ES2876176T3 - Receptores de células T anti-SSX-2 y materiales relacionados y métodos de uso - Google Patents

Receptores de células T anti-SSX-2 y materiales relacionados y métodos de uso Download PDF

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Abstract

Un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos con codones optimizados que codifica un receptor de células T (TCR) que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 13-18 y que tiene especificidad antigénica por el punto de ruptura X del sarcoma sinovial (SSX)-2 (SEQ ID NO: 1), donde el TCR también reconoce a SSX-3 (SEQ ID NO: 3).

Description

DESCRIPCIÓN
Receptores de células T anti-SSX-2 y materiales relacionados y métodos de uso
Remisión a una solicitud relacionada
La presente solicitud reivindica el derecho de prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos n.° 61/384.931, presentada el 21 de septiembre de 2010.
Antecedentes de la invención
La terapia celular adoptiva (ACT) implica la transferencia de células T reactivas a pacientes, incluyendo la transferencia de células T reactivas ante tumores a pacientes con cáncer. La terapia celular adoptiva ha tenido éxito en provocar la regresión de tumores en algunos cánceres, por ejemplo, el melanoma. Un obstáculo para la aplicación generalizada de la terapia celular adoptiva es la dificultad para generar células T humanas con potencial antitumoral. Otro obstáculo para la aplicación exitosa de la terapia celular adoptiva es que las células T que se transfieren también pueden ser tóxicas para los tejidos normales, es decir, tejidos no cancerosos. Por consiguiente, existe la necesidad de composiciones inmunológicas y métodos mejorados para tratar el cáncer.
Breve sumario de la invención
El objeto de la invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas. La invención proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos con codones optimizados que codifica un receptor de células T (TCR) que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 13-18 y que tiene especificidad antigénica por el punto de ruptura X del sarcoma sinovial (SSX)-2 (SEQ ID NO: 1), donde el TCR también reconoce a SSX-3 (SEQ ID NO: 3).
La invención proporciona además un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos con codones optimizados que codifica un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 13-18. La invención proporciona además un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos con codones optimizados que codifica una proteína que comprende: (a) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (b) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; o (c) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26.
La invención proporciona además un ácido nucleico aislado o purificado que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de los ácidos nucleicos proporcionados por la invención.
La invención proporciona además un ácido nucleico aislado o purificado que comprende una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de nucleótidos de los ácidos nucleicos proporcionados por la invención.
La invención proporciona además un vector de expresión recombinante que comprende un ácido nucleico proporcionado por la invención, opcionalmente donde el vector es un vector retroviral.
La invención proporciona además una célula hospedadora aislada que comprende el vector de expresión recombinante de la invención.
La invención proporciona además una población de células que comprenden al menos una célula hospedadora de la invención.
La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende (i) un ácido nucleico de la invención, el vector de expresión recombinante de la invención, la célula hospedadora de la invención o la población de células de la invención, y (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La invención proporciona además los ácidos nucleicos de la invención, el vector de expresión recombinante de la invención, la célula hospedadora de la invención, la población de células de la invención y la composición farmacéutica de la invención para su uso en un método para tratar o prevenir el cáncer en un hospedador.
La invención proporciona además el ácido nucleico, vector de expresión recombinante, célula hospedadora, población o composición farmacéutica para su uso en un método de tratamiento o prevención del cáncer en un hospedador, donde: (i) el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de cabeza y cuello, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, glioma, melanoma, cáncer renal, linfoma, cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de próstata, sarcoma sinovial, sarcoma osteogénico, leiomiosarcoma uterino y carcinoma hepatocelular; (ii) la célula hospedadora es una célula que es autóloga para el hospedador o las células de la población son células que son autólogas para el hospedador; y/o (iii) el método comprende además la administración de 5-aza-2'-desoxicitidina (DAC) al hospedador.
También se divulga un receptor de células T (TCR) aislado o purificado que tiene especificidad antigénica por el punto de ruptura X del sarcoma sinovial (SSX)-2 (SEQ ID NO: 1). El TCR puede comprender secuencias de aminoácidos especificadas como se describe en el presente documento. Por ejemplo, el TCR divulgado puede comprender la secuencia de aminoácidos de una cualquiera o más de las SEQ ID NO: 13-18, SEQ ID NO: 19 y 20, SEQ ID NO: 23 y 24 o SEQ ID NO: 25 y 26.
También se proporcionan y divulgan polipéptidos y proteínas relacionados, así como ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células hospedadoras y poblaciones de células asociados. También se divulgan anticuerpos o una porción de unión a antígeno de los mismos, y composiciones farmacéuticas relacionadas con los TCR de la divulgación.
También se divulgan métodos para detectar la presencia de cáncer en un hospedador y métodos para tratar o prevenir el cáncer en un hospedador. El método divulgado para detectar la presencia de cáncer en un hospedador comprende (i) poner en contacto una muestra que comprende células del cáncer con cualquiera de los TCR, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células hospedadoras, poblaciones de células hospedadoras, o anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos, de la invención, que se describen en el presente documento, de manera que formen un complejo, y (ii) detectar el complejo, donde la detección del complejo es un indicativo de la presencia de cáncer en el hospedador.
El documento WO 2005/010190 A1 divulga péptidos SSX-2 presentados por moléculas de1HLA de clase II.
Richman et al. "Display, engineering, and applications of antigen specific T cell receptors", Biomolecular Engineering, Elsevier, Nueva York, US, vol. 24, n.° 4, 16 de septiembre de 2007, páginas 361-373, divulga TCR de alta afinidad. Ayyoub Maha et al., "Proteasome-assisted identification of a SSX-2-derived epitope recognized by tumor- reactive CTL infiltrating metastatic melanoma", Journal of Immunology, American Association of Immunologists, US, vol. 168, n.° 4, 15 de febrero de 2002, páginas 1717-1722, divulga células T que comprenden TCR que reconocen péptidos derivados de SSX-2.
Ayyoub Maha et al., "Distinct but overlapping T helper epitopes in the 37-58 region of SSX-2", Clinical Immunology, Academic Press, US, vol. 114, n.° 1, 1 de enero de 2005, páginas 70-78, divulga epítopos de células T auxiliares en péptidos derivados de SSX-2.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1A es un diagrama de barras que muestra los niveles de interferón-Y (IFN-y) que se midieron después de que los leucocitos de sangre periférica (PBL) transducidos con SSX-2 TCR se cultivaran conjuntamente con células T2 de un donante humano, donde las células T2 se pulsaron con concentraciones variables del péptido SSX-2: 41-49 (KASEKIFYV) (SEQ ID NO: 2).
La Figura 1B es un diagrama de barras que muestra los niveles de IFN-y que se midieron, como en la Figura 1A, con la excepción de que las células T2 eran de un donante humano diferente.
La Figura 2 es un diagrama de barras que muestra los niveles de IFN-y que se midieron cuando los PBL transducidos con SSX-2 TCR se cultivaron conjuntamente con células 293-A2 y COS7-A2 que expresan el gen SSX-2 y células T2 pulsadas con el péptido SsX-2: 41-49.
La Figura 3 es un diagrama de barras que muestra los niveles de IFN-y resultantes que se midieron cuando los PBL transducidos con SSX-2 TCR (barras sombreadas) o los PBL no transducidos (UT) (barras sin sombrear) se cultivaron conjuntamente con varias líneas de células tumorales.
La Figura 4A es un diagrama de barras que muestra los niveles de IFN-y después de que los PBL de un donante humano, que se transdujeron con un SSX-2 TCR (barras sombreadas) o que no se transdujeron (UT) (barras sin sombrear), se cultivaran conjuntamente con varias células tumorales.
La Figura 4B es un diagrama de barras que muestra niveles de IFN-y, como en la Figura 4A, con la excepción de que los PBL eran de un donante humano diferente.
La Figura 5 es un diagrama lineal que muestra los resultados de los ensayos de cocultivo que se realizaron con los PBL transducidos con SSX-2 t Cr y células T2 que se pulsaron con péptidos. Los péptidos utilizados para la pulsación fueron: SSX-1 (KYSEKISYV, SEQ ID NO: 32) (-♦-); SSX-2 (KASEKIFYV, SEQ ID NO: 2) (■); SSX-3 (KVSEKIVYV, SEQ ID NO: 8) (▲); SSX-4 (KSSEKIVYV, SEQ ID NO: 9) (X); SSX-5 (KASEKIIYV, SEQ ID NO: 10) (*); SSX-6 (KFSEKISCV, SEQ ID NO: 33) (•); SSX-7 (KSLEKISYV, SEQ ID NO: 34) (|); SSX-8 KYSEKISYV, SEQ ID NO: 32) (-); SSX-9 (KSSEKIIYV, SEQ ID NO: 11) (—); y SSX-10 (KASEKILYV, SEQ ID NO: 12) (♦—). Las Figuras 6A y 6B son diagramas de barras que muestran la proliferación (en términos de recuentos de incorporación de [3H]-timidina por minuto (CPM)) de los PBL de un donante 1 (A) o donante 2 (B) que no se transdujeron (UT) o se transdujeron con SSX-2 TCR ("SSX-WT"), SSX-2 TCR con codones optimizados ("SSX-CO op") o una quimera humano-ratón SSX-2 TCR con codones optimizados ("SSX-MCR").
Las figuras 7A-D son diagramas que muestran el porcentaje de lisis de 938 mel (HLA-A2-/SSX-2+) (A), COS-A2 (B), 938-A2 mel (C), COS-A2-SSX-2 (D) cuando se cultivaron conjuntamente con PBL que no se transdujeron (I) o se transdujeron con SSX-2 TCR (■), SSX-2 TCR con codones optimizados (A), o una quimera de humanoratón con codones optimizados SSX-2 TCR (X) a las relaciones indicadas entre efector y diana (E:T).
Las Figuras 8A-D son diagramas lineales que muestran el porcentaje de lisis de 624 mel (A), 1300 mel (B), SK mel 37 (C) u 888 mel (D) cuando se cultivaron conjuntamente con PBL que no se transdujeron (I) o se transdujeron con SSX-2 TCR (•), SSX-2 TCR (A) con codones optimizados, o una quimera de humano-ratón SSX-2 TCR (X) con codones optimizados a las relaciones indicadas entre efector y diana (E:T).
Las Figuras 9A-9E son diagramas de barras que muestran la proliferación (en términos de recuentos de incorporación de [3H]-timidina por minuto (CPM)) de PBL que no se transdujeron o que se transdujeron con SSX-2 TCR ("SSX-TCR-Wt "), SsX-2 TCR con codones optimizados ("PBL-SSX-TCR-con codones optimizados"), o una quimera de ratón-humano SSX-2 TCR con codones optimizados ("PBL-SSX-2-TCR región constante de ratón").
La Figura 10 es un diagrama de barras que muestra los niveles de IFN-y medidos después de que los PBL transducidos con SSX-2 TCR ("SSX2-WT") (barras grises), SSX-2 TCR con codones optimizados "SSX2-Co Op") (barras sin sombrear), o una quimera de humano-ratón SSX-2 TCR con codones optimizados "SSX2-MCR") (barras negras) se cultivaran conjuntamente con células T2 de un donante humano, donde las células T2 se pulsaron con concentraciones variables del péptido SSX-2: 41-49.
La Figura 11 es un diagrama de barras que muestra los niveles de IFN-y después de los PBL de un donante humano, que se transdujeron con un SSX-2 TCR (barras sin sombrear) o que no se transdujeron (UT) (barras sombreadas), se cultivaran conjuntamente con varias células de melanoma primario.
La Figura 12 es un diagrama de barras que muestra los niveles de IFN-y después de que los PBL de un donante humano que se transdujeron con un SSX-2 TCR se cultivaran conjuntamente con células mel 1300 en ausencia (barras grises) o en presencia (0,1 pM (barras sin sombrear)) o 1,0 pM (barras negras)) del agente desmetilante, 5-aza-2'-desoxicitidina (DAC). NM es un medio normal sin control por medicamentos.
Descripción detallada de la invención
El objeto de la invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas. La invención proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos con codones optimizados que codifica un receptor de células T (TCR) que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 13-18 y que tiene especificidad antigénica por el punto de ruptura X del sarcoma sinovial (SSX)-2 (SEQ ID NO: 1), donde el TCR también reconoce a SSX-3 (SEQ ID NO: 3).
La invención proporciona además un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos con codones optimizados que codifica un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 13-18. La invención proporciona además un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos con codones optimizados que codifica una proteína que comprende: (a) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (b) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; o (c) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26.
La invención proporciona además un ácido nucleico aislado o purificado que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de los ácidos nucleicos proporcionados por la invención.
La invención proporciona además un ácido nucleico aislado o purificado que comprende una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de nucleótidos de los ácidos nucleicos proporcionados por la invención.
La invención proporciona además un vector de expresión recombinante que comprende un ácido nucleico proporcionado por la invención, opcionalmente donde el vector es un vector retroviral.
La invención proporciona además una célula hospedadora aislada que comprende el vector de expresión recombinante de la invención.
La invención proporciona además una población de células que comprenden al menos una célula hospedadora de la invención.
La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende (i) un ácido nucleico de la invención, el vector de expresión recombinante de la invención, la célula hospedadora de la invención o la población de células de la invención, y (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La invención proporciona además los ácidos nucleicos de la invención, el vector de expresión recombinante de la invención, la célula hospedadora de la invención, la población de células de la invención y la composición farmacéutica de la invención para su uso en un método para tratar o prevenir el cáncer en un hospedador.
La invención proporciona además el ácido nucleico, vector de expresión recombinante, célula hospedadora, población o composición farmacéutica para su uso en un método de tratamiento o prevención del cáncer en un hospedador, donde: (i) el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de cabeza y cuello, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, glioma, melanoma, cáncer renal, linfoma, cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de próstata, sarcoma sinovial, sarcoma osteogénico, leiomiosarcoma uterino y carcinoma hepatocelular; (ii) la célula hospedadora es una célula que es autóloga para el hospedador o las células de la población son células que son autólogas para el hospedador; y/o (iii) el método comprende además la administración de 5-aza-2'-desoxicitidina (DAC) al hospedador.
