menos que se defina de otra manera, los. términos científicos y téenicos usados en conexión con la presente invención tendrán los significados que son comúnmente comprendidos por aquellos que tienen habilidad ordinaria en el arte. Adicionalmente, a menos que se requiera de otra manera por contexto, los términos singulares deben incluir pluralidades y los términos en plural deben incluir el singular. Generalmente, las nomenclaturas utilizadas en conexión con, y las téenicas de cultivo celular y de tejidos, biología molecular, química de proteínas y oligo-polinucleótido e hibridación escritas aquí son aquellas bien conocidas y comúnmente usadas en el arte. Las técnicas estándar son usadas para DNA recombinante, síntesis de oligonucleótidos, cultivo de tejidos y transformación (por ejemplo: electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación son realizadas de acuerdo a las especificaciones del fabricante o como se cumple comúnmente en el arte o como se describió aquí. Las técnicas y procedimientos precedentes son generalmente realizadas de acuerdo a métodos convencionales bien conocidos en el arte y como se describió en varias referencias generales y más específicas que son citadas y discutidas a través de la presente especificación. Ver, por ejemplo: Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, N.Y. (1989)). Las nomenclaturas utilizadas en la conexión con, y los procedimientos de laboratorio y técnicas de química analítica, química orgánica sintética y química medicinal y farmacéutica descritas aquí son aquellas bien conocidas y comúnmente usadas en el arte. Las téenicas estándar son usadas para la síntesis de químicos, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación, entrega y tratamiento de pacientes.
Como se utilizaron de acuerdo con la presente divulgación, los siguientes términos, a menos que se indique de otra manera, deben ser comprendidos por tener los siguientes significados: Como se usó aquí, el término "anticuerpo" se refiere a las moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina (Ig), por ejemplo: moléculas que contienen un sitio de unión al antigeno que se une específicamente (inmunorreacciona con) un antigeno. Al decir "unir específicamente" o "inmunorreacciona con" o "se une inmunoespecífreamente" se quiere decir que el anticuerpo reacciona con uno o más determinantes antigénicos del antígeno deseado y no reacciona con otros polipéptidos o se une en afinidad mucho más baja (Kd >10~6). Los anticuerpos incluyen, pero no están limitados a, fragmentos policlonales , monoclonales, quiméricos, anticuerpos de dominio, cadena única, Fab, y F(ab')2, scFvs y librería de expresión Fab.
Se conoce que la unidad estructural básica del anticuerpo comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas de polipéptidos, cada par tiene una "luz" (alrededor de 25 kDa) y una cadena "pesada" (alrededor de 50 - 70 kDa). La fragmento amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de alrededor de 100 a 110 o más aminoácidos, responsables principalmente del reconocimiento del antigeno. La fragmento carboxi-terminal de cada cadena define una región constante responsable principalmente por la función de efector. En general, las moléculas de anticuerpo obtenidas de humanos en relación con cualquiera de las clases IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, que difieren uno del otro por la naturaleza de la cadena pesada presente en la molécula. Ciertas clases tienen subclases también, como en IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 y otros. Adicionalmente, en humanos, la cadena ligera podría ser una cadena Kappa o una cadena Lambda.
El término "anticuerpo monoclonal" (mAb) o "composición de anticuerpo monoclonal", tal como es usado aquí, se refiere a una población de moléculas de anticuerpos que contiene sólo una especie molecular de anticuerpo consistente de un único producto génico de cadena ligera y un único producto génico de cadena pesada. En particular, las regiones determinantes de complementaridad (CDRs) del anticuerpo monoclonal son idénticas en todas las moléculas de la población. Los MAbs contienen un sitio de unión al antígeno capaz de inmunorreacionar con un epítope particular del antígeno caracterizado por una afinidad de unión única.
El término "sitio de unión del antígeno" o "fragmento de unión" se refiere a la parte de la molécula de inmunoglobulina que participa en la unión del antigeno. El sitio de unión del antígeno es formado por residuos de aminoácidos le las regiones variables N-terminales ("V") de las cadenas pesada ("H") y ligera ("L"). Tres ramos altamente divergentes dentro de las regiones V de las cadenas pesada y ligera, mencionadas como "regiones hipervariables", son interpuestos entre más tramos flanqueantes más conservados conocidos como "regiones marco" o "FRs". Por lo tanto, el término "FR" se refiere a las secuencias de aminoácidos que son encontradas naturalmente entre, y adyacentes a, regiones hipervariables en las inmunoglobulinas. En una molécula de anticuerpo, las tres regiones hipervariables de una cadena ligera y las tres regiones variables de una cadena pesada están dispuestas una en relación a otra en el espacio tridimensional para formar la superficie de unión al antígeno. La superficie de unión al antígeno es complementaria a la superficie tridimensional de un antígeno ligado, y las tres regiones hipervariables de las cadenas pesadas y ligeras son nombradas como "regiones determinantes de complementariedad", o "CDRs". La asignación de aminoácidos para cada dominio está en concordancia con las definiciones de las Secuencias Kabat de Proteínas de Interés Inmunológico (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)), o Chothia & Lesk J. Mol. Biol.196:901-917 (1987), Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989).
Como es usado aquí, el término "epítope" incluye cualquier proteína determinante capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina, un scFv o un receptor de célula T. El término "epítope" incluye cualquier proteina determinante capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina o receptor de célula T. Los determinantes epitópicos consisten usualmente de agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y usualmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características específicas de carga. Por ejemplo, los anticuerpos pueden elevarse contra los péptidos N-terminal o C-terminal de un polipéptido. Se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando la constante de disociación es £ 1 mM; por ejemplo, en algunas realizaciones £100 nM y en algunas realizaciones £10 nM.
Como son usados aquí, los términos "unión específica", "unión inmunológica", y "propiedades inmunológicas de unión" se refieren a las interacciones no covalentes del tipo que ocurre entre una molécula de inmunoglobulina y un antígeno para el que la inmunoglobulina es específica. La fuerza, o afinidad de las interacciones de unión inmunológica pueden expresarse en términos de la constante de disociación (Kd) de la interacción, donde un Kd más pequeño representa una afinidad mayor. Las propiedades de unión inmunológica de polipéptidos seleccionados pueden ser cuantificadas usando métodos bien conocidos en el arte. Uno de estos métodos implica la medición de las tasas de formación y disociación de complejos sitio de unión al antigeno/antigeno, donde aquellas tasas dependen de las concentraciones de los agentes del complejo, la afinidad de la interacción y los parámetros geométricos que influencian igualmente la tasa en ambas direcciones. Por lo tanto, la "tasa constante para la disociación de un ligando de su receptor" (Kon) y la "tasa constante para la formación de un complejo receptor-ligando" (Koff) puede determinarse calculando las concentraciones y las tasas reales de asociación y disociación (Ver Nature 361:186-87 (1993)). La profragmento de Koff/Kon permite la cancelación de todos los parámetros no relacionados a la afinidad, y es igual a la constante de disociación Kd. (Ver, generalmente, Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473). Se dice que un anticuerpo de la presente invención se une específicamente a EGFR, cuando la constante de equilibrio de unión (Kd) es £1 mM, por ejemplo en algunas realizaciones es £10 nM, y en algunas realizaciones £100 pM hasta cerca de 1 pM, según lo medido por ensayos tales como ensayos de unión a radioligandos o ensayos similares conocidos por los expertos en el arte.
El término "polinucleótido aislado" tal como se usa aquí debe significar un polinucleótido de origen genómico, cDNA o sintético o una combinación de estas, que en virtud de su origen el "polinucleótido aislado" (1) no está asociado con todo o un fragmento de un polinucleótido en el que el "polinucleótido aislado" es encontrado en la naturaleza, (2) está unida operativamente a un polinucleótido a la que no está unida en la naturaleza, o (3) no sucede en la naturaleza como parte de una secuencia mayor. Los polinucleótidos, de acuerdo con la invención, incluyen las moléculas de ácido nucleico que codifican las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada y las moléculas de ácido nucleico que codifican las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera aquí mostradas.
El término "proteína aislada" que aquí se menciona significa una proteína de origen cDNA, RNA recombinante o sintético o alguna combinación de éstas, la cual por virtud de su origen, o fuente de derivación, la "proteína aislada" (1) no está asociado con proteínas encontradas en la naturaleza, (2) está libre de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo, libre de proteínas murinas, (3) está expresada por una célula de una especie diferente, o (4) no ocurre en la naturaleza.
El término "polipéptido" es usado aquí como un término genérico para referirse a proteínas nativas, fragmentos o análogos de una secuencia de polipéptidos. Por lo tanto, los fragmentos de proteína nativa y los análogos son especies del género polipéptido. Los polipéptidos de acuerdo con la invención comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada aquí mostrados, y las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera mostrados aquí, así como moléculas de anticuerpo formadas por combinaciones comprendiendo las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada con moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera kappa, y viceversa, así como también fragmentos y análogos de éstos.
El término "naturalmente ocurrente" usado aquí como aplicado a un objeto se refiere al hecho de que un objeto pueda ser encontrado en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptido o un polinucleótido que está presente en un organismo (incluyendo virus) que puede ser aislado de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificado intencionalmente por el hombre en el laboratorio y ha ocurrido en la naturaleza.
El término "operablemente relacionado" usado aquí se refiere a las posiciones de los componentes descritos que están en una relación que les permite funcionar de una manera determinada. Una secuencia de control "operablemente relacionada" a una secuencia codificante está ligada de tal manera que la expresión de la secuencia codificante es alcanzada bajo condiciones compatibles con las secuencias de control.
El término "secuencia de control" como se usa aquí se refiere a las secuencias de polinucleótidos que son necesarias para efectuar la expresión y procesamiento de secuencias codificantes a las que están ligadas. La naturaleza de tales secuencias de control difieren dependiendo del organismo huésped en procariotes, tales secuencias de control incluyen generalmente un promotor, un sitio de unión ribsosómica, y secuencia de terminación de la transcripción en eucariotas, generalmente, tales secuencias de control incluyen promotores y secuencias de terminación de la transcripción. El término "secuencias de control" incluye, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y procesamiento, y también pueden incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de fusión de complementos. El término "polinucleótido" como se menciona aquí significa nucleótidos de al menos 10 bases de longitud, sean ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas de cadena simple y doble de ADN.
El término oligonucleótido que aquí se menciona incluye nucleótidos de ocurrencia natural y nucleótidos modificados enlazados juntos por enlaces de ocurrencia natural y no natural. Los oligonucleótidos son un subjuego de los polinucleótidos, que comprenden generalmente una longitud de 200 bases o menos. En algunas realizaciones los oligonucleótidos son de 10 a 60 bases de longitud, por ejemplo, en algunas realizaciones tienen 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 a 40 bases de longitud. Los oligonucleótidos son usualmente de cadena única, por ejemplo, para sondas, aunque los oligonucleótidos pueden ser de doble cadena, por ejemplo para su uso en la construcción de un gen mutante. Los oligonucleótidos de la invención son oligonucleótidos de sentido o antisentido.
El término "nucleótidos de ocurrencia natural" que aquí se menciona incluye a los desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. El término "nucleótidos modificados" que aquí se menciona incluye nucleótidos con grupos azúcar modificados o sustituidos y similares. El término "uniones de oligonucleótidos" que aquí se menciona incluye uniones de oligonucleótidos como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselerloato, fosfodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforonmidato y similares. Ver, por ejemplo, LaPlanche et al. Nucí. Acids Res.14:9081 (1986); Stec et al.
J. Am. Chem. Soc.106:6077 (1984), Stein et al. Nucí. Acids Res. 16:3209 (1988), Zon et al. Anti Cáncer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al. Patente de E.U.A. No. 5,151,510; Uhlmann and Pcyman Chemical Reviews 90:543 (1990). Un oligonucleótido puede incluir una marca para su detección, si se desea.
Tal como se usa aquí, los 20 aminoácidos convencionales y sus abreviaciones siguen el uso convencional. Ver Immunology -A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland7 Mass. (1991)). Los estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los 20 aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales como los aminoácidos a-, a-disustituidos, aminoácidos N-alquil, ácido láctico y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes idóneos para polipéptidos de la presente invención. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4 hidroxiprolina, g-carboxiglutamato, e-N,N,N-trimetillisina, e -N-acetillisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hydroxilisina, s-N-metilarginina y otros aminoácidos similares e iminoácidos (por ejemplo 4-hidroxiprolina). En la notación de polipéptidos usada aqui, la dirección izquierda es la dirección amino terminal y la dirección derecha es la dirección carboxi terminal, de acuerdo con el uso estándar y la convención.
De igual forma, a menos que se especifique de otra manera, la dirección izquierda de las secuencias de polinucleótidos de cadena única es el final 5', la dirección izquierda de las secuencias de polinucleótidos de doble cadena se refiere a la dirección 5'. La dirección de 5'a 3' en adición a los transcriptos RNA nacientes se refiere a la dirección de la transcripción de las regiones de secuencia sobre la cadena de ADN, teniendo la misma secuencia del RNA que son 5'al final 5'del transcripto RNA son mencionadas como "secuencias cadena arriba", las regiones de secuencia de ADN que tienen la misma secuencia del RNA y que son de 3'al final 3'del transcripto RNA son mencionadas como "secuencias cadena abajo".
Tal como se aplica a los polipéptidos, el término "identidad sustancial" significa que dos secuencias de péptidos, cuando se alinean de manera óptima, como por los programas GAP o BESTFIT usando pesos de vacio por defecto, comparten al menos 80% de identidad de secuencia, por ejemplo, en algunas realizaciones, al menos 90% de identidad de secuencia, en algunas realizaciones al menos 95% de identidad de secuencia y, en algunas realizaciones, al menos 99% de identidad de secuencia.
En algunas realizaciones, las posiciones de los residuos que no son idénticos difieren por sustituciones conservativas de aminoácidos.
Tal como se discutió aquí, las variaciones menores en las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina se contemplan como englobados por la invención presente, de tal forma que las variaciones en las secuencias de aminoácidos mantienen al menos 75%, por ejemplo en algunas realizaciones, al menos 80%, 90%, 95%, y en algunas realizaciones 99%. En particular, se contempla los reemplazos conservativos de aminoácidos. Los reemplazos conservativos son aquellos que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos relacionados en sus cadenas laterales. Los aminoácidos genéticamente codificados están divididos generalmente en familias: (1) los aminoácidos acídicos son aspartato, glutamato; (2) los aminoácidos básicos son lisina, arginina, histidina; (3) los aminoácidos no polares son alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano y (4) los aminoácidos polares sin carga son glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Los aminoácidos hidrofílicos incluyen arginina, asparagina, aspartato, glutamina, glutamato, histidina, lisina, serina y treonina. Los aminoácidos hidrofóbicos incluyen alanina, cisteína, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, triptófano, tirosina y valina. Otras familias de aminoácidos incluyen (i) serina y treonina, que son la familia alifática-hidroxi; (ii) asparagina y glutamina, que son la familia conteniendo amidas; (iii) alanina, valina, leucina e isoleucina, que son la familia alifática; y (iv) fenilalanina, triptófano y tirosina, que son la familia aromática. Por ejemplo, es razonable esperar que un reemplazo aislado de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo similar de un aminoácido dentro de un sitio marco. Si un cambio de aminoácido resulta en un péptido funcional, se puede determinar rápidamente mediante ensayo de la actividad especifica del derivativo polipéptido. Aquí se describen ensayos en detalle. Los fragmentos o análogos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina pueden prepararse rápidamente por personas de moderada habilidad en el arte. En algunas realizaciones, los términos amino y carboxi de los fragmentos o análogos ocurren cerca de las uniones de los dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales pueden ser identificados mediante comparación de la secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos en bases de datos de secuencias públicas o privadas. Los métodos de comparación computarizada son usados para identificar los motivos de secuencia o predecir los dominios de conformación de proteína que ocurren en otras proteínas de estructura y/o función conocida. Los métodos para identificar las secuencias de proteínas que se pliegan en una estructura tridimensional conocida son conocidos. Bowie et al. Science 253:164 (1991). Por lo tanto, los ejemplos anteriores demostraron que los expertos en el arte pueden reconocer los motivos de secuencia y las conformaciones estructurales que pueden ser usadas para definir los dominios estructurales y funcionales de acuerdo con la invención.
En algunas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de proteínas, (4) alteran las afinidades de unión, y (5) confieren o modificas otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de aquellos análogos. Los análogos pueden incluir varias muteínas de una secuencia en lugar de la secuencia de péptidos de ocurrencia natural. Por ejemplo, las sustituciones únicas o múltiples de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones conservativas de aminoácidos) pueden hacerse en la secuencia de ocurrencia natural (por ejemplo, en la porción del polipéptido fuera de los dominios que forman contactos intermoleculares. Una sustitución conservativa de aminoácidos no debería cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia parental (por ejemplo, un aminoácido de reemplazo no debe tender a romper una hélice que ocurre en la secuencia parental, o alterar otros tipos de estructura secundaria que caracteriza a la secuencia parental). Los ejemplos de estructuras secundarias y terciaras de polipéptidos reconocidos por el arte son descritas en Proteins, Structures and Molecular Principies (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); y Thornton et at. Nature 354:105 (1991).
El término "fragmento de polipéptido" usado aquí se refiere a un polipéptido que tiene una deleción amino terminal y/o carboxi terminal y/o una o más deleciones internas, pero donde la secuencia restante de aminoácidos es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia de ocurrencia natural deducida, por ejemplo, de una secuencia cDNA de longitud completa. Los fragmentos típicamente son de al menos 5, 6, 8 o 10 aminoácidos de largo, por ejemplo, en algunas realizaciones al menos de 14 aminoácidos de largo, en algunas realizaciones al menos 20 aminoácidos de largo, usualmente al menos 50 aminoácidos de largo, y en algunas realizaciones al menos 70 aminoácidos de largo. El término "análogo" usado aquí se refiere a los polipéptidos que están comprendidos de un segmento de al menos 25 aminoácidos que tienen identidad sustancial con un fragmento de una secuencia de aminoácidos deducida y tiene unión especifica a EGFR, bajo condiciones adecuadas de unión. Típicamente, los análogos polipéptidos comprenden una sustitución conservativa de aminoácido (o adición o deleción) con respecto a la secuencia de ocurrencia natural. Los análogos típicamente son de al menos 20 aminoácidos de largo, por ejemplo en algunas realizaciones son de al menos 50 aminoácidos de largo o mayores, y usualmente pueden ser tan largos como los polipéptidos completos de ocurrencia natural.
El término "agente" es usado aquí para denotar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica, o un extracto hecho de materiales biológicos.
Tal como se usan aquí, los términos "marca" o "marcado" se refieren a la incorporación de un marcador detectable, por ejemplo, por incorporación de un aminoácido radiomarcado o adjunto a un polipéptido de porciones biotinil que puede ser detectado por avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina conteniendo un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede ser detectada por métodos ópticos o calorimétricos). En ciertas situaciones, la marca o marcador también puede ser terapéutico. Se conocen varios métodos de mareaje de polipéptidos y glicoproteínas en el arte, y pueden ser usados.
Los ejemplos de marcas para polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: radioisótopos o radionucleidos (por ejemplo 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, "Te, 411In, 125I, 131I), marcas fluorescentes (por ejemplo, un fluoroforo, rodamina, fósforos lantánidos), marcas enzimáticas (por ejemplo peroxidasa de rábano picante, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), grupos biotinil quimioluminiscentes, epitopes de polipéptidos predeterminados y reconozidos por un reportero secundario (pares de secuencia zipper de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, marcas de epitope). En algunas realizaciones, las marcas son adosadas por brazos espaciadores de varias longitudes para reducir el potencial impedimento estérico. El término "agente farmacéutico o droga" tal como es usado aquí se refiere a un compuesto químico o composición capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra adecuadamente a un paciente.
Otros términos químicos son usados aquí de acuerdo al uso convencional en el arte, ejemplificado por The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)).
Tal como se usa aquí, "sustancialmente puro" significa que una especie objeto es la especie predominantemente presente (por ejemplo, en una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición), y una fracción sustancialmente purificada es una composición donde la especie objeto comprende al menos el 50% (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes.
Generalmente, una composición sustancialmente pura comprenderá más del 80% de todas las especies macromoleculares presentes en la composición, por ejemplo, en algunas realizaciones más de. 85%, 90%, 95% y 99%. En algunas realizaciones, la especie objeto es purificada hasta la homogeneidad esencial (las especies contaminantes no se pueden detectar en la composición mediante métodos convencionales de detección) donde la composición consiste esencialmente de una sola especie macromolecular.
El término paciente incluye individuos humanos y veterinarios.
Las indicaciones que se beneficiarían de la inhibición Jagged incluyen leucemias, incluyendo leucemia linfoblástica agua de células T (T-ALL), eníermedades linfoblásticas incluyendo mieloma múltiple, y tumores sólidos, incluyendo cáncer de pulmón, colorectal, de próstata, pancreático y de mama, incluyendo cáncer de mama triple negativo. Adicionalmente, ya que la señalización Notch es importante para la sobrevivencia y crecimiento de las células madre cancerosas, la inhibición de la señalización Notch Jagged-dependiente es critica para diferenciación epitelial y de fibroblastos a miofibroblastos, células con un rol central en el desarrollo de la enfermedad fibrótica. La inhibición de la señalización Notch Jagged-dependiente y, por lo tanto, la inhibición de la emergencia de miofibrobastos, seria un tratamiento efectivo para enfermedades fibróticas del riñón, hígado, pulmón y piel.
Anticuerpos anti-Jagged y anticuerpos anti-Jagged activables Los anticuerpos monoclonales y/o anticuerpos activables de la invención tienen la capacidad de inhibir la señalización mediada por Jagged 1 y/o Jagged 2 hacia los receptores Notch. La inhibición es determinada usando una variedad de téenicas reconocidas, incluyendo los ensayos descritos en los ejemplos aquí proporcionados.
Los anticuerpos anti-jagged y/o anticuerpos anti-Jagged activables de la invención incluyen adicionalmente, por ejemplo, las combinaciones de regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (VH CDRs) y de regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (VL CDRs). Los ejemplos de aquellos CDRs se muestran en la Tabla 2 o son los CDRs de los anticuerpos aquí mostrados, incluyendo, pero no limitándose a, aquellos en la tabla 3 y tabla 4. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-jagged de la invención incluyen anticuerpos que contienen una combinación de una secuencia VH CDR1, una secuencia VH CDR2, una secuencia VH CDR3, una secuencia VL CDR1, una secuencia VL CDR2 y una secuencia VL CDR3 de al menos un anticuerpo seleccionado del grupo consistente del anticuerpo 4D11, el anticuerpo 4B2, el anticuerpo 4E7, el anticuerpo 4E11, el anticuerpo 6B7 y el anticuerpo 6F8. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Jagged de la invención incluyen anticuerpos que contienen una combinación de una secuencia VH CDR1, una secuencia VH CDR2, una secuencia VH CDR3, una secuencia VL CDR1, una secuencia VL CDR2 y una secuencia VL CDR3 que son al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idénticas a las secuencias de al menos un anticuerpo seleccionado del grupo consistente del anticuerpo 4D11, el anticuerpo 4B2, el anticuerpo 4E7, el anticuerpo 4E11, el anticuerpo 6B7 y el anticuerpo 6F8.
Los anticuerpos anti-Jagged de la invención incluyen anticuerpos que contienen una combinación de una secuencia VH CDRl, una secuencia VH CDR2, una secuencia VH CDR3, una secuencia VL CDRl, una secuencia VL CDR2 y una secuencia VL CDR3, donde al menos una secuencia CDR es seleccionada a partir del grupo consistente de una secuencia VH CDRl que incluye al menos la secuencia de aminoácidos SYAMS (SEQ ID NO: 200); una secuencia VH CD2 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos SIDPEGRQTYYADSVKG (SEQ ID NO: 208); una secuencia VH CD3 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos DIGGRSAFDY (SEQ ID NO: 209); una secuencia VL CDR1 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos RASQSISSY (SEQ ID NO: 210); una secuencia VL CDR2 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos AASSLQS (SEQ ID NO: 211); y una secuencia VL CDR3 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos QQTVVAPPL (SEQ ID NO: 212).
Los anticuerpos anti-Jagged de la invención incluyen anticuerpos que contienen una combinación de una secuencia VH CDRl, una secuencia VH CDR2, una secuencia VH CDR3, una secuencia VL CDRl, una secuencia VL CDR2 y una secuencia VL CDR3, donde al menos una secuencia CDRl es seleccionada a partir del grupo consistente de una secuencia VH CDRl que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos SYAMS (SEQ ID NO: 200); una secuencia VH CDR2 que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos SIDPEGRQTYYADSVKG (SEQ ID NO: 208); una secuencia VH CDR3 que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos DIGGRSAFDY (SEQ ID NO: 209); una secuencia VL CDRl que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos RASQSISSY (SEQ ID NO: 210); una secuencia VL CDR2 que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos AASSLQS (SEQ ID NO: 211); y una secuencia VL CDR3 que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos QQTVVAPPL (SEQ ID NO: 212).
Los anticuerpos anti-Jagged de la invención incluyen anticuerpos que contienen una secuencia VH CDR1 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos SYAMS (SEQ ID NO: 200); una secuencia VH CDR2 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos SIDPEGRQTYYADSVKG (SEQ ID NO: 208); una secuencia VH CDR3 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos DIGGRSAFDY (SEQ ID NO: 209); una secuencia VL CDR1 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos RASQSISSY (SEQ ID NO: 210); una secuencia VL CDR2 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos AASSLQS (SEQ ID NO: 211); y una secuencia VL CDR3 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos QQTVVAPPL (SEQ ID NO: 212).
Los anticuerpos anti-Jagged de la invención incluyen anticuerpos que contienen una secuencia VH CDRl que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos SYAMS (SEQ ID NO: 200); una secuencia VH CDR2 que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos SIDPEGRQTYYADSVKG (SEQ ID NO: 208); una secuencia VH CDR3 que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos DIGGRSAFDY (SEQ ID NO: 209); una secuencia VL CDR1 que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos RASQSISSY (SEQ ID NO: 210); una secuencia VL CDR2 que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos AASSLQS (SEQ ID NO: 211); y una secuencia VL CDR3 que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos QQTVVAPPL (SEQ ID NO: 212).
Los anticuerpos que sirven de ejemplo y/o anticuerpos activables de la invención incluyen, por ejemplo, el anticuerpo 4D11, el anticuerpo 4B2, el anticuerpo 4E7, el anticuerpo 4E11, el anticuerpo 6B7 y el anticuerpo 6F8, y variantes de éstos. Estos anticuerpos muestran especificidad por Jagged 1 y Jagged 2 humanos, y han mostrado inhibir la señalización mediada Jagged 1 y/o Jagged 2 humanos hacia los receptores Notch. Estos anticuerpos incluyen las combinaciones de una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), como muestran las secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos correspondientes mencionadas en la tabla 4 y mostradas en el ejemplo 5.
También se incluyeron en la invención los anticuerpos y/o anticuerpos activables que se unen al mismo epitope como los anticuerpos aquí descritos. Por ejemplo, los anticuerpos y/o un anticuerpo activable de la invención se unen específicamente a jagged 1 humano, donde el anticuerpo se une a un epitope que incluye uno o más residuos de aminoácidos de Jagged 1 humano (mostrado, por ejemplo, en los Nos. De accesión AAC52020.1; AAB84053.1; NP_000205.1; P78504.3; AAB39007.1; EAX10341.1; AAI26208.1; AAI26206.1; AAH98393.1; CAC07198.1 y/o BAG35596.1). los anticuerpos y/o anticuerpos activables de la invención se unen específicamente a Jagged 2 humano, donde el anticuerpo se une a un epitope que incluye uno o más residuos de aminoácidos de Jagged 2 humano (ver, por ejemplo, los Nos. De accesión AAB61285, AAB71189.1, EAW81901.1, NP_002217.3, y/o Q9Y219.3). Los anticuerpos de la invención se unen específicamente a Jagged 1 y Jagged 2 humanos, donde el anticuerpo se une a un epitope que incluye uno o más residuos de aminoácidos de Jagged 2 humano.
Los más entrenados en el arte reconocerán que es posible determinar, sin experimentación debida, si un anticuerpo monoclonal (por ejemplo anticuerpo monoclonal totalmente humano) y/o anticuerpo activable tiene la misma o similar especificidad que el anticuerpo monoclonal y/o anticuerpo activable de la invención (por ejemplo, los anticuerpos 4D11, 4B2, 4E7, 4E11, 6B7, y/o 6F8 y los anticuerpos activables que incluyen estos anticuerpos) por determinar si los primeros previenen que los últimos se unan a Jagged 1, Jagged 2 o ambos. Si el anticuerpo monoclonal y/o un anticuerpo activable en evaluación compiten con el anticuerpo monoclonal y/o anticuerpo activable de la invención, mostrado por un descenso en la unión del anticuerpo monoclonal y/o anticuerpo activable de la invención, entonces los dos anticuerpos monoclonales y/o anticuerpos activables se unen al mismo, o a un epitope cercanamente relacionado.
Una realización para determinar si un anticuerpo monoclonal y/o un anticuerpo activable tiene la especificidad de un anticuerpo monoclonal y/o anticuerpo activable de la invención es pre-incubar el anticuerpo monoclonal y/o anticuerpo activable de la invención con proteínas solubles Jagged 1 y/o Jagged 2 (con la que es normalmente reactivo), y luego agregar el anticuerpo monoclonal y/o un anticuerpo activable en evaluación para determinar si el anticuerpo monoclonal y/o anticuerpo activable en evaluación es inhibido en su capacidad de unirse a Jagged 1 y/o Jagged 2. Si el anticuerpo monoclonal y/o anticuerpo activable en evaluación es inhibido entonces, con toda probabilidad, tiene la misma o funcionalmente equivalente especificidad epitópica que el anticuerpo monoclonal y/o anticuerpo activadle de la invención.
La detección de anticuerpos monoclonales y/o un anticuerpo activable de la invención, también se puede realizar, por ejemplo, midiendo la señalización mediada por Jagged 1 y Jagged 2 hacia los receptores Notch y determinando si el anticuerpo monoclonal de prueba es capaz de modular, inhibir, reducir, antagonizar, neutralizar o de otra forma interferir con la señalización mediada Jagged 1 y/o Jagged 2 hacia los receptores Notch. Los ejemplos de actividad Jagged incluyen, pero no se limitan a, la división celular y diferenciación, sobrevivencia celular/ apoptosis, transición epitelial-mesenquimal (EMT) e invasión, angiogénesis, autorenovación de células madre cancerosas, y lesiones óseas osteoliticas. Los métodos para medir tales actividades son conocidos por los expertos en el arte.
Varios procedimientos conocidos dentro del arte pueden usarse para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra Jagged 1 y/o Jagged 2 humanos, o contra derivados, fragmentos, análogos, homólogos u ortólogos de los mismos. (Ver, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, and Lañe D, 1988, Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, NY, incorporado aquí mediante referencia). Los anticuerpos completamente humanos son moléculas de anticuerpos en las que toda la secuencia de la cadena ligera y pesada, incluyendo CDRs, resultan de genes humanos. Aquellos anticuerpos aquí son llamados "anticuerpos humanos", o "anticuerpos completamente humanos". Los anticuerpos monoclonales humanos son preparados, por ejemplo, usando los procedimientos descritos en los ejemplos dados anteriormente. Los anticuerpos monoclonales humanos también pueden prepararse usando la téenica trioma; la técnica de hibridoma de células B humanas (ver Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72); y la técnica de hibridoma EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (ver Colé, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96). Los anticuerpos monoclonales humanos pueden ser utilizados y producidos usando hibridomas humanos (ver Cote, et al., 1983. Proc Nati Acad Sci USA 80: 2026-2030) o por transformación de células B humanas con el Virus Epstein Barr in vitro (ver Colé, et al·., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96).
Los anticuerpos son purificados por técnicas bien conocidas, como la de cromatografía de afinidad usando proteína A o G, que dan primariamente la fracción IgG del suero inmune. Posteriormente, o alternativamente, el antígeno específico que es el blanco de la inmunoglobulina buscada, o un epítope de ésta, puede ser inmovilizado en una columna para purificar el anticuerpo inmune especifico mediante cromatografía por inmunoafinidad. La purificación de las inmunoglobulinas es discutida, por ejemplo, por D. Wilkinson (The Scientist, published by The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol.14, No. 8 (Abril 17, 2000), pp.25-28).
Los anticuerpos de la invención son anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales que modulan, bloquean, inhiben, reducen, antagonizan, neutralizan o de otra forma interfieren con la señalización mediada por Jagged 1 y/o Jagged 2 hacia los receptores Notch son generados, por ejemplo, inmunizando un animal con Jagged 1 y/o Jagged 2, con tal, por ejemplo, Jagged 1 y/o Jagged 2 murino, de rata o humano o un fragmento inmunogénico, derivado o variante de ésta. Alternativamente, el animal es inmunizado con las células transfectadas con un vector conteniendo una molécula de ácido nucleico codificando Jagged 1 y/o Jagged 2, por lo que Jagged 1 y/o Jagged 2 es expresado y asociado con la superficie de las células transfectadas. Alternativamente, los anticuerpos son obtenidos al seleccionar una librería que contiene secuencias de dominio de unión al anticuerpo o al antígeno para que se unan a Jagged 1 y/o Jagged 2. Esta librería es preparada, por ejemplo, en bacteriófagos como proteína o fusiones de péptidos para un revestimiento proteico de bacteriófago que es expresado sobre la superficie de las partículas del fago ensamblado (es decir, "librería de muestras de fago"). Los hibridomas resultantes de fusiones celulares mieloma/B son luego seleccionadas por reactividad a Jagged 1 y Jagged 2.
Los anticuerpos monoclonales son preparados, por ejemplo, usando métodos de hibridoma, como los descritos por Kohler y Milstein, Nature, 256:495 (1975). En un método de hibridoma, un ratón, hámster u otro animal hospedero apropiado, es típicamente inmunizado con un agente inmunizante para provocar que los linfocitos produzcan o sea capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al agente inmunizante. Alternativamente, los linfocitos pueden ser inmunizados in vitro.
El agente inmunizante incluirá típicamente la proteína antígeno, un fragmento de ésta o una proteína de fusión de ésta. Generalmente se usa linfocitos de sangre periférica si se desean células de origen humano, o se usan células de bazo o nodulos linfáticos si se desean fuentes mamíferas no humanas. Los linfocitos son luego fusionados con una línea celular inmortalizada usando un agente fusionador adecuado, como polietilenglicol, para formar una célula hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, (1986) pp.59-103). Las líneas celulares inmortalizadas son usualmente células mamíferas transformadas, particularmente de células de mieloma de origen roedor, bovino o humano. Usualmente son empleadas las lineas celulares de mieloma de ratón o rata. Las células hibridoma pueden cultivarse en un medio de cultivo adecuado que, en algunas realizaciones, contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o sobrevivencia de las células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá típicamente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), cuyas sustancias previenen el crecimiento de células HGPRT deficientes.
En algunas realizaciones, las líneas celulares inmortalizadas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan un alto nivel estable de expresión de anticuerpo mediante las células productoras de anticuerpos seleccionados, y son sensibles a un medio como el HAT. En algunas realizaciones, las líneas celulares inmortalizadas son líneas de mieloma urino, que pueden obtenerse del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California y el American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Las líneas celulares de mieloma humano y hetero ieloma de ratón-humano también han sido descritas para la producción de anticuerpos monoclonales. (ver Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp.51-63)).
El medio de cultivo en el que las células de hibridoma son cultivadas puede entonces ser ensayado para la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antigeno. La especificidad de ligamiento de los anticuerpos monoclonales producidos por las células del hibridoma es determinada por la inmunoprecipitación o por un ensayo de ligación in vitro, como por radioinmunoensayo (RIA) o ensayo de enzimas enlazadas con inmunoabsorbentes (ELISA). Tales téenicas y ensayos son conocidos en el arte. La afinidad de ligación del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, ser determinada por el análisis Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980). Adicionalmente, en las aplicaciones terapéuticas de anticuerpos monoclonales, es importante identificar los anticuerpos poseedores de un alto grado de especificidad y una alta afinidad de ligación por el antigeno blanco.
Después de identificar a las células deseadas del hibridoma, los clones pueden ser subclonados al limitar los procesos de dilución y crecimiento por métodos estándar (ver Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103). Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, Medio Eagle modificado de Dulbecco y medio RPMI-1640.
Alternativamente, las células del hibridoma pueden hacerse crecer in vivo como ascitis en un mamífero.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden ser aislados o purificados del medio de cultivo de fluido de ascitis mediante procedimientos de purificación convencional de inmunoglobulinas como, por ejemplo, proteína A-Sefarosa, comatografía hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.
Los anticuerpos monoclonales también pueden hacerse por métodos de ADN recombinante, como los descritos en la Patente de E.U.A. No.4,816,567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención puede ser rápidamente aislado y secuenciado usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos capaces de ligarse específicamente a genes codificantes de las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos murinos). Una vez aisladas, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que son luego transferidos a células hospederas como células COS de simio, células de ovario de hámster chino o células de mieloma que de otra manera no producirían proteínas inmunoglobulinas, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospederas recombinantes. Para anticuerpos aislados de los hibridomas murinos, el ADN también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante para los dominios constantes de las cadenas pesadas y ligeras humanas en lugar de las secuencias murinas homologas (ver Patente de E.U.A. No.4,816,567; Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)). El ADN codificante de anticuerpos puede ser unido covalentemente a la secuencia codificante de inmunoglobulina en su totalidad o parte de la secuencia codificante para un polipéptido no inmunoglobulina. Tal polipéptido no inmunoglobulina puede ser sustituido por los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o pueden sustituirse por los dominios variables de un sitio combinado de antigeno de un anticuerpo o de la invención para crear un anticuerpo quimérico bivalente.
Anticuerpos Humanos y Humanización de Anticuerpos Los anticuerpos monoclonales de la invención incluyen anticuerpos completamente humanos o anticuerpos humanizados. Estos anticuerpos son adecuados para la administración a humanos sin generar una respuesta inmune humana contra la inmunoglobulina administrada.
Un anticuerpo anti-Jagged es generado, por ejemplo, usando los procedimientos descritos en los ejemplos proporcionados más abajo.
En algunos métodos, el anticuerpo anti-Jagged es desarrollado, por ejemplo, usando métodos de presentación de fagos usando anticuerpos conteniendo sólo secuencias humanas. Tales planteamientos son bien conocidos en el arte, por ejemplo, en W092/01047 y Patente de E.U.A. No.6,521,404, que son aquí incorporados mediante referencia. En este método, se selecciona una librería combinacional de fagos llevando pares aleatorios de cadenas ligeras y pesadas usando fuentes naturales o recombinantes de Jagged 1, Jagged 2 y/o ambas o fragmentos de éstas. En otro método, un anticuerpo anti-Jagged puede producirse por un proceso donde al menos un paso del proceso incluye la inmunización de un animal transgénico, no humano con la proteína Jagged 1 humana, proteína Jagged 2 humana o ambas proteínas. En este estudio, algunos de los loci de la cadena endógena pesada y/o ligera kappa de este animal xenogénico no humano han sido desactivadas y son incapaz del rearreglo requerido para generar genes que codifican inmunoglobulinas en respuesta a un antígeno. Adicionalmente, al menos un locus de cadena pesada humana y al menos un locus de cadena ligera humana han sido transfectados establemente al animal. Por lo tanto en respuesta a un antígeno administrado, el rearreglo de los loci humanos proporciona genes codificando regiones inmunoespecíficas variables humanas para el antígeno. Luego de la inmunización, por lo tanto, el xenoratón produce células B que secretan inmunoglobulinas completamente humanas.
Una variedad de téenicas son bien conocidas en el arte por producir animales cenogénicos no humanos. Por ejemplo, ver la Pat. U.S. No.6,075,181 y No.6,150,584, la cual se incorpora aquí mediante referencia en su totalidad. Esta estrategia general fue demostrada en conexión con la generación de la primera raza de XenoRatón™ como se publicó en 1994. Ver Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994), que aquí se incorporó mediante referencia en su totalidad. Ver también, Patente de E.U.A. Nos. 6,162,963, 6,150,584, 6, 114,598, 6,075,181, y 5,939,598, Patentes Japonesas Nos.3 068 180 B2, 3068506 B2, y 3 068 507 B2 y Patente Europea No. EP 0463 151 B1 y las Aplicaciones de Patentes Internacionales No. WO 94/02602, WO 96/34096, WO 98/24893, WO 00/76310 y miembros relacionados de la familia.
En un estudio alternativo, otros han utilizado un estudio de "minilocus" en el que un locus Ig exógeno es imitado a través de la inclusión de piezas (genes individuales) del locus Ig. Por lo tanto, uno o más genes VH, uno o más genes DH, uno o más genes JH, una región constante mu, y una segunda región constante (por ejemplo, una región constante gamma) son formados en un constructo para su inserción en un animal. Ver, por ejemplo, Patente de E.U.A. Nos. 5,545,806; 5,545,807; 5,591,669; 5,612,205;5,625,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,643,763; 5,661,016; 5,721,367; 5,770,429; 5,789,215; 5,789,650; 5,814,318; 5,877; 397; 5,874,299; 6,023,010; y 6,255,458; y Patente Europea No.0 546 073 Bl; y la Solicitud de la Patente Internacional Nos. WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, y WO 98/24884 y miembros relacionados de la familia.
También se ha demostrado la generación de anticuerpos humanos de un ratón en el cual, a través de fusión de microcélulas, porciones largas de cromosomas, o cromosomas enteros, han sido introducidos. Ver Solicitud de Patente Europea Nos.773 288 y 843961.
Las respuestas de los anticuerpos humanos anti ratón (HAMA) han conducido a la industria a preparar anticuerpos quiméricos o humanizados. Cuando los anticuerpos quiméricos tienen una región constante humana y una región variable murina, se esperó observar las respuestas de ciertos anticuerpos humanos anti-quiméricos (HACA), particularmente en utilizaciones crónicas o de dosis múltiples del anticuerpo. Por lo tanto, seria deseable proporcionar anticuerpos completamente humanos contra Jagged 1, Jagged 2 y/o ambos para viciar o de otra forma mitigar las preocupaciones y/o efectos de la respuesta HAMA o HACA.
La producción de anticuerpos con inmunogenicidad reducida también se logró por medio de la humanización, quimerización y téenicas de visualización usando librerías apropiadas. Se apreciaría que los anticuerpos murinos o anticuerpos de otras especies pueden ser humanizados o primatizados usando técnicas bien conocidas en el arte. Ver, por ejemplo, Winter and Harris Immunol Today 14:4346 (1993) y Wright et al. Crit, Reviews in I unol. 12125-168 (1992). El anticuerpo de interés puede ser diseñado por téenicas de ADN recombinante para sustituir los dominios bisagra CH1, CH2, CH3, y/o el dominio marco con la secuencia humana correspondiente (Ver WO 92102190 y Patente de E.U.A. Nos. 5,530,101, 5,585,089, 5, 693,761, 5,693,792, 5,714,350, and 5,777,085). Además, el uso de Ig cDNA para la construcción de genes de inmunoglobulina quiméricos es conocido en el arte (Liu et al. P.N.A.S.84:3439 (1987) and J. Immunol. 139:3521 (1987)). El mRNA es aislado a partir de un hibridoma u otra célula productora del anticuerpo y se usó para producir cDNA. En cDNA de interés puede ser amplificado mediante la reacción en cadena de la polimerasa usando primers específicos (Pat. U.S. Nos.4,683, 195 y 4,683,202). Alternativamente, se hace una librería y se selecciona para aislar la secuencia de interés. La secuencia de ADN codificando la región variable del anticuerpo es luego fusionada a secuencias de región constante humanas. Las secuencias de genes de regiones constantes humanas pueden encontrarse en Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of immunological Interest, N.I.H. publication no.91-3242. Los genes de la región C humana están rápidamente disponibles a partir de clones conocidos. La elección del isotipo será guiada por las funciones deseadas del efector, como fijación del complemento, o actividad en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. Los isotipos adecuados son IgGl, IgG3 y IgG4. Se pueden usar las regiones constantes de cadena ligera, kappa o lambda. El anticuerpo quimérico es luego expresado por métodos convencionales.
