CN117659205A - 一种分选激活磁珠的偶联方法及应用 - Google Patents

一种分选激活磁珠的偶联方法及应用 Download PDF

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CN117659205A CN202311656536.4A CN202311656536A CN117659205A CN 117659205 A CN117659205 A CN 117659205A CN 202311656536 A CN202311656536 A CN 202311656536A CN 117659205 A CN117659205 A CN 117659205A
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邱志宇
王巧玲
乔倩
杨丽微
陈晓通
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Abstract

本发明公开了一种分选激活磁珠的偶联方法及应用，本发明提供了一种磁珠的偶联方法，本发明还提供了一种根据磁珠的偶联方法得到的分选激活磁珠。本发明提供了一种所述的磁珠的偶联方法获得的分选激活磁珠在制备产品中的应用。本发明还提供了一种根据磁珠的偶联方法获得的分选激活磁珠在促进T细胞分选、激活和/或扩增中的应用。本发明还提供了一种根据磁珠的偶联方法获得的分选激活磁珠在提升T细胞纯度中的应用。

Description

一种分选激活磁珠的偶联方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种分选激活磁珠的偶联方法及应用，具体涉及CD3/CD28。
背景技术
磁珠偶联技术是以生物学为基础，生物信息学、临床医学、材料学等交叉学科共同组成，其主要应用于细胞分离、蛋白质及核酸纯化、免疫检测等等，随着磁珠偶联技术日趋成熟，以及细胞治疗领域的快速发展，为磁珠偶联抗体领域带来了广大的应用前景。
磁珠可根据结构不同分为三类：1.核壳式：磁珠最早采用的结构，聚合物完全包被磁珠内核的磁性颗粒。2.夹心式：磁珠内核及外层结构为聚合物，中间层为磁性颗粒，工艺难度相对核壳式更高。3.弥散式：磁性颗粒随机分布于聚合物微球中，是目前较为成熟的工艺。
相较于琼脂糖珠，磁珠作为整个免疫反应的载体具有显著优越性：
1)与琼脂糖珠磁珠海绵状多孔结构不同，磁珠表面粗糙程度较低，抗体只结合于磁珠表面，可提高抗体与磁珠的结合效率，减少非特异性结合。
2)通过磁性分离能够快速富集免疫磁珠，大大缩短反应时间。由于吸取上清时不需要离心，所以还能够降低免疫磁珠丢失的概率。
3)粒径较小的纳米磁珠呈胶体状，能够均匀悬浮于反应溶液中，增加免疫磁珠与样本的接触机会，从而加快反应速度，提高免疫磁珠与样本的结合效率。
4)磁珠具有磁响应性(又称超顺磁性)，可以通过外加磁场收集磁珠，撤除磁场后磁珠的磁性消失，随后重新均匀分散在溶液中。且磁珠能够通过共聚及表面改性等方法赋予其表面功能基，例如羟基、羧基、巯基和氨基等功能基团，通过这些基团可以和目的分子进行特异性的结合。
发明内容
为了解决现有技术中存在的技术问题，提供以下技术方案：
本发明提供了一种磁珠的偶联方法，所述偶联方法包括：
1)磁珠充分混匀，加入不同pH值的MES buffer重悬，混匀，磁力架上静置后弃上清，重复步骤1)多次；
2)加入与步骤1)对应pH值的MES buffer重悬，加入EDC，混匀1h；
3)加入PBS重悬，混匀，磁力架上静置后弃上清，重复步骤3)多次；
4)加入PBS重悬磁珠，加入NHS，混匀1h；
5)加入PBS重悬，混匀，磁力架上静置后弃上清，重复步骤5)多次；
6)加入PBS重悬磁珠，加入CD3、CD28单克隆抗体原液，混匀2.5h，磁力架上静置后弃上清；
7)加入PBS重悬，混匀，磁力架上静置后弃上清，重复步骤7)多次；
8)加入封闭buffer重悬磁珠，混匀1h；
9)磁力架上静置后弃上清；
10)加入保存液buffer重悬，混匀，磁力架上静置后弃上清，重复步骤10)多次；
11)加入保存液buffer重悬磁珠，得到偶联磁珠。
在某些具体的实施方案中，所述磁珠原料为1-10μm粒径，在某个具体的实施方案中，所述磁珠原料为1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、5.5μm、6μm、6.5μm、7μm、7.5μm、8μm、8.5μm、9μm、9.5μm、10μm。
术语“磁珠”是指具有超强的顺磁性的细小粒径的微球，在磁场中能够迅速聚集，离开磁场后又能够有助于磁分离地均匀分散。其次，具有合适的且差别较小的粒径，保证了足够强的磁响应性又不会沉降。再次，具有丰富的表面活性基团，以便可以和生化物质偶联，并在外磁场的作用下实现与被待测样品的分离。与传统的分离方法相比，把磁珠用于生化样品复杂组分的分离，能够实现分离和富集的同时进行，有效地提高了分离速度和富集效率，同时也使分析检测的灵敏度大大提升。
进一步，所述磁珠包括氨基磁珠、羧基磁珠、环氧基磁珠、巯基磁珠、无包被磁珠。
在某些具体的实施方案中，所述磁珠为羧基磁珠。
术语“重悬”是指在进行洗涤时故意将沉降的沉淀物放回到悬液中并将其保持在悬液中的行为。
术语“CD3抗体”、“CD3单克隆抗体”通常是指能够特异性识别CD3亚基(例如，CD3epsilon、CD3 gamma、CD3 delta，或上述的复合物)的抗体，该抗体可以为只能够识别CD3的单克隆抗体，或者是可以同时识别CD3和其他靶点的多靶点抗体。
术语“CD28抗体”、“CD28单克隆抗体”通常是指能够特异性识别CD28亚基(例如，CD28 epsilon、CD28 gamma、CD28 delta，或上述的复合物)的抗体，该抗体可以为只能够识别CD28的单克隆抗体，或者是可以同时识别CD28和其他靶点的多靶点抗体。