También se divulga un receptor de células T (TCR) aislado o purificado que tiene especificidad antigénica por el punto de ruptura X del sarcoma sinovial (SSX)-2 (también conocido como HOM-MEL-40). SSX-2 es un miembro de la familia SSX de diez proteínas nucleares altamente homólogas que también incluye a SSX-1, SSX-3, SSX-4, SSX-5, SSX-6, SSX-7, SSX-8, SSX-9 y SSX-10. Las proteínas SSX son antígenos de cáncer de testículo (CTA), que se expresan solo en células tumorales y células germinales de testículo que no expresan MHC. SSX-2 se expresa en una variedad de cánceres humanos que incluyen, pero no se limitan a, melanomas, cánceres de cabeza, cánceres de cuello, linfomas, mieloma múltiple, cáncer pancreático, cáncer de próstata, sarcomas, carcinomas de colon y hepatocelular. La proteína SSX-2 puede comprender, consistir o consistir esencialmente en, SEQ ID NO: 1.
La frase "especificidad antigénica" como se usa en el presente documento significa que el TCR puede unirse de forma específica y reconocer de forma inmunológica al SSX-2 con alta afinidad. Por ejemplo, se puede considerar que un TCR tiene una "especificidad antigénica" para el SSX-2 si las células T que expresan el TCR secretan al menos aproximadamente 200 pg/ml o más (por ejemplo, 200 pg/ml o más, 300 pg/ml o más, 400 pg/ml o más, 500 pg/ml o más, 600 pg/ml o más, 700 pg/ml o más) de IFN-y al cultivarse conjuntamente con una baja concentración de SSX-2 limitado por HLA-A2 (por ejemplo, aproximadamente 0,01 ng/ml a aproximadamente 1 ng/ml, 0,01 ng/ml, 0,1 ng/ml, o 1 ng/ml). Los TCR de la invención también pueden secretar IFN-y al cultivarse conjuntamente con concentraciones más altas de SSX-2.
La divulgación incluye un receptor de células T (TCR) aislado o purificado que tiene reactividad antigénica con respecto al punto de ruptura X del sarcoma sinovial (SSX)-2 o SSX-2 y uno o más de SSX-3, SSX-4, SSX-5, SSX-9 y SSX-10.
El TCR puede tener especificidad antigénica por cualquier proteína, polipéptido o péptido SSX-2. El TCR tiene especificidad antigénica por una proteína SSX-2 que comprende, que consiste en, o consiste esencialmente en, la SEQ ID NO: 1. Preferentemente, el TCR tiene especificidad antigénica por un péptido SSX-2 que comprende, que consiste en, o consiste esencialmente en, KASEKIFYV (SEQ ID NO: 2).
Si bien los TCR tienen especificidad antigénica por SSX-2, los TCR también pueden reconocer uno o más de SSX-3, SSX-4, SSX-5, SSX-9 y SSX-10. Es decir, los TCR pueden unirse y reconocer de forma inmunológica a uno cualquiera o más de un SSX-3, SSX-4, SSX-5, SSX-9 y SSX-10, pero con una afinidad menor que la que se observó para la unión a SSX-2, de modo que la unión del TCR a una de estas proteínas provoca una respuesta inmunitaria a una concentración más alta de cualquiera de estas proteínas que la que es necesaria para provocar una respuesta inmunitaria con SSX-2. Por ejemplo, se puede considerar que el TCR reconoce una cualquiera o más de SSX-3, SSX-4, SSX-5, SSX-9 y SSX-10 con baja afinidad si las células T que expresan el TCR no secretan al menos aproximadamente 200 pg/ml (por ejemplo, secretan menos de 200 pg/ml, menos de 100 pg/ml) de IFN-y al cultivarse conjuntamente con una concentración baja de uno cualquiera o más de SSX-3, SSX-4, SSX-5, SSX-9 y SSX-10 (por ejemplo, aproximadamente 0,01 ng/ml a aproximadamente 1 ng/ml, 0,01 ng/ml, 0,1 ng/ml o 1 ng/ml) pero secretan al menos aproximadamente 200 pg/ml o más (por ejemplo, 200 pg/ml o más, 300 pg/ml o más, 400 pg/ml o más, 500 pg/ml o más, 600 pg/ml o más, 700 pg/ml o más) al cultivarse conjuntamente con una mayor concentración de uno cualquiera o más de SSX-3, SSX-4, SSX-5, SSX-9 y SSX-10 (por ejemplo, aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml, 10 ng/ml, 50 ng/ml o 100 ng/ml).
El TCR puede reconocer una proteína, polipéptido o péptido SSX-3, SSX-4, SSX-5, SSX-9 y/o SSX-10. En una realización de la divulgación, el TCR reconoce una proteína que comprende, que consiste en, o que consiste esencialmente en, SEQ ID NO: 3 (SSX-3), SEQ ID NO: 4 (SSX-4), SEQ ID NO: 5 (SSX-5), SEQ ID NO: 6 (SSX-9), y/o SEQ ID NO: 7 (SSX-10). Preferentemente, el TCR reconoce un péptido que comprende, consiste en, o consiste esencialmente en, el péptido SSX-3 KVSEKIVYV (SEQ ID NO: 8), péptido SSX-4 KSSEKIIYV (SEQ ID NO: 9), péptido SSX-5 KASEKIIYV (SEQ ID NO: 10), péptido SSX-9 KSSEKIIYV (SEQ ID NO: 11) y/o péptido SSX-10 KASEKILYV (SEQ ID NO: 12).
Los TCR son capaces de reconocer a SSX-2, SSX-3, SSX-4, SSX-5, SSX-9 y/o SSX-10 (en adelante, "antígenos de cáncer SSX") de una manera dependiente de HLA-A2. Por "modo HLA-A2-dependiente" como se usa en el presente documento, se entiende que el TCR provoca una respuesta inmunitaria al unirse a un antígeno de cáncer SSX dentro del contexto de una molécula de HLA-A2.
Además, sin estar vinculados a ninguna teoría concreta, los TCR son capaces de reconocer un antígeno de cáncer SSX de una manera independiente de CD8 y/o CD4. Por "manera independiente de CD8 y / o CD4" se entiende que los TCR pueden provocar una respuesta inmunitaria al unirse a un antígeno de cáncer SSX, en ausencia de una molécula CD8 o CD4, o de ambas moléculas CD8 y CD4, que se expresan en la célula que expresa el TCR o en ausencia de una molécula funcional de CD8 o CD4, o ambas. A diferencia de los TCR tradicionales, los TCR de la invención no tienen una preferencia por CD8 o CD4 y pueden funcionar en el contexto de una molécula de CD8 o de CD4.
Los TCR de la divulgación proporcionan muchas ventajas, incluso cuando se usan para la transferencia de células adoptivas. Por ejemplo, sin estar vinculado a una teoría concreta, se cree que debido a que SSX-2, SSX-3, SSX-4, SSX-5, SSX -9, y/o SSX-10 se expresan en células de múltiples tipos de cáncer, los TCR de la invención proporcionan de forma ventajosa la capacidad de destruir células de múltiples tipos de cáncer y, por consiguiente, tratar o prevenir múltiples tipos de cáncer. De forma adicional, sin estar vinculado a una teoría concreta, se cree que debido a que las proteínas SSX son antígenos de cáncer de testículo que se expresan solo en células tumorales y células germinales de testículo que no expresan MHC, los TCR abordan de forma ventajosa la destrucción de células cancerosas mientras minimizan o eliminan la destrucción de células normales, no cancerosas, por ende reduciendo, por ejemplo, minimizando o eliminando, la toxicidad. Asimismo, si bien los TCR de la invención tienen especificidad antigénica por SSX-2, los TCR también reconocen favorablemente uno o más de SSX-3, SSX-4, SSX-5, SSX-9 y SSX-10. Sin estar vinculado a una teoría concreta, se cree que la capacidad de reconocer múltiples antígenos de cáncer aumenta de forma favorable el número de células cancerosas que pueden ser destruidas por los TCR de la invención. Además, si un antígeno SSX se muta, los TCR pueden ser aún viables ya que reconocen más de un solo antígeno.
También se divulga un TCR que comprende dos polipéptidos (es decir, cadenas polipeptídicas), tales como una cadena a de un TCR, una cadena p de un TCR, una cadena y de un TCR, una cadena 8 de un TCR, o una combinación de las mismas. Tales cadenas polipeptídicas de los TCR se conocen en la técnica. Los polipéptidos de los TCR pueden comprender cualquier secuencia siempre que el TCR tenga especificidad antigénica por SSX-2 y/o reconozca uno o más de SSX-3, SSX-4 SSX-5, SSX-9 y SsX-10.
El TCR comprende dos cadenas polipeptídicas, comprendiendo cada una una región variable que comprende una región determinante de complementariedad (CDR) 1, una CDR2 y una CDR3 de un TCR. Preferentemente, la primera cadena polipeptídica comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13 (CDR1 de la cadena a), una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 (CDR2 de la cadena a ) y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15 (CDR3 de la cadena a ), y la segunda cadena polipeptídica comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16 (CDR1 de la cadena p), una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17 (CDR2 de la cadena p), y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18 (CDR3 de la cadena p). A este respecto, el TCR puede comprender las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en una o más de las sEq ID NO: 13-15, 16-18 y 13-18. Preferentemente, el TCR comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 13-18.
De forma adicional o alternativa, el TCR puede comprender una secuencia de aminoácidos de una región variable de un TCR que comprende las CDR expuestas anteriormente. A este respecto, el TCR puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 (la región variable de una cadena a) o 20 (la región variable de una cadena p), ambas SEQ ID NO: 19 y 20, la SEQ ID NO: 35 (una porción de la región variable de una cadena a) o 36 (una porción de la región variable de una cadena p), o ambas SEQ ID NO: 35 y 36. Preferentemente, el TCR comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 19 y 20.
De forma adicional o alternativa, el TCR puede comprender una cadena a de un TCR y una cadena p de un TCR. Cada cadena a y cadena p del TCR de la invención puede comprender independientemente cualquier secuencia de aminoácidos. Preferentemente, la cadena a comprende la región variable de una cadena a como se expuso anteriormente. A este respecto, el TCR de la invención puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23. Un TCR de este tipo puede emparejarse con cualquier cadena p de un TCR. Preferentemente, la cadena p del TCR comprende la región variable de una cadena de p como se expuso anteriormente. A este respecto, el TCR de la invención puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24. El TCR de la invención, por lo tanto, puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 o 24, o ambas SEQ ID NO: 23 y 24. Preferentemente, el TCR comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 23 y 24.
El TCR puede comprender un TCR quimérico humano/ratón. A este respecto, el TCR puede comprender una región constante de ratón que comprende la SEQ ID NO: 21 (región constante de ratón de una cadena a), SEQ ID NO: 22 (región constante de ratón de cadena p), o ambas SEQ ID NO: 21 y 22. Preferentemente, el TCR comprende ambas SEQ ID NO: 21 y 22.
De forma adicional o alternativa, el TCR quimérico humano/ratón de la invención puede comprender cualquiera de las CDR expuestas anteriormente. A este respecto, el TCR quimérico humano/ratón puede comprender las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 13-15, 16-18 y 13-18. Preferentemente, el TCR quimérico humano/ratón comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 13­ 18.
De forma adicional o alternativa, el TCR quimérico humano/ratón puede comprender cualquiera de las regiones variables expuestas anteriormente. A este respecto, el TCR quimérico humano/ratón puede comprender la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19 (la región variable de una cadena a) o 20 (la región variable de una cadena p), ambas SEQ ID NO: 19 y 20, la SEQ ID NO: 35 (una porción de la región variable de una cadena a) o 36 (una porción de la región variable de una cadena p), o ambas SEQ ID NO: 35 y 36. Preferentemente, el TCR comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 19 y 20.
De forma adicional o alternativa, el TCR quimérico humano/ratón puede comprender una cadena a de un TCR y una cadena p de un TCR. Cada cadena a y cadena p del TCR quimérico humano/ratón puede comprender independientemente cualquier secuencia de aminoácidos. Preferentemente, la cadena a comprende la región variable de una cadena a como se expuso anteriormente. A este respecto, el TCR quimérico humano/ratón puede comprender la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25. Un TCR quimérico humano/ratón de este tipo puede emparejarse con cualquier cadena p de un TCR. La cadena p del TCR quimérico humano/ratón comprende preferentemente la región variable de una cadena p como se expuso anteriormente. A este respecto, el TCR quimérico humano/ratón puede comprender la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 26. El TCR quimérico humano/ratón, por lo tanto, puede comprender la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25 o 26, o ambas SEQ ID NO: 25 y 26. Preferentemente, el TCR comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 25 y 26.
También se divulga un polipéptido aislado o purificado que comprende una porción funcional de cualquiera de los TCR descritos en el presente documento. La expresión "polipéptido", como se usa en el presente documento, incluye oligopéptidos y se refiere a una sola cadena de aminoácidos unida por uno o más enlaces peptídicos.
Con respecto a los polipéptidos, la porción funcional puede ser cualquier porción que comprenda aminoácidos contiguos del TCR del que forman parte, siempre que la porción funcional se una específicamente a SSX-2 y/o reconozca uno cualquiera o más de un SSX-3, SSX-4, SSX-5, SSX-9 y SSX-10. La expresión "porción funcional" cuando se usa en referencia a un TCR se refiere a cualquier parte o fragmento del TCR de la invención, conservando dicha parte o fragmento la actividad biológica del TCR del que forma parte (el TCR parental). Las porciones funcionales abarcan, por ejemplo, aquellas partes de un TCR que conservan la capacidad de unirse de forma específica al SSX-2 y/o reconocer uno o más de un SSX-3, SSX-4, SSX-5, SSX-9 y SSX-10 (por ejemplo, de una manera dependiente de HLA-A2), o detectar, tratar o prevenir el cáncer, en una medida similar, en la misma medida o, en mayor medida que el TCR parental. En referencia al TCR parental, la porción funcional puede comprender, por ejemplo, aproximadamente el 10%, 25%, 30%, 50%, 68%, 80%, 90%, 95%, o más, del TCR parental.
La porción funcional puede comprender aminoácidos adicionales en el extremo amino o carboxilo de la porción, o en ambos extremos, sin que dichos aminoácidos adicionales se encuentren en la secuencia de aminoácidos del TCR parental. De forma deseable, los aminoácidos adicionales no interfieren con la función biológica de la porción funcional, por ejemplo, unirse de forma específica a SSX-2; reconocer uno o más de un SSX-3, SSX-4, SSX-5, SSX-9 y SSX-10; tener la capacidad de detectar, tratar o prevenir el cáncer, etc. De forma más deseable, los aminoácidos adicionales mejoran la actividad biológica, en comparación con la actividad biológica del TCR parental.
