BR112020014913A2 - Métodos para uso de células t car - Google Patents

Métodos para uso de células t car Download PDF

Info

Publication number
BR112020014913A2
BR112020014913A2 BR112020014913-6A BR112020014913A BR112020014913A2 BR 112020014913 A2 BR112020014913 A2 BR 112020014913A2 BR 112020014913 A BR112020014913 A BR 112020014913A BR 112020014913 A2 BR112020014913 A2 BR 112020014913A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
car
cells
patient
dose
compound
Prior art date
Application number
BR112020014913-6A
Other languages
English (en)
Inventor
Michael C. Jensen
James Matthaei
Philip S. Low
Haiyan CHU
Yingjuan J. LU
Christopher P. Leamon
Leroy W. Wheeler Ii
Original Assignee
Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) filed Critical Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute)
Publication of BR112020014913A2 publication Critical patent/BR112020014913A2/pt

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1774—Immunoglobulin superfamily (e.g. CD2, CD4, CD8, ICAM molecules, B7 molecules, Fc-receptors, MHC-molecules)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464403—Receptors for growth factors
    • A61K39/464404—Epidermal growth factor receptors [EGFR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
    • A61K47/551—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds one of the codrug's components being a vitamin, e.g. niacinamide, vitamin B3, cobalamin, vitamin B12, folate, vitamin A or retinoic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/555—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound pre-targeting systems involving an organic compound, other than a peptide, protein or antibody, for targeting specific cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0041—Xanthene dyes, used in vivo, e.g. administered to a mice, e.g. rhodamines, rose Bengal
    • A61K49/0043—Fluorescein, used in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • A61K2039/622—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier non-covalent binding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

