BR112019016315A2 - Proteínas de ligação multiespecíficas para ativação de células natural killer e usos terapêuticos destas para tratamento de câncer - Google Patents

Proteínas de ligação multiespecíficas para ativação de células natural killer e usos terapêuticos destas para tratamento de câncer Download PDF

Info

Publication number
BR112019016315A2
BR112019016315A2 BR112019016315-8A BR112019016315A BR112019016315A2 BR 112019016315 A2 BR112019016315 A2 BR 112019016315A2 BR 112019016315 A BR112019016315 A BR 112019016315A BR 112019016315 A2 BR112019016315 A2 BR 112019016315A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
cells
cancer
tumor
binding
nkg2d
Prior art date
Application number
BR112019016315-8A
Other languages
English (en)
Inventor
P. Chang Gregory
F. Cheung Ann
Haney William
Grinberg Asya
Original Assignee
Dragonfly Therapeutics, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dragonfly Therapeutics, Inc. filed Critical Dragonfly Therapeutics, Inc.
Publication of BR112019016315A2 publication Critical patent/BR112019016315A2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3053—Skin, nerves, brain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Abstract

proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam a um antígeno tumor-associado, o receptor nkg2d e cd16 são descritos, bem como composições farmacêuticas e métodos terapêuticos úteis para o tratamento de câncer.

Description

PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO MÜLTIESPECÍFICAS PARA ATIVAÇÃO DE CÉLULAS NATURAL KILLER E USOS TERAPÊUTICOS DESTAS PARA TRATAMENTO DE CÂNCER
REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS [0001] Esse pedido reivindica o beneficio do e prioridade para o Pedido de Patente U.S. Provisório N° 62/456.535, depositado em 08 de fevereiro de 2017, cujo conteúdo completo é incorporado por referência nesse relatório descritivo para todas as finalidades.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS [0002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi submetida eletronicamente em formato ASCII e é incorporada nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade. A referida cópia em ASCII, criada em 6 de fevereiro de 2018, é denominada DFY001PC_SL.txt e em 71.169 bytes de tamanho.
CAMPO DA INVENÇÃO [0003] A invenção está relacionada às proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam a um antígeno tumorassociado, o receptor NKG2D e CD16.
FUNDAMENTOS [0004] O câncer continua a ser um problema de saúde significante, apesar dos esforços de pesquisa e avanços científicos substanciais relatados na literatura para o tratamento dessa doença. Alguns dos cânceres mais frequentemente diagnosticados incluem câncer de próstata, câncer de mama e câncer de pulmão. O câncer de próstata é a forma mais comum de câncer em homens. O câncer de mama permanece uma causa importante de morte em mulheres. As opções de tratamento atuais para esses cânceres não são
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 8/175
2/120 eficazes para todos os pacientes e/ou podem ter efeitos colaterais adversos substanciais. Outros tipos de câncer também permanecem desafiadores para tratar usando as opções terapêuticas existentes.
[0005] As imunoterapias do câncer são desejáveis, pois são altamente especificas e podem facilitar a destruição de células de câncer usando o próprio sistema imune do paciente. Proteínas de fusão como, por exemplo, engajadores de células T biespecificos, são imunoterapias para o câncer descritas na literatura que se ligam às células tumorais e células T para facilitar a destruição de células tumorais. Anticorpos que se ligam a certos antigenos tumor-associados e a certas células imunes foram descritos na literatura. Veja, por exemplo, WO 2016/134371 e WO 2015/095412.
[0006] Células natural killer (NK) são um componente do sistema imune inato e constituem aproximadamente 15% de linfócitos circulantes. Células NK infiltram praticamente todos os tecidos e foram originalmente caracterizadas por sua habilidade para matar células tumorais eficazmente sem a necessidade de sensibilização prévia. Células NK ativadas matam células-alvo por meios similares às células T citotóxicas - ou seja, por meio de grânulos citoliticos que contêm perforina e granzimas, bem como por meio de vias de receptor de morte. Células NK ativadas também secretam citocinas inflamatórias como, por exemplo, IFN-gama e quimiocinas que promovem o recrutamento de outros leucócitos ao tecido-alvo.
[0007] As células NK respondem aos sinais por meio de diversos receptores de ativação e inibitórios em sua superfície. Por exemplo, quando células NK encontram células
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 9/175
3/120 próprias (self-cells) saudáveis, sua atividade é inibida por meio da ativação dos receptores de célula-killer imunoglobulina-like (KIRs). Alternativamente, quando células NK encontram células estranhas ou células de câncer, elas são ativadas por meio de seus receptores de ativação (por exemplo, NKG2D, NCRs, DNAM1). Células NK também são ativadas pela região constante de algumas imunoglobulinas por meio de receptores CD16 em sua superfície. A sensibilidade global de células NK à ativação depende da soma de sinais estimulatórios e inibitórios.
SUMÁRIO [0008] A invenção fornece proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam a um antígeno tumor-associado em uma célula de câncer e ao receptor NKG2D e ao receptor CD16 em células natural killer para ativar as células natural killer, composições farmacêuticas que compreendem essas proteínas de ligação multiespecíficas, e métodos terapêuticos que utilizam essas proteínas multiespecíficas e composições farmacêuticas, incluindo para o tratamento de câncer. Essas proteínas podem engajar mais de um tipo de receptor de ativação de NK, e podem bloquear a ligação de ligantes naturais ao NKG2D. Em certas modalidades, a proteína pode agonizar células NK em humanos, e em outras espécies como, por exemplo, roedores e macacos Cynomolgus. Vários aspectos e modalidades da invenção são descritos em mais detalhe abaixo.
[0009] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica pode incorporar um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D; um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno tumor-associado; e um
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 10/175
4/120 domínio Fc de anticorpo, uma porção deste suficiente para se ligar a CD16, ou um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a CD16.
[0010] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica é trivalente, que inclui um primeiro e um segundo sítio de ligação ao antígeno que se ligam, ambos, ao mesmo antígeno tumor-associado; um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D; e um domínio Fc de anticorpo, uma porção deste suficiente para se ligar a CD16.
[0011] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica é tetravalente, que inclui um primeiro e um segundo sítio de ligação ao antígeno que se ligam, ambos, ao mesmo antígeno tumor-associado; um terceiro e quarto sítios de ligação ao antígeno que se liga, ambos, a NKG2D; e um domínio Fc de anticorpo, uma porção deste suficiente para se ligar a CD16.
[0012] Cada um dos sítios de ligação ao antígeno pode incorporar um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo e um domínio variável da cadeia leve de anticorpo (por exemplo, dispostos como um anticorpo, ou fundidos juntos para formar um scFv), ou um ou mais dos sítios de ligação ao antígeno podem ser um anticorpo de domínio único, por exemplo, um anticorpo VhH como um anticorpo de camelídeo ou um anticorpo Vnar como aqueles encontrados em peixes cartilaginosos. Em alguns casos, o antígeno tumor-associado pode ser selecionado do grupo que consiste em HER2, CD20, CD33, antígeno de maturação de célula B (BCMA), EpCAM, CD2, CD19, CD30, CD38, CD40, CD52, CD70, EGFR/ERBB1, IGF1R, HER3/ERBB3, HER4/ERBB4, MUC1, cMET, SLAMF7, PSCA, MICA, MICB, TRAILR1, TRAILR2, MAGE-A3, B7.1, B7.2, CTLA4 e PD1.
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 11/175
5/120 [0013] Outro aspecto da invenção fornece um método de tratamento de câncer em um paciente. O método compreende a administração a um paciente necessitado de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteina de ligação multiespecifica descrita nesse relatório descritivo para tratar o câncer. Cânceres exemplares para tratamento com o uso das proteinas de ligação multiespecificas incluem, por exemplo, um carcinoma que expressa HER2.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0014] A FIG. 1 é uma representação de uma proteina de ligação multiespecifica que contém um dominio de ligação ao NKG2D (braço direito), um dominio de ligação ao antigeno tumor-associado (braço esquerdo) e um dominio Fc ou uma porção deste que se liga a CD16.
[0015] A FIG. 2 é uma representação de uma proteina de ligação multiespecifica que contém um dominio de ligação ao NKG2D em um formato de scFv (braço direito), um dominio de ligação ao antigeno tumor-associado (braço esquerdo) e um dominio Fc ou uma porção deste que se liga a CD16.
[0016] A FIG. 3 é uma representação de um TriNKET na forma de Triomab, que é um anticorpo biespecifico, trifuncional, que mantém um formato IgG-like. Essa quimera consiste em duas metades de anticorpos, cada uma com uma cadeia leve e uma cadeia pesada, que se originam de dois anticorpos parentais. A forma de Triomab pode ser uma construção heterodimérica que contém ½ de anticorpo de rato e ½ de anticorpo de camundongo.
[0017] A FIG. 4 é uma representação de um TriNKET na forma de Cadeia Leve Comum (LC) de KiH, que envolve a tecnologia knobs-into-holes (KIHs). KiH é um heterodimero
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 12/175
6/120 que contém 2 Fabs de ligação ao alvo 1 e 2, e um Fc estabilizado por mutações de heterodimerização. TriNKET no formato de KiH pode ser uma construção heterodimérica com 2 Fabs de ligação ao alvo 1 e alvo 2, que contêm 2 cadeias pesadas diferentes e uma cadeia leve comum que pareia com ambas as HC.
[0018] A FIG. 5 é uma representação de um TriNKET na forma de imunoglobulina de dominio variável duplo (DVDIg™) , que combina os dominios de ligação ao alvo de dois anticorpos monoclonais por meio de vinculadores flexiveis de ocorrência natural, e gera uma molécula tetravalente IgGlike . DVD-Ig™ é uma construção homodimérica na qual o dominio variável que visa o antigeno 2 é fundido ao terminal-N do dominio variável de Fab que visa o antigeno 1, A Construção contém Fc normal.
[0019] A FIG. 6 é uma representação de um TriNKET na forma de interface de Fab Ortogonal (Orto-Fab) , que é uma construção heterodimérica que contém 2 Fabs de ligação ao alvo 1 e alvo 2 fundidos ao Fc. O pareamento LC-HC é assegurado por interface ortogonal. A heterodimerização é assegurada por mutações na FC.
[0020] A FIG. 7 é uma representação de um TrinKET no formato de Ig 2-em-l.
[0021] A FIG. 8 é uma representação de um TriNKET na forma de ES, que é uma construção heterodimérica que contém 2 Fabs de ligação ao alvo 1 e alvo 2 diferentes fundidos ao Fc. A heterodimerização é assegurada por mutações de direção eletrostática no Fc.
[0022] A FIG. 9 é uma representação de um TriNKET na forma de Troca de Braço de Fab: anticorpos que trocam braços
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 13/175
7/120 de Fab por troca de uma cadeia pesada (HC) e cadeia leve (LC) anexada (meia-molécula) com um par de cadeia pesadaleve de outra molécula, resultando em anticorpos biespecificos. A forma de Troca de Braço de Fab (cFae) é um heterodimero que contém 2 Fabs de ligação ao alvo 1 e 2, e um FC estabilizado por mutações de heterodimerização.
[0023] A FIG. 10 é uma representação de um TriNKET na forma de Corpo SEED, que é um heterodimero que contém 2 Fabs de ligação ao alvo 1 e 2, e um FC estabilizado por mutações de heterodimerização.
[0024] A FIG. 11 é uma representação de um TriNKET na forma de LuZ-Y, no qual ziper de leucina é usado para induzir heterodimerização de duas HCs diferentes. A forma de LuZ-Y é um heterodimero que contém 2 scFabs de ligação ao alvo 1 e 2 diferentes, fundidos ao FC. A heterodimerização é assegurada por meio de motivos de ziper de leucina fundidos ao terminal-C de Fc.
[0025] A FIG. 12 é uma representação de um TriNKET na forma de Cov-X-Corpo.
[0026] As FIGs. 13A-13B são representações de TriNKETs na forma de KÀ-Corpo, que são construções heterodiméricas com 2 Fabs diferentes fundidos ao Fc estabilizado por mutações de heterodimerização: Fabl direcionado ao antigeno 1 contém kappa LC, enquanto o segundo Fab direcionado ao antigeno 2 contém LC lambda. A FIG. 13A é uma representação exemplar de uma forma de um KÀ-Corpo; a
FIG. 13B é uma representação exemplar de outro KÀ-Corpo.
[0027] A FIG. 14 é um gráfico que demonstra a
afinidade de ligação de dominios de ligação ao NKG2D
(listados como clones) ao NKG2D recombinante humano em um
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 14/175
8/120 ensaio ELISA.
[0028] A FIG. 15 é um gráfico que demonstra a
afinidade de ligação de domínios de ligação ao NKG2D
(listados como clones) ao NKG2D recombinante de Cynomolgus
em um ensaio ELISA.
[0029] A FIG. 16 é um gráfico que demonstra a
afinidade de ligação de domínios de ligação ao NKG2D
(listados como clones) ao NKG2D recombinante de camundongo
em um ensaio ELISA.
[0030] A FIG. 17 é um gráfico que demonstra a ligação de dominios de ligação ao NKG2D (listados como clones) às células EL4 que expressam NKG2D humano por citometria de fluxo que mostra a razão de aumento da intensidade de fluorescência média (MFI) em relação ao nível de base.
[0031] A FIG. 18 é um gráfico que demonstra a ligação de domínios de ligação ao NKG2D (listados como clones) às células EL4 que expressam NKG2D de camundongo por citometria de fluxo que mostra a razão de aumento da intensidade de fluorescência média (MFI) em relação ao nível de base.
[0032] A FIG. 19 é um gráfico que demonstra afinidade de ligação específica de domínios de ligação ao NKG2D (listados como clones) ao NKG2D humano recombinante-Fc por competição com ligante natural ULBP-6.
[0033] A FIG. 20 é um gráfico que demonstra afinidade de ligação específica de domínios de ligação ao NKG2D (listados como clones) ao NKG2D humano recombinante-Fc por competição com ligante natural MICA.
[0034] A FIG. 21 é um gráfico que demonstra a afinidade de ligação específica de domínios de ligação ao NKG2D (listados como clones) ao NKG2D de camundongo
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 15/175
9/120 recombinante-Fc por competição com ligante natural Rae-1 delta .
[0035] A FIG. 22 é um gráfico que mostra a ativação de NKG2D humano por dominios de ligação ao NKG2D (listados como clones) por quantificação da percentagem de células TNF-alfa-positivas que expressam proteínas de fusão NKG2D humano-CD3 zeta.
[0036] A FIG. 23 é um gráfico que mostra a ativação de NKG2D de camundongo por domínios de ligação ao NKG2D (listados como clones) por quantificação da percentagem de células TNF-alfa-positivas que expressam proteínas de fusão NKG2D de camundongo-CD3 zeta.
[0037] A FIG. 24 é um gráfico que mostra a ativação
de células NK humanas por domínios de ligação ao NKG2D
(listados como clones).
[0038] A FIG. 25 é um gráfico que mostra a ativação
de células NK humanas por domínios de ligação ao NKG2D
(listados como clones).
[0039] A FIG. 26 é um gráfico que mostra a ativação
de células NK de camundongo por domínios de ligação ao NKG2D (listados como clones).
[0040] A FIG. 27 é um gráfico que mostra a ativação de células NK de camundongo por domínios de ligação ao NKG2D (listados como clones).
[0041] A FIG. 28 é um gráfico que mostra o efeito citotóxico de domínios de ligação ao NKG2D (listados como clones) em células tumorais.
[0042] A FIG. 29 é um gráfico que mostra a temperatura de fusão de domínios de ligação ao NKG2D (listados como clones) medida por fluorimetria de varredura
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 16/175
10/120 diferencial.
[0043] A FIG. 30 é um gráfico que mostra a ativação aumentada de células NK humanas por proteínas de ligação multiespecíficas.
[0044] A FIG. 31 é um gráfico que mostra que
proteínas de ligação multiespecíficas induziram níveis mais
elevados de citotoxicidade contra células tumorais-alvo por
células NK humanas.
[0045] A FIG. 32 é um gráfico que mostra que
proteínas de ligação multiespecíficas induziram níveis mais
elevados de citotoxicidade contra células tumorais-alvo por
células NK humanas.
[0046] A FIG. 33 é um gráfico que mostra que
proteínas de ligação multiespecíficas induziram níveis mais
elevados de citotoxicidade contra células tumorais-alvo por
células NK humanas.
[0047] A FIG. 34 é um gráfico que mostra que
proteínas de ligação multiespecíficas induziram níveis mais
elevados de citotoxicidade contra células tumorais-alvo por
células NK humanas.
[0048] A FIG. 35 é um gráfico que mostra que
proteínas de ligação multiespecíficas induziram níveis mais
elevados de citotoxicidade contra células tumorais-alvo por
células NK de camundongo.
[0049] A FIG. 36 é um gráfico que mostra que
proteínas de ligação multiespecíficas induziram níveis mais
elevados de citotoxicidade contra células tumorais-alvo por
células NK de camundongo.
[0050] A FIG. 37 é um perfil de ligação de TriNKETs
direcionados ao CD33 ao NKG2D expresso em células EL4. A
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 17/175
11/120
FIG. 37 mostra a ligação dos dois TriNKETs quando um domínio de ligação ao CD33 é usado como o segundo braço de direcionamento.
[0051] A FIG. 38 é um perfil de ligação de TriNKETs direcionados ao HER2 ao NKG2D expresso em células EL4. A FIG. 38 mostra os mesmos dois domínios de ligação ao NKG2D agora pareados com um segundo braço de direcionamento ao HER2 .
[0052] A FIG. 39 é um perfil de ligação de TriNKETs direcionados ao BCMA ao NKG2D expresso em células EL4.
[0053] A FIG. 40 é um histograma de TriNKETs direcionados ao CD20 que se ligam ao NKG2D expresso em células EL4 . Células EL4 não coradas foram usadas como um controle negativo para o sinal de fluorescência. Não coradas: preenchido; CD20-TriNKET-F04: linha sólida; CD20-TriNKETC26: linha tracejada.
[0054] A FIG. 41 é um perfil de ligação de TriNKETs
direcionados ao CD33 ao CD33 expresso em célula s de AML
humana MV4-11.
[0055] A FIG. 42 é um perfil de ligação de TriNKETs
direcionados ao HER2 ao HER2 expresso em células de carcinoma
de célula renal humano 786-0.
[0056] A FIG. 43 é um perfil de ligação de TriNKETs
direcionados ao BCMA ao BCMA expresso em células de mieloma humano MM.IS.
[0057] A FIG. 44 é um histograma de TriNKETs direcionados ao CD20 que se ligam ao CD20 expresso em células de linfoma humano Raji. Células não coradas foram usadas um controle negativo para o sinal de fluorescência. Não coradas: preenchido; CD20-TriNKET-F04: linha sólida; CD20-TriNKET
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 18/175
12/120
C26: linha tracejada.
[0058] As FIGs. 45A-45C são gráficos de barras de ativação sinérgica de células NK usando CD16 e NKG2D. A FIG. 45A demonstra níveis de CD107a; a FIG. 45B demonstra níveis de IFNy; a FIG. 45C demonstra níveis de CD107a e ΙΕΝγ. Os gráficos indicam a média (n = 2) ± DP. Os dados são representativos de cinco experimentos independentes com o uso de cinco doadores saudáveis diferentes.
[0059] A FIG. 46 é um gráfico de barras que mostra a ativação de células NK usando TriNKETs que visam NKG2D e CD16. Os anticorpos testados foram de isótipos de IgGl humana. Os gráficos indicam a média (n = 2) ± DP.
[0060] As FIGs. 47A — 47C são gráficos de barras que demonstram que TriNKETs e trastuzumab foram capazes de ativar células NK humanas primárias em cocultura com células tumorais humanas HER2-positivas, indicado por um aumento em degranulação CD107a e produção de citocina ΙΕΝγ. Comparados com o anticorpo monoclonal trastuzumab, ambos os TriNKETs exibiram ativação superior de células NK humanas com diversas células de câncer humano HER2. A FIG. 47A mostra que células NK humanas são ativadas por TriNKETs quando cultivadas com células SkBr-3. A FIG. 47B mostra que células NK humanas são ativadas por TriNKETs quando cultivadas com células Colo201. A FIG. 47C mostra que células NK humanas são ativadas por TriNKETs quando cultivadas com células HCC1954.
[0061] As FIGs. 48A — 48B são gráficos de linhas que demonstram ativação mediada por TriNKET de células NK humanas em repouso ou ativadas por IL-2 em cocultura com a linhagem de célula MV4-11 de AML humana que expressa CD33. A FIG. 48A mostra a ativação mediada por TriNKET de células NK humanas
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 19/175
13/120 em repouso. A FIG. 48B mostra a ativação mediada por TriNKET de células NK humanas ativadas por IL-2 do mesmo doador.
[0062] As FIGs . 49A — 49B são gráficos que demonstram aumento por TriNKET da atividade citotóxica usando células NK humanas ativadas por IL-2 e em repouso. A FIG. 49A mostra o percentual de lise especifica de células tumorais SkBr-3 por células NK humanas em repouso. A FIG. 49B mostra o percentual de lise especifica de células tumorais SkBr-3 por células NK humanas ativadas por IL-2 .
[0063] As FIGs. 50A-50B são gráficos que demonstram que TriNKETs fornecem a maior vantagem contra cânceres com HER2 médio e baixo comparados com trastuzumab. A FIG. 50A mostra morte por célula NK humana ativada de células tumorais SkBr-3 com HER2 elevado. A FIG. 50B mostra morte por célula NK humana de células tumorais 786-0 com HER2 baixo. TriNKETs fornecem uma vantagem maior comparados com trastuzumab contra células de câncer com expressão de HER2 baixa.
[0064] As FIGs. 51A - 51C são histogramas que mostram que a expressão do FcRyI de alta afinidade (CD64) em três linhagens de células de AML humana, linhagem de célula Molm13 (FIG. 51A), linhagem de célula Mv4-ll (FIG. 51B) e linhagem de célula THP-1 (FIG. 51C).
[0065] As FIGs. 52A—52B são gráficos de linhas da ativação mediada por anticorpo monoclonal ou TriNKET de células NK humanas em cocultura com células Molm-13 (FIG. 52B) ou THP-1 (FIG. 52A).
[0066] As FIGs. 53A-53C são gráficos de linhas de ensaios de citotoxicidade de NK humana usando as três linhagens de células de AML humana como alvos. A FIG. 53A mostra que células Mv4-ll, que expressam CD64, mas em um
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 20/175
14/120 nível menor do que THP-1, mostram eficácia reduzida com o anti-CD33 monoclonal. A FIG. 53B demonstra que um anticorpo monoclonal contra CD33 mostra boa eficácia contra células Molm-13, que não expressam CD64. A FIG. 53C demonstra que células THP-1 não mostraram efeito com anti-CD33 monoclonal isoladamente. As identidades dos gráficos de linhas anotadas na FIG. 53C também são aplicáveis aos gráficos de linhas nas FIGS. 53A-53B.
[0067] As FIGs. 54A e 54B são gráficos de barras que mostram que células B de um doador saudável são sensíveis à lise mediada por TriNKET.
[0068] As FIGs. 54C e 54D são gráficos de barras que mostram que células mielóides são resistentes à lise mediada por TriNKET.
[0069] A FIG. 55 são gráficos de linhas de morte por hPBMCs mediadas por TriNKETs de células tumorais SkBr-3 em coculturas de longo prazo.
[0070] A FIG. 56 é um fluxograma do design de estudo da eficácia de SC2.2 sobre RMA/S-HER2 subcutâneo.
[0071] A FIG. 57 são gráficos de linhas que mostram que SC2.2 não possui efeito sobre crescimento do tumor subcutâneo RMA/S-HER2.
[0072] As FIGs. 58A — 58B são gráficos que mostram ligação in vitro por mcFAE-C26.99 TriNKET. Sessenta pg/mL de anticorpos indicados com diluições de quatro vezes foram adicionados a 2 x 105 células tumorais B16F10 (FIG. 58A) ou células EL4-mNKG2D (FIG. 58B). A ligação foi avaliada usando um anticorpo secundário anti-camundongo PE de cabra, seguido por análise citométrica de fluxo.
[0073] A FIG. 59 é um gráfico que mostra
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 21/175
15/120 citotoxicidade de NK aumentada mediada por mcFAE-C26.99 TriNKET.
[0074] As FIGs. 60A—60B mostram a eficácia antitumoral de mcFAE-C26.99 TriNKET em modelos s.c. de B16F10. Os camundongos foram tratados por via intraperitoneal com (FIG. 60A) mab IgG2a de camundongo de controle de isótipo Cl.18.4 e anticorpo monoclonal antiTyrp-1 de camundongo ou (FIG. 60B) mab IgG2a de camundongo de controle de isótipo Cl.18.4 e mcFAE-C26.99 TriNKET,
injetados em uma dose de 150 pg (dias 6, 8, 10, 12, 14, 16
e 21) . 0 crescimento tumoral foi avaliado por 28 dias. Os
gráficos mostram curvas de crescimento tumoral de
camundongos individuais.
[0075] As FIGs. 61A—61B mostram eficácia antitumoral de mcFAE-C26.99 TriNKET em modelos i.v. de B16F10. A FIG. 61A representa a carga tumoral quando anticorpos foram administrados em uma dose de 150 pg (dias 4, 6, 8, 11, 13, 15). A FIG. 61B representa a carga tumoral quando anticorpos foram administrados em uma dose de 150 pg (dias 7, 9, 11, 13, 15) . Dezoito dias após ataque do tumor, os camundongos foram sacrificados e metástases pulmonares da superfície foram pontuadas.
[0076] A FIG. 62 é um gráfico de barras que mostra que células NK humanas são ativadas por TriNKETs quando cultivadas com células Raji CD20+.
[0077] A FIG. 63 é um gráfico de barras que mostra ativação de NK humana em cultura com células de mieloma humano MM.1S BCMA-positivas.
[0078] A FIG. 64 é um gráfico que mostra que TriNKETs aumentam célula lise por NK humana de células de mieloma
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 22/175
16/120
KMS12-PE.
[0079] A FIG. 65 é um gráfico que mostra que TriNKETs direcionados ao BCMA com domínios de ligação ao NKG2D diferentes aumentam a lise de células por NK humana de células de mieloma KMS12-PE.
[0080] A FIG. 66 é um gráfico de linhas mostrando que a ligação triespecífica em uma molécula é importante para atividade máxima de célula NK.
[0081] A FIG. 67 é uma construção heterodimérica Oasc-Fab que inclui Fab de ligação ao alvo 1 e scFab de ligação ao alvo 2 fundidos ao Fc. A heterodimerização é assegurada por mutações na Fc.
[0082] A FIG. 68 é um DuetMab, que é uma construção heterodimérica que contém 2 Fabs de ligação ao antígeno 1 e 2 diferentes e Fc estabilizado por mutações de heterodimerização. Fab 1 e 2 contêm pontes S-S diferenciais que asseguram pareamento de LC e HC correto.
[0083] A FIG. 69 é um CrossmAb, que é uma construção heterodimérica com 2 Fabs de ligação ao alvo 1 e 2 diferentes fundidos ao Fc estabilizado por heterodimerização. Os domínios CL e CHI e os domínios Vh e VL são trocados, por exemplo, CHI é fundida alinhada com VL, enquanto CL é fundida alinhada com VH.
[0084] A FIG. 70 é um Fit-Ig, que é uma construção homodimérica na qual Fab de ligação ao antígeno 2 é fundido ao terminal-N da HC de Fab que se liga ao antígeno 1. A construção contém Fc do tipo selvagem.
DESCRIÇÃO DETALHADA [0085] A invenção fornece proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam a um antígeno tumor-associado
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 23/175
17/120 em uma célula de câncer e ao receptor NKG2D e ao receptor CD16 em células natural killer para ativar a célula natural killer, composições farmacêuticas que compreendem essas proteinas de ligação multiespecificas, e métodos terapêuticos que utilizam essas proteinas multiespecificas e composições farmacêuticas, incluindo para o tratamento de câncer. Vários aspectos da invenção são apresentados abaixo em seções; no entanto, aspectos da invenção descritos em uma seção particular não estão limitados a qualquer seção particular.