在本申请中，术语“CD3”、“CD28”指来自任何脊椎动物来源的任何天然CD3/CD28，包括哺乳动物，诸如灵长动物(例如人)，非人灵长动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖“全长”和未加工的CD3/CD28蛋白质以及源自细胞中加工的任何形式的蛋白质或一种或多种CD3/CD28链(多肽)(例如成熟多肽)。该术语还涵盖CD3/CD28的天然发生变体和同等型，例如剪接变体或等位变体。
同样的，本申请的术语“CD3 epsilon”、“CD28 epsilon”、“CD3 gamma”、“CD28gamma”、“CD3 delta”和/或“CD28 delta”指来自任何脊椎动物来源的任何天然CD3/CD28，包括哺乳动物，诸如灵长动物(例如人)，非人灵长动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。“CD3 epsilon”、“CD28 epsilon”、“CD3 gamma”、“CD28 gamma”、“CD3delta”和/或“CD28 delta”分别涵盖“全长”和未加工的“CD3 epsilon”、“CD28 epsilon”、“CD3 gamma”、“CD28 gamma”、“CD3 delta”和/或“CD28 delta”蛋白质以及源自细胞中加工的任何形式的CD3/CD28链(多肽)(例如成熟多肽)。该术语还涵盖CD3/CD28链的天然发生变体和同等型，例如剪接变体或等位变体。
术语“CD28”是指蛋白质分化抗原簇28，其是在T细胞上表达的提供T细胞活化和存活所需的共刺激信号的蛋白质之一。
术语“CD3”是指一种多聚体蛋白复合物，历史上称为T3复合物，由4条不同的多肽链组成。ε(ε)、γ(γ)、δ(δ)和ζ(ζ)，它们组装并作为三对二聚体(εγ、εδ、ζζ)发挥作用。
进一步，所述偶联方法步骤1)中pH值范围为4.5-6.5。
在某些具体的实施方案中，所述MES buffer的pH值为4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5。在某个优选的实施方案中，所述MES buffer的pH值为5.5-6.0。
进一步，所述步骤1)中重悬所用的MES buffer与加入的磁珠的比值为1mL：100μL。
进一步，所述步骤1)加入MES buffer后混匀方式为上下颠倒混匀。
进一步，所述步骤2)中MES buffer与步骤1)加入的磁珠的比值为300μL：100μL。
进一步，所述步骤2)中EDC与步骤1)加入的磁珠的比值为10-50μL：100μL。
在某些具体的实施方案中，所述EDC与步骤1)中的磁珠的比值为10μL：100μL，20μL：100μL，30μL：100μL，40μL：100μL，50μL：100μL。在某个具体的实施方案中，所述EDC与步骤1)中的磁珠的比值为30μL：100μL。
进一步，所述步骤2)中混匀方式为室温震荡混匀。
进一步，所述步骤3)中PBS与步骤1)加入的磁珠的比值为1mL：100μL。
进一步，所述步骤3)中混匀方式为上下颠倒混匀。
进一步，所述步骤4)中PBS与步骤1)加入的磁珠的比值为300μL：100μL。
进一步，所述步骤4)中NHS与步骤1)加入的磁珠的比值为10-100μL：100μL。
在某些具体的实施方案中，所述NHS与步骤1)中的磁珠的比值为10μL：100μL，20μL：100μL，30μL：100μL，40μL：100μL，50μL：100μL，60μL：100μL，70μL：100μL，80μL：100μL，90μL：100μL，100μL：100μL。在某些优选的实施方案中，所述NHS与步骤1)中的磁珠的比值为30-100μL：100μL，在某个更优选的实施方案中，所述NHS与步骤1)中的磁珠的比值为30μL：100μL。
进一步，所述步骤4)中混匀方式为室温震荡混匀。
进一步，所述步骤5)中PBS与步骤1)加入的磁珠的比值为1mL：100μL。
进一步，所述步骤5)中混匀方式为上下颠倒混匀。
进一步，所述步骤6)中PBS与步骤1)加入的磁珠的比值为600μL：100μL。
进一步，所述步骤6)中CD3、CD28与步骤1)加入的磁珠的比值为200-300μL：200-100μL：100μL。
在某些具体的实施方案中，所述CD3与CD28的添加量在1-3:1，具体的包括1:1，2:1，3:1。在某个优选的实施方案中，所述CD3与CD28的添加量为1:1。
进一步，所述步骤6)中CD3的浓度为1-5mg/mL。
进一步，所述步骤6)中CD28的浓度为1-5mg/mL。
在某些具体的实施方案中，所述CD3的浓度为1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL。在某个具体的实施方案中，所述CD3的浓度为3mg/mL。
在某些具体的实施方案中，所述CD28的浓度为1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL。在某个具体的实施方案中，所述CD28的浓度为3mg/mL。
进一步，所述步骤6)中混匀方式为2-8℃震荡混匀。
进一步，所述步骤7)中PBS与步骤1)加入的磁珠的比值为1mL：100μL。
进一步，所述步骤7)中混匀方式为上下颠倒混匀。
进一步，所述步骤8)中封闭buffer与步骤1)加入的磁珠的比值为1mL：100μL。
进一步，所述步骤8)中混匀方式为2-8℃震荡混匀。
进一步，所述步骤10)中保存液buffer与步骤1)加入的磁珠的比值为1mL：100μL。
进一步，所述步骤10)中混匀方式为上下颠倒混匀。
进一步，所述步骤11)保存液buffer与步骤1)加入的磁珠的比值为200μL：200μL。