a presente descrição se refere a métodos de tratamento de um paciente com câncer, através da administração ao paciente de uma composição compreendendo células t car, em que as células t car compreendem um car e o car compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína e2 e da administração ao paciente de uma molécula pequena ligada a uma fração alvo por um ligante. a descrição também se refere a composições para uso em tais métodos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “MÉTODOS PARA USO DE CÉLULAS T CAR”
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica prioridade ao pedido provisório U.S. No. 62/736.727 depositado em 26 de setembro de 2018, intitulado “METHODS OF USE FOR CAR T CELLS”, Pedido Prov. U.S. No. 62/735.627 depositado em segunda-feira, 24 de setembro de 2018, intitulado “METHODS OF USE FOR CAR T CELLS”, Pedido Prov. U.S. No. 62/724.171 depositado em quarta-feira, 29 de agosto de 2018, intitulado “METHODS OF USE FOR CAR T CELLS”, Pedido Prov. U.S. No. 62/656.233 depositado em quarta-feira, 11 de abril de 2018, intitulado “METHODS OF USE FOR CAR T CELLS”, Pedido Prov. U.S. 62/620.706 depositado em 23 de janeiro de 2018 intitulado “METHODS OF USE FOR CAR T CELLS”, e Pedido Prov. U.S. No. 62/620.414 depositado em 22 de janeiro de 2018, intitulado “METHODS OF USE FOR CAR T CELLS”, que são cada um incorporado por referência em sua totalidade.
REFERÊNCIA A LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[002] o presente pedido está sendo depositado juntamente com uma Listagem de Sequências em formato eletrônico. A Listagem de sequência é fornecida como um arquivo intitulado SCRIZ0O0WOSEQLIST, criado em 14 de janeiro de 2019, com aproximadamente 26 Kb de tamanho. As informações no formato eletrônico da Listagem de Sequência são incorporadas neste documento — por referência em sua totalidade.
CAMPO TÉCNICO
[003] A presente divulgação se refere aos métodos de tratamento de um paciente com câncer pela administração ao paciente de uma composição compreendendo células T CAR, em que as células T CAR compreendem um CAR e o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 e administração a ao paciente uma pequena molécula ligada a uma fração alvo por um ligante. A divulgação também se refere às composições para uso em tais métodos.
FUNDAMENTOS
[004] A imunoterapia baseada na transferência adotiva de linfócitos (por exemplo, células T) para um paciente é uma terapia valiosa no tratamento de câncer e outras doenças. Muitos avanços importantes foram feitos no desenvolvimento de imunoterapias baseadas na transferência adotiva de linfócitos. Entre os muitos tipos diferentes de agentes imunoterápicos, um dos mais promissores agentes imunoterápicos em desenvolvimento são as células T que expressam receptores de antígeno quiméricos (células T CAR).
O receptor de antígeno quimérico (CAR) é um receptor geneticamente modificado que é projetado para atingir um antígeno específico, por exemplo, um antígeno tumoral. Esse direcionamento pode resultar em citotoxicidade contra o tumor, por exemplo, de modo que as células T CAR que expressam os CARs possam direcionar e matar tumores através dos antígenos tumorais específicos.
[005] Os CARs de primeira geração são compostos de uma região de reconhecimento, por exemplo, uma região variável de fragmento de cadeia única (scFv) derivada de um anticorpo para reconhecimento e ligação ao antígeno expresso pelo tumor e um domínio de sinalização de ativação, por exemplo, a cadeia CD3Ç€ de células T pode servir como um sinal de ativação de células T nos CARs. Embora as células T CAR tenham mostrado resultados positivos in vitro, elas tiveram sucesso limitado na eliminação de doenças (por exemplo, câncer) em ensaios clínicos. Um problema tem sido a incapacidade de prolongar a ativação e expandir a população de células T CAR in vivo.
[006] Para resolver esse problema, um domínio de coestimulação (por exemplo, CD137, CD28 ou CD1I34) foi incluído nos CARS de segunda geração para obter ativação prolongada das células T in vivo. A adição de um domínio de coestimulação aumenta a proliferação e a sobrevivência in vivo de células T contendo CARs, e dados clínicos iniciais mostraram que tais construtos são agentes terapêuticos promissores no tratamento de doenças, como o câncer.
[007] Embora melhorias tenham sido feitas em terapias com células T CAR, vários problemas permanecem. Primeiro, a toxicidade “fora do alvo” pode ocorrer devido a células normais que expressam o antígeno alvo das células T CAR (por exemplo, um antígeno associado ao tumor). Segundo, a ativação desregulada das células T CAR pode ser encontrada onde a eliminação rápida e descontrolada de células doentes (por exemplo, células cancerígenas) pelas células CAR induz uma constelação de distúrbios metabólicos, denominados síndrome de lise tumoral ou síndrome de liberação de citocinas (SRC), que pode ser fatal para os pacientes. A síndrome de lise tumoral e a CRS podem resultar devido às células T CAR administradas que não podem ser facilmente reguladas e são ativadas incontrolavelmente. Consequentemente, embora as células CAR T mostrem grandes promessas como uma ferramenta no tratamento de doenças, como o câncer, são necessárias terapias adicionais com células T CAR que proporcionem uma toxicidade fora do alvo reduzida e controle mais preciso da ativação das células T CAR.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[008] Os presentes inventores descobriram métodos para reduzir a toxicidade fora do alvo e controlar mais precisamente a ativação das células T CAR, fornecendo avanços importantes na terapia de células T CAR. Nas várias modalidades descritas aqui, um ligante de molécula pequena ligado a uma fração alvo por um ligante é usado como uma ponte entre o câncer e as células T CAR expressando um CAR, em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2. A ponte direciona as células T CAR, expressando um CAR compreendendo um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2, para o câncer, para melhoria do câncer. Em uma modalidade, o “ligante de molécula pequena” pode ser, por exemplo, um folato, DUPA, um ligante NK-1IR, um ligante CAIX, um ligante de gama glutamil transpeptidase, um ligante NKG2D ou um ligante CCK2R, cada um dos quais é um ligante de molécula pequena que se liga especificamente às células cancerígenas (ou seja, o receptor desses ligantes é sobre- expressado nos cânceres em comparação aos tecidos normais).
[009] Em uma modalidade, o “ligante de molécula pequena” está ligado a uma “fração de direcionamento” que se liga ao CAR expresso pelas células T CAR. Em várias modalidades, a “fração de direcionamento” pode ser selecionada, por exemplo, a partir de fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína (FITC), NHS e/ou fluoresceína.
[0010] A “fração alvo” se liga à região de reconhecimento do CAR geneticamente modificado, expressando um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2. Por conseguinte, a região de reconhecimento do CAR (por exemplo, uma região variável de cadeia única (scFv) de um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2, um fragmento Fab, Fv, Fc, (Fab')2 e semelhantes) é direcionada para a “fração de direcionamento”. Assim, o ligante de pequena molécula ligado a uma fração de direcionamento por um ligante atua como uma ponte entre o câncer e as células T CAR, expressando um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2, direcionando as células T CAR para o câncer para a melhoria do câncer.
[0011] Em uma modalidade, é fornecido um método de tratamento de um câncer. O método compreende i) administrar a um paciente um composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto compreende um ligante de molécula pequena ligado a uma fração alvo por um ligante, ii) administrar ao paciente uma primeira dose de uma composição de célula T CAR compreendendo células T CAR em que as células T CAR compreendem um CAR direcionado à fração de direcionamento e em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceina E2 e iii) administração ao paciente de uma segunda dose de uma composição de células T CAR compreendendo células CAR T em que as células T CAR compreendem o CAR direcionado à fração de direcionamento e em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2.
[0012] Em outra modalidade, é fornecido um método de tratamento de um câncer. O método compreende i) administrar a um paciente um composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto compreende um ligante de molécula pequena ligado a uma fração alvo por um ligante, e ii) administrar ao paciente uma composição de células T CAR, em que a composição de células T CAR compreende células T CAR, em que as células T CAR compreendem um CAR direcionado para a fração alvo, em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceina E2 e em que a composição de células T CAR compreende uma mistura das células T CAR e células T não transformadas.
[0013] Em ainda outra modalidade, é fornecido um método de tratamento de um câncer. O método compreende i) administrar a um paciente um composto ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto compreende um ligante de molécula pequena ligado a uma fração alvo por um ligante, ii) administrar ao paciente uma composição de células T CAR em que a composição de células T CAR compreende células T CAR, em que as células T CAR compreendem um CAR direcionado para a fração alvo e em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2; e iii) administrar ao paciente um folato, um conjugado compreendendo um folato, em que o conjugado compreendendo um folato não compreende uma fração de direcionamento ou um agente que inibe a ativação das células T CAR.
[0014] Ainda em outra modalidade, é fornecido um método de tratamento de um câncer. O método compreende 1) administrar a um paciente um composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto compreende um ligante de molécula pequena ligado a uma fração alvo por um ligante, em que pelo menos uma primeira dose e uma segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, são administrados ao paciente, em que a primeira dose e a segunda dose são diferentes, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é cerca de 2 vezes a cerca de 15000 vezes maior em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e ii) administrar ao paciente uma composição de células T CAR compreendendo células T CAR em que as células T CAR compreendem um CAR direcionado para a fração alvo e em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2.
[0015] Em outra modalidade ilustrativa, é fornecido um método de tratamento de um câncer. O método compreende i) administrar a um paciente uma primeira dose de um composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto compreende um ligante de molécula pequena ligado a uma fração de direcionamento por um ligante, ii) administrar ao paciente pelo menos uma segunda dose do composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é pelo menos cerca de 50 por cento menor em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ; e iii) administrar ao paciente uma dose de uma composição de células T CAR compreendendo células T CAR, em que as células T CAR compreendem um CAR direcionado à fração de direcionamento e em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2.
[0016] Em outra modalidade, é fornecido um método de tratamento de um câncer. O método compreende i) administrar a um paciente um composto ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto compreende um ligante de molécula pequena ligado a uma fração alvo por um ligante e em que o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado a uma dose de cerca de 10 nmoles/kg de peso corporal do paciente a cerca de 2500 nmoles/kg de peso corporal do paciente, e ii) administrar ao paciente uma composição de células T CAR compreendendo células T CAR, em que as células T CAR compreendem um CAR, em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 e em que as células T CAR estão em uma dose de cerca de 1 milhão de células T CAR a cerca de 15 milhões de células T CAR.
[0017] Em ainda outra modalidade, um método de tratamento de um câncer é fornecido. O método compreende i) administrar continuamente a um paciente um composto, Ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto compreende um ligante de molécula pequena ligado a uma fração alvo por um ligante, ii) administrar ao paciente uma composição de células T CAR compreendendo CAR Células T em que as células T CAR compreendem um CAR, em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 e iii) terminar a administração contínua do composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para inibir ou prevenir a síndrome de liberação de citocina no paciente.
[0018] Em outra modalidade, um método de tratamento de um câncer é fornecido. O método compreende i) administrar a um paciente um composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto compreende um ligante de molécula pequena ligado a uma fração de direcionamento por um ligante e em que o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado uma vez por semana ao paciente, e ii) administrar ao paciente uma composição de células T CAR compreendendo células T CAR em que as células T CAR compreendem um CAR, em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2.
[0019] Em ainda outra modalidade, um método de tratamento de um câncer é fornecido. O método compreende i) administrar a um paciente uma primeira dose de um composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto compreende um ligante de molécula pequena ligado a uma fração de direcionamento por um ligante e em que o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo , é administrado ao paciente antes da administração de uma composição de células T CAR, compreendendo células T CAR, em que as células T CAR compreendem um CAR direcionado para a fração alvo, ii) depois administrar ao paciente uma dose da composição de células T CAR, e iii) em seguida, administrar ao paciente uma segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2.
[0020] Modalidades adicionais também são descritas pelas seguintes cláusulas enumeradas. Também são contempladas qualquer uma das modalidades a seguir em combinação com as modalidades aplicáveis descritas na seção Resumo, na Descrição Detalhada da seção Modalidades TIlustrativas, na seção Exemplos ou nas Reivindicações deste pedido de patente.
1. Um método de tratamento de um câncer, o método compreendendo i) administrar a um paciente um composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto compreende um ligante de molécula pequena ligado a uma fração alvo por um ligante; ii) administrar ao paciente uma primeira dose de uma composição de células T CAR, compreendendo células T CAR, em que as células T CAR compreendem um CAR direcionado para a fração alvo e em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2; e iii) administrar ao paciente uma segunda dose de uma composição de células T CAR compreendendo células T CAR, em que as células T CAR compreendem o CAR direcionado para a fração alvo e em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2.
2. Um método de tratamento de um câncer, o método compreendendo i) administrar a um paciente um composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto compreende um ligante de molécula pequena ligado a uma fração alvo por um ligante; e ii) administrar ao paciente uma composição de células T CAR em que a composição de células T CAR compreende células T CAR, em que as células T CAR compreendem um CAR direcionado para a fração alvo em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 e em que a composição de células T CAR compreende uma mistura das células T CAR e células T não transformadas.
3. Um método de tratamento de um câncer, o método compreendendo i) administrar a um paciente um composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto compreende um ligante de molécula pequena ligado a uma fração alvo por um ligante; ii) administrar ao paciente uma composição de células T CAR em que a composição de células T CAR compreende células T CAR em que as células T CAR compreendem um CAR direcionado à fração de direcionamento e em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2; e iii) administrar ao paciente um folato, um conjugado compreendendo um folato, em que o conjugado compreendendo um folato não compreende uma fração de direcionamento ou um agente que inibe a ativação das células T CAR.
4. O método da cláusula 3, em que a etapa iii compreende a administração de um folato.
5. O método de qualquer uma das cláusulas 3 ou 4, em que a etapa iii compreende a administração de ácido fólico ou leucovorina.
6. O método da cláusula 3, em que a etapa iii compreende a administração o conjugado compreendendo um folato.
7. O método da cláusula 6, em que o conjugado compreendendo um folato compreende um folato ligado a um ou mais aminoácidos.
8. O método da cláusula 7, em que o conjugado que compreende um folato tem a fórmula o com o FO”
ASA N o o x as CoH Ss O
9. O método de qualquer uma das cláusulas 3 a 8, em que o folato tem a fórmula x RR RR R Mapa AIEA NOS “a SO rs
PCA CBF Y! N U em que xi e Y' são cada um, selecionados independentemente do grupo que consiste em halo, R?º, ORº, SRº, e NRÍRi; Uy V, e W representam frações bivalentes, cada uma, selecionada independentemente do grupo que consiste em - (R62) C=, -N=, -(R69)C(R1º)-, e -N(R$9)-; Q é selecionado do grupo que consiste em C e CH; T é selecionado do grupo que consiste em S, O, N, e -C=C-; Xº e X? são, cada um, selecionados independentemente do grupo que consiste em oxigênio, enxofre, -C(Z)-, -C(Z)O-, -OC(Z)-, -N(R%P)-, -— C(Z)N(R*”)-, -N(R*”)C(Z)-, OC (Z) N(RºP) —, —-N(RºP)C(2) O-, -N(Rº%*) C(Z)N(R5b)-, -S(0)-, -S(0)2-, -N(R4a)S(0)2-, -C(R6b) (R7 b)-, —-N(C=CH)-, —-N(CH2C=CH) -, C1-Ci2 alquileno, e C1-C12 alquieneoxi, em que Z é oxigênio ou enxofre; R! é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halo, Ci-Ci2 alquil, e C1-C12 alcoxi; R?ºà, Rà, Ri, Ria, Rº”, R5, Rº», R6p, e Ri são, cada um, independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halo, C1-C1i2 alquil, C1i-Ciz alcoxi, C1-C17r alcanoil, C1-Ci2 alquenil, C1-Ci2z alquinil, (C1-Cir alcoxi)carbonil, e (C1-Cir alquilamino)carbonil; Rº e R'º são,
cada um, independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halo, C1-Ci2r alquil, e Cri Cir alcoxi; ou, Rº e R' são tomados em conjunto para formar um grupo carbonil; R$ e Ri? são, cada um, independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halo, C1-C12 alquil, e C1i-Ci2r alcoxi; ou R%ºº e R'º são tomados em conjunto para formar um grupo carbonil; p, r, Ss, e t são, cada um, independentemente ou 0 ou 1; e * representa uma ligação covalente ao resto do conjugado.
10. O método da cláusula 3, em que o agente que inibe a ativação das células T CAR é administrado e é selecionado a partir do grupo que consiste em um inibidor de proteína tirosina quinase específico de linfócito, um inibidor de PI3 quinase, um inibidor de uma célula T induzível por IL-2 quinase, um inibidor de JAK, um inibidor de BTK, EC2319 e um agente que bloqueia a ligação de células T CAR ao composto ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, mas não se liga ao câncer.
11. O método da cláusula 10, em que o agente que inibe a ativação das células T CAR é administrado e o agente é um inibidor da proteína tirosina quinase específica para linfócitos.
12. O método da cláusula 11, em que o inibidor da proteína tirosina quinase específica de linfócitos é Dasatinibe.
13. O método da cláusula 10, em que o agente que inibe a ativação das células T CAR é administrado e o agente é um inibidor da PI3 quinase.
14. O método da cláusula 13, em que o inibidor da PI3 quinase é GDCO0980.
15. O método da cláusula 10, em que o agente que inibe a ativação das células T CAR é administrado e o agente é um inibidor de quinase de células T induzível por IL-2.
16. O método da cláusula 15 em que o inibidor de quinase de células T induzível por IL-2 é BMS-509744.
17. Método, de acordo com a cláusula 10, em que o agente que inibe a ativação das células T CAR é administrado e é um agente que bloqueia a ligação das células T CAR ao composto ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, mas não se liga ao câncer.
18. O método da cláusula 17, em que o agente é fluoresceinamina, FITC ou fluoresceína de sódio.
19. O método da cláusula 18, em que o agente é FITC.
20. O método da cláusula 18, em que o agente é fluoresceína de sódio.
21. O método de qualquer uma das cláusulas 17 a 20, em que o agente que inibe a ativação das células T CAR é administrado a uma dose de cerca de 0,0l a cerca de 300 umoles/kg de peso corporal do paciente.
22. O método de qualquer uma das cláusulas 17 a 20, em que o agente que inibe a ativação das células T CAR é administrado a uma dose de cerca de 0,06 a cerca de 100 umoles/kg de peso corporal do paciente.
23. O método de qualquer uma das cláusulas 17 a 20, em que o agente que inibe a ativação das células T CAR é administrado a uma dose de cerca de 0,06 a cerca de 90 umoles/kg de peso corporal do paciente.
24. O método de qualquer uma das cláusulas 17 a 20, em que o agente que inibe a ativação das células T CAR é administrado a uma dose de cerca de 0,06 a cerca de 80 umoles/kg de peso corporal do paciente.
25. O método de qualquer uma das cláusulas 17 a 20, em que o agente que inibe a ativação das células T CAR é administrado a uma dose de cerca de 0,06 a cerca de 70 umoles/kg de peso corporal do paciente.
26. O método de qualquer uma das cláusulas 17 a 20, em que o agente que inibe a ativação das células T CAR é administrado a uma dose de cerca de 0,06 a cerca de 60 umoles/kg de peso corporal do paciente.
27. O método de qualquer uma das cláusulas 17 a 20, em que o agente que inibe a ativação das células T CAR é administrado a uma dose de cerca de 0,06 a cerca de 50 umoles/kg de peso corporal do paciente.
28. O método de qualquer uma das cláusulas 17 a 20, em que o agente que inibe a ativação das células T CAR é administrado a uma dose de cerca de 0,06 a cerca de 40 umoles/kg de peso corporal do paciente.
29. O método de qualquer uma das cláusulas 17 a 20, em que o agente que inibe a ativação das células T CAR é administrado a uma dose de cerca de 0,06 a cerca de 30 umoles/kg de peso corporal do paciente.
30. O método de qualquer uma das cláusulas 17 a 20, em que o agente que inibe a ativação das células T CAR é administrado a uma dose de cerca de 0,06 a cerca de 20 umoles/kg de peso corporal do paciente.
31. O método de qualquer uma das cláusulas 17 a 20, em que o agente que inibe a ativação das células T CAR é administrado a uma dose de cerca de 0,06 a cerca de 10 umoles/kg de peso corporal do paciente.
32. O método de qualquer uma das cláusulas 17 a 20, em que o agente que inibe a ativação das células T CAR é administrado a uma dose de cerca de 0,06 a cerca de 8 umoles/kg de peso corporal do paciente.
33. O método de qualquer uma das cláusulas 17 a 20, em que o agente que inibe a ativação das células T CAR é administrado a uma dose de cerca de 0,06 a cerca de 6 umoles/kg de peso corporal do paciente.
34. O método de qualquer uma das cláusulas 3 a 33, em que mais do que uma dose é administrada ao paciente do folato, o conjugado compreendendo um folato em que o conjugado compreendendo um folato não compreende uma fração de direcionamento, ou oO agente que inibe a ativação das células T CAR.
35. O método de qualquer uma das cláusulas 3 a 34, em que o folato, o conjugado compreendendo um folato em que o conjugado compreendendo um folato não compreende uma fração alvo, ou o agente que inibe a ativação das células T CAR é administrado ao paciente antes e/ou após o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
36. O método de qualquer uma das cláusulas 3 a 35, em que a administração do folato, o conjugado compreendendo um folato em que o conjugado compreendendo um folato não compreende uma fração alvo, ou o agente que inibe a ativação das células T CAR causa redução nos níveis de citocinas no paciente.
37. O método da cláusula 36, em que a redução nos níveis de citocinas ocorre cerca de 3 horas após a administração ao paciente de folato, o conjugado compreendendo um folato em que o conjugado compreendendo um folato não compreende uma fração de direcionamento ou o agente que inibe a ativação das células T CAR.
38. O método da cláusula 36, em que a redução nos níveis de citocinas ocorre cerca de 6 horas após a administração ao paciente de folato, o conjugado compreendendo um folato em que o conjugado compreendendo um folato não compreende uma fração de direcionamento ou o agente que inibe a ativação das células T CAR.
39. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas 36 a 38, em que a redução nos níveis de citocinas é uma redução para cerca dos níveis de citocinas em um paciente não tratado.
40. O método de qualquer uma das cláusulas 3 a 39, em que o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado antes e após a administração do folato, o conjugado compreendendo um folato em que o conjugado compreendendo um folato não compreende uma fração de direcionamento, ou o agente que inibe a ativação das células T CAR.
41. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas 3 a 40, em que o número de células T CAR aumenta no sangue do paciente após a administração do folato, o conjugado compreendendo um folato, em que o conjugado compreendendo um folato não compreende uma fração de direcionamento ou o agente que inibe a ativação das células T CAR, embora os níveis de citocinas no paciente sejam reduzidos.
42. O método de qualquer uma das cláusulas 3 a 41, em que a ativação das células T CAR é aprimorada ou mantida, em relação a um paciente não tratado com um agente de resgate, após administração do folato, o conjugado compreendendo um folato em que o conjugado compreendendo um folato não compreendem uma fração de direcionamento, ou o agente que inibe a ativação das células T CAR, mesmo que os níveis de citocinas no paciente tratado sejam reduzidos.
43. O método de qualquer uma das cláusulas 3 a 42, em que o câncer compreende um tumor e o tamanho do tumor no paciente não é aumentado quando o folato, o conjugado compreendendo um folato, em que o conjugado compreendendo um folato não compreende uma fração de direcionamento, ou o agente que inibe a ativação das células T CAR é administrado ao paciente.
44, O método da cláusula 43, em que é obtida uma resposta completa para o tumor.
45. O método de qualquer uma das cláusulas 3 a 44, em que o folato, o conjugado compreendendo um folato em que o conjugado compreendendo um folato não compreende uma fração alvo, ou o agente que inibe a ativação das células T CAR, o agente que inibe a ativação das células T CAR são administrados ao paciente quando o grau de CRS atinge 1, 2, 3 ou 4.
46. O método da cláusula 45, em que o agente que inibe a ativação das células T CAR é administrado ao paciente quando o grau de CRS atinge 3 ou 4.
47. Método de qualquer uma das cláusulas 3 a 46, em que o edema pulmonar é reduzido.
48. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas l1 a 47, em que o composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado a uma dose de cerca de 10 nmoles/kg de peso corporal do paciente a cerca de 2500 nmoles/kg de peso corporal do paciente; e as células T CAR estão em uma dose de cerca de 1 milhão de células T CAR a cerca de 15 milhões de células T CAR.
49. O método da cláusula 48, em que o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado a uma dose de cerca de 10 nmoles/kg a cerca de 100 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
50. O método de qualquer uma das cláusulas 48 a 49, em que o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado a uma dose de cerca de 10 nmoles/kg a cerca de 50 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
51. O método de qualquer uma das cláusulas 48 a 50, em que o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado a uma dose de cerca de 10 nmoles/kg a cerca de 20 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
52. O método da cláusula 48, em que o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado a uma dose de cerca de 10 nmoles/kg a cerca de 600 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
53. O método da cláusula 48, em que o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado a uma dose de cerca de 200 nmoles/kg a cerca de 600 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
54. O método da cláusula 48, em que o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado a uma dose de cerca de 400 nmoles/kg a cerca de 600 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
55. O método de qualquer uma das cláusulas 48 a 54, em que as células T CAR estão em uma dose de cerca de 1 milhão de células T CAR a cerca de 12,5 milhões de células T CAR.
56. O método de qualquer uma das cláusulas 48 a 55, em que as células T CAR estão em uma dose de cerca de 1 milhão de células T CAR a cerca de 7 milhões de células T CAR.
57. O método de qualquer uma das cláusulas 48 a 56, em que as células T CAR estão em uma dose de cerca de 1 milhão de células T CAR a cerca de 5 milhões de células T CAR.
58. O método de qualquer uma das cláusulas 48 a 57, em que as células T CAR estão em uma dose de cerca de 2 milhão de células T CAR a cerca de 5 milhões de células T CAR.
59. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 58,em que que compreende ainda a etapa de terminar a administração contínua do composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para inibir ou prevenir a síndrome de liberação de citocina no paciente.
60. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 59, em que o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado continuamente por pelo menos uma hora ao paciente.
61. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 59, em que o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado continuamente por pelo menos quatro horas ao paciente.
62. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas l1 a 59, em que o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado continuamente por pelo menos seis horas ao paciente.
63. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 62, em que o composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é administrado ao paciente em dias alternados.
64. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas l a 62, em que o composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado ao paciente três vezes por semana.
65. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 62, em que o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado ao paciente duas vezes por semana.
66. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 a 62, em que o composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado ao paciente uma vez por semana.
67. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 62, em que o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado ao paciente até que ocorra uma perda inaceitável de peso corporal do paciente, febre, queda na pressão sanguínea ou edema pulmonar.
68. Método de tratamento de um câncer, o método compreendendo i) administrar a um paciente um composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto compreende um ligante de molécula pequena ligado a uma fração de direcionamento por um ligante, em que pelo menos uma primeira dose e uma segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, são administrados ao paciente, em que a primeira dose e a segunda dose são diferentes, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é de cerca de 2 vezes até cerca de 15000 vezes maior em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; e ii) administrar ao paciente uma composição de células T CAR, compreendendo células T CAR, em que as células T CAR compreendem um CAR direcionado à fração alvo e em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2.
69. O método da cláusula 68, em que pelo menos uma primeira dose, uma segunda dose e uma terceira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, são administradas ao paciente, em que a primeira dose, a segunda dose e a terceira dose são diferentes, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é cerca de 2 a 750 vezes maior em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e em que a terceira a dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é cerca de 800 vezes a cerca de 10000 vezes maior em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
70. O método da cláusula 68, em que pelo menos uma primeira dose, uma segunda dose, uma terceira dose e uma quarta dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, são administradas ao paciente, em que a primeira dose, a segunda dose, a terceira dose e a quarta dose são diferentes, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é cerca de 2 vezes a cerca de 750 vezes maior em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o produto farmaceuticamente sal aceitável do mesmo, em que a terceira dose do composto, ou O seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico, é de cerca de 800 a 7500 vezes maior em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico, e em que o à quarta dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é cerca de 8.000 a cerca de 15.000 vezes maior em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
71. O método da cláusula 70, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é cerca de 100 vezes maior em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que a terceira dose do composto , ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é cerca de 1000 vezes maior em quantidade do que a primeira dose do composto, ou Oo sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e em que a quarta dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é de cerca de 10000 vezes em quantidade maior que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
72. O método da cláusula 68, em que pelo menos uma primeira dose e uma segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, são administradas ao paciente, em que a primeira dose e a segunda dose são diferentes, em que a segunda dose do composto, ou oO sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é cerca de 2 vezes a cerca de 15000 vezes maior em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
73. Um método de tratamento de um câncer, o método compreendendo i) administrar a um paciente uma primeira dose de um composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto compreende um ligante de molécula pequena ligado a uma fração alvo por um ligante; ii) administrar ao paciente pelo menos uma segunda dose do composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é pelo menos cerca de 50 por cento menor em quantidade do que a primeira dose do composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; e iii) administrar ao paciente uma dose de uma composição de células T CAR compreendendo células T CAR, em que as células T CAR compreendem um CAR direcionado à fração de direcionamento e em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2.
74. O método da cláusula 74, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é pelo menos cerca de 60% menor em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
75. O método da cláusula 74, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é pelo menos cerca de 70% menor em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
76. O método da cláusula 74, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é pelo menos cerca de 80% menor em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
77. O método da cláusula 74, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é pelo menos cerca de 90% menor em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
78. O método da cláusula 74, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é pelo menos cerca de 95% menor em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
79. O método da cláusula 74, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é pelo menos cerca de 96% menor em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
80. O método da cláusula 74, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é pelo menos cerca de 97% menor em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
81. O método da cláusula 74, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é pelo menos cerca de 98% menor em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
82. O método da cláusula 74, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é pelo menos cerca de 99,5% menor em quantidade do que a primeira dose do composto, Ou oO sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
83. O método da cláusula 74, em que a segunda dose do composto, ou seu sal farmaceuticamente aceitável, é pelo menos cerca de 99,5 por cento menor em quantidade do que a primeira dose do composto, ou seu sal farmaceuticamente aceitável.
84. O método de qualquer uma das cláusulas 73 a 83, em que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é de cerca de 100 nmoles/kg a cerca de 1000 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
85. O método de qualquer uma das cláusulas 73 a 83, em que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é de cerca de 100 nmoles/kg a cerca de 900 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
86. O método de qualquer uma das cláusulas 73 a 83, em que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é de cerca de 100 nmoles/kg a cerca de 800 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
87. O método de qualquer uma das cláusulas 73 a 83, em que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é de cerca de 100 nmoles/kg a cerca de 700 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
88. O método de qualquer uma das cláusulas 73 a 83, em que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é de cerca de 100 nmoles/kg a cerca de 600 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
89. O método de qualquer uma das cláusulas 73 a 83, em que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é de cerca de 200 nmoles/kg a cerca de 600 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
90. O método de qualquer uma das cláusulas 73 a 83, em que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é de cerca de 400 nmoles/kg a cerca de 600 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
91. O método de qualquer uma das cláusulas 73 a 83, em que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é de cerca de 500 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
92. O método da cláusula 84, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é de cerca de 0,5 nmoles/kg a cerca de 500 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
93. O método da cláusula 85, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é de cerca de 0,5 nmoles/kg a cerca de 450 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
94. O método da cláusula 86, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é de cerca de 0,5 nmoles/kg a cerca de 400 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
95. O método da cláusula 87, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é de cerca de 0,5 nmoles/kg a cerca de 350 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
96. O método da cláusula 88, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é de cerca de 0,5 nmoles/kg a cerca de 300 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
97. O método da cláusula 89, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é de cerca de 1 nmole/kg a cerca de 300 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
98. O método da cláusula 90, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é de cerca de 2 nmoles/kg a cerca de 300 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
99. O método da cláusula 91, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é de cerca de 2 nmoles/kg a cerca de 250 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
100. O método de qualquer uma das cláusulas 92 a 99, em que a segunda dose do composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é de cerca de 5 nmoles/kg a cerca de 40 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
101. O método de qualquer uma das cláusulas 92 a 99, em que a segunda dose do composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é de cerca de 40 nmoles/kg a cerca de 150 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
102. O método de qualquer uma das cláusulas 73 a 101, compreendendo —“ainda administrar uma terceira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que a terceira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é a mesma que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
103. O método da cláusula 102, compreendendo ainda a administração de uma quarta dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que a quarta dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é a mesma que a segunda dose, ou o sal farmaceuticamente aceitável e a terceira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
104. O método de qualquer uma das cláusulas 73 a 103, em que as doses do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, administradas após a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, mantêm a inibição do crescimento do câncer em relação à primeira dose do composto, ou ao sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
105. O método de qualquer uma das cláusulas 73 a 104, em que as células T CAR são administradas a uma dose de cerca de 1 milhão de células T CAR a cerca de 40 milhões de células T CAR.
106. O método de qualquer uma das cláusulas 73 a 105, em que as doses do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, administrados após a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, são administrados uma vez por semana.
107. O método de qualquer uma das cláusulas 73 a 105, em que as doses do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, são administrados duas vezes por semana.
108. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 107, em que o CAR compreende ainda um domínio de dobradiça de IgG4, um domínio de ativação de CD36€ e um domínio de coestimulação 4-1BB.
109. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 108, em que o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 é um fragmento scFv.
110. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 109, em que a proteína CAR tem pelo menos cerca de 90% de identidade com a SEQ ID NO: 2.
111. O método de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 a 109, em que a proteína CAR tem pelo menos cerca de 95% de identidade com a SEQ ID NO: 2.
112. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 109, em que a proteína CAR tem pelo menos cerca de 98% de identidade com a SEQ ID NO: 2.
113. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 112, em que o CAR se liga a fluoresceína.
114. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 109, em que a sequência da proteína CAR tem até cerca de 50 substituições conservadas de aminoácidos e em que o CAR se liga à fluoresceína.
115. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 109, em que o CAR é codificado por um polinucleotídeo com pelo menos cerca de 90% de identidade com a SEQ ID NO: 1.
116. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 109, em que o CAR é codificado por um polinucleotídeo com pelo menos cerca de 95% de identidade com a SEQ ID NO: 1.
117. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 109, em que o CAR é codificado por um polinucleotídeo com pelo menos cerca de 98% de identidade com a SEQ ID NO: 1.
118. O método de qualquer uma das cláusulas 115 a 117, em que o CAR se liga à fluoresceína.
119. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 118, em que o CAR é codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de alto rigor com um polinucleotídeo com a SEQ ID NO: 1 e em que o CAR se liga à fluoresceína.
120. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 119, em que o CAR é codificado por um polinucleotídeo que possui a
SEQ ID NO: 1 ou por uma variante degenerada da SEQ ID NO: 1.
121. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 120, em que o ligante é selecionado do grupo que consiste em um folato, DUPA, um ligante NK-1R, um ligante CAIX, um ligante de gama glutamil transpeptidase, um ligante NKG2D e um ligante CCK2R.
122. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 121, em que a fração alvo é a fluoresceína, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
123. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 122, em que o ligante compreende polietilenoglicol (PEG), poliprolina, um aminoácido hidrofílico, um açúcar, um peptidoglicano não natural, uma polivinilpirrolidona, F-127 plurônico ou uma combinação dos mesmos.
124. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 123, em que o ligante compreende PEG.
125. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 124, em que o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, tem a fórmula B—L—T em que B representa o ligante de molécula pequena, L representa o ligante e T representa a fração de direcionamento, e em que L compreende uma estrutura com a fórmula n em que n é um número inteiro de O a 200.
126. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 125, em que o câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer de pulmão, câncer ósseo, câncer de pâncreas, câncer de pele, câncer de cabeça, câncer de pescoço, melanoma cutâneo, melanoma intraocular, melanoma intraocular, câncer uterino, câncer de ovário, câncer de endométrio, câncer de reto, câncer de estômago, câncer de cólon, câncer de mama, câncer de mama triplo negativo, carcinoma das trompas de falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma do colo do útero, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, Doença de Hodgkin, câncer de esôfago, câncer de intestino delgado, câncer de sistema endócrino, câncer de glândula tireoide, câncer de glândula paratireoide, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de glândula adrenal, sarcoma de tecidos moles, osteossarcoma, câncer de uretra, câncer de próstata, leucemia crônica, leucemia aguda, leucemia mielocítica aguda, linfoma linfocítico, leucemia mieloide, leucemia mielomonocítica, leucemia de células pilosa, leucemia mielomonocítica, leucemia de células pilosa, mesotelioma pleural, câncer de bexiga, linfoma de Burkitt, câncer de ureter, câncer de rim, carcinoma de células renais, carcinoma de pelve renal, neoplasias do sistema nervoso central (SNC), linfoma primário do SNC, tumores axiais da coluna vertebral glioma do tronco encefálico, adenoma da hipófise e adenocarcinoma da junção gastroesofágica.
127. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 126, em que o câncer é um receptor de folato que expressa câncer.
128. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 127, em que o câncer é um câncer endometrial.
129. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 127, em que o câncer é um câncer de pulmão de células não pequenas.
130. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 127, em que o câncer é um câncer ovariano.
131. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 127, em que o câncer é um câncer de mama triplo negativo.
132. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 127, em que o câncer é leucemia mielocítica aguda.
133. O método da cláusula 132, em que o câncer expressa o receptor de folato-f.
134. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 133, em que doses múltiplas da composição de células T CAR são administradas.
135. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 134, em que pelo menos duas doses da composição de células T CAR são administradas.
136. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 135, em que o paciente é imageado antes da administração do composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ou antes da administração da composição de células T CAR.
137. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 136, em que o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, não é um anticorpo e não compreende um fragmento de um anticorpo.
138. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 137, em que a fração de direcionamento não compreende um epítopo de peptídeo.
139. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 a 138, em que a liberação de citocinas resultando em toxicidade fora do alvo no paciente não ocorre e em que ocorre toxicidade de células T CAR para o câncer.
140. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 a 138, em que a toxicidade do tecido fora do alvo não ocorre no paciente e em que ocorre a toxicidade das células T CAR para o câncer.
141. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 a 138, em que o câncer compreende um tumor, em que o tamanho do tumor é reduzido no paciente e em que não ocorre toxicidade fora do alvo.
142. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 a 141, em que CRS é reduzida ou evitada e o método resulta em uma diminuição no volume do tumor no paciente.
143. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 142, em que a perda de peso corporal devido à CRS é reduzida ou impedida.
144. O método de qualquer uma das cláusulas 59 a 67, compreendendo ainda a readministração do composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ao paciente.
145. O método da cláusula 144, em que a administração subsequente do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, causa a ativação de células T CAR e um aumento nos níveis de citocinas no paciente.
146. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 145, em que o câncer compreende um tumor e em que é obtida uma resposta completa para o tumor.
147. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 146, em que as células T CAR têm um fenótipo de memória central/memória efetora.
148. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 147, em que a razão CD8: CD4 das células T CAR é de cerca de 1: 1.
[0021] Alternativas adicionais incluem o seguinte.
149. Um ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo: um ácido nucleico que possui pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou pelo menos cerca de 99,5% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 1 ou 4, em que o referido ácido nucleico codifica um scFv antifluoresceína; ou um ácido nucleico com a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1 ou 4; em que, opcionalmente, o referido ácido nucleico de (a) ou (b) compreende ainda um ácido nucleico que codifica o domínio de articulação n de Ig6G4, um domínio de ativação de CD3(C e um domínio de coestimulação de 4-1BB.
150. Polipeptídeo que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo: um polipeptídeo que possui pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou pelo menos cerca de 99,5% de identidade de sequência da SEQ ID NO: 2 ou 3, em que o referido polipeptídeo codifica um scFv antifluoresceína; ou um polipeptídeo tendo a sequência apresentada na SEQ ID NO:
2, ou 3, em que o referido polipeptídeo codifica um scFv antifluoresceína, e em que, opcionalmente, o referido polipeptídeo de (a) ou (b) compreende ainda um polipeptídeo que codifica um domínio de dobradiça IgG4, um domínio de ativação CD37 e um domínio de coestimulação 4-1BB.
151. Um vetor compreendendo o ácido nucleico da alternativa 149.
152. O vetor da alternativa 151, em que o referido vetor é um vetor lentiviral.
153. Uma célula compreendendo o ácido nucleico ou vetor de qualquer uma das alternativas 149, 151 ou 152.
154. A célula da alternativa 153, em que a célula é um linfócito T ou linfócito T citotóxico.
155. O polipeptídeo da alternativa 150, em que o referido polipeptídeo compreende ou consiste em sequências de aminoácidos humanizadas ou humanas.
156. Uma célula compreendendo o polipeptídeo alternativo 150 ou 155.
157. A célula da alternativa 156, em que a célula é um linfócito T ou linfócito T citotóxico.
158. Método para melhorar ou tratar um câncer em um paciente, compreendendo: marcar um câncer no referido paciente com um ligante de molécula pequena tendo uma fração de isotiocianato de fluoresceína (FITC); e administrar ao referido paciente uma composição de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo a célula, linfócito T ou linfócito T citotóxico das alternativas 153, 154 ou 157.
159. O método da alternativa 158, em que a composição de células T CAR é administrada antes de marcar o câncer com o ligante de molécula pequena tendo uma fração FITC.
160. O método da alternativa 158 ou 159, em que a composição de células T CAR compreende células autólogas.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0022] A FIG. 1 mostra o construto E2 vs. o construto 4M5.3 em diagrama e mostra um mapa do construto E2.
[0023] A FIG. 2 mostra uma dose fixa ECl7 e esquema de redução da dose.
[0024] As FIGS. 3A e 3B mostram atividade antitumoral de E2-CAR-T (30 milhões de células) com redução da dose de ECl17 e alterações no peso corporal. Como mostrado, a atividade antitumoral é mantida após o resgate de NaFL.
[0025] As FIGs. 4A e 4B mostram atividade antitumoral de 4M5.3-CAR-T (30 milhões de células) com redução da dose de EC17 e alterações de peso corporal. Como mostrado, 4M5.3-CAR- T foi menos ativo que E2-CAR-T. Além disso, foi observada atividade antitumoral dependente da dose de ECl7 e perda de peso corporal.
[0026] As FIGs. 5A e 5B mostram atividade antitumoral E2-CAR-T (10 e 20 milhões de células) e alterações de peso corporal em um regime de dosagem de EC17 fixo (500 nmol/kg SIW). Como mostrado, a atividade antitumoral foi mantida após o resgate de NaFL.
[0027] As FIGs. 6A e 6B mostram atividade antitumoral 4M5.3-CAR-T (10 e 20 milhões de células) e alterações no peso corporal em um regime de dosagem fixo de EC17 (500 nmol/kg SIW). Como mostrado, 4M5.3-CAR-T foi menos ativo que E2-CAR- T.
[0028] As FIGs. 7A e 7B mostram a caracterização fenotípica de células T E2 CAR antes da infusão em camundongos NSG.
[0029] As FIGS. 8A e 8B mostram a comparação de fenótipos de diferenciação de CAR-T em diferentes preparações, incluindo células E2-CAR-T e células 4M5.3-CAR- T, e células GFP + 4M5.3 CAR-T.
[0030] As FIGsS. 9A e 9B mostram ligação de E2-IgG marcada com DIG a FITC.
[0031] As FIGs. 10A e 10B mostram coloração IHC do anticorpo E2 marcado com DIG em células KB marcadas com FIT.
[0032] A FIG. 11 mostra a coloração por IHC do anticorpo DIG-E2 ligado em tecidos normais de órgãos humanos: Glândula adrenal. Painel A: teste de seção de tecido pré- incubado com anticorpo DIG-E2; Painel B: seção de tecido de controle sem pré-incubação com anticorpo DIG-E2.
[0033] A FIG. 12 mostra a coloração por IHC do anticorpo DIG-E2 ligado em tecidos normais de órgãos humanos: Medula óssea. Painel A: teste de seção de tecido pré-incubado com anticorpo DIG-E2; Painel B: seção de tecido de controle sem pré-incubação com anticorpo DIG-E2.
[0034] A FIG. 13 mostra a coloração por IHC do anticorpo DIG-E2 ligado em tecidos normais de órgãos humanos: Mama. Painel A: teste de seção de tecido pré-incubado com anticorpo DIG-E2; Painel B: seção de tecido de controle sem pré-incubação com anticorpo DIG-E2.
[0035] A FIG. 14 mostra a coloração por IHC do anticorpo DIG-E2 ligado em tecidos normais de órgãos humanos: Tecido cerebelar. Painel A: teste de seção de tecido pré- incubado com anticorpo DIG-E2; Painel B: seção de tecido de controle sem pré-incubação com anticorpo DIG-E2.
[0036] A FIG. 15 mostra a coloração por IHC do anticorpo DIG-E2 ligado em tecidos normais de órgãos humanos: Colo do útero. Painel A: teste de seção de tecido pré- incubado com anticorpo DIG-E2; Painel B: seção de tecido de controle sem pré-incubação com anticorpo DIG-E2.
[0037] A FIG. 16 mostra a coloração por IHC do anticorpo DIG-E2 ligado em tecidos normais de órgãos humanos: Cólon. Painel A: teste de seção de tecido pré-incubado com anticorpo DIG-E2; Painel B: seção de tecido de controle sem pré-incubação com anticorpo DIG-E2.
[0038] A FIG. 17 mostra a coloração por IHC do anticorpo DIG-E2 ligado em tecidos normais de órgãos humanos: Esôfago. Painel A: teste de seção de tecido pré-incubado com anticorpo DIG-E2; Painel B: seção de tecido de controle sem pré-incubação com anticorpo DIG-E2.
[0039] A FIG. 18 mostra a coloração por IHC do anticorpo DIG-E2 ligado em tecidos normais de órgãos humanos: Olho. Painel A: teste de seção de tecido pré-incubado com anticorpo DIG-E2; Painel B: seção de tecido de controle sem pré-incubação com anticorpo DIG-E2.
[0040] A FIG. 19 mostra a coloração por IHC do anticorpo DIG-E2 ligado em tecidos normais de órgãos humanos: Coração. Painel A: teste de seção de tecido pré-incubado com anticorpo DIG-E2; Painel B: seção de tecido de controle sem pré-incubação com anticorpo DIG-E2.
[0041] A FIG. 20 mostra a coloração por IHC do anticorpo DIG-E2 ligado em tecidos normais de órgãos humanos:
Hipófise. Painel A: teste de seção de tecido pré-incubado com anticorpo DIG-E2; Painel B: seção de tecido de controle sem pré-incubação com anticorpo DIG-E2.
[0042] A FIG. 21 mostra a coloração por IHC do anticorpo DIG-E2 ligado em tecidos normais de órgãos humanos: Rim. Painel A: teste de seção de tecido pré-incubado com anticorpo DIG-E2; Painel B: seção de tecido de controle sem pré-incubação com anticorpo DIG-E2.
[0043] A FIG. 22 mostra a coloração por IHC do anticorpo DIG-E2 ligado em tecidos normais de órgãos humanos: Laringe. Painel A: teste de seção de tecido pré-incubado com anticorpo DIG-E2; Painel B: seção de tecido de controle sem pré-incubação com anticorpo DIG-E2.
[0044] A FIG. 23 mostra a coloração por IHC do anticorpo DIG-E2 ligado em tecidos normais de órgãos humanos: Baço. Painel A: teste de seção de tecido pré-incubado com anticorpo DIG-E2; Painel B: seção de tecido de controle sem pré-incubação com anticorpo DIG-E2.
[0045] A FIG. 24 mostra a coloração por IHC do anticorpo DIG-E2 ligado em tecidos normais de órgãos humanos: Fígado. Painel A: teste de seção de tecido pré-incubado com anticorpo DIG-E2; Painel B: seção de tecido de controle sem pré-incubação com anticorpo DIG-E2.
[0046] A FIG. 25 mostra a coloração por IHC do anticorpo DIG-E2 ligado em tecidos normais de órgãos humanos: Pulmão. Painel A: teste de seção de tecido pré-incubado com anticorpo DIG-E2; Painel B: seção de tecido de controle sem pré-incubação com anticorpo DIG-E2.
[0047] A FIG. 26 mostra a coloração por IHC do anticorpo DIG-E2 ligado em tecidos normais de órgãos humanos: Linfonodo. Painel A: teste de seção de tecido pré-incubado com anticorpo DIG-E2; Painel B: seção de tecido de controle sem pré-incubação com anticorpo DIG-E2.
[0048] A FIG. 27 mostra a coloração por IHC do anticorpo DIG-E2 ligado em tecidos normais de órgãos humanos: Nervo. Painel A: teste de seção de tecido pré-incubado com anticorpo DIG-E2; Painel B: seção de tecido de controle sem pré-incubação com anticorpo DIG-E2.
[0049] A FIG. 28 mostra a coloração por IHC do anticorpo DIG-E2 ligado em tecidos normais de órgãos humanos: Ovário. Painel A: teste de seção de tecido pré-incubado com anticorpo DIG-E2; Painel B: seção de tecido de controle sem pré-incubação com anticorpo DIG-E2.
[0050] A FIG. 29 mostra a coloração por IHC do anticorpo DIG-E2 ligado em tecidos normais de órgãos humanos: Pâncreas. Painel A: teste de seção de tecido pré-incubado com anticorpo DIG-E2; Painel B: seção de tecido de controle sem pré-incubação com anticorpo DIG-E2.
[0051] A FIG. 30 mostra a coloração por IHC do anticorpo DIG-E2 ligado em tecidos normais de órgãos humanos: Próstata. Painel A: teste de seção de tecido pré-incubado com anticorpo DIG-E2; Painel B: seção de tecido de controle sem pré-incubação com anticorpo DIG-E2.
[0052] A FIG. 31 mostra a coloração por IHC do anticorpo DIG-E2 ligado em tecidos normais de órgãos humanos: Pele. Painel A: teste de seção de tecido pré-incubado com anticorpo DIG-E2; Painel B: seção de tecido de controle sem pré-incubação com anticorpo DIG-E2.
[0053] A FIG. 32 mostra a coloração por IHC do anticorpo DIG-E2 ligado em tecidos normais de órgãos humanos: Intestino delgado. Painel A: teste de seção de tecido pré- incubado com anticorpo DIG-E2; Painel B: seção de tecido de controle sem pré-incubação com anticorpo DIG-E2.
[0054] A FIG. 33 mostra a coloração por IHC do anticorpo DIG-E2 ligado em tecidos normais de órgãos humanos: Estômago. Painel A: teste de seção de tecido pré-incubado com anticorpo DIG-E2; Painel B: seção de tecido de controle sem pré-incubação com anticorpo DIG-E2.
[0055] A FIG. 34 mostra a coloração por IHC do anticorpo DIG-E2 ligado em tecidos normais de órgãos humanos: Músculo estriado. Painel A: teste de seção de tecido pré- incubado com anticorpo DIG-E2; Painel B: seção de tecido de controle sem pré-incubação com anticorpo DIG-E2.
[0056] A FIG. 35 mostra a coloração por IHC do anticorpo DIG-E2 ligado em tecidos normais de órgãos humanos: Testículo. Painel A: teste de seção de tecido pré-incubado com anticorpo DIG-E2; Painel B: seção de tecido de controle sem pré-incubação com anticorpo DIG-E2.
[0057] A FIG. 36 mostra a coloração por IHC do anticorpo DIG-E2 ligado em tecidos normais de órgãos humanos: Glândula timo. Painel A: teste de seção de tecido pré- incubado com anticorpo DIG-E2; Painel B: seção de tecido de controle sem pré-incubação com anticorpo DIG-E2.
[0058] A FIG. 37 mostra a coloração por IHC do anticorpo DIG-E2 ligado em tecidos normais de órgãos humanos: Língua. Painel A: teste de seção de tecido pré-incubado com anticorpo DIG-E2; Painel B: seção de tecido de controle sem pré-incubação com anticorpo DIG-E2.
[0059] A FIG. 38 mostra a coloração por IHC do anticorpo DIG-E2 ligado em tecidos normais de órgãos humanos: Útero. Painel A: teste de seção de tecido pré-incubado com anticorpo DIG-E2; Painel B: seção de tecido de controle sem pré-incubação com anticorpo DIG-E2.
[0060] A FIG. 39 é um gráfico que mostra a ativação de células T em coculturas de um dia com várias células-alvo. O percentual de células T CAR E2 que são ativadas após a cocultura de um dia (eixo y) é representada graficamente em relação ao nível de expressão FR das células alvo no momento do ensaio (eixo x). (VW) células OV90; (+) células SKOV3; (A) células IGROV1; (NM) células HOS-Fra; (*) células MDA-MB-231.
[0061] A FIG. 40 é um gráfico que mostra a apoptose das células alvo na cocultura de 2 dias com os 5 tipos de células diferentes (células OV90; células SKOV3; células IGROVI1; células HOS-Fr; células MDA-MB-231) sob três condições diferentes. Para cada tipo de célula, as condições são as seguintes: As células alvo da barra à esquerda sozinhas + EC17; Barra central T CAR mais coculturas de células alvo sem pré-tratamento EC17; Barra à direita células T CAR alvo mais tratadas com pré-tratamento com EC17.
[0062] A FIG. 41 é um gráfico que mostra os níveis de expressão do receptor de folato funcional em 5 tipos de células diferentes (células OV90; células SKOV3; células IGROV1; células HOS-Fra; células MDA-MB-231).
[0063] A FIG. 42 é um desenho animado mostrando a linha do tempo experimental para camundongos portadores de tumor e ingênuos.
[0064] A FIG. 43 (painel à esquerda) é um gráfico que mostra que os níveis de citocina IFN-VY eram dependentes de EC-17 em camundongos ingênuos e portadores de tumor, e que o aumento do IFN-Y era muito menor em camundongos ingênuos em comparação com camundongos portadores de tumores MDA-MB-231 (23 vezes menor). A FIG. 43 (painel à direita) é um gráfico que mostra a expansão CAR-T da análise FACS em camundongos portadores de tumores MDA-MB-231l e nenhuma expansão de células CAR-T detectável em camundongos ingênuos.
[0065] A FIG. 44 (painel superior) é um gráfico que mostra a produção de citocina (IL-2) a partir de células T Mock e anti-FLCAR em níveis quantitativamente semelhantes em cocultura com a linhagem de células de controle positivo K562-OKT3 (par de barras à esquerda, onde Mock é a barra à esquerda e as células anti-FLCAR T20 é a barra direita); nenhuma citocina foi produzida pelas células T Mock ou anti- FLCAR após a cocultura com K562 (meio); e as células T anti- FLCAR foram as únicas células capazes de provocar a secreção da citocina IL-2, mas apenas com o pré-tratamento da EC-17 (à direita, onde apenas as células T anti-FLCAR mostram um resultado). A FIG. 44 (painel do meio) é um gráfico que mostra a produção de citocinas (IFN-VY) a partir de células T
Mock e células T anti-FLCAR em níveis quantitativamente semelhantes em cocultura com a linhagem de células de controle positivo K562-OKT3 (par de barras á esquerda, onde Mock é a barra á esquerda e células T anti-FLCAR é a barra á direita); nenhuma citocina foi produzida por células T Mock ou anti-FLCAR após a cocultura com K562 (meio); e as células T anti-FLCAR foram as únicas células capazes de induzir a secreção da citocina IFN-VY, mas apenas com o pré-tratamento de EC-17 (à direita, onde apenas as células T anti-FLCAR mostram um resultado). A FIG. 44 (painel inferior) é um gráfico que mostra a produção de citocinas (TNF-a) a partir de células T Mock e células T anti-FLCAR em níveis quantitativamente semelhantes em cocultura com a linhagem de células de controle positivo K562-OKT3 (par de barras à esquerda, onde Mock é a barra à esquerda e as células T anti- FLCAR são a barra à direita); nenhuma citocina foi produzida por células T Mock ou anti-FLCAR após a cocultura com K562 (meio); e as células T anti-FLCAR foram as únicas células capazes de induzir a secreção da citocina TNF-a, mas apenas com o pré-tratamento de EC-17 (á direita, onde apenas as células T anti-FLCAR mostram um resultado). A FIG. 45 (canto superior à esquerda) é um gráfico que mostra a lise percentual quando as células T CD8 + Mock e as células T anti-FLCAR são cocultivadas com células K562 de controle negativo na proporção de 30: 1, 10: 1, 3: 1 ou 1: 1
[0066] A FIG. 45 (canto superior á direita) é um gráfico que mostra o percentual de lise quando as células T CD8 + Mock e as células T anti-FLCAR são cocultivadas com células alvo K562 + OKT3 em uma proporção de 30: 1, 10: 1, 3: 1 ou 1: l1. A FIG. 45 (inferior á esquerda) é um gráfico que mostra o percentual de lise quando células T CD8 + Mock e células T anti-FLCAR são cocultivadas com células MDA-MB-231 não marcadas em uma proporção de 30: 1, 10: 1, 3: 1 ou 1: 1. A FIG. 45 (canto inferior à direita) é um gráfico mostrando o percentual de lise quando as células T CD8 + Mock e as células T anti-FLCAR são cocultivadas com células MDA-MB-231 marcadas com ECl7 na proporção de 30: 1, 10: 1, 3: 1 ou 1: 1. Em todos os gráficos, (x) células T CD8 + Mock; (0) células T anti-FLCAR. A FIG. 46 (superior) mostra a estrutura química do folato de FITC.
[0067] A FIG. 46 (inferior) é um gráfico que mostra a curva de resposta à dose para folato de FITC. A FIG. 47 (superior) mostra a estrutura química do FITC-DUPA.
[0068] A FIG. 47 (inferior) é um gráfico que mostra a curva de resposta à dose para o FITC-DUPA. A FIG. 48 (superior) mostra a estrutura química do FITC-CA9.
[0069] A FIG. 48 (inferior) é um gráfico que mostra a curva de resposta à dose para o FITC-CA9. A FIG. 49 (superior) mostra a estrutura química do FITC-NKIR.
[0070] A FIG. 49 (superior) mostra a estrutura química do FITC-NKIR.
[0071] A FIG. 50 mostra a ligação (por análise FACS) de pontes para as células tumorais usadas em um modelo in vivo e expressando o receptor correspondente ao ligante de molécula pequena da ponte.
[0072] A FIG. 51 mostra a indução ECl7 de uma potente morte de células tumorais dependentes de FR por células T CAR.
[0073] A FIG. 52 mostra a correlação da atividade citolítica das células T CAR com os níveis funcionais de FR nas células tumorais.
[0074] A FIG. 53 mostra a ativação e a exaustão de células T CAR dependentes de EC1I7/FR. A expressão de marcadores de ativação de células T precoces (CD69), intermediárias (CD1l37) e tardias (PDl) detectadas em células T CAR cocultivadas (E/T = 1:1) com células tumorais FR+ alvos pré-carregadas sem ou com ECl17 (pulso de 100 nM, 30 min a 37ºC). As duas primeiras barras abertas representam células T transduzidas por CAR-T e Mock apenas sem células alvo.
[0075] A FIG. 54 mostra os perfis de exaustão de células T dependentes de EC17/FR. Linha superior: Gráficos de setores circulares coloridos que representam a mudança no status de diferenciação de células CAR-T em cultura sem células alvo nos dias 0-3. Linha inferior: Quatro conjuntos de gráficos coloridos representando o status de diferenciação de células CAR-T após 3 dias de cocultura (E/T = 1: 2) com FR+ (MDA-MB- 231, THP-1FRb, HOS-FRa, KB) e células tumorais FR-negativas (THP1-FG12, HOS-143b) pré-carregadas sem ou com EC17 (0,1 ou 10 nM, pulso de 30 minutos a 37ºC).
[0076] A FIG. 55 mostra um construto CAR totalmente humano composto de anti-FITC scFv (clone E2), um espaçador IgG4 de comprimento completo (Fc derivado de dobradiça-CH2 (L235D, N2970Q)-CH3), domínio transmembranar CD28tm, domínios de ativação citoplasmática 4-1BB/CD36, e um polipeptídeo não funcional da superfície celular truncada do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFRt). Inferior: Exemplos de fenotipagem de células T CD4/CD8 realizadas por citometria de fluxo em uma preparação de células T CAR classificada por EGFRt (gráficos de pizza à esquerda) e um “fac-símile clínico” não classificado (gráficos de pizza à direita). As teclas coloridas são as mostradas.
[0077] A FIG. 56, Painel A: Valores de Kd da captação de 3H-EC17 pelas células alvo FR+ após uma incubação de 2 horas a 37ºC (calculada a partir do número de moléculas ligadas por célula). Painel B: Valor de Kd de captação de 3H- EC17 pelas células E2-CAR-T (- 24% EGFRt +, proporção CD8/CD4 - 95: 5) após uma incubação de 2 horas em temperatura ambiente (calculado a partir da radioatividade total associada à célula, DPM).
[0078] A FIG. 57 (painéis A e B) mostram a escala de classificação de CRS e as condições experimentais aplicadas ao resgate de fluoresceína de sódio em camundongos portadores de tumor HOS-FRa. São mostradas alterações nas citocinas derivadas de células T com e sem resgate. Os valores de p foram calculados pelo teste t de Student.
[0079] A FIG. 58 mostra os níveis funcionais de FR nas células tumorais medidos por um ensaio de ligação à base de 3H-FA (ácido fólico) (100 nM, 1 hora a 37ºC).
[0080] A FIG. 59 mostra (Painel A) resposta de dose completa de ECl7 em lise específica (%) de linhagens de células 5 FR (receptor de folato)+ tumorais cocultivadas com células T CAR classificadas com EGFRt por 24 horas a uma proporção 1:1 E/T (efetor/alvo); (painel B) os valores máximos de lise (%) e EC50 foram obtidos a partir das curvas dose-resposta ajustadas até 100 nM.
[0081] A FIG. 60 mostra a correlação da atividade das células T CAR com os níveis de FR e a sensibilidade natural das células tumorais. Painel A: Cinética de lise específica (%) em diferentes proporções E/T em linhagens de células FR+ (MDA-MB-231, KB, THPI-FRbL, OV90, HOS-FRa) e FR- negativas (HOS-143b) após 16 e 48 horas de cocultura na presença de 10 nM de EC17. Painel B: Lise específica (%) das células alvo plotadas contra uma escala linear de proporções E/T. As células KB FR+ altas demonstraram resistência precoce em 16 horas, enquanto o HOS-l143b FR-negativo não respondeu. Painel C: Excluindo as células KB, foi estabelecida uma correlação semi-logarítmica entre a lise específica (%) em 16 horas de cocultura e os níveis funcionais de FR nas células tumorais. Painel D: Diagramas em 3D que descrevem as relações entre os níveis de citocinas Thl derivadas de células T CAR (IFNg, IL- 2 e TNFa) após 44 horas de cocultura a 10 nM EC17 com proporções E/T variáveis. Painel E: Níveis de citocinas Thl derivadas de células T CAR representadas graficamente contra os níveis de FR da célula alvo FR+ em uma escala Logl0.
[0082] A FIG. 61 mostra (painel A) o gráfico de barras para mostrar o status de carregamento de ECl7 das células alvo confirmado por citometria de fluxo e expresso como MFI (ECl7 era indetectável em linhagens de células FR-negativas)
e (painel B) apoptose de células alvo (%) detectada pela coloração Anexina V após 2 dias de cocultura, conforme descrito na Figura 54.
[0083] A FIG. 62 mostra a farmacocinética e a captação de tumor de células T CAR in vivo. Painel A: Diagrama esquemático do layout experimental para mostrar o cronograma de coleta de animais em relação à injeção de células T CAR e doses semanais de EC17 (500 nmol /kg) em camundongos portadores de tumor MDA-MB-231l. Um total de 15 camundongos recebeu -4,8 milhões de células T CAR classificadas com EGFRt no dia O (três camundongos tinham grandes tumores para começar). Painel B: Painel à esquerda mostrando medidas do volume do tumor e alteração no peso corporal; Gráfico médio mostrando expansão das células T CAR no sangue 7 dias após uma dose única de EC17; Gráfico de barras à direita mostrando perfis de diferenciação de subconjuntos de células T CD4/CD8 circulantes em camundongos com tumores pequenos e maiores. Painel C: Medições de mudança no volume do tumor e peso corporal. Painel D: Gráfico superior mostrando a cinética das células T CAR no sangue (linha sólida) versus tumor (linha pontilhada). Gráfico de barras inferior mostrando alterações nos fenótipos das células T CAR no sangue. Painel E: Alterações cinéticas na expressão superficial de marcadores de ativação (4-1BB, PDl) em células T CAR infiltradas em tumores.
[0084] A FIG. 63 mostra o efeito do folato na dieta sobre a atividade antitumoral e a toxicidade da SRC. Painel A: Medições da mudança no volume tumoral e no peso corporal de camundongos NSG xenoenxertados com grandes tumores MDA-MB- 231 e tratados com células T CAR (- 10 milhões de “fac-símile clínico”) mais EC17 SIW a 500 nmol/kg enquanto são mantidos em dieta completa com FA ou deficiente em AF ao longo do estudo (n = 5). Painel B: Gráfico de barras para mostrar as células T CAR circulantes (CD3e + EGFRt + humano) medidas no final do estudo no dia 52 (deficiente em FA) e no dia 59 (repleto de FA), respectivamente. Painel C: Gráficos de pontos citométricos de fluxo representativos para mostrar uma ausência de células T CAR circulantes em camundongos com deficiência de FA tratados apenas com células T CAR (sem EC17) e número elevado de células T CAR circulantes em camundongos tratados com células T CAR mais ECl7 em dieta deficiente em FA em comparação com camundongos tratados de forma idêntica, mas em dieta repleta de FA. Painel D: A perda de expressão de FR foi detectada em 2 de 3 tumores MDA-MB-231 coletados no dia 59 de animais repletos de FA e analisados por citometria de fluxo (posteriormente confirmada por um ensaio de ligação de radioligante quantitativo, dados não mostrados).
DEFINIÇÕES
[0085] Conforme usado neste documento, “um” ou “uma” pode significar um ou mais. Como usado aqui, “cerca de” em relação a um valor numérico, incluindo, por exemplo, números inteiros, frações e percentual, geralmente se refere a uma faixa de valores numéricos (por exemplo, +/- 5% a 10% do valor mencionado) que um técnico especialista no assunto consideraria equivalente ao valor mencionado (por exemplo, tendo a mesma função ou resultado).
[0086] Conforme usado neste documento, os termos “tratar”, “tratando”, “tratado” ou “tratamento” se referem tanto ao tratamento terapêutico quanto ao tratamento profilático ou preventivo.
[0087] Tal como aqui utilizado, os termos “melhorar”, “melhorando”, “amenizar” ou “amenizando” em referência ao câncer podem significar reduzir os sintomas do câncer, reduzir o tamanho de um tumor, remover completamente ou parcialmente o tumor (por exemplo, uma resposta completa ou parcial), causando doença estável, impedindo a progressão do câncer (por exemplo, sobrevida livre de progressão) ou qualquer outro efeito sobre o câncer que seria considerado por um médico como terapêutico, profilático ou tratamento preventivo do câncer.
[0088] Como usado aqui, os termos “administrar”, “administrando” ou “administrado” significam todos os meios de introdução do composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ou a composição de células T CAR, em que a composição de células T CAR compreende células T e em que O CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 para o paciente, incluindo, entre outros, oral, intravenoso, intramuscular, subcutâneo e transdérmico.
[0089] Como usado aqui, o termo “toxicidade fora do alvo” significa dano aos órgãos ou uma redução no peso do paciente que é inaceitável para o médico que trata o paciente ou qualquer outro efeito no paciente que é inaceitável para o médico que trata o paciente, por exemplo, aplasia de células B, febre, queda da pressão arterial ou edema pulmonar.
[0090] Como usado aqui, os termos “transdução” e “transfecção” são usados equivalentemente e os termos significam a introdução de um ácido nucleico em uma célula por qualquer método artificial, incluindo métodos virais e não virais.
DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES ILUSTRADAS
[0091] Nas várias modalidades descritas aqui, um ligante de molécula pequena ligado a uma fração alvo por um ligante é usado como uma ponte entre um câncer e células T CAR (isto é, células T expressando um receptor de antígeno quimérico), em que as células T CAR compreendem um CAR geneticamente modificado direcionado para a fração alvo, em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2. A ponte direciona as células T CAR para o câncer para a melhoria do câncer. Em uma modalidade, o “ligante de molécula pequena” pode ser um folato, um ligante CAIX, DUPA, um ligante NK-1IR, um ligante de gama glutamil transpeptidase, um ligante NKG2D ou um ligante CCK2R, cada um dos quais uma molécula pequena ligante que se liga especificamente a um tipo de célula cancerígena (ou seja, o receptor de cada um desses ligantes é sobre-expressado nos cânceres em comparação aos tecidos normais).
[0092] A “fração de direcionamento” ligada ao ligante de molécula pequena se liga à região de reconhecimento do CAR geneticamente modificada expressa por células T CAR, em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2. Consequentemente, a região de reconhecimento do CAR (por exemplo, uma região variável de fragmento de cadeia única (scFv) de um anticorpo antifluoresceína E2) é direcionada para a “fração alvo”. Assim, o ligante de molécula pequena ligado a uma fração de direcionamento por um ligante atua como uma ponte entre o câncer e as células T CAR, em que as células T CAR compreendem o CAR geneticamente modificado, direcionando as células T CAR para o câncer para melhoria do câncer.
[0093] A ponte é uma pequena molécula orgânica, para que a liberação da corrente sanguínea possa ser rapidamente alcançada (por exemplo, cerca de 20 minutos ou menos). Em um aspecto, a resposta da célula T CAR, em que as células T CAR compreendem um CAR geneticamente modificado compreendendo um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2, pode ser direcionada apenas às células cancerígenas que expressam um receptor para a fração de ligante de molécula pequena da 'ponte' reduzindo, assim, a toxicidade fora do alvo para os tecidos normais. Além disso, este sistema pode ser 'universal' porque um tipo de construto de célula T CAR, em que a célula T compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2, pode ser usado para atingir uma ampla variedade de cânceres usando diferentes 'pontes'. Ilustrativamente, a fração de direcionamento reconhecida pela célula CAR T, em que a célula T CAR compreende um CAR geneticamente modificado compreendendo um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2, pode permanecer constante para que um tipo de célula T CAR possa ser usada, enquanto aàa o ligante de molécula pequena que se liga ao câncer pode ser alterado para permitir o direcionamento de uma ampla variedade de cânceres.
[0094] Em várias modalidades aqui descritas, o ligante de molécula pequena ligado a uma fração de direcionamento por um ligante é referido como um “composto”. Em várias modalidades, a cláusula “fragmento de anticorpo antifluoresceíina E2” significa um CAR compreendendo um fragmento (por exemplo, um fragmento scFv) do anticorpo antifluoresceína E2. O anticorpo antifluoresceína E2 é descrito, por exemplo, em Vaughan, et al., Nature Biotechnol. Vol. 14 (3), PP. 309-314, 1996, aqui incorporado por referência. Em várias modalidades, o CAR pode ainda compreender um domínio de dobradiça IgG4, um domínio de ativação de CD36 e/ou um domínio de coestimulação de 4-1BB ou qualquer outro domínio adequado, como o domínio EGFRt. Ainda em outras modalidades, o CAR pode ser codificado por um polinucleotídeo com pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% identidade para SEQ ID NO: 1. Em outra modalidade ilustrativa, o CAR pode ser codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de alto rigor com um polinucleotídeo que possui a SEQ ID NO:
1. Em ainda outro aspecto, o CAR pode ser codificado por um polinucleotídeo tendo a SEQ ID NO: ll ou por uma variante degenerada da SEQ ID NO: l1. Em outras modalidades, a sequência de proteína CAR pode ter pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 2. Em ainda outra modalidade, a sequência da proteína CAR pode ter até cerca de 50 substituições de aminoácidos conservadoras. Em qualquer uma das modalidades aqui descritas, o CAR se liga a fluoresceína.
[0095] Em uma modalidade, é fornecido um método de tratamento de um câncer. O método compreende i) administrar a um paciente um composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto compreende um ligante de molécula pequena ligado a uma fração alvo por um ligante, ii) administrar ao paciente uma primeira dose de uma composição de células T CAR, em que a composição de células T CAR compreende células T CAR, em que as células T CAR compreendem um CAR e em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 e iii) administrar ao paciente uma segunda dose da composição de células T CAR em que a composição de células T CAR compreende células T CAR, em que as células T CAR compreendem um CAR e em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2.
[0096] Em outra modalidade, um método de tratamento de um câncer é fornecido. O método compreende i) administrar a um paciente um composto ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto compreende um ligante de molécula pequena ligado a uma fração alvo por um ligante e ii) administrar ao paciente uma composição de células T CAR compreendendo células T CAR, em que as células T CAR compreendem um CAR, em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 e em que a composição da célula T CAR compreende uma mistura das células T CAR e células T não transformadas.
[0097] Em ainda outra modalidade, é fornecido um método de tratamento de um câncer. O método compreende i) administrar a um paciente um composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto compreende um ligante de molécula pequena ligado a uma fração de direcionamento por um ligante, ii) administrar ao paciente uma composição de células T CAR em que a composição de células T CAR compreende células T CAR, em que as células T CAR compreendem um CAR, em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 e iii) administrar ao paciente um folato, um conjugado compreendendo um folato em que o conjugado compreendendo um folato não compreende uma fração de direcionamento ou um medicamento que inibe a ativação das células T CAR.
[0098] Em outra modalidade, é fornecido um método de tratamento de um câncer. O método compreende i) administrar a um paciente um composto ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto compreende um ligante de molécula pequena ligado a uma fração alvo por um ligante e em que o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado a uma dose de cerca de 10 nmoles/kg de peso corporal do paciente a cerca de 2500 nmoles/kg de peso corporal do paciente, e ii) administrar ao paciente uma composição de células T CAR compreendendo células T CAR, em que as células T CAR compreendem um CAR, em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 e em que as células T CAR estão em uma dose de cerca de 1 milhão de células T CAR a cerca de 15 milhões de células T CAR.
[0099] Ainda em outra modalidade, é fornecido um método de tratamento de um câncer. O método compreende 1) administrar continuamente a um paciente um composto, Ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto compreende um ligante de molécula pequena ligado a uma fração alvo por um ligante, ii) administrar ao paciente uma composição de células T CAR compreendendo CAR Células T em que as células T CAR compreendem um CAR, em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 e iii) terminar a administração contínua do composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para inibir ou prevenir a síndrome de liberação de citocina no paciente.
[00100] Em outro aspecto ilustrativo, é fornecido um método de tratamento de um câncer. O método compreende i) administrar a um paciente um composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto compreende um ligante de molécula pequena ligado a uma fração de direcionamento por um ligante, em que pelo menos uma primeira dose e uma segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, são administrados ao paciente, em que a primeira dose e a segunda dose são diferentes, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é cerca de 2 vezes a cerca de 15.000 vezes maior em quantidade que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e ii) administrar ao paciente uma composição de células T CAR compreendendo “células T CAR em que as células T CAR compreendem um CAR, em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2.
[00101] Em outra modalidade, é fornecido um método de tratamento de um câncer. O método compreende i) administrar a um paciente um composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto compreende um ligante de molécula pequena ligado a uma fração de direcionamento por um ligante e em que o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado uma vez por semana ao paciente, e ii) administrar ao paciente uma composição de células T CAR compreendendo células T CAR em que as células T CAR compreendem um CAR, em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2.
[00102] Em ainda outra modalidade, é fornecido um método de tratamento de um câncer. O método compreende i) administrar a um paciente uma primeira dose de um composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que oO composto compreende um ligante de molécula pequena ligado a uma fração alvo por um ligante, ii) administrar ao paciente pelo menos uma segunda dose do composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é pelo menos cerca de 50% menor em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e iii) administrar ao paciente uma dose de uma composição de células T CAR, compreendendo células T CAR, em que as células T CAR compreendem um CAR e em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2.
[00103] Diversas modalidades são descritas pelas seguintes cláusulas enumeradas. Qualquer uma das seguintes modalidades em combinação com quaisquer modalidades aplicáveis descritas na seção Resumo deste pedido de patente, na seção Descrição detalhada das modalidades ilustrativas, na seção Exemplos ou nas reivindicações deste pedido de patente, também são contempladas.
[00104] 1. Um método de tratamento de um câncer, oO método “compreendendo 1) administrar a um paciente um composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto compreende um ligante de molécula pequena ligado a uma fração alvo por um ligante; ii) administrar ao paciente uma primeira dose de uma composição de células T CAR, compreendendo células T CAR, em que as células T CAR compreendem um CAR direcionado para a fração alvo e em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2; e iii) administrar ao paciente uma segunda dose de uma composição de células T CAR compreendendo células T CAR, em que as células T CAR compreendem o CAR direcionado para a fração alvo e em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2.