[0086] Para facilitar a compreensão da presente invenção, diversos termos e frases são definidos abaixo.
[0087] Os termos um e uma, como usados nesse relatório descritivo, significam um ou mais e incluem o plural, a menos que o contexto seja inadequado.
[0088] Como usado nesse relatório descritivo, o termo sitio de ligação ao antigeno se refere à parte da molécula de imunoglobulina que participa na ligação ao antigeno. Em anticorpos humanos, o sitio de ligação ao antigeno é formado por residues de aminoácidos das regiões variáveis do terminal-N (V) das cadeias pesadas (H) e leves (L) . Três trechos altamente divergentes dentro das regiões V das cadeias pesadas e leves são referidos como regiões hipervariáveis que são interpostas entre trechos de flanqueamento mais conservados conhecidos como regiões framework, ou FRs. Dessa forma, o termo FR se refere às sequências de aminoácidos que são encontradas naturalmente entre e adjacentes às regiões hipervariáveis em imunoglobulinas. Em uma molécula de anticorpo humano, as três regiões hipervariáveis de uma cadeia leve e as três
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 24/175
18/120 regiões hipervariáveis de uma cadeia pesada estão dispostas em relação umas às outras no espaço tridimensional para formar uma superfície de ligação ao antígeno. A superfície de ligação ao antígeno é complementar à superfície tridimensional de um antígeno ligado, e as três regiões hipervariáveis de cada uma das cadeias pesadas e leves são referidas como regiões determinantes de complementaridade, ou CDRs. Em certos animais, por exemplo, camelos e peixes cartilaginosos, o sítio de ligação ao antígeno é formado por uma única cadeia de anticorpo, fornecendo um anticorpo de domínio único. Sítios de ligação ao antígeno podem existir em um anticorpo intacto, em um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo que retém a superfície de ligação ao antígeno, ou em um polipeptídeo recombinante como, por exemplo, um scFv, usando um vinculador peptídico para conectar o domínio variável da cadeia pesada ao domínio variável da cadeia leve em um único polipeptídeo.
[0089] O termo antígeno tumor-associado, como usado nesse relatório descritivo, significa qualquer antígeno incluindo, sem limitação, uma proteína, glicoproteína, gangliosídeo, carboidrato, lipídeo, que está associado com câncer. Esse antígeno pode ser expresso em células malignas ou no microambiente tumoral como, por exemplo, em vasos sanguíneos associados ao tumor, matriz extracelular, estroma mesenquimal ou infiltrados imunes.
[0090] Como usados nesse relatório descritivo, os termos indivíduo e paciente se referem a um organismo a ser tratado pelos métodos e composições descritos nesse relatório descritivo. Esses organismos preferivelmente incluem, sem limitação, mamíferos (por exemplo, murídeos,
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 25/175
19/120 símios, eqüinos, bovinos, suínos, caninos, felinos e semelhantes) e, mais preferivelmente, incluem humanos.
[0091] Como usado nesse relatório descritivo, o termo quantidade eficaz se refere à quantidade de um composto (por exemplo, um composto da presente invenção) suficiente para efetuar resultados benéficos ou desejados. Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações, aplicações ou dosagens e não visa ser limitada a uma formulação ou via de administração particular. Como usado nesse relatório descritivo, o termo tratamento inclui qualquer efeito, por exemplo, diminuição, redução, modulação, melhora ou eliminação, que resulte na melhora da condição, doença, distúrbio e semelhantes, ou na melhora de um sintoma deste.
[0092] Como usado nesse relatório descritivo, o termo composição farmacêutica se refere à combinação de um agente ativo com um carreador, inerte ou ativo, tornando a composição especialmente adequada para uso diagnóstico ou terapêutico in vivo ou ex vivo.
[0093] Como usado nesse relatório descritivo, o termo carreador farmaceuticamente aceitável se refere a qualquer um dos carreadores farmacêuticos padronizados, por exemplo, uma solução salina tamponada com fosfato, água, emulsões (como, por exemplo, emulsões óleo/água ou água/óleo), e vários tipos de agentes umidificantes. As composições também podem incluir estabilizantes e conservantes. Para exemplos de carreadores, estabilizantes e adjuvantes, veja, por exemplo, Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15a Edição, Mack Publ. Co., Easton, PA [1975].
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 26/175
20/120 [0094] Como usado nesse relatório descritivo, o termo sal farmaceuticamente aceitável se refere a qualquer sal farmaceuticamente aceitável (por exemplo, ácido ou base) de um composto da presente invenção que, mediante administração a um indivíduo, é capaz de fornecer um composto dessa invenção ou um metabólito ativo ou resíduo deste. Como é conhecido por aqueles habilitados na técnica, sais dos compostos da presente invenção podem ser derivados de ácidos e bases inorgânicos ou orgânicos. Ácidos exemplares incluem, sem limitação, ácido clorídrico, hidrobrômico, sulfúrico, nítrico, perclórico, fumárico, maléico, fosfórico, glicólico, lático, salicílico, succínico, tolueno-psulfônico, tartárico, acético, cítrico, metanossulfônico, etanossulfônico, fórmico, benzóico, malônico, naftaleno-2sulfônico, benzenossulfônico e semelhantes. Outros ácidos, por exemplo, oxálico, embora eles próprios não sejam farmaceuticamente aceitáveis, podem ser empregados na preparação de sais úteis como intermediários na obtenção dos compostos da invenção e seus sais de adição ácida farmaceuticamente aceitáveis.
[0095] Bases exemplares incluem, sem limitação, hidróxidos de metal alcalino (por exemplo, sódio), hidróxidos de metal alcalino terroso (por exemplo, magnésio) , amônia, e compostos de fórmula NW4+, em que W é Ci-4 alquil e semelhantes.
[0096] Sais exemplares incluem, sem imitação: acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, benzenossulfonato, bissulfato, butirato, citrato, canforato, canforsulfonato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanossulfonato, fumarato, glucoheptanoato,
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 27/175
21/120 glicerofosfato, hemissulfato, heptanoato, hexanoato, cloridrato, hidrobrometo, hidroiodeto, 2hidroxietanossulfonato, lactato, maleato, metanossulfonato, 2-naftalenossulfonato, nicotinato, oxalato, palmoato, pectinato, persulfato, fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartrato, tiocianato, tosilato, undecanoato e semelhantes. Outros exemplos de sais incluem ânions dos compostos da presente invenção formados com um cátion adequado como, por exemplo, Na+, NH4+ e NW4+ (em que W é um grupo C1-4 alquil) e semelhantes.
[0097] Para uso terapêutico, os sais dos compostos da presente invenção são contemplados com sendo farmaceuticamente aceitáveis. No entanto, sais de ácidos e bases que não são farmaceuticamente aceitáveis também podem encontrar utilidade, por exemplo, na preparação ou purificação de um composto farmaceuticamente aceitável.
[0098] Ao longo da descrição, quando composições são descritas como tendo, incluindo ou compreendendo componentes específicos, ou quando processos e métodos são descritos como tendo, incluindo ou compreendendo etapas específicas, é contemplado que, adicionalmente, há composições da presente invenção que consistem basicamente, ou consistem, nos componentes citados, e que há processos e métodos de acordo com a presente invenção que consistem basicamente, ou consistem, nas etapas de processamento citadas.
[0099] Como uma questão geral, composições que especificam uma percentagem são por peso, salvo especificação em contrário. Além disso, se uma variável não é acompanhada por uma definição, então a definição prévia da variável predomina.
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 28/175
22/120
I. PROTEÍNAS [0100] A invenção fornece proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam a um antigeno tumor-associado em uma célula de câncer e ao receptor NKG2D e ao receptor CD16 em células natural killer para ativar a célula natural killer. As proteínas de ligação multiespecíficas são úteis nas composições farmacêuticas e métodos terapêuticos descritos nesse relatório descritivo. A ligação da proteína de ligação multiespecífica ao receptor NKG2D e ao receptor CD16 em células natural killer aumenta a atividade da célula natural killer em direção à destruição de uma célula de câncer. A ligação da proteína de ligação multiespecífica a um antigeno tumor-associado em uma célula de câncer coloca a célula de câncer próxima à célula natural killer, o que facilita a destruição direta e indireta da célula de câncer pela célula natural killer. Descrição adicional de proteínas de ligação multiespecíficas exemplares é fornecida abaixo.
[0101] O primeiro componente das proteínas de ligação multiespecíficas se liga às células que expressam o receptor NKG2D, que podem incluir, sem limitação, células NK, células T γδ e células T CD8+ αβ. Mediante ligação ao NKG2D, as proteínas de ligação multiespecíficas podem bloquear ligantes naturais, por exemplo, ULBP6 e MICA, da ligação ao NKG2D.
[0102] O segundo componente das proteínas de ligação multiespecí ficas se liga a um ou mais antígenos tumorassociados, que podem incluir, sem limitação, HER2, CD20, CD33, BCMA, EpCAM, CD2, CD19, CD30, CD38, CD40, CD52, CD70, EGFR/ERBB1, IGF1R, HER3/ERBB3, HER4/ERBB4, MUC1, cMET, SLAMF7, PSCA, MICA, MICB, TRAILR1, TRAILR2, MAGE-A3, B7.1,
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 29/175
23/120
B7.2, CTLA4 e PD1.
[0103] O terceiro componente para as proteínas de ligação multiespecificas se liga às células que expressam CD16, um receptor Fc na superfície de leucócitos, incluindo células natural killer, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, mastócitos e células dendríticas foliculares.
[0104] As proteínas de ligação multiespecificas podem assumir vários formatos, como mostrado, sem limitação, nos exemplos abaixo. Um formato é um anticorpo multiespecífico, heterodimérico, que inclui uma primeira cadeia pesada de imunoglobulina, uma segunda cadeia pesada de imunoglobulina e uma cadeia leve de imunoglobulina. A primeira cadeia pesada de imunoglobulina inclui um primeiro domínio Fc (dobradiça-CH2-CH3), um primeiro domínio variável da cadeia pesada e um primeiro domínio da cadeia pesada CHI opcional. A cadeia leve de imunoglobulina inclui um domínio variável da cadeia leve e um domínio constante da cadeia leve; junto com a primeira cadeia pesada de imunoglobulina, a cadeia leve de imunoglobulina forma um sítio de ligação ao antigeno que se liga a NKG2D. A segunda cadeia pesada de imunoglobulina compreende um segundo domínio Fc (dobradiçaCH2-CH3), um segundo domínio variável da cadeia pesada e um segundo domínio da cadeia pesada CHI opcional que pode parear com uma cadeia leve de imunoglobulina idêntica àquela que pareia com a primeira cadeia pesada de imunoglobulina, exceto que, quando a cadeia leve de imunoglobulina está pareada com a segunda cadeia pesada de imunoglobulina, o sítio de ligação ao antigeno resultante se liga a um antigeno tumoral. O primeiro domínio Fc e segundo domínio Fc juntos são capazes de se ligar ao CD16 (FIG. 1).
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 30/175
24/120 [0105] Outro formato exemplar envolve um anticorpo multiespecifico, heterodimérico, que inclui uma primeira cadeia pesada de imunoglobulina, uma cadeia leve de imunoglobulina e uma segunda cadeia pesada de imunoglobulina. A primeira cadeia pesada de imunoglobulina inclui um primeiro dominio Fc (dobradiça-CH2-CH3) fundido por meio de um vinculador ou uma dobradiça de anticorpo a um Fv de cadeia única (scFv) que se liga a NKG2D. Diversos vinculadores poderiam ser usados para a ligação do scFv ao primeiro dominio Fc ou dentro do próprio scFv. Além disso, o scFv pode incorporar mutações que permitem a formação de uma ligação dissulfeto para estabilizar a estrutura global do scFv. O scFv também pode incorporar mutações para modificar o ponto isoelétrico da primeira cadeia pesada de imunoglobulina global e/ou para permitir uma purificação mais fácil a jusante. A segunda cadeia pesada de imunoglobulina inclui um segundo dominio Fc (dobradiça-CH2CH3) e um segundo dominio variável da cadeia pesada e um segundo dominio da cadeia pesada CHI opcional. A cadeia leve de imunoglobulina inclui um dominio variável da cadeia leve e um dominio constante da cadeia leve. A segunda cadeia pesada de imunoglobulina pareia com a cadeia leve de imunoglobulina e se liga a um antigeno tumoral. O primeiro dominio Fc e o segundo dominio Fc juntos são capazes de se ligar ao CD16 (FIG. 2).
[0106] Um formato alternativo das proteinas heterodiméricas multiespecificas inclui uma primeira cadeia pesada de imunoglobulina, uma segunda cadeia pesada de imunoglobulina, uma primeira cadeia leve de imunoglobulina e uma segunda cadeia leve de imunoglobulina. A primeira
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 31/175
25/120 cadeia pesada de imunoglobulina inclui um primeiro domínio Fc (dobradiça-CH2-CH3) , um primeiro domínio variável da cadeia pesada e um primeiro domínio da cadeia pesada CHI opcional. A primeira cadeia leve de imunoglobulina inclui um domínio variável da cadeia leve e um domínio constante da cadeia leve. Junto com a primeira cadeia pesada de imunoglobulina, a primeira cadeia leve de imunoglobulina forma um sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno tumoral. A segunda cadeia pesada de imunoglobulina compreende um segundo domínio Fc (dobradiça-CH2-CH3), um segundo domínio variável da cadeia pesada e um segundo domínio da cadeia pesada CHI opcional. A segunda cadeia leve de imunoglobulina inclui um domínio variável da cadeia leve e um domínio constante da cadeia leve. Junto com a segunda cadeia pesada de imunoglobulina, a cadeia leve de imunoglobulina forma um sítio de ligação ao antígeno que se liga ao mesmo antígeno tumoral. A segunda cadeia pesada de imunoglobulina pode parear com uma cadeia leve de imunoglobulina, que pode ser idêntica à cadeia leve de imunoglobulina que pareia com a primeira cadeia pesada de imunoglobulina, exceto que, quando a cadeia leve de imunoglobulina está pareada com a segunda cadeia pesada de imunoglobulina, o sítio de ligação ao antígeno resultante é um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno tumoral. Em certas modalidades, o primeiro domínio Fc e o segundo domínio Fc juntos são capazes de se ligar ao CD16 (FIG. 1).
[0107] Um ou mais motivos de ligação adicionais podem ser fundidos ao terminal-C do domínio CH3 da região constante, opcionalmente por meio de uma sequência
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 32/175
26/120 vinculadora. Em certas modalidades, o sítio de ligação ao antígeno podería ser uma região variável de cadeia única ou estabilizada por dissulfeto (ScFv) ou podería formar uma molécula tetravalente ou trivalente.
[0108] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de Triomab, que é um anticorpo biespecífico, trifuncional, que mantém um formato IgG-like. Essa quimera consiste em duas metades de anticorpos, cada uma com uma cadeia leve e uma cadeia pesada, que se originam de dois anticorpos parentais.
[0109] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica é a forma de Cadeia Leve Comum (LC) KiH, que envolve a tecnologia knobs-into-holes (KIHs). O KIH envolve a modificação por engenharia genética de domínios CH3 para criar uma protuberância ou um orifício em cada cadeia pesada para promover heterodimerização. O conceito por trás da tecnologia de Fc Knobs-into-Holes (KiH) foi introduzir uma protuberância em um domínio CH3 (CH3A) por substituição de um resíduo pequeno com um volumoso (ou seja, T366Wch3a na numeração de EU) . Para acomodar a protuberância, uma superfície complementar de orifício foi criada no outro domínio CH3 (CH3B) por substituição dos resíduos vizinhos mais próximos a protuberância por uns menores (ou seja, T366S/L368A/Y407Vch3b) . A mutação de orifício foi otimizada pela pesquisa guiada-estruturada da biblioteca de fago (Atwell S., Ridgway J.B., Wells J.A., Carter P. Stable heterodimers from remodeling the domain interface of a homodimer using a phage display library. J. Mol. Biol.
(1997) 270 (1): 26-35). As estruturas cristais por raios-X de variantes de Fc KiH (Elliott J.M., Ultsch M, . Lee J.,
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 33/175
27/120
Tong R., Takeda K., Spiess C., e outros, Antiparallel conformation of knob and hole aglycosylated half-antibody homodimers is mediated by a CH2-CH3 hydrophobic interaction. J. Mol. Biol. (2014) 426 (9) : 1.947-57; Mimoto F., Kadono S., Katada H., Igawa T., Kamikawa T., Hattori K. Crystal structure of a novel asymmetrically engineered Fc variant with improved affinity for FcgammaRs. Mol.
Immunol. (2014) 58 (1) : 132-8) demonstraram que a heterodimerização é termodinamicamente favorecida por interações hidrofóbicas dirigidas por complementaridade estérica na interface central interdominio CH3, enquanto as interfaces protuberância-protuberância e as interfaces orificio-orificio não favorecem a homodimerização em consequência de impedimento estérico e ruptura das interações favoráveis, respectivamente.
[0110] Em algumas modalidades, a proteina de ligação multiespecifica está na forma de imunoglobulina de dominio variável duplo (DVD-Ig™) , que combina os dominios de ligação ao alvo de dois anticorpos monoclonais por meio de vinculadores flexíveis de ocorrência natural, e gera uma molécula tetravalente IgG-like.
[0111] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecifica está na forma de interface de Fab Ortogonal (Orto-Fab). Na abordagem de IgG de orto-Fab (Lewis S.M., Wu X., Pustilnik A., Sereno A., Huang F., Rick H.L., e outros Generation of bispecific IgG antibodies by structure-based design of an orthogonal Fab interface. Nat. Biotechnol. (2014) 32 (2): 191-8), o design regional baseado em estrutura introduz mutações complementares na interface LC e HCvh-chi em apenas um Fab, não sendo feita nenhuma alteração no outro
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 34/175
28/120
Fab .
[0112] Em algumas modalidades, a proteina de ligação multiespecifica está no formato de Ig 2-em-l. Em algumas modalidades, a proteina de ligação multiespecifica está na forma de ES, que é uma construção heterodimérica que contém 2 Fabs de ligação ao alvo 1 e alvo 2 diferentes fundidos ao Fc. A heterodimerização é assegurada por mutações de direção eletrostática no Fc. Em algumas modalidades, a proteina de ligação multiespecifica está na forma de KÀ-Corpo, que é uma construção heterodimérica com 2 Fabs diferentes fundidos ao Fc estabilizado por mutações de heterodimerização: Fabl direcionado ao antigeno 1 contém kappa LC, enquanto o segundo Fab direcionado ao antigeno 2 contém LC lambda. A FIG. 13A é uma representação exemplar de uma forma de um KÀ-Corpo; FIG. 13B é uma representação exemplar de outro κλ-Corpo.
[0113] Em algumas modalidades, a proteina de ligação multiespecifica está em forma de uma Troca de Braço de Fab (anticorpos que trocam braços de Fab por troca de uma cadeia pesada e cadeia leve anexada (meia-molécula) com um par de cadeia pesada-leve de outra molécula, o que resulta em anticorpos biespecificos). Em algumas modalidades, a proteina de ligação multiespecifica está na forma de Corpo SEED (a plataforma de dominio modificado por engenharia genética por troca de fitas (SEED) foi projetada para gerar moléculas assimétricas e anticorpo biespecifico semelhante, uma capacidade que expande as aplicações terapêuticas dos anticorpos naturais. Essa plataforma de modificação por engenharia genética de proteínas se baseia na troca de sequências de imunoglobulina estruturalmente relacionadas dentro dos domínios CH3 conservados. O design de SEED permite
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 35/175
29/120 a geração eficiente de heterodímeros de AG/GA, enquanto desfavorece a homodimerização de dominios CH3 SEED AG e GA (Muda M. e outros, Protein Eng. Des. Sei. (2011, 24 (5): 447-54)). Em algumas modalidades, a proteína de ligação mult iespecí f ica está na forma de LuZ-Y, no qual zíper de leucina é usado para induzir heterodimerização de duas HCs diferentes (Wranik, BJ. e outros, J. Biol. Chem. (2012), 287 : 43.331-9) .
[0114] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de Cov-X-Corpo (em CovX-Corpos biespecíficos, dois peptídeos diferentes são unidos juntos usando um vinculador de azetidinona ramificado e fundido ao anticorpo de arcabouço sob condições suaves de uma forma sítio-específica. Enquanto os farmacóforos são responsáveis por atividades funcionais, o arcabouço de anticorpo transmite meia-vida longa e distribuição Ig-like. Os farmacóforos podem ser otimizados quimicamente ou trocados com outros farmacóforos para gerar anticorpos biespecíficos otimizados ou únicos (Doppalapudi V.R. e outros, PNAS (2010), 107 (52); 22611-22616).
[0115] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está em uma forma heterodimérica Oasc-Fab que inclui Fab de ligação ao alvo 1 e scFab de ligação ao alvo 2 fundidos ao Fc. A heterodimerização é assegurada por mutações no Fc.
[0116] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecí fica está em forma de um DuetMab, que é uma construção heterodimérica que contém 2 Fabs de ligação ao antígeno 1 e 2 diferentes e Fc estabilizado por mutações de heterodimerização. Fab 1 e 2 contêm pontes S-S diferenciais
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 36/175
30/120 que asseguram pareamento de LC e HC correto.
[0117] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecí fica está em forma de um CrossmAb, que é uma construção heterodimérica com 2 Fabs diferentes de ligação ao Alvo 1 e 2 fundidos ao Fc estabilizado por heterodimerização. Domínios CL e CHI e domínios VH e VL são trocados, por exemplo, CHI é fundida alinhada com VL, enquanto CL é fundida alinhada com VH.
[0118] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecí fica está em forma de um Fit-Ig, que é uma construção homodimérica na qual Fab de ligação ao antigeno 2 é fundido ao terminal-N de HC de Fab que se liga ao antigeno
1. A construção contém Fc do tipo selvagem.
[0119] A Tabela 1 lista sequências de peptídeos de domínios variáveis da cadeia pesada e domínios variáveis da cadeia leve que, em combinação, podem se ligar ao NKG2D.
Tabela 1
Clones Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve
ADI—27705 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGS FSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGS TNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSS VTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTL VTVSS (ID. DE SEQ. N°: 1) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCR ASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLI YKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFT LTISSLQPDDFATYYCQQYNSYPI TFGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 2)
ADI—27724 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGS FSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGS TNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSS VTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTL VTVSS (ID. DE SEQ. N°: 3) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR AS QSVS S S YLAWYQQKPGQAPRLL IYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDF TLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSP ITFGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 4)
ADI—27740 (A40) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGS FSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGS TNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSS VTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTL VTVSS (ID. DE SEQ. N°: 5) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCR ASQSIGSWLAWYQQKPGKAPKLLI YKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFT LTISSLQPDDFATYYCQQYHSFYT FGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 6)
ADI—27741 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGS FSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGS TNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSS VTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTL VTVSS DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCR ASQSIGSWLAWYQQKPGKAPKLLI YKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFT LTISSLQPDDFATYYCQQSNSYYT FGGGTKVEIK
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 37/175
31/120
(ID. DE SEQ. N°: 7) (ID. DE SEQ. N°: 8)
ADI-27743 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGS FSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGS TNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSS VTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTL VTVSS (ID. DE SEQ. N°: 9) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCR ASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLI YKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFT LTISSLQPDDFATYYCQQYNSYPT FGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 10)
ADI-28153 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGS FSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGS TNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSS VTAADTAVYYCARARGPWGFDPWGQGTL VTVSS (ID. DE SEQ. N°: 11) ELQMTQSPSSLSASVGDRVTITCR TSQSISSYLNWYQQKPGQPPKLLI YWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFT LTISSLQPEDSATYYCQQSYDIPY TFGQGTKLEIK (ID. DE SEQ. N°: 12)
ADI-28226 (C26) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGS FSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGS TNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSS VTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTL VTVSS (ID. DE SEQ. N°: 13) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCR ASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLI YKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFT LTISSLQPDDFATYYCQQYGSFPI TFGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 14)
ADI-28154 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGS FSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGS TNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSS VTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTL VTVSS (ID. DE SEQ. N°: 15) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCR ASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLI YKASSLESGVPSRFSGSGSGTDFT LTISSLQPDDFATYYCQQSKEVPW TFGQGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 16)
ADI-29399 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGS FSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGS TNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSS VTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTL VTVSS (ID. DE SEQ. N°: 17) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCR ASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLI YKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFT LTISSLQPDDFATYYCQQYNSFPT FGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 18)
ADI-29401 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGS FSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGS TNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSS VTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTL VTVSS (ID. DE SEQ. N°: 19) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCR ASQSIGSWLAWYQQKPGKAPKLLI YKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFT LTISSLQPDDFATYYCQQYDIYPT FGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 20)
ADI-29403 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGS FSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGS TNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSS VTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTL VTVSS (ID. DE SEQ. N°: 21) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCR ASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLI YKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFT LTISSLQPDDFATYYCQQYDSYPT FGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 22)
ADI-29405 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGS FSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGS TNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSS VTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTL VTVSS (ID. DE SEQ. N°: 23) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCR ASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLI YKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFT LTISSLQPDDFATYYCQQYGSFPI FGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 24)
ADI-29407 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGS FSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGS TNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSS VTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTL VTVSS (ID. DE SEQ. N°: 25) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCR ASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLI YKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFT LTISSLQPDDFATYYCQQYQSFPT FGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 26)
ADI-29419 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGS FSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGS TNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSS VTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTL DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCR ASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLI YKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFT LTISSLQPDDFATYYCQQYSSFST
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 38/175
32/120
VTVSS (ID. DE SEQ. N°: 27) FGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 28)
ADI-29421 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGS FSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGS TNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSS VTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTL VTVSS (ID. DE SEQ. N°: 29) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCR ASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLI YKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFT LTISSLQPDDFATYYCQQYESYST FGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 30)
ADI-29424 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGS FSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGS TNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSS VTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTL VTVSS (ID. DE SEQ. N°: 31) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCR ASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLI YKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFT LTISSLQPDDFATYYCQQYDSFIT FGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 32)
ADI-29425 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGS FSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGS TNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSS VTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTL VTVSS (ID. DE SEQ. N°: 33) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCR ASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLI YKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFT LTISSLQPDDFATYYCQQYQSYPT FGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 34)
ADI-29426 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGS FSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGS TNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSS VTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTL VTVSS (ID. DE SEQ. N°: 35) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCR ASQSIGSWLAWYQQKPGKAPKLLI YKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFT LTISSLQPDDFATYYCQQYHSFPT FGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 36)
ADI-29429 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGS FSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGS TNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSS VTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTL VTVSS (ID. DE SEQ. N°: 37) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCR ASQSIGSWLAWYQQKPGKAPKLLI YKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFT LTISSLQPDDFATYYCQQYELYSY TFGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 38)
ADI-29447 (F47) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGS FSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGS TNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSS VTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTL VTVSS (ID. DE SEQ. N°: 39) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCR ASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLI YKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFT LTISSLQPDDFATYYCQQYDTFIT FGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 40)
ADI-27727 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGT FSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFG TANYAQKF QGRVTITADE STS TAYME LS SLRSEDTAVYYCARGDSSIRHAYYYYGM DVWGQGTTVTVSS (ID. DE SEQ. N°: 41) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCK S SQSVLYS SNNKNYLAWYQQKP GQ PPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSG SGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQ YYSTPITFGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 42)
ADI-29443 (F43) QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGS ISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYS GSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKL SSVTAADTAVYYCARGSDRFHPYFDYWG QGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N°: 43) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCR ASQSVSRYLAWYQQKPGQAPRLLI YDASNRATGIPARFSGSGSGTDFT LTISSLEPEDFAVYYCQQFDTWPP TFGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 44)
ADI-27744 (A44) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFT FSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGG STYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMN SLRAEDTAVYYCAKDGGYYDSGAGDYWG QGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N°: 45) DIQMTQSP S SVSASVGDRVTITCR ASQGIDSWLAWYQQKPGKAPKLLI YAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFT LTISSLQPEDFATYYCQQGVSYPR TFGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 46)
CDR1 (ID. DE SEQ. N°: 51) - FTFSSYAMS CDR1 (ID. DE SEQ. N°: 54) - RASQGIDSWLA
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 39/175
33/120
CDR2 (ID. DE SEQ. N°: 52) AISGSGGSTYYADSVKG CDR3 (ID. DE SEQ. N°: 53) AKDGGYYDSGAGDY CDR2 (ID. DE SEQ. N°: 55) - AASSLQS CDR3 (ID. DE SEQ. N°: 56) - QQGVSYPRT
ADI—27749 (A49) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT FSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSS YIYYAD SVKGRF TISRDNAKNS LYLQMN SLRAEDTAVYYCARGAPMGAAAGWFDPW GQGTLVTVSS (ID. DE SEQ. N°: 47) DIQMTQSP S SVSASVGDRVTITCR AS QGIS SWLAWYQQKP GKAPKLLI YAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFT LTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPR TFGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 48)
CDR1 (ID. DE SEQ. N°: 57) FTFSSYSMN CDR2 (ID. DE SEQ. N°: 58) SISSSSSYIYYADSVKG CDR3 (ID. DE SEQ. N°: 59) ARGAPMGAAAGWFDP CDR1 (ID. DE SEQ. N°: 60) - RASQGISSWLA CDR2 (ID. DE SEQ. N°: 61) - AASSLQS CDR3 (ID. DE SEQ. N°: 62) - QQGVSFPRT
ADI-29463 (F63) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYT FTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSG GTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELS RLRS DD TAVYYCARD TGEYYDTDD HGMD VWGQGTTVTVSS (ID. DE SEQ. N°: 49) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCR ASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLI YGASTRATGIPARFSGSGSGTEFT LTISSLQSEDFAVYYCQQDDYWPP TFGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 50)
CDR1 (ID. DE SEQ. N°: 63) YTFTGYYMH CDR2 (ID. DE SEQ. N°: 64) - WINPNSGGTNYAQKFQG CDR3 (ID. DE SEQ. N°: 65) - ARD TGEYYDTDD HGMDV CDR1 (ID. DE SEQ. N°: 66) - RASQSVSSNLA CDR2 (ID. DE SEQ. N°: 67) - GASTRAT CDR3 (ID. DE SEQ. N°: 68) - QQDDYWPPT
ADI—29404 (F04) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGS FSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGS TNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSS VTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTL VTVSS (ID. DE SEQ. N°: 78) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCR ASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLI YKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFT LTISSLQPDDFATYYCEQYDSYPT FGGGTKVEIK (ID. DE SEQ. N°: 79)
ADI—28200 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGT FSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFG TANYAQKF QGRVTITADE STS TAYME LS SLRSEDTAVYYCARRGRKASGSFYYYYG MDVWGQGTTVTVSS (ID. DE SEQ. N°: 80) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCE SSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQ PPKPLIYWASTRESGVPDRFSGSG SGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQN DYSYPYTFGQGTKLEIK (ID. DE SEQ. N°: 81)
[0120] Alternativamente, um dominio variável da cadeia pesada definido pelo ID. DE SEQ. N°: 69 pode ser pareado com um dominio variável da cadeia leve definido pelo ID. DE SEQ. N°: 70 para formar um sitio de ligação ao antigeno que pode se ligar ao NKG2D, como ilustrado em US 9.273.136. ID. DE SEQ. N°: 69 QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKY
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 40/175
34/120
YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRGLGDGTYFDYWGQGTTVT VSS
ID. DE SEQ. N°: 70 QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYYDDLLPSGV SDRFSGSKSGTSAFLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTVL [0121] Alternativamente, o domínio variável da cadeia pesada definido pelo ID. DE SEQ. N°: 71 pode ser pareado com o domínio variável da cadeia leve definido pelo ID. DE SEQ. N°: 72 para formar um sítio de ligação ao antígeno que pode se ligar ao NKG2D, como ilustrado em US 7.879.985. ID. DE SEQ. N°: 71 QVHLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSDDSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGHISYSGSANY NPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCANWDDAFNIWGQGTMVTVSS ID. DE SEQ. N°: 72 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGI PDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK [0122] Dentro do domínio Fc, a ligação ao CD16 é mediada pela região de dobradiça e pelo domínio CH2. Por exemplo, dentro de IgGl humana, a interação com CD16 é primariamente concentrada nos resíduos de aminoácidos Asp 265 - Glu 269, Asn 297 - Thr 299, Ala 327 - Ile 332, Leu 234 - Ser 239, e resíduo de carboidrato N-acetil-D-glicosamina no domínio CH2 (veja, Sondermann e outros, Nature, 406 (6793) : 267-273) . Com base nos domínios conhecidos, podem ser selecionadas mutações para aumentar ou reduzir a afinidade de ligação ao CD16, por exemplo, por utilização de bibliotecas exibidas em fago ou bibliotecas de cDNA exibidas na superfície de levedura, ou podem ser projetadas com base na estrutura tridimensional conhecida da interação.