Los fragmentos de anticuerpos, como Fv, F(ab')2 y Fab pueden prepararse por escisión de la proteína intacta, por ejemplo, mediante proteasa o escisión química. Alternativamente, un gen truncado es diseñado. Por ejemplo, un gen quimérico codificando un fragmento del fragmento F(ab')2 incluiría secuencias de ADN codificando el dominio CH1 y la región bisagra de la cadena H, seguida por un codón de detención translacional para producir la molécula truncada.
Las secuencias consenso de las regiones H, L y J pueden usarse para diseñar oligonucleótidos para ser usados como primers para introducir sitios útiles de restricción en la región J para la posterior ligación de los segmentos de la región V para os segmentos de la región C humanos. El cDNA de la región C puede modificarse por mutagénesis sitio dirigida para colocar un sitio de restricción en la posición análoga en la secuencia humana.
Los vectores de expresión incluyen plásmidos, retrovirus, YACs, episomas derivados de EBV, y similares. Un vector conveniente es uno que codifica una secuencia de inmunoglobulina CH o CL humana, con sitios de restricción apropiados y diseñados para que cualquier secuencia VH o VL pueda ser insertada fácilmente y ser expresada. En tales vectores, el splicing ocurre usualmente entre el donador del sitio de empalme en la región J insertada y el aceptor de empalme precediendo la región C humana, y además en las regiones de empalme que ocurren dentro de los exones CH humanos. La poliadenilacion y término de la transcripción ocurren en sitios cromosómicos nativos cadena debajo de las regiones codificantes. El anticuerpo resultante puede adjuntarse a cualquier promotor fuerte, incluyendo LTRs retrovirales, por ejemplo, el promotor temprano SV-40, (Okayama et al. Mol. Cell. Bio.3:280 (1983)), virus LTR del sarcoma de Rous (Gorman et al. P.N.A.S.79:6777 (1982)), y virus LTR de leucemia urina de Moloncy (Grosschedl et al. Cell 41:885 (1985)). Además, como se apreciará, se pueden usar promotores Ig nativos y similares.
Se pueden generar, adicionalmente, anticuerpos humanos o anticuerpos de otras especies a través de teenologías de visualización, incluyendo, sin limitaciones, visualización de fagos, de retrovirus de ribosomas y otras técnicas, usando técnicas bien conocidas en el arte y las moléculas resultantes pueden ser sometidas a maduración adicional, como maduración de afinidad, tales técnicas son bien conocidas en el arte.
Wright et al. Crit, Reviews in Immunol.12125-168 (1992), Hanes and Plückthun PNAS USA 94:4937-4942 (1997) (ribosomal display), Parmlcy and Smith Gene 73:305-318 (1988) (phage display), Scott, TIBS, vol.17:241-245 (1992), Cwirla et al. PNAS USA 87:6378-6382 (1990), Russel et al. Nucí. Acids Research 21:1081-1085 (1993), Hoganboom et al. Immunol. Reviews 130:43-68 (1992), Chiswell and McCafferty TIBTECH; 10:80-8A (1992), y Patente de E.U.A. No.5,733,743. Si se utilizan teenologías de visualización para producir anticuerpos no humanos, aquellos anticuerpos pueden ser humanizados como se describe más arriba.
Usando estas técnicas, los anticuerpos pueden ser generados para células expresando Jagged 1, Jagged 2 y/o ambas Jagged 1 y Jagged 2, formas de Jagged 1 y/o Jagged 2, epítopes o péptidos del mismo, y las mismas librerías de expresión (ver, por ejemplo, Patente de E.U.A. No.5,703,057) que puede ser visualizada posteriormente como se describió más arriba para las actividades aquí descritas.
Los anticuerpos Anti-Jagged de la invención pueden ser expresados por un vector conteniendo un segmento de ADN codificando el anticuerpo de cadena única descrito anteriormente.
Estos pueden incluir vectores, liposomas, DNA desnudo, DNA asistido con adyuvantes, pistolas de genes, catéteres, etc. Los vectores incluyen conjugados químicos como los descritos en WO 93/64701, que tienen una fragmento blanco (por ejemplo un ligando para un receptor de superficie celular), y una fragmento de ligación para ácidos nucleicos (por ejemplo, polilisina), vectores virales (por ejemplo, vector viral DNA o RNA), proteínas de fusión como las descritas en PCT/US 95/02140 (WO 95/22618) que es una proteina de fusión conteniendo una fragmento blanco (por ejemplo, un anticuerpo específico para una célula blanco) y una fragmento de ligación para ácidos nucleicos (por ejemplo, protamina), plásmidos, fagos, etc. Los vectores pueden ser cromosómicos, no cromosómicos o sintéticos.
Los vectores adecuados incluyen vectores vírales, proteínas de fusión y conjugados químicos. Los vectores retrovirales incluyen virus de leucemia murina de Moloncy. En algunas realizaciones se prefirió vectores virales de DNA. Estos vectores incluyen vectores de viruela, vectores de herpesvirus como el vector del virus herpes simplex I (HSV) (ver Geller, A. I. et al., J. Neurochem, 64:487 (1995); Lim, F., et al., in DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995); Geller, A. I. et al., Proc Nati. Acad. Sci.: U.S.A.90:7603 (1993); Geller, A. I., et al., Proc Nati. Acad. Sci USA 87:1149 (1990), Vectores de adenovirus (ver LeGal LaSalle et al., Science, 259:988 (1993); Davidson, et al., Nat. Genet 3:219 (1993); Yang, et al., J. Virol. 69:2004 (1995) y vectores virales adeno-asociados (ver Kaplitt, M. G. et al., Nat. Genet.8:148 (1994).
Los vectores de viruela virales introducen el gen en el citoplasma de la célula. Los vectores de virus Avipox resultan sólo en una expresión a corto plazo del ácido nucleico. En algunas realizaciones, los vectores de adenovirus, vectores de virus adenovirus-asociados y vectores de virus herpes simplex (HSV) son preferidos por introducir el ácido nucleico en células neurales. El vector de adenovirus resulta en una expresión a más corto plazo (cerca de 2 meses) que los virus adeno-asociados (alrededor de 4 meses), que a su vez es más corto que los vectores HSV. El vector particular elegido dependerá de la célula blanco y la condición a ser tratada. La introducción puede hacerse por téenicas estándar, por ejemplo, infección, transíección, transducción o transformación. Los ejemplos de los modos de transferencia de genes incluyen, por ejemplo, DNA desnudo, precipitación con CaP04, DEAE dextrano, electroporación, fusión de protoplastos, lipofección, microinyección de células y vectores virales.
El vector puede ser empleado para apuntar esencialmente a cualquier célula blanco deseada. Por ejemplo, la inyección estereotáxica puede usarse para dirigir a los vectores (por ejemplo, adenovirus, HSV) hacia una ubicación deseada. Adicionalmente, las partículas pueden ser entregadas por infusión intracerebroventricular (icv) usando un sistema de infusión con minibomba, como el sistema de Infusión SynchroMed. Un método basado en flujo bruto, denominado convección, también ha probado ser efectivo en la entrega de grandes moléculas a áreas extensas del cerebro, y puede ser útil al entregar el vector a la célula blanco, (ver Bobo et al·., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:2076-2080 (1994); Morrison et al., Am. J. Physiol. 266:292-305 (1994)). Se pueden usar otros métodos, incluyendo catéteres, inyección intravenosa, parenteral, intraperitoneal y subcutánea, oral y otras rutas conocidas de administración.
Estos vectores pueden ser usados para expresar grandes cantidades de anticuerpos que pueden usarse de diferentes maneras, por ejemplo, para detectar la presencia de Jagged 1, Jagged 2 y/o ambas en una muestra. El anticuerpo también puede ser usado para intentar ligar y alterar la señalización relacionada con Jagged 1, Jagged 2 y/o ambas.
Las téenicas pueden adaptarse para la producción de anticuerpos de cadena única específicos para una proteina antigénica de la invención (ver, por ejemplo, Patente de E.U.A. No.4,946,778). Además, los métodos pueden ser adaptados para la construcción de librerías de expresión Fab (ver, por ejemplo, Huse, et al., 1989 Science 246: 1275-1281) para permitir la identificación rápida y efectiva de fragmentos monoclonales Fab con la especificidad deseada para una proteina o sus derivados, fragmentos, análogos u homólogos de éstas. Los fragmentos de anticuerpo que contienen los idiotipos para una proteina antigeno pueden producirse mediante téenicas conocidas en el arte, incluyendo pero no limitándose a: (i) un fragmento F(ab')2 producido por la digestión con pepsina de una molécula anticuerpo; (ii) un fragmento Fab generado mediante la reducción de los puentes disulfuro de un fragmento F(ab')2; (iii) un fragmento Fab generado mediante el tratamiento de la molécula del anticuerpo con papaina y un agente reductor y (iv) fragmentos Fv.
La invención también incluye fragmentos de anticuerpo Fv, Fab, Fab' y F(ab')2, anticuerpos anti-Jagged de cadena única, anticuerpos anti-Jagged biespecificos, anticuerpos anti-jagged multiespecificos, y anticuerpos anti-Jagged heteroconjugados.
Los anticuerpos biespecificos son anticuerpos que tienen especificidades de ligación por lo menos con dos antigenos diferentes. En el caso presente, una de las especificidades de ligación es para Jagged 1 y Jagged 2. El segundo blanco de ligación es cualquier otro antigeno, y ventajosamente es una proteina de superficie celular, receptor o unidad de receptor.
Los métodos para producir anticuerpos biespecificos son conocidos en el arte. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecificos se basó en la coexpresión de 2 pares de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades (Milstein and Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)). Debido al ordenamiento aleatorio de las cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina, estos hibridomas (quadromas) producen una mezcla potencial de diferentes moléculas de anticuerpo, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecifica correcta. La purificación de la molécula correcta se realiza usualmente por pasos de cromatografía por afinidad. Se muestran procedimientos similares en WO 93/08829, publicado el 13 de Mayo de 1993, y en Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).
Los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de ligación deseadas (sitios de combinación antícuerpo-antígeno) pueden fusionarse en las secuencias de dominio constante de las inmunoglobulinas. La fusión es, en algunas realizaciones, con un dominio constante de la cadena pesada de una inmunoglobulina, comprendiendo al menos parte de la bisagra, regiones CH2 y CH3. Se prefirió tener la primera región constante de la cadena pesada en al menos una de las fusiones. Los DNAs codificando las fusiones de inmunoglobulina en la cadena pesada y, si se desea, la cadena ligera de la inmunoglobulina, son insertados en vectores separados de expresión, y son co-transfectados en organismos huéspedes adecuados. Para datos adicionales de la generación de anticuerpos específicos ver, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).
De acuerdo a otro estudio descrito en WO 96/27011, la interface entre un par de moléculas de anticuerpo puede diseñarse para maximizar el porcentaje de heterodímeros que son recuperados para el cultivo de células recombinantes. La interface comprende al menos una parte de la región CH3 del dominio constante de un anticuerpo. En este método, uno o más cadenas laterales pequeñas de aminoácidos de la interface de la primera molécula de anticuerpo son reemplazados con cadenas laterales más largas (por ejemplo, tirosina o triptófano). "Agujeros" compensatorios de tamaño idéntico o similar al largo de las cadenas grandes son creados sobre la interface de la segunda molécula de anticuerpo al reemplazar las cadenas laterales de aminoácidos grandes con pequeños (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento de un heterodímero sobre los productos no deseados como homodímeros.
Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos específicos F(ab')2). Las téenicas para generar anticuerpos específicos de fragmentos de anticuerpos han sido descritos en la literatura. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse usando ligación química. Brennan et al., Science 229:81 (1985) describe un procedimiento donde anticuerpos intactos son escindidos proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos son reducidos en presencia del agente de complejación ditiol arsenito de sodio para estabilizar los ditioles vecinos y prevenir la formación intermolecular de disulfuro. Los fragmentos F(ab')2 generados son luego convertidos a derivados del tionitrobenzoato (TBN). Uno de los derivados de Fab'-TNB es luego reconvertido a Fab'-tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y es mezclado con una cantidad equimolar del otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden usarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.
Adicionalmente, los fragmentos Fab' pueden recuperarse directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar anticuerpos biespecífíeos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992) describe la producción de la molécula de un anticuerpo biespecífico completamente humanizado F(ab')2. Cada fragmento Fab' fue secretado por separado a partir de E. coli y sometido al acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico formado fue capaz de ligarse a las células sobreexpresendo el receptor ErbB2 y a células T humanas normales, así como también gatillar la actividad litica de linfocitos citotóxicos humanos contra objetivos de tumor de mama humanos.
También se han descrito varias téenicas para producir y aislar fragmentos de anticuerpo biespecífíeos directamente de cultivos celulares recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecífíeos usando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992). Los péptidos de la cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se enlazaron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes por fusión genética. Los homodímeros de los anticuerpos fueron reducidos en la región bisagra para formar monómeros y luego se re-oxidaron para formar los heterodímeros de anticuerpos. Este método también puede ser utilizado para la producción de homodímeros. La tecnología de "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para producir fragmentos de anticuerpos biespecífíeos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) mediante un enlazador que es muy corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios de la misma cadena. De acuerdo a esto, los dominios VH y VL de un fragmento son forzados a aparearse con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, formando dos sitios de unión al antígeno. Otra estrategia para producir fragmentos de anticuerpo biespecificos es el uso de dimeros Fv de cadena simple (scFv o ScFv) también ha sido reportado. Ver Gruber et al., J. Immunol.152:5368 (1994).
Los anticuerpos con más de dos valencias son contemplados. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecificos. Tutt et al., J. Immunol.147:60 (1991).
Anticuerpos biespecificos que sirven de ejemplo pueden ligarse a dos epítopes diferentes, al menos uno de ellos se origina en el antigeno de la proteina de la invención. Alternativamente, se puede combinar un brazo anti-antigénico de una molécula de inmunoglobulina con un brazo que se liga a una molécula gatilladora sobre un leucocito como la molécula receptora de células T (por ejemplo CD2, CD3, CD28, o B7), o receptores Fe para IgG (FcyR), como FcyRI (CD64), FCYRII (CD32) y FcyRIII (CD16), asi como para enfocar los mecanismo de defensa celular para la célula que expresa el antígeno en particular. Los anticuerpos biespecificos también pueden usarse para dirigir agentes citotóxicos a células que expresan un antigeno particular. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión al antigeno y un brazo que se liga a un agente citotóxico o a un quelador radionicleido, como EOTUBE, DPTA, DOTA, o TETA. Otras realizaciones biespecificas de anticuerpo ligan el antigeno de la proteina aquí descrita y luego se ligan al factor del tejido (TF) Los anticuerpos conjugados también están dentro del objetivo de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos covalentemente unidos. Aquellos anticuerpos han, por ejemplo, sido propuestos para elegir como blanco células del sistema inmune hacia células no deseadas (ver Patente de E.U.A. No.. 4,676,980), y para el tratamiento de la infección por HIV (ver WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089). Está contemplado que los anticuerpos pueden ser preparados in vi tro usando métodos conocidos de química de proteínas sintéticas, incluyendo aquellas que involucran agentes de entrecruzamiento. Por ejemplo, las inmunotoxinas pueden construirse usando una reacción de intercambio de disulfuro o formando un enlace tioeter. Ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen iminotiolato y metil-4-mercabtobutirimidato y aquellos mostrados, por ejemplo, en la Patente de E.U.A. No. 4,676,980.
Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, así como para elevar, por ejemplo, la efectividad del anticuerpo para tratar enfermedades y desórdenes asociados con la señalización de Jagged 1 y/o Jagged 2. Por ejemplo, los residuos de cisteína pueden introducirse en la región Fe, permitiendo la formación de puentes disulfuro entre cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico generado puede tener una capacidad mejorada de internalización y/o incremento de la muerte celular mediada por complemento y de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). (Ver Carón et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992) and Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)). Alternativamente, un anticuerpo puede ser diseñado para tener regiones Fe duales y puede tener lisis de complemento mejorada y capacidades ADCC. (ver Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989)).
La invención también se relaciona con los inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico como una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de ésta), o un isótopo radiactivo (por ejemplo, un radioconjugado). Los agentes citotóxicos apropiados incluyen, por ejemplo, dolastatinas y sus derivados (por ejemplo auristatina E, AFP, MMAF, MMAE). Por ejemplo, el agente citotóxico es monometil auristatin E (MMAE). En algunas realizaciones, el agente es un agente seleccionado a partir del grupo listado en la tabla 30. En algunas realizaciones, el agente es una dolastatina. En algunas realizaciones, el agente es aurostatina E o un derivado del mismo. En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatin E (MMAE). En algunas realizaciones, el agente es un maitansinoide o un derivado maitansinoide. En algunas realizaciones, el agente es DM1 o DM4. En algunas realizaciones, el agente es una duocarmicina o un derivado del mismo. En algunas realizaciones, el agente es una calicheamicina o un derivado.
Las toxinas enzimáticamente activas y sus fragmentos que pueden ser usados incluyen cadena A de difteria, fragmentos activos no unibles de la toxina de difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas dianthin, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricothecenos. Una variedad de radionucleidos están disponibles para la producción de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen 212Bi, 64Cu, 125I, 131I, 131In, 99mTc, 90Y, 186Re, y 89Zr.
Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico están hechos usando una variedad de agentes bifuncionales de acoplamiento a proteínas como N-succinimidil-3- (2-piridilditiol) propionato (SPDP), iminotiolan (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (como dimetil adipimidato HCL), ásteres activos (como disuccinimidil suberato), aldehidos (como glutaraldehído), compuestos bis-azido (como bis (p- azidobenzoil) hexanediamina), derivados bis-diazonio (como bis-(p-diazoniumbenzoil)-etilenediamina), diisocianatos (como toliene 2,6-diisocianato), y compuestos de flúor bis-activos (como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, una inmunotoxina de ricino puede ser preparada como se describió en Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilen triaminepentaacético (MX-DTPA) marcado con 14C es un ejemplo de agente quelante para la conjugación de radionucleótidos para el anticuerpo. (Ver WO94/11026).
La tabla 30 muestra algunos de los ejemplos de agentes farmacéuticos que pueden emplearse en la invención aquí descrita pero de ninguna manera significa que sea una lista exhaustiva.
Tabla 30: ejemplos de agentes farmacéuticos para la conjugación AGENTES CITOTÓXICOS Auristatinas Turbostatina Auristatin E Fenstatinas Monometil auristatina E Hidroxifenstatina (MMAE) Desraetil auristatina E Espongistatina 5 (DMAE) Auristatina F Espongistatina 7 Monometil auristatina F Halistatina 1 (MMAF) Desmetil auristatina F Halistatina 2 (DMAF) Derivados de Halistatina 3 Auristatina (amidas) Auristatin tiramina Briostatinas Modificadas Auristatin quinolina Halocomstatinas Pirrolobencimidazoles Dolastatinas (PBI) Derivados de Cibrostatina 6 dolastatina Dolastatina 16 DmJ Doxaliform Análogos de Dolastatina 16 Dpv antracielinas, Maitansinoides, p.ej. Análogos de DM-1; DM-4 antraciclinas, Derivados de Maitansinoide Análogo de Cemadotina, Duocarmicina (CemCH2-SH) Derivados de Toxina A de Pseudomonas Duocarmicina, (PE38) variante Alfa-amanitina Toxina A de Pseudomonas (ZZ-PE38) variante Antraciclinas ZJ-101 Doxorubicina OSW-1 Daunorubicina derivados 4- Nitrobenciloxicarbonil de la 06-Bencilguanina Briostatinas Inhibidores de Topoisomerasa, Camptotecina Hemiasterlina Derivados de Cefalotaxina Camptotecina Camptotecina 7- Homoharringtonina sustituída 10, 11- Pirrolobenzodiazepina, Difluorometilenedioxicamptot dimeros (PBDs) ecina Combretastatinas Pirrolobenzodiazepenos funcionalizados Debromoaplisiatoxina Calicheamicinas Kahalalide-F Podofilotoxinas Discodermolida Taxanos Ecteinascidinas Alcaloides Vinca, ANTIVIRALES REACTIVOS CONJUGABLES DE DETECCIÓN Fluoresceina y sus Aciclovir derivados Fluoresceina Vira A isotiocianato (FITC) (Tabla 30 continúa en la Simetrel siguiente página) ANTIFUNGICOS Nistatina ANTI -NEOPLÁSICOS ADICIONALES RADIOFARMACÉUTICOS Adriamicina 125 J Cerubidina 1311 Bleomicina ; Alkeran Velban 123 J Oncovina 1311 Fluorouracil "mTc Metotrexato 201T1 Tiotepa 133Xe Bisantreno nC Novantrona 62Cu Tioguanina 18 p Procarabizina 68Ga Citarabina 13N 150 ANTI -BACTERIANOS 38K Aminoglicosidos 82Rb Estreptomicina "mTc (Tecnecio) Neomicina Kanamicina METALES PESADOS Amikacina Bario Gentamicina Oro Tobramicina Platino Estreptomicina B Espectinomicina AN I-MICOPLASMICOS Ampicilina Tilosina Sulfanilamida Espectinomicina Polimixina Cloramfenicol Los que tienen cierto dominio en el arte reconocerán que se puede acoplar una gran variedad de fracciones a los anticuerpos resultantes de la invención (Ver, por ejemplo, "Conjúgate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, New York, (1989), todo el contenido del cual está incorporado aquí por referencia).
El acoplamiento puede ser realizado por cualquier reacción química que unirá las dos moléculas mientras que el anticuerpo y la otra fracción retengan sus actividades respectivas. Esta ligación puede incluir muchos mecanismos químicos, por ejemplo unión covalente, unión por afinidad unión coordinada y formación de complejos. En algunas realizaciones, la unión preferida es, sin embargo, la unión covalente. Esta puede ser alcanzada ya sea por condensación directa de cadenas laterales existentes o por la incorporación de moléculas puente externas. Muchos agentes bivalentes o polivalentes son útiles al acoplar moléculas de proteína, tales como los anticuerpos de la invención presente, hacia otras moléculas. Por ejemplo, los agentes representativos de acoplamiento pueden incluir compuestos orgánicos como tioésteres, carbodiimidas, ésteres de succinimida, diisocianatos, glutaraldehido, diazobencenos y hexametilen diaminas. Esta lista no es exhaustiva para las varias clases de agentes de acoplamiento conocidos en el arte, pero es un ejemplo de los agentes de acoplamiento más comunes.
(Ver Killen and Lindstrom, Jour. Im un.133:1335-2549 (1984); Jansen et al., Immunological Reviews 62:185-216 (1982); y Vitetta et al., Science 238:1098 (1987).
Los enlazadores apropiados se encuentran descritos en la literatura. (Ver, por ejemplo, Ramakrishnan, S. et al., Cáncer Res. 44:201-208 (1984) que describe el uso de MBS (ester M- maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida). Ver también la Patente de E.U.A. No. 5,030,719, que describe el uso de un derivado halogenado de acetil hidrazida acoplado a un anticuerpo por medio de un oligopéptido de enlace. Los enlazadores particularmente adecuados incluyen: (i) SMPT (4-succinimidiloxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-pridil-dithio)-tolueno (Pierce Chem. Co., Cat. (21558G); (ii) SPDP (succinimidil-6-[3-(2-piridilditio)propionamido] hexanoato (Pierce Chem. Co., Cat #21651G); y (iii) Sulfo-LC-SPDP (sulfosuccinimidil 6 [3-(2-piridilditio)-propianamida] hexanoato (Pierce Chem. Co. Cat. #2165-G.
Los enlazadores descritos anteriormente contienen componentes que tienen diferentes atributos, produciendo conjugados con diferentes propiedades fisicoquímicas. Por ejemplo, el enlazador SMPT contiene un puente disulfuro estéricamente oculto, y puede formar conjugados con estabilidad incrementada. Las uniones disulfuro son, en general, menos estables que otros enlaces porque el enlace disulfuro es escindido in vitro, resultando en menos conjugado disponible.
El reactivo EDC hidrocloruro de (l-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida es útil para crear un carboxamida inicial con un ácido carboxílico y una amina primaria o secundaria. Por lo tanto, EDC puede ser usado para enlazar residuos de lisina en un anticuerpo con un ácido carboxílico en un enlazador o toxina, o enlazar residuos de aspartato o glutamato en un anticuerpo con una amina en un enlazador o toxina. Tales reacciones de conjugación que utilizan EDC pueden ser mejoradas adicionando NHS (N-hidroxisuccinimida) o sulfo-NHS (N-hidroxi-3-oxisulfonilsuccinimida). La adición de NHS o sulfo-NHS a aquellas reacciones de conjugación pueden elevar la tasa, integridad, selectividad y/o reproducibilidad de las reacciones de conjugación.
En algunas realizaciones, los enlazadores son escindibles. En algunas realizaciones, los enlazadores no son escindibles. En algunas realizaciones, se encuentran presentes dos o más enlazadores. Los dos o más enlazadores son todos los mismos, por ejemplo, escindibles o no escindibles, o los dos o más enlazadores son diferentes, por ejemplo, al menos uno es escindible y al menos uno es no escindible.
La presente invención utiliza varios métodos para ligar agentes a los AB: (a) unión a las fracciones carbohidrato del AB, o (b) unión a los grupos sulfhidrilo de las AB, o (c) unión a los grupos amino del AB, o (d) unión a los grupos carboxilato del AB. De acuerdo a la invención, los ABs pueden ser covalentemente ligados a un agente mediante un enlazador intermediario que tiene al menos dos grupos reactivos, uno para reaccionar con AB y uno para reaccionar con el agente. El enlazador, que puede incluir cualquier compuesto orgánico compatible, puede ser elegido con de tal forma que la reacción con AB (o el agente) no afecte adversamente la reactividad y selectividad del AB. Adicionalmente, la ligación del enlazador al agente podría no destruir la actividad del agente. Los enlazadores apropiados para la reacción con anticuerpos oxidados o fragmentos de anticuerpo oxidados incluyen a los que contienen una amina seleccionada a partir del grupo consistente de amina primaria, amina secundaria, hidracina, hidrazida, hidroxilamina, fenilhidrazina, semicarbazida y tiosemicarbazida. Tales grupos funcionales reactivos pueden existir como parte de la estructura del enlazador, o pueden ser introducidos mediante la modificación adecuada de los enlazadores que no contienen aquellos grupos.
De acuerdo a la presente invención, los enlazadores adecuados para la ligación con los ABs reducidos incluyen aquellos que tienen ciertos grupos reactivos capaces de la reacción con un grupo sulfhidrilo de un anticuerpo reducido o fragmento. Tales grupos reactivos incluyen, pero no están limitados a: grupos haloalquilo reducido (incluyendo, por ejemplo, grupos haloacetilo), grupos p-mercuribenzoato y grupos capaces de hacer reacciones de adición tipo Michael (incluyendo, por ejemplo, maleimidas y grupos del tipo descrito por Mitra and Lawton, 1979, J. Amer. Chem. Soc.101: 3097-3110).
De acuerdo a la presente invención, los enlazadores adecuados para la unión a Abs no oxidados ni reducidos incluyen aquellos que poseen ciertos grupos funcionales capaces de reaccionar con los grupos amino primarios presentes en los residuos de U sina no modificados en el Ab. Tales grupos reactivos incluyen, pero no están limitados a, ásteres carboxílicos o carbónicos de NHS, ásteres carboxilicos o carbónicos de pentafluorofenilos, acil imidazoles, isocianatos e isotiocianatos.
De acuerdo a la presente invención, los enlazadores adecuados para la ligación para Abs no oxidados ni reducidos incluyen aquellos que tienen ciertos grupos funcionales capaces de reaccionar con los grupos de ácido carboxilico presentes en los residuos aspartato o glutamato en el Ab, los cuales han sido activados con reactivos adecuados. Los reactivos de activación adecuados incluyen EDC con o sin NHS o sulfo-NHS agregado, y otros agentes deshidratantes utilizados para la formación de carboxamida. En estas instancias, los grupos funcionales presentes en los enlazadores adecuados incluirían aminas primarias y secundarias, hidracinas, hidroxilaminas e hidrazidas.
El agente puede ser ligado al enlazador antes o después de ligar el enlazador al AB. En ciertas aplicaciones, podría ser deseable producir primero un intermediario AB-enlazador en el que el enlazador está libre de un agente asociado. Dependiendo de la aplicación particular, un agente específico puede entonces ser ligado covalentemente al enlazador. En otras realizaciones, el AB es primero ligado al MM, CM y enlazadores asociados y luego enlazado al enlazador con propósitos de conjugación.
Enlazadores ramificados: en realizaciones específicas, se utilizan los enlazadores ramificados que tienen sitios múltiples para la ligación de agentes. Para los enlazadores de sitios múltiples, una sola ligación covalente a un AB resultaría en un intermediario AB-enlazador capaz de ligar un agente en varios sitios. Los sitios pueden ser grupos aldehido o sulfhidrilo de cualquier sitio químico al que los agentes puedan ser ligados.
Alternativamente, se puede alcanzar una actividad específica más alta (o una proporción más alta de agentes para el AB) al ligar un solo enlazador de sitio a una pluralidad de sitios sobre el AB. Esta pluralidad de sitios puede ser introducida en el AB por dos métodos. Primero, uno puede generar múltiples grupos aldehido y/o sulfhidrilo en el mismo AB. Segundo, uno puede ligar a un aldehido o sulfhidrilo del AB un "enlazador ramificado" poscyendo múltiples sitios funcionales para la posterior unión a los enlazadores. Los sitios funcionales del enlazador ramificado o enlazador de sitios múltiples pueden ser aldehido o grupos sulfhidrilo, o puede ser cualquier sitio químico al que los enlazadores pueden ser ligados. Se pueden obtener actividades especificas aún más altas al combinar estos dos enfoques, que es, ligar enlazadores de sitios múltiples en varios sitios sobre el AB.
Enlazadores escindibles : los enlazadores peptídicos que son susceptibles a la escisión por enzimas del sistema de complemento, tales como urikinasa, activador del plasminógeno de tejidos, tripsina, plasmina u otra enzima con actividad proteolítica pueden ser usados en una realización de la invención presente. De acuerdo a un método de la presente invención, un agente es ligado por medio de un enlazador susceptible a la escisión por el complemento. El anticuerpo es seleccionado de una clase que puede activar el complemento. El conjugado anticuerpo-agente, por lo tanto, activa la cascada de complemento y libera el agente en el sitio blanco. De acuerdo a otro método de la presente invención, un agente es ligado por medio de un enlazador susceptible a la escisión por enzimas que tienen actividad proteolítica como urokinasa, un activador de plasminógeno de tejido, plasmina o tripsina. Estos enlazadores escindibles son útiles en anticuerpos activables conjugados que incluyen una toxina extracelular, por ejemplo, por medio de un ejemplo no limitante, cualquier toxina extracelular mostrada en la tabla 30.
Ejemplos no limitantes de secuencias de enlace escindibles en la tabla 31.
Tabla 31: Ejemplos de secuencias de enlace para la conjugación Tipos de secuencias Secuencia de aminoácidos escindibles Secuencias de plasmina escindibles Pro-urokinasa PRFKIIGG (SEQ ID NO: 235) PRFRIIGG (SEQ ID NO: 236) TGF SSRHRRALD (SEQ ID NO: 237) Plasminógeno RKSS111RMRDVVL (SEQ ID NO: 238) Estafilokinasa SSSFDKGKYKKGDDA (SEQ ID NO: 239) SSSFDKGKYKRGDDA (SEQ ID NO: 240) Factor Xa, secuencias IEGR (SEQ ID NO: 241) escindibles IDGR (SEQ ID NO: 242) GGSIDGR (SEQ ID NO: 243) MMP, secuencias escindibles Gelatinasa, A PLGLWA (SEQ ID NO: 244) Colagenasa, secuencias escindibles Colágeno de piel de GPQGIAGQ (SEQ ID NO: 245) ternero (cadena al(I)) Colágeno de piel de GPQGLLGA (SEQ ID NO: 246) ternero (cadena a2(I)) Colágeno de cartílago GIAGQ (SEQ ID NO: 247) bovino (cadena al(II)) Colágeno de hígado GPLGIAGI (SEQ ID NO: 248) humano (cadena al(III)) a2M de humano GPEGLRVG (SEQ ID NO: 249) PZP de humano YGAGLGVV (SEQ ID NO: 250) AGLGVVER (SEQ ID NO: 251) AGLGISST (SEQ ID NO: 252) oíiM de rata EPQALAMS (SEQ ID NO: 253) QALAMSAI (SEQ ID NO: 254) 0Í2M de rata AAYHLVSQ (SEQ ID NO: 255) MDAFLESS (SEQ ID NO: 256) OÍII3(2J) de rata ESLPVVAV (SEQ ID NO: 257) ail3(27J) de rata SAPAVESE (SEQ ID NO: 258) Colagenasa de DVAQFVLT (SEQ ID NO: 259) fibroblastos humanos (escisiones autoliticas) VAQFVLTE (SEQ ID NO: 260) AQFVLTEG (SEQ ID NO: 261) PVQPIGPQ (SEQ ID NO: 262) En adición, los agentes pueden ligarse por medio de puentes disulfuro (por ejemplo, los puentes disulfuro en una molécula de cisteina) al AB. Debido a que muchos tumores liberan naturalmente altos niveles de glutatión (un agente reductor) esto puede reducir los puentes disulfuro con la subsecuente liberación del agente en el sitio de entrega. En ciertas realizaciones especificas, el agente reductor que modificaría una CM también modificaría el enlazador del anticuerpo activable conjugado.
Espaciadores y elementos escindibles : en otra realización, podría ser necesario construir el enlazador de manera que optimice el espaciamiento entre el agente y el AB del anticuerpo activable. Esto puede ser logrado usando un enlazador de la estructura general: W - (CH2)n - Q Donde: W es — NH— CH2— o --CH2— ; Q es un aminoácido, péptido; y N es un entero de 0 a 20 En otras realizaciones, el enlazador podría incluir un elemento espaciador y un elemento escindible. El elemento espaciador sirve para posicionar el elemento escindible lejos del núcleo del AB de tal forma que el elemento escindible es más accesible a la enzima responsable de la escisión. Ciertos enlazadores ramificados descritos anteriormente podrían servir como elementos espaciadores.
A través de esta discusión, se debe incluir que la ligación del enlazador al agente (o del elemento espaciador al elemento escindible, o del elemento escindible al agente) no necesita ser de un modo particular de ligación o reacción. Cualquier reacción que produzca un producto de estabilidad adecuada y compatibilidad biológica es aceptable.
Complemento sérico y selección de enlazadores : de acuerdo a un método de la presente invención, cuando se desea liberar un agente, se usa un AB que es un anticuerpo de una clase que puede activar el complemento. El conjugado resultante retiene la capacidad de unirse al antígeno y activar la cascada del complemento. Por lo tanto, de acuerdo a esta realización de la presente invención, se une un agente a un final del enlazador escindible o elemento escindible y el otro final del grupo enlazador es ligado a un sitio específico del AB. por ejemplo, si el agente tiene un grupo hidroxi o un grupo amino, puede ser ligado al carboxi terminal de un péptido, aminoácido u otro enlazador adecuadamente elegido por medio de un enlace éster o amida, respectivamente. Por ejemplo, aquellos agentes podrían ser ligaos al péptido enlazador por medio de una reacción carbodimida. Si el reactivo contiene grupos funcionales que interferirían con la unión al enlazador, estos grupos funcionales interfirientes pueden ser bloqueados antes de la ligación y desbloqueados una vez que se hace el conjugado del producto o intermediario. El opuesto o amino terminal del enlazador es usado entonces ya sea directa o después de una modificación para ligarse a un AB que es capaz de activar el complemento.
Los enlazadores (o elementos espaciadores de enlazadores) pueden ser de cualquier longitud deseada, con un extremo que puede estar covalentemente ligado a sitios específicos sobre el AB del anticuerpo activable. El otro extremo del enlazador o elemento espaciador puede ser ligado a un aminoácido o enlazador péptido.
Entonces, cuando estos conjugados se unen al antígeno en presencia del complemento, la unión amida o éster que liga el agente al enlazador será escindida, resultando en la liberación del agente en su forma activa. Estos conjugados, cuando se administran a un paciente, cumplirán con entregar y liberar el agente en el sitio blanco, y son particularmente efectivos para la entrega in vivo de agentes farmacéuticos, antibióticos, antimetabolitos, agentes antiproliferativos y similares a los presentados pero no limitados a los de la tabla 30.
Enlazadores para la liberación sin activación del complemento: en otra aplicación de entrega dirigida, la liberación del agente sin la activación del complemento es deseada ya que la activación de la cascada del complemento terminaría U sando la célula blanco. Por lo tanto, este enfoque es útil cuando la entrega y liberación del agente debe ser realizada sin matar a la célula blanco. Tal es el objetivo cuando se desea entregar mediadores celulares como hormonas, enzimas, corticoesteroides, neurotransmisores, genes o enzimas a las células blanco. Estos conjugados pueden prepararse ligando el agente a un AB que no es capaz de activar el complemento por medio de un enlazador que es ligeramente susceptible a la escisión por proteasas séricas. Cuando este conjugado es administrado a un paciente, se formarán los complejos antígeno-anticuerpo rápidamente, mientras que la escisión del agente ocurrirá lentamente, resultando en la liberación del compuesto en el sitio blanco.
Entrecruzadores bioquímicos: en otras realizaciones, el anticuerpo activable puede ser conjugado a uno o más agentes terapéuticos usando ciertos entrecruzadores bioquímicos. Los reactivos entrecruzadores forman puentes moleculares que mantienen juntos los grupos funcionales de dos moléculas diferentes. Para enlazar dos proteínas diferentes de manera escalonada, se pueden usar enlazadores hetero-bifuncionales que eliminan la formación de homopolímeros no deseados.
También son útiles los enlazadores peptidil escindibles por proteasas lisosomales, por ejemplo, Val-Cit, Val-Ala u otros dipéptidos. Adicionalmente, se pueden usar enlazadores ácido-lábiles escindibles en ambientes con pH bajo del lisosoma, por ejemplo: bis-sialil éter. Otros enlazadores adecuados incluyen sustratos catepsina-lábiles, particularmente aquellos que muestran función óptima en pH ácido.
Los ejemplos de entrecruzadores hetero-funcionales están mostrados en la tabla 32.
Tabla 32: ejemplos de entrecruzadores hetero-bifuncionales ENTRECRUZADORES HETERO-BIFUNCIONALES Longitu d del brazo espaciador después del entrecruzam Enlaza Reactive Ventajas y iento dor hacia aplicaciones (Angstroms) SMPT Aminas Mayor 11.2 Á primarias estabilidad Sulfhidrilo s SPDP Aminas Tiolación 6.8 Á primarias Sulfhidrilo Entrecruzamie s nto escindióle LC- Aminas Brazo 15.6 A SPDP primarias espaciador extendido Sulfhidrilo Sulfo- Aminas Brazo 15.6 Á LC-SPDP primarias espaciador extendido Sulfhidrilo Soluble en agua SMCC Aminas Grupo 11.6 A primarias reactive maleimida estable Sulfhidrilo Conjugación enzima-anticuerpo Conjugación Hapteno-proteína vehículo Sulfo- Aminas Grupo 11.6 Á SMCC primarias reactive maleimida estable Sulfhidrilo Soluble en agua Conjugación Enzima-anticuerpo MBS Aminas Conjugación 9.9 Á primarias enzima-anticuerpo Sulfhidrilo Con jugación Hapteno-proteína vehículo Sulfo- Aminas Soluble en 9.9 Á MBS primarias agua Sulfhidrilo SIAB Aminas Conjugación 10.6 A primarias enzima-anticuerpo Sulfhidrilo Sulfo- Aminas Soluble en 10.6 A SIAB primarias agua Sulfhidrilo s SMPB Aminas Brazo 14.5 A primarias espaciador extendido Sulfhidrilo Conjugación enzima-anticuerpo Sulfo- Aminas Brazo 14.5 Á SMPB primarias espaciador extendido Sulfhidrilo Soluble en s agua EDE/Su Aminas Conjugación 0 lfo-NHS primarias Hapteno-proteína vehículo Grupos carboxilo ABH Carbohidrat Reacciona con 11.9 Á os grupos azúcar No selectivo Enlazadores no escindidles o ligación directa : en otras realizaciones de la invención, el conjugado puede ser diseñado para que el agente sea entregado al blanco pero no sea liberado. Esto puede realizarse ligando un agente al AB directamente o por medio de un enlazador no escindible.
Estos enlazadores no escindibles pueden incluir aminoácidos, péptidos, D-aminoácidos u otros compuestos orgánicos que pueden ser modificados para incluir grupos funcionales que pueden ser posteriormente utilizados en la unión a ABs por los métodos aquí descritos. Una fórmula general para tales enlazadores orgánicos podría ser: W - (CH2)n - Q Donde: W es — NH— CH2— o --CH2— ; Q es un aminoácido, péptido; y n es un entero de 0 a 20.
Conjugados no escindibles : alternativamente, un compuesto puede ser ligado a los ABs que no activan el complemento. Cuando se usan ABs que son incapaces de activar el complemento, esta ligación puede realizarse usando enlazadores que son susceptibles a la escisión por el complemento activado o usando enlazadores que no son susceptibles a la escisión por complemento activado.
Los anticuerpos aquí mostrados también pueden ser formulados como inmunoliposomas. Los liposomas conteniendo el anticuerpo son preparados por métodos conocidos en el arte, tales como los descritos en Epstein et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); y U.S. Pat. Nos.4,485,045 y 4,544,545. Los liposomas con tiempo de circulación mejorada son mostrados en la Patente de E.U.A. No.5,013,556.
Se pueden generar liposomas particularmente útiles por evaporación en fase reversa con una composición de lípidos comprendiendo fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas son extruidos a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con un diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la invención presente pueden ser conjugados a los liposomas como se describe en Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982) por medio de una reacción de intercambio disulfuro.
Anticuerpos An i-Jagged activables Los anticuerpos activables y las composiciones de los anticuerpos activables dados aquí contienen al menos un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de éste (mencionado colectivamente como AB durante la descripción), que liga especifreamente Jagged 1 y Jagged 2, donde el AB es modificado por una grupo enmascarante (MM).
Cuando el AB es modificado con un MM y está en presencia de Jagged 1 y/o Jagged 2, la unión especifica del AB a su blanco es reducida o inhibida al compararse a la unión especifica del AB no modificado con un MM o la unión especifica del AB parental al blanco.
El Kd del AB modificado con una MM hacia el blanco, por ejemplo, Jagged 1 y Jagged 2, es al menos 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000, 500.000, 1,000,000, 5,000,000, 10,000,000, 50,000,000 o mayor, o entre 5-10, 10-100, 10-1,000, 10-10,000, 10-100,000, 10-1,000,000, 10-10,000,000, 100-1,000, 100-10,000, 100-100,000, 100-1,000,000, 100-10,000,000, 1,000-10,000, 1,000-100,000, 1,000-1,000,000, 1000-10,000,000, 10,000-100,000, 10,000- 1.000.000, 10,000-10,000,000, 100,000-1,000,000, o 100,000- 10,000,000 veces mayor que el Kd del AB no modificado con un MM o el AB parental hacia el blanco. Contrariamente, la afinidad de unión del AB modificado con un MM hacia el blanco, por ejemplo, Jagged 1 y/o Jagged 2, es al menos 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000, 500,000, 1,000,000, 5,000,000, 10,000,000, 50,000,000 o mayor, o entre 5-10, 10-100, 10-1,000, 10-10,000, 10-100,000, 10- 1,000,000, 10-10,000,000, 100-1,000, 100-10,000, 100-100,000, 100-1,000,000, 100-10,000,000, 1,000-10,000, 1,000-100,000, 1,000-1,000,000, 1000-10,000,000, 10,000-100,000, 10,000-1,000,000, 10,000-10,000,000, 100,000-1,000,000, o 100,000- 10.000.000 veces menor que la afinidad de unión del AB no modificado con un MM o el AB parental hacia el blanco.