[00105] 2. Um método de tratamento de um câncer, o método compreendendo i) administrar a um paciente um composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto compreende um ligante de molécula pequena ligado a uma fração alvo por um ligante; e ii) administrar ao paciente uma composição de células T CAR em que a composição de células T CAR compreende células T CAR, em que as células T CAR compreendem um CAR direcionado para a fração alvo em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 e em que a composição de células T CAR compreende uma mistura das células T CAR e células T não transformadas.
[00106] 3. Um método de tratamento de um câncer, o método compreendendo i) administrar a um paciente um composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto compreende um ligante de molécula pequena ligado a uma fração alvo por um ligante; ii) administrar ao paciente uma composição de células T CAR em que a composição de células T CAR compreende células T CAR em que as células T CAR compreendem um CAR direcionado à fração de direcionamento e em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2; e iii) administrar ao paciente um folato, um conjugado compreendendo um folato, em que o conjugado compreendendo um folato não compreende uma fração de direcionamento ou um agente que inibe a ativação das células T CAR.
[00107] 4. O método da cláusula 3, em que a etapa iii compreende a administração de um folato.
[00108] 5. O método de qualquer uma das cláusulas 3 ou 4, em que a etapa iii compreende a administração de ácido fólico ou leucovorina.
[00109] 6. O método da cláusula 3, em que a etapa iii compreende a administração o conjugado compreendendo um folato.
[00110] 7. O método da cláusula 6, em que o conjugado compreendendo um folato compreende um folato ligado a um ou mais aminoácidos.
[00111] 8. O método da cláusula 7, em que o conjugado que compreende um folato tem a fórmula com o cor o É : KH à ou o OA O N. o o HN Da N coH | H ss DP
HN N N
[00112] 9. O método de qualquer uma das cláusulas 3 a 8, em que o folato tem a fórmula x RR RR Mana AE DO SB *t É | ! Ms * AD x O
Y N U em que Xl e Yl são, cada um, independentemente selecionados do grupo que consiste em halo, R2, OR2, SR3, e NR4R5; U, V, e W representam frações bivalentes, cada um, independentemente selecionadas do grupo que consiste em - (R6a) C=, -N=, -(R6a)C(R7a)-, and -N(R4a)-; Q é selecionado a partir do grupo que consiste em C e CH; T é selecionado a partir do grupo que consiste em S, O, N, e -C=C-; X2 e X3 são, cada um, independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em oxigênio, enxofre, -C(Z)-, -C(2)O-, - OC(Z)-, -N(R4b)-, -C(Z)N(R4b)-, -N(R4b)C(Z)-, -OC(Z)N(R4b)-, -N(R4b)C (2) O-, -N(R4b) C (Z) N(R5b) -, -S(0)-, -S (0) 2-, - N(R4a) S(0)2-, -C(R6b)(R7b)-, -N(C=CH)-, -N(CH2C=CH)-, C1-C1l2 alquileno, e C1-Cl12 alquieneoxi, em que Z é oxigênio ou enxofre; R1 é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halo, C1-Cl12 alquil, e C1-C12 alcoxi; R2, R3, R4, R4a, R4b, R5, R5b, R6b, and R7b são, cada um, independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halo, C1-C12 alquil, C1-Cl12 alcoxi, C1l-Cl2 alcanoil, Cc1-C12 alquenil, c1-Cl12 alquinil, (C1-C12 alcoxi)carbonil, and (C1-Cl2 alquilamino)carbonil; R6 e R7 são, cada um, independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halo, C1-C12 alquil, e Cl- Cl2 alcoxi; ou, R6 e R7 são tomados em conjunto para formar um grupo carbonil; R6a e R7a são, cada um, independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halo, C1-Cl2 alquil, e C1-Cl2 alcoxi; ou R6a e R/a são tomados em conjunto para formar um grupo carbonil; p, r, S, e t são, cada um, independentemente ou 0 ou 1; e * representa uma ligação covalente ao resto do conjugado.
[00113] 10. O método da cláusula 3, em que o agente que inibe a ativação das células T CAR é administrado e é selecionado a partir do grupo que consiste em um inibidor de proteína tirosina quinase específico de linfócito, um inibidor de PI3 quinase, um inibidor de uma célula T induzível por IL-2 quinase, um inibidor de JAK, um inibidor de BTK, EC2319 e um agente que bloqueia a ligação de células T CAR ao composto ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, mas não se liga ao câncer.
[00114] 11. O método da cláusula 10, em que o agente que inibe a ativação das células T CAR é administrado e o agente é um inibidor da proteína tirosina quinase específica para linfócitos.
[00115] 12. O método da cláusula 11, em que o inibidor da proteína tirosina quinase específica de linfócitos é Dasatinibe.
[00116] 13. O método da cláusula 10, em que o agente que inibe a ativação das células T CAR é administrado e o agente é um inibidor da PI3 quinase.
[00117] 14. O método da cláusula 13, em que o inibidor da PI3 quinase é GDCO0980.
[00118] 15. O método da cláusula 10, em que o agente que inibe a ativação das células T CAR é administrado e o agente é um inibidor de quinase de células T induzível por IL-2.
[00119] 16. O método da cláusula 15 em que o inibidor de quinase de células T induzível por IL-2 é BMS-509744.
[00120] 17. Método, de acordo com a cláusula 10, em que o agente que inibe a ativação das células T CAR é administrado e é um agente que bloqueia a ligação das células T CAR ao composto ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, mas não se liga ao câncer.
[00121] 18. O método da cláusula 17, em que o agente é fluoresceinamina, FITC ou fluoresceína de sódio.
[00122] 19. O método da cláusula 18, em que o agente é FITC.
[00123] 20. O método da cláusula 18, em que o agente é fluoresceína de sódio.
[00124] 21. O método de qualquer uma das cláusulas 17 a 20, em que o agente que inibe a ativação das células T CAR é administrado a uma dose de cerca de 0,01 a cerca de 300 umoles/kg de peso corporal do paciente.
[00125] 22. O método de qualquer uma das cláusulas 17 a 20, em que o agente que inibe a ativação das células T CAR é administrado a uma dose de cerca de 0,06 a cerca de 100 umoles/kg de peso corporal do paciente.
[00126] 23. O método de qualquer uma das cláusulas 17 a 20, em que o agente que inibe a ativação das células T CAR é administrado a uma dose de cerca de 0,06 a cerca de 90 umoles/kg de peso corporal do paciente.
[00127] 24. O método de qualquer uma das cláusulas 17 a 20, em que o agente que inibe a ativação das células T CAR é administrado a uma dose de cerca de 0,06 a cerca de 80 umoles/kg de peso corporal do paciente.
[00128] 25. O método de qualquer uma das cláusulas 17 a 20, em que o agente que inibe a ativação das células T CAR é administrado a uma dose de cerca de 0,06 a cerca de 70 umoles/kg de peso corporal do paciente.
[00129] 26. O método de qualquer uma das cláusulas 17 a
20, em que o agente que inibe a ativação das células T CAR é administrado a uma dose de cerca de 0,06 a cerca de 60 umoles/kg de peso corporal do paciente.
[00130] 27. O método de qualquer uma das cláusulas 17 a 20, em que o agente que inibe a ativação das células T CAR é administrado a uma dose de cerca de 0,06 a cerca de 50 umoles/kg de peso corporal do paciente.
[00131] 28. O método de qualquer uma das cláusulas 17 a 20, em que o agente que inibe a ativação das células T CAR é administrado a uma dose de cerca de 0,06 a cerca de 40 umoles/kg de peso corporal do paciente.
[00132] 29. O método de qualquer uma das cláusulas 17 a 20, em que o agente que inibe a ativação das células T CAR é administrado a uma dose de cerca de 0,06 a cerca de 30 umoles/kg de peso corporal do paciente.
[00133] 30. O método de qualquer uma das cláusulas 17 a 20, em que o agente que inibe a ativação das células T CAR é administrado a uma dose de cerca de 0,06 a cerca de 20 umoles/kg de peso corporal do paciente.
[00134] 31. O método de qualquer uma das cláusulas 17 a 20, em que o agente que inibe a ativação das células T CAR é administrado a uma dose de cerca de 0,06 a cerca de 10 umoles/kg de peso corporal do paciente.
[00135] 32. O método de qualquer uma das cláusulas 17 a 20, em que o agente que inibe a ativação das células T CAR é administrado a uma dose de cerca de 0,06 a cerca de 8 umoles/kg de peso corporal do paciente.
[00136] 33. O método de qualquer uma das cláusulas 17 a 20, em que o agente que inibe a ativação das células T CAR é administrado a uma dose de cerca de 0,06 a cerca de 6 umoles/kg de peso corporal do paciente.
[00137] 34. O método de qualquer uma das cláusulas 3 a 33, em que mais do que uma dose é administrada ao paciente do folato, o conjugado compreendendo um folato em que o conjugado compreendendo um folato não compreende uma fração de direcionamento, ou o agente que inibe a ativação das células T CAR.
[00138] 35. O método de qualquer uma das cláusulas 3 a 34, em que o folato, o conjugado compreendendo um folato em que o conjugado compreendendo um folato não compreende uma fração alvo, ou o agente que inibe a ativação das células T CAR é administrado ao paciente antes e/ou após o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00139] 36. O método de qualquer uma das cláusulas 3 a 35, em que a administração do folato, o conjugado compreendendo um folato em que o conjugado compreendendo um folato não compreende uma fração alvo, ou o agente que inibe a ativação das células T CAR causa redução nos níveis de citocinas no paciente.
[00140] 37. O método da cláusula 36, em que a redução nos níveis de citocinas ocorre cerca de 3 horas após a administração ao paciente de folato, o conjugado compreendendo um folato em que o conjugado compreendendo um folato não compreende uma fração de direcionamento ou oO agente que inibe a ativação das células T CAR.
[00141] 38. O método da cláusula 36, em que a redução nos níveis de citocinas ocorre cerca de 6 horas após a administração ao paciente de folato, o conjugado compreendendo um folato em que o conjugado compreendendo um folato não compreende uma fração de direcionamento ou oO agente que inibe a ativação das células T CAR.
[00142] 39. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas 36 a 38, em que a redução nos níveis de citocinas é uma redução para cerca dos níveis de citocinas em um paciente não tratado.
[00143] 40. O método de qualquer uma das cláusulas 3 a 39, em que o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado antes e após a administração do folato, o conjugado compreendendo um folato em que o conjugado compreendendo um folato não compreende uma fração de direcionamento, ou o agente que inibe a ativação das células T CAR.
[00144] 41. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas 3 a 40, em que o número de células T CAR aumenta no sangue do paciente após a administração do folato, o conjugado compreendendo um folato, em que o conjugado compreendendo um folato não compreende uma fração de direcionamento ou o agente que inibe a ativação das células T CAR, embora os níveis de citocinas no paciente sejam reduzidos.
[00145] 42. O método de qualquer uma das cláusulas 3 a 41, em que a ativação das células T CAR é aprimorada ou mantida, em relação a um paciente não tratado com um agente de resgate, após administração do folato, o conjugado compreendendo um folato em que o conjugado compreendendo um folato não compreendem uma fração de direcionamento, ou oO agente que inibe a ativação das células T CAR, mesmo que os níveis de citocinas no paciente tratado sejam reduzidos.
[00146] 43. O método de qualquer uma das cláusulas 3 a 42, em que o câncer compreende um tumor e o tamanho do tumor no paciente não é aumentado quando o folato, o conjugado compreendendo um folato, em que o conjugado compreendendo um folato não compreende uma fração de direcionamento, ou oO agente que inibe a ativação das células T CAR é administrado ao paciente.
[00147] 44. O método da cláusula 43, em que é obtida uma resposta completa para o tumor.
[00148] 45. O método de qualquer uma das cláusulas 3 a 44, em que o folato, o conjugado compreendendo um folato em que o conjugado compreendendo um folato não compreende uma fração alvo, ou o agente que inibe a ativação das células T CAR, o agente que inibe a ativação das células T CAR são administrados ao paciente quando o grau de CRS atinge 1, 2, 3 ou 4.
[00149] 46. O método da cláusula 45, em que o agente que inibe a ativação das células T CAR é administrado ao paciente quando o grau de CRS atinge 3 ou 4.
[00150] 47. Método de qualquer uma das cláusulas 3 a 46, em que o edema pulmonar é reduzido.
[00151] 48. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 a 47, em que o composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado a uma dose de cerca de 10 nmoles/kg de peso corporal do paciente a cerca de 2500 nmoles/kg de peso corporal do paciente; e as células T CAR estão em uma dose de cerca de 1 milhão de células T CAR a cerca de 15 milhões de células T CAR.
[00152] 49. O método da cláusula 48, em que o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado a uma dose de cerca de 10 nmoles/kg a cerca de 100 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
[00153] 50. O método de qualquer uma das cláusulas 48 a 49, em que o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado a uma dose de cerca de 10 nmoles/kg a cerca de 50 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
[00154] 51. O método de qualquer uma das cláusulas 48 a 50, em que o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado a uma dose de cerca de 10 nmoles/kg a cerca de 20 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
[00155] 52. O método da cláusula 48, em que o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado a uma dose de cerca de 10 nmoles/kg a cerca de 600 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
[00156] 53. O método da cláusula 48, em que o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado a uma dose de cerca de 200 nmoles/kg a cerca de 600 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
[00157] 54. O método da cláusula 48, em que o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado a uma dose de cerca de 400 nmoles/kg a cerca de 600 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
[00158] 55. O método de qualquer uma das cláusulas 48 a 54, em que as células T CAR estão em uma dose de cerca de 1 milhão de células T CAR a cerca de 12,5 milhões de células T CAR.
[00159] 56. O método de qualquer uma das cláusulas 48 a 55, em que as células T CAR estão em uma dose de cerca de 1 milhão de células T CAR a cerca de 7 milhões de células T CAR.
[00160] 57. O método de qualquer uma das cláusulas 48 a 56, em que as células T CAR estão em uma dose de cerca de 1 milhão de células T CAR a cerca de 5 milhões de células T CAR.
[00161] 58. O método de qualquer uma das cláusulas 48 a 57, em que as células T CAR estão em uma dose de cerca de 2 milhão de células T CAR a cerca de 5 milhões de células T CAR.
[00162] 59. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 58, compreendendo ainda a etapa de terminar a administração contínua do composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para inibir ou prevenir a síndrome de liberação de citocina no paciente.
[00163] 60. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 59, em que o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado continuamente por pelo menos uma hora ao paciente.
[00164] 61. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 59, em que o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado continuamente por pelo menos quatro horas ao paciente.
[00165] 62. o Método de qualquer uma das cláusulas 1 a 59, em que o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado continuamente por pelo menos seis horas ao paciente.
[00166] 63. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 62, em que o composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado ao paciente em dias alternados.
[00167] 64. o método de qualquer uma das cláusulas 1 a 62, em que o composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado ao paciente três vezes por semana.
[00168] 65. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 62, em que o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado ao paciente duas vezes por semana.
[00169] 66. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 62, em que o composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado ao paciente uma vez por semana.
[00170] 67. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 62, em que o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado ao paciente até que ocorra uma perda inaceitável de peso corporal do paciente, febre, queda na pressão sanguínea ou edema pulmonar.
[00171] 68. Um método de tratamento de um câncer, oO método compreendendo i) administrar a um paciente um composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto compreende um ligante de molécula pequena ligado a uma fração de direcionamento por um ligante, em que pelo menos uma primeira dose e uma segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, são administrados ao paciente, em que a primeira dose e a segunda dose são diferentes, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é de cerca de 2 vezes até cerca de 15000 vezes maior em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; e ii) administrar ao paciente uma composição de células T CAR, compreendendo células T CAR, em que as células T CAR compreendem um CAR direcionado à fração alvo e em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2.
[00172] 69. O método da cláusula 68, em que pelo menos uma primeira dose, uma segunda dose e uma terceira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, são administradas ao paciente, em que a primeira dose, a segunda dose e a terceira dose são diferentes, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é cerca de 2 a 750 vezes maior em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e em que a terceira a dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é cerca de 800 vezes a cerca de 10000 vezes maior em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00173] 70. O método da cláusula 68, em que pelo menos uma primeira dose, uma segunda dose, uma terceira dose e uma quarta dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, são administradas ao paciente, em que a primeira dose, a segunda dose, a terceira dose e a quarta dose são diferentes, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é cerca de 2 vezes a cerca de 750 vezes maior em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o produto farmaceuticamente sal aceitável do mesmo, em que a terceira dose do composto, ou o seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico, é de cerca de 800 a 7500 vezes maior em quantidade do que a primeira dose do composto, OU O Seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico, e em que o à quarta dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é cerca de 8.000 a cerca de 15.000 vezes maior em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00174] 71. O método da cláusula 70, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é cerca de 100 vezes maior em quantidade do que a primeira dose do composto, ou oO sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que a terceira dose do composto , ou Oo sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é cerca de 1000 vezes maior em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e em que a quarta dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é de cerca de 10000 vezes em quantidade maior que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00175] 72. O método da cláusula 68, em que pelo menos uma primeira dose e uma segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, são administradas ao paciente, em que a primeira dose e a segunda dose são diferentes, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é cerca de 2 vezes a cerca de 15000 vezes maior em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00176] 73. Um método de tratamento de um câncer, oO método compreendendo 1) administrar a um paciente uma primeira dose de um composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto compreende um ligante de molécula pequena ligado a uma fração alvo por um ligante; ii) administrar ao paciente pelo menos uma segunda dose do composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é pelo menos cerca de 50 por cento menor em quantidade do que a primeira dose do composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; e iii) administrar ao paciente uma dose de uma composição de células T CAR compreendendo células T CAR, em que as células T CAR compreendem um CAR direcionado à fração de direcionamento e em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2.
[00177] 74. O método da cláusula 74, em que a segunda dose do composto, ou seu sal farmaceuticamente aceitável, é pelo menos cerca de 60 por cento menor em quantidade do que a primeira dose do composto, ou seu sal farmaceuticamente aceitável.
[00178] 75. O método da cláusula 74, em que a segunda dose do composto, ou seu sal farmaceuticamente aceitável, é pelo menos cerca de 70 por cento menor em quantidade do que a primeira dose do composto, ou seu sal farmaceuticamente aceitável.
[00179] 76. O método da cláusula 74, em que a segunda dose do composto, ou seu sal farmaceuticamente aceitável, é pelo menos cerca de 80 por cento menor em quantidade do que a primeira dose do composto, ou seu sal farmaceuticamente aceitável.
[00180] 77. O método da cláusula 74, em que a segunda dose do composto, ou seu sal farmaceuticamente aceitável, é pelo menos cerca de 90 por cento menor em quantidade do que a primeira dose do composto, ou seu sal farmaceuticamente aceitável.
[00181] 78. O método da cláusula 74, em que a segunda dose do composto, ou seu sal farmaceuticamente aceitável, é pelo menos cerca de 95 por cento menor em quantidade do que a primeira dose do composto, ou seu sal farmaceuticamente aceitável.
[00182] 79. O método da cláusula 74, em que a segunda dose do composto, ou seu sal farmaceuticamente aceitável, é pelo menos cerca de 96 por cento menor em quantidade do que a primeira dose do composto, ou seu sal farmaceuticamente aceitável.
[00183] 80. O método da cláusula 74, em que a segunda dose do composto, ou seu sal farmaceuticamente aceitável, é pelo menos cerca de 97 por cento menor em quantidade do que a primeira dose do composto, ou seu sal farmaceuticamente aceitável.
[00184] 81. O método da cláusula 74, em que a segunda dose do composto, ou seu sal farmaceuticamente aceitável, é pelo menos cerca de 98 por cento menor em quantidade do que a primeira dose do composto, ou seu sal farmaceuticamente aceitável.
[00185] 82. O método da cláusula 74, em que a segunda dose do composto, ou seu sal farmaceuticamente aceitável, é pelo menos cerca de 99 por cento menor em quantidade do que a primeira dose do composto, ou seu sal farmaceuticamente aceitável.
[00186] 83. O método da cláusula 74, em que a segunda dose do composto, ou seu sal farmaceuticamente aceitável, é pelo menos cerca de 99,5 por cento menor em quantidade do que a primeira dose do composto, ou seu sal farmaceuticamente aceitável.
[00187] 84. O método de qualquer uma das cláusulas 73 a 83, em que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é de cerca de 100 nmoles/kg a cerca de 1000 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
[00188] 85. O método de qualquer uma das cláusulas 73 a 83, em que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é de cerca de 100 nmoles/kg a cerca de 900 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
[00189] 86. O método de qualquer uma das cláusulas 73 a 83, em que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é de cerca de 100 nmoles/kg a cerca de 800 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
[00190] 87. O método de qualquer uma das cláusulas 73 a 83, em que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é de cerca de 100 nmoles/kg a cerca de 700 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
[00191] 88. O método de qualquer uma das cláusulas 73 a 83, em que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é de cerca de 100 nmoles/kg a cerca de 600 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
[00192] 89. O método de qualquer uma das cláusulas 73 a 83, em que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é de cerca de 200 nmoles/kg a cerca de 600 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
[00193] 90. O método de qualquer uma das cláusulas 73 a 83, em que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é de cerca de 400 nmoles/kg a cerca de 600 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
[00194] 91. O método de qualquer uma das cláusulas 73 a 83, em que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é de cerca de 500 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
[00195] 92. O método da cláusula 84, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é de cerca de 0,5 nmoles/kg a cerca de 500 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
[00196] 93. O método da cláusula 85, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é de cerca de 0,5 nmoles/kg a cerca de 450 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
[00197] 94. O método da cláusula 86, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é de cerca de 0,5 nmoles/kg a cerca de 400 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
[00198] 95. O método da cláusula 87, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é de cerca de 0,5 nmoles/kg a cerca de 350 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
[00199] 96. O método da cláusula 88, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é de cerca de 0,5 nmoles/kg a cerca de 300 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
[00200] 97. O método da cláusula 89, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é de cerca de 1 nmole/kg a cerca de 300 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
[00201] 98. O método da cláusula 90, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é de cerca de 2 nmoles/kg a cerca de 300 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
[00202] 99. O método da cláusula 91, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é de cerca de 2 nmoles/kg a cerca de 250 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
[00203] 100. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas 92 a 99, em que à segunda dose do composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é de cerca de 5 nmoles/kg a cerca de 40 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
[00204] 101. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas 92 a 99, em que a segunda dose do composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é de cerca de 40 nmoles/kg a cerca de 150 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
[00205] 102. O método de qualquer uma das cláusulas 73 a 101, compreendendo ainda administrar uma terceira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que a terceira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é a mesma que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00206] 103. O método da cláusula 102, compreendendo ainda a administração de uma quarta dose do composto, ou O sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que a quarta dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é a mesma que a segunda dose, ou o sal farmaceuticamente aceitável e a terceira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00207] 104. O método de qualquer uma das cláusulas 73 a 103, em que as doses do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, administradas após a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, mantêm a inibição do crescimento do câncer em relação à primeira dose do composto, ou ao sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00208] 105. O método de qualquer uma das cláusulas 73 a 104, em que as células T CAR são administradas a uma dose de cerca de 1 milhão de células T CAR a cerca de 40 milhões de células T CAR.
[00209] 106. O método de qualquer uma das cláusulas 73 a 105, em que as doses do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, administrados após a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, são administrados uma vez por semana.
[00210] 107. O método de qualquer uma das cláusulas 73 a 105, em que as doses do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, são administrados duas vezes por semana.
[00211] 108. O método de qualquer uma das cláusulas l1 a 107, em que o CAR compreende ainda um domínio de dobradiça de IgG4, um domínio de ativação de CD3C e um domínio de coestimulação 4-1BB.
[00212] 109. O método de qualquer uma das cláusulas l1 a 108, em que o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 é um fragmento scEFv.
[00213] 110. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 109, em que a proteína CAR tem pelo menos cerca de 90% de identidade com a SEQ ID NO: 2.
[00214] 111. O método de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 a 109, em que a proteína CAR tem pelo menos cerca de 95% de identidade com a SEQ ID NO: 2.
[00215] 112. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 109, em que a proteína CAR tem pelo menos cerca de 98% de identidade com a SEQ ID NO: 2.
[00216] 113. O método de qualquer uma das cláusulas l a 112, em que o CAR se liga a fluoresceína.
[00217] 114. O método de qualquer uma das cláusulas l1 a 109, em que a sequência da proteína CAR tem até cerca de 50 substituições conservadas de aminoácidos e em que o CAR se liga à fluoresceína.
[00218] 115. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 109, em que o CAR é codificado por um polinucleotídeo com pelo menos cerca de 90% de identidade com a SEQ ID NO: 1.
[00219] 116. O método de qualquer uma das cláusulas l a 109, em que o CAR é codificado por um polinucleotídeo com pelo menos cerca de 95% de identidade com a SEQ ID NO: 1.
[00220] 117. O método de qualquer uma das cláusulas 1 a 109, em que o CAR é codificado por um polinucleotídeo com pelo menos cerca de 98% de identidade com a SEQ ID NO: 1.
[00221] 118. O método de qualquer uma das cláusulas 115 a 117, em que o CAR se liga à fluoresceína.
[00222] 119. O método de qualquer uma das cláusulas l1 a 118, em que o CAR é codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de alto rigor com um polinucleotídeo com a SEQ ID NO: 1 e em que o CAR se liga à fluoresceína.
[00223] 120. O método de qualquer uma das cláusulas l1 a 119, em que o CAR é codificado por um polinucleotídeo que possui a SEQ ID NO: 1 ou por uma variante degenerada da SEQ ID NO: 1.
[00224] 121. O método de qualquer uma das cláusulas l a 120, em que o ligante é selecionado do grupo que consiste em um folato, DUPA, um ligante NK-1IR, um ligante CAIX, um ligante de gama glutamil transpeptidase, um ligante NKG2D e um ligante CCK2R.
[00225] 122. O método de qualquer uma das cláusulas l a 121, em que a fração alvo é a fluoresceína, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00226] 123. O método de qualquer uma das cláusulas l a 122, em que o ligante compreende polietilenoglicol (PEG), poliprolina, um aminoácido hidrofílico, um açúcar, um peptidoglicano não natural, uma polivinilpirrolidona, F-127 plurônico ou uma combinação dos mesmos.
[00227] 124. O método de qualquer uma das cláusulas l1 a 123, em que o ligante compreende PEG.
[00228] 125. O método de qualquer uma das cláusulas l a 124, em que o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, tem a fórmula B—L—T.
em que B representa o ligante de molécula pequena, L representa o ligante e T representa a fração de direcionamento, e em que L compreende uma estrutura com a fórmula n em que n é um número inteiro de O a 200.
[00229] 126. O método de qualquer uma das cláusulas l a 125, em que o câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer de pulmão, câncer ósseo, câncer de pâncreas, câncer de pele, câncer de cabeça, câncer de pescoço, melanoma cutâneo, melanoma intraocular, melanoma intraocular, câncer uterino, câncer de ovário, câncer de endométrio, câncer de reto, câncer de estômago, câncer de cólon, câncer de mama, câncer de mama triplo negativo, carcinoma das trompas de falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma do colo do útero, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, Doença de Hodgkin, câncer de esôfago, câncer de intestino delgado, câncer de sistema endócrino, câncer de glândula tireoide, câncer de glândula paratireoide, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de glândula adrenal, sarcoma de tecidos moles, osteossarcoma, câncer de uretra, câncer de próstata, leucemia crônica, leucemia aguda, leucemia mielocítica aguda, linfoma linfocítico, leucemia mieloide, leucemia mielomonocítica, leucemia de células pilosa, leucemia mielomonocítica, leucemia de células pilosa, mesotelioma pleural, câncer de bexiga, linfoma de Burkitt, câncer de ureter, câncer de rim, carcinoma de células renais, carcinoma de pelve renal, neoplasias do sistema nervoso central (SNC),
linfoma primário do SNC, tumores axiais da coluna vertebral, glioma do tronco encefálico, adenoma da hipófise e adenocarcinoma da junção gastroesofágica.
[00230] 127. O método de qualquer uma das cláusulas l a 126, em que o câncer é um receptor de folato que expressa câncer.
[00231] 128. O método de qualquer uma das cláusulas l a 127, em que o câncer é um câncer endometrial.
[00232] 129. O método de qualquer uma das cláusulas l1 a 127, em que o câncer é um câncer de pulmão de células não pequenas.
[00233] 130. O método de qualquer uma das cláusulas l a 127, em que o câncer é um câncer ovariano.
[00234] 131. O método de qualquer uma das cláusulas l a 127, em que o câncer é um câncer de mama triplo negativo.
[00235] 132. O método de qualquer uma das cláusulas l1 a 127, em que o câncer é leucemia mielocítica aguda.
[00236] 133. O método da cláusula 132, em que o câncer expressa o receptor de folato-fb.
[00237] 134. O método de qualquer uma das cláusulas l a 133, em que doses múltiplas da composição de células T CAR são administradas.
[00238] 135. O método de qualquer uma das cláusulas l1 a
134, em que pelo menos duas doses da composição de células T CAR são administradas.
[00239] 136. O método de qualquer uma das cláusulas l a 135, em que o paciente é imageado antes da administração do composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ou antes da administração da composição de células T CAR.
[00240] 137. O método de qualquer uma das cláusulas l a 136, em que o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, não é um anticorpo e não compreende um fragmento de um anticorpo.
[00241] 138. O método de qualquer uma das cláusulas l1 a 137, em que a fração de direcionamento não compreende um epítopo de peptídeo.
[00242] 139. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 a 138, em que a liberação de citocinas resultando em toxicidade fora do alvo no paciente não ocorre e em que ocorre toxicidade de células T CAR para o câncer.
[00243] 140. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 a 138, em que à toxicidade do tecido fora do alvo não ocorre no paciente e em que ocorre a toxicidade das células T CAR para o câncer.
[00244] 141. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 a 138, em que o câncer compreende um tumor, em que o tamanho do tumor é reduzido no paciente e em que não ocorre toxicidade fora do alvo.
[00245] 142. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 a 141, em que CRS é reduzida ou evitada e o método resulta em uma diminuição no volume do tumor no paciente.
[00246] 143. O método de qualquer uma das cláusulas l a 142, em que a perda de peso corporal devido à CRS é reduzida ou impedida.
[00247] 144. O método de qualquer uma das cláusulas 59 a 67, compreendendo ainda a readministração do composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ao paciente.
[00248] 145. O método da cláusula 144, em que a administração subsequente do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, causa a ativação de células T CAR e um aumento nos níveis de citocinas no paciente.
[00249] 146. O método de qualquer uma das cláusulas l a 145, em que Oo câncer compreende um tumor e em que é obtida uma resposta completa para o tumor.
[00250] 147. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 a 146, em que as células T CAR têm um fenótipo de memória central/memória efetora.
[00251] 148. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 a 147, em que a razão CD8: CD4 das células T CAR é de cerca de 1: 1.
[00252] Assim, em uma modalidade, é fornecido um método de tratamento de um câncer. O método compreende i) administrar a um paciente um composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto compreende um ligante de molécula pequena ligado a uma fração alvo por um ligante, ii) administrar ao paciente uma primeira dose de uma composição de células T CAR, em que a composição de células T CAR compreende células T CAR, em que as células T CAR compreendem um CAR e em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 e iii) administrar ao paciente uma segunda dose da composição de células T CAR em que a composição de células T CAR compreende células T CAR, em que as células T CAR compreendem um CAR e em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2.
[00253] Em outra modalidade, é fornecido um método de tratamento de um câncer. O método compreende i) administrar a um paciente um composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto compreende um ligante de molécula pequena ligado a uma fração de direcionamento por um ligante e ii) administrar ao paciente uma composição de células T CAR compreendendo células T CAR, em que as células T CAR compreendem um CAR, em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceíina E2 e em que a composição da célula T CAR compreende uma mistura das células T CAR e células T não transformadas.
[00254] Em ainda outra modalidade, um método de tratamento de um câncer é fornecido. O método compreende 1) administrar a um paciente um composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto compreende um ligante de molécula pequena ligado a uma fração de direcionamento por um ligante, ii) administrar ao paciente uma composição de células T CAR em que a composição de células T CAR compreende células T CAR, em que as células T CAR compreendem um CAR, em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 e iii) administrar ao paciente um folato, um conjugado compreendendo um folato em que o conjugado compreendendo um folato não compreende uma fração de direcionamento ou um medicamento que inibe a ativação das células T CAR.
[00255] Em outra modalidade, é fornecido um método de tratamento de um câncer. O método compreende i) administrar a um paciente um composto ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto compreende um ligante de molécula pequena ligado a uma fração alvo por um ligante e em que o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado a uma dose de cerca de 10 nmoles/kg de peso corporal do paciente a cerca de 2500 nmoles/kg de peso corporal do paciente, e ii) administrar ao paciente uma composição de células T CAR compreendendo células T CAR, em que as células T CAR compreendem um CAR, em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 e em que as células T CAR estão em uma dose de cerca de 1 milhão de células T CAR a cerca de 15 milhões de células T CAR.
[00256] Em ainda outra modalidade, é fornecido um método de tratamento de um câncer. O método compreende i) administrar continuamente a um paciente um composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto compreende um ligante de molécula pequena ligado a uma fração alvo por um ligante, ii) administrar ao paciente uma composição de células T CAR compreendendo CAR Células T em que as células T CAR compreendem um CAR, em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 e iii) terminar a administração contínua do composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para inibir ou prevenir a síndrome de liberação de citocina no paciente.
[00257] Em outro aspecto ilustrativo, é fornecido um método de tratamento de um câncer. O método compreende i) administrar a um paciente um composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto compreende um ligante de molécula pequena ligado a uma fração de direcionamento por um ligante, em que pelo menos uma primeira dose e uma segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, são administrados ao paciente, em que a primeira dose e a segunda dose são diferentes, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é cerca de 2 vezes a cerca de 15.000 vezes maior em quantidade que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e ii) administrar ao paciente uma composição de células T CAR compreendendo células T CAR em que as células T CAR compreendem um CAR, em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2.
[00258] Em outra modalidade, é fornecido um método de tratamento de um câncer. O método compreende i) administrar a um paciente um composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto compreende um ligante de molécula pequena ligado a uma fração de direcionamento por um ligante e em que o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado uma vez por semana ao paciente, e ii) administrar ao paciente uma composição de células T CAR compreendendo células T CAR em que as células T CAR compreendem um CAR, em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2.
[00259] Em ainda outra modalidade, um método de tratamento de um câncer é fornecido. O método compreende i) administrar a um paciente uma primeira dose de um composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que oO composto compreende um ligante de molécula pequena ligado a uma fração alvo por um ligante, ii) administrar ao paciente pelo menos uma segunda dose do composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é pelo menos cerca de 50% menor em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e iii) administrar ao paciente uma dose de uma composição de células T CAR, compreendendo células T CAR, em que as células T CAR compreendem um CAR e em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2.
[00260] Consequentemente, várias modalidades são fornecidas nos parágrafos anteriores e na lista de cláusulas acima, e todas as modalidades aplicáveis descritas nesta “Descrição Detalhada de Modalidades Ilustrativas”, a seção
Resumo, os Exemplos e as reivindicações aplicam-se a essas modalidades.
[00261] Como descrito aqui, um “paciente” pode ser humano ou, no caso de aplicações veterinárias, oO paciente pode ser um animal de laboratório, de agricultura, um animal doméstico ou um animal selvagem. Em vários aspectos, oO paciente pode ser um animal de laboratório, como um roedor (por exemplo, camundongo, rato, hamster, etc.), um coelho, um macaco, um chimpanzé, um animal doméstico, como um cachorro, um gato ou um coelho, um animal agrícola, como uma vaca, um cavalo, um porco, uma ovelha, uma cabra ou um animal selvagem em cativeiro, como um urso, um panda, um leão, um tigre, um leopardo, um elefante, uma zebra, uma girafa, um gorila, um golfinho ou uma baleia.
[00262] Em várias modalidades, o câncer a ser tratado pode ser selecionado a partir de um carcinoma, um sarcoma, um osteossarcoma, um linfoma, um melanoma, um mesotelioma, um carcinoma nasofaríngeo, uma leucemia, um adenocarcinoma ou um mieloma. Em outras modalidades, o câncer pode ser câncer de pulmão, câncer ósseo, câncer de pâncreas, câncer de pele, câncer de cabeça, câncer de pescoço, melanoma cutâneo, câncer uterino de melanoma intraocular, câncer de ovário, câncer de endométrio, câncer de reto, câncer de estômago, câncer de cólon, câncer de mama, câncer de mama triplo negativo, carcinoma das trompas de falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma de cólon, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, doença de Hodgkin, câncer do esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireoide, câncer da glândula paratireoide, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer da glândula adrenal, sarcoma de tecidos moles, osteossarcoma, câncer da uretra, câncer de próstata, leucemia crônica, leucemia aguda, incluindo leucemia mielocítica aguda, linfoma linfocítico, leucemia mieloide, leucemia —mielomonocítica, leucemia de células pilosas, mesotelioma pleural, câncer de bexiga, linfoma de Burkitt, câncer de mama e ureter, câncer de rim, carcinoma de células renais, carcinoma da pelve renal, uma neoplasia do sistema nervoso central (SNC), linfoma primário do SNC, um tumor do eixo espinhal, um glioma do tronco cerebral, um adenoma hipofisário e um adenocarcinoma da junção gastroesofágica.
[00263] Em alguns aspectos dessas modalidades, o câncer é um receptor de folato que expressa câncer. Em outra modalidade, o câncer é um câncer que expressa o receptor a de folato. Em ainda outra modalidade, o câncer é um câncer que expressa o receptor à de folato. Em alguns aspectos dessas modalidades, o câncer é um câncer endometrial, um câncer de pulmão de células não pequenas, um câncer de ovário ou um câncer de mama triplo negativo. Em outra modalidade, o câncer sendo tratado é um tumor. Em outra modalidade, o câncer é maligno. Em outra modalidade, o câncer é leucemia mielocítica aguda. Em ainda outra modalidade, o câncer é leucemia mielocítica aguda e o câncer expressa o receptor B de folato. Ainda em outra modalidade, o câncer é leucemia mielocítica aguda e as células T CAR têm um fenótipo de memória central/memória efetora. Em ainda outra modalidade, a razão CD8: CD4 das células T CAR é de cerca de 1: 1, cerca de uma razão de 1,2 para l, cerca de uma razão de 1 para 1,2, cerca de uma razão de 1,3 para l, cerca de uma razão de 1 para 1,3, cerca de uma razão de 1,4 para l, cerca de 1 para 1,4, cerca de 1,5 para 1 ou cerca de 1 para 1,5. Em outra modalidade, em que o câncer é leucemia mielocítica aguda ou outro câncer, as células T CAR associadas ao tumor podem ter expressão aumentada de CD25 em relação às células T CAR não associadas ao tumor.
[00264] Em uma modalidade, o “ligante de molécula pequena” pode ser um folato, DUPA (um ligante ligado por células cancerígenas da próstata humana positivas para PSMA e outros tipos de células cancerígenas), um ligante NK-1R
(receptores para NK-1R o ligante encontrado, por exemplo, em cânceres de cólon e pâncreas), um ligante CAIX (receptores para o ligante CAIX encontrados, por exemplo, em câncer renal, ovário, vulvar e de mama), um ligante de gama glutamil transpeptidase (a transpeptidase sobre-expressa, por exemplo, em câncer de ovário, câncer de cólon, câncer de fígado, gliomas astrocitários, melanomas e leucemias), um ligante NKG2D (receptores para oO ligante NKG2D encontrado, por exemplo, em câncer de pulmão, cólon, rim, próstata, e em linfomas de células T e B), ou um ligante CCK2R (receptores para o ligante CCK2R encontrado em cânceres de tireoide, pulmão, pâncreas, ovário, cérebro, estômago, estroma gastrointestinal e cólon, entre outros), cada um dos quais é um ligante de molécula pequena que se liga especificamente a um tipo de célula cancerígena (ou seja, o receptor (cada um desses ligantes pode ser sobre-expresso nos cânceres em comparação com os tecidos normais).
[00265] Em uma modalidade, o ligante de molécula pequena pode ter uma massa de menos de 10.000 Daltons, menos de cerca de 9.000 Daltons, menos de cerca de 8.000 Daltons, menos de cerca de 8.000 Daltons, menos de cerca de 7.000 Daltons, menos de cerca de 6000 Daltons, menos de cerca de 5.000 Daltons, menos de 4500 Daltons, menos de 4000 Daltons, menos de 3500 Daltons, menos de 3000 Daltons, menos de 2500 Daltons, menos de 2500 Daltons, menos de 2000 Daltons, menos de 2000 Daltons, menos de 1500 Daltons, menos de 1000 Daltons, ou menos do que cerca de 500 Daltons. Em outra modalidade, o ligante de molécula pequena pode ter uma massa de cerca de 1 a cerca de 10.000 Daltons, cerca de 1 a cerca de 9000 Daltons, cerca de 1 a cerca de 8.000 Daltons, cerca de 1 a cerca de 7000 Daltons, cerca de 1 a cerca de 6000 Daltons, cerca de |] a cerca de 5000 Daltons, cerca de l a cerca de 4500 Daltons, cerca de 1 a cerca de 4000 Daltons, cerca de 1 a cerca de 3500 Daltons, cerca de 1 a cerca de 3000 Daltons, cerca de l1 a cerca de 2500 Daltons, cerca de 1 a cerca de 2000 Daltons, cerca de 1 a cerca de 1500 Daltons, cerca de 1 a cerca de 1000 Daltons ou cerca de 1 a cerca de 500 Daltons.
[00266] Em uma modalidade, um derivado DUPA pode ser o ligante do ligante de molécula pequena ligada a uma fração de direcionamento, e derivados DUPA são descritos no documento WO 2015/057852, aqui incorporado por referência.
[00267] Em uma modalidade, o ligante de molécula pequena no contexto do “ligante de molécula pequena ligado a um ligante” é um folato. Em várias modalidades, o folato pode ser ácido fólico, um análogo do ácido fólico Ou outra molécula de ligação ao receptor de folato. Em várias modalidades, os análogos de folato que podem ser usados incluem ácido folínico, ácido pteropoliglutâmico e pteridinas de ligação ao receptor de folato, como tetra-hidropterinas, di-hidrofolatos, tetra-hidrofolatos e seus análogos de deaza e dideaza. Os termos análogos de “deaza” e “dideaza” se referem aos análogos reconhecidos na técnica que têm um átomo de carbono substituído por um ou dois átomos de nitrogênio na estrutura de ácido fólico que ocorre naturalmente. Por exemplo, os análogos de deaza incluem os análogos l-deaza, 3- deaza, 5-deaza, 8-deaza e l0-deaza. Os análogos dideaza incluem, por exemplo, análogos 1,5 dideaza, 5,l0-dideaza, 8,10-dideaza e 5,8-dideaza. Os análogos anteriores do ácido fólico são convencionalmente denominados “folatos”, refletindo sua capacidade de se ligar aos receptores de folato. Outros análogos de ligação a receptores de folato incluem aminopterina, ametopterina (metotrexato), N10- metilfolato, 2-deamino-hidroxifolato, análogos de deaza, como l-deazametopterina ou 3-deazametopterina e ácido 3',5'- dicloro-4-amino-4-desoxi-Nl0-metilpteroilglutâmico (diclorometotrexato).
[00268] Em outra modalidade, o ligante de molécula pequena no contexto do “ligante de molécula pequena ligado a um ligante” pode ter a fórmula xº RR RR à WA a A EX AA x O Y? N U em que X e Y são, cada um, independentemente selecionados do grupo que consiste em halo, Rº, ORº?, SRº, e NRIRi; U, V, e W representam frações bivalentes, cada um, independentemente selecionadas do grupo que consiste em - (Ré8)C=, -N=, -(Rº)C(R'º2)-, and -N(R$9)-; Q é selecionado a partir do grupo que consiste em C e CH; T é selecionado a partir do grupo que consiste em S, O, N, e -C=C-; X? and Xº são, cada um, independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em oxigênio, enxofre, -C(Z)-, -C(Z2)O-, - OC(Z)-, -N(RP)-, -C(Z)N(RP)-, -N(RP)C(Z)-, -OC(Z)N(RP)-, - NRP) C(Z)O-, -N(R'P)C(Z)N(R*)-, -S(0)-, -S(0)>-, -N(Rº)S(0)>2- 7, -C(RóP) (R?º)-, -N(C=CH)—-, -N(CH;C=CH)-, C1-C1i2r alquileno, e C1-C12 alquieneoxi, em que Z é oxigênio ou enxofre; Rº' é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halo, C1-C1i2r alquil, e C1i-Cir alcoxi; R?º, Rô3, Ri, R%8, RP, R5, R*”, Rº”, e R'? são, cada um, independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halo, C1-Ci2 alquil, C1-Cir alcoxi, C1-C1i2 alcanoil, C1-C1i2r alquenil, C1-Ci?
alquinil, (C1-C12 alcoxi)carbonil, e (C1-C12 alquilamino)carbonil; Rº e R' são, cada um, independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halo, C1-C12 alquil, e Ci-C1i2 alcoxi; ou, Ré e R' são tomados em conjunto para formar um grupo carbonil; R% e R'º são, cada um, independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halo, C1i-C1i2r alquil, e C1i-Ci2r alcoxi; ou R% e Rº são tomados em conjunto para formar um grupo carbonil; p, r, s, e t são, cada um, independentemente ou O ou 1; e * representa uma ligação covalente ao resto do conjugado.
[00269] Em um aspecto, a “fração de direcionamento” que se liga ao CAR compreendendo um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 e expressa por células T CAR pode ser selecionada, por exemplo, a partir de fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína (FITC) e NHS- fluoresceína. A identidade da fração de direcionamento é limitada apenas pelo fato de que deve ser reconhecida e ligada pelo CAR compreendendo um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2, de preferência com especificidade, e que tem um peso molecular relativamente baixo. Em vários aspectos, frações de direcionamento exemplares são haptenos, incluindo moléculas orgânicas de pequeno peso molecular.
[00270] Em uma modalidade ilustrativa, a fração de direcionamento pode ter a seguinte estrutura ilustrativa:
R Y = Nr AZ XxX N o HO23C a,
RY em que X é oxigênio, nitrogênio, ou enxofre, e em que X é ligado a um ligante L; Y é ORº?, NR2%, ou NR3*; e Y' É O, NRa, ou NR%º%'; em que cada R é independentemente selecionado em cada caso a partir de EH, flúor, ácido sulfônico, sulfonato, e sais dos mesmos, e semelhantes; e Rº é hidrogênio ou alquil.
[00271] En um aspecto ilustrativo, o ligante pode compreender — polietileno glicol (PEG), poliprolina, um aminoácido hidrofílico, um açúcar, um peptidoglicano não natural, uma polivinilpirrolidona, F-127 plurônico ou uma combinação dos mesmos.
[00272] En outro aspecto ilustrativo, o ligante no composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, aqui descrito pode compreender uma ligação direta (por exemplo, uma reação entre o grupo isotiocianato de FITC e um grupo amina livre de um ligante de pequena molécula) ou a ligação pode ser por meio de um ligante intermediário. Em uma modalidade, se presente, um ligante intermediário pode ser qualquer ligante biocompatível conhecido na técnica, tal como um ligante bivalente. Em uma modalidade ilustrativa, o ligante bivalente pode compreender cerca de 1 a cerca de 30 átomos de carbono. Em outra modalidade ilustrativa, o ligante bivalente pode compreender cerca de 2 a cerca de 20 átomos de carbono. Em outras modalidades, ligantes bivalentes de baixo peso molecular (isto é, aqueles com um peso molecular aproximado de cerca de 30 a cerca de 300 Daltons) são empregados. Em outra modalidade, comprimentos de ligantes que são adequados incluem, mas não estão limitados a, ligantes com 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 ou mais átomos.
[00273] Em várias modalidades, o ligante de molécula pequena ligado a uma fração alvo pode ser da fórmula B—L—T em que B representa o ligante de molécula pequena, L representa o ligante e T representa a fração de direcionamento, e em que L compreende uma estrutura com a fórmula n em que n é um número inteiro de O a 200. Em outra modalidade, n pode ser um número inteiro de O a 150, 0 a 110, 0 a 100, O a 90, O a 80, O a 70, O a 60, 0 a 50, 0 a 40, 0 a 30, 0 a 20, 0 a 15, 0 a 14, 0 a 13, 0 a 12, 0 a 11, 0 a 10, O a 9, 0 a 8, 0 a 7, 0 a 6, 0 a 5, 00a4, 00 a3, 0a2, 0al, a 16, 15 a 17, 15 a 18, 15 a 19, 15 a 20, 15 a 21, 15 a 22, 15 a 23, 15 a 24, 15 a 25, 15 a 26, 15 a 27, 15 a 28, 15 a 29, 15 a 30, 15 a 31, 15 a 32, 15 a 33, 15 a 34, 15 a 35, 15 a 36, 15 a 37, 15 a 38, 15 a 39, 15 a 40, 15 a 50, 15 a 60, 15 a 70, 15 a 80, 15 a 90, 15 a 100, 15 a 110, 15 a 120, 15 a 130, 15 a 140, 15 a 150 ou n podem ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 108, 110, 120, 130, 140 ou 150.
[00274] En outra modalidade, o ligante pode ser um ligante bivalente que pode incluir um ou mais espaçadores. Espaçadores ilustrativos são mostrados na tabela a seguir. Os seguintes —“espaçadores não limitativos ilustrativos são descritos onde * indica o ponto de ligação ao ligante de molécula pequena ou à fração de direcionamento, ou a outras porções de ligante bivalentes.
ex HN. HS om CO *e dO, ora * CO2H o H ” HOZC. ço
H ta ASA * * *.s | | õ N, Ç Oz8 OH 5 ã El N cos Ea * N+ N * H - Se o Não o COH Com *s L * *Ls* dA X *
O HOzZC, HOZC. o yu *N. NL co
N N A o o Se HOC OQ ms o TO ” TOA N+ +N " * HoN NH ANNA ota + * N, * N
FW NA NO Ô
O NH2 NH?
COH Nº * «ND * asAA ANTE o o o
% o o SH SH N a NETA CO2H N* Ls q& ads * o o n=1-3 . o o . o o Ss. . . Ss. Ds NA, nf, NH o o o n=03 n=03 n=13
[00275] En outras modalidades, o ligante de molécula pequena ligado a uma fração de direcionamento (ponte) pode ter qualquer uma das seguintes estruturas. Ho = Lo
AR Amas) SA ã CcOoH
N VONON
HN N As HN' N N Ho
Q O COH , v 8 Ã ” co º a N N o. a LON ÇAAAS AAA N õ Ô
MXN HNONONE
Ho ota SS HD» : A icms Rx OI SORA NO Ss mn Nº Ho (D+ LEA Ro À (> SP ? A es d OA tro E NO
XI
HNT NONE Li it cer R RE COMA o
COOH LORI si d Y É ê H YT À Do HoOCue, a COOH O
RE E oH
; o o coor À RA o 9 : HOOC 1. Sa = COOoH
H HOT W 1 -
OO SOIS O TO Ss . oH F4C. era o o ຠHOC o
N s Ata A AS EA a AE, O Q oH
H H H o HOC ; o OR o! 10 o OND OOONO ON OH H nm Sd H H
AOS ho A mo So o s o NH o o o H COoH O. Ra RA HA OP. e A Ao OI A Quo q o NH IA O rs Ads O WC o
O N H2NO,S F o o F S j : O “ow o
OH HO Oo Oo
CO o IS" o nNN O H XY Hu
NA A A A A ÇA EN Oo
S H
HO o o
CO o e. TI" O? H Ç Ho HN INR o AN Ae
S SO
NH e ST O on
[00276] Em outras modalidades, o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, não é um anticorpo, e não compreende um fragmento de um anticorpo. Em ainda outra modalidade, a fração alvo não compreende um epítopo peptídico.
[00277] En uma modalidade ilustrativa, o ligante de molécula pequena ligado a uma fração alvo por um ligante (a ponte) compreende isotiocianato de fluoresceína (FITC) ligado ao ligante de molécula pequena. Em um aspecto, o câncer pode sobre-expressar um receptor para o ligante de molécula pequena. Em outro aspecto, por exemplo, células T citotóxicas, ou outro tipo de célula T, podem ser transformadas para expressar um CAR que compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2. Neste aspecto, oO CAR pode ter como alvo FITC, decorando o câncer com moléculas FITC como resultado da ligação do ligante de molécula pequena ao câncer. Assim, a toxicidade para células normais não alvo pode ser evitada. Nesta modalidade, quando as células T do fragmento de anticorpo anti-fluroesceína E2 que expressam CAR se ligam a FITC, as células T CAR são ativadas e o câncer é melhorado.
[00278] Um “sal farmaceuticamente aceitável” de um ligante de molécula pequena ligado a uma fração alvo por um ligante é contemplado. Conforme usado neste documento, o termo “sal farmaceuticamente aceitável” se refere aos sais cujos contra-íons podem ser usados em produtos farmacêuticos. Em várias modalidades, esses sais incluem, mas não estão limitados a 1) sais de adição de ácido, que podem ser obtidos por reação da base livre do composto original com ácidos inorgânicos, como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico e ácido perclórico e semelhantes, ou com ácidos orgânicos como ácido acético, ácido oxálico, ácido (D) ou (L) málico, ácido maleico, ácido metanossulfônico, ácido etanossulfônico, ácido Pp- toluenossulfônico, ácido salicílico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico ou ácido malônico e semelhantes; ou
2) sais formados quando um próton ácido presente no composto original é substituído por um íon metálico, por exemplo, um íon alcalino, um íon alcalino-terroso ou um íon alumínio; ou coordena com uma base orgânica tal como etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, trimetamina, N-metilglucamina e semelhantes. Os sais farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos dos especialistas na técnica e qualquer sal farmaceuticamente aceitável é contemplado em conexão com as modalidades descritas neste documento.
[00279] Em várias modalidades, sais de adição de ácido adequados são formados a partir de ácidos que formam sais não tóxicos. Os exemplos ilustrativos incluem sais de acetato, aspartato, benzoato, besilato, bicarbonato/carbonato, bisulfato/sulfato, borato, camsilato, citrato, edisilato, esilato, formato, fumarato, gluceptado, gluconato, glucuronato, hexafluorofosfato hibenzato, cloridrato/cloreto, bromidrato/brometo, iodrídico/iodeto, isionato, lactato, malato, maleato, malonato, mesilato, metilsulfato, naftilato, 2-napsilato, nicotinato, nitrato, orotato, oxalato, palmitato, pamoato, fosfato/hidrogeno fosfato/di- hidrogenofosfato, sacarato, estearato, succinato, tartarato, tosilato e trifluoroacetato.
[00280] Em várias modalidades, os sais de base adequados são formados a partir de bases que formam sais não tóxicos. Exemplos ilustrativos incluem os sais de arginina, benzatina, cálcio, colina, dietilamina, diolamina, glicina, lisina, magnésio, meglumina, olamina, potássio, sódio, trometamina e zinco. Hemissais de ácidos e bases também podem ser formados, por exemplo, sais de hemissulfato e hemicálcio.
[00281] Em um aspecto ilustrativo, o composto, ou um sal farmaceuticamente do mesmo descrito aqui pode conter um ou mais centros quirais, ou pode ser capaz de existir como múltiplos estereoisômeros. Por conseguinte, várias modalidades podem incluir estereoisômeros puros, bem como misturas de estereoisômeros, tais como enantiômeros, diastereoisômeros e misturas enantiomericamente ou diastereoisomericamente enriquecidas. Em um aspecto, o composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, descrito aqui pode ser capaz de existir como isômeros geométricos. Por conseguinte, várias modalidades podem incluir isômeros geométricos puros ou misturas de isômeros geométricos.
[00282] Em alguns aspectos, o composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, aqui descrito pode existir em formas não solvatadas, bem como formas solvatadas, incluindo formas hidratadas. Em geral, as formas solvatadas são equivalentes às formas não solvatadas e estão incluídas no escopo da presente invenção.
[00283] Os “métodos aqui descritos também utilizam linfócitos T (por exemplo, linfócitos T citotóxicos) projetados para expressar um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2, que reconhece e se liga à fração alvo (por exemplo, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína) (FITC) e NHS-fluoresceína) da ponte. Em uma modalidade, os CARS aqui descritos compreendem três domínios, incluindo 1) uma região de reconhecimento (por exemplo, uma região variável de fragmento de cadeia única (scFv) de um anticorpo antifluoresceína E2, um fragmento Fab e semelhantes) que reconhece e se liga à fração alvo com especificidade, 2) um domínio de coestimulação que aumenta a proliferação e sobrevivência dos linfócitos T e 3) um domínio de sinalização de ativação que gera um sinal de ativação de linfócitos T.
[00284] Em vários aspectos, como exemplos não limitativos, podem ser usadas regiões scFv de anticorpos que se ligam a fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína (FITC) e NHS-fluoresceína. Em modalidades ilustrativas não limitativas, as regiões scFv podem ser preparadas a partir de (i) o anticorpo E2 conhecido na técnica que se liga à fração alvo e (iii) variantes de sequência derivadas das regiões scFv de tais anticorpos, por exemplo, regiões scFv tendo pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou pelo menos cerca de 99,5% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da região de scFv da qual são derivados.
[00285] Em um aspecto, o domínio de coestimulação serve para melhorar a proliferação e sobrevivência dos linfócitos T citotóxicos após a ligação do CAR a uma fração alvo. Os domínios de coestimulação adequados incluem, mas não estão limitados a, CD28, CDl37 (4-1BB), um membro da família de receptores do fator de necrose tumoral (TNF), CD134 (OX40), um membro da superfamília de receptores de TNFR, CD27, CD30, CD150, DAP10, NKG2D e CD278 (ICOS), uma molécula coestimuladora da superfamília de CD28 expressa em células T ativadas ou as combinações dos mesmos. Em uma modalidade ilustrativa, os domínios de coestimulação do CAR modificado compreendem CD 28 e CD137. Um técnico especialista no assunto entenderá que variantes de sequência desses domínios de coestimulação podem ser usadas sem afetar adversamente a invenção, onde as variantes têm a mesma atividade Ou atividade semelhante à do domínio em que são modeladas. Em várias modalidades, essas variantes podem ter pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou pelo menos cerca de 99,5% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos do domínio do qual são derivados.
[00286] Em uma modalidade ilustrativa, o domínio de sinalização de ativação serve para ativar os linfócitos T (por exemplo, linfócitos T citotóxicos) após a ligação do CAR a uma fração de direcionamento. Em várias modalidades, os domínios de sinalização de ativação adequados incluem a cadeia CD3C da célula T, proteína receptora CD3 delta, proteína receptora mbl, proteína receptora Bbl, proteína receptora B29 e receptor y da Fc. O técnico especialista no assunto entenderá que variantes de sequência desses domínios de sinalização de ativação podem ser usadas onde as variantes têm a mesma atividade ou atividade semelhante ao domínio sobre o qual elas são modeladas. Em várias modalidades, as variantes têm pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de
90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, em pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou pelo menos cerca de 99,5% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos do domínio do qual são derivados.
[00287] Em um aspecto, os construtos que codificam os CARs compreendendo o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 são preparados usando técnicas de engenharia genética. Tais técnicas são descritas em detalhes em Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001), aqui incorporado por referência, e Green and Sambrook, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 4th Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2012), aqui incorporado por referência.
[00288] Como exemplos, um plasmídeo ou vetor de expressão viral (por exemplo, um vetor lentiviral, um vetor de retrovírus, sleepping beauty e um piggyback (sistemas de transposon/transposase que incluem um sistema de liberação de genes CAR mediados não virais)) pode ser preparado que codifica uma proteína de fusão compreendendo uma região de reconhecimento, um ou mais domínios de coestimulação e um domínio de sinalização de ativação, na região e ligado em uma direção de 5' para 3'. Em outras modalidades, outros arranjos são aceitáveis e incluem uma região de reconhecimento, um domínio de sinalização de ativação e um ou mais domínios de coestimulação. Em uma modalidade, a colocação da região de reconhecimento na proteína de fusão será geralmente tal que a exibição da região no exterior da célula seja alcançada. Em uma modalidade, os CARS que compreendem o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 podem incluir elementos adicionais, como um peptídeo sinal (por exemplo, peptídeo sinal CD8a) para garantir a exportação adequada da proteína de fusão para a superfície celular, um domínio transmembranar para garantir que a proteína de fusão seja mantida como uma proteína de membrana integral (por exemplo, domínio transmembranar CD8a, domínio transmembranar CD28 ou domínio transmembranar CD3C) e um domínio em dobradiça (por exemplo, dobradiça CD8a ou dobradiça IgG4) que confere flexibilidade à região de reconhecimento e permite forte ligação à fração de direcionamento e qualquer outro domínio adequado.
[00289] Um diagrama de um construto de CAR exemplar em que o CAR expresso compreende o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 é mostrado na Figura l, onde a sequência da proteína de fusão é incorporada em um vetor de expressão e onde o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2, um domínio de dobradiça IgG4, um domínio transmembranar CD28 e onde o domínio de coestimulação é CD137 (4-1BB) e o domínio de sinalização de ativação é CD37. O CAR pode compreender domínios adequados adicionais.
Uma sequência de ácido nucleico exemplar de uma inserção de CAR é fornecida como SEQ ID NO: 1 e a sequência de aminoácidos codificada exemplar é fornecida como SEQ ID NO: 2. Como aqui utilizado, “SEQ ID NO: 1” significa a sequência que começa no códon “age” sublinhado e termina no códon “ggc” sublinhado.
Essa parte da sequência mais longa codifica o CAR que é inserido na membrana da célula T.
As outras frações da sequência mais longa incluem a sequência de codificação para peptídeos de sinal, o domínio EGFRt, etc., que não fazem parte do CAR inserido na membrana e que funciona como receptor de antígeno quimérico.
Como aqui utilizado, “SEQ ID NO: 2” significa a sequência começando no sublinhado “S” e terminando no sublinhado “GG”. Essa fração da sequência mais longa é a sequência de aminoácidos do CAR que é inserida na membrana da célula T.
As outras frações da sequência mais longa incluem sequências de aminoácidos para peptídeos de sinal, o domínio EGFRt, etc. que não fazem parte do CAR inserido na membrana e que funciona como receptor de antígeno quimérico.
Em ainda outra modalidade, a SEQ ID NO: 2 pode compreender ou consistir em sequências de aminoácidos humanizadas ou humanas. SEQ ID NOS: 1 e 2 são como descritas acima. Os códons de início e de parada na sequência mais longa de ácido nucleico estão sublinhados e a sequência mais longa é uma sequência exemplar que pode ser usada para a transdução de células T para uso nos métodos descritos aqui.
[00290] SEQ ID NO: 1 (sequência de ácido nucleico do fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 CAR (inserção) atgcttctectggtgacaagecttetgetetgtgagttaccacacecageattect ccetgatcecaagegtgctgacacagcetagetecegtgtetgcegecectgagecagaaagto accatcagctgtageggcageaceageaacateggeaacaactacgtgtcectagtatceage agcaccceceggcaaggececeaagetgatgatetacgacgtgtecaageggeceageggegt gccegatagatttteeggcagcaagageggeaacagegecagectggatatceageggectg cagtctgaggacgaggcegactactattgegeegectagggacgatagcectgagegagttec tgtttggcaceggcaccaagetgacagtgctgggeggaggeggaggatctggeggeggagg aagtaggceggagggggatctcaggtgcagctggtggaaagceggeggeaacetagtgeagect ggceggatctetgagactgagetgtgcegecageggetteacetteggeagetteageatga gcectgggtgegecaggetectaggggaggactggaataggtggcaggactgagegecagaag cagccetgacceactacgcegatagegtgaagggecggtteaceateagecgggacaacgec aagaacagcegtgtacctgcagatgaacagcctgegggtagaagatacegeegtgtactact gegecagacggtectacgacagceageggetactggggccacttetacagetacatggacgt gtggggccagggeacectegtgacagtgtetgagagcaagtacggacegecetgececect tgcectgececegagttegacggeggacecagegtgttectgttecececeaageceaagg acacccectgatgatcagceggacceceegaggtgaccetacgtagtggtggacgtgagccagga agatccegaggtecagtteaattggtacgtagacggcgtagaagtgcacaacgccaagace aagcccagagaggaacagttccagagcaccectacegggtagtatetgtgcetgacegtgectago accaggactggctgaacggcaaagaatacaagtgcaaggtgtecaacaagggectgeecag cagcatcgaaaagaccatcagcaaggccaagggecagectegegagececaggtgtacace ctgccteceteceaggaagagatgaccaagaaccaggtgtecetgacctagccetaggtgaagg gettetaceceagegacategecegtggagtgggagagcaacggccagectgagaacaacta caagaccacccectecegtgetggacagegacggeagettettectatacageeggetgace gtaggacaagagccgagtggcaggaaggcaacgtetttagctgcagegtgatgcacgaggece tgcacaaccactacacccagaagagcetgagectgtecetgggeaagatgttetgggtget ggtggtggtaggeggggtgetggectgetacagectactagtgacagtggectteateate ttttgggtgaaacggggcagaaagaaactccetgtatatattcaaacaaccatttatgagac cagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctagcegatttccagaagaagaagaaggo aggatgtgaactgcgggtgaagttcagcagaagegecgacgeeectgeetaceageaggge cagaatcagctgtacaacgagctgaacctgggcagaagggaagagtacgacgtcctggata agcggagaggcegggaccetgagatagggeggeaagecteggeggaagaacececaggaagg cctgtataacgaactgcagaaagacaagatggcegaggectacagegagateggcatgaag ggcgageggaggeggggeaagggecacgacggectgatatceagggectgtecacegecacea aggatacctacgacgcecectgcacatgcaggecetgececeaaggetegagggeggeggaga gggcagaggaagtcettetaacatgeggtgacgtggaggagaatcceggecetaggatgctt ctcectggtgacaagecttetgetetgtgagttaccacacecageattectectgateceae gcaaagtgtgtaacggaataggtattggtgaatttaaagactcactctccataaatgctac gaatattaaacacttcaaaaactgcacctccatceagtggegatetecacatectgeceggtg gcatttaggggtgactectteacacatactectectetggatecacaggaactggatatteo tgaaaaccgtaaaggaaatcacagggtttttgctgattcaggettggcctgaaaacaggac ggacctceccatgectttgagaacctagaaatcatacgcggcaggaccaagcaacatggtcag ttttctettgcagtegteagectgaacataacatcettagggattacgcteceteaaggaga taagtgatggagatgtgataatttcaggaaacaaaaatttgtgctatgcaaatacaataaa ctggaaaaaactgtttagggacctccegateagaaaaccaaaattataagcaacagaggtgaa aacagctgcaaggccacaggecaggtetgccatgecttgtgctececegagggetgetagg gcceeggagcecagggactgegtetettgceggaatatcageegaggcagggaatgegtaga caagtgcaaccttctggagggtgagccaagggagtttgtggagaactctgagtgcatacag tgccacccagagtgectgecteaggecatgaacatceacetgcacaggacggggaccagaca actgtatccagtgtgceccactacattgacggececcactgegteaagacetgcceggeagg agtcatgggagaaaacaacaccctggtctaggaagtacgcagacgceggecatgtgtgccac ctgtgccatecaaactgcacetacggatgcactaggagccaggtettgaaggetgtecaacga atgggcctaagatcecegtecategecactgggatggtaggggecetectettgetgetagt ggtggccetagggateggectetteatgtga
[00291] .SEQ ID NO: 2 (sequência de aminoácidos CAR do fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 (inserção)
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPSVLTOQPSSVSAAPGQKVTISCSGSTSNIGNNYVS WYQOQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNSASLDISGLQSEDEADYYCAAWDDSL SEFLFGTGTKLTVLGGGGGSGGGGSCGGCGCGSQVEOLVESGGNLVOPGGSLRLSCAASGFTFGS FSMSWVROAPGGGLEWVAGLSARSSLTHYADSVKGREFTISRDNAKNSVYLOMNSLRVEDTA VYYCARRSYDSSGYWGHEFYSYMDVWGOGTLVTVSESKYGPPCPPCPAPEFDGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFOSTYRVVSVL TVLHODWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGOPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVM HEALHNHYTOKSLSLSLGKMFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQP FMRPVOTTOEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGOENQLYNELNLGRREEYD VLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSE IGMKGERRRGKGHDGLYQGLS TATKDTYDALHMOALPPRLEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPRMLLLVTSLLLCELPHPAFL LIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPOE LDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRS LKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGOKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPE GCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPOAMNITCTGR GPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEG CPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM
[00292] Em uma modalidade, o CAR, expressando o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2, compreende uma região de reconhecimento e a região de reconhecimento é uma região variável de fragmento de cadeia única (scFv) do anticorpo antifluoresceína E2, um domínio de coestimulação e o domínio de estimulação co25 é CD137 (4-1BB), e um domínio de sinalização de ativação e o domínio de sinalização de ativação é uma cadeia CD37 de células T. Em outra modalidade, o CAR pode compreender ainda quaisquer domínios adequados adicionais. É bem conhecido do técnico especialista no assunto que um scFv anti-FITC e um scFv antifluoresceína são termos equivalentes.
[00293] Em várias modalidades, o “fragmento de anticorpo antifluoresceína E2” pode ser um CAR compreendendo um fragmento (por exemplo, um fragmento scFv) do anticorpo antifluoresceina E2. O anticorpo antifluoresceina E2 é descrito, por exemplo, em Vaughan, et al., Nature Biotechnol. Vol. 14 (3), PP. 309-314, 1996, aqui incorporado por referência. Em uma modalidade, o CAR que expressa o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 pode ter uma afinidade de ligação à fluoresceína de cerca de 0,7 nM a cerca de 0,8 nM, cerca de 0,72 nM a cerca de 0,8 nM, cerca de 0,73 nM a cerca de 0,8 nM, cerca de 0,72 nM a cerca de 7,8 nM, cerca de 0,73 a cerca de 0,77 nM ou cerca de 0,75 nM.
[00294] Em várias modalidades, o CAR pode ainda compreender um domínio de dobradiça IgG4, um domínio de ativação de CD3C e/ou um domínio de coestimulação 4-1BB e outros domínios adequados. Ainda em outras modalidades, o CAR pode ser codificado por um polinucleotídeo com pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% identidade para SEQ ID NO: l1. Em outra modalidade ilustrativa, o CAR pode ser codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de alto rigor com um polinucleotídeo que possui a SEQ ID NO: 1. Em ainda outro aspecto, o CAR pode ser codificado por um polinucleotídeo tendo a SEQ ID NO: 1 ou por uma variante degenerada da SEQ ID NO: 1. Em outras modalidades, a sequência de proteína CAR pode ter pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% de identidade com a SEQ ID NO: 2. Em ainda outra modalidade, a sequência da proteína CAR pode ter até cerca de 50 substituições de aminoácidos conservadoras. Em qualquer uma das modalidades aqui descritas, o CAR se liga a fluoresceína.
[00295] Em uma modalidade, os linfócitos T (por exemplo, linfócitos T citotóxicos) podem ser geneticamente modificados para expressar um construto CAR, em que a construção CAR expressa um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2, transfectando uma população dos linfócitos T com um vetor de expressão que codifica o construto CAR que expressa O fragmento de anticorpo antifluoresceíina E2. Os métodos adequados para a preparação de uma população transduzida de linfócitos T que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 são bem conhecidos dos técnicos especialistas no assunto e são descritos em Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001), aqui incorporado por referência, e Green and Sambrook, “Molecular Cloning: A
Laboratory Manual”, 4th Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2012), aqui incorporado por referência.
[00296] Em uma modalidade, as células T CAR compreendendo um ácido nucleico da SEQ ID NO: 1 podem ser usadas como aqui descrito. Em outra modalidade, as células T CAR compreendendo um polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 podem ser usadas, como aqui descrito. Em outro aspecto ilustrativo, um ácido nucleico (por exemplo, um ácido nucleico isolado) compreendendo SEQ ID NO: 1 e codificando um receptor de antígeno quimérico pode ser usado para preparar as células T CAR para uso, como aqui descrito. Em ainda outra modalidade, um polipeptídeo receptor quimérico de antígeno compreendendo SEQ ID NO: 2 pode ser usado para preparar as células T CAR para uso, como aqui descrito. Em outra modalidade, um vetor compreendendo SEQ ID NO: 1 pode ser usado para preparar as células T CAR para uso, como aqui descrito. Em outro aspecto, é fornecido um vetor lentiviral compreendendo a SEQ ID NO: 1 para preparar as células T CAR para uso, como aqui descrito. Em ainda outra modalidade, a SEQ ID NO: 2 pode compreender ou consistir em sequências de aminoácidos humanizadas ou humanas.
[00297] Em cada uma dessas modalidades, as sequências variantes de ácidos nucleicos ou as sequências de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou pelo menos cerca de 99,5% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1 são contempladas.
Em outra modalidade, a sequência de ácidos nucleicos pode ser uma sequência de ácidos nucleicos variante tendo pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94 %, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou pelo menos cerca de 99,5% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, desde que a sequência variante codifique um polipeptídeo da SEQ ID NO: 2. Em outra modalidade, a sequência de ácidos nucleicos ou a sequência de aminoácidos pode ser uma sequência de ácidos nucleicos ou de aminoácidos variante tendo pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou pelo menos cerca de 99,5% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 ao longo de um trecho de 200 ácidos nucleicos ou, para a SEQ ID NO: 2, ao longo de um trecho de 200 aminoácidos. Em uma modalidade, a determinação do percentual de identidade ou similaridade entre sequências pode ser feita, por exemplo, usando o programa GAP (Genetics Computer Group, software; agora disponível via Accelrys em http://www.accelrys.com), e os alinhamentos podem ser feitos usando, por exemplo, o algoritmo ClustalW (software VNTI, InforMax Inc.). Um banco de dados de sequências pode ser pesquisado usando a sequência de ácidos nucleicos ou aminoácidos de interesse. Os algoritmos para pesquisa de banco de dados são tipicamente baseados no software BLAST (Altschul et al., 1990). Em algumas modalidades, o percentual de identidade pode ser determinado ao longo de todo o comprimento da sequência de ácidos nucleicos ou de aminoácidos.
[00298] Também dentro do escopo da invenção, ácidos nucleicos complementares ao ácido nucleico representado pela SEQ ID NO: 1 podem ser usados para preparar as células T CAR para uso como descrito aqui, e aqueles que hibridizam com o ácido nucleico representado pela SEQ ID NO: 1 ou aquelas que hibridizam com seu complemento sob condições altamente rigorosas podem ser usadas. De acordo com a invenção,
“condições altamente rigorosas” significa hibridização a 65ºC em 5X SSPE e formamida a 50% e lavagem a 65ºC em 0,5X SSPE. Condições para alto rigor, baixo rigor e hibridização moderadamente rigorosa são descritas em Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001), aqui incorporado por referência, e Green and Sambrook, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 4th Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2012), aqui incorporado por referência. Em alguns aspectos ilustrativos, a hibridização ocorre ao longo do comprimento total do ácido nucleico.
[00299] Ainda em outras modalidades, o CAR para uso nos métodos aqui descritos pode ser codificado por um polinucleotídeo que possui pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% de identidade com a SEQ ID NO: 1. Em outra modalidade ilustrativa, o CAR pode ser codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de alto rigor com um polinucleotídeo que possui a SEQ ID NO: l. Em ainda outro aspecto, o CAR pode ser codificado por um polinucleotídeo tendo a SEQ ID NO: 1 ou por uma variante degenerada da SEQ ID NO: 1. Como usado aqui, uma variante degenerada se refere ao código genético que possui mais de um códon para especificar qualquer aminoácido particular. Os códons variantes degenerados que especificam cada aminoácido são bem conhecidos na técnica. Em ainda outro aspecto, uma substituição pode ser feita para otimizar o nível de produção do polipeptídeo em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica específica (isto é, uma variante de codonusagem) .
[00300] Em outras modalidades, a sequência da proteína CAR pode ter pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 2. Em ainda outra modalidade, a sequência da proteína CAR pode ter até cerca de 50 substituições de aminoácidos conservadoras. Em uma modalidade, a sequência da proteína CAR que expressa o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 pode ter até cerca de 5 substituições conservadas de aminoácidos, até cerca de 10 substituições conservadas de aminoácidos, até cerca de 15 substituições conservadas de aminoácidos, até cerca de 20 conservadas substituições de aminoácidos, até cerca de 25 substituições de aminoácidos conservadas, até cerca de 30 substituições de aminoácidos conservadas, até cerca de 35 substituições de aminoácidos conservadas, até cerca de 40 substituições de aminoácidos conservadas, até cerca de 45 substituições de aminoácidos conservadas, até cerca de 50 substituições conservadas de aminoácidos, até cerca de 55 substituições conservadas de aminoácidos, até cerca de 60 substituições conservadas de aminoácidos, até cerca de 65 substituições conservadas de aminoácidos, até cerca de 70 substituições conservadas de aminoácidos ou até cerca de 75 substituições conservadas de aminoácidos. Como é bem conhecido dos técnicos especialistas no assunto, alterar qualquer aminoácido não crítico de um polipeptídeo por substituição conservada de aminoácido não deve alterar significativamente a atividade desse polipeptídeo porque a cadeia lateral do aminoácido de substituição deve ser capaz de formar ligações e contatos semelhantes à cadeia lateral do aminoácido que foi substituído. Em qualquer uma das modalidades aqui descritas, o CAR se liga a fluoresceína.
[00301] Em um aspecto ilustrativo, as substituições não conservadas são possíveis, desde que estes não prejudiquem excessivamente a atividade de ligação à fluoresceína do polipeptídeo fragmento de anticorpo antifluoresceína E2. Como é bem conhecido na técnica, uma “substituição conservada” de um aminoácido ou uma “variante de substituição conservada” de um polipeptídeo se refere a uma substituição de aminoácido que mantém: 1) a estrutura secundária do polipeptídeo; 2) a carga ou hidrofobicidade do aminoácido; e 3) o volume da cadeia lateral ou qualquer uma ou mais dessas características. Em uma modalidade, a substituição conservada de aminoácidos pode ser com um análogo de aminoácidos.
Ilustrativamente, as terminologias bem conhecidas “resíduos hidrofílicos” referem-se a serina ou treonina. “Resíduos hidrofóbicos” se refere a leucina, isoleucina, fenilalanina, valina ou alanina, ou semelhantes. “Resíduos carregados positivamente” se refere a lisina, arginina, ornitina Ou histidina. “Resíduos com carga negativa” se refere ao ácido aspártico ou ácido glutâmico. Os resíduos com “cadeias laterais volumosas” se referem a fenilalanina, triptofano ou tirosina ou semelhantes. Uma lista exemplificativa de substituições conservadas de aminoácidos é apresentada na Tabela 1.
TABELA 1 Substituir com Alanina D-Ala, GLy, Aib, B-Ala, L- Cys, D-Cys D-Arg, Lys, D-Lys, Orn D-Orn Asparaginina D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu Gln, D-Gln Ácido aspártico D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D- Glu, Gln, D-Gln Cisteína D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr Glutamina D-Gln, Asn, D-Asn, Glu, D- Glu, Asp, D-Asp Ácido glutâmico D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D- Asn, Gln, D-Gln [Gema — 8a DA, Pro, DIPro, Alb,
Isoleucina D-Ile, Val, D-Val, Leu, D- Leu, Met, D-Met Leucina Val, D-Val, Met, D-Met, D- Ile, D-Leu, Ile Lisina D-Lys, Arg, D-Arg, Orn, D-Orn Metionina D-Met, S-Me-Cys, Ile, D-Ile, Leu, D-Leu, Val, D-Val Fenilalanina D-Phe, Tyr, D-Tyr, His, D- His, Trp, D-Trp Prolina Serina D-Ser, Thr, D-Thr, alo-Thr, L-Cys, D-Cys Treonina D-Thr, Ser, D-Ser, alo-Thr, Met, D-Met, Val, D-Val Tirosina D-Tyr, Phe, D-Phe, His, Trp, D-Trp Valina D-Val, Leu, D-Leu, Ile, D- Ile, Met, D-Met
[00302] Em uma modalidade, os linfócitos T (por exemplo, linfócitos T citotóxicos usados para preparar células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2, ou células T não transformadas), usados nos métodos aqui descritos, podem ser células autólogas, embora células heterólogas também possam ser usadas, como quando o paciente em tratamento recebeu quimioterapia em altas doses ou tratamento com radiação para destruir o sistema imunológico do paciente. Em uma modalidade, as células alogênicas podem ser usadas.
[00303] Em um aspecto, os linfócitos T podem ser obtidos de um paciente por meios bem conhecidos na técnica. Por exemplo, as células T (por exemplo, células T citotóxicas ou células T não transformadas) podem ser obtidas coletando sangue periférico do paciente, submetendo o sangue à centrifugação em gradiente de densidade Ficoll e usando um kit de isolamento de células T negativo (como Kit de Isolamento de Células T EasySep") para isolar uma população de células T do sangue periférico. Em uma modalidade ilustrativa, a população de linfócitos T (por exemplo, células T citotóxicas ou células T não transformadas) não precisa ser pura e pode conter outras células, como outros tipos de células T (no caso de células T citotóxicas, por exemplo ), monócitos, macrófagos, células natural killer e células B. Em um aspecto, a população sendo coletada pode compreender pelo menos cerca de 90% do tipo de célula selecionado, pelo menos cerca de 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% do tipo de célula selecionado.
[00304] Em uma modalidade, após a obtenção dos linfócitos T (por exemplo, células T citotóxicas usadas para preparar células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2), as células são cultivadas em condições que promovem a ativação das células. Nesta modalidade, as condições de cultura podem ser tais que as células possam ser administradas a um paciente sem preocupação com reatividade contra componentes do meio de cultura. Por exemplo, as condições de cultura podem não incluir produtos séricos bovinos, como albumina sérica bovina. Em um aspecto ilustrativo, a ativação pode ser alcançada através da introdução de ativadores conhecidos no meio de cultura, como anticorpos anti-CD3 no caso de células T citotóxicas. Outros ativadores adequados incluem anticorpos anti-CD28. Em um aspecto, a população de linfócitos pode ser cultivada em condições que promovam a ativação por cerca de 1 a cerca de 4 dias. Em uma modalidade, o nível apropriado de ativação pode ser determinado pelo tamanho da célula, taxa de proliferação ou marcadores de ativação determinados por citometria de fluxo.