[0123] A montagem de cadeias pesadas de anticorpo
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 41/175
35/120 heterodiméricas pode ser obtida por expressão de duas sequências da cadeia pesada de anticorpo diferentes na mesma célula, o que pode levar à montagem de homodimeros de cada cadeia pesada de anticorpo, bem como à montagem de heterodimeros. A promoção da montagem preferencial de heterodimeros pode ser obtida por incorporação de mutações diferentes no dominio CH3 de cada região constante da cadeia pesada de anticorpo, como mostrado em US13/494870, US16/028850, US11/533709, US12/875015, US13/289934, US14/773418, US12/811207, US13/866756, US14/647480, US14/830336. Por exemplo, podem ser feitas mutações no domínio CH3 com base em IgGl humana e incorporação de pares distintos de substituições de aminoácidos dentro de um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, o que permite que essas duas cadeias heterodimerizem seletivamente entre elas. As posições de substituições de aminoácidos ilustradas abaixo são todas numeradas de acordo com o índice de EU como em Kabat.
[0124] Em um cenário, uma substituição de aminoácido no primeiro polipeptídeo substitui o aminoácido original com um aminoácido maior, selecionado de arginina (R) , fenilalanina (F) , tirosina (Y) ou triptofano (W) , e pelo menos uma substituição de aminoácido no segundo polipeptídeo substitui o aminoácido (ou aminoácidos) original com um aminoácido (ou aminoácidos) menor, escolhido de alanina (A), serina (S) , treonina (T) ou valina (V) , de modo que a substituição do aminoácido maior (uma protuberância) se ajuste na superfície das substituições de aminoácidos maiores (uma cavidade). Por exemplo, um polipeptídeo pode incorporar uma substituição T366W, e o outro pode incorporar
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 42/175
36/120 três substituições que incluem T366S, L368A e Y407V.
[0125] Um domínio variável da cadeia pesada de anticorpo da invenção pode opcionalmente ser acoplado a uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a uma região constante de anticorpo, por exemplo, uma região constante de IgG que inclui domínios de dobradiça, CH2 e CH3 com ou sem domínio CHI. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos da região constante é pelo menos 90% idêntica a uma região constante de anticorpo humano, por exemplo, uma região constante de IgGl humana, uma região constante de IgG2, região constante de IgG3 ou região constante de IgG4. Em algumas outras modalidades, a sequência de aminoácidos da região constante é pelo menos 90% idêntica a uma região constante de anticorpo de outro mamífero, por exemplo, coelho, cão, gato, camundongo ou cavalo. Uma ou mais mutações podem ser incorporadas na região constante, comparada com a
região constante de IgGl humana, por exemplo, em Q347, Y349,
L351, S354, E356, E357 , K360, Q362, S364, T3 66, L368, K370,
N390, K392, T394, D392 >, S400, D401, F405, Y407, K409 , T411
e/ou K439. Substituições exemplares incluem i, por exemplo,
Q347E, Q347R, Y349S, Y349K, Y349T, Y349D, Y349E, Y349C,
T350V, L351K, L351D, L351Y, S354C, E356K, E357Q, E357L,
E357W, K360E, K360W, Q362E, S364K, S364E, S364H, S364D,
T366V, T366I, T366L, T366M, T366K, T366W, T366S, L368E,
L368A, L368D, K370S, N390D, N390E, K392L, K392M, K392V,
K392F, K392D, K392E, T394F, T394W, D399R, D399K, D399V,
S400K, S400R, D401K, F405A, F405T, Y407A, Y407I , Y407V,
K409F, K409W, K409D, T411D, T411E, K439D e K439E.
[0126] Em certas modalidades, mutações que podem ser incorporadas na CHI de uma região constante de IgGl humana
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 43/175
37/120 podem ser no aminoácido V125, F126, P127, T135, T139, A140, F170, P171 e/ou V173. Em certas modalidades, mutações que podem ser incorporadas na Ck de uma região constante de IgGl humana podem ser no aminoácido E123, F116, S176, V163, S174 e/ou TI64.
[0127] Alternativamente, substituições de aminoácidos poderiam ser selecionadas dos conjuntos de substituições seguintes mostrado na Tabela 2.
Tabela 2
Primeiro polipeptídeo Segundo polipeptídeo
Conjunto 1 S364E/F405A Y349K/T394F
Conjunto 2 S364H/D401K Y349T/T411E
Conjunto 3 S364H/T394F Y349T/F405A
Conjunto 4 S364E/T394F Y349K/F405A
Conjunto 5 S364E/T411E Y349K/D401K
Conjunto 6 S364D/T394F Y349K/F405A
Conjunto 7 S364H/F405A Y349T/T394F
Conjunto 8 S364K/E357Q L368D/K370S
Conjunto 9 L368D/K370S S364K
Conjunto 10 L368E/K370S S364K
Conjunto 11 K360E/Q362E D401K
Conjunto 12 L368D/K370S S364K/E357L
Conjunto 13 K370S S364K/E357Q
Conjunto 14 F405L K409R
Conjunto 15 K409R F405L
[0128] Alternativamente, substituições de aminoácidos poderiam ser selecionadas dos conjuntos de substituições seguintes mostrado na Tabela 3.
Tabela 3
Primeiro polipeptídeo Segundo polipeptídeo
Conjunto 1 K4 0 9W D399V/F405T
Conjunto 2 Y349S E357W
Conjunto 3 K360E Q347R
Conjunto 4 K360E/K409W Q347R/D399V/F405T
Conjunto 5 Q347E/K360E/K409W Q347R/D399V/F405T
Conjunto 6 Y349S/K409W E357W/D399V/F405T
[0129] Alternativamente, substituições de aminoácidos poderiam ser selecionadas do conjunto de substituições seguintes mostrado na Tabela 4.
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 44/175
38/120
Tabela 4
Primeiro polipeptídeo Segundo polipeptídeo
Conjunto 1 T366K/L351K L351D/L368E
Conjunto 2 T366K/L351K L351D/Y349E
Conjunto 3 T366K/L351K L351D/Y349D
Conjunto 4 T366K/L351K L351D/Y349E/L368E
Conjunto 5 T366K/L351K L351D/Y349D/L368E
Conjunto 6 E356K/D399K K392D/K409D
[0130] Alternativamente, pelo menos uma substituição de aminoácido em cada cadeia polipeptídica poderia ser selecionada da Tabela 5.
Tabela 5
Primeiro polipeptídeo Segundo polipeptídeo
L351Y, D399R, D399K, S400K, S400R, Y407A, Y407I, Y407V T366V, T366I, T366L, T366M, N390D, N390E, K392L, K392M, K392V, K392F K392D, K392E, K409F, K409W, T411D e T411E
[0131] Alternativamente, pelo menos uma substituição de aminoácidos poderia ser selecionada do conjunto de substituições seguinte na Tabela 6, em que a posição (ou posições) indicada na coluna do Primeiro Polipeptídeo é substituída por qualquer aminoácido carregado negativamente conhecido, e a posição (ou posições) indicada na coluna do Segundo Polipeptídeo é substituída por qualquer aminoácido carregado positivamente conhecido.
Tabela 6
Primeiro polipeptídeo Segundo polipeptídeo
K392, K370, K409 ou K439 D399, E356 ou E357
[0132] Alternativamente, pelo menos uma substituição de aminoácidos poderia ser selecionada do conjunto seguinte na Tabela 7, em que a posição (ou posições) indicada na coluna do Primeiro Polipeptídeo é substituída por qualquer
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 45/175
39/120 aminoácido carregado positivamente conhecido, e a posição (ou posições) indicada na coluna do Segundo Polipeptídeo é substituída por qualquer aminoácido carregado negativamente conhecido.
Tabela 7
Primeiro polipeptídeo Segundo polipeptídeo
D399, E356 ou E357 K409, K439, K370 ou K392
[0133] Alternativamente, substituições de aminoácidos poderiam ser selecionadas do conjunto seguinte na Tabela 8.
Tabela 8
Primeiro polipeptídeo Segundo polipeptídeo
T350V, L351Y, F405A e Y407V T350V, T366L, K392L e T394W
[0134] Alternativamente, ou em adição, a estabilidade estrutural de uma proteína de heteromultímero pode ser aumentada por introdução de S354C na primeira ou segunda cadeia polipeptídica, e Y349C na cadeia polipeptídica oposta, o que forma uma ponte dissulfeto artificial dentro da interface dos dois polipeptídeos.
[0135] As proteínas multiespecíficas descritas acima podem ser feitas usando tecnologia de DNA recombinante bem conhecida por aqueles habilitados na técnica. Por exemplo, uma primeira sequência de ácidos nucleicos que codifica a primeira cadeia pesada de imunoglobulina pode ser clonada em um primeiro vetor de expressão; uma segunda sequência de ácidos nucleicos que codifica a segunda cadeia pesada de imunoglobulina pode ser clonada em um segundo vetor de expressão; uma terceira sequência de ácidos nucleicos que codifica a cadeia leve de imunoglobulina pode ser clonada em um terceiro vetor de expressão; o primeiro, segundo e terceiro vetores de expressão podem ser transfectados
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 46/175
40/120 estavelmente juntos em células hospedeiras para produzir as proteínas multiméricas.
[0136] Para obter o maior rendimento da proteína multiespecífica, proporções diferentes do primeiro, segundo e terceiro vetores de expressão podem ser exploradas para determinar a proporção ótima para transfecção nas células hospedeiras. Após transfecção, clones únicos podem ser isolados para geração de banco de células usando métodos conhecidos na técnica, por exemplo, diluição limitada, ELISA, FACS, microscopia ou Clonepix.
[0137] Os clones podem ser cultivados sob condições adequadas para aumento de escala em biorreator e expressão mantida da proteína multiespecífica. As proteínas multiespecíficas podem ser isoladas e purificadas usando métodos conhecidos na técnica, incluindo centrifugação, filtração profunda, lise de células, homogeneização, congelamento-descongelamento, purificação por afinidade, filtração em gel, cromatografia de troca iônica, cromatografia por troca de interação hidrofóbica e cromatografia de modo misto.
II. Características de TriNKETs [0138] Em certas modalidades, os TriNKETs descritos nesse relatório descritivo, que incluem um domínio de ligação ao NKG2D e um domínio de ligação para um antigeno tumorassociado, se ligam às células que expressam NKG2D humano. Em certas modalidades, TriNKETs, que incluem um domínio de ligação ao NKG2D e um domínio de ligação para um antigeno tumor-associado, se ligam ao antigeno tumor-associado em um nível comparável com aquele de um anticorpo monoclonal que possui o mesmo domínio de ligação ao antigeno tumor
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 47/175
41/120 associado. Por exemplo, TriNKETs que incluem um domínio de ligação ao NKG2D e um domínio de ligação ao HER2 de Trastuzumab podem se ligar ao HER2 expresso em células em um nível comparável com aquele de Trastuzumab.
[0139] No entanto, os TriNKETs descritos nesse
relatório descritivo são mais eficazes na redução do
crescimento tumoral e morte de células de câncer. Por
exemplo, um TriNKET da presente revelação que visa células
tumorais/de câncer que expressam HER2 é mais eficaz do que
SC2.2 — uma molécula biespecífica de cadeia única construída a partir de um scFv derivado de trastuzumab ligado a ULBP6, um ligante para NKG2D. SC2.2 se liga às células de câncer HER2+ e células NK NKG2D+ simultaneamente. Portanto, a eficácia de SC2.2 na redução do número de células de câncer HER2+ foi investigada. Ensaios de ativação e citotoxicidade in vitro demonstraram que SC2.2 foi eficaz na ativação e morte de células NK. No entanto, SC2.2 não demonstrou eficácia no modelo de tumor subcutâneo RMA/S-HER2. A eficácia de SC2.2 também foi testada in vivo usando um modelo em camundongo singênico que superexpressa RMA/S-HER2. Nesse modelo em camundongo, SC2.2 não demonstrou controle do crescimento tumoral, comparado com controle de veículo. Dessa forma, embora SC2.2 fosse capaz de ativar e matar células NK, e se ligar às células de câncer HER2+, essas propriedades eram insuficientes para controlar eficazmente o crescimento de tumores HER2+.
[0140] Em certas modalidades, os TriNKETs descritos nesse relatório descritivo, que incluem um domínio de ligação ao NKG2D e um domínio de ligação para antígeno tumorassociado, ativam células NK humanas primárias quando
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 48/175
42/120 cultivados com células tumorais que expressam o antigeno. A ativação de célula NK é marcada pelo aumento na degranulação de CD107a e produção de citocina IFNy. Além disso, comparados com um anticorpo monoclonal que inclui o dominio de ligação ao antigeno tumor-associado, TriNKETs exibem ativação superior de células NK humanas na presença de células tumorais que expressam o antigeno. Por exemplo, comparados com o anticorpo monoclonal trastuzumab, os TriNKETs da presente revelação que possuem um domínio de ligação ao HER2, possuem uma ativação superior de células NK humanas na presença de células de câncer que expressam HER2.
[0141] Em certas modalidades, os TriNKETs descritos nesse relatório descritivo, que incluem um domínio de ligação ao NKG2D e um domínio de ligação para um antigeno tumorassociado, aumentam a atividade de células NK humanas em repouso e ativadas por IL-2 na presença de células tumorais que expressam o antigeno. Células NK em repouso mostraram menos produção de IFNy e degranulação de CD107a no nível de base do que células NK ativadas por IL-2. Em certas modalidades, células NK em repouso exibem uma alteração maior na produção de IFNy e degranulação de CD107a, comparadas com células NK ativadas por IL-2. Em certas modalidades, células NK ativadas por IL-2 exibem uma percentagem maior de células que se tornam IFNy+; CD107a+ após estimulação com TriNKETs.
[0142] Em certas modalidades, os TriNKETs descritos nesse relatório descritivo, que incluem um domínio de ligação ao NKG2D e um domínio de ligação para um antigeno tumorassociado (exemplos não limitantes de antígenos tumorassociados incluindo CD20, BCMA e HER2), aumentam a atividade citotóxica de células NK humanas em repouso e ativadas por
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 49/175
43/120
IL-2 na presença de células tumorais que expressam o antigeno. Além disso, TriNKETs (por exemplo, A40-TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43TriNKET, F47-TriNKET e F63-TriNKET), que incluem um domínio de ligação para um antigeno tumor-associado (exemplos não limitantes de antígenos tumor-associados incluindo CD20, BCMA e HER2) direcionam mais potentemente respostas de células NK ativadas e em repouso contra as células tumorais, comparados com um anticorpo monoclonal que inclui o mesmo sítio de ligação ao antigeno tumor-associado. Em certas modalidades, TriNKETs oferecem vantagens contra células tumorais que expressam de forma média e baixa antígenos tumorais, comparados com anticorpos monoclonais que incluem o mesmo sítio de ligação ao antigeno tumoral. Portanto, uma terapia que inclui TriNKETs pode ser superior a uma terapia com anticorpo monoclonal.
[0143] Em certas modalidades, comparados com anticorpos monoclonais, os TriNKETs descritos nesse relatório descritivo (por exemplo, A40-TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47TriNKET e F63-TriNKET), que incluem um domínio de ligação para um antigeno tumor-associado (exemplos não limitantes de antígenos tumor-associados incluindo CD20, BCMA e HER2) são vantajosos no tratamento de cânceres com expressão alta de receptor Fc (FcR) , ou cânceres que residem em um microambiente tumoral com níveis elevados de FcR. Anticorpos monoclonais exercem seus efeitos sobre o crescimento tumoral por meio de múltiplos mecanismos, incluindo ADCC, CDC, fagocitose e bloqueio de sinal, entre outros. Entre FcyRs, CD16 possui a menor afinidade para Fc de IgG; FcyR! (CD64)
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 50/175
44/120 é o FcR de alta afinidade, que se liga cerca de 1000 vezes mais fortemente ao Fc de IgG do que CD16. CD64 é normalmente expresso em muitas linhagens hematopoiéticas como, por exemplo, a linhagem mielóide, e pode ser expresso em tumores derivados desses tipos de células, por exemplo, leucemia mielóide aguda (AML). Células imunes que infiltram no tumor, tais como MDSCs e monócitos, também expressam CD64 e reconhecidamente infiltram o microambiente tumoral. A expressão de CD64 pelo tumor ou no microambiente tumoral pode ter um efeito prejudicial sobre a terapia com anticorpo monoclonal. A expressão de CD64 no microambiente tumoral torna difícil que esses anticorpos se liguem ao CD16 na superfície de células NK, na medida em que os anticorpos preferem se ligar ao receptor de alta afinidade. TriNKETs, por meio do direcionamento a dois receptores de ativação na superfície de células NK, podem superar o efeito prejudicial da expressão de CD64 (no tumor ou no microambiente tumoral) na terapia com anticorpo monoclonal. Independentemente da expressão de CD64 nas células tumorais, TriNKETs são capazes de mediar respostas de células NK humanas contra todas as células tumorais, pois o direcionamento duplo a dois receptores de ativação em células NK fornece ligação específica mais forte às células NK.
[0144] Em algumas modalidades, os TriNKETs descritos nesse relatório descritivo (por exemplo, A40-TriNKET, A44TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET e F63-TriNKET), que incluem um domínio de ligação para um antígeno tumor-associado (exemplos não limitantes de antígenos tumor-associados incluindo CD20, BCMA e HER2) fornecem um perfil de segurança melhor por meio de efeitos
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 51/175
45/120 colaterais no alvo/fora do tumor reduzidos. Células natural killer e células T CD8 são, ambas, capazes de destruir diretamente células tumorais, embora os mecanismos por meio do quais as células NK e células T CD8 reconhecem células próprias normais de células tumorais sejam diferentes. A atividade de células NK é regulada pelo equilíbrio de sinais de receptores de ativação (NCRs, NKG2D, CD16 etc.) e inibitórios (KIRs, NKG2A etc.). O equilíbrio desses sinais de ativação e inibitórios permite que as células NK diferenciem células próprias saudáveis de células próprias estressadas, infectadas por vírus ou transformadas. Esse mecanismo embutido de autotolerância irá ajudar a proteger tecido saudável normal de respostas de células NK. Para estender esse princípio, a autotolerância de células NK permitirá que TriNKETs visem antígenos expressos tanto próprios quanto tumorais sem efeitos colaterais fora do tumor, ou com uma janela terapêutica aumentada. Diferentemente de células natural killer, células T exigem o reconhecimento de um peptídeo específico apresentado por moléculas MHC para ativação e funções efetoras. Células T foram o alvo primário da imunoterapia, e muitas estratégias foram desenvolvidas para redirecionar respostas de células T contra o tumor. Biespecíficos de células T, inibidores do ponto de verificação e células CAR-T foram todos aprovados pelo FDA, mas frequentemente sofrem de toxicidades doselimitantes. Biespecíficos de células T e células CAR-T funcionam em torno do sistema de reconhecimento TCR-MHC por utilização de domínios de ligação a antígenos-alvo na superfície de células tumorais, e por utilização de domínios de sinalização modificados geneticamente para transduzir os
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 52/175
46/120 sinais de ativação para a célula efetora. Embora eficazes para provocar uma resposta imune antitumoral, essas terapias estão frequentemente associadas com a síndrome de liberação de citocina (CRS), e efeitos colaterais no alvo/fora do tumor. TriNKETs são únicos nesse contexto, na medida em que não irão anular os sistemas naturais de ativação e inibição de células NK. Pelo contrário, TriNKETs são projetados para gerenciar o equilíbrio, e fornecer sinais de ativação adicionais às células NK, enquanto mantêm a tolerância de NK em caráter saudável.
[0145] Em algumas modalidades, os TriNKETs descritos nesse relatório descritivo que incluem um domínio de ligação ao NKG2D (por exemplo, A40-TriNKET, A44-TriNKET, A4 9TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET e F63-TriNKET), que incluem um domínio de ligação para um antígeno tumor-associado (exemplos não limitantes de antígenos tumor-associados incluindo CD20, BCMA e HER2) retardam a progressão do tumor mais eficazmente do que anticorpos monoclonais que incluem o mesmo domínio de ligação ao antígeno tumoral. Em algumas modalidades, TriNKETs que incluem um domínio de ligação ao NKG2D e um domínio de ligação ao antígeno tumoral são mais eficazes contra câncer metástases do que anticorpos monoclonais que incluem o mesmo domínio de ligação ao antígeno tumoral.
[0146] A descrição acima descreve vários aspectos e modalidades da invenção. O pedido de patente especificamente contempla todas as combinações e permutações dos aspectos e modalidades.
III. Aplicações terapêuticas [0147] A invenção fornece métodos para o tratamento
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 53/175
47/120 de câncer com o uso de uma proteína de ligação multiespecifica descrita nesse relatório descritivo (por exemplo, A40-TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET e F63-TriNKET), que inclui um domínio de ligação para um antigeno tumor-associado (exemplos não limitantes de antígenos tumor-associados incluindo CD20, BCMA e HER2) e/ou uma composição farmacêutica descrita nesse relatório descritivo. Os métodos podem ser usados para tratar diversos cânceres, incluindo um tumor sólido, um linfoma e uma leucemia. O tipo de câncer a ser tratado é desejavelmente compatível com o tipo de célula de câncer ao qual a proteína de ligação multiespecifica se liga. Por exemplo, tratamento de um câncer que expressa molécula de adesão à célula epitelial (EpCAM), por exemplo, um câncer do cólon que expressa EpCAM, é desejavelmente tratado com o uso de uma proteína de ligação multiespecifica descrita nesse relatório descritivo que se liga a uma proteína de ligação multiespecifica. Aspectos e modalidades adicionais dos métodos terapêuticos são descritos abaixo.
[0148] Consequentemente, um aspecto da invenção fornece um método de tratamento de câncer em um paciente, em que o método compreende a administração a um paciente necessitado de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de ligação multiespecifica descrita nesse relatório descritivo (por exemplo, A40-TriNKET, A44-TriNKET, A49TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET e F63-TriNKET), que inclui um domínio de ligação para um antigeno tumor-associado (exemplos não limitantes de antígenos tumor-associados incluindo CD20, BCMA e HER2) para tratar o câncer. Cânceres exemplares para tratamento incluem
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 54/175
48/120 um tumor sólido, leucemia e linfoma.