El polipéptido puede comprender una porción funcional de una o ambas cadenas a y p de los TCR de la invención, tal como una porción funcional que comprende una o más de las CDR1, CDR2 y CDR3 de la(s) región (regiones) variable(s) de la cadena a y/o cadena p de un TCR de la invención. A este respecto, el polipéptido puede comprender una porción funcional que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13 (CDR1 de la cadena a), 14 (CDR2 de la cadena a), 15 (CDR3 de la cadena a), 16 (CDR1 de la cadena p), 17 (CDR2 de la cadena p), 18 (CDR3 de la cadena p), o una combinación de las mismas. El polipéptido, comprende preferentemente una porción funcional que comprende las SEQ ID NO: 13-15, 16-18, o todas las SEQ ID NO: 13-18. Más preferentemente, el polipéptido comprende una porción funcional que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 13-18.
De forma adicional o alternativa, el polipéptido puede comprender, por ejemplo, la región variable del TCR que comprende una combinación de las regiones CDR expuestas anteriormente. A este respecto, el polipéptido puede comprender la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19 (la región variable de una cadena a), 20 (la región variable de una cadena p), ambas SEQ ID NO: 19 y 20, la SEQ ID NO: 35 (una porción de la región variable de una cadena a ) o 36 (una porción de la región variable de la cadena p), o ambas SEQ ID NO: 35 y 36. Preferentemente, el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, o las secuencias de aminoácidos de ambas SEQ ID NO: 19 y 20.
De forma alternativa o adicional, el polipéptido puede comprender la longitud total de una cadena a o p de uno de los TCR descritos en el presente documento. A este respecto, el polipéptido puede comprender una secuencia de aminoácidos de las sEq ID NO: 23, 24, 25, o 26. De forma alternativa, el polipéptido puede comprender las cadenas a y p de los TCR descritos en el presente documento. Por ejemplo, el polipéptido de la invención puede comprender las secuencias de aminoácidos de ambas SEQ ID NO: 23 y 24 o las secuencias de ambas SEQ ID NO: 25 y 26.
Además, se divulga una proteína aislada o purificada que comprende al menos uno de los polipéptidos que se describen en el presente documento. Por "proteína" se entiende una molécula que comprende una o más cadenas polipeptídicas.
La proteína puede comprender una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19 o 35 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20 o 36. La proteína puede, por ejemplo, comprender una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23 o 25 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 24 o 26. En este caso, la proteína puede ser un TCR. De forma alternativa, si, por ejemplo, la proteína comprende una sola cadena polipeptídica que comprende la SEQ ID NO: 23 o 25 y la SEQ Id NO: 24 o 26, o si la primera y/o la segunda cadena(s) polipeptídica(s) de la proteína además comprende o comprenden además otras secuencias de aminoácidos, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que codifica una inmunoglobulina o una porción de la misma, entonces la proteína puede ser una proteína de fusión. A este respecto, se divulga además una proteína de fusión que comprende al menos uno de los polipéptidos que se describen en el presente documento junto con al menos otro polipéptido. El otro polipéptido puede existir como un polipéptido separado de la proteína de fusión, o puede existir como un polipéptido, que se exprese en marco (en tándem) con uno de los polipéptidos descritos en el presente documento. El otro polipéptido puede codificar cualquier molécula peptídica o proteica, o una porción de la misma, que incluye, pero no se limita a una inmunoglobulina, CD3, CD4, CD8, una molécula de MHC, una molécula de CD1, por ejemplo, CD1a, CD1b, CD1c, CD1d, etc.
La proteína de fusión puede comprender una o más copias del polipéptido y/o una o más copias del otro polipéptido. Por ejemplo, la proteína de fusión puede comprender 1, 2, 3, 4, 5 o más copias del polipéptido y/o del otro polipéptido. En la técnica se conocen métodos adecuados para hacer proteínas de fusión, e incluyen, por ejemplo, métodos recombinantes. Véase, por ejemplo, Choi et al., Mol. Biotechnol. 31: 193-202 (2005).
En algunas divulgaciones, los TCR, polipéptidos y proteínas pueden expresarse como una proteína única que comprende un péptido de unión que une la cadena a y la cadena p. A este respecto, los TCR, polipéptidos y proteínas de la divulgación pueden comprender un péptido de unión adicional comprendiendo dicho péptido una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 37. En una divulgación, el péptido de unión puede codificarse por una secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID NO: 38. El péptido de unión puede facilitar de forma ventajosa la expresión de un TCR recombinante, polipéptido y/o proteína en una célula hospedadora. El péptido de unión puede escindirse tras la expresión del constructo que incluye el péptido de unión en una célula hospedadora, dando como resultado cadenas a y p separadas.
La proteína puede ser un anticuerpo recombinante que comprenda al menos uno de los polipéptidos de la invención descritos en el presente documento. Como se usa en el presente documento, "anticuerpo recombinante" se refiere a una proteína recombinante (por ejemplo, modificada mediante ingeniería genética) que comprende al menos uno de los polipéptidos divulgados en el presente documento y una cadena polipeptídica de un anticuerpo, o una porción de la misma. El polipéptido de un anticuerpo, o una porción del mismo, puede ser una cadena pesada, una cadena ligera, una región variable o constante de una cadena pesada o ligera, un fragmento variable de cadena única (scFv), o un fragmento Fc, Fab o F(ab)2 ' de un anticuerpo, etc. La cadena polipeptídica de un anticuerpo, o una porción de la mismo, puede existir como un polipéptido separado del anticuerpo recombinante. La cadena polipeptídica de un anticuerpo, o porción del mismo, puede existir de forma alternativa como un polipéptido, que se expresa en marco (en tándem) con el polipéptido. El polipéptido de un anticuerpo, o una porción del mismo, puede ser un polipéptido de cualquier anticuerpo o de cualquier fragmento de anticuerpo, incluyendo cualquiera de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que se describen en el presente documento.
En el ámbito de la divulgación se incluyen variantes funcionales de los TCR, polipéptidos y proteínas descritos en el presente documento. La expresión "variante funcional", como se usa en el presente documento, se refiere a un TCR, polipéptido o proteína que tiene una identidad o similitud de secuencia sustancial o significativa con un TCR, polipéptido o proteína primaria, reteniendo dicha variante funcional la actividad biológica del TCR, polipéptido o proteína de la que es una variante. Las variantes funcionales abarcan, por ejemplo, aquellas variantes del TCR, polipéptido o proteína descritas en el presente documento (el TCR, polipéptido o proteína parental) que conservan la capacidad de unirse de forma específica a SSX-2 para el cual el TCR parental tiene especificidad antigénica o al cual el polipéptido o proteína parental se une de forma específica, en un grado similar, en el mismo grado, o en un grado mayor, que el TCR parental, polipéptido, o proteína. Las variantes funcionales también pueden abarcar de forma alternativa o de forma adicional, por ejemplo, aquellas variantes del TCR, polipéptido o proteína descritas en el presente documento (el TCR, polipéptido o proteína parental) que conservan la capacidad de reconocer uno cualquiera o más de un SSX-3, SSX-4, SSX-5, SSX-9 y SSX-10, las cuales el polipéptido o proteína primaria reconoce, en un grado similar, en el mismo grado, o en mayor grado, que el TCR, el polipéptido o la proteína parentales. En referencia al TCR, polipéptido o proteína parental, la variante funcional puede ser, por ejemplo, al menos aproximadamente 30%, 50%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntico en la secuencia de aminoácidos en comparación con el TCR, polipéptido o proteína parental.
La variante funcional puede comprender, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos del TCR, polipéptido o proteína parental con al menos una sustitución conservativa de aminoácidos. Las sustituciones conservativas de aminoácidos se conocen en la técnica e incluyen sustituciones de aminoácidos en las que un aminoácido que tiene ciertas propiedades físicas y/o químicas se intercambia por otro aminoácido que tiene las mismas propiedades químicas o físicas. Por ejemplo, la sustitución de aminoácidos conservativa puede ser de un aminoácido ácido que se sustituye por otro aminoácido ácido (por ejemplo, Asp o Glu), de un aminoácido con una cadena lateral no polar que se sustituye por otro aminoácido con una cadena lateral no polar (por ejemplo, Ala, Gly, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val, etc.), un aminoácido básico que se sustituye por otro aminoácido básico (Lys, Arg, etc.), un aminoácido con una cadena lateral polar que se sustituye por otro aminoácido con una cadena lateral polar (Asn, Cys, Gln, Ser, Thr, Tyr, etc.), etc.
De forma alternativa o de forma adicional, las variantes funcionales pueden comprender la secuencia de aminoácidos del TCR, polipéptido o proteína parental con al menos una sustitución de aminoácido no conservativa. En este caso, se prefiere que la sustitución de aminoácidos no conservativa no interfiera o inhiba la actividad biológica de la variante funcional. Preferentemente, la sustitución de aminoácidos no conservativa aumenta la actividad biológica de la variante funcional, de modo que la actividad biológica de la variante funcional aumenta en comparación con el TCR, polipéptido o proteína parental.
El TCR, polipéptido o proteína puede consistir fundamentalmente en la secuencia o secuencias de aminoácidos específicas que se describen en el presente documento, de modo que otros componentes de la variante funcional, por ejemplo, otros aminoácidos, no cambien materialmente la actividad biológica de la variante funcional. A este respecto, por ejemplo, el TCR, polipéptido o proteína pueden consistir fundamentalmente en la secuencia de aminoácidos de la SeQ ID NO: 23, 24, 25, 26, ambas SEQ ID NO: 23 y 24 o ambas SEQ ID NO: 25 y 26. Además, por ejemplo, los TCR, polipéptidos o proteínas pueden consistir fundamentalmente en la(s) secuencia(s) de aminoácidos de las SEQ ID nO: 19, 20, 21, 22, 35, 36, ambas SEQ ID NO: 19 y 20, ambas SEQ ID NO: 21 y 22 o ambas SEQ ID NO: 35 y 36. Asimismo, los TCR, polipéptidos o proteínas pueden consistir fundamentalmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13 (CDR1 de cadena a), 14 (CDR2 de cadena a), 15 (CDR3 de cadena a), 16 (CDR1 de la cadena p), 17 (CDR2 de la cadena p), 18 (CDR3 de la cadena p) o cualquier combinación de las mismas, por ejemplo, SEQ ID NO: 13-15, 16-18 o 13-18.
Los TCR, polipéptidos y proteínas (que incluyen porciones funcionales y variantes funcionales) pueden ser de cualquier longitud, es decir, pueden comprender cualquier número de aminoácidos, siempre que los TCR, polipéptidos o proteínas (o porciones funcionales o variantes funcionales de los mismos) conserven su actividad biológica, por ejemplo, la capacidad de unirse específicamente a SSX-2; reconocer uno cualquiera o más de SSX-3, SSX-4, sSX-5, sSX-9 y SSX-10; detectar el cáncer en un hospedador; o tratar o prevenir el cáncer en un hospedador, etc. Por ejemplo, el polipéptido puede tener una longitud de 50 a 5000 aminoácidos, tal como 50, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o más aminoácidos de longitud. En este sentido, los polipéptidos de la invención también incluyen oligopéptidos.
Los TCR, polipéptidos y proteínas de la divulgación (incluyendo las porciones funcionales y las variantes funcionales) pueden comprender aminoácidos sintéticos en lugar de uno o más aminoácidos producidos de forma natural. Dichos aminoácidos sintéticos se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, ácido aminociclohexano carboxílico, norleucina, ácido a-amino n-decanoico, homoserina, S-acetilaminometil-cisteína, trans-3- y trans-4-hidroxiprolina, 4-aminofenilalanina, 4-nitrofenilalanina, 4-chlorofenilalanina, 4-carboxifenilalanina, p-fenilserina phidroxifenilalanina, fenilglicina, a-naftilalanina ciclohexilalanina, ciclohexilglicina, ácido indolino-2-carboxílico, ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolino-3-carboxílico, ácido aminomalónico, monoamida de ácido aminomalónico, N'-bencil-N'-metil-lisina, N', N'-dibencil-lisina, 6-hidroxilisina, ornitina, ácido carboxílico a-aminociclopentano, ácido carboxílico aaminociclohexano, ácido carboxílico a-aminocicloheptano, ácido carboxílico a-(2-amino-2-norbornano), ácido a,Y-diaminobutírico, ácido a,p-diaminopropiónico, homofenilalanina, y a-terc-butilglicina.
Los TCR, polipéptidos y proteínas (incluidas las porciones funcionales y las variantes funcionales) pueden glicosilarse, amidarse, carboxilarse, fosforilarse, esterificarse, N-acilarse, ciclarse mediante, por ejemplo, un puente disulfuro, o convertirse en una sal de adición de ácidos y/o de manera opcional, formar un conjugado, o polimerizarse, o formar un dímero.
Cuando los TCR, polipéptidos y proteínas (incluidas las porciones funcionales y las variantes funcionales) están en forma de sal, dichos polipéptidos están preferentemente, en forma de una sal aceptable a nivel farmacéutico. Las sales de adición de ácidos adecuadas aceptables a nivel farmacéutico incluyen aquellas derivadas de ácidos minerales, tales como los ácidos clorhídrico, bromhídrico, fosfórico, metafosfórico, nítrico y sulfúrico, y ácidos orgánicos como el tartárico, acético, cítrico, málico, láctico, fumárico, benzoico, glicólico, ácidos glucónico, succínico y ácidos arilsulfónicos, por ejemplo, ácido p-toluenosulfónico.