进一步，所述MES buffer组分为MES：注射用水＝1.59g：50mL，pH值调整为4.5-6.5。
进一步，所述PBS组分为NaCl：KCl：Na2HPO4：KH2PO4：注射用水＝8g：0.2g：1.44g：0.24g：1L。
进一步，所述步骤2)中EDC的浓度为1mg/mL，1mg/mL EDC的组分为EDC：MES＝0.01g：10mL，所述EDC需要即用即配。
进一步，所述步骤4)中NHS的浓度为1mg/mL，所述1mg/mL NHS的组分为NHS：PBS＝0.01g：10mL，所述NHS需要即用即配。
进一步，所述封闭buffer的组分为20mM PBS、1％ BSA。
进一步，所述保存液buffer的组分为20mM PBS、5％ BSA。
术语“粒径”、“粒度”是指颗粒图像的平均直径，其由电子显微镜或光学显微镜所观察。除非另行指出，否则术语“粒径”以这种方式使用。除非另行指出，否则术语“平均粒径”意指颗粒(对于具有至少500nm的平均粒度的颗粒)的集合的平均粒度，或者使用球形模型，由使用与完全致密颗粒(对于具有小于500nm的平均粒度的颗粒)一致的Brunauer-Emmett-Teller method(BET法)所测定的颗粒的比表面积(以m2/g测量)进行计算的。
本发明提供了一种根据前面所述的磁珠的偶联方法获得的分选激活磁珠。
本发明提供了一种根据前面所述的磁珠的偶联方法获得的分选激活磁珠在制备产品中的应用。
进一步，所述产品包括试剂、试剂盒、层析试纸。
本发明提供了一种根据前面所述的磁珠的偶联方法获得的分选激活磁珠在促进T细胞分选、激活和/或扩增中的应用。
本发明提供了一种根据前面所述的磁珠的偶联方法获得的分选激活磁珠在提升T细胞纯度中的应用。
在本申请中，术语“抗体”通常是指一种能够特异性识别和/或中和特定抗原的多肽分子。例如，抗体可包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链组成的免疫球蛋白，并且包括任何包含其抗原结合部分的分子。术语“抗体”包括单克隆抗体、抗体片段或抗体衍生物，包括但不限于人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单域抗体(例如，dAb)，单链抗体(例如，scFv)，以及与抗原结合的抗体片段(例如，Fab、Fab’和(Fab)2片段)。术语“抗体”还包括抗体的所有重组体形式，例如在原核细胞中表达的抗体、未糖基化的抗体以及本申请所述的任何与抗原结合的抗体片段及其衍生物。每条重链可由重链可变区(VH)和重链恒定区构成。每条轻链可由轻链可变区(VL)和轻链恒定区构成。VH和VL区可进一步被区分为称为互补决定区(CDR)的高变区，它们散布在称为构架区(FR)的更保守的区域中。每个VH和VL可由三个CDR和四个FR区构成，它们从氨基端至羧基端可按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。
术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体的群体获得的相同抗体，即构成所述群体的每个抗体，但不包括可能以少量存在的可能的天然存在的突变。单克隆抗体具有高度特异性并且是针对单一抗原位点诱导的。
在本申请中，术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项的两项。
在本申请中，术语“包含”通常是指包括明确指定的特征，但不排除其他要素。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
附图说明
图1是实施例1方法得到的磁珠的分选效率图
图2是实施例1方法得到的磁珠的激活效率图；
图3是实施例1方法得到的磁珠的扩增倍数图；
图4是实施例2方法得到的磁珠的分选效率图；
图5是实施例2方法得到的磁珠的激活效率图；
图6是实施例2方法得到的磁珠的扩增倍数图；
图7是实施例3方法得到的磁珠的分选效率图；
图8是实施例3方法得到的磁珠的激活效率图；
图9是实施例3方法得到的磁珠的扩增倍数图；
图10是实施例4方法得到的磁珠的分选效率图；
图11是实施例4方法得到的磁珠的激活效率图；
图12是实施例4方法得到的磁珠的扩增倍数图；
图13是实施例5方法得到的磁珠的分选效率图；
图14是实施例5方法得到的磁珠的激活效率图；
图15是实施例5方法得到的磁珠的扩增倍数图；
图16是实施例6方法得到的磁珠的分选效率图；
图17是实施例6方法得到的磁珠的激活效率图；
图18是实施例6方法得到的磁珠的扩增倍数图。
具体实施方式
除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式完整地并入。此外，本文中所述的材料、方法和例子仅是说明性的并且不意在是限制性的。本发明的其他特征、目的和优点将从本说明书及附图并且从后附的权利要求书中显而易见。
为了解决T细胞分选、激活、扩增的问题，本发明通过磁珠偶联抗体技术，将CD3和CD28抗体与磁珠进行化学偶联。通过CD3/CD28免疫磁珠(以下简称免疫磁珠)与细胞共孵育，免疫磁珠特异性结合T细胞，通过磁分离技术分离纯化T细胞，提高T细胞纯度。免疫磁珠中具有激活T细胞的第一信使CD3以及第二信使CD28，能够快速对T细胞进行激活，促进T细胞的扩增。
实施例1
1、实验材料
羧基磁珠(裸珠)、MES buffer、CB buffer、封闭液buffer、保存液buffer、抗人CD3单克隆抗体、抗人CD28单克隆抗体、EDC、NHS、
2、试剂配制
1)MES buffer(分子量：213.25)：称量MES1.59g，溶于50mL注射用水，NaOH调整pH值至pH 4.5～6.5。
2)1mg/mL EDC：0.01g EDC干粉溶于10mL的0.15M MES(现用现配)。
3)1mg/mL NHS：0.01g NHS干粉溶于10mL的20mM PBS(现用现配)。
