BR112020007246A2 - processo para hidrólise enzimática de material lignocelulósico e fermentação de açúcares - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de um produto de açúcar e/ou de fermentação a partir de material lignocelulósico.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PRO- CESSO PARA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE MATERIAL LIGNOCE- LULÓSICO E FERMENTAÇÃO DE AÇÚCARES". Campo

[0001] A presente invenção refere-se a um processo para preparar um produto de açúcar ("sugar product") a partir de material lignoceluló- sico por hidrólise enzimática e a um processo para preparar um produ- to de fermentação por fermentação de açúcares. Fundamentos

[0002] O material lignocelulósico é composto principalmente de celulose, hemicelulose e lignina e fornece uma plataforma atraente pa- ra gerar fontes de energia alternativas a combustíveis fósseis. O mate- rial está disponível em grandes quantidades e pode ser convertido em produtos valiosos, por exemplo, açúcares ou biocombustíveis, como bioetanol.

[0003] A produção de produtos de fermentação a partir de material lignocelulósico é conhecida na técnica e geralmente inclui as etapas de pré-tratamento, hidrólise, fermentação e, opcionalmente, recupera- ção dos produtos de fermentação.

[0004] Durante a hidrólise, que pode compreender as etapas de liquefação, pré-sacarificação e/ou sacarificação, a celulose presente no material lignocelulósico é parcialmente (tipicamente 30 a 95%, de- pendendo da atividade enzimática e das condições de hidrólise) con- vertidas em açúcares pelas enzimas celulolíticas. A hidrólise ocorre tipicamente durante um processo com duração de 6 a 168 horas (ver Kumar, S., Chem. Eng. Technol. 32 (2009), 517-526) em temperaturas elevadas de 45 a 50ºC e condições não estéreis.

[0005] Geralmente, os açúcares são, então, convertidos em produ- tos de fermentação valiosos, como etanol, por micro-organismos, co- mo leveduras. A fermentação ocorre em uma etapa do processo sepa-

rada, de preferência anaeróbica, no mesmo vaso ou em um vaso dife- rente. A temperatura durante a fermentação é ajustada para 30 a 33ºC para acomodar o crescimento e a produção de etanol por micro- organismos, geralmente leveduras. Durante o processo de fermenta- ção, o material celulósico restante é convertido em açúcares pelas en- zimas já presentes na etapa de hidrólise, enquanto biomassa microbi- ana e etanol são produzidos. A fermentação termina assim que o ma- terial celulósico é convertido em açúcares fermentáveis e todos os açúcares fermentáveis são convertidos em etanol, dióxido de carbono e biomassa microbiana. Isso pode levar até 6 dias. Em geral, o tempo total do processo de hidrólise e fermentação pode chegar a 13 dias.

[0006] Em geral, o custo de produção de enzimas é um fator de custo importante no processo geral de produção de produtos de fer- mentação a partir de material lignocelulósico (ver Kumar, S., Chem. Eng. Technol. 32 (2009), 517-526). Até o momento, redução dos cus- tos de produção de enzimas é alcançada aplicando produtos enzimáti- cos de uma única ou de múltiplas fontes microbianas (ver WO 2008/008793) com atividade hidrolítica mais ampla e/ou mais alta (es- pecífica). Isso leva a uma menor necessidade de enzimas, taxas de conversão mais altas e/ou maiores rendimentos de conversão e, por- tanto, a custos gerais de produção mais baixos.

[0007] Além da otimização de enzimas, otimização do design do processo é uma ferramenta crucial para reduzir os custos gerais de produção de produtos de açúcar e de produtos de fermentação.

[0008] Por razões econômicas, é, portanto, desejável incluir confi- gurações de processo novas e inovadoras destinadas a reduzir os cus- tos gerais de produção no processo que envolve hidrólise e fermenta- ção do material lignocelulósico. Sumário

[0009] Um objetivo do pedido é fornecer um processo melhorado para preparação de um produto de açúcar e/ou um produto de fermen- tação a partir de material lignocelulósico. O processo é melhorado tra- tando o material lignocelulósico com uma composição enzimática con- tendo uma mono-oxigenase lítica de polissacarídeo. Depois disso, é adicionado oxigênio à mistura que inclui o material lignocelulósico e a composição enzimática e, em seguida, é acrescentada mono-oxige- nase lítica de polissacarídeo adicional à mistura contendo o material lignocelulósico e a composição enzimática. Descrição detalhada

[0010] Em todo o presente relatório e reivindicações anexas, as palavras "compreendem" e "incluem" e variações como "compreende", "compreendendo", "inclui" e "incluindo" devem ser interpretadas inclu- sivamente. Ou seja, essas palavras pretendem transmitir a possível inclusão de outros elementos ou números inteiros não citados especi- ficamente, onde o contexto permitir. Os artigos "um" e "uma" são usa- dos aqui para se referir a um ou mais de um (isto é, a um ou pelo me- nos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, "um ele- mento" pode significar um elemento ou mais de um elemento.

[0011] O presente pedido refere-se a um processo para prepara- ção de um produto de açúcar a partir de material lignocelulósico, o re- ferido processo compreendendo as etapas de (a) hidrolisar enzimati- camente o material lignocelulósico para obter o produto de açúcar em um processo compreendendo as etapas de (i) tratar o material lignoce- lulósico com uma composição enzimática contendo uma mono- oxigenase lítica de polissacarídeo, (ii) adicionar oxigênio à mistura contendo o material lignocelulósico e a composição enzimática e (iii) adicionar mono-oxigenase lítica de polissacarídeo adicional à mistura contendo o material lignocelulósico e a composição enzimática, e (b) opcionalmente, recuperar o produto de açúcar.

[0012] O presente pedido também se refere a um processo para preparação de um produto de fermentação a partir de material lignoce- lulósico, compreendendo as etapas de (a) executar um processo para preparação de um produto de açúcar a partir de material lignocelulósi- co, conforme descrito neste documento, (b) fermentar o produto de açúcar para produzir o produto de fermentação e (c) opcionalmente, recuperar o produto de fermentação.

[0013] Em uma modalidade, o material lignocelulósico é pré-trata- do antes e/ou durante a hidrólise enzimática, de preferência antes da hidrólise enzimática. Métodos de pré-tratamento são conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados a, calor, modificação me- cânica, química, modificação biológica e qualquer combinação dos mesmos. Pré-tratamento é tipicamente realizado para melhorar a acessibilidade do material lignocelulósico à hidrólise enzimática e/ou hidrolisar a hemicelulose e/ou solubilizar a hemicelulose e/ou celulose e/ou lignina do material lignocelulósico. Em uma modalidade, o pré- tratamento compreende tratar o material lignocelulósico com explosão de vapor, tratamento com água quente ou tratamento com ácido ou base diluída. Exemplos de métodos de pré-tratamento incluem, mas não se limitam a, tratamento com vapor (por exemplo, tratamento a 100-260ºC, a uma pressão de 7-45 bar, em pH neutro, por 1-10 minu- tos), tratamento com ácido diluído (por exemplo, tratamento com H2SO4 0,1 a 5 %, e/ou SO2 e/ou HNO;3 e/ou HCl, na presença ou na ausência de vapor, a 120-200ºC, a uma pressão de 2-15 bar, a pH ácido, por 2-30 minutos), tratamento com organosolv (por exemplo, tratamento com H2SO, 1 - 1,5% na presença de solvente orgânico e vapor, a 160-200ºC, a uma pressão de 7 a 30 bar, a pH ácido, por 30 a 60 minutos), tratamento com cal (por exemplo, tratamento com 0,1 - 2% NaOH / Ca (OH) 2 na presença de água / vapor a 60-160ºC, a uma pressão de 1-10 bar, em pH alcalino, por 60-4800 minutos), tratamento ARP (por exemplo, tratamento com 5 -15 % NH;3, a 150-180ºC, a uma pressão de 9 a 17 bar, em pH alcalino, por 10-90 minutos), tratamento AFEX (por exemplo, tratamento com > 15% de NH;3, a 60-140ºC, a uma pressão de 8 -20 bar, em pH alcalino, por 5-30 minutos).

[0014] O material lignocelulósico pode ser lavado. Em uma moda- lidade, o material lignocelulósico pode ser lavado após o pré-trata- mento. A etapa de lavagem pode ser usada para remover compostos solúveis em água que podem atuar como inibidores para a etapa de fermentação e / ou hidrólise. A etapa de lavagem pode ser conduzida de maneira conhecida pelo especialista. Ao lado da lavagem, existem outros métodos de desintoxicação. O material lignocelulósico também pode ser desintoxicado por qualquer (ou qualquer combinação) desses métodos, que incluem, mas não se limitam a, separação sólido/líquido, evaporação a vácuo, extração, adsorção, neutralização, sobrecalagem ("overliming"), adição de agentes redutores, adição de enzimas desin- toxicantes como lacases ou peroxidases, adição de microrganismos capazes de destoxificação de hidrolisados. Em uma modalidade, o ma- terial lignocelulósico hidrolisado enzimaticamente é lavado e / ou des- toxificado.

[0015] Nos processos aqui descritos, material lignocelulósico pode ser adicionado a um biorreator e depois hidrolisado enzimaticamente. Em uma modalidade, a composição enzimática contendo uma mono- oxigenase lítica de polissacarídeo já está presente no biorreator antes da adição do material lignocelulósico. Em outra modalidade, a compo- sição enzimática contendo uma mono-oxigenase lítica de polissacaríi- deo pode ser adicionada ao biorreator. Em uma modalidade, o material lignocelulósico já está presente no biorreator antes da adição da com- posição enzimática que compreende uma mono-oxigenase lítica de polissacarídeo. Em uma modalidade, o material lignocelulósico e a composição enzimática contendo uma mono-oxigenase lítica de polis- sacarídeo são adicionados simultaneamente ao biorreator. A composi-

ção enzimática contendo uma mono-oxigenase lítica de polissacarídeo pode ser uma composição aquosa.

[0016] Em uma modalidade, o processo para preparação de um produto de açúcar a partir de material lignocelulósico compreende pelo menos uma etapa de liquefação em que o material lignocelulósico é hidrolisado enzimaticamente em um primeiro biorreator e pelo menos uma etapa de sacarificação em que o material lignocelulósico liquefeito é hidrolisado no primeiro biorreator e/ou em um segundo biorreator. À sacarificação pode ser feita no mesmo biorreator que a liquefação (isto é, no primeiro biorreator). Também pode ser feito em um biorreator separado (isto é, no segundo biorreator). No processo de hidrólise en- zimática, a liquefação e sacarificação podem ser etapas separadas. Alternativamente, a liquefação e sacarificação podem ser combinadas. Liquefação e sacarificação podem ser realizadas em diferentes tempe- raturas, mas também podem ser realizadas em uma única temperatu- ra. Em uma modalidade, a temperatura da liquefação é superior à temperatura da sacarificação. Liquefação é preferivelmente realizada a uma temperatura de 60 - 75ºC e sacarificação é preferivelmente reali- zada a uma temperatura de 50 - 65ºC. Em uma modalidade, a compo- sição enzimática contendo uma mono-oxigenase lítica de polissacaríi- deo pode ser usada na etapa de liquefação e / ou na etapa de sacarifi- cação.

[0017] Em uma modalidade, a hidrólise enzimática dos processos aqui descritos leva de 1 a 300 horas, de 2 a 250 horas, de 3 a 225 ho- ras, de 4 a 200 horas, de 5 a 190 horas, de 10 a 180 horas, de 15 a 170 horas, de 20 a 160 horas e preferivelmente de 25 a 150 horas.

[0018] Em uma modalidade, é adicionado oxigênio durante o pro- cesso para preparação de um produto de açúcar a partir de material lignocelulósico, como aqui descrito. Em uma modalidade, o material lignocelulósico é primeiro tratado com uma composição enzimática contendo uma mono-oxigenase lítica de polissacarídeo e, em seguida, é adicionado oxigênio à mistura que contém o material lignocelulósico e a composição enzimática. Em uma modalidade, o início da etapa (ii) do processo para preparação de um produto de açúcar a partir de ma- terial lignocelulósico, conforme descrito neste documento, é de 1 a 100 horas após o início da etapa (i) do processo para preparação de um produto de açúcar a partir de material lignocelulósico conforme aqui descrito. Isto significa que o material lignocelulósico é tratado com uma composição enzimática contendo uma mono-oxigenase lítica de polis- sacarídeo e de 1 a 100 horas depois é adicionado oxigênio à mistura que compreende o material lignocelulósico e a composição enzimática. Em uma modalidade, o início da etapa (ii) do processo para prepara- ção de um produto de açúcar a partir de material lignocelulósico, con- forme aqui descrito, é de 1 a 100 horas, de 5 a 95 horas, de 10 a 90 horas, de 15 a 85 horas, de 20 a 80 horas, preferivelmente de 25 a 70 horas após o início da etapa (i) do processo, conforme aqui descrito.

[0019] Oxigênio pode ser adicionado continuamente ou desconti- nuamente durante a hidrólise enzimática. Em uma modalidade, quan- do adicionado descontinuamente, oxigênio pode ser adicionado de 1% - 10%, de 1% - 15%, de 1% - 20%, de 1% - 25%, de 1% - 30%, de 1% - 35%, de 1% - 40%, de 1% - 45%, 1% - 50%, de 1% - 55%, de 1% - 60%, de 1% - 65%, de 1% - 70%, de 1% - 75%, de 1% - 80%, de 1% - 85%, de 1% - 90%, de 1% — 95%, ou de 1% - 99% do tempo total de hidrólise. Em uma modalidade, quando adicionado na segunda metade do processo de hidrólise, oxigênio pode ser adicionado de 1% - 10%, de 1% - 15%, de 1% - 20%, de 1% - 25%, de 1% - 30%, de 1% - 35%, de 1% - 40%, de 1% - 45%, 1% - 50%, de 1% - 55%, de 1% - 60%, de 1% - 65%, de 1% - 70%, de 1% - 75%, de 1% - 80%, de 1% - 85%, de 1% - 90%, de 1% — 95%, ou de 1% - 99% do tempo da segunda meta- de do processo de hidrólise. Oxigênio pode ser adicionado de várias formas. Por exemplo, oxigênio pode ser adicionado como oxigênio gás, gás enriquecido com oxigênio, como ar enriquecido com oxigênio ou ar. Exemplos de como adicionar oxigênio incluem, entre outros, adição de oxigênio por meio de borbulhamento, adição química de oxigênio, enchendo os biorreatores usados em uma hidrólise enzimáti- ca a partir do topo (empurrando ("plunging") o hidrolisado para dentro do biorreator e, consequentemente, introduzindo oxigênio no hidrolisa- do) e adição de oxigênio ao espaço superior dos biorreatores. Em ge- ral, a quantidade de oxigênio adicionada aos biorreatores pode ser controlada e / ou variada. Restrição do oxigênio fornecido é possível adicionando somente oxigênio durante parte do tempo de hidrólise. Outra opção é adicionar oxigênio em baixa concentração, por exem- plo, usando uma mistura de ar e ar reciclado (o ar que sai do biorrea- tor) ou "diluindo" o ar com um gás inerte. O aumento da quantidade de oxigênio adicionado pode ser obtido por adição de oxigênio durante períodos mais longos do tempo de hidrólise, adicionando o oxigênio a uma concentração mais alta ou adicionando mais ar. Outra maneira de controlar a concentração de oxigênio é adicionar um consumidor de oxigênio e/ou um gerador de oxigênio. Oxigênio pode ser introduzido, por exemplo, soprado no biorreator, por exemplo, no material lignoce- lulósico presente no biorreator.