La constante de disociación (Kd) del MM hacia el AB es generalmente mayor que el Kd del AB hacia el blanco, por ejemplo, Jagged 1 y Jagged 2. El Kd del MM hacia el AB puede ser al menos 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 10.000, 100,000, 1,000,000 o incluso 10,000,000 veces mayor que el Kd del AB hacia el blanco, por ejemplo, Jagged 1 y Jagged 2. Contrariamente, la afinidad de unión del MM hacia el AB es generalmente menor que la afinidad de unión del AB hacia el blanco, por ejemplo, Jagged 1 y Jagged 2.
Cuando el AB es modificado con un MM y está en presencia del blanco, por ejemplo Jagged 1 y Jagged 2, la unión especifica del AB a su blanco es reducida o inhibida, al compararse con la unión específica del AB no modificado con un MM o la unión específica del AB parental con el blanco. Al compararse a la unión del AB no modificado con un MM o la unión del AB parental al blanco, por ejemplo, Jagged 1 y Jagged 2, la capacidad del AB para unirse al blanco cuando es modificado con un MM puede reducirse en al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% e incluso 100% por al menos 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, o 96 horas, o 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, o 180 días, o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 meses o más cuando se midieron en un ensayo in vivo o in vitro.
El MM inhibe la unión del AB al blanco, por ejemplo, Jagged 1 y Jagged 2. El MM liga el dominio de unión al antígeno del AB e inhibe la ligación del AB con Jagged 1 y Jagged 2. El MM puede inhibir esféricamente la unión del AB con el blanco, por ejemplo Jagged 1 y Jagged 2. El MM puede inhibir alostéricamente la unión del AB con el blanco, por ejemplo Jagged 1 y Jagged 2. En estas realizaciones, cuando el AB es modificado o ligado a un MM y está en presencia del blanco, por ejemplo Jagged 1 y Jagged 2, no hay unión o sustancialmente no unión del AB con el blanco, o no más de 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 2%, 3%, 4 4%%, 5c%Oo.,f 6%o., 77/% oo,,f 8Oo%?o./, 9 9%%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, o 50% de unión del AB con el blanco, al compararse a la unión del AB no modificado con un MM, el AB parental o el AB no ligado a un MM hacia el blanco, por al menos 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, o 96 horas, o 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, o 180 dias, o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 meses o más cuando se midieron en un ensayo in vivo o in vitro.
Cuando AB es ligado a o modificado mediante un MM, el MM "enmascara" o reduce o inhibe la unión especifica del AB a Jagged 1 y Jagged 2. Cuando un AB es acoplado a o modificado mediante un MM, tal acoplamiento o modificación puede ocasionar un cambio estructural que reduce o inhibe la capacidad del AB para unirse específicamente a su blanco.
Un AB acoplado a o modificado con un MM puede ser representado por la siguientes fórmulas (en orden desde una región amino (N) terminal hacia una región carboxi (C) terminal : (MM)-(AB) (AB)-(MM) (MM)-L-(AB) (AB)-L-(MM) Donde MM es una grupo enmascarante, AB es un anticuerpo o fragmento de éste, y L es un enlazador. En muchas realizaciones, podría ser deseable insertar uno o más enlazadores como por ejemplo enlazadores flexibles en la composición, para darle flexibilidad.
En ciertas realizaciones, el MM no es un compañero natural de unión del AB. En algunas realizaciones, el MM no contiene o contiene no sustancialmente homología con cualquier compañero natural de unión del AB. En otras realizaciones, el MM no es mayor al 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, o 80% similar a cualquier compañero natural de unión del AB. En algunas realizaciones, el MM no es mayor al 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, o 80% idéntico a cualquier compañero natural de unión del AB. En algunas realizaciones, el MM no es mayor al 25% idéntico a cualquier compañero natural de unión al AB. En algunas realizaciones, el MM no es mayor al 50% idéntico a cualquier compañero natural de unión al AB. En algunas realizaciones, el MM no es mayor al 20% idéntico a cualquier compañero natural de unión al AB. En algunas realizaciones, el MM no es mayor al 10% idéntico a cualquier compañero natural de unión al AB.
En algunas realizaciones, los anticuerpos activables incluyen un AB que está modificado mediante un MM y también incluye uno o más fracciones escindibles (CM). Tales anticuerpos activables muestran unión activable/conmutable para el blanco de AB, por ejemplo Jagged 1 y Jagged 2. Los anticuerpos activables incluyen generalmente un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (AB), modificado por o ligado a una grupo enmascarante (MM) y a una fracción modificable o escindible (CM). En algunas realizaciones, el CM contiene una secuencia de aminoácidos que sirve como sustrato para una proteasa de interés.
Los elementos de los anticuerpos activables están arreglados para que el MM y CM estén posicionados de manera que en estado escindido (o relativamente activo) y en presencia de un blanco, el AB se une al blanco, por ejemplo Jagged 1 y Jagged 2, mientras que en estado no escindido (o relativamente inactivo) en presencia del blanco, la unión especifica del AB a su blanco, por ejemplo, Jagged 1 y Jagged 2, es reducida o inhibida. La unión especifica del AB a su blanco puede reducirse debido a la inhibición o enmascaramiento de la capacidad de AB mediante un MM.
El Kd del AB modificado con un MM y un CM hacia el blanco, por ejemplo, Jagged 1 y Jagged 2, es al menos 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000, 500.000, 1,000,000, 5,000,000, 10,000,000, 50,000,000 o mayor, o entre 5-10, 10-100, 10-1,000, 10-10,000, 10-100,000, 10- 1.000.000, 10-10,000,000, 100-1,000, 100-10,000, 100-100,000, 100-1,000,000, 100-10,000,000, 1,000-10,000, 1,000-100,000, 1,000-1,000,000, 1000-10,000,000, 10,000-100,000, 10,000- 1.000.000, 10,000-10,000,000, 100,000-1,000,000, o 100,000- 10.000.000 veces mayor que el Kd del AB no modificado con un MM y un CM o el AB parental hacia el blanco, por ejemplo, Jagged 1 y Jagged 2. Contrariamente, la afinidad de unión del AB modificado con un MM y un CM hacia el blanco, por ejemplo, Jagged 1 y Jagged 2, es al menos 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000, 500,000, 1,000,000, 5,000,000, 10,000,000, 50,000,000 o mayor, o entre 5-10, 10-100, 10-1,000, 10-10,000, 10-100,000, 10-1,000,000, 10-10,000,000, 100-1,000, 100-10,000, 100-100,000, 100-1,000,000, 100-10,000,000, 1,000-10,000, 1,000-100,000, 1,000-1,000,000, 1000-10,000,000, 10,000-100,000, 10,000-1,000,000, 10,000-10,000,000, 100,000-1,000,000, o 100,000-10,000,000 veces mayor que la afinidad de unión del AB no modificado con un MM y un CM o el AB parental hacia el blanco, por ejemplo, Jagged 1 y Jagged 2.
Cuando un AB es modificado con un MM y un CM y está en presencia del blanco pero no en presencia de un agente modificante (por ejemplo, una proteasa), la unión especifica del AB a su blanco, por ejemplo Jagged 1 y Jagged 2, es reducida o inhibida, al compararse a la unión especifica del AB no modificado con una MM y un CM o el AB parental hacia el blanco.
Cuando se comparó a la unión del AB parental o la unión de un AB no modificado con un MM y un CM hacia su blanco, la capacidad de AB para unirse al blanco al ser modificado con un MM y un CM puede reducirse en al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% e incluso 100% por al menos 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, o 96 horas o 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, o 180 días, o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 meses o más cuando se midió en un ensayo in vivo o in vitro.
Como se usó aquí, el término estado escindido se refiere a la condición de los anticuerpos activables luego de la modificación del CM mediante una proteasa. El término estado no escindido, como se usa aquí, se refiere a la condición de los anticuerpos activables en la ausencia de escisión del CM mediante una proteasa. Como se discutió más arriba, el término "anticuerpos activables" es usado aquí para referirse a un anticuerpo activadle en estado no escindido (nativo), así como en su estado escindido. Será aparente para el artesano hábil que en algunas realizaciones, un anticuerpo activadle escindido puede carecer de MM debido a la escisión del CM por una proteasa, resultando en la liberación de al menos el MM (por ejemplo donde el MM no está ligado a los anticuerpos activables mediante un enlace covalente (por ejemplo, un enlace disulfuro entre los residuos de cisterna).
Por activadle o conmutable se quiere decir que el anticuerpo activable muestra un primer nivel de unión al blanco, es decir, Jagged 1 y/o Jagged 2, cuando en un estado inhibido, enmascarado o no escindido (es decir, una segunda conformación), donde el segundo de unión al blanco es mayor que el primer nivel de unión. En general, el acceso al blanco para el AB del anticuerpo activadle es mayor en presencia de un agente de escisión capaz de escindir el CM que en la ausencia de aquel agente de escisión. Por tanto, cuando el anticuerpo activable está en estado no escindido, el AB es inhibido de unirse al blanco y puede ser enmascarado de la unión al blanco (es decir, la primera conformación es aquella en que AB no puede unirse al blanco), y en el estado escindido el AB no está inhibido o está desenmascarado para unirse al blanco.
El CM y AB de los anticuerpos activables son seleccionados para que el AB represente una fracción de unión para Jagged 1 y Jagged 2, y el CM representa un sustrato para una proteasa que está co-localizada con Jagged 1 y Jagged 2 en el sitio de tratamiento o sitio de diagnóstico en un paciente. Los anticuerpos activables mostrados aquí hallan un uso particular cuando, por ejemplo, una proteasa capaz de escindir un sitio en el CM está presente en niveles relativamente más altos en tejidos conteniendo el blanco de un sitio de tratamiento o de diagnóstico que en tejidos de sitios de no-tratamiento (por ejemplo, tejido saludable).
En algunas realizaciones, los anticuerpos activables brindan una reducción de la toxicidad y/o efectos colaterales adversos que podrían de otra manera resultar de la unión del AB en sitios de no tratamiento si el AB no estuviese enmascarado o inhibido de unirse a Jagged 1 y Jagged 2.
En general, un anticuerpo activable puede diseñarse seleccionando un AB de interés y construyendo el resto del anticuerpo activable para que, cuando esté conformacionalmente limitado, el MM brinde un enmascaramiento del AB o reduzca la unión del AB a su blanco. Se deben tomar en cuenta criterios de diseño estructural para dar esta característica funcional.
Se proporcionan anticuerpos activables que muestran un fenotipo conmutable de un rango dinámico para la unión al blanco en una conformación inhibida versus una conformación no inhibida. El rango dinámico se refiere generalmente a una proporción de (a) un nivel máximo detectado de un parámetro bajo un primer conjunto de condiciones a (b) un valor mínimo detectado de tal parámetro bajo un segundo conjunto de condiciones. Por ejemplo, en el contexto de un anticuerpo activable, el rango dinámico se refiere a la proporción de (a) un nivel máximo detectado de proteína blanco, por ejemplo, Jagged 1 y Jagged 2, uniéndose a un anticuerpo activable en presencia de una proteasa capaz de escindir el CM de los anticuerpo activables a (b) el nivel mínimo detectado de proteína blanco, por ejemplo, Jagged 1 y Jagged 2, uniéndose a un anticuerpo activable en ausencia de la proteasa. El rango dinámico de un anticuerpo activable puede calcularse como la proporción de la constante de equilibrio de disociación de un agente de escisión del anticuerpo activadle (por ejemplo, una enzima) para la constante de equilibrio de disociación de los anticuerpos activadles escindiendo el agente de tratamiento. Mientras mayor sea el rango dinámico de un anticuerpo activable, mejor conmutable es el fenotipo del anticuerpo activable. Los anticuerpos activadles con valores de rango dinámico más altos (por ejemplo, mayores a 1) muestran más fenotipos de conmutación deseables por lo que tal unión a la proteina blanco mediante anticuerpos activables ocurre en una gran cantidad (es decir, ocurre predominantemente) en presencia de un agente de escisión (por ejemplo, una enzima) capaz de escindir el CM de los anticuerpos activables que en ausencia de un agente de escisión.
Los anticuerpos activables pueden proporcionarse en una variedad de configuraciones estructurales. Las fórmulas de ejemplo para los anticuerpos activables son dadas abajo. Se contempló específicamente que el orden N- a C- terminal del AB, MM y CM puede revertirse en un anticuerpo activable. También se ha contemplado específicamente que el CM y MM pueden solaparse en una secuencia de aminoácidos, por ejemplo, para que el CM esté contenido en el MM.
Por ejemplo, los anticuerpos activables pueden ser representados por la siguiente fórmula (en orden desde una región amino (N) terminal hasta la región carboxilo (C) terminal: (MM)-(CM)-(AB) (AB)-(CM)-(MM) Donde MM es una grupo enmascarante , CM es una fracción escindióle, u AB es un anticuerpo o fragmento de éste. Se debe notar que aunque MM y CM están indicados como componentes distintos en las fórmulas anteriores, en todas las 0 realizaciones de ejemplo (incluyendo las fórmulas) de las que aquí se muestran se ha contemplado que las secuencias de aminoácidos del MM y CM podrían solaparse, por ejemplo, para que el CM esté completa o parcialmente contenido dentro del MM. En adición, la fórmula dada más arriba proporciona 5 secuencias adicionales de aminoácidos que podrían estar posicionadas en el N terminal o C terminal en los elementos de los anticuerpos activables.
En ciertas realizaciones, el MM no es un compañero natural de unión del AB. En algunas realizaciones, el MM no contiene o 0 sustancialmente no tiene homología con cualquier compañero natural de unión al AB. En otras realizaciones, el MM no es mayor al 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, o 80% similar a cualquier compañero natural e unión al AB. En algunas realizaciones, el MM no es mayor al 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, o 80% idéntico a cualquier compañero natural de unión al AB. En algunas realizaciones, el MM no es mayor al 50% idéntico a cualquier compañero natural de unión al AB. En algunas realizaciones, el MM no es mayor al 25 % idéntico a cualquier compañero natural de unión al AB. En algunas realizaciones, el MM no es mayor al 20% idéntico a cualquier compañero natural de unión al AB. En algunas realizaciones, el MM no es mayor al 10% idéntico a cualquier compañero natural de unión al AB.
En muchas realizaciones podría ser deseable insertar uno o más enlazadores, por ejemplo, enlazadores flexibles, en el constructo del anticuerpo activable para darle flexibilidad en una o más uniones MM-CM, la unión CM-AB, o ambas. Por ejemplo, el AB, MM y/o CM podrían no contener un número suficiente de residuos (por ejemplo, Gly, Ser, Asp, Asn, especialmente Gly y Ser, particularmente Gly) para brindar la flexibilidad deseada. Como tal, el fenotipo conmutable de aquel constructo de anticuerpo activable podría beneficiar a partir de la introducción de uno o más aminoácidos para dar un enlazador flexible. Adicionalmente, como se describió más abajo, donde el anticuerpo activable está proporcionado como un constructo conformacionalmente limitado, un enlazador flexible puede ser operablemente insertado para facilitar la formación y mantenimiento de una estructura cíclica en el anticuerpo activable no escindido.
Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un anticuerpo activable incluye una de las siguientes fórmulas (donde la fórmula abajo representa una secuencia de aminoácidos en dirección N- a C- terminal o en dirección C- a N- terminal): (MM)-Ll-(CM)-(AB) (MM)-(CM)-L2-(AB) (MM)-Ll-(CM)-L2-(AB) Donde MM, CM y AB son como se definió arriba, donde Ll y L2 están independiente y opcionalmente presentes o ausentes, son los mismos o diferentes enlazadores flexibles que incluyen al menos un aminoácido flexible (por ejemplo, Gly) . Adicionalmente, la fórmula de arriba proporciona secuencias de aminoácidos adicionales que podrían ubicarse N- terminal o C-terminal para los elementos de los anticuerpos activables. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, fracciones de direccionamiento (por ejemplo, un ligando para un receptor de una célula presente en un tejido blanco) y fracciones de extensión de la vida media (por ejemplo, polipéptidos que se unen a proteínas séricas como la inmunoglobulina (por ejemplo, IgG) o albúmina sérica (por ejemplo, albúmina sérica humana (HAS)).
En algunas realizaciones, la porción escindióle (CM) del anticuerpo activable incluye una secuencia de aminoácidos que pueden servir como sustrato para una proteasa, usualmente una proteasa extracelular. El CM puede seleccionarse en base a una proteasa que está co-localizada en tejidos con el blanco deseado del AB del anticuerpo activable. Se conoce una variedad de diferentes condiciones en el que el blanco de interés está co-localizado con una proteasa, donde el sustrato de la proteasa es conocido en el arte. En el ejemplo del cáncer, el tejido blanco puede ser un tejido canceroso, particularmente tejido canceroso de un tumor sólido. Hay reportes en la literatura de niveles incrementados de proteasas teniendo sustratos conocidos en muchos cánceres, por ejemplo, tumores sólidos. Ver, por ejemplo La Rocca et al, (2004) British J. of Cáncer 90(7): 1414-1421. Los ejemplos no limitantes de enfermedad incluyen: todos los tipos de cánceres (pecho, pulmón, colorectal, próstata, melanomas, cabeza y cuello, pancreático, etc), artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, SLE, daño cardiovascular, isquemia, etc. Por ejemplo, las indicaciones incluirían leucemias, incluyendo leucemia linfoblástica aguda de células T (T-ALL), enfermedades linfoblásticas incluyendo mieloma múltiple, y tumores sólidos, incluyendo pulmón, colorectal, próstata, pancreático y de mama, incluyendo cáncer de mama triple negativo. Por ejemplo, las indicaciones incluyen enfermedad ósea o métastasis en cáncer, sin importar el origen primario del tumor; cáncer de mama, incluyendo mediante un ejemplo no limitante, cáncer de mama ER/PR+, cáncer de mama Her2+, cáncer de mama triple negativo, cáncer colorectal, cáncer gástrico, glioblastoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón, como ejemplo no limitante el cáncer de células no pequeñas de pulmón; mieloma múltiple, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata, sarcoma, cáncer renal, como ejemplo no limitante, carcinoma de células renales, melanoma. En adición al cáncer, el señalamiento Notch Jagged-dependiente es critico para la diferenciación epitelial y de fibroblastos hacia miofibroblastos, células con un rol central en el desarrollo de la enfermedad fibrótica. La inhibición de la señalización Notch Jagged-dependiente y, por lo tanto, la inhibición de la emergencia de miofibroblastos, seria un efectivo tratamiento para enfermedades fibróticas del riñón, hígado, pulmón y piel. Por ejemplo, las indicaciones incluirían un desorden fibrótico como la fibrosis pulmonar idiopática (IPF); enfermedad fibrótica renal, enfermedad fibrótica hepática, fibrosis peritoneal inducida por diálisis y/o escleroderma. Otras indicaciones adecuadas incluyen, por ejemplo, una patología como por ejemplo pérdida de audición.
El CM es escindido específicamente por una enzima a una tasa de alrededor de 0.001-1500 x 104 M-1S-1 o al menos 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2.5, 5, 7.5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 500, 750, 1000, 1250, o 1500 x 104 M_1S_1.
Para la escisión específica mediante una enzima, se hace contacto entre la enzima y el CM. Cuando el anticuerpo activadle que comprende un AB ligado a un MM y un CM está en presencia del blanco y suficiente actividad enzimática, el CM puede ser escindido. Con actividad enzimática suficiente se habla de la capacidad de la enzima para hacer contacto con el CM y realizar la escisión. Se puede prever rápidamente que una enzima puede estar en la vecindad del CM pero es incapaz de escindir debido a otros factores celulares o modificaciones proteicas de la enzima.
Los ejemplos de sustratos incluyen pero no se limitan a los sustratos escindibles por una o más de las siguientes enzimas o proteasas en la tabla 33: - ADAMTS1 Legumaina ADAMTS4 Serino proteasas por Catepsina K Catepsina L Por ejemplo, en algunas realizaciones, el sustrato es escindible por una o más de las siguientes enzimas o proteasas: uPA, legumaina, MT-SPl, ADAM17, BMP-1, TMPRSS3, TMPRSS4, MMP-9, MMP-12, MMP-13, y/o MMP-14. En algunas realizaciones, la proteasa es seleccionada a partir del grupo de uPA, legumaina y MT-SPl. En algunas realizaciones, la proteasa es una matriz metaloproteinasa.
Los enlazadores adecuados para ser usados en las composiciones aquí descritas son generalmente las que brindan flexibilidad del AB hacia el blanco. Aquellos enlazadores están relacionados generalmente a enlazadores flexibles. Los enlazadores adecuados que pueden ser rápidamente seleccionados y pueden ser de cualquier longitud adecuada, tales como las de 1 aminoácido (por ejemplo, GLy) hasta 20 aminoácidos, de 2 aminoácidos a 15 aminoácidos, de 3 aminoácidos a 12 aminoácidos, incluyendo 4 aminoácidos a 10 aminoácidos, 5 aminoácidos a 9 aminoácidos, 6 aminoácidos a 8 aminoácidos, 7 aminoácidos a 8 aminoácidos y puede ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 aminoácidos de longitud.
Los enlazadores flexibles que sirven de ejemplo incluyen polímeros de glicina (G)n, polímeros de glicina-serina (incluyendo, por ejemplo, (GS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 123) y (GGGS)n (SEQ ID NO: 124), donde n es un entero de al menos 1), polímeros de glicina-alanina, polímeros de alanina-serina y otros enlazadores flexibles conocidos en el arte. Los polímeros de glicina y glicina-serina son relativamente no estructurados, por lo que son capaces de servir como amarre neutral entre los componentes. La glicina permite significantemente más espacio phi-psi que incluso la alanina, y es mucho menos restringida que los residuos con cadenas laterales más largas (ver Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)). Los enlazadores flexibles que sirven de ejemplo incluyen, pero no se limitan a Gly-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 125), Gly-Gly-Ser- Gly-Gly (SEQ ID NO: 126), Gly-Ser-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 127), Gly-Ser-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 128), Gly-Gly-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 129), Gly-Ser-Ser-Ser-Gly (SEQ ID NO: 130), y similares. El artesano hábil reconocerá que el diseño de un anticuerpo activable puede incluir enlazadores que son completa o parcialmente flexibles, por lo que el enlazador puede incluir un enlazador flexible así como una o más posiciones que le confieren una estructura menos flexible para obtener la estructura deseada de los anticuerpos activables.
En adición a los elementos descritos arriba, los anticuerpos activables pueden contener elementos como, por ejemplo, secuencias de aminoácidos N- o C-terminales de los anticuerpos activables. Por ejemplo, los anticuerpos activables pueden incluir una fracción blanco para facilitar la entrega a una célula o tejido de interés. Los anticuerpos activables pueden ser conjugados con un agente, como un agente terapéutico, un agente antineoplásico, una toxina o un fragmento de ésta, una fracción detectadle o un agente de diagnóstico. Los ejemplos de agentes están mostrados aquí.
Los anticuerpos activables también pueden incluir cualquiera de los agentes conjugados, enlazadores y otros componentes descritos aquí en conjunción con un anticuerpo anti-Jagged de la invención, incluyendo por medio de un ejemplo no limitante, cualquiera de los agentes listados en la tabla 30 y/o cualquiera de los enlazadores listados en la tabla 31 y/o 32.
Anticuerpos Anti-Jagged activables que tienen fracciones estéricas no vinculantes o compañeros de unión para fracciones estéricas no vinculantes La invención también proporciona anticuerpos anti-Jagged activables que incluyen fracciones estéricas no vinculantes (NB) o compañeros de unión (BP) para las fracciones estéricas no vinculantes, donde el BO recluta o atrae al NB hacia el anticuerpo anti-Jagged activable. Los anticuerpos anti-Jagged activables proporcionados aquí incluyen, por ejemplo, un anticuerpo anti-Jagged que incluye una fracción esférica no vinculante (NB), un enlazador escindible (CL) y un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (AB) que se liga a Jagged 1 y Jagged 2; un anticuerpo activable que incluye una BP para la que se ha reclutado un NB, un CL y un AB que se liga a Jagged 1 y Jagged 2. Los anticuerpos activables en los que el NB está ligado covalente ligado al CL y AB del anticuerpo anti-Jagged activable o están asociados mediante interacción con un BP que está covalentemente ligado al CL y AB del anticuerpo anti-Jagged activable son mencionados aquí como "anticuerpos anti-Jagged activables conteniendo NB". Por activable o conmutable se quiere decir que el anticuerpo activable muestra un primer nivel de unión a un blanco, por ejemplo, Jagged 1 y/o Jagged 2, cuando el anticuerpo activable está en un estado inhibido, enmascarado o no escindido (por ejemplo, una primera conformación) y un segundo nivel de unión al blanco cuando el anticuerpo activable está en un estado no inhibido, desenmascarado y/o escindido (por ejemplo, una segunda conformación, anticuerpo activado), donde el segundo nivel de unión al blanco es mayor que el primer nivel de unión al banco. Las composiciones de anticuerpos activables pueden mostrar biodisponibilidad incrementada y biodistribución más favorable en comparación a las terapias convencionales con anticuerpos.
En algunas realizaciones, los anticuerpos activables brindan una toxicidad y/o efectos colaterales adversos reducidos que podrían de otra manera resultar de la unión del AB anti-Jagged en sitios de no-tratamiento y/o no diagnóstico si el AB anti-Jagged no estuviera enmascarado o inhibido de unirse a aquel sitio.
En una realización, el anticuerpo activable incluye una fracción estérica no vinculante (NB); un enlazador escindióle (CL) y un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (AB) que se une específicamente a Jagged 1 y Jagged 2, donde el NB es un polipéptido que no se une específicamente al AB; el CL es un polipéptido que incluye un sustrato (S) para una enzima; el CL está posicionado de manera que en un estado no escindido, el NB interfiere con la unión del AB a Jagged 1 y/o Jagged 2; y el NB no inhibe la escisión del CL por la enzima. Como se usó aquí y durante la descripción, el término polipéptido se refiere a cualquier polipéptido que incluye al menos 2 residuos de aminoácido, incluyendo polipéptidos más grandes, proteínas de tamaño completo y fragmentos de éstas, y el término polipéptido no está limitado a polipéptidos de cadena única y puede incluir polipéptidos multi-unidad (por ejemplo, multi-cadena) . En casos donde el polipéptido es de longitud más corta, por ejemplo, menos de 50 aminoácidos en total, los términos péptido y polipéptido son usados de manera intercambiable, y en casos donde el polipéptido es de más largo, por ejemplo 50 aminoácidos o mayor, los términos polipéptido y proteina son usados de manera intercambiable.
En una realización, el anticuerpo activable incluye una fracción estérica no vinculante (NB); un enlazador escindióle (CL) y un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (AB) que se liga específicamente a Jagged 1 y Jagged 2, donde (i) el NB incluye un polipéptido que no se liga específicamente al DB; (ii) CL es un polipéptido de hasta 50 aminoácidos de longitud que incluye un sustrato (S) para una enzima; (iii) el C1 está posicíonado de manera que en el estado no escindido, el NB interfiere con la ligación del AB a Jagged 1 y/o Jagged 2; y (iv) el NB no inhibe la escisión del CL por la enzima. Por ejemplo, el CL tiene una longitud de hasta 15 aminoácidos, una longitud de hasta 20 aminoácidos, una longitud de hasta 25 aminoácidos, una longitud de hasta 30 aminoácidos, una longitud de hasta 40 aminoácidos, una longitud de hasta 45 aminoácidos, una longitud de hasta 50 aminoácidos, una longitud en el rango de 10 - 50 aminoácidos, una longitud en el rango de 20 - 50 aminoácidos, una longitud en el rango de 25 - 50 aminoácidos, una longitud en el rango de 30 - 50 aminoácidos, una longitud en el rango de 35 - 50 aminoácidos, una longitud en el rango de 40 - 50 aminoácidos, una longitud en el rango de 45 - 50 aminoácidos, una longitud en el rango de 10 - 40 aminoácidos, una longitud en el rango de 15 - 40 aminoácidos, una longitud en el rango de 20 - 40 aminoácidos, una longitud en el rango de 30 - 40 aminoácidos, una longitud en el rango de 35 - 40 aminoácidos, una longitud en el rango de 10 - 30 aminoácidos, una longitud en el rango de 15 - 30 aminoácidos, una longitud en el rango de 20 - 30 aminoácidos, una longitud en el rango de 25 - 30 aminoácidos, una longitud en el rango de 10 - 20 aminoácidos, o una longitud en el rango de 10 - 15 aminoácidos En una realización, el anticuerpo activable incluye una fracción estérica no vinculante (NB); un enlazador escindible (CL); y un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (AB) que se liga específicamente a Jagged 1 y Jagged 2, donde (i) el NB incluye un polipéptido que no se liga específicamente al AB; (ii) el CL es un polipéptido que incluye un sustrato (S) para una enzima; (iii) el CL está posicionado de tal modo que en estado no escindido el NB interfiere con la ligación del AB a Jagged 1 y/o Jagged 2, y en un estado escindido, el NB no interfiere con la ligación del AB a Jagged 1 y/o Jagged 2; (iv) el NB no inhibe la escisión del CL por la enzima; y (v) el anticuerpo activable tiene el arreglo estructural desde N-terminal a C-terminal como sigue en el estado no escindido: NB-CL-AB o AB-CL-NB.
En una realización, el anticuerpo activable incluye una fracción estérica no vinculante (NB); un enlazador escindible (CL) y un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (AB) que se liga específicamente a Jagged 1 y Jagged 2, donde (i) el NB incluye un polipéptido que no se liga específicamente al AB; (ii). el CL es un polipéptido que incluye un sustrato (S) para una enzima; (iii) el CL está posicionado de manera que en estado no escindido el NB interfiere con la ligación del AB a Jagged 1 y/o Jagged 2, y en estado escindido el NB no interfiere con la ligación del AB a Jagged 1 y/o Jagged 2, y donde el NB en el anticuerpo activable no escindido reduce la capacidad del AB para unirse a Jagged 1 y/o Jagged 2 por al menos 50%, por ejemplo, por al menos 60%, por al menos 70%, por al menos 75%, por al menos 80%, por al menos 85%, por al menos 90%, por al menos 95%, por al menos 96%, por al menos 97%, por al menos 98%, por al menos 99%, por al menos 100% al compararse a la capacidad del AB escindido de ligarse a Jagged ly/o Jagge 2; y (iv) el NB no inhibe la escisión del CL por la enzima. La reducción en la capacidad del AB para ligarse a Jagged ly/o Jagged 2 es determinada, por ejemplo, usando un ensayo aquí descrito o un ensayo de desplazamiento de blanco in vitro como, por ejemplo, el ensayo descrito en Documentos PCT de Nos. de publicación. WO 2009/025846 y WO 2010/081173.
En una realización, el anticuerpo activable incluye un compañero de ligación (BP) para una fracción esférica no vinculante (NB), un enlazador escindióle (CL) y un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (AB) que se liga específicamente a Jagged 1 y Jagged 2, donde el BP es un polipéptido que se liga al NB cuando es expuesto al mismo; el NB no se liga específicamente al AB; el CL es un polipéptido que incluye un sustrato (S) para una enzima; el CL está posicionado de tal manera que, en un estado no escindido y en presencia del NB, el NB interfiere con la ligación del AB a Jagged ly/o Jagged 2, y en un estado escindido, el NB no interfiere con la ligación del AB con Jagged 1 y/o Jagged 2 y el BP no interfiere con la ligación del AB a Jagged 1 y/o Jagged 2; y el NB y el BP no inhiben la escisión del CL por la enzima. En algunos ejemplos de esta realización, el BP del anticuerpo activable está ligado opcionalmente al NB. En una realización, el NB es reclutado por el BP del anticuerpo activable in vivo.
En algunos ejemplos de algunas de estas realizaciones de anticuerpos anti-Jagged activables, el anticuerpo anti-Jagged activable es formulado como una composición. En algunas de estas realizaciones, la composición también incluye el NB, donde el NB está co-formulado con el anticuerpo anti-Jagged activable que incluye el BP, CL y AB. En algunos ejemplos de esta realización, el BP es seleccionado del grupo consistente de un péptido de unión a albúmina, un péptido de unión al fibrinógeno, un péptido de unión a fibronectina, un péptido de unión a fibronectina, un péptido de unión a hemoglobina, un péptido de unión a transferrina, un péptido de unión al dominio inmunoglobulina, y otros péptidos de unión a proteínas séricas.
En algunos ejemplos de algunas realizaciones de estos anticuerpos anti-Jagged activables, el NB es una proteína globular soluble. En algunos ejemplos de algunas realizaciones de estos anticuerpos anti-Jagged activables, el NB es una proteína que circula en la sangre. En algunos ejemplos de algunas realizaciones de estos anticuerpos anti-Jagged activables, el NB es seleccionado del grupo consistente de albúmina, fibrinógeno, fibronectina, hemoglobina, transferrina, un dominio inmunoglobulina y otras proteínas séricas.
En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpos anti-Jagged activables, el CL es un polipéptido que incluye las realizaciones de anticuerpos anti-Jagged, la proteasa está co-localizada con Jagged 1 y/o Jagged 2 en un tejido, y la proteasa escinde el CL en el anticuerpo anti-Jagged activable cuando el anticuerpo activable es expuesto a la proteasa. En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpos anti-Jagged, el CL es un polipéptido de hasta 50 aminoácidos de longitud. En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpos anti-Jagged, el CL es un polipéptido que incluye un sustrato (S) teniendo una longitud de hasta 15 aminoácidos, por ejemplo, 3 aminoácidos de largo, 4 aminoácidos de largo, 5 aminoácidos de largo, 6 aminoácidos de largo, 7 aminoácidos de largo, 8 aminoácidos de largo, 9 aminoácidos de largo, 10 aminoácidos de largo, 11 aminoácidos de largo, 12 aminoácidos de largo, 13 aminoácidos de largo, 14 aminoácidos de largo o 15 aminoácidos de largo.
En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpos anti-Jagged, el anticuerpo activable tiene el arreglo estructural desde el extremo N-terminal hasta C-terminal como sigue en el estado no escindido: NB-CL-AB, AB-CL-NB, BP-CL-AB o AB-CL-BP. En realizaciones donde el anticuerpo anti-Jagged activable incluye un BP, y el anticuerpo activable está en presencia del NB correspondiente, el anticuerpo activable tiene un arreglo estructural desde N-terminal a C-terminal como sigue en el estado no escindido: NB:BP-CM-AB o AB-CM-BP :NB, donde representa una interacción, por ejemplo, unión entre el NB y el BP.
En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpos anti-Jagged, el anticuerpo activable incluye un anticuerpo o fragmento de unión al antigeno que se liga específicamente a Jagged 1 y Jagged 2 y es un anticuerpo monoclonal, dominio anticuerpo, cadena simple, fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un scFv, un scab, un dAb, una cadena de anticuerpos de cadena simple y dominio único, y un anticuerpo de cadena ligera y de dominio único. En algunas realizaciones, como un anticuerpo o un fragmento inmunológicamente activo o un fragmento de este que se liga a Jagged 1 y Jagged 2 es un anticuerpo de ratón, quimérico, humanizado o completamente humano y monoclonal.
En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpos anti-Jagged, el anticuerpo activadle incluye una combinación de una secuencia VH CDR1, una secuencia VH CDR2, una secuencia VH CDR3, una secuencia VL CDR1, una secuencia VL CDR2 y una secuencia VL CDR3 seleccionada de las combinaciones mostradas en la tabla 2. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable incluye una combinación de una secuencia VH CDR1, una secuencia VH CDR2, una secuencia VH CDR3, una secuencia VL CDR1, una secuencia VL CDR2 y una secuencia VL CDR3 que son al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idénticas a las secuencias mostradas en la tabla 2.
Los anticuerpos anti-Jagged de la invención incluyen anticuerpos que contienen una combinación de una secuencia VH CDR1, una secuencia VH CDR2, una secuencia VH CDR3, una secuencia VL CDR1, una secuencia VL CDR2 y una secuencia VL CDR3 de al menos un anticuerpo seleccionado del grupo consistente del anticuerpo 4D11, el anticuerpo 4B2, el anticuerpo 4E7, el anticuerpo 4E11, el anticuerpo 6B7 y el anticuerpo 6F8.
Los anticuerpos anti-Jagged de la invención incluyen anticuerpos que contienen una combinación de una secuencia VH CDR1, una secuencia VH CDR2, una secuencia VH CDR3, una secuencia VL CDR1, una secuencia VL CDR2 y una secuencia VL CDR3, donde al menos una secuencia CDR es seleccionada a partir del grupo consistente de una secuencia VH CDRl que incluye al menos la secuencia de aminoácidos SYAMS (SEQ ID NO: 200); una secuencia VH CD2 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos SIDPEGRQTYYADSVKG (SEQ ID NO: 208); una secuencia VH CDR3 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos DIGGRSAFDY (SEQ ID NO: 209); una secuencia VL CDRl que incluye al menos la secuencia de aminoácidos RASQSISSY (SEQ ID NO: 210); una secuencia VL CDR2 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos AASSLQS (SEQ ID NO: 211); y una secuencia VL CDR3 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos QQTVVAPPL (SEQ ID NO: 212).
Los anticuerpos anti-Jagged de la invención incluyen anticuerpos que contienen una combinación de una secuencia VH CDRl, una secuencia VH CDR2, una secuencia VH CDR3, una secuencia VL CDRl, una secuencia VL CDR2 y una secuencia VL CDR3, donde al menos una secuencia CDR es seleccionada a partir del grupo consistente de una secuencia VH CDRl que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos SYAMS (SEQ ID NO: 200); una secuencia VH CD2 que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos SIDPEGRQTYYADSVKG (SEQ ID NO: 208); una secuencia VL CDRl que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos RASQSISSY (SEQ ID NO: 210); una secuencia VL CDR2 que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos AASSLQS (SEQ ID NO: 211); y una secuencia VL CDR3 que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos QQTVVAPPL (SEQ ID NO: 212).
Los anticuerpos anti-Jagged de la invención incluyen anticuerpos que contienen una secuencia VHCDR1 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos SYAMS (SEQ ID NO: 200); una secuencia VH CDR2 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos SIDPEGRQTYYADSVKG (SEQ ID NO: 208); una secuencia VH CDR3 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos DIGGRSAFDY (SEQ ID NO: 209); una secuencia VL CDRl que incluye al menos la secuencia de aminoácidos RASQSISSY (SEQ ID NO: 210); una secuencia VL CDR2 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos AASSLQS (SEQ ID NO: 211); y una secuencia VL CDR3 que incluye al menos la secuencia de aminoácidos QQTVVAPPL (SEQ ID NO: 212).
Los anticuerpos anti-Jagged de la invención incluyen anticuerpos que contienen una secuencia VH CDR1 que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos SYAMS (SEQ ID NO: 200); una secuencia VH CD2 que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos SIDPEGRQTYYADSVKG (SEQ ID NO: 208); una secuencia VH CDR3 que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntico a la secuencia de aminoácidos DIGGRSAFDY (SEQ ID NO: 209); una secuencia VL CDRl que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos RASQSISSY (SEQ ID NO: 210); una secuencia VL CDR2 que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos AASSLQS (SEQ ID NO: 211); y una secuencia VL CDR3 que incluye una secuencia que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos QQTVVAPPL (SEQ ID NO: 212).
En algunos ejemplos de algunos de estas realizaciones de anticuerpos anti-Jagged activables, el anticuerpo activable incluye una combinación de una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera seleccionada de las combinaciones listadas en la tabla 4. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable incluye una combinación de una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera que son al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idénticas a las combinaciones listadas en la tabla 4.
En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpos anti-Jagged activables, el anticuerpo activable también incluye un agente conjugado con el AB. En algunas realizaciones, el agente es un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el agente es un agente antineoplásico. En algunas realizaciones, el agente es una toxina o un fragmento de ésta. En algunas realizaciones, el agente está conjugad con AB mediante un enlazador. En algunas realizaciones, el agente es un enlazador escindible. En algunas realizaciones, el agente es un agente seleccionado del grupo listado en la tabla 30. En algunas realizaciones, el agente es una dolastatina. En algunas realizaciones, el agente es una auristatina o derivado de ésta. En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatina E (MMAE). En algunas realizaciones, el agente es un maitansinoide o derivado de maitansinoide. En algunas realizaciones, el agente es DM1 o DM4. En algunas realizaciones, el agente es una duocarmicina o un derivado de ésta. En algunas realizaciones, el agente es una calicheamicina o un derivado de ésta.
En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpos anti-Jagged activables, el anticuerpo activable también incluye una fracción detectable. En algunas realizaciones, la fracción detectable es un agente de diagnóstico.
En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpos anti-Jagged activables, el anticuerpo activable también incluye un espaciador. En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpos anti-Jagged activables, el anticuerpo activable también incluye un péptido señal. En algunas realizaciones, el péptido señal está conjugado con el anticuerpo activable mediante un espaciador. En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpos anti-Jagged activables, el espaciador está ligado directamente al MM del anticuerpo activable.
En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpos anti-Jagged activables, la vida media sérica del anticuerpo activable es al menos de 5 dias al ser administrado a un organismo. En algunas realizaciones, la vida media sérica del anticuerpo activable es al menos 4 dias cuando es administrado a un organismo. En algunas realizaciones, la vida media sérica del anticuerpo activable es al menos 3 dias cuando es administrado a un organismo. En algunas realizaciones, la vida media sérica del anticuerpo activable es al menos 2 dias cuando es administrado a un organismo. En algunas realizaciones, la vida media sérica del anticuerpo activable es de al menos 24 horas cuando es administrado a un organismo. En algunas realizaciones, la vida media sérica del anticuerpo activable es de al menos 20 horas cuando es administrado a un organismo. En algunas realizaciones, la vida media sérica del anticuerpo activable es de al menos 18 horas cuando es administrado a un organismo. En algunas realizaciones, la vida media sérica del anticuerpo activable es de al menos 16 horas cuando es administrado a un organismo. En algunas realizaciones, la vida media sérica del anticuerpo activable es de al menos 14 horas cuando es administrado a un organismo. En algunas realizaciones, la vida media sérica del anticuerpo activable es de al menos 12 horas cuando es administrado a un organismo. En algunas realizaciones, la vida media sérica del anticuerpo activable es de al menos 10 horas cuando es administrado a un organismo. En algunas realizaciones, la vida media sérica del anticuerpo activable es de al menos 8 horas cuando es administrado a un organismo.
En algunas realizaciones, la vida inedia sérica del anticuerpo activadle es de al menos 6 horas cuando es administrado a un organismo. En algunas realizaciones, la vida media sérica del anticuerpo activable es de al menos 4 horas cuando es administrado a un organismo. En algunas realizaciones, la vida media sérica del anticuerpo activable es de al menos 3 horas cuando es administrado a un organismo.
La invención también proporciona una molécula aislada de ácido nucleico codificando cualquiera de estos anticuerpos anti-Jagged activables, así como también los vectores que incluyen estas secuencias aisladas de ácido nucleico. La invención proporciona métodos para producir un anticuerpo activable mediante el· cultivo de células bajo condiciones que llevan a la expresión del anticuerpo activable, donde la célula incluye tal secuencia de ácido nucleico. En algunas realizaciones, la célula dispone de tal vector.