[0149] 0 método terapêutico pode ser caracterizado de acordo com o câncer a ser tratado. Por exemplo, em certas modalidades, o câncer é um tumor sólido. Em algumas outras modalidades, o câncer é câncer cerebral, câncer da bexiga, câncer de mama, câncer cervical, câncer do cólon, câncer cólon-retal, câncer endometrial, câncer esofágico, leucemia, câncer de pulmão, câncer do fígado, melanoma, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer retal, câncer renal, câncer do estômago, câncer testicular ou câncer uterino. Ainda em outras modalidades, o câncer é um tumor vascularizado, carcinoma de célula escamosa, adenocarcinoma, carcinoma de pequena célula, melanoma, glioma, neuroblastoma, sarcoma (por exemplo, um angiossarcoma ou condrossarcoma), câncer da laringe, câncer da parótida, câncer do trato biliar, câncer da tireóide, melanoma acral lentiginoso, ceratoses actínicas, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielóide aguda, carcinoma cístico da adenóide, adenomas, adenossarcoma, carcinoma adenoescamoso, câncer do canal anal, câncer anal, câncer anorretal, tumor astrocítico, carcinoma da glândula de Bartholin, carcinoma de célula basal, câncer biliar, câncer ósseo, câncer da medula óssea, câncer bronquial, carcinoma da glândula bronquial, carcinóide, colangiocarcinoma, condrossarcoma, papiloma/carcinoma do plexo coróide, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielóide crônica, carcinoma de célula clara, câncer do tecido conjuntivo, cistadenoma, câncer do sistema digestivo, câncer do duodeno, câncer do sistema endócrino, tumor do seio endodérmico, hiperplasia endometrial, sarcoma endometrial estromal,
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 55/175
49/120 adenocarcinoma endometrióide, câncer de célula endotelial, câncer ependimal, câncer de célula epitelial, sarcoma de Ewing, câncer dos olhos e órbitas, câncer genital feminino, hiperplasia nodular focal, câncer da vesicula biliar, câncer do antro gástrico, câncer do fundo gástrico, gastrinoma, glioblastoma, glucagonoma, câncer cardíaco, hemangioblastomas, hemangioendotelioma, hemangiomas, adenoma hepático, adenomatose hepática, câncer hepatobiliar, carcinoma hepatocelular, doença de Hodgkin, câncer do íleo, insulinoma, neoplasia intraepitelial, neoplasia de célula escamosa interepitelial, câncer intra-hepático do dueto biliar, carcinoma invasivo de célula escamosa, câncer do jejuno, câncer articular, sarcoma de Kaposi, câncer pélvico, carcinoma de célula grande, câncer do intestino grosso, leiomiossarcoma, melanomas malignos de lentigo, linfoma, câncer genital masculino, melanoma maligno, tumores mesoteliais malignos, meduloblastoma, meduloepitelioma, câncer meníngeo, câncer mesotelial, carcinoma metastático, câncer da boca, carcinoma mucoepidermóide, mieloma múltiplo, câncer muscular, câncer do trato nasal, câncer do sistema nervoso, adenocarcinoma neuroepitelial, melanoma nodular, câncer de pele não epitelial, linfoma não-Hodgkin, carcinoma de células pequenas, câncer oligodendroglial, câncer da cavidade oral, osteossarcoma, adenocarcinoma papilar seroso, câncer do pênis, câncer da faringe, tumores da hipófise, plasmocitoma, pseudossarcoma, blastoma pulmonar, câncer retal, carcinoma de célula renal, câncer do sistema respiratório, retinoblastoma, rabdomiossarcoma, sarcoma, carcinoma seroso, câncer sinusal, câncer de pele, carcinoma de pequena célula, câncer do intestino delgado, câncer de
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 56/175
50/120 músculo liso, câncer de tecido mole, tumor secretor de somatostatina, câncer espinhal, carcinoma de célula escamosa, câncer de músculo estriado, câncer submesotelial, melanoma superficial disseminante, leucemia de célula T, câncer da língua, carcinoma indiferenciado, câncer do ureter, câncer da uretra, câncer da bexiga urinária, câncer do sistema urinário, câncer do cólon uterino, câncer do corpo uterino, melanoma uveal, câncer vaginal, carcinoma verrucoso, VIPoma, câncer da vulva, carcinoma bem diferenciado ou tumor de Wilms.
[0150] Em algumas outras modalidades, o câncer é linfoma não-Hodgkin, por exemplo, um linfoma de célula B ou um linfoma de célula T. Em certas modalidades, o linfoma não-Hodgkin é um linfoma de célula B, por exemplo, um linfoma de célula B grande difuso, linfoma de célula B mediastinal primário, linfoma folicular, linfoma linfocítico pequeno, linfoma de célula do manto, linfoma de célula B da zona marginal, linfoma de célula B da zona marginal extranodal, linfoma de célula B da zona marginal nodal, linfoma de célula B esplênico da zona marginal, linfoma de Burkitt, linfoma linfoplasmocítico, leucemia de célula pilosa ou linfoma primário do sistema nervoso central (SNC). Em algumas outras modalidades, o linfoma não-Hodgkin é um linfoma de célula T, por exemplo, um linfoma linfoblástico de precursor T, linfoma de célula T periférico, linfoma de célula T cutâneo, linfoma de célula T angioimunoblástico, linfoma de célula natural killer/T extranodal, linfoma de célula T do tipo enteropatia, linfoma de célula T paniculite subcutânea-lífe, linfoma de célula grande anaplásica ou linfoma de célula T periférico.
[0151] O câncer a ser tratado pode ser caracterizado
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 57/175
51/120 de acordo com a presença de um antigeno particular expresso na superficie da célula de câncer. Em certas modalidades, a célula de câncer expressa um ou mais dos seguintes: HER2, CD20, CD33, BCMA, EpCAM, CD2, CD19, CD30, CD38, CD40, CD52, CD70, EGFR/ERBB1, IGF1R, HER3/ERBB3, HER4/ERBB4, MUC1, cMET, SLAMF7, PSCA, MICA, MICB, TRAILR1, TRAILR2, MAGE-A3, B7.1, B7.2, CTLA4 e PD1.
[0152] Em certas modalidades, uma proteina da presente revelação é usada em um método de aumento da morte de células tumorais (sinônimo com lise, morte, ablação, redução da sobrevida ou da proliferação celular e semelhantes) diretamente ou indiretamente, ou na fabricação de um medicamento para uso em um método de aumento da morte de células tumorais (sinônimo com lise, morte, ablação, redução da sobrevida ou da proliferação celular e semelhantes) diretamente ou indiretamente, pela exposição de um tumor ou célula de câncer e células natural killer a uma proteina da presente revelação (por exemplo, A40-TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43TriNKET, F47-TriNKET e F63-TriNKET) , que inclui um dominio de ligação para um antigeno tumor-associado (exemplos não limitantes de antigenos tumor-associados incluindo CD20, BCMA e HER2) . A célula tumoral que é responsiva a uma proteina, como descrito acima, expressa o antigeno tumorassociado ao qual o segundo sitio de ligação ao antigeno da proteina se liga. Por exemplo, em uma modalidade exemplar o C26-TriNKET-CD20 é usado para visar uma célula tumoral ou de câncer que expressa CD20 (em repouso ou ativada); em outra modalidade exemplar, C26-TriNKET-BMCA é usado para visar uma célula tumoral ou de câncer que expressa BMCA (em repouso ou
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 58/175
52/120 ativada).
[0153] Em certas modalidades, uma proteína da presente revelação é usada em um método de tratamento de um câncer em um indivíduo necessitado, ou na fabricação de um medicamento para uso em um método de tratamento de um câncer em um indivíduo necessitado, que envolve a administração ao indivíduo de uma proteína ou uma formulação que inclui a proteína da presente revelação (por exemplo, A40-TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43TriNKET, F47-TriNKET e F63-TriNKET), que inclui um domínio de ligação para um antígeno tumor-associado (exemplos não limitantes de antígenos tumor-associados incluindo CD20, BCMA e HER2). A célula de câncer responsiva a uma proteína, como descrito acima, expressa o antígeno tumor-associado ao qual o segundo sítio de ligação ao antígeno da proteína se liga. Por exemplo, em uma modalidade exemplar o C26-TriNKETCD20 é usado para visar uma célula de câncer que expressa CD20 (em repouso ou ativada); em outra modalidade exemplar, C26-TriNKET-BMCA é usado para visar uma célula tumoral ou de câncer que expressa BMCA (em repouso ou ativada).
IV. TERAPIA COMBINADA [0154] Outro aspecto da invenção fornece terapia combinada. Proteínas de ligação multiespecíficas descritas nesse relatório descritivo podem ser usadas em combinação com agentes terapêuticos adicionais para tratar o câncer.
[0155] Agentes terapêuticos exemplares que podem ser usados como parte de uma terapia combinada no tratamento de câncer, incluem, por exemplo, radiação, mitomicina, tretinoína, Ribomustin, gencitabina, vincristina, etoposida, cladribina, mitobronitol, metotrexato, doxorrubicina,
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 59/175
53/120 carboquona, pentostatina, nitracrina, zinostatina, cetrorelix, letrozol, raltitrexed, daunorrubicina, fadrozol, fotemustina, timalfasina, sobuzoxano, nedaplatina, citarabina, bicalutamida, vinorelbina, vesnarinona, aminoglutetimida, amsacrina, proglumida, acetato de eliptinio, cetanserina, doxifluridina, etretinato, isotretinoina, estreptozocina, nimustina, vindesina, flutamida, drogenil, butocina, carmofur, razoxano, sizofilan, carboplatina, mitolactol, tegafur, ifosfamida, prednimustina, picibanil, levamisol, teniposida, improssulfan, enocitabina, lisurida, oximetolona, tamoxifeno, progesterona, mepitiostano, epitiostanol, formestano, interferon-alfa, interferon-2 alfa, interferonbeta, interferon-gama, fator estimulante de colônia-1, fator estimulante de colônia-2, denileukin diftitox, interleucina2, fator de liberação de hormônio luteinizante e variações dos agentes mencionados anteriormente que possam exibir ligação diferencial ao seu receptor cognato, e meia-vida sérica aumentada ou diminuída.
[0156] Uma classe adicional de agentes que podem ser usados como parte de uma terapia combinada no tratamento de câncer consiste nos inibidores do ponto de verificação imune. Inibidores do ponto de verificação imune exemplares incluem agentes que inibem um ou mais de (i) antígeno associado ao linfócito-T citotóxico 4 (CTLA4), (ii) proteína de morte celular programada 1 (PD1), (iii) PDL1, (iv) LAG3, (v) B7H3, (vi) B7-H4 e (vii) TIM3. O inibidor de CTLA4 ipilimumab foi aprovado pela Administração de Alimentos e Drogas dos Estados Unidos para o tratamento de melanoma.
[0157] Ainda outros agentes que podem ser usados como
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 60/175
54/120 parte de uma terapia combinada no tratamento de câncer são agentes de anticorpo monoclonal que visam alvos que não são do ponto de verificação (por exemplo, herceptina) e agentes não citotóxicos (por exemplo, inibidores de tirosinaquinase).
[0158] Ainda outras categorias de agentes anticâncer incluem, por exemplo: (i) um inibidor selecionado de um Inibidor de ALK, um Inibidor de ATR, um Antagonista de A2A, um Inibidor de Reparo de Excisão de Base, um Inibidor de Tirosina-Quinase Bcr-Abl, um Inibidor de Tirosina-Quinase de Bruton, um Inibidor de CDC7, um Inibidor de CHK1, um Inibidor de Quinase Ciclina-Dependente, um Inibidor de DNA-PK, um Inibidor tanto de DNA-PK quanto de mTOR, um Inibidor de DNMT1, um Inibidor de DNMT1 mais 2-cloro-desoxiadenosina, um Inibidor de HDAC, um Inibidor da Via de Sinalização Hedgehog, um Inibidor de IDO, um Inibidor de JAK, um Inibidor de mTOR, um Inibidor de MEK, um Inibidor de MELK, um Inibidor de MTH1, um Inibidor de PARP, um Inibidor de Fosfoinositida 3-Quinase, um Inibidor tanto de PARP1 quanto de DHODH, um Inibidor de Proteossomo, um Inibidor de Topoisomerase-II, um Inibidor de Tirosina-Quinase, um Inibidor de VEGFR e um Inibidor de WEE1; (ii) um agonista de 0X40, CD137, CD40, GITR, CD27, HVEM, TNFRSF25 ou ICOS; e (iii) uma citocina selecionada de IL-12, IL-15, GM-CSF e G-CSF.
[0159] As proteinas da invenção também podem ser usadas como um auxiliar à remoção cirúrgica da lesão primária.
[0160] A quantidade de proteina de ligação multiespecifica e de agente terapêutico adicional e o momento relativo de administração podem ser selecionados a fim de
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 61/175
55/120 obter um efeito terapêutico combinado desejado. Por exemplo, quando se administra uma terapia combinada a um paciente que necessita dessa administração, os agentes terapêuticos na combinação, ou uma composição ou composições farmacêuticas que compreendem os agentes terapêuticos, podem ser administrados em qualquer ordem como, por exemplo, seqüencialmente, concomitantemente, juntos, simultaneamente e semelhantes. Além disso, por exemplo, uma proteína de ligação multiespecífica pode ser administrada durante um tempo quando o agente terapêutico (ou agentes terapêuticos) adicional exerce seu efeito profilático ou terapêutico, ou vice-versa.
V. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS [0161] A presente revelação também apresenta composições farmacêuticas que contêm uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína descrita nesse relatório descritivo (por exemplo, A40-TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47TriNKET e F63-TriNKET) , que inclui um domínio de ligação para um antígeno tumor-associado (exemplos não limitantes de antígenos tumor-associados incluindo CD20, BCMA e HER2). A composição pode ser formulada para uso em diversos sistemas de liberação de fármacos. Um ou mais excipientes ou carreadores fisiologicamente aceitáveis também podem ser incluídos na composição para formulação adequada. Formulações adequadas para uso na presente revelação são encontradas em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17a Edição., 1985. Para uma breve revisão de métodos para liberação de fármacos, veja, por exemplo, Langer (Science 249: 1.527-1.533, 1990) .
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 62/175
56/120 [0162] A formulação de liberação farmacológica intravenosa da presente revelação pode estar contida em uma bolsa, uma caneta ou uma seringa. Em certas modalidades, a bolsa pode estar conectada a um canal que compreende um tubo e/ou uma agulha. Em certas modalidades, a formulação pode ser uma formulação liofilizada ou uma formulação liquida. Em certas modalidades, a formulação pode ser seca por congelamento (liofilizada) e contida em cerca de 12-60 frascos. Em certas modalidades, a formulação pode ser seca por congelamento e 45 mg da formulação liofilizada podem estar contidos em um frasco. Em certas modalidades, os cerca de 40 mg - cerca de 100 mg de formulação liofilizada podem estar contidos em um frasco. Em certas modalidades, formulações liofilizadas de 12, 27, ou 45 frascos são combinadas para obter uma dose terapêutica da proteína na formulação farmacológica intravenosa. Em certas modalidades, a formulação pode ser uma formulação líquida e armazenada como cerca de 250 mg/frasco até cerca de 1.000 mg/frasco. Em certas modalidades, a formulação pode ser uma formulação líquida e armazenada como cerca de 600 mg/frasco. Em certas modalidades, a formulação pode ser uma formulação líquida e armazenada como cerca de 25C [0163] Essa presente uma formulação farmacêutica quantidade terapeuticamente solução tamponada que forma [0164] Essas composi técnicas de esterilização filtradas de forma estéril, podem ser embaladas para us ) mg/frasco.
revelação podería existir em aquosa líquida que inclui uma ; eficaz da proteína em uma uma formulação.
ções podem ser esterilizadas por convencionais, ou podem ser As soluções aquosas resultantes o dessa forma, ou liofilizadas,
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 63/175
57/120 a preparação liofilizada sendo combinada com um carreador aquoso estéril antes da administração. O pH das preparações tipicamente estará entre 3 e 11, mais preferivelmente entre 5 e 9 ou entre 6 e 8 e, principalmente, entre 7 e 8, por exemplo, 7 a 7,5. As composições em forma sólida resultantes podem ser embaladas em múltiplas unidades de dose única, cada uma contendo uma quantidade fixa do agente ou agentes mencionados acima. A composição em forma sólida também pode ser embalada em um recipiente para uma quantidade flexível.
[0165] Em certas modalidades, a presente revelação fornece uma formulação com um prazo de validade estendido, incluindo a proteína da presente revelação, em combinação com manitol, monoidrato de ácido cítrico, citrato de sódio, diidrato de fosfato dissódico, diidrato de diidrogenofosfato de sódio, cloreto de sódio, polissorbato 80, água e hidróxido de sódio.
[0166] Em certas modalidades, é preparada uma formulação aquosa que inclui a proteína da presente revelação em uma solução com pH tamponado. O tampão dessa invenção pode ter um pH que varia de cerca de 4 até cerca de 8, por exemplo, de cerca de 4,5 até cerca de 6,0, ou de cerca de 4,8 até cerca de 5,5, ou pode ter um pH de cerca de 5,0 até cerca de 5,2. Faixas intermediárias até acima dos pHs citados também visam ser parte dessa revelação. Por exemplo, faixas de valores que usam uma combinação de qualquer um dos valores citados acima como limites superiores e/ou inferiores visam ser incluídas. Exemplos de tampões que controlarão o pH dentro dessa faixa incluem acetato (por exemplo, acetato de sódio), succinato (por exemplo, succinato de sódio), gluconato, histidina, citrato e outros tampões de ácido
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 64/175
58/120 orgânico .
[0167] Em certas modalidades, a formulação inclui um sistema-tampão que contém citrato e fosfato para manter o pH em uma faixa de cerca de 4 até cerca de 8. Em certas modalidades a faixa de pH pode ser de cerca de 4,5 até cerca de 6,0, ou de cerca de pH 4,8 até cerca de 5,5, ou em uma faixa de pH de cerca de 5,0 até cerca de 5,2. Em certas modalidades, o sistema-tampão inclui monoidrato de ácido citrico, citrato de sódio, diidrato de fosfato dissódico e/ou diidrato de diidrogenofosfato de sódio. Em certas modalidades, o sistema-tampão inclui cerca de 1,3 mg/mL de ácido citrico (por exemplo, 1,305 mg/mL), cerca de 0,3 mg/mL de citrato de sódio (por exemplo, 0,305 mg/mL), cerca de 1,5 mg/mL de diidrato de fosfato dissódico (por exemplo, 1,53 mg/mL), cerca de 0,9 mg/mL de diidrato de diidrogenofosfato de sódio (por exemplo, 0,86) e cerca de 6,2 mg/mL de cloreto de sódio (por exemplo, 6,165 mg/mL). Em certas modalidades, o sistema-tampão inclui 1-1,5 mg/mL de ácido cítrico, 0,25 a 0,5 mg/mL de citrato de sódio, 1,25 até 1,75 mg/mL de diidrato de fosfato dissódico, 0,7 até 1,1 mg/mL de diidrato de diidrogenofosfato de sódio, e 6, 0 até 6,4 mg/mL de cloreto de sódio. Em certas modalidades, o pH da formulação é ajustado com hidróxido de sódio.
[0168] Um poliol, que atua como um tonificante e pode estabilizar o anticorpo, também pode ser incluído na formulação. O poliol é adicionado à formulação em uma quantidade que pode variar com relação à isotonicidade desejada da formulação. Em certas modalidades, a formulação aquosa pode ser isotônica. A quantidade de poliol adicionada também pode ser alterada com relação ao peso molecular do
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 65/175
59/120 poliol. Por exemplo, uma quantidade menor de um monossacarídeo (por exemplo, manitol) pode ser adicionada, comparada com a de um dissacarideo (por exemplo, trehalose). Em certas modalidades, o poliol que pode ser usado na formulação como um agente de tonicidade é manitol. Em certas modalidades, a concentração de manitol pode ser cerca de 5 até cerca de 20 mg/mL. Em certas modalidades, a concentração de manitol pode ser cerca de 7,5 até 15 mg/mL. Em certas modalidades, a concentração de manitol pode ser cerca de ΙΟΙ 4 mg/mL. Em certas modalidades, a concentração de manitol pode ser cerca de 12 mg/mL. Em certas modalidades, o sorbitol de poliol pode ser incluído na formulação.
[0169] Um detergente ou tensoativo também pode ser adicionado à formulação. Detergentes exemplares incluem detergentes não iônicos como, por exemplo, polissorbatos (por exemplo, polissorbatos 20, 80 etc.) ou poloxâmeros (por exemplo, poloxâmero 188) . A quantidade de detergente adicionada é tal que reduz a agregação do anticorpo formulado e/ou minimiza a formação de particulados na formulação e/ou reduz a adsorção. Em certas modalidades, a formulação pode incluir um tensoativo que é um polissorbato. Em certas modalidades, a formulação pode conter o detergente polissorbato 80 ou Tween 80. Tween 80 é um termo usado para descrever polioxietileno (20) sorbitano-monooleato (veja Fiedler, Lexikon der Hifsstoffe, Editio Cantor Verlag Aulendorf, 4a Edição., 1996). Em certas modalidades, a formulação pode conter entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 10 mg/mL de polissorbato 80, ou entre cerca de 0,5 mg/mL e cerca de 5 mg/mL. Em certas modalidades, cerca de 0,1% polissorbato 80 pode ser adicionado na formulação.
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 66/175
60/120 [0170] Em modalidades, o produto de proteína da presente revelação é formulado como uma formulação líquida. A formulação líquida pode ser apresentada em uma concentração de 10 mg/mL em um frasco USP/Ph Eur tipo I 50R fechado com uma tampa de borracha e lacrado com um fechamento de lacre de crimpagem de alumínio. A tampa pode ser feita de elastômero compatível com USP e Ph Eur. Em certas modalidades os frascos podem ser preenchidos com 61,2 mL do produto de proteína solução a fim de permitir um volume extraível de 60 mL. Em certas modalidades, a formulação líquida pode ser diluída com solução salina 0,9%.
[0171] Em certas modalidades, a formulação líquida da revelação pode ser preparada como uma solução na concentração de 10 mg/mL em combinação com um açúcar em níveis estabilizantes. Em certas modalidades, a formulação líquida pode ser preparada em um carreador aquoso. Em certas modalidades, um estabilizante pode ser adicionado em uma quantidade de, no máximo, aquela que pode resultar em uma viscosidade indesejável ou inadequada para administração intravenosa. Em certas modalidades, o açúcar pode ser dissacarídeos, por exemplo, sacarose. Em certas modalidades, a formulação líquida também pode incluir um ou mais de um agente de tamponamento, um tensoativo e um conservante.
[0172] Em certas modalidades, o pH da formulação líquida pode ser ajustado por adição de um ácido e/ou uma base farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades, o ácido farmaceuticamente aceitável pode ser ácido clorídrico. Em certas modalidades, a base pode ser hidróxido de sódio.
[0173] Além da agregação, a desamidação é uma variante de produto comum de peptídeos e proteínas que pode
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 67/175
61/120 ocorrer durante a fermentação, coleta/clarificação de células, purificação, armazenamento da substância farmacológica/produto farmacológico e durante análise de amostra. A desamidação é a perda de NH3 de uma proteina formando um intermediário succinimida que pode passar por hidrólise. O intermediário succinimida resulta em uma diminuição de massa de 17 dáltons (2,822901e 26 kg) do peptídeo parental. A hidrólise subsequente resulta em um aumento de massa de 18 dáltons (2.988954e 26) . O isolamento do intermediário succinimida é difícil em consequência da instabilidade sob condições aquosas. Dessa forma, a desamidação é tipicamente detectável como um aumento de massa de 1 dálton (1.66053 x 10 22) . A desamidação de uma asparagina resulta em ácido aspártico ou isoaspártico. Os parâmetros que afetam a taxa de desamidação incluem pH, temperatura, constante dielétrica do solvente, força iônica, sequência primária, conformação local e estrutura terciária do polipeptideo. Os resíduos de aminoácidos adjacentes a Asn na cadeia peptídica afetam as taxas de desamidação. Gly e Ser após um Asn em sequências de proteína resultam em uma suscetibilidade maior à desamidação.
[0174] Em certas modalidades, a formulação líquida da presente revelação pode ser conservada sob condições de pH e umidade para evitar a desaminação do produto de proteína.
[0175] O carreador aquoso de interesse nesse relatório descritivo é um que seja farmaceuticamente aceitável (seguro e atóxico para administração a um humano) e seja útil para a preparação de uma formulação líquida. Carreadores ilustrativos incluem água para injeção estéril
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 68/175
62/120 (SWFI), água para injeção bacteriostática (BWFI), uma solução com pH tamponado (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de dextrose.
[0176] Um conservante pode ser opcionalmente adicionado às formulações nesse relatório descritivo para reduzir a ação bacteriana. A adição de um conservante pode, por exemplo, facilitar a produção de uma formulação multiuso (doses múltiplas).
[0177] Formulações intravenosas (IV) podem ser a via de administração preferida em casos particulares, por exemplo, quando um paciente está no hospital após transplante recebendo todos os fármacos por meio da via IV. Em certas modalidades, a formulação liquida é diluída com solução de cloreto de sódio 0,9% antes da administração. Em certas modalidades, o produto farmacológico diluído para injeção é isotônico e adequado para administração por infusão intravenosa.
[0178] Em certas modalidades, um sal ou componentes de tamponamento podem ser adicionados em uma quantidade de 10 mM - 200 mM. Os sais e/ou tampões são farmaceuticamente aceitáveis e são derivados de vários ácidos conhecidos (inorgânicos e orgânicos) com metais formadores de base ou aminas. Em certas modalidades, o tampão pode ser tampão fosfato. Em certas modalidades, o tampão pode ser tampões glicinato, carbonato, citrato, quando então, ions sódio, potássio ou amônio podem servir como contra-íon.
[0179] Um conservante pode ser opcionalmente adicionado às formulações nesse relatório descritivo para reduzir a ação bacteriana. A adição de um conservante pode,
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 69/175
63/120 por exemplo, facilitar a produção de uma formulação multiuso (doses múltiplas).
[0180] O carreador aquoso de interesse nesse relatório descritivo é um que seja farmaceuticamente aceitável (seguro e atóxico para administração a um humano) e seja útil para a preparação de uma formulação liquida. Carreadores ilustrativos incluem água para injeção estéril (SWFI), água para injeção bacteriostática (BWFI), uma solução com pH tamponado (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de dextrose.
[0181] Essa presente revelação poderia existir em uma formulação liofilizada que inclui as proteinas e um lioprotetor. O lioprotetor pode ser açúcar, por exemplo, dissacarideos. Em certas modalidades, o lioprotetor pode ser sacarose ou maltose. A formulação liofilizada também pode incluir um ou mais de um agente de tamponamento, um tensoativo, um agente de volume e/ou um conservante.
[0182] A quantidade de sacarose ou maltose útil para estabilização do produto farmacológico liofilizado pode estar em uma proporção de peso de pelo menos 1:2 de proteina para sacarose ou maltose. Em certas modalidades, a proporção de peso de proteina para sacarose ou maltose pode ser de 1:2 até 1:5.
[0183] Em certas modalidades, o pH da formulação, antes da liofilização, pode ser ajustado por adição de um ácido e/ou uma base farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades, o ácido farmaceuticamente aceitável pode ser ácido cloridrico. Em certas modalidades, a base farmaceuticamente aceitável pode ser hidróxido de sódio.
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 70/175
64/120 [0184] Antes da liofilização, o pH da solução que contém a proteína da presente revelação pode ser ajustado entre 6 a 8. Em certas modalidades, a faixa de pH para o produto farmacológico liofilizado pode ser de 7 a 8.
[0185] Em certas modalidades, um sal ou componentes de tamponamento podem ser adicionados em uma quantidade de 10 mM - 200 mM. Os sais e/ou tampões são farmaceuticamente aceitáveis e são derivados de vários ácidos conhecidos (inorgânicos e orgânicos) com metais formadores de base ou aminas. Em certas modalidades, o tampão pode ser tampão fosfato. Em certas modalidades, o tampão pode ser tampões glicinato, carbonato, citrato, quando então, íons sódio, potássio ou amônio podem servir como contra-íon.
[0186] Em certas modalidades, pode ser adicionado um agente de volume. Um agente de volume é um composto que acrescenta massa a uma mistura liofilizada e contribui para a estrutura física da torta liofilizada (por exemplo, facilita a produção de uma torta liofilizada basicamente uniforme que mantém uma estrutura de poros aberta). Agentes de volume ilustrativos incluem manitol, glicina, polietileno glicol e sorbitol. As formulações liofilizadas da presente invenção podem conter esses agentes de volume.