[0020] Em uma modalidade, oxigênio é adicionado a um ou mais biorreatores usados na hidrólise enzimática antes e/ou durante e/ou após a adição do material lignocelulósico aos biorreatores. O oxigênio pode ser introduzido juntamente com o material lignocelulósico que entra no (s) biorreator (es). O oxigênio pode ser introduzido no fluxo de material que entra no(s) biorreator(es) ou com parte do conteúdo do(s) biorreator(es) que passa por um loop externo do(s) biorreator (es). De preferência, o oxigênio é adicionado quando o material lignocelulósico está no biorreator. De preferência, o oxigênio é adicionado quando a composição enzimática contendo uma mono-oxigenase lítica de polis- sacarídeo está no biorreator. De preferência, o oxigênio é adicionado quando o material lignocelulósico e a composição enzimática contendo uma mono-oxigenase lítica de polissacarídeo estão no biorreator. De preferência, o oxigênio é adicionado à mistura que compreende o ma- terial lignocelulósico e a composição enzimática. De preferência, a mistura está presente no biorreator quando o oxigênio é adicionado ao mesmo.

[0021] Em uma modalidade, oxigênio é adicionado à mistura que compreende o material lignocelulósico e a composição enzimática, de modo que o nível de oxigênio dissolvido (dissolved oxygen - DO) na mistura seja mantido em um nível de 0,1% a 100% do nível de oxigê- nio dissolvido na saturação durante o processo de hidrólise. Em uma modalidade, oxigênio é adicionado à mistura que compreende o mate- rial lignocelulósico e a composição enzimática, de modo que o nível de oxigênio dissolvido na mistura seja mantido em um nível de 2,5% a 99% do nível de oxigênio dissolvido na saturação durante o processo de hidrólise. Em uma modalidade oxigênio é adicionado à mistura que compreende o material lignocelulósico e a composição enzimática, de modo que o nível de oxigênio dissolvido na mistura seja mantido em um nível de 5% a 95% do nível de oxigênio dissolvido na saturação durante o processo de hidrólise. Em uma modalidade oxigênio é adici- onado à mistura que compreende o material lignocelulósico e a com- posição enzimática, de modo que o nível de oxigênio dissolvido na mistura seja mantido em um nível de 7,5% a 90% do nível de oxigênio dissolvido na saturação durante o processo de hidrólise. Em uma mo- dalidade oxigênio é adicionado à mistura que compreende o material lignocelulósico e a composição enzimática, de modo que o nível de oxigênio dissolvido na mistura seja mantido em um nível de 10% a 85% do nível de oxigênio dissolvido na saturação durante o processo de hidrólise. Em uma modalidade oxigênio é adicionado à mistura que compreende o material lignocelulósico e a composição enzimática, de modo que o nível de oxigênio dissolvido na mistura seja mantido em um nível de 13% a 80% do nível de oxigênio dissolvido na saturação durante o processo de hidrólise. O DO pode ser medido usando uma sonda de DO. A sonda pode ser imersa na mistura mantida à tempera- tura de hidrólise. Em uma modalidade, a sonda foi pré-calibrada na mesma temperatura. O nível de OD pode ser monitorado continua- mente ou em intervalos.

[0022] Em uma modalidade, mono-oxigenase lítica de polissacaríi- deo adicional é adicionada durante o processo para preparação de um produto de açúcar a partir de material lignocelulósico, como aqui des- crito. Em uma modalidade, o material lignocelulósico é tratado primeiro com uma composição enzimática contendo uma mono-oxigenase lítica de polissacarídeo, depois oxigênio é adicionado à mistura contendo o material lignocelulósico e a composição enzimática e, posteriormente, é adicionada mono-oxigenase lítica de polissacarídeo adicional à mis- tura contendo o material lignocelulósico e a composição enzimática contendo mono-oxigenase lítica de polissacarídeo. Durante e/ou após adição de mono-oxigenase lítica de polissacarídeo adicional à mistura que compreende o material lignocelulósico e a composição enzimática contendo uma mono-oxigenase lítica de polissacarídeo, oxigênio ainda pode ser adicionado à mistura. Alternativamente, a adição de oxigênio pode ser interrompida durante e/ou após o acréscimo de mono- oxigenase lítica de polissacarídeo adicional à mistura que compreende o material lignocelulósico e a composição enzimática contendo uma mono-oxigenase lítica de polissacarídeo.

[0023] Em uma modalidade, mono-oxigenase lítica de polissacaríi- deo adicional é acrescentada à mistura contendo o material lignocelu- lósico e a composição enzimática (incluindo uma mono-oxigenase |íti-

ca de polissacarídeo) de 1 a 100 horas após o início da etapa (ii) do processo para preparação de um produto de açúcar a partir de materi- al lignocelulósico, como aqui descrito. Em outras palavras, a etapa (iii) do processo para preparação de açúcar a partir de material lignocelu- lósico, aqui descrito, começa de 1 a 100 horas após o início da etapa (ii) do processo para preparação de um produto de açúcar a partir de material lignocelulósico, conforme aqui descrito.

[0024] Em uma modalidade, o início da etapa (iii) do processo para preparação de um produto de açúcar a partir de material lignocelulósi- co, conforme descrito aqui, é de 1 a 100 horas, de 5 a 95 horas, de 10 a 90 horas, de 15 a 85 horas, de 20 a 80 horas, preferivelmente de 25 a 70 horas após o início da etapa (ii) do processo para preparação de um produto de açúcar a partir de material lignocelulósico, aqui des- crito.

[0025] Em uma modalidade, a hidrólise enzimática é realizada em um ou mais biorreatores. Em uma modalidade, o(s) biorreator(es) usa- do(s) nos processos aqui descritos possuem um volume de pelo me- nos 1 m?. De preferência, os biorreatores têm um volume de pelo me- nos 2 m?, pelo menos 3 m?, pelo menos 4 m?, pelo menos 5 m3?, pelo menos 6 m3, pelo menos 7 m?, pelo menos 8 m3?, pelo menos 9 m?, pe- lo menos 10 m?, pelo menos 15 m?, pelo menos 20 m?, pelo menos 25 m?, pelo menos 30 m?, pelo menos 35 m?, pelo menos 40 m?, pelo menos 45 m?, pelo menos 50 m?, pelo menos 60 m?, pelo menos 70 m?, pelo menos 75 m?, pelo menos 80 m?, pelo menos 90 m?, pelo menos 100 m?, pelo menos 200 m?, pelo menos 300 m?, pelo menos 400 m3, pelo menos 500 m?, pelo menos 600 m3, pelo menos 700 mº, pelo menos 800 m?, pelo menos 900 m?, pelo menos 1000 m?, pelo menos 1500 m?, pelo menos 2000 m?, pelo menos 2500 m?. Em geral, o(s) biorreator(es) ser(á)(ão) menor(es) que 3000 m? ou 5000 m?. Em uma modalidade, o tamanho do(s) biorreator(es) é de 10 m? a 5000 m?. Caso vários biorreatores sejam utilizados em uma hidrólise enzi- mática dos processos descritos aqui, eles podem ter o mesmo volume, mas também podem ter um volume diferente.

[0026] Em uma modalidade, a composição enzimática compreen- dendo uma mono-oxigenase lítica de polissacarídeo e/ou a mono- oxigenase lítica de polissacarídeo usada nos processos aqui descritos é de um fungo, preferivelmente um fungo filamentoso. Em uma moda- lidade, as enzimas da composição enzimática aqui descrita são deri- vadas de um fungo, preferivelmente de um fungo filamentoso ou as enzimas compreendem uma enzima fúngica, preferivelmente uma en- zima fúngica filamentosa. As enzimas usadas na hidrólise enzimática dos processos aqui descritos são derivadas de um fungo ou as enzi- mas usadas na hidrólise enzimática dos processos aqui descritos in- cluem uma enzima fúngica. Em uma modalidade, a mono-oxigenase lítica de polissacarídeo da composição enzimática e / ou a mono- oxigenase lítica de polissacarídeo adicional são mono-oxigenases líti- cas de polissacarídeos fúngicas. Em uma modalidade, a mono- oxigenase lítica de polissacarídeo da composição enzimática e/ou a mono-oxigenase lítica de polissacarídeo adicional são idênticas. Em outra modalidade, elas diferem entre si.

[0027] "Fungos filamentosos" incluem todas as formas filamento- sas da subdivisão Eumycota e Oomycota (como definido por Hawks- worth et a/., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi (Dicioná- rio dos Fungos), 8º edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK). Fungos filamentosos incluem, mas não se limitam a Acremonium, — Agaricus, Aspergillus, “Aureobasidium, Beauvaria, Cephalosporium, Ceriporiopsis, Chaetomium paecilomyces, Chrysos- porium, Claviceps, Cochiobolus, Coprinus, Cryptococcus, Cyathus, Emericella, Endothia, Endothia mucor, Filibasidium, Fusarium, Geos- mithia, Gilocladium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora,

Myrothecium, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Panerochaete, Pleurotus, Podospora, Pyricularia, Rasam- sonia, Rhizomucor, Rhizopus, Scylatidium, Schizophyllum, Stagonos- pora, Talaromyces, Thermoascus, Thermomyces, Thielavia, Tolypo- cladium, Trametes pleurotus, Trichoderma e Trichophyton. Em uma modalidade preferida, o fungo é Rasamsonia, sendo Rasamsonia emersonii o mais preferido. Logo, os processos como aqui descritos são vantajosamente aplicados em combinação com enzimas derivadas de um micro-organismo do gênero Rasamsonia ou as enzimas usadas nos processos aqui descritos incluem uma enzima Rasamsonia.

[0028] Várias cepas de fungos filamentosos são facilmente aces- síveis ao público em várias coleções de culturas, como a American Type Culture Collection (ATCC), a Deutsche Sammlung von Mikroor- ganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) e Agricultural Research Service Patent Cultu- re Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

[0029] Os processos de hidrólise enzimática, conforme descrito aqui, são preferivelmente realizados entre 40 e 90ºC. De preferência, os processos aqui descritos são feitos com enzimas termoestáveis. Enzima "termoestável", como aqui usado, significa que a enzima pos- sui uma temperatura ideal de 50ºC ou superior, 60ºC ou superior, 70ºC ou superior, 75ºC ou superior, 75ºC ou superior, 80ºC ou superior ou mesmo 85ºC ou superior. Elas podem, por exemplo, ser isoladas de microrganismos termofílicos ou podem ser projetadas pelo especialista e sintetizadas artificialmente. Em uma modalidade, os polinucleotídeos que codificam as enzimas termoestáveis podem ser isolados ou obti- dos a partir de fungos filamentosos termofílicos ou termotolerantes ou isolados a partir de fungos não termofílicos ou não termotolerantes, mas que se mostram termoestáveis. Por "fungo termofílico" entende-se um fungo que se desenvolve a uma temperatura de 50ºC ou superior.

Por fungo "termotolerante" entende-se um fungo que se desenvolve a uma temperatura de 45ºC ou superior, com um máximo próximo de 50ºC.

[0030] Células fúngicas termofílicas ou termotolerantes podem ser células de Humicola, Rhizomucor, Myceliophthora, Rasamsonia, Tala- romyces, Thermomyces, Thermoascus ou Thielavia, preferivelmente células de Rasamsonia. Fungos termofílicos ou termotolerantes prefe- ridos são Humicola grisea var. thermoidea, Humicola lanuginosa, Myceliophthora thermophila, Papulaspora thermophilia, Rasamsonia byssochlamydoides, Rasamsonia emersonii, Rasamsonia argillacea, Rasamsonia eburnean, Rasamsonia brevistipitata, Rasamsonia cylin- drospora, Rhizomucor pusillus, Rhizomucor miehei, Talaromyces bacil- lisporus, Talaromyces leycettanus, Talaromyces thermophilus, Ther- momyces lenuginosus, Thermoascus crustaceus, Thermoascus ther- mophilus Thermoascus aurantiacus e Thielavia terrestris.

[0031] Rasamsonia é um novo gênero que compreende as espé- cies termotolerantes e termofílicas Talaromyces e Geosmithia. Com base em dados fenotípicos, fisiológicos e moleculares, as espécies Talaromyces emersonii, Talaromyces byssochlamydoides, Talaromyces eburneus, Geosmithia argillacea e Geosmithia cylindrospora foram trans- feridas para o gênero Rasamsonia nov. Talaromyces emersonii, Peni- cillium geosmithia emersonii e Rasamsonia emersonii são aqui usados intercambiavelmente.

[0032] Nos processos aqui descritos são utilizadas composições enzimáticas. Preferivelmente, as composições são estáveis. "Compo- sições enzimáticas estáveis", como aqui usado, significa que as com- posições enzimáticas mantêm atividade após 30 horas de tempo de reação de hidrólise, de preferência pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de sua atividade inicial após 30 horas de tempo de rea-

ção da hidrólise. De preferência, a composição enzimática mantém a atividade após 40, 50, 60, 70, 80, 90 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 horas de tempo de reação da hidrólise.

[0033] As enzimas podem ser preparadas por fermentação de um substrato adequado com um micro-organismo adequado, por exemplo, Rasamsonia emersonii ou Aspergillus niger, em que as enzimas são produzidas pelo micro-organismo. O micro-organismo pode ser altera- do para melhorar ou produzir as enzimas. Por exemplo, o micro- organismo pode ser mutado por procedimentos clássicos de melhora- mento de cepa ou por técnicas de DNA recombinante. Assim, os mi- crorganismos aqui mencionados podem ser usados como tais para produzir as enzimas ou podem ser alterados para aumentar a produ- ção ou produzir enzimas alteradas que podem incluir enzimas heteró- logas, por exemplo, celulases, enzimas que não são originalmente produzidas por esse micro-organismo. De preferência, um fungo, mais preferivelmente um fungo filamentoso, é usado para produzir as enzi- mas. Vantajosamente, é usado um micro-organismo termofílico ou termotolerante. Opcionalmente, é usado um substrato que induz a ex- pressão das enzimas pelo micro-organismo produtor de enzimas.

[0034] As enzimas são usadas para liquefazer o material lignocelu- lósico e/ou liberar açúcares do material lignocelulósico que compreen- de polissacarídeos. Os principais polissacarídeos são celulose (gluca- nos), hemiceluloses (xilanos, heteroxilanos e xiloglucanos). Além dis- so, alguma hemicelulose pode estar presente como glucomananos, por exemplo, em material lignocelulósico derivado da madeira. A hidró- lise enzimática destes polissacarídeos a açúcares solúveis, incluindo monômeros e multímeros, por exemplo, glicose, celobiose, xilose, ara- binose, galactose, frutose, manose, ramnose, ribose, ácido galacturô- nico, ácido glucorônico e outras hexoses e pentoses ocorre sob a ação de diferentes enzimas atuando em conjunto. Por produto de açúcar

("sugar product") entende-se um produto da hidrólise enzimática do material lignocelulósico. O produto de açúcar compreende açúcares solúveis, incluindo monômeros e multímeros. De preferência, compre- ende glicose. Exemplos de outros açúcares são celobiose, xilose, ara- binose, galactose, frutose, manose, ramnose, ribose, ácido galacturô- nico, ácido glucorônico e outras hexoses e pentoses. O produto de açúcar pode ser utilizado como tal ou pode ser posteriormente proces- sado, por exemplo, recuperado e/ou purificado.

[0035] Além disso, pectinas e outras substâncias pécticas, como arabinanas, podem representar uma proporção considerável da massa seca de paredes celulares típicas de tecidos vegetais não lenhosos (cerca de um quarto a metade da massa seca pode ser pectinas). Além disso, o material lignocelulósico pode incluir lignina.

[0036] Em uma modalidade, a composição enzimática contendo uma mono-oxigenase lítica de polissacarídeo e/ou a mono-oxigenase lítica de polissacarídeo adicional é adicionada na forma de um caldo de fermentação integral de um fungo, preferivelmente Rasamsonia. O caldo de fermentação integral pode ser preparado a partir da fermen- tação de fungos filamentosos não recombinantes e / ou recombinan- tes. Em uma modalidade, o fungo filamentoso é um fungo filamentoso recombinante que compreende um ou mais genes que podem ser ho- mólogos ou heterólogos ao fungo filamentoso. Em uma modalidade, o fungo filamentoso é um fungo filamentoso recombinante compreen- dendo um ou mais genes que podem ser homólogos ou heterólogos ao fungo filamentoso, em que o um ou mais genes codificam enzimas que podem degradar um substrato celulósico. O caldo de fermentação integral pode compreender qualquer uma das enzimas descritas abai- xo ou qualquer combinação das mesmas.