[00305] En uma modalidade ilustrativa, depois que a população de linfócitos T (por exemplo, linfócitos T citotóxicos usados para preparar células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2) foi cultivada sob condições que promovem a ativação, as células podem ser transfectadas com um vetor de expressão que codifica um CAR compreendendo o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2. Os vetores e métodos de transfecção adequados para uso em várias modalidades são descritos acima. Em um aspecto, após a transfecção, as células podem ser administradas imediatamente ao paciente ou as células podem ser cultivadas por pelo menos cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou mais dias, ou entre cerca de 5 e cerca de 12 dias, entre cerca de 6 e cerca de 13 dias, entre cerca de 7 e cerca de 14 dias, ou entre cerca de 8 e cerca de 15 dias, por exemplo, para dar tempo para as células se recuperarem da transfecção. Em um aspecto, as condições de cultura adequadas podem ser semelhantes às condições em que as células foram cultivadas para ativação com ou sem o agente que foi usado para promover a ativação.
[00306] Assim, como descrito acima, em um aspecto ilustrativo, os métodos de tratamento aqui descritos podem compreender ainda 1) obter uma população de linfócitos T autólogos ou heterólogos (por exemplo, linfócitos T citotóxicos usados para preparar células T CAR que expressam o anticorpo E2), 2) cultivar os linfócitos T sob condições que promovem a ativação das células e 3) transfectar os linfócitos com um vetor de expressão que codifica um CAR compreendendo um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 para formar células T CAR expressando o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2.
[00307] Em uma modalidade ilustrativa, quando as células foram transfectadas e ativadas, uma composição compreendendo as células T CAR, em que as células T CAR compreendem um CAR compreendendo um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 pode ser preparada e administrada ao paciente, com ou sem células T não transformadas.
Em uma modalidade, o meio de cultura que não possui produtos de origem animal, como soro bovino, pode ser usado para cultivar as células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 e/ou as células T não transformadas.
Em outra modalidade, podem ser usadas as condições de cultura de tecidos tipicamente usadas pelo técnico especialista no assunto para evitar a contaminação com bactérias, fungos e micoplasma.
Em uma modalidade exemplar, antes de serem administradas a um paciente, as células (por exemplo, células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 e/ou células T não transformadas) são sedimentadas, lavadas e ressuspensas em um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável do mesmo.
Composições exemplares compreendendo linfócitos T expressando CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 (por exemplo, linfócitos T citotóxicos) ou células T não transformadas incluem composições “compreendendo as células em solução salina estéril 290 mOsm, em criomeio infusível (contendo Plasma-Lyte
A, dextrose, injeção de cloreto de sódio, albumina de soro humano e DMSO), em NaCl a 0,9% com albumina de soro humano a 2% ou em quaisquer outros materiais infusíveis de 290 mOsm estéreis. Alternativamente, em outra modalidade, dependendo da identidade do meio de cultura, as células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2, Ou células T não transformadas, podem ser administradas no meio de cultura como a composição, ou concentradas e ressuspensas no meio de cultura antes da administração. Em várias modalidades, a composição de células T CAR em que o CAR compreende o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2, com ou sem células T não transformadas, pode ser administrada ao paciente por meio de qualquer meio adequado, tal como administração parenteral, por exemplo, por via intradérmica, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa Ou intratecal.
[00308] Em um aspecto, o número total de células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 e a concentração das células na composição administrada ao paciente variarão dependendo de vários fatores, incluindo o tipo de linfócitos T (por exemplo, linfócitos T citotóxicos) sendo usados, a especificidade de ligação do CAR que compreende o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2, a identidade da fração de direcionamento e o ligante de molécula pequena, a identidade do câncer, a localização do câncer no paciente, os meios utilizados para administrar as composições ao paciente e a saúde, idade e peso do paciente a ser tratado. Em várias modalidades, composições adequadas compreendendo células T CAR transduzidas que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 incluem aquelas com um volume de cerca de 0,1 ml a cerca de 200 ml e cerca de 0,1 ml a cerca de 125 ml.
[00309] Em várias modalidades, as células T CAR transduzidas, em que as células T CAR compreendem um CAR compreendendo um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2, administrado ao paciente pode compreender de cerca de 1 X 10º a cerca de 1 X 10º? ou 1 X 10º a cerca de 1 X 10º? células T CAR transduzidas que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2. Em várias modalidades, cerca de 1 X 10º a cerca de 1 X 10ºº, cerca del X 10º a cerca de 1 X 10ºº, cerca de 1 X 10º à cerca de 1 X 10º, cerca de 1 X 10º a cerca de 1 X 10º, cerca de 1 X 10º a cerca de 2 X 10º, cerca de 1 X 10º a cerca de 3 X 107, cerca de 1 X 10º a cerca de 1,5 X 107, cerca de 1 X 10º a cerca de 1 X 107, cerca de 1 X 10º a cerca de 9 X 10º, cerca de 1 X 10º a cerca de 8 X 10º, cerca de 1 X 10º a cerca de 7 X 10º, cerca de 1 X 10º a cerca de 6 X 10º, cerca de 1 X 10º à cerca de 5 X 106º, cerca de 1 X 10º a cerca de 4 X 10º, cerca de 1 X 10º a cerca de 3 X 10º, cerca de 1 X 10º a cerca de 2 X 106º, cerca de 2 X 10º a cerca de 6 X 10º, cerca de 2 X 10º a cerca de 5 X 106, cerca de 3 X 10º a cerca de 6 X 106º, cerca de 4 X 10º a cerca de 6 X 10º, cerca de 4 X 10º a cerca de 1 X 107, cerca de 1 X 10º a cerca de 1 X 107, cerca de 1 X 10º a cerca de 1.5 X 107, cerca de 1 X 10º a cerca de 2 XxX 107, cerca de 0,2 X 10º à cerca de 1 X 107, cerca de 0,2 X 10º a cerca de 1,5 X 107, cerca de 0,2 X 10º a cerca de 2 X 107, ou cerca de 5 X 10º células T CAR T expressando o anticorpo antifluoresceina E2 podem ser administrada ao paciente.
Em um aspecto, em qualquer modalidade aqui descrita, uma dose única ou múltiplas doses das células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 pode ser administrada ao paciente.
Em qualquer uma das modalidades descritas neste parágrafo ou neste documento, os números de células T CAR podem ser em kg de peso corporal do paciente.
Em qualquer modalidade aqui descrita, as células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 podem ser administradas antes do composto ou do sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
Como seria entendido, as designações i), ii) e iii), etc., para as etapas de qualquer método descrito aqui, não indicam um pedido, a menos que seja indicado de outra forma.
[00310] Nas várias modalidades aqui descritas, as células T não transformadas também podem ser administradas com as células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 e podem ser administradas em quantidades aqui descritas para as células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 e as células T não transformadas. Em um aspecto, uma mistura de células T CAR, em que as células T CAR compreendem um CAR compreendendo o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2, e as células T não transformadas podem ser administradas uma única vez Ou várias vezes, ou combinações de doses de células T CAR puras que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 e misturas de células CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 e células T não transformadas (por exemplo, uma dose de células T expressando o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 seguido por uma ou mais doses de uma mistura de células T CAR expressando o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 e células T não transformadas). Como é claro para o técnico especialista no assunto a partir da divulgação aqui, uma “mistura” de células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 e células T não transformadas, como aqui descrito,
significa que as células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 são misturados com células T não transformadas que não foram expostas a um construto usado para a expressão de um CAR compreendendo um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2.
[00311] Em outras modalidades, a dose das células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 administrado ao paciente na composição de células T CAR é selecionada do grupo que consiste em cerca de 1 milhão, cerca de 2 milhões, cerca de 3 milhões, cerca de 4 milhões, cerca de 5 milhões, cerca de 6 milhões, cerca de 7 milhões, cerca de 8 milhões, cerca de 9 milhões, cerca de 10 milhões, cerca de 11 milhões, cerca de 12 milhões, cerca de 12,5 milhões, cerca de 13 milhões, cerca de 14 milhões, e cerca de 15 milhões de células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2.
[00312] Em ainda outras modalidades ilustrativas, a composição de células T CAR compreendendo células T CAR expressando o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 é administrada por injeção na corrente sanguínea do paciente, e as células T CAR expressando o fragmento de anticorpo anti- fluorescência E2 na corrente sanguínea do paciente é de pelo menos 5 por cento, pelo menos 7 por cento, pelo menos 10 por cento, pelo menos 11 por cento, pelo menos 12 por cento, pelo menos 13 por cento, pelo menos 14 por cento, ou pelo menos 15 por cento do total de células T do paciente na corrente sanguínea do paciente cerca de quatro semanas após a injeção da composição de células T CAR, pelo menos 20%, 25%, 30%, 35%, 40% ou 50% ou cerca de 3 semanas após a injeção da composição de células T CAR, em pelo menos 60%, 65%, 70%, 75% ou 80% por cerca de 2 semanas após a injeção da composição de células T CAR, ou pelo menos 85%, 90% ou 95 por cerca de 1 semana após a injeção da composição de células T CAR.
[00313] Nas modalidades descritas neste documento, a composição de células T CAR pode compreender células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2, sem qualquer outro tipo de célula, ou células T não transformadas “podem ser administradas ao paciente em combinação com células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2. Para modalidades onde múltiplas doses da composição de células T CAR são administradas, qualquer dose pode compreender células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 ou uma mistura de células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 e células T não transformadas. Em várias modalidades, as células T não transformadas podem ser administradas em quantidades aqui descritas para as células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2.
[00314] Em outra modalidade, qualquer dose da composição de células T CAR pode compreender uma mistura das células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 e células T não transformadas em uma proporção selecionada entre cerca de 1: 5 de células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 para as células T não transformadas, cerca de 1: 4 das células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 para as células T não transformadas, cerca de 1: 3 das células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 para as células T não transformadas, cerca de 1: 2 das células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 para as células T não transformadas e cerca de 1: 1 das células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceina E2 para as células T não transformadas.
[00315] Em ainda outras modalidades, qualquer dose da composição de células T CAR pode compreender uma mistura das células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 e células T não transformadas em uma razão de cerca de 1: 1 à cerca de 1: 5 das células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 para as células T não transformadas, ou a composição de células T CAR pode compreender uma mistura de cerca de 10 milhões de células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 e cerca de 40 milhões de células T não transformadas, cerca de 15 milhões de células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 e cerca de 35 milhões de células T não transformadas, cerca de milhões de células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceíina E2 e cerca de 30 milhões de células T não transformadas, ou cerca de 25 milhões de células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 e cerca de 25 milhões de células T não transformadas.
[00316] O composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ou composição de células T CAR, em que a composição compreende células T CAR compreendendo um CAR compreendendo um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2, aqui descrito pode ser administrado ao paciente usando qualquer método adequado “conhecido na técnica. Conforme descrito neste documento, o termo “administrar” ou “administrado” inclui todos os meios de introdução do composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ou composição de células T CAR compreendendo células T CAR tendo um CAR compreendendo um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 ao paciente, incluindo, mas não se limitando a, oral, intravenosa, intramuscular, subcutânea, transdérmica e semelhantes. Em um aspecto, o composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, descrito aqui pode ser administrado em formas de dosagem unitárias e/ou formulações contendo carreadores, adjuvantes e veículos convencionais não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis.
[00317] Em um aspecto, o composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ou composição de células T CAR, em que a composição de células T CAR compreende células T CAR que expressam um CAR compreendendo um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2, conforme descrito neste documento, pode ser administrado diretamente na corrente sanguínea, no músculo ou em um órgão interno. Em várias modalidades, as vias adequadas para essa administração parenteral incluem liberação intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intratecal, epidural, intracerebroventricular, intrauretral, intrasternal, intracraniana, intratumoral, intramuscular e subcutânea. Em uma modalidade, os meios para administração parenteral incluem injetores de agulha (incluindo microagulha), injetores sem agulha e técnicas de infusão.
[00318] Em um aspecto ilustrativo, as formulações parenterais são tipicamente soluções aquosas que podem conter carreadores ou excipientes, como sais, carboidratos e agentes tamponantes (de preferência a um pH de 3 a 9), mas podem ser mais adequadamente formulados como solução não aquosa esterilizada ou como uma forma seca para ser usada em conjunto com um carreador adequado, como água estéril, apirogênica ou solução salina estéril. Em outras modalidades, qualquer uma das formulações líquidas aqui descritas pode ser adaptada para administração parenteral, conforme descrito neste documento. A preparação sob condições estéreis, por liofilização para produzir um pó liofilizado estéril para uma formulação parenteral, pode ser facilmente realizada usando técnicas farmacêuticas padrão bem conhecidas dos técnicos especialistas no assunto. Em uma modalidade, a solubilidade do composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, utilizado na preparação de uma formulação parenteral pode ser aumentada pelo uso de técnicas de formulação apropriadas, tais como a incorporação de agentes que aumentam a solubilidade.
[00319] À quantidade do composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, a ser administrada ao paciente pode variar significativamente, dependendo do câncer a ser tratado, da via de administração do composto, ou do sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e da distribuição do tecido.
A quantidade a ser administrada a um paciente pode ser baseada na área da superfície corporal, massa e avaliação do médico.
Em várias modalidades, as quantidades a serem administradas podem variar, por exemplo, de cerca de 0,05 mg a cerca de 30 mg, 0,05 mg a cerca de 25,0 mg, cerca de 0,05 mg a cerca de 20,0 mg, cerca de 0,05 mg a cerca de 15,0 mg, cerca de 0,05 mg a cerca de 10,0 mg, cerca de 0,05 mg à cerca de 9,0 mg, cerca de 0,05 mg a cerca de 8,0 mg, cerca de 0,05 mg a cerca de 7,0 mg, cerca de 0,05 mg a cerca de 6,0 ma, cerca de 0,05 mg a cerca de 5,0 mg, cerca de 0,05 mg à cerca de 4,0 mg, cerca de 0,05 mg a cerca de 3,0 mg, cerca de 0,05 mg a cerca de 2,0 mg, cerca de 0,05 mg a cerca de 1,0 mg, cerca de 0,05 mg a cerca de 0,5 mg, cerca de 0,05 mg à cerca de 0,4 mg, cerca de 0,05 mg a cerca de 0,3 mg, cerca de 0,05 mg a cerca de 0,2 mg, cerca de 0,05 mg a cerca de 0,1 ma, cerca de 0,01 mg a cerca de 2 mg, cerca de 0,3 mg a cerca de mg, cerca de 0,1 mg a cerca de 20 mg ou cerca de 0,8 a cerca de 3 mg.
Um técnico especialista no assunto apreciará prontamente que a dose pode variar dentro dos vários intervalos fornecidos acima, com base nos fatores mencionados acima, e pode ficar a critério do médico.
[00320] Em outras modalidades, a dose do composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, pode variar, por exemplo, de cerca de 50 nmoles/kg a cerca de 3000 nmoles/kg de peso corporal do paciente, cerca de 50 nmoles/kg a cerca de 2000 nmoles/kg, cerca de 50 nmoles/kg a cerca de 1000 nmoles/kg, cerca de 50 nmoles/kg a cerca de 900 nmoles/kg, cerca de 50 nmoles/kg a cerca de 800 nmoles/kg, cerca de 50 nmoles/kg a cerca de 700 nmoles/kg, cerca de 50 nmoles/kg a cerca de 600 nmoles/kg, cerca de 50 nmoles/kg a cerca de 500 nmoles/kg, cerca de 50 nmoles/kg a cerca de 400 nmoles/kg, cerca de 50 nmoles/kg a cerca de 300 nmoles/kg, cerca de 50 nmoles/kg a cerca de 200 nmoles/kg, cerca de 50 nmoles/kg a cerca de 100 nmoles/kg, cerca de 100 nmoles/kg a cerca de 300 nmoles/kg, cerca de 100 nmoles/kg a cerca de 500 nmoles/kg, cerca de 100 nmoles/kg a cerca de 1000 nmoles/kg, cerca de 100 nmoles/kg a cerca de 2000 nmoles/kg de peso corporal do paciente. Em outras modalidades, a dose pode ser de cerca de 1 nmoles/kg, cerca de 5 nmoles/kg, cerca de 10 nmoles/kg, cerca de 20 nmoles kg, cerca de 25 nmoles/kg, cerca de 30 nmoles/kg, cerca de 40 nmoles/kg, cerca de 50 nmoles/kg, cerca de 60 nmoles/kg, cerca de 70 nmoles/kg, cerca de 80 nmoles/kg, cerca de 90 nmoles/kg, cerca de 100 nmoles/kg, cerca de 150 nmoles/kg, cerca de 200 nmoles/kg, cerca de 250 nmoles/kg, cerca de 300 nmoles/kg, cerca de 350 nmoles/kg, cerca de 400 nmoles/kg, cerca de 450 nmoles/kg, cerca de 500 nmoles/kg, cerca de 600 nmoles/kg, cerca de 700 nmoles/kg, cerca de 700 nmoles/kg, cerca de 800 nmoles/kg, cerca de 900 nmoles/kg, cerca de 1000 nmoles/kg, cerca de 2000 nmoles/kg, cerca de 2500 nmoles/kg ou cerca de 3000 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
[00321] Em várias outras modalidades, a dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, pode variar de, por exemplo, cerca de 10 nmoles/kg a cerca de
10.000 nmoles/kg, de cerca de 10 nmoles/kg a cerca de 5000 nmoles/kg, de cerca de 10 nmoles/kg a cerca de 3000 nmoles/kg, cerca de 10 nmoles/kg a cerca de 2500 nmoles/kg, cerca de 10 nmoles/kg a cerca de 2000 nmoles/kg, cerca de 10 nmoles/kg a cerca de 1000 nmoles/kg, cerca de 10 nmoles/kg a cerca de 900 nmoles/kg, cerca de 10 nmoles/kg a cerca de 800 nmoles/kg, cerca de 10 nmoles/kg a cerca de 700 nmoles/kg, cerca de 10 nmoles/kg a cerca de 600 nmoles/kg, cerca de 10 nmoles/kg a cerca de 500 nmoles/kg, cerca de 10 nmoles/kg a cerca de 400 nmoles/kg, cerca de 10 nmoles/kg a cerca de 300 nmoles/kg, cerca de 10 nmoles/kg a cerca de 200 nmoles/kg,
cerca de 10 nmoles/kg a cerca de 150 nmoles/kg, cerca de 10 nmoles/kg a cerca de 100 nmoles/kg, cerca de 10 nmoles/kg a cerca de 90 nmoles/kg, cerca de 10 nmoles/kg a cerca de 80 nmoles/kg, cerca de 10 nmoles/kg a cerca de 70 nmoles/kg, cerca de 10 nmoles/kg a cerca de 60 nmoles/kg, cerca de 10 nmoles/kg a cerca de 50 nmoles/kg, cerca de 10 nmoles/kg a cerca de 40 nmoles/kg, cerca de 10 nmoles/kg a cerca de 30 nmoles/kg, cerca de 10 nmoles/kg a cerca de 20 nmoles/kg, cerca de 200 nmoles/kg a cerca de 900 nmoles/kg, cerca de 200 nmoles/kg a cerca de 800 nmoles/kg, cerca de 200 nmoles/kg a cerca de 700 nmoles/kg, cerca de 200 nmoles/kg a cerca de 600 nmoles/kg, cerca de 200 nmoles/kg a cerca de 500 nmoles/kg, cerca de 250 nmoles/kg a cerca de 600 nmoles/kg, cerca de 300 nmoles/kg a cerca de 600 nmoles/kg, cerca de 300 nmoles/kg a cerca de 500 nmoles/kg, ou cerca de 400 nmoles/kg a cerca de 600 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
Em várias outras modalidades, a dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, pode variar de, por exemplo, cerca de 1 nmol/kg a cerca de 10.000 nmoles/kg, de cerca de 1 nmol/kg a cerca de 5000 nmoles/kg, de cerca de 1 nmol/kg a cerca de 3000 nmoles/kg, cerca de 1 nmol/kg a cerca de 2500 nmoles/kg, cerca de 1 nmol/kg a cerca de 2000 nmoles/kg, cerca de 1 nmol/kg a cerca de 1000 nmoles/kg, cerca de 1 nmol/kg a cerca de 900 nmoles/kg, cerca de 1 nmol/kg a cerca de 800 nmoles/kg, cerca de 1 nmol/kg a cerca de 700 nmoles/kg, cerca de 1 nmol/kg a cerca de 600 nmoles/kg, cerca de 1 nmol/kg a cerca de 500 nmoles/kg, cerca de 1 nmol/kg a cerca de 400 nmoles/kg, cerca de 1 nmol/kg a cerca de 300 nmoles/kg, cerca de 1 nmol/kg a cerca de 200 nmoles/kg, cerca de 1 nmol/kg a cerca de 150 nmoles/kg, cerca de 1 nmol/kg a cerca de 100 nmoles/kg, cerca de 1 nmol/kg a cerca de 90 nmoles/kg, cerca de 1 nmol/kg a cerca de 80 nmoles/kg, cerca de 1 nmol/kg ou cerca de 70 nmoles/kg, cerca de 1 nmol/kg a cerca de 60 nmoles/kg, cerca de 1 nmol/kg a cerca de 50 nmoles/kg, cerca de 1 nmol/kg a cerca de 40 nmoles/kg, cerca de 1 nmol/kg a cerca de 30 nmoles/kg, ou cerca de 1 nmol/kg a cerca de 20 nmoles/kg, Em ainda outras modalidades, a dose pode ser de cerca de 0,1 nmol/kg, cerca de 0,2 nmoles/kg, cerca de 0,3 nmoles/kg, cerca de 0,4 nmoles kg, ou cerca de 0,5 nmoles/kg, cerca de 0,1 nmol/kg a cerca de 0,1 nmol/kg a cerca de 1000 nmoles/kg, cerca de O0,l nmol/kg a cerca de 900 nmoles/kg, cerca de 0,1 nmol/kg a cerca de 850 nmoles/kg, cerca de 0,1 nmol/kg a cerca de 800 nmoles/kg, cerca de 0,1 nmol/kg a cerca de 700 nmoles/kg, cerca de 0,1 nmol/kg a cerca de 600 nmoles/kg, cerca de 0,1 nmol/kg a cerca de 500 nmoles/kg, cerca de 0,1 nmol/kg a cerca de 400 nmoles/kg, cerca de 0,1 nmol/kg a cerca de 300 nmoles/kg, cerca de 0,1 nmol/kg a cerca de 0,1 nmol/kg 200 nmoles/kg, cerca de 0,1 nmol/kg a cerca de 100 nmoles/kg, cerca de 0,1 nmol/kg a cerca de 50 nmoles/kg, cerca de 0,1 nmol/kg a cerca de 10 nmoles/kg ou cerca de 0,1 nmol/kg a cerca de 1 nmol/kg de peso corporal do paciente. Em outras modalidades, a dose pode ser de cerca de 0,3 nmol/kg a cerca de 1000 nmoles/kg, cerca de 0,3 nmol/kg a cerca de 900 nmoles/kg, cerca de 0,3 nmol/kg a cerca de 850 nmoles/kg, cerca de 0,3 nmol/kg a cerca de 800 nmoles/kg, cerca de 0,3 nmol/kg a cerca de 700 nmoles/kg, cerca de 0,3 nmol/kg a cerca de 600 nmoles/kg, cerca de 0,3 nmol/kg a cerca de 500 nmoles/kg, cerca de 0,3 nmol/kg a cerca de 400 nmoles/kg, cerca de 0,3 nmol/kg a cerca de 300 nmoles/kg, cerca de 0,3 nmol/kg a cerca de 200 nmoles/kg, cerca de 0,3 nmol/kg a cerca de 100 nmoles/kg, cerca de 0,3 nmol/kg a cerca de 50 nmoles/kg, cerca de 0,3 nmol/kg a cerca de 10 nmoles/kg, ou cerca de 0,3 nmol/kg a cerca de 1 nmol/kg de peso corporal do paciente. Nessas modalidades, “kg” é quilogramas do peso corporal do paciente. Em um aspecto, uma dose única ou doses múltiplas do composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, podem ser administradas ao paciente.
[00322] Em outra modalidade, entre cerca de 20 ug/kg de peso corporal do paciente e cerca de 3 mg/kg de peso corporal do paciente do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, podem ser administrados ao paciente. Em outro aspecto, as quantidades podem ser de cerca de 0,2 mg/kg de peso corporal do paciente e cerca de 0,4 mg/kg de peso corporal do paciente, ou podem ser de cerca de 50 uvg/kg de peso corporal do paciente. Em um aspecto, uma única dose ou doses múltiplas do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, podem ser administrados ao paciente.
[00323] Em uma modalidade, o ligante de molécula pequena ligado à fração alvo (o composto) pode ser administrado ao paciente antes da composição de células T CAR compreendendo células T CAR, em que as células T CAR têm um CAR compreendendo um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2. Em outra modalidade, o ligante de molécula pequena ligado à fração alvo (ponte) pode ser administrado ao paciente ao mesmo tempo que a composição de células T CAR compreendendo células T CAR, em que as células T CAR têm um CAR compreendendo um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2, mas em formulações diferentes ou na mesma formulação. Em ainda outra modalidade, o ligante de molécula pequena ligado à fração de direcionamento pode ser administrado ao paciente após a composição de células T CAR compreendendo células T
CAR em que as células T CAR têm um CAR compreendendo um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2.
[00324] En um aspecto ilustrativo, o tempo entre a administração das células T CAR tendo um CAR compreendendo um fragmento de anticorpo antifluoresceíina E2 e a molécula pequena ligada à fração alvo (ponte) pode variar amplamente, dependendo de fatores que incluem o tipo de células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 sendo usado, a especificidade de ligação do CAR com o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2, a identidade da fração alvo e o ligante de molécula pequena, a identidade do câncer, a localização no paciente com câncer, os meios utilizados para administrar ao paciente as células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 e o ligante de molécula pequena ligado à fração alvo, bem como a saúde, idade e peso da paciente. Em um aspecto, o ligante de molécula pequena ligado à fração de direcionamento pode ser administrado antes ou depois das células T CAR, como dentro de cerca de 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48 ou 51 horas, ou em cerca de 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais dias.
[00325] Em uma modalidade, qualquer esquema de dosagem aplicável conhecido na técnica pode ser usado para administração do composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ou para a composição de células T CAR, em que aàa composição de células T CAR compreende células T CAR, em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2. Por exemplo, uma dose por dia (ou seja, qd), duas vezes por dia (ou seja, bid), três vezes por dia (ou seja, tid), duas vezes por semana (ou seja, BIW), três vezes por semana (ou seja, TIW), uma dose por semana, e semelhantes, pode ser usada. Em um aspecto, o cronograma de dosagem selecionado para o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e a composição de células T CAR em que a composição de células T CAR compreende células T CAR tendo um CAR, em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2, pode levar em consideração a concentração do composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e o número de células T CAR expressando o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 administrado, para regular a citotoxicidade da composição de células T CAR em que a composição de célula T CAR compreende células T CAR com um CAR, em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 e para controlar o SRC.
[00326] Em uma modalidade, para prevenir ou inibir a síndrome de liberação de citocinas (SRC) no paciente, é fornecido um método de tratamento de um câncer. O método compreende i) administrar a um paciente um composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto compreende um ligante de molécula pequena ligado a uma fração de direcionamento por um ligante, ii) administrar ao paciente uma composição de células T CAR em que a composição de células T CAR compreende células T CAR, em que as células T CAR compreendem um CAR, em que o CAR compreende um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 e iii) administrar ao paciente um folato, um conjugado compreendendo um folato em que o conjugado compreendendo um folato não compreende uma fração de direcionamento ou um medicamento que inibe a ativação das células T CAR.
[00327] Nesta modalidade do método, a etapa de administração ao paciente de um folato, um conjugado compreendendo um folato em que o conjugado compreendendo um folato não compreende uma fração de direcionamento, ou uma droga que inibe a ativação das células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 pode ser usado para prevenir ou inibir SRC no paciente. Nesta modalidade, qualquer um de um folato, um conjugado que compreende um folato, em que o conjugado que compreende um folato não compreende uma fração de direcionamento, ou uma droga que inibe a ativação das células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 pode ser referido aqui como “um agente de resgate”. Em uma modalidade, um folato, como o ácido fólico, pode ser administrado para prevenir ou inibir a SRC no paciente. Nesta modalidade, o folato inibe a interação da ponte (isto é, o ligante de molécula pequena ligado à fração alvo por um ligante) com os receptores da ponte na inibição da lise
[00328] do tumor e na prevenção ou inibição da RSC no o ea fe ee tas fa Joe Normal -pilo pilo moribundo | Morte gorduroso [O fes e [a e gorduroso gorduroso fino pálido não ativo, ainda menos a menos letárgico ativo ativo que estimulado O O o paciente.
[00329] Em outra modalidade, o agente de resgate pode reduzir a SRC tão rapidamente quanto cerca de 30 minutos,
cerca de 1 hora, cerca de 2 horas, cerca de 3 horas, cerca de 4 horas, cerca de 5 horas, cerca de 5 horas, cerca de 6 horas, cerca de 7 horas, aproximadamente 8 horas, cerca de 9 horas ou cerca de 10 horas após a administração do agente de resgate. Por exemplo, o grau do CRS pode ser reduzido (por exemplo, grau 3 para grau 2, grau 4 para grau 3, etc.).
[00330] Um sistema de classificação exemplar é mostrado abaixo com colunas 1-6 que são graus O, 1, 2, 3, 4 e 5:
[00331] Em uma modalidade, o folato administrado como um inibidor da ligação da ponte ao tumor pode ser, por exemplo, ácido fólico, um análogo do ácido fólico ou outra molécula receptora de folato. Em várias modalidades, os análogos de folato que podem ser usados incluem ácido folínico, ácido pteropoliglutâmico e pteridinas de ligação ao receptor de folato, como tetra-hidropterinas, di-hidrofolatos, tetra- hidrofolatos e seus análogos de deaza e dideaza. Os termos análogos de “deaza” e “dideaza” se referem aos análogos reconhecidos na técnica que têm um átomo de carbono substituído por um ou dois átomos de nitrogênio na estrutura de ácido fólico que ocorre naturalmente. Por exemplo, os análogos de deaza incluem os análogos l-deaza, 3-deaza, 5- deaza, 8-deaza e l0-deaza. Os análogos dideaza incluem, por exemplo, análogos 1,5 dideaza, 5,l0-dideaza, 8,l0-dideaza e
5,8-dideaza. Os análogos anteriores do ácido fólico são convencionalmente denominados “folatos”, refletindo sua capacidade de se ligar aos receptores de folato. Outros análogos de ligação ao receptor de folato incluem aminopterina, ametopterina (metotrexato), NlO0O-metilfolato, 2- desamino-hidroxifolato, análogos de deaza, tais como 1- desazametopterina ou 3-desazametopterina e 3',5'-dicloro-4- amino-4 ácido-desoxi-Nl10-metilpterolilututilo (diclorometotrexato).
[00332] Em outra modalidade, o folato administrado como um inibidor de ligação da ponte ao tumor tem a fórmula x RW RE Mo 1a AGE
DO EA ÉS | | AT IR no À => PA o;
YVONT DU em que X!' e Y! são, cada um, independentemente selecionados do grupo que consiste em halo, Rº, OR?, SR?%, e NRIRi; U, V, e W representam frações bivalentes, cada um, independentemente selecionadas do grupo que consiste em - (R62) C=, —N=, —(R699)C(R'1º9)-, e -N(Rº)-; Q é selecionado a partir do grupo que consiste em C e CH; T é selecionado a partir do grupo que consiste em S, O, N, e -C=C-; X? e X3 são, cada um, independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em oxigênio, enxofre, -C(Z)-, -C(Z)O-, -OC(Z)—, - N(R%)-, -C(Z)N(RO)-, -N(R%)C(Z2)-, -OC(Z) N(RP)-, - N(RP)C(Z)O-, -N(Rº*”)C(Z)N(R?*)-, -S(0)-, -S(0)>»-, -N(Rº)S(0)2- 7 TC(R%)(RP)-, -N(C=CH)-, -N(CHXC=CH)-, C1i-Cir alquileno, e C1-C12 alquieneoxi, em que Z é oxigênio ou enxofre; R!| é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halo, C1-C12 alquil, e C1-Cir alcoxi; R?º, Rà, Ri, R%ºº8, R*”, R, RP”, Rº”, e R'?” são, cada um, independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halo, C1-Ci alquil, C1-Ci2 alcoxi, C1i-C12 alcanoil, C1i-C1i2r alquenil, C1-Ci2 alquinil, (C1-C12 alcoxi)carbonil, e (C1-C12 alquilamino)carbonil; Rº e R' são, cada um, independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halo, C1-C12 alquil, e C1i-C1i2r alcoxi; ou, Rº e R' são tomados em conjunto para formar um grupo carbonil; R%º e R'"º são, cada um, independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halo, C1-Ci2r alquil, e C1-Ci2 alcoxi; ou R%º e R'º são tomados em conjunto para formar um grupo carbonil; p, r, s, e t são, cada um, independentemente ou O ou 1; and * representa uma ligação covalente ao resto do conjugado.
[00333] Em ainda outra modalidade, um conjugado compreendendo um folato pode ser administrado para prevenir ou síndrome de liberação de inibição de citocinas (CRS) no paciente. CRS é um termo bem conhecido na técnica e esta síndrome pode causar efeitos prejudiciais ao paciente, incluindo, mas não se limitando a perda de peso, febre alta, edema pulmonar e uma queda perigosa da pressão arterial.
[00334] Nesta modalidade, o conjugado compreendendo um folato não compreende uma fração de direcionamento e, assim, o conjugado inibe a interação da ponte com o tumor para prevenir a lise tumoral e reduzir CRS no paciente. Nesta modalidade, a fração de folato no conjugado que compreende um folato pode compreender qualquer um dos folatos descritos nos parágrafos anteriores ligados a uma fração química que não compreende uma fração de direcionamento. Em um aspecto, o conjugado compreendendo um folato pode compreender um folato ligado a um ou mais aminoácidos que não compreendem uma fração de direcionamento. Ilustrativamente, o conjugado compreendendo um folato pode ter a fórmula o gem o ES o OO AC Ss FP
[00335] Este composto também pode ser referido como
“EC923”. Nessas modalidades, o folato ou o conjugado compreendendo um folato pode ser administrado ao paciente em excesso molar em relação à ponte (ou seja, o ligante de molécula pequena ligado a uma fração de direcionamento por um ligante), como um excesso de 10 vezes, um excesso de 100 vezes, um excesso de 200 vezes, um excesso de 300 vezes, um excesso de 400 vezes, um excesso de 500 vezes, um excesso de 600 vezes, um excesso de 700 vezes, um excesso de 800 vezes, um excesso de 900 vezes, um excesso de 1000 vezes, um excesso de 10.000 vezes do folato ou o conjugado compreendendo um folato em relação ao ligante de molécula pequena ligado a uma fração de direcionamento por um ligante. A quantidade de folato ou do conjugado compreendendo um folato em relação à quantidade do ligante de molécula pequena ligada a uma fração de direcionamento por um ligante necessário para inibir a interação da ponte com o tumor pode ser determinada pelo técnico especialista no assunto.
[00336] Em outra modalidade, um agente de resgate que inibe a ativação das células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2, pode ser administrado ao paciente para inibir a ativação das células T CAR e para inibir ou prevenir a CRS no paciente. Em um aspecto, o agente pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um inibidor específico da proteína tirosina quinase de linfócitos (por exemplo, Dasatinibe), um inibidor da PI3 quinase (por exemplo, GDC0980), um inibidor de uma quinase de células T induzível por IL-2 (por exemplo, BMS-509744), inibidores de JAK, inibidores de BTK, Tociluzumabe, agonistas de SIP (por exemplo, Siponimod e Ozanimod) e um agente que bloqueia a ligação das células T CAR à ponte, mas não se liga ao câncer (por exemplo, fluoresceinamina, FITC ou fluoresceína de sódio). É entendido pelo técnico especialista no assunto que o FITC (isto é, fluoresceína) pode estar na forma de um sal (por exemplo, fluoresceína de sódio) ou na sua forma sem sal, em condições fisiológicas ou, por exemplo, em um tampão em pH fisiológico. Por conseguinte, em uma modalidade, quando a fluoresceina é administrada a um paciente, ela pode estar em equilíbrio entre sua forma salgada (por exemplo, fluoresceína de sódio) e sua forma não salgada. Em outra modalidade, um agente de resgate que inibe a ativação de células T CAR pode ser um composto da fórmula Cor com SE A Sen RAR A A A st De
HNT NON O NH O NH CNH NONÔNH + hi É om no" OH no" sor oo no no HO OH Ho HO
[00337] Em várias modalidades, o agente de resgate pode ser administrado em uma concentração de cerca de 0,001 nM a cerca de 100 mM, cerca de 0,01 nM a cerca de 100 mM, cerca de 1 nM a cerca de 100 mM, cerca de 10 nM a cerca de 100 mM, cerca de 50 nM a cerca de 100 mM, ou de cerca de 100 nM a cerca de 100 mM em qualquer volume apropriado, incluindo, por exemplo, 0,1 ml, 0,2 ml, 0,3 ml, 0,4 ml, 0,5 ml, 0,6 ml, 0,7 ml, 0,8 ml, 0,9 ml, 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 10 ml, 100 ml ou 1000 ml.
Em outras modalidades, o agente de resgate pode ser administrado em uma dose de cerca de 0,01 a cerca de 300 umoles/kg de peso corporal do paciente, cerca de 0,06 a cerca de 100 umoles/kg de peso corporal do paciente, cerca de 0,06 a cerca de 90 umoles/kg de peso corporal do paciente, cerca de 0,06 a cerca de 80 umoles/kg de peso corporal do paciente, cerca de 0,06 a cerca de 70 umoles/kg de peso corporal do paciente, cerca de 0,06 a cerca de 60 umoles/kg de peso corporal do paciente, cerca de ,06 a cerca de 50 umoles/kg de peso corporal do paciente, cerca de ,06 a cerca de 40 umoles/kg de peso corporal do paciente, cerca de ,06 a cerca de 30 umoles/kg de peso corporal do paciente, cerca de 0,06 a cerca de 20 umoles/kg de peso corporal do paciente, cerca de 0,06 a cerca de 10 umoles/kg de peso corporal do paciente, cerca de 0,06 a cerca de 8 umoles/kg de peso corporal do paciente, ou cerca de 0,06 a cerca de 6 umoles/kg de peso corporal do paciente.
[00338] Nessas modalidades, o agente de resgate pode ser administrado ao paciente em excesso molar em relação ao composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo (ou seja, o ligante de molécula pequena ligado a uma fração de direcionamento por um ligante), tal como cerca de um excesso de 10 vezes, excesso de cerca de 20 vezes, excesso de cerca de 30 vezes, excesso de cerca de 40 vezes, excesso de cerca de 50 vezes, excesso de cerca de 60 vezes, excesso de cerca de 70 vezes, excesso de cerca de 80 excesso de dobras, cerca de 90 vezes, cerca de 100 vezes, cerca de 200 vezes, cerca de 200 vezes, cerca de 300 vezes, cerca de 400 vezes, cerca de 400 vezes, cerca de 500 vezes, cerca de 600 vezes excesso de dobras, cerca de 700 vezes, cerca de 800 vezes, cerca de 900 vezes, cerca de 900 vezes, cerca de 1000 vezes ou cerca de
10.000 vezes o excesso do agente de resgate em relação ao ligante de molécula pequena ligado a uma fração de segmentação por um ligante. A quantidade do agente de resgate em relação à quantidade do ligante de molécula pequena ligada a uma fração alvo por um ligante (ponte) necessária para inibir a interação do composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, com o tumor e/ou as células T CAR expressando o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 pode ser determinado pelo técnico especialista no assunto.
[00339] Em outra modalidade, mais de uma dose pode ser administrada ao paciente do folato, o conjugado compreendendo um folato em que o conjugado compreendendo um folato não compreende uma fração de direcionamento ou o agente que inibe a ativação das células T CAR expressando o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2.
[00340] Nas modalidades de 'agente de resgate' aqui descritas, o folato, o conjugado que compreende um folato em que o conjugado que compreende um folato não compreende uma fração de direcionamento, ou o agente que inibe a ativação das células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo de anti fluoresceína E2, pode ser administrado ao paciente antes e/ou após o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Em outro aspecto, o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, pode ser administrado antes e após a administração do folato, o conjugado compreendendo um folato em que o conjugado compreendendo um folato não compreende uma fração de direcionamento ou o agente que inibe a ativação das células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2. Nesta modalidade, a administração subsequente do composto, ou do sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, pode causar a ativação das células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 e um aumento nos níveis de citocinas no paciente.
[00341] Em outra modalidade, administração do folato, o conjugado compreendendo um folato em que o conjugado compreendendo um folato não compreende uma fração de direcionamento ou o agente que inibe a ativação das células CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2, pode causar redução nos níveis de citocinas no paciente. Em ainda outra modalidade, a redução nos níveis de citocinas pode ocorrer por cerca de 1 hora, por cerca de 2 horas, por cerca de 3 horas, por cerca de 4 horas, por cerca de 5 horas, por cerca de 6 horas, por cerca de 7 horas, ou por cerca de 8 horas após a administração ao paciente do folato, o conjugado compreendendo um folato em que o conjugado compreendendo um folato não compreende uma fração alvo, ou o agente que inibe a ativação das células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2. Em outra modalidade, a redução nos níveis de citocinas é uma redução para cerca dos níveis de citocinas em um paciente não tratado.
[00342] Em outra modalidade ilustrativa, o número de células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 pode aumentar no sangue do paciente após a administração do folato, o conjugado compreendendo um folato em que o conjugado compreendendo um folato não compreendem uma fração de direcionamento ou o agente que inibe a ativação das células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2, mesmo que os níveis de citocinas no paciente sejam reduzidos.
Em outro aspecto ilustrativo, a ativação das células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 pode ser aprimorada ou mantida em relação a um paciente não tratado com um agente de resgate, após administração do folato, o conjugado compreendendo um folato em que o conjugado compreendendo um folato não compreende uma fração de direcionamento ou o agente de resgate que inibe a ativação das células T CAR em que as células T CAR compreendem um CAR compreendendo o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2, mesmo que os níveis de citocina no paciente tratado sejam reduzidos.
Em ainda outra modalidade, o câncer compreende um tumor e o tamanho do tumor no paciente não é aumentado quando o folato, o conjugado compreendendo um folato em que o conjugado compreendendo um folato não compreende uma fração de direcionamento, ou o agente de resgate que inibe a ativação das células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 são administradas ao paciente. Nesta modalidade, uma resposta completa para o tumor pode ser obtida.
[00343] Em outras modalidades, o agente de resgate que inibe a ativação das células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 é administrado ao paciente quando o grau de CRS atinge 1, 2, 3 ou 4 ou quando o grau de CRS atinge 3 ou 4. Em outro aspecto, o edema pulmonar é reduzido no paciente quando o agente de resgate é administrado.
[00344] Em uma modalidade aqui descrita, é fornecido um método de tratamento de um câncer e o método compreende 1) administrar continuamente a um paciente um composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto compreende um ligante de molécula pequena ligado a um fração de direcionamento por um ligante, ii) administrar ao paciente uma composição de células T CAR compreendendo células T CAR em que as células T CAR compreendem um CAR compreendendo um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 e iii) terminando a administração contínua do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável deste, para inibir ou prevenir a síndrome de liberação de citocina no paciente.
[00345] De acordo com esta modalidade, o termo
“continuamente” pode significar a administração do composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ao paciente, por exemplo, pelo menos uma hora, pelo menos quatro horas, pelo menos seis horas, em pelo menos oito horas, pelo menos dez horas, pelo menos doze horas ou pelo menos vinte e quatro horas, ou pode significar um regime de administração diária ou semanal, como uma vez ao dia, duas vezes ao dia, três vezes ao dia, a cada dia, em dias alternados, uma vez por semana, duas vezes por semana, três vezes por semana Ou qualquer outro regime adequado que seria considerado administração contínua por um técnico especialista no assunto. Em outro aspecto, o termo “continuamente” pode significar qualquer combinação das modalidades descritas neste parágrafo.
[00346] Nesta modalidade do método, a etapa de “terminar a administração contínua” do composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para inibir ou prevenir a síndrome de liberação de citocinas no paciente, pode significar, por exemplo, a interrupção da administração após a administração por um período contínuo de tempo, como horas ou dias, ou descontinuação de um regime de tratamento, como os regimes diários ou semanais descritos acima. Em outra modalidade, a etapa de “terminar a administração contínua”
pode significar, por exemplo, a administração até que ocorra uma perda inaceitável de peso corporal para o paciente, ou até que qualquer outro efeito colateral inaceitável ocorrer, como febre alta, queda no sangue pressão ou edema pulmonar. Nesta modalidade, a etapa de “terminar a administração contínua” do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, não significa um único tratamento com o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, sem tratamento subsequente com o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Neste método, a modalidade “inibir ou prevenir” a síndrone de liberação de citocinas (CRS) significa eliminar a CRS ou reduzir ou melhorar os sintomas da CRS.
[00347] Em uma modalidade da modalidade envolvendo o encerramento da administração contínua do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, o método pode ainda compreender a etapa de iv) ou re-administrar o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ao paciente. Em uma modalidade, o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, pode ser administrado, por exemplo, uma vez por semana e uma dose pode ser omitida. Em outra modalidade, o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, pode ser administrado em dias alternados (isto é, todos os dias) e uma ou mais (por exemplo, duas, três, quatro, etc.) doses podem ser omitidas. Em outra modalidade, o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, pode ser administrado duas vezes por semana e uma ou mais (por exemplo, duas, três, quatro, etc.) doses podem ser omitidas. Em outra modalidade, o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, pode ser administrado segunda-feira, terça-feira e, na segunda-feira seguinte, e, depois, a dosagem pode ser interrompida por duas semanas e o ciclo repetido. Em outra modalidade, qualquer uma das modalidades de regime descritas acima pode ser usada e uma ou mais (por exemplo, duas, três, quatro, etc.) doses podem ser omitidas. Nestas modalidades, as doses omitidas podem prevenir ou reduzir a CRS no paciente.
[00348] Em ainda outro aspecto ilustrativo, é fornecido um método de tratamento de um câncer. O método compreende i) administrar a um paciente um composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto compreende um ligante de molécula pequena ligado a uma fração de direcionamento por um ligante, em que pelo menos uma primeira dose e uma segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, são administrados ao paciente, em que a primeira dose e a segunda dose são diferentes, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é cerca de 2 vezes a cerca de 15.000 vezes maior em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e ii) administrar ao paciente uma composição de células T CAR compreendendo células T CAR em que as células T CAR compreendem um CAR compreendendo um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2.
[00349] Nesta modalidade, a dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, pode ser aumentada gradualmente para inibir ou prevenir a síndrome de liberação de citocinas no paciente. Por exemplo, pelo menos uma primeira dose e uma segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, podem ser administradas ao paciente, em que a primeira dose e a segunda dose são diferentes, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é cerca de 20 vezes a cerca de 15000 vezes maior, 2 vezes a cerca de 15000 vezes maior em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Em outras modalidades, a segunda dose, ou uma dose subsequente, pode ser cerca de 2 vezes a cerca de 5 vezes, cerca de 2 vezes a cerca de 10 vezes, cerca de 2 vezes a cerca de 20 vezes,
cerca de 2 vezes a cerca de 30 vezes, cerca de 2 vezes a cerca de 40 vezes, cerca de 2 vezes a cerca de 50 vezes, cerca de 2 vezes a cerca de 60 vezes, cerca de 2 vezes a cerca de 70 vezes, cerca de 2 vezes a cerca de 80 vezes, cerca de 2 vezes a cerca de 90 vezes, cerca de 2 vezes a cerca de 100 vezes, cerca de 2 vezes a cerca de 15000 vezes, cerca de 2 vezes a cerca de 10000 vezes, cerca de 5 vezes a cerca de 9000 vezes, cerca de 5 vezes a cerca de 8000 vezes, cerca de 5 vezes a cerca de 7000 vezes, cerca de 5 vezes a cerca de 6000 vezes, cerca de 5 vezes a cerca de 5000 vezes, cerca de 5 vezes a cerca de 4000 vezes, cerca de 5 vezes a cerca de 3000 vezes, cerca de 5 vezes a cerca de 4000 vezes, cerca de 5 vezes a cerca de 3000 vezes, cerca de 5 vezes a cerca de 2000 vezes, cerca de 5 vezes a cerca de 1000 vezes, cerca de 5 vezes a cerca de 750 vezes, cerca de 2 vezes a cerca de 750 vezes, cerca de 5 vezes a cerca de 500 vezes, cerca de 5 vezes a cerca de 100 vezes, cerca de 800 vezes a cerca de 15000 vezes, cerca de 800 vezes a cerca de 10000 vezes, cerca de 800 vezes a cerca de 9000 vezes, cerca de 800 vezes a cerca de 8000 vezes, cerca de 800 vezes a cerca de 7000 vezes, cerca de 800 vezes a cerca de 6000 vezes, cerca de 800 vezes a cerca de 5000 vezes, cerca de 800 vezes a cerca de 4000 vezes, cerca de 800 vezes a cerca de 3000 vezes, cerca de 800 vezes a cerca de 2000 vezes, cerca de 800 vezes a cerca de 1000 vezes, cerca de 8.000 vezes a cerca de
15.000 vezes, cerca de 8.000 vezes a cerca de 10.000 vezes, cerca de 8.000 vezes a cerca de 9.000 vezes, cerca de 15.000 vezes, cerca de 10.000 vezes, cerca de 9.000 vezes, cerca de
8.000 vezes, cerca de 7000 vezes, cerca de 6000 vezes, cerca de 5000 vezes, cerca de 4000 vezes, cerca de 3000 vezes, cerca de 2000 vezes, cerca de 1000 vezes, cerca de 1000 vezes, cerca de 500 vezes, cerca de 400 vezes, cerca de 300 vezes, cerca de 200 vezes, cerca de 100 vezes, cerca de 90 vezes, cerca de 80 vezes, cerca de 70 vezes, cerca de 60 vezes, cerca de 50 vezes, cerca de 40 vezes, cerca de 30 vezes, cerca de 20 vezes, cerca de 10 vezes, cerca de 5 vezes, ou cerca de 2 vezes maior em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00350] Em outra modalidade ilustrativa do método de escalonamento de dose, pelo menos uma primeira dose, uma segunda dose e uma terceira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, podem ser administrados ao paciente, em que a primeira dose, a segunda dose e a terceira dose são diferentes, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é cerca de 2 vezes a cerca de 750 vezes maior em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e em que a terceira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é cerca de 800 vezes a cerca de 10.000 vezes maior em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00351] Em outro aspecto do método de escalonamento de dose, pelo menos uma primeira dose, uma segunda dose, uma terceira dose e uma quarta dose do composto, ou oO sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, podem ser administrados ao paciente, em que o primeira dose, a segunda dose, a terceira dose e a quarta dose são diferentes, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é de cerca de 2 vezes a cerca de 750 vezes maior em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que a terceira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é de cerca de 800 vezes a cerca de 7500 vezes maior em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o farmaceuticamente sal aceitável do mesmo, e em que a quarta dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é cerca de 8000 a cerca de 15000 vezes maior em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00352] Em ainda outra modalidade, a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, pode ser cerca de 100 vezes maior em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, a terceira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, pode ser cerca de 1000 vezes maior em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e a quarta dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, pode ser cerca de 10000 vezes maior em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Em uma modalidade exemplar, a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é 0,05 nmoles/kg, a segunda dose é 5 nmoles/kg, a terceira dose é 50 nmoles/kg e a quarta dose é 500 nmoles/kg. Nas modalidades de escalonamento de dose aqui descritas, a primeira, a segunda, a terceira, a quarta e as doses subsequentes do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, podem ser administradas várias vezes (por exemplo, a primeira dose a 0,05 nmoles/kg pode administrada várias vezes antes da administração das doses subsequentes).
[00353] Em outra modalidade aqui descrita, um método de tratamento de um câncer é fornecido. O método compreende i) administrar a um paciente uma primeira dose de um composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto compreende um ligante de molécula pequena ligado a uma fração alvo por um ligante, ii) administrar ao paciente pelo menos uma segunda dose do composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é pelo menos cerca de 50 por cento menor em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e iii) administrar ao paciente uma dose de uma composição de células T CAR compreendendo células T CAR, em que as células T CAR compreendem um CAR compreendendo um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2.
[00354] Em várias modalidades desta modalidade de redução de escalonamento de dose, a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, pode ser pelo menos cerca de 60 por cento menor em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o farmaceuticamente aceitável sal do mesmo, pelo menos cerca de 70% menor em quantidade do que a primeira dose do composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, pelo menos cerca de 80% menor em quantidade do que a primeira dose do composto, Ou oO sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em pelo menos cerca de 90 por cento menor em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, pelo menos cerca de 95 por cento menor em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, pelo menos cerca de 96 por cento menor em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, pelo menos cerca de 97 por cento menor em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, pelo menos cerca de 98 por cento menor em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, pelo menos cerca de 99 por cento menor em quantidade do que a primeira dose do composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ou pelo menos cerca de 99,5% menor em quantidade do que a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00355] Em várias modalidades da modalidade da redução de escalonamento de dose aqui descrita, a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, pode ser de cerca de 100 nmoles/kg a cerca de 1000 nmoles/kg de peso corporal do paciente, cerca de 100 nmoles/kg a cerca de
900 nmoles/kg de peso corporal do paciente, cerca de 100 nmoles/kg a cerca de 800 nmoles/kg de peso corporal do paciente, cerca de 100 nmoles/kg a cerca de 700 nmoles/kg a cerca de 700 nmoles/kg de peso corporal do paciente, cerca de 100 nmoles/kg a cerca de 600 nmoles/kg de peso corporal do paciente, cerca de 200 nmoles/kg a cerca de 600 nmoles/kg de peso corporal do paciente, cerca de 400 nmoles/kg a cerca de 600 nmoles/kg de peso corporal do paciente ou cerca de 500 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
[00356] Em várias modalidades da modalidade de redução de escalonamento de dose aqui descrita, a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, pode ser de cerca de 0,5 nmoles/kg a cerca de 500 nmoles/kg de peso corporal do paciente, cerca de 0,5 nmoles/kg a cerca de 450 nmoles/kg de peso corporal do paciente, cerca de 0,5 nmoles/kg a cerca de 400 nmoles/kg de peso corporal do paciente, cerca de 0,5 nmoles/kg a cerca de 350 nmoles/kg a cerca de 350 nmoles/kg de peso corporal do paciente, cerca de 0,5 nmoles/kg a cerca de 300 nmoles/kg de peso corporal do paciente, cerca de 1 nmole/kg a cerca de 300 nmoles/kg de peso corporal do paciente, cerca de 2 nmoles/kg a cerca de 300 nmoles/kg de peso corporal do paciente, cerca de 2 nmoles/kg a cerca de 250 nmoles/kg de peso corporal do paciente, cerca de 5 nmoles/kg a cerca de 40 nmoles/kg de peso corporal do paciente, ou cerca de 40 nmoles/kg a cerca de 150 nmoles/kg de peso corporal do paciente.
[00357] Em “modalidades adicionais da modalidade de redução de dose aqui descrita, o método pode ainda compreender administrar uma terceira dose do composto, ou O sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que a terceira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é a mesma que a segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Em outra modalidade, o método pode ainda compreender administrar uma quarta dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que a quarta dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é a mesma que a segunda dose ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e a terceira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Em ainda outra modalidade, as doses do composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, administradas após a primeira dose do composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, podem manter a inibição do crescimento do câncer em relação à primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00358] Em outras modalidades da modalidade de redução de dose aqui descrita, as células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 podem ser administradas a uma dose de cerca de 1 milhão de células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 a cerca de 40 milhões de células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2.
[00359] Em ainda outras modalidades, as doses do composto ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, administradas após a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, podem ser administradas uma ou duas vezes por semana. Em ainda outras modalidades da modalidade de redução do escalonamento de dose Em ainda outras modalidades da modalidade de redução do escalonamento de dose aqui descrita, o método pode compreender ainda a etapa de administração ao paciente de um folato, um conjugado que compreende um folato em que o conjugado que compreende um folato não compreende uma fração de direcionamento ou um agente que inibe a ativação das células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2.
[00360] Em outra modalidade, o agente que inibe a ativação das células T CAR que expressa o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 é administrado ao paciente e o agente é um agente que bloqueia a ligação das células T CAR que expressa o fragmento de anticorpo anti-fluorescência E2 para o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, mas não se liga ao câncer, e o agente é fluoresceinamina, fluoresceína de sódio ou fluoresceína.
Em ainda outra modalidade, o agente é a fluoresceína de sódio.
Em outra modalidade, é fornecido um método de tratamento de um câncer.
O método compreende i) administrar a um paciente uma primeira dose de um composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto compreende um ligante de molécula pequena ligado a uma fração de direcionamento por um ligante e em que o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é administrado ao paciente pelo menos cerca de uma hora antes da administração de uma composição de células T CAR compreendendo células T CAR em que as células T CAR compreendem um CAR compreendendo um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2, ii) depois administrando ao paciente uma dose da composição de células T CAR, compreendendo células T CAR, em que as células T CAR compreendem um CAR compreendendo um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 e iii) administrando ao paciente uma segunda dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
Em várias modalidades desta modalidade de pré-tratamento, a primeira dose do composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, pode ser administrada ao paciente pelo menos cerca de duas horas antes da administração da composição de células T CAR, pelo menos cerca de quatro horas antes da administração da composição de células T CAR, pelo menos cerca de oito horas antes da administração da composição de células T CAR, pelo menos cerca de doze horas antes da administração da composição de células T CAR, pelo menos cerca de dezesseis horas antes da administração da composição de células T CAR, pelo menos cerca de vinte horas antes da administração da composição de células T CAR ou pelo menos cerca de vinte e quatro horas antes da administração da composição de células T CAR, em cada caso em que a composição de células T CAR compreende células T CAR compreendendo um CAR compreendendo um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2.
[00361] Em várias modalidades desta modalidade de pré- tratamento, a segunda dose do composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, pode ser administrada ao paciente por pelo menos cerca de vinte e quatro horas após a administração da composição de células T CAR, por pelo menos cerca de vinte horas após a administração da composição de células T CAR, por pelo menos cerca de dezoito horas após a administração da composição de células T CAR, por pelo menos cerca de dezesseis horas após a administração da composição de células T CAR, por pelo menos cerca de catorze horas após a administração da composição de células T CAR, por pelo menos cerca de doze horas após a administração da composição de células T CAR, por pelo menos cerca de dez horas após a administração da composição de células T CAR, pelo menos cerca de oito horas após a administração da composição de células T CAR, pelo menos cerca de seis horas após a administração da composição de células T CAR, pelo menos cerca de quatro horas após a administração da composição de células T CAR, ou pelo menos cerca de duas horas após a administração da composição de células T CAR, em cada caso em que a composição de células T CAR compreende células T CAR compreendendo um CAR compreendendo um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2.
[00362] Em qualquer uma das modalidades aqui descritas onde um folato é o ligante ligado à fração de direcionamento por um ligante, o paciente pode ser colocado em uma dieta deficiente em folato antes do tratamento com os métodos descritos, ou o paciente pode ser administrado como folato na dieta. Na modalidade em que o folato é administrado ao paciente, a dose pode variar, por exemplo, de cerca de 50 nmol/kg a cerca de 3000 nmol/kg de peso corporal do paciente,
cerca de 50 nmol/kg a cerca de 2000 nmol/kg, cerca de 50 nmol/kg a cerca de 1000 nmol/kg, cerca de 50 nmol/kg a cerca de 900 nmol/kg, cerca de 50 nmol/kg a cerca de 800 nmol/kg, cerca de 50 nmol/kg a cerca de 700 nmol/kg, cerca de 50 nmol/kg a cerca de 600 nmol/kg, cerca de 50 nmol/kg a cerca de 500 nmol/kg, cerca de 50 nmol/kg a cerca de 400 nmol/kg, cerca de 50 nmol/kg a cerca de 300 nmol/kg, cerca de 50 nmol/kg a cerca 200 nmol/kg, cerca de 50 nmol/kg a cerca de 100 nmol/kg, cerca de 100 nmol/kg a cerca de 300 nmol/kg, cerca de 100 nmol/kg a cerca de 500 nmol/kg, cerca de 100 nmol/kg a cerca de 1000 nmol/kg, cerca de 100 nmol/kg a cerca de 2000 nmol/kg de peso corporal do paciente.
Em outras modalidades, a dose pode ser de cerca de 100 nmol/kg, cerca de 150 nmol/kg, cerca de 200 nmol/kg, cerca de 250 nmol/kg, cerca de 300 nmol/kg, cerca de 350 nmol/kg, cerca de 400 nmol/kg, cerca de 450 nmol/kg, cerca de 500 nmol/kg, cerca de 600 nmol/kg, cerca de 700 nmol/kg, cerca de 800 nmol/kg, cerca de 900 nmol/kg, cerca de 900 nmol/kg, cerca de 1000 nmol/kg, cerca de 1000 nmol/kg, cerca de 2000 nmol/kg, ou cerca de 3000 nmol/kg de peso corporal do paciente.
Nessas modalidades, “kg” são quilogramas de peso corporal do paciente.
Em um aspecto, o folato pode ser administrado, por exemplo, diariamente, semanalmente, quinzenalmente, três vezes por semana, ou usando qualquer regime adequado para a administração do folato.
[00363] Em várias modalidades descritas aqui, as células T CAR podem persistir em um número elevado de células T CAR circulantes por até 10 dias, até 15 dias, até 20 dias, até cerca de 25 dias, até cerca de 30 dias, até cerca de 35 dias, até cerca de 40 dias, até cerca de 45 dias, até cerca de 45 dias, até cerca de 50 dias, até cerca de 50 dias, até cerca de 55 dias, até cerca de 55 dias, até cerca de 60 dias, até cerca de 65 dias, até cerca de 70 dias, até cerca de 75 dias, ou até cerca de 80 dias após a administração de células T CAR.
[00364] Em várias modalidades descritas aqui, as concentrações efetivas semi-máximas (EC50) para o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, podem ser de cerca de 1 pM a cerca de 2 nM, cerca de 1 pM a cerca de 5 nM, cerca de 1 pM a cerca de 10 nM, cerca de 1 pM a cerca de 20 nM, cerca de 1 pM a cerca de 30 nM, cerca de 1 pM a cerca de 40 nM, cerca de 1 pM a cerca de 50 nM, cerca de 1 pM a cerca de 50 nM, cerca de 1 pM a cerca de 60 nM, cerca de 1 pM a cerca de 70 nM, cerca de 1 pM a cerca de 80 nM, cerca de 1 pM a cerca de 90 nM, cerca de 1 pM a cerca de 100 nM, cerca de 1 PpM a cerca de 200 nM, cerca de 1 pM a cerca de 200 nM, cerca de 1 pM a cerca de 300 nM, cerca de 1 pM a cerca de 400 nM, cerca de 1 pM a cerca de 500 nM, cerca de 1 pM à cerca de 600 nM, cerca de 1 pM a cerca de 700 nM, cerca de 1 pM a cerca de 800 nM, cerca de 1 pM a cerca de 900 nM, cerca de 1 pM a cerca de 900 nM, cerca de 1 pM a cerca de 1 nM, cerca de 1 pM a cerca de 900 pM, cerca de 1 pM a cerca de 800 pM, cerca de l pM a cerca de 700 pM, cerca de 1 pM a cerca de 600 pM, cerca de 1 pM a cerca de 500 pM, cerca de 1 pM à cerca de 500 PM, cerca de 1 pM a cerca de 400 pM, cerca de 1 pM à cerca de 300 pM, cerca de 1 pM a cerca de 200 pM, cerca de 1 pM a cerca de 100 pM, cerca de 1 pM à cerca de 90 pM, cerca de 1 PM a cerca de 80 pM, cerca de 1 pM a cerca de 70 pM, cerca de l1 pM a cerca de 60 pM, cerca de 1 pM a cerca de 50 pM, cerca de 1 pM a cerca de 50 pM, cerca de 1 pM a cerca de 40 pM, cerca de 1 pM a cerca de 30 pM, cerca de 1 pM a cerca de 20 PM, cerca de 1 pM a cerca de 10 pM ou cerca de 1 pM à cerca de 5 pM.
[00365] Em várias modalidades descritas neste documento, a Kd para ligação do composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, às células T CAR pode ser de cerca de 1 nM a cerca de 100 nM, cerca de 1 nM a cerca de 200 nM, cerca de 1 nM a cerca de 300 nM, cerca de 1 nM a cerca de 400 nM, cerca de 1 nM a cerca de 500 nM, cerca de 1 nM a cerca de 600 nM, cerca de 1 nM a cerca de 700 nM, cerca de 1 nM a cerca de 800 nM, cerca de 1 nM a cerca de 900 nM, cerca de 100 nM a cerca de 500 nM, cerca de 100 nM a cerca de 400 nM, cerca de 100 nM a cerca de 300 nM, cerca de 100 nM a cerca de 200 nM, cerca de 100 nM a cerca de 150 nM ou cerca de 130 nWM.
[00366] Em várias modalidades ilustrativas aqui descritas, o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, pode ser administrado primeiro ao paciente cerca de l, cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9 ou 10 dias antes ou depois das células T CAR ou em qualquer dia apropriado antes ou depois das células T CAR.
[00367] Nas várias modalidades descritas neste documento, podem ser utilizadas células T CAR ou EGFRt classificadas ou não classificadas. Em outra modalidade, um lote de “fac-símile clínico” de células T CAR pode ser usado com um perfil de baixa diferenciação. Em outra modalidade, um “lote de pesquisa” de células T CAR pode ser usado. O lote de “fac-símile clínico” (—- 39% EGFRE +) pode compreender subconjuntos CD4+ em cerca de 66% Tsw e cerca de 32% Tm E subconjuntos CD8 em cerca de 95% Tsm e cerca de 3% Te. O lote de pesquisa (- 23% EGFRt+) pode compreender subconjuntos CD4 em cerca de 32% Tsm, cerca de 53% To, cerca de 11% Tm €e cerca de 3,7% Trrr e subconjuntos CD8 em cerca de 44% Tscv, cerca de 0,28% Teco, cerca de 3,4% de Try e cerca de 52% de TzrFF.
[00368] Em várias modalidades adicionais desta modalidade de pré-tratamento, a liberação de citocinas resultando em toxicidade fora do alvo no paciente não ocorre, mas a toxicidade das células T CAR, expressando o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2, para o câncer ocorre ou a toxicidade do tecido fora do alvo não ocorre no paciente, mas a toxicidade das células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 para o câncer ocorre, Ou oO câncer compreende um tumor e o tamanho do tumor é reduzido no paciente, mas a toxicidade fora do alvo não ocorre ou a redução no tamanho do tumor no paciente é maior do que em um paciente não pré-tratado com o composto ou com o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, antes da administração da composição de células T CAR compreendendo células T compreendendo um CAR compreendendo um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2. Como seria entendido por um técnico especialista no assunto, o “alvo” pode ser o câncer (por exemplo, um tumor).
[00369] Em outra modalidade, é fornecido um método de tratamento de um câncer. O método compreende i) administrar a um paciente um composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto compreende um ligante de molécula pequena ligado a uma fração alvo por um ligante, e ii) administrar ao paciente uma composição de células T CAR, em que a composição de células T CAR compreende células T CAR e em que as células T CAR compreendem um CAR compreendendo um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 e em que o ligante de molécula pequena é um ligante PSMA e a fração alvo é FITC. Nesta modalidade, o ligante de molécula pequena ligado a uma fração alvo por um ligante pode ter a fórmula 2 | 6 * .
COOH AA aa O, toco). x Leoon º TD * EN HN No 6 SA
[00370] Em ainda outra modalidade, é fornecido um método de tratamento de um câncer. O método compreende i) administrar a um paciente um composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o composto compreende um ligante de molécula pequena ligado a uma fração alvo por um ligante, e ii) administrar ao paciente uma composição de células T CAR, em que a composição de células T
CAR compreende células T CAR e em que as células T CAR compreendem um CAR compreendendo um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2 e em que o ligante de molécula pequena é um ligante CAIX e a fração alvo é FITC. Nesta modalidade, o ligante de molécula pequena ligado a uma fração alvo por um ligante pode ter a fórmula
O OH iã SO o A Is
DOS A
Ô N HoNO>S F o o f O" *oH o
CL OH
[00371] Em ainda outra modalidade, é fornecido um método de tratamento de um câncer. O método compreende i) administrar a um paciente um primeiro composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o primeiro composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, compreende um ligante PSMA ligado a FITC por um ligante, ii) administrar ao paciente um segundo composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o segundo composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo,
compreende um ligante CAIX ligado ao FITC por um ligante e iii) administrar ao paciente uma composição de células T CAR em que a composição de células T CAR compreende células T CAR e em que as células T CAR compreendem um CAR compreendendo um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2. Nesta modalidade, o primeiro composto pode ter a fórmula
FPF Y ? o o il O. Roo A NU N Ú CA cooH ;N O ARODARE A So
H HA CAL o Ss Í x COoH O E) HOOC". Ti | “ RW HN NA 6 SA e o segundo composto pode ter a fórmula Os OH CL s o o LL À O. Ss KR AA NO no o u H H
O N HINOS F O o
ANSIOSO
A f O “or Oo
OH
[00372] Em uma modalidade dos métodos aqui descritos, o câncer é imageado antes da administração ao paciente do composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ou antes da administração da composição de células T CAR ao paciente, em que a composição de células T CAR compreende células CAR compreendendo um CAR compreendendo um fragmento de anticorpo antifluoresceína E2. Em uma modalidade ilustrativa, a imagem ocorre por imagem PET. Em outras modalidades ilustrativas, a geração de imagens ocorre por imagens de ressonância magnética ou imagens SPECT/CT. O método de imagem pode ser qualquer método de imagem adequado conhecido na técnica. Em uma modalidade, o método de imagem pode envolver o uso do ligante de molécula pequena aqui descrito, mas ligado a um agente de imagem adequado para os tipos de imagem aqui descritos.
[00373] Em qualquer uma das modalidades descritas neste documento, a liberação de citocinas resultando em toxicidade fora do alvo no paciente pode não ocorrer, embora ocorra toxicidade para o câncer das células T CAR, que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2. Em qualquer modalidade aqui descrita, a toxicidade de tecido fora do alvo pode não ocorrer no paciente, embora ocorra toxicidade para o câncer das células T CAR que expressam o fragmento de anticorpo antifluoresceína E2. Em qualquer modalidade aqui descrita, o câncer pode compreender um tumor e o tamanho do tumor pode ser reduzido no paciente, mesmo que a toxicidade fora do alvo não ocorra. Em qualquer uma das modalidades descritas neste documento, a CRS pode ser reduzida ou evitada e o método pode resultar em uma diminuição no volume do tumor no paciente. Em qualquer modalidade aqui descrita, a perda de peso corporal devido a CRS pode ser reduzida ou evitada. Em qualquer modalidade aqui descrita, o câncer pode compreender um tumor e uma resposta completa para o tumor pode ser obtida.
[00374] Em outra modalidade dos métodos aqui descritos, qualquer um dos métodos aqui descritos pode ser usado sozinho ou qualquer um dos métodos aqui descritos pode ser usado em combinação com qualquer outro método ou métodos aqui descritos.
EXEMPLOS EXEMPLO 1.
REDUÇÃO DE ESCALONAMENTO DE DOSE DE EC17 PODE REDUZIR A
TOXICIDADE RELACIONADA À TERAPIA
[00375] O efeito da dose de redução de escalonamento de desse de EC1l7 foi investigado na atividade antitumoral e a toxicidade (alterações de peso corporal) de terapia CAR-T. Dois scFv antifluoresceína diferentes foram usados para os construtos de CAR (FIG. 1). O primeiro construto de CAR contém os seguintes domínios: antiFL(FITC-E2)scFv - dobradiça IgG4 (CH2 (L235D, N297Q)-CH3) -CD28 TM - 4-1BB - CD3z - T2A -
EGFRt. A segundo construto do CAR contém os seguintes domínios: antiFL(FITC-4M5.3)scFv - dobradiça IgG4 (CH2 (L235D, N297Q)-CH3) -CD28 TM - 4-1BB - CD3z - T2A - EGFRt. A sequência de ácidos nucleicos e a sequência de aminoácidos do CAR de cada construto são mostradas como SEQ ID NOS: 1 a 4. As células T humanas foram isoladas, ativadas e transduzidas com um vetor lentiviral contendo o gene CAR apropriado. A sequência de ácido nucleico e a sequência de aminoácidos do CAR de cada construto são mostradas como SEQ ID NOS: 1 a 4. As células CD4+ CAR-T e as células CD8+ CAR-T foram misturadas na proporção de 1: 1 antes da administração i.v. para estudos em animais.
[00376] Os camundongos portadores de tumores MDA-MB-231 (150-250 mm?) foram usados para os estudos in vivo para avaliar células E2-CAR-T. Na primeira parte do estudo, 10 ou milhões de células E2-CAR-T foram administradas e 500 nmol/kg de EC1l7 foram administrados i.v. por semana nos dias 2, 9, 16, 23, etc. após a administração de CAR-T (como mostrado na FIG. 2A). Os camundongos administrados com 20 milhões de células E2-CAR-T apresentaram CRS grave após a segunda dose de ECl7 e tiveram de ser resgatados com 6 umol/kg de fluoresceína de sódio (NaFL). Os grupos de 10 e 20 milhões de CAR-T apresentaram CRS grave após a terceira e à quarta doses de ECl7 e tiveram que ser resgatados com NaFL (como indicado nas FIGS. 5A e 5B). Ambos os grupos apresentaram perda grave de peso corporal (- 20%) durante o tratamento com E2-CAR-T, indicando que a terapia com 10 ou 20 milhões de SI2 CAR-T/ECl7 500 nmol/kg de SIW apresentou toxicidade grave. (Embora 20 milhões de células E2-CAR-T sozinhas também apresentaram atividade antitumoral (FIG. 5A, círculo aberto), isso provavelmente foi causado por TCRs incompatíveis de HLA alogênico comumente encontrados em células T “jovens” cultivadas in vitro por um período mais curto.)
[00377] O segundo construto 4M5.3-CAR (antiFL(FITC- 4M5.3) scFv - dobradiça IgG4 (CH2 (L235D, N297Q0)-CH3) -CD28 TM - 4-1BB - CD3z - T2A - EGFRt) também foi avaliado. Camundongos portadores de tumores MDA-MB-231 (150-250 mmº) foram utilizados para estudos in vivo para avaliar células 4M5.3-CAR-T. Na primeira parte do estudo, 10 ou 20 milhões de células 4M5.3-CAR-T foram administradas e 500 nmol/kg de EC17 foi administrado i.v. por semana nos dias 2, 9, 16, 23, etc. após a administração de CAR-T (como mostrado na FIG. 2A). Os camundongos administrados com 10 ou 20 milhões de células 4M5.3-CAR-T não mostraram CRS grave ou perda de peso corporal após a administração de uma dose de ECl17 (FIG. 6B), mas todos os seus tumores foram reduzidos e eventualmente desapareceram (FIG. 6A). 20 milhões de células T CAR (linha superior) mostraram melhor atividade antitumoral do que 10 milhões de células T CAR (linha média).
[00378] Na segunda parte do estudo, as células 4M5.3- CAR-T utilizadas foram cultivadas in vitro durante cerca de 2 semanas. Foram administrados 30 milhões de células 4M5.3-CAR- T ea dosagem de EC1l7 foi modificada para diminuir a redução do escalonamento de escala. Como mostrado na Fig. 2B, 500 nmol/kg de ECl7 foram administrados 2 dias após a administração de CAR-T, então uma dose mais baixa de EC1l7 (5 ou 20 ou 100 nmol/kg) foi administrada por semana (nos dias 9, 16, 23, etc. após a administração de CAR-T). Como mostrado na Fig. 4A, grupo de redução no escalonamento de dose EC17 de 100 nmol/kg mostrou a melhor atividade antitumoral e todos os tumores foram curados (linha inferior), enquanto que nem o grupo EC17 de 5 nmol/kg (segunda linha do topo) nem o grupo de EC1I7 de 20 nmol/kg (terceira linha a partir do topo) mostrou uma resposta completa à terapia CAR-T. Os dados indicam que a atividade CAR-T é controlada pela dose de EC-17 usada para redução no escalonamento de dose. Além disso, como mostrado na Fig. 4B, a perda de peso corporal de camundongos nos três grupos de redução no escalonamento de dose também dependia da dose de EC17. O grupo de redução de escalonamento de dose de 100 nmol/kg de EC1l7 mostrou mais perda de peso corporal do que os outros dois grupos com 5 ou 20 nmol/kg de EC17. Esses dados indicam que a redução no escalonamento de dose da ponte (uma dose de carregamento de alto nível seguida de doses reduzidas de manutenção) pode controlar a atividade antitumoral e a toxicidade da terapia com CAR-T.
[00379] A única diferença entre E2-CAR e 4M5.3-CAR são as sequências scFv usadas. Ao comparar esses dois CARS com as mesmas condições, 10 milhões de células E2-CAR-T apresentaram melhor atividade antitumoral do que 10 milhões de células 4M5.3-CAR-T; 30 milhões de células E2-CAR-T também apresentaram melhor atividade antitumoral do que 30 milhões de células 4M5.3-CAR-T quando foi testada a redução da dose de EC17 (5, 20 ou 100 nmol/kg).
[00380] Como usado aqui, “SEQ ID NO: 4” significa a sequência que começa no códon “gac” sublinhado e termina no códon “ggc” sublinhado. Esta parte da sequência mais longa codifica o CAR 4M5.3 exemplar. O CAR é inserido na membrana das células T. As outras frações da sequência mais longa incluem a sequência de codificação para peptídeos de sinal, o domínio EGFRt, etc., que não fazem parte do CAR inserido na membrana e que funciona como receptor de antígeno quimérico.
Conforme usado neste documento, “SEQ ID NO: 3” significa a sequência que começa no “D” sublinhado e termina com o “G” sublinhado. Essa fração da sequência mais longa é a sequência de aminoácidos do CAR que é inserida na membrana da célula T. As outras frações da sequência mais longa incluem sequências de aminoácidos para peptídeos de sinal, o domínio EGFRt, etc. que não fazem parte do CAR inserido na membrana e que funciona como receptor de antígeno quimérico. Em ainda outra modalidade, a SEQ ID NO: 3 pode compreender ou consistir em sequências de aminoácidos humanizadas ou humanas. SEQ ID NOS: 3 e 4 são como descritas acima. Os códons de início e de parada na sequência mais longa de ácido nucleico estão sublinhados e a sequência mais longa é uma sequência exemplar que pode ser usada para a transdução de células T para preparar o CAR 4M5.3.
SEQ TID NO: 3 [4M5.3-CAR sequência de aminoácidos (inserto)]
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDVVMTOTPLSLPVSLGDOASISCRSSQOSLVHSNG NTYLRWYLQOKPGQOSPKVLIYKVSNRVSGVPDRFSGSGSGTDFTLKINRVEAEDLGVYFCSQ STHVPWTFGGGTKLEIKSSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDGGVKLDETGGGLVQPGGAMK LSCVTSGFTFGHYWMNWVROSPEKGLEWVAQFRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSS VYLOMNNLRVEDTGIYYCTGASYGMEYLGQOGTSVTVSESKYGPPCPPCPAPEFDGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQOSTYRVV SVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQOPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGOQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWOEGNVFSC SVMHEALHNHYTOKSLSLSLGKMEFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIF KQPFMRPVOTTOEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQOGONQLYNELNLGRRE EYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPOEGLYNELQOKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQ GLSTATKDTYDALHMOALPPRLEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPRMLLLVTSLLLCELPHP AFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLD POELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQOFSLAVVSLNITSLG LRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQOKTKIISNRGENSCKATGOVCHALC SPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPOAMNITC TGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPG
LEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM SEQ ID NO: 4 [4M5.3-CAR sequência de ácido nucleotídico (inserto)] ATG (INÍCIO) cttetcctaggtgacaagecttetgctetgtgagttaccacaceca gcattcctectgateccagacgttoataatgacccagacecetetgtetetececgtaaget tgggegaccaggegageatetettgteggtetteceagtecetagtecatteaaacageaa tacttacttgecggtggtacttgcagaagcceggteaatececaaaagtgectgatatacaag gttagcaatcegggtcagtggagtgccegacegetteageggaageggatecegggactgact tcactctgaagatcaaccegggtagaagcetgaagaccetaggggtgtacttetgcteteagte aacacacgtgccatggacctttggaggtggcaccaagetggaaatcaaatcatceageggac gatgccaaaaaagacgcggccaagaaggacgatgccaagaaggatgatgctaaaaaggato gceggagtcaaattagacgagacaggegggggactggtgcagcceggeggtgccatgaaact gtcttgtgtgaccageggetttacettegggeattattagatgaactgggtgegacagtet ccagagaaagggctegagtgggtggeccagtttegaaataaacegtacaattatgagacct actattcagattctgtgaaagggegetteactattteacgegacgacagcaaaagttecgt ctaccttcagatgaacaaccttagagtggaggataccggaatatactactgcacgggtgce agttatggcatggagtacttaggggcaggggacatcetatgacegtttcetgagagcaagtacg gaccegecetgecececttgecetgececegagttegacggeggacecagegtgttectagtt ccceceecaageceaaggacaccectgatgateageceggacececegaggtgaccetgegtagtga gtggacgtgagccaggaagatccegaggtecagtteaattggtacgtagacggegtgagaag tgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagttccagagcacctacegggtggtagte tgtgctgacegtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagaatacaagtgcaaggtagtec aacaagggcctgcccagecageategaaaagaccateageaaggecaagggecagectegeg agcccecaggtgtacaccetgeeteceteceaggaagagatgaccaagaaccaggtgtecet gacctgcetggtaaagggettetaceceagegacategecgtggagtaggagagcaacgge cagcctgagaacaactacaagaccaccecetecegtgetggacagegacggeagettettee tgtacagceggectgacegtggacaagagceggtggcaggaaggeaacgtetttagctgcag cgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagagccetgagcectgtecetagge aagatgttctgggtgcetagtagtagtgggeggggtgctggectgctacagectgctagtga cagtggcetteateatettttgggtgaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaa acaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgcegattt ccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgcgggtgaagttcagcagaagegecgacgece ctgccetaccagcagggecagaateagetgtacaacgagctgaacctagggcagaagggaaga gtacgacgtcctggataageggagaggcegggacceetgagatgggeggeaagecteggegg aagaacccccaggaaggectgtataacgaactgcagaaagacaagatggcegaggectaca gegagatceggcatgaagggegageggaggeggggeaagggecacgacggectatatcaggg cetgtecacegecaceaaggatacctacgacgcecetagcacatgcaggecetgecececaagg ctcegagggeggeggagagggcagaggaagtcttcetaacatgeggtgacgtggaggagaatce ceggecetaggatgettetectagtgacaagecttetgetetgtgagttaccacacecage attccetectgateccacgecaaagtgatataacggaataggtattagtgaatttaaagactca ctcetccataaatgctacgaatattaaacacttcaaaaactgcacctcceateagtaggegate tcecacatectgecagtageatttaggggtgactectteacacatactectectetggatec acaggaactggatattctgaaaaccgtaaaggaaatcacagggtttttgctgattcagget tggcctgaaaacaggacggacctecatgcectttgagaacctagaaatcatacgcggcagga ccaagcaacatggtcagttttetettgcagtegteagectgaacataacatecttgggatt acgcteceteaaggagataagtgatggagatgtgataatttcaggaaacaaaaatttgtgeo tatgcaaatacaataaactggaaaaaactgtttgggacctceggteagaaaaccaaaatta taagcaacagaggtgaaaacagctgcaaggccacaggccaggtetgecatacettgtacte ccecegagggetgetaggggeceggageceagggactgegtetettgeeggaatgteagecega ggcagggaatgcgtggacaagtgcaaccttctagaggagtgagccaagggagtttgtggaga actctgagtgcatacagtgccacccagagtgectgecteaggecatgaacatcaccetgcac aggacggggaccagacaactgtatccagtgtgeccactacattgacggececeactgegte aagacctgcceggcaggagtcatgggagaaaacaacaccectaggtetggaagtacgcagacg ceggeccatgtgtgecacetgtgccatecaaactgcacetacggatgcactgggecaggtet tgaaggctgtccaacgaatagggectaagatecegtecategecactgggatagtaggggee ctectettgetgetagtagtggecetagggateggectetteataTGA (STOP CODON) EXEMPLO 2.
CARACTERIZAÇÃO DE FENÓTIPOS DE DIFERENCIAÇÃO DE CÉLULAS CAR ANTES DA INFUSÃO EM CAMUNDONGOS NSG