[0187] Um conservante pode ser opcionalmente adicionado às formulações nesse relatório descritivo para reduzir a ação bacteriana. A adição de um conservante pode, por exemplo, facilitar a produção de uma formulação multiuso (doses múltiplas).
[0188] Em certas modalidades, o produto farmacológico liofilizado pode ser reconstituído com um carreador aquoso. O carreador aquoso de interesse nesse
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 71/175
65/120 relatório descritivo é um que seja farmaceuticamente aceitável (por exemplo, seguro e atóxico para administração a um humano) e seja útil para a preparação de uma formulação liquida, após liofilização. Diluentes ilustrativos incluem água para injeção estéril (SWFI), água para injeção bacteriostática (BWFI), uma solução com pH tamponado (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de dextrose.
[0189] Em certas modalidades, o produto farmacológico liofilizado da presente revelação é reconstituído com Água para Injeção Estéril, USP (SWFI) ou Injeção de Cloreto de Sódio 0,9%, USP. Durante a reconstituição, o pó liofilizado se dissolve em uma solução.
[0190] Em certas modalidades, o produto de proteina liofilizado da presente revelação é constituído até cerca de 4,5 mL de água para injeção e diluido com solução salina 0,9% (solução de cloreto de sódio).
[0191] Os niveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas dessa invenção podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz para obter a resposta terapêutica desejada para um paciente, composição e modo de administração particulares, sem serem tóxicas para o paciente.
[0192] A dose especifica pode ser uma dose uniforme para cada paciente, por exemplo, 50-5000 mg de proteina. Alternativamente, a dose de um paciente pode ser adaptada ao peso ou área de superfície corporal aproximada do paciente. Outros fatores na determinação da dosagem apropriada podem incluir a doença ou condição a ser tratada ou evitada, a gravidade da doença, a via de administração, e a idade, sexo
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 72/175
66/120 e condição médica do paciente. Um refinamento adicional dos cálculos necessários para determinar a dosagem apropriada para o tratamento é rotineiramente feito por aqueles habilitados na técnica, especialmente à luz da informação de dosagem e ensaios revelados nesse relatório descritivo. A dosagem também pode ser determinada por meio do uso de ensaios conhecidos para determinação de dosagens usadas em conjunto com dados de dose-resposta apropriados. A dosagem de um paciente individual pode ser ajustada à medida que o progresso da doença é monitorado. Os níveis sanguíneos da construção ou complexo direcionável em um paciente podem ser medidos para ver se a dosagem precisa ser ajustada para alcançar ou manter uma concentração eficaz. Farmacogenômica pode ser usada para determinar quais construções e/ou complexos direcionáveis, e suas dosagens, têm a maior probabilidade de serem eficazes para certo indivíduo (Schmitz e outros, Clinica Chimica Acta 308: 43-53, 2001; Steimer e outros, Clinica Chimica Acta 308: 33-41, 2001) .
[0193] Em geral, dosagens com base no peso corporal são de cerca de 0,01 pg até cerca de 100 mg por kg de peso
corporal, por exemplo, cerca de 0,01 pg até cerca de 100
mg/kg de peso corporal, cerca de 0,01 pg até cerca de 50
mg/kg de peso corporal, cerca de 0,01 pg até cerca de 10
mg/kg de peso corporal, cerca de 0, 01 pg até cerca de 1 mg/kg
de peso corporal, cerca de 0,01 pg até cerca de 100 pg/kg de peso corporal, cerca de 0,01 pg até cerca de 50 pg/kg de peso corporal, cerca de 0,01 pg até cerca de 10 pg/kg de peso corporal, cerca de 0,01 pg até cerca de 1 pg/kg de peso corporal, cerca de 0,01 pg até cerca de 0,1 pg/kg de peso corporal, cerca de 0,1 pg até cerca de 100 mg/kg de peso
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 73/175
67/120
corporal, cerca de 0, 1 pg até cerca de 50 mg/kg de peso
corporal, cerca de 0, 1 pg até cerca de 10 mg/kg de peso
corporal, cerca de o, 1 pg até cerca de 1 mg/kg de peso
corporal, cerca de o, 1 pg até cerca de 100 pg/kg de peso
corporal, cerca de o, 1 pg até cerca de 10 pg/kg de peso
corporal, cerca de o, 1 pg até cerca de 1 pg/kg de peso
corporal, cerca de 1 pg até cerca de 100 mg/kg de peso
corporal, cerca de 1 pg até cerca de 50 mg/kg de peso
corporal, cerca de 1 pg até cerca de 10 mg/kg de peso
corporal, cerca < de 1 pg até i cerca de 1 mg/kg de peso corporal,
cerca de 1 pg até cerca de 100 pg/kg de peso corporal, cerca de 1 pg até cerca de 50 pg/kg de peso corporal, cerca de 1 pg até cerca de 10 pg/kg de peso corporal, cerca de 10 pg até cerca de 100 mg/kg de peso corporal, cerca de 10 pg até cerca de 50 mg/kg de peso corporal, cerca de 10 pg até cerca de 10 mg/kg de peso corporal, cerca de 10 pg até cerca de 1 mg/kg de peso corporal, cerca de 10 pg até cerca de 100 pg/kg de peso corporal, cerca de 10 pg até cerca de 50 pg/kg de peso corporal, cerca de 50 pg até cerca de 100 mg/kg de peso
corporal, cerca de 50 pg até cerca de 50 mg/kg de peso
corporal, cerca de 50 pg até cerca de 10 mg/kg de peso
corporal, cerca de 50 pg até cerca de 1 mg/kg de peso
corporal, cerca de 50 pg até cerca de 100 pg/kg de peso
corporal, cerca de 100 pg até cerca de 100 mg/kg de peso
corporal, cerca de 100 pg até cerca de 50 mg/kg de peso
corporal, cerca de 100 pg até cerca de 10 mg/kg de peso
corporal, cerca de 10C i pg até cerca de 1 mg/kg de peso
corporal, cerca de 1 ] ng até cerca de 100 mg/kg de peso
corporal, cerca de 1 mg até cerca de 50 mg/kg de peso
corporal, cerca de 1 mg até cerca de 10 mg/kg de peso
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 74/175
68/120
corporal, cerca de 10 mg até cerca de 100 mg/kg de peso
corporal, cerca de 10 mg até cerca de 50 mg/kg de peso
corporal, cerca de 50 mg até cerca de 100 mg/kg de peso
corporal.
[0194] As doses podem ser dadas uma ou mais vezes diariamente, semanalmente, mensalmente ou anualmente, ou até mesmo uma vez a cada 2 a 20 anos. Aqueles habilitados na técnica podem facilmente estimar taxas de repetição para dosagem com base nos tempos de residência e concentrações medidos da construção ou complexo direcionável em líquidos ou tecidos corpóreos. A administração da presente invenção poderia ser intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, intrapleural, intratecal, intracavitária, por perfusão através de um cateter ou por injeção intralesional direta. Essa pode ser administrada uma ou mais vezes ao dia, uma ou mais vezes semanalmente, uma ou mais vezes mensalmente e uma ou mais vezes anualmente.
[0195] A descrição acima descreve vários aspectos e modalidades da invenção. O pedido de patente especificamente contempla todas as combinações e permutações dos aspectos e modalidades.
EXEMPLOS [0196] A invenção que está sendo geralmente descrita, será mais facilmente compreendida por referência aos exemplos seguintes, que são incluídos meramente para fins de ilustração de certos aspectos e modalidades da presente invenção, e não visam limitar a invenção.
Exemplo 1 - Domínios de ligação ao NKG2D se ligam ao NKG2D
Domínios de ligação ao NKG2D se ligam ao NKG2D
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 75/175
69/120 recombinante purificado [0197] As sequências de ácidos nucleicos de ectodomínios de NKG2D humanos, de camundongo ou de Cynomolgus foram fundidas com sequências de ácidos nucleicos que codificam domínios Fc de IgGl humana e introduzidas em células de mamíferos para serem expressas. Após purificação, proteínas de fusão NKG2D-Fc foram adsorvidas aos poços de microplacas. Após bloqueio dos poços com albumina sérica bovina para evitar ligação não específica, domínios de ligação ao NKG2D foram titulados e adicionados aos poços pré-adsorvidos com proteínas de fusão NKG2D-Fc. A ligação ao anticorpo primário foi detectada usando um anticorpo secundário que foi conjugado à peroxidase de raiz-forte e reconhece especificamente uma cadeia leve kappa humana para evitar reatividade cruzada de Fc. 3,3',5,5'Tetrametilbenzidina (TMB), um substrato para peroxidase de raiz-forte, foi adicionada aos poços para visualizar o sinal de ligação, cuja absorbância foi medida a 450 nM e corrigida a 540 nM. Um clone do domínio de ligação ao NKG2D, um controle de isótipo ou um controle positivo (selecionado do ID. DE SEQ. N° : 45-48, ou clones anti-NKG2D de camundongo MI-6 e CX-5 disponíveis em eBioscience) foi adicionado a cada poço.
[0198] O controle de isótipo mostrou ligação mínima às proteínas NKG2D-Fc recombinantes, enquanto o controle positivo foi o que se ligou mais forte aos antígenos recombinantes. Domínios de ligação ao NKG2D produzidos por todos os clones demonstraram ligação através de proteínas NKG2D-Fc recombinantes humanas (FIG. 14), de camundongo (FIG. 16) e de Cynomolgus (FIG. 15), embora com afinidades variáveis de clone para clone. Geralmente, cada clone anti
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 76/175
70/120
NKG2D se ligou ao NKG2D recombinante-Fc humano (FIG. 14) e de Cynomolgus (FIG. 15) com afinidade similar, mas com afinidade menor para NKG2D-Fc recombinante de camundongo (FIG. 16) .
Domínios de ligação ao NKG2D se ligam às células que expressam NKG2D [0199] Linhagens de células de linfoma de camundongo EL4 foram modificadas geneticamente para expressar receptores de antígenos quiméricos de domínio de sinalização de NKG2D - CD3 zeta humanos ou de camundongo. Um clone de ligação ao NKG2D, um controle de isótipo ou um controle positivo foi usado em uma concentração de 100 nM para corar NKG2D extracelular expresso nas células EL4. A ligação ao anticorpo foi detectada usando anticorpos secundários antiIgG humana conjugados a fluoróforo. As células foram analisadas por citometria de fluxo, e a razão de aumento em relação ao nível de base (FOB) foi calculada usando a intensidade de fluorescência média (MFI) de células que expressam NKG2D, comparadas com células EL4 parentais.
[0200] Os domínios de ligação ao NKG2D produzidos por todos os clones se ligaram às células EL4 que expressam NKG2D humano e de camundongo. Anticorpos de controle positivo (selecionados do ID. DE SEQ. N°: 45-48, ou clones anti-NKG2D de camundongo MI-6 e CX-5 disponíveis em eBioscience) geraram o melhor sinal de ligação FOB. A afinidade de ligação ao NKG2D para cada clone foi similar entre células que expressam NKG2Ds humanos (FIG. 17) e de camundongo (FIG. 18) (FIGs. 17-18, respectivamente).
Exemplo 2 - Domínios de ligação ao NKG2D bloqueiam a ligação do ligante natural ao NKG2D
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 77/175
71/120
Competição com ULBP-6 [0201] Proteínas NKG2D-Fc humano recombinantes foram adsorvidas aos poços de uma microplaca, e os poços foram bloqueados com albumina sérica bovina para reduzir a ligação não específica. Uma concentração saturante de ULBP-6-Hisbiotina foi adicionada aos poços, seguida por adição dos clones do domínio de ligação ao NKG2D. Após uma incubação de 2 horas, os poços foram lavados e ULBP-6-His-biotina que permanecia ligada aos poços revestidos com NKG2D-Fc foi detectada por estreptavidina conjugada à peroxidase de raizforte e substrato TMB. A absorbância foi medida a 450 nM e corrigida a 540 nM. Após subtração do nível de base, a ligação específica de domínios de ligação ao NKG2D às proteínas NKG2D-Fc foi calculada a partir da percentagem de ULBP-6-His-biotina que foi bloqueada da ligação às proteínas NKG2D-Fc nos poços. O anticorpo de controle positivo (selecionado do ID. DE SEQ. N°: 45-48) e vários domínios de ligação ao NKG2D bloquearam a ligação de ULBP-6 ao NKG2D, enquanto o controle de isótipo mostrou pouca competição com ULBP-6 (FIG. 19).
Competição com MICA [0202] Proteínas MICA-Fc humanas recombinantes foram adsorvidas aos poços de uma microplaca, e os poços foram bloqueados com albumina sérica bovina para reduzir a ligação não específica. NKG2D-Fc-biotina foi adicionada aos poços, seguida por domínios de ligação ao NKG2D. Após incubação e lavagem, NKG2D-Fc-biotina que permanecia ligada aos poços revestidos com MICA-Fc foi detectada usando estreptavidinaHRP e substrato TMB. A absorbância foi medida a 450 nM e corrigida a 540 nM. Após subtração do nível de base, a
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 78/175
72/120 ligação especifica de domínios de ligação ao NKG2D às proteínas NKG2D-Fc foi calculada a partir da percentagem de NKG2D-Fc-biotina que foi bloqueada da ligação aos poços revestidos com MICA-Fc. O anticorpo de controle positivo (selecionado do ID. DE SEQ. N°: 45-48) e vários domínios de ligação ao NKG2D bloquearam a ligação de MICA ao NKG2D, enquanto o controle de isótipo mostrou pouca competição com MICA (FIG. 20).
Competição com Rae-1 delta [0203] Rae-1 delta-Fc recombinante de camundongo (adquirido de R&D Systems) foi adsorvido aos poços de uma microplaca, e os poços foram bloqueados com albumina sérica bovina para reduzir a ligação não específica. NKG2D-Fcbiotina de camundongo foi adicionada aos poços, seguida por domínios de ligação ao NKG2D. Após incubação e lavagem, NKG2D-Fc-biotina que permanecia ligada aos poços revestidos com Rae-1 delta-Fc foi detectada usando estreptavidina-HRP e substrato TMB. A absorbância foi medida a 450 nM e corrigida a 540 nM. Após subtração do nível de base, a ligação específica de domínios de ligação ao NKG2D às proteínas NKG2D-Fc foi calculada a partir da percentagem de NKG2D-Fc-biotina que foi bloqueada da ligação aos poços revestidos com Rae-1 delta-Fc. O controle positivo (selecionado do ID. DE SEQ. N°: 45-48, ou clones anti-NKG2D de camundongo MI-6 e CX-5 disponíveis em eBioscience) e vários clones do domínio de ligação ao NKG2D bloquearam a ligação de Rae-1 delta ao NKG2D de camundongo, enquanto o controle de isótipo anticorpo mostrou pouca competição com Rae-1 delta (FIG. 21).
Exemplo 3 - Clones do domínio de ligação ao NKG2D ativam
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 79/175
73/120
NKG2D [0204] Sequências de ácidos nucleicos de NKG2D humano e de camundongo foram fundidas às sequências de ácidos nucleicos que codificam um domínio de sinalização de CD3 zeta para obter construções de receptor de antígeno quimérico (CAR). As construções NKG2D-CAR foram então clonadas em um vetor de retrovirus usando montagem de Gibson e transfectadas em células expi293 para produção de retrovirus. Células EL4 foram infectadas com vírus que contêm NKG2D-CAR junto com 8 pg/mL de polibreno. Vinte e quatro horas após infecção, os níveis de expressão de NKG2D-CAR nas células EL4 foram analisados por citometria de fluxo, e clones que expressam níveis elevados da NKG2D-CAR na superfície da célula foram selecionados.
[0205] Para determinar se domínios de ligação ao NKG2D ativam NKG2D, eles foram adsorvidos aos poços de uma microplaca, e células EL4 NKG2D-CAR foram cultivadas nos poços revestidos com fragmento de anticorpo por 4 horas na presença de brefeldina-A e monensina. A produção de TNF-alfa intracelular, um indicador para ativação de NKG2D, foi testada por citometria de fluxo. A percentagem de células TNF-alfa-positivas foi normalizada para as células tratadas com o controle positivo. Todos os domínios de ligação ao NKG2D ativaram NKG2Ds tanto humanos (FIG. 22) quanto de camundongo (FIG. 23).
Exemplo 4 - Domínios de ligação ao NKG2D ativam células NK
Células NK humanas primárias [0206] Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas de camadas leucoplaquetárias do
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 80/175
74/120 sangue periférico humano usando centrifugação por gradiente de densidade. Células NK (CD3 CD56+) foram isoladas de PBMCs usando seleção negativa com glóbulos magnéticos, e a pureza das células NK isoladas foi tipicamente >95%. As células NK isoladas foram então cultivadas em meio contendo 100 ng/mL de IL-2 por 24-48 horas antes de serem transferidas para os poços de uma microplaca à qual os domínios de ligação ao NKG2D foram adsorvidos, e cultivadas nos meios contendo anticorpo anti-CD107a conjugado a fluoróforo, brefeldina-A e monensina. Após cultura, as células NK foram testadas por citometria de fluxo usando anticorpos conjugados a fluoróforo contra CD3, CD56 e IFN-gama. A coloração para CD107a e IFN-gama foi analisada em células CD3 CD56+ para avaliar a ativação de célula NK. O aumento em células duplaspositivas para CD107a/IFN-gama é indicativo de melhor ativação de célula NK por meio do engajamento de dois receptores de ativação, ao invés de um receptor. Domínios de ligação ao NKG2D e o controle positivo (selecionado do ID. DE SEQ. N° : 45-48) mostraram uma percentagem maior de células NK que se tornam CD107a+ e IFN-gama+ do que o controle de isótipo (FIG. 24 e FIG. 25 representam dois experimentos independentes, cada um usando PBMCs de um doador diferente para preparação de células NK).
Células NK primárias de camundongo [0207] Baços foram obtidos de camundongos C57B1/6 e esmagados por meio de uma peneira de células de 70 pm para obter suspensão de célula única. As células foram peletizadas e ressuspensas em tampão de lise ACK (adquirido de Thermo Fisher Scientific #A1049201; 155 mM de cloreto de amônio, 10 mM de bicarbonate de potássio, 0,01 mM de EDTA) para remover
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 81/175
75/120 células sanguíneas vermelhas. As células restantes foram cultivadas com 100 ng/mL de hIL-2 por 72 horas antes de serem coletadas e preparadas para isolamento de células NK. Células NK (CD3 NK1.11) foram então isoladas de células esplênicas usando uma técnica de depleção negativa com glóbulos magnéticos com tipicamente >90% de pureza. Células NK purificadas foram cultivadas em meio contendo 100 ng/mL de mIL-15 por 48 horas antes de serem transferidas para os poços de uma microplaca à qual os domínios de ligação ao NKG2D foram adsorvidos, e cultivadas nos meios contendo anticorpo anti-CD107a conjugado a fluoróforo, brefeldina-A e monensina. Após cultura em poços revestidos com domínio de ligação ao NKG2D, células NK foram testadas por citometria de fluxo usando anticorpos conjugados a fluoróforo contra CD3, NK1.1 e IFN-gama. A coloração para CD107a e IFN-gama foi analisada em células CD3 NK1.1+ para avaliar a ativação de célula NK. O aumento em células duplas-positivas para CD107a/IFN-gama é indicativo de melhor ativação de célula NK por meio do engajamento de dois receptores de ativação, ao invés de um receptor. Domínios de ligação ao NKG2D e o controle positivo (selecionado de clones anti-NKG2D de camundongo MI-6 e CX-5 disponíveis em eBioscience) mostraram uma percentagem maior de células NK que se tornam CD107a+ e IFN-gama+ do que o controle de isótipo (FIG. 2 6 e FIG. 27 representam dois experimentos independentes, cada um usando um camundongo diferente para preparação de células NK).
Exemplo 5 - Domínios de ligação ao NKG2D habilitam a citotoxicidade de células tumorais-alvo [0208] Ensaios de ativação de célula NK primária humana e de camundongo demonstram marcadores de
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 82/175
76/120 citotoxicidade aumentados em células NK após incubação com domínios de ligação ao NKG2D. Para verificar se isso se traduz em lise aumentada de células tumorais, foi usado um ensaio à base de células no qual cada domínio de ligação ao NKG2D foi desenvolvido em um anticorpo monoespecífico. A região Fc foi usada como um braço de direcionamento, enquanto a região Fab (domínio de ligação ao NKG2D) atuou como outro braço de direcionamento para ativar células NK. Células ΊΉΡ1, que são de origem humana e expressam níveis elevados de receptores Fc, foram usadas como um alvo de tumor e foi usado um Kit de Citotoxicidade Perkin Elmer DELFIA. Células THP-1 foram marcadas com reagente BATDA, e ressuspensas a 105/mL em meio de cultura. Células THP-1 marcadas foram então combinadas com anticorpos para NKG2D e células NK isoladas de camundongo em poços de uma placa de microtitulação a 37°C por 3 horas. Após incubação, 20 μΐ do sobrenadante da cultura foram removidos, misturados com 200 μΐ de solução de Európio e incubados com agitação por 15 minutos no escuro. A fluorescência foi medida ao longo do tempo por uma leitora de placas PheraStar equipada com um módulo de fluorescência tempo-resolvida (Excitação 337 nm, Emissão 620 nm) e a lise específica foi calculada de acordo com as instruções do kit.
[0209] O controle positivo, ULBP-6 - um ligante natural para NKG2D, mostrou lise específica aumentada de células alvo THP-1 por células NK de camundongo. Anticorpos para NKG2D também aumentaram a lise específica de células alvo THP-1, enquanto controle de isótipo anticorpo mostrou lise específica reduzida. A linha pontilhada indica lise específica de células THP-1 por células NK de camundongo sem anticorpo adicionado (FIG. 28).
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 83/175
77/120
Exemplo 6 - Anticorpos para NKG2D exibem termoestabilidade alta [0210] As temperaturas de fusão de domínios de ligação ao NKG2D foram testadas usando fluorimetria de varredura diferencial. As temperaturas de fusão aparentes extrapoladas são altas em relação aos anticorpos IgGl típicos (FIG. 29) .
Exemplo 7 - Proteínas de ligação multiespecificas exibem habilidade aumentada para ativar células NK [0211] Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas de camadas leucoplaquetárias do sangue periférico humano usando centrifugação por gradiente de densidade. Células NK (CD3 CD56+) foram isoladas de PBMCs usando seleção negativa com glóbulos magnéticos, e a pureza das células NK isoladas foi tipicamente >95%. As células NK isoladas foram então cultivadas em meio contendo 100 ng/mL de IL-2 por 24-48 horas antes de serem transferidas para os poços de uma microplaca à qual proteínas de ligação multiespecificas e biespecíficas foram adsorvidas, respectivamente, e cultivadas nos meios contendo anticorpo anti-CD107a conjugado a fluoróforo, brefeldina-A e monensina. Após cultura, as células NK foram testadas por citometria de fluxo usando anticorpos conjugados a fluoróforo contra CD3, CD56 e IFN-gama. A coloração para CD107a e IFN-gama foi analisada em células CD3 CD56+ para avaliar a ativação de célula NK. O aumento em células duplaspositivas para CD107a/IFN-gama é indicativo de melhor ativação de célula NK. AL2.2 é uma proteína de ligação multiespecifica que contém domínio de ligação ao HER2 (trastuzumab), domínio de ligação ao NKG2D (ULBP-6) e um
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 84/175
78/120 domínio Fc de IgGl humana. Ela foi feita por meio de uma reação de troca controlada de braço Fab (cFAE) partindo de homodímero de trastuzumab e homodímero de ULBP-6-Fc (veja Labrijn e outros Nature Protocols 9, 2450-2463) . SC2.2 é uma proteína de cadeia única que inclui um scFv derivado de trastuzumab, e ULBP-6 (ID. DE SEQ. N° : 73).
ID. DE SEQ. N°: 73 MAAAAIPALLLCLPLLFLLFGWSRARRDDPHSLCYDITVIPKFRPGPRWCAVQGQVDEK TFLHYDCGNKTVTPVSPLGKKLNVTMAWKAQNPVLREWDILTEQLLDIQLENYTPKEP LTLQARMSCEQKAEGHSSGSWQFSIDGQTFLLFDSEKRMWTTVHPGARKMKEKWENDKD VAMSFHYISMGDCIGWLEDFLMGMDSTLEPSAGAPLAMSSGTTQLRATATTLILCCLLI ILPCFILPGI [0212] A análise da coloração de CD107a e IFN-gama indicou que controle de isótipo IgG não mostrou ativação de células NK, enquanto uma percentagem maior de células NK se tornou CD107a+ e IFN-gama+ após estimulação com uma proteína de ligação multiespecífica, comparada com uma proteína biespecífica, demonstrando ativação mais forte de célula NK por meio do engajamento de dois receptores de ativação (NKG2D e CD16) ao invés de apenas um (NKG2D) (FIG. 30). Espera-se que esse aumento na ativação de célula NK se traduza em morte de célula tumoral mais potente.
Exemplo 8 - Proteínas de ligação multíespecífícas exibem citotoxicidade aumentada contra células tumorais-alvo Ensaio de citotoxicidade de célula NK humana primária [0213] Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas de camadas leucoplaquetárias do sangue periférico humano usando centrifugação por gradiente de densidade. Células NK (CD3 CD56+) foram isoladas de PBMCs usando seleção negativa com glóbulos magnéticos, e a pureza
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 85/175
79/120 das células NK isoladas foi tipicamente >95%. Células NK foram então cultivadas de um dia para o outro em meio contendo 100 ng/mL de IL-2 antes de serem usadas em ensaios de citotoxicidade. No dia seguinte, as células NK foram ressuspensas a 5xl05/mL em meio de cultura fresco. Células de câncer de mama humano SkBr-3 foram marcadas com reagente BATDA de acordo com o Kit de Citotoxicidade Perkin Elmer DELFIA e ressuspensas a 5xlO4/mL em meio de cultura. Foram feitas várias diluições das proteínas de ligação multiespecificas em meios de cultura. Células NK, as células SkBr-3 marcadas e as proteínas de ligação multiespecíficas foram então combinadas em poços de uma placa de microtitulação e incubadas a 37 °C por 3 horas. Após incubação, 20 μΐ do sobrenadante da cultura foram removidos, misturados com 200 μΐ de solução de Európio e incubados com agitação por 15 minutos no escuro. A fluorescência foi medida ao longo do tempo por uma leitora de placas PheraStar equipada com um módulo de fluorescência tempo-resolvida (Excitação 337 nm, Emissão 620 nm) e a lise especifica foi calculada de acordo com as instruções do kit. ALO. 2 é uma proteína de ligação multiespecífica que contém domínio de ligação ao HER2 (trastuzumab), domínio de ligação ao NKG2D (selecionado do ID. DE SEQ. N° : 1-44)) e um domínio Fc de IgGl humana. Ela foi feita por meio de uma reação de troca controlada de braço Fab (cFAE) partindo de homodímero de trastuzumab e homodímero anti-NKG2D. AL0.2si é baseada em ALO. 2 e contém uma mutação D2 65A adicional no domínio Fc, que elimina a ligação a CD16. Trastuzumab-si se baseia em Trastuzumab e contém uma mutação D265A adicional no domínio Fc, que elimina a ligação a CD16. AL2.2 é uma proteína de
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 86/175
80/120 ligação multiespecifica que contém domínio de ligação ao HER2 (trastuzumab), domínio de ligação ao NKG2D (ULBP-6) e um domínio Fc de IgGl humana. SC2.2 é uma proteína de cadeia única que inclui um scFv derivado de trastuzumab, e ULBP-6.