4)PBS：NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO4 1.44g、KH2PO4 0.24g，溶于1L注射用水。
5)封闭液：20mM PBS+1％ BSA。
6)保存液：20mM PBS+5‰BSA。
3、实验方法
(1)磁珠偶联
1)从2～8℃冰箱中取出羧基磁珠，旋涡震荡仪充分混匀1min。
2)把羧基磁珠放入生物安全柜，上下颠倒充分混匀后，取出100μL羧基磁珠，放入无菌1.5mL Ep管，并按如下实验方案，加入1mL不同pH值的MESbuffer重悬，详情如表1所示，上下颠倒混匀。
表1
组1 组2 组3 组4 组5
MES pH值 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
3)将Ep管放磁力架上，静置1min后弃上清。
4)将管子从磁力架上移下来，加入1mL相应pH值的MES buffer重悬，上下颠倒混匀。
5)重复步骤3)、步骤4)；
6)将Ep管放磁力架上，静置1min，弃上清，尽量吸净，加入300μL相应pH值的MESbuffer重悬磁珠。
7)加入30μL 1mg/mL EDC，室温震荡混匀1h。
8)加入1mL PBS重悬，将Ep管放磁力架上，静置1min后弃上清。
9)将管子从磁力架上移下来，加入1mL PBS重悬，上下颠倒混匀，将Ep管放磁力架上，静置1min后弃上清。
10)重复步骤9)2次。
11)300μL PBS重悬磁珠，加入30μL 1mg/mL NHS，室温震荡混匀1h。
12)加入1mL PBS重悬，将Ep管放磁力架上，静置1min后弃上清。
13)将管子从磁力架上移下来，加入1mL PBS重悬，上下颠倒混匀，将Ep管放磁力架上，静置1min后弃上清。
14)重复步骤13)2次，加入1mL PBS重悬磁珠。
15)将Ep管移下磁力架，加入600μL PBS重悬磁珠，随后各加入200μL浓度为1mg/mL的CD3、CD28单克隆抗体原液。
16)上下颠倒混匀，2～8℃震荡混匀2.5h。
17)将Ep管放磁力架上，静置1min后弃上清。
18)将管子从磁力架上移下来，加入1mL PBS重悬，上下颠倒混匀。
19)重复步骤17)、步骤18)；
20)将Ep管放磁力架上，静置1min，弃上清，尽量吸净，1mL封闭buffer重悬磁珠。
21)2～8℃震荡混匀1h。
22)将Ep管放磁力架上，静置1min后弃上清。
23)将管子从磁力架上移下来，加入1mL保存液buffer重悬，上下颠倒混匀。
24)重复步骤22)、步骤23)2次；
25)将Ep管放磁力架上，静置1min，弃上清，尽量吸净，200μL保存液buffer重悬磁珠。
26)若不进行下一步可用封口膜缠好管口，放入4℃保存。
(2)磁珠活性测试
1)将人的PBMC细胞重悬于含1％ HSA的PBS缓冲液中，取样计数并标记CD3进行流式检测。
2)根据PBMC细胞CD3阳性率，用含1％ HSA的PBS缓冲液调节CD3+T细胞密度至1×107cells/mL。
3)重悬磁珠(涡旋不低于30s，或者颠倒混匀5min)。
4)按照磁珠数和CD3+T细胞孵育比例1:1的关系转移到离心管中。
5)向上述离心管中加入l mL含1％ HSA的PBS缓冲液，将磁珠进行重悬，吹打或涡旋进行润洗。
6)将上述装有重悬磁珠的离心管放在磁力架(磁珠专用)上，静置1min，弃去上清，注意不要吸取到磁珠。
7)向上述洗涤后的磁珠中按比例加入调整好CD3+T细胞密度的PBMC，混合均匀。
8)将上述离心管置于转速15～30rpm的混样仪上，室温孵育30min。
9)将上述离心管放在磁力架(磁珠专用)上，静置1min，收集上清并进行计数和流式检测，标记CD3。
10)用含200IU/mL rh IL-2的完全培养基重悬磁珠和细胞的混合物，并调整细胞密度为1×106cells/mL。
11)将上述细胞悬液置于细胞培养容器中，于37℃，5％ CO2培养箱中培养48h，取样去除磁珠后计数并测试激活效率(CD69+CD25+百分比)。
12)观察细胞状态并定期补液，当细胞密度超过2.5×106cells/mL或培养基变黄时，调整细胞密度至1×106cells/mL。将细胞培养至14天即可收获细胞。
4、实验结果
1)分选效率
如图1所示，随着MES溶液pH值逐渐升高，当MES pH值在6.0时，分选效率最高，说明EDC与磁珠上的羧基反应最适pH值为6.0。具体各组分选效率如表2所示。
表2分选效率
组1 组2 组3 组4 组5
20.54 40.82 85.08 98.22 90.31
30.58 48.93 90.58 94.54 85.37
2)激活效率
如图2所示，组1～组5激活效率无明显差异，说明MES的pH值对于激活效率无影响。具体激活效率如表3所示。
表3激活效率
组1 组2 组3 组4 组5
80.2 79.1 82.6 81.7 82.5
84.39 82.54 88.49 83.49 87.43
3)扩增倍数
如图3所示，组3、组4扩增倍数高于其他组别，说明MES的pH值在5.5～6.0之间，扩增倍数均可。具体扩增倍数如表4所示。
表4扩增倍数
综上所述，实施例1通过不同MES的pH值优化EDC与磁珠上的羧基反应，通过分选效率、激活效率、扩增倍数3项指标进行分析，对比实验数据时发现，当MES的pH值为6.0时，各项指标数据较优，因此能够得出结论：当MES的pH值为6.0时，为本实验最优条件。
实施例2
1、实验材料
羧基磁珠(裸珠)、MES buffer、CB buffer、封闭液buffer、保存液buffer、抗人CD3单克隆抗体、抗人CD28单克隆抗体、EDC、NHS、
2、试剂配制
同实施例1试剂配制。
3、实验方法
(1)磁珠偶联
1)按照实验方案从2～8℃冰箱中取出羧基磁珠，旋涡震荡仪充分混匀1min。