[0037] De preferência, a composição enzimática é um caldo de fermentação integral em que as células são mortas. O caldo de fer-

mentação integral pode conter ácido(s) orgânico(s) (usados para matar as células), células mortas e/ou detritos celulares e meio de cultura.

[0038] Geralmente, os fungos filamentosos são cultivados em um meio de cultura de células adequado para produção de enzimas capa- zes de hidrolisar um substrato celulósico. O cultivo ocorre em um meio nutriente adequado compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica. Meios de cultura adequados, faixas de temperatura e outras condições ade- quadas para crescimento e produção de celulase e / ou hemicelulase e/ou pectinase são conhecidas na técnica. O caldo de fermentação integral pode ser preparado cultivando os fungos filamentosos até a fase estacionária e mantendo os fungos filamentosos sob condições limitantes de carbono por um período de tempo suficiente para expres- sar as uma ou mais celulases e/ou hemicelulases e/ou pectinases. Uma vez que enzimas, como celulases e/ou hemicelulases e/ou pecti- nases, são secretadas pelos fungos filamentosos no meio de fermen- tação, o caldo de fermentação integral pode ser usado. O caldo de fermentação integral da presente invenção pode compreender fungos filamentosos. Em algumas modalidades, o caldo de fermentação inte- gral compreende o conteúdo não fracionado dos materiais de fermen- tação derivados no final da fermentação. Tipicamente, o caldo de fer- mentação integral compreende o meio de cultura gasto e resíduos ce- lulares presentes após o crescimento dos fungos filamentosos até sa- turação, incubados em condições de limitação de carbono para permi- tir a síntese de proteínas (particularmente, expressão de celulases e / ou hemicelulases e / ou pectinases). Em algumas modalidades, o cal- do de fermentação integral compreende o meio de cultura celular gas- to, enzimas extracelulares e fungos filamentosos. Em algumas modali- dades, os fungos filamentosos presentes no caldo de fermentação in- tegral podem ser lisados, permeabilizados ou mortos usando métodos conhecidos na técnica para produzir um caldo de fermentação inteiro com células mortas. Em uma modalidade, o caldo de fermentação in- tegral é um caldo de fermentação integral com células mortas, em que o caldo de fermentação integral contendo as células de fungos fila- mentosos é lisado ou morto. Em algumas modalidades, as células são mortas lisando os fungos filamentosos por tratamento químico e / ou de pH para gerar o caldo inteiro de células mortas de uma fermenta- ção dos fungos filamentosos. Em algumas modalidades, as células são mortas lisando os fungos filamentosos por tratamento químico e/ou de pH e ajustando o pH da mistura de fermentação de células mortas para um pH adequado. Em uma modalidade, o caldo de fer- mentação integral compreende um primeiro componente de ácido or- gânico compreendendo pelo menos um ácido orgânico de 1-5 carbo- nos e/ou um sal do mesmo e um segundo componente de ácido orgâ- nico compreendendo um ácido orgânico com pelo menos 6 ou mais carbonos e/ou um sal do mesmo. Em uma modalidade, o primeiro componente de ácido orgânico é ácido acético, ácido fórmico, ácido propiônico, um sal dos mesmos ou qualquer combinação dos mesmos e o segundo componente de ácido orgânico é ácido benzoico, ácido ciclo-hexanocarboxílico, ácido 4-metilvalérico, ácido fenilacético, um sal dos mesmos ou qualquer combinação dos mesmos.

[0039] O termo "caldo de fermentação integral", como aqui usado, refere-se a uma preparação produzida por fermentação celular que não sofre recuperação e/ou purificação, ou tem recuperação e/ou puri- ficação mínimas. Por exemplo, caldos de fermentação integrais são produzidos quando culturas microbianas são cultivadas até saturação, incubadas em condições de limitação de carbono para permitir a sínte- se de proteínas (por exemplo, expressão de enzimas por células hos- pedeiras) e secreção no meio de cultura de células. Tipicamente, o caldo de fermentação integral não é fracionado e compreende o meio de cultura celular gasto, enzimas extracelulares e células microbianas, de preferência não viáveis.

[0040] Se necessário, o caldo de fermentação integral pode ser fracionado e os um ou mais conteúdos fracionados podem ser usa- dos. Por exemplo, as células e/ou detritos celulares mortos podem ser removidos de um caldo de fermentação integral para fornecer uma composição isenta desses componentes.

[0041] O caldo de fermentação integral pode ainda compreender um conservante e/ou agente antimicrobiano. Esses conservantes e/ou agentes são conhecidos na arte.

[0042] O caldo de fermentação, conforme aqui descrito, é tipica- mente um líquido, mas pode conter componentes insolúveis, como cé- lulas mortas, detritos celulares, componentes do meio de cultura e / ou enzima(s) insolúvel(!)(is). Em algumas modalidades, componentes in- solúveis podem ser removidos para fornecer um caldo de fermentação integral clarificado.

[0043] Em uma modalidade, o caldo de fermentação integral pode ser suplementado com uma ou mais atividades enzimáticas que não são expressas endogenamente ou são expressas em nível relativa- mente baixo pelos fungos filamentosos, para melhorar a degradação do substrato celulósico, por exemplo, em açúcares fermentáveis como glicose ou xilose. A(s) enzima(s) suplementar(es) pode (m) ser adicio- nada (s) como complemento do caldo de fermentação integral e as en- zimas podem ser um componente de um caldo de fermentação integral separado, ou podem ser purificadas ou minimamente recuperadas e/ou purificadas.

[0044] Em uma modalidade, o caldo de fermentação integral com- preende um caldo de fermentação integral de uma fermentação de um fungo filamentoso recombinante que superexpressa uma ou mais en- zimas para melhorar a degradação do substrato celulósico. Alternati-

vamente, o caldo de fermentação integral pode compreender uma mis- tura de um caldo de fermentação integral de uma fermentação de um fungo filamentoso não recombinante e de um fungo filamentoso re- combinante que superexpresse uma ou mais enzimas para melhorar a degradação do substrato celulósico. Em uma modalidade, o caldo de fermentação integral compreende um caldo de fermentação integral de uma fermentação de um fungo filamentoso que superexpressa beta- glucosidase. Alternativamente, o caldo de fermentação para uso nos presentes métodos e composições reativas pode compreender uma mistura de um caldo de fermentação integral de uma fermentação de um fungo filamentoso não recombinante e um caldo de fermentação inteiro de uma fermentação de um fungo filamentoso recombinante que superexpressa uma beta -glucosidase.

[0045] Em uma modalidade, a composição enzimática compreen- dendo uma mono-oxigenase lítica de polissacarídeo compreende ain- da um polipeptídeo selecionado no grupo que consiste em uma celo- bio-hidrolase, uma endoglucanase, uma beta-glucosidase, uma beta- xilosidase, uma endoxilanase e qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, a mono-oxigenase lítica de polissacarídeo adici- onal é adicionada na forma de uma composição enzimática. Esta composição enzimática pode ainda compreender um polipeptídeo se- lecionado no grupo que consiste em uma celobio-hidrolase, uma en- doglucanase, uma beta-glucosidase, uma beta-xilosidase, uma endoxi- lanase e qualquer combinação das mesmas. As enzimas (que podem estar presentes nas composições enzimáticas usadas nos processos aqui descritos) são descritas em mais detalhes abaixo. Em outra mo- dalidade, a mono-oxigenase lítica de polissacarídeo adicional é adicio- nada como uma única enzima. A única enzima pode ser purificada.

[0046] Uma composição enzimática para uso nos processos des- critos aqui pode compreender pelo menos duas atividades, embora tipicamente uma composição compreenda mais de duas atividades, por exemplo, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou até mais ati- vidades. Tipicamente, uma composição enzimática para uso nos pro- cessos aqui descritos compreende pelo menos duas celulases. As pe- lo menos duas celulases podem conter atividades iguais ou diferentes. A composição enzimática para uso nos processos aqui descritos tam- bém pode compreender pelo menos uma enzima diferente de uma ce- lulase. De preferência, a pelo menos uma outra enzima tem uma ativi- dade enzimática auxiliar, isto é, uma atividade adicional que, direta ou indiretamente, leva à degradação da lignocelulose. Exemplos de tais atividades auxiliares são mencionados aqui e incluem, mas não estão limitadas, a hemicelulases.

[0047] Em uma modalidade, uma composição enzimática para uso nos processos de hidrólise aqui descritos compreende uma mono- oxigenase lítica de polissacarídeo. Em uma modalidade, a mono- oxigenase lítica de polissacarídeo adicionada na etapa (i) do processo para a preparação de um produto de açúcar a partir de material ligno- celulósico descrito aqui é idêntica à mono-oxigenase lítica de polissa- carídeo adicional acrescentada na etapa (iii) do processo para a pre- paração de um produto de açúcar a partir de material lignocelulósico aqui descrito. Em uma modalidade, a mono-oxigenase lítica de polis- sacarídeo adicionada na etapa (i) do processo para a preparação de um produto de açúcar a partir de material lignocelulósico, conforme descrito neste documento, difere da mono-oxigenase lítica de polissa- carídeo adicionada na etapa (iii) do processo para preparação de um produto de açúcar a partir de material lignocelulósico aqui descrito. Em uma modalidade, a mono-oxigenase lítica de polissacarídeo adiciona- da na etapa (i) do processo para preparação de um produto de açúcar a partir de material lignocelulósico, aqui descrito e a mono-oxigenase lítica de polissacarídeo adicional acrescentada na etapa (iii) do pro-

cesso para preparação de um produto de açúcar a partir de material lignocelulósico aqui descrito são ambas adicionadas na forma de um caldo de fermentação integral de um fungo. Os caldos de fermentação integrais podem ser idênticos, mas, alternativamente, também podem diferir entre si. Em uma modalidade, a mono-oxigenase lítica de polis- sacarídeo adicionada na etapa (i) do processo para preparação de um produto de açúcar a partir de material lignocelulósico, conforme des- crito aqui, é adicionada na forma de um caldo de fermentação integral de um fungo, enquanto a mono-oxigenase lítica de polissacarídeo adi- cional acrescentada na etapa (iii) do processo para preparação de um produto de açúcar a partir de material lignocelulósico aqui descrita é adicionada como uma enzima purificada.

[0048] Em uma modalidade, a proporção de mono-oxigenase lítica de polissacarídeo adicionada na etapa (i) para a mono-oxigenase lítica de polissacarídeo adicionada na etapa (iii) é de 10:1 a 1:10, de 5:1 a 1:8, de 2:1 a 1:6, de preferência de 2:1 a 1:4.

[0049] Em uma modalidade, a composição enzimática compreen- dendo uma mono-oxigenase lítica de polissacarídeo pode compreen- der mais de uma mono-oxigenase lítica de polissacarídeo, isto é, com- preende duas ou mais mono-oxigenases líticas de polissacarídeos di- ferentes, por exemplo mono-oxigenases líticas de polissacarídeos de diferentes fungos. Em uma modalidade, a mono-oxigenase lítica de polissacarídeo adicional acrescentada na etapa (ili) do processo para preparação de um produto de açúcar a partir de material lignocelulósi- co, conforme descrito aqui pode compreender mais de uma mono- oxigenase lítica de polissacarídeo, ou seja, compreende duas ou mais mono-oxigenases líticas de polissacarídeos diferentes, por exemplo mono-oxigenases líticas de polissacarídeos de diferentes fungos.

[0050] Uma composição enzimática para uso nos processos aqui descritos pode compreender uma mono-oxigenase lítica de polissaca-

rídeo, uma endoglucanase, uma celobio-hidrolase e/ou uma beta- glucosidase. Uma composição enzimática pode compreender mais de uma atividade enzimática por classe de atividade. Por exemplo, uma composição pode compreender duas endoglucanases, por exemplo uma endoglucanase com atividade de endo-1,3 (1,4)-B glucanase e uma endoglucanase com atividade de endo-B-1,4-glucanase.

[0051] Uma composição para uso nos processos aqui descritos pode ser derivada de um fungo, como um fungo filamentoso, como Rasamsonia, como Rasamsonia emersonii. Em uma modalidade, um conjunto principal de enzimas pode ser derivado de Rasamsonia emersonii. Se necessário, o conjunto de enzimas pode ser suplemen- tado com enzimas adicionais de outras fontes. Tais enzimas adicionais podem ser derivadas de fontes clássicas e/ou produzidas por organis- mos geneticamente modificados.

[0052] Além disso, as enzimas das composições enzimáticas para uso nos processos aqui descritos podem ser capazes de trabalhar em PH baixo. Para fins desta invenção, pH baixo indica um pH de 5,5 ou inferior, 5 ou inferior, 4,9 ou inferior, 4,8 ou inferior, 4,7 ou inferior, 4,6 ou inferior, 4,5 ou inferior, 4,4 ou inferior, 4,3 ou inferior, 4,2 ou inferior, 4,1 ou inferior, 4,0 ou inferior 3,9 ou inferior, 3,8 ou inferior, 3,7 ou infe- rior, 3,6 ou inferior, 3,5 ou inferior.

[0053] Uma composição enzimática para uso nos processos aqui descritos pode compreender uma celulase e/ou uma hemicelulase e/ou uma pectinase de Rasamsonia. Pode também compreender uma celulase e/ou uma hemicelulase e/ou uma pectinase de uma fonte dife- rente de Rasamsonia. Pode ser utilizada em conjunto com uma ou mais enzimas Rasamsonia ou ser utilizada sem a presença de enzi- mas Rasamsonia adicionais.

[0054] Uma composição enzimática para uso nos processos aqui descritos pode compreender uma mono-oxigenase lítica de polissaca-

rídeo, uma endoglucanase, uma ou duas celobio-hidrolases e/ou uma beta-glucosidase.

[0055] Uma composição enzimática para uso nos processos aqui descritos pode compreender um tipo de atividade de celulase e/ou de atividade de hemicelulase e/ou de atividade de pectinase fornecidas por uma composição descrita aqui e um segundo tipo de atividade de celulase e/ou de atividade de hemicelulase e/ou de atividade de pecti- nase fornecidas por uma celulase/hemicelulase/pectinase adicional.

[0056] Como aqui usado, uma celulase é qualquer polipeptídeo capaz de degradar ou modificar celulose. Um polipeptídeo capaz de degradar celulose é aquele capaz de catalisar o processo de quebra da celulose em unidades menores, parcialmente, por exemplo, em ce- lodextrinas ou completamente, em monômeros de glicose. Uma celu- lase de acordo com a invenção pode dar origem a uma população mis- ta de celodextrinas e monômeros de glicose. Essa degradação ocorre tipicamente por meio de uma reação de hidrólise.

[0057] Como aqui usado, uma hemicelulase é qualquer polipeptí- deo capaz de degradar ou modificar hemicelulose. Ou seja, uma hemi- celulase pode ser capaz de degradar ou modificar um ou mais dentre xilanos, glucuronoxilanos, arabinoxilanos, glucomananos e xilogluca- nos. Um polipeptídeo capaz de degradar hemicelulose é aquele que é capaz de catalisar o processo de quebra da hemicelulose em polissa- carídeos menores, seja parcialmente, por exemplo, em oligossacaríi- deos ou completamente em monômeros de açúcar, por exemplo, he- xose ou pentose. Uma hemicelulase de acordo com a invenção pode dar origem a uma população mista de oligossacarídeos e monômeros de açúcar. Essa degradação ocorre tipicamente por meio de uma rea- ção de hidrólise.