[00381] A citometria de fluxo multicolor foi usada para determinar os fenótipos de produtos de células T CAR a serem infundidos em camundongos portadores de tumor. O status de diferenciação dos subconjuntos CD4+ e CD8+ foi analisado usando combinações específicas de marcadores de superfície, como mostrado na FIG. 7A. O produto de células T CAR fac- símile E2 clínicas não classificadas foi feito predominantemente do fenótipo Tscm/Tecm de auto-renovação (FIG. 7B). Na FIG. 7B, a barra mais alta é “Tscm” e a barra inferior é “Tcm”. Além das diferenças nas proporções CD8: CD4 mostradas na FIG. 8A, as células T CAR T fac-símile E2 clínicas atuais eram diferentes das células T CAR-T E2/4M5.3 previamente classificadas e preparações GFP+ 4M5.3 CAR T iniciais do estudo in vivo (resumidas como gráficos de pizza na FIG. 8B). Na FIG. 8A, nos 10 grupos da esquerda para a direita, as barras representam o seguinte - 1 (barra superior Tscm, barra inferior Tem), 2 - (barra superior Tscm, barra inferior Tcm), 3 - (barra superior Teff, barra inferior Tem), 4 - (barra superior Tem, barra inferior Teff, barra inferior Tem), 5 - (barra superior Teff, barra inferior Tem), 6 - (barra superior Tem, barra inferior Teff, barra inferior Tem), 7 - (alta barra Teff, barra inferior Tscm), 8 - (barra superior Teff, barra inferior Tem), 9 - (barra superior Teff, barra inferior Tscm), 10 - (barra superior Teff, barra inferior Tscm), 10 - (barra superior Teff, barra inferior Tscm). Por conseguinte, esperava-se que as células T CAR de fenótipo predominantemente Tscm/Tcm possuíssem um fenótipo antitumoral superior quando comparadas com preparações T CAR anteriores que possuem um fenótipo Tem/Teff mais diferenciado. Pela mesma razão, O SCRS surge mais tarde para a preparação CAR-T atual do que para as preparações CAR-T anteriores que receberam os mesmos regimes de dosagem ECl7.
Recuperação de células T CAR após criopreservação
[00382] As células T CAR criopreservadas foram rapidamente descongeladas em banho-maria a 37ºC e imediatamente colocadas no meio de recuperação de células T (TexMACS" Media contendo glutamina (Miltenyi Biotec *fÀ 130- 097-196) suplementado com soro AB humano a 2%) e 50 U/mL de IL2 humana recombinante e cultivada in vitro por aproximadamente 3 a 5 dias para recuperação de células T.
Análise por citometria de fluxo
[00383] As células T CAR foram coletadas a partir de meios de recuperação in vitro e sedimentadas por centrifugação a 400g durante 5 minutos. As células T foram então ressuspensas em solução de coloração por citometria de fluxo [albumina sérica bovina a 1%, IgG humana 50mg/mL (Equitech Bio, cat * SLH56- 0001), azida de sódio a 0,9% em solução salina tamponada com fosfato, pH = 7,4] suplementada com ambos os receptores anti-FcyIII/II de camundongo (CD16/CD32) bloqueiam [clone 2.4G2; BD Bioscience, catálogo * 553142 na diluição 1: 100 (v/v)] e anti-Fc Block humano [BD Biosciences, catálogo * 564220 na diluição 1:50 (v/v)]. A coloração do marcador de superfície foi realizada com a adição dos seguintes anticorpos monoclonais conjugados com fluorocromo adicionados a cada amostra por 20 minutos em gelo no escuro: anti-CD45RA-APCeF780 humano [clone HI100, ThermoFisher H4 47-0458-42 em diluição 1:20 (v/v)]l, anti- CD45RO-eF450 humano [clone UCHLl, Thermofisher * 48-0457-42 em diluição 1:20 (v/v)], anti-CD8a-PECy7 humano [clone RPA- T8, BD Bioscience, catálogo * 557746 em diluição 1:20 (v/v)], anti-CD4-Percpe710 humano [clone SK3, eBioscience catálogo + 46-0047-42 em diluição 1:20 (v/v)]l, anti- EGFR biotinilado humano (Cetuximab; P&D Systems * FAB9577B- 100 em 1:10 (v/v) seguido por anti-biotina conjugada com PE (BioLegend * 53- 9895-82 em 1: 400 (v/v). Após a coloração do marcador de superfície, as células T foram lavadas com PBS e ressuspensas em PBS frio contendo 3uM de iodeto de propídio e transferidas para tubos de coleta de citometria de fluxo.
Os dados da citometria de fluxo foram coletados no citômetro de fluxo Gallios (Beckman Coulter, Brea, CA), onde um mínimo de 20.000 eventos foram coletados e os dados foram analisados usando o software Kaluza vl.5.
EXEMPLO 3.
ANTICORPO ANTI-FITC E2 NÃO SE LIGA A NENHUM TECIDO
HUMANO NORMAL
[00384] Um anticorpo IgG anti-FITC E2 com as mesmas sequências de fragmentos variável como aqueles em construto anti-FITC CAR E2 foi usado para testar se o anticorpo E2 tem qualquer ligação aos tecidos normais humanos. Um IgGl anti- FITC E2 Lambda 1 humano recombinante foi expresso em células HEK293 e purificado usando uma coluna de afinidade de proteína A. A pureza do anticorpo era superior a 98% usando a análise SEC-HPLC. O anticorpo foi marcado com digoxigenina (DIG) usando o kit de marcação de anticorpos Mix-N-Stain DIG (Biotium). A afinidade de ligação do anticorpo E2 marcado com DIG para os grânulos imobilizados com FITC foi medida por FACS. Várias concentrações de IgG DIGE2 foram incubadas com grânulos imobilizados por FITC por 30 min em temperatura ambiente. Após a lavagemy um Ab monoclonal anti-DIG foi adicionado e incubado com grânulos por 30 min. Um anticorpo secundário anticamundongo conjugado com erF660 foi adicionado e incubado com os grânulos lavados. Os grânulos lavados foram analisados quanto ao sinal erF660 por FACS. Os grânulos imobilizados com PE foram usados como grânulos de controle negativo. A intensidade de fluorescência de erF660 foi plotada contra as concentrações de E2-IgG marcado com DIG adicionado e mostrada na FIG. 9. A afinidade de ligação do anticorpo E2 marcado com DIG30 para FITC foi calculada usando o software PRISM. Como indicado na FIG. No inserto 9B, o Kd era de cerca de 0,66 nM, indicando que o anticorpo anti-FITC E2 marcado com DIG tem alta afinidade de ligação para FITC e pode ser usado para avaliar a ligação de E2 aos tecidos humanos normais.
[00385] Un ensaio IHC foi desenvolvido para testar a ligação de anticorpo E2 aos tecidos humanos. A seção de tecido fixada em formalina e embebida em parafina (FFEP) do bloco de ágar com células KB marcadas com FITC foi usada como controle positivo, enquanto a seção de tecido FFPE de células KB não marcadas foi usada como controle negativo. As seções de tecido foram desparafinizadas e reidratadas; a recuperação do antígeno foi realizada incubando as seções de tecido com um tampão de recuperação de antígeno (pH 6,0) a 91ºC por 24 minutos; em seguida, o anticorpo DIG-E2 foi incubado com seções de tecido reidratado e foi realizada coloração anti-
DIG IH. Em resumo, um anticorpo monoclonal anti-DIG foi adicionado e incubado, seguido por um anticorpo secundário anticamundongo marcado com peroxidase. Como mostrado na Fig. 10A, as células KB marcadas com FITC mostraram coloração positiva, indicando que o anticorpo E2 se liga ao FITC nessas células KB marcadas. As células KB não marcadas não mostraram nenhuma coloração (FIG. 10B).
[00386] O anticorpo E2 marcado com DIG foi incubado com um microarranjo de tecido normal de múltiplos órgãos humanos (FDA999, US Biomax, Inc) e a ligação do anticorpo E2 aos tecidos normais humanos foi avaliada usando o mesmo procedimento de IHC nas mesmas condições descritas acima. Este microarranjo de tecido normal de múltiplos órgãos tem 99 núcleos com 28 tipos de órgãos humanos normais, incluindo glândula adrenal (FIG. 11), medula óssea (FIG. 12), mama (FIG. 13), tecido do cerebelo (FIG. 14), colo do útero (FIG. 15), cólon (FIG. 16), esôfago (FIG 17), olho (FIG. 18), coração (FIG. 19), hipófise (FIG. 20), rim (FIG. 21), laringe (FIG. 22), fígado (FIG. 24), pulmão (FIG. 25), linfonodo (FIG. 26), nervo (FIG. 27), ovário (FIG. 28), pâncreas (FIG. 29), próstata (FIG. 30), pele (FIG. 31), intestino delgado (FIG. 32), baço (FIG. 23), estômago FIG. 33), músculo estriado (FIG. 34), testículos (FIG. 35), glândula timo (FIG.
36), língua (FIG. 37) , e útero (FIG. 38). Os órgãos retirados de pelo menos três indivíduos humanos normais foram incluídos no painel de microarranjos. Como mostrado nas Figs. 11-38, nenhuma coloração positiva de IHC foi encontrada em nenhum desses 28 tipos de órgãos humanos normais testados, indicando que o anticorpo E2 anti-FITC não possui nenhuma ligação com tecidos normais de órgãos humanos. Algumas células plasmáticas mostraram certos níveis de intensidade de coloração em ambas as seções de teste pré-incubadas com anticorpo DIG-E2 e as seções de controle negativo sem pré- incubação com anticorpo DIG-E2, indicando que esta coloração fraca era inespecífica.
[00387] Em conclusão, o anticorpo anti-E2 FITC não se liga com todos os tecidos normais de órgãos humanos testados, indicando que a célula anti-FITC CAR-T E2 em si não deve se ligar a e atacar quaisquer tecidos normais humanos in vivo.
EXEMPLO 4.
SÍNTESE DE FITC-FOLATO
Ho ps 7 Cs 9 cor $ (OT ESTO A Mo A eo n NONO MT i
HAN NONÔ
[00388] Folato-y-etilenodiamina foi acoplado ao isotiocianato de fluoresceína (FITC) isômero 1 (Sigma- Aldrich) em dimetilsulfóxido anidro (DMF) na presença de tetrametilguanidina e di-isopropilamina. O produto bruto foi carregado em uma coluna de HPLC preparatória Xterra RP18 (Waters) e eluído com condições de gradientes começando com 99% de fosfato de sódio 5 mM (fase móvel A, pH 7,4) e 1% de acetonitrila (fase móvel B) e atingindo 90% A e 10% B em 10 minutos a uma vazão de 20 mL/min. Sob essas condições, o pico principal do FITC folato geralmente elui de 27 a 50 minutos. A qualidade da fração FITC-folato foi monitorada por HPLC analítico de fase reversa com um detector de UV. As frações com pureza superior a 98,0% (LCMS) foram liofilizadas para se obter o produto FITC-folato final. Como conhecido na técnica, o composto com esta estrutura também é referido como EC1l7. EXEMPLO 5.
SÍNTESE DE FITC-PEG12-FOLATO Ho (O to 1 do Q GÇçoH à ú $ É Dos re JA a A a a
XI Hon" NON
[00389] A resina Nova Tag" de polietilenoglicol (PEG) universal (0,2 g) foi carregada em um recipiente de síntese peptídica e lavada com álcool isopropílico (i- PrOH) (3 x 10 mL) e dimetilformamida (DMF, 3 x 10 mL). A desproteção de 9- fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc) foi realizada usando piperidina a 20% em DMF (3 x 10 mL). Testes de Kaiser foram realizados para avaliar o progresso da reação. Ao recipiente foi introduzida uma solução de éster 5-terc-butílico do ácido Fmoc-L-glutâmico (Fmoc-Glu- (Ot-Bu)-OH) (23,5 mg) em DMF, N,N- diisopropiletilamina (i-Pr2oNEt) (4 equiv), e hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il- oxitripirrolidinofosfônio (PyBOP) (2 equiv). A desproteção de Fmoc foi realizada utilizando piperidina a 20% em DMF (3 x 10 mL). Para o recipiente foi então introduzido uma solução de N!º-TFA-Pte-OH (22,5 mg), DMF, i-PraWNEt (4 equiv), e PyBOP (2 equiv). O argônio foi borbulhado durante 2 horas e a resina foi lavada com DMF (3 x 3 mL) e i-PrOH (3 x 3 mL). Após inchar a resina em diclorometano (DCM), foi adicionada uma solução de hidroxibenzotriazol 1M (HOBT) em DCM/trifluoroetano (TFE) (1: 1) (2 x 3 mL). O argônio foi borbulhado durante 1 h, o solvente foi removido e a resina foi lavada com DMF (3 x 3 mL) e i-PrOH (3 x 3 mL). Após inchar a resina em DMF, adicionou-se uma solução de Emoc-NH- (PEG) 12-COOH (46,3 mg) em DMF, i-PrAaNEt (4 equiv) e PyBOP (2 equiv). O argônio foi borbulhado durante 2 horas e a resina foi lavada com DMF (3 x 3 mL) e i-PrOH (3 x 3 mL). A desproteção de Fmoc foi realizada utilizando piperidina a 20% em DMF (3 x 10 mL). Testes de Kaiser foram realizados para avaliar o progresso da reação.
No recipiente foi então introduzida uma solução de FITC (Life Technologies 21,4 mg) em DMF e i-Pr/WNEt (4 equiv), então argônio foi borbulhado por 2h, ea resina foi lavada com DMF (3 x 3 mL) e i-PrOH (3 x 3 mL). Em seguida, ao recipiente foi adicionado 2% de NHANH>; em DMF (2 x 2 mL). O composto final foi clivado a partir da resina usando um TFA:H20:tri-isopropilsilano (TIS) (95: 2,5: 2,5) (Solução A clivagem) e concentrado sob vácuo.
O produto concentrado foi precipitado em Et20 e seco sob vácuo.
O produto em bruto foi purificado usando RP-HPLC preparativa (fase móvel: A = acetato de amônio 10 mM, pH = 7, B = ACN; método: 0% B a 30% B em 30 min a 13 mL/min). As frações puras foram reunidas e liofilizadas, proporcionando o FITC-PEG12- Folato. EXEMPLO 6. SÍNTESE DE FITC-PEG20-FOLATO Ho
À
O ta
IS O = ls fo à SO K/ o H Ã AZ cor 9 PI NAO OO RIO ONOON dae! E 10 DA &h HN [ O: Bo NÃO
[00390] À resina etilenodiamina, ligada ao polímero (malha 200-400) (50 mg) foi carregada em um recipiente de síntese de peptídeos e inchada com DCM (3 mL) seguido de DMF (3 mL). No recipiente foi então introduzida a solução de Fmoc-PEG20-COOH (131 mg, 1,0 equiv) em DMF, i-Pr*NEt (6,0 equiv) e PyBOP (4,0 equiv). O argônio foi borbulhado durante 6 horas, a solução de acoplamento foi drenada e a resina foi lavada com DMF (3 x 10 mL) e i-PrOH (3 x 10 mL). Testes de Kaiser foram realizados para avaliar o progresso da reação. À desproteção de Fmoc foi realizada usando piperidina a 20% em DMF (3 x 10 mL), antes de cada acoplamento de aminoácido. A sequência acima foi repetida para completar a reação com etapas de acoplamento de Fmoc-Glu-OtBu (72 mg, 2,0 equiv) e ácido Tfa.Pteroico (41 mg, 1,2 equiv). A resina foi lavada com hidrazina a 2% em DMF 3 x 10 mL (5 min) para clivar o grupo protetor trifluor-acetil em ácido pteroico e lavada com i-PrOH (3 x 10 mL) seguido de DMF (3 x 10 mL). A resina foi seca sob argônio durante 30 min. O folato-peptídeo foi clivado a partir da resina usando a solução de clivagem. Introduziram-se 10 ml da mistura de clivagem e argônio foi borbulhado durante 1,5 hora. A mistura de clivagem foi drenada para um frasco limpo. A resina foi lavada 3 vezes com mais mistura de clivagem. A mistura combinada foi concentrada sob pressão reduzida para um volume menor (- 5 mL) e precipitada em éter etílico.
[00391] O precipitado foi coletado por centrifugação, lavado com éter etílico (3 vezes) e seco sob alto vácuo. O Folato-PEG».-EDA seco (1,0 equiv) foi tratado com FITC (50 mg, 1,5 equiv) em DMSO e DIPEA em temperatura ambiente. Progresso da reação monitorada por LCMS. Após 8 horas, o material de partida foi consumido para gerar o produto. A mistura de reação bruta foi purificada por HPLC preparativa (fase móvel A = acetato de amônio 10mMM, pH = 7; fase orgânica B = acetonitrila; método: 0% B a 30% B em 35 minutos a 13 mL/min) e gerou FITC-PEG20-Folato com 60% de rendimento.
EXEMPLO 7.
SÍNTESE DE FITC-PEG108-FOLATO Ho Lo O . q SoM Ni A 8 À a: Lo LO TA OAÍIAO
HNTNONÕ
[00392] A resina etilenodiamina ligada ao polímero (malha 200-400) (50 mg) foi carregada em um recipiente de síntese peptídica e inchada com DCM (3 mL) seguido de DMF (3 mL). No recipiente foi então introduzida a solução Fmoc-PEG36- COOH (161 mg, 1,0 equiv) em DMF, i-Pr.NEt (6,0 equiv) e PyBOP (4,0 equiv). O argônio foi borbulhado durante 6 horas, a solução de acoplamento foi drenada e a resina foi lavada com DMF (3 x 10 mL) e i-PrOH (3 x 10 mL). Testes de Kaiser foram realizados para avaliar o progresso da reação. A desproteção de Fmoc foi realizada usando piperidina a 20% em DMF (3 x 10 mL), antes de cada acoplamento de aminoácido. A sequência acima foi repetida para completar a reação com 2X de Fmoc-PEG 36-COOH (161 mg, 1,0 equiv), Fmoc-Glu-OtBu (72 mg, 2,0 equiv) e etapas de acoplamento de ácido Tfa-Pteroico. No final, a resina foi lavada com 2% de hidrazina em DMF 3 x l0mL (5 min) para clivar o grupo protetor trifluor-acetil em ácido pteroico e lavada com i-PrOH (3 x 10mL) seguido por DMF (3 x 10mL). A resina foi seca sob argônio durante 30 min. O folato-peptídeo foi clivado a partir da resina usando a solução de clivagem. Introduziram-se 10 ml da mistura de clivagem e argônio foi borbulhado durante 1,5 hora. A mistura de clivagem foi drenada para um frasco limpo. A resina foi lavada 3X com mais solução de clivagem. A mistura combinada foi concentrada sob pressão reduzida para um volume menor (- mL) e precipitada em éter etílico.
[00393] O precipitado foi coletado por centrifugação, lavado com éter etílico (3X) e seco sob alto vácuo. O Folato- PEG:0o8g-EDA seco (1,0 equiv) foi tratado com FITC (50 mg, 1,5 equiv) em DMSO e DIPEA em temperatura ambiente. O progresso da reação foi monitorado por LCMS. Após 10 horas, o material de partida foi consumido para gerar o produto. A mistura de reação bruta foi purificada por HPLC preparativa (fase móvel A = acetato de amônio 10mM, pH = 7; fase orgânica B = acetonitrila; método: 0% B a 30% B em 35 minutos a 13 mL/min) e gerou FITC-PEG108-Folato com 64% de rendimento.
EXEMPLO 8.
SÍNTESE DE FITC-DUPA o o COOH TOO RA! Fon O | oo & e. À, z ái O or
[00394] DUPA-FITC foi sintetizado pela metodologia de fase sólida como a seguir. A resina Universal Nova TagTM (50 mg, 0,53 mM) foi inchada com DCM (3 mL) seguido por DMF 3 mL). Uma solução de piperidina a 20% em DMF (3 x 3 mL) foi adicionada à resina e argônio foi borbulhado por 5 min. A resina foi lavada com DMF (3 x 3 mL) e álcool isopropílico (i-ProH, 3 x 3 mL). Após o inchaço da resina em DMF, foi adicionada uma solução de DUPA-(OtBu)-OH (1,5 equiv), HATU (2,5 equiv) e i-PraNEt (4,0 equiv) em DMF. Argônio foi borbulhado por 2 horas, e a resina foi lavada com DMF (3 x 3 mL) e i-PrOH (3 x 3 mL). Após inchar a resina em DCM, foi adicionada uma solução de HOBt 1 M em DCM/TFE (1: 1) (2 x 3 mL). Argônio foi borbulhado por 1 hora, o solvente foi removido e a resina foi lavada com DMF (3 x 3 mL) e i-PrOH (3 x 3 mL). Após inchar a resina em DMF, foi adicionada uma solução de Fmoc-Phe-OH (2,5 equiv), HATU (2,5 equiv) e DIPEA (4,0 equiv) em DMF. Argônio foi borbulhado por 2 horas, e a resina foi lavada com DMF (3 x 3 mL) e i-PrOH (3 x 3 mL). A sequência acima foi repetida para mais 2 etapas de acoplamento para adição de ácido 8-amino-octanóico e isotiocianato de fluoresceína ou isotiocianato de rodamina B.
O composto final foi clivado da resina utilizando a Solução de Clivagem e concentrado sob vácuo.
O produto concentrado foi precipitado em éter dietílico e seco sob vácuo.
O produto em bruto foi purificado utilizando RP-HPLC preparativa [X = 488 nm; gradiente de solvente: 1% B a 80% B em 25 min, 80% B lavagem 30 min corrida; A = 10 mM de NH40Ac, pH = 7; B = acetonitrila (ACN)]. A ACN foi removida sob vácuo e as frações purificadas foram liofilizadas para produzir FITC- DUPA como um sólido laranja acastanhado.
RP-HPLC: tR = 8,0 min (A = 10 mM NH;OAc, pH = 7,0; B = ACN, gradiente de solvente: 13 B a 50% B em 10 minutos, 80% B lavagem por 15 minutos). 1H NMR (DMSO-d6/D20): 3 0,98-1,27 (ms, 9H); 1,45 (b, 3H); 1,68-1,85 (ms, 11H); 'H NMR (DMSO-d6/D20): 0,98-1,27 (ms, 9H); 1,45 (b, 3H); 1,68-1,85 (ms, 11H); 2,03 (m, 8H); 2,6-3,44 (ms, 12H); 3,82 (b, 2H); 4,35 (m, 1H); 6,53 (dy, J = 8,1 Hz, 2H), 6,61 (dd, J = 5,3, 3,5 Hz, 2H); 6,64 (s, 2H); 7,05 (dy, JIJ = 8,2 Hz, 2H), 7,19 (my, 5H); 7,76 (df, IJ = 8,0 Hz, 1H); 8,38 (s, 1H). HRMS (ESI) (m/z): (M + H)+ calculado para CsiHs9N;015S, 1040.3712, encontrado, 1040,3702. UV/vis: À máx = 491 nm.
EXEMPLO 9.
SÍNTESE DE FITC-PEG12-DUPA . mo À a ESPN AÔR ASA RAOOSPSO CooH xs y rx x o é) 1). À Lsenon . É E N õ Former Ss o jo ou
[00395] À resina de 1,2-diaminoetano tritil (0,025 g9) foi carregada em um recipiente de síntese peptídica e lavada com i-PrOH (3 x 10 mL), seguido por DMF (3 x 10 mL). Ao recipiente foi introduzida uma solução de Fmoc-NH- (PEG)12-COOH (42,8 mg) em DMF, i-PrNEt (2.5 equiv), e PyBOP (2.5 equiv). A solução resultante foi borbulhada com Ar durante 1 hora, a solução de acoplamento foi drenada e a resina lavada com DMF (3 x 10 mL) e i-PrOH (3 x 10 mL). Testes de Kaiser foram realizados para avaliar o progresso da reação. A desproteção de Fmoc foi realizada utilizando piperidina a 20% em DMF (3 x mL). Este procedimento foi repetido para completar todas as etapas de acoplamento (2 x 1,5 equiv de Emoc-Phe-OH e 1,5 equiv de ácido 8-amino-octanoico e 1,2 equiv de DUPA foram usados em cada uma das respectivas etapas de acoplamento). Após o acoplamento DUPA, a resina foi lavada com DMF (3 x 10 mL) e i-ProOH (3 x 10 mL) e seca sob pressão reduzida.
O peptídeo foi clivado da resina no recipiente de síntese peptídica usando a solução de clivagem.
Quinze mL da solução de clivagem foram adicionados ao recipiente de síntese de peptídeos e a reação foi borbulhada sob Ar por 15 min.
A resina foi tratada com duas quantidades adicionais de 10 mL da solução de clivagem por 5 min cada.
A mistura de clivagem foi concentrada até cerca de 5 mL e precipitada com éter etílico.
O precipitado foi coletado por centrifugação, lavado com éter etílico (3X) e seco sob alto vácuo, resultando na recuperação do material bruto.
A uma solução agitada do DUPA- (PEG)12-EDA (10 mg) e FITC (5,6 mg) em dimetilsulfóxido (DMSO, 1 mL) foi adicionado i-PrNEt (5 equiv) em temperatura ambiente e agitado durante 6 h sob argônio.
A reação foi monitorada por LCMS e purificada por HPLC preparativa (fase móvel: A = acetato de amônio 10 mM, pH = 7, B = ACN; método: 0% B a 50% B em 30 min a 13 mL/min). As frações purificadas foram reunidas e liofilizadas, fornecendo o FITCPEG12-DUPA.
EXEMPLO 10. SÍNTESE DE FITC-PEG11-NK1 ds O | o O A * nx o) Hoze O o Dão LO CO Po QDO DATADA O Ao
[00396] À uma solução agitada de NK-1 (0,02 gg, 0,0433 mmol, 1,0 eq.), O- (2-Aminoetil)- O'-[2- (Boc- amino) etil]decaetileno glicol (BocNH-PEGu:-NH2) (Sigma, 0,0336 g, 0,0521 mmol, 1,2 eq.), Benzotriazol-1-i1l- oxitripirrolidinofosfônio hexafluorofosfato (PyBOP) (0,027 g, 0,0521 mmol, 1.2 eq.) em CHCl>, seco foi adicionado N,N-Di- isopropiletilamina (DIPEA) (0,076 mL, 0,4338 mmol, 10 eq.) sob argônio em temperatura ambiente. O progresso da reação foi monitorado por LCMS e purificado por RP-HPLC preparativa (Waters, XBridge" Prep C18, coluna de 5 um; 19 x 100 mm, fase móvel A = tampão de acetato de amônio 20 mM, pH 7, B = acetonitrila, gradiente 10 -100% B em 30 min, 13 mL/min, A = 220 nm, 254 nm). As frações puras foram coletadas, todos os solventes “orgânicos foram evaporados e a amostra foi liofilizada por 48 horas para fornecer o NK1-PEGu-NHBoc. Rendimento: 40,13 mg (97%). Ao NK1I-PEG,i-NHBoc (0,0165 g9g, 0,015 mmol) em DCM seco foi adicionado ácido trifluoroacético (TFA, 20 eq.) e a mistura de reação foi agitada por 4 horas em temperatura ambiente O TFA em excesso foi removido, e a solução remanescente foi diluída com água e extraída com CHCl2 (3 x 5 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura, secas (NazszSOs) e concentradas. O resíduo obtido foi seco sob vácuo e usado na etapa seguinte sem purificação adicional. Uma solução agitada de NK1-PEG)-NH> (0,008 g, 0,0081 mmol, 1,0 eq.), Isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Sigma, 0,0037 g, 0,0097 mmol, 1,2 eq.) em dimetilsulfóxido seco (DMSO, 0,3 mL) foi adicionado a di- isopropiletil amina (0,0028 mL, 0,0162 mmol, 2,0 eq.) em temperatura ambiente sob argônio. O progresso da reação foi monitorado por LCMS e o produto foi purificado por RPHPLC preparativa (Waters, XBridge" Prep C18, 5 um; coluna 19 x 100 mm, fase móvel A = tampão de acetato de amônio 20 mM, pH 7, B = acetonitrila, gradiente 10 a 100% de B em 30 min, 13 mL/min, A = 280 nm). As frações puras foram coletadas, todos os solventes orgânicos foram evaporados e a amostra foi liofilizada por 48 horas para fornecer o FITC-PEG11-NK1 em um rendimento de 8,54 mg (77%).
[00397] * Nota: O composto NK-1 foi sintetizado por um procedimento de duas etapas a partir do ligante base, que foi preparado usando um procedimento na literatura. (Ref: DESIGN AND DEVELOPMENT OF NEUROKININ-1 RECEPTOR-BINDING AGENT DELIVERY CONJUGATES, Número de pedido: PCT/US2015/44229; aqui incorporado por referência. EXEMPLO 11. SÍNTESE DE FITC-PEG2-CA9 o HO,ZC Oo So 1,0 O NÃ Bro a AA N OH o A e TO. É NH7
[00398] O ligante CA9 (53,6 mg) foi dissolvido em DMF (2-3 mL) em um frasco de fundo redondo de 50 mL usando uma barra de agitação magnética de Teflon. O ar ambiente foi removido usando um vácuo e substituído por gás nitrogênio, isso foi feito em três ciclos. O frasco de fundo redondo foi mantido sob gás nitrogênio constante. Ao frasco, foram adicionados 28,9 ma de cloridrato de N-(3- dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodi-imida (EDC), seguidos por 21,6 mg de hidrato de l-hidroxibenzotriazol (HOBt) e 18,9 uL de Boc-PEG;-NH;, (Sigma Aldrich) 5,4 ul de trietilamina (TEA) foram adicionados e a reação foi agitada durante a noite. A mistura de reação foi purificada utilizando HPLC e confirmada com UHPLC-MS (m/z alvo de 831). A acetonitrila foi removida utilizando evaporação rotativa em alto vácuo e o produto foi liofilizado. O composto foi misturado com 1: 1 TFA: DCM durante 30 minutos. O TFA/DCM foi removido usando evaporação rotativa em alto vácuo seguida por 30 minutos em alto vácuo. O composto foi então dissolvido em DMF e combinado com 5 equivalentes molares de i-Pr.NEt, 16 mg de isotiocianato de fluoresceína (Life Technologies) e agitado durante 1 hora. A mistura de reação foi purificada por HPLC e o composto alvo foi confirmado com UHPLC-MS (m/z alvo de 1120). As amostras foram liofilizadas e armazenadas a -20ºC.
EXEMPLO 12.
FITC-DUPA
[00399] O DUPA-FITC foi sintetizado pela metodologia de fase sólida da seguinte maneira. A resina NovaTag universal (50 mg, 0,53 mM) foi inchada com diclorometano (DCM) (3 mL) seguido por dimetilformamida (DMF, 3 mL). Uma solução de piperidina a 20% em DMF (3 x 3 mL) foi adicionada à resina e argônio foi borbulhada por 5 minutos. A resina foi lavada com DMF (3 x 3 mL) e álcool isopropílico (i-PrOH, 3 x 3 mL). Após inchar a resina em DMF, foi adicionada uma solução de DUPA- (OtBu)-OH (1,5 equiv), HATU (2,5 equiv) e DIPEA (4,0 equiv) em DMF. O argônio foi borbulhado por 2 horas e a resina foi lavada com DMF (3 x 3 mL) e i-PrOH (3 x 3 mL). Após inchar a resina em DCM, foi adicionada uma solução de HOBt 1M em DCM/trifluoroetano (TFE) (1: 1) (2 x 3 mL). O argônio foi borbulhado durante 1 hora, o solvente foi removido e a resina foi lavada com DMF (3 x 3 mL) e i-PrOH (3 x 3 mL). Após inchar a resina em DMF, foi adicionada uma solução de Fmoc- Phe-OH (2,5 equiv), HATU (2,5 equiv) e DIPEA (4,0 equiv) em DMF.
O argônio foi borbulhado por 2 horas e a resina foi lavada com DMF (3 x 3 mL) e i-PrOH (3 x 3 mL). A sequência acima foi repetida para mais 2 etapas de acoplamento para adição de ácido 8-amino-octanóico e isotiocianato de fluoresceína ou isotiocianato de rodamina B.
O composto final foi clivado da resina utilizando um ácido trifluoroacético (TFA): H20: tri-isopropilsilano: coquetel (95: 2,5: 2,5) e concentrado sob vácuo.
O produto concentrado foi precipitado em éter dietílico e seco sob vácuo.
O produto em bruto foi purificado utilizando RP-HPLC preparativa [X = 488 nm; gradiente de solvente: 1% B a 80% B em 25 min, 80% B lavagem min corrida; A = NH40Ac 10 mM, pH = 7; B = acetonitrila (ACN) ] . A ACN foi removida sob vácuo e as frações puras foram liofilizadas para produzir DUPA-FITC como um sólido laranja acastanhado.
RP-HPLC: tR = 8,0 min (A = 10 mM NH40Ac, pH = 7,0; B = ACN, gradiente de solvente: 1% B a 50% B em 10 minutos, 80% B lavagem por 15 minutos). 1H NMR (DMSO-d6/D20):
0,98-1,27 (ms, 9H); 1,45 (b, 3H); 1,68-1,85 (ms, 11H); 2,03 (m, 8H); 2,6-3,44 (ms, 12H); 3,82 (b, 2H); 4,35 (m, 1H); 6,53 (dy, J = 8,1 Hz, 2H), 6,61 (dd, JIJ = 5,3, 3,5 Hz, 2H); 6,64 (s, 2H); 7,05 (df, J = 8,2 Hz, 2H), 7,19 (my, 5H); 7,76 (d, IJ = 8,0 Hz, 1H); 8,38 (s, 1H). HRMS (ESI) (m/z): (M + H)+ calculado para C5S1H59N7015S, 1040,3712, encontrado, 1040,3702. UV/vis: A máx = 491 nm.
o o r CooH o LAILA AA AS, " x Ee º Õ : E) HANNAH FO o FÃoy EXEMPLO 13.
FITC-CA9
[00400] Em um frasco de fundo redondo de 50 mL, o ligante CA9 (53, 6mg, sintetizado em laboratório) foi dissolvido em uma quantidade desejada de N,N-dimetilformamida (DMF) (2-3 mL), utilizando uma barra de agitação magnética de Teflon. O ar ambiente foi removido usando vácuo e substituído por gás nitrogênio, isso foi feito em três ciclos. Em seguida, o frasco de fundo redondo foi mantido sob gás nitrogênio constante. Ao frasco, 28,9 mg de cloridrato de N- (3-Dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodi-imida (EDC) foi adicionado seguido por 21,6 mo de hidrato de 1- hidroxibenzotriazol (HOBt) e 18,9 ul de Boc-PEG2-NH2 (adquirido de Sigma Aldrich). 5,4puL de trietilamina (TEA) foram adicionados por último e a reação foi deixada agitar durante a noite.
A mistura de reação foi purificada usando HPLC e confirmada com UHPLC-MS (m/z alvo 831). A acetonitrila foi removida utilizando evaporação rotativa em alto vácuo e colocada no liofilizador durante 48 horas.
A desproteção de Boc foi realizada com TFA: DCM 1: 1 por 30 minutos.
O TFA/DCM foi removido usando evaporação rotativa de alto vácuo seguida por 30 minutos em alto vácuo.
O composto foi então dissolvido em DMF e combinado com 5 equivalentes molares de N,N-Di- isopropiletilamina (DIPEA) . 16 mg de isotiocianato de fluoresceína (adquirido da Life Technologies) foram adicionados à solução e OH foi agitado por 1 hora.
A mistura de reação foi purificada por HPLC e o composto alvo foi confirmado com UHPLC-MS (m/z alvo de 1120). As amostras foram colocadas em liofilizador por 48 horas e o composto armazenado a -20ºC.
O SN Any o o fe PD Oo Ss R À NO o Yo [AO SIN H2NO,7S FE 5 O
F NTÁ
F A j JA oÊÉ o. P
O 7
OH EXEMPLO 14. FITC-NKIR
[00401] À uma solução agitada de NK-1 (0,02 g, 0,0433 mmol, 1,0 eq.), O- (2-Aminoetil)-O'-[2-(Boc- amino) etil]decaetilenoglicol (BocNH-PEG11-NH2) (Sigma, 0,0336 g, 0,0521 mmol, 1,2 eq.), Benzotriazol-1-il- oxitripirrolidinofosfônio hexafluorofosfato (PYBOP) (0,027 g, 0,0521 mmol, 1,2 eq.) em CH2Cl2 seco foi adicionado N,N-Di- isopropiletilamina (DIPEA) (0,076 mL, 0,4338 mmol, 10 eq.) sob argônio em temperatura ambiente. O progresso da reação foi monitorado por LCMS e purificado por RP-HPLC preparativa (Waters, XBridge"”" Prep C18, coluna de 5 um; 19 x 100 mm, fase móvel A = tampão de acetato de amônio 20 mM, pH 7, B = acetonitrila, gradiente 10 -100% B em 30 min, 13 mL/min, A = 220 nm, 254 nm). As frações puras foram coletadas, todos os solventes orgânicos evaporados e a amostra liofilizada por 48 horas para fornecer o NK1I-PEG1l1-NHBoc.
Rendimento: 40,13 mg (97%). Ao NK1I-PEG11-NHBoc (0,0165 g, 0,015 mmol) em CH2C1l2 seco foi adicionado ácido trifluoroacético (TFA, 20 eq.) e a mistura de reação foi agitada por 4 horas em temperatura ambiente O excesso de TFA foi removido, diluído com água e extraído usando CH2Cl2 (3x5 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura, secas (Na2S04) e concentradas.
O resíduo obtido foi seco sob vácuo e utilizado na etapa seguinte sem purificação adicional de OH.
Foi adicionada uma solução agitada de NK1-PEG11-NH2 (0,008 g9, 0,0081 mmol, 1,0 eq.), Isotiocianato de fluorescência (FITC) (Sigma, 0,0037 g, 0,0097 mmol, 1,2 eq.) em dimetilsulfóxido seco (DMSO, 0,3 mL) di-isopropiletilamina (0,0028 mL, 0,0162 mmol, 2,0 eq.) em temperatura ambiente sob argônio.
O progresso da reação foi monitorado por LCMS e purificado por RP-HPLC preparativa (Waters, XBridgeTM Prep C18, coluna de 5 um; 19 x 100 mm, fase móvel A = tampão de acetato de amônio mM, pH 7, B = acetonitrila, gradiente 10- 100% de B em 30 min, 13 mL/miny, A = 280 nm). As frações puras foram coletadas, todos os solventes orgânicos foram evaporados e a amostra foi liofilizada por 48 horas para fornecer o NK1- PEG11-FITC (5). Rendimento: 8,54 mg (77%).
[00402] O NK-1 composto foi sintetizado por um procedimento de duas etapas a partir de ligante de base, o qual foi preparado usando um procedimento da literatura. (Ref: DESIGN AND DEVELOPMENT OF NEUROKININ-1 RECEPTOR-BINDING AGENT DELIVERY CONJUGATES, Número de pedido: PCT/US2015/44229, aqui incorporado por referência na sua totalidade).
EXEMPLO 15.
ATIVAÇÃO DE COCULTURA DE E2 CAR T IN VITRO E ENSAIO DE
MORTE CELULAR ALVO
[00403] As células T E2 CAR foram descongeladas e recuperadas da criopreservação em uma densidade celular entre 0,5 milhão a 2 milhões de células T por mililitro de meio de crescimento de células T (meio TexMACS + 2% de soro AB humano + 50 U/mL de IL2 recombinante humana) por 4 dias. As células alvo que expressam diferentes níveis de receptor de folato na superfície também foram descongeladas e recuperadas da criopreservação no meio de crescimento (RPMI1640 com deficiência de folato + 10% de FCS + penicilina/estreptomicina por 4 dias).
[00404] No dia -1, 100.000 células alvo foram colocadas em placas em 2 ml de meio de crescimento por poço de uma placa de cultura de tecidos de 12 poços para permitir que as células-alvo para aderir e se recuperar. No dia 0, os poços que receberam a molécula de ponte EC1l7 foram tratados com EC17 a 100 nM por 30 min na incubadora de cultura de tecidos. Posteriormente, todos os meios foram lavados e substituídos por novos meios de crescimento isentos de folato e ECl7. Durante a incubação com ECl7, as células T foram coletadas, contadas e após o tratamento com ECl7, 100.000 células T E2 CAR foram adicionadas diretamente a cada poço das células alvo em um total de 3 ml de meio de crescimento na proporção de 1: 1 (E : T) e incubadas por 1 e 2 dias sob condições padrão de umidificação de cultura de tecidos de 37ºC a 5% de CO2. As condições de cocultura de um dia foram usadas para testar a ativação das células T E2 CAR pelas células alvo e à incubação de dois dias foi utilizada para avaliar a morte celular alvo.
[00405] Para determinar o nível de atividade das células T E2 CAR após cocultura de um dia com células alvo possuindo diferentes níveis de receptor de folato de superfície, as células flutuantes foram coletadas e agrupadas com as células aderentes restantes que foram removidas usando uma digestão de tripsina de 0,25% de 5 minutos da placa de cultura de tecidos. As células flutuantes e aderentes agrupadas foram sedimentadas com uma etapa de centrifugação por gravidade de
400 x por 5 minutos e depois ressuspensas em solução de coloração por citometria de fluxo. A coloração de marcador de superfície para identificação de células T E2 por meio de citometria de fluxo incluiu anti-EGFR humano e anti-CD3 humano, enquanto a detecção de ativação de células T CAR por meio de citometria de fluxo utilizou uma coloração de anti- CD137 humano. As células T CAR E2 foram identificadas como EGFR+ CD3+ enquanto as células T CAR ativadas também coexpressaram CD137 (ver métodos de citometria de fluxo).
[00406] Para determinar a eficiência da morte de células T E2 CAR de células alvo com diferentes níveis de expressão de receptor de folato de superfície após uma cocultura de dois dias, as células agrupadas e aderentes foram peletizadas da mesma maneira que o ensaio de cocultura de um dia acima, em seguida, coradas para os marcadores de E2 CAR T EGFR e CD3 foram então lavadas e coradas para o marcador de apoptose, anexina V, suspendendo novamente as amostras coradas com anticorpo de fluxo com a Anexina V recombinante conjugada a Alexa Fluor 647 (Invitrogen cat jd A23204 na diluição 1:50 em tampão de coloração de anexina 1X fornecido) com 3uM de iodeto de propídio.
A ativação das células T CAR E2 depende da coloração EC17 das células alvo
[00407] Em um esforço para compreender os níveis de receptor de folato necessários para ativar as células T E2 CAR, coculturas de um dia com células alvo que expressam o receptor de folato de superfície (FR) em níveis variáveis foram realizadas (FIG. 39). O percentual de células T E2 CAR ativadas após a cocultura de um dia é representada graficamente no eixo y, enquanto o nível de expressão FR das células alvo no momento do ensaio é representado graficamente no eixo x.
É importante ressaltar que os dados do nível de expressão de FR foram adquiridos no mesmo dia em que o ensaio foi realizado usando as mesmas células alvo que foram tratadas com ECl7, mas cultivadas sem células T CAR, para evitar que artefatos de células com elevada expressão de FR fossem abatidas pelas células T CAR.
Quatro de cinco linhas celulares alvo que expressam uma ampla gama de receptores de folato ativaram as células T CAR em níveis semelhantes.
Curiosamente, a linhagem de células com baixa expressão de FR, OV90 (triângulo para baixo), expressa cerca de 50% da FR como células SKOV3 (diamante) e ativa cerca de 50% das células T CAR, como as células SKOV3. Esses dados mostram que uma ampla gama de ECl7 ativará as células T E2 CAR para níveis semelhantes, sugerindo que é necessário um certo limiar de EC1l7 ligado à célula alvo para obter a ativação completa das células T E2 CAR. Além disso, também é sugerido que exista um limiar de expressão de FR que fornecerá uma resposta E2 CAR T abaixo do ideal.
Célula alvo da célula T E2 CAR
[00408] Para confirmar que a ativação das células T E2 CAR também se traduz em morte bem-sucedida das células alvo, realizamos um ensaio de cocultura de dois dias e analisamos os eventos das células alvo (EGFR-CD3-) via citometria de fluxo e determinamos o percentual de coloração da célula alvo com o marcador de superfície apoptótico, coloração com anexina V. Na Figura 40, as mesmas cinco células alvo mostradas (conforme rotuladas no eixo x), cada uma cultivada por dois dias em três condições diferentes, mostradas como três barras diferentes. A primeira barra em cada grupo representa o nível basal de apoptose de células alvo, visto que estas eram células alvo tratadas com EC1l7, mas cultivadas na ausência de células T E2 CAR. A segunda barra em cada grupo representa CAR T mais coculturas de células alvo sem qualquer tratamento prévio de células alvo com EC1l7, enquanto a terceira barra em cada grupo representa as células alvo pré-tratadas com CAR T mais EClI7. O eixo y mostra oO percentual de células alvo que são apoptóticas (anexina V +). A partir desses dados, descobriu-se que a ativação das células T CAR se traduz bem na morte celular alvo dos três expressores mais altos de receptor de folato (MDAMB231, HOS- FRa e IGROVI). No entanto, para as células SKOV3 que apresentaram a quarta expressão FR mais baixa (figura 39, eixo x), uma ativação semelhante de E2 CAR T não se traduziu em morte celular semelhante (figura 40). É possível que essa desconexão entre a ativação das células T CAR e a apoptose das células alvo nas células SKOV 3 possa não ser uma função da expressão baixa do receptor de folato. Como afirmado anteriormente, cada célula cancerígena pode ter desenvolvido seu próprio mecanismo anti-apoptótico e é possível que níveis de expressão de FR como o das células SKOV3, mas em uma linhagem de células diferente, sejam suficientes para um nível mais alto de apoptose da célula alvo.
[00409] No seu conjunto, os dados das figuras 39 e figura 40 demonstram que a ligação de ECl7 às células cancerígenas é necessária para a morte de células. Estes dados sugerem ainda que abaixo de um certo limite de EC1l7 ligado à célula alvo existe uma relação linear entre EC17 ligado à superfície e ativação e morte de E2 CAR T.
EXEMPLO 16.
ENSAIO DE LIGAÇÃO AO 3H-ÁCIDO FÓLICO
[00410] Todas as linhagens de células de tumor foram semeadas durante a noite em meio de RPMI isento de folato, contendo 10% de soro fetal de bezerro inativado pelo calor. No dia seguinte, as células foram incubadas por 15 min em gelo com 3H-ácido fólico a 100 nM com e sem ácido fólico frio a 10 uM. Depois de aumentar 3 vezes com PBS 1X frio, as células inteiras foram lisadas e a radioatividade total associada às células foi contada em um contador de cintilação. A ligação específica a FR de *H-ácido fólico foram determinados subtraindo as contagens de amostras de ácido fólico e competiram calculado como o número de moléculas por célula usando a atividade específica de *ºH- ácido fólico.
[00411] A Figura 41 demonstra vários níveis de expressão de FR nessas linhagens de células. A ordem dos níveis de FR são: IGROV1I > MDA-MB-231, HOS-FRa > OV90, SKOV3.
EXEMPLO 17.
TERAPIA COM CÉLULAS T EC17/E2-CAR EM CAMUNDONGOS NSG COM E SEM TUMORES MDAMB-231 IMPLANTADOS POR VIA SUBCUTÂNEA Implantação de tumor
[00412] As células de tumor MDA-MB-231 foram cultivadas em meio RPMI deficiente em folato 1640 com 5-10% de FBS a 37ºC em uma atmosfera de CO2 a 5% umidificada. As células tumorais MDA-MB-231 foram inoculadas por via subcutânea a 2,5 x 10º células por animal. Apenas 42 dos 66 camundongos foram inoculados e os 22 camundongos restantes foram mantidos livres de tumor.
Administração de células CAR-T
[00413] As células anti-FITC E3 scFV-CAR T classificadas por EGFRt foram congeladas em meio de células T de congelamento. Os Frascos de células T CAR congeladas foram imediatamente armazenados a -80ºC. As células T CAR foram rapidamente descongeladas a 37ºC, lavadas duas vezes com PBS e usadas para injeção em animais a 10 milhões de células T CAR EGFRt+ E2 viáveis (CD4/CD8 a +- 1: 1) por animal. Uma pequena alíquota foi tomada no dia da infusão para análise citométrica de fluxo de fenótipos de células T E2-CAR.
Análises de citocinas humanas/camundongos
[00414] As amostras de sangue de camundongo foram processadas para plasma e armazenadas a -20ºC até o uso. Um painel de citocinas THl humano (Biolegend, Cat. 740009) e um painel de citocinas de células-tronco hematopoiéticas humanas (Biolegend, Cat. 740610) foram usados para detectar citocinas humanas no sangue de camundongos. Utilizou-se um painel de citocinas inflamatórias de 13 plexos de camundongo (Biolengend, No. 740150) para detectar citocinas de camundongos. Todas as análises foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante.
Análise por citometria de fluxo
[00415] Análise de células de sangue total: O plasma foi removido de volumes predeterminados de sangue total tratado com EDTA e os glóbulos vermelhos foram lisados com solução de lise de glóbulos vermelhos. Os pellets de leucócitos foram então ressuspensos em solução de coloração por citometria de fluxo (albumina sérica bovina a 1%, IgG humana a 50 mg/mL (Equitech Bio, cat * SLH56-0001), azida de sódio a 0,9% em solução salina tamponada com fosfato, pH = 7,4) e coloração do marcador de superfície de leucócitos foi realizada usando os seguintes anticorpos: anti-CD45 humano [clone HIT30, eBioscience ft 47-0459-42 em diluição 1:20 (v/v)], anti-CD137 humano [clone 4B4-1, BD Bioscience * 564092 em diluição 1:20 (v/v)], CD8a anti-humano [clone RPA-T8, BD Bioscience, catálogo * 557746 em diluição 1:20 (v/v)]l, CD4 anti-humano [clone SK3, eBioscience catálogo * 46-0047-42 em diluição 1:20 (v/v)], anti-EGFR humano [P&D Systems, clone Hul, catálogo * FAB9577B & 1:10 (v/v)]), anti-PDl humano [BD Biosciences, clone EH12.1, catálogo * 562511 & 1:20 (v/v)], anti-LAG3 humano [BD Biosciences, clone T47-530, catálogo * 565616 €& 1: 20 (v/v)], anti-TIM3 humano [BD Biosciences, clone 7D3, catálogo * 565558 €& 1:20 (v/v)], anti-CD3e humano
[BD Biosciences, clone SK7, catálogo * 557832 & 1:20 (v/v)]. Após a coloração dos leucócitos, as células foram lavadas com PBS e ressuspensas em PBS frio contendo 53.000 grânulos CountBrightTM (Invitrogen catálogo t C36950) e transferidas para tubos de coleta de citometria de fluxo. Os dados da citometria de fluxo foram coletados no citômetro de fluxo Gallios (Beckman —"Coulter, Brea, CA). A determinação da concentração de células T CAR em cada amostra de sangue foi calculada de acordo com as instruções da Invitrogen. As células T CAR foram identificadas como eventos CD3e + EGFRt+ humanos e facilmente distinguidas e contadas usando O software de citometria de fluxo KaluzaTM. O número de células T CAR na circulação de cada camundongo infundido foi então representado nos gráficos como o número total de células T CAR por 100 ul de sangue total analisado. A significância estatística foi determinada utilizando um teste t30 de Student não-pareado, bicaudal, com significância definida em bp <0,05.
[00416] Análise de tumor e tecido: Os tumores sólidos (100-1000 mm?) foram coletados, pesados e picados em pequenos pedaços e depois transferidos para tubos de 50 mL contendo 20 mL de um coquetel de digestão do tumor. O coquetel de digestão enzimática do tumor consistia em 0,5 mg/ml de
Colagenase IV (Sigma-Aldrich, Catálogo * C5138), 0,5 mg/mL de hialuronidase (Sigma-Aldrich, Catálogo * H3506) e 0,1 mg/mL de DNase I (Sigma-Aldrich, Catálogo * DN25) em meio RPMI1640 sem soro e com folato, suplementado com antibióticos. Os fragmentos de tumor foram digeridos durante uma hora a 37ºC a 300 rpm em um agitador horizontal. Posteriormente, o tumor digerido foi centrifugado a 400 x g por 5 minutos e o pellet de células tumorais passou por uma etapa de lise de glóbulos vermelhos, foi então lavado com solução salina tamponada com fosfato frio (PBS, pH 7,4) e finalmente filtrado através de um filtro de células de náilon de 40 um.
Fenótipos E2-CAR-T e proliferação in vivo
[00417] A expansão e persistência de células T CAR no sangue tem sido relatada a correlação com resposta à terapia CAR T específica para CDl9 em estudos clínicos. Não é irracional supor que um conjunto maior de E2 CAR T circulante no sangue permita uma maior resposta ao ataque direcionado por EC1I7 aos tumores FR+ em nossos modelos in vivo. Como medida da resposta da terapia com células T E2 CAR à ECl7, quantificamos o número de células T E2 CAR circulantes por 100 ul de sangue total e observamos coortes que receberam estimulação ECl7 (coortes 2, 3, 4 e 5) tinham pelo menos aumento de mais de 10 vezes na circulação quando comparado às coortes que não receberam EC17 (coortes 1 e 6). É importante ressaltar que essa expansão das células T CAR circulantes no sangue é consistente com a expansão das células T CAR de maneira dependente do antígeno. Além disso, também observamos a persistência dos números elevados de células T CAR circulantes de até 54 dias após a infusão de células T CAR e, novamente, a persistência de T CAR era dependente de ECl7 (coortes 2, 3, 4 e 5) em comparação com coortes 1 e 6 que não receberam EC17.
Camundongos com tumor vs sem tumor
[00418] Como mostrado na Figura 42, 10 milhões de células E2 CAR-T foram injetadas em camundongos NSG ingênuos por via i.v. sem tumor ou camundongos NSG portadores de tumores MDA-MB-231. A dosagem i.v. de 500 nmol/kg de EC1l7 nos dias 2 e 10 após a injeção de CAR-T, e os camundongos foram sacrificados 20 horas após a segunda dose de EC17 (dia 11) para avaliação de órgãos e análise de sangue. As amostras de plasma foram isoladas do sangue imediatamente e armazenadas a -20ºC até a análise das citocinas. No dia 12 após a injeção de CAR-T, um conjunto separado de animais foi coletado para análise FACS como descrito acima.
[00419] Como mostrado na Figura 43, a produção de citocinas em camundongos portadores de tumor foi dependente de CEl7. Os níveis de citocina, incluindo IL2, IFN-V, IL-10, foram todos aumentados em camundongos portadores de tumor com EC17 em relação àqueles sem dose de EClI7. Em camundongos ingênuos sem tumor, a regulação positiva da produção de citocinas também foi observada nos camundongos tratados com EC17, mas o aumento nos camundongos livres de tumor foi muito menor em comparação aos camundongos com tumores MDA-MB-231 (por exemplo, 23 vezes menor para IFN-g).
[00420] Os camundongos portadores de tumor tinham a produção de IFN-g -23 vezes mais elevada do que camundongos sem tumor. Enquanto camundongos sem tumor (em dieta FD por - 2 meses) mostraram alguma produção de citocina após EC17 SIWS5S00 x 2 doses, não houve expansão de células T CAR detectável por FACS.
EXEMPLO 18.
ATIVIDADE ESPECÍFICA DO ALVO DEMONSTRADA IN VITRO USANDO O CONSTRUTO ANTI-FITC SCFV E2-CAR HUMANIZADO E CÉLULAS T
MODIFICADAS POR CAR
[00421] Linhagens de células: Todas as linhagens de células foram mantidas em RPMI 1640 (Irvine Scientific) suplementado com L-glutamina 2mM (Cellgro), HEPES 25mM (Irvine Scientific) e 10% de FBS inativado pelo calor (Hyclone), a menos que indicado de outra forma. O Dr. Stanley
Riddell (FHCRC) gentilmente forneceu as linhagens de células alvo K562. A linhagem de células K562 OKT3 foi gerada por transdução com um transgene OKT3 contendo lentivírus. O OKT3 é um scFv amarrado à membrana que tem como alvo CD3epsilon. Os MDA-MB-231 foram fornecidos pelo Endocyte e cultivados em DMEM livre de folato. Todas as linhagens de células foram autenticadas pelo STR Profiling correspondente ao banco de dados DSMZ pelo núcleo de genética da Universidade do Arizona.
[00422] Citotoxicidade e secreção de citocinas: Ensaios de liberação de cromo de quatro horas foram realizados. Resumidamente, as células alvo foram marcadas com 51Cr (PerkinElmer) durante a noite, lavadas três vezes em PBS e incubadas em RPMI em triplicado a 5x103 células/poço com células T em várias proporções de efetor para alvo (E: T) em uma placa de 96 poços. Os sobrenadantes foram coletados para contagem y e a lise específica foi calculada. Para a secreção de citocina, 5x10” células T foram plaqueadas em triplicado com células-alvo a uma proporção E: T de 2: 1 em uma placa de 96 poços durante 24 horas e os sobrenadantes foram analisados por arranjo de grânulos de citometria usando um Painel de citocinas Bio-Plex Humanas (Bio-Rad) de acordo com as instruções do fabricante. Para alvos marcados com ECl7, as células foram incubadas no escuro em temperatura ambiente por 1 hora com EC17 100 nM em PBS antes do plaqueamento. Quando EC17 foi usado, as células foram incubadas com RPMI livre de folato durante o ensaio.
Ensaio de liberação de citocina:
[00423] As células T CD4+ foram cocultivadas em uma proporção de célula T 2:1 para o alvo por 24 horas e, em seguida, o sobrenadante foi analisado para a presença de efetor de citocinas IL-2, IFN-y, e TNF-a. Os ensaios foram realizados em triplicado e os dados mostrados como média + SE. Como mostrado na Figura 44, observamos que as células T mock e anti-FLCAR produziram níveis quantitativamente semelhantes de produção de citocinas em resposta à cocultura com a linhagem de células de controle positivo K562-OKT3. Nenhuma citocina foi produzida por células T Mock ou anti- FLCAR após cocultura com K562. A liberação de citocinas dependeu da incubação prévia de EClI7 com a linhagem de células MDA-MB-231 e as células T anti-FLCAR foram as únicas células capazes de provocar secreção das citocinas IL-2, IFN- vy e TNF-a contra MDA-MB-231 marcado com EC1l7.
Ensaio de liberação de cromo:
[00424] As células T CD8+ foram cocultivadas com células alvo em uma proporção 30: 1, 10: 1, 3: 1, ou 1: 1. O percentual de lise (média + SE) dos poços triplicados é representada. Como mostrado na Figura 45, as células T anti- FLCAR não exibiram citotoxicidade contra o controle negativo (K562) ou as linhagens de células MDA-MB-231 não marcadas. No entanto, as células T transduzidas e anti-FLCAR mock foram capazes de induzir níveis semelhantes de lise específica contra a linhagem de células K562-OKT3 de controle positivo. Além disso, as células MDA-MB-231 marcadas com EC1l7 foram eficientemente reconhecidas e lisadas por células T anti- FLCAR, enquanto as células T simuladas não foram capazes de conferir lise.
EXEMPLO 19.
ESTRUTURA DOS ADAPTADORES PARA CÉLULAS CAR-T
[00425] As Figuras 46-49 mostram as estruturas das pontes usadas nos experimentos com células T CAR e suas afinidades, determinadas in vitro, para os tipos de células contra as quais as pontes são direcionadas (por exemplo, folato-FITC para células cancerígenas que expressam receptores de folato). A Figura 50 mostra a ligação (por análise FACS) de pontes às células tumorais usadas em um modelo in vivo e expressando o receptor correspondente ao ligante de molécula pequena da ponte.
[00426] Para os exemplos 20 a 30 - Ver FIGURAS 55 a 63
EXEMPLO 20.
LINHAGENS DE CÉLULAS E REAGENTES
[00427] Salvo indicação em contrário, todas as linhagens de células de câncer FR+ e FR- negativas foram mantidas em meio RPMI-1640 (Gibco BRL) suplementado com 10% de soro fetal de bezerro inativado por calor sem (FFRPMI) ou com (RPMI) ácido fólico 2,4 mM (FA). Foram utilizadas KB (carcinoma cervical humano que expressa FRa com marcadores HeLa) e CHO-b (células de ovário de hamster chinês transfectadas com FRb humano) como fontes de FRa e FRb para ensaios de ligação ao radioligante, respectivamente. MDA-MB-231 representa um subclone de FRa da linhagem de células de câncer de mama triplo negativo humano (TNBC). Para estudos de LMA, foram fornecidos pares isogênicos que expressam proteína verde fluorescente (GFP) de linhagens de células FRb-positivas (THP1-FRb) e FR-negativas (THP1-FG12). Ambos foram estabelecidos a partir do THP-l1 (ATCC, TIB-202), um modelo de célula comumente usado para pesquisar AML pediátrica, originalmente derivado de um bebê de 1 ano de idade com leucemia monocítica aguda. Para estudos de osteossarcoma, HOS-FRa foi estabelecido por transdução lentiviral de FRnegativo HOS-l143b (ATCC, CRL8303) com o gene FOLR1I que codifica o FRa humano. O HOS-l143b é originalmente estabelecido a partir de um tumor primário de uma mulher branca de 13 anos e altamente tumorigênico em camundongos NSG. Os pares bioluminescentes que expressam GFP de FR+ HOS- FRaíftve e FR-HOS-l43bí!"e negativo foram transduzidos com luciferase lentiviral do vaga-lume.
[00428] Os painéis de citocinas humanas LEGENDplexTM foram adquiridos da BioLegend (San Diego, CA). O kit de ensaio de citotoxicidade não radioativa à base de lactato desidrogenase (LDH) CytoTox 966 foi adquirido da Promega (Madison, WI). os anticorpos anti-humanos disponíveis comercialmente usados para citometria de fluxo multicolorida foram: CD45RA (clone HI100), CD45RO (clone UCHL1), CD4 (clone SK3), e CD69 (clone FEN50) da Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA); CD3e (clone SK7), CcD8a (clone RPA-T8), CD137/4-1BB (clone 4B4-1), CD25 (clone MA251), PDl (clone EH12.1), LAG3 (clone T47-530), e TIM3 (clone 7D3) da BD Bioscience (San Jose, CA); anti-EGFR biotinilado humano (Cetuximab, clone Hul) da R&D systems (Minneapolis, MN); e FRa (clone LK26) da BioLegend (San Diego, CA). Também foi comprada uma anti-biotina conjugada com fluoróforo da BioLegend. O anticorpo IgG2a/capa anti-FITC de camundongo conjugado com APC (clone NAWESLEE), grânulos CountBright" (Invitrogen), tampão de coloração com anexina V e anexina V conjugada com AlexaFluor-647 foram adquiridos da Thermo Fisher Scientific. Para digestão enzimática dos tecidos tumorais, todas as colagenase IV, hialuronidase e DNase [ foram adquiridas da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
[00429] EC17 ou folato-FITC [FA-(g)-etilenodiamina-FITC] foi sintetizado no endócito. O 3HEC17 foi comprado da Moravek Biochemicals (Brea, CA) em uma atividade específica de - 0,952 Ci/mmol ou preparado no Endócito por conjugação de FITC com 3H-FA- (g) -etilenodiamina produzida por ViTrax (Placentia, CA) atividade de - 1,2 Ci/mmol. O 3H-FA também foi adquirido da ViTrax em uma atividade específica de 59 Ci/mmol. Para resgate de CRS, a solução de dosagem de fluoresceína de sódio foi diluída a partir de AK-FLUORE a 25% (injeção de fluoresceína, USP), que foi adquirida da Purdue Pharmacy (NDC 17478-250-25).
EXEMPLO 21.
CONSTRUTO CAR HUMANIZADO E CÉLULAS T MODIFICADAS COM CAR
[00430] Estudos anteriores usaram um scFv anti-FITC de segunda geração GFP+ (clone 4M5.3) CAR contendo as sequências de dobradiça e transmembrana dos domínios de sinalização CD8a e 4-1BB/CD376 (isto é, FITC-4M5.3-scFv-CD8adobradiça-CD8atm-4- 1BB/CD3z). Para a tradução em testes de firstina em humanos, foi desenvolvida o construto de CAR específico para FITC totalmente humano de segunda geração totalmente (clone E2) (aqui referido como E2) (Figura 55, diagrama superior). As células T modificadas com CAR são mostradas na Figura 55, gráficos de pizza inferiores.
[00431] O construto aqui descrito é um construto CAR específico para FITC composto por (1) um scFv anti-FITC totalmente humano (clone E2, Kd = 0,75 nM), (2) um espaçador de dobradiça IgG4-CH2(L235D, N2970)-CH3 fundido a um domínio transmembrana CD28, (3) um endodomínio 4-1BB/CD36 de segunda geração e (4) um tag de EGFRt humano de superfície celular (Figura 55, diagrama superior) (SEQ ID NOS: l1 e 2 são as sequências de ácido nucleico e de aminoácidos, respectivamente). Para gerar células T modificadas por CAR, lentivírus foi produzido em células 293T cotransfectadas com vetor lentiviral epHIV7 que codifica CAR. As células T CD4+ e CD8+ doadoras foram purificadas por seleção imunomagnética e transduzidas separadamente ou a uma proporção de 50:50. Em geral, apenas uma rodada de ativação do grânulo CD3/CD28 seguida por uma ou duas rodadas de expansão rápida in vitro foi realizada. Para avaliações pré-clínicas, foram utilizados vários lotes de células CD4, CD8 e CD4/CD8 não classificadas com EGFRt. Todas as preparações de células T CAR foram analisadas antes da criopreservação e após o descongelamento para determinar a expressão de EGFRt e as proporções CD4/CD8 por citometria de fluxo. Utilizando combinações de marcadores de superfície, analisou-se o status de diferenciação dos subconjuntos de células T CAR CD4+ e CD8+ no dia da infusão e definidas como células Tn, CD45RA+ CD45RO- CD62L+ CD95- naive T; Tsm, células-tronco CD45RA+ CD45RO- CD62L+ CD95+, células T de memória; TCM, células T de memória central CD45RA- CD45RO+ CD62L+ CD95+; Trm, células de memória efetoras CD45RA- CD45RO+ CD62L- CD95+; e Trrr, células T efetoras CD45RA+ CD45RO- CD62L- CD95+. Para os testes pré-clínicos descritos abaixo, os estudos incluíram dois lotes de subconjuntos CD4 e CD8 puros classificados por EGFRt (após mistura em proporções de cerca de 1: 1) e vários lotes de mistura não classificada - 1: 1 de EGFRt + CD4/CD8 - 1: 1, incluindo uma preparação de “fac-símile clínico” com perfis de baixa diferenciação.
[00432] Em meio a uma série de diferentes construtos de CAR sintetizados e avaliados, o CAR anti-FITC scFv (FITC-E2) totalmente humano foi escolhido para desenvolvimento pré- clínico (Figura 55). Este CAR de segunda geração totalmente humano consistia em anti-FITC scFv (clone E2), um espaçador/dobradiça IgG4-Fc com mutações duplas na região CH2 (L235D e N297Q0) para reduzir a ligação a FCcyR, um domínio transmembranar CD28 e 4 domínios de sinalização -1BB/CD3z anexados a um tag EGFRt de superfície celular por uma sequência de salto ribossomal T2A (isto é, FITC-E2-scFv- IgG4dobradiça-CD28tm- . 4-1BB/CD3z-T2A-EGFRt). Para estudos pré-clínicos, as células CAR-T E2 classificadas e não classificadas com EGFRt foram preparadas em proporções - 1:1 CD4/CD8, e a fenotipagem do subtipo de células T era rotineiramente realizada por citometria de fluxo no momento da infusão de células T CAR (dia O) para cada experimento in vivo.
Um padrão de expressão típico de células T CAR classificadas com EGFRt era composto por subconjuntos CD4 e CD8 a aproximadamente 42% Tscm, 10% Tem, 12% Trem, 12% Tm e 34% Trrr (Figura 55, gráficos à esquerda)) Apenas células T CAR classificadas com EGFRt foram usadas para cocultura (Figuras 53, 54, 56, 58, 59 e 61) e estudos farmacocinéticos (Figura 62). Para a terapia tumoral, foi utilizado um lote de “fac- símile clínico” com um baixo perfil de diferenciação (Figura 55, gráficos de pizza à direita) e esse “lote clínico” também foi usado para estudos MDA-MB-231 (Figura 63) e um lote de pesquisa foi usado para estudos THPI-FRb e HOS-FRa (Figura 57). O lote “fac-símile clínico” (- 39% EGFRt +) era composto por subconjuntos CD4+ a - 66% Tsw e - 32% Tm e subconjuntos CD8 a - 95% Tscw e 3% To.
O lote de pesquisa (- 23% EGFRt +) foi mais diferenciado e composto por subconjuntos CD4 em 32%
Tscm, 53% Tem, 11% Tm e 11% Tm e 3,7% Trzrr E subconjuntos CD8 em 44% Tscm, 0,28% Tem, 3,4% Tr e 52% Tgerr.
EXEMPLO 22.
AFINIDADE BIESPECÍFICA DO EC17 CAM
[00433] As afinidades biespecíficas de CEl7 CAM foram avaliadas utilizando *?H-CEl7 nos ensaios de ligação do radioligante à base de células. Para ligação aos alvos FR+, células KB e CHO-B foram pré-semeadas durante a noite em placas de cultura de tecidos de 24 poços e incubadas com 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 20 e 40 nM de *?H-EC17 em FFRPMI por 2 horas a 37ºC. Posteriormente, as células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4) e lisadas com dodecilsulfato de sódio a 1%. Os lisados de células inteiras foram quantificados quanto ao nível de radioatividade e conteúdo de proteína celular por ensaio de proteína Pierce BCA padrão. O número de moléculas de 3H-EC17 ligadas por célula foi calculado para determinar as constantes de dissociação (Kd) para FRa (KB) e FRB (CHO-b), respectivamente (Figura 56).
[00434] Os componentes principais da terapia de células T CAR controlada por CAM. Os componentes básicos da terapia de células T CAR envolvem o FITC como pseudo antígeno de tumor, CAM de alta afinidade para ECl7 (um CAM é equivalente a uma ponte ou “composto” neste pedido) e anti-FITC projetadas racionalmente e modificadas por células T CAR. O EC17 já foi testado na clínica para fins de imunoterapia e imagem óptica. Para diretamente quantificar as suas afinidades de ligação biespecíficas, 3H-ECl7 foi sintetizado e os ensaios de ligação ao radioligante foram realizados em linhagens de células de KB e CHO-B que representam as células alvo FRoa+ e FRB+, respectivamente, e em células T CAR EGFRt não triadas representando as células efetoras. Quando se liga aos seus alvos, o ECl17 demonstrou afinidades semelhantes para FRa e FRB com baixos valores de Kd de 1,7 nM e 0,8 nM, respectivamente (Figura 56, painel A). Após a ligação às células E2-CAR-T não classificadas (- 24% EGFRt+, proporção de CD8/CD4 - 95: 5), o valor Kd foi estimado em - 130 nM (Figura 56, painel B).
EXEMPLO 23.
MODELOS DE TUMOR
[00435] Todos os cuidados e uso de animais foram realizados de acordo com as diretrizes do NIH e em conformidade com os protocolos aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidados com Animais da Universidade de Purdue. Camundongos fêmeas NOD/SCID gama (NSG"”") de 4 a 5 semanas de idade (número de estoque: 005557) foram adquiridos no The Jackson
Laboratory (Bar Harbor, ME). A menos que especificamente indicado, todos os animais foram mantidos com uma dieta deficiente em FA (TestDiet, St. Louis, MO) na chegada e ao longo do estudo. Para estabelecer xenoenxertos subcutâneos, MDA-MB-231 e HOS-FRa foram implantados na região do flanco direito a 2,5 x 10º e 1 x 10º células por animal, respectivamente. Para xenoenxertos intravenosos, as células THP1-FRb foram inoculadas a 5 x 10º células por animal. Os tumores subcutâneos foram medidos 2 a 3 vezes por semana com um paquímetro e calculados usando a fórmula elipsoidal (comprimento x largura?)/2. A eutanásia foi realizada de acordo com o desenho do estudo ou quando (i) os animais perderam *20% do peso corporal ou se aproximaram de condições moribundas, (ii) tumores subcutâneos atingiram 21500 mm? de tamanho, ou (iii) os animais exibiram sinais de barriga inchada e angústia grave (isto é, THPI-FRB). Todas as doses em animais (células CAR-T, EC1l7, fluoresceína sódica) foram administradas por via intravenosa.
EXEMPLO 24.
TERAPIAS TUMORAIS
[00436] En um cenário terapêutico, CEl7 CAM pode, teoricamente, ser administrada antes ou após a injeção de células-T CAR. Como aqui descrito, a primeira dose de EC1l7 foi administrada 2 a 3,5 dias após as células T CAR para permitir um período de observação de células T humanas em camundongos portadores de tumor. Dois lotes de células T E2 CAR não classificadas (23% ou 39% EGFRt+, 1: 1 CD4/CD8) foram usados para estudos in vivo. No dia da infusão para cada experimento (dia O), as células T CAR congeladas foram rapidamente descongeladas a 37ºC, lavadas 2x com 1X PBS da Dulbecco (pH 7,4) e injetadas na veia da cauda no EGFRt+ em doses desejadas de células E2-CAR-T. Além disso, uma pequena alíquota de células T CAR foi analisada por citometria de fluxo quanto à proporção CD4 para CD8 e status de diferenciação das células T CAR. No primeiro dia da dose de EC1l7, os animais portadores de tumor foram aleatoriamente designados em grupos de acordo com seus tamanhos de tumor ou o mesmo número de dias após a implantação intravenosa (ou seja, THP1-FRE). EXEMPLO 25.
TOXICIDADE E RESGATE DE CRS
[00437] Dependendo da dose das células T CAR e de como EC17 é administrado, os camundongos portadores de tumor que recebem células T CAR específicas para FITC podem sofrer CRS grave e graus variados de perda de peso corporal. Portanto, um sistema de classificação de CRS (escala 0-5) foi desenvolvido para avaliar empiricamente a toxicidade do CRS a partir da morfologia grosseira e do comportamento social dos animais, para permitir um melhor momento para o resgate do CRS.
Enquanto os graus O e 5 indicaram normal (sem CRS) ou óbito (devido a CRS grave), respectivamente, os graus l, 2 e 3 a 4 foram considerados CRS leve, leve a moderada e grave (Figura 57 A, descrições da tabela). Além disso, todas as doses de ECl7 foram intencionalmente administradas no final de qualquer dia para permitir o desenvolvimento de possíveis sintomas da CRS durante a noite.
Nos dias imediatamente após cada dose de ECl7, os animais foram avaliados e agentes de resgate, como fluoresceína sódica, ácido fólico e leucovorina, foram usados para mitigar a toxicidade da CRS.
Nesse caso em particular, um lote de células T CAR E2 com uma alta proporção de EGFRt+ CD4/CD8 (- 93: 7) foi administrado aos camundongos portadores de tumor HOS-FRa a uma mistura de - 2,5 milhões de CD8 e - 33 milhões de CD4 no dia O (Figura 57 A, diagrama). Quando ECl7 foi dosado respectivamente em 500, 100 e 500 nmol/kg nos dias 3, 10 e 12, foi observada baixa CRS (graus 1-2) nos dias 4 e 11, mas alta CRS (nota 3) no dia 13. Para mitigar a toxicidade grave de CRS, a fluoresceína de sódio foi administrada por via intravenosa a - 9% mg/kg na manhã do dia 13 e as amostras de plasma de camundongo foram coletadas 6 horas depois para análise de citocinas associadas a CRS.
[00438] Para examinar as capacidades de resgate do CRS com fluoresceína de sódio, foi desenvolvido um sistema de classificação da CRS capaz de capturar o aparecimento de CRS grave (graus 3/4) após a administração da EC17 (Figura 57A). Como mostrado por um caso desafiador de rápido início da CRS em camundongos portadores de tumor HOS-FRa, devido a uma dose muito alta de 35 milhões de células T CAR totais (93:7 CD4/CD8), fluoresceíina de sódio intravenosa em uma dose equivalente humana (- 95 mg/kg em camundongos) agiu muito rapidamente para reduzir as citocinas humanas derivadas de células T CAR (Figura 57B).
EXEMPLO 26.
ESTATÍSTICAS
[00439] As análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa de computador GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA). Os dados foram analisados pelo teste t de Student ou ANOVA de uma via. Se aplicável, os dados foram analisados posteriormente entre os grupos de tratamento usando o pós-teste de comparação múltipla apropriado. * = p <0,05 foi considerado estatisticamente significativo em todos os testes.
EXEMPLO 27.
EXPERIMENTOS DE COCULTURA
[00440] Para investigar a ação da ECl7 CAM in vitro, células CD4 e CD8 CAR-T classificadas com EGFRt puras foram misturadas em uma proporção de 1: 1 e células T transduzidas por mock foram incluídas por delineamento experimental. Além de pares isogênicos FR+/- de AML e linhagens de células de osteossarcoma, KB, MDA-MB-231 e OV90 foram adicionados para representar diferentes tipos de tumor histológico e níveis de expressão de FR. Todas as linhagens de células alvo FR+ foram submetidas a um ensaio de ligação direta a 3H-FA para quantificar o número de moléculas FR ligadas/célula (Figura 58). Antes dos experimentos de cocultura, as células T CAR criopreservadas foram deixadas se recuperar por 2 a 3 dias em meio de cultura de células T. Todas as células efetoras e alvo foram pré-lavadas com FFRPMI para remover qualquer FA exógena que pudesse competir contra a ECl7. Foram realizados estudos de cocultura de curto prazo de < 3 dias no FFRPMI sem adição de citocinas exógenas.
[00441] Para um estudo de resposta à dose EC1l7 (Figura 59, painéis A e B), as linhagens de células FR+ (KB, MDA-MB- 231, HOS-FRa, THP1-FRE, OV90) foram cocultivadas com células T CAR E2 classificadas com EGFRt em uma proporção efetora-
para-alvo (E/T) de 1: 1 na presença de EC17 variando de 0,1 PM a 100 uM em incrementos de 10 vezes. Após 24 horas de cocultura, os sobrenadantes foram coletados para determinar a morte das células tumorais. Para estudar a cinética da ativação das células T e da correlação FR in vitro (Figura 60, painéis AE), as coculturas foram realizadas em linhagens de células FR+/- em diferentes proporções E/T (1:27, 1: 9, 1: 3, 1: 1, 3: 1) na presença contínua de 10 nM EC17. A cinética da morte de células tumorais foi quantificada após 16 e 48 horas de cocultura. Enquanto isso, uma fração dos sobrenadantes foi tomada após 44 horas de cocultura para medição de IFNg, IL-2 e TNFa. Usando o kit de ensaio CytoTox 968 LDH da Promega, a morte de células alvo foi quantificada e expressa como lise específica (%) que foi normalizada para níveis basais na ausência de EClI7 em proporções E/T definidas. O painel de citocinas Thl humano LEGENDplexTM (BioLegend, San Diego, CA) foi usado para determinar citocinas derivadas de células CAR-T.
[00442] Para estudar a ativação das células T CAR na presença de alvos de células tumorais FR+ (Figura 53), inicialmente foram realizados experimentos de cocultura com MDA-MB-231, THP1-FREB e HOS-FRa. Após uma exposição de 30 min ao meio contendo 100 nM de EC1l7, todas as células alvo foram lavadas e, em seguida, incubadas na proporção E/T de 1: 1 com células T CAR E2 selecionadas por EGFRt (1: 1 CD4/CD8) ou células T de controle mock transduzidas.
Após 24 horas de cocultura, a expressão de superfície dos marcadores de ativação de células T CD69, CD137 (4-1BB) e PDl foram analisados por citometria de fluxo.
Para estudos de exaustão de células T (Figura 54), linhagens de células tumorais FR+ (KB, MDA-MB-231, HOS-FRa fLuc, THP1-FREB) e FR-negativas (HOS- 143b fLuc, THP1I-FG12) foram usadas como alvos.
Aqui, as células alvo foram incubadas no dia O sem ou com 0,1 e 10 nM de ECl7 por 30 minutos a 37ºC e o status de “pré- carregamento” de ECl7 foi avaliado por meio da contra- coloração EC17 de superfície celular com um anticorpo anti- FITC (Figura 61, painel A). Três dias depois, a expressão de superfície dos receptores inibidores de PDl, LAG3 e TIM3 em células T CAR cocultivadas foi analisada e considerada a maior frequência de células duplas e triplas positivas aproximando-se de um fenótipo esgotado.
Como as células tumorais usadas neste estudo mostraram variabilidade dos tempos de duplicação, a apoptose das células alvo (%) foi medida como anexina V+ após 2 dias de cocultura e normalizada contra os níveis de apoptose das células alvo cultivadas nas mesmas condições na ausência de células T (Figura 61, painel
B).
Avaliações funcionais de FR
[00443] Estas avaliações de FR funcionais são aplicáveis aos vários exemplos aqui descritos. Além das linhagens de células pediátricas de câncer transfectadas com FRa (HOS-FRa) e FREB (THPI-FRB), foram incluídas linhagens de células de câncer de diferentes histologias e níveis de expressão de FR (Figura 58). Conforme estimado por um ensaio de ligação de radioligante (100 nM 3 H-FA, l1 hora a 37ºC), a ordem de classificação do total de FRs disponíveis nessas linhagens de células era: 9 x 10º (0V90, uma linhagem de células de câncer de ovário com baixa expressão de FR), 1,9 x 105 (THP1-FRB), 2,4 x 105 (HOS-FRaítºe), 7 x 105 (HOS-FRa), 2,1 x 106 (MDAMB- 231) e 4,8 x 10º (KB) FA moléculas/célula. Também incluídos como controles FR-negativos estavam as linhagens de células parentais HOS-l43b(ftu) e THPI-FG12. Assim, a classificação geral da expressão funcional de FR nas linhagens de células de câncer FR+ cocultivadas foi: KB > MDA-MB-231 > HOS-FRa > HOSFRaítue > THP1I-FRB (AML) > OV90.
Correlação dos níveis de FR com à lise das células alvo e a produção de citocinas
[00444] Para analisar a dependência de FR, foram cocultivadas 5 linhagens de células FR+ (MDA-MB-231, KB, HOS-
FRa, THPI-FREB, OV90) e 1 linhagem de células FR-negativas (HOS-143b) na presença contínua de EC17 a 10 nM com células T CAR E2 em proporções E/T variáveis (1:27, 1: 9, 1: 3, 1: l1 e 3: 1). A lise específica (%) foi quantificada após 16 e 48 horas de cocultura e as citocinas Thl (IFNg, IL-2, TNFa) nos meios de cultura foram medidas após 44 horas de cocultura. Enquanto o início da lise específica (- 16 horas) variou entre os diferentes tumores, um aumento na citólise específica foi observado em 48 horas para todas as linhagens de células de câncer FR+ (Figura 60, painel A). Geralmente, demorava mais tempo (48 horas) e uma proporção E/T mais alta (21: 1) para ver atividade significativa nas células OV90 que expressam FR mais baixos (Figura 60, painel A). As células KB com alta expressão de FR responderam muito lentamente e também exigiram uma proporção E/T mais alta (21: 3) e maior tempo de exposição para causar morte celular significativa (Figura 60, painel B, gráfico à esquerda). Quando as células efetoras suficientes estavam presentes (proporções E/T 1: 1), todas as células cancerígenas FR+ responderam após 48 horas de cocultura. Notavelmente, apenas as células HOS-l143b FR- negativas estavam essencialmente ilesas (Figura 60, painel B, gráfico à direita).
[00445] Para estabelecer uma correlação da atividade das células T CAR com a expressão de FR in vitro, os valores de lise específica de 16 horas foram plotados em uma proporção E/T de 1: 1 contra os níveis funcionais de FR encontrados nas células tumorais (Figura 58). Excluindo as células KB que mostraram uma resistência incomum no início, houve uma forte correlação semi-logarítmica entre a expressão de FR e o início da citólise com um valor R de 0,98 (Figura 60, painel C). Da mesma forma, todas, exceto as células tumorais HOS- 143b FR-negativas, desencadearam altos níveis de produção de IFNy, IL-2 e TNFa após 44 horas de cocultura na proporção E/T de 1: 1 com células T CAR E2 (Figura 60, painel D). Para a produção de citocinas Thl, também foi observada uma correlação semi-logarítmica com todas as linhagens de células incluídas nos valores R de 0,88 (IFNy), 0,89 (IL-2) e 0,89 (TNFa), respectivamente (Figura 60, painel E). Em coculturas de curto prazo, o MDA-MB-231 foi considerado mais sensível à morte pelas células T CAR, mas o osteossarcoma HOS-FRa e THP1I-FRa AML também responderam rapidamente de maneira dependente do nível de FR (Figuras 60, painel C).
Alta potência da ECI7 CAM no envolvimento célula efetora/alvo in vitro
[00446] O EC17 monovalente em sua forma livre (isto é, um FITC por ligante FA) não ativa automaticamente as células
T CAR anti-FITC. Para estudar a robustez da ativação das células T CAR, foram utilizadas 5 linhagens de células FR+ (KB, MDA-MB-231, HOS-FRa, THP1-FREB, OV90), juntamente com uma ampla faixa de concentração de EC17 (0,l pM a 100 uM) na proporção E/T de 1: 1 (Figura 59, painéis A e B). A lise específica (3%) foi quantificada pelo kit de ensaio de citotoxicidade LDH da Promega após 24 horas de cocultura. Em todas as linhagens de células, a citólise dependente de EC17 seguiu uma resposta da dose em forma de sino com um platô de concentração um tanto amplo (- 0,1 nM a 1 mM) (Figura 59, painel A). Quando as curvas de resposta à dose foram ajustadas ao cume (até 100 nM), as concentrações efetivas de metade da máxima (EC 50) foram obtidas a 4,5 pM (MDA-MB-231), 5,3 pM (KB), 15 pM (THPI-FRB), 30 pM (HOS-FRa) e 418 pM (O0V90), respectivamente. No entanto, a lise máxima obtida para cada linhagem de células classificada de forma diferente em 45% (MDA-MB-231), 27% (THPI-FRb), 18% (HOS-FRa), 15% (O0V90) e 11% (KB) (Figura 59, painel B). Os baixos valores de EC50 em geral sugeriram que ECl7 era altamente potente no desencadeamento de lise de células alvo específicas de FR por células T CAR E2 ativadas.
Ativação e exaustão de células T CAR dependentes de EC17/FR in vitro
[00447] Para examinar a ativação de células T CAR dependente de antígeno, células MDA-MB-231, THP1I-FRE e HOS- FRa foram pré-carregadas com 100 nM de EC17 ao longo de 30 min.
As células foram lavadas e então incubadas na proporção E/T de 1: 1 com células T CAR E2 selecionadas por EGFRt (1: 1 CD4/CD8) ou células T de controle mock transduzidas.
Após 24 horas de cocultura, medimos a expressão de superfície dos marcadores de ativação de células T CD69, CD137 (4-1BB) e PD1l (Figura 53). MDA-MB-231l e HOS-FRa pré-carregados com EC1l7 foram fortes ativadores de nossas células T CAR.
As células THP1-FRb, que expressam FR 11 vezes menor em comparação com as células MDA-MB-231, acionaram a ativação das células T CAR, mas em níveis mais baixos.
É importante ressaltar que as células T de controle mock não foram ativadas sob essas condições.
Alguns tipos de tumor FRt (por exemplo, KB) exibem uma resistência natural à morte por células T CAR dirigidas por EC17 (Figuras 56, 58, 59 e 60), estudamos a ativação de células T versus exaustão como um mecanismo de ação de EC1l7 CAM.
As linhagens de células tumorais FR+ (KB, MDA-MB-231, HOS-FRa fLuc, THP1I-FREB) e FR-negativas (HOS-l143b fLuc, THPl- FG12) foram escolhidas para esse fim.
O HOS-FRaít"e expressou -— 5,6x nível menor de FR funcional do que seu HOS-FRa parente, e o HOS-l143pí""º foi FR-negativo semelhante ao HOS-
143b (Figura 59, painel A). Aqui, as células tumorais FR+ e FR-negativas sem ou com pré-carregamento de EC17 (0,1 ou 10 nM, pulso de 30 min a 37ºC) foram incubadas com células T CAR classificadas por EGFRt (1: 1 CD4/CD8) em uma proporção E/T de 1: 2 (Figura 54 e Figura 61, painel B). O pré-carregamento dependente da dose de ECl7 foi confirmado no dia O por contraste da EC1l7 ligada à membrana com um anticorpo anti- FITC conjugado com APC (clone NAWESLEE) (Figura 61, painel A). Três dias depois, as células T CAR cocultivadas foram medidas para a regulação positiva e coexpressão de marcadores de ativação/exaustão de células T PDl, LAG3 e TIM3. Na ausência de células alvo, as células T CAR E2 foram submetidas a uma diferenciação de baixo grau na cultura, com baixas frequências de células duplas ou triplas positivas.
Curiosamente, a presença de células tumorais isoladamente (sem pré-carregamento de EC1l7) pareceu “relaxar” as células T CAR em vários graus.
Porém, ao encontrar células alvos tumorais FR+ pré-carregados com ECl7 (mas não negativas para FR), as células T CAR E2 sofreram diferenciação significativa com o aumento da coexpressão de marcadores de exaustão.
Com base nas frequências aumentadas de células triplas e duplas positivas, um fenótipo mais esgotado apareceu em células T CAR cocultivadas na ordem de KB> HOS-FRaít"e > THPl- FRB> MDA-
MD-231. Embora apoptose dependente da dose de EC17 (anexina V+) tenha sido observada em todas as linhagens de células de tumor FR+ no dia 2, as células KB com alta expressão de FR mostraram "novamente apoptose desproporcionalmente baixa (Figura 61, painel B).
EXEMPLO 28.
CINÉTICA DA EXPANSÃO DE CÉLULAS T CAR E CAPTAÇÃO DE TUMOR
[00448] Para estudar a expansão de células T CAR in vivo, a análise começou com 15 camundongos portadores de tumor MDA-MB-231l com - 4,8 milhões de células T CAR E2 classificadas com EGFRt (1: 1 CD4/CD8) injetadas no dia O (Figura 62, painel A). Quando os tamanhos dos tumores foram em média de - 350 + 60 mm? no dia 2, foram administradas até 6 doses semanais de EC17 a 500 nmol/kg nos dias 2, 9, 16, 23 e 30. Para a análise ex-vivo, 3 animais foram retirados antes da próxima dose de EC17 nos dias 9, 16, 23 e 30 para um total de 4 coletas. Para comparação, a mesma dose de ECl7 foi administrada a 3 camundongos CAR-T que tinham tamanhos de tumor - 4,4x maiores no dia 2 (- 1555 + 79 mmº3). Para cada coleta, amostras de sangue fresco e tumor (se disponíveis) foram analisadas quanto à presença de células CD3e + EGFRt+ CAR-T humanas por citometria de fluxo. Além disso, alterações fenotípicas das células T CAR E2 na circulação (Tscwm, Tem, Try e Trmf) e o status de ativação das células T CAR infiltradas em tumores (ou seja, CD137/4-1BB, PDl) foram analisados.
Expansão de Células T CAR mediadas por EC17 e Captação de Tumor In Vivo
[00449] A interação dinâmica entre EC1l7 e as células T CAR in vivo foi analisada adicionalmente usando o modelo de tumor MDA-MB-231, que foi previamente encontrado estando entre os tumores que expressam mais FR em 103 + 15 pmol/mg de proteína de membrana usando um ensaio de ligação do radioligante à base de *H-FA. Neste estudo, a cinética da expansão das células T CAR foi estudada em camundongos com tumor que receberam - 4,8 milhões de células T CAR E2 classificadas com EGFRt (Figura 62, painel A). Sete dias após uma dose única de EC17 (ou seja, dia 9 do estudo), células T CAR CD3et EGFRt+ humanas foram detectadas no sangue de camundongos, com um número elevado circulando em camundongos portadores de tumores maiores (Figura 62, painel B). Além disso, a tendência no sentido de uma maior expansão in vivo, estas células T CAR originada no sangue também exibiram um perfil mais diferenciado (Figura 62, painel B, 2504 + 441mm? contra 422 + 16 mm?) em camundongos possuindo tumores maiores. Os camundongos com os tumores de menor tamanho continuaram em estudo para receber um total de 5 doses semanais de ECl7 a 500 nmol/kg.
Como mostrado na Figura 62, painel C, os tumores MDA-MB-231l começaram a responder após a segunda dose de ECl7. Os camundongos experimentaram leve perda de peso corporal após a administração de ECl7, especialmente após a terceira dose.
Como as células T CAR circulantes atingiram o pico em torno do dia 15 e persistiram por até 30 dias (última análise por citometria de fluxo), foi observado um aumento constante nas células T CAR infiltradas em tumores (Figura 62, painel D, plotagem superior, linha tracejada). Além disso, as células T CAR sofreram alterações fenotípicas dinâmicas no sangue de um fenótipo predominantemente Tscm no dia 9, para perfis mais diferenciados em dias posteriores com tratamento ECl7 continuado (Figura 62, painel D, gráfico de barra inferior). Por conseguinte, essas células T CAR que se infiltram no tumor foram ativadas e expressas precocemente (CD1l37/4-1BB), bem como marcadores de ativação de células T tardios (PDIl) (Figura 62, painel E). A expressão de CD137/4-1BB atingiu o pico em torno do dia 9, enquanto a expressão de PDl permaneceu alta a partir do dia 9 e em diante.
Assim, a dosagem de EC17 CAM conduz a ativação, expansão e captação de tumor de células T CAR in vivo, resultando em uma imunidade antitumoral robusta.
EXEMPLO 29.
CITOMETRIA DE FLUXO EX-VIVO
[00450] Para a análise de células T CAR na circulação, o plasma foi removido a partir de um volume predeterminado de sangue total coletado em tubos contendo anticoagulante ácido etilenodiaminotetracético. Após a lise dos glóbulos vermelhos, os pellets de leucócitos foram ressuspensos em uma solução de coloração de citometria de fluxo compreendendo 1% de albumina de soro bovino, 50 mg/mL de IgG humana (Equitech Bio) e 0,9% de azida de sódio. As amostras foram coradas para marcadores de superfície de leucócitos humanos (CD3ec, CD4, CD8a, CD45RA, CD62L) e EGFR anti-humano biotinilado (cetuximabe) seguido por um anticorpo secundário anti-biotina conjugado com fluoróforo. Para análise de células CAR-T infiltradas em tumores, fragmentos de tumor fresco pré- pesados foram finamente picados e digeridos enzimaticamente com um coquetel de digestão consistindo em 0,5 mg/mL de colagenase IV, 0,5 ma/mL de hialuronidase e 0,1 mg/mL de DNase I no soro - FFRPMI livre com agitação vigorosa por uma hora a 37ºC. Posteriormente, os pellets de células tumorais foram submetidos a uma etapa de lise de hemácias, lavados com PBS frio e filtrados em um filtro de células de náilon de 40 um. As suspensões de células únicas resultantes foram coradas para EGFRt e marcadores de leucócitos humanos, CDl37/4-1BB e PDl. Um mínimo de 20.000 eventos de células vivas negativas com iodeto de propídio foram coletados no citômetro de fluxo Gallios e analisados com o software Kaluza, versão 2.1 (Beckman Coulter, Brea, CA). As células T positivas para CAR foram identificadas no sangue de camundongo como eventos CD3e + EGFRt+ humanos e os números absolutos por volume de sangue foram calculados usando números iguais de grânulos CountBrightTM (Invitrogen, Carlsbad, CA) adicionadas a cada amostra. O número de células T CAR CD3e+ EGFRt+ infiltradas em tumor foi expresso como % de células tumorais viáveis totais analisadas.
EXEMPLO 30.
TERAPIAS TUMORAIS
[00451] Para estudar o efeito de folato alimentar elevado (Figura 63, painéis A-D), dois conjuntos de camundongos NSG foram colocados em uma dieta repleta de FA (4 mg/kg, Envigo, Indianapolis, IN) ou deficiente em dieta de FA (TestDiet, St. Louis, MO) na chegada. No dia O, ambos os conjuntos de camundongos receberam - 10 milhões do mesmo “fac-símile clínico” de células T CAR seguidas por nenhum EC17 ou ECI7 SIW a 500 nmol/kg começando no dia 3. No primeiro dia da administração de EC1l7, o tamanho dos tumores MDA-MB-231 foi em média em torno de - 549 + 184 mm? (280-918 mm?) em camundongos repletos de FA, e - 559 + 165 mm? (356-961 mm?) em camundongos deficientes em FA.
Efeito do alto teor de folato na dieta sobre a CRS e àa atividade antitumoral
[00452] Anteriormente, demonstrou-se que a administração de FA ou um ligante de FA ajudou a reduzir a gravidade de CRS em MDA-MB-231 de camundongos portadores de tumor. Para testar o efeito a longo prazo do folato na dieta, os camundongos foram mantidos em dietas definidas por - 73 dias e usados quando seus tumores atingiram - 549 + 184 mm? (280-918 mm?) em camundongos repletos de FA e - 559 + 165 mm? (356-961 mm?) em camundongos com deficiência de FA (Figura 63, painéis de AD). Todos os camundongos receberam - 10 milhões do mesmo “fac- símile clínico” das células T CAR E2 no dia 0, e as coortes tratadas com ECl1I7 receberam oito doses semanais de 500 nmol/kg a partir do dia 2 (repleto de FA) ou dia 3 (deficiente em FA). Como visto anteriormente, a primeira dose completa de EC17 era geralmente segura e não causava qualquer CRS ou perda de peso corporal em camundongos em qualquer dieta. Na verdade, os animais repletos de FA não apresentaram sintomas de CRS durante o tratamento com ECl7, enquanto os animais deficientes em FA experimentaram graus 2 a 3 de CRS e perda de peso corporal (até - 11,4%) com cada uma das doses subsequentes de EC17 (Figura 63, painel A, painéis inferiores). Na mesma duração do tratamento com ECl7, foi encontrado um nível muito mais alto de células T CAR CD3e+ EGFRt+ em camundongos em dieta deficiente em FA (1,6-20,4 x 10º por 100 ul de sangue no dia 52) quando comparados a camundongos em dieta repleta de FA (0,027-4,3 x 10? por 100 ul de sangue no dia 59) (Figura 63, painéis A-C). É importante ressaltar que não houve expansão de células T CAR detectada em animais com deficiência de FA que não receberam tratamento EC17 (Figura 63, painel C).
[00453] Desde que iniciamos os tumores MDA-MB-231l em tamanhos maiores que os estudos anteriores, a regressão do tumor devido à alorreatividade nessa dose de 10 milhões de células T CAR “fac-símile clínicas” não era aparente (Figura 63, painel A, linhas superiores)) Os tumores de controle (sem EC17) em camundongos repletos de FA pareciam ter uma cinética de crescimento mais rápida em comparação com os tumores de controle em camundongos com deficiência de FA; mas no geral, houve 2/5 curas, 2/5 respostas completas e 1/5 respostas parciais em camundongos repletos de FA que receberam EC1l7 (Figura 63, painel A, figura superior à esquerda). Uma expansão mais robusta das células T in vivo foi observada em camundongos com dieta deficiente em FA e resultou em 5/5 curas, embora a saúde desses animais se deteriorasse a cada episódio de CRS (Figura 63, painel A, figura superior à direita).
[00454] Usando anti-EGFR humano (clone Hul) para identificar as células cancerígenas MDA-MB-231 dentro de massas tumorais de camundongos após uma digestão enzimática, analisamos a expressão da proteína FRa (clone LK26) em três tumores recuperados de camundongos com dieta repleta de FA que experimentou uma recaída apesar de continuar o tratamento com ECl7. Por detecção citométrica de fluxo, as células cancerígenas EGFR+ isoladas do menor tumor (21 mg) expressaram FRa, enquanto as células cancerígenas EGFR+ isoladas dos dois tumores maiores (90 mg e 363 mg) perderam completamente sua expressão de FRa (Figura 63, painel D). Utilizando o ensaio de ligação de radioligante quantitativo com H-FA, a perda de níveis de FR funcionais em homogeneizados de tecidos obtidos a partir desses tumores foi confirmada (- 2,1 pmol/mg de potencial de ligação contra - 103 pmol/mg em tumores de animais não tratados). Portanto, a deficiência de FA pode levar ao aumento da atividade e toxicidade da CRS; enquanto a ingestão não fisiológica de FA previne a CRS e o consumo contínuo pode levar à redução da atividade.