La constante de disociación (Kd) del anticuerpo activable conteniendo NB hacia el blanco es mayor que el Kd del AB hacia el blanco cuando no está asociado con el NB ni el NB:BP. La constante de disociación (Kd) del anticuerpo activable que contiene nB hacia el blanco es mayor al Kd del AB parental hacia el blanco. Por ejemplo, el Kd del anticuerpo activable conteniendo NB hacia el blanco es al menos 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000, 500. 000, 1, 000, 000, 5, 000, 000, 10, 000, 000, 50, 000, 000 o mayor, o entre 5-10, 10-100, 10-1, 000, 10-10, 000, 10-100, 000, 10- 1.000.000, 10-10,000,000, 100-1,000, 100-10,000, 100-100,000, 100-1,000,000, 100-10,000,000, 1,000-10,000, 1,000-100,000, 1,000-1,000,000, 1000-10,000,000, 10,000-100,000, 10,000- 1.000.000, 10,000-10,000,000, 100,000-1,000,000, o 100,000- 10.000.000,veces mayor que el Kd del AB cuando no está asociado con el NB o NB:BP o el Kd del parental AB hacia el blanco. Por el contrario, la afinidad de ligación del anticuerpo activable conteniendo NB hacia el blanco es menor que la afinidad de ligación del AB cuando no está asociado con el NB o NB:BP o menor que la afinidad de ligación del parental AB hacia el blanco. Por ejemplo, la afinidad de ligación del anticuerpo activable conteniendo NB hacia el banco es al menos 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 10,000, 50,000, 100.000, 500,000, 1,000,000, 5,000,000, 10,000,000, 50,000,000 o mayor, o entre 5-10, 10-100, 10-1,000, 10-10,000, 10-100,000, 10-1,000,000, 10-10,000,000, 100-1,000, 100-10,000, 100-100,000, 100-1,000,000, 100-10,000,000, 1,000-10,000, 1,000-100,000, 1,000-1,000,000, 1000-10,000,000, 10,000-100,000, 10.000-1,000,000, 10,000-10,000,000, 100,000-1,000,000, o 100.000-10,000,000 veces menor que la afinidad de ligación del AB cuando no está asociado con el NB o NB:BP o menor que la afinidad de ligación del AB parental hacia el blanco.
Cuando el anticuerpo activable conteniendo NB está en presencia de Jagged 1 y/o Jagged 2, la ligación específica del AB para Jagged 1 y/o Jagged 2 es reducida o inhibida al compararse a la ligación especifica del AB cuando no está asociado con NB o NB:BP. Cuando el anticuerpo activable conteniendo AB está en presencia de Jagged 1 y/o Jagged 2, la ligación especifica del AB a Jagged 1 y/o Jagged 2 es reducida o inhibida al compararse con la ligación especifica del AB parental para Jagged 1 y/o Jagged 2. Cuando se comparó con la ligación del AB no asociado con un NB o NB:BP de la ligación del AB parental para Jagged 1 y Jagged 2, la capacidad del anticuerpo activable conteniendo NB para ligar Jagged 1 y/o Jagged 2 es reducida, por ejemplo, en al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o incluso 100% por al menos 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, o 96 horas, o 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, o 180 dias, o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 meses o más cuando se midió in vivo y/o in vivo.
Cuando el anticuerpo activable que contiene NB está en presencia de Jagged 1 y Jagged 2 pero no en presencia de un agente modificante (por ejemplo, una proteasa u otra enzima), la ligación especifica del AB a Jagged 1 y/o Jagged 2 es reducida o inhibida al compararse a la ligación especifica del AB cuando no está asociado con NB o NB:BP. Cuando el anticuerpo activable que contiene NB está en presencia de Jagged 1 y/o Jagged 2, pero no en presencia de un agente modificante (por ejemplo, una proteasa, otra enzima, agente reductor, o luz), la ligación especifica del AB parental para Jagged 1 y/o Jagged 2. Cuando se comparó con la ligación del AB no asociado con NB o NB:BP o la ligación del AB parental para Jagged 1 y/o Jagged 2, la capacidad del anticuerpo activable conteniendo NB para ligar Jagged 1 y/o Jagged 2 es reducida, por ejemplo, por al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o incluso 100% por al menos 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, o 96 horas, o 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, o 180 dias, o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 meses o más cuando se midió in vivo y/o in vivo.
En algunos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones de anticuerpos activadles, el anticuerpo activable incluye un agente conjugado al AB para producir un anticuerpo activable conjugado. En algunas realizaciones, el agente es un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el agente es un agente de diagnóstico. En algunas realizaciones, el agente es un marcador detectable. En algunas realizaciones del anticuerpo activable conjugado, el agente es un agente antineoplásico. En algunas realizaciones del anticuerpo activable conjugado, el agente es una toxina o un fragmento de ésta. En algunas realizaciones, del anticuerpo activable conjugado, el agente es conjugado con el AB por medio de un enlazador. En algunas realizaciones del anticuerpo activable conjugado, el enlazador es un enlazador escindible. En algunas realizaciones del anticuerpo activable conjugado, el agente es un agente seleccionado del grupo listado en la tabla 30. En algunas realizaciones, el agente es una dolastatina. En algunas realizaciones, el agente es una auristatina o un derivado de esta. En algunas realizaciones, el agente es auristatina E o un derivado de ésta. En algunas realizaciones, el agente es monometil auristatin E (MMAE). En algunas realizaciones, el agente es un maitansinoide o un derivado maitansinoide. En algunas realizaciones el agente es DM1 o DM4. En algunas realizaciones, el agente es una duocarmicina o un derivado de ésta. En algunas realizaciones, el agente es una calicheamicina o un derivado de ésta.
En algunos ejemplos de las realizaciones del anticuerpo activable conjugado, los anticuerpos activadles son anticuerpos activables de unión dual al blanco. Tales anticuerpos activables de unión dual al blanco contienen dos Abs que pueden unirse a los mismos o a diferentes blancos. En realizaciones especificas, los anticuerpos activables de unión dual contienen anticuerpos biespecificos o fracciones de anticuerpos Los anticuerpos activables de unión dual al blanco son diseñados asi para tener un CL escindible mediante un agente de escisión que está co-localizado en un tejido blanco con uno o ambos blancos capaces de unirse a las ABs de los anticuerpos activables. Los anticuerpos activables de unión dual al blanco con más de un AB para los mismos o diferentes blancos puede diseñarse para tener más de un CL, donde el primer CL es escindible por un agente de escisión en un primer tejido blanco y donde el segundo CL es escindible por un agente de escisión en un segundo tejido blanco, con uno o más de los blancos ligados a los ABS de los anticuerpos activables. En una realización, el primer y segundo tejido blanco están espacialmente separados, por ejemplo, en diferentes lugares del organismo. En una realización, el primer y segundo tejido blanco son los mismos tejidos separados temporalmente, por ejemplo, el mismo tejidos en diferentes momentos en el tiempo, por ejemplo, el primer momento es cuando el tejido está en estadio temprano de tumor, y el segundo momento es cuando el tejido está en un estadio tardío.
La invención también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos activables aquí descritos. La invención también proporciona vectores que incluyen estos ácidos nucleicos. Los anticuerpos activables descritos aquí son producidos por cultivo celular bajo condiciones que llevan a la expresión del anticuerpo activable, donde la célula incluye estas moléculas de ácido nucleico o los vectores.
La invención también proporciona métodos de fabricación de anticuerpos activables. En una realización, el método incluye los pasos de (a) cultivar células que incluyan un constructo de ácido nucleico que codifica el anticuerpo activable bajo condiciones que llevan a la expresión del anticuerpo activable, donde el anticuerpo activable incluye (i) una fracción esférica no vinculante (NB); (ii) un enlazador escindióle (CL) y (iii) un anticuerpo o un fragmento de unión al antigeno del mismo (AB) que se liga específicamente al blanco, donde (1) el NB no se liga específicamente al AB; (2) el CL es un polipéptido que incluye un sustrato (S) para una enzima; (3) el CL es posicionado de tal forma que en estado no escindido el NB interfiere con la ligación del AB al blanco y en un estado escindido, el NB no interfiere con la ligación del AB al blanco y (4) el NB no inhibe la escisión del CL por la enzima; y (b) la recuperación del anticuerpo activable.
En otra realización, el método incluye pasos de (a) cultivos celulares que incluyen un constructo de ácido nucleico que codifica el anticuerpo activable bajo condiciones que llevan a la expresión del anticuerpo activable, donde el anticuerpo activable incluye (i) un compañero de ligación (BP) para una fracción esférica no vinculante (NB); (ii) un enlazador escindióle (CL); y (ii) un anticuerpo o un fragmento de unión al antigeno (AB) que se liga específicamente a un blanco donde (1) el NB no se liga específicamente al AB; (2) el CL es un polipéptido que incluye un sustrato (S) para una enzima; (3) el CL está posicionado de tal manera que en estado no escindido y en presencia de NB, el NB interfiere con la ligación del AB al blanco y en estado escindido el NB no interfiere con la ligación del AB al blanco, y el BP no interfiere con la ligación del AB al blanco; y (4) el NB y el BP no inhiben la escisión del CL por la enzima; y (b) recuperando el anticuerpo activable. En algunos ejemplos de esta realización, el BP del anticuerpo activable está ligado al NB.
Uso de anticuerpos Ant.i-Jagged y anticuerpos Anti-Jagged activables Se apreciará que la administración de entidades terapéuticas de acuerdo con la invención será administrada con vehículos adecuados, excipientes y otros agentes que son incorporados a las formulaciones para brindar una mejora en la transferencia, entrega, tolerancia y gusto. Se puede encontrar una multitud de formulaciones apropiadas en el formulario conocido por todos los químicos farmacéuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences (15th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), particularmente el capitulo 87 por Blaug, Scymour. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, ungüentos, jaleas, ceras, aceites, lipidos, lipidos conteniendo vesículas (catiónicas o aniónicas) (como Lipofectin™), conjugados de DNA, pastas de absorción anhidra, emulsiones de aceite en agua y agua en aceite, emulsiones carbowax (polietilenglicol de varios pesos moleculares), geles semi-sólidos, y mezclas semi-sólidas conteniendo Carbowax. Cualquiera de las mezclas precedentes puede ser apropiada en los tratamientos y terapias de acuerdo con la invención presente, a condición de que el ingrediente activo en la formulación no sea activado por la formulación y la formulación es fisiológicamente compatible y tolerable con la ruta de administración. Ver también Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance." Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals. " Int. J. Pharm.203(1-2):1-60 (2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts." J Pharm Sci.89(8):967-78 (2000), Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol.52:238-311 (1998) y las citaciones dentro por información adicional relacionada a formulaciones, excipientes y vehículos bien conocidos por los químicos farmacéuticos.
En una realización, un anticuerpo y/o un anticuerpo activable de la invención que incluye un anticuerpo monoclonal de la invención (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal completamente humano) y/o un anticuerpo activable, pueden ser usados como agentes terapéuticos. Tales agentes generalmente serán empleados para el diagnóstico, prognosis, monitoreo, trato, alivio y/o prevención de una enfermedad o patología asociada con la señalización Jagged 1 y/o Jagged 2 hacia los receptores Notch en un paciente. Se realiza un régimen terapéutico identificando un paciente sea humano u otro mamífero sufriendo (o en riesgo de desarrollar) un desorden como el cáncer, incluyendo leucemias y tumores sólidos, o un desorden fibrótico usando métodos estándar. Un anticuerpo y/o preparación de anticuerpo activable, por ejemplo en algunas realizaciones, uno teniendo alta especificidad y alta afinidad por su antígeno blanco, es administrado al paciente y generalmente tendrá un efecto debido a su unión con el blanco. La administración del anticuerpo y/o anticuerpo activable puede anular o inhibir o interferir con la función de señalamiento del blanco (por ejemplo, el señalamiento mediado por Jagged 1 y/o Jagged 2 a través de los receptores Notch). La administración del anticuerpo y/o anticuerpo activable puede anular o inhibir o interferir con la unión del blanco (por ejemplo, Jagged 1 y/o Jagged 2) con un ligando endógeno (por ejemplo, un receptor Notch) con el cual se liga naturalmente. Por ejemplo, el anticuerpo y/o un anticuerpo activable se liga al blanco y modula, bloquea, inhibe, reduce, antagoniza, neutraliza o interfiere con la señalización mediada por Jagged 1 y/o Jagged 2 hacia los receptores Notch.
Generalmente, el alivio o tratamiento de una enfermedad o desorden involucra la disminución de uno o más síntomas o problemas médicos asociados con la enfermedad o desorden. Por ejemplo, en el caso del cáncer, la cantidad terapéuticamente efectivas de la droga puede lograr una o una combinación de los siguientes: reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor; inhibir en parte el crecimiento tumoral y/o aliviar de alguna manera uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. En algunas realizaciones, se puede usar una composición de esta invención para prevenir el comienzo o recurrencia de la enfermedad o desorden en un paciente, por ejemplo, humano u otro mamífero, tal como un primate no humano, animal de compañía (por ejemplo gatos, perros, caballos), animales de granja, animales de trabajo o animales de zoológico. Los términos sujeto y paciente son usados aquí de manera intercambiable.
Una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo y/o un anticuerpo activadle de la invención está relacionada generalmente a la cantidad necesaria para alcanzar un objetivo terapéutico. Como se notó arriba, esto podría ser una interacción de ligación entre el anticuerpo y su antígeno blanco que, en ciertos casos, interfiere con el funcionamiento del blanco. La cantidad requerida para ser administrada dependerá además de la afinidad de ligación del anticuerpo y/o un anticuerpo activable para su antígeno específico, y también dependerá de la tasa en la que un anticuerpo administrado y/o un anticuerpo activable son agotados desde el volumen libre y del individuo al que se está administrando. Los rangos comunes para la dosis terapéuticamente efectiva de un anticuerpo y/o fragmento de anticuerpo y/o anticuerpo activable de la invención podría ser, por medio de un ejemplo no limitante, alrededor de 0.1 mg/kg de peso hasta alrededor de 50 mg/kg de peso. Las frecuencias comunes de dosis pueden variar, por ejemplo, de dos veces al día a una vez por semana.
La eficacia del tratamiento está determinada en asociación con un método conocido para diagnosticar o tratar el desorden particular relacionado a la inflamación. El alivio de uno o más síntomas del cáncer o desorden fibrótico indica que el anticuerpo y/o un anticuerpo activable confieren un beneficio clínico.
Los métodos para la selección de anticuerpos y/o anticuerpos activadles que posean la especificidad deseada incluyen, pero no están limitados a, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y otras téenicas mediadas inmunológicamente conocidas en el arte.
En otra realización, un anticuerpo y/o anticuerpo activable dirigido contra Jagged 1 y/o Jagged 2 dentro de las muestras fisiológicas apropiadas, para uso en métodos de diagnóstico, para uso de visualización de la proteina, y similares). En una realización dada, un anticuerpo y/o un anticuerpo activable especifico para Jagged 1 y/o Jagged 2, o un derivado, fragmento, análogo o un homólogo de este, que contiene el anticuerpo derivado del dominio de unión del antigeno, son usados como compuestos farmacológicamente activos (referidos aquí como "terapéuticos").
En otra realización, un anticuerpo y/o anticuerpo activable especifico para Jagged 1 y/o Jagged 2 es usado para aislar un polipéptido Jagged 1 y/o Jagged 2 mediante técnicas estándar, como inmunoafinidad, cromatografía o inmunoprecipitación. Los anticuerpos dirigidos contra Jagged 1 y/o Jagged 2 y/o un anticuerpo activable (o un fragmento de éste) son usados diagnósticamente para monitorear niveles de proteina en tejidos como parte de un procedimiento de prueba clínica, es decir, para determinar la eficacia de un determinado régimen de tratamiento. La detección puede facilitarse por ligación (enlace físico) del anticuerpo a una sustancia detectable. Ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radiactivos. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, b-galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbelliferona, fluoresceína, fluoresceína isotiocianato, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, dansil cloruro o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aequorina, y los ejemplos de materiales radiactivos adecuados incluyen 125I, 131I, 35S o 3H.
En otra realización, un anticuerpo y/o anticuerpo activable, de acuerdo a la invención, puede ser usado como agente para la detección de la presencia de Jagged 1 y/o Jagged 2 (o un fragmento de éste) en una muestra. En algunas realizaciones, el anticuerpo contiene una marca detectable. Los anticuerpos son policlonales, o en algunas realizaciones, monoclonales. Se usa un anticuerpo intacto, o un fragmento de éste (por ejemplo Fab, scFv, o F(ab>2)· El término "marcado", con respecto a la sonda o anticuerpo, se pretende que abarque la marca directa de la sonda o anticuerpo por ligación (es decir, enlace físico) una sustancia detectable para la sonda o anticuerpo, así como la marcación indirecta de la sonda o anticuerpo por reactividad con otro reactivo que está directamente marcado. Ejemplos de mareaje indirecto incluyen la detección de un anticuerpo primario usando un anticuerpo secundario marcado fluorescentemente y un mareaje final de un anticuerpo con biotina para que pueda ser detectada con estreptavidina fluorescentemente marcada. El término "muestra biológica" trata de incluir tejidos, células y fluidos biológicos aislados de un individuo, así como de tejidos, células y fluidos presentes dentro de un individuo. Incluida dentro del uso del término "muestra biológica", por lo tanto, está la sangre y una fracción del componente de la sangre incluyendo suero sanguíneo, plasma sanguíneo o linfa. Es decir, el método de detección de la invención puede ser usado para detectar una proteína en una muestra biológica In vitro, así como in vivo. Por ejemplo, las téenicas in vitro para la detección de una proteína analito incluye ensayos inmunosorbentes ligados a enzimas (ELISAs), Western blots, inmunoprecipitaciones e inmunofluorescencia. Los procedimientos para realizar inmunoensayos están descritos, por ejemplo en "ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology", Vol.42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995; "Immunoassay", E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996; y "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985. Adicionalmente, las téenicas in vivo para la detección de un una proteina o analito incluyen el introducir en un individuo una proteina anticuerpo anti-analito marcada. Por ejemplo, el anticuerpo puede estar marcado radiactivamente con un marcador cuya presencia y ubicación en un individuo puede ser determinada por técnicas estándar de visualización.
Los anticuerpos anti-Jagged y/o anticuerpos anti-Jagged activadles de la invención también son útiles en una variedad de diagnósticos y formulaciones profilácticas. En una realización, un anticuerpo anti-Jagged y/o un anticuerpo anti-Jagged activable es administrado a pacientes que están en riesgo de desarrollar uno o más de los mencionados cánceres o desórdenes fibróticos. La predisposición de un paciente o un órgano para uno o más de los desórdenes antes mencionados puede determinarse usando marcadores genotipicos, serológicos o bioquímicos.
En otra realización de la invención, un anticuerpo anti-Jagged y/o anticuerpo anti-Jagged activable es administrado a individuos humanos diagnosticados con una indicación clínica asociada con uno o más de los desórdenes antes mencionados.
Hasta el diagnóstico, un anticuerpo anti-Jagged y/o anticuerpo anti-Jagged activable es administrado para mitigar o revertir los efectos de la indicación clínica.
Los anticuerpos y/o anticuerpos activadles de la invención también son útiles en la detección de Jagged 1 y/o Jagged 2 en muestras de pacientes y de acuerdo a esto son útiles como diagnóstico. Por ejemplo, los anticuerpos anti-Jagged y/o anticuerpos anti-Jagged activables de la invención son usados en ensayos in vitro, por ejemplo, ELISA, para detectar niveles de Jagged 1 y/o Jagged 2 en una muestra de un paciente.
En una realización, un anticuerpo anti-jagged y/o un anticuerpo anti-Jagged activable de la invención es inmovilizado en un soporte sólido (los pocilios de una placa de microtitulación). El anticuerpo inmovilizado y/o anticuerpo activable sirve como una captura de anticuerpos para Jagged 1 y/o Jagged 2 que puede estar presente en una muestra de prueba. Antes de entrar en contacto con el anticuerpo inmovilizado con la muestra de un paciente, el soporte sólido es lavado y tratado con un agente bloqueador como proteína de leche o albúmina para prevenir la adsorción no específica del analito.
Posteriormente, los pocilios son tratadas con una muestra de prueba sospechosa de contener el antígeno, o con una solución conteniendo una cantidad estándar del antígeno. Tal muestra es, por ejemplo, una muestra de suero de un paciente sospechoso de tener niveles de antigeno circulante considerados como diagnósticos de una patología. Después de enjuagar la muestra de prueba o estándar, el soporte sólido es tratado con un segundo anticuerpo que está detectablemente marcado. El segundo anticuerpo marcado sirve como anticuerpo de detección. El nivel de marca detectable es medido, y la concentración de antígeno Jagged en la muestra de prueba es determinado por comparación con una curva estándar desarrollada de las muestras estándar.
Se apreciará que en base a los resultados obtenidos usando los anticuerpos anti-Jagged de la invención en un ensayo diagnóstico in vitro, es posible notar una enfermedad en un individuo en base a-los niveles de expresión del antígeno Jagged. Para una determinada enfermedad, se toman muestras de sangre de individuos diagnosticados como de varios estadios en la progresión de la enfermedad y/o en varios puntos en el tratamiento terapéutico de la enfermedad. Usando una población de muestras que brinden resultados estadísticamente significativos para cada estadio de progresión o terapia, se diseña un rango de concentraciones del antígeno que podría ser considerado característico de cada estadio.
Los anticuerpos anti-Jagged y/o anticuerpos anti-Jagged activables también pueden usarse en diagnósticos y/o métodos de visualización. En algunas realizaciones, tales métodos son in vitro. En algunas realizaciones, tales métodos son in vivo. En algunas realizaciones, tales métodos son in situ. En algunas realizaciones, tales métodos son ex vivo. Por ejemplo, los anticuerpos anti-Jagged activables con un CM enzimáticamente escindible pueden ser usados para detectar la presencia o ausencia de una enzima que es capaz de escindir el CM. Tal anticuerpo anti-Jagged activable puede ser usado en diagnósticos, que pueden incluir detección in vivo (por ejemplo, cuantitativa o cualitativa) de la actividad enzimática (o, en algunas realizaciones, un ambiente de potencial de reducción incrementado como el que se puede dar para la reducción de un puente disulfuro) mediante la medición de la acumulación de anticuerpos anti-Jagged activados en una célula dada o tejido de un determinado organismo. Tal acumulación de anticuerpos anti-Jagged activados indica no sólo que el tejido expresa actividad enzimática (o un potencial de reducción incrementado dependiendo de la naturaleza del CM) pero también que el tejido expresa el blanco con el que se une el anticuerpo activado.
Por ejemplo, el CM puede ser seleccionado para ser un sustrato de proteasa para una proteasa encontrada en el sitio de un tumor, en el sitio de una infección viral o bacteriana en un sitio biológicamente confirmado (por ejemplo, tal como un absceso, en un órgano, o similares) y similares. El DB puede ser uno que se una al antigeno blanco. Usando métodos familiares para alguien experimentado en el arte, se puede conjugar una marca detectable (por ejemplo, una marca fluorescente o marca radiactiva o radiotrazador) con un AB u otra región de un anticuerpo anti-Jagged y/o anticuerpo anti-Jagged activable. Las marcas detectables adecuadas son discutidas en el contexto de los métodos de selección, y se dan ejemplos específicos adicionales más abajo. Usando un AB específico para una proteína o péptido del estado de la enfermedad, junto con una proteasa cuya actividad está elevada en el tejido enfermo de interés, los anticuerpos anti-Jagged mostrarán una tasa incrementada de unión al tejido enfermo en relación a los tejidos donde la enzima específica para el CM no está presente en un nivel detectable o está presente en un nivel menor que en el tejido enfermo o está inactiva (por ejemplo, en forma de zimógeno o en complejo con un inhibidor). Debido a que las proteínas y péptidos pequeños son rápidamente limpiados de la sangre por el sistema de filtración renal, y debido a que la enzima específica para el CM no está presente en un nivel detectable (o está presente en niveles menores en tejidos no enfermos o está presente en su conformación inactiva), la acumulación de anticuerpos anti-Jagged activados en el tejido enfermo está mejorada con relación a los tejidos no enfermos.
En otro ejemplo, los anticuerpos anti-Jagged activables pueden usarse para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión en una muestra. Por ejemplo, donde los anticuerpos anti-Jagged activables contienen un CM susceptible de ser escindido por una enzima, los anticuerpos anti-Jagged activables pueden ser usados para detectar (cualitativa o cuantitativamente) la presencia de una enzima en la muestra. En otro ejemplo, donde los anticuerpos anti-Jagged activables contienen un CM susceptible a la escisión por un agente reductor, los anticuerpos anti-Jagged activables pueden ser usados para detectar (cualitativa o cuantitativamente) la presencia de condiciones reductoras en una muestra. Para facilitar el análisis en estos métodos, los anticuerpos activables pueden detectar marcas y pueden unirse a un soporte (por ejemplo, un soporte sólido como una lámina o una gota). La marca detectable puede ubicarse en una fracción del anticuerpo anti-Jagged activable que no es liberada luego de la escisión, por ejemplo, la marca detectable puede ser una marca fluorescente inactiva u otra marca que no es detectable hasta que la escisión ha ocurrido. El ensayo puede realizarse, por ejemplo, mediante el contacto de los anticuerpos anti-Jagged activables inmovilizados y detectablemente marcados con una muestra sospechosa de contener una enzima y/o agente reductor por un tiempo suficiente para que ocurra la escisión, luego se lava para remover el exceso de muestra y contaminantes. La presencia o ausencia del agente e escisión (por ejemplo, una enzima o agente reductor) en la muestra es luego evaluada por un cambio en la señal detectable de los anticuerpos anti-jagged activadles antes de entrar en contacto con la muestra, por ejemplo, la presencia de y/o un incremento en la señal detectable debido a la escisión del anticuerpo activable por el agente de escisión en la muestra.
Tales métodos de detección pueden ser adaptados para dar también detección sobre la presencia o ausencia de un blanco que es capaz de unirse al AB del anticuerpo anti-Jagged activable cuando es escindido. Por lo tanto, los ensayos pueden adaptarse para evaluar la presencia o ausencia de un agente de escisión y la presencia o ausencia de un blanco de interés. La presencia o ausencia del agente de escisión puede ser detectado por la presencia de y/o un incremento en la marca detectable de los anticuerpos anti-Jagged activadles como se describió arriba, y la presencia o ausencia del blanco puede detectarse mediante detección de un complejo blanco-AB, por ejemplo, usando una marca detectable de un anticuerpo anti-blanco.
Los anticuerpos anti-Jagged activables también son útiles en la visualización in si tu para la validación de la activación de anticuerpos activables, por ejemplo, por escisión con proteasa, y uniéndose a un blanco particular. La visualización in situ es una téenica que permite la localización de la actividad proteolitica y del blanco en muestras biológicas como cultivos celulares o secciones de tejido. Usando esta técnica, es posible confirmar la ligación para un determinado blanco y actividad proteolitica en base a la presencia de una marca detectable (por ejemplo, una marca fluorescente).
Estas técnicas son útiles con cualquier célula o tejido congelado derivado de un sitio enfermo (por ejemplo, tejido tumoral) o tejidos saludables. Estas técnicas también son útiles con muestras frescas de células o tejidos.
En estas técnicas, un anticuerpo anti-Jagged activable es marcado con una marca detectable. La marca detectable puede ser un pigmento fluorescente (por ejemplo, un fluoróforo, Fluorescein Isotiocianato (FITC), Rodamina Isotiocianato (TRITC), una marca Alexa Fluor®), un pigmento infrarrojo (NIR) (por ejemplo nanocristales Qdot®), un metal coloidal, un hapteno, un marcador radiactivo, biotina y un reactivo de ampli icación como estreptavidina, o una enzima (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina).
La detección de la marca en una muestra que ha sido incubada con el anticuerpo anti-Jagged activable indica que la muestra contiene el blanco, por ejemplo, Jagged 1 y/o Jagged 2, y contiene una proteasa que es especifica para el CM del anticuerpo anti-Jagged activable. En algunas realizaciones, la presencia de la proteasa puede confirmarse usando un amplio espectro de inhibidores de proteasa como los aqui descritos, y/o usando un agente que es específico para la proteasa, por ejemplo, un anticuerpo como All, que es específico para la proteasa matriptasa (MT-SP1) e inhibe la actividad proteolítica de MT-SPl; ver, por ejemplo, el documento de Número de Publicación Internacional WO 2010/129609, publicado el 11 de Noviembre de 2010. La misma aproximación de uso de un amplio espectro de inhibidores de proteasa como los aquí descritos y/o mediante el uso de agentes inhibitorios más selectivos se pueden usar para identificar una proteasa o clase de proteasas específicas para el CM del anticuerpo anti-Jagged activable. En algunas realizaciones, la presencia del blanco puede confirmarse usando un agente que es específico para el blanco, por ejemplo, otro anticuerpo anti-Jagged 1 y/o anti-Jagged 2, o la marca detectable puede competir con Jagged 1 y/o Jagged 2 no marcado. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable no marcado anti-Jagged podría ser usado con detección mediante un anticuerpo secundario marcado o más sistemas de detección de complejo.
Téenicas similares también son útiles para la visualización in vivo cuando la detección de la señal fluorescente en un individuo, por ejemplo, un mamífero, incluyendo un humano, indica que el sitio de la enfermedad contiene el blanco, por ejemplo, Jagged 1 y/o Jagged 2, y contiene una proteasa que es especifica para el CM del anticuerpo anti-Jagged activable.
Estas téenicas también son útiles en kits y/o como reactivos para la detección, identificación o caracterización de actividad proteasa en una variedad de células, tejidos y organismos en base al CM proteasa-especifico en el anticuerpo anti-Jagged activable.
La invención proporciona métodos de uso para los anticuerpos anti-Jagged y/o anticuerpos anti-Jagged activadles en una variedad de diagnósticos y/o indicaciones profilácticas. Por ejemplo, la invención proporciona métodos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión y un blanco de interés en un individuo o una muestra por (i) contacto de un individuo o una muestra con un anticuerpo anti-Jagged activable, donde el anticuerpo anti-Jagged activable incluye una grupo enmascarante (MM), una fracción escindióle (CM) que es escindida por el agente de escisión, y un dominio de unión al antigeno o un fragmento de éste (AB) que se une específicamente al blanco de interés, donde el anticuerpo anti-Jagged activable en un estado no escindido y no activado incluye un arreglo estructural desde N-terminal a C-terminal como sigue: MM-CM-AB o AB-CM-MM; (a) donde el MM es un péptido que inhibe la unión del AB al Jagged blanco, y donde el MM no tiene una secuencia de aminoácidos de un compañero natural de unión del AB y no es una forma modificada de un compañero natural de unión del AB; y (b) donde, en un estado no escindido y no activado, el MM interfiere con la unión especifica del AB al Jagged blanco, y en estado escindido y activado el MM no interfiere o compite con la ligación especifica del AB al Jagged blanco; y (ii) la medición de un nivel de anticuerpo anti-Jagged activadle activado en el individuo o muestra, donde un nivel detectable de anticuerpo anti-Jagged activable activo en el individuo o muestra indica que el agente de escisión y un Jagged blanco están presentes en el individuo o muestra y donde no hay niveles detectables de anticuerpo anti-Jagged activable activado en el individuo o muestra indica que el agente de escisión, un Jagged blanco o el agente de escisión y un Jagged blanco están ausentes y/o no suficientemente presentes en el individuo o muestra. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged activable es un anticuerpo anti-Jagged activable con el que se ha conjugado un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged activable no está conjugado con un agente. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged activable incluye una marca detectable. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged activable está posicionado sobre el AB. En algunas realizaciones, la medición del nivel de anticuerpo anti-Jagged activable en el individuo o muestra es lograda usando un reactivo secundario que se une específicamente al anticuerpo activado, donde el reactivo incluye una marca detectable. En algunas realizaciones, el reactivo secundario es un anticuerpo que incluye una marca detectable.
La invención también proporciona métodos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión en un individuo o una muestra mediante (i) el contacto del individuo o muestra con un anticuerpo anti-Jagged activable en presencia de un blanco Jagged de interés, por ejemplo, Jagged 1 y/o Jagged 2, donde el anticuerpo anti-Jagged activable incluye una fracción de enmascaramiento (MM), una fracción escindióle (CM) que es escindida por el agente de escisión, y un dominio de unión al antígeno o fragmento de éste (AB) que se une específicamente al blanco de interés, donde el anticuerpo anti-Jagged activable en estado no escindido y no activado incluye un arreglo estructural desde N- terminal a C- terminal como sigue: MM-CM-AB o AB-CM-MM; (a) donde el MM es un péptido que inhibe la unión del AB al blanco Jagged, y donde el MM no tiene una secuencia de aminoácidos naturalmente ocurrente en un compañero de ligación del AB y no es una forma modificada de un compañero natural de unión del AB; y (b) donde, en un estado no escindido, no activado, el MM interfiere con la unión específica del AB al blanco Jagged, y en forma escindida, activad, el MM no interfiere o compite con la unión especifica del AB con el blanco Jagged; y (ii) midiendo un nivel de anticuerpo anti-Jagged activable activado en el individuo o la muestra, donde el nivel detectable de anticuerpo anti-Jagged activable activado en el individuo o muestra indica que el agente de escisión está presente en el individuo o muestra y donde niveles no detectables de anticuerpo anti-Jagged activable activado en el individuo o muestra indican que el agente de escisión está ausente y/o no suficientemente presente en el individuo o muestra. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged activable es un anticuerpo anti-Jagged activable con el que se ha conjugado un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged activable no está conjugado con un agente. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged activable incluye una marca detectable. En algunas realizaciones, la marca detectable está posicionada sobre el AB. En algunas realizaciones, la medición del nivel de anticuerpo anti-Jagged activable en el individuo o muestra es lograda usando un reactivo secundario que se une específicamente al anticuerpo activado, donde el reactivo incluye de una marca detectable. En algunas realizaciones, el reactivo secundario es un anticuerpo que incluye una marca detectable.
La invención también proporciona kits para ser usado en métodos de detección de la presencia o ausencia de un agente de escisión y un blanco Jagged de interés (por ejemplo, Jagged 1 y/o Jagged 2) en un individuo o una muestra, donde los kits incluyen al menos un anticuerpo anti-Jagged activable que consta de una grupo enmascarante (MM), una fracción escindióle (CM) y es escindido por el agente de escisión, y un dominio de unión al antigeno o fragmento de este (AB) que se liga específicamente al blanco de interés, donde el anticuerpo anti-Jagged activable en estado no escindido y no activado incluye un arreglo estructural de N-terminal a C-terminal como sigue: MM-CM-AB o AB-CM-MM; (a) donde el MM es un péptido que inhibe la unión del AB al Jagged blanco, y donde el MM no tiene una secuencia de aminoácidos de ocurrencia natural para un compañero de unión del AB y no es una forma modificada de un compañero natural de unión del AB; y (b) donde, en estado no escindido, no activado, el MM interfiere con la unión específica del AB al blanco Jagged, y en estado escindido, activado, el MM no interfiere o compite con la unión específica del AB al blanco Jagged; y (ii) la medición del nivel de anticuerpo anti-Jagged activable activado en el individuo o muestra, donde un nivel detectadle de anticuerpo anti-Jagged activable activado en el individuo o muestra indica que el agente de escisión está presente en el individuo o muestra y donde no hay niveles detectables de anticuerpo anti-Jagged activable activado en el individuo o muestra, indica que el agente de escisión está ausente y/o no suficientemente presente en el individuo o la muestra. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable anti-Jagged es un anticuerpo anti-Jagged activable con el que se ha conjugado un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged activable no está conjugado con un agente. En algunas realizaciones, el anticuerpo activable anti-Jagged incluye una marca detectable. En algunas realizaciones, la marca detectable está posicionada sobre el AB. En algunas realizaciones, la medición del nivel de anticuerpo activable anti-Jagged en el individuo o muestra se logra usando un reactivo secundario que se une específicamente al anticuerpo activado, donde el reactivo incluye una marca detectable. En algunas realizaciones, el reactivo secundario es un anticuerpo comprendiendo una marca detectable.
La invención también proporciona métodos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión en un individuo o muestra mediante (i) el contacto del individuo o muestra con un anticuerpo anti-Jagged activable, donde el anticuerpo anti-Jagged activable incluye una fracción de enmascaramiento (MM), una fracción escindióle (CM) que es escindida por un agente de escisión, un dominio de unión al antigeno (AB) que se liga específicamente al blanco Jagged, por ejemplo, Jagged 1 y/o Jagged 2, y una marca detectable, donde el anticuerpo anti-Jagged activable en estado no escindido, no activado, incluye un arreglo estructural desde N-terminal a C-terminal como sigue: MM-CM-AB o AB-CM-MM; donde el MM es un péptido que inhibe la unión del AB al blanco Jagged y donde el MM no tiene una secuencia de aminoácidos de un compañero natural de unión del AB y no es una forma modificada de un compañero natural de unión del AB; donde, en estado no escindido, no activado, el MM interfiere con la ligación específica del AB al blanco Jagged y, en la forma escindida, activada, el MM no interfiere o compite con la ligación específica del AB con el blanco Jagged, y donde la marca detectable está posicionada en una fracción del anticuerpo anti-Jagged activable que es liberada luego de la escisión del CM; y (ii) la medición del nivel de marca detectable en el individuo o muestra, donde un nivel detectable de la marca detectable en el individuo o muestra indica que el agente de escisión está ausente y/o no suficientemente presente en el individuo o muestra y donde niveles no detectables de la marca detectable en el individuo o muestra indican que el agente de escisión está presente en el individuo o muestra. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged activable está en un anticuerpo anti-Jagged activable al que se ha conjugado un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged activable no está conjugado a un agente. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged activable incluye una marca detectable. En algunas realizaciones, la marca detectable está posicionada sobre el AB. En algunas realizaciones, la medición del nivel de anticuerpo anti-Jagged activable en el individuo o muestra se logra usando un reactivo secundario que se liga específicamente al anticuerpo activado, donde el reactivo incluye una marca detectable. En algunas realizaciones, el reactivo secundario es un anticuerpo comprendiendo una marca detectable.
La invención también suministra kits para ser usados en métodos para detectar la presencia de un agente de escisión y un blanco Jagged de interés (por ejemplo, Jagged 1 y/o Jagged 2) en un individuo o muestra, donde los kits incluyen al menos un anticuerpo anti-Jagged activable y/o un anticuerpo anti-Jagged activable conjugado (es decir, un anticuerpo activable al que se le ha conjugado un agente terapéutico) descrito aquí para ser usado en contacto con el individuo o muestra biológica y como medio para detectar el nivel de anticuerpo anti-Jagged activable y/o anticuerpo anti-Jagged activable conjugado en el individuo o muestra biológica, donde un nivel detectable de anticuerpo anti-Jagged activable activado en el individuo o muestra biológica indica que el agente de escisión y el blanco Jagged están presentes en el individuo o muestra biológica y donde niveles no detectables de anticuerpo anti-Jagged activable activado en el individuo o muestra biológica indica que el agente de escisión, el blanco Jagged o ambos están ausentes y/o no suficientemente presentes en el individuo o muestra biológica, de tal forma que la unión al blanco Jagged y/o escisión por proteasa del anticuerpo anti-Jagged activable no puede detectarse en el individuo o muestra biológica.
La invención también proporciona métodos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión en un individuo o muestra mediante (i) contacto del individuo o muestra biológica con un anticuerpo anti-Jagged activable en presencia del blanco Jagged, y (ii) medición del nivel de anticuerpo anti-Jagged activable activado en el individuo o muestra biológica, donde un nivel detectable de anticuerpo anti-Jagged activable activado en el individuo o muestra biológica indica que el agente de escisión está presente en el individuo o muestra biológica y donde no hay niveles detectables de anticuerpo anti-Jagged activable activado en el individuo o muestra biológica es indicación de que el agente de escisión está ausente y/o no suficientemente presente en el individuo o muestra biológica en un nivel detectable, de tal forma que la escisión por proteasa del anticuerpo anti-Jagged activable no puede detectarse en el individuo o muestra biológica. Tal anticuerpo anti-Jagged activadle incluye una grupo enmascarante (MM), una fracción escindible (CM) gue es escindida por el agente de escisión, y un dominio de unión al antigeno o un fragmento de éste (AB) que se liga específicamente al Jagged blanco, donde el anticuerpo anti-Jagged activable en estado no escindido (no activado) incluye un arreglo estructural desde N-terminal a C-terminal como sigue: MM-CM-AB o AB-CM-MM; (a) donde el MM es un péptido que inhibe la unión de AB al Jagged blanco, y (b) donde el MM del anticuerpo anti-Jagged activable en estado no escindido interfiere con la ligación específica del AB con el Jagged blanco. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged activable es un anticuerpo anti-Jagged activable al que se ha conjugado un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged activable no está conjugado con un agente. En algunas realizaciones, la marca detectable está ligada al grupo enmascarante. En algunas realizaciones, la marca detectable está ligada a la fracción escindible N-terminal hacia el sitio de escisión de proteasa. En algunas realizaciones, un solo sitio de unión al antígeno del AB es enmascarado. En algunas realizaciones donde un anticuerpo de la descripción tiene al menos dos sitios de unión al antígeno, al menos un sitio de unión al antígeno está enmascarado, y al menos un sitio de unión al antígeno no está enmascarado. En algunas realizaciones, todos los sitios de unión al antigeno están enmascaradas. En algunas realizaciones, los pasos de medición incluyen el uso de un reactivo secundario que incluye una marca detectadle.
La invención también proporciona kits para usar en métodos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión y un blanco Jagged de interés (por ejemplo, Jagged 1 y/o Jagged 2) en un individuo o una muestra, donde los kits incluyen al menos un anticuerpo anti-Jagged activable y/o anticuerpo anti-Jagged activable conjugado aquí descrito para ser usado en contacto con el individuo o muestra biológica con un anticuerpo anti-Jagged activable en presencia del Jagged blanco, y midiendo el nivel de anticuerpo anti-Jagged activable activado en el individuo o muestra biológica, donde un nivel detectable de anticuerpo anti-Jagged activable activado en el individuo o muestra biológica indica que el agente de escisión está presente en el individuo o muestra biológica y donde un nivel no detectable de anticuerpo anti-Jagged activable activado en el individuo o muestra biológica indica que el agente de escisión está ausente y/o no suficientemente presente en el individuo o muestra biológica en un nivel detectable, de tal forma que la escisión de la proteasa del anticuerpo anti-Jagged activable no puede detectarse en el individuo o muestra biológica. Tal anticuerpo anti-Jagged activable incluye una grupo enmascarante (MM), una fracción escindible (CM) que es escindida por el agente de escisión, y un dominio de unión al antigeno o un fragmento de éste (AB) que se liga específicamente al Jagged blanco, donde el anticuerpo anti-Jagged activable en estado no escindido (no activado) incluye un arreglo estructural desde N-terminal a C-terminal como sigue: MM-CM-AB o AB-CM-MM; (a) donde el MM es un péptido que inhibe la ligación del AB al Jagged blanco, y donde el MM no tiene una secuencia de aminoácidos de un compañero de ligación natural del AB; y (b) donde el MM del anticuerpo anti-Jagged activable en estado no escindido interfiere con la ligación específica del AB hacia el jagged blanco, y donde el MM de un anticuerpo anti-Jagged activable en estado escindido (es decir, activado) no interfiere o compite con la unión específica de AB hacia el Jagged blanco. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged activable es un anticuerpo anti-Jagged activable al que se ha conjugado un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged activable no está conjugado con un agente. En algunas realizaciones, la marca detectadle está ligada a la fracción de enmascaramiento. En algunas realizaciones, la marca detectable está ligada a la fracción N-terminal escindible hacia el sitio de escisión de la proteasa. En algunas realizaciones, sólo un sitio de unión al antígeno AB está enmascarado. En algunas realizaciones, donde un anticuerpo de la descripción tiene al menos dos sitios de unión al antigeno, al menos un sitio de unión al antigeno está enmascarado y al menos un sitio de unión al antigeno no está enmascarado. En algunas realizaciones, todos los sitios de unión al antigeno están enmascarados. En algunas realizaciones, el paso de medición incluye el uso de un reactivo secundario comprendiendo una marca detectable.