[0058] Como aqui usado, uma pectinase é qualquer polipeptídeo capaz de degradar ou modificar pectina. Um polipeptídeo capaz de degradar pectina é aquele capaz de catalisar o processo de quebra da pectina em unidades menores, parcialmente, por exemplo, em oligos- sacarídeos ou completamente em monômeros de açúcar. Uma pecti- nase de acordo com a invenção pode dar origem a uma população mista de oligossacarídeos e monômeros de açúcar. Essa degradação ocorrerá tipicamente por meio de uma reação de hidrólise.

[0059] Assim, uma composição enzimática para uso nos proces- sos aqui descritos pode compreender uma ou mais das seguintes en- zimas, uma mono-oxigenase lítica de polissacarídeo (por exemplo, GH61), uma celobio-hidrolase, uma endoglucanase e uma beta- glucosidase. Uma composição para uso nos processos aqui descritos pode também compreender uma ou mais hemicelulases, por exemplo, uma endoxilanase, uma B-xilosidase, uma a-L-arabionofuranosidase, uma a-D-glucuronidase, uma a-D-glucuronidase, uma acetil-xilan este- rase, uma feruloil-esterase, uma cumaroil-esterase, uma a-galactosi- dase, uma f-galactosidase, uma B-mananase e / ou uma B-manosi- dase. Uma composição para uso nos processos aqui descritos pode também compreender uma ou mais pectinases, por exemplo, uma en- do poligalacturonase, uma pectina metil esterase, uma endo-galacta- nase, uma beta galactosidase, uma pectina acetil esterase, uma endo- pectina-liase, pectato liase, alfa ramnosidase, uma exo-galacturonase, uma expoligalacturonato liase, uma ramnogalacturonan hidrolase, uma ramnogalacturonan liase, uma ramnogalacturonan acetil esterase, uma ramnogalacturonan galacturono-hidrolase e / ou uma xilogalacturo- nase. Além disso, uma ou mais das seguintes enzimas, uma amilase, uma protease, uma lipase, uma ligninase, uma hexosiltransferase, uma glucuronidase, uma expansina, uma proteína induzida por celulo- se ou uma proteína integradora de celulose ou uma proteína seme- lhante podem estar presentes em uma composição para uso nos pro- cessos aqui descritos aqui (estas são referidas como atividades auxili-

ares acima).

[0060] Como aqui usado, mono-oxigenases líticas de polissacarí- deos são enzimas recentemente classificada por CAZy na família AA9 (Auxiliary Activity Family 9 -Família de Atividades Auxiliares 9) ou na família AN10 (Família de Atividades Auxiliares 10). Portanto, existem mono-oxigenases líticas de polissacarídeos AA9 e mono-oxigenases líticas de polissacarídeos AA9. Mono-oxigenases líticas de polissaca- rídeos são capazes de abrir uma estrutura cristalina de glucano e au- mentar a ação das celulases em substratos lignocelulósicos. São en- zimas que possuem atividade celulolítica aumentada. Mono-oxigena- ses líticas de polissacarídeos podem também afetar celo-oligossacarí- deos. De acordo com a literatura mais recente (ver Isaksen et al., Journal of Biological Chemistry, vol. 289, nº 5, p. 2632-2642), proteínas denominadas GH61 (família da glicosídeo hidrolase 61 ou, às vezes, referidas como EGIV) são mono- oxigenases líticas de polissacari- deos. GH61 foi originalmente classificado como endoglucanase com base na medição da atividade endo-1,4-B-d-glucanase muito fraca em um membro da família, mas foi recentemente reclassificado pelo CAZy na família AA9. CBM33 (módulo de ligação a carboidratos da família 33) também é uma mono-oxigenase lítica de polissacarídeo (ver Isaksen et al., Journal of Biological Chemistry, vol. 289, no. 5, pp. 2632-2642). CAZy reclassificou recentemente o CBM33 na família AA10.

[0061] Em uma modalidade, a mono-oxigenase lítica de polissaca- rídeo compreende uma mono-oxigenase lítica de polissacarídeo de AAS. Isto significa que pelo menos uma das mono-oxigenases líticas de polissacarídeos da composição enzimática e/ou pelo menos uma das mono-oxigenases líticas de polissacarídeos adicionais é uma mo- no-oxigenase lítica de polissacarídeo de AA9. Em uma modalidade, todas as mono-oxigenases líticas de polissacarídeos da composição enzimática e/ou todas as mono-oxigenases líticas de polissacarídeos adicionais são mono-oxigenases líticas de polissacarídeo de AA9.

[0062] Em uma modalidade, a composição enzimática compreende uma mono-oxigenase lítica de polissacarídeo de Thermoascus, como Thermoascus aurantiacus, como a descrita em WO 2005/074656 como SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 1 em WO?2014/130812 e em WO 2010/065830; ou de Thielavia, como Thielavia terrestris, como a des- crita em WO 2005/074647 como SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 4 em WO?2014/130812 e em WO 2008/148131 e WO 2011/035027; ou de Aspergillus, como Aspergillus fumigatus, como a descrita em WO 2010/138754 como SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3 em WO?2014/ 130812; ou de Penicillium, como Penicillium emersonii, como a divul- gada como SEQ ID NO: 2 em WO 2011/041397 ou SEQ ID NO: 2 em WO?2014/130812. Outras mono-oxigenases líticas de polissacarídeos adequadas incluem, mas não estão limitadas a, Trichoderma reesei (ver WO 2007/089290), Myceliophthora thermophila (ver WO 2009/ 085935, WO 2009/085859, WO 2009/085864, WO 2009/085868), Pe- nicillium pinophilum (ver WO 2011/005867), Thermoascus sp. (ver WO 2011/039319) e Thermoascus cristaceous (ver WO 2011/041504). Ou- tras enzimas celulolíticas que podem estar compreendidas na compo- sição enzimática são descritas nos documentos WO 98/13465, WO 98/015619, WO 98/015633, WO 99/06574, WO 99/10481, WO 99/ 025847, WO 99/031255, WO 2002/101078, WO 2003/027306, WO 2003/052054, WO 2003/052055, WO 2003/052056, WO 2003/052057, WO 2003/052118, WO 2004/016760, WO 2004/043980, WO 2004/ 048592, WO 2005/001065, WO 2005/028636, WO 2005/093050, WO 2005/093073, WO 2006/074005, WO 2006/117432, WO 2007/071818, WO 2007/071820, WO 2008/008070, WO 2008/008793, US 5.457.046, US 5.648.263 e US 5.686.593, para citar apenas alguns. Em uma mo- dalidade preferida, a mono-oxigenase lítica de polissacarídeo é de Ra- samsonia, por exemplo Rasamsonia emersonii (ver WO 2012/000892).

[0063] Em uma modalidade, a mono-oxigenase lítica de polissaca- rídeo adicional compreende uma das mono-oxigenases líticas de po- lissacarídeos acima mencionadas.

[0064] Como aqui usado, endoglucanases são enzimas capazes de catalisar a endo-hidrólise de ligações 1,4-B-D-glucosídicas em celu- lose, liquenina ou B-D-glucanos de cereais. Pertencem à EC 3.2.1.4 e também podem ser capazes de hidrolisar ligações 1,4 em B-D-gluca- nos contendo também ligações 1,3. Endoglucanases também podem ser referidas como celulases, avicelases, B-1,4-endoglucano-hidrola- ses, B-1,4-glucanases, carboximetil celulases, celudextrinases, endo- 1,4-B-D-glucanases, endo-1,4 -B-D-glucano-hidrolases ou endo-1,4-B- glucanases.

[0065] Em uma modalidade, a endoglucanase compreende uma endoglucanase de GH5 e/ou uma endoglucanase de GH7. Isto signifi- ca que pelo menos uma das endoglucanases da composição enzimá- tica é uma endoglucanase de GH5 ou uma endoglucanase de GH7. No caso de haver mais endoglucanases na composição enzimática, essas endoglucanases podem ser endoglucanases de GH5, endoglu- canases de GH7 ou uma combinação de endoglucanases de GH5 e endoglucanases de GH7. Numa modalidade preferida, a endogluca- nase compreende uma endoglucanase de GH5.

[0066] Em uma modalidade, uma composição enzimática aqui descrita inclui uma endoglucanase de Trichoderma, como Trichoderma reesei; de Humicola, como uma cepa de Humicola insolens; de Asper- gillus, como Aspergillus aculeatus ou Aspergillus kawachii, de Erwinia, como Erwinia carotovara; de Fusarium, como Fusarium oxysporum; de Thielavia, como Thielavia terrestris, de Humicola, como Humicola gri- sea var. thermoidea ou Humicola insolens; de Melanocarpus, como Melanocarpus albomyces; de Neurospora, como Neurospora crassa; de Myceliophthora, como Myceliophthora thermophila; de Cladorrhi-

num, como Cladorrhinum foecundissimum; e/ou de Chrysosporium, como uma cepa de Chrysosporium lucknowense. Em uma modalidade preferida a endoglucanase é de Rasamsonia, como a cepa de Rasam- sonia emersonii (ver WO 01/70998). Em uma modalidade até uma en- doglucanase bacteriana pode ser usada, incluindo, mas não limitada a, endoglucanase Acidothermus cellulolyticus (ver WO 91/05039; WO 93/15186; US 5 275 944; WO 96/02551; US 5 536 655, WO 00/70031, WO 05/093050); endoglucanase Ill de Thermobifida fusca (ver WO 05/093050); e endoglucanase V de Thermobifida fusca (ver WO 05/093050).

[0067] Como aqui usado, beta-xilosidases (EC 3.2.1.37) são poli- peptídeos que são capazes de catalisar a hidrólise de 1,4-B-D-xilanos, para remover resíduos sucessivos de D-xilose das terminações não redutoras. Beta-xilosidases podem também hidrolisar xilobiose. Beta- xilosidase pode também ser referida como xilano 1,4-B-xilosidase, 1,4- B-D-xilano xilo-hidrolase, exo-1,4-B-xilosidase ou xilobiase.

[0068] Em uma modalidade a beta-xilosidase inclui uma beta- xilosidase de GH3. Isto significa que pelo menos uma das beta- xilosidases da composição enzimática é uma beta-xilosidase de GH3. Em uma modalidade todas as beta-xilosidases da composição enzimá- tica são beta-xilosidases de GH3.

[0069] Em uma modalidade uma composição enzimática aqui des- crita inclui uma beta-xilosidase de Neurospora crassa, Aspergillus fu- migatus ou Trichoderma reesei. Em uma modalidade preferida a com- posição enzimática inclui uma beta-xilosidase de Rasamsonia, como Rasamsonia emersonii (ver WO 2014/118360).

[0070] Como aqui usado, uma endoxilanase (EC 3.2.1.8) é qual- quer polipeptídeo capaz de catalisar a endo-hidrólise de ligações 1,4- B-D-xilosídicas em xilanos. Esta enzima também pode ser referida co- mo endo-1,4-B-xilanase ou 1,4-B-D-xilan xilano-hidrolase. Uma alterna-

tiva é EC 3.2.1.136, uma endoxilanase de glucuronoarabinoxilano, uma enzima capaz de hidrolisar 1,4 ligações xilosídicas em glucurono- arabinoxilanos.

[0071] Em uma modalidade, a endoxilanase compreende uma xi- lanase de GH10. Isto significa que pelo menos uma das endoxilanases da composição enzimática é uma xilanase de GH10. Em uma modali- dade, todas as endoxilanases da composição enzimática são xilana- ses de GH10.

[0072] Em uma modalidade uma composição enzimática aqui des- crita compreende uma endoxilanase de Aspergillus aculeatus (ver WO 94/21785), Aspergillus fumigatus (ver WO 2006/078256), Penicillium pinophilum (ver WO 2011/041405), Penicillium sp. (ver WO 2010/ 126772), Thielavia terrestris NRRL 8126 (ver WO 2009/079210), Tala- romyces leycettanus, Thermobifida fusca, ou Trichophaea saccata GH10 (ver WO 2011/057083). Em uma modalidade preferida a com- posição enzimática compreende uma endoxilanase de Rasamsonia, como Rasamsonia emersonii (ver WO 02/24926).

[0073] Como aqui usado, uma beta-glucosidase (EC 3.2.1.21) é qualquer polipeptídeo capaz de catalisar a hidrólise de resíduos termi- nais de B-D-glicose não redutores com liberação de B-D-glicose. Esse polipeptídeo pode ter uma ampla especificidade para os B-D-glucosí- deos e também pode hidrolisar um ou mais dos seguintes: um B-D- galactosídeo, um a-L-arabinosídeo, um B-D-xilosídeo ou um B-D - fucosídeo. Esta enzima também pode ser referida como amigdalase, B-D-glucosídeo gluco-hidrolase, celobiase ou gentobiase.

[0074] Em uma modalidade, uma composição enzimática como aqui descrita compreende uma beta-glucosidase de Aspergillus, como Aspergillus oryzae, como a divulgada em WO 02/095014 ou a proteína de fusão com atividade de beta-glucosidase divulgada em WO 2008/057637, ou Aspergillus fumigatus, como o divulgado como SEQ

ID NO: 2 em WO 2005/047499 ou SEQ ID NO: 5 em WO 2014/130812 ou uma variante de beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus, como o divulgado em WO 2012/044915, como uma com as seguintes substi- tuições : F100D, S283G, N456E, F512Y (usando SEQ ID NO: 5 em WO 2014/130812 para numeração), ou Aspergillus aculeatus, Asper- gillus niger ou Aspergillus kawachi. Em outra modalidade a beta- glucosidase é derivada de Penicillium, como Penicillium brasilianum divulgada como SEQ ID NO:2 em WO 2007/019442, ou de Trichoder- ma, como Trichoderma reesei, como as descritas em US 6 022 725, US 6 982 159, US 7 045 332, US 7 005 289, US 2006/0258554 US 2004/0102619. Em uma modalidade até uma beta-glucosidase bacte- riana pode ser usada. Em outra modalidade, a beta-glucosidase é de- rivada de Thielavia terrestris (WO 2011/035029) ou Trichophaea sac- cata (WO 2007/019442). Em uma modalidade preferida a composição enzimática compreende uma beta-glucosidase de Rasamsonia, como Rasamsonia emersonii (ver WO 2012/000886).

[0075] Como aqui usado, uma celobio-hidrolase (EC 3.2.1.91) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de ligações 1,4-B-D-glucosídicas em celulose ou celotetraose, liberando celobiose das extremidades das cadeias. Essa enzima também pode ser referida como celulase 1,4-B-celobiosidase, 1,4-B-celobio-hidrolase, 1,4-B-D-glu- cano celobio-hidrolase, avicelase, exo-1,4-B-D-glucanase, exocelobio- hidrolase ou exoglucanase.

[0076] Em uma modalidade uma composição enzimática como aqui descrita inclui uma celobio-hidrolase | de Aspergillus, como As- pergillus fumigatus, como a Cel7A CBH | divulgada em SEQ ID NO:6 em WO 2011/057140 ou SEQ ID NO:6 em WO 2014/130812; de Tri- choderma, como Trichoderma reesei; de Chaetomium, como Chaeto- mium thermophilum; de Talaromyces, como Talaromyces leycettanus ou de Penicillium, como Penicillium emersonii. Em uma modalidade prefe-

rida a composição enzimática compreende uma celobio-hidrolase | de Rasamsonia, como Rasamsonia emersonii (ver WO 2010/122141).

[0077] Em uma modalidade, uma composição enzimática confor- me aqui descrita compreende uma celobio-hidrolase Il de Aspergillus, como Aspergillus fumigatus, como a da SEQ ID NO:7 em WO 2014/ 130812 ou de Trichoderma, como Trichoderma reesei, ou de Tala- romyces, como Talaromyces leycettanus, ou de Thielavia, como Thie- lavia terrestris, como celobio-hidrolase |l CEL6A de Thielavia terrestris. Em uma modalidade preferida a composição enzimática compreende uma celobio-hidrolase 1l de Rasamsonia, como Rasamsonia emersonii (ver WO 2011/098580).