2)把羧基磁珠放入生物安全柜，上下颠倒充分混匀后，取出100μL羧基磁珠，放入无菌1.5mL Ep管，加入1mL MES buffer重悬，上下颠倒混匀。
3)将Ep管放磁力架上，静置1min后弃上清。
4)将管子从磁力架上移下来，加入1mL MES buffer重悬，上下颠倒混匀。
5)重复步骤3)、步骤4)；
6)将Ep管放磁力架上，静置1min，弃上清，尽量吸净，300μL MES buffer重悬磁珠。
7)按表5所述实验方案，加入不同体积的EDC，室温震荡混匀1h。
表5
组1 组2 组3 组4
EDC加入量 10μL 30μL 50μL 100μL
8)加入1mL PBS重悬，将Ep管放磁力架上，静置1min后弃上清。
9)将管子从磁力架上移下来，加入1mL PBS重悬，上下颠倒混匀，将Ep管放磁力架上，静置1min后弃上清。
10)重复步骤9)2次。
11)300μL PBS重悬磁珠，加入30μL 1mg/mL NHS，室温震荡混匀1h。
12)加入1mL PBS重悬，将Ep管放磁力架上，静置1min后弃上清。
13)将管子从磁力架上移下来，加入1mL PBS重悬，上下颠倒混匀，将Ep管放磁力架上，静置1min后弃上清。
14)重复步骤13)2次，加入1mL PBS重悬磁珠。
15)将Ep管移下磁力架，加入600μL PBS重悬磁珠，随后各加入200μL浓度为1mg/mL的CD3、CD28单克隆抗体原液。
16)上下颠倒混匀，2～8℃震荡混匀2.5h。
17)将Ep管放磁力架上，静置1min后弃上清。
18)将管子从磁力架上移下来，加入1mL PBS重悬，上下颠倒混匀。
19)重复步骤17)、步骤18)；
20)将Ep管放磁力架上，静置1min，弃上清，尽量吸净，1mL封闭buffer重悬磁珠。
21)2～8℃震荡混匀1h。
22)将Ep管放磁力架上，静置1min后弃上清。
23)将管子从磁力架上移下来，加入1mL保存液buffer重悬，上下颠倒混匀。
24)重复步骤22)、步骤23)2次；
25)将Ep管放磁力架上，静置1min，弃上清，尽量吸净，200μL保存液buffer重悬磁珠。
26)若不进行下一步可用封口膜缠好管口，放入4℃保存。
(2)磁珠活性测试
步骤同实施例1磁珠活性测试。
4、实验结果
1)分选效率
如图4所示，随着EDC的添加量逐渐升高，分选效率逐步提高。具体各组分选效率如表6所示。
表6分选效率
组1 组2 组3 组4
33.3 45.71 54.15 60.42
31.88 51.74 56.12 63.19
2)激活效率
如图5所示，组1～组3激活效率无明显差异，组4激活效率下降。说明1mg/mL的EDC添加量在10μL～50μL之间对于激活效率无影响。具体结果如表7所示。
表7激活效率
组1 组2 组3 组4
77 73.3 79.5 68.15
80.6 82.6 77.4 64.42
3)扩增倍数
如图6所示，组2、组3扩增倍数高于组1、组4，说明1mg/mL的EDC添加量在10μL～50μL均可。具体扩增倍数如表8所示。
表8扩增倍数
综上所述，实施例2通过不同EDC添加量进行CD3/CD28抗体与磁珠的偶联反应，综合分选效率、激活效率、扩增倍数实验数据发现，当1mg/mL EDC添加30μL～50μL时，结果较好，结合成本因素，因此能够得出结论：1mg/mL EDC添加30μL时，为本实验最优条件。
实施例3
1、实验材料
羧基磁珠(裸珠)、MES buffer、CB buffer、封闭液buffer、保存液buffer、抗人CD3单克隆抗体、抗人CD28单克隆抗体、EDC、NHS、
2、试剂配制
同实施例1试剂配制。
3、实验方法
1)按照实验方案从2～8℃冰箱中取出羧基磁珠，旋涡震荡仪充分混匀1min。
2)把羧基磁珠放入生物安全柜，上下颠倒充分混匀后，取出100μL羧基磁珠，放入无菌1.5mL Ep管，加入1mL MES buffer重悬，上下颠倒混匀。
3)将Ep管放磁力架上，静置1min后弃上清。
4)将管子从磁力架上移下来，加入1mL MES buffer重悬，上下颠倒混匀。
5)重复步骤3)、步骤4)；
6)将Ep管放磁力架上，静置1min，弃上清，尽量吸净，300μL MES buffer重悬磁珠。
7)加入30μL 1mg/mL EDC，室温震荡混匀1h。
8)加入1mL PBS重悬，将Ep管放磁力架上，静置1min后弃上清。
9)将管子从磁力架上移下来，加入1mL PBS重悬，上下颠倒混匀，将Ep管放磁力架上，静置1min后弃上清。
10)重复步骤9)2次。
11)300μL PBS重悬磁珠，按表9加入NHS，室温震荡混匀1h。
表9
组1 组2 组3 组4
NHS加入量 10μL 30μL 50μL 100μL
12)加入1 mL PBS重悬，将Ep管放磁力架上，静置1 min后弃上清。
13)将管子从磁力架上移下来，加入1 mL PBS重悬，上下颠倒混匀，将Ep管放磁力架上，静置1 min后弃上清。
14)重复步骤13)2次，加入1 mL PBS重悬磁珠。
15)将Ep管移下磁力架，加入600μL PBS重悬磁珠，随后各加入200μL浓度为1 mg/mL的CD3、CD28单克隆抗体原液。
16)上下颠倒混匀，2～8℃震荡混匀2.5 h。
17)将Ep管放磁力架上，静置1 min后弃上清。
18)将管子从磁力架上移下来，加入1 mL PBS重悬，上下颠倒混匀。
19)重复步骤17)、步骤18)；
20)将Ep管放磁力架上，静置1 min，弃上清，尽量吸净，1 mL封闭buffer重悬磁珠。
21)2～8℃震荡混匀1 h。
22)将Ep管放磁力架上，静置1 min后弃上清。
23)将管子从磁力架上移下来，加入1 mL保存液buffer重悬，上下颠倒混匀。
24)重复步骤22)、步骤23)2次；
25)将Ep管放磁力架上，静置1 min，弃上清，尽量吸净，200μL保存液buffer重悬磁珠。