[0214] ALO.2 mostrou lise mais aumentada de células alvo SkBr-3 por células NK humanas do que trastuzumab de uma forma dose-dependente, com um valor p de 0,0311 em EC50 (FIG. 31). AL0.2si (FIG. 32) e trastuzumab-si (FIG. 33) mostraram redução tanto na potência quanto na lise específica máxima de células SkBr-3, comparados com ALO.2, com um valor p de 0,0002 e 0,0001 em EC50, respectivamente (FIGs. 32-33). Além disso, ALO.2 mostrou lise mais aumentada de células SkBr-3 do que AL2.2 de uma forma dose-dependente (FIG. 34). A IgG de controle de isótipo não mostrou aumento na lise específica em qualquer uma das concentrações testadas. Em conjunto, os dados demonstraram que proteínas de ligação multiespecificas que engajam 2 receptores de ativação em células NK e um antigeno tumoral, induzem morte mais potente de células tumorais por células NK humanas, comparadas com proteínas biespecíficas que engajam um receptor de ativação em células NK e um antigeno tumoral.
Ensaio de citotoxicidade de célula NK primária de camundongo [0215] Baços foram obtidos de camundongos C57B1/6 e esmagados por meio de uma peneira de células de 70 pm para obter suspensão de célula única. As células foram peletizadas e ressuspensas em tampão de lise ACK (adquirido de Thermo Fisher Scientific #A1049201; 155 mM de cloreto de amônio, 10 mM de bicarbonato de potássio, 0,01 mM de EDTA) para remover células sanguíneas vermelhas. As células restantes foram
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 87/175
81/120 cultivadas com 100 ng/mL de hIL-2 por 72 horas antes de serem coletadas e preparadas para isolamento de células NK. Células NK (CD3 NK1.11) foram então isoladas de células esplênicas usando uma técnica de depleção negativa com glóbulos magnéticos com tipicamente >90% de pureza. Células NK purificadas foram cultivadas em meio contendo 100 ng/mL de mIL-15 por 48 horas antes de serem ressuspensas em meios de cultura a 106/mL para ensaios citotóxicos. RMA-HER2-dTomato, uma linhagem de célula tumoral de camundongo modificada geneticamente para expressar HER2 e dTomato, e sua contraparte de controle, células RMA que expressam zsGreen foram usadas como alvos. Elas foram ressuspensas a 2xl05/mL em meio de cultura e semeadas em poços de uma microplaca em proporção de 1:1. Foram feitas diluições de proteína multiespecífica em meios de cultura, e adicionadas às células RMA junto com as células NK. Após incubação de um dia para o outro a 37°C com CO2 5%, a percentagem de células RMA-HER2dTomato e RMA-zsGreen foi determinada por citometria de fluxo usando o repórter fluorescente para identificar os dois tipos de células. Morte de célula-alvo específica = (1- ( (% de células RMA-Ca2T-dTomato no grupo de tratamento * % de células RMA-zsGreen no grupo de controle)/(% de células RMACa2T-dTomato no grupo de controle * % de células RMA-zsGreen no grupo de tratamento))) * 100%.
[0216] AL2.2 é mais potente no redirecionamento de respostas de células NK a alvos tumorais do que SC2.2 (FIG. 36) e Trastuzumab (FIG. 35) . Proteína de controle mostrou pouco impacto sobre morte alvo-específica. Esses dados demonstram que as proteínas de ligação multiespecíficas que engajam 2 receptores de ativação em células NK e um antígeno
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 88/175
82/120 tumoral, induzem morte mais potente de células tumorais por células NK de camundongo, comparadas com proteínas biespecíficas que engajam um receptor de ativação em células NK e um antígeno tumoral.
Exemplo 9 - Proteínas de ligação multíespecífícas se ligam ao NKG2D [0217] Linhagens de células de linfoma de camundongo EL4 foram modificadas geneticamente para expressar proteínas triespecíficas de ligação ao NKG2D humano (TriNKETs), em que cada uma contém um domínio de ligação ao NKG2D, um domínio de ligação ao antígeno tumor-associado (por exemplo, um domínio de ligação ao CD33, HER2, CD20 ou BCMA), e um domínio Fc que se liga a CD16 como mostrado na FIG. 1, foram testadas quanto à sua afinidade para NKG2D extracelular expresso em células EL4. A ligação das proteínas de ligação multiespecíficas ao NKG2D foi detectada usando anticorpos secundários anti-IgG humana conjugados a fluoróforo. As células foram analisadas por citometria de fluxo, e a razão de aumento em relação ao nível de base (FOB) foi calculada usando a intensidade de fluorescência média (MFI) de células que expressam NKG2D, comparadas com células EL4 parentais.
[0218] Os TriNKETs testados incluem CD33-TriNKET-C26 (ADI-28226 e um domínio de ligação ao CD33), CD33-TriNKETF04 (ADI-29404 e um domínio de ligação ao CD33), HER2TriNKET-C26 (ADI-28226 e um domínio de ligação ao HER2), HER2-TriNKET-F04 (ADI-29404 e um domínio de ligação ao HER2), CD20-TriNKET-C26 (ADI-28226 e um domínio de ligação ao CD20), CD2O-TriNKET-FO4 (ADI-29404 e um domínio de ligação ao CD20), BCMA-TriNKET-C26 (ADI-28226 e um domínio de ligação ao BCMA), BCMA-TriNKET-FO4 (ADI-29404 e um domínio de ligação ao BCMA),
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 89/175
83/120
BCMA-TriNKET-F43 (ADI-29443 e um domínio de ligação ao BCMA), e BCMA-TriNKET-F47 (ADI-29447 e um dominio de ligação ao BCMA) . O dominio de ligação ao HER2 usado nas moléculas testadas era composto por um domínio variável da cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve de Trastuzumab. O domínio de ligação ao CD33 era composto por um domínio variável da cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve listados abaixo.
ID. DE SEQ. N°: 74:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYWHWVRQAPGQGLEWMGYINPYND
CDR1
GTKYNEKFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDYRYEVYGMDYWGQ CDR2 CDR3
GTLVTVSS
ID. DE SEQ. N°: 75:
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCTASSSVNYIHWYQQKPGQPPKLLIYDTSKVASGVPA R
CDR1 CDR1
FSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQQWRSYPLTFGQGTKLEIK
CDR3 [0219] O domínio de ligação ao CD20 usado nas moléculas testadas era composto por um domínio variável da cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve. O domínio de ligação ao BCMA usado nas moléculas testadas era composto por um domínio variável da cadeia pesada e domínio variável da cadeia leve como listados abaixo.
Domínio variável da cadeia pesada de EM-801 (ID. DE SEQ. N°: 82) :
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGG
CDR1 CDR2
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 90/175
84/120
STYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVLGWFDYWGQGTLVTVS S CDR3
Domínio variável da cadeia leve de EM-801 (ID. DE SEQ. N°: 83) :
EIVLTQSPGTLSLSP GE RAT L S CRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAP RLLIYGASSRATGI
CDR1 CDR2
PDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGYPPDFTFGQGTKVEIK
CDR3
Domínio variável da cadeia pesada de EM-901 (ID. DE SEQ. N°:
76)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDNAMGWVRQAPGKGLEWVSAISGPGSST
CDR1 CDR2
YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVLGWFDYWGQGTLVTVSS
CDR3
Domínio variável da cadeia leve de EM-901 (ID. DE SEQ. N°:
77)
EIVLTQSPGTLSLSP GE RAT L S CRASQSVSDEYLSWYQQKPGQAP RLLIHSASTRATGI PD CDR1 CDR2
RFSGSGSGTDFTLAISRLEPEDFAVYYCQQYGYPPDFTFGQGTKVEIK
CDR3 [0220] Os dados mostram que um TriNKET da presente revelação se liga a NKG2D quando a proteína inclui um domínio de ligação ao antígeno tumoral como, por exemplo, CD33, HER2, CD20 e BCMA.
Exemplo 10 - Proteínas de ligação multiespecíficas se ligam a antigenos tumorais humanos
Proteínas de ligação triespecíficas se ligam ao CD33, HER2, CD20 e BCMA [0221] A linhagem de célula de AML humana MV4-11 que expressa CD33 foi usada para testar a ligação de TriNKETs ao
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 91/175
85/120 antígeno tumor-associado. TriNKETs e o anticorpo monoclonal anti-CD33 parental foram incubados com as células, e a ligação foi detectada usando anticorpos secundários anti-IgG humana conjugados a fluoróforo. As células foram analisadas por citometria de fluxo, e a razão de aumento em relação ao nível de base (FOB) foi calculada usando a intensidade de fluorescência média (MFI) de TriNKETs e do anticorpo monoclonal anti-CD33 parental normalizada para controles de anticorpo secundário. CD33-TriNKET-C26 e CD33-TriNKET-F04 exibem níveis comparáveis de ligação ao CD33, quando comparados com o anticorpo anti-CD33 parental (FIG. 41).
[0222] Linhagens de células de câncer humano que expressam HER2 foram usadas para testar a ligação de TriNKETs ao antígeno tumor-associado. A linhagem de célula de carcinoma de célula renal 786-0 expressa níveis baixos de HER2. TriNKETs e, opcionalmente, o anticorpo monoclonal anti-HER2 parental (Trastuzumab) foram incubados com as células, e a ligação foi detectada usando anticorpos secundários anti-IgG humana conjugados a fluoróforo. As células foram analisadas por citometria de fluxo, e a razão de aumento em relação ao nível de base (FOB) foi calculada usando a intensidade de fluorescência média (MFI) de TriNKETs e Trastuzumab normalizada para controles de anticorpo secundário. HER2-TriNKET-C26 e HER2-TriNKET-F04 exibem níveis comparáveis de ligação ao HER2 expresso em células 786-0, quando comparados com Trastuzumab (FIG. 42).
[0223] Células de mieloma humano MM.1S que expressam BCMA foram usadas para testar a ligação de TriNKETs ao antígeno tumor-associado BCMA. TriNKETs e, opcionalmente, o anticorpo monoclonal anti-BCMA parental (EM-801) foram
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 92/175
86/120 incubados com as células, e a ligação foi detectada usando anticorpos secundários anti-IgG humana conjugados a fluoróforo. As células foram analisadas por citometria de fluxo, e a razão de aumento em relação ao nivel de base (FOB) foi calculada usando a intensidade de fluorescência média (MFI) de TriNKETs e EM-801 normalizada para controles de anticorpo secundário. C26—TriNKET-BCMA, F04-TriNKET-BCMA, F43-TriNKET-BCMA e F47-TriNKET-BCMA exibem níveis comparáveis de ligação ao BCMA expresso em células MM.1S, quando comparados com EM-801 (FIG. 43).
[0224] Células de linfoma humano Raji que expressam CD20 foram usadas para testar a ligação de TriNKETs ao antigeno tumor-associado CD20. TriNKETs foram incubados com as células, e a ligação foi detectada usando anticorpos secundários anti-IgG humana conjugados a fluoróforo. As células foram analisadas por citometria de fluxo e o histograma foi tabulado. Como mostrado na FIG. 44, CD20TriNKET-C26 e CD20-TriNKET-F04 se ligam ao CD20 igualmente bem.
Exemplo 11 - Proteínas de ligação multiespecificas ativam células NK [0225] Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas de camadas leucoplaquetárias do sangue periférico humano usando centrifugação por gradiente de densidade. Células NK (CD3 CD56+) foram isoladas de PBMCs usando seleção negativa com glóbulos magnéticos, e a pureza das células NK isoladas foi tipicamente >90%. Células NK isoladas foram cultivadas em meio contendo 100 ng/mL de IL2 para ativação ou descansaram de um dia para o outro sem citocina. Células NK ativadas por IL-2 foram usadas dentro
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 93/175
87/120 de 24-48 horas após ativação.
[0226] Células de câncer humano que expressam um antígeno tumoral foram coletadas e ressuspensas em meios de cultura a 2xlO6/mL. Anticorpos monoclonais ou TriNKETs que visam o antígeno tumoral foram diluídos em meios de cultura. Células NK ativadas foram coletadas, lavadas e ressuspensas a 2xlO6/mL em meio de cultura. Células de câncer foram então misturadas com anticorpos monoclonais/TriNKETs e células NK ativadas na presença de IL-2. Brefeldina-A e monensina também foram adicionadas à cultura misturada para bloquear o transporte de proteína para fora da célula para coloração de citocina intracelular. Anti-CD107a conjugado a fluoróforo foi adicionado à cultura misturada e a cultura foi incubada por 4 horas antes de as amostras terem sido preparadas para análise por FACS usando anticorpos conjugados a fluoróforo contra CD3, CD56 e IFN-gama. A coloração de CD107a e IFNgama foi analisada em células CD3 CD56+ para avaliar a ativação de célula NK. O aumento em células duplas-positivas para CD107a/IFN-gama é indicativo de melhor ativação de célula NK por meio do engajamento de dois receptores de ativação, ao invés de um receptor.
[0227] TriNKETs medeiam a ativação de células NK humanas cocultivadas com células SkBr-3 (FIG. 47A), células Colo201 (FIG. 47B) e células HCC1954 (FIG. 47C) que expressam HER2, respectivamente, como indicado por um aumento da degranulação de CD107a e produção de IFN-gama. Células SkBr3 e células HCC1954 possuem níveis elevados de expressão de superfície de HER2, e Colo201 possui expressão média de HER2 . Comparados com o anticorpo monoclonal trastuzumab, TriNKETs exibem ativação superior de células NK humanas na presença
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 94/175
88/120 de células de câncer humano. Células NK isoladamente, células NK mais células SkBr-3 são usadas como controles negativos.
[0228] TriNKETs (C26-TriNKET-HER2 e F04-TriNKETHER2) medeiam a ativação de células NK humanas cocultivadas com células Mv4-ll de AML humana que expressam CD33 mostraram um aumento da degranulação de CD107a e produção de IFN-gama. Comparados com o anticorpo monoclonal anti-CD33, TriNKETs (C26-TriNKET-HER2 e F04-TriNKET-HER2) mostraram ativação superior de células NK humanas na presença de células de câncer humano que expressam HER2 (FIGs. 47A-47C).
Células NK humanas primárias são ativadas por TriNKETs em cocultura com alvos expressando linhagens de células de câncer humano [0229] O cocultivo de células NK humanas primárias com células de câncer humano CD20-positivas resultou em ativação mediada por TriNKET de células NK humanas primárias (FIG. 62) . TriNKETs que visam CD20 (por exemplo, C2 6-TriNKETCD20 e F04-TriNKET-CD20), mediaram ativação de células NK humanas cocultivadas com células Raji CD20-positivas, como indicado por um aumento na degranulação de CD107a e produção de citocina IFNy (FIG. 62) . Comparados com o anticorpo monoclonal Rituximab, ambos os TriNKETs (por exemplo, C26TriNKET-CD20 e F04-TriNKET-CD20) mostraram ativação superior de células NK humanas (FIG. 62).
Rituximab_vH QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGN
CDR1 CDR2
GDTSYNQKFKGKATLTADKS S S TAYMQLSSLTSED SAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAG TTVTVSA (ID. DE SEQ. N°: 84) CDR3
Rituximab_vL
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 95/175
89/120
QIVL SQSPAIL SASP GE KVTMT CRASSSVSYIHWFQQKPGS SP KPWIYATSNLASGVP
CDR1 CDR2
VRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIK (ID. DE SEQ. N°: 85) CDR3 [0230] O cocultivo de células NK humanas primárias com células de mieloma MM.IS BCMA-positivas resultou em ativação mediada por TriNKET das células NK humanas primárias. TriNKETs que visam BCMA (por exemplo, C26TriNKET-BMCA e F04-TriNKET-BMCA) mediaram a ativação de células NK humanas cocultivadas com células de mieloma MM.1S, como indicado por um aumento em degranulação de CD107a e produção de citocina ΙΕΝγ (FIG. 63). Comparados com TriNKET de isótipo, TriNKETs que visam BCMA (por exemplo, A44TriNKET-BMCA, A49-TriNKET-BMCA, C26-TriNKET-BMCA, F04TriNKET-BMCA, F43-TriNKET-BMCA, F43-TriNKET-BMCA, F47TriNKET-BMCA e F63-TriNKET-BMCA) mostraram atividade de célula NK aumentada (FIG. 63).
Exemplo 12 - Proteínas de ligação tríespecífícas habilitam a cítotoxícídade de células alvo de câncer [0231] Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas de camadas leucoplaquetárias do sangue periférico humano usando centrifugação por gradiente de densidade. Células NK (CD3 CD56+) foram isoladas de PBMCs usando seleção negativa com glóbulos magnéticos, e a pureza das células NK isoladas foi tipicamente >90%. Células NK isoladas foram cultivadas em meio contendo 100 ng/mL de IL2 para ativação ou descansaram de um dia para o outro sem citocina. Células NK ativadas por IL-2 ou em repouso foram usadas no dia seguinte em ensaios de citotoxicidade.
[0232] A fim de testar a habilidade de células NK
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 96/175
90/120 humanas para lisar células de câncer na presença de TriNKETs, um ensaio de citotoxicidade não radioativo Cyto Tox 96 de Promega (G1780) foi usado de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, células de câncer humano que expressam um antigeno tumoral foram coletadas, lavadas e ressuspensas em meios de cultura a l-2xl05/mL. Células NK em repouso e/ou ativadas foram coletadas, lavadas e ressuspensas a 105-2,0xl06/mL no mesmo meio de cultura que aquele das células de câncer. Em cada poço de uma placa de 96 poços, 50 μΐ da suspensão de células de câncer foram misturados com 50 μΐ de suspensão de células NK com ou sem TriNKETs que visam o antigeno tumoral expresso nas células de câncer. Após incubação a 37°C com CO2 5% por 3 horas e 15 minutos, lOx tampão de lise foi adicionado aos poços que contêm apenas células de câncer, e aos poços que contêm apenas meio para lise máxima e controles negativos de reagente, respectivamente. A placa foi então colocada de volta na incubadora por mais 45 minutos até alcançar uma incubação total de 4 horas. As células foram então peletizadas, e o sobrenadante da cultura foi transferido para uma nova placa de 96 poços e misturado com um substrato para desenvolvimento. A nova placa foi incubada por 30 minutos em temperatura ambiente, e a absorbância foi lida a 492nm em um SpectraMax i3x. A percentagem de lise especifica das células de câncer foi calculada da seguinte forma: % de lise especifica = ((lise experimental - lise espontânea de Células NK isoladamente - lise espontânea de células de câncer isoladamente) / (Lise máxima - controle de reagente negativo)) x 100%.
[0233] TriNKETs medeiam a citotoxicidade de células
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 97/175
91/120
NK humanas contra a linhagem de célula de AML humana Molm13 CD33-positiva. Como mostrado na FIG. 53B, células NK humanas em repouso foram misturadas com células de câncer Molm-13, e TriNKETs (por exemplo, C26-TriNKET-CD33 e F04TriNKET-CD33) são capazes de aumentar a atividade citotóxica de células NK humanas em repouso de forma dose-responsiva contra as células de câncer. A linha pontilhada indica atividade citotóxica de células NK em repouso sem TriNKETs. Células NK humanas ativadas foram misturadas com células de câncer Molm-13, e TriNKETs aumentaram a atividade citotóxica de células NK humanas ativadas ainda mais, comparados com um anticorpo anti-CD33, de forma dose-responsiva contra as células de câncer (FIG. 53B).
[0234] TriNKETs aumentam a citotoxicidade de células NK contra alvos com expressão de superfície baixa, comparada com a atividade citotóxica de trastuzumab, um anticorpo monoclonal anti-HER2. Células NK humanas em repouso foram misturadas com células tumorais SkBr que possuem expressão alta de HER2 e células de câncer 786-0 que possuem expressão baixa de HER2, e a habilidade de TriNKETs para aumentar a atividade citotóxica de células NK humanas em repouso contra as células de câncer que expressam HER2 de forma alta e baixa de forma dose-responsiva foi testada. As linhas pontilhadas na FIG. 50A e FIG. 50B indicam a atividade citotóxica de células NK em repouso contra as células de câncer na ausência de TriNKETs. Como mostrado na FIG. 50B, mediante misturação de células NK humanas ativadas com células 786-0 com expressão baixa de HER2, e TriNKET (por exemplo, CD26TriNKET-HER2 e FO4-TriNKET-HER2) foi observada atividade citotóxica dose-responsiva de células NK humanas ativadas
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 98/175
92/120 contra as células de câncer.
[0235] Foi avaliada a lise mediada por TriNKET de células de mieloma BCMA-positivas. A FIG. 64 mostra a lise mediada por TriNKET de células de mieloma KMS12-PE BCMApositivas por células efetoras NK humanas em repouso. Dois TriNKETs (CFAE-A49.801 e CFAE-A49.901) que usam o mesmo domínio de ligação ao NKG2D (A49), mas domínios de direcionamento a BCMA diferentes, foram testados quanto à eficácia in vitro. Ambos os TriNKETs aumentaram a lise por células NK de células KMS12-PE até uma extensão similar, mas TriNKETs que utilizam o domínio de direcionamento a EM-901 forneceram potência aumentada.
[0236] A FIG. 65 mostra a atividade citotóxica de vários TriNKETs que utilizam domínios de ligação ao NKG2D diferentes (A40, A44, A49, C26 e F47), mas o mesmo domínio de direcionamento a BCMA. A alteração do domínio de ligação ao NKG2D do TriNKET direcionado a BCMA produziu variações na morte máxima, bem como na potência dos TriNKETs. Todos os TriNKETs demonstraram morte aumentada de células alvo KMS12PE, comparados com o anticorpo monoclonal EM-901 (FIG. 65) .
Exemplo 13 [0237] A ativação sinérgica de células NK humanas por reticulação de NKG2D e CD 16 foi investigada.
Ensaio de ativação de célula NK humana primária [0238] Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas de camadas leucoplaquetárias do sangue periférico humano usando centrifugação por gradiente de densidade. Células NK foram purificadas das PBMCs usando glóbulos magnéticos negativos (StemCell # 17955) . As células NK eram >90% CD3 CD561, como determinado por citometria de
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 99/175
93/120 fluxo. As células foram então expandidas 48 horas em meio contendo 100 ng/mL de hIL-2 (Peprotech #200-02) antes do uso em ensaios de ativação. Anticorpos foram revestidos sobre uma placa de 96 poços de fundo plano em uma concentração de 2 pg/mL (anti-CD16, Biolegend # 302013) e 5 pg/mL (antiNKG2D, R&D #MAB139) em 100 pl de PBS estéril de um dia para o outro a 4°C, seguido por lavagem dos poços cuidadosamente para remover anticorpo em excesso. Para avaliação da degranulação, células NK ativadas por IL-2 foram ressuspensas a 5xl05 células/mL em meio de cultura suplementado com 100 ng/mL de hIL2 e 1 pg/mL de mAb antiCD107a conjugado a APC (Biolegend # 328619). lxlO5 células/poço foram então adicionadas às placas revestidas com anticorpo. Os inibidores do transporte de proteína Brefeldina A (BFA, Biolegend # 420601) e Monensina (Biolegend # 420701) foram adicionados em uma diluição final de 1:1000 e 1:270, respectivamente. As células plaqueadas foram incubadas por 4 horas a 37°C em CO2 5%. Para coloração intracelular de IFN-γ, células NK foram marcadas com mAb anti-CD3 (Biolegend #300452) e mAb anti-CD56 (Biolegend # 318328) e subsequentemente fixadas e permeabilizadas e marcadas com mAb anti-IFN-γ (Biolegend # 506507). As células NK foram analisadas quanto à expressão de CD107a e IFN-γ por citometria de fluxo após separação de células CD56'CD3 vivas.
[0239] Para investigar a potência relativa da combinação de receptores, a reticulação de NKG2D ou CD16 e a correticulação de ambos os receptores por estimulação ligada à placa foram realizadas. Como mostrado na Figura 45 (FIGs. 45A-45C), a estimulação combinada de CD16 e NKG2D
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 100/175
94/120 resultou em níveis altamente elevados de CD107a (degranulação) (FIG. 45A) e/ou produção de IFN-γ (FIG. 45B). As linhas pontilhadas representam um efeito aditivo de estimulações individuais de cada receptor.
[0240] Os niveis de CD107a e a produção intracelular de IFN-γ de células NK ativadas por IL-2 foram analisados após 4 horas de estimulação ligada à placa com anti-CD16, anti-NKG2D ou uma combinação de ambos os anticorpos monoclonais. Os gráficos indicam a média (n = 2) ± DP. A FIG. 45A demonstra niveis de CD107a; a FIG. 45B demonstra niveis de IFNy; a FIG. 45C demonstra niveis de CD107a e produção de IFN-γ. Os dados mostrados nas FIGs. 45A-45C são representativos de cinco experimentos independentes com o uso de cinco doadores saudáveis diferentes.
[0241] A degranulação de CD107a e a produção intracelular de IFN-γ de células NK ativadas por IL-2 foram analisadas após 4 horas de estimulação ligada à placa com trastuzumab, anti-NKG2D, ou um TriNKET derivado dos dominios de ligação de trastuzumab e do anticorpo anti-NKG2D (FIG. 46) . Em todos os casos, os anticorpos testados eram do isótipo de IgGl humana. Os gráficos indicam a média (n = 2) ± DP .
Exemplo 14
Avaliação da ligação de TriNKET ao NKG2D humano expresso por célula [0242] Células EL4 transduzidas com NKG2D humano foram usadas para testar a ligação ao NKG2D humano expresso por célula. TriNKETs foram diluidos até 20 pg/mL, e depois diluidos serialmente. O mAb ou as diluições de TriNKET foram usados para corar células, e a ligação do TriNKET ou mAb foi
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 101/175
95/120 detectada usando um anticorpo secundário anti-IgG humana conjugado a fluoróforo. As células foram analisadas por citometria de fluxo, a MFI da ligação foi normalizada para controles de anticorpo secundário para obter a variação em relação aos valores no nível de base.
Avaliação da ligação de TriNKET aos antigenos de câncer humano expressos por células [0243] Linhagens de células de câncer humano que expressam CD33 ou HER2 foram usadas para avaliar a ligação ao antigeno tumoral de TriNKETs derivados de diferentes clones que visam NKG2D. A linhagem de célula de AML humana MV4-11 foi usada para avaliar a ligação de TriNKETs ao CD33 expresso em células. A linhagem de célula de carcinoma de célula renal humano 786-0 expressa níveis baixos de HER2 e foi usada para avaliar a ligação de TriNKET ao HER2 expresso por células. TriNKETs foram diluídos até 20 pg/mL, e foram incubados com as respectivas células. A ligação do TriNKET foi detectada usando um anticorpo secundário anti-IgG humana conjugado a fluoróforo. As células foram analisadas por citometria de fluxo, a MFI da ligação ao CD33 e HER2 expressos em células foi normalizada para controles de anticorpo secundário para obter a variação em relação aos valores no nível de base.
Determinação de capacidade de ligação ao anticorpo de linhagens de células de câncer humano HER2-positivas [0244] A capacidade de ligação ao anticorpo (ABC) de linhagens de células de câncer humano HER2-positivas foi medida. Foi usado o kit Quantum Simply Cellular de Bangs Lab (#815), e as instruções do fabricante foram seguidas para a preparação de glóbulos marcados com anticorpo.
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 102/175
96/120
Resumidamente, cada uma das quatro populações de glóbulos foi corada com uma quantidade saturante de anticorpo antiHER2, e as populações de células também foram coradas com uma quantidade saturante do mesmo anticorpo. Foram adquiridos dados de amostras para cada população de glóbulos, bem como para as populações de células. A planilha QuickCal, fornecida com o kit, foi usada para a geração de uma curvapadrão e extrapolação de valores ABC para cada uma das linhagens de células.
Ativação de células NK primárias por TriNKETs [0245] PBMCs foram isoladas de camadas leucoplaquetárias do sangue periférico humano usando centrifugação por gradiente de densidade. PBMCs isoladas foram lavadas e preparadas para isolamento de células NK. Células NK foram isoladas usando uma técnica de seleção negativa com glóbulos magnéticos; a pureza de células NK isoladas foi tipicamente >90% CD3-CD56+. Células NK isoladas foram cultivadas em meio contendo 100 ng/mL de IL-2 para ativação ou descansaram de um dia para o outro sem citocina. Células NK ativadas por IL-2 foram usadas 24-48 horas mais tarde; células NK em repouso foram sempre usadas no dia seguinte à purificação.