[0078] Em uma modalidade, uma composição enzimática como aqui descrita compreende pelo menos duas celulases. As pelo menos duas celulases podem conter atividades iguais ou diferentes. A com- posição enzimática também pode compreender pelo menos uma en- zima que não seja uma celulase, por exemplo, uma hemicelulase ou uma pectinase. Em uma modalidade, a composição enzimática como aqui descrita compreende uma, duas, três, quatro classes ou mais de celulase, por exemplo, uma, duas, três ou quatro ou todas de uma mono-oxigenase lítica de polissacarídeo, uma endoglucanase, uma ou duas celobio-hidrolases e uma beta-glucosidase.

[0079] Em uma modalidade, uma composição enzimática como aqui descrita compreende uma mono-oxigenase lítica de polissacarí- deo, uma endoglucanase, uma celobio-hidrolase |, uma celobio- hidrolase Il, uma beta-glucosidase, uma beta-xilosidase e uma endoxi- lanase.

[0080] Em uma modalidade, uma composição enzimática como aqui descrita também compreende uma ou mais das enzimas mencio- nadas abaixo.

[0081] Como aqui usado, uma B-(1,3)(1,4)-glucanase (EC 3.2.1.73)

é qualquer polipeptídeo capaz de catalisar a hidrólise de ligações 1,4- B-D-glucosídicas em B-D -glucanos contendo ligações 1,3 e 1,4. Esse polipeptídeo pode atuar em liquenina e B-D-glucanos de cereais, mas não em B-D-glucanos contendo apenas ligações 1,3 ou 1,4. Essa en- zima também pode ser referida como liqueninase, 1,3-1,4-B-D-glucano 4-glucano-hidrolase, B-glucanase, endo-B-1,3-1,4 glucanase, liquenase ou ligação mista B- glucanase. Uma alternativa para esse tipo de en- zima é a EC 3.2.1.6, descrita como endo-1,3 (4) -beta-glucanase. Esse tipo de enzima hidrolisa ligações 1,3 ou 1,4 em beta-D-glucanase quando o resíduo de glicose cujo grupo redutor está envolvido na liga- ção a ser hidrolisada é ele próprio substituído em C-3. Nomes alterna- tivos incluem endo-1,3-beta-glucanase, laminarinase, 1,3- (1,3;)14) - beta-D-glucano 3 (4) glucano-hidrolase. Substratos incluem laminarina, liquenina e beta-D-glucanos de cereais.

[0082] Como aqui usado, uma a-L-arabinofuranosidase (EC

3.2.1.55) é qualquer polipeptídeo capaz de atuar em a-L-arabinofura- nosídeos, a-L-arabinanos contendo ligações (1,2) e/ou (1,3) - e/ou (1,5), arabinoxilanos e arabinogalactanos. Esta enzima também pode ser referida como a-N-arabinofuranosidase, arabinofuranosidase ou arabinosidase. Exemplos de arabinofuranosidases que podem estar compreendidas na composição enzimática incluem, mas não se limi- tam a, arabinofuranosidases de Aspergillus niger, Humicola insolens DSM 1800 (ver WO 2006/114094 e WO 2009/073383) e M. giganteus (ver WO 2006/114094).

[0083] Como aqui usado, uma a-D-glucuronidase (EC 3.2.1.139) é qualquer polipeptídeo capaz de catalisar uma reação da seguinte for- ma: alfa-D-glucuronosídeo + HO = um álcool + D-glucuronato. Esta enzima também pode ser referida como alfa-glucuronidase ou alfa- glucosiduronase. Essas enzimas também podem hidrolisar o ácido glucorônico 4-O-metilado, que também pode estar presente como um substituinte em xilanos. Uma alternativa é EC 3.2.1.131: xilan alfa-1,2- glucuronosidase, que catalisa a hidrólise de ligações alfa-1,2- (4-O- metil)alucuronosila. Exemplos de alfa-glucuronidases que podem estar compreendidas na composição enzimática incluem, mas não se limi- tam a, alfa-glucuronidases de Aspergillus clavatus, Aspergillus fumi- gatus, Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Humicola insolens (ver WO 2010/014706), Penicillium aurantiogrise ver WO 2009/068565) e Trichoderma reesei.

[0084] Como aqui usado, uma acetil-xilan esterase (EC 3.1.1.72) é qualquer polipeptídeo capaz de catalisar a desacetilação de xilanos e de xilo-oligossacarídeos. Esse polipeptídeo pode catalisar a hidrólise de grupos acetila a partir de xilana polimérica, xilose acetilada, glicose acetilada, acetato de alfa-naftila ou acetato de p-nitrofenila, mas, tipi- camente, não a partir de triacetilglicerol. Esse polipeptídeo normalmen- te não age sobre manano ou pactina acetilados. Exemplos de acetilxi- lano esterases que podem estar compreendidas na composição enzi- mática incluem, mas não estão limitados a, acetilxilano esterases de Aspergillus aculeatus (ver WO 2010/108918), Chaetomium globosum, Chaetomium gracile, Humicola insolens DSM 1800 (ver WO 2009/ 073709), Hypocrea jecorina (ver WO 2005/001036), Myceliophtera thermophila (ver WO 2010/014880), Neurospora crassa, Phaeosphae- ria nodorum e Thielavia terrestris NRRL 8126 (ver WO 2009/042846). Em uma modalidade preferida, a composição enzimática compreende uma acetil xilano esterase de Rasamsonia, como Rasamsonia emer- sonii (ver WO 2010/000888)

[0085] Como aqui usado, uma feruloil esterase (EC 3.1.1.73) é qualquer polipeptídeo capaz de catalisar uma reação da forma: feruloil- sacarídeo + HO = ferulado + sacarídeo. O sacarídeo pode ser, por exemplo, um oligossacarídeo ou um polissacarídeo. Pode tipicamente catalisar a hidrólise do grupo 4-hidroxi-3-metoxicinamoíla (feruloíla) a partir de um produto de açúcar esterificado, que geralmente é arabino- se em substratos "naturais". Acetato de p-nitrofenol e metil ferulato são tipicamente substratos mais pobres. Esta enzima também pode ser referida como hidrolase de éster de cinamoíla, esterase de ácido ferú- lico ou esterase de hidroxicinamoíla. Também pode ser referida como enzima acessória de hemicelulase, pois pode ajudar xilanases e pecti- nases a quebrar a hemicelulose e pectina da parede celular vegetal. Exemplos de feruloil esterases (esterase de ácido ferúlico) que podem estar compreendidas na composição enzimática incluem, mas não es- tão limitadas a, feruloil esterases de Humicola insolens DSM 1800 (ver WO 2009/076122), Neosartorya fischeri, Neurospora crassa, Penicil- lium aurantiogriseum (consulte WO 2009/127729) e Thielavia terrestris (ver WO 2010/053838 e WO 2010/065448).

[0086] Como aqui usado, uma cumaroilesterase (EC 3.1.1.73) é qualquer polipeptídeo capaz de catalisar uma reação da forma: cuma- roil-sacarídeo + H2O = cumarato + sacarídeo. O sacarídeo pode ser, por exemplo, um oligossacarídeo ou um polissacarídeo. Esta enzima pode também ser referida como trans-4-cumaroil esterase, trans-p- cumaroil esterase, p-cumaroil esterase ou ácido p-cumárico esterase. Esta enzima também se enquadra na EC 3.1.1.73, pelo que também pode ser referida como uma feruloil esterase.

[0087] Como aqui usado, uma a-galactosidase (EC 3.2.1.22) é qualquer polipeptídeo capaz de catalisar a hidrólise de resíduos de a- D-galactose terminais não redutores em a-D-galactosídeos, incluindo oligossacarídeos de galactose, galactomananos, galactanos e arabi- nogalactanos. Esse polipeptídeo também pode ser capaz de hidrolisar a-D-fucosídeos. Essa enzima também pode ser chamada de melibi- ase.

[0088] Como aqui usado, uma B-galactosidase (EC 3.2.1.23) é qualquer polipeptídeo capaz de catalisar a hidrólise de resíduos termi-

nais de B-D-galactose não redutores nos B-D-galactosídeos. Esse po- lipeptídeo também pode ser capaz de hidrolisar a-L-arabinosídeos. Esta enzima também pode ser referida como exo- (1-> 4) -B-D- galactanase ou lactase.

[0089] Como aqui usado, uma B-mananase (EC 3.2.1.78) é qual- quer polipeptídeo capaz de catalisar a hidrólise aleatória de ligações 1,4-B-D-manosídicas em mananos, galactomananos e glucomananos. Esta enzima também pode ser referida como manano endo-1,4-8- manosidase ou endo-1,4-mananase.

[0090] Como aqui usado, uma B-manosidase (EC 3.2.1.25) é qual- quer polipeptídeo capaz de catalisar a hidrólise de resíduos terminais de B-D-manose não redutores nos B-D-manosídeos. Esta enzima tam- bém pode ser referida como mananase ou manase.

[0091] Como aqui usado, uma endo-poligalacturonase (EC

3.2.1.15) é qualquer polipeptídeo capaz de catalisar a hidrólise aleató- ria de ligações 1,4-a-D-galactosidurônicas em pectato e outros galac- turonanos. Esta enzima pode também ser referida como poligalacturo- nase pectina despolimerase, pectinase, endopoligalacturonase, pecto- lase, pectina hidrolase, pectina poligalacturonase, poli-a-1,4-galacturo- nida glicanoidrolase, endogalacturonase; endo-D-galacturonase ou poli (1,4-a-D-galacturonida) glicanoidrolase.

[0092] Como aqui usado, uma pectina metil esterase (EC 3.1.1.11) é qualquer enzima capaz de catalisar a reação: pectina + nHO = n metanol + pectato. A enzima também pode ser conhecida como pecti- nesterase, pectina desmetoxilase, pectina metoxilase, pectina metiles- terase, pectase, pectinoesterase ou pectina pectil-hidrolase.

[0093] Como aqui usado, uma endo-galactanase (EC 3.2.1.89) é qualquer enzima capaz de catalisar a endo-hidrólise de ligações 1,4-B- D-galactosídicas em arabinogalactanos. A enzima também pode ser conhecida como endo-1,4-B-galactosidase de arabinogalactano, endo-

1,4-B-galactanase, galactanase, arabinogalactanase ou arabinogalac- tan 4-B-D-galactano-hidrolase.

[0094] Como aqui usado, uma pectina-acetil-esterase é aqui defi- nida como qualquer enzima que possui uma atividade de acetil- esterase que catalisa a desacetilação dos grupos acetila dos grupos hidroxila dos resíduos GalUA da pectina.

[0095] Como aqui usado, uma endo-pectina-liase (EC 4.2.2.10) é qualquer enzima capaz de catalisar a clivagem eliminativa do éster metílico de (1— 4) -a-D-galacturonana para dar oligossacarídeos com grupos 4-desóxi-6-O-metil a-D-galact-4-enuronosila nas suas extremi- dades não redutoras. A enzima também pode ser conhecida como pectina-liase, pectina trans-eliminase; endo-pectina-liase, polimetil- galacturônico transeliminase, pectina-metiltranseliminase, pectoliase, PL, PNL ou PMGL ou (1 4) -6-O-metil-a-D-galacturonan-liase.

[0096] Como aqui usado, uma pectato-liase (EC 4.2.2.2) é qual- quer enzima capaz de catalisar a clivagem eliminativa de (1—+4)-a-D- galacturonano para dar oligossacarídeos com grupos 4-desóxi-a-D- galact-4-enuronosila em suas terminações não redutores. A enzima também pode ser conhecida como transeliminase poligalacturônica, ácido péctico transeliminase, poligalacturonato-liase, endopectina me- tiltranseliminase, pectato transeliminase, endogalacturonato transeli- minase, ácido péctico liase, liase péctica, ácido a-1,4-D-endopoliga- lacturônico liase, PGA liase, PPase-N, ácido endo-a-1,4-poligalactu- rônico liase, ácido poligalacturônico liase, pectina trans-eliminase, áci- do poligalacturônico trans-eliminase ou (1 +4)-a-D-galacturonano liase.

[0097] Como aqui usado, uma alfa-ramnosidase (EC 3.2.1.40) é qualquer polipeptídeo capaz de catalisar a hidrólise de resíduos termi- nais de a-L-ramnose não redutores em a-L-ramnosídeos ou, alternati- vamente, em ramnogalacturonano. Esta enzima pode também ser co- nhecida como a-L-ramnosidase T, a-L-ramnosidase N ou a-L-ramno-

sídeo ramno-hidrolase.

[0098] Como aqui usado, exogalacturonase (EC 3.2.1.82) é qual- quer polipeptídeo capaz de hidrólise do ácido péctico a partir da ex- tremidade não redutora, liberando digalacturonato. A enzima também pode ser conhecida como exo-poli-a-galacturonosidase, exopoligalac- turonosidase ou exopoligalacturanosidase.

[0099] Como aqui usado, exo-galacturonase (EC 3.2.1.67) é qual- quer polipeptídeo capaz de catalisar: (1,4-a-D-galacturonida)) + HO = (1,4-a-D-galacturonida))-; + D-galacturonato. A enzima também pode ser conhecida como galacturan 1,4-a-galacturonidase, exopoligalactu- ronase, poli(galacturonato)hidrolase, exo-D-galacturonase, exo-D-ga- lacturonanase, exopoli-D-galacturonase ou poli(1,4-a- D-galacturonida) galacturono-hidrolase.

[00100] Como aqui usado, exopoligalacturonato-liase (EC 4.2.2.9) é qualquer polipeptídeo capaz de catalisar a clivagem eliminativa de 4- (4-desóxi-a-D-galact-4-enuronosil)-D-galacturonato da extremidade redutora do pectato, isto é, pectina desesterificada. Essa enzima pode ser conhecida como dissacarídeo pectato-liase, pectato exo-liase, áci- do exopéctico transeliminase, exopectato liase, ácido exopoligalactu- rônico-trans-eliminase, PATE, exo-PATE, exo-PGL ou dissacarídeo com extremidade redutora (1—+4)-a-D-galacturonano-liase.

[00101] Como aqui usado, ramnogalacturonano hidrolase é qual- quer polipeptídeo capaz de hidrolisar a ligação entre ácido galactosilu- rônico e ramnopiranosila de uma maneira endo, em estruturas de ram- nogalacturonanas estritamente alternadas, consistindo do dissacarídeo [(1,2-alfa-L-ramnoil-ácido(1,4)-alfa-galactosilurônico].

[00102] Como aqui usado, ramnogalacturonano-liase é qualquer polipeptídeo capaz de clivar ligações a-L-Rhap-(144)-a-D-GalpA de uma maneira endo em ramnogalacturonano por eliminação beta.

[00103] Como aqui usado, ramnogalacturonano acetil esterase é qualquer polipeptídeo que catalisa a desacetilação da espinha dorsal de resíduos de ramnose e ácido galacturônico alternados em ramno- galacturonano.

[00104] “Como aqui usado, ramnogalacturonano galacturono-hidro- lase é qualquer polipeptídeo capaz de hidrolisar o ácido galacturônico a partir da extremidade não redutora de estruturas de ramnogalacturo- nano estritamente alternadas de uma maneira exo.

[00105] “Como aqui usado, xilogalacturonase é qualquer polipeptí- deo que atua sobre xilogalacturonano, clivando a espinha dorsal do ácido galacturônico substituído por B-xilose de uma maneira endo. Es- sa enzima também pode ser conhecida como xilogalacturonano hidro- lase.