26)若不进行下一步可用封口膜缠好管口，放入4℃保存。
(2)磁珠活性测试
步骤同实施例1磁珠活性测试。
4、实验结果
1)分选效率
如图7所示，随着NHS的添加量逐渐升高，分选效率逐步提高。各组具体分选效率如表10所示。
表10分选效率
组1 组2 组3 组4
44.32 58.67 67.97 62.05
46.32 54.67 59.97 60.05
2)激活效率
如图8所示，组1～组4激活效率无明显差异，说明1mg/mL NHS添加量在10μL～100μL之间对于激活效率无影响。各组具体激活效率如表11所示。
表11激活效率
组1 组2 组3 组4
77.7 84.7 83.4 78.15
70.43 82.8 78.4 72.42
3)扩增倍数
如图9所示，组1扩增倍数较低，组2～组4条件扩增倍数无明显差异，说明1mg/mL的NHS添加量在30μL～100μL均可。各组具体扩增倍数如表12所示。
表12扩增倍数
综上所述，实施例3通过不同NHS添加量进行CD3/CD28抗体与磁珠的偶联反应，综合分选效率、激活效率、扩增倍数实验数据发现，当1mg/mL NHS添加30μL～100μL时，结果较好，结合成本因素，因此能够得出结论：1mg/mL NHS添加30μL时，为本实验最优条件。
实施例4
1、实验材料
羧基磁珠(裸珠)、MES buffer、CB buffer、封闭液buffer、保存液buffer、抗人CD3单克隆抗体、抗人CD28单克隆抗体、EDC、NHS、
2、试剂配制
同实施例1试剂配制。
3、实验方法
(1)磁珠偶联
1)按照实验方案从2～8℃冰箱中取出羧基磁珠，旋涡震荡仪充分混匀1min。
2)把羧基磁珠放入生物安全柜，上下颠倒充分混匀后，取出100μL羧基磁珠，放入无菌1.5mL Ep管，加入1mL MES buffer重悬，上下颠倒混匀。
3)将Ep管放磁力架上，静置1min后弃上清。
4)将管子从磁力架上移下来，加入1mL MES buffer重悬，上下颠倒混匀。
5)重复步骤3)、步骤4)；
6)将Ep管放磁力架上，静置1min，弃上清，尽量吸净，300μL MES buffer重悬磁珠。
7)加入30μL 1mg/mL EDC，室温震荡混匀1h。
8)加入1mL PBS重悬，将Ep管放磁力架上，静置1min后弃上清。
9)将管子从磁力架上移下来，加入1mL PBS重悬，上下颠倒混匀，将Ep管放磁力架上，静置1min后弃上清。
10)重复步骤9)2次。
11)300μL PBS重悬磁珠，加入30μL 1mg/mL NHS，室温震荡混匀1h。
12)加入1mL PBS重悬，将Ep管放磁力架上，静置1min后弃上清。
13)将管子从磁力架上移下来，加入1mL PBS重悬，上下颠倒混匀，将Ep管放磁力架上，静置1min后弃上清。
14)重复步骤13)2次，加入1mL PBS重悬磁珠。
15)将Ep管移下磁力架，加入600μL PBS重悬磁珠，并按表13加入不同浓度的CD3/CD28单克隆抗体原液。
表13
组1 组2 组3 组4
CD3/CD28单克隆抗体原液浓度 0.5mg/mL 1mg/mL 3mg/mL 5mg/mL
CD3单克隆抗体原液加入量 200μL 200μL 200μL 200μL
CD28单克隆抗体原液加入量 200μL 200μL 200μL 200μL
16)上下颠倒混匀，2～8℃震荡混匀2.5h。
17)将Ep管放磁力架上，静置1min后弃上清。
18)将管子从磁力架上移下来，加入1mL PBS重悬，上下颠倒混匀。
19)重复步骤17)、步骤18)；
20)将Ep管放磁力架上，静置1min，弃上清，尽量吸净，1mL封闭buffer重悬磁珠。
21)2～8℃震荡混匀1h。
22)将Ep管放磁力架上，静置1min后弃上清。
23)将管子从磁力架上移下来，加入1mL保存液buffer重悬，上下颠倒混匀。
24)重复步骤22)、步骤23)2次；
25)将Ep管放磁力架上，静置1min，弃上清，尽量吸净，200μL保存液buffer重悬磁珠。
26)若不进行下一步可用封口膜缠好管口，放入4℃保存。
(2)磁珠活性测试
步骤同实施例1磁珠活性测试。
4、实验结果
1)分选效率
如图10所示，除去组1分选效率较差以外，组2～组4分选效率无明显差异，说明抗体浓度在1～5mg/mL之间分选效率均可。具体分选效率如表14所示。
表14分选效率
组1 组2 组3 组4
42.36 53.03 62.66 66.42
32.72 58.87 57.6 68.19
2)激活效率
如图11所示，组1～组4激活效率无明显差异，说明抗体浓度对于激活效率无影响。具体激活效率如表15所示。
表15激活效率
组1 组2 组3 组4
87.28 88.07 87.3 85.17
86.76 88.09 88.44 86.42
3)扩增倍数
如图12所示，组2～组4扩增倍数均高于组1，而组2～组4之间无明显差异，说明抗体浓度在1～5mg/mL之间扩增倍数均可。具体扩增倍数如表16所示。
表16扩增倍数
综上所述，实施例4通过不同抗体浓度与磁珠进行偶联，综合分选效率、激活效率、扩增倍数实验数据发现，当CD3与CD28抗体浓度≥1mg/mL时，各项指标无明显差异，结合抗体成本因素，因此能够得出结论：CD3与CD28抗体浓度等于1mg/mL时，为本实验最优条件。
实施例5
1、实验材料
羧基磁珠(裸珠)、MES buffer、CB buffer、封闭液buffer、保存液buffer、抗人CD3单克隆抗体、抗人CD28单克隆抗体、EDC、NHS、
2、试剂配制
同实施例1试剂配制。
3、实验方法
(1)磁珠偶联
1)按照实验方案从2～8℃冰箱中取出羧基磁珠，旋涡震荡仪充分混匀1min。
2)把羧基磁珠放入生物安全柜，上下颠倒充分混匀后，取出100μL羧基磁珠，放入无菌1.5mL Ep管，加入1mL MES buffer重悬，上下颠倒混匀。