La invención también proporciona kits para ser usados en métodos de detección para la presencia o ausencia de un agente de escisión en un individuo o una muestra, donde los kits incluyen al menos un anticuerpo anti-Jagged activable y/o anticuerpo anti-Jagged activable conjugado aqui descrito para ser usado por contacto con un individuo o muestra biológica y como medio para detectar el nivel de anticuerpo anti-Jagged activable activado y/o anticuerpo anti-Jagged activable conjugado en el individuo o muestra biológica, donde el anticuerpo anti-Jagged activable incluye una marca detectable que está posicionada sobre una porción del anticuerpo anti-Jagged activable que es liberada luego de la escisión del CM, donde un nivel detectable de anticuerpo anti-Jagged activable en el individuo o muestra biológica indica que el agente de escisión está ausente y/o no suficientemente presente en el individuo o muestra biológica, de tal forma que la unión al blanco Jagged y/o la escisión por proteasa del anticuerpo anti- Jagged activable no puede ser detectada en el individuo o muestra biológica, y donde un nivel no detectable de anticuerpo anti-Jagged activable activado en el individuo o muestra biológica indica que el agente de escisión está presente en el individuo o muestra biológica en un nivel detectable.
La invención proporciona métodos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión y el blanco Jagged en un individuo o una muestra mediante (i) el contacto con un individuo o muestra biológica con un anticuerpo anti-Jagged activable, donde el anticuerpo anti-Jagged activable incluye una marca detectable que está posicionada sobre una fracción del anticuerpo anti-Jagged activable que es liberada luego de la escisión del CM y (ii) medición del nivel de anticuerpo anti-Jagged activable en el individuo o muestra biológica, que indica que el agente de escisión, el blanco Jagged o ambos están ausentes y/o no suficientemente presentes en el individuo o muestra biológica, de tal forma que la unión al blanco Jagged y/o la escisión por proteasa del anticuerpo anti-Jagged activable no pueden ser detectadas en el individuo o muestra biológica, y donde un nivel detectable reducido de anticuerpo anti-Jagged activable activado en el individuo o muestra biológica indica que el agente de escisión y el blanco Jagged están presentes en el individuo o muestra biológica. Un nivel reducido de marca detectable es, por ejemplo una reducción de alrededor del 5%, alrededor del 10%, alrededor del 15%, alrededor del 20%, alrededor del 25%, alrededor del 30%, alrededor del 35%, alrededor del 40%, alrededor del 45%, alrededor del 50%, alrededor del 55%, alrededor del 60%, alrededor del 65%, alrededor del 70%, alrededor del 75%, alrededor del 80%, alrededor del 85%, alrededor del 90%, alrededor del 95% y/o alrededor del 100%. Tal anticuerpo anti-Jagged activable incluye una grupo enmascarante (MM), una fracción escindióle (CM) que es escindida por un agente de escisión, y un dominio de unión al antigeno o un fragmento de ésta (AB) que se liga específicamente al blanco Jagged, donde el anticuerpo anti-Jagged activable es estado no escindido (no activado) incluye un arreglo estructural desde N-terminal a C-terminal como sigue: MM-CM-AB o AB-CM-MM; (a) donde el MM es un péptido que inhibe la unión del AB al blanco Jagged, y donde el MM no tiene una secuencia de aminoácidos de un compañero de unión del AB; y (b) donde el MM del anticuerpo anti-Jagged activable en estado no escindido interfiere con la ligación específica del AB al blanco Jagged, y donde el MM de un anticuerpo anti-Jagged activable en estado escindido (activado) no interfiere o compute con la ligación específica del AB al blanco Jagged. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged activable es un anticuerpo anti-Jagged activable al que se ha conjugado un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged activable incluye una marca detectable. En algunas realizaciones, la marca detectable está posicionada sobre el AB. En algunas realizaciones, las mediciones del nivel de anticuerpo anti-Jagged activable en el individuo o muestra se logra usando un reactivo secundario que se liga específicamente al anticuerpo activado, donde el reactivo incluye una marca detectable. En algunas realizaciones, el reactivo secundario es un anticuerpo comprendiendo una marca detectable.
La invención también proporciona kits para ser usados en métodos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión y un blanco Jagged de interés en un individuo o muestra, donde se incluyen al menos un anticuerpo anti-Jagged activable y/o anticuerpo anti-Jagged activable conjugado descrito aquí para usarlo en contacto con un individuo o muestra biológica y como medio para detectar el nivel de anticuerpo anti-Jagged activable activado y/o anticuerpo anti-Jagged activable conjugado en el individuo o muestra biológica, donde un nivel detectable de anticuerpo anti-Jagged activable en el individuo o muestra biológica indica que el agente de escisión, el blanco Jagged o ambos están ausentes y/o no suficientemente presentes en el individuo o muestra biológica, de tal forma que la unión al blanco Jagged y/o la escisión por proteasa del anticuerpo anti-Jagged activable no puede detectarse en individuo o muestra biológica, y donde un nivel detectable reducido de anticuerpo anti-Jagged activable activado en el individuo o muestra biológica indica que el agente de escisión y el blanco Jagged están presentes en el individuo o muestra biológica. Un nivel reducido de marca detectable es, por ejemplo, una reducción de alrededor del 5%, de alrededor del 10%, de alrededor del 15%, de alrededor del 20%, de alrededor del 25%, de alrededor del 30%, de alrededor del 35%, de alrededor del 40%, de alrededor del 45%, de alrededor del 50%, de alrededor del 55%, de alrededor del 60%, de alrededor del 65%, de alrededor del 70%, de alrededor del 75%, de alrededor del 80%, de alrededor del 85%, de alrededor del 90%, de alrededor del 95% y/o de alrededor del 100%.
La invención también proporciona métodos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión en un individuo o una muestra mediante (i) contacto con un sujeto o muestra biológica con un anticuerpo anti-Jagged activable, donde el anticuerpo anti-Jagged activable incluye una marca detectable posicionada en una fracción del anticuerpo anti-Jagged activable que es liberada luego de la escisión del CM; y (ii) midiendo el nivel de marca detectable en el individuo o muestra biológica, donde un nivel detectable de la marca en el individuo o en la muestra biológica indica que el agente de escisión está ausente y/o no suficientemente presente en el individuo o muestra biológica a un nivel detectable, de tal forma que la escisión de la proteasa del anticuerpo anti-Jagged activable no puede detectarse en el individuo o muestra biológica, y donde un nivel reducido de la marca detectable en el individuo o muestra biológica indica que el agente de escisión está presente en el individuo o muestra biológica. Un nivel reducido de marca detectable es marca detectable es, por ejemplo, una reducción de alrededor del 5%, de alrededor del 10%, de alrededor del 15%, de alrededor del 20%, de alrededor del 25%, de alrededor del 30%, de alrededor del 35%, de alrededor del 40%, de alrededor del 45%, de alrededor del 50%, de alrededor del 55%, de alrededor del 60%, de alrededor del 65%, de alrededor del 70%, de alrededor del 75%, de alrededor del 80%, de alrededor del 85%, de alrededor del 90%, de alrededor del 95% y/o de alrededor del 100%.
Tal anticuerpo anti-Jagged activable incluye una grupo enmascarante (MM), una fracción escindióle (CM) que es escindida por un agente de escisión, y un dominio de unión al antigeno o fragmento de éste (AB) que se liga específicamente al blanco Jagged, donde el anticuerpo anti-Jagged activable en estado no escindido (no activado) incluye un arreglo estructural desde N-terminal a C-terminal como sigue: MM-CM-AB o AB-CM-MM; (a) donde el MM es un péptido que inhibe la unión del AB al blanco Jagged. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged activable es un anticuerpo anti-Jagged activable al que se ha conjugado un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged activable no está conjugado con un agente. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged activable incluye una marca detectable. En algunas realizaciones, la marca detectable está posicionada sobre el AB. En algunas realizaciones, la medición del nivel de anticuerpo anti-Jagged activable en el individuo o muestra es lograda usando un reactivo secundario que se liga específicamente al anticuerpo activado, donde el reactivo incluye una marca detectable. En algunas realizaciones, el reactivo secundario es un anticuerpo que incluye una marca detectable.
La invención también proporciona kits para usar en métodos para detectar la presencia o ausencia de un agente de escisión de interés en un individuo o muestra, donde los kits incluyen al menos un anticuerpo anti-Jagged activable y/o anticuerpo anti-Jagged activable conjugado descrito aquí para ser usado en contacto con un individuo o muestra biológica y como medio para detectar el nivel de anticuerpo anti-Jagged activable activado y/o anticuerpo anti-Jagged activable conjugado en el individuo o muestra biológica, donde el anticuerpo anti-Jagged activable incluye una marca detectable posicionada en una fracción del anticuerpo anti-Jagged activable que es liberado luego de la escisión del CM, donde un nivel detectable de la marca en el individuo o muestra biológica indica que el agente de escisión, el blanco Jagged, o ambos, están ausentes o no suficientemente presentes en el individuo o muestra biológica, de tal forma que la unión del blanco Jagged y/o escisión de la proteasa del anticuerpo anti-Jagged activable no puede detectarse en el individuo o muestra biológica, y donde un nivel reducido detectable de la marca en el individuo o muestra biológica indica que el agente de escisión y el blanco Jagged están presentes en el individuo o muestra biológica. Un nivel reducido de marca detectable es, por ejemplo, una reducción de alrededor del 5%, de alrededor del 10%, de alrededor del 15%, de alrededor del 20%, de alrededor del 25%, de alrededor del 30%, de alrededor del 35%, de alrededor del 40%, de alrededor del 45%, de alrededor del 50%, de alrededor del 55%, de alrededor del 60%, de alrededor del 65%, de alrededor del 70%, de alrededor del 75%, de alrededor del 80%, de alrededor del 85%, de alrededor del 90%, de alrededor del 95% y/o de alrededor del 100%, En algunas realizaciones de estos métodos y kits, el anticuerpo anti-Jagged activable incluye una marca detectable. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, la marca detectable incluye un agente de visualización, un agente contrastante, una enzima, una marca fluorescente, un cromóforo, un pigmento, uno o más iones metálicos, o una marca basada en ligandos. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, el radioisótopo es indio o tectnecio. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, el agente constrastante incluye yodo, gadolinio u óxido de hierro. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, la enzima incluye peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina o b-galactosidasa. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, la marca fluorescente incluye proteina amarilla fluorescente (YPF), proteína cían fluorescente (CFP), proteína verde fluorescente (GFP), proteína roja modificada fluorescente (mRFP), proteína roja fluorescente tdimer2 (RFP tdimer2), HCRED o un derivado de europio. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, la marca luminiscente incluye un derivado del N-metilacridium. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, la marca incluye una marca Alexa Fluor®, como Alexa Fluor®680 o Alexa FLuor®750. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, la marca basada en ligandos incluye biotina, avidina, estreptavidina o uno o más haptenos.
En algunas realizaciones de estos métodos y kits, el individuo es un mamífero. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, el individuo es un humano. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, el individuo es un mamífero no humano, como un primate no humano, animal de compañía (gato, perro, caballo), animal de granja, animal de trabajo o animal de zoológico. En algunas realizaciones, el individuo es un roedor.
En algunas realizaciones de estos métodos y kits, el método es un método in vivo. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, el método es un método in situ. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, el método es un método ex vivo. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, el método es un método in vitro.
En algunas realizaciones, la visualización in situ y/o in vivo es útil en métodos para identificar qué pacientes tratar. Por ejemplo, en la visualización in situ, los anticuerpos anti-Jagged activables son usados para seleccionar muestras de pacientes para identificar qué pacientes tienen las proteasas apropiadas y blancos en la ubicación apropiada, por ejemplo, un tumor.
En algunas realizaciones in situ, la visualización se usa para identificar o seleccionar una población de pacientes adecuados para el tratamiento con anticuerpos anti-Jagged activables de la descripción. Por ejemplo, pacientes que dan positivo para ambos blancos (Jagged 1 y/o Jagged 2) y una proteasa que escinde el sustrato en la fracción escindióle (CM) del anticuerpo anti-Jagged activable siendo evaluado (por ejemplo, anticuerpos activados acumulados en el lugar de la enfermedad) son identificados como candidatos adecuados para el tratamiento con anticuerpos anti-Jagged activables incluyendo un CM. De la misma forma, los pacientes que dan negativo para uno o ambos blancos (por ejemplo, Jagged 1 y/o Jagged 2) y la proteasa que escinde el sustrato en el CM en el anticuerpo activable siendo evaluado usando estos métodos deben ser identificados como candidatos adecuados para otra forma de terapia. En algunas realizaciones, aquellos pacientes que dan negativo con respecto al primer anticuerpo anti-Jagged activable, pueden ser evaluados con otros anticuerpos anti-Jagged activables incluyendo diferentes CMs hasta que se identifique un anticuerpo anti-Jagged adecuado para el tratamiento (por ejemplo, un anticuerpo anti-Jagged activable que incluye un CM que es escindido por el paciente en el lugar de la enfermedad).
En algunas realizaciones in vivo, se usa la visualización para identificar o seleccionar una población de pacientes adecuados para el tratamiento con un anticuerpo anti-Jagged activable de la descripción. Por ejemplo, pacientes que dan positivo para ambos blancos (por ejemplo, Jagged 1 y/o Jagged 2) y una proteasa que escinde el sustrato en la fracción escindióle (CM) del anticuerpo anti-Jagged activable siendo evaluado (por ejemplo, anticuerpos activados acumulados en el sitio de la enfermedad) son identificados como candidatos adecuados para el tratamiento con tal anticuerpo anti-Jagged activable incluyendo un CM. De la misma forma, pacientes que dan negativo deben ser identificados como candidatos adecuados para otra forma de terapia. En algunas realizaciones, aquellos pacientes que dan negativo con respecto al primer anticuerpo anti-Jagged activable pueden ser evaluados con otro anticuerpo anti-Jagged activable incluyendo diferentes CMs hasta que se identifique un anticuerpo anti-Jagged activable adecuado (por ejemplo, un anticuerpo anti-Jagged activable incluyendo un CM que es escindido por el paciente en el sitio de la enfermedad).
En algunas realizaciones de los métodos y kits, el método o kit es usado para identificar o seleccionar una población de pacientes adecuados para el tratamiento con un anticuerpo anti-Jagged activable de la descripción. Por ejemplo, pacientes que dan positivo para ambos blancos (por ejemplo, Jagged 1 y/o Jagged 2) y una proteasa que escinde el sustrato en la fracción escindióle (CM) del anticuerpo anti-Jagged activable siendo evaluado en estos métodos, son identificados como candidatos adecuados para el tratamiento con un anticuerpo anti-Jagged activable que incluye un CM. De la misma forma, pacientes que dan negativo para ambos blancos (por ejemplo, Jagged 1 y Jagged 2) y la proteasa que escinde el sustrato en el CM en el anticuerpo anti-Jagged activable siendo evaluado usando estos métodos deben ser identificados como candidatos adecuados para otras formas de terapia. En algunas realizaciones, aquellos pacientes pueden ser evaluados con otro anticuerpo anti-Jagged activable hasta que se identifique un anticuerpo anti-Jagged activable adecuado (por ejemplo, un anticuerpo anti-Jagged activable incluyendo un CM que es escindido por el paciente en el sitio de la enfermedad). En algunas realizaciones, los pacientes que dan negativo para uno o ambos blancos (por ejemplo, Jagged 1 y/o Jagged 2) son identificados como candidatos adecuados para el tratamiento con un anticuerpo anti-Jagged activable que incluya tal CM. En algunas realizaciones, los pacientes que dan negativo para alguno de los blancos (por ejemplo, Jagged 1 y/o Jagged 2) son identificados como candidatos no adecuados para el tratamiento con el anticuerpo anti-Jagged activable incluyendo tal CM. En algunas realizaciones, aquellos pacientes pueden ser evaluados con otro anticuerpo anti-Jagged activable hasta que se identifique un anticuerpo anti-Jagged activable adecuado (por ejemplo, un anticuerpo anti-Jagged activable incluyendo un CM que es escindido por el paciente en el lugar de la enfermedad). En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged activable es un anticuerpo anti-Jagged activable al que se le conjugó un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged activable no está conjugado a un agente. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Jagged activable incluye una marca detectable. En algunas realizaciones, la marca detectable está posicionada en el AB. En algunas realizaciones, la medición del nivel de anticuerpo anti-Jagged activable en el individuo o muestra se realiza usando un reactivo secundario que se liga específicamente al anticuerpo activado, donde el reactivo incluye una marca detectable. En algunas realizaciones, el reactivo secundario es un anticuerpo que incluye una marca detectable.
En algunas realizaciones, se usa un método o kit para identificar o seleccionar una población de pacientes adecuada para el tratamiento con un anticuerpo anti-Jagged activable y/o anticuerpo anti-Jagged activable conjugado (por ejemplo, un anticuerpo activable al que se le conjugó un agente terapéutico) de la descripción, seguido por el tratamiento al administrar el anticuerpo anti-Jagged activable y/o anticuerpo anti-Jagged activable conjugado a un individuo que lo necesita. Por ejemplo, pacientes que dan positivo para ambos blancos (por ejemplo, Jagged 1 y Jagged 2) y una proteasa que escinde el sustrato en la fracción escindible (CM) del anticuerpo anti-Jagged activable y/o anticuerpo anti-Jagged activable conjugado que está siendo evaluado en estos métodos, son identificados como candidatos adecuados para el tratamiento con el anticuerpo y/o anticuerpo anti-Jagged activable conjugado que incluye tal CM, y el paciente es tratado con una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo anti-Jagged activable y/o anticuerpo anti-Jagged activable conjugado que fue evaluado. De la misma forma, pacientes que dan negativo para algún o ambos blancos (por ejemplo, Jagged 1 y/o Jagged 2) y la proteasa que escinde el sustrato en el CM en el anticuerpo anti-Jagged activable siendo evaluado usando estos métodos pueden ser identificados como candidatos adecuados para otra forma de terapia. En algunas realizaciones, tales pacientes pueden ser evaluados con otro anticuerpo y/o anticuerpo anti-Jagged activable conjugado incluyendo un CM que es escindido por el paciente en el sitio de la enfermedad). En algunas realizaciones, el paciente es luego tratado con una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo anti-Jagged activable y/o anticuerpo anti-Jagged activable conjugado para el cual el paciente dio positivo.
En algunas realizaciones de estos métodos y kit, el MM es un péptido que posee una longitud de alrededor de 4 a 40 aminoácidos. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, el anticuerpo anti-Jagged activable incluye un péptido enlazador, donde el péptido enlazador está posicionado entre el MM y el CM. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, el anticuerpo anti-Jagged activable incluye un péptido enlazador, donde el péptido enlazador está posicionado entre el AB y el CM. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, el anticuerpo anti-Jagged activable incluye un primer péptido enlazador (Ll) y un segundo péptido enlazador (L2), donde el primer péptido enlazador está posicionado entre el MM y el CM y el segundo péptido enlazador está posicionado entre el AB y el CM. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, cada Ll y L2 es un péptido de alrededor de 1 a 20 aminoácidos de largo, y donde Ll y L2 no necesariamente son el mismo enlazador. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, uno de Ll o L2 incluye un polímero de glicina-serina. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, al menos uno de Ll y L2 incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo consistente de (GS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 123) y (GGGS)n (SEQ ID NO: 124), donde n es un entero de al menos 1. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, al menos uno de Ll y L2 incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo consistente de Gly-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 125), Gly-Gly-Ser-Gly-Gly (SEQ ID NO: 126), Gly-Ser-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 127), Gly-Ser-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 128), Gly-Gly-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 129), y Gly-Ser-Ser-Ser-Gly (SEQ ID NO: 130).
En algunas realizaciones de estos métodos y kits, el AB incluye un anticuerpo o fragmento de anticuerpo seleccionado a partir de las secuencias de anticuerpos anti-Jagged de reacción cruzada que aquí se presentan. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, el AB incluye un fragmento Fab, un scFv o un anticuerpo de cadena única (scAb).
En algunas realizaciones de estos métodos y kits, el agente de escisión es una proteasa que está co-localizada en el individuo o muestra con el blanco Jagged y el CM es un polipéptido que funciona como sustrato para la proteasa, donde la proteasa escinde el CM en el anticuerpo anti-Jagged activable cuando el anticuerpo anti-Jagged activable es expuesto a la proteasa. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, el CM es un polipéptido de hasta 15 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, el CM está acoplado al N-terminal del AB. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, el CM está acoplado al C-terminal del AB. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, el CM está acoplado al N-terminal de una cadena VL del AB.
En algunas realizaciones de estos métodos y kits, el agente de escisión es una enzima y el CM es un sustrato para la enzima. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, la enzima es una proteasa de las que aquí se muestran. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, la proteasa es una de las proteasas de las que aquí se muestran. En algunas realizaciones de estos métodos y kits, la proteasa es seleccionada a partir del grupo consistente de uPA, legumaina, MT-SP1, ADAM17, BMP-1, TMPRSS3, TMPRSS4, MMP-9, MMP-12, MMP- 13, y MMP-14. En algunas realizaciones, la proteasa es una catepsina.
Administración terapeutica y formulaciones de anticuerpos Anti-Jagged Se apreciará que la administración de las entidades terapéuticas de acuerdo con la invención sea realizada con vehículos adecuados, excipientes y otros agentes que son incorporados a las formulaciones para otorgar una transferencia mejorada, administración, tolerancia y similares. Una multitud de formulaciones apropiadas se pueden encontrar en el formulario conocido por todos los químicos farmacéuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences (15th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), particularmente el capítulo 87 por Blaug, Scymour. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, ungüentos, jaleas, ceras, aceites, lípidos, lípidos conteniendo vesículas (catiónicas o aniónicas) (como Lipofectin™), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y de agua en aceite, emulsiones carbowax (polietilen glicoles de varios pesos moleculares), geles semisólidos, y mezclas semisólidas conteniendo carbowax. Cualquiera de las anteriores mezclas puede ser apropiada en tratamientos y terapias de acuerdo con la presente invención, dado que el ingrediente activo en la formulación no es activado por la formulación y la formulación es fisiológicamente compatible y tolerable con la ruta de administración. Ver también "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance." Regul. Toxicol Pharmacol.32(2):210-8 (2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals. " Int. J. Pharm.203(1-2):1-60 (2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts." J Pharm Sci.89(8):967-78 (2000), Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol.52:238-311 (1998) y las citaciones de aqui para información adicional relacionada a las formulaciones, excipientes y vehículos bien conocidos por los químicos farmacéuticos.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Jagged, los anticuerpos anti-Jagged activables y las composiciones con los anticuerpos anti-Jagged usados para tratar un cáncer o desorden fibrótico son administrados junto con uno o más agentes adicionales, o una combinación de agentes adicionales. Los agentes adicionales adecuados incluyen fármacos actuales y/o terapias quirúrgicas para una aplicación prevista. Por ejemplo, los anticuerpos anti-Jagged y/o los anticuerpos anti-Jagged activables pueden usarse junto con un agente adicional quimioterapéutico o antineoplásico. Por ejemplo, el anticuerpo anti-Jagged y/o anticuerpo anti-Jagged activable y un agente adicional son formulados en una sola composición terapéutica, y el anticuerpo anti-Jagged y/o anticuerpo anti-Jagged activable y el agente adicional son administrados simultáneamente. Por el contrario, el anticuerpo anti-Jagged y/o anticuerpo anti-Jagged activable y el agente adicional están separados uno de otro, es decir, cada uno es formulado en una composición terapéutica separada, y el anticuerpo anti-Jagged y/o anticuerpo anti-Jagged activable y el agente adicional son administrados simultáneamente, o el anticuerpo anti-Jagged y/o anticuerpo anti-Jagged activable y el agente adicional son administrados en diferentes momentos durante el régimen de tratamiento. Por ejemplo, el anticuerpo anti-Jagged y/o anticuerpo anti-Jagged activable es administrado antes de la administración del agente adicional, el anticuerpo anti-Jagged y/o anticuerpo anti-Jagged activable es administrado luego de la administración del agente adicional, o el anticuerpo anti-Jagged y/o anticuerpo anti-Jagged activable y el agente adicional son administrados de manera alternada. Tal como se describió aqui, el anticuerpo anti-Jagged y/o anticuerpo anti-Jagged activable y el agente adicional son administrados en dosis únicas o en dosis múltiples.
En algunas realizaciones, el agente adicional está acoplado o ligado al anticuerpo anti-Jagged y/o anticuerpo anti-Jagged activable.
Los agentes adicionales adecuados son seleccionados de acuerdo al propósito de la aplicación (matar, prevenir la proliferación celular, terapia hormonal o terapia génica).
Tales agentes pueden incluir pero no limitarse a, por ejemplo, agentes farmacéuticos, toxinas, fragmentos de toxinas, agentes alquilantes, enzimas, antibióticos, antimetabolitos, agentes antiproliferaticos, hormonas, neurotransmisores, DNA, RNA, siRNA, oligonucleótidos, RNA antisentido, aptameros, diagnósticos, pigmentos rad100pacos, isotopos radiactivos, compuestos fluorogénicos, marcas magnéticas, nanoparticulas, compuestos marcadores, lectinas, compuestos que alteran la permeabilidad de la membrana celular, compuestos fotoquimicos, pequeñas moléculas, liposomas, micelas, vectores de terapia génica, vectores virales, y similares. Finalmente, se pueden usar combinaciones de agentes o combinación de diferentes clases de agentes.
Los anticuerpos y/o anticuerpos activables de la invención (también mencionados aquí como "compuestos activos"), y derivados, fragmentos, análogos y homólogos de los mismos, pueden ser incorporados en las composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración. Se proporcionan los principios y consideraciones involucradas en preparar estas composiciones, asi como la guia en la elección de los componentes, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences: The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa.: 1995; Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994; and Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol.4), 1991, M. Dekker, New York.
Tales composiciones incluyen típicamente el anticuerpo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se puede usar donde el anticuerpo activable incluye un fragmento del domino AB, el fragmento más pequeño del AB que se une específicamente al dominio de unión de la proteína blanco. Por ejemplo, en base a las secuencias de la región variable de un anticuerpo, las moléculas del péptido pueden ser diseñadas para retener la capacidad del AB para unirse a la secuencia de la proteína blanco. Tales péptidos pueden ser sintetizados químicamente y/o ser producidos por teenología de DNA recombinante. (Ver, por ejemplo, Marasco et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)).
Tal como se ha usado aquí, el término "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquier y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. Se describieron los vehículos adecuados en la edición más reciente del Remington's Pharmaceutical Sciences, un texto estándar de referencia en el campo, que es incorporado aquí en la referencia. Los ejemplos adecuados de tales vehículos o diluyentes incluyen, pero no se limitan a, agua, solución salina, soluciones de ringer, solución de dextrosa y albúmina sérica humana al 5%. Los liposomas y vehículos no acuosos tales como aceites fijados también pueden usarse. El uso de esos medios y agentes para las sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en el arte. Excepto en la medida de que cualquier medio convencional o agente sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones.
Las formulaciones a ser usadas para la administración in vivo deben ser estériles. Esto es rápidamente conseguido por filtración a través de membranas estériles de filtración.
Una composición farmacéutica de la invención es formulada para ser compatible con su ruta prevista de administración. Los ejemplos de rutas de administración incluyen la parenteral, es decir, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (tópica), transmucosal y rectal. Las soluciones o suspensiones usadas para la aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para la inyección, solución salina, aceites fijados, polietilen glicoles, glicerina, propilen glicol y otros solventes sintéticos; agentes antibacterianos como benzil alcohol o metil parabenos; antioxidantes como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes como EDTA; soluciones tamponadas como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad como cloruro de sodio o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos y bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede ser contenida en ampollas, jeringas descartadles o viales de dosis múltiples hechos de vidrio o plástico.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para el uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando sean solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones inyectables estériles de dispersión. Para la administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina, agua bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) o solución salina buffer fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida para su administración con jeringa. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe preservarse contra la acción contaminante de microorganismos como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un solvente o medio de dispersión conteniendo, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilen glicol y polietilen glicol liquido, y similares) y mezclas adecuadas. Se debe mantener la fluidez apropiada, por ejemplo, usando un recubrimiento como lecitina para mantener el tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de surfactantes. La prevención de la acción de los microorganismos puede conseguirse mediante varios agentes antibacterianos y anti fúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será adecuado incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes como manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables debe llevarse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, aluminio monoestearato y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con una o una combinación de ingredientes enumerados arriba, como se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones son preparadas incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básica y otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación son el secado al vacío y el secado al frío que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución previamente estéril y filtrada.
Las composiciones orales incluyen generalmente un diluyente inerte o un vehículo comestible. Estas pueden contenerse en cápsulas de gelatina o comprimirse en tabletas. Para el propósito de la administración terapéutica oral, el compuesto activo puede ser incorporado con excipientes y usado en la forma de tabletas, grageas o cápsulas. Las composiciones orales también pueden prepararse usando un vehículo fluido para su uso como enjuague bucal, donde el compuesto en el vehículo fluido es aplicado oralmente, enjuagado, expectorado o ingerido. Los agentes de unión farmacéuticamente compatibles y/o materiales adyuvantes pueden incluirse como parte de la composición. Las tabletas, píldoras, cápsulas, grageas y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante como celulosa microcristalina, goma tragacanto o gelatina; un excipiente como almidón o lactosa, un agente desintegrante como ácido algínico, primogel o almidón de maíz; un lubricante como estearato de magnesio o sterotes; un deslizante como dióxido de silicona coloidal; un agente edulcorante como sucrosa o sacarina; o un agente saborizante como menta, metil salicilato o sabor a naranja.
Para la administración por inhalación, los compuestos son entregados en forma de una aspersión de aerosol de un envase presurizado o dispensador que contiene un propelente adecuado, por ejemplo, gas como dióxido de carbono, o un nebulizador.
La administración sistémica también puede ser por las mucosas o por la piel, para la administración transmucosa o transdérmica, se usan penetrantes apropiados para la barrera a ser pern eada en la formulación. Tales penetrantes son conocidos generalmente en el arte e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosa: detergentes, sales biliares y derivados del ácido fusidico. La administración transmucosa puede ser lograda a través del uso de aspersores nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos son formulados en ungüentos, bálsamos, geles o cremas conocidas generalmente en el arte.
Los compuestos pueden prepararse también en la forma de supositorios (por ejemplo, con bases convencionales de supositorios como mantequilla de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para la entrega rectal.
En una realización, los componentes activos son preparados con vehículos que protegerán al compuesto contra la rápida eliminación del cuerpo, tales como formulaciones de liberación sostenida/controlada, incluyendo implantes y sistemas de entrega microencapsulada. Se pueden usar polímeros biodegradables, biocompatibles como etileno vinil acetato, polianhidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoesteres, y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de tales formulaciones serán aparentes para los experimentados en el arte.
Por ejemplo, los ingredientes activos pueden ser atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por téenicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas coloidales de entrega de drogas (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano partículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones.
Se pueden hacer preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, tales matrices tienen formas, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo poli(2-hidroxietil-metacrilate), o poli (vinilalcohol)), polilactidos (Pat. de E.U.A. No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y g etil-L- glutamato, etileno-vinil-acetato no degradable, ácido láctico degradable-copolímeros de ácido glicólico como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de ácido láctico-copolímero de ácido glicólico y leuprolida acetato), y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutirico. Mientras que los polímeros como etilen-vinil acetato y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas por hasta 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas por periodos de tiempo más cortos.
Los materiales también pueden obtenerse comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposomales (incluyendo liposomas destinados a células infectadas con anticuerpos monoclonales para antígenos virales) y también pueden usarse como vehículo farmacéuticamente aceptables. Estos pueden prepararse de acuerdo a los métodos conocidos por los experimentados en el arte, por ejemplo, como se describe en la Patente de E.U.A. No. 4,522,811.
Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en unidades de dosis para la fácil administración y uniformidad de la dosis. La forma de unidad de dosificación que aquí se usa se refiere a las unidades físicamente discretas preparadas como dosis unitarias para el individuo a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas de unidad de dosis de la invención están dictados por y son directamente dependientes de las características únicas del compuesto activo y los efectos terapéuticos particulares a ser alcanzados, y las limitaciones inherentes en el arte de componer tal compuesto activo para el tratamiento de personas.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluirse en un envase, empaque o dispensador junto con las instrucciones de administración.
La formulación también puede contener más de un compuesto activo necesario para la indicación particular que está siendo tratada, por ejemplo, aquellas con actividades complementarias que no se afectan adversamente unas a otras. Alternativamente, o en adición, la composición puede incluir un agente que incremente su función, tal como, por ejemplo, un agente citotóxico, citokina, agente quimioterapéutico o agente inhibidor del crecimiento. Tales moléculas están adecuadamente presentes en combinación y en cantidades que son efectivas para la finalidad prevista.
En una realización, los compuestos activos son administrados en terapia de combinación, es decir, combinados con otros agentes, por ejemplo, agentes terapéuticos, que son útiles para tratar condiciones patológicas o desordenes como desordenes autoinmunes y enfermedades inflamatorias. El término "en combinación" en este contexto significa que los agentes son administrados sustancialmente de manera contemporánea, ya sea simultáneamente o secuencialmente. Si se administran secuencialmente, al inicio de la administración del segundo compuesto, el primero de los dos compuestos sigue siendo detectable en las concentraciones efectivas en el sitio de tratamiento.
Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir uno o más anticuerpos de la invención coformulados con, y/o coadministrados con, uno o más agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo, uno o más citoquinas y factores inhibidores de crecimiento, inmunosupresores, agentes antiinflamatorios, inhibidores metabólicos, inhibidores de enzimas, y/o agentes citotóxicos o citostáticos, como se describió en más detalle más abajo. Adicionalmente, uno o más anticuerpos descritos aquí pueden ser usados en combinación con dos o más agentes terapéuticos aquí descritos. Tales terapias de combinación pueden utilizar ventajosamente dosis menores de los agentes terapéuticos administrados, evitando posibles toxicidades o complicaciones asociadas con varias monoterapias.
En otras realizaciones, uno o más anticuerpos de la invención pueden ser coformulados con, y/o coadministrados con, una o más drogas anti-inflamatorias, inmunosupresores o inhibidores metabólicos o enzimáticos. Los ejemplos no limitantes de las drogas o inhibidores que pueden usarse en combinación con los anticuerpos aquí descritos incluyen, pero no se limitan a, una o más de: drogas anti-inflamatorias no esteroideas (NSAIDs), por ejemplo, ibuprofeno, tenidap, naproxeno, meloxicam, piroxicam, diclofenaco e indometacina; sulfasalazina; corticoesteroides como prednisolona; drogas anti-inflamatorias supresoras de citokinas (CSAIDs); inhibidores de la síntesis de nucleótidos, por ejemplo, inhibidores de la biosíntesis de purinas, antagonistas de folato (por ejemplo, metotrexato (ácido N-[4-[[(2,4-diamino-6-pteridinil)metil] metilamino] benzoil]-L-glutámico); e inhibidores de la biosíntesis de pirimidinas, por ejemplo, inhibidores de dihidroorotato deshidrogenasa (DHODH). Los agentes terapéuticos adecuados para usarse en combinación con los anticuerpos de la invención incluyen: NSAIDs, CSAIDs, inhibidores (DHODH) (por ejemplo, leflunomida), y antagonistas de folato (por ejemplo, metrotrexato).
Ejemplos de inhibidores adicionales incluyen uno o más de: corticosteroides (orales, de inhalación e inyección local); inmunosupresores, por ejemplo, ciclosporina, tacrolimus (FK-506); e inhibidores mTOR, por ejemplo, sirolimus (rapamicina -RAPAMUNE™ o derivados de rapamicina, por ejemplo, derivados solubles de rapamicina (por ejemplo, derivados ester de rapa icina, CCI-779); agentes que interfieren con el señalamiento mediante citoquinas proinflamatorias como TNFOÍ O IL-1 (por ejemplo, IRAK, NIK, IKK, p38 o inhibidores de quinasa MAP); inhibidores C0X2, por ejemplo, celecoxib, rofecoxib, y variantes de éstas; inhibidores de fosfodiesterasa, por ejemplo, R973401 (inhibidor de fosfodiesterasa tipo IV); inhibidores de fosfolipasa, por ejemplo, inhibidores de la fosfolipasa citosólica 2 (cPLA2) (por ejemplo, análogos de trifluorometil cetona); inhibidores del factor de crecimiento de células endoteliales vasculares o receptor del factor de crecimiento, por ejemplo, inhibidor VEGF y/o inhibidor vegf-r, e inhibidores de angiogénesis. Los agentes terapéuticos adecuados para su uso en combinación con los anticuerpos de la invención son inmunosupresores, por ejemplo, ciclosporina, tacrolimus (FK-506_; inhibidores mTOR, por ejemplo, sirolimus (rapamicina) o derivados de rapamicina, por ejemplo derivados solubles de rapamicina (por ejemplo derivados éster de rapamicina, CCI-779); inhibidores C0X2, por ejemplo, celecoxib y sus variantes; e inhibidores de fosfolipasa, por ejemplo, inhibidores de la fosfolipasa citosólica 2 (cPLA2), por ejemplo, análogos de trifluorometil cetona.
Ejemplos adicionales de agentes terapéuticos que pueden combinarse con un anticuerpo de la invención incluyen uno o más de: 6-mercaptopurinas (6-MP); azatioprine sulfasalazina; mesalazina; olsalazina; cloroquina/hidroxicloroquina (PLAQUENIL®); pencillamina, aurotiornalato (intramuscular y oral); azatioprina; colchicina; agonistas del adrenoreceptor beta-2 (salbutamol, terbutalina, salmeteral); xantinas (teofilina, arninofillina); cromoglicato; nedocromil; Cetotifen; ipratropio y oxitropio; mofetil micofenolato; agonistas de adenosina; agentes antitrombóticos, inhibidores del complemento y agentes adrenérgicos.
Diseño y generación de otras terapias De acuerdo con la presente invención y en base a la actividad de los anticuerpos que son producidos y caracterizados aquí con respecto a Jagged 1 y/o Jagged 2, se facilitó el diseño de otras modalidades terapéuticas más allá de las fracciones de anticuerpos. Tales modalidades incluyen, sin limitación, terapias avanzadas de anticuerpos, como anticuerpos biespecificos, inmunotoxinas, y terapias con radiomarcados, generación de péptidos terapéuticos, terapias génicas, particularmente intracuerpos, terapias antisentido y moléculas pequeñas.
Por ejemplo, en conexión con los anticuerpos biespecificos, los anticuerpos biespecificos pueden ser generados para incluir (i) dos anticuerpos, uno con una especificidad para Jagged 1 y Jagged 2 y otro para una segunda molécula que son conjugadas juntas, (ii) un solo anticuerpo que tiene una cadena especifica para Jagged 1 y Jagged 2, y una segunda cadena especifica para una segunda molécula o (iii) un anticuerpo de cadena única que tiene especificidad para Jagged 1 y Jagged 2 y una segunda molécula. Tales anticuerpos biespecíficos son generados usando téenicas bien conocidas, por ejemplo, en conexión con (y) y (ii), ver, por ejemplo, Fanger et al. Immunol Methods 4:72-81 (1994) and Wright et al. Crit, Reviews in Immunol.12125-168 (1992), y en conexión con (iü ) véase por ejemplo, Traunecker et al. Int. J. Cáncer (Suppl.) 7:51-52 (1992).
En conexión con las inmunotoxinas, los anticuerpos pueden ser modificados para actuar como inmunotoxinas utilizando técnicas que son bien conocidas en el arte. Ver, por ejemplo, Vitetta Immunol Today 14:252 (1993). Ver también Patente de E.U.A. No. 5,194,594. En conexión con la preparación de anticuerpos radiomarcados, tales anticuerpos modificados también se pueden preparar rápidamente usando técnicas bien conocidas en el arte. Ver, por ejemplo, Junghans et al. in Cáncer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2d edition, Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven (1996)). Ver también las Patentes de E.U.A. Nos. 4,681,581, 4,735,210, 5,101,827, 5,102,990 (RE 35,500), 5,648,471, y 5,697,902. Seria probable que cada una de las inmunotoxinas y moléculas radiomarcadas se acopla a células expresando Jagged 1, Jagged 2 y/o ambas.
En conexión con la generación de péptidos terapéuticos, mediante la utilización de la información estructural relacionada a Jagged 1, Jagged 2 y/o ambas y los mismos anticuerpos, como los anticuerpos de la invención o selección de librerías de péptidos, los péptidos terapéuticos pueden generarse para dirigirse contra Jagged 1, Jagged 2 y/o ambos. El diseño y selección de los péptidos terapéuticos es discutido en conexión con Houghten et al. Biotechniques 13:412-421 (1992), Houghten PNAS USA 82:5131-5135 (1985), Pinalla et al. Biotechniques 13:901-905 (1992), Blake and Litzi-Davis BioConjugate Che . 3:510-513 (1992). Las inmunotoxinas y moléculas radiomarcadas también pueden prepararse de manera similar, en conexión con fracciones peptídicas como se discutió arriba en conexión con los anticuerpos. Asumiendo que la molécula Jagged 1, la molécula Jagged 2y/o ambas (o una forma, como una variante de splice o forma alternada) es funcionalmente activa en un proceso de enfermedad, también será posible diseñar genes y terapias antisentido de las mismas a través de téenicas convencionales. Tales modalidades pueden utilizarse para modular la función de Jagged 1, Jagged 2 y/o ambas. En conexión con eso, los anticuerpos de la presente invención Facilitaron el diseño y uso de ensayos funcionales relacionados al mismo. Un diseño y la estrategia para las terapias antisentido son discutidos en detalle en la Aplicación Patente Internacional No. WO 94/29444. El diseño y las estrategias para la terapia génica son bien conocidos. Sin embargo, en particular, el uso de téenicas de terapia génica involucrando intracuerpos podria probar ser particularmente ventajoso. Ver, por ejemplo, Chen et al. Human Gene Therapy 5:595-601 (1994) and Marasco Gene Therapy 4:11-15 (1997). El diseño general de y las consideraciones relacionadas a las terapias génicas también son discutidas en la Aplicación Patente Internacional No. WO 97/38137.
El conocimiento obtenido de la estructura de la molécula Jagged 1 y Jagged 2 y/o ambas, asi como sus interacciones con otras moléculas de acuerdo con la presente invención, como anticuerpos de la invención, y otros, pueden utilizarse para diseñar racionalmente modalidades terapéuticas adicionales. Con respecto a esto, las técnicas racionales de diseño de drogas como cristalografía de rayos X, modelamiento molecular asistido por computadora (CAMM), relación cuantitativa o cualitativa de la estructura-actividad (QSAR), y similares tecnologías pueden utilizarse para enfocar los esfuerzos de descubrir drogas. El diseño racional permite la predicción de proteínas o estructuras sintéticas que pueden interactuar con la molécula o formas especificas e esta que pueden ser usadas para modificar o modular la actividad de Jagged 1, Jagged 2 y/o ambas. Tales estructuras pueden ser sintetizadas químicamente o expresadas en sistemas biológicos. Este enfoque ha sido revisado en Capscy et al. Genetically Engineered Human Therapeutic Drugs (Stockton Press, NY (1988)). Se pueden diseñar y sintetizar librerías combinatorias posteriormente y usarlas en programas de selección, tales como los esfuerzos de selección de alto rendimiento.
Metodos de selección La invención proporciona métodos (también mencionados aquí como "ensayos de selección") para la identificación de moduladores, compuestos de prueba o agentes (por ejemplo, péptidos, peptidomiméticos, pequeñas moléculas y otras drogas) que modulan, bloquean, inhiben, reducen, antagonizan neutralizan o interfieren con la ligación de Jagged 1, Jagged 2 y/o ambos a su receptor innato, o compuestos de prueba o agentes que modulan, bloquean, inhiben, reducen, antagonizan, neutralizan o interfieren con la función de señalización de Jagged 1, Jagged 2 y/o ambas. También se proporcionó métodos de identificación de compuestos útiles para tratar desordenes asociados con la señalización de Jagged 1, Jagged 2 y/o ambos. La invención también incluye compuestos identificados en los ensayos de selección aquí descritos.