Claims (12)

REIVINDICAÇÕES
1. Ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um ácido nucleico tendo pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou pelo menos cerca de 99,5% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 ou 4, em que o dito ácido nucleico codifica um scFv antifluoresceína; ou (b) um ácido nucleico tendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1 ou 4; em que, opcionalmente, o dito ácido nucleico de (a) ou (b) compreende —adicionalmente um ácido nucleico que codifica um domínio de articulação de IgG4, um domínio de ativação de CD36 e um domínio de coestimulação de 4-1BB.
2. Polipeptídeo que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou pelo menos cerca de 99,5% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2 ou 3, em que o dito o polipeptídeo codifica um scFv antifluororesceína; ou (b) um polipeptídeo tendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 ou 3, em que o dito polipeptídeo codifica um scFv antifluoresceína e em que, opcionalmente, o dito polipeptídeo de (a) ou
(b) compreende adicionalmente um polipeptídeo que codifica um domínio de articulação de IgG4, um domínio de ativação de CD36 e um domínio de coestimulação de 4-1BB.
3. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico conforme definido na reivindicação 1.
4. Vetor, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o dito vetor é um vetor lentiviral.
5. Célula caracterizada pelo fato de que compreende o ácido nucleico ou vetor conforme definidos em uma das reivindicações 1, 3 ou 4.
6. Célula, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a célula é um linfócito T ou linfócito T citotóxico.
7. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o dito polipeptídeo compreende ou consiste em sequências de aminoácidos humanizadas ou humanas.
8. Célula caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo conforme definido na reivindicação 2 ou 7.
9. célula, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a célula é um linfócito T ou linfócito T citotóxico.
10. Método para melhorar ou tratar um câncer em um paciente caracterizado pelo fato de que compreende:
marcar um câncer no dito paciente com um ligante de molécula pequena com uma fração de isotiocianato de fluoresceína (FITC); e administrar ao dito paciente uma composição de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo a célula, o linfócito T ou linfócito T citotóxico conforme definido nas reivindicações 5, 6 ou 9.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a composição de células T CAR é administrada antes de marcar o câncer com o ligante de molécula pequena tendo uma fração FITC.
12. Método, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que a composição de células T CAR compreende células autólogas.
BR112020014913-6A 2018-01-22 2019-01-22 Métodos para uso de células t car BR112020014913A2 (pt)