3)将Ep管放磁力架上，静置1min后弃上清。
4)将管子从磁力架上移下来，加入1mL MES buffer重悬，上下颠倒混匀。
5)重复步骤3)、步骤4)；
6)将Ep管放磁力架上，静置1min，弃上清，尽量吸净，300μL MES buffer重悬磁珠。
7)加入30μL 1mg/mL EDC，室温震荡混匀1h。
8)加入1mL PBS重悬，将Ep管放磁力架上，静置1min后弃上清。
9)将管子从磁力架上移下来，加入1mL PBS重悬，上下颠倒混匀，将Ep管放磁力架上，静置1min后弃上清。
10)重复步骤9)2次。
11)300μL PBS重悬磁珠，加入30μL 1mg/mL NHS，室温震荡混匀1h。
12)加入1mL PBS重悬，将Ep管放磁力架上，静置1min后弃上清。
13)将管子从磁力架上移下来，加入1mL PBS重悬，上下颠倒混匀，将Ep管放磁力架上，静置1min后弃上清。
14)重复步骤13)2次，加入1mL PBS重悬磁珠。
15)将Ep管移下磁力架，加入600μL PBS重悬磁珠，并按表17加入不同比例添加CD3/CD28单克隆抗体原液。
表17
组1 组2 组3 组4
CD3/CD28单克隆抗体原液浓度 1mg/mL 1mg/mL 1mg/mL 1mg/mL
CD3：CD28单克隆抗体原液加入量比例 0.5:1 1:1 2:1 3:1
CD3单克隆抗体原液加入量 133μL 200μL 267μL 300μL
CD28单克隆抗体原液加入量 267μL 200μL 133μL 100μL
16)上下颠倒混匀，2～8℃震荡混匀2.5h。
17)将Ep管放磁力架上，静置1min后弃上清。
18)将管子从磁力架上移下来，加入1mL PBS重悬，上下颠倒混匀。
19)重复步骤17)、步骤18)；
20)将Ep管放磁力架上，静置1min，弃上清，尽量吸净，1mL封闭buffer重悬磁珠。
21)2～8℃震荡混匀1h。
22)将Ep管放磁力架上，静置1min后弃上清。
23)将管子从磁力架上移下来，加入1mL保存液buffer重悬，上下颠倒混匀。
24)重复步骤22)、步骤23)2次；
25)将Ep管放磁力架上，静置1min，弃上清，尽量吸净，200μL保存液buffer重悬磁珠。
26)若不进行下一步可用封口膜缠好管口，放入4℃保存。
(2)磁珠活性测试
步骤同实施例1磁珠活性测试。
4、实验结果
1)分选效率：如图13所示，组1～组4分选效率无明显差异，说明抗体比例关系不影响分选效率。具体分选效率如表18所示。
表18分选效率
组1 组2 组3 组4
42.36 53.03 62.66 66.42
32.72 58.87 57.6 68.19
2)激活效率：如图14所示，组1激活效率略小于其它3组实验，组2～组4激活效率无明显差异，说明CD3、CD28抗体比例在1～3:1对于激活效率无影响。具体激活效率如表19所示。
表19激活效率
组1 组2 组3 组4
87.28 88.07 87.3 85.17
86.76 88.09 88.44 86.42
3)扩增倍数：如图15所示，组2～组4扩增倍数均高于组1，而组2～组4之间无明显差异，说明CD3、CD28抗体比例在1～3:1对于扩增倍数无影响。具体扩增倍数如表20所示。
表20扩增倍数
综上所述，实施例5通过不同CD3、CD28抗体比例关系与磁珠进行偶联，综合分选效率、激活效率、扩增倍数实验数据发现，当CD3与CD28比例关系为1～3：1时，各项指标较优。
实施例6
1、实验材料
羧基磁珠(裸珠)、MES buffer、CB buffer、封闭液buffer、保存液buffer、抗人CD3单克隆抗体、抗人CD28单克隆抗体、EDC、NHS、
2、试剂配制
同实施例1试剂配制。
3、实验方法
按照不同偶联方式进行比对
组1：根据专利申请公布号CN110568176A《一种抗体和磁珠定向偶联的方法》进行偶联。
组2：根据本文优化方案进行偶联：
1)按照实验方案从2～8℃冰箱中取出羧基磁珠，旋涡震荡仪充分混匀1min。
2)把羧基磁珠放入生物安全柜，上下颠倒充分混匀后，取出100μL羧基磁珠，放入无菌1.5mL Ep管，加入1mL MES buffer重悬，上下颠倒混匀。
3)将Ep管放磁力架上，静置1min后弃上清。
4)将管子从磁力架上移下来，加入1mL MES buffer重悬，上下颠倒混匀。
5)重复步骤3)、步骤4)；
6)将Ep管放磁力架上，静置1min，弃上清，尽量吸净，300μL MES buffer重悬磁珠。
7)加入30μL 1mg/mL EDC，室温震荡混匀1h。
8)加入1mL PBS重悬，将Ep管放磁力架上，静置1min后弃上清。
9)将管子从磁力架上移下来，加入1mL PBS重悬，上下颠倒混匀，将Ep管放磁力架上，静置1min后弃上清。
10)重复步骤9)2次。
11)300μL PBS重悬磁珠，加入30μL 1mg/mL NHS，室温震荡混匀1h。
12)加入1mL PBS重悬，将Ep管放磁力架上，静置1min后弃上清。
13)将管子从磁力架上移下来，加入1mL PBS重悬，上下颠倒混匀，将Ep管放磁力架上，静置1min后弃上清。
14)重复步骤13)2次，加入1mL PBS重悬磁珠。
15)将Ep管移下磁力架，加入600μL PBS重悬磁珠，随后各加入200μL浓度为1mg/mL的CD3、CD28单克隆抗体原液。
16)上下颠倒混匀，2～8℃震荡混匀2.5h。
17)将Ep管放磁力架上，静置1min后弃上清。
18)将管子从磁力架上移下来，加入1mL PBS重悬，上下颠倒混匀。
19)重复步骤17)、步骤18)；
20)将Ep管放磁力架上，静置1min，弃上清，尽量吸净，1mL封闭buffer重悬磁珠。
21)2～8℃震荡混匀1h。
22)将Ep管放磁力架上，静置1min后弃上清。
23)将管子从磁力架上移下来，加入1mL保存液buffer重悬，上下颠倒混匀。