[0246] Linhagens de células de câncer humano que expressam um alvo de câncer de interesse foram coletadas da cultura, e células foram ajustadas até 2xlO6/mL. Anticorpos monoclonais ou TriNKETs que visam o alvo de câncer de interesse foram diluidos em meio de cultura. Células NK em repouso e/ou ativadas foram coletadas da cultura, as células foram lavadas e foram ressuspensas a 2xlO6/mL em meio de cultura. IL-2 e anti-CD107a conjugado a fluoróforo foram
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 103/175
97/120 adicionados às células NK para a cultura de ativação. Brefeldina-A e monensina foram diluidas em meio de cultura para bloquear o transporte de proteína para fora da célula para coloração de citocina intracelular. Em uma placa de 96 poços, 50 μΐ de alvos tumorais, mAbs/TriNKETs, BFA/monensina e células NK foram adicionados para um volume de cultura total de 200 μΐ. A placa foi cultivada por 4 horas antes de as amostras terem sido preparadas para análise por FACS.
[0247] Após a cultura de ativação de 4 horas, as células foram preparadas para análise por citometria de fluxo usando anticorpos conjugados a fluoróforo contra CD3, CD56 e IFNy. A coloração para CD107a e IFNy foi analisada em populações CD3-CD56+ para avaliar a ativação de célula NK.
Ensaio de citotoxicidade de célula NK humana primária [0248] PBMCs foram isoladas de camadas leucoplaquetárias do sangue periférico humano usando centrifugação por gradiente de densidade. PBMCs isoladas foram lavadas e preparadas para isolamento de células NK. Células NK foram isoladas usando uma técnica de seleção negativa com glóbulos magnéticos, a pureza de células NK isoladas foi tipicamente >90% CD3-CD56+. Células NK isoladas foram cultivadas em meio contendo 100 ng/mL de IL-2 ou descansaram de um dia para o outro sem citocina. Células NK ativadas por IL-2 ou em repouso foram usadas no dia seguinte em ensaios de citotoxicidade.
Ensaio de liberação de LHD Cyto Tox 96:
[0249] A habilidade de células NK humanas para lisar células tumorais foi medida com ou sem a adição de TriNKETs utilizando o ensaio de citotoxicidade não radioativo Cyto Tox 96 de Promega (G1780) . Linhagens de células de câncer
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 104/175
98/120 humano que expressam um alvo de câncer de interesse foram coletadas da cultura, as células foram lavadas com PBS, e foram ressuspensas em meio de crescimento a l-2xl05/mL para uso como células-alvo. Cinquenta μΐ da suspensão de célulaalvo foram adicionados a cada poço. Anticorpos monoclonais ou TriNKETs que visam um antigeno de câncer de interesse foram diluidos em meio de cultura, 50 μΐ de mAb ou TriNKET diluido foram adicionados a cada poço. Células NK em repouso e/ou ativadas foram coletadas da cultura, as células foram lavadas e foram ressuspensas a 105-2,0xl06/mL em meio de cultura, dependendo da proporção E:T desejada. Cinquenta μΐ de células NK foram adicionados a cada poço da placa para fazer um total de 150 μΐ de volume de cultura. A placa foi incubada a 37°C com CO2 5% por 3 horas e 15 minutos. Após a incubação, lOx tampão de lise foi adicionado aos poços de células-alvo isoladamente, e aos poços que contêm apenas meio, para lise máxima e controles de volume. A placa foi então colocada de volta na incubadora por mais 45 minutos, para fazer um total de 4 horas de incubação antes do desenvolvimento.
[0250] Após incubação, a placa foi removida da incubadora e as células foram peletizadas por centrifugação a 200 g por 5 minutos. Cinquenta μΐ de sobrenadante da cultura foram transferidos para uma microplaca limpa e 50 μΐ de solução de substrato foram adicionados a cada poço. A placa foi protegida da luz e incubada por 30 minutos em temperatura ambiente. Cinquenta μΐ de solução de parada foram adicionados a cada poço, e a absorbância foi lida a 492 nm em um SpectraMax i3x. O % de lise especifica foi calculado da seguinte forma: % de lise específica = ((Liberação
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 105/175
99/120 experimental - Liberação espontânea pelo efetor - Liberação espontânea pelo alvo) / (Liberação máxima - Liberação espontânea)) * 100%.
Ensaio de citotoxicidade DELFIA:
[0251] Linhagens de células de câncer humano que expressam um alvo de interesse foram coletadas da cultura, as células foram lavadas com PBS, e foram ressuspensas em meio de crescimento a 106/mL para marcação com reagente BATDA (Perkin Elmer AD0116). As instruções do fabricante foram seguidas para marcação das células-alvo. Após marcação, as células foram lavadas 3x com PBS, e foram ressuspensas a 0,5-1,0 x 105/mL em meio de cultura. Para preparar os poços de base, uma alíquota das células marcadas foi colocada de lado, e as células foram centrifugadas para fora do meio. Cem μΐ do meio foram cuidadosamente adicionados aos poços em triplicata para evitar perturbação das células peletizadas. Cem μΐ de células marcadas com BATDA foram adicionados a cada poço da placa de 96 poços. Os poços foram salvos para liberação espontânea por células-alvo, e poços foram preparados para lise máxima de células-alvo por adição de Triton-X 1%. Anticorpos monoclonais ou TriNKETs contra o alvo tumoral de interesse foram diluídos em meio de cultura e 50 μΐ de mAb ou TriNKET diluído foram adicionados a cada poço. Células NK em repouso e/ou ativadas foram coletadas da cultura, as células foram lavadas e foram ressuspensas a 1052,0xl06/mL em meio de cultura, dependendo da proporção E:T desejada. Cinquenta μΐ de células NK foram adicionados a cada poço da placa para fazer um total de 200 μΐ de volume de cultura. A placa foi incubada a 37°C com CO2 5% por 2-3 horas antes do desenvolvimento do ensaio.
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 106/175
100/120 [0252] Após cultivo por 2-3 horas, a placa foi removida da incubadora e as células foram peletizadas por centrifugação a 200 g por 5 minutos. Vinte μΐ de sobrenadante da cultura foram transferidos para uma microplaca limpa fornecida pelo fabricante, 200 μΐ de solução de európio em temperatura ambiente foram adicionados a cada poço. A placa foi protegida da luz e incubada em uma agitadora de placas a 250 rpm por 15 minutos. A placa foi lida usando instrumentos Victor 3 ou SpectraMax i3X. O % de lise especifica foi calculado da seguinte forma: % de lise especifica = ((Liberação experimental - Liberação espontânea) / (Liberação máxima - Liberação espontânea)) * 100% .
Ensaio de citotoxicidade de longo prazo de PBMCs humanas:
[0253] Células alvo SkBr-3 foram marcadas com Verde BacMam 3.0 NucLight (#4622) para permitir o rastreamento das células-alvo. O protocolo do fabricante foi seguido para marcação de células alvo SkBr-3. Vermelho Anexina V (Essen Bioscience #4641) foi diluido e preparado de acordo com as instruções do fabricante. Anticorpos monoclonais ou TriNKETs foram diluídos em meio de cultura. Cinquenta μΐ de mAbs ou TriNKETs, Anexina V e células NK em repouso foram adicionados aos poços de uma placa de 96 poços que já contém células marcadas SkBr-3; 50 μΐ de meio de cultura completo foram adicionados para um total de 200 μΐ de volume de cultura.
[0254] A coleta de imagens foi configurada no IncuCyte S3. Imagens para os canais de fase, verde e vermelho foram coletadas a cada hora, com 2 imagens por poço. A análise das imagens foi feita usando o software IncuCyte S3. Foram criadas máscaras para os canais verdes e vermelhos
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 107/175
101/120 para contar o número de células tumorais e células Anexina V-positivas, respectivamente. Para calcular o % de células Mv4-ll-alvo Anexina V-positivas, a seguinte fórmula foi usada. % células SkBr-3 Anexina V-positivas = ((contagem de objeto sobreposto) / (contagem de objeto verde)) * 100%.
Comparação de um TriNKET que visa células de câncer HER+ com SC2.2 [0255] Um TriNKET que visa HER2 é mais eficaz do que Trastuzumab na redução do número de células SkBr-3, e somente 60% das células desde o tempo zero restavam após 60 horas. Um TriNKET da presente revelação que visa células tumorais/de câncer que expressam HER2 é mais eficaz do que SC2.2 — uma molécula biespecífica de cadeia única construída a partir de um scFv derivado de trastuzumab ligado a ULBP-6, um ligante para NKG2D. SC2.2 se liga às células de câncer HER2+ e células NK NKG2D+ simultaneamente. Portanto, a eficácia de SC2.2 na redução do número de células de câncer HER2+ foi investigada. Ensaios de ativação e citotoxicidade in vitro demonstraram que SC2.2 foi eficaz na ativação e morte de células NK. No entanto, SC2.2 não demonstrou eficácia no modelo de tumor subcutâneo RMA/S-HER2. A eficácia de SC2.2 também foi testada in vivo usando um modelo em camundongo singênico que superexpressa RMA/S-HER2. Nesse modelo em camundongo, SC2.2 não demonstrou controle do crescimento tumoral, comparado com controle de veículo. Dessa forma, embora SC2.2 fosse capaz de ativar e matar células NK, e se ligar às células de câncer HER2+, essas propriedades eram insuficientes para controlar eficazmente o crescimento de tumores HER2+.
Avaliação da meia-vida sérica de SC2.2 em camundongos
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 108/175
102/120
C57B1/6 [0256] Para determinar a meia-vida sérica de SC2.2 em camundongos C57B1/6, SC2.2 foi marcado com um tag fluorescente para rastrear sua concentração in vivo. SC2.2 foi marcado com IRDye 800CW (Licor #929-70020). A proteína marcada foi injetada por via intravenosa em 3 camundongos C57B1/6, foi retirado sangue de cada camundongo nos pontos do tempo indicados. Após a coleta, o sangue foi centrifugado a 1.000 g por 15 min e soro foi coletado de cada amostra e armazenado a 4 °C até que todos os pontos do tempo fossem coletados.
[0257] Foram feitas imagens do soro usando um sistema de imagem infravermelho Odyssey CLx, o sinal fluorescente do canal 800 foi quantificado usando o software Image J. As intensidades das imagens foram normalizadas para o primeiro ponto do tempo, e os dados foram ajustados para uma equação de decaimento bifásico. Nesse sistema experimental, a meiavida beta de SC2.2 foi calculada como sendo em torno de 7 horas.
Testagem in vivo de SC2.2 contra tumores subcutâneos RMA/S-HER2 [0258] Foi projetado um estudo in vivo de acordo com a FIG. 56 para testar a eficácia de SC2.2 contra tumores subcutâneos RMA/S-HER2. 106 células RMA/S transduzidas com HER2 humano foram injetadas por via subcutânea no flanco de 20 camundongos C57B1/6. Começando no dia 2 após inoculação do tumor SC2.2, foi dosado diariamente por meio de injeção IP. SC2.2 foi dosado em concentrações altas e baixas, juntamente com um controle de veículo. Começando no dia 4 após inoculação do tumor, os tumores foram medidos Segunda
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 109/175
103/120 feira, Quarta-feira e Sexta-feira pela duração do estudo. O volume do tumor foi calculado usando a seguinte fórmula: Volume do tumor = Comprimento x largura x altura
TriNKETs se ligam às células que expressam NKG2D humano [0259] A habilidade de um TriNKET para se ligar às células que expressam NKG2D humano foi determinada. A FIG. 37 e a FIG. 38 mostram a ligação dose-responsiva de dois TriNKETs que contêm dominios de ligação ao NKG2D diferentes. A FIG. 37 mostra a ligação dos dois TriNKETs quando um dominio de ligação ao CD33 é usado como o segundo braço de direcionamento. A FIG. 38 mostra os mesmos dois dominios de ligação ao NKG2D agora pareados com um segundo braço de direcionamento ao HER2. Os seis dominios de ligação ao NKG2D retêm o mesmo perfil de ligação com ambos os dominios que visam o tumor.
TriNKETs se ligam às células que expressam antigenos de câncer humano [02 60] A habilidade de um TriNKET para se ligar às células que expressam antigenos de câncer humano foi determinada. A FIG. 41 e a FIG. 42 mostram a ligação de TriNKETs ao CD33 expresso em células (FIG. 41) e HER2 (FIG. 42) . A ligação de TriNKET ao antigeno expresso por células foi consistente entre dominios de ligação ao NKG2D. TriNKETs se ligaram em niveis comparáveis aos do anticorpo monoclonal parental.
Capacidade de ligação ao anticorpo de linhagens de células de câncer humano HER2-positivas [0261] A Tabela 9 mostra os resultados da quantificação de superfície de HER2. Células SkBr-3 e HCC1954 foram identificadas como tendo niveis altos (+++) de HER2 de
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 110/175
104/120 superfície. ZR-75-1 e Colo201 mostraram níveis médios (++) de HER2 de superfície, e 786-0 mostrou o menor nível de HER2 ( + ) .
[0262] Tabela 9: ABC de linhagens de células de câncer HER2-positivas.
Linhagem celular Expressão de HER2 ABC
786-0 Baixa 28.162
Colo201 Média 273.568
ZR-75-1 Média 281.026
SkBr-3 Alta 6.820.532
HCC1954 Alta 10.569.869
Células NK humanas primárias são ativadas por TriNKETs em cocultura com linhagens de câncer humano que expressam niveis variáveis de HER2 [0263] As FIGs. 47A - 47C mostram que TriNKETs e trastuzumab foram capazes de ativar células NK humanas primárias em cocultura com células tumorais humanas HER2positivas, indicado por um aumento em degranulação de CD107a e produção de citocina IFNy. Comparados com o anticorpo monoclonal trastuzumab, ambos os TriNKETs exibiram ativação superior de células NK humanas com diversas células de câncer humano HER2.
[0264] A FIG. 47A mostra que células NK humanas são ativadas por TriNKETs quando cultivadas com células SkBr-3. A FIG. 47B mostra que células NK humanas são ativadas por TriNKETs quando cultivadas com células Colo201. A FIG. 47C mostra que células NK humanas são ativadas por TriNKETs quando cultivadas com células HCC1954.
TriNKETs aumentam a atividade de células NK humanas em
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 111/175
105/120 repouso e ativadas por IL-2 [0265] As FIGs. 48A - 48B mostram ativação mediada por TriNKET de células NK humanas em repouso ou ativadas por IL-2 em cocultura com a linhagem de célula MV4-11 de AML humana que expressa CD33. A FIG. 48A mostra a ativação mediada por TriNKET de células NK humanas em repouso. A FIG. 48B mostra a ativação mediada por TriNKET de células NK humanas ativadas por IL-2 do mesmo doador. Células NK em repouso mostraram menos produção de IFNy e degranulação de CD107a de base, do que células NK ativadas por IL-2. Células NK em repouso mostraram uma alteração maior na produção de IFNy e degranulação de CD107a, comparadas com células NK ativadas por IL-2. Células NK ativadas por IL-2 mostraram uma percentagem maior de células que se tornam IFNy+; CD107a+ após estimulação com TriNKETs.
TriNKETs aumentam a citotoxicidade de células NK humanas em repouso e ativadas por IL-2 [0266] As FIGs. 4 9A - 49B mostram aumento por TriNKET da atividade citotóxica usando células NK humanas ativadas por IL-2 e em repouso. A FIG. 4 9A mostra o percentual de lise especifica de células tumorais SkBr-3 por células NK humanas em repouso. A FIG. 49B mostra o percentual de lise específica de células tumorais SkBr-3 por células NK humanas ativadas por IL-2. As populações de células NK ativadas por IL-2 e em repouso vieram do mesmo doador. Comparados com trastuzumab, TriNKETs dirigem mais potentemente respostas contra células SkBr-3 por populações de células NK ativadas ou em repouso.
TriNKETs aumentam a citotoxicidade de células NK contra alvos com expressão de superficie baixa
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 112/175
106/120 [0267] As FIGs. 50A-50B mostram que TriNKETs fornecem uma vantagem maior contra cânceres com HER2 médio e baixo comparados com trastuzumab. A FIG. 50A mostra morte por célula NK humana ativada de células tumorais SkBr-3 com HER2 alto. A FIG. 50B mostra morte por célula NK humana de células tumorais 786-0 com HER2 baixo. TriNKETs fornecem uma vantagem maior comparados com trastuzumab contra células de câncer com expressão de HER2 baixa. TriNKETs fornecem a maior vantagem contra alvos com expressão de superfície baixa.
A vantagem de TriNKETs no tratamento de cânceres com expressão alta de FCR, ou em microambientes tumorais com niveis elevados de FcR [0268] A terapia com anticorpo monoclonal foi aprovada para o tratamento de muitos tipos de câncer, incluindo tanto tumores hematológicos quanto tumores sólidos. Embora o uso de anticorpos monoclonais no tratamento do câncer tenha melhorado os resultados finais dos pacientes, ainda há limitações. Estudos mecanisticos demonstraram que anticorpos monoclonais exercem seus efeitos sobre o
crescimento tumoral por meio de múltiplos mecanismos,
incluindo ADCC, CDC, fagocitose e bloqueio de sinal, entre
outros.
[0269] Mais notavelmente, acredita-se que a ADCC
seja um mecanismo importante por meio do qual anticorpos monoclonais exercem seu efeito. ADCC se baseia no engajamento de Fc de anticorpo do FcyRIII de baixa afinidade (CD16) na superfície de células natural killer, que medeiam a lise direta da célula tumoral. Entre FcyR, CD16 possui a menor afinidade para Fc de IgG, FcyRI (CD64) é o FcR de alta afinidade, e se liga cerca de 1000 vezes mais forte ao Fc de
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 113/175
107/120
IgG do que CD16.
[0270] CD64 é normalmente expresso em muitas linhagens hematopoiéticas como, por exemplo, na linhagem mielóide, e pode ser expresso em tumores derivados desses tipos de células, por exemplo, leucemia mielóide aguda (AML). Células imunes que infiltram no tumor, tais como MDSCs e monócitos, também expressam CD64 e reconhecidamente infiltram o microambiente tumoral. A expressão de CD64 pelo tumor ou no microambiente tumoral pode ter um efeito prejudicial sobre a terapia com anticorpo monoclonal. A expressão de CD64 no microambiente tumoral torna difícil que esses anticorpos se liguem ao CD16 na superfície de células NK, na medida em que os anticorpos preferem se ligar ao receptor de alta afinidade. Por meio do direcionamento a dois receptores de ativação na superfície de células NK, TriNKETs podem ser capazes de superar o efeito prejudicial da expressão de CD64 na terapia com anticorpo monoclonal.
Expressão de FcRyl (CD64) em três linhagens de células de AML [0271] Um sistema de cultura in vitro foi desenvolvido para testar a atividade de TriNKETs e anticorpos monoclonais contra tumores com níveis altos e baixos de expressão de superfície de CD64. Molm-13 e THP-1 são duas linhagens de células de AML humana que possuem expressão de superfície de CD33 similar, mas células Molm-13 não expressam CD64, enquanto células THP-1 expressam CD64 em sua superfície (FIGs. 51A - 51C). Usando anticorpos monoclonais ou TriNKETs dirigidos ao CD33-alvo, o efeito da expressão de CD64 pelo tumor sobre a terapia com anticorpo monoclonal ou TriNKET foi testado. As FIGs. 51A - 51C mostram a expressão do FcRy!
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 114/175
108/120 de alta afinidade (CD64) em três linhagens de células de AML humana, linhagem de célula Molm-13 (FIG. 51A), linhagem de célula Mv4-ll (FIG. 51B) e linhagem de célula THP-1 (FIG. 51C). Células Molm-13 não expressam CD64, enquanto células Mv4-ll possuem um nivel baixo, e THP-1 possuem um nivel alto de CD64 na superfície da célula.
TriNKETs possuem uma vantagem no direcionamento de células tumorais com expressão de superfície alta de FcRs [0272] As FIGs. 52A-52B mostram ativação mediada por anticorpo monoclonal ou TriNKET de células NK humanas em cocultura com células Molm-13 (FIG. 52B) ou THP-1 (FIG. 52A). Um anticorpo monoclonal contra CD33 humano demonstrou boa ativação de células NK humanas, no sistema de cocultura de Molm-13, como evidenciado por degranulação de CD107a e produção de ΙΕΝγ aumentadas. O anticorpo monoclonal não possui efeito no sistema de cocultura de THP-1, em que níveis elevados de CD64 estão presentes no tumor. Curiosamente, TriNKETs foram eficazes contra células Molm-13 (FIG. 52B) e THP-1 (FIG. 52A), enquanto anticorpos monoclonais não ativaram células NK em cultura com células THP-1 FcR-Hi, indicando que TriNKETs são capazes de superar a ligação ao CD64 no tumor, e eficazmente células NK-alvo para ativação. O direcionamento duplo de dois receptores de ativação em células NK forneceu ligação específica mais forte às células NK. Anticorpos monoclonais, que só visam CD16 em células NK, podem ser ligados por outros FcRs de alta afinidade, e evitam o engajamento de CD16 em células NK.
[0273] Ensaios de citotoxicidade de células NK humanas usando os sistemas de cocultura de Molm-13 e THP-1
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 115/175
109/120 fornecem evidência adicional para dar suporte à eficácia de TriNKETs na presença de niveis altos de CD64. Nesses ensaios de citotoxicidade, uma terceira linhagem de célula de AML humana foi usada, Mv4-ll. Células Mv4-ll (FIG. 51B) expressam niveis baixos de CD64, e se enquadram entre células THP-1 (FIG. 51C) e Molm-13 (FIG. 51A) quanto aos níveis de CD64 em sua superfície.
TriNKETs demonstram eficácia em linhagens de células de AML, independentemente da expressão de FCyRI [0274] As FIGs. 53A - 53C mostram ensaios de citotoxicidade de NK humana usando as três linhagens de células de AML humana como alvos. Um anticorpo monoclonal contra CD33 mostra boa eficácia contra células Molm-13 (FIG. 53B), que não expressam CD64. Células Mv4-ll (FIG. 53A), que expressam CD64, mas em um nível menor do que THP-1, mostram eficácia reduzida com o anti-CD33 monoclonal. Células THP-1 (FIG. 53C) não mostraram efeito com anti-CD33 monoclonal isoladamente. Independentemente da expressão de CD64 nas células tumorais, TriNKETs foram capazes de mediar respostas de células NK humanas contra todas as células tumorais aqui testadas.
[0275] As FIGs. 53A - 53C mostram que células THP-1 foram protegidas contra terapia com anticorpo monoclonal, em função dos níveis elevados de expressão de FcR de alta afinidade em sua superfície. TriNKETs burlaram essa proteção por direcionamento a dois receptores de ativação na superfície de células NK. Os dados de citotoxicidade se correlacionaram diretamente com aqueles observados nos experimentos de ativação de cocultura. TriNKETs foram capazes de burlar a proteção da terapia com mAb observada
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 116/175
110/120 com células THP-1, e induzem lise mediada por células NK, apesar dos niveis elevados de FcR.
Morte de células mielóides normais e células B normais em culturas de PBMC: TriNKETs fornecem um perfil de segurança melhor por meio de menos efeitos colaterais no alvo fora do tumor [0276] Células natural killer e células T CD8 são, ambas, capazes de lisar diretamente células tumorais, embora os mecanismos por meio do quais as células NK e células T CD8 reconhecem células próprias normais de células tumorais sejam diferentes. A atividade de células NK é regulada pelo equilibrio de sinais de receptores de ativação (NCRs, NKG2D, CD16 etc.) e inibitórios (KIRs, NKG2A etc.). O equilibrio desses sinais de ativação e inibitórios permite que as células NK diferenciem células próprias saudáveis de células próprias estressadas, infectadas por virus ou transformadas. Esse mecanismo embutido de autotolerância irá ajudar a proteger tecido saudável normal de respostas de células NK. Para estender esse principio, a autotolerância de células NK permitirá que TriNKETs visem antigenos expressos tanto próprios quanto tumorais sem efeitos colaterais fora do tumor, ou com uma janela terapêutica aumentada.
[0277] Diferentemente de células natural killer, células T exigem o reconhecimento de um peptideo especifico apresentado por moléculas MHC para ativação e funções efetoras. Células T foram o alvo primário da imunoterapia, e muitas estratégias foram desenvolvidas para redirecionar respostas de células T contra o tumor. Biespecificos de células T, inibidores do ponto de verificação e células CART foram todos aprovados pelo FDA, mas frequentemente sofrem
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 117/175
111/120 de toxicidades dose-limitantes. Biespecificos de células T e células CAR-T funcionam em torno do sistema de reconhecimento TCR-MHC por utilização de domínios de ligação a antigenos-alvo na superfície de células tumorais, e por utilização de domínios de sinalização modificados geneticamente para transduzir os sinais de ativação para a célula efetora. Embora eficazes para provocar uma resposta imune antitumoral, essas terapias estão frequentemente associadas com a síndrome de liberação de citocina (CRS), e efeitos colaterais no alvo fora do tumor. TriNKETs são únicos nesse contexto, na medida em que não irão anular os sistemas naturais de ativação e inibição de células NK. Pelo contrário, TriNKETs são projetados para gerenciar o equilíbrio, e fornecer sinais de ativação adicionais às células NK, enquanto mantêm a tolerância de NK aos próprios saudáveis.
[0278] PBMCs foram isoladas de sangue total por centrifugação por gradiente de densidade. Quaisquer células sanguíneas vermelhas contaminantes foram lisadas por incubação em tampão de lise ACK. PBMCs foram lavadas 3x em PBS, e PBMCs totais foram contadas. PBMCs foram ajustadas até 106/mL em meio de cultura de célula primária. Um mL de PBMCs foi semeado em poços de uma placa de 24 poços, os TriNKETs ou mAbs indicados foram adicionados às culturas de PBMC a 10 pg/mL. As células foram cultivadas de um dia para o outro a 37°C com CO2 5%. No dia seguinte (24 horas mais tarde), as PBMCs foram coletadas da cultura e preparadas para análise por FACS. A percentagem de células B CD45+; CD19+ e células mielóides CD45+; CD33+; CDllb+ foi analisada nos diferentes grupos de tratamento.
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 118/175
112/120 [0279] As FIGs. 54B e 54D mostram que células mielóides autólogas são protegidas de respostas de células NK mediadas por TriNKET. As FIGs. 54A e 54B mostram que células B de um doador saudável são sensíveis à lise mediada por TriNKET, enquanto células mielóides são resistentes à lise por TriNKET. PBMCs tratadas com TriNKETs que visam CD20 mostraram frequência reduzida de células B CD19+ com a população de linfócitos CD45+ (FIG. 54A), mas sem efeito na população de linfócitos CD45 + , CDD3-, CD56- (FIG. 54C) . Nessas culturas, a frequência de células mielóides CD45+, CD19+ (FIG. 54B), ou a frequência de células mielóides CD33+, CD 33+, CDllb+ (FIG. 54D) não foram alteradas.
TriNKETs medeiam morte por hPBMC de células tumorais SkBr-3 em coculturas de longo prazo
Ensaio de citotoxicidade de PBMCs humanas primárias [0280] A FIG. 55 mostra morte de longo prazo de células SkBr-3 em cultura com PBMCs humanas. Quando cultivadas isoladamente, células SkBr-3 proliferam e quase dobram em 60 horas. Quando PBMCs humanas são adicionadas às células SkBr-3 em cultura, a taxa de proliferação fica mais lenta, e quando um controle de TriNKET de isótipo que visa CD33 é adicionado, a proliferação também fica mais lenta, mas em um grau menor. Quando as culturas são tratadas com Trastuzumab, SkBr-3 não prolifera mais e, após 60 horas, só restam 80% das células desde o tempo zero. Como as células SkBr-3 são sensíveis ao bloqueio de sinal de HER2, o efeito sobre o crescimento de células SkBr-3 podería ser mediado por bloqueio de sinal de HER2 ou por meio de funções efetoras de Fc como, por exemplo, ADCC.