El TCR, polipéptido y/o proteína de la divulgación (incluidas las porciones funcionales y variantes funcionales de los mismos) se pueden obtener por métodos que se conocen en la técnica. Los métodos adecuados de síntesis de novo de polipéptidos y proteínas se describen en referencias, tales como Chan et al., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis. Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2005; Peptide and Protein Drug Analvsis. ed. Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000; Epitope Mapping, ed. Westwood et al., Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2000; y en la Patente de los Estados Unidos n.° 5.449.752. Los polipéptidos y las proteínas también pueden producirse de forma recombinante utilizando los ácidos nucleicos descritos en el presente documento utilizando métodos de recombinación estándar. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2001; y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994. Además, algunos de los TCR, polipéptidos y proteínas (incluidas las porciones funcionales y variantes funcionales de los mismos) pueden aislarse y/o purificarse a partir de una fuente, como una planta, una bacteria, un insecto, un mamífero, por ejemplo, una rata, un humano, etc. Los métodos de aislamiento y purificación se conocen bien en la técnica. De forma alternativa, los TCR, polipéptidos y/o proteínas que se describen en el presente documento (incluidas las porciones funcionales y sus variantes funcionales) pueden sintetizarse de forma comercial por compañías como Synpep (Dublin, CA), Peptide Technologies Corp. (Gaithersburg, MD) y Multiple Peptide Systems (San Diego, CA). A este respecto, los TCR, polipéptidos y proteínas pueden ser sintéticos, recombinantes, aislados y/o purificados.
En el ámbito de la divulgación se incluyen conjugados, por ejemplo, bioconjugados, que comprenden cualquiera de los TCR, polipéptidos o proteínas de la invención (incluidas cualquiera de las porciones funcionales o variantes de los mismos), ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células hospedadoras, poblaciones de células hospedadoras o anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos. Los conjugados, así como los métodos para sintetizar conjugados en general, se conocen en la técnica (Véase, por ejemplo, Hudecz, F., Methods Mol. Biol.
298: 209-223 (2005) y Kirin et al., Inorg Chem. 44(15): 5405-5415 (2005)). El objeto de la invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas.
La invención proporciona además un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de los TCR, polipéptidos o proteínas descritas en el presente documento (incluidas las porciones funcionales y variantes funcionales de las mismas).
"Ácido nucleico", como se usa en el presente documento, incluye "polinucleótido", "oligonucleótido" y "molécula de ácido nucleico", y generalmente significa un polímero de ADN o ARN, que puede ser monocatenario o bicatenario, sintetizado u obtenido (por ejemplo, aislado y/o purificado) a partir de fuentes naturales, que pueden contener nucleótidos naturales, no naturales o modificados, y que pueden contener un enlace entre nucleótidos natural, no natural o modificado, tal como un enlace fosforoamidato o un enlace fosforotioato, en vez del enlace fosfodiéster que se encuentra entre los nucleótidos de un oligonucleótido no modificado. Generalmente se prefiere que el ácido nucleico no contenga ninguna inserción, deleción, inversión y/o sustitución. No obstante, en algunas circunstancias puede aceptarse que el ácido nucleico contenga una o más inserciones, deleciones, inversiones y/o sustituciones, como se discute en el presente documento.
Preferentemente, los ácidos nucleicos de la invención son recombinantes. Como se usa en el presente documento, la expresión "recombinante" se refiere a (i) moléculas que se construyen fuera de las células vivas mediante la unión de segmentos de ácido nucleico naturales o sintéticos a moléculas de ácido nucleico que pueden replicarse en una célula viva, o (ii) moléculas que resultan de la replicación de las descritas anteriormente en (i). Para los fines del presente documento, la replicación puede ser replicación in vitro replicación in vivo.
Los ácidos nucleicos se pueden construir basándose en la síntesis química y/o reacciones de ligación enzimática utilizando procedimientos que se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., supra. y Ausubel et al, supra. Por ejemplo, un ácido nucleico puede sintetizarse de forma química utilizando nucleótidos que se sintetizan de forma natural o nucleótidos que se modifican de diversas maneras diseñados para incrementar la estabilidad biológica de las moléculas o para incrementar la estabilidad física del dúplex que se forma en la hibridación (por ejemplo, derivados del fosforotioato y nucleótidos con sustituciones producidas por acridina). Los ejemplos de nucleótidos modificados que pueden utilizarse para generar los ácidos nucleicos incluyen, pero no se limitan al, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil) uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina sustituida, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo y 2,6-diaminopurina. Como alternativa, uno o más de los ácidos nucleicos de la invención se pueden comprar en compañías, como Macromolecular Resources (Fort Collins, CO) y Synthegen (Houston, TX). El ácido nucleico puede comprender cualquier secuencia de nucleótidos que codifique cualquiera de los TCR, polipéptidos o proteínas, o porciones funcionales de acuerdo con la invención o variantes funcionales de los mismos. Por ejemplo, el ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que comprende, que consiste en, o consiste esencialmente en, la SeQ ID NO: 27 (codifica las cadenas alfa y beta de TCR anti-SSX-2) o la SEQ ID NO: 28 (codifica cadenas alfa y beta quiméricas humano/ratón de TCR anti-SSX-2 ). La secuencia de nucleótidos puede comprender de forma alternativa una secuencia de nucleótidos que sea degenerada con respecto a la SEQ ID NO: 27 o 28.
De acuerdo con la invención, la secuencia del ácido nucleico está optimizada. Sin estar vinculado a una teoría en particular, se cree que la optimización de la secuencia del ácido nucleico aumenta la eficiencia de traducción de los transcritos de ARNm. La optimización de la secuencia de ácido nucleico puede implicar la sustitución de un codón nativo por otro codón que codifica el mismo aminoácido, pero puede traducirse por ARNt que está más fácilmente disponible dentro de una célula, lo que aumenta la eficiencia de traducción. La optimización de la secuencia de ácido nucleico también puede reducir las estructuras de ARNm secundarias que podrían interferir con la traducción, aumentando así la eficiencia de traducción. Por ejemplo, el ácido nucleico que se optimiza puede comprender una secuencia de nucleótidos que comprende, que consiste en, o consiste esencialmente en, la SEQ ID NO: 29 (codifica cadenas alfa y beta de t Cr anti-SSX-2) o la SEQ ID NO: 30 (codifica cadenas alfa y cadenas beta quiméricas humano/ratón de TCR anti-SSX-2 ). La secuencia de nucleótidos puede comprender de forma alternativa una secuencia de nucleótidos que sea degenerada con respecto a la SEQ ID NO: 29 o 30.
La invención también proporciona un ácido nucleico aislado o purificado que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención o una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas a la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento.
La secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas se hibrida preferentemente en condiciones de alta rigurosidad. Por "condiciones de alta rigurosidad" se entiende que la secuencia de nucleótidos se hibrida específicamente con una secuencia diana (la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento) en una cantidad que es detectable de forma más intensa que en la hibridación no específica. Las condiciones de alta rigurosidad incluyen condiciones que distinguirían un polinucleótido con una secuencia complementaria exacta, o uno que contenga solo algunos desapareamientos dispersos de una secuencia aleatoria que resulta que tenía algunas regiones pequeñas (por ejemplo, 3-10 bases) que coincidían con la secuencia de nucleótidos. Estas pequeñas regiones de complementariedad se funden más fácilmente que un complemento de longitud completa de 14-17 o más bases, y la hibridación de alta rigurosidad las hace fácilmente distinguibles. Las condiciones de rigurosidad relativamente altas incluirían, por ejemplo, condiciones de baja sal y/o alta temperatura, tales como las que proporcionan una concentración aproximadamente 0,02-0,1 M de NaCl o el equivalente, a temperaturas de aproximadamente 50-70 °C. Estas condiciones de alta rigurosidad toleran pocos, o ningún, desapareamiento entre la secuencia de nucleótidos y la plantilla o cadena diana, y son particularmente adecuadas para detectar la expresión de cualquiera de los TCR de la invención. En general, se aprecia que las condiciones pueden ser más estrictas si se agregan cantidades crecientes de formamida.
Los ácidos nucleicos de la invención se pueden incorporar en un vector de expresión recombinante. A este respecto, la invención proporciona vectores de expresión recombinantes que comprenden cualquiera de los ácidos nucleicos de la invención. Para los fines del presente documento, la expresión "vector de expresión recombinante" significa un constructo de oligonucleótido o polinucleótido genéticamente modificado que permite la expresión de un ARNm, proteína, polipéptido o péptido por una célula hospedadora, cuando el constructo comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el ARNm, proteína, polipéptido o péptido, y el vector se pone en contacto con la célula en condiciones suficientes para tener el ARNm, proteína, polipéptido o péptido expresado dentro de la célula. Los vectores de la invención no son de origen natural en su conjunto. Sin embargo, partes de los vectores pueden ser de origen natural. Los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden comprender cualquier tipo de nucleótidos, incluyendo, pero sin limitarse a ADN y ARN, que puede ser monocatenario o bicatenario, sintetizado o que se obtiene en parte de una fuente natural, y que contiene nucleótidos naturales, no naturales y modificados. Los vectores de expresión recombinantes pueden comprender enlaces entre nucleótidos de origen natural o de origen no natural, o ambos tipos de enlaces. Preferentemente, los nucleótidos o enlaces entre nucleótidos de origen no natural o modificados no impiden la transcripción o replicación del vector.
El vector de expresión recombinante de la invención puede ser cualquier vector de expresión recombinante adecuado, y puede utilizarse para transformar o transfectar cualquier célula hospedadora adecuada. Los vectores adecuados incluyen aquellos diseñados para la propagación y expansión o para la expresión o ambas cosas, tales como plásmidos y virus. El vector puede seleccionarse del grupo que consiste en la serie pUC (Fermentas Life Sciences), la serie pBluescript (Stratagene, LaJolla, CA), la serie pET (Novagen, Madison, WI), la serie pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) y la serie pEX (Clontech, Palo Alto, CA). También pueden usarse bacteriófagos como vectores, tales como ÁGT10, AGTl1, AZapII (Stratagene), AEMBL4 y ANMl149. Los ejemplos de vectores de expresión de plantas incluyen pBI01, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 y pBIN19 (Clontech). Los ejemplos de vectores de expresión animal incluyen pEUK-Cl, pMAM y pMAMneo (Clontech). Preferentemente, el vector de expresión recombinante es un vector viral, por ejemplo, un vector retroviral.
Los vectores de expresión recombinantes de la invención se pueden preparar utilizando técnicas de ADN recombinante estándar descritas en, por ejemplo, Sambrook et al., supra, y Ausubel et al., supra. Las construcciones de vectores de expresión, que son circulares o lineales, se pueden preparar para contener un sistema de replicación funcional en una célula hospedadora procariota o eucariota. Los sistemas de replicación pueden proceder, por ejemplo de ColEI, plásmido 2 |j, A, SV40, virus del papiloma bovino y similares.
De forma deseable, el vector de expresión recombinante comprende secuencias reguladoras, tales como codones de iniciación y terminación de la transcripción y traducción, que son específicos para el tipo de célula hospedadora (por ejemplo, bacteria, hongo, planta o animal) en el que se va a introducir el vector, según sea apropiado, y teniendo en cuenta si el vector está basado en ADN o ARN.
El vector de expresión recombinante puede incluir uno o más genes marcadores, que permiten la selección de células hospedadoras transformadas o transfectadas. Los genes marcadores incluyen resistencia a biocidas, por ejemplo, resistencia a antibióticos, metales pesados, etc., complementación en un hospedador auxotrófico para proporcionar prototrofia, y similares. Los genes marcadores adecuados para los vectores de expresión de la invención incluyen, por ejemplo, genes de resistencia a neomicina/G418, genes de resistencia a higromicina, genes de resistencia a histidinol, genes de resistencia a tetraciclina y genes de resistencia a ampicilina.
El vector de expresión recombinante puede comprender un promotor nativo o no nativo unido de forma operativa a la secuencia de nucleótidos que codifica el TCR, polipéptido o proteína (incluyendo porciones funcionales y las variantes funcionales de los mismos), o a la secuencia de nucleótidos que es complementaria de o que hibrida con la secuencia de nucleótidos que codifica el TCR, polipéptido, o proteína. La selección de promotores, por ejemplo, fuerte, débil, inducible, específico de tejido y específico de desarrollo, está dentro de la habilidad habitual del experto en la materia. De forma similar, la combinación de una secuencia de nucleótidos con un promotor también está dentro de la habilidad del experto en la materia. El promotor puede ser un promotor no viral o un promotor viral, por ejemplo, un promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor de SV40, un promotor de RSV, o un promotor encontrado en la repetición terminal larga del virus de células madre murinas.
Los vectores de expresión recombinantes de la invención se pueden diseñar tanto para una expresión transitoria como para una expresión estable o para ambas. Asimismo, los vectores de expresión recombinantes se pueden fabricar para la expresión constitutiva o para la expresión inducible. Además, los vectores de expresión recombinantes se pueden fabricar para que incluyan un gen suicida.
Como se usa en el presente documento, la expresión "gen suicida" se refiere a un gen que hace que la célula que expresa el gen suicida muera. El gen suicida puede ser un gen que confiere sensibilidad a un agente, por ejemplo, un fármaco, a la célula en la que se expresa el gen, y hace que la célula muera cuando la célula se pone en contacto o se expone al agente. Los genes suicidas se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Suicide Gene Therapy: Methods and Reviews. Springer, Caroline J. (Cancer Research UK Centre for Cancer Therapeutics at the Institute of Cancer Research, Sutton, Surrey, UK), Humana Press, 2004) e incluyen, por ejemplo, el gen del virus del herpes simple (VHS) de la timidina quinasa (TK), de la citosina desaminasa, de la purina nucleósido fosforilasa y de la nitrorreductasa.
Otra realización de la invención proporciona además una célula hospedadora que comprende cualquiera de los vectores de expresión recombinante descritos en el presente documento. Como se usa en el presente documento, la expresión "célula hospedadora" se refiere a cualquier tipo de célula que pueda contener el vector de expresión recombinante de la invención. La célula hospedadora puede ser una célula eucariota, por ejemplo, de planta, animal, hongo o alga, o puede ser una célula procariota, por ejemplo, bacteria o protozoo. La célula hospedadora puede ser una célula cultivada o una célula primaria, es decir, aislada directamente de un organismo, por ejemplo, un ser humano. La célula hospedadora puede ser una célula adherente o una célula suspendida, es decir, una célula que crece en suspensión. Las células hospedadoras adecuadas se conocen bien en la técnica e incluyen, por ejemplo, células DH5a de E. coli, células de ovario de hámster chino, células VERO de mono, células COS, células HEK293 y similares. Con el fin de amplificar o replicar el vector de expresión recombinante, la célula hospedadora es preferentemente una célula procariota, por ejemplo, una célula DH5a. Para los fines de producir un TCR recombinante, polipéptido o proteína, la célula hospedadora puede ser una célula de mamífero. Lo más preferentemente es que la célula hospedadora sea una célula humana. Si bien la célula hospedadora puede ser de cualquier tipo celular, puede originarse a partir de cualquier tipo de tejido y puede estar en cualquier etapa de desarrollo, la célula hospedadora preferentemente es un linfocito de sangre periférica (PBL, de sus siglas en inglés) o una célula mononuclear de sangre periférica (PBMC, de sus siglas en inglés). Más preferentemente, la célula hospedadora es un linfocito T.