En una realización, la invención proporciona ensayos para candidatos de selección o compuestos de prueba que modulan la función de señalización de Jagged 1, Jagged 2 y/o ambos. Los compuestos de prueba de la invención son obtenidos usando cualquiera de los numerosos enfoques en métodos conocidos en el arte de librerías combinacionales, incluyendo librerías biológicas; direccionables espacialmente en fase solida paralela o librerías de fase de solución; métodos de librería sintética requiriendo deconvolución, el método de librería "una gota un compuesto" y métodos de librería sintética usando selección cromatográfica por afinidad. El enfoque de librería biológica está limitado a librerías de péptidos, mientras que los otros enfoques son aplicables a péptidos, no péptidos, oligomeros no péptidos o librerías de moléculas pequeñas o compuestos (Ver, por ejemplo, Lam, 1997. Anticancer Drug Design 12: 145).
Una "molécula pequeña" tal como se usa aquí, se refiere a una composición que tiene un peso molecular de menos de aproximadamente de 5 kD y en algunas realizaciones menos de aproximadamente 4 kD. Las moléculas pequeñas pueden ser, por ejemplo, ácidos nucleicos, péptidos, polipéptidos, peptidomiméticos, carbohidratos, lípidos u otras moléculas orgánicas o inorgánicas. Las librerías de químicos y/o mezclas biológicas, como extractos fúngicos, bacterianos o algales, son conocidos en el arte y pueden ser seleccionados con cualquiera de los ensayos de la invención.
Ejemplos de métodos para la síntesis de librerías moleculares pueden encontrarse en el arte, por ejemplo en: DeWitt, et al., 1993. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A.90: 6909; Erb, et al·., 1994. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A.91: 11422; Zuckermann, et al., 1994. J. Med. Chem.37: 2678; Cho, et al., 1993. Science 261: 1303; Carrell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl.33: 2059; Carell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl.33: 2061; y Gallop, et al., 1994. J. Med. Chem. 37: 1233.
Las librerías de compuestos pueden representarse en solución (ver, por ejemplo, Houghten, 1992. Biotechniques 13: 412-421), o sobre cuentas (ver Lam, 1991. Nature 354: 82-84), sobre chips (ver Patente de E.U.A 5,233,409), plásmidos (ver Culi, et al., 1992. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869) o en fagos (ver Scott and Smith, 1990. Science 249: 386-390; Devlin, 1990. Science 249: 404-406; Cwirla, et al., 1990. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A.87: 6378-6382; Felici, 1991. J. Mol. Biol. 222: 301-310; and Patente de E.U.A. No.5,233,409.).
En una realización, un compuesto candidato es introducido a un complejo anticuerpo-antígeno y se determinó si el compuesto candidato alteraba el completo antígeno-anticuerpo, donde una alteración de este complejo indica que el compuesto candidato modula la función de señalización de Jagged 1, Jagged 2 y/o Jagged 1 y Jagged 2.
En otra realización, Jagged 1 y Jagged 2 son proporcionados y expuestos al menos a un anticuerpo monoclonal. La formación de un complejo anticuerpo-antígeno es detectada, y uno o más compuestos candidatos son introducidos al complejo. Si el complejo anticuerpo-antígeno es alterado luego de la introducción de uno o más compuestos candidatos, los compuestos candidatos son útiles para tratar desordenes asociados con la señalización de Jagged 1, Jagged 2 y/o ambos.
En otra realización, una proteína soluble de la invención es proporcionada y expuesta a al menos un anticuerpo monoclonal neutralizante. La formación de un complejo anticuerpo-antígeno es detectada, y uno o más compuestos candidatos son introducidos al complejo. Si el complejo anticuerpo-antígeno es alterado luego de la introducción de uno o más compuestos candidatos, los compuestos candidatos son útiles para tratar desórdenes asociados con la señalización de Jagged 1, Jagged 2 y/o ambos.
Se puede lograr determinar la capacidad del compuesto de prueba para interferir o alterar el complejo anticuerpo-antígeno, por ejemplo, acoplando el compuesto de prueba con un radioisótopo o marca enzimática de tal forma que la unión del compuesto de prueba al antígeno, o a la fracción biológicamente activa de esta, puede determinarse detectando al compuesto marcado en un complejo. Por ejemplo, los compuestos de prueba pueden ser marcados con 125I, 35S, 14C, o 3H, ya sea directa o indirectamente, y el radioisótopo es detectado por conteo directo de radioemisión o centelleo. Alternativamente, los compuestos de prueba pueden ser marcados enzimáticamente con, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina o luciferasa, y la marca enzimática puede detectarse por determinación de la conversión o un sustrato apropiado para el producto.
En una realización, el ensayo incluye contactar un complejo anticuerpo-antigeno con un compuesto de prueba, y determinar la capacidad del compuesto de prueba para interactuar con el antigeno o de otra manera alterar el complejo anticuerpo-antigeno existente. En esta realización, determinar la capacidad del compuesto de prueba para interactuar con el antigeno y/o alterar el complejo anticuerpo-antigeno incluye determinar la capacidad del compuesto de prueba para unirse preferentemente al antigeno o a la fracción biológicamente activa de ésta, en comparación con el anticuerpo .
En otra realización, el ensayo incluye contactar un complejo anticuerpo-antigeno con un compuesto de prueba y determinar la capacidad del compuesto de prueba para modular el complejo anticuerpo-antigeno. Se puede logar determinar la capacidad del compuesto de prueba para modular el complejo anticuerpo-antigeno, por ejemplo, determinando la capacidad del antigeno para ligarse a o interactuar con el anticuerpo, en presencia del compuesto de prueba.
Los métodos de selección mostrados aqui se pueden realizar como ensayos basados en células o en ensayos libres de células. Los ensayos libres de células de la invención son fáciles para usar Jagged 1, Jagged 2 y/o ambos solubles, y fragmentos de los mismos.
En más de una realización, podría ser deseable inmovilizar el anticuerpo o el antígeno para facilitar la separación del complejo de formas no complejas de uno o ambos luego de la introducción del compuesto candidato, así como para acomodar la automatización del ensayo. La observación del complejo anticuerpo-antigeno en presencia o ausencia de un compuesto candidato puede lograrse en cualquier recipiente adecuado para contener los reactivos. Ejemplos de estos recipientes incluyen placas de microtitulación, tubos de prueba y tubos de micro-centrifuga. En una realización, se puede prever que una proteína de fusión agrega un dominio que permite a una o ambas proteínas a unirse a una matriz. Por ejemplo, las proteínas de fusión GST-anticuerpo o proteínas de fusión GST-antígeno pueden ser absorbidas en gotas de glutation sefarosa (Sigma Chemical, St. Louis, MO) o placas de microtitulación derivatizadas con glutation, que son entonces combinadas con el compuesto de prueba, y la mezcla es incubada bajo condiciones que llevan a la formación de complejos (por ejemplo, en condiciones fisiológicas para sal y pH). Luego de la incubación, las gotas de las fosas de las placas de microtitulación son lavadas para remover cualquier componente no ligado, la matriz inmovilizada en el caso de las gotas, el complejo es determinado directa o indirectamente. Alternativamente, los complejos pueden disociarse de la matriz, y el nivel de formación de complejo anticuerpo-antigeno puede ser determinado usando téenicas estándar.
Otras técnicas para inmovilizar proteínas sobre matrices también se pueden usar en ensayos de selección de la invención. Por ejemplo, el anticuerpo o el antigeno (por ejemplo, Jagged 1, Jagged 2 y/o ambos) pueden ser inmovilizados utilizando la conjugación de biotina y estreptavidina. El anticuerpo o las moléculas de antigeno biotiniladas pueden prepararse a partir de biotin-NHS (N-hidroxi-succinimida) usando técnicas bien conocidas en el arte (por ejemplo, kit de biotinilación, Pierce Chemicals, Rockford, 111.), e inmovilizarse en los pocilios de placas cribadas y cubiertas con estreptavidina (Pierce Chemical). Alternativamente, otros anticuerpos reactivos con el anticuerpo o antigeno de interés, pero que no interfieren con la formación del complejo anticuerpo-antigeno, pueden derivatizarse en los pocilios del plato, y los anticuerpos o antigenos no ligados son atrapados en los pocilios por conjugación de anticuerpos. Los métodos para detectar dichos complejos, en adición a los descritos arriba para los complejos GST-inmovilizados, incluyen la inmunodetección de complejos usando otros anticuerpos reactivos con el anticuerpo o antigeno.
La invención se refiere además a nuevos agentes identificados por cualquiera de los ensayos de selección antes mencionados y usos de estos para los tratamientos aquí descritos.
Todas las publicaciones y documentos de patente que aquí son citados se encuentran incorporados mediante referencia, de tal forma como si cada una de las publicaciones fuera especifica e individualmente indicada como incorporada aquí mediante referencias. La citación de publicaciones y documentos de patente no tiene la intención de admitir que cualquiera es un antecedente del estado del arte pertinente, ni constituye una admisión sobre el contenido o fecha de los mismos. La invención ha sido descrita por medio de la descripción escrita, los expertos en el arte reconocerán que la invención puede ser practicada en una variedad de realizaciones y que la descripción precedente y los ejemplos a continuación son proporcionados únicamente con propósitos de ilustración y no de limitación de las reivindicaciones que siguen.
EJEMPLOS EJEMPLO 1: Selección de ScFvs humanos de las realizaciones que ligan Jagged 1 Este ejemplo demuestra que los ScFvs (fragmentos variables de cadena única) de las realizaciones que ligan Jagged 1 pueden ser seleccionadas de una visualización de librería de fagos de ScFvs con diversas secuencias CDR, y que tal ligación puede ser inhibida por Notch 1.
Los ScFvs fueron seleccionados a partir de una librería ScFv completamente humana visualizada en bacteriófagos M13; la selección de fagos ScFv fue realizada bajo contrato con Creative Biolabs, Shirlcy, NY). Una proteína de fusión comprendida del dominio extracelular (ECD) de Jagged 1 humano fusionada a la porción Fe de IgGl humano (R&D Systems, Minneapolis, MN, Cat# 1277-JG-050) fue usada como el antígeno en 3 rondas de selección para ScFvs mostrados en bacteriófagos M13 que ligan Jagged 1 humano. Todas las selecciones se hicieron en presencia de CA2++, requerido para la conformación nativa de Jagged 1, y IgGl humano para prevenir la ligación Fe humana. En la primera ronda, el fago ligado fue liberado mediante digestión con tripsina, y en rondas posteriores, el fago fue eluído por competición con la proteína de fusión humana Notch 1-Fc (R&D Systems; Cat # 3637-TK-050). Se aislaron 5 ScFvs que ligan Jaggedl humano. La tabla 1 lista los 5 ScFvs y los SEQ ID Nos de sus respectivas secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos.
Tabla 1: SEQ ID Nos de los ScFvs seleccionados Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de cada uno de los ScFvs ant-Jagged se muestran debajo: SEQ ID NO: 1 gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgag actctcctgtgcagcctctggattcacctttagcagctatgccatgagctgggtccgccag gctccagggagggctggagtgggtctcagcgattgcggagctgggtgcgcttacatagtac gcagactccgtgaagggccggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatc tgcaaatgaacagctagagccgaggacacggccgtatattactgtgcgagagctcatacta gttttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagcggtggaggcggttcagg cggaggtggcagcggcgggggggtcgacggacatccagatgacccagtctccatcctccct gtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagagcattagcagc tatttaaattggtatcagcagaaccgggaaagcccctaagctcctgatctataaggcatcc actttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactc tcaccatcagcagtctgcaacctgaaatttgcaacttactactgtcaacaggctatggatc agcctcctacgttcggccaa gggaccaaggtggaaatcaaacgg-3' SEQ ID NO: 2 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIAELGA LTQYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAHTSFDYWGQGTLVTVSSG GGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKL LIYKASTLSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAMDQPPTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 3 gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgag actctcctgtgcagcctctggattcacctttagcagctatgccatgagctgggtccgccag gctccagggagggctggagtgggtctcaacgattgctgcttagggtaagcatacagattac gcagactccgtgaagggccggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatc tgcaaatgaacagctagagccgaggacacggccgtatattactgtgcgaaatcgatgcgtg gttttgacaactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagcggtggaggcggttcagg cggaggtggcagcggcgggggggtcgacggacatccagatgacccagtctccatcctccct gtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagagcattagcagc tatttaaattggtatcagcagaaccgggaaagcccctaagctcctgatctatcgggcatcc tctttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactc tcaccatcagcagtctgcaacctgaaatttgcaacttactactgtcaacaggatgcgactg gtcctgcgacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaacgg-3' SEQ ID NO: 4 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIAA*GK HTDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSMRGFDNWGQGTLVTVSSG GGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKL LIYAS SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDATGPATFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 5 gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgag actctcctgtgcagcctctggattcacctttagcagctatgccatgagctgggtccgccag gctccagggagggctggagtgggtctcatcgattgagacttagggtccgactacactgtac gcagactccgtgaagggcaggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatc tgcaaatgaacagctagagccgaggacacggccgtatattactgtgcgaaaacgtctagtg cgtttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagcggtggaggcggttcagg cggaggtggcagcggcgggggggtcgacggacatccagatgacccagtctccatcctccct gtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagagcattagcagc tatttaaattggtatcagcagaaccgggaaagcccctaagctcctgatctatcatgcatcc tcgttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactc tcaccatcggcagtctgcaacctgaaatttgcaacttactactgtcaacagaatgttgcta ctcctctgacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaacgg-3' SEQ ID NO: 6 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIETQGP TTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTSSAFDYWGQGTLVTVSSG GGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKL LIYASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIGSLQPEDFATYYCQQNVATPLTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 7 gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgag actctcctgtgcagcctctggattcacctttagcagctatgccatgagctgggtccgccag gctccagggagggctggagtgggtctcaacgattgagccgtagggttcggctacagagtac gcagactccgtgaagggccggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatc tgcaaatgaacagctagagccgaggacacggccgtatattactgtgcgaaaacgcagacgg gttttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagcggtggaggcggttcagg cggaggtggcagcggcgggggggtcgacggacatccagatgacccagtctccatcctccct gtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagagcattagcagc tatttaaattggtatcagcagaaccgggaaagcccctaagctcctgatctataaggcatcc actttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcacto tcaccatcagcagtctgcaacctgaaatttgcaacttactactgtcaacaggatgttgagc ctcctgctacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaacgg-3' SEQ ID NO: 8 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIEP*GS ATEYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTQTGFDYWGQGTLVTVSSG GGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKL LIYASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDVEPPATFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 9 Gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgag actctcctgtgcagcctctggattcacctttagcagctatgccatgagctgggtccgccag gctccagggagggctggagtgggtctcaagtattgagcagatgggttggtagacatattac gcagactccgtgaagggccggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatc tgcaaatgaacagctagagccgaggacacggccgtatattactgtgcgaaatcggctgctg cttttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagcggtggaggcggttcagg cggaggtggcagcggcgggggggtcgacggacatccagatgacccagtctccatcctccct gtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagagcattagcagc tatttaaattggtatcagcagaaccgggaaagcccctaagctcctgatctatgcggcatcc agtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactc tcaccatcagcagtctgcaacctgaaatttgcaacttactactgtcaacagacggttgtgg cgcctttgacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaacgg-3' SEQ ID NO: 10 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGW QTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAAAFDYWGQGTLVTVSSG GGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKL LIYAASLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVVAPLTFGQGTKVEIKR La unión determinada mediante ensayo de ELISA del Jagged 13 ScFv-phage y Jagged 32 ScFv-phage hacia Jagged 1 humano mostró ser inhibida por Notch 1 humano. Brevemente, Jagged 1-Fc humano (R&D Systems; ibid.) fue adsorbido en los pocilios de una placa de ELISA de 96 pocilios. Se aplicaron los fagos a la placa en presencia o ausencia de Notchl-Fc humano y se permitió la ligación. Los fagos ligados fueron visualizados con un conjugado anti-M13-HRP (GE Healthcare, Piscataway, NY) y se revelaron con el sustrato cromogénico tetrametil benzidina (TMB) (Thermo Scientific, Rockford, IL).
EJEMPLO 2: Producción y evaluación de anticuerpos Jagged IgG completamente humanos de las realizaciones El presente ejemplo demuestra que Jagged ScFv-phage que se une a Jagged 1 humano puede ser convertido a anticuerpos IgG completamente humanos que ligan Jagged 1 y Jagged 2 humanos, asi como Jagged 1 de ratón. Notch 1 humano puede inhibir dicha unión.
La producción de IgGs completamente humanos incluyendo los dominios variables de Jagged 13 y Jagged 32 fue lograda usando téenicas similares a las descritas en documento PCT de No. de Publicación WO 2010/081173, ibid. El ADN codificante de los dominios variables Jagged 13 y 32 del Jagged 13 ScFv-phage y Jagged 32 ScFv-phage fueron clonados en vectores de expresión para la expresión de IgGs completamente humanos. Los dominios variables de cadena ligera (Le) fueron amplificados de moldes ScFv usando el primer CX1197 (cacttgtcacgaattcggacatccagatgacccagtc) (SEQ ID NO: 83) y primer CX1198 (gtgcagccaccgtacgtttgatttccaccttggtccc) (SEQ ID NO: 84). Vector (LcpOP (modificado de pCDNA3, Invitrogen, Carlsbad, CA)) y el DNA amplificado fueron cortados con BsiWI y EcoRI toda la noche, combinados mediante ligación y transformados en células E. coli MC1061. Los dominios variables de la cadena pesada (He) fueron amplificados a partir de moldes ScFv usando el primer CX1199 (ttgcacttgtcacgaattcggaggtgcagctgttggagtc) (SEQ ID NO: 85) y primer CX1202 (ggcccttggtgctagcgctcgagacggtgaccagggttc) (SEQ ID NO: 86). El DNA codificante de la secuencia señal de interleucina 2 (ILD) fue amplificado a partir de HcpPOP (modificado a partir de pCDNA3, Invitrogen) usando el primer CX1184 (gaaccgtcagatcactagaagc) (SEQ ID NO: 81) y primer CX1185 (cgaattcgtgacaagtgcaagacttagtg) (SEQ ID NO: 82), y templado con los dominios variables HC. El vector (HcpOP (modificado a partir de pCDNA3, Invitrogen)) y los dominios variables IL2-Hc fueron escindidos con HindIII y NheI toda la noche, combinados mediante ligación y transformados en células E. coli MC1061. IgGs completamente humanos (por ejemplo, Jagged 13 IgG y Jagged 32 IgG, también mencionados aqui como anti-Jagged 13 (o anti- Jag 13) y anti-Jagged 32 (o anti-Jag 32), respectivamente) fueron expresados de células temporalmente transfectadas HEK-293 y purificadas del cultivo sobrenadante mediante cromatografía con Proteína A.
Como mostró la figura 1, los experimentos de ligación ELISA revelaron que anti-Jagged 13 IgG y anti-Jagged 32 IgG ligan Jagged 1 humano y de ratón y Jagged 1 humano, con afinidades sobre los 30 nM: Jagged 1 humano-Fc (R&D Systems; ibid.), Jagged 2 humano-Fc (R&D Systems; Cat # 1726-JG-050), o Jagged 1-Fc de rata (R&D Systems; Cat # 599-JG-100) fueron adsorbidos en los pocilios de una placa de ELISA de 96 pocilios. Los anticuerpos purificados anti-Jagged 13 y anti-Jagged 32 fueron aplicados a la placa y se permitió su ligación. El anticuerpo ligado fue visualizado con un conjugado anti-IgG-HRP humano, Fab-específico (Sig a, St Louis, MO; Cat # A0293-1ML) y se reveló con el sustrato cromogénico TMB.
Como se muestra en la figura 2, los experimentos de ligación ELISA demostraron que la ligación de Jagged 1 con anti-jagged 13 y anti-Jagged 32 fue inhibida por Notch 1 humano: para experimentos de competición, Notch 1-Fc (R&D Systems; ibid.) fue adsorbido a las paredes de una placa de ELISA de 96 pocilios. Se aplicó Jagged 1-Fc humano (R&D Systems; ibid.) biotinilado a la placa en concentraciones en aumento de los anticuerpos anti-Jagged 13 y anti-Jagged 32, y se permitió su ligación. El Jagged 1 ligado fue visualizado con estreptavidina-HPL (Thermo Scientific) y revelado con el sustrato cromogénico TMB. Se usó Anti-Jagged MAB-12771 (R&D Systems; Cat# MAB12771) como control positivo para la inhibición y bevaxizumab como un control negativo. Los términos "viejo" y "nuevo" se refieren a lotes diferentes de producción de anticuerpos. El anticuerpo 32/13 tiene una cadena ligera anti-Jagged 32 y una cadena pesada anti-13. El anticuerpo 32/32 tiene las cadenas ligeras y pesadas anti-Jagged 32.
EJEMPLO 3. Maduración de la afinidad de anticuerpos anti-Jagged de las realizaciones Este ejemplo demuestra el aislamiento de anticuerpos de las realizaciones con cinéticas mejoradas de ligación y especificidades de ligación Jagged.
Los anticuerpos Anti-Jagged fueron aislados de las librerías con CDRs modificados a partir de anti-Jagged 32. Tales librerías fueron diseñadas como se mostró en la tabla 2. Seis librerías de anticuerpos, basados en la secuencia de anti-Jagged 32, fueron construidas usando mutagénesis Dut/ug (ver, por ejemplo, Kunkel TA, 1985, Proc Nati Acad Sci 82, 488-492). Los residuos fueron variados por aleatorización suave en cada nucleótido indicado, reteniendo el 70% de los nucleótidos originales y 10% de cada uno de los otros tres posibles nucleótidos (superíndice 1 en la tabla 2), o por aleatorización total (superindice 2 en la tabla 2). Adicionalmente, entre las librerías 3 y 6, se agregaron residuos adicionales a CD3 de la cadena pesada. Las librerías fueron transfectadas en E. coli cepa TG1 y los fagos fueron preparados siguiendo súper-infección con M13K07 (Invitrogen).
Se realizaron tres rondas de selección para cada librería aumentando el rigor. Para la Ronda tres, se adsorbió Jagged 1 humano 1 (R&D Systems; ibid. ) en inmunotubos (Nunc, Denmark) a 5 microgramos por mL (pg/mL). Los fagos fueron bloqueados con 100 mg/mL de IgG (huIgG, or hlgG) agrupado humano y 2% de leche seca sin grasa (NFDM) en salina Tris-buffer (TBS; 40 mM Tris, 129 mM NaCl, pH 7.4), y luego se agregaron a los tubos recubiertos para la ligación. Luego de la ligación, los tubos fueron lavados extensivamente incluyendo cuatro lavados a 37 °C durante 30 minutos cada uno. Luego de los lavados, el fago ligado remanente fue eluido con 100 mM trietanolamina (TEA) (Sigma, St. Louis, MO) y expandido mediante E. coli TG1. Las librerías 1, 2 y 5 fueron combinadas para formar la librería 125, y las librerías 3, 4 y 6 fueron combinadas para formar la librería 346; cada librería fue sometida a una Ronda adicional de selección, también mencionada aquí como ronda cuatro de selección de la librería 125 y ronda cuatro de selección de la librería 34, respectivamente, como se describió para la ronda tres.
Tabla 2. Secuencias CDR para librerías de maduración por afinidad El superíndice 1 denota los residuos que fueron variados por aleatorización suave en cada nucleótido indicado, reteniendo el 70% del nucleótido original y 10% de cada uno de los otros tres posibles nucleótidos, mientras que Superíndice 2 denota los residuos que fueron variados por aleatorización total.
EJEMPLO 4. Características de ligación de la afinidad madurada de anticuerpos anti-Jagged Este ejemplo demuestra las características de ligación de la afinidad de los anticuerpos anti-Jagged madurados de las realizaciones aisladas a partir de procesos de maduración de la afinidad.
Cuarenta y ocho (48) clones de cada ronda cuatro de selección de la librería 125 y ronda cuatro de selección de la librería 346 fueron crecidos e infectados con M13K07 para generar un fago. Cada fago fue analizado por su capacidad de ligar Jagged 1-Fc humano (R&D Systems; íbid. por fago ELISA. Los ligandos Jagged fueron absorbidos en los pocilios de las placas de ELISA de 96 pocilios, cada ligando en una placa separado. Los fagos se aplicaron en pocilios correlativos en cada plato y se permitió la ligación. Los fagos ligados se visualizaron con un conjugado anti-M13-HRP y se revelaron con el sustrato cromogénico TMB. Los aislados individuales mostraron especificidades de ligación divergentes; estas especificidades son mostradas en la tabla 3. También se muestra el SEQ ID NO de cada uno de estos aislados.
Tabla 3: aislados únicos tienen distintas especificidades de ligación Las secuencias de aminoácidos de cada uno de los clones de la tabla 3 se muestra abajo: SEQ ID NO: 11 Lc4 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 12 Hc4 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGW QTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTV SS SEQ ID NO: 13 Lc5 DIQ TQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 14 Hc5 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGW QTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPYHGQFDYWGQGTLVTV SS SEQ ID NO: 15 Lc7 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 16 Hc7 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGW QTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPFFGQFDYWGQGTLVTV SS SEQ ID NO: 17 Lc8 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 18 Hc8 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGW QTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHIGRTNPFDYWGQGTLVTV SS SEQ ID NO: 19 Lcl3 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 20 Hcl3 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGW QTEYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAAAFDY GQGTLVTVSS SEQ ID NO: 21 Lcl6 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 22 Hcl6 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGW QTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPYYGQFDYWGQGTLVTV SS SEQ ID NO: 23 Lcl9 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 24 Hcl9 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGW QTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPFFGQFDYWGQGTLVTV SS SEQ ID NO: 25 Lc21 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 26 Hc21 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGW QTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTV SS SEQ ID NO: 27 Lc24 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 28 Hc24 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEEMGW QTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAAAFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 29 Lc26 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 30 Hc26 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYA SWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGW QTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTV SS SEQ ID NO: 31 Lc27 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 32 Hc27 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGW QTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPFYGQFDYWGQGTLVTV SS SEQ ID NO: 33 Lc28 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 34 Hc28 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGW QTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPFFGQFDYWGQGTLVTV SS SEQ ID NO: 35 Lc30 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 36 Hc30 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEEMGW QTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYAKSAAAFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 37 Lc31 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 38 Hc31 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGW QTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTV SS SEQ ID NO: 39 Lc32 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 40 Hc32 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYA SWVRQAPGKGLEWVSSIDPEGW QTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAAAFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 41 Lc37 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 42 Hc37 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGW QTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPHNGQFDYWGQGTLVTV SS SEQ ID NO: 43 Lc39 DIQ TQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 44 Hc39 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGW QTEYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAAAFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 45 Lc40 DIQ TQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 46 Hc40 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGW QTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPFFGQFDYWGQGTLVTV SS SEQ ID NO: 47 Lc47 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO: 48 Hc47 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIDEMGW QTEYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAAAFDYWGQGTLVTVSS EJEMPLO 5:Aislamiento y prueba de afinidad de anticuerpos madurados anti-Jagged 1 y anti-Jagged 2 de las realizaciones.
Este ejemplo describe el uso de la mezcla de CDR para aislar anticuerpos de las realizaciones que muestran afinidades de ligación mejoradas para Jagged 1 y/o Jagged 2.
Una sétima librería se construyó combinando las cadenas ligeras de la ronda cuatro de selección de la librería 125 y las cadenas pesadas de la ronda cuatro de selección de la librería 346. Esta librería H/L fue seleccionada mediante dos rondas adicionales. En la ronda uno, la librería fue dividida en dos partes: una parte fue seleccionada para ligarse a Jagged 1-Fc humano (R&D Systems; ibid. y la segunda parte fue seleccionada para ligarse a Jagged 2-Fc humano (R&D Systems; ibid. . En la ronda dos, el fago seleccionado Jagged 1 humano de la Ronda 1 fue seleccionado para ligarse a Jagged 1-Fc humano (R&D Systems; ibid. ) o Jagged 2-Fc humano (R&D Systems; ibid.) en reacciones de ligación separadas, produciendo dos agrupaciones, designadas Jagged 1/1 y Jagged 1/2, respectivamente. De la misma manera, el fago seleccionado Jagged 2 de la Ronda uno fue seleccionado para ligarse a Jagged 1-Fc humano (R&D Systems; ibid. ) o Jagged 2-Fc humano (R&D Systems; ibid.) en reacciones de ligación separadas, produciendo dos agrupaciones, designadas Jagged 2/1 y Jagged 2/2, respectivamente.
Se eligieron noventa y cinco (95) aislados individuales de cada una de las cuatro agrupaciones. Los fagos fueron derivados de cada aislados y ensayados para ligación a Jagged 1-Fc humano (R&D Systems; ibid.) o Jagged 2-Fc humano (R&D Systems; ibid.). Los ligandos Jagged fueron adsorbidos a los pocilios de una placa de ELISA de 96 pocilios, cada ligando en una placa separado. Los fagos fueron aplicados a pocilios correlativos en cada plato y se permitió la ligación. Los fagos ligados fueron visualizados con un conjugado anti-M13-HRP conjugado y revelados con la sustancia cromogénica TMB. En base a los resultados de ELISA y la secuencia de DNA, se eligieron 6 clones únicos para estudios posteriores. La tabla 4 lista los anticuerpos codificados por los 6 clones y los SEQ ID Nos para las secuencias de ácidos nucleicos y secuencias de aminoácidos de sus respectivas cadenas ligeras y pesadas.
Tabla 4. SEQ ID Nos de los seis clones codificando la afinidad de los anticuerpos madurados 0 5 Las secuencias de aminoácidos de cada uno de los clones finales en la tabla 4 después de la transposición se muestran abajo: 4B2 Cadena ligera 0 SEQ ID NO: 49 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGT CACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAA CCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCAT CAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACC TGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGACGCTAGACGCTCCTCCGCAATTCGGCCAA GGGACCAAGGTGGAAATCAAACGT SEQ ID NO: 50 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q S I S S Y L N W Y Q Q K P G K A P K L L I Y A A S S L Q S G V P S R F S G S G S G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q T L D A P P Q F G Q G T K V E I K R Cadena pesada SEQ ID NO: 51 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAG ACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAG GCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAAGTATTGAGCAGATGGGTTGGCAGACATATT ACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTA TCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGACATC GGCGGCAGGTCGGCCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA SEQ ID NO: 52 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S S Y A M S W V R Q A P G K G L E W V S S I E Q M G W Q T Y Y A D S V K G R F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K D I G G R S A F D Y W G Q G T L V T V S S 4D11 Cadena ligera SEQ ID NO: 53 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGT CACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAA CCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCAT CAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACC TGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGACGGTTGTGGCGCCTCCGTTATTCGGCCAA GGGACCAAGGTGGAAATCAAACGT SEQ ID NO: 54 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q S I S S Y L N W Y Q Q K P G K A P K L L I Y A A S S L Q S G V P S R F S G S G S G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q T V V A P P L F G Q G T K V E I K R Cadena pesada SEQ ID NO: 55 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAG ACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAG GCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGTCAAGTATTGACCCGGAAGGTCGGCAGACATATT ACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTA TCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCC GTATATTACTGTGCGAAAGACATCGGCGGCAGGTCGGCCTTTGACTACTGGGGCCA GGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA SEQ ID NO: 56 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S S Y A M S W V R Q A P G K G L E W V S S I D P E G R Q T Y Y A D S V K G R F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K D I G G R S A F D Y W G Q G T L V T V S S 4E7 Cadena ligera SEQ ID NO: 57 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGT CACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAA CCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCAT CAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACC TGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGTCGCTGGTGGCGCCTCTTACCTTCGGCCAA GGGACCAAGGTGGAAATCAAACGT SEQ ID NO: 58 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q S I S S Y L N W Y Q Q K P G K A P K L L I Y A A S S L Q S G V P S R F S G S G S G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q S L V A P L T F G Q G T K V E I K R Cadena pesada SEQ ID NO: 59 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAG ACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAG GCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGTCAAGTATTGAAGAGATGGGTTGGCAGACAAAGT ACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTA TCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAATCGGCT GCTGCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA SEQ ID NO: 60 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S S Y A M S W V R Q A P G K G L E W V S S I E E M G W Q T K Y A D S V K G R F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K S A A A F D Y W G Q G T L V T V S S 4E11 Cadena ligera SEQ ID NO: 61 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGT CACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAA CCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCAT CAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACC TGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGGCGTTAGATGCCCCTCTGATGTTCGGCCAA GGGACCAAGGTGGAAATCAAACGT SEQ ID NO: 62 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q S I S S Y L N W Y Q Q K P G K A P K L L I Y A A S S L Q S G V P S R F S G S G S G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q A L D A P L M F G Q G T K V E I K R Cadena pesada SEQ ID NO: 63 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAG ACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAG GCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGTCAAGTATTGAGCCTATGGGTTGACTAACAGAAT ACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTA TCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGACATC GGCGGCAGGTCGGCCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA SEQ ID NO: 64 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S S Y A M S W V R Q A P G K G L E W V S S I E P G Q L T E Y A D S V K G R F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K D I G G R S A F D Y W G Q G T L V T V SS 6B7 Cadena ligera SEQ ID NO: 65 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGT CACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAA CCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCAT CAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACC TGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGGCGCTTGTCGCCCCTCTGACGTTCGGCCAA GGGACCAAGGTGGAAATCAAACGT SEQ ID NO: 66 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q S I S S Y L N W Y Q Q K P G K A P K L L I Y A A S S L Q S G V P S R F S G S G S G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q A L V A P L T F G Q G T K V E I K R Cadena pesada SEQ ID NO: 67 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAG ACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAG GCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGTCAAGTATTGATGAGATGGGTTGGCAGACATATT ACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTA TCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAATCGGCT GCTGCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA SEQ ID NO: 68 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F IJ F S S Y A M S W V R Q A P G K G L E W V S S I D E M G W Q T Y Y A D S V K G R F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K S A A A F D Y W G Q G T L V T V S S 6F8 Cadena ligera SEQ ID NO: 69 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGT CACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAA CCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCAT CAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACC TGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGGCGCTTGTCGCCCCTCTGACGTTCGGCCAA GGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTAC SEQ ID NO: 70 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q S I S S Y L N W Y Q Q K P G K A P K L L I Y A A S S L Q S G V P S R F S G S G S G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q A L V A P L T F G Q G T K V E I K R Cadena pesada SEQ ID NO: 71 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAG ACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAG GCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGTCAAGTATTGATGAGATGGGTTGGCAGACATATT ACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTA TCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAATCGGCT GCTGCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA SEQ ID NO : 72 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S S Y A M S W V R Q A P G K G L E W V S S I D E M G W Q T Y Y A D S V K G R F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K S A A A F D Y W G Q G T L V T V S S Las librerías fueron configuradas con una etiqueta de His en el extremo carboxi en el Fab, y un codón de parada ámbar en el extremo carboxi para la etiqueta de His, de tal forma que, cuando los fagémidos codificando los seis anticuerpos maduros de afinidad estuvieron en una cadena supresora no ámbar, los fagémidos dirigieron la expresión de un Fab marcado con His en el extremo C-terminal que podría ser purificado del espacio periplásmico de E. coli . Para medir las afinidades de los seis aislados madurados, asi como las afinidades de los Fabs Jagged 13 y anti-jagged 32, los Fabs fueron expresados y purificados de E. coli DH12b. [000473] Las tasas de decrecimiento para los Fabs individuales se midieron usando un Octeto (ForteBio, Menlo Park, CA). Las puntas del Octeto Anti-Fc humano (ForteBio, Cat # 18-5060) fueron bloqueadas con biocitina y 100 mg/mL BSA y luego cargadas con 25 micromolar (25 mM) de ligando Jagged, llamado Jagged 1 humano-Fc (R&D Systems; ibid. ) , Jagged 2 humano-Fc (R&D Systems; ibid. ) , o Jagged 1 murino-Fc (R&D Systems; ibid. ) . Luego del lavado, las puntas cargadas fueron expuestas a 25 mM Fab hasta que la ligación haya alcanzado el equilibrio. Las puntas fueron removidas con una solución fresca sin Fab, y la tasa de disociación Fav fue medida. Las constantes de disociación listadas en la tabla 5 muestran que las tasas de decrecimiento de la afinidad de los anticuerpos madurados han disminuido 10 a 100 veces en comparación con los anticuerpos ScFv jagged 13 y Jagged 32.
Tabla 5: constantes de disociación para los Fabs anti-Jagged EJEMPLO 6. Producción de anticuerpos anti-Jagged de las realizaciones Este ejemplo demuestra la expresión y purificación de anticuerpos anti-Jagged de las realizaciones.
Los vectores se hicieron de la siguiente manera. La región de secuencia codificante de la señal IL2 fue movida desde pINFUSE-hIgGl-Fc2 (InvivoGen, San Diego, CA) como un fragmento Kasl/Ncol hacia pFUSE2-CLIg-hk (InvivoGen) digerido con Kasl/Ncol, resultando en el plásmido pFIL2-CL-hk. La región codificante de la secuencia señal IL2 también fue movida desde pINFUSE-hIgGl-Fc2 como ún fragmento KasI/EcoRI hacia pFUSE-CHIg-hGl (InvivoGen) digerido con KasI/ EcoRI (fragmentos largos y medianos) en una ligación de 3 vías, resultando en el plásmido pFIL-CHIg-hGl.
La región codificante de cadena ligera del vector pFIL2-CL-hk fue amplificada usando primers CX1170 y CX1168 y clonada en el vector pOP Neo usando los sitios NheI y Notl usando el sistema de infusión de clonamiento (HD EcoDry, Clontech, Mountain View, CA), mutando el sitio Noti en el proceso. La región codificante de la cadena variable ligera 4D11 fue amplificada mediante PCR de la secuencia codificante aislada 4D11 usando primers CX1197 y CX1198 y clonada en los sitios de restricción EcoRI y BsiWI. Los primers son proporcionados en la tabla 6. La secuencia de ácidos nucleicos de la cadena ligera 4D11 está representada por SEQ ID NO:73, y la secuencia de aminoácidos está representada por SEQ ID NO:74. 4D11 Secuencia de cadena ligera: SEQ ID NO: 73 gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagt caccatcacttgccgggcaagtcagagcattagcagctatttaaattggtatcagcagaaa ccagggaaagcccctaagctcctgatctatgcggcatccagtttgcaaagtggggtcccat caaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacc tgaagattttgcaacttactactgtcaacagacggttgtggcgcctccgttattcggccaa gggaccaaggtggaaatcaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccat ctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcc cagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggag agtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctga gcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgag ctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt SEQ ID NO: 74 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVVAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC La región codificante de la cadena pesada del vector pFIL-CHIg-hGl fue clonada en el vector pOP Hygr (modificación del pCDNA3, Invitrogen) como sigue: dos fragmentos solapados fueron amplificados, el primero fue la región no codificante 5'del vector pOP Hygr usando primers CX1184 y CX1185 y el Segundo fue la región codificante del vector pOP Hygr usando primers CX1184 y CX1185 y el Segundo fue la región codificante de pFIL- CHIg-hGl usando primers CX1172 y CX1169 y clonados en el vector pOP Hygr usando los sitios de restricción HindlII y Notl . La región variable codificante de la cadena pesada 4D11 fue clonada de manera similar, usando el mismo primer fragmento de DNA y el segundo fragmento siendo amplificado de la secuencia codificante 4D11 aislada usando primers CX1199 y CX102. Los dos fragmentos fueron amplificados usando primers CX1184 y CX1202 y clonados en los sitios de restricción HindlII y NheI. Los primers son proporcionados en la tabla 6. La secuencia de ácidos nucleicos de la cadena ligera 4D11 está representada por SEQ ID NO:75, y la secuencia de aminoácidos está representada por SEQ ID NO:76. 4D11 Secuencia de cadena pesada: SEQ ID NO: 75 gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactct cctgtgcagcctctggattcacctttagcagctatgccatgagctgggtccgccaggctcc agggaaggggctggagtgggtgtcaagtattgacccggaaggtcggcagacatattacgca gactccgtgaagggccggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgc aaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtatattactgtgcgaaagacatcggcgg caggtcggcctttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagctagcacc aagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcgg ccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcagg cgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactcc ctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacg tgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaa aactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctc ttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtgg tggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtgga ggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtc agcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtct ccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccg agaaccacaggtgtacaecetgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagc ctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatg ggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttctt cctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgc tccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgg gtaaa SEQ ID NO: 76 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIDPEGRQTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Tabla 6. Secuencias de los primers Se expresaron IgGs completamente humanos de células HEK-293 temporalmente transfectadas y purificadas a partir del sobrenadante del cultivo mediante cromatografía con proteína A.
EJEMPLO 7. Un anticuerpo anti-Jagged de las realizaciones reduce los tumores BxPC-3 en ratones En este ejemplo, el anti-Jagged 4D11 fue analizado en cuanto a la capacidad de reducir el crecimiento de tumores de xenoinjerto BxPC-3.
La línea celular de cáncer pancreático humano BxPC-3 fue obtenida del Cell Bank of Shanghai Institute for Biological Sciences , Chínese Academy of Sciences . Los xenoinjertos BxPC-3 fueron desarrollados inyectando células BxPC-3 por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones sin pelo Balb/c. Hasta alcanzar los 500 - 700 m3, el tumor fue cosechado para un cultivo celular in vitro y pasaje serial. Las células BxPC-3 adaptadas in vivo (células derivadas de xenoinjerto) fueron crecidas en RPMI-1640 suplementado con suero fetal bovino 10% a 37 °C en una atmósfera de 5% CO2 en el aire. Las células tumorales fueron subcultivadas rutinariamente dos veces por semana. Las células fueron cosechadas durante el periodo de crecimiento logarítmico, resuspendidas en PBS físico con la concentración celular apropiada, y mantenidas en hielo para inducir tumores.
Cada ratón fue inoculado por via subcutánea en el flanco derecho con 5 x 106células de BxPC3 en 0.1 mL de PBS para el desarrollo de tumores. Los tratamientos iniciaron cuando el tamaño promedio del tumor alcanzó aproximadamente 150 m3. Los tamaños de los tumores se midieron dos veces por semana en dos dimensiones usando un calibrador, y el volumen fue expresado en m 3 usando la fórmula: V = 0.5 a x b2 donde a y b son los diámetros largo y corto del tumor, respectivamente.
Los ratones fueron agrupados y tratados como se estableció en la tabla 7.
Tabla 7: grupos y dosis para el estudio de xenoinjertos BxPC- 3.
La Figura 3, que gráfica el volumen del tumor versus el número de días después de la dosis inicial, demuestra que el anticuerpo anti-Jagged AD11 inhibe el crecimiento de tumores de xenoinjerto BxPXX-3. La figura 4 indica la pérdida de peso en los animales de los grupos 1 y 2. La concentración sérica de linfoproteina estromal timica de ratón (TSLP_ fue medida usando el inmunoensayo Quantikine mouse TSLP (R&D Systems) c siguiendo el protocolo del fabricante. Los niveles séricos de TSLP de ratón fueron cuantificados individualmente para cada ratón de cada grupo y se promediaron para generar la figura 5.
Anti-Jagged 4D11 también fue evaluado en cuanto a la capacidad de reducir el crecimiento de tumores de xenoinjerto BxPC-3 de manera dependiente a la dosis, usando un método similar al descrito arriba.
Tabla 8. Grupos y dosis para el estudio de xenoinjertos BxPC- Figura 6, que gráfica el volumen del tumor versus el número de dias después de la dosis, demuestra que el anticuerpo anti-Jagged AD11 inhibe el crecimiento de tumores de xenoinjerto BxPC-3. La figura 7 indica pérdida de peso en los animales.