Applications Claiming Priority (13)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862620414P 2018-01-22 2018-01-22
US62/620,414 2018-01-22
US201862620706P 2018-01-23 2018-01-23
US62/620,706 2018-01-23
US201862656233P 2018-04-11 2018-04-11
US62/656,233 2018-04-11
US201862724171P 2018-08-29 2018-08-29
US62/724,171 2018-08-29
US201862735627P 2018-09-24 2018-09-24
US62/735,627 2018-09-24
US201862736727P 2018-09-26 2018-09-26
US62/736,727 2018-09-26
PCT/US2019/014478 WO2019144095A1 (en) 2018-01-22 2019-01-22 Methods of use for car t cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112020014913A2 true BR112020014913A2 (pt) 2020-12-08

Family

ID=67299784

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112020014913-6A BR112020014913A2 (pt) 2018-01-22 2019-01-22 Métodos para uso de células t car

Country Status (11)

Country Link
US (4) US11779602B2 (pt)
EP (2) EP3743082A4 (pt)
JP (2) JP2021512147A (pt)
CN (2) CN112055595A (pt)
AU (2) AU2019209428A1 (pt)
BR (1) BR112020014913A2 (pt)
CA (2) CA3089319A1 (pt)
IL (1) IL276131A (pt)
SG (1) SG11202006886VA (pt)
TW (1) TW201940182A (pt)
WO (2) WO2019144095A1 (pt)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11649288B2 (en) 2017-02-07 2023-05-16 Seattle Children's Hospital Phospholipid ether (PLE) CAR T cell tumor targeting (CTCT) agents
CN110582288A (zh) 2017-02-28 2019-12-17 恩多塞特公司 用于car t细胞疗法的组合物和方法
BR112020014913A2 (pt) 2018-01-22 2020-12-08 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Métodos para uso de células t car
US20200354477A1 (en) * 2018-02-06 2020-11-12 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Fluorescein-specific cars exhibiting optimal t cell function against fl-ple labelled tumors
US20210346431A1 (en) * 2018-02-23 2021-11-11 Endocyte, Inc. Sequencing method for car t cell therapy
WO2022099153A1 (en) * 2020-11-09 2022-05-12 St. Jude Children's Research Hospital Novel vhl small molecule probes
AU2021386252A1 (en) * 2020-11-30 2023-06-29 Purdue Research Foundation Combinations of small molecule drug conjugate and car-expressing cytotoxic lymphocytes and methods of treating cancer using the same
EP4032910A1 (en) * 2021-01-22 2022-07-27 ETH Zurich Bispecific binding agent that binds to cd3 and a fluorophore
WO2023115049A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Umoja Biopharma, Inc. Cytotoxic innate lymphoid cell and uses thereof
WO2023240282A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Umoja Biopharma, Inc. Engineered stem cells and uses thereof
WO2024097992A2 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Umoja Biopharma, Inc. Particles displaying adhesion-molecule fusions
CN116376828B (zh) * 2023-06-02 2023-08-11 成都云测医学生物技术有限公司 一种诱导CD4+T细胞生成Treg细胞的方法及应用
CN117659205A (zh) * 2023-12-05 2024-03-08 北京同立海源生物科技有限公司 一种分选激活磁珠的偶联方法及应用