Para los fines del presente documento, el linfocito T puede ser cualquier linfocito T, tal como un linfocito T cultivado, por ejemplo, un linfocito T primario o un linfocito T de una línea de linfocitos T cultivada, por ejemplo, Jurkat, SupTl, etc., o un linfocito T obtenido de un mamífero. Si se obtiene de un mamífero, el linfocito T se puede obtener de numerosas fuentes, que incluyen, aunque no se limitan a sangre, médula ósea, ganglios linfáticos, el timo u otros tejidos o líquidos. Los linfocitos T también pueden enriquecerse o purificarse. Preferentemente, el linfocito T es un linfocito T humano. Más preferentemente, el linfocito T es un linfocito T aislado de un ser humano. El linfocito T puede ser cualquier tipo de linfocito T y puede estar en cualquier etapa de desarrollo incluyendo, aunque no de forma limitante, linfocitos T dobles positivos CD4+/CD8+, linfocitos T auxiliares CD4+, por ejemplo, linfocitos Thi y Th2 , linfocitos T CD8+ (por ejemplo, linfocitos T citotóxicos), células infiltrantes de tumores (TIL), linfocitos T de memoria, linfocitos T vírgenes y similares. Preferentemente, el linfocito T es un linfocito T CD8+ o un linfocito T CD4+.
La invención también proporciona una población de células que comprende al menos una célula hospedadora descrita en el presente documento. La población de células puede ser una población heterogénea que comprende la célula hospedadora que comprende cualquiera de los vectores de expresión recombinante que se describen, además de al menos otra célula, por ejemplo, una célula hospedadora (por ejemplo, un linfocito T), que no comprende ninguno de los vectores de expresión recombinante, o una célula distinta de un linfocito T, por ejemplo, un linfocito B, un macrófago, un neutrófilo, un eritrocito, un hepatocito, una célula endotelial, una célula epitelial, una célula muscular, una célula cerebral, etc. De forma alternativa, la población de células puede ser una población sustancialmente homogénea, en la que la población comprende principalmente células hospedadoras (por ejemplo, que consisten esencialmente en) que comprenden el vector de expresión recombinante. La población también puede ser una población clonal de células, en la que todas las células de la población son clones de una única célula hospedadora que comprende un vector de expresión recombinante, de forma que todas las células de la población comprenden el vector de expresión recombinante. En una realización de la invención, la población de células es una población clonal que comprende células hospedadoras que comprenden un vector de expresión recombinante como se describe en el presente documento.
También se divulga un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une de forma específica a una porción funcional de cualquiera de los TCR descritos en el presente documento. Preferentemente, la porción funcional se une de manera específica al antígeno del cáncer, por ejemplo, la porción funcional que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO:13 (CDR1 de una cadena a), 14 (CDR2 de una cadena a), 15 (CDR3 de una cadena a), 16 (CDR1 de una cadena p), 17 (CDR2 de una cadena p), 18 (CDR3 de una cadena p), SEQ ID NO: 19, SEQ ID No : 20, SEQ ID NO: 35, SeQ ID nO: 36, o una combinación de las mismas, por ejemplo, 13-15; 16­ 18; 13-18; 19-20 o 35-36. Más preferentemente, la porción funcional comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 13-18. En otro aspecto de la divulgación, el anticuerpo, o región de unión a antígeno del mismo, se une a un epítopo que se forma por las 6 CDR (CDR1-3 de la cadena alfa y CDR1-3 de la cadena beta). El anticuerpo puede ser cualquier tipo de inmunoglobulina que se conozca en la técnica. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser de cualquier isotipo, por ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, etc. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. El anticuerpo puede ser un anticuerpo de origen natural, por ejemplo, un anticuerpo aislado y/o purificado a partir de un mamífero, por ejemplo, ratón, conejo, cabra, caballo, pollo, hámster, humano, etc. De forma alternativa, el anticuerpo puede ser un anticuerpo diseñado mediante ingeniería genética, por ejemplo, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico. El anticuerpo puede estar en forma monomérica o polimérica. Asimismo, el anticuerpo puede tener cualquier nivel de afinidad o avidez por la porción funcional del TCR. De forma deseable, el anticuerpo es específico para la porción funcional del TCR, de forma que hay reacciones cruzadas mínimas con otros péptidos o proteínas.
Los métodos de ensayo de anticuerpos para determinar la capacidad de unirse a cualquier porción funcional del TCR se conocen en la técnica e incluyen cualquier ensayo de unión antígeno-anticuerpo, tales como, por ejemplo, radioinmunoensayo (RIA), ELISA, transferencia de Western, inmunoprecipitación y ensayos de inhibición competitiva (véase, por ejemplo, Janeway et al., infra, y la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos n.° 2002/0197266 A1).
En la materia se conocen métodos adecuados para fabricar anticuerpos. Por ejemplo, los métodos de hibridoma estándar se describen en, por ejemplo, Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol., 5, 511-519 (1976)), Harlow y Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988), y C.A. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New York, NY (2001)). Como alternativa, se conocen otros métodos en la técnica, tales como los métodos de hibridoma EBV (Haskard and Archer, J. Immunol. Methods, 74(2), 361-67 (1984), y Roder et al., Methods Enzymol., 121, 140-67 (1986)), y los sistemas de expresión de vectores bacteriofágicos (véase, por ejemplo, Huse et al., Science,246, 1275-81 (1989)). Además, los métodos para producir anticuerpos en animales no humanos se describen en, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos 5.545.806, 5.569.825 y 5.714.352, y en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos No 2002/0197266 A1).
Además, la presentación de fagos se puede utilizar para generar un anticuerpo. A este respecto, se pueden generar bibliotecas de fagos que codifican dominios variables (V) de unión a antígeno de anticuerpos utilizando técnicas estándar de biología molecular y ADN recombinante (véase, por ejemplo, Sambrook et al. (eds.), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001)). Los fagos que codifican una región variable con la especificidad deseada se seleccionan para la unión específica al antígeno deseado, y se reconstituye un anticuerpo completo o parcial que comprende el dominio variable seleccionado. Las secuencias de ácido nucleico que codifican el anticuerpo reconstituido se introducen en una línea celular adecuada, tal como una célula de mieloma utilizada para la producción de hibridomas, de modo que los anticuerpos que secreta la célula tienen las características de los anticuerpos monoclonales (véase, por ejemplo, Janeway et al., supra, Huse et al., supra, y la patente de Estados Unidos 6.265.150).
Los ratones transgénicos pueden producir anticuerpos que son transgénicos para genes específicos de inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera. Dichos métodos se conocen en la técnica y se describen en, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos 5.545.806 y 5.569.825, y Janeway et al., supra.
Los métodos para generar anticuerpos humanizados se conocen bien en la técnica y se describen en detalle en, por ejemplo, Janeway et al., supra, las patentes de Estados Unidos 5.225.539, 5.585.089 y 5.693.761, la patente europea n.° 0239400 B1 y la patente de Reino Unido n.° 2188638. Los anticuerpos humanizados también se pueden generar utilizando la tecnología de rechapado de anticuerpos descrita en la Patente de Estados Unidos 5.639.641 y Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235, 959-973 (1994).
También se divulgan porciones de unión a antígeno de cualquiera de los anticuerpos que se describen en el presente documento. La porción de unión a antígeno puede ser cualquier porción que tenga al menos un sitio de unión a antígeno, tal como Fab, F(ab')2, dsFv, sFv, diacuerpos y triacuerpos.
Utilizando técnicas de tecnología de ADN recombinante rutinarias, (véase, por ejemplo, Janeway et al., supra)se puede generar un fragmento de una región variable de cadena sencilla (sFv) de un fragmento de anticuerpo, que consiste en un fragmento Fab truncado que comprende el dominio variable (V) de una cadena pesada de un anticuerpo unida a un domino V de una cadena ligera de un anticuerpo a través de un péptido sintético. De forma similar, se pueden preparar fragmentos de región variable estabilizados con disulfuro (dsFv) mediante tecnología de ADN recombinante (véase, por ejemplo, Reiter et al., Protein Engineering, 7, 697-704 (1994)). Los fragmentos de anticuerpo de la invención, sin embargo, no se limitan a estos tipos ejemplares de fragmentos de anticuerpo.
Asimismo, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se puede modificar para que comprenda un marcador detectable, tales como, por ejemplo, un radioisótopo, un fluoróforo (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE)), una enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante) y partículas de elementos (por ejemplo, partículas de oro).
Los TCR, polipéptidos, proteínas, (incluidas las porciones y variantes funcionales de los mismos), ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células hospedadoras (incluidas las poblaciones de las mismas) y anticuerpos (incluidas los fragmentos de unión a antígeno de los mismos), pueden aislarse o purificarse. La expresión "aislado" como se usa en el presente documento significa que se ha retirado de su entorno natural. La expresión "purificado" como se usa en el presente documento significa que se ha incrementado en pureza, donde "pureza" es una expresión relativa y no tiene que interpretarse como pureza absoluta. Por ejemplo, la pureza puede ser al menos aproximadamente 50%, puede ser mayor que el 60%, 70% u 80%, 90% o puede ser del 100%.
Los TCR, polipéptidos, proteínas (incluidas las porciones y variantes funcionales de los mismos), ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células hospedadoras (incluidas las poblaciones de las mismas) y anticuerpos (incluidos los fragmentos de unión a antígeno de los mismos), todos los cuales se denominan de aquí en adelante, de forma colectiva como "materiales TCR", pueden formularse en una composición, tal como una composición farmacéutica. También se proporciona y divulga una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los TCR, polipéptidos, proteínas, porciones funcionales, variantes funcionales, ácidos nucleicos, vectores de expresión, células hospedadoras (incluidas poblaciones de las mismas) y anticuerpos (incluidas las porciones de unión a antígeno de los mismos), y un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas de la invención que contienen cualquiera de los materiales TCR pueden comprender más de un material TCR, por ejemplo, un polipéptido y un ácido nucleico, o dos o más TCR diferentes. Como alternativa, la composición farmacéutica puede comprender un material TCR en combinación con otros agentes o fármacos farmacéuticamente activos, tales como agentes quimioterapéuticos, por ejemplo, asparaginasa, busulfán, carboplatino, cisplatino, daunorrubicina, doxorrubicina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, metotrexato, paclitaxel, rituximab, vinblastina, vincristina, etc.
Preferentemente, el transportador es un portador farmacéuticamente aceptable. Con respecto a las composiciones farmacéuticas, el transportador puede ser cualquiera de los que se usan de forma convencional y está limitado solo por consideraciones físico-químicas, tales como la solubilidad y la falta de reactividad con el (los) compuesto(s) activo(s), y por la vía de administración. Los transportadores farmacéuticamente aceptables descritos en el presente documento, por ejemplo, vehículos, adyuvantes, excipientes y diluyentes, son bien conocidos por los expertos en la materia y están fácilmente disponibles para el público. Se prefiere que el vehículo farmacéuticamente aceptable sea uno que sea químicamente inerte al (los) agente(s) activo(s) y uno que no tenga efectos secundarios perjudiciales o toxicidad en las condiciones de uso.
La elección del transportador se determinará en parte por el material TCR en particular, así como por el método que se usa en particular para administrar el material TCR. Por consiguiente, hay una variedad de formulaciones adecuadas de la composición farmacéutica de la invención. Las siguientes formulaciones para administración oral, aerosol, parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal e intraperitoneal son ejemplares y de ninguna manera limitantes. Se puede utilizar más de una ruta para administrar los materiales TCR, y en ciertos casos, una ruta particular puede proporcionar una respuesta más inmediata y más eficaz que otra ruta.
Las formulaciones tópicas son bien conocidas por los expertos en la materia. Tales formulaciones son particularmente adecuadas para la aplicación en la piel en el contexto de la invención.
Las formulaciones adecuadas para administración oral pueden consistir en (a) soluciones líquidas, tales como una cantidad eficaz del material TCR de la invención disuelto en diluyentes, tales como agua, solución salina o zumo de naranja; (b) cápsulas, sobres, comprimidos, pastillas y trociscos, conteniendo cada uno una cantidad predeterminada del principio activo, como sólidos o gránulos; (c) polvos; (d) suspensiones en un líquido apropiado; y (e) emulsiones adecuadas. Las formulaciones líquidas pueden incluir diluyentes, tales como agua y alcoholes, por ejemplo, etanol, alcohol bencílico y los alcoholes de polietileno, con o sin la adición de un tensioactivo farmacéuticamente aceptable. Las formas de cápsula pueden ser del tipo ordinario de gelatina de cubierta dura o blanda que contiene, por ejemplo, tensioactivos, lubricantes y rellenos inertes, tales como lactosa, sacarosa, fosfato cálcico, y almidón de maíz. Las formas de comprimidos pueden incluir uno o más de lactosa, sacarosa, manitol, almidón de patata, ácido algínico, celulosa microcristalina, goma arábiga, gelatina, goma guar, dióxido de silicio coloidal, croscarmelosa de sodio, talco, estearato de magnesio, estearato de calcio, estearato de zinc, ácido esteárico y otros excipientes, colorantes, diluyentes, agentes tamponantes, agentes disgregantes, agentes humectantes, conservantes, agentes aromatizantes, y otros excipientes farmacológicamente compatibles. Las formas de grajea pueden comprender el material TCR en un saborizante, usualmente sacarosa y goma arábiga o tragacanto, así como pastillas que comprenden el material TCR en una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y goma arábiga, emulsiones, geles y similares que contienen, además, los excipientes conocidos en la técnica.
El material TCR, solo o en combinación con otros componentes adecuados, se puede convertir en formulaciones en aerosol para administrarse mediante inhalación. Estas formulaciones en aerosol se pueden colocar en propelentes aceptables a presión, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y similares. También pueden formularse como productos farmacéuticos para preparaciones sin presión, tales como en un nebulizador o un atomizador. Dichas formulaciones en aerosol también se pueden utilizar para pulverizar mucosa.
Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas y no-acuosas, isotónicas estériles, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor al que se dirige, y suspensiones acuosas y no acuosas que incluyen agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes y conservantes. El material t Cr puede administrarse en un diluyente fisiológicamente aceptable en un transportador farmacéutico, tal como un líquido estéril o una mezcla de líquidos, que incluye agua, solución salina, dextrosa acuosa y soluciones de azúcar relacionadas, un alcohol, tal como etanol o alcohol hexadecílico, un glicol, tal como propilenglicol o polietilenglicol, dimetilsulfóxido, glicerol, cetales tales como 2,2-dimetil-1,3-dioxolano-4-metanol, éteres, poli(etilenglicol) 400, aceites, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos o glicéridos, o glicéridos de ácidos grasos acetilados con o sin la adición de un tensioactivo farmacéuticamente aceptable, tal como un jabón o un detergente, un agente suspensor, tal como pectina, carbómeros, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa o carboximetilcelulosa, o agentes emulsionantes y otros adyuvantes farmacéuticos.
Los aceites, que pueden usarse en formulaciones parenterales incluyen aceites derivados del petróleo, animales, vegetales o sintéticos. Los ejemplos específicos de aceites incluyen maní, soja, sésamo, semillas de algodón, maíz, aceituna, vaselina y mineral. Los ácidos grasos adecuados para su uso en formulaciones parenterales incluyen ácido oleico, ácido esteárico y ácido isoesteárico. El oleato de etilo y el miristato de isopropilo son ejemplos de ésteres de ácidos grasos adecuados.
Los jabones adecuados para su uso en formulaciones parenterales incluyen sales de metal alcalino, amonio y trietanolamina de ácidos grasos, y los detergentes adecuados incluyen (a) detergentes catiónicos tales como, por ejemplo, haluros de dimetil dialquil amonio y haluros de alquil piridinio, (b) detergentes aniónicos tales como, por ejemplo, alquil, aril y olefina sulfonatos, alquil, olefina, éter y monoglicéridos sulfatos y sulfosuccinatos, (c) detergentes no iónicos tales como, por ejemplo, óxidos de aminas grasas, alcanolamidas de ácidos grasos y copolímeros de polioxietilenopolipropileno, (d) detergentes anfóteros tales como, por ejemplo, sales de amonio cuaternario de alquil-p-aminopropionatos y 2-alquil-imidazolina, y (e) mezclas de los mismos.
Las formulaciones parenterales contendrán típicamente de aproximadamente el 0,5 % hasta aproximadamente el 25 % en peso del material TCR de la invención en solución. Se pueden utilizar conservantes y tampones. Con el fin de minimizar o eliminar la irritación en el lugar de la inyección, dichas composiciones pueden contener uno o más tensioactivos no iónicos que tienen un equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB) de aproximadamente 12 a aproximadamente 17. La cantidad de tensioactivo en tales formulaciones típicamente variará de aproximadamente un 5% a aproximadamente un 15% en peso. Los tensioactivos adecuados incluyen ésteres de ácidos grasos de sorbitán polietilenglicol, tales como monooleato de sorbitán y los aductos de alto peso molecular de óxido de etileno con una base hidrófoba, formados por la condensación de óxido de propileno con propilenglicol. Las formulaciones parenterales se pueden presentar en recipientes sellados de dosis unitarias o de dosis múltiples, tales como ampollas y viales, y se pueden almacenar en un estado congelado en seco (liofilizado) que requiere solo la adición del excipiente líquido estéril, por ejemplo, agua, para inyecciones, inmediatamente antes de su uso. Las soluciones y suspensiones para inyección extemporánea se pueden preparar a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles del tipo descrito anteriormente.
Las formulaciones inyectables están de acuerdo con la invención. Los requisitos para transportadores farmacéuticos eficaces para composiciones inyectables son bien conocidos por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J.B. Lippincott Company, Filadelfia, PA, Banker and Chalmers, eds., páginas 238-250 (1982), y ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4a ed., páginas 622-630 (1986)). Preferentemente, cuando se administran células, por ejemplo, linfocitos T, las células se administran mediante inyección.
Un experto en la materia apreciará que, además de las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente, los materiales TCR pueden formularse como complejos de inclusión, tales como complejos de inclusión de ciclodextrina, o liposomas.
Para los fines de la invención, la cantidad o dosis del material TCR que se administra debe ser suficiente para efectuar, por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica, en el sujeto o animal durante un período de tiempo razonable. Por ejemplo, la dosis del material TCR debe ser suficiente para unirse a un antígeno del cáncer, o detectar, tratar o prevenir el cáncer en un período de aproximadamente 2 horas o más, por ejemplo, de 12 a 24 horas o más, desde el momento de la administración. En ciertas realizaciones, el período de tiempo podría ser incluso más largo. La dosis se determinará por la eficacia del material TCR particular y por la condición del animal (por ejemplo, humano), así como el peso corporal del animal (por ejemplo, humano) a tratar.
Se conocen muchos ensayos en la técnica para determinar y administrar la dosis. Para los fines de la invención, podría usarse un ensayo, que comprende comparar en qué medida las células diana se lisan o el IFN-y se secreta por los linfocitos T que expresan el TCR, polipéptido o proteína tras la administración de una dosis dada de dichos linfocitos T a un mamífero entre un conjunto de mamíferos a los que se les da una dosis diferente de los linfocitos T, para determinar una dosis inicial a administrar a un mamífero. La medida en que se lisan las células diana o el IFN-y se secreta tras la administración de una determinada dosis puede analizarse mediante métodos que se conocen en la técnica.
La dosis del material TCR también se podrá determinar mediante la existencia, naturaleza y medida de cualquier efecto secundario adverso que pueda acompañar a la administración de un material TCR particular. Típicamente, el médico tratante decidirá la dosis del material TCR con el cual tratar a cada paciente individual, teniendo en cuenta una variedad de factores, tales como la edad, peso corporal, salud general, dieta, sexo, material TCR que se administrará, vía de administración y la severidad de la afección a tratar. A modo de ejemplo y sin pretender limitar la invención, la dosis del material TCR puede ser de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal del sujeto que se trata/día, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal/día, de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal/día.
Una persona con experiencia ordinaria en la materia apreciará fácilmente que los materiales TCR pueden modificarse de varias formas, de tal forma que la eficacia terapéutica o profiláctica de los materiales TCR se incremente por la modificación. Por ejemplo, los materiales TCR pueden conjugarse directa o indirectamente a través de un puente a un resto de direccionamiento. La práctica de la conjugación de compuestos, por ejemplo, materiales TCR, con restos de direccionamiento, se conoce en la materia. Véase, por ejemplo, Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 111 (1995) y la patente de Estados Unidos n.° 5.087.616. El término "resto de direccionamiento" tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier molécula o agente que reconoce de forma específica y se une a un receptor de la superficie celular, de tal manera que el resto de direccionamiento dirige la liberación de los materiales TCR a una población de células en cuya superficie se expresa el receptor. Los restos de direccionamiento incluyen, pero sin estar limitados, anticuerpos, o fragmentos de los mismos, péptidos, hormonas, factores de crecimiento, citoquinas, y cualquier otro ligando natural o no natural, que se una a los receptores de superficie de la célula (por ejemplo, el receptor del factor de crecimiento epitelial (EGFR), receptor de linfocitos T (TCR), receptor de linfocitos B (BCR), CD28, el receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), receptor nicotínico de acetilcolina (nAChR), etc.). El término "puente", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier agente o molécula que une los materiales TCR con el resto de direccionamiento. Un experto en la materia reconoce que los sitios en los materiales TCR, que no son necesarios para la función de los materiales TCR, son sitios ideales para unir un puente y/o un resto de direccionamiento, siempre que el puente y/o el resto de direccionamiento, una vez unido a los materiales de TCR, no interfiera con la función de los materiales TCR de la invención, es decir, la capacidad de unirse a SSX-2; reconocer uno o más de SSX-3, SSX-4, SSX-5, SSX-9 y SSX-10; o detectar, tratar o prevenir el cáncer.
Como alternativa, los materiales TCR se pueden modificar en una forma de depósito, de tal manera que la manera en que los materiales TCR se liberan en el cuerpo al que se administra se controla con respecto al tiempo y la ubicación dentro del cuerpo (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 4.450.150). Las formas de depósito de los materiales TCR pueden ser, por ejemplo, una composición implantable que comprende los materiales TCR y un material poroso o no poroso, tal como un polímero, donde los materiales TCR están encapsulados o difundidos por todo el material y/o la degradación del material no poroso. El depósito se implanta en la ubicación deseada dentro del cuerpo y los materiales TCR se liberan del implante a un ritmo predeterminado. En una realización de la invención, la composición farmacéutica comprende además 5-aza-2'-desoxicitidina (DAC).
Sin estar vinculado a una teoría particular, se cree que el agente de desmetilación DAC mejora el reconocimiento de las células cancerosas por cualquiera de los materiales TCR mediante la regulación positiva de la expresión de SSX-2 por las células cancerosas.
Se contempla que las composiciones farmacéuticas, TCR, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, anticuerpos, células hospedadoras o poblaciones de células de la invención pueden usarse en métodos para tratar o prevenir el cáncer. Sin estar vinculado a una teoría particular, se cree que los TCR se unen de forma específica a SSX-2 y pueden reconocer también uno o más de SSX-3, SSX-4, SSX-5, SSX-9 y SSX-10 de tal manera que el TCR (o polipéptido o proteína de la invención relacionada), cuando se expresa en una célula, es capaz de mediar una respuesta inmunitaria contra la célula que expresa SSX-2 y también puede mediar una respuesta inmunitaria contra uno o más de SSX-3, SSX-4, SSX-5, SSX-9 y SSX-10. A este respecto, la invención proporciona cualquiera de las composiciones farmacéuticas, cualquier ácido nucleico o vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de los TCR, polipéptidos o proteínas descritas en el presente documento, o cualquier célula hospedadora o población de células que comprenden un vector recombinante que codifica cualquiera de los TCR, polipéptidos o proteínas descritas en el presente documento, en una cantidad eficaz para uso en un método para tratar o prevenir el cáncer en el hospedador.
En una realización de la invención, el método para tratar o prevenir el cáncer en un hospedador comprende además la administración de DAC al hospedador. El método puede comprender administrar DAC antes, simultáneamente o después de administrar cualquiera de las composiciones farmacéuticas de la invención, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células hospedadoras o poblaciones de células al hospedador. Sin estar vinculado a una teoría particular, se cree que el agente desmetilante DAC mejora el reconocimiento de las células cancerosas por cualquiera de los materiales TCR al regular de manera positiva la expresión de SSX-2 por las células cancerosas.
Los términos "tratar" y "prevenir", así como las palabras derivadas de los mismos, como se usan en el presente documento, no implican necesariamente un tratamiento o prevención del 100 % o completos. Por el contrario, hay diversos grados de tratamiento o prevención, de los cuales un experto en la materia reconoce que tienen un efecto beneficioso o efecto terapéutico potencial. A este respecto, los métodos de la invención pueden proporcionar cualquier cantidad de cualquier nivel de tratamiento o prevención del cáncer en un mamífero. Además, el tratamiento o prevención proporcionados por el método de la invención pueden incluir el tratamiento o prevención de una o más afecciones o síntomas de la enfermedad, por ejemplo, cáncer, que se está tratando o previniendo. Asimismo, para los fines del presente documento, "prevención" puede abarcar el retraso del inicio de la enfermedad, o de un síntoma o afección de la misma.
También se divulga un método para detectar la presencia de cáncer en un hospedador. El método comprende (i) poner en contacto una muestra que comprende células del cáncer con cualquiera de los TCR, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinante, células hospedadoras, poblaciones de células o anticuerpos, o porciones de unión a antígeno del mismo, descritos en el presente documento, formando así un complejo, y detectar el complejo, donde la detección del complejo indica la presencia de cáncer en el hospedador. Con respecto al método desvelado para detectar cáncer en un hospedador, la muestra de células del cáncer puede ser una muestra que comprende células completas, lisados de las mismas, o una fracción del conjunto de lisados de las células, por ejemplo, una fracción nuclear o citoplasmática, una fracción proteica completa o una fracción de un ácido nucleico.
Para los fines del método de detección desvelado, la etapa de puesta en contacto puede tener lugar in vitro o in vivo con respecto al hospedador. Preferentemente, la puesta en contacto es in vitro.
Asimismo, la detección del complejo puede ocurrir de varias formas que se conocen en la técnica. Por ejemplo, los TCR, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células hospedadoras, poblaciones de células o anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, descritos en el presente documento, se pueden marcar con un marcador detectable como, por ejemplo, un radioisótopo, un fluoróforo (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE)), una enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante) y partículas de elementos (por ejemplo, partículas de oro).
Para los fines de uso en un método para tratar o prevenir el cáncer en un hospedador, de acuerdo con la invención, donde se administran células hospedadoras o poblaciones de células, las células pueden ser células alogénicas o autólogas para el hospedador. Preferentemente, las células son autólogas para el hospedador.
Con respecto al uso en un método para tratar o prevenir el cáncer en un hospedador, el cáncer puede ser cualquier tipo de cáncer, incluyendo cualquiera de los sarcomas (por ejemplo, sarcoma sinovial, sarcoma osteogénico, leiomiosarcoma uterino y rabdomiosarcoma alveolar), linfomas (por ejemplo, linfoma de Hodgkin y linfoma no hodgkiniano), carcinoma hepatocelular, glioma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer linfocítico agudo, leucemia mieloide aguda, cáncer de huesos, cáncer cerebral, cáncer de mama, cáncer de ano, canal anal o anorrectal, cáncer de ojo, cáncer del conducto biliar intrahepático, cáncer de las articulaciones, cáncer de cuello, vesícula biliar, o pleura, cáncer de nariz, cavidad nasal u oído medio, cáncer de la cavidad oral, cáncer de vulva, leucemia linfocítica crónica, cáncer mieloide crónico, cáncer de colon (por ejemplo, carcinoma de colon), cáncer esofágico, cáncer cervical, tumor carcinoide gastrointestinal, cáncer hipofaríngeo, cáncer laríngeo, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, mesotelioma maligno, melanoma, mieloma múltiple, cáncer de la nasofaringe, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de peritoneo, omento y mesentérico, cáncer de faringe, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer renal, cáncer de intestino delgado, cáncer de tejidos blandos, cáncer de estómago, cáncer de testículos, cáncer de tiroides, cáncer de uretra y cáncer de vejiga urinaria. De estos, preferentemente se tratan sarcomas (por ejemplo, sarcoma sinovial, sarcoma osteogénico, leiomiosarcoma uterino y rabdomiosarcoma alveolar), carcinoma hepatocelular, glioma, cáncer de hígado, melanoma, cáncer de ovarios, cáncer de páncreas y cáncer de próstata. Una realización de la invención proporciona cualquiera de los ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células hospedadoras, poblaciones de células o composiciones farmacéuticas para uso en un método para tratar o prevenir el cáncer en un hospedador. En una realización, el método puede comprender además el uso de DAC.