[00106] Como aqui usado, uma a-L-arabinofuranosidase (EC

3.2.1.55) é qualquer polipeptídeo capaz de atuar em a-L-arabinofura- nosídeos, a-L-arabinanos contendo ligações (1,2) e/ou (1,3) e/ou (1,5), arabinoxilanos e arabinogalactanos. Esta enzima também pode ser referida como a-N-arabinofuranosidase, arabinofuranosidase ou arabi- nosidase.

[00107] Como aqui usado, endo-arabinanase (EC 3.2.1.99) é qual- quer polipeptídeo capaz de catalisar endo-hidrólise de ligações 1,5-0 - arabinofuranosídicas em 1,5-arabinanos. A enzima também pode ser conhecida como endo-arabinase, arabinano endo-1,5-a-L-arabinosi- dase, endo-1,5-a-L-arabinanase, endo-a-1,5-arabanase; endo-araba- nase ou 1,5-a-L-arabinano 1,5-a-L-arabinano-hidrolase.

[00108] "Protease" inclui enzimas que hidrolisam ligações peptídi- cas (peptidases), bem como enzimas que hidrolisam ligações entre peptídeos e outras porções, como produto de açúcares (glicopeptida- ses). Muitas proteases são caracterizadas de acordo com EC 34 e são adequadas para uso nos processos aqui descritos. Alguns tipos específicos de proteases incluem cisteína proteases, incluindo pepsi-

na, papaína e serina proteases, incluindo quimotripsinas, carboxipepti- dases e metaloendopeptidases.

[00109] "Lipase" inclui enzimas que hidrolisam lipídios, ácidos gra- xos e acilglicerídeos, incluindo fosfoglicerídeos, lipoproteínas, diacilgli- cerois e similares. Nas plantas, lipídios são usados como componen- tes estruturais para limitar a perda de água e a infecção por patóge- nos. Esses lipídios incluem ceras derivadas de ácidos graxos, bem como cutina e suberina.

[00110] "Ligninase" inclui enzimas que podem hidrolisar ou quebrar a estrutura dos polímeros de lignina. As enzimas que podem quebrar lignina incluem lignina-peroxidases, manganês-peroxidases, lacases e feruloil-esterases e outras enzimas descritas na técnica conhecidas por despolimerizar ou de outro modo quebrar polímeros de lignina. Também estão incluídas enzimas capazes de hidrolisar ligações for- madas entre açúcares hemicelulósicos (principalmente arabinose) e lignina. As ligninases incluem, mas não estão limitadas ao seguinte grupo de enzimas: lignina peroxidases (EC 1.11.1.14), manganês pe- roxidases (EC 1.11.1.13), lacases (EC 1.10.3.2) e feruloil esterases (EC 3.1.1.73).

[00111] "Hexosiltransferase" (2.4.1-) inclui enzimas que são capa- zes de catalisar uma reação de transferase, mas que também podem catalisar uma reação de hidrólise, por exemplo, de celulose e/ou pro- dutos de degradação da celulose. Um exemplo de uma hexosiltransfe- rase que pode ser utilizada é uma B-glucanosiltransferase. Essa enzi- ma pode ser capaz de catalisar a degradação de (1,3) (1,4) glucano e/ou celulose e/ou um produto de degradação de celulose.

[00112] "Glucuronidase" inclui enzimas que catalisam a hidrólise de um glucuronosídeo, por exemplo B-glucuronosídeo para produzir um álcool. Muitas glucuronidases foram caracterizadas e podem ser ade- quadas para uso, por exemplo, B-glucuronidase (EC 3.2.1.31), hialuro-

no-glucuronidase (EC 3.2.1.36), glucuronosil-dissulfoglucosamina glu- curonidase (3.2.1.56), glicirrizinato B-glucuronidase (3.2 .1.128) ou a- D-glucuronidase (EC 3.2.1.139).

[00113] Expansinas estão implicadas no afrouxamento da estrutura da parede celular durante o crescimento celular da planta. As expansi- nas foram propostas para romper a ligação de hidrogênio entre a celu- lose e outros polissacarídeos da parede celular sem ter atividade hi- drolítica. Deste modo, acredita-se que elas permitam o deslizamento das fibras de celulose e alargamento da parede celular. A swolenina, uma proteína do tipo expansina, contém um domínio da família 1 de módulos de ligação a carboidratos de terminal N (CBD) e um domínio do tipo expansina de terminal C. Como descrito neste documento, uma proteína do tipo expansina ou uma proteína do tipo swolenina pode compreender um ou ambos os domínios e/ou pode romper a estrutura das paredes celulares (como romper a estrutura da celulose), opcio- nalmente sem produzir quantidades detectáveis de açúcares reduto- res.

[00114] Uma proteína induzida por celulose, por exemplo, o produto polipeptídico do gene cip1 ou cip2 ou de genes semelhantes (ver Fo- reman et al., J. Biol. Chem. 278 (34), 31988-31997, 2003), uma proteí- na integradora de celulose/celulossoma, por exemplo, o produto poli- peptídico do gene cipA ou cipC, ou uma proteína andaime ou proteína semelhante à proteína andaime. Andaimes ("scaffoldins") e proteínas integradoras de celulose são subunidades integradoras multifuncionais que podem organizar subunidades celulolíticas em um complexo mul- tienzima. Isto é conseguido pela interação de duas classes de domínio complementares, isto é, um domínio de coesão em andaime e um do- mínio dockerina em cada unidade enzimática. A subunidade andaime também possui um módulo de ligação à celulose (cellulose-binding module CBM) que medeia a ligação do celulossoma a seu substrato.

Um andaime ou proteína de integração à celulose pode abranger um ou ambos os domínios.

[00115] Uma catalase; o termo "catalase" significa um peróxido de hidrogênio: oxidoredutase de peróxido de hidrogênio (EC 1.11.1.6 ou EC 1.11.1.21) que catalisa a conversão de dois peróxidos de hidrogê- nio em oxigênio e duas águas. A atividade de catalase pode ser de- terminada monitorando a degradação do peróxido de hidrogênio a 240 nm, com base na seguinte reação: 2H202 — 2H20 + O>. A reação é conduzida em fosfato 50 mM, pH 7,0 a 25ºC, com substrato 10,3 mM (H2O0>2) e aproximadamente 100 unidades de enzima por ml. A absor- bância é monitorada espectrofotometricamente dentro de 16 a 24 se- gundos, o que deve corresponder a uma redução de absorbância de 0,45 a 0,4. Uma unidade de atividade de catalase pode ser expressa como um micromo!l de H2O>2 degradado por minuto a pH 7,0 e 25ºC.

[00116] O termo "amilase", como aqui usado, significa enzimas que hidrolisam as ligações alfa-1,4-glucosídicas no amido, tanto na amilose quanto na amilopectina, como alfa-amilase (EC 3.2.1.1), beta-amilase (EC 3.2.1.2) , glucano 1,4-alfa-glucosidase (EC 3.2.1.3), glucano 1,4- alfa-maltotetrao-hidrolase (EC 3.2.1.60), glucano 1,4-alfa-maltohexa- osidase (EC 3.2.1.98), glucano 1,4 -alfa-maltotrio-hidrolase (EC

3.2.1.116) e glucano 1,4-alfa-malto-hidrolase (EC 3.2.1.133) e enzimas que hidrolisam as ligações alfa-1,6-glucosídicas, sendo os pontos de ramificação da amilopectina, como pululanase (EC 3.2.1.41) e dexti- nase-limite (EC 3.2.1.142).

[00117] Uma composição para uso nos processos conforme aqui descritos pode ser composta por enzimas de (1) fornecedores comer- ciais; (2) genes clonados que expressam enzimas; (3) caldo (como aquele resultante do crescimento de uma cepa microbiana em meio, em que as cepas secretam proteínas e enzimas no meio); (4) lisados celulares de cepas cultivadas como em (3); e / ou (5) material de plan-

ta expressando enzimas. Diferentes enzimas em uma composição da invenção podem ser obtidas de diferentes fontes.

[00118] As enzimas podem ser produzidas exogenamente em mi- cro-organismos, leveduras, fungos, bactérias ou plantas, depois isola- das e adicionadas, por exemplo, a material lignocelulósico. Alternati- vamente, a enzima pode ser produzida em uma fermentação que utili- za material lignocelulósico (pré-tratado) (como palha de milho ou palha de trigo) para fornecer nutrição a um organismo que produz (uma) en- zima (s). Deste modo, plantas que produzem as enzimas podem, elas mesmas, servir como material lignocelulósico e serem adicionadas ao material lignocelulósico.

[00119] Nos usos e processos aqui descritos, os componentes das composições descritas acima podem ser fornecidos concomitantemen- te (isto é, como uma única composição per se) ou separadamente ou sequencialmente.

[00120] Material lignocelulósico, conforme aqui utilizado, inclui qualquer material lignocelulósico e / ou hemicelulósico. Material ligno- celulósico adequado para utilização nos processos aqui descritos inclui biomassa, por exemplo, biomassa virgem e/ou biomassa não-virgem, como biomassa agrícola, produtos orgânicos comerciais, detritos de construção e demolição, resíduos sólidos urbanos, resíduos de papel e restos de jardinagem (lixo verde). Formas comuns de biomassa incluem árvores, arbustos e gramíneas, trigo, palha de trigo, cana-de-açúcar, pa- lha de cana, bagaço de cana, switch grass (Panicum virgatum) , Mis- canthus, cana-energia, milho, palha de milho, casca de milho, espigas de milho, fibra de milho, grãos de milho, hastes de canola, hastes de soja, sorgo doce, produtos e subprodutos da moagem de grãos como milho, trigo e cevada (incluindo moagem úmida e moagem a seco), geralmente chamados de "farelo ou fibra", grãos secos para destilari- as, bem como resíduos sólidos urbanos, resíduos de papel e restos de jardinagem. A biomassa também pode ser, mas não se limita a, mate- rial herbáceo, resíduos agrícolas, resíduos florestais, resíduos sólidos urbanos, resíduos de papel e resíduos de fábricas de polpa e papel. "Biomassa agrícola" inclui galhos, arbustos, canas, milho e cascas de milho, culturas energéticas, florestas, frutos, flores, grãos, gramíneas, culturas herbáceas, folhas, casca, agulhas, toras, raízes, mudas, cultu- ras lenhosas de rotação curta, arbustos, switch grasses (gramíneas da família Panicum Virgatum), árvores, legumes, cascas de frutas, trepa- deiras, polpa de beterraba sacarina, produto da moagem de trigo que não é a farinha de trigo em si (wheat middlings), cascas de aveia e madeiras duras e macias (sem incluir madeiras com materiais prejudi- ciais). Além disso, biomassa agrícola inclui resíduos orgânicos gera- dos a partir de processos agrícolas, incluindo atividades agrícolas e florestais, incluindo especificamente resíduos florestais de madeira. Biomassa agrícola pode ser qualquer um dos itens mencionados ante- riormente sozinhos ou em qualquer combinação ou mistura dos mes- mos.

[00121] A composição enzimática usada no processo descrito aqui pode hidrolisar de maneira extremamente eficaz material lignocelulósi- co, por exemplo, palha de milho, palha de trigo, palha de cana e/ou bagaço de cana de açúcar, que pode ser posteriormente convertida em um produto, como etanol, biogás, butanol, um plástico, um ácido orgânico, um solvente, um suplemento de ração animal, um produto farmacêutico, uma vitamina, um aminoácido, uma enzima ou uma ma- téria-prima química. Além disso, produtos intermediários de um pro- cesso após hidrólise, por exemplo, ácido lático como intermediário na produção de biogás, podem ser usados como blocos de construção para outros materiais.

[00122] Em uma modalidade, a quantidade de proteína (isto é, pro- teína de composição enzimática, conforme determinada pelo ensaio de biureto (veja, por exemplo, o Exemplo 1)) adicionada na etapa (i) (do processo de hidrólise como aqui descrito) é de 1 a 40 mg/g de glu- cano no material lignocelulósico pré-tratado. De preferência, a quanti- dade de proteína adicionada na etapa (i) é de 2 a 30 mg/g de glucano no material lignocelulósico pré-tratado, de 3 a 20 mg/g de glucano no material lignocelulósico pré-tratado, de 4 a 18 mg/g de glucano no ma- terial lignocelulósico pré-tratado e de preferência de 5 a 15 mg/g de glucano no material lignocelulósico pré-tratado.

[00123] Emuma modalidade, a quantidade de proteína LPMO (con- forme determinada pelo ensaio de TCA-biureto (veja, por exemplo, o Exemplo 1)) adicionada na etapa (iii) (do processo de hidrólise con- forme descrito aqui) é de 0,01 a 20 mg/g de glucano no material ligno- celulósico pré-tratado. De preferência, a quantidade de proteína LPMO adicionada na etapa (ili) é de 0,02 a 15 mg/g de glucano no material lignocelulósico pré-tratado, de 0,05 a 10 mg/g de glucano no material lignocelulósico pré-tratado, de 0,1 a 8 mg/g de glucano no material lig- nocelulósico pré-tratado e de preferência de 0,2 a 5 mg/g de glucano no material lignocelulósico pré-tratado.

[00124] A quantidade de glucano no material lignocelulósico pré- tratado é medida de acordo com o método descrito por Carvalho de Souza et al. (Carbohydrate Polymers (polímeros de Carboidrato), 95 (2013) 657-663).

[00125] O pH durante a hidrólise enzimática pode ser escolhido pe- lo especialista. Em uma modalidade, o pH durante a hidrólise é de 3,0 a 6,5, de 3,5 a 6,0, preferivelmente de 4,0 a 5,0.

[00126] Em uma modalidade, a hidrólise enzimática é realizada a uma temperatura de 40ºC a 90ºC, de 45ºC a 80ºC, de 50ºC a 70ºC, de 55ºC a 65ºC.

[00127] Em uma modalidade, a hidrólise enzimática é realizada até que 70% ou mais, 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 92% ou mais, 95% ou mais do produto de açúcar disponível no material ligno- celulósico sejam liberados.

[00128] Significativamente, um processo de hidrólise enzimática conforme aqui descrito pode ser realizado usando altos níveis de ma- téria seca do material lignocelulósico. Em uma modalidade o teor de matéria seca é de 5% em peso ou mais, 6 % em peso ou mais, 7 % em peso ou mais, 8 % em peso ou mais, 9 % em peso ou mais, 10 % em peso ou mais, 11 % em peso ou mais, 12 % em peso ou mais, 13 % em peso ou mais, 14 % em peso ou mais, 15 % em peso ou mais, 16 % em peso ou mais, 17 % em peso ou mais, 18 % em peso ou mais, 19 % em peso ou mais, 20 % em peso ou mais, 21 % em peso ou mais, 22 % em peso ou mais, 23 % em peso ou mais, 24 % em pe- so ou mais, 25 % em peso ou mais, 26 % em peso ou mais, 27 % em peso ou mais, 28 % em peso ou mais, 29 % em peso ou mais, 30 % em peso ou mais, 31 % em peso ou mais, 32 % em peso ou mais, 33 % em peso ou mais, 34 % em peso ou mais, 35 % em peso ou mais, 36 % em peso ou mais, 37 % em peso ou mais, 38 % em peso ou mais or 39 % em peso ou mais. Em uma modalidade o teor de matéria seca da hidrólise enzimática é de 5 % em peso - 40 % em peso, de 6 % em peso - 38 % em peso, de 7 % em peso - 36 % em peso, de 8 % em peso - 34 % em peso, de 9 % em peso - 32 % em peso, de 10 % em peso - 30 % em peso, de 11 % em peso - 28 % em peso, de 12% em peso - 26 % em peso, de 13 % em peso - 24 % em peso, de 14 % em peso - 22 % em peso, de 15 % em peso - 20 % em peso

[00129] “Como descrito acima, a presente invenção também se refe- re a um processo para preparação de um produto de fermentação a partir de material lignocelulósico, compreendendo as etapas de (a) realizar um processo para preparação de um produto de açúcar a par- tir de material lignocelulósico, como descrito acima, (b) fermentar o produto de açúcar para obter o produto de fermentação; e (c) opcio-

nalmente, recuperar o produto de fermentação.