Family Cites Families (398)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR870700095A (ko) 1985-01-28 1987-02-28 원본미기재 AraB 프로모터 및 미생물학적 방법에 의해 세크로핀을 포함한 폴리펩타이드를 제조하는 방법
US4690915A (en) 1985-08-08 1987-09-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans
IN165717B (pt) 1986-08-07 1989-12-23 Battelle Memorial Institute
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5202238A (en) 1987-10-27 1993-04-13 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
US6004781A (en) 1988-01-22 1999-12-21 The General Hospital Corporation Nucleic acid encoding Ig-CD4 fusion proteins
IL86278A (en) 1988-05-04 2003-06-24 Yeda Res & Dev Endowing cells with antibody specificity using chimeric t cell receptor
US5906936A (en) 1988-05-04 1999-05-25 Yeda Research And Development Co. Ltd. Endowing lymphocytes with antibody specificity
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US6406697B1 (en) 1989-02-23 2002-06-18 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5216132A (en) 1990-01-12 1993-06-01 Protein Design Labs, Inc. Soluble t-cell antigen receptor chimeric antigens
US20020004052A1 (en) 1990-05-08 2002-01-10 David Berd Composition comprising a tumor cell extract and method of using the composition
US5914109A (en) 1990-06-15 1999-06-22 New York University Heterohybridomas producing human monoclonal antibodies to HIV-1
CA2074825C (en) 1990-12-14 2005-04-12 Daniel J. Capon Chimeric chains for receptor-associated signal transduction pathways
US20020111474A1 (en) 1990-12-14 2002-08-15 Capon Daniel J. Chimeric chains for receptor-associated signal transduction pathways
US6319494B1 (en) 1990-12-14 2001-11-20 Cell Genesys, Inc. Chimeric chains for receptor-associated signal transduction pathways
US6407221B1 (en) 1990-12-14 2002-06-18 Cell Genesys, Inc. Chimeric chains for receptor-associated signal transduction pathways
US6753162B1 (en) 1991-03-07 2004-06-22 The General Hospital Corporation Targeted cytolysis of HIV-infected cells by chimeric CD4 receptor-bearing cells
US5912170A (en) 1991-03-07 1999-06-15 The General Hospital Corporation Redirection of cellular immunity by protein-tyrosine kinase chimeras
NZ241855A (en) 1991-03-07 1994-04-27 Gen Hospital Corp Use of therapeutic cells to obtain cellular response to infection, tumours or autoimmune-generated cells, cells with chimaeric receptors (with binding component and destruction signal), dna encoding the receptor, vectors and antibodies to receptor
US5843728A (en) 1991-03-07 1998-12-01 The General Hospital Corporation Redirection of cellular immunity by receptor chimeras
US5851828A (en) 1991-03-07 1998-12-22 The General Hospital Corporation Targeted cytolysis of HIV-infected cells by chimeric CD4 receptor-bearing cells
US7049136B2 (en) 1991-03-07 2006-05-23 The General Hospital Corporation Redirection of cellular immunity by receptor chimeras
US6004811A (en) 1991-03-07 1999-12-21 The Massachussetts General Hospital Redirection of cellular immunity by protein tyrosine kinase chimeras
EP0575537A1 (en) 1991-03-08 1993-12-29 Cytomed, Inc. Soluble cd28 proteins and methods of treatment therewith
US6582959B2 (en) 1991-03-29 2003-06-24 Genentech, Inc. Antibodies to vascular endothelial cell growth factor
ATE194494T1 (de) 1991-10-21 2000-07-15 Cell Genesys Inc Kombinierte zelluläre und immunsuppressive therapien
IL104570A0 (en) 1992-03-18 1993-05-13 Yeda Res & Dev Chimeric genes and cells transformed therewith
US8211422B2 (en) 1992-03-18 2012-07-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric receptor genes and cells transformed therewith
US5372930A (en) 1992-09-16 1994-12-13 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Sensor for ultra-low concentration molecular recognition
DK0668777T3 (da) 1992-11-05 2007-02-19 Sloan Kettering Inst Cancer Prostataspecifikt membran-antigen
US6953668B1 (en) 1992-11-05 2005-10-11 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Prostate-specific membrane antigen
US7105159B1 (en) 1992-11-05 2006-09-12 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Antibodies to prostate-specific membrane antigen
US5861156A (en) 1993-01-08 1999-01-19 Creative Biomolecules Methods of delivering agents to target cells
CA2160011A1 (en) 1993-04-06 1994-10-13 Philip D. Greenberg Chimeric cytokine receptors in lymphocytes
US6051427A (en) 1993-06-11 2000-04-18 Cell Genesys, Inc. Method for production of high titer virus and high efficiency retroviral mediated transduction of mammalian cells
US5834256A (en) 1993-06-11 1998-11-10 Cell Genesys, Inc. Method for production of high titer virus and high efficiency retroviral mediated transduction of mammalian cells
US5525503A (en) 1993-09-28 1996-06-11 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Signal transduction via CD28
US5935818A (en) 1995-02-24 1999-08-10 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid molecule encoding alternatively spliced prostate-specific membrane antigen and uses thereof
NZ285395A (en) 1994-05-02 1998-10-28 Novartis Ag Chimeric antibody, cancer treatment
US5798100A (en) 1994-07-06 1998-08-25 Immunomedics, Inc. Multi-stage cascade boosting vaccine
US7354587B1 (en) 1994-07-06 2008-04-08 Immunomedics, Inc. Use of immunoconjugates to enhance the efficacy of multi-stage cascade boosting vaccines
US5716614A (en) 1994-08-05 1998-02-10 Molecular/Structural Biotechnologies, Inc. Method for delivering active agents to mammalian brains in a complex with eicosapentaenoic acid or docosahexaenoic acid-conjugated polycationic carrier
CA2204183A1 (en) 1994-11-01 1996-05-09 Andrew Lawrence Feldhaus Chimeric receptors for the generation of selectively-activatable th-independent cytotoxic t cells
US5741899A (en) 1995-02-02 1998-04-21 Cell Genesys, Inc. Chimeric receptors comprising janus kinase for regulating cellular pro liferation
US5712149A (en) 1995-02-03 1998-01-27 Cell Genesys, Inc. Chimeric receptor molecules for delivery of co-stimulatory signals
US6103521A (en) 1995-02-06 2000-08-15 Cell Genesys, Inc. Multispecific chimeric receptors
ATE317435T1 (de) 1995-02-24 2006-02-15 Sloan Kettering Inst Cancer Prostataspezifisches membranes antigen und seine anwendungen
US5830755A (en) 1995-03-27 1998-11-03 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services T-cell receptors and their use in therapeutic and diagnostic methods
WO1997004752A1 (en) 1995-07-26 1997-02-13 Duramed Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical compositions of conjugated estrogens and methods for their use
GB9526131D0 (en) 1995-12-21 1996-02-21 Celltech Therapeutics Ltd Recombinant chimeric receptors
US6451995B1 (en) 1996-03-20 2002-09-17 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Single chain FV polynucleotide or peptide constructs of anti-ganglioside GD2 antibodies, cells expressing same and related methods
US6261787B1 (en) 1996-06-03 2001-07-17 Case Western Reserve University Bifunctional molecules for delivery of therapeutics
US5969102A (en) 1997-03-03 1999-10-19 St. Jude Children's Research Hospital Lymphocyte surface receptor that binds CAML, nucleic acids encoding the same and methods of use thereof
US20020018783A1 (en) 1997-03-20 2002-02-14 Michel Sadelain Fusion proteins of a single chain antibody and cd28 and uses thereof
CA2293270A1 (en) 1997-06-11 1998-12-17 New York University Prenylcysteine carboxyl methyltransferase, dna encoding same, and a method of screening for inhibitors thereof
US6759243B2 (en) 1998-01-20 2004-07-06 Board Of Trustees Of The University Of Illinois High affinity TCR proteins and methods
US20090011984A1 (en) 1998-02-23 2009-01-08 Seppo Yla-Herttuala Biotin-binding receptor molecules
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
IL139345A0 (en) 1998-05-19 2001-11-25 Avidex Ltd Multivalent t cell receptor complexes
CA2343156A1 (en) 1998-09-04 2000-03-16 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Fusion receptors specific for prostate-specific membrane antigen and uses thereof
WO2000023573A2 (en) 1998-10-20 2000-04-27 City Of Hope Cd20-specific redirected t cells and their use in cellular immunotherapy of cd20+ malignancies
ATE370967T1 (de) 1998-10-21 2007-09-15 Altor Bioscience Corp Polyspezifische bindemoleküle und deren verwendung
US7217421B1 (en) 1998-11-03 2007-05-15 Cell Genesys, Inc. Cancer-associated antigens and methods of their identification and use
IL145067A0 (en) 1999-03-01 2002-06-30 Cell Genesys Inc Nucleic acid composition containing a first sequence encoding a chimeric cyclin-dependent kinase protein and a second sequence encoding an adenovirus e4 protein
EP1171596A1 (en) 1999-04-16 2002-01-16 Celltech Therapeutics Limited Synthetic transmembrane components
US6699972B1 (en) 1999-06-25 2004-03-02 Academia Sinica Chimeric protein and method of controlling tumor growth using the protein
EP1248645B1 (en) 2000-01-03 2007-04-18 Tr Associates, L.L.C. Novel chimeric proteins and their use
EP1255554B1 (en) 2000-02-14 2007-04-25 The Regents Of The University Of California Kidney-specific tumor vaccine directed against kidney tumor antigen g-250
US6770749B2 (en) 2000-02-22 2004-08-03 City Of Hope P53-specific T cell receptor for adoptive immunotherapy
CZ304942B6 (cs) 2000-03-31 2015-02-04 Purdue Research Foundation Léčivo pro zvyšování specifické eliminace populace tumorových buněk a farmaceutický prostředek obsahující konjugát fosfát-FITC nebo fosfát-dinitrofenyl
WO2001091625A2 (en) 2000-04-21 2001-12-06 Rutgers, The State University Of New Jersey Methods and compositions for the diagnosis of schizophrenia
US6524572B1 (en) 2000-06-26 2003-02-25 Rainbow Therapeutic Company Targeting recombinant virus with a bispecific fusion protein ligand in coupling with an antibody to cells for gene therapy
EP1306431B1 (en) 2000-07-31 2008-03-19 Green Peptide Co., Ltd. Tumor antigen
US7666424B2 (en) 2001-10-17 2010-02-23 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Methods of preparing and using single chain anti-tumor antibodies
EP1334188B1 (en) 2000-11-07 2006-08-30 City of Hope Cd19-specific redirected immune cells
US20020132983A1 (en) 2000-11-30 2002-09-19 Junghans Richard P. Antibodies as chimeric effector cell receptors against tumor antigens
US7723111B2 (en) 2001-03-09 2010-05-25 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Activated dual specificity lymphocytes and their methods of use
US7070995B2 (en) 2001-04-11 2006-07-04 City Of Hope CE7-specific redirected immune cells
CA2445746C (en) 2001-04-30 2012-09-18 City Of Hope Chimeric immunoreceptor useful in treating human cancers
US20090257994A1 (en) 2001-04-30 2009-10-15 City Of Hope Chimeric immunoreceptor useful in treating human cancers
US7514537B2 (en) 2001-04-30 2009-04-07 City Of Hope Chimeric immunoreceptor useful in treating human gliomas
US7939059B2 (en) 2001-12-10 2011-05-10 California Institute Of Technology Method for the generation of antigen-specific lymphocytes
US20070031438A1 (en) 2001-12-10 2007-02-08 Junghans Richard P Antibodies as chimeric effector cell receptors against tumor antigens
US20030170238A1 (en) 2002-03-07 2003-09-11 Gruenberg Micheal L. Re-activated T-cells for adoptive immunotherapy
US7446190B2 (en) 2002-05-28 2008-11-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Nucleic acids encoding chimeric T cell receptors
US7906620B2 (en) 2002-08-16 2011-03-15 Yeda Research And Development Co. Ltd. Tumor associated antigen, peptides thereof, and use of same as anti-tumor vaccines
AU2003265866A1 (en) 2002-09-03 2004-03-29 Vit Lauermann Targeted release
DE10244457A1 (de) 2002-09-24 2004-04-01 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Verfahren zur rationalen Mutagenese von alpha/beta T-Zell Rezeptoren und entsprechend mutierte MDM2-Protein spezifische alpha/beta T-Zell Rezeptoren
US20060018878A1 (en) 2003-03-11 2006-01-26 City Of Hope Dual antigen specific T cells with trafficking ability
US20050129671A1 (en) 2003-03-11 2005-06-16 City Of Hope Mammalian antigen-presenting T cells and bi-specific T cells
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US7348004B2 (en) 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US20050113564A1 (en) 2003-11-05 2005-05-26 St. Jude Children's Research Hospital Chimeric receptors with 4-1BB stimulatory signaling domain
US20130266551A1 (en) 2003-11-05 2013-10-10 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Chimeric receptors with 4-1bb stimulatory signaling domain
US7435596B2 (en) 2004-11-04 2008-10-14 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Modified cell line and method for expansion of NK cell
US8652484B2 (en) 2004-02-13 2014-02-18 Immunomedics, Inc. Delivery system for cytotoxic drugs by bispecific antibody pretargeting
WO2005079836A1 (en) 2004-02-18 2005-09-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Method for treating glaucoma
DE602005015687D1 (de) 2004-03-02 2009-09-10 Cellectar Inc Phospholipid-analoga für die behandlung von krebs
DK2801583T3 (en) 2004-07-10 2018-07-16 Fox Chase Cancer Center Genetically modified human natural killer cell lines
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
US7994298B2 (en) 2004-09-24 2011-08-09 Trustees Of Dartmouth College Chimeric NK receptor and methods for treating cancer
US7998736B2 (en) 2004-10-08 2011-08-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adoptive immunotherapy with enhanced T lymphocyte survival
CA2587766A1 (en) 2004-11-10 2007-03-01 Macrogenics, Inc. Engineering fc antibody regions to confer effector function
WO2007044033A2 (en) 2004-12-07 2007-04-19 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Therapeutic and diagnostic cloned mhc-unrestricted receptor specific for the muc1 tumor associated antigen
US20070036773A1 (en) 2005-08-09 2007-02-15 City Of Hope Generation and application of universal T cells for B-ALL
US8466263B2 (en) 2005-12-02 2013-06-18 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Carbonic anhydrase IX (G250) anitbodies
US7919079B2 (en) 2006-03-31 2011-04-05 Biosante Pharmaceuticals, Inc. Cancer immunotherapy compositions and methods of use
CA3149553C (en) 2006-06-12 2023-11-21 Aptevo Research And Development Llc Single-chain multivalent binding proteins with effector function
US20080051380A1 (en) 2006-08-25 2008-02-28 Auerbach Alan H Methods and compositions for treating cancer
EP1900752A1 (en) 2006-09-15 2008-03-19 DOMPE' pha.r.ma s.p.a. Human anti-folate receptor alpha antibodies and antibody fragments for the radioimmunotherapy of ovarian carcinoma
WO2008045437A2 (en) 2006-10-09 2008-04-17 The General Hospital Corporation Chimeric t-cell receptors and t-cells targeting egfrviii on tumors
US9334330B2 (en) 2006-10-10 2016-05-10 Universite De Nantes Use of monoclonal antibodies specific to the O-acetylated form of GD2 ganglioside for the treatment of certain cancers
EP2087337A4 (en) 2006-11-03 2010-09-08 Purdue Research Foundation METHOD AND DEVICE FOR EX-VIVO FLOW CYTOMETRY
WO2008060510A2 (en) 2006-11-13 2008-05-22 Sangamo Biosciences, Inc. Zinc finger nuclease for targeting the human glucocorticoid receptor locus
US20080131415A1 (en) 2006-11-30 2008-06-05 Riddell Stanley R Adoptive transfer of cd8 + t cell clones derived from central memory cells
US8748405B2 (en) 2007-01-26 2014-06-10 City Of Hope Methods and compositions for the treatment of cancer or other diseases
WO2008093688A1 (ja) 2007-01-30 2008-08-07 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. キメラFcγレセプター及び該レセプターを用いたＡＤＣＣ活性測定方法
PL2126054T3 (pl) 2007-01-31 2017-01-31 Yeda Research And Development Company Limited Przekierowane, genetycznie modyfikowane regulatorowe komórki T i ich zastosowanie w hamowaniu choroby autoimmunologicznej i zapalnej
WO2008097926A2 (en) 2007-02-02 2008-08-14 Yale University Transient transfection with rna
US8865169B2 (en) 2007-02-20 2014-10-21 Tufts University Methods and systems for multi-antibody therapies
EP2141997B1 (en) 2007-03-30 2012-10-31 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Constitutive expression of costimulatory ligands on adoptively transferred t lymphocytes
US20110269942A1 (en) 2007-08-09 2011-11-03 Daiichi Sankyo Company, Limited Antibodies modified with hydrophobic molecule
WO2009091826A2 (en) 2008-01-14 2009-07-23 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods related to a human cd19-specific chimeric antigen receptor (h-car)
US20110070191A1 (en) 2008-03-19 2011-03-24 Wong Hing C T cell receptor fusions and conjugates and methods of use there of
US8450112B2 (en) 2008-04-09 2013-05-28 Maxcyte, Inc. Engineering and delivery of therapeutic compositions of freshly isolated cells
CA2719924C (en) 2008-04-11 2017-10-03 Philip Tan Cd37 immunotherapeutic and combination with bifunctional chemotherapeutic thereof
US20090324630A1 (en) 2008-04-21 2009-12-31 Jensen Michael C Fusion multiviral chimeric antigen
EP2331566B1 (en) 2008-08-26 2015-10-07 City of Hope Method and compositions for enhanced anti-tumor effector functioning of t cells
CA2737496A1 (en) 2008-09-17 2010-03-25 Endocyte, Inc. Folate receptor binding conjugates of antifolates
EP2364368B1 (en) 2008-11-07 2014-01-15 Sequenta, Inc. Methods of monitoring conditions by sequence analysis
ES2866623T3 (es) 2008-11-24 2021-10-19 Massachusetts Inst Technology Métodos y composiciones para el suministro localizado de nanopartículas a un tumor
US20110178279A1 (en) 2009-08-03 2011-07-21 Williams John C Development of masked therapeutic antibodies to limit off-target effects: application to anti-egfr antibodies
WO2010132532A1 (en) 2009-05-15 2010-11-18 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services B cell surface reactive antibodies
US20100322909A1 (en) 2009-06-17 2010-12-23 The University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Th1-associated micrornas and their use for tumor immunotherapy
AU2010301042B2 (en) 2009-10-01 2014-03-20 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-vascular endothelial growth factor receptor-2 chimeric antigen receptors and use of same for the treatment of cancer
US9211321B2 (en) 2009-10-27 2015-12-15 Immunicum Ab Method for proliferation of antigen-specific T cells
US9181527B2 (en) 2009-10-29 2015-11-10 The Trustees Of Dartmouth College T cell receptor-deficient T cell compositions
US9273283B2 (en) 2009-10-29 2016-03-01 The Trustees Of Dartmouth College Method of producing T cell receptor-deficient T cells expressing a chimeric receptor
CA2779526C (en) 2009-11-03 2022-12-06 City Of Hope Truncated epiderimal growth factor receptor (egfrt) for transduced t cell selection
CN102762719A (zh) 2009-12-08 2012-10-31 威尔森沃尔夫制造公司 用于过继细胞疗法的细胞培养的改进方法
US8956860B2 (en) 2009-12-08 2015-02-17 Juan F. Vera Methods of cell culture for adoptive cell therapy
MX340102B (es) 2010-01-28 2016-06-24 The Children's Hospital Of Philadelphia * Una plataforma de fabricacion ajustable en escala, para la purificacion de vector viral y vectores virales asi purificados para el uso en terapia de genes.
WO2011097477A1 (en) 2010-02-04 2011-08-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Icos critically regulates the expansion and function of inflammatory human th17 cells
AU2011215685B2 (en) 2010-02-12 2015-08-20 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods for identifying and isolating cells expressing a polypeptide
SA111320200B1 (ar) 2010-02-17 2014-02-16 ديبيوفارم اس ايه مركبات ثنائية الحلقة واستخداماتها كمثبطات c-src/jak مزدوجة
US9833480B2 (en) 2010-04-14 2017-12-05 Prospect Chartercare, Llc Methods and compositions for treating HIV
EP2566954B2 (en) 2010-05-04 2022-11-02 Yeda Research and Development Co. Ltd. Immunotherapy using redirected allogeneic cells
US9089520B2 (en) 2010-05-21 2015-07-28 Baylor College Of Medicine Methods for inducing selective apoptosis
WO2011159847A2 (en) 2010-06-15 2011-12-22 The Regents Of The University Of California Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1 (ror1) single chain fv antibody fragment conjugates and methods of use thereof
WO2012012695A2 (en) 2010-07-23 2012-01-26 Fred Hutchinson Cancer Research Center A method for the treatment of obesity
DE102010036122A1 (de) 2010-09-01 2012-03-01 Nora Systems Gmbh Bodenbelag
WO2012136231A1 (en) 2010-09-08 2012-10-11 Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg-Speyer-Haus Interleukin 15 as selectable marker for gene transfer in lymphocytes
ES2754394T3 (es) 2010-09-08 2020-04-17 Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg Speyer Haus Receptores de antígenos quiméricos con una región bisagra optimizada
EP2614143B1 (en) 2010-09-08 2018-11-07 Baylor College Of Medicine Immunotherapy of non-small lung cancer using genetically engineered gd2-specific t cells
ES2876176T3 (es) 2010-09-21 2021-11-12 The Us Secretary Department Of Health And Human Services Office Of Technology Transfer National Inst Receptores de células T anti-SSX-2 y materiales relacionados y métodos de uso
WO2012040550A1 (en) 2010-09-26 2012-03-29 Da Yu Enterprises, L.L.C. Method of recombinant macromolecular production
US9845362B2 (en) 2010-10-08 2017-12-19 The University Of North Carolina At Charlotte Compositions comprising chimeric antigen receptors, T cells comprising the same, and methods of using the same
WO2012054825A1 (en) 2010-10-22 2012-04-26 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-mage-a3 t cell receptors and related materials and methods of use
DK2649086T3 (en) 2010-12-09 2017-09-18 Univ Pennsylvania USING CHEMICAL ANTIGEN RECEPTOR-MODIFIED T-CELLS TO TREAT CANCER
WO2012076059A1 (en) 2010-12-09 2012-06-14 Stichting Het Nederlands Kanker Instituut Immune restricted peptides with increased efficacy
ES2791716T3 (es) 2010-12-14 2020-11-05 Univ Maryland Células T que expresan al receptor de antígeno quimérico antietiqueta universal y métodos para el tratamiento del cáncer
CA2824997C (en) 2011-01-18 2023-01-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for treating cancer
SG193023A1 (en) 2011-02-11 2013-10-30 Sloan Kettering Inst Cancer Hla-restricted, peptide-specific antigen binding proteins
BR112013024395B1 (pt) 2011-03-23 2021-10-26 Fred Hutchinson Cancer Research Center Composições adotivas de imunoterapia celular e método para fabricação da dita composição
EP2502934B1 (en) 2011-03-24 2018-01-17 Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-Universität Mainz Single chain antigen recognizing constructs (scARCs) stabilized by the introduction of novel disulfide bonds
JP6082997B2 (ja) 2011-04-01 2017-02-22 メモリアル スローン−ケタリング キャンサー センター Ｈｌａ−ａ２により提示されるｗｔ１ペプチドへのｔ細胞受容体様抗体
JP6076963B2 (ja) 2011-04-08 2017-02-15 アメリカ合衆国 抗上皮成長因子受容体変異体ｉｉｉキメラ抗原受容体及び癌の治療のためのその使用
CN103502439B (zh) 2011-04-13 2016-10-12 因缪尼卡姆股份公司 用于抗原特异性t细胞增殖的方法
KR20140043340A (ko) 2011-04-13 2014-04-09 이뮤니쿰 에이비 T 세포의 프라이밍을 위한 방법
WO2012145469A1 (en) 2011-04-19 2012-10-26 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Human monoclonal antibodies specific for glypican-3 and use thereof
GB201108236D0 (en) 2011-05-17 2011-06-29 Ucl Business Plc Method
KR20140045533A (ko) 2011-07-29 2014-04-16 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 스위치 공자극 수용체
MX356947B (es) 2011-08-23 2018-06-20 Roche Glycart Ag Anticuerpos bioespecíficos específicos para antígenos que activan células t y un antígeno tumoral y métodos de uso.
WO2013033626A2 (en) 2011-08-31 2013-03-07 Trustees Of Dartmouth College Nkp30 receptor targeted therapeutics
SI2755997T1 (sl) 2011-09-15 2018-11-30 The United States of America, as represented by Secretary, Department of Health and Human Services, Office of Technology Transfer, National Institutes of Health T-celični receptorji, ki prepoznajo HLA-A1- ali HLA-CW7-omejeni mage
EP2755487B1 (en) 2011-09-16 2018-12-19 Baylor College Of Medicine Targeting the tumor microenvironment using manipulated nkt cells
EA201490636A1 (ru) 2011-09-16 2014-08-29 Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания Сконструированные с помощью рнк t-клетки для лечения злокачественных новообразований
US9708384B2 (en) 2011-09-22 2017-07-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Universal immune receptor expressed by T cells for the targeting of diverse and multiple antigens
CN104126009B (zh) 2011-10-07 2019-05-10 国立大学法人三重大学 嵌合抗原受体
WO2013059593A1 (en) 2011-10-20 2013-04-25 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-cd22 chimeric antigen receptors
US9688740B2 (en) 2011-10-26 2017-06-27 National Cancer Center Mutant CTLA4 gene transfected T cell and composition including same for anticancer immunotherapy
US9272002B2 (en) 2011-10-28 2016-03-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Fully human, anti-mesothelin specific chimeric immune receptor for redirected mesothelin-expressing cell targeting
US9226936B2 (en) 2011-10-28 2016-01-05 The Wistar of Anatomy and Biology Methods and compositions for enhancing the therapeutic effect of anti-tumor T cells
EP2773651B1 (en) 2011-11-03 2020-12-23 The Trustees of the University of Pennsylvania Isolated b7-h4 specific compositions and methods of use thereof
WO2013070468A1 (en) 2011-11-08 2013-05-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Glypican-3-specific antibody and uses thereof
EP2776451B1 (en) 2011-11-11 2018-07-18 Fred Hutchinson Cancer Research Center Cyclin a1-targeted t-cell immunotherapy for cancer
BR112014014105B1 (pt) 2011-12-16 2023-10-10 Targetgene Biotechnologies Ltd Método para modificar um sítio-alvo predeterminado no interior de um ácido nucleico genômico ou organelar alvo em uma célula hospedeira eucariótica por um complexo núcleoproteína
WO2013093809A1 (en) 2011-12-23 2013-06-27 Pfizer Inc. Engineered antibody constant regions for site-specific conjugation and methods and uses therefor
CA2899433A1 (en) 2012-01-27 2013-08-01 Gliknik Inc. Fusion proteins comprising igg2 hinge domains
EP2814846B1 (en) 2012-02-13 2020-01-08 Seattle Children's Hospital d/b/a Seattle Children's Research Institute Bispecific chimeric antigen receptors and therapeutic uses thereof
KR20140127829A (ko) 2012-02-22 2014-11-04 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 2세대 키메라 항원 수용체에서 cd2 시그널링 도메인의 용도
EA201491574A1 (ru) 2012-02-22 2014-12-30 Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания Применение car, основанных на icos, для усиления противоопухолевой активности и длительного сохранения car
WO2013126726A1 (en) 2012-02-22 2013-08-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Double transgenic t cells comprising a car and a tcr and their methods of use
EP2828290B1 (en) 2012-03-23 2018-08-15 The United States of America, represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Anti-mesothelin chimeric antigen receptors
CA2869562C (en) 2012-04-11 2023-09-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric antigen receptors targeting b-cell maturation antigen
US9156915B2 (en) 2012-04-26 2015-10-13 Thomas Jefferson University Anti-GCC antibody molecules
EP2844743B1 (en) 2012-05-03 2021-01-13 Fred Hutchinson Cancer Research Center Enhanced affinity t cell receptors and methods for making the same
ES2719495T3 (es) 2012-05-07 2019-07-10 Dartmouth College Anticuerpo dirigido contra b7-h6, proteínas de fusión, y métodos de uso de los mismos
CN107881183B (zh) 2012-05-22 2021-04-02 美国卫生和人力服务部 鼠抗-ny-eso-1 t细胞受体
SG11201408284VA (en) 2012-05-22 2015-02-27 Xenon Pharmaceuticals Inc N-substituted benzamides and their use in the treatment of pain
IN2014DN10991A (pt) 2012-05-25 2015-09-25 Cellectis
SG11201407972RA (en) 2012-06-01 2015-01-29 Us Health High-affinity monoclonal antibodies to glypican-3 and use thereof
JP6421371B2 (ja) 2012-06-08 2018-11-14 学校法人近畿大学 トランスポーターに対する抗体およびその用途
JP5863585B2 (ja) 2012-07-11 2016-02-16 三菱電機株式会社 大信号等価回路モデルを用いたトランジスタ特性計算装置
KR20210149195A (ko) 2012-07-13 2021-12-08 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 형질도입된 ｔ 세포의 투여 적합성을 평가하는 방법
FI4019041T3 (fi) 2012-07-13 2023-04-03 Univ Pennsylvania Car:ien antitumoraalisen aktiivisuuden toksisuuden hallinta
CN104507537A (zh) 2012-07-13 2015-04-08 宾夕法尼亚大学董事会 用于调节car t细胞的组合物和方法
EA201590208A1 (ru) 2012-07-13 2015-11-30 Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания Усиление активности т-клеток car путем совместного введения биспецифического антитела
CN102775500A (zh) 2012-08-03 2012-11-14 郑骏年 嵌合抗原受体iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3ζ及其用途
LT2884999T (lt) 2012-08-20 2021-04-12 Fred Hutchinson Cancer Research Center Ląstelinės imunoterapijos būdas ir kompozicijos
CA2882753C (en) 2012-08-21 2021-08-24 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Mesothelin domain-specific monoclonal antibodies and use thereof
KR102141259B1 (ko) 2012-09-04 2020-08-05 셀렉티스 멀티―체인 키메라 항원 수용체 및 그것의 용도들
KR102303166B1 (ko) 2012-09-14 2021-09-17 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈 Mhc ii형 제한된 mage-a3을 인식하는 t 세포 수용체
EP2900695B1 (en) 2012-09-27 2018-01-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Mesothelin antibodies and methods for eliciting potent antitumor activity
AR092745A1 (es) 2012-10-01 2015-04-29 Univ Pennsylvania Composiciones que comprenden un dominio de union anti-fap y metodos para hacer blanco en celulas estromales para el tratamiento del cancer
AU2013327136A1 (en) 2012-10-02 2015-04-16 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Compositions and methods for immunotherapy
WO2014055657A1 (en) 2012-10-05 2014-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of a trans-signaling approach in chimeric antigen receptors
WO2014055771A1 (en) 2012-10-05 2014-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Human alpha-folate receptor chimeric antigen receptor
CA2886684C (en) 2012-10-10 2023-09-19 Sangamo Biosciences, Inc. T cell modifying compounds and uses thereof
US20140120136A1 (en) 2012-10-12 2014-05-01 The Babraham Institute Mir-155 enhancement of cd8+ t cell immunity
UY35103A (es) 2012-10-29 2014-05-30 Glaxo Group Ltd Compuestos de cefem 2-sustituidos
ES2776698T3 (es) * 2012-12-20 2020-07-31 Purdue Research Foundation Células T que expresan un receptor antigénico quimérico como terapia contra el cáncer
WO2014099671A1 (en) 2012-12-20 2014-06-26 Bluebird Bio, Inc. Chimeric antigen receptors and immune cells targeting b cell malignancies
AU2013204922B2 (en) 2012-12-20 2015-05-14 Celgene Corporation Chimeric antigen receptors
EP2948544A4 (en) 2013-01-28 2016-08-03 St Jude Childrens Res Hospital CHIMERIC RECEPTOR WITH NKG2D SPECIFICITY FOR CELL THERAPY AGAINST CANCER AND INFECTION DISEASES
SG10201810087QA (en) 2013-02-06 2018-12-28 Celgene Corp Modified t lymphocytes having improved specificity
JO3529B1 (ar) 2013-02-08 2020-07-05 Amgen Res Munich Gmbh مضاد التصاق خلايا الدم البيض من أجل التخفيف من الاثار السلبية الممكنة الناتجة عن مجالات ارتباط cd3- المحدد
PT3613439T (pt) 2013-02-15 2021-05-12 Univ California Recetor de antigénio quimérico e métodos de utilização do mesmo
RU2708032C2 (ru) 2013-02-20 2019-12-03 Новартис Аг ЛЕЧЕНИЕ РАКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ХИМЕРНОГО АНТИГЕНСПЕЦИФИЧЕСКОГО РЕЦЕПТОРА НА ОСНОВЕ ГУМАНИЗИРОВАННОГО АНТИТЕЛА ПРОТИВ EGFRvIII
TW201446794A (zh) 2013-02-20 2014-12-16 Novartis Ag 利用抗－ｃｄ１２３嵌合抗原受體工程化ｔ細胞之初級人類白血病有效靶向
US9434935B2 (en) 2013-03-10 2016-09-06 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Modified caspase polypeptides and uses thereof
CA2905352A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Methods for controlling t cell proliferation
CN110420333A (zh) 2013-03-14 2019-11-08 斯克利普斯研究所 靶向剂抗体偶联物及其用途
US9587237B2 (en) 2013-03-14 2017-03-07 Elwha Llc Compositions, methods, and computer systems related to making and administering modified T cells
US9402888B2 (en) 2013-03-14 2016-08-02 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods and compositions for treating cancer
US9499855B2 (en) 2013-03-14 2016-11-22 Elwha Llc Compositions, methods, and computer systems related to making and administering modified T cells
US9393268B2 (en) 2013-03-15 2016-07-19 Thomas Jefferson University Cell-based anti-cancer compositions with reduced toxicity and methods of making and using the same
US9657105B2 (en) 2013-03-15 2017-05-23 City Of Hope CD123-specific chimeric antigen receptor redirected T cells and methods of their use
EP2970426B1 (en) 2013-03-15 2019-08-28 Michael C. Milone Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
CN105518018B (zh) 2013-03-15 2020-04-03 细胞基因公司 修饰的t淋巴细胞
US9446105B2 (en) 2013-03-15 2016-09-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Chimeric antigen receptor specific for folate receptor β
US9561291B2 (en) 2013-03-15 2017-02-07 Imre Kovesdi Methods of targeting T-cells to tumors
UY35468A (es) 2013-03-16 2014-10-31 Novartis Ag Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico de antígeno anti-cd19
US9790282B2 (en) 2013-03-25 2017-10-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-CD276 polypeptides, proteins, and chimeric antigen receptors
JP6463577B2 (ja) 2013-05-14 2019-02-06 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム 改変キメラ抗原受容体（ｃａｒ）ｔ細胞のヒト応用
US9873894B2 (en) 2013-05-15 2018-01-23 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treatment of a genetic condition
CA2913052A1 (en) 2013-05-24 2014-11-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Chimeric antigen receptor-targeting monoclonal antibodies
ES2883131T3 (es) 2013-05-29 2021-12-07 Cellectis Métodos para la modificación de células T para inmunoterapia utilizando el sistema de nucleasa CAS guiado por ARN
DK3309248T3 (da) 2013-05-29 2021-08-02 Cellectis Fremgangsmåde til manipulering af T-celler til immunterapi under anvendelse af et RNA-guidet CAS-nuklease-system
DK3004329T3 (da) 2013-06-05 2020-05-18 Bellicum Pharmaceuticals Inc Fremgangsmåder til induktion af delvis apoptose under anvendelse af caspasepolypeptider
US9738726B2 (en) 2013-06-11 2017-08-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services HER2-specific monoclonal antibodies and conjugates thereof
DK3013350T3 (da) 2013-06-25 2020-04-14 Vaccinex Inc Anvendelse af semaphorin-4D-hæmmende molekyler i kombination med en immunmodulerende terapi for at hæmme tumorvækst og metastaser
EP3492094A1 (en) 2013-08-30 2019-06-05 Board of Regents, The University of Texas System Administration of kynurenine depleting enzymes for tumor therapy
WO2015038579A1 (en) 2013-09-11 2015-03-19 Equip, Llc Discrete peg based dyes
JP6502931B2 (ja) 2013-10-11 2019-04-17 アメリカ合衆国 Ｔｅｍ８抗体およびその使用
KR102339240B1 (ko) 2013-10-15 2021-12-15 더 스크립스 리서치 인스티튜트 펩타이드 키메라 항원 수용체 t 세포 스위치 및 이의 용도
CA2926698C (en) 2013-10-15 2021-06-22 The California Institute For Biomedical Research Chimeric antigen receptor t cell switches and uses thereof
US10144770B2 (en) 2013-10-17 2018-12-04 National University Of Singapore Chimeric receptors and uses thereof in immune therapy
NZ719840A (en) 2013-10-31 2023-01-27 Seattle Children’S Hospital Dba Seattle Children’S Res Institute Modified hematopoietic stem/progenitor and non-t effector cells, and uses thereof
EP3626748A1 (en) * 2014-01-13 2020-03-25 Stephen J. Forman Chimeric antigen receptors (cars) having mutations in the fc spacer region and methods for their use
JP2017507917A (ja) 2014-01-14 2017-03-23 セレクティスＣｅｌｌｅｃｔｉｓ 軟骨魚類由来の抗原認識ドメインを使用したキメラ抗原受容体
US9694033B2 (en) 2014-01-24 2017-07-04 The Cleveland Clinic Foundation IL-9 secreting CD8+ Tc9 cells and methods of treating cancer
BR112016018521A2 (pt) 2014-02-14 2017-10-17 Immune Design Corp composição, e, kit.
JP6772063B2 (ja) 2014-02-14 2020-10-21 ベリカム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 誘導可能なキメラポリペプチドを使用して細胞を活性化するための方法
CN106132436B (zh) * 2014-02-21 2021-06-15 Ibc药品公司 通过诱导对trop-2表达细胞的免疫应答的疾病疗法
CA2977839C (en) 2014-02-28 2022-07-26 The Royal Institution For The Advancement Of Learning / Mcgill University Tc-ptp inhibitors as apc activators for immunotherapy
GB201403875D0 (en) 2014-03-05 2014-04-16 Cantargia Ab Novel antibodies and uses thereof
KR101605421B1 (ko) 2014-03-05 2016-03-23 국립암센터 B 세포 림프종 세포를 특이적으로 인지하는 단일클론항체 및 이의 용도
EP3114217A4 (en) 2014-03-07 2017-09-20 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Caspase polypeptides having modified activity and uses thereof
US20170081411A1 (en) 2014-03-15 2017-03-23 Novartis Ag Regulatable chimeric antigen receptor
IL280215B (en) 2014-04-07 2022-07-01 Novartis Ag Cancer treatment using a chimeric receptor antigen (car) against cd19
WO2015157299A2 (en) 2014-04-09 2015-10-15 Seattle Children's Hospital (Dba Seattle Children's Research Institute Inhibition of lactate dehydrogenase 5 (ldh-5) binding, incorporation, internalization and/or endocytosis to immune cells
KR102509481B1 (ko) 2014-04-10 2023-03-10 시애틀 칠드런즈 호스피탈 디/비/에이 시애틀 칠드런즈 리서치 인스티튜트 규정된 조성물 유전자 변형된 t-세포 생성물
JP2017514471A (ja) 2014-04-23 2017-06-08 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム キメラ抗原受容体（ｃａｒ）並びにその製造及び使用方法
US10494422B2 (en) 2014-04-29 2019-12-03 Seattle Children's Hospital CCR5 disruption of cells expressing anti-HIV chimeric antigen receptor (CAR) derived from broadly neutralizing antibodies
EP3155018A4 (en) 2014-06-06 2018-01-10 The California Institute for Biomedical Research Constant region antibody fusion proteins and compositions thereof
US9885021B2 (en) 2014-06-12 2018-02-06 Children's National Medical Center Generation of broadly-specific, virus-immune cells targeting multiple HIV antigens for preventive and therapeutic use
JP6831777B2 (ja) 2014-07-21 2021-02-17 ノバルティス アーゲー Ｃｄ３３キメラ抗原受容体を使用する癌の処置
RU2751660C2 (ru) 2014-07-21 2021-07-15 Новартис Аг Лечение злокачественного новообразования с использованием гуманизированного химерного антигенного рецептора против всма
RU2741120C2 (ru) 2014-07-21 2021-01-22 Новартис Аг Лечение рака с использованием химерного антигенного рецептора cll-1
EP3177640B1 (en) 2014-08-08 2020-05-06 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University High affinity pd-1 agents and methods of use
WO2016025322A1 (en) 2014-08-09 2016-02-18 Purdue Research Foundation Design and development of neurokinin-1 receptor-binding agent delivery conjugates
US20180080008A1 (en) 2014-08-12 2018-03-22 Anthrogenesis Corporation Car-t lymphocytes engineered to home to lymph node b cell zone, skin, or gastrointestinal tract
CN107108744B (zh) 2014-08-19 2020-09-25 诺华股份有限公司 抗cd123嵌合抗原受体(car)用于癌症治疗
CA2959168A1 (en) 2014-09-02 2016-03-10 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Costimulation of chimeric antigen receptors by myd88 and cd40 polypeptides
EP3194433B1 (en) 2014-09-19 2019-05-22 City of Hope Costimulatory chimeric antigen receptor t cells targeting il13r 2
WO2016054520A2 (en) 2014-10-03 2016-04-07 The California Institute For Biomedical Research Engineered cell surface proteins and uses thereof
US9943612B2 (en) 2014-10-09 2018-04-17 Seattle Children's Hospital Long poly(A) plasmids and methods for introduction of long poly(A) sequences into the plasmid
EP3206704B1 (en) 2014-10-14 2022-04-20 Riptide Bioscience, Inc. Peptides having anti-inflammatory properties
SG10201903912XA (en) 2014-10-31 2019-05-30 Massachusetts Inst Technology Delivery of biomolecules to immune cells
EP3536707A1 (en) * 2014-11-05 2019-09-11 Board of Regents, The University of Texas System Gene modified immune effector cells and engineered cells for expansion of immune effector cells
US9879087B2 (en) 2014-11-12 2018-01-30 Siamab Therapeutics, Inc. Glycan-interacting compounds and methods of use
CN107002089B (zh) 2014-11-14 2021-09-07 麻省理工学院 化合物和组合物向细胞中的破坏和场实现的递送
EP3750545B1 (en) 2014-11-17 2024-03-27 Cellectar Biosciences, Inc. Phospholipid ether analogs as cancer-targeting drug vehicles
EP3227317A4 (en) 2014-12-02 2018-04-25 Roger Williams Hospital Methods and compositons for treating cancer
EP4219530A1 (en) 2014-12-05 2023-08-02 City of Hope Cs1 targeted chimeric antigen receptor-modified t cells
US20160166613A1 (en) 2014-12-15 2016-06-16 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Methods for controlled elimination of therapeutic cells
CA3008162A1 (en) 2014-12-15 2016-06-23 The Regents Of The University Of California Bispecific or-gate chimeric antigen receptor responsive to cd19 and cd20
EP3608408A1 (en) 2014-12-15 2020-02-12 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Methods for controlled activation or elimination of therapeutic cells
WO2016098078A2 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Novartis Ag Dimerization switches and uses thereof
IL274903B (en) 2014-12-24 2022-07-01 Ucl Business Ltd A cell that simultaneously expresses a chimeric antigen receptor (car) of 19cd and 22cd
SG11201705293WA (en) 2014-12-29 2017-07-28 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
US20180021378A1 (en) 2014-12-31 2018-01-25 Anthrogenesis Corporation Methods of treating hematological disorders, solid tumors, or infectious diseases using natural killer cells
US9765330B1 (en) 2015-01-09 2017-09-19 Nant Holdings Ip, Llc Compositions and methods for reduction of allograft recognition and rejection
AU2016221305B2 (en) 2015-02-18 2021-05-27 Enlivex Therapeutics Rdo Ltd Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
KR102624023B1 (ko) 2015-02-24 2024-01-11 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 결합-촉발된 전사 스위치 및 이들의 이용 방법
AU2016228080B2 (en) 2015-03-02 2020-11-12 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. Reducing immune tolerance induced by PD-L1
EP3270936A4 (en) 2015-03-17 2018-08-08 Chimera Bioengineering Inc. Smart car devices, de car polypeptides, side cars and uses thereof
CA2984624A1 (en) 2015-03-18 2016-09-22 Baylor College Of Medicine Her2/erbb2 chimeric antigen receptor
US9717745B2 (en) 2015-03-19 2017-08-01 Zhejiang DTRM Biopharma Co. Ltd. Pharmaceutical compositions and their use for treatment of cancer and autoimmune diseases
WO2016154628A1 (en) 2015-03-26 2016-09-29 Xiuli Wang Bi-specific targeted chimeric antigen receptor t cells
WO2016154621A1 (en) 2015-03-26 2016-09-29 The California Institute For Biomedical Research SWITCHABLE NON-scFv CHIMERIC RECEPTORS, SWITCHES, AND USES THEREOF
GB201505305D0 (en) 2015-03-27 2015-05-13 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against various tumors
WO2016168766A1 (en) * 2015-04-15 2016-10-20 The California Institute For Biomedical Research Optimized chimeric receptor t cell switches and uses thereof
EP3283113A4 (en) 2015-04-15 2018-12-05 The California Institute for Biomedical Research Optimized pne-based chimeric receptor t cell switches and uses thereof
EP3842448A1 (en) 2015-05-15 2021-06-30 City of Hope Chimeric antigen receptor compositions
US9636388B2 (en) 2015-05-19 2017-05-02 Morphogenesis, Inc. Multi-indication mRNA cancer immunotherapy
IL295224A (en) 2015-05-28 2022-10-01 Kite Pharma Inc Methods for training patients for t-cell therapy
AU2016274989A1 (en) 2015-06-12 2017-11-02 Immunomedics, Inc. Disease therapy with chimeric antigen receptor (car) constructs and t cells (car-t) or nk cells (car-nk) expressing car constructs
US9663756B1 (en) 2016-02-25 2017-05-30 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic separation of cellular supporting materials from cultured cells
WO2016210447A1 (en) 2015-06-26 2016-12-29 University Of Southern California Masking chimeric antigen receptor t cells for tumor-specific activation
GB201514328D0 (en) 2015-08-12 2015-09-23 Sigmoid Pharma Ltd Compositions
GB201514874D0 (en) 2015-08-20 2015-10-07 Autolus Ltd Cell
GB201514875D0 (en) 2015-08-20 2015-10-07 Autolus Ltd Receptor
WO2017035362A1 (en) 2015-08-26 2017-03-02 Achillion Pharmaceuticals, Inc. Use of complement pathway inhibitor compounds to mitigate adoptive t-cell therapy associated adverse immune responses
AU2016318773A1 (en) 2015-09-09 2018-04-12 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Genetic engineering of macrophages for immunotherapy
US9790467B2 (en) 2015-09-22 2017-10-17 Qt Holdings Corp Methods and compositions for activation or expansion of T lymphocytes
EP3359184B1 (en) 2015-10-05 2020-05-06 Precision Biosciences, Inc. Genetically-modified cells comprising a modified human t cell receptor alpha constant region gene
BR112018006991A2 (pt) 2015-10-06 2018-10-16 Hope City receptores de antígeno quiméricos direcionados ao psca
GB201518817D0 (en) 2015-10-23 2015-12-09 Autolus Ltd Cell
GB201518816D0 (en) 2015-10-23 2015-12-09 Autolus Ltd Receptor
CA3004299A1 (en) 2015-11-05 2017-05-11 City Of Hope Methods for preparing cells for adoptive t cell therapy
WO2017083274A1 (en) 2015-11-09 2017-05-18 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Novel rna-based vector system for transient and stable gene expression
TWI734715B (zh) 2015-11-19 2021-08-01 美商卡默森屈有限公司 趨化因子受體調節劑
TWI724056B (zh) 2015-11-19 2021-04-11 美商卡默森屈有限公司 Ｃｘｃｒ２抑制劑
WO2017106185A2 (en) 2015-12-14 2017-06-22 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Dual controls for therapeutic cell activation or elimination
US9849092B2 (en) 2015-12-21 2017-12-26 Gholam A. Peyman Early cancer detection and enhanced immunotherapy
SG10201913805RA (en) 2016-01-08 2020-03-30 Univ California Conditionally active heterodimeric polypeptides and methods of use thereof
KR20180096800A (ko) 2016-01-11 2018-08-29 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 키메라 단백질 및 유전자 발현을 조절하는 방법
EP3402509A4 (en) 2016-01-14 2019-07-10 Seattle Children's Hospital (DBA Seattle Children's Research Institute) TUMOR SPECIFIC IFNA SECRETION BY CAR T CELLS FOR RESTORING SOLID TUMOR MICRO ENVIRONMENT
IL287889B2 (en) 2016-02-05 2024-03-01 Hope City Administration of transgenic T cells for the treatment of central nervous system cancer
GB201602571D0 (en) 2016-02-12 2016-03-30 Autolus Ltd Signalling system
GB201602563D0 (en) 2016-02-12 2016-03-30 Autolus Ltd Signalling system
US11225520B2 (en) 2016-02-16 2022-01-18 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Immunotherapy compositions and methods
US11219635B2 (en) 2016-02-19 2022-01-11 City Of Hope Bi-specific aptamer
SG10202104509PA (en) 2016-03-19 2021-06-29 Exuma Biotech Corp Methods and compositions for transducing lymphocytes and regulated expansion thereof
US11111505B2 (en) 2016-03-19 2021-09-07 Exuma Biotech, Corp. Methods and compositions for transducing lymphocytes and regulating the activity thereof
WO2017165571A1 (en) * 2016-03-22 2017-09-28 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Early intervention methods to prevent or ameliorate toxicity
JP7282521B2 (ja) * 2016-04-08 2023-05-29 パーデュー・リサーチ・ファウンデイション Ｃａｒ ｔ細胞療法のための方法および組成物
US11446398B2 (en) 2016-04-11 2022-09-20 Obsidian Therapeutics, Inc. Regulated biocircuit systems
KR102410360B1 (ko) 2016-06-06 2022-06-17 시티 오브 호프 Baff-r 표적 키메라 항원 수용체-변형된 t 세포 및 그 용도
WO2017214170A2 (en) 2016-06-06 2017-12-14 City Of Hope Baff-r antibodies and uses thereof
GB201610512D0 (en) 2016-06-16 2016-08-03 Autolus Ltd Chimeric antigen receptor
GB201610515D0 (en) 2016-06-16 2016-08-03 Autolus Ltd Cell
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
WO2018013797A1 (en) 2016-07-13 2018-01-18 President And Fellows Of Harvard College Antigen-presenting cell-mimetic scaffolds and methods for making and using the same
KR20230113832A (ko) 2016-08-09 2023-08-01 시티 오브 호프 키메라 폭스바이러스 조성물 및 이의 용도
US9642906B2 (en) 2016-09-16 2017-05-09 Baylor College Of Medicine Generation of HPV-specific T-cells
WO2018075813A1 (en) 2016-10-19 2018-04-26 City Of Hope Use of endogenous viral vaccine in chimeric antigen receptor t cell therapy
EP3529268A1 (en) 2016-10-19 2019-08-28 The Scripps Research Institute Chimeric antigen receptor effector cell switches with humanized targeting moieties and/or optimized chimeric antigen receptor interacting domains and uses thereof
US20190247500A1 (en) 2016-10-19 2019-08-15 City Of Hope Use of Triplex CMV Vaccine in CAR T Cell Therapy
US10617720B2 (en) 2016-10-20 2020-04-14 Miltenyi Biotech, GmbH Chimeric antigen receptor specific for tumor cells
JP7069152B2 (ja) 2016-10-31 2022-05-17 シアトル チルドレンズ ホスピタル （ディービーエイ シアトル チルドレンズ リサーチ インスティテュート） 遺伝子組換えにより内在性ｆｏｘｐ３遺伝子の発現が安定化されたｃｄ４ ｔ細胞を使用した自己免疫疾患の治療方法
WO2018102761A1 (en) 2016-12-02 2018-06-07 City Of Hope Methods for manufacturing and expanding t cells expressing chimeric antigen receptors and other receptors
CN110291200B (zh) 2016-12-12 2024-05-14 西雅图儿童医院（Dba西雅图儿童研究所） 对哺乳动物细胞中转基因表达的药剂配体诱导具有增大的灵敏度的嵌合转录因子变异体
AU2017378153B2 (en) 2016-12-13 2024-03-28 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Methods of exogenous drug activation of chemical-induced signaling complexes expressed in engineered cells in vitro and in vivo
EP3336107A1 (en) 2016-12-15 2018-06-20 Miltenyi Biotec GmbH Immune cells expressing an antigen binding receptor and a chimeric costimulatory receptor
WO2018115146A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Danmarks Tekniske Universitet Antigen presenting scaffolds for immune-cell manipulation
US11649288B2 (en) 2017-02-07 2023-05-16 Seattle Children's Hospital Phospholipid ether (PLE) CAR T cell tumor targeting (CTCT) agents
US20200054676A1 (en) 2017-02-17 2020-02-20 Purdue Research Foundation Targeted Ligand-Payload Based Drug Delivery for Cell Therapy
CN110582288A (zh) * 2017-02-28 2019-12-17 恩多塞特公司 用于car t细胞疗法的组合物和方法
WO2018165194A1 (en) 2017-03-06 2018-09-13 University Of Washington Engineered cells and agent compositions for therapeutic agent delivery and treatments using same
US20200405881A1 (en) 2017-03-06 2020-12-31 University Of Washington Cell based methods and compositions for therapeutic agent delivery and treatments using same
AU2018235957B2 (en) 2017-03-16 2024-02-01 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Engraftable cell-based immunotherapy for long-term delivery of therapeutic proteins
CA3057452A1 (en) 2017-03-20 2018-09-27 City Of Hope Cs1 targeted chimeric antigen receptor-modified t cells for treatment of al amyloidosis
CA3063695A1 (en) 2017-05-17 2018-11-22 Seattle Children's Hospital (Dba Seattle Children's Research Institute Generating mammalian t cell activation inducible synthetic promoters (syn+pro) to improve t cell therapy
JP2020533960A (ja) 2017-08-01 2020-11-26 シティ・オブ・ホープＣｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ 抗ｉｌ１ｒａｐ抗体
US20200181264A1 (en) 2017-08-11 2020-06-11 City Of Hope Bispecific antigen-binding molecule
BR112020014913A2 (pt) 2018-01-22 2020-12-08 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Métodos para uso de células t car
US20200354477A1 (en) 2018-02-06 2020-11-12 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Fluorescein-specific cars exhibiting optimal t cell function against fl-ple labelled tumors
US20210346431A1 (en) 2018-02-23 2021-11-11 Endocyte, Inc. Sequencing method for car t cell therapy
JP2021520853A (ja) 2018-04-12 2021-08-26 ウモジャ バイオファーマ， インコーポレイテッド ウイルスベクター及びパッケージング細胞株
AU2019260687B2 (en) 2018-04-27 2022-09-22 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Rapamycin resistant cells
US20210317407A1 (en) 2018-08-06 2021-10-14 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Methods and compositions for stimulation of chimeric antigen receptor t cells with hapten labelled cells
CN112543651B (zh) 2018-08-07 2023-06-02 普渡研究基金会 使car t细胞恢复活力
US20220017920A1 (en) 2018-11-21 2022-01-20 Umoja Biopharma, Inc. Multicistronic vector for surface engineering lentiviral particles
CA3145290A1 (en) 2019-07-05 2021-01-14 Purdue Research Foundation Design and efficient synthesis of lipid-fluorescein conjugates for car-t cell therapy
WO2021055641A1 (en) 2019-09-17 2021-03-25 Purdue Research Foundation Fibroblast activation protein (fap)-targeted imaging and therapy of cancers and other fibrotic and inflammatory diseases
CA3154281A1 (en) 2019-10-16 2021-04-22 Andrew Scharenberg Retroviral vector for universal receptor therapy
KR20220144377A (ko) 2020-01-30 2022-10-26 우모자 바이오파마 인코포레이티드 이중특이적 형질도입 촉진제
CN115397440A (zh) 2020-02-04 2022-11-25 西雅图儿童医院（Dba西雅图儿童研究所） 用半抗原标记细胞刺激嵌合抗原受体t细胞的方法和组合物
JP2023513157A (ja) 2020-02-04 2023-03-30 シアトル チルドレンズ ホスピタル （ディービーエイ シアトル チルドレンズ リサーチ インスティテュート） 抗ジニトロフェノールキメラ抗原受容体
BR112022017815A2 (pt) 2020-03-06 2022-11-29 Purdue Research Foundation Métodos, compostos e composições para modificar a atividade de células car-t
WO2022015955A1 (en) 2020-07-16 2022-01-20 Umoja Biopharma, Inc. Gated adapter targeting receptor
CA3199588A1 (en) 2020-11-20 2022-05-27 Andrew Scharenberg Vector system for delivery of multiple polynucleotides and uses thereof
MX2023008831A (es) 2021-01-27 2023-10-19 Umoja Biopharma Inc Lentivirus para generar células que expresan receptores de antígeno quimérico anti-cd19.

Also Published As

Publication number Publication date
JP7417542B2 (ja) 2024-01-18
CN112292138A (zh) 2021-01-29
EP3743082A4 (en) 2021-11-03
CA3089319A1 (en) 2019-07-25
CN112055595A (zh) 2020-12-08
IL276131A (en) 2020-08-31
JP2021511826A (ja) 2021-05-13
US20190255109A1 (en) 2019-08-22
US11311576B2 (en) 2022-04-26
WO2019144091A1 (en) 2019-07-25
AU2019209428A1 (en) 2020-07-30
TW201940182A (zh) 2019-10-16
US20220257652A1 (en) 2022-08-18
EP3740217A1 (en) 2020-11-25
WO2019144095A1 (en) 2019-07-25
EP3743082A1 (en) 2020-12-02
CA3089051A1 (en) 2019-07-25
US11779602B2 (en) 2023-10-10
EP3740217A4 (en) 2021-11-10
US20190224237A1 (en) 2019-07-25
AU2019209432A1 (en) 2020-08-06
JP2021512147A (ja) 2021-05-13
US20240075069A1 (en) 2024-03-07
SG11202006886VA (en) 2020-08-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BR112020014913A2 (pt) Métodos para uso de células t car
JP7282521B2 (ja) Ｃａｒ ｔ細胞療法のための方法および組成物
US11759480B2 (en) Compositions and methods for CAR T cell therapy
US20210346431A1 (en) Sequencing method for car t cell therapy
CA3169152A1 (en) Methods, compounds, and compositions for modifying car-t cell activity
RU2792653C2 (ru) Способы и композиции для car-t-клеточной терапии
WO2024086563A1 (en) Therapeutic methods with target-linked small molecules and anti-target car t cells

Legal Events

Date Code Title Description
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]