El hospedador al que se hace referencia en el uso médico de la invención, puede ser cualquier hospedador. Preferentemente, el hospedador es un mamífero. Como se usa en el presente documento, el término "mamífero" se refiere a cualquier mamífero, incluidos, entre otros, mamíferos del orden Rodentia, tales como ratones y hámsteres, y mamíferos del orden Lagomorpha, tales como conejos. Es preferente que los mamíferos sean del orden Carnivora, que incluye los félidos (gatos) y los cánidos (perros). Es más preferente que los mamíferos sean del orden Artiodactyla, que incluye los bóvidos (vacas) y los suidos (cerdos) o del orden Perissodactyla, incluidos los équidos (caballos). Lo más preferente es que los mamíferos sean del orden Primates, cébidos o simiformes (monos) o del orden Antropoides (humanos y simios). Un mamífero preferente de forma especial es el humano.
Los siguientes ejemplos ilustran en gran medida a la invención pero no deben considerarse de ninguna manera limitantes de su alcance.
Ejemplo 1
Este ejemplo ilustra la construcción de un vector retroviral para expresar SSX-2 y verifica la expresión de SSX-2 en ciertas líneas celulares.
El gen SSX-2 se insertó en los vectores de expresión pMSGV1 y pRRLSIN.cPPT.PGK. La secuencia de SSX-2 insertada fue:
ATGaacggagacgacgcctttgcaaggagacccacggttggtgctcaaataccagagaagatccaaaaggccttcgat gatattgccaaatacttctctaaggaagagtgggaaaagatgaaagcctcggagaaaatcttctatgtgtatatgaagagaa agtatgaggctatgactaaactaggtttcaaggccaccctcccacetttcatgtgtaataaacgggccgaagacttccaggg gaatgatttggataatgaccctaaccgtgggaatcaggttgaacgtcctcagatgactttcggcaggctccagggaatctcc ccgaagatcatgcccaagaagccagcagaggaaggaaatgattcggaggaagtgccagaagcatctggcccacaaaat gatgggaaagagctgtgccccccgggaaaaccaactacctctgagaagattcacgagagatctggaaatagggaggccc aagaaaaggaagagagacgcggaacagctcatcggtggagcagtcagaacacaeacaacattggtcgattcagtttgtca acttctatgggtgcagttcatggtacccccaaaacaattacacacaacagggacccaaaaggggggaacatgcctggacc cacagactgcgtgagagaaaacagctggTGA
(SEQ ID NO: 31). El vector pRRLSIN también tenía insertado el WPRE (elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis Woodchuck).
La expresión de SSX-2 se observó mediante transferencia de Western en 624.38 células y también en células COS7-A2 que se transdujeron con un vector SSX2 como se describió anteriormente. No se observó expresión de SSX-2 en células H508, Panc2551, A549 u OVCAR3 o en células COS7-A2 no transducidas. SSX-2 también se midió en células 938mel, U251, T567A, SKMEL23 y SKMEL37. El número de copias de SSX-2 normalizado a pactina se muestra en la Tabla 1.
TABLA 1
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Se realizaron estudios adicionales de expresión de SSX-2 utilizando PCR en tiempo real. Los resultados se muestran en la Tabla 2
TABLA 2
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continuación
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Ejemplo 2
Este ejemplo ilustra la construcción de un vector retroviral para expresar un TCR específico para SSX-2.
Se aisló un TCR restringido por HLA-A2 de un clon de linfocitos T natural utilizando 5'-RACE de un ganglio linfático infiltrado por un tumor (TILN) de un paciente melanoma seropositivo para SSX-2 y cuyo tumor expresaba SSX-2. El clon de linfocitos T mostró: TRAV14 /DV4*01 (número de clones bacterianos positivos 21/23) y TRBV15*02-CB1 (número de clones bacterianos positivos 23/23).
Se construyó un vector retroviral que expresaba las cadenas a y p de TCR que incorporaban el péptido de escisión 2a. Se realizaron reacciones de PCR separadas para la cadena a y la cadena p. Para la cadena a, el cebador directo incorporó un sitio de restricción de ATG Ncol. El cebador inverso tenía furina-SGSG-P2a incorporada antes de la secuencia de reconocimiento. Para la cadena p, el cebador directo también incorporó furina-SGSG-P2a antes de la secuencia de reconocimiento, y el cebador inverso tenía un codón de parada y un sitio de restricción Notl. Al finalizar, las reacciones de PCR separadas se combinaron y se realizó una PCR adicional con cebadores externos para generar un constructo de cadena a (TRAV14)-enlazador-cadena p (TRBV15-CB1). El constructo contenía la SEQ ID NO: 27, que codifica cadenas alfa y beta de TCR anti-SSX-2.
La construcción se clonó en el vector retroviral pMSGVI utilizando los sitios de restricción Ncol y Notl.
Ejemplo 3
Este ejemplo demuestra que los PBL modificados mediante ingeniería genética con un SSX-2 TCR muestran reactividad específica para el péptido SSX-2 y su unión al tetrámero.
Se transdujeron PBL derivados de donantes humanos con el vector SSX-2 TCR del Ejemplo 2 y se analizaron para determinar la reactividad del péptido y su unión al tetrámero.
Se observó una unión al tetrámero en las células CD4 y CD8.
Se cocultivaron PBL transducidos con el SSX-2 TCR conjuntamente con células T2 de dos donantes humanos, donde las células T2 se sometieron a pulsos con concentraciones variables del péptido SSX-2: 41-49 (KASEKIFYV). Las Figuras 1A y 1B muestran los niveles resultantes de interferón-Y (pg/ml) que se midieron. Estos datos muestran que los PBL transducidos con el SSX-2 TCR reconocen el péptido SSX-2: 41-49 por debajo de 0,01 ng/ml, o menos. Las diferencias entre las Figuras 1A y 1B pueden deberse a la variabilidad del donante.
También se cultivaron PBL transducidos con SSX-2 TCR conjuntamente con células del Ejemplo 1 modificadas mediante ingeniería genética retroviral para expresar el gen SSX-2. La Figura 2 muestra los niveles de interferón-Y resultantes (pg/ml) que se midieron cuando los PBL se cultivaron conjuntamente con las células 293-A2 y COS7-A2 que expresan el gen SSX-2 y las células T2 sometidas a pulsos del péptido SSX-2: 41-49. Los PBL que no se transdujeron con un SSX-2 TCR no mostraron reactividad ante estas células.
Ejemplo 4
Este ejemplo demuestra que los PBL modificados mediante ingeniería genética con el SSX-2 TCR del Ejemplo 2 muestran reactividad ante líneas de células tumorales.
Los PBL transducidos con SSX-2 TCR se cultivaron conjuntamente con varias líneas de células tumorales.
La Figura 3 representa los niveles de interferón-Y resultantes (pg/ml) que se midieron. Estos datos muestran que los linfocitos T modificados mediante ingeniería genética con SSX-2 TCR reconocieron la proteína SSX-2 procesada y presentada de forma natural en las líneas celulares tanto de melanoma (624 y 1300) como de glioblastoma (U251). Los PBL que no se transdujeron con un SSX-2 TCR (UT) mostraron muy poca o ninguna reactividad.
Las Figuras 4A y 4B, la Figura 11 y las Tablas 3 y 4 muestran resultados adicionales de los PBL de donantes humanos que se transdujeron con el SSX-2 TCR del Ejemplo 2 cuando estos PBL se cultivaron conjuntamente con diversas células tumorales.
TABLA 3
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TABLA 4
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Ejemplo 5
Este ejemplo demuestra que los PBL modificados por ingeniería genética con un SSX-2 TCR muestran reactividad frente a otros péptidos de proteínas SSX.
Se realizaron ensayos de cocultivo con los PBL transducidos con el SSX-2 TCR del Ejemplo 2 y las células T2 sometidas a pulsos de péptidos.
La Figura 5 muestra que el SSX-2 TCR es el más reactivo con el péptido SSX-2 y también reconoce los péptidos de SSX-3, -4, -5, -9 y -10 entre los otros péptidos SSX, aunque se vio un reconocimiento mayor a concentraciones más elevadas de péptido.
Ejemplo 6
Este ejemplo demuestra que la optimización mediante codones y la introducción de una región constante de ratón mejoraron la expresión y la función del SSX-2 TCR en los PBL humanos.
Los PBL humanos no se transdujeron o se transdujeron con un vector que comprende la SEQ ID NO: 27 (SSX-2 TCR), la SEQ ID NO: 29 (SSX-2 TCR con codones optimizados), o la SeQ ID NO: 30 (SSX-2 TCR con codones optimizados incluyendo la región constante del ratón). La expresión se midió mediante análisis FACS. Se midió una intensidad de fluorescencia media de 656 para las células transducidas con SEQ ID NO: 27 (SSX-2 TCR), 910 para las células transducidas con SEQ ID NO: 29 (SSX-2 TCR con codones optimizados) y 949 para las células transducidas con SEQ ID NO: 30 (SSX-2 TCR con codones optimizados incluyendo la región constante del ratón). En otro experimento, la medición de la unión al tetrámero confirmó que la optimización con codones y la introducción de una región constante de ratón mejoraron la expresión de SSX-2 TCR en los PBL humanos.
En otro experimento, el análisis de FACS también reveló que el marcador de activación CD137 (4-1BB) estaba regulado positivamente tras el cultivo conjunto de PBL humano transducido con la SEQ ID NO: 27 (SSX-2 TCR), la SEQ ID No : 29 SSX-2 TCR) o la SEQ ID NO: 30 (SSX-2 TCR con codones optimizados incluyendo la región constante del ratón) con células COS-A2-SSX2.
Otro experimento evaluó la función de los SSX-2 TCR midiendo la movilización de CD107a tras el cocultivo con células COS-A2-SSX-2. En el día 0, las PBL se estimularon con OKT3. En el día 2, los PBL se transdujeron como se describe en este ejemplo. En el día 15, los PBL se cultivaron conjuntamente durante 2 horas con células COS-A2 o células COS-A2-SSX-2. En el día 16, la movilización de CD107a se midió mediante análisis FACS. Los resultados mostraron que la optimización por codones y la introducción de una región constante de ratón mejoraron la función del SSX-2 TCR, medida por la movilización de CD107a después del cultivo conjunto con células COS-A2-SSX-2. También se midió la función de los SSX-2 TCR por la producción de IL-2 e IFN-y tras el cultivo conjunto con células COS-A2-SSX-2 o células 938-A2 mel. Los PBL se estimularon con OKT3 y se transdujeron como se describe en este ejemplo. En el día 10, los PBL se cultivaron conjuntamente con células COS-A2, células COS-A2-SSX-2, células 938-A2 mel o células 938mel. En el día 11, la producción de IL-2 e IFN-y se midió mediante análisis FACS. Los resultados mostraron que la optimización con codones y la introducción de una región constante de ratón mejoraron la función del SSX-2 TCR que se midió por la producción de IL-2 e IFN-y después del cultivo conjunto con células COS-A2-SSX-2 y 938-A2 mel.
Ejemplo 7
Este ejemplo demuestra que los PBL diseñados con el SSX-2 TCR, el SSX-2 TCR optimizado por codones o la quimera de humano-ratón SSX-2 con codones optimizados muestran reactividad frente a líneas celulares tumorales. Los PBL que no se transdujeron (untransduced, UT) o que se transdujeron con un vector que comprende SEQ ID NO: 27 (SSX-2 TCR), SEQ ID NO: 29 (SSX-2 TCR con codones optimizados) o SEQ ID NO: 30 (SSX-2 TCR con codones optimizados), incluyendo la región constante de ratón, se cultivaron conjuntamente con varias líneas de células tumorales. Las tablas 5 y 6 muestran los niveles de interferón-Y resultantes (pg/ml) medidos con respecto a los PBL de dos donantes diferentes. Estos datos muestran que las células T transducidas reconocieron la proteína SSX-2 procesada y presentada de forma natural en múltiples líneas de células tumorales. Los PBL que no se transdujeron con un SSX-2 TCR (UT) mostraron muy poca o ninguna reactividad.
TABLA 5
Línea celular UT SSX2-TCR-WT SSX2-TCR-CO Op SSX2-TCR-MCR (SEQ (SEQ ID NO: 27) (SEQ ID NO: 29) ID NO: 30) Linfocitos T solos 445 165 164 327 K562 1950 1969 1714 2752 Lau 149 mel 925 285 193 270 T331A mel 47 30 30 30 Cos-A2 1280 2839 2338 2827 293-A2 1234 582 711 802 938 mel 1117 1239 890 1122 Cos-A2-SSX2 615 52577 64142 56893 293-A2-SSX2 515 29804 37522 37258 K562-A2-Eritroleucemia 1830 12542 21325 17437 Skmel 37 mel 96 6635 8869 10401 1300 mel 176 2556 2596 2715 624 mel 453 27344 37547 46999 (continuación)
Línea celular UT SSX2-TCR-WT SSX2-TCR-CO Op SSX2-TCR-MCR (SEQ (SEQ ID NO: 27) (SEQ ID NO: 29) ID NO: 30) 938-A2 mel 626 37032 46304 51092 U251 Glioma 372 16653 19223 19027 SKOV3 Ovárico 877 2414 2527 2221
TABLA 6
Línea celular UT SSX2-TCR-WT SSX2-TCR-CO SSX2-TCR-Op MCR Linfocitos T solos 180 322 290 554 K562 1734 1807 2784 3328 Lau 149 mel 124 125 120 142 T331A mel 115 58 30 38 Cos-A2 252 460 601 553 293-A2 994 1520 1067 1005 938 mel 915 1451 768 932 Cos-A2-SSX2 65 85892 138324 164314 293-A2-SSX2 1027 52481 49112 47273 K562-A2-Eritroleucemia 1945 12825 13610 13555 Skmel 37 232 8941 11445 10630 1300 mel 258 3162 3052 3460 624 mel 2340 60174 47059 57693 938-A2 mel 2175 46094 51173 40047 U251 Glioma 656 22888 21418 20027 SKOV3 Ovárico 652 10953 22509 9857 Ejemplo 8
Este ejemplo demuestra que los PBL modificados mediante ingeniería genética con el SSX-2 TCR, el SSX-2 TCR con codones optimizados o la quimera de humano-ratón con codones optimizados SSX-2 proliferan tras cultivarse conjuntamente con células diana SSX2+/HLA-A2+.