En un segundo estudio, también se evaluó anti-Jagged 4D11 en cuanto a la capacidad de reducir el crecimiento de tumores de xenoinjerto BxPC-3 en combinación con un segundo agente anticancerígeno. En este estudio, anti-Jagged 4D11 fue administrado sólo o en combinación con gemcitabina, el estándar actual de cuidados quimioterapéuticos en cáncer pancreático, usando un método similar al descrito arriba, y usando las dosis establecidas en la figura 23. En estos estudios, la toxicidad del anticuerpo fue aparente desde la pérdida de peso y mortalidad. Estos estudios demostraron que la combinación de anti-Jagged 4D11 y gemcitabina inhibe el crecimiento de tumores de xenoinjerto BxPC-3. Como se vio en la figura 23, la combinación de anticuerpo anti-Jagged y gemcitabina produjo un efecto aditivo en el modelo de xenoinjerto pancreático BXPC3.
EJEMPLO 8. Un anticuerpo anti-Jagged de las realizaciones inhibe el crecimiento de RPMI 8226 en co-cultivos de médula ósea humana Este ejemplo demuestra que anti-Jagged 4D11 inhibe el crecimiento de RPMI 8226 en co-cultivos de médula ósea humana.
En melanoma múltiple, la interacción entre las células de mieloma y las células estromales de la médula ósea es importante para la sobrevivencia y proliferación de las células de mieloma y el desarrollo de la enfermedad osteolitica acompañante. Los receptores Notch y los ligandos son sobreregulados en el mieloma múltiple. La capacidad de anti-Jagged 4D11 para inhibir la proliferación de la linea celular RPMI 8226 fue medida in vitro en co-cultivos de RPMI 8226 y aspirados de médula ósea humana. La médula ósea humana fue conseguida de AllCells, LLC (Emeryville, CA). Las células RPMI 8226 fueron marcadas con CFSE como indican las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA). Brevemente, la médula ósea fue diluida dos veces en RPMI-1640, 10% FBS y 2 mL se plaquearon en los pocilios de una placa de cultivo de 6 pocilios. Una cantidad de 50,000 células RMPI 8226 marcadas con CFSE, en 1 mL RPMI1640, 10% FBS, fueron plaqueadas en los pocilios conteniendo médula ósea. Las sustancias de prueba, es decir, anti-Jagged 4D11, anti-EGFR (anticuerpo c225, cetuximab UCSF Pharmacy, producido y comercializado por Bristol-Myers Squibb, NY, NY) o inhibidor de gamma secretase BMS299897 (Sigma, St. Louis, MO), fueron agregados, y los cultivos fueron incubados a 37 °C y 5% de C02 durante cinco dias. Luego de la incubación, los glóbulos rojos fueron U sados, y las células vivas fueron colectadas mediante centrifugación. La intensidad fluorescente de las células fue medida mediante FACS.
Los resultados son mostrados en la figura 8. La fluorescencia reducida, que indica proliferación, fue medida en ausencia de cualquier tratamiento o en presencia del anti-EGFR. Por el contrario, BMS299897 (GSI) y anti-Jagged 4D11 inhibieron la proliferación de RPMI 8226 marcado con CFSE.
EJEMPLO 9. Un anticuerpo anti-Jagged de las realizaciones inhibe el desarrollo de la fibrosis in vitro Este ejemplo demuestra que anti-Jagged 4D11 inhibe el desarrollo de la fibrosis in vitro.
La linea celular de fibroblastos de rata NRK-49F (ATCC, Manassas, VA) responde a la transformación del factor de crecimiento beta 1 humano (TGF i) por pérdida de contacto célula-célula, producción elevada y deposición de colágeno y desarrollo de focos. Células NRK-F49 fueron plaqueadas a 50,000 células/pocillo, en una placa de cultivo de 6 pocilios y cultivado toda la noche en RPMI-1640, suero bovino fetal (FBS) al 10% para permitir la formación de ligandos y monocapas. El medio fue removido, y las células fueron lavadas dos veces con RPMI-1640, 1% FBS inactivado con calor y cultivado toda la noche en RPMI-1640, 1% FBS inactivado con calor. Luego de la incubación toda la noche, anti-Jagged 4D11, ??BbI, o la combinación de TGFpi y anti-Jagged 4D11 fue agregado a las células en cultivo. Las células fueron cultivadas durante 5 dias y observadas para una respuesta a TGFpi.
Los resultados están ilustrados en la figura 9. El panel A muestra que los cultivos de NRK-F49 retienen una característica monocapa cuando son cultivados en presencia de 100 nM anti-Jagged 4D11. El panel B muestra que la formación de focos fibróticos estimulada por TGTbl es completamente inhibida por 100 nM anti-Jagged 4D11 en cultivos tratados con 10 ng/mL TGF i.
EJEMPLO 10. Fracciones enmascarantes del anticuerpo anti-Jagged activable Este ejemplo describe la identificación de fracciones enmascarantes (MM) para reducir la ligación de anticuerpos anti-Jagged activables a su blanco.
El anticuerpo anti-Jagged 4D11 y Fab fueron usados para seleccionar una librería de péptidos X15 aleatoria con una diversidad total de 2 x 1010, donde X es cualquier aminoácido, usando un método similar al descrito en El documento PCT Internacional de Número de Publicación WO 2010/081173, que se publicó el 15 de julio del 2010. La selección consistió de una ronda de clasificación MACS y dos rondas de clasificación FACS. La MACS inicial fue hecha con Dynabeads Proteína A (Invitrogen) y el anticuerpo anti-Jagged 4D11 a una concentración de 250 nM. Para MACS, aproximadamente IOcIO11 células fueron seleccionadas por ligación y 6xl06 células fueron colectadas. Se usó StreptAvidin-PE como sonda fluorescente para el FACS inicial y anti-biotina-PE (Miltenyi) para el Segundo FACS. El anticuerpo anti-Jagged 4D11 biotinilado fue usado a una concentración de 100 nM y 10 nM en la primera y segunda ronda de FACS, respectivamente. La población positive de la segunda ronda de FACS fue verificada por estar inhibida por la proteína Jagged recombinante de ligarse al anticuerpo anti-Jagged 4D11 y Fab. Los clones péptidos individuales fueron identificados por análisis de secuencia y posteriormente fueron verificados por su capacidad de ligar el anticuerpo anti-Jagged 4D11 y Fab, como se mostró en la figura 10.
Las secuencias de las fracciones enmascarantes anti-Jagged están listadas en la tabla 9.
Tabla 9. Fracciones enmascarantes anti-Jagged (MM) EJEMPLO 11. Maduración de la afinidad de las fracciones enmascarantes anti-Jagged Este ejemplo describe la maduración de la afinidad de las fracciones enmascarantes anti-Jagged La afinidad de los péptidos de ligación anti-Jagged JS4874, JS4896, JS4899, y JS4906 fue madurada usando un enfoque de aleatorización suave. Una librería de visualización celular eCPX, descrita en el documento PCT Internacional de Número de Publicación WO 2009/014726, fue construida con las proporciones de nucleótidos mostradas en la tabla 10. Se construyeron cuatro librerías: 4874SR, 4896SR, 4899SR, y 4906SR. La diversidad final para cada librería fue aproximadamente 5 x 109. _ Tabla 10: Proporciones de nucleótidos_ Base original Proporción de bases G G=70% ; T=8%; A=ll%; C=ll% T T=70% ; G=8%; A=ll%; C=ll% A A=80%; G=5%; T=6%; 09% C C=80% ; G=5%; T=6%; A=9% Cada librería de maduración de afinidad fue seleccionada por separado. Se realizó una ronda inicial MACS con un número de células mayor a 100X de sobre-muestreo de la librería. Todo el etiquetado fue realizado a 4 °C bajo agitación constante y delicada. Las células fueron marcadas con anti-Jagged Fab (librería 4896SR) 25 nM o anticuerpo anti-Jagged (librerías 4874SR, 4899SR, y 4906SR) 50 nM y luego ligadas a aproximadamente 500 mg de estreptavidina o a microesferas magnéticas marcadas con proteína A (Dynabeads Invitrogen). Las microesferas fueron posteriormente lavadas extensivamente con PBS conteniendo 0.5% BSA. Aproximadamente 2 x 106 a 2 x 107 células de cada librería fueron recuperadas de la Ronda MACS inicial.
Las células bacterianas para todas las rondas FACS fueron marcadas con Fab anti-Jagged biotinilada. La marca fluorescente secundaria usada fue anti-biotina-PE (Milteny) o estreptavidina-PE (Invitrogen) dependiendo sólo del fondo de unión de la marca secundaria. Para todas las rondas FACS, el 2% más brillante de las células positivas fue clasificado. Para la librería 4896SR, las células para la Ronda 1 FACS (Fl) y Ronda 2 FACS (F2) fueron marcados con 2 nM y InM Fab, respectivamente. Para las librerías 4874SR, 4899SR, y 4906SR, las células para Fl fueron marcadas con 100 nM Fab. Para la librería 4874SR, las células paraF2 fueron marcadas con 1 NM Fab mientras que las células para las librerías 4899SR y 4906SR fueron marcadas con 10 nM Fab. Las secuencias de los FACS ronda 2 de cada librería son mostradas en las tablas 11 - 14.
Tabla 11. Secuencias de la fracción de enmascaramiento de la _ ronda 2 FACS de la librería 4874SR_ Secuencias de péptidos 4874SR M1F2 JF5336 PWCMQRQDYLRCPQP SEQ ID NO: 93 Tabla 12: Secuencias de la fracción de enmascaramiento de la ronda 2 FACS de la librería 4896SR Secuencias de péptidos 4896SR M1F2 JF5411 CNLWISGGDCRGLAG SEQ ID NO: 94 JF5416 CNLWVSGGDCRGVQG SEQ ID NO: 95 JF5421 CNLWVSGGDCRGLRG SEQ ID NO: 96 JF5432 CNLWISGGDCRGLPG SEQ ID NO: 97 JF5436 CNLWVSGGDCRDAPW SEQ ID NO: 98 JF5439 CNLWVSGGDCRDLLG SEQ ID NO: 99 JF5424 CNLWVSGGDCRGLQG SEQ ID NO: 100 JS5340 CNLWLHGGDCRGWQG SEQ ID NO: 101 JS5342 CNIWLVGGDCRGWQG SEQ ID NO: 102 JS5345 CTTWFCGGDCGVMRG SEQ ID NO: 103 JS5347 CNIWGPSVDCGALLG SEQ ID NO: 104 JS5358 CNIWVNGGDCRSFEG SEQ ID NO: 105 Tabla 13: Secuencias de la fracción de enmascaramiento de la ronda 2 FACS de la librería 4899SR Secuencias de péptidos 4899SR M1F2 JF5366 YCLNLPRYMQD CWA SEQ ID NO: 106 JF5372 YCLALPHYMQADCAR SEQ ID NO: 107 Tabla 14: Secuencias de la fracción de enmascaramiento de la ronda 2 FACS de la librería 4906SR Secuencias de péptidos 4906SR M1F2 JF5386 CFLYSCGDVSYWGSA SEQ ID NO: 108 JF5387 CYLYSCTDSAFWNNR SEQ ID NO: 109 JF5388 CYLYSCNDVSYWSNT SEQ ID NO: 110 5 JF5389 CFLYSCTDVSYW SEQ ID NO: 111 JF5390 CFLYSCTDVAYW SA SEQ ID NO: 112 JF5391 CFLYSCTDVSYWGDT SEQ ID NO: 113 JF5394 CFLYSCTDVSYWGNS SEQ ID NO: 114 JF5395 CFLYSCTDVAYWNNT SEQ ID NO: 115 JF5399 CFLYSCGDVSYWGNPGLS SEQ ID NO: 116 JF5402 CFLYSCTDVAYWSGL SEQ ID NO: 117 JF5404 CYLYSCTDGSYWNST SEQ ID NO: 118 JF5405 CFLYSCSDVSYWGNI SEQ ID NO: 119 JF5407 CFLYSCTDVAYW SEQ ID NO: 120 0 JF5409 CFLYSCTDVSYWGST SEQ ID NO: 121 JF5410 CFLYSCTDVAYWGDT SEQ ID NO: 122 La ligación del péptido de la fracción enmascarante parental JS4896 fue comparada a la ligación de los péptidos de la fracción enmascarante de la librería 4896SR (clones JS5340, JS5342, JS5347, y JS5358). Las células que contienen los clones indicados fueron analizados en FACS en 3 diferentes concentraciones de Fab anti-Jagged biotinilado, por ejemplo, 1 nM, 10 nM, 100 nM. Se usó estreptavidina-PE como una marca fluorescente secundaria. La expresión de los péptidos fue cuantificada por marcación con yPet-MONA usando téenicas similares a las descritas en PCT WO 2007/027935. Los resultados son mostrados en la figura 11.
EJEMPLO 12. Anticuerpos anti-Jagged activables Este ejemplo describe ejemplos de anticuerpos anti-Jagged activables de la descripción.
Los anticuerpos anti-Jagged activables que incluyen una fracción de enmascaramiento anti-Jagged, una fracción escindible y un anticuerpo anti-Jagged de la descripción fueron producidos de acuerdo a métodos similares a los que se encuentran descritos en los documentos PCT de Nos. de Publicación WO 2009/025846 y WO 2010/081173. El control de calidad de los anticuerpos activables resultantes indicó que la mayor parte comprendió de al menos 95% de monómeros. Las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de varios anticuerpos anti-Jagged activables de la descripción son proporcionadas abajo.
Las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de las cadenas ligeras (Le) o varios anticuerpos activadles anti-Jagged incluyendo la fracción enmascarante JS5342 (también referidos aquí como MM5342 o 5342), una CM que puede ser escindida por al menos una proteasa, y la cadena ligera de AB 4D11 son mostradas abajo. 5342-1203-4D11 Le Aminoácido QGQSGQCNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSGGSGGTGRGPSWVGGGSDIQMTQSPSSLS ASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTL TISSLQPEDFATYYCQQTVVAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVC LLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE VTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 132) Secuencia de nucleótidos CAAGGCCAGTCTGGCCAATGCAATATTTGGCTCGTAGGTGGTGATTGCAGGGGCTG GCAGGGGGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGTACTGGCCGTGGTCCAAGCTGG GTTGGCGGCGGTTCTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAG GAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTA TCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCATCCAGTTTGCAAAGT GGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCA GTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGACGGTTGTGGCGCCTCCGTT ATTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC TTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATA ACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAA CTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACC CTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATC AGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAÁGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT (SEQ ID NO: 131) 5342-1204-4D11 Lc Secuencia de aminoácidos QGQSGQCNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSGGSGGLSGRSDNHGGGSDIQMTQSPSSLS ASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTL TISSLQPEXFATYYCQQTVVAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVC LLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE VTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 134) Secuencia de nucleótidos CAAGGCCAGTCTGGCCAGTGCAATATTTGGCTCGTAGGTGGTGATTGCAGGGGCTG GCAGGGGGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGTCTGAGCGGCCGTTCCGATAAT CATGGCGGCGGTTCTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAG GAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTA TCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCATCCAGTTTGCAAAGT GGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCA GTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGACGGTTGTGGCGCCTCCGTT ATTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC TTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATA ACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAA CTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACC CTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATC AGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT (SEQ ID NO: 133) 5342-1214-4D11 Lc Secuencia de aminoácidos QGQSGQCNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSGGSGGSPLTGRSGGGGSDIQMTQSPSSLS ASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLXIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTL TISRLQPEDFATYYCQQTVVAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVC LLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE VTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 136) Secuencia de nucleótidos CAAGGCCAGTCTGGCCAGTGCAATATTTGGCTCGTAGGTGGTGATTGCAGGGGCTG GCAGGGGGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGCTCACCACTGACTGGTCGTTCC GGTGGCGGCGGTTCTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAG GAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTA TCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCATCCAGTTTGCAAAGT GGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCA GTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGACGGTTGTGGCGCCTCCGTT ATTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC TTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATA ACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAA CTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACC CTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATC AGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT (SEQ ID NO: 135) 5342-PLGL-4D11 Le Secuencia de aminoácidos QGQSGQCNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSGGSGGSGGGSPLGLGGSDIQMTQSPSSLS ASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTL TISSLQPEDFATYYCQQTVVAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVC LLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE VTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 138) Secuencia de nucleótidos CAAGGCCAGTCTGGCCAGTGCAATATTTGGCTCGTAGGTGGTGATTGCAGGGGCTG GCAGGGGGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGCTCAGGTGGAGGCTCGCCACTG GGCCTGGGCGGTTCTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAG GAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTA TCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCATCCAGTTTGCAAAGT GGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCA GTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGACGGTTGTGGCGCCTCCGTT ATTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC TTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATA ACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAA CTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACC CTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATC AGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT (SEQ ID NO: 137) Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de la cadena ligera de un anticuerpo enmascarado incluyendo la fracción de enmascaramiento 5342, un enlazador no escindióle, y la cadena ligera de AB 4D11 son mostrados abajo: 5342-NSUÓ-4D11 Le Secuencia de aminoácidos QGQSGQCNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSSGSGGSGGGSGGGSGGSDIQMTQSPSSLS ASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTL TISSLQPEDFATYYCQQTVVAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVC LLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE VTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 140) Secuencia de nucleótidos CAAGGCCAGTCTGGCCAGTGCAATATTTGGCTCGTAGGTGGTGATTGCAGGGGCTG GCAGGGGGGCTCGAGCGGTGGCAGCAGTGGCTCTGGTGGCTCAGGTGGAGGCTCGGGCGGT GGGAGCGGCGGTTCTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAG GAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTA TCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCATCCAGTTTGCAAAGT GGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCA GTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGACGGTTGTGGCGCCTCCGTT ATTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC TTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATA ACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAA CTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACC CTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATC AGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT (SEQ ID NO: 139) A continuación se proporcionan las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de varios polipéptidos, incluyendo MM 5342 y un CM que puede ligarse a un anticuerpo anti-Jagged de la descripción usando métodos como los descritos aquí para producir un anticuerpo anti-Jagged activable de la descripción: 5342-Cath.E Secuencia de aminoácidos QGQSGQCNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSGGSGGSAGFSLPAGGGS (SEQ ID NO: 142) Secuencia de nucleótidos CAAGGCCAGTCTGGCCAGTGCAATATTTGGCTCGTAGGTGGTGATTGCAGGGGCTG GCAGGGGGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGCTCAGCTGGCTTCTCCCTCCCC GCAGGTGGCGGTTCT (SEQ ID NO: 141) 5342-MMP-14 QGQSGQCNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSGGSGSLAPLGLQRRGGS (SEQ ID NO: 144) Secuencia de nucleótidos CAAGGCCAGTCTGGCCAGTGCAATATTTGGCTCGTAGGTGGTGATTGCAGGGGCTG GCAGGGGGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTAGCCTGGCACCTCTGGGTCTGCAA CGCCGTGGCGGTTCT (SEQ ID NO: 143) 5342-panMMP Secuencia de aminoácidos QGQSGQCNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSGGSGGSGGPLGVRGGGS (SEQ ID NO: 146) Secuencia de nucleótidos CAAGGCCAGTCTGGCCAGTGCAATATTTGGCTCGTAGGTGGTGATTGCAGGGGCTG GCAGGGGGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGCTCAGGTGGACCTTTGGGAGTC AGAGGTGGCGGTTCT (SEQ ID NO: 145) La catepsina E (Cath E), MMP-14 y los sustratos pan MMP (CMs) usados para producir estos polipéptidos han sido reportados en la literatura: Cruz-Monserrate Z et al., 2011, Gut, doi:10.1136/gutjnl-2011-300544; Abeer J et al., 2011, Chem. Biol.18, 392-401; Zhu L et al., 2011, Theranostics 1, 18-27.
Los ejemplos de anticuerpos para los que MM y CM que contienen polipéptidos pueden ser ligados incluyen el anticuerpo anti-Jagged 4D11 o una variante de ésta. Las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de la cadena pesada de la variante 4D11, mencionadas como 4D11 He QAH, son proporcionadas abajo: 4D11 He QAH Aminoácido EVHLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIDPEGR QTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 148) Nucleótido GAGGTGCACCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAG ACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAG GCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGTCAAGTATTGACCCGGAAGGTCGGCAGACATATT ACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTA TCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGACATC GGCGGCAGGTCGGCCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTA GCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCAC AGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAAC TCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCT ACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTG CAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGT GACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCT TCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATG CGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGC GTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTG TGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAA GGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAG CCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGG TCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAG CAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCC TTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCT CATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTC TCCGGGTAAA (SEQ ID NO: 147) EJEMPLO 13. Caracterización in vi tro de los anticuerpos anti-Jagged activables Este ejemplo describe la capacidad de una fracción enmascarante de la descripción para reducir la capacidad de los anticuerpos anti-Jagged activables incluyendo tal fracción enmascarante para ligarse al Jagged blanco. Este ejemplo también describe la activación proteolitica de aquellos anticuerpos activables.
Las capacidades de los anticuerpos activables 5342-1203-4D11, 5342-1204-4DI1, 5342-1214-4D11, y 5342-PLGL-4D11, asi como el anticuerpo enmascarado 5342-NSub-4Dll, para ligar a un blanco Jagged 1 humano fueron comparadas con respecto a la capacidad del anticuerpo anti-Jagged 4D11 para ligar al mismo blanco en un ensayo de ligación in vitro como aquí se describe. La capacidad de MM 5342 para inhibir aquella ligación blanco es demostrada en la figura 12 y la tabla 15.
Tabla 15. Comparación de la ligación del blanco Jagged por un anticuerpo anti-Jagged 4D11 y por un anticuerpo enmascarado y anticuerpos activables de éste. KD aparente para el anticuerpo activable/KD aparente para el anticuerpo 4D11.
Anticuerpo activadle Veces de enmascaramiento 5342-1203-4DI1 52.7 5342-1204-4D11 127.0 5342-1214-4DI1 64.7 5342-PLGL-4D11 131.7 Anticuerpo enmascarado Veces de enmascaramiento 5342-NSub- Dll 31.2 Los anticuerpos anti-Jagged activables 5342-1203-4D11, 5342-1204-4D11, 5342-1214-4D11, y 5342-PLGL-4D11, asi como el anticuerpo enmascarado 5342-NSub-4Dll, fueron evaluados en cuanto a su capacidad de ser escindidos por proteasas. Brevemente, 250 ng de anticuerpo activadle fueron digeridos por luM uPA o 387 nM MMP-2 por 24 horas a 37 °C en el buffer apropiado (para uPA: 0.1M Tris pH 8.0 en HBSS; para MMP-2: TCNB (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.05% Brij, 10 mM CaC12, pH 9.5)). El material digerido fue posteriormente analizado mediante SDS-PAGE y western blotting, usando anti-IgG Fab'2 HRP humano de cabra como agente de detección. La figura 13 demuestra que la digestión proteolitica produjo una proteina con una movilidad similar a la de la cadena ligera Parental (es decir, el anticuerpo 4D11), indicando que los anticuerpos activables respectivos fueron escindidos con las proteasas uPA o MMP-2, respectivamente.
EJEMPLO 14. Caracterización in vivo de anticuerpos anti-Jagged activables Este ejemplo describe la eficacia y seguridad in vivo de los anticuerpos anti-Jagged de la descripción en un modelo de tumor de ratón BxPC3.
Los anticuerpos anti-Jagged activables 5342-1203-4D11, 5342-1204-4DI1, 5342-1214-4D11, y 5342-PLGL-4D11, asi como también el anticuerpo enmascarado 5342-NSub-4Dll, fueron evaluados en cuanto a sus capacidades de reducir el crecimiento de tumores de xenoinjerto BxPC3 implantados en ratones, usando un método similar al aquí descrito. También se evaluó la capacidad de estos anticuerpos activables y enmascarados para reducir la pérdida de peso en el modelo de tumor en comparación con la pérdida de peso causada por un anticuerpo anti-Jagged 4D11. Los grupos, dosis, ruta y cronograma de dosis están establecidos en la tabla 16. Los resultados de la eficacia (reducción en el tamaño del tumor) son mostrados en la figura 14. Los resultados de la seguridad (reducción en la pérdida de peso) son mostrados en la figura 15. Las concentraciones séricas de la linfopoietina estromal timica (TSLP) son mostrados en la figura 16A.
Tabla 16. Grupos y dosis para el estudio de eficacia para el anticuerpo anti-Jagged BxPC3 activadle.
La figura 14, que gráfica el volumen del tumor versus el número de dias luego de la dosis inicial, demuestra que los anticuerpos anti-Jagged activables inhibieron el crecimiento de tumores de xenoinjerto BxPC-3 en ratones, como lo hicieron los anticuerpos 4D11 anti-Jagged (anticuerpo parental).
La figura 15 compara la pérdida de peso de los ratones tratados con anticuerpos anti-jagged activables, anticuerpo enmascarado o anticuerpo parental. Mientras que los animales tratados con anticuerpo parental 4D11 mostraron una pérdida de peso significativa, los animales tratados con un anticuerpo anti-Jagged activable no mostraron una pérdida significativa de peso.
Las concentraciones séricas de linfopoietina estromal timica de ratón (TSLP) fueron medidas tal como se describió aquí. Los niveles séricos de TSLP de ratón fueron cuantificados para ratones individuales antes de cada dosis y 10 dias después de la dosis final de cada grupo y promediadas para generar la figura 16A. la figura 16B muestra el paso del tiempo de las concentraciones TSLP séricas para el anticuerpo anti-Jagged 4D11 y el anticuerpo anti-Jagged activable 5342-1204-4D11. El TSLP sérico de ratón está elevado en el grupo del anticuerpo anti-Jagged parenteral 4D11 en comparación con los niveles TSLP de ratón en los grupos tratados con anticuerpos anti-Jagged activables.
EJEMPLO 15. Datos farmacocinéticos de los anticuerpos anti-Jagged activables Este ejemplo compara las farmacocinéticas del parental anti-Jagged y los anticuerpos activables en el suero de ratones tratados con dichos anticuerpos.
Evaluación farmacocinética de dosis única en ratones hembra sin pelo Balb/c sin tumores, tratadas con anticuerpo anti-Jagged 4D11 o anticuerpo anti-Jagged activable 5342-1204-4D11. Los ratones fueron tratados como se señaló en la tabla 17. Cohortes de 5 ratones fueron sangrados rotativamente a las 0.5, 3, 8, 24, 72, 168, y 240 horas. Las muestras de plasma fueron analizadas para contenido de hlgG usando una captura con anti-hFc con posterior detección con un conjugado anti-hlgG Fab'2 HRP.
Tabla 17. Grupos y dosis para el estudio comparando las farmacocinéticas de anticuerpos anti-Jagged parentales y activables La figura 17 compara los niveles de IgG humano en el tiempo en el suero de ratones luego de la administración intraperitoneal de un anticuerpo anti-Jagged activable 5342-1204-4D11 (también mencionado aqui como 5342-1204) o un anticuerpo anti-jagge 4D11. Los ratones tratados con anticuerpo anti-Jagged 4D11 por via intravenosa mostraron niveles similares de IgG humano en el tiempo a los ratones tratados con el mismo anticuerpo por via intraperitoneal.
La tabla 18 brinda un análisis no compartimental preliminar hasta el dia 7. Los datos fueron analizados usando el software Phoenix WinNonlin versión 6.3, modo de muestreo disperso.
Tabla 18. Farmacocinéticas anti-Jagged (PK) estudio preliminar no compartimental, análisis hasta el dia 7 Vida Tmax Cmax AUClast SE_AUClast Grupo media (horas) (pg/mL) (hora*pg/mL) (hora*pg/mL) (horas) 4D11 28 3 118 7,431 432 5342 187 8 81 11,613 690 EJEMPLO 16. Madura ión adicional da fracciones enmascarantes anti-Jagged Este ejemplo describe la producción de fracciones enmascarantes anti-Jagged adicionales de la descripción.
Para madurar posteriormente la afinidad de la familia de fracciones de péptidos enmascarantes JS4896 (también mencionados aquí como MM 4896 o 4896), las secuencias de las clasificaciones de la librería SR descritas abajo fueron usadas para diseñar cuatro librerías de maduración por afinidad dirigida. Una biblioteca de presentación celular eCPX, tal como la descrita en El documento PCT Internacional de Número de Publicación WO 2009/014726, fue construida con la secuencia de nucleótidos mostrada en la tabla 19. La diversidad final para cada librería fue aproximadamente 5 x 109 células.
Tabla 19. Familia de péptidos 4896 - diseños de la librería dirigida Nombre Diseño de librería (nucleótidos) 1517/1519 TGCAATMTKTGGVBCNNKGGTGGTGATTGCCGCGG GTGGNNKNNKNNKNNKNNK (SEQ ID NO:149) 1518/1521 NNKNNKNNKNNKTGCAATMTKTGGVBCNNKGGTGGT 0 GATTGCCGCGGGTGGNNK (SEQ ID NO: 150) 1559 TGCAATMTKTGGVBCNNKGGTGGTGATTGCCGCNNKN NKNNKNNKNNK (SEQ ID NO: 151) 1561 NNKNNKNNKNNKTGCAATMTKTGGVBCNNKGGTG GTGATTGCCGCNNK (SEQ ID NO: 152) Librerías 1517/1519 y 1518/1521 5 Cada librería de afinidad por maduración fue clasificada por separado pero de la misma manera. Se realizó una ronda MACS inicial con una cantidad de células que proporcionó más de 100X de sobre-muestreo de la librería. Todo el etiquetado fue realizado a 4 °C bajo aqitación constante y delicada. Las 0 células fueron marcadas con 25 nM Fab 4D11 marcado con biotina.
Las células que se ligaron al Fab fueron capturadas usando cuentas magnéticas marcadas con estreptavidina (Dynabeads, Invitrogen). Las cuentas fueron lavadas posteriormente con PBS conteniendo 0.5% BSA. Aproximadamente 1 x 106células de cada librería fueron recuperadas de la ronda MACS inicial.
Las células bacterianas para todas las rondas FACS fueron marcadas con anti-Jagged Fab 4D11 (es decir, el Fab del anticuuerpo anti-Jagged IgG 4D11) marcado con DyLight-488. Para todas las rondas FACS, el 0.1 - 0.2% más brillante de las células positivas fue clasificado. Las células para la ronda 1 FACS (Fl) y ronda FACS 2 (F2) fueron marcadas con 1 nM y 100 pM Fab 4D11, respectivamente. Para las rondas FACS 3 y 4, las células fueron marcadas con anti-Jagged Fab 4D11 marcado con 1 nM DyLight, resuspendidas en 500 ml PBS e incubadas a 37 °C por entre 5 y 10 minutos antes de clasificar. Los clones que fueron clasificados en la ronda 4 FACS fueron secuenciados y los resultados son mostrados en las tablas 20 y 21.
Tabla 20: Fracciones enmascarantes anti-Jagged (MM) 4896 librería dirigida 1517/1519 secuencias de péptidos JS5872 GCNIWLNGGDCRGWVDPLQG (SEQ ID NO: 153) JS5877 GCNIWLVGGDCRGWIGDTNG (SEQ ID NO: 154) JS5885 GCNIWLVGGDCRGWIEDSNG (SEQ ID NO: 155) JS5887 GCNIWANGGDCRGWIDNIDG (SEQ ID NO: 156) JS5937 GCNIWLVGGDCRGWLGEAVG (SEQ ID NO: 157) JS5954 GCNIWLVGGDCRGWLEEAVG (SEQ ID NO: 158) Tabla 21. Fracciones enmascarantes anti-Jagged (MM) 4896 librería dirigida 1518/1521 secuencias de péptidos JS5892 GGPALCNIWLNGGDCRGWSG (SEQ ID NO: 159) JS5893 GAPVFCNIWLNGGDCRGWMG (SEQ ID NO: 160) JS5894 GQQQWCNIWINGGDCRGWNG (SEQ ID NO: 161) JS5899 GKSEFCNIWLNGGDCRGWIG (SEQ ID NO: 162) JS5902 GTPGGCNIWANGGDCRGWEG (SEQ ID NO: 163) JS5908 GASQYCNLWINGGDCRGWRG (SEQ ID NO: 164) Se evaluaron clones individuales mediante FACS para la ligación Fab. Un ejemplo es mostrado en la figura 18. Los clones expresando fracciones enmascarantes de las librerías dirigidas (MM 5872, 5877, 5885, y 5887) ligan el Fab 4D11 mejor que un solo clon expresando MM 5342 de la clasificación de librería SR.
Librerías 1559 y 1561 Las librerías de maduración de la afinidad 1559 y 1561 fueron seleccionadas por separado pero de la misma manera. Se realizó una ronda MACS inicial como arriba pero con 50 nM Fab 4D11 marcado con biotina. Aproximadamente 1 x 106 células de cada librería fueron recuperadas de la ronda inicial MACS.
Las células bacterianas para todas las rondas FACS fueron marcadas con anti-Jagged Fab 4D11 marcado con DyLight-488. Para todas las rondas FACS, el 0.2% más brillante de las células positivas fue seleccionado. Las células para las rondas FACS 3 y 4 fueron marcadas con anti-Jagged Fab 4D11 marcado con 1 nM DyLight, resuspendidas en 500 ml PBS e incubadas a 37 °C por entre 5 y 10 minutos antes de clasificar. Los clones que fueron clasificados en la ronda 4 FACs fueron secuenciados, y los resultados son mostrados en las tablas 22 y 23.
Tabla 22. Fracciones enmascarantes anti-Jagged (MM) 4896-libreria dirigida 1559 secuencias de peptidos JS6094 GCNIWLVGGDCRPWVEGG (SEQ ID NO: 165) JS6095 GCNIWAVGGDCRPFVDGG (SEQ ID NO: 166) JS6097 GCNIWLNGGDCRAWVDTG (SEQ ID NO: 167) JS6098 GCNIWIVGGDCRPFINDG (SEQ ID NO: 168) JS6099 GCNIWLNGGDCRPVVFGG (SEQ ID NO: 169) JS6101 GCNIWLSGGDCRMFMNEG (SEQ ID NO: 170) JS6104 GCNIWVNGGDCRSFVYSG (SEQ ID NO: 171) JS6108 GCNIWLNGGDCRGWEASG (SEQ ID NO: 172) JS6110 GCNIWAHGGDCRGFIEPG (SEQ ID NO: 173) JS6112 GCNIWLNGGDCRTFVASG (SEQ ID NO: 174) JS6116 GCNIWAHGGDCRGFIEPG (SEQ ID NO: 175) Tabla 23. Fracciones enmascarantes anti-jagged (MM) 4896 librería dirigida 1561 secuencias de péptidos JS6118 GFLENCNIWLNGGDCRTG (SEQ ID NO: 176) JS6119 GIYENCNIWLNGGDCRMG (SEQ ID NO: 177) JS6126 GIPDNCNIWINGGDCRYG (SEQ ID NO: 178) _ EJEMPLO 17. Anticuerpos anti-jagged activables adicionales Este ejemplo describe ejemplos adicionales de anticuerpos anti-Jagged de la descripción.
Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de varios polipéptidos, que incluyen la fracción enmascarante JS5894 (también mencionada aqui como MM 5894 o 5894) y un CM que puede ser ligado a un anticuerpo anti-Jagged de la descripción usando métodos como los aqui descritos para producir un anticuerpo anti-Jagged activable de la descripción son proporcionados abajo : Mask 5894 que también incluye un espaciador N-terminal de 6 aminoácidos Secuencia de aminoácidos QGQSGQGQQQWCNIWINGGDCRGWNG (SEQ ID NO: 180) Secuencia de ácidos nucleicos CAAGGCCAGTCTGGCCAGGGTCAGCAGCAGTGGTGCAATATTTGGATCAATGGTGG TGATTGCCGCGGGTGGAATGGT (SEQ ID NO: 179) 5894-1203 Secuencia de aminoácidos QGQSGQGQQQWCNIWINGGDCRGWNGGSSGGSGGSGGTGRGPSWVGGGS (SEQ ID NO: 182) Secuencia de nucleótidos CAAGGCCAGTCTGGCCAGGGTCAGCAGCAGTGGTGCAATATTTGGATCAATGGTGG TGATTGCCGCGGGTGGAATGGTGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGTACTGGC CGTGGTCCAAGCTGGGTTGGCGGCGGTTCT (SEQ ID NO: 181) 5894-1203-4D11 Le Secuencia de aminoácidos QGQSGQGQQQWCNIWINGGDCRGWNGGSSGGSGGSGGTGRGPSWVGGGSDIQMTQS PSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVVAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGT ASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 263) Secuencia de nucleótidos CAAGGCCAGTCTGGCCAGGGTCAGCAGCAGTGGTGCAATATTTGGATCAATGGTGG TGATTGCCGCGGGTGGAATGGTGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGTACTGGC CGTGGTCCAAGCTGGGTTGGCGGCGGTTCTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCC TGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAG CTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCA TCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCA CTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGACGGT TGTGGCGCCTCCGTTATTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCA CCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTG TGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGC CCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTAC AGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCT GCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTG T (SEQ ID NO: 264) 5894-1204 Secuencia de aminoácidos QGQSGQGQQQWCNIWINGGDCRGWNGGSSGGSGGSGGLSGRSDNHGGGS (SEQ ID NO: 184) Secuencia de nucleótidos CAAGGCCAGTCTGGCCAGGGTCAGCAGCAGTGGTGCAATATTTGGATCAATGGTGG TGATTGCCGCGGGTGGAATGGTGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGTCTGAGC GGCCGTTCCGATAATCATGGCGGCGGTTCT (SEQ ID NO: 183) 5894-1204-4D11 Le Secuencia de aminoácidos QGQSGQGQQQWCNIWINGGDCRGWNGGSSGGSGGSGGLSGRSDNHGGGSDIQMTQS PSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVVAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGT ASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 265) Secuencia de nucleótidos CAAGGCCAGTCTGGCCAGGGTCAGCAGCAGTGGTGCAATATTTGGATCAATGGTGG TGATTGCCGCGGGTGGAATGGTGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGTCTGAGC GGCCGTTCCGATAATCATGGCGGCGGTTCTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCC TGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAG CTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCA TCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCA CTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGACGGT TGTGGCGCCTCCGTTATTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCA CCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTG TGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGC CCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTAC AGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCT GCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTG T (SEQ ID NO: 266) 5894-1214 Secuencia de aminoácidos QGQSGQGQQQWCNIWINGGDCRGWNGGSSGGSGGSGGSPLTGRSGGGGS (SEQ ID NO: 186) Secuencia de nucleótidos CAAGGCCAGTCTGGCCAGGGTCAGCAGCAGTGGTGCAATATTTGGATCAATGGTGG TGATTGCCGCGGGTGGAATGGTGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGCTCACCA CTGACTGGTCGTTCCGGTGGCGGCGGTTCT (SEQ ID NO: 185) 5894-1214-4D11 Le Secuencia de aminoácidos QGQSGQGQQQWCNIWINGGDCRGWNGGSSGGSGGSGGSPLTGRSGGGGSDIQMTQS PSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVVAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGT ASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 267) Secuencia de nucleótidos CAAGGCCAGTCTGGCCAGGGTCAGCAGCAGTGGTGCAATATTTGGATCAATGGTGG TGATTGCCGCGGGTGGAATGGTGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGCTCACCA CTGACTGGTCGTTCCGGTGGCGGCGGTTCTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCC TGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAG CTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCA TCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCA CTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGACGGT TGTGGCGCCTCCGTTATTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCA CCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTG TGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGC CCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTAC AGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCT GCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTG T (SEQ ID NO: 268) 5894-PLGL Secuencia de aminoácidos QGQSGQGQQQWCNIWINGGDCRGWNGGSSGGSGGSGGSGGGSPLGLGGS (SEQ ID NO: 188) Secuencia de nucleótidos CAAGGCCAGTCTGGCCAGGGTCAGCAGCAGTGGTGCAATATTTGGATCAATGGTGG TGATTGCCGCGGGTGGAATGGTGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGCTCAGGT GGAGGCTCGCCACTGGGCCTGGGCGGTTCT (SEQ ID NO: 187) 5894- PLGL -4D11 Le Secuencia de aminoácidos QGQSGQGQQQWCNIWINGGDCRGWNGGSSGGSGGSGGSGGGSPLGLGGSDIQMTQS PSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVVAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGT ASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 269) Secuencia de nucleótidos CAAGGCCAGTCTGGCCAGGGTCAGCAGCAGTGGTGCAATATTTGGATCAATGGTGG TGATTGCCGCGGGTGGAATGGTGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGCTCAGGT GGAGGCTCGCCACTGGGCCTGGGCGGTTCTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCC TGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAG CTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCA TCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCA CTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGACGGT TGTGGCGCCTCCGTTATTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCA CCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTG TGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGC CCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTAC AGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCT GCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTG T (SEQ ID NO: 270) 5894-Cath.E Secuencia de aminoácidos QGQSGQGQQQWCNIWINGGDCRGWNGGSSGGSGGSGGSAGFSLPAGGGS (SEQ ID NO: 190) Secuencia de nucleótidos CAAGGCCAGTCTGGCCAGGGTCAGCAGCAGTGGTGCAATATTTGGATCAATGGTGG TGATTGCCGCGGGTGGAATGGTGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGCTCAGCT GGCTTCTCCCTCCCCGCAGGTGGCGGTTCT (SEQ ID NO: 189) 5894- Cath.E -4D11 Le Secuencia de aminoácidos QGQSGQGQQQWCNIWINGGDCRGWNGGSSGGSGGSGGSAGFSLPAGGGSDIQMTQS PSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVVAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGT ASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKS FNRGEC (SEQ ID NO : 271 ) Secuencia de nucleótidos CAAGGCCAGTCTGGCCAGGGTCAGCAGCAGTGGTGCAATATTTGGATCAATGGTGGTGATT GCCGCGGGTGGAATGGTGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGCTCAGCTGGCTT CTCCCTCCCCGCAGGTGGCGGTTCTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCT GCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATT TAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCATCCAG TTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTC ACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGACGGTTGTGG CGCCTCCGTTATTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATC TGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGC CTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCC AATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCT CAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAA GTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT (SEQ ID NO: 272) 5894-MMP-14 Secuencia de aminoácidos QGQSGQGQQQWCNIWINGGDCRGWNGGSSGGSGGSGSLAPLGLQRRGGS (SEQ ID NO: 192) Secuencia de nucleótidos CAAGGCCAGTCTGGCCAGGGTCAGCAGCAGTGGTGCAATATTTGGATCAATGGTGG TGATTGCCGCGGGTGGAATGGTGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTAGCCTGGCA CCTCTGGGTCTGCAACGCCGTGGCGGTTCT (SEQ ID NO: 191) 5894- MMP-14-4D11 Le Secuencia de aminoácidos QGQSGQGQQQWCNIWINGGDCRGWNGGSSGGSGGSGSLAPLGLQRRGGSDIQMTQS PSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTW APPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGT ASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 273) Secuencia de nucleótidos CAAGGCCAGTCTGGCCAGGGTCAGCAGCAGTGGTGCAATATTTGGATCAATGGTGG TGATTGCCGCGGGTGGAATGGTGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTAGCCTGGCA CCTCTGGGTCTGCAACGCCGTGGCGGTTCTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCC TGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAG CTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCA TCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCA CTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGACGGT TGTGGCGCCTCCGTTATTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCA CCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTG TGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGC CCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTAC AGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCT GCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTG T (SEQ ID NO: 274) 5894-panMMP Secuencia de aminoácidos QGQSGQGQQQWCNIWINGGDCRGWNGGSSGGSGGSGGSGGPLGVRGGGS (SEQ ID NO: 194) Secuencia de nucleótidos CAAGGCCAGTCTGGCCAGGGTCAGCAGCAGTGGTGCAATATTTGGATCAATGGTGG TGATTGCCGCGGGTGGAATGGTGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGCTCAGGT GGACCTTTGGGAGTCAGAGGTGGCGGTTCT (SEQ ID NO: 193) 5894- panMMP -4D11 Le Secuencia de aminoácidos QGQSGQGQQQWCNIWINGGDCRGWNGGSSGGSGGSGGSGGPLGVRGGGSDIQMTQS PSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVVAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGT ASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 275) Secuencia de nucleótidos CAAGGCCAGTCTGGCCAGGGTCAGCAGCAGTGGTGCAATATTTGGATCAATGGTGG TGATTGCCGCGGGTGGAATGGTGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGCTCAGGT GGACCTTTGGGAGTCAGAGGTGGCGGTTCTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCC TGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAG CTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCA TCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCA CTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGACGGT TGTGGCGCCTCCGTTATTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCA CCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTG TGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGC CCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTAC AGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCT GCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTG T (SEQ ID NO: 276) Las secuencias de ácidos nucleicos y secuencias de aminoácidos de un polipéptido que incluye la fracción enmascarante JS 5894 y un enlazador no escindible que puede ser ligado a un anticuerpo anti-Jagged usando métodos como los aquí descritos para formar un anticuerpo enmascarado son proporcionadas abajo: 5894-NSUB Secuencia de aminoácidos QGQSGQGQQQWCNIWINGGDCRGWNGGSSGGSGGSGGSGGGSGGGSGGS (SEQ ID NO: 196) Secuencia de nucleótidos CAAGGCCAGTCTGGCCAGGGTCAGCAGCAGTGGTGCAATATTTGGATCAATGGTGG TGATTGCCGCGGGTGGAATGGTGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGCTCAGGT GGAGGCTCGGGCGGTGGGAGCGGCGGTTCT (SEQ ID NO: 195) 5894- NSUB -4D11 Le Secuencia de aminoácidos QGQSGQGQQQWCNIWINGGDCRGWNGGSSGGSGGSGGSGGGSGGGSGGSDIQMTQS PSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVVAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGT ASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 278) Secuencia de nucleótidos CAAGGCCAGTCTGGCCAGGGTCAGCAGCAGTGGTGCAATATTTGGATCAATGGTGG TGATTGCCGCGGGTGGAATGGTGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGCTCAGGT GGAGGCTCGGGCGGTGGGAGCGGCGGTTCTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCC TGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAG CTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCA TCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCA CTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGACGGT TGTGGCGCCTCCGTTATTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCA CCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTG TGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGC CCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTAC AGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCT GCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTG T (SEQ ID NO: 279) Ejemplos de anticuerpos para los cuales el MM y CM conteniendo polipéptidos pueden ligarse incluyen al anticuerpo anti-Jagged 4D11 o sus variantes, como la variante 4D11 QAH descrita abajo.