[00130] Em uma modalidade, a fermentação (isto é, a etapa b) é realizada em um ou mais biorreatores. Em uma modalidade, a fermen- tação é feita por um micro-organismo produtor de álcool para produzir álcool. A fermentação por um microrganismo produtor de álcool para produzir álcool pode ser feita no mesmo biorreator em que é realizada a hidrólise enzimática. Alternativamente, a fermentação por um mi- crorganismo produtor de álcool para produzir álcool pode ser realizada em um ou mais biorreatores separados.

[00131] Emuma modalidade, a fermentação é feita por uma levedu- ra. Em uma modalidade, o microrganismo produtor de álcool é uma levedura. Em uma modalidade, o microrganismo produtor de álcool é capaz de fermentar pelo menos um produto de açúcar C5 e pelo me- nos um produto de açúcar C6.

[00132] Em um aspecto adicional, a invenção inclui assim proces- sos de fermentação nos quais um micro-organismo é usado para fer- mentação de uma fonte de carbono contendo produto de açúcar(es), por exemplo, glicose, L-arabinose e/ou xilose. A fonte de carbono pode incluir qualquer oligo ou polímero de carboidrato compreendendo uni- dades de L-arabinose, xilose ou glicose, como por exemplo lignocelu- lose, xilanos, celulose, amido, arabinano e similares. Para liberação de unidades de xilose ou glicose desses carboidratos, carboidrases apro- priadas (tais como xilanases, glucanases, amilases e similares) podem ser adicionadas ao meio de fermentação ou podem ser produzidas pe- la célula hospedeira modificada. No último caso, a célula hospedeira modificada pode ser geneticamente modificada para produzir e excre- tar essas carboidrases. Uma vantagem adicional do uso de fontes oli- go- ou poliméricas de glicose é que ela permite manter uma concen- tração mais baixa de glicose livre durante a fermentação, por exemplo, usando quantidades limitadoras de taxa das carboidrases. Isso, por sua vez, impedirá a repressão de sistemas necessários para metabo- lismo e transporte de açúcares que não sejam glicose, como a xilose. Em um processo preferido, a célula hospedeira modificada fermenta tanto a L-arabinose (opcionalmente xilose) como a glicose, preferivel- mente simultaneamente; caso em que, preferivelmente é utilizada uma célula hospedeira modificada que é insensível à repressão da glicose para impedir o crescimento diauxico. Além de uma fonte de L-arabi- nose, opcionalmente xilose (e glicose) como fonte de carbono, o meio de fermentação incluirá ainda o ingrediente apropriado necessário pa- ra o crescimento da célula hospedeira modificada. Composições de meios de fermentação para crescimento de microrganismos, como le- veduras ou fungos filamentosos, são bem conhecidas na técnica.

[00133] O processo de fermentação pode ser um processo de fer- mentação aeróbica ou anaeróbica. Um processo de fermentação ana- eróbica é aqui definido como um processo de fermentação executado na ausência de oxigênio ou no qual substancialmente nenhum oxigê- nio é consumido, de preferência menos de 5, 2,5 ou 1 mmol/L/h, mais preferivelmente O mmol/L/h é consumido (ou seja, o consumo de oxi- gênio não é detectável) e em que moléculas orgânicas servem como doadoras e aceptoras de elétrons. Na ausência de oxigênio, o NADH produzido na glicólise e na formação de biomassa não pode ser oxida- do por fosforilação oxidativa. Para resolver esse problema, muitos mi- cro-organismos usam piruvato ou um de seus derivados como um aceptor de elétrons e hidrogênio, regenerando assim o NAD +. Assim, em um processo de fermentação anaeróbica preferido, piruvato é usa- do como aceptor de elétron (e hidrogênio) e é reduzido a produtos de fermentação como etanol, ácido lático, ácido 3-hidróxi-propiônico, áci- do acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, um aminoácido, 1,3-propanodiol, etileno, glicerol, bu- tanol, um antibiótico B-lactama e uma cefalosporina. Em uma modali-

dade preferida, o processo de fermentação é anaeróbico. Um proces- so anaeróbico é vantajoso, pois é mais barato que processos aeróbi- cos: é necessário menos equipamento especial. Além disso, espera-se que processos anaeróbicos resultem em um rendimento mais alto do que processos aeróbicos. Em condições aeróbicas, geralmente o ren- dimento de biomassa é maior do que em condições anaeróbicas. Co- mo consequência, geralmente em condições aeróbicas, o rendimento esperado do produto é menor do que em condições anaeróbicas.

[00134] Em outramodalidade, o processo de fermentação está sob condições limitadas de oxigênio. Mais preferivelmente, o processo de fermentação é aeróbico e em condições limitadas de oxigênio. Um processo de fermentação com oxigênio limitado é um processo no qual o consumo de oxigênio é limitado pela transferência de oxigênio do gás para o líquido. O grau de limitação de oxigênio é determinado pela quantidade e composição do fluxo de entrada de gás, bem como pelas propriedades reais de mistura / transferência de massa do equipamen- to de fermentação utilizado. De preferência, em um processo em con- dições limitadas de oxigênio, a taxa de consumo de oxigênio é de pelo menos 5,5, mais preferivelmente de pelo menos 6 e ainda mais prefe- rivelmente de pelo menos 7 mmol/L/h. Em uma modalidade, o proces- so de fermentação de álcool é anaeróbico.

[00135] O processo de fermentação é de preferência executado a uma temperatura ideal para o micro-organismo utilizado. Assim, para a maioria das leveduras ou células fúngicas, o processo de fermentação é realizado a uma temperatura inferior a 42ºC, preferivelmente 38ºC ou inferior. Para células hospedeiras de levedura ou fungos filamentosos, o processo de fermentação é realizado de preferência a uma tempera- tura inferior a 35, 33, 30 ou 28ºC e a uma temperatura superior a 20, 22 ou 25ºC. Em uma modalidade, a etapa de fermentação do álcool é realizada entre 25ºC e 35ºC.

[00136] Em uma modalidade, as fermentações são realizadas com um micro-organismo fermentador. Em uma modalidade da invenção, as fermentações de álcool (por exemplo etanol) de açúcares C5 são realizadas com um micro-organismo fermentador C5. Em uma modali- dade da invenção, as fermentações de álcool (por exemplo etanol) de açúcares C6 são realizadas com um microrganismo fermentador C5 ou um microrganismo comercial fermentador C6. Leveduras disponí- veis comercialmente adequadas para a produção de etanol incluem, entre outras, BIOFERMTY AFT e XR (NABC - North American Biopro- ducts Corporation, GA, EUA), levedura ETHANOL RED'Y (Fermentis / Lesaffre, EUA), FALI'Y (Fleischmann's Yeast, EUA), FERMIOLTY (DSM Specialties), GERT STRAND'Y (Gert Strand AB, Suécia) e leve- dura fresca SUPERSTART'!Y e THERMOSACC'Y (Ethanol Techno- logy, WI, EUA).

[00137] Em uma modalidade, o micro-organismo produtor de álcool é um micro-organismo capaz de fermentar pelo menos um produto de açúcar C5. De preferência, também é capaz de fermentar pelo menos um produto de açúcar C6. Em uma modalidade, o pedido descreve um processo para preparação de etanol a partir de material lignocelulósi- co, compreendendo as etapas de (a) executar um processo para pre- paração de um produto de açúcar a partir de material lignocelulósico, conforme descrito acima, (b) fermentação do produto de açúcar para produzir etanol; e (c) opcionalmente, recuperação do etanol. A fermen- tação pode ser feita com um micro-organismo capaz de fermentar pelo menos um produto de açúcar C5.

[00138] Os microrganismos produtores de álcool podem ser um or- ganismo procariótico ou eucariótico. O micro-organismo usado no pro- cesso pode ser um micro-organismo geneticamente modificado. Exemplos de organismos produtores de álcool adequados são leveduras, por exemplo Saccharomyces, e.g. Saccharomyces cerevisiae, Saccha-

romyces pastorianus ou Saccharomyces uvarum, Hansenula, Issat- chenkia, e.g. Issatchenkia orientalis, Pichia, e.g. Pichia stipites ou Pi- chia pastoris, Kluyveromyces, e.g. Kluyveromyces fagilis, Candida, e.g. Candida pseudotropicalis ou Candida acidothermophilum, Pachysolen, e.g. Pachysolen tannophilus ou bactérias, por exemplo Lactobacillus, e.g. Lactobacillus lactis, Geobacillus, Zymomonas, e.g. Zymomonas mobilis, Clostridium, e.g. Clostridium phytofermentans, Escherichia, e.g. E. coli, Klebsiella, e.g. Klebsiella oxytoca. Em uma modalidade, o microrganismo capaz de fermentar pelo menos um produto de açúcar C5 é uma levedura. Em uma modalidade, a levedura pertence ao gê- nero Saccharomyces, preferivelmente da espécie Saccharomyces ce- revisiae. A levedura, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, utilizada nos processos de acordo com a presente invenção, é capaz de con- verter açúcares hexose (C6) e açúcares pentose (C5). A levedura, por exemplo,.Saccharomyces cerevisiae, usada nos processos de acordo com a presente invenção, pode fermentar anaerobicamente pelo me- nos um produto de açúcar C6 e pelo menos um produto de açúcar C5. Por exemplo, a levedura é capaz de usar L-arabinose e xilose em adi- ção à glicose anaerobicamente. Em uma modalidade, a levedura é ca- paz de converter L-arabinose em L-ribulose e / ou xilulose 5-fosfato e/ou em um produto de fermentação desejado, por exemplo, em eta- nol. Organismos, por exemplo, cepas de Saccharomyces cerevisiae, capazes de produzir etanol a partir de L-arabinose podem ser produzi- dos modificando uma levedura hospedeira que introduz os genes araA (L-arabinose isomerase), araB (L-ribuloglioxalato) e araD (L-ribulose-5- P4 -epimerase) de uma fonte adequada. Esses genes podem ser in- troduzidos em uma célula hospedeira para que seja capaz de usar arabinose. Essa abordagem é descrita no documento WOZ2003 /

095627. Genes araA, araB e araD de Lactobacillus plantarum podem ser utilizados e são divulgados em WO2008/041840. O gene araÃA de

Bacillus subtilis e os genes araB e araD de Escherichia coli podem ser utilizados e são divulgados em EP1499708. Em outra modalidade, os genes araA, araB e araD podem derivar de pelo menos um dos gêne- ros Clavibacter, Arthrobacter e/ou Gramella, em particular um de Cla- vibacter michiganensis, Arthrobacter aurescens e/ou Gramella forsetii, conforme divulgado em WO 2009011591. Em uma modalidade, a le- vedura também pode compreender uma ou mais cópias do gene de xilose isomerase e/ou uma ou mais cópias de xilose redutase e/ou xili- tol desidrogenase.

[00139] A levedura pode compreender uma ou mais modificações genéticas para permitir que a levedura fermente xilose. Exemplos de modificações genéticas são a introdução de um ou mais genes xylA, genes XYL1 e genes XYL2 e/ou genes XKS1; deleção do gene da al- dose redutase (GRE3); superexpressão de genes PPP TAL1, TKL1, RPE1 e RKI1 para permitir o aumento do fluxo através da via da pen- tose fosfato na célula. Exemplos de leveduras geneticamente modifi- cadas são descritos em EP1468093 e/ou WO2006/009434.

[00140] Um exemplo de uma levedura comercial adequada é RN1016, que é uma cepa Saccharomyces cerevisiae que fermenta xilose e glicose da DSM, na Holanda.

[00141] Em uma modalidade, o processo de fermentação para pro- dução de etanol é anaeróbico. Anaeróbico já foi definido anteriormente neste relatório. Em outra modalidade preferida, o processo de fermen- tação para produção de etanol é aeróbico. Em outra modalidade prefe- rida, o processo de fermentação para produção de etanol é feito em condições limitadas de oxigênio, mais preferivelmente aeróbicas e em condições limitadas de oxigênio. As condições limitadas de oxigênio já foram definidas anteriormente neste relatório.

[00142] É Alternativamente, para os processos de fermentação des- critos acima, pelo menos duas células distintas podem ser usadas; isto significa que este processo é um processo de cofermentação. Todas as modalidades preferidas dos processos de fermentação, descritas acima, também são modalidades preferidas deste processo de cofer- mentação: identidade do produto de fermentação, identidade da fonte de L-arabinose e fonte de xilose, condições de fermentação (condi- ções aeróbicas ou anaeróbicas, condições de oxigênio limitado, tem- peratura na qual o processo está sendo realizado, produtividade de etanol, rendimento de etanol).

[00143] Produtos de fermentação que podem ser produzidos pelos processos da invenção podem ser qualquer substância derivada da fermentação. Eles incluem, mas não estão limitados a, álcool (como arabinitol, butanol, etanol, glicerol, metanol, 1,3-propanodiol, sorbitol e xílitol); ácido orgânico (como ácido acético, ácido acetônico, ácido adí- pico, ácido ascórbico, ácido acrílico, ácido cítrico, ácido 2,5-diceto-D- glucônico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido glucárico, ácido glucô- nico, ácido glucurônico, ácido glutárico, ácido 3- hidroxipropiônico, áci- do itacônico, ácido láctico, ácido maleico, ácido málico, ácido malôni- co, ácido oxálico, ácido oxaloacético, ácido propiônico, ácido succínico e ácido xilônico); cetonas (como acetona); aminoácidos (como ácido aspártico, ácido glutâmico, glicina, lisina, serina, triptofano e treonina); alcanos (como pentano, hexano, heptano, octano, nonano, decano, undecano e dodecano), cicloalcanos (como ciclopentano, ciclo- hexano, ciclo-heptano e ciclooctano), alquenos (como penteno, hexe- no, hepteno e octeno); e gases (como metano, hidrogênio (H2), dióxido de carbono (CO>2) e monóxido de carbono (CO)). O produto de fermen- tação também pode ser uma proteína, uma vitamina, um produto far- macêutico, um suplemento de ração animal, um produto químico es- pecializado, uma matéria-prima química, um plástico, um solvente, eti- leno, uma enzima, como uma protease, uma celulase, uma amilase, uma glucanase, uma lactase, uma lipase, uma liase, uma oxidoredu-

tase, uma transferase ou uma xilanase. Em uma modalidade preferida, é preparado um álcool nos processos de fermentação, como aqui des- crito. Em uma modalidade preferida, etanol é preparado nos processos de fermentação como aqui descrito.

[00144] Os processos descritos aqui podem compreender a recupe- ração de todos os tipos de produtos feitos durante os processos, inclu- indo produtos de fermentação, como etanol. Um produto de fermenta- ção pode ser separado do caldo de fermentação de maneira conheci- da pelo especialista. Exemplos de técnicas para recuperação incluem, mas não estão limitadas a, cromatografia, procedimentos eletroforéti- cos, solubilidade diferencial, destilação ou extração. Para cada produto de fermentação, o especialista poderá selecionar uma técnica de se- paração adequada. Por exemplo, etanol pode ser separado de um cal- do de fermentação de levedura por destilação, por exemplo, destilação a vapor/destilação a vácuo, de maneira convencional.

[00145] Em uma modalidade, os processos aqui descritos também produzem energia, calor, eletricidade e/ou vapor.

[00146] Os efeitos benéficos da presente invenção são verificados para vários materiais lignocelulósicos e, portanto, acredita-se que este- jam presentes para a hidrólise de todos os tipos de materiais lignocelu- lósicos. Os efeitos benéficos da presente invenção são verificados pa- ra várias enzimas e, portanto, acredita-se que estejam presentes para todos os tipos de composições de enzimas hidrolisantes.