Los PBL del donante 1 o donante 2 que no se transdujeron (UT) o que si se transdujeron con un vector que comprende la SEQ ID NO: 27 (SSX-2 TCR), la SEQ ID n O: 29 (SsX-2 TCR con codones optimizados) o la SEQ ID NO: 30 (SSX-2 TCR con codones optimizados, incluyendo la región constante de ratón) se cultivaron conjuntamente con células COS-A2-SSX-2. La proliferación se midió en términos de incorporación de [3H]-timidina (CPM) y se muestra en la Figura 6A (Donante 1) y 6B (Donante 2). Estos datos muestran que los PBL transducidos con s SX-2 TCR, SSX-2 TCR con codones optimizados o SSX-2 TCR con codones optimizados incluyendo la región constante de ratón proliferan en respuesta al cocultivo con células COS-A2-SSX-2.
En otro experimento, los PBL transducidos como se describe en este ejemplo se cultivaron conjuntamente con células mel 1300, células mel 624, células mel 888, células mel SK 37 o células COS-A2-SSX-2. La proliferación se midió en términos de recuento de incorporación de [3H]-timidina por minuto (CPM) y se muestra en las Figuras 9A-9E. Estos datos muestran que los PBL transducidos con SSX-2 TCR, SSX-2 TCR con codones optimizados o SSX-2 TCR con codones optimizados incluida la región constante del ratón proliferan en respuesta al cultivo conjunto con células diana SSX-2+/HLA-A2+.
Ejemplo 9
Este ejemplo demuestra que los PBL modificados mediante ingeniería genética con el SSX-2 TCR, el SSX-2 TCR con codones optimizados, o la quimera de humano-ratón SSX-2 TCR con codones optimizados muestran actividad lítica específica contra las células diana SSX-2+/HLA-A2+.
Los PBL que no se transdujeron (UT) o que se transdujeron con un vector que comprende SEQ ID NO: 27 (SSX-2 TCR), SEQ ID NO: 29 (SSX-2 Tc R con codones optimizados) o SEQ ID NO: 30 (SSX-2 TCR con codones optimizados que incluye la región constante del ratón) se cultivaron conjuntamente con células diana 938 mel (HLA-A2-/SSX-2+), COS-A2, 938-A2 mel, COS-A2-SSX-2, 624 mel, 1300 mel, SK mel 37 u 888 mel a relaciones entre el efector y la diana establecidas en las Figuras 7A-D y 8A-D. El porcentaje de lisis de las células diana se midió y se muestra en las Figuras 7A-D y 8A-D. Las células no transducidas mostraron poca o ninguna reactividad. Estos datos muestran que los PBL modificados por ingeniería genética con el SSX-2 TCR, el SSX-2 TCR con codones optimizados o la quimera de humano-ratón SSX-2 TCR con codones optimizados muestran actividad lítica específica contra las células diana. SSX-2+/HLA-A2+.
Ejemplo 10
Este ejemplo demuestra que los PBL modificados mediante ingeniería genética con el SSX-2 TCR, el SSX-2 TCR con codones optimizados o la quimera de humano-ratón SSX-2 TCR con codones optimizados secretan citoquina cuando se cultivan conjuntamente con células T2 sometidas a pulsos de péptido.
Los PBL que no se transdujeron (UT) o se transdujeron con un vector que comprende SEQ ID NO: 27 (SSX-2 TCR), SEQ ID NO: 29 (SSX-2 t Cr con codones optimizados) o SEQ ID nO: 30 (SSX-2 TCR con codones optimizados incluyendo la región constante de ratón) se cultivaron conjuntamente con células T2 que se sometieron a pulsos con un SSX-2 y se sometieron a pulsos con concentraciones variables del péptido SSX-2: 41-49 (KASEKIFYV) (SEQ ID NO: 1). La Figura 10 representa los niveles de interferón-Y resultantes (pg/ml) que se midieron. Estos datos muestran que los PBL transducidos con SSX-2 TCR reconocen el péptido SSX-2: 41-49.
Ejemplo 11
Este ejemplo demuestra que el agente desmetilante, 5-aza-2'-desoxicitidina (DAC), mejora el reconocimiento de las células mel 1300 por el p Bl modificado mediante ingeniería genética por SSX2-TCR.
Los PBL transducidos con SSX-2 TCR de tres donantes se cultivaron conjuntamente con células mel 1300 sin DAC o con DAC 0,1 pM o 1,0 pM. La Figura 12 representa los niveles de interferón-Y resultantes (pg/ml) que se midieron. Estos datos muestran que el DAC mejora el reconocimiento de las células mel 1300 por el p Bl modificado mediante ingeniería genética por SSX2-TCR.
El objeto de la invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas. La invención proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos con codones optimizados que codifica un receptor de células T (TCR) que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 13-18 y que tiene especificidad antigénica por el punto de ruptura X del sarcoma sinovial (SSX)-2 (SEQ ID NO: 1), donde el TCR también reconoce a SSX-3 (SEQ ID NO: 3).
La invención proporciona además un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos con codones optimizados que codifica un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 13-18. La invención proporciona además un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos con codones optimizados que codifica una proteína que comprende: (a) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (b) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; o (c) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26.
La invención proporciona además un ácido nucleico aislado o purificado que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de los ácidos nucleicos proporcionados por la invención.
La invención proporciona además un ácido nucleico aislado o purificado que comprende una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de nucleótidos de los ácidos nucleicos proporcionados por la invención.
La invención proporciona además un vector de expresión recombinante que comprende un ácido nucleico proporcionado por la invención, opcionalmente donde el vector es un vector retroviral.
La invención proporciona además una célula hospedadora aislada que comprende el vector de expresión recombinante de la invención.
La invención proporciona además una población de células que comprenden al menos una célula hospedadora de la invención.
La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende (i) un ácido nucleico de la invención, el vector de expresión recombinante de la invención, la célula hospedadora de la invención o la población de células de la invención, y (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La invención proporciona además los ácidos nucleicos de la invención, el vector de expresión recombinante de la invención, la célula hospedadora de la invención, la población de células de la invención y la composición farmacéutica de la invención para su uso en un método para tratar o prevenir el cáncer en un hospedador.
La invención proporciona además el ácido nucleico, vector de expresión recombinante, célula hospedadora, población o composición farmacéutica para su uso en un método de tratamiento o prevención del cáncer en un hospedador, donde: (i) el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de cabeza y cuello, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, glioma, melanoma, cáncer renal, linfoma, cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de próstata, sarcoma sinovial, sarcoma osteogénico, leiomiosarcoma uterino y carcinoma hepatocelular; (ii) la célula hospedadora es una célula que es autóloga para el hospedador o las células de la población son células que son autólogas para el hospedador; y/o (iii) el método comprende además la administración de 5-aza-2'-desoxicitidina (DAC) al hospedador.
También se divulga:
1. Un receptor de células T aislado o purificado (TCR) que tiene especificidad antigénica por el punto de ruptura X del sarcoma sinovial (SSX)-2 (SEQ ID NO: 1).
2. El TCR de la divulgación 1, donde el TCR también reconoce uno cualquiera o más de SSX-3 (SEQ ID NO: 3), SSX-4 (SEQ ID NO: 4), SSX-5 (SEQ ID NO: 5), SSX-9 (SEQ ID NO: 6) y SSX-10 (SEQ ID NO: 7).
3. El TCR de cualquiera de las divulgaciones 1 o 2, donde el TCR tiene especificidad antigénica por un péptido SSX-2 que comprende KASEKIFYV (SEQ ID NO: 2).
4. El TCR de cualquiera de las divulgaciones 1-3, donde el TCR reconoce uno o más de KVSEKIVYV (SEQ ID NO: 8), KSSEKIVYV (SEQ ID NO: 9), KASEKIIYV (SEQ ID NO: 10), KSSEKIIYV (SEQ ID NO: 11) y KASEKILYV (SEQ ID NO: 12).
5. El TCR de cualquiera de las divulgaciones 1-4, donde el TCR comprende secuencias de aminoácidos que comprenden las SEQ ID NO: 13-18.
6. El TCR de cualquiera de las divulgaciones 1-5, donde el TCR comprende las SEQ ID NO: 19 y 20.
7. El TCR de la divulgación 6, donde el TCR también comprende las SEQ ID NO: 21 y 22.
8. El TCR de cualquiera de las divulgaciones 1-7, donde el TCR comprende:
a) las SEQ ID NO: 23 y 24 o
b) las SEQ ID NO: 25 y 26.
9. Un polipéptido aislado o purificado que comprende una porción funcional del TCR de cualquiera de las divulgaciones 1 a 8, donde la porción funcional comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 13-18.
10. El polipéptido aislado o purificado de la divulgación 9, donde la porción comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID nO: 19 y 20.
11. El polipéptido aislado o purificado de la divulgación 10, que comprende:
a) las SEQ ID NO: 23 y 24; o
b) las SEQ ID NO: 25 y 26.
12. Una proteína aislada o purificada que comprende al menos uno de los polipéptidos de cualquiera de las divulgaciones 9-11.
13. La proteína aislada o purificada de la divulgación 12, que comprende una primera cadena polipeptídica que comprende la SEQ ID NO: 19 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la SEQ ID NO: 20.
14. La proteína aislada o purificada de la divulgación 13, que comprende
a) una primera cadena polipeptídica que comprende la SEQ ID NO: 23 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la SEQ ID NO: 24; o
b) una primera cadena polipeptídica que comprende la SEQ ID NO: 25 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la SEQ ID NO: 26.
15. La proteína aislada o purificada de cualquiera de las divulgaciones 12-14, donde la proteína es una proteína de fusión.
16. La proteína aislada o purificada de cualquiera de las divulgaciones 12-15, donde la proteína es un anticuerpo recombinante.
17. Un anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, que se une de forma específica a una porción funcional del TCR de cualquiera de las divulgaciones 1 a 8, donde la porción funcional comprende las secuencias

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos con codones optimizados que codifica un receptor de células T (TCR) que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 13-18 y que tiene especificidad antigénica por el punto de ruptura X del sarcoma sinovial (SSX)-2 (SEQ ID NO: 1), donde el TCR también reconoce a SSX-3 (SeQ ID NO: 3).
2. El ácido nucleico de la reivindicación 1, donde el TCR:
(a) también reconoce uno o más de SSX-4 (SEQ ID NO: 4), SSX-5 (SEQ ID NO: 5), SSX-9 (SEQ ID NO: 6) y SSX-10 (SEQ ID NO: 7);
(b) tiene especificidad antigénica por un péptido SSX-2 que comprende KASEKIFYV (SEQ ID NO: 2);
(c) reconoce uno o más de KVSEKIVYV (SEQ ID NO: 8), KSSEKIVYV (SEQ ID NO: 9), KASEKIIYV (SEQ ID NO: 10), KSSEKIIYV (SEQ ID NO: 11) y KASEKILYV (SEQ ID NO: 12);
(d) comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y 20;
(e) comprende además las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 y 22;
(f) comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y 24; o
(g) comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y 26.
3. Un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos con codones optimizados que codifica un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 13-18.
4. El ácido nucleico de la reivindicación 3, donde el polipéptido comprende las secuencias de aminoácidos de:
(a) SEQ ID NO: 19 y 20;
(b) SEQ ID NO: 23 y 24; o
(c) SEQ ID NO: 25 y 26.
5. Un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos con codones optimizados que codifica una proteína que comprende:
(a) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20;
(b) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; o
(c) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26.
6. El ácido nucleico de la reivindicación 5, donde la proteína es:
(a) una proteína de fusión; y/o
(b) un anticuerpo recombinante.
7. Un ácido nucleico aislado o purificado que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
8. Un ácido nucleico aislado o purificado que comprende una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
9. Un vector de expresión recombinante que comprende el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, opcionalmente donde el vector es un vector retroviral.
10. Una célula hospedadora aislada que comprende el vector de expresión recombinante de la reivindicación 9.
11. La célula hospedadora aislada de la reivindicación 10, donde la célula es:
(a) un linfocito de sangre periférica (PBL);
(b) un linfocito T CD8+; o
(c) un linfocito T CD4+.
12. Una población de células que comprende al menos una célula hospedadora de la reivindicación 10 u 11.
13. Una composición farmacéutica que comprende (i) el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, el vector de expresión recombinante de la reivindicación 9, la célula hospedadora de la reivindicación 10 u 11 o la población de células de la reivindicación 12, y (ii) un portador farmacéuticamente aceptable.
14. El ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, el vector de expresión recombinante de la reivindicación 9, la célula hospedadora de la reivindicación 10 u 11, la población de células de la reivindicación 12 o la composición farmacéutica de la reivindicación 13, para uso en un método para el tratamiento o la prevención de cáncer en un hospedador.
15. El ácido nucleico, vector de expresión recombinante, célula hospedadora, población o composición farmacéutica para uso según la reivindicación 14, donde:
(i) el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de cabeza y cuello, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, glioma, melanoma, cáncer renal, linfoma, cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de próstata, sarcoma sinovial, sarcoma osteogénico, leiomiosarcoma uterino y carcinoma hepatocelular;
(ii) la célula hospedadora es una célula que es autóloga para el hospedador o las células de la población son células que son autólogas para el hospedador; y/o
(iii) el método comprende además la administración de 5-aza-2'-desoxicitidina (DAC) al hospedador.
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