24)重复步骤22)、步骤23)2次；
25)将Ep管放磁力架上，静置1min，弃上清，尽量吸净，200μL保存液buffer重悬磁珠。
26)若不进行下一步可用封口膜缠好管口，放入4℃保存。
(2)磁珠活性测试
步骤同实施例1磁珠活性测试。
4、实验结果
1)分选效率
如图16所示，组2分选效率高于组1，说明本文优化偶联方法能够提高CD3/CD28分选激活磁珠的分选效率。具体分选效率如表21所示。
表21分选效率
组1 组2
48.27 68.83
53.34 64.53
2)激活效率
如图17所示，组1、组2激活效率无明显差异，说明不同偶联工艺对于细胞的激活效率无影响。具体激活效率如表22所示。
表22激活效率
组1 组2
88.45 89.58
83.58 85.83
3)扩增倍数
如图18所示，组2扩增倍数均高于组1，说明本文优化偶联方法能够提高T细胞的扩增倍数。具体扩增倍数如表23所示。
表23扩增倍数
/>
综上所述，实施例6通过对比常规以及本文优化后的磁珠偶联抗体工艺，综合分选效率、激活效率、扩增倍数实验数据发现，本文优化后的偶联工艺更适用于CD3/CD28抗体的偶联。

Claims (10)

1.一种磁珠的偶联方法，其特征在于，所述偶联方法包括：
1)磁珠充分混匀，加入不同pH值的MES buffer重悬，混匀，磁力架上静置后弃上清，重复步骤1)多次；
2)加入与步骤1)对应pH值的MES buffer重悬，加入EDC，混匀1h；
3)加入PBS重悬，混匀，磁力架上静置后弃上清，重复步骤3)多次；
4)加入PBS重悬磁珠，加入NHS，混匀1h；
5)加入PBS重悬，混匀，磁力架上静置后弃上清，重复步骤5)多次；
6)加入PBS重悬磁珠，加入CD3、CD28单克隆抗体原液，混匀2.5h，磁力架上静置后弃上清；
7)加入PBS重悬，混匀，磁力架上静置后弃上清，重复步骤7)多次；
8)加入封闭buffer重悬磁珠，混匀1h；
9)磁力架上静置后弃上清；
10)加入保存液buffer重悬，混匀，磁力架上静置后弃上清，重复步骤10)多次；
11)加入保存液buffer重悬磁珠，得到偶联磁珠。
2.根据权利要求1所述的偶联方法，其特征在于，所述偶联方法步骤1)中pH值范围为4.5-6.5；
优选地，所述步骤1)中重悬所用的MES buffer与加入的磁珠的比值为1mL：100μL；
优选地，所述步骤1)加入MES buffer后混匀方式为上下颠倒混匀；
优选地，所述步骤2)中MES buffer与步骤1)加入的磁珠的比值为300μL：100μL；
优选地，所述步骤2)中EDC与步骤1)加入的磁珠的比值为10-50μL：100μL；
优选地，所述步骤2)中混匀方式为室温震荡混匀；
优选地，所述步骤3)中PBS与步骤1)加入的磁珠的比值为1mL：100μL；
优选地，所述步骤3)中混匀方式为上下颠倒混匀；
优选地，所述步骤4)中PBS与步骤1)加入的磁珠的比值为300μL：100μL；
优选地，所述步骤4)中NHS与步骤1)加入的磁珠的比值为10-100μL：100μL；
优选地，所述步骤4)中混匀方式为室温震荡混匀；
优选地，所述步骤5)中PBS与步骤1)加入的磁珠的比值为1mL：100μL；
优选地，所述步骤5)中混匀方式为上下颠倒混匀；
优选地，所述步骤6)中PBS与步骤1)加入的磁珠的比值为600μL：100μL；
优选地，所述步骤6)中CD3、CD28与步骤1)加入的磁珠的比值为200-300μL：200-100μL：100μL；
优选地，所述步骤6)中CD3的浓度为1-5mg/mL；
优选地，所述步骤6)中CD28的浓度为1-5mg/mL；
优选地，所述步骤6)中混匀方式为2-8℃震荡混匀；
优选地，所述步骤7)中PBS与步骤1)加入的磁珠的比值为1mL：100μL；
优选地，所述步骤7)中混匀方式为上下颠倒混匀；
优选地，所述步骤8)中封闭buffer与步骤1)加入的磁珠的比值为1mL：100μL；
优选地，所述步骤8)中混匀方式为2-8℃震荡混匀；
优选地，所述步骤10)中保存液buffer与步骤1)加入的磁珠的比值为1mL：100μL；
优选地，所述步骤10)中混匀方式为上下颠倒混匀；
优选地，所述步骤11)保存液buffer与步骤1)加入的磁珠的比值为200μL：200μL。
3.根据权利要求1所述的偶联方法，其特征在于，所述MES buffer组分为MES：注射用水＝1.59g：50mL，pH值调整为4.5-6.5。
4.根据权利要求1所述的偶联方法，其特征在于，所述PBS组分为NaCl：KCl：Na2HPO4：KH2PO4：注射用水＝8g：0.2g：1.44g：0.24g：1L。
5.根据权利要求1所述的偶联方法，其特征在于，所述步骤2)中EDC的浓度为1mg/mL，1mg/mL EDC的组分为EDC：MES＝0.01g：10mL，所述EDC需要即用即配；
优选地，所述步骤4)中NHS的浓度为1mg/mL，所述1mg/mL NHS的组分为NHS：PBS＝0.01g：10mL，所述NHS需要即用即配。
6.根据权利要求1所述的偶联方法，其特征在于，所述封闭buffer的组分为20mM PBS、1％BSA；
优选地，所述保存液buffer的组分为20mM PBS、5％BSA。
7.一种根据权利要求1-6任一项所述的磁珠的偶联方法获得的分选激活磁珠。
8.一种根据权利要求1-6任一项所述的磁珠的偶联方法获得的分选激活磁珠在制备产品中的应用；
优选地，所述产品包括试剂、试剂盒、层析试纸。
9.一种根据权利要求1-6任一项所述的磁珠的偶联方法获得的分选激活磁珠在促进T细胞分选、激活和/或扩增中的应用。
10.一种根据权利要求1-6任一项所述的磁珠的偶联方法获得的分选激活磁珠在提升T细胞纯度中的应用。
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