EJEMPLO 18. Vxsualxzacxón in si tu de anticuerpos anti- Jagged activables El presente ejemplo describe el uso de la visualización in situ de la activación y ligación de un anticuerpo anti-Jagged activable de la descripción. Los resultados indicaron que los anticuerpos anti-Jagged activables de la descripción pueden ser activados por proteasas expresadas por un tejido y ligar blancos Jagged de ese tejido.
La visualización in situ de los anticuerpos activables representa un enfoque único para caracterizar la actividad proteasa en células y tejidos. Esta teenología permite la validación de la activación de anticuerpos activables y la ligación a un blanco en secciones histológicas de células y tejidos expresando proteasas capaces de escindir el anticuerpo activable. Un esquema de este enfoque in situ es presentado en la figura 19.
La visualización in situ de la activación y ligación de un anticuerpo anti-Jagged (también mencionado aquí como visualización in situ por una célula o tejido capaz de escindir el anticuerpo activable en un sitio co-localizado con el blanco reconocido por el anticuerpo activado fue realizado como sigue: secciones de tejido congelado fueron colocadas sobre láminas de vidrio. Una solución conteniendo anticuerpos anti-Jagged activables marcados (con una marca fluorescente) fue aplicada sobre el tejido e incubada durante una hora a temperatura ambiente (alrededor de 22 - 24 °C) en un buffer de incubación de 50 mM Tris-HCl buffer pH 7.4, conteniendo 150 mM NaCl, 100 mM ZnC12, 5 mM CaC12 y 0.05% Tween 20; anticuerpo activable a una concentración de alrededor de l g/mL. El te ido fue extensivamente lavado para remover el material no ligado y se midió la marca detectable. Por ejemplo, cuando se usó una marca fluorescente, el tejido fue enviado a microscopía fluorescente. La detección de anticuerpos activados sobre el tejido indicó que el tejido expresó proteasas que escindieron el anticuerpo activable y también expresó blancos Jagged para los que el anticuerpo activado se liga.
Las capacidades de los anticuerpos anti-jagged activables 5342-1204-4D11 y 5342-PLGL-4D11 para ser activados y ligarse a los tejidos del tumor xenoinjerto BxPC3 fueron evaluados usando visualización in situ. Los anticuerpos activables fueron marcados con Alexa Fluor® 680 (Invitrogen) para producir anticuerpos activables marcados 5342-1204-4D11-AF680 y 5342-PLGL-4D11-AF680, también mencionados aquí como 1204-4D11-AF680 y PLGL-4D11-AF680, respectivamente. También se evaluó el anticuerpo parental anti-Jagged 4D11-AF680.4D11-AF680, 1204-4D11-AF680 y PLGL-4D11-AF680 fueron incubados con una muestra congelada de tejido de tumor xenoinjerto BxPC3 como se describió arriba. Los resultados se muestran en la figura 20, paneles A, B y C, respectivamente. Las imágenes rojas fluorescentes demostraron la unión del anticuerpo 4D11 y de los anticuerpos 4D11 activados por escisión proteolitica derivada de tejido de los respectivos anticuerpos activables a Jagged. Los paneles D, E, y F representan las imágenes fluorescentes obtenidas después de la incubación de 4D11-AF680, 1204-4D11-AF680 y PLGL-4D11-AF680 con tejido congelado de tumor de xenoinjerto BxPC3 pre-tratado con una dilución 1:100 de proteasa de amplio espectro set coctel inhibidor II (No. de Catálogo 539134, EMD Millipore) y 50 mM EDTA. La fluorescencia reducida en los paneles E y F indican que la ligación de los anticuerpos 1204-4D11-AF680 y PLGL-4D11-AF680 vista en los paneles B y C fue efectuada por la escisión de los anticuerpos activables por proteasas derivadas de tejido; el coctel inhibidor de proteasa inhibió tal proteólisis. La tinción azul representa la tinción nuclear DAPI. La unión del anticuerpo parental anti-Jagged 4D11 o de los anticuerpos anti-Jagged activables 5342-1204-4D11 y 5342-PLGL-4D11 a tejidos congelados de tumor de xenoinjerto BxPC3 fue inhibida al pre-tratar el tejido con anticuerpo parental anti-jagged 4D11 sin marcar o por pre-tratar tal tejido con Jagged 1, Jagged 2 o una combinación de éstas.
La activación de los anticuerpos anti-Jagged activables 5342-1204-4D11 y 5342-PLGL-4D11 también fueron evaluados por visualización in situ de tejidos de cáncer pancreático humano. Cada 4D11-AF680 4D11), 1204-4D11-AF680 (1204) y PLGL-4D11- AF680 (PLGL) fue incubado con una muestra aislada de tejido congelado de un paciente humano con cáncer pancreático. Los resultados son mostrados en la figura 21, paneles en la columna 1, filas 1, 2 y 3, respectivamente. Los paneles en las columnas 2, 3 y 4, respectivamente, representan las imágenes fluorescentes obtenidas después de la incubación de 4D11-AF680, 1204-4D11-AF680 y PLGL-4D11-AF680 con tejido congelado de paciente con cáncer pancreático pre-tratado con 10 mg/ml de anticuerpo All (All es un anticuerpo que se liga específicamente al sitio activo de la proteasa MT-SPl, también conocida como matriptasa) (Figura 21, columna 2) con 50 mM de inhibidor M p de amplio espectro Galardin (Calbiochem, Millipore) (Figura 21, columna 4). La tinción azul representa tinción nuclear DAPI. Los resultados sugieren que la muestra de tejido pancreático produce matriptasa activa y metaloproteasa, la presencia de los cuales escinde las fracciones escindibles de los anticuerpos activables, por lo tanto, liberando la fracción enmascarante y permitiendo la ligación estable del anticuerpo a blancos Jagged sobre el tejido .
EJEMPLO 19. Visualización in vivo de un anticuerpo anti-Jagged El presente ejemplo describe la visualización in vivo de un anticuerpo anti-Jagged de la descripción.
El anticuerpo anti-Jagged 4D11 fue marcado con Alexa Fluor® 750 y purificado del pigmento no conjugado usando Columnas de 40 kDa Thermo Scientific Zeba Spin de Desalinación. Un grupo de 3 ratones con tumores de cáncer pancreático humano BxPC3 con volúmenes tumorales de aproximadamente 400 - 600 mm3 fueron administrados por vía intraperitoneal con una sola dosis de 10-mg/kg de anticuerpos 4D11 marcados con Alexa Fluor® 750 (n = 3). Los ratones fueron anestesiados con isoflurano y visualizados con fluorescencia a 750 nm cerca al infrarrojo (NIR) antes de la inyección y a las 24, 48 y 72 horas después de la inyección usando el sistema de visualización Caliper IVIS SpectrumCT (Caliper, Perkin Elmer, Hopkinton MA). Los ratones fueron sacrificados después del último procedimiento de visualización. La figura 22A proporciona una representación de la señal de fluorescencia del anticuerpo 4D11 marcado a las 48 horas después de la inyección en el modelo de xenoinjerto de tumor BxPC3 en ratón.
Los datos de visualización in vivo fueron normalizados y analizados usando el programa Living Image® 4.1. Para la comparación cuantitativa, las regiones de interés (ROI) fueron dibujadas sobre el tumor (T) y el tejido normal (N). La señal de fluorescencia, cuantificada como la eficiencia radiante promedio (fotonesxcm-2xs-l) fue medida para cada área. La proporción de la señal en el tumor ROI comparado con el ROI en tejido normal (T/N) fue calculada para proporcionar una medida de la tasa de acumulación del anticuerpo anti-Jagged 4D11 en el tumor versus el tejido normal. La figura 22B proporciona un gráfico mostrando la tasa T/N promedio de eficacia radiante promedio para el anticuerpo 4D11. Grupo de dosis +SD.
EJEMPLO 20. Visualización in situ de anticuerpos anti-Jagged activables El presente ejemplo describe el uso de la visualización in situ para mostrar tejido de tumor pancreático canceroso de xenoinjerto y tejido de cáncer pancreático humano para la activación y ligación de un anticuerpo anti-Jagged activable. Los resultados indican que los anticuerpos anti-Jagged activables de la descripción pueden ser activados por proteasas expresadas por aquellos tejidos y ligar blancos Jagged sobre tales tejidos.
Las muestras de tumor BxPC3 y muestras de tejido de cáncer pancreático humano fueron perfilados para la expresión de Jagged y MT-SP1 mediante 1 hora de tratamiento de tejido congelado con anticuerpo 4D11 anti-Jagged marcado y anticuerpo anti-matriptasa All a 1 mg/ml and 5 pg/ml, respectivamente.
Adicionalmente, las capacidades de los anticuerpos anti-Jagged activables 5342-1204-4D11 y 5342-PLGL-4D11 para ser activadas y ligarse a xenoinjerto BxPC3 y tejido de cáncer pancreático humano fueron evaluadas usando visualización in situ. Los anticuerpos activables fueron marcados con Alexa Fluor® 680 (Invitrogen) como se describe arriba (ejemplo 18). Estos anticuerpos activables marcados 5342-1204-4D11-AF680 (mencionado como 1204-4D11-AF680) y 5342-PLGL-4D11-AF680 (mencionado como PLGL-4D11-AF680), fueron incubados con tejido de xenoinjerto BxPC3 congelado o con muestras de cáncer pancreático humano aisladas de cuatro pacientes de acuerdo al protocolo de visualización in situ descrito arriba (ejemplo 18). La tabla 24 resume los resultados, demostrando la capacidad de las muestras de tumor BxPC3 y muestras de tejido de pacientes con cáncer pancreático para activar y ligar anticuerpos anti-Jagged activables. En la tabla 24, la tinción IHC que midió la cantidad de anticuerpo anti-Jagged 4D11 o anticuerpo anti-matriptasa All ligándose a las muestras de tejido (columnas 2 y 3) fue calificada de 0 a 3+, 0, no tinción; 1+, tinción débil; tinción moderada, 2+ y 3+, tinción fuerte. La calificación de la tinción de visualización in situ (columnas 4 y 5) se basó en la comparación con la tinción del anticuerpo 4D11 y se definió como sigue: 0, no tinción; 1+, tinción débil al compararse al anticuerpo parental; 2+, tinción moderada al compararse al anticuerpo parental; y 3+, tinción análoga al anticuerpo parental. Los resultados de BxPC3 también son mostrados en la figura 20.
Tabla 24. Detección de la expresión de Jagged y MT-SP1 y visualización in situ de los anticuerpos anti-Jagged en tejidos de xenoinjerto BxPC3 y tejidos de cáncer pancréatico humano EJEMPLO 21. Caracterización in vitro de un anticuerpo activable conjugado con un agente Este ejemplo describe la capacidad de un conjugado anticuerpo-agente de la descripción para inhibir la proliferación de células BxPC3 en cultivo.
Se conjugaron anticuerpos activadles anti-Jagged 5342-1204-4D11, 4D11 y rituxan para monometilauristatina E (MMAE), un anti mitótico sintético inhibidor de la polimerización de la tubulina, para generar un conjugado anticuerpo-agente activable .
Las capacidades de los siguientes compuestos para inhibir la proliferación de células BxPC3 en cultivo celular fueron determinadas: anticuerpo anti-Jagged activable - agente conjugado 5342-1204-4D11-MMAE; anticuerpo anti-Jagged activable - agente conjugado 5342-1204-4D11-MMAE activado mediante uPA; anticuerpo anti-Jagged 4D11; anticuerpo anti-Jagged activable - agente conjugado 4D11-M AE; Rituxan; y Rituxan-MMAE. La activación del anticuerpo activable y conjugado anticuerpo activable-agente fue efectuada por digestión toda la noche a 37 °C con sitio activo titratado uPA (500 nM) en Tris pH 8.5; la activación fue medida por análisis CE (LabChip GXII). El anticuerpo activable activado con uPA y el conjugado anticuerpo activable activado-agente fueron purificados usando proteina A y luego se almacenaron a 4°C antes del estudio.
La linea celular BxPC-3 de cáncer pancreático humano fue obtenida de ATCC. Las células BxPC3 fueron crecidas en medio completo (RPMI-1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino) a 37 °C en una atmósfera e 5% C02 en aire. Las células BxPC-3 fueron cosechadas durante el periodo de crecimiento logarítmico, resuspendidas en medio completo, y plaqueadas a una densidad de 5000 células por pocilio en una placa de 96 pocilios. Luego de la incubación nocturna, se agregó una dilución seriada de 10 puntos 1:3, iniciando a 10 mg/mL y terminando en 0 de cada compuesto para células en cultivos repetidos. Las células fueron cultivadas durante 3 dias y la viabilidad celular fue medida usando CellTiterGlo (Promega) siguiendo el protocolo del fabricante y un luminómetro (Tecan). Los datos fueron analizados usando Prism GraphPad. Los resultados son mostrados en la figura 24.
EJEMPLO 22. Eficacia in vivo y seguridad de un anticuerpo ac ivable-agente conjugado Este ejemplo describe la capacidad de un anticuerpo activable-agente conjugado de la descripción para reducir el 0 crecimiento de tumores de xenoinjerto BxPC3 in vivo.
Los anticuerpos anti-Jagged activables y conjugados anticuerpo anti-Jagged-agente fueron evaluados en cuanto a su capacidad para reducir el crecimiento de tumores xenoinjerto BxPC3, usando un método similar al descrito arriba, usando los 5 compuestos, grupos y dosis de la tabla 25.
Tabla 25. Grupos y regímenes de dosis 0 La Figura 25, que gráfica el volumen del tumor versus el número de dias luego de la dosis inicial, demuestra que el anticuerpo anti-Jagged 4D11-MMAE y el anticuerpo anti-Jagged activable 5342-1204-4D11-MMAE inhibieron el crecimiento de las células de xenotransplante BxPC-3 más efectivamente que sus contrapartes conjugadas.
La figura 26 muestra la pérdida de peso de varios grupos. Mientras que los animales tratados con anticuerpo anti-Jagged 4D11 o anticuerpo anti-Jagged-MMAE mostraron una pérdida significativa de peso, los animales tratados con anticuerpo anti-Jagged 5342-1204-4D1 o anticuerpo anti-Jagged activable-agente conjugado 5342-1204-4D11-MMAE no mostraron una pérdida significativa de peso.
EJEMPLO 23. Eficacia y seguridad in vivo para anticuerpos anti-Jagged y anticuerpos anti-Jagged activables.
Los anticuerpos anti-Jagged activadles fueron evaluados en cuanto a su capacidad de reducir el crecimiento de tumores xenoinjerto BxPC3, usando un método similar al descrito arriba, usando los anticuerpos, anticuerpos activables, grupos y dosis colocados en la tabla 26.
Tabla 26. Grupos y dosis para el estudio de la eficacia del anticuerpo anti-Jagged activable BxPC3 La Figura 29, que gráfica el volumen del tumor versus el número de dias después de la inoculación del tumor, demuestra que el anticuerpo anti-Jagged activable 5342-1204-4D11, en combinación con Gemcitabina inhibe el crecimiento de tumores de xenoinjerto BxPC3. La primera dosis fue dada el dia 30. La figura 30 indica la pérdida de peso para el grupo de Gemcitabina y para el grupo al que se administró anticuerpo en combinación con Gentamicina. Mientras que los animales tratados con dosis más altas de anticuerpo y Gemcitabina mostraron una pérdida significativa de peso, los animales tratados con anticuerpos activables y Gemcitabina no mostraron pérdida de peso sobre el grupo de Gemcitabina sólo. El anticuerpo a 20 mg/kg no fue tolerado cuando se dio en combinación con Gemcitabina, resultando en el sacrificio de ese grupo el dia 49 debido a la pérdida de peso corporal.
Sin embargo, el anticuerpo activable a 20 mg/kg, en combinación con Gemcitabina, fue tolerado y mostró una eficacia equivalente a la del anticuerpo a 6.7 y 20 mg/kg en combinación con Gemcitabina. La concentración sérica de linfoproteina estromal tímica (TSLP) fue medida como se describió arriba.
Los niveles séricos de TSLP de ratón (mTSLP) fueron cuantificados para ratones individuales antes de la segunda dosis. Sólo grupo del anticuerpo a 20 mg/kg en combinación con Gembcitabina mostró mTSLP sérico elevado, como indicó la figura 31.
EJEMPLO 24. Eficacia in vivo de un anticuerpo anti-Jagged en modelos de tumor prostático y mamario La eficacia del anticuerpo anti-Jagged 4D11 fue evaluada en modelos de tumor autóctonos para cáncer de próstata y mamario. Estos modelos imitan la condición humana mientras que los tumores producidos pasan por las distintas fases de desarrollo del tumor y/ de manera importante, permiten el uso de ratones inmunocompetentes.
Modelo de cáncer de próstata.- La linea de ratones TRAMPS es un modelo ampliamente usado de cáncer de próstata (Greenberg NM et al, 1995, Proc Nati Acad Sci U S A.92, 3439-3443). Las lesiones iniciales son hiperplasia intraepitelial prostática (PIN) que progresa cerca a las 12 semanas de edad a un adenocarcinoma bien diferenciado. Adenocarcinomas pobremente diferenciados aparecen en animales TRAMP de 24 semanas de edad. A las 18 - 24 semanas de edad, los ratones TRAMP fueron separados en dos grupos, control y terapia, de 6 ratones cada uno. El anticuerpo anti-Jagged 4D11 y las alícuotas de control IVIg fueron administradas de modo IP al grupo respectivo, 17DX5 a 20 mg/kg.7 días después de la dosis final, los animales fueron sacrificados y se midieron las cargas tumorales como el peso del tracto genitourinario y se comparó con los ratones del control de tipo silvestre C57/B16. La figura 32 indica que el anticuerpo anti-Jagged 4D11 fue efectivo al limitar el crecimiento de tumores prostéticos en ratones TRAMP.
Modelo de cáncer mamario.- Una línea transgénica HER2/neu desarrolla tumores mamarios en hembras multíparas a las 20 semanas de edad y presenta un 100% de metástasis pulmonar a las 25 semanas de edad (Siegel PM et al., 1999, The EMBO Journal 18, 2149-2164). Para experimentos que evalúan la terapia para cáncer mamario, se cruzaron ratones macho HER2/neu con hembras de tipo silvestre FVB y su progenie fue genotipada para seleccionar las hembras Her2/neu. A las 20 semanas de edad, las hembras HER2/neu fueron separadas en 2 grupos, control y terapia. Alícuotas del anticuerpo anti-Jagged 4D11 y el control IVIg fueron tratados de manera OP, q7DX5 a 20 mg/kg. La figura 33 indica que el anticuerpo anti-Jagged 4D11 inhibió potentemente el crecimiento de los tumores espontáneos en ratones transgénicos Her2/neu.
EJEMPLO 25. Visualización ia situ de anticuerpos anti- Jagged activables no marcados con detección mediante anticuerpos secundarios El ejemplo presente describe el uso de la visualización in situ de anticuerpos anti-Jagged marcados o no marcados, donde la escisión y ligación fueron detectados usando un anticuerpo secundario que se liga específicamente a la fracción AB del anticuerpo activadle. Los resultados indicaron la capacidad para evaluar la activación y ligación de los anticuerpos activables no marcados.
La visualización in situ de la activación y ligación de un anticuerpo activable anti-Jagged 5342-1204-4D11 marcado con Alexa680 en tejido de cáncer de próstata TRAMP fue conducida como sigue: secciones congeladas de tejido fueron colocadas sobre láminas de vidrio. Una solución conteniendo anticuerpos activables anti-Jagged marcados con Alexa680 fue aplicada sobre el tejido y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente (alrededor de 22 - 24 °C) en un buffer de incubación 50 M Tris-HCl buffer pH 7.4, conteniendo 150 mM NaCl, 100 mM ZnC12, 5 mM CaC12 y 0.05% Tween 20; anticuerpo activable a una concentración de aproximadamente 4 mg/ml. Las condiciones de la incubación pueden ajustarse para ser conductivos para el agente de escisión en la sección de tejido mediante, por ejemplo, la variación del pH de la solución (por ejemplo, dentro de un rango de aproximadamente pH 7 a pH 8.5), la temperatura de incubación (dentro del rango de 20 - 40 °C, temperatura ambiente o 37 °C), el tiempo de incubación (dentro de un rango de 15 minutos hasta 150 minutos, y/o las concentraciones de anticuerpo activadle (dentro de un rango de 0.05 - 10 mg/ml). El tejido fue extensivamente lavado para remover el material no ligado. La presencia de anticuerpo activado sobre el tejido fue detectada visualizando a 680 nm y un anticuerpo secundario anti-IgG humano marcado con AlexaFLuor 488. Las condiciones de la detección pueden ajustarse para el reactivo de detección y la modalidad de detección (fluorescentemente marcado). Por ejemplo, cuando una marca fluorescente fue usada, el tejido fue llevado a microscopía fluorescente. Como se mostró en la figura 34, el anticuerpo anti-Jagged activable 5342-1204-4D11 demostró tinción idéntica en los canales Alexa 680 (marca del anticuerpo anti-Jagged activable) y FITC (marca del anticuerpo anti-IgG humano), indicando que es posible realizar una visualización in situ con anticuerpos activables no marcados y un reactivo secundario que se liga específicamente al anticuerpo activable, como un anticuerpo marcado. La señal fluorescente mostrada en ambos canales fue inhibida mediante pre-tratamiento del tejido con una dilución 1:100 del coctel set III inhibidor de amplio espectro (BSPI) 539134, EMD Millipore, Billerica, MA) y 50 mM de inhibidor Galardina MMP de amplio espectro (Calbiochem, Millipore), como se mostró en la figura 34, fila inferior.
EJEMPLO 26. Visualización in si tu de anticuerpos anti-Jagged activables no marcados El presente ejemplo describe el uso de la visualización in situ de anticuerpos anti-Jagged activables no marcados. La escisión y ligación fueron detectadas usando un anticuerpo secundario que se liga específicamente a la fracción AB del anticuerpo activadle.
La visualización in si tu de la activación y ligación de un anticuerpo anti-Jagged activable no marcado 5342-1204-4D11 en tejido tumoral canceroso de cáncer de próstata TRAMP fue realizada como sigue: secciones congeladas de tejido fueron colocadas sobre láminas de vidrio. Una solución conteniendo anticuerpos anti-Jagged activables no marcados fue aplicada sobre el tejido e incubada durante 1 hora a temperatura ambiente (alrededor de 22-24 °C) en un buffer de incubación de 50 mM Tris-HCl buffer pH 7.4, conteniendo 150 mM NaCl, 100 mM ZnC12, 5 mM CaC12 y 0.05% Tween 20; anticuerpo activable a una concentración de alrededor de 4 mg/ml. Las condiciones de la incubación pueden ser ajustadas para ser conductivas hacia el agente de escisión en la sección de tejido mediante, por ejemplo, la variación del pH de la solución (dentro del rango de pH 7 - 8.5), la temperatura de incubación (dentro de un rango de 20 a 40 °C, temperatura ambiente o 37 °C), el tiempo de incubación (dentro del rango de alrededor de 15 minutos hasta alrededor de 150 minutos) y/o las concentraciones de anticuerpo activable (dentro del rango de 0.05 - 10 mg/ml). El tejido fue luego extensivamente lavado para remover el material no ligado. La presencia de anticuerpo activado sobre el tejido fue detectada usando un anticuerpo secundario anti-IgG humano marcado con AlexaFLuor 488. Las condiciones de esa detección pueden ajustarse para el reactivo detector y modalidad de detección (marca fluorescente). Por ejemplo, cuando se usa una marca fluorescente, el tejido se somete a microscopía fluorescente.
Como mostró la figura 35, el anticuerpo anti-Jagged activable 5342-1204-4D11 demostró tinción con intensidad comparable y patrón al anticuerpo anti-Jagged parental (columnas 2 y 1, respectivamente). La señal fluorescente del anticuerpo anti-Jagged activable 5342-1204-4D11 fue inhibida mediante el pre-tratamiento del tejido con una dilución 1:100 de coctel inhibidor de amplio espectro setlll (BSPI) (539134, EMD Millipore, Bíllerica, MA) y 50 mM de inhibidor Galardin MMP de amplio espectro (Calbiochem, Millipore), como se mostró en la figura 35, columna 3. Los datos demostraron la factibilidad de conducir una visualización in situ usando anticuerpos activables no marcados y un reactivo secundario que comprende una marca detectable que se liga específicamente al AB del anticuerpo activable.
Se perfilaron muestras de cáncer de mama triple negativo humano (TNBC) y muestras de tejido de cáncer pancreático para la capacidad del anticuerpo anti-Jagged activable 5342-1204-4D11 para ser activado y por ligar en tumores humanos usando visualización in situ. El anticuerpo activable fue marcado con Alexa Fluor® 680 como se describió arriba. El anticuerpo activable resultante 5342-1204-4D11-AF680 fue incubado con muestras de tejido congeladas de acuerdo al protocolo de visualización in situ aquí descrito. Los resultados de la capacidad de las muestras de tejido de cáncer TNCB y pancreático para activar y lugar anticuerpos anti-Jagged activables son resumidos en la tabla 27 y 28. La tinción IHC que mide la cantidad de anticuerpo anti-Jagged (411) ligándose a la muestra de tejido se calificó de - a 3+: -, no tinción; 1+ (o +), tinción débil; 2+ (o ++), tinción moderada y 3+ (o +++), tinción fuerte. La visualización de la tinción in situ de anticuerpos anti-Jagged activables fue cuantificada en base a la comparación con la tinción del anticuerpo anti-Jagged. La tabla 27 ilustra el nivel de expresión de Jagged 1 y/o Jagged 2 detectados por la ligación 4D11 y la capacidad del cáncer de mama triple negativo (TNBC) para activar y ligar anticuerpos anti-EGFR activables. La tabla 28 ilustra el nivel de expresión de Jagged 1 y/o Jagged 2 detectados por ligación 4D11 y la capacidad de los tejidos de cáncer pancreático para activar y ligar anticuerpos anti-EGFR activables.
Tabla 27: detección de la expresión de Jagged 1 y/o Jagged 2 usando anticuerpo anti-Jagged 4D11 y visualización in situ de anticuerpo anti-Jagged activable 5342-1204-4D11 en tejidos de cáncer de pacientes TNBC. 0 5 0 Tabla 28: detección de la expresión para Jagged 1 y/o 2 usando anticuerpos anti-Jagged 4D11 y visualización situ de anticuerpos anti-Jagged activables 5342-1204-4D11 tejidos de tumor de cáncer pancreático.
EJEMPLO 27. Activación con proteasa y ligación de un anticuerpo anti-Jagged activable Este ejemplo demuestra la capacidad de un anticuerpo anti-Jagged 5342-1204-4D11 para ser activado in vitro.
El anticuerpo anti-Jagged activable 5342-1204-4D11 fue activado combinando el anticuerpo activable y el sitio activo titratado MT-SPl en PBS en concentraciones finales de 58.5 uM y 570 nM, respectivamente. La mezcla fue incubada a 37 °C durante 20 horas. Antes de la purificación de la proteina A, se removió una alícuota y se analizó mediante SDS-PAGE para confirmar que la digestión proteolitica de 5342-1204-4D11 se había completado.
Para remover el MT-SPl y la fracción de enmascaramiento escindida, el 5342-1204-4D11 fue purificado usando cromatografía estándar con Proteína A. brevemente, una columna con Proteína A Hi-Trap 1 mL (GE Healthcare life Sciences) fue equilibrada con PBS. La proteína digerida fue ligada a la columna y lavada extensivamente con PBS. La proteína ligada fue eluída usando Glicina 1M, pH 3.0 y neutralizada con Tris pH 8.00.1 M, y posteriormente se dializó toda la noche en PBS.
La ligación del anticuerpo anti-Jagged 4D11, anticuerpo anti-Jagged activable 5342-1204-4D11 y anticuerpo anti-Jagged activable 5342-1204-4D11 activado hacia jagged 1-Fc recombinante humano fue medida con un ensayo de inmunosorbente enlazado a enzimas (ELISA). Brevemente, el recombinante hJagl-Fc (R&D Systems) fue absorbido a pocilios de una placa de ELISA de 96 pocilios a una concentración de 1 mg/ml en buffer HANKS toda la noche a 4 °C. Todos los pasos posteriores fueron hechos a temperatura ambiente. Las placas fueron bloqueados con HANKS, 0.05% Tween, 4.0% leche seca sin grasa durante 1 hora. El anticuerpo 4D11 y el anticuerpo activado 5342-1204-4D11 fueron agregados al plato a 1000, 300, 100, 30, 10, 3, 1, 0.3 nM y se incubaron durante 1 hora. Todas las mediciones se hicieron por triplicado. Después de que los platos fueron lavados 5 veces con HANKS, se agregó 0.05% Tween y un anti-FAB-cabra-HRP humano (Sigma) fue agregado al plato a una concentración de 1:5000 en HANKS, 0.05% Tween, 4.0% leche seca sin grasa y se incubó durante 1 hora. Se lavó 5 veces como antes y luego se reveló usando una solución 1-STEP-TMBl ELISA (Thermo Scientific). La absorbancia a 450 nm fue medida usando un lector de plato TECAN. La figura 36 muestra que la capacidad del anticuerpo activado 5342-1204-4D11 para ligar Jagged 1 es indistinguible de la ligación del anticuerpo 4D11 a Jagged 1.
EJEMPLO 28. Eficacia y seguridad in vivo de un anticuerpo anti-Jagged activable en el modelo de tumor H292 El anticuerpo anti-Jagged activable 5342-1204-4D11 fue evaluado en cuanto a la capacidad de reducir el crecimiento de tumores de xenoinjerto H292 usando el siguiente método. Ratones hembra un/un, de 6 - 8 semanas de edad, fueron implantadas subcutáneamente con 5 x 106células H292 en medio libre de suero con matrigel (1:1). Los tumores fueron medidos cada dos dias hasta que hubo 48 - 60 ratones con tumores en el rango blanco (~100 - 250 m3) pudieron ser aleatorizadas en grupos de igual promedio de volumen tumoral, cuando el promedio del tamaño del tumor alcanzó 150 - 200 mm3 (n= 8 - 10/grupo). Los animales fueron tratados usando las dosis mostradas en la tabla 29.
Tabla 29. Grupos y dosis para el estudio de eficacia del H292 Figura 37, que muestra el volumen del tumor, demostrando que el anticuerpo anti-Jagged activable 5342-1204-4D11 inhibió el crecimiento de los tumores de xenoinjerto H292. La concentración sérica de la linfopoietina estromal timica (TSLP) fue medida como se describe arriba. Los niveles séricos de TSLP de ratón (mTSLP) fueron cuantificados individualmente para cada ratón hasta el sacrificio; los resultados son mostrados en la figura 38. El anticuerpo activable 5342-1204-4D11 no mostró elevación en TSLP mientras que los animales en el grupo de anticuerpo a 6.7 y 20 mg/kg mostraron TSLP incrementado al compararse con el grupo tratado con IVIg.
En el sacrificio, se tomó piel del abdomen de los animales tratados con 20 mg/kg de IVIg, anticuerpo 4D11 o anticuerpo activadle 5342-1204-4D11. La piel fue fijada en formalina, embebida en parafina y teñida con H&E. Como ilustra la figura 39, se observó hiperqueratosis en el grupo tratado con anticuerpo, mientras que el grupo tratado con anticuerpo activable mostró hiperqueratosis limitada o no la mostró. La fleche apunta a un folículo piloso mostrando hiperqueratosis significativas.
Otras realizaciones Si bien la invención se ha descrito junto con la descripción detallada de la misma, la descripción anterior pretende ilustrar y no limitar el alcance de la invención, la cual se define por el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (48)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones. REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo monoclonal completamente humano 0 aislado que se une a Jagged 1 y Jagged 2.
2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende una secuencia VH-CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos SYAMS (SEQ ID NO: 200); una secuencia VH CD2 que comprende la secuencia de aminoácidos 5 SIDPEGRQTYYADSVKG (SEQ ID NO: 208); a una secuencia VH CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos DIGGRSAFDY (SEQ ID NO: 209); una secuencia VL CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASQSISSY (SEQ ID NO: 210); una secuencia VL CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos AASSLQS (SEQ ID NO: 0 211); y una secuencia VL CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQTVVAPPL (SEQ ID NO: 212).
3. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una combinación de una Secuencia VH-CDR1, una secuencia VH CDR2, una secuencia VH CDR3, una secuencia VL CDR1, una secuencia VL CDR2, y una secuencia VL CDR3 seleccionada a partir de las combinaciones que se muestran en la Tabla 2.
4. El anticuerpo de la reivindicación 3, en donde el anticuerpo comprende una combinación de una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera a partir de las combinaciones enumeradas en la Tabla 4.
5. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo se une a Jagged 1 y Jagged 2 e impide que uno o más de Jagged 1 o Jagged 2 se unan al receptor Notch.
6. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo es un isotipo IgG.
7. El anticuerpo de la reivindicación 6, en donde dicho anticuerpo es un isotipo IgGl.
8. El anticuerpo de la reivindicación 1 que comprende un agente conjugado con el anticuerpo.
9. El anticuerpo de la reivindicación 8, en donde el agente es un agente terapéutico, un agente antineoplásico, una toxina o fragmento de la misma, una porción detectadle o un agente de diagnóstico.
10. El anticuerpo de la reivindicación 8, en donde el agente se conjuga con el anticuerpo mediante un enlazador.
11. El anticuerpo de la reivindicación 10, en donde el conector es un conector escindióle.
12. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes y un vehículo.
13. Un anticuerpo activable que en un estado activado se une a Jagged 1 y Jagged 2 que comprende: un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo (AB) que se une específicamente a Jagged 1 y Jagged 2; una porción de enmascaramiento (MM) que inhibe la unión de AB a Jagged 1 y Jagged 2 cuando el anticuerpo activable está en un estado no escindido; y una porción escindible (CM) acoplada al AB, en donde el CM es un polipéptido que funciona como un sustrato para una proteasa.
14. El anticuerpo activable de la reivindicación 13, en donde el MM tiene una constante de equilibrio de disociación para la unión a AB que es mayor que la constante de disociación de equilibrio del AB a Jagged 1 y Jagged 2.
15. El anticuerpo activable de la reivindicación 13, en donde el MM no interfiere o compite con el AB en cuanto a la unión a Jagged 1 y Jagged 2 cuando el anticuerpo activable se encuentra en un estado escindido.
16. El anticuerpo activable de la reivindicación 13, en donde la proteasa se encuentra co-localizada con Jagged 1 y/o Jagged 2 en un tejido, y en donde la proteasa escinde el CM en el anticuerpo activable cuando el anticuerpo activable está expuesto a la proteasa.
17. El anticuerpo activable de la reivindicación 13, en donde la anticuerpo activable en el estado no escindido tiene la disposición estructural desde el extremo N-terminal al C-terminal tal como sigue: MM-CM-AB o AB-CM-MM.
18. El anticuerpo activable de la reivindicación 13, en el que el anticuerpo activable comprende un péptido de enlace entre el MM y el CM.
19. El anticuerpo activable de la reivindicación 13, en el que el anticuerpo activable comprende un péptido de enlace entre el CM y el AB.
20. El anticuerpo activable de la reivindicación 13, en el que el anticuerpo activable comprende un primer péptido de unión (LP1) y un segundo péptido de unión (LP2), y en el que el anticuerpo activable en el estado no escindido tiene la disposición estructural desde el extremo N-terminal al C-terminal tal como: MM-LP1-CM-LP2-AB o AB-LP2-CM-LP1-MM.
21. El anticuerpo activable de la reivindicación 20, en el que el dos péptidos de unión no necesitan ser idénticos entre sí.
22. El anticuerpo activable de la reivindicación 20, donde cada uno de LPl y LP2 es un péptido de aproximadamente 1 a 20 aminoácidos de longitud.
23. El anticuerpo activable de la reivindicación 13, en donde el MM es un polipéptido de alrededor de 2 a 40 aminoácidos de longitud.
24. El anticuerpo activable de la reivindicación 13, en donde el secuencia del polipéptido MM es diferente de la de Jagged 1 y Jagged 2 y en donde la secuencia del polipéptido MM no es más que 50% idéntica a cualquier pareja de unión natural de AB.
25. El anticuerpo activable de la reivindicación 13, en donde el CM es un polipéptido de hasta 15 aminoácidos de longitud.
26. El anticuerpo activable de la reivindicación 13, en donde el fragmento de unión a antigeno del mismo se selecciona a partir del grupo que consiste en un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un scFv, un scab, un dAb, un único dominio de cadena pesada de anticuerpo, y un único dominio de cadena ligera de anticuerpo.
27. El anticuerpo activable de la reivindicación 13, en donde el CM es un sustrato para una enzima seleccionada a partir del grupo que consiste de uPA, legumaina, MT-SP1, ADAM17, BMP-1, TMPRSS3, TMPRSS4, MMP-9, M P-12, MMP-13, y MMP-14.
28. El anticuerpo activable de la reivindicación 13 que comprende un agente conjugado con el AB.
29. El anticuerpo activable de la reivindicación 28, en donde el agente es un agente terapéutico, un agente antineoplásico, una toxina o fragmento de la misma, una porción detectable o un agente de diagnóstico.
30. El anticuerpo activable de la reivindicación 28, en donde el agente está conjugado al AB a través de un enlazador.
31. El anticuerpo activable de la reivindicación 30, en donde el enlazador es un enlazador escindible.
32. El anticuerpo activable de la reivindicación 13, en donde el MM comprende una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste en las secuencias que se muestran en Tabla 9, Tabla 11, Tabla 12, Tabla 13, Tabla 14, Tabla 19, Tabla 20, Tabla 21, Tabla 22, o Tabla 23.
33. El anticuerpo activable de la reivindicación 13, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que se une a Jagged 1 y Jagged 2 comprende una secuencia VH-CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos SYAMS (SEQ ID NO: 200); una secuencia VH CD2 que comprende la secuencia de aminoácidos SIDPEGRQTYYADSVKG (SEQ ID NO: 208); una secuencia VH CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos DIGGRSAFDY (SEQ ID NO: 209); una secuencia VL CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASQSISSY (SEQ ID NO: 210); una secuencia VL CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos AASSLQS (SEQ ID NO: 211); y una secuencia VL CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQTVVAPPL (SEQ ID NO: 212).
34. El anticuerpo activable de la reivindicación 13, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que se une a Jagged 1 y Jagged 2 comprende una combinación de una secuencia VH-CDR1, una secuencia VH CDR2, una secuencia VH CDR3, una secuencia VL CDR1, una secuencia VL CDR2, y una secuencia VL CDR3 seleccionada a partir de las combinaciones que se muestran en la Tabla 2.
35. El anticuerpo activable de la reivindicación 13, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que se une a Jagged 1 y Jagged 2 comprende una combinación de una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera a partir de las combinaciones enumeradas en la Tabla 4.
36. El anticuerpo activable de la reivindicación 13 que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera seleccionado a partir del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 74, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, y 196, y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada seleccionado a partir del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 76 y 148.
37. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el anticuerpo de la reivindicación 1 o el anticuerpo activable de la reivindicación 13.
38. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 37.
39. Un método para producir un anticuerpo o un anticuerpo activable mediante el cultivo de una célula bajo condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo o del anticuerpo activable, en donde la célula comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 37.
40. Un método de fabricación de un anticuerpo activable que se une a Jagged 1 y Jagged 2 en un estado activado, en donde el método comprende: (a) cultivar una célula que comprende un constructo de ácido nucleico que codifica el anticuerpo activable en condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo activable, en el que el anticuerpo activable comprende una porción de enmascaramiento (MM), una porción escindióle (CM), y un anticuerpo o un fragmento de unión a antigeno del mismo (AB) que se une específicamente a Jagged 1 y Jagged 2, y (b) recuperar el anticuerpo activable.
41. El método de la reivindicación 40, en donde el CM es un polipéptido que funciona como un sustrato para una proteasa.
42. El método de la reivindicación 40, en donde el CM está posicionado en el anticuerpo activable de tal manera que, en un estado no escindido, el MM interfiere con la unión especifica de AB a Jagged 1 y Jagged 2 y en un estado escindido el MM no interfiere o compite con la unión especifica de AB a Jagged 1 y Jagged 2.
43. Un método para aliviar un síntoma de una indicación clínica asociada con el cáncer en un sujeto, el método comprende la administración del anticuerpo de la reivindicación 1 o el anticuerpo activable de la reivindicación 13 a un sujeto en necesidad del mismo en una cantidad suficiente para aliviar el síntoma de la indicación clínica asociada con el cáncer.
44. Un método para reducir la angiogénesis que comprende la administración del anticuerpo de la reivindicación 1 o el anticuerpo activable de la reivindicación 13 a un sujeto en necesidad del mismo en una cantidad suficiente para reducir la angiogénesis.
45. Un método para reducir la señalización Jagged 1 y/o Jagged 2 que comprende la administración del anticuerpo de la reivindicación 1 o del anticuerpo activable de la reivindicación 13 a un sujeto en necesidad del mismo en una cantidad suficiente para reducir la señalización Jagged 1 y/o Jagged 2.
46. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 43 a 45, en el que dicho sujeto es un humano.
47. Un método para aliviar un sintoma de un trastorno fibrótico, en donde el método que comprende administrar el anticuerpo de la reivindicación 1 o el anticuerpo activable de la reivindicación 13 a un sujeto en necesidad del mismo en una cantidad suficiente para aliviar el síntoma del trastorno fibrótico en el sujeto.
48. El método de la reivindicación 47, en el que dicho sujeto es un humano.
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