EXEMPLOS Exemplo 1 Adição de uma a mono-oxigenase lítica de polissacarídeo (lytic polys- accharide monooxygenase - LPMO) antes do início da aeração

[00147] Este exemplo mostra o efeito de acrescentar LPMO adicio- nal antes da aeração na hidrólise de material lignocelulósico.

[00148] Coquetel de celulase de Rasamsonia emersonii e coquetel de ALPMO-cellulase de Rasamsonia emersonii (isto é, ambos caldos de fermentação integrais) foram produzidos de acordo com os méto- dos descritos em WOZ2011/000949. A cepa ALPMO de Rasamsonia emersonii foi feita eliminando o gene que codifica LPMO (ver WO2012/ 000892) de uma cepa de Rasamsonia emersonii por métodos conhe- cidos na arte. Além disso, a mono-oxigenase lítica de polissacarídeo de Rasamsonia emersonii (LPMO) descrita em WO2012/ 00892? e be- ta-glucosidase de Rasamsonia emersonii descrita em WO2012/000890 foram usadas nos experimentos.

[00149] A concentração de proteína da LPMO foi determinada usando um método TCA-biureto. Em resumo, foram feitas diluições de albumina de soro bovino (bovine serum albumin - BSA) (0, 1,2,5,8 e mg/ml) para gerar uma curva de calibração. Além disso, diluições das amostras de LPMO foram feitas com água. De cada amostra diluí- da (de BSA e de LPMO), 270 ul foram transferidos para um tubo de 10 ml contendo 830 ul de uma solução de ácido tricloroacético a 12% (p/v) em acetona e bem misturados. Posteriormente, os tubos foram incubados em água gelada por uma hora e centrifugados por 30 minu- tos a 4ºC e 6000 rpm. O sobrenadante foi descartado e os péletes fo- ram secos invertendo os tubos em um tecido e deixando-os repousar por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, 3 ml de mistura de reagente BioQuant Biuret foram adicionados aos péletes nos tubos e os péletes foram solubilizados após mistura, seguido pela adição de 1 ml de água. Os tubos foram bem misturados e incubados à tempera- tura ambiente por 30 minutos. A absorção das misturas foi medida a 546 nm e uma amostra de água foi usada como medida em branco. Diluições do LPMO que deram um valor de absorção a 546 nm dentro da faixa da linha de calibração foram usadas para calcular a concen- tração total de proteínas das amostras de LPMO via linha de calibra- ção do BSA.

[00150] A concentração de proteína dos coquetéis de celulase foi determinada usando um método de biureto. Amostras de coquetel fo- ram diluídas com base em peso com água e centrifugadas por 5 minu- tos a >14000xg. Foram feitas diluições de albumina de soro bovino (BSA) (0,5, 1, 2, 5, 10 e 15 mg/ml) para gerar uma curva de calibração. De cada amostra de proteína diluída (de BSA e do coquetel), 200 ul do sobrenadante foram transferidos para um tubo de reação de 1,5 ml. 800 ul de reagente BioQuant Biuret foram adicionados e completamen- te misturados. Da mesma amostra de proteína diluída, 500 ul foram adicionados ao tubo de reação contendo um filtro de 10 KD. 200 ul do efluente foram transferidos para um tubo de reação de 1,5 ml; 800 ul de reagente BioQuant Biuret foram adicionados e bem misturados. Em seguida, todas as misturas (amostras de proteína diluídas antes e após filtração de 10KD misturadas com BioQuant) foram incubadas em temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos. A absorção das misturas foi medida a 546 nm com uma amostra de água usada como uma medida em branco. Diluições do coquetel que deram um valor de absorção a 546 nm dentro da faixa da linha de calibração foram usa- das para calcular a concentração total de proteína das amostras de coquetel via linha de calibração BSA.

[00151] A atividade enzimática de beta-glucosidase (WBDG) foi de- terminada a 37ºC e pH 4,4 usando para-nitrofenil-&-D-glucopiranosí- deo como substrato. A hidrólise enzimática de pnP-beta-D-glucopira- nosídeo resultou na liberação de para-nitrofenol (pDNP) e D-glicose. O para-nitrofenol liberado quantitativamente, determinado em condições alcalinas, foi uma medida da atividade enzimática. Após 10 minutos de incubação, a reação foi interrompida pela adição de carbonato de só- dio 1 M e a absorbância foi determinada no comprimento de onda de 405 nm. A atividade enzimática de beta-glucosidase (WBDG) foi calcu- lada utilizando o coeficiente de extinção molar de para-nitrofenol. Uma linha de calibração de para-nitro-fenol foi preparada diluindo uma solu- ção estoque de pNP 10 mM em tampão acetato 100 mM pH 4,40 BSA a 0,1% para concentrações de pNP de 0,25, 0,40, 0,67 e 1,25 MM. O substrato foi uma solução de 5,0 mM de pNP-BDG em um tampão de acetato (100 mM, pH 4,4). A 3 ml de substrato, foram adicionados 200 ul de solução de calibração e 3 ml! de carbonato de sódio a 1M. A ab- sorção da mistura foi medida em 405 nm com um tampão de acetato (100 mM) usado como uma medida em branco. O teor de pNP foi cal- culado usando protocolos de cálculo padrão conhecidos na técnica, plotando a ODaos versus a concentração de amostras com concentra- ção conhecida, seguido pelo cálculo da concentração das amostras desconhecidas usando a equação gerada a partir da linha de calibra- ção. Amostras foram diluídas em peso, correspondendo a uma ativi- dade entre 1,7 e 3,3 unidades. A 3 ml de substrato, pré-aquecido a 37ºC, foram adicionados 200 ul de solução de amostra diluída. Esta foi registrada como t = O. Após 10,0 minutos, a reação foi interrompida com adição de 3 ml de carbonato de sódio IM. A atividade de beta- glucosidase é expressa em unidades WBDG por grama de caldo de enzima. Uma unidade WBDG é definida como a quantidade de enzima que libera um nanomol de para-nitrofenol por segundo do para- nitrofenil-beta-D-glucopiranosídeo nas condições de ensaio definidas (P-nitrofenil-beta-D-glucopiranosídeo - DNPBDG 4,7 mM, pH=4,4eT =37ºC).

[00152] Palha de milho pré-tratada com ácido (aCS) foi preparada incubando palha de milho por 6,7 minutos a 186ºC. Antes do tratamen- to térmico, a palha de milho foi impregnada com H2SO. por 10 minutos para ajustar o pH em 2,3 durante o pré-tratamento. A quantidade de glucano no material lignocelulósico pré-tratado foi medida de acordo com o método descrito por Carvalho de Souza et al. (Carbohydrate Polymers (Polímeros de Carboidratos), 95 (013) 657-663. As reações de hidrólise foram realizadas com palha de milho pré-tratada com áci- do (aCS) a uma concentração final de 17% (p/p) de matéria seca. À solução de matéria-prima foi preparada por diluição de uma solução concentrada de matéria-prima com água. Em seguida, o pH foi ajusta- do para pH 4,5 com uma solução de NH.OH a 10% (p/p).

[00153] As reações de hidrólise foram realizadas em um reator fe- chado, agitado, com controle de pH e temperatura, com um volume de trabalho de 1 |. Cada hidrólise foi realizada e controlada em pH 4,5 e temperatura de 62ºC. Os vasos de reação foram carregados com a matéria-prima a 17% (p/p) (pH 4,5) e agitados a 150 rom por 18 horas, enquanto o espaço de topo livre era continuamente renovado (refres- hed) por um fluxo de nitrogênio (100 mI/min) a 62ºC para tornar o vaso anaeróbico. Posteriormente, as reações de hidrólise foram iniciadas e os seguintes experimentos foram realizados:

[00154] 1. Adiçãoemt= 0 hora de (a) um coquetel de celulase de Rasamsonia emersonii a uma concentração de 7 mg de proteína/g de glucano no material lignocelulósico pré-tratado e (b) 836 unidades WBDG7/g de glucano no material lignocelulósico pré-tratado (reação de controle ).

[00155] 2. Adiçãoemt=>=0 hora de um coquetel de celulase de Ra- samsonia emersonii a uma concentração de 7 mg de proteína/g de glucano no material lignocelulósico pré-tratado, 836 WBDG/g de glu- cano no material lignocelulósico pré-tratado e 0,7 mg de proteína LPMO de Rasamsonia emersonii /g de glucano no material lignocelu- lósico pré-tratado (adição de proteína LPMO em t = O hora).

[00156] 3. Adiçãoemt=3=o0 hora de um coquetel de celulase de Ra- samsonia emersonii a uma concentração de 7 mg de proteína/g de glucano no material lignocelulósico pré-tratado, 836 WBDG/g de glu- cano no material lignocelulósico pré-tratado e um coquetel de ALPMO- celulase de Rasamsonia emersonii em uma concentração de 0,7 mg de proteína/g de glucano no material lignocelulósico pré-tratado (adi- ção de coquetel de ALPMO-celulase em t = O hora).

[00157] Após adição das enzimas em t = O hora, cada vaso de hi- drólise foi mantido anaeróbico por 6 horas, após as quais o fluxo de nitrogênio (100 ml/min) foi trocado por um fluxo de ar (100 mIl/min) re- sultando em um nível de oxigênio dissolvido (DO) de 5% (0,008 mol/m?) na mistura de reação, conforme medido por um eletrodo de DO. O tempo total de hidrólise foi de 144 horas.

[00158] No final da hidrólise, foram colhidas amostras para análise que foram imediatamente centrifugadas por 8 min a 4000xg. O sobre- nadante foi filtrado sobre filtros de nylon de 0,2 um (Whatman) e arma- zenado a 4 C até análise do teor de açúcar como descrito abaixo.

[00159] As concentrações de açúcar das amostras diluídas foram medidas usando HPLC equipada com uma coluna Aminex HPX-87H de acordo com o relatório técnico da NREL NREL/TP-510-42623, Ja- neiro de 2008. Os resultados são apresentados na Tabela 1.

[00160] Os dados mostram que é benéfico acrescentar proteína LPMO adicional em um processo de hidrólise, resultando em 6% de liberação de glicose aumentada em comparação com quando nada é adicionalmente acrescentado ("spiked") ou quando uma quantidade igual de coquetel de celulase que não contém LPMO é acrescentada. Exemplo 2 Adição de uma mono-oxigenase lítica de polissacarídeo (LPMO) após início da aeração

[00161] Este exemplo mostra o efeito da adição de mais LPMO após o início da aeração na hidrólise do material lignocelulósico.

[00162] O experimento foi realizado conforme descrito no Exemplo 1, com a condição de que os seguintes experimentos foram realizados:

[00163] 1. Adiçãoem:t= 0 hora de (a) um coquetel de celulase de Rasamsonia emersonii a uma concentração de 7 mg de proteína/g de glucano no material lignocelulósico pré-tratado e (b) 836 unidades WBDG/g de glucano no material lignocelulósico pré-tratado (reação de controle).

[00164] 2. Adiçãoemt= 0 hora de um coquetel de celulase de Ra- samsonia emersonii a uma concentração de 7 mg de proteína/g de glucano no material lignocelulósico pré-tratado e 836 WBDG/g de glu- cano no material lignocelulósico pré-tratado e adição em t=24h de 0,7 mg de proteína LPMO de Rasamsonia emersonii /g de glucano no ma- terial lignocelulósico pré-tratado (adição de proteína LPMO em t = 24 horas).

[00165] 3. Adiçãoemt=>=0 hora de um coquetel de celulase de Ra- samsonia emersonii a uma concentração de 7 mg de proteína/g de glucano no material lignocelulósico pré-tratado e 836 WBDG/g de glu- cano no material lignocelulósico pré-tratado e adição em t = 24h de um coquetel de ALPMO-celulase de Rasamsonia emersonii em uma con- centração de 0,7 mg de proteína/g de glucano no material lignoceluló- sico pré-tratado (adição de coquetel de ALPMO-celulase em t = 24 ho- ras).

[00166] Os resultados são apresentados na Tabela 2. Os dados mostram claramente que é benéfico adicionar proteína LPMO após o início da aeração (liberação de glicose aumentada em 12%) em com- paração com quando nada é adicionalmente acrescentado ou quando uma quantidade igual de coquetel de celulase não contendo LPMO é acrescentado após o início da aeração. A adição de proteína LPMO após o início da aeração (liberação adicional de 12% de glicose) é vantajosa em relação à adição de proteína LPMO antes do início da aeração (liberação adicional de 6% de glicose). Tabela 1: Efeito da adição de proteína LPMO ou coquetel de ALPMO- celulase antes do início da aeração na liberação de glicose, medida no final do processo de hidrólise (t = 144 horas).

Experimento

[00167] Tabela 2: Efeito da adição de proteína LPMO ou coquetel de ALPMO-celulase após o início da aeração na liberação de glicose, medida no final do processo de hidrólise (t= 144 horas) Experimento Acréscimo de proteína LPMO em t=24 horas | egg] Acréscimo de coquetel ALPMO-celulase em t=24 | 54,2 a

Claims (14)

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para a preparação de um produto de açúcar ("sugar product") a partir de material lignocelulósico, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de a) pré-tratar o material lignocelulósico b) hidrolisar enzimaticamente o material lignocelulósico pré- tratado para obter o produto de açúcar em um processo compreen- dendo as etapas de (i) primeiramente tratar o material lignocelulósico com uma composição enzimática contendo uma mono-oxigenase lítica de polissacarídeo e um polipeptídeo selecionado do grupo consistindo em uma celobio-hidrolase, uma endoglucanase, uma beta-glucosidase, uma beta-xilosidase, uma endoxilanase e qualquer combinação das mesmas, em seguida (ii) adicionar oxigênio à mistura compreendendo o mate- rial lignocelulósico e a composição enzimática, e depois (ili) adicionar mono-oxigenase lítica de polissacarídeo adicional à mistura compreendendo o material lignocelulósico e a composição enzimática, e c) opcionalmente, recuperar o produto de açúcar.

2. Processo para a preparação de um produto de fermenta- ção a partir de material lignocelulósico, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) executar um processo como definido na reivindicação 1, b) fermentar o produto de açúcar para produzir o produto de fermentação; e c) opcionalmente, recuperar o produto de fermentação

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracte- rizado pelo fato que o teor de matéria seca do material lignocelulósico na hidrólise enzimática é de 10 a 40% em peso.

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 3, caracterizado pelo fato que a composição enzimática com- preendendo uma mono-oxigenase lítica de polissacarídeo e/ou a mo- no-oxigenase lítica de polissacarídeo adicional é proveniente de um fungo.

5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a composição enzimática compreendendo uma mono-oxigenase lítica de polissacarídeo e / ou a mono-oxigenase lítica de polissacarídeo adicional é adicionada na forma de um caldo de fermentação integral de um fungo.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracte- rizado pelo fato que o fungo é Rasamsonia.

7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 2 a 6, caracterizado pelo fato que a fermentação é feita por uma levedura.

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 7, caracterizado pelo fato que a hidrólise enzimática é reali- zada em um biorreator com um volume de pelo menos 10 m?.

9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 8, caracterizado pelo fato que o início da etapa (ii) é de 1 a 100 horas após o início da etapa (i).

10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 9, caracterizado pelo fato que a quantidade de proteína adici- onada na etapa (i) é de 1 a 40 mg/g de glucano no material lignocelu- lósico pré-tratado.

11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 10, caracterizado pelo fato que a quantidade de proteína adi- cionada na etapa (iii) é de 0,01 a 20 mg/g de glucano no material lig- nocelulósico pré-tratado.

12. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica-

ções 1 a 11, caracterizado pelo fato que a proporção de mono- oxigenase lítica de polissacarídeo adicionada na etapa (i) para a mo- no-oxigenase lítica de polissacarídeo adicionada na etapa (iii) é de 10:1 a 1:10.

13. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 12, caracterizado pelo fato que o pH da hidrólise enzimática é de 3,5a5,5.

14. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a temperatura da hidrólise enzimática é de 50ºC a 70ºC