Exemplo 15
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 119/175
113/120
Eficácia antitumoral de mcFAE-C26.99 TriNKETs in vitro [0281] Para verificar as atividades de ligação do CFAE-C26.99 TriNKET murideo, a ligação direta foi medida em comparação com seus anticorpos monoclonais por ensaios de citometria de fluxo contra células de melanoma B16F10 Tyrp1-positivas (FIG. 58A) e a linhagem EL4 que superexpressa NKG2D murideo (EL4-mNKG2D, FIG. 58B).
[0282] Para testar se mcFAE-C26.99 TriNKETs retinham a habilidade para mediar citotoxicidade, a morte de alvos tumorais B16F10 Tyrp-l-positivos por células NK murídeas ativadas por IL-2 foi medida. Como mostrado na FIG. 59, células NK murídeas aumentaram sua atividade citotóxica na presença de mcFAE-C26.99. Notavelmente, o anticorpo monoclonal anti-Tyrp-1 TA99 só exibiu efeitos marginais.
Citotoxicidade aumentada de NK mediada por mcFAE-C26.99 TriNKET [0283] Cerca de 5 x 103 células de melanoma B16F10 por poço foram semeadas dois dias antes do ensaio. No dia do experimento, 5xl04 células NK murídeas ativadas por IL-2 foram adicionadas na presença de mab TA99 ou mcFAE-C26.99 TriNKET (mcFAE-C26.99 é um heterodímero de mC26 e TA99 com IgG2c de camundongo como o Fc. Mutações Gm se referem às mutações de heterodimerização usadas para gerar heterodímero). 20 pg/mL de anticorpos com diluições de quatro vezes foram usados. Após 4 horas de cocultura, a percentagem de citotoxicidade foi avaliada usando o kit CytoTox96 para liberação de LDH. A linha pontilhada representa citotoxicidade basal na ausência de anticorpos.
mC26_hvL_mCL (seção em negrito) (aminoácidos sublinhados em itálico são as mutações de heterodimerização usadas para
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 120/175
114/120 gerar heterodímero):
DIQMTQSP STLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVP SRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYGSFPITFGGGTKVEIKRADAAPTVSIF
PPSSEQLTSGGASWCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSS TLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (ID. DE SEQ. N° : 86) mC2 6_hvH_IgG2CGmB
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNY NPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLS SVTAAD TAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVS SA
KTTAPSVYPLAPVCGGTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPALLQSG LYTLSSSVTVTSNTWPSQTITCNVAHPASSTKVDKKIEPRVPITQNPCPPLKECPPCAA PDLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPMVTCVWDVSEDDPDVQI SWFVNNVEVHTAQTQ THREDYNSTLRWSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNRALP SPIEKTISKPRGPVRAPQVY VLPPPAEEMTKKEFSLTCMIKGFLPAEIAVDWTSNGRTEQNYKNTATVLDSDGSYFMYS RLRVQKSTWERGSLFACSWHEGLHNHLTTKTISRSLGK (ID. DE SEQ. N° : 87)
TA9 9_mvL_mCL
DIQMSQSPASLSASVGETVTITCRASGNIYNYLAWYQQKQGKSPHLLVYDAKTLADGVP SRFSGSGSGTQYSLKISSLQTEDSGNYYCQHFWSLPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIF
PPSSEQLTSGGASWCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSS TLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (ID. DE SEQ. N°: 88) TA9 9_mvH_IgG2C fflnA evqlqqsgaelvrp galvkl s ckt sgfnikdyflhwvrqrpdqglewigwinpdngntv YDPKFQGTASLTADTSSNTVYLQLSGLTSEDTAVYFCTRRDYTYEKAALDYWGQGASVI
VSSAKTTAPSVYPLAPVCGGTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAL LQSGLYTLSSSVTVTSNTWPSQTITCNVAHPASSTKVDKKIEPRVPITQNPCPPLKECP PCAAPDLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPMVTCVWDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHT AQTQTHREDYNSTLRWSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNRALP SPIEKTISKPRGPVRA PQVYVLPPPAEEMTKKEFSLTCMITGFLPAEIAVDWTSNGRTEQNYKNTATVLDSDGSY LMYSKLTVQKSTWERGSLFACSWHEGLHNHLTTKTISRSLGK (ID. DE SEQ. N° :
89)
Exemplo 16
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 121/175
115/120
Eficácia antitumoral de mcFAE-C26.99 TriNKETs in vivo [0284] Para testar se mcFAE-C26.99 provoca funções antitumorais in vivo, camundongos C57BL/6 foram injetados por via subcutânea com 2xl05 células tumorais B16F10. Os camundongos foram tratados com o controle de isótipo, anticorpo monoclonal TA99 ou com o mcFAE-C26.99 TriNKET. O tratamento com o anticorpo monoclonal TA99 mostrou progressão tumoral similar como no grupo de controle tratado com o isótipo. No entanto, a administração do mcFAE-C26.99 TriNKET resultou em progressão tumoral retardada, comparado com o grupo tratado com isótipo. Cerca de 2xl05 células de melanoma B16F10 foram injetadas por via subcutânea no flanco de camundongos C57BL/6. No Dia 6 após inoculação do tumor, os camundongos foram randomizados (n = 10 por grupo) . Os camundongos foram tratados por via intraperitoneal com (FIG. 60A) mab IgG2a de camundongo de controle de isótipo Cl.18.4 e anticorpo monoclonal anti-Tyrp-1 de camundongo ou (FIG. 60B) mab IgG2a de camundongo de controle de isótipo Cl. 18.4 e mcFAE-C2 6.99 TriNKET, injetados em uma dose de 150 pg (dias 6, 8, 10, 12, 14, 16 e 21) . O crescimento tumoral foi avaliado por 28 dias. Os gráficos mostram curvas de crescimento tumoral de camundongos individuais.
[0285] Além do modelo de tumor B16F10 subcutâneo, o mcFAE-C26.99 TriNKET também foi testado quanto à sua eficácia tumoral em um quadro de tumor disseminado. lxlO5 células B16F10 foram injetadas por via intravenosa nos camundongos. O tratamento começou no dia 4 ou dia 7 com uma dose de anticorpo baixa (300 pg/injeção) e alta (600 pg/injeção). No dia 18 após inoculação do tumor, as metástases pulmonares foram contadas. O tratamento que começou no dia 4 e 7 após
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 122/175
116/120 inoculação do tumor resultou em números reduzidos de metástases pulmonares quando anticorpo monoclonal TA99 ou mcFAE-C26.99 TriNKET foi usado em concentração alta, comparado com o grupo tratado com isótipo de controle. Nas concentrações baixas, somente mcFAE-C26.99 TriNKET diminuiu a carga tumoral (FIG. 61A). Efeitos similares foram observados quando anticorpos foram administrados começando no dia 7 após inoculação do tumor. No geral, a terapia com mcFAE-C26.99 TriNKET resultou em números menores de metástases pulmonares, comparado com o anticorpo monoclonal TA99 em todas as condições testadas. Cerca de lxlO5 células de melanoma B16F10 foram injetadas por via intravenosa na veia da cauda de camundongos C57BL/6 (n = 8 por grupo). Os camundongos foram deixados não tratados ou tratados por via intraperitoneal com mab de controle (isótipo, clone Cl. 18.4), anticorpo monoclonal TA99 ou TA99 TriNKET (mcFAEC26.99). A FIG. 61A representa a carga tumoral quando anticorpos foram administrados em uma dose de 150 pg (dias 4, 6, 8, 11, 13, 15). A FIG. 61B representa a carga tumoral quando anticorpos foram administrados em uma dose de 150 pg (dias 7, 9, 11, 13, 15). Dezoito dias após ataque do tumor, os camundongos foram sacrificados e as metástases pulmonares da superfície foram pontuadas (FIG. 61B).
Exemplo 17
Atividade citotóxica de células NK humanas em repouso mediada por TriNKETs, anticorpos monoclonais ou anticorpos biespecificos contra células HER2-positivas [0286] PBMCs foram isoladas de camadas leucoplaquetárias do sangue periférico humano usando centrifugação por gradiente de densidade. PBMCs isoladas
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 123/175
117/120 foram lavadas e preparadas para isolamento de células NK. Células NK foram isoladas usando uma técnica de seleção negativa com glóbulos magnéticos; a pureza das células NK isoladas foi tipicamente >90% CD3-CD56+. Células NK isoladas foram cultivadas em meio contendo 100 ng/mL de IL-2 ou descansaram de um dia para o outro sem citocina. Células NK ativadas por IL-2 ou em repouso foram usadas no dia seguinte em ensaios de citotoxicidade.
[0287] Ensaio de citotoxicidade DELFIA:
[0288] Linhagens de células de câncer humano que expressam um alvo de interesse foram coletadas da cultura, as células foram lavadas com HBS, e foram ressuspensas em meio de crescimento a 106/mL para marcação com reagente BATDA (Perkin Elmer AD0116). As instruções do fabricante foram seguidas para marcação das células-alvo. Após marcação, as células foram lavadas 3x com HBS, e foram ressuspensas a 0,5-1,0xl05/mL em meio de cultura. Para preparar os poços de base, uma alíquota das células marcadas foi colocada de lado, e as células foram centrifugadas para fora do meio. Cem μΐ do meio foram cuidadosamente adicionados aos poços em triplicata para evitar perturbação das células peletizadas. Cem μΐ de células marcadas com BATDA foram adicionados a cada poço da placa de 96 poços. Os poços foram salvos para liberação espontânea por células-alvo, e poços foram preparados para lise máxima de células-alvo por adição de Triton-X 1%. Anticorpos monoclonais ou TriNKETs contra o alvo tumoral de interesse foram diluídos em meio de cultura e 50 μΐ de mAb ou TriNKET diluído foram adicionados a cada poço. Células NK em repouso e/ou ativadas foram coletadas da cultura, as células foram lavadas e foram ressuspensas a 105
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 124/175
118/120
2,0xl06/mL em meio de cultura, dependendo da proporção E:T desejada. Cinquenta μΐ de células NK foram adicionados a cada poço da placa para fazer um total de 200 μΐ de volume de cultura. A placa foi incubada a 37°C com CO2 5% por 2-3 horas antes do desenvolvimento do ensaio.
[0289] Após cultivo por 2-3 horas, a placa foi removida da incubadora e as células foram peletizadas por centrifugação a 200g por 5 minutos. Vinte μΐ de sobrenadante da cultura foram transferidos para uma microplaca limpa fornecida pelo fabricante e 200 μΐ de solução de európio em temperatura ambiente foram adicionados a cada poço. A placa foi protegida da luz e incubada em uma agitadora de placas a 250 rpm por 15 minutos. A placa foi lida usando instrumentos Victor 3 ou SpectraMax i3X. O % de lise especifica foi calculado da seguinte forma: % de lise especifica = ((Liberação experimental - Liberação espontânea) / (Liberação máxima - Liberação espontânea)) * 100% .
Combinação de anticorpo monoclonal e engajador de célula NK biespecifica não recapitula atividade de TriNKET:
[0290] A FIG. 66 mostra a atividade citotóxica de células NK humanas em repouso mediada por TriNKETs, anticorpos monoclonais ou anticorpos biespecificos contra a linhagem de células Colo-201 HER2-positivas. Um TriNKET (ADI-29404 (F04)) que visa HER2 induziu lise máxima de células Colo-201 por células NK humanas em repouso. A mutação D265A foi introduzida no dominio CH2 do TriNKET para interromper a ligação ao FcR. O HER2-TriNKET (ADI-29404 (F04))-D265A não medeia a lise de células Colo-201, demonstrando a importância do direcionamento duplo de CD16
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 125/175
119/120 e NKG2D em células NK. Para demonstrar ainda mais a importância do direcionamento duplo em células NK, o anticorpo monoclonal Trastuzumab foi usado para visar HER2 e mediar ADCC por células NK, Trastuzumab isoladamente foi capaz de aumentar a lise por células NK de células Colo-201, mas a lise máxima obtida por Trastuzumab isoladamente foi cerca de 4x menor, comparada com o TriNKET. Para compreender a importância de ter o direcionamento a CD16 e NKG2D na mesma molécula, a atividade de TriNKET (ADI-29404 (F04)) foi comparada com a atividade de um anticorpo biespecifico que visa HER2 e NKG2D combinado com Trastuzumab. Quando usada em concentrações eqüimolares, a combinação de biespecifico e Trastuzumab não foi capaz de mediar lise máxima de células Colo-201 por células NK humanas em repouso. A incapacidade da combinação de Trastuzumab + biespecifico demonstra a importância de conter a ligação triespecifica de TriNKETs em uma molécula.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA [0291] A revelação completa de cada um dos documentos de patente e artigos científicos citados nesse relatório descritivo é incorporada por referência para todas as finalidades.
EQUIVALENTES [0292] A invenção pode ser exemplificada em outras formas específicas, sem se afastar do espírito ou suas características essenciais. As modalidades apresentadas anteriormente, portanto, devem ser consideradas em todos os aspectos ilustrativas, e não limitantes, da invenção descrita nesse relatório descritivo. O escopo da invenção, dessa forma, é indicado pelas reivindicações em anexo, e não
Petição 870190107547, de 23/10/2019, pág. 126/175
120/120 pela descrição apresentada anteriormente, e todas as alterações englobadas pelo significado e amplitude de equivalência das reivindicações visam ser por elas englobadas.

Claims (24)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Proteína, caracterizada por compreender:
    (a) um primeiro sítio de ligação ao antigeno que se liga a NKG2D;
    (b) um segundo sítio de ligação ao antigeno que se liga a um antigeno tumor-associado; e (c) um domínio Fc de anticorpo ou uma porção deste suficiente para se ligar a CD16, ou um terceiro sítio de ligação ao antigeno que se liga a CDI6.
  2. 2. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antigeno se liga a NKG2D em humanos, primatas não humanos e roedores.
  3. 3. Proteína, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antigeno compreende um domínio variável da cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve.
  4. 4. Proteína, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o domínio variável da cadeia pesada e o domínio variável da cadeia leve estão presentes no mesmo polipeptídeo.
  5. 5. Proteína, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antigeno também compreende um domínio variável da cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve.
  6. 6. Proteína, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o domínio variável da cadeia leve do primeiro sítio de ligação ao antigeno possui uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia leve do segundo sítio de
    Petição 870190075975, de 07/08/2019, pág. 23/29
    2/5 ligação ao antigeno.
  7. 7. Proteina, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o primeiro sitio de ligação ao antigeno é um anticorpo de dominio-único.
  8. 8. Proteina, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o anticorpo de dominio-único é um fragmento VhH ou um fragmento Vnar.
  9. 9. Proteina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou 7 a 8, caracterizada pelo fato de que o segundo sitio de ligação ao antigeno é um anticorpo de dominio-único.
  10. 10. Proteína, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antigeno é um fragmento VhH ou um fragmento Vnar.
  11. 11. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, 2, 7 ou 8, caracterizada pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antigeno compreende um domínio variável da cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve.
  12. 12. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antigeno compreende um domínio variável da cadeia pesada pelo menos 90% idêntico ao ID. DE SEQ. N°: 1.
  13. 13. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antigeno compreende um domínio variável da cadeia pesada pelo menos 90% idêntico ao ID. DE SEQ. N°: 41 e um domínio variável da cadeia leve pelo menos 90% idêntico ao ID. DE SEQ. N°: 42.
  14. 14. Proteína, de acordo com qualquer uma das
    Petição 870190075975, de 07/08/2019, pág. 24/29
    3/5 reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que o primeiro sitio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada pelo menos 90% idêntico ao ID. DE SEQ. N°: 43 e um domínio variável da cadeia leve pelo menos 90% idêntico ao ID. DE SEQ. N° : 44.
  15. 15. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada pelo menos 90% idêntico ao ID. DE SEQ. N°: 69 e um domínio variável da cadeia leve pelo menos 90% idêntico ao ID. DE SEQ. N° : 70.
  16. 16. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada pelo menos 90% idêntico ao ID. DE SEQ. N°: 71 e um domínio variável da cadeia leve pelo menos 90% idêntico ao ID. DE SEQ. N° : 72.
  17. 17. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o antígeno tumor-associado é selecionado do grupo que consiste em HER2, CD20, CD33, BCMA, EpCAM, CD2, CD19, CD30, CD38, CD40, CD52, CD70, EGFR/ERBB1, IGF1R, HER3/ERBB3, HER4/ERBB4, MUC1, cMET, SLAMF7, PSCA, MICA, MICB, TRAILR1, TRAILR2, MAGE-A3, B7.1, B7.2, CTLA4 e PD1.
  18. 18. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a proteína compreende uma porção de um domínio Fc de anticorpo suficiente para se ligar a CD16, em que o domínio Fc de anticorpo compreende domínios de dobradiça e CH2.
  19. 19. Proteína, de acordo com qualquer uma das
    Petição 870190075975, de 07/08/2019, pág. 25/29
    4/5 reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo fato de que a proteína compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica aos aminoácidos 234-332 de um anticorpo IgGl humano.
  20. 20. Formulação caracterizada por compreender uma proteína, conforme definida em qualquer uma das reivindicações precedentes, e um carreador farmaceuticamente aceitável.
  21. 21. Célula caracterizada por compreender um ou mais ácidos nucléicos que codificam uma proteína, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 19.
  22. 22. Método de aumento da morte de células tumorais diretamente ou indiretamente, o método caracterizado por compreender a exposição de um tumor e células natural killer a uma proteína, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 19.
  23. 23. Método de tratamento de câncer, caracterizado pelo fato de que o método compreende a administração de uma proteína, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 19, ou uma formulação, conforme definida na reivindicação 20, a um paciente.
  24. 24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo que consiste em leucemia mielóide aguda, leucemia mielomonocítica aguda, linfoma de célula B, câncer da bexiga, câncer de mama, câncer cólon-retal, linfoma de célula B grande difuso, câncer esofágico, sarcoma de Ewing, linfoma folicular, câncer gástrico, câncer gastrintestinal, tumores estromais gastrintestinais, glioblastoma, câncer da cabeça e pescoço, melanoma, mesotelioma, mieloma múltiplo, síndrome
    Petição 870190075975, de 07/08/2019, pág. 26/29
    5/5 mielodisplásica, carcinoma de célula renal, neuroblastoma, câncer de pulmão de célula não pequena, tumores neuroendócrinos, câncer ovariano e câncer pancreático, câncer de próstata, sarcomas, câncer de pulmão de pequena célula, linfoma de célula T, câncer do testículo, carcinoma tímico, câncer da tireóide, câncer urotelial, cânceres infiltrados por células supressoras de derivação mielóide, cânceres com deposição da matriz extracelular, cânceres com níveis elevados de estroma reativo, e cânceres com neoangiogênese.
BR112019016315-8A 2017-02-08 2018-02-08 Proteínas de ligação multiespecíficas para ativação de células natural killer e usos terapêuticos destas para tratamento de câncer BR112019016315A2 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762456535P 2017-02-08 2017-02-08
US62/456,535 2017-02-08
PCT/US2018/017470 WO2018148445A1 (en) 2017-02-08 2018-02-08 Multi-specific binding proteins for activation of natural killer cells and therapeutic uses thereof to treat cancer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112019016315A2 true BR112019016315A2 (pt) 2020-03-31

Family

ID=63107062

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112019016315-8A BR112019016315A2 (pt) 2017-02-08 2018-02-08 Proteínas de ligação multiespecíficas para ativação de células natural killer e usos terapêuticos destas para tratamento de câncer

Country Status (12)

Country Link
US (1) US11834506B2 (pt)
EP (1) EP3579848A4 (pt)
JP (2) JP2020506971A (pt)
KR (2) KR20190118172A (pt)
CN (1) CN110944651A (pt)
AU (1) AU2018219887A1 (pt)
BR (1) BR112019016315A2 (pt)
CA (2) CA3053010A1 (pt)
IL (1) IL268554A (pt)
MX (1) MX2019009468A (pt)
SG (1) SG11201907299XA (pt)
WO (1) WO2018148445A1 (pt)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110944651A (zh) 2017-02-08 2020-03-31 蜻蜓疗法股份有限公司 用于自然杀伤细胞激活的多特异性结合蛋白及其治疗癌症的治疗性用途
AU2018219348A1 (en) * 2017-02-10 2019-08-29 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding BCMA, NKG2D and CD16
CA3054079A1 (en) 2017-02-20 2018-08-23 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding her2, nkg2d and cd16
RU2019129174A (ru) * 2017-02-20 2021-03-22 Драгонфлай Терапьютикс, Инк. Белки, связывающие cd33, nkg2d и cd16
KR20190120783A (ko) * 2017-02-20 2019-10-24 드래곤플라이 쎄라퓨틱스, 인크. Gd2, nkg2d 및 cd16에 결합하는 단백질
CA3064714A1 (en) * 2017-05-23 2018-11-29 Dragonfly Therapeutics, Inc. A protein binding nkg2d, cd16 and a tumor-associated antigen
US20200157226A1 (en) * 2017-05-23 2020-05-21 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding nkg2d, cd16 and a tumor-associated antigen
PE20220278A1 (es) 2018-02-08 2022-02-25 Dragonfly Therapeutics Inc Dominios variables de anticuerpos que se dirigen al receptor nkg2d
AU2019218125A1 (en) * 2018-02-08 2020-08-20 Dragonfly Therapeutics, Inc. Combination therapy of cancer involving multi-specific binding proteins that activate natural killer cells
US20210101976A1 (en) * 2018-02-20 2021-04-08 Dragonfly Therapeutics, Inc. Multi-specific binding proteins that bind cd33, nkg2d, and cd16, and methods of use
EA202091977A1 (ru) * 2018-05-28 2021-02-09 Драгонфлай Терапьютикс, Инк. Мультиспецифические связывающие белки, которые связывают cd33, nkg2d и cd16, и способы применения
SG11202108878VA (en) * 2019-02-18 2021-09-29 Courier Therapeutics Inc BISPECIFIC FUSION PROTEIN USING ORTHOPOXVIRUS MAJOR HISTOCOMPATIBILITY COMPLEX (MHC) CLASS l-LIKE PROTEIN (OMCP) AND TUMOR-SPECIFIC BINDING PARTNER
AR119393A1 (es) 2019-07-15 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a nkg2d
CN115803037A (zh) 2020-06-30 2023-03-14 盖亚生物制药有限公司 稳定nk细胞与抗体的结合的方法及其应用
AU2021320311A1 (en) 2020-08-05 2023-03-02 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding NKG2D, CD16 and EGFR
WO2022148853A1 (en) 2021-01-11 2022-07-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Immunoconjugates
WO2023107956A1 (en) 2021-12-08 2023-06-15 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding nkg2d, cd16 and 5t4
CN116948029A (zh) * 2022-04-20 2023-10-27 南京融捷康生物科技有限公司 一种包含IgG类Fc区变体的抗体及其用途
CN115058393A (zh) * 2022-07-13 2022-09-16 北京鼎成肽源生物技术有限公司 一种包被刺激物、培养试剂盒和自然杀伤细胞的培养方法
US20240124607A1 (en) 2022-08-10 2024-04-18 Merck Sharp & Dohme Llc Proteins binding nkg2d, cd16, and ceacam5
WO2024056862A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 Avidicure Ip B.V. Multispecific antigen binding proteins for tumor-targeting of nk cells and use thereof

Family Cites Families (276)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1988008854A1 (en) 1987-05-06 1988-11-17 Egbert Oosterwijk Monoclonal antibodies to renal cell carcinoma
WO1989006544A1 (en) 1988-01-15 1989-07-27 Centocor, Inc. Heteroligating antibodies and therapeutic uses thereof
ATE239506T1 (de) 1992-03-05 2003-05-15 Univ Texas Verwendung von immunokonjugate zur diagnose und/oder therapie der vaskularisierten tumoren
US5776427A (en) 1992-03-05 1998-07-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for targeting the vasculature of solid tumors
US6036955A (en) 1992-03-05 2000-03-14 The Scripps Research Institute Kits and methods for the specific coagulation of vasculature
US5965132A (en) 1992-03-05 1999-10-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors
US7381803B1 (en) 1992-03-27 2008-06-03 Pdl Biopharma, Inc. Humanized antibodies against CD3
US6129914A (en) 1992-03-27 2000-10-10 Protein Design Labs, Inc. Bispecific antibody effective to treat B-cell lymphoma and cell line
US5622701A (en) 1994-06-14 1997-04-22 Protein Design Labs, Inc. Cross-reacting monoclonal antibodies specific for E- and P-selectin
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
DE69636015T2 (de) 1995-05-03 2007-01-04 Bioenhancementsments Ltd. Bispezifische antikörper in denen die bindungsfähigkeit durch eine mittels licht spaltbare gruppe reversibel inhibiert wird
DE19531346A1 (de) 1995-08-25 1997-02-27 Gsf Forschungszentrum Umwelt Arzneimittel zur Immuntherapie, enthaltend Antikörper, die spezifisch das MHCII-Antigen eines zu behandelnden Patienten erkennen
US7951917B1 (en) 1997-05-02 2011-05-31 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
JP4169478B2 (ja) 1998-04-21 2008-10-22 マイクロメット アーゲー Ｃｄ１９×ｃｄ３特異的ポリペプチドおよびその使用
US6572856B1 (en) 1998-09-10 2003-06-03 The University Of Virginia Patent Foundation Methods for the prevention and treatment of cancer using anti-C3b(i) antibodies
JP4467188B2 (ja) 1998-10-21 2010-05-26 アルター・バイオサイエンス・コーポレーション 多重特異的結合分子とその使用
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
WO2001071005A2 (en) * 2000-03-24 2001-09-27 Micromet Ag Multifunctional polypeptides comprising a binding site to an epitope of the nkg2d receptor complex
US20020103345A1 (en) 2000-05-24 2002-08-01 Zhenping Zhu Bispecific immunoglobulin-like antigen binding proteins and method of production
US20040115198A1 (en) 2001-02-28 2004-06-17 Fred Hutchinson Cancer Research Center Activation of lymphocyte populations expressing NKG2D using anti-NKG2D antibodies and ligand derivatives
US20020193569A1 (en) 2001-06-04 2002-12-19 Idec Pharmaceuticals Corporation Bispecific fusion protein and method of use for enhancing effector cell killing of target cells
DE10156482A1 (de) 2001-11-12 2003-05-28 Gundram Jung Bispezifisches Antikörper-Molekül
RU2339647C2 (ru) 2002-08-19 2008-11-27 Астразенека Аб Антитела против моноцитарного хемоаттрактантного белка-1 (мср-1) и их применение
US7820166B2 (en) 2002-10-11 2010-10-26 Micromet Ag Potent T cell modulating molecules
DE10261223A1 (de) 2002-12-20 2004-07-08 MedInnova Gesellschaft für medizinische Innovationen aus akademischer Forschung mbH Steigerung der Immunantwort durch Substanzen, welche die Funktion von Natürlichen Killerzellen beeinflussen
BRPI0407293A (pt) 2003-02-06 2006-02-07 Micromet Ag Resposta duradoura da célula t
US7666417B2 (en) 2003-04-22 2010-02-23 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods and compositions for treating autoimmune diseases or conditions
JP2008501621A (ja) 2003-05-31 2008-01-24 マイクロメット アクツィエン ゲゼルシャフト Ｂ細胞関連疾患を処置するための二重特異性抗ｃｄ３、抗ｃｄ１９抗体構築物を含む薬学的組成物
DE602004025101D1 (de) 2003-05-31 2010-03-04 Micromet Ag Humane anti-humane cd3-bindungsmoleküle
ES2619171T3 (es) 2003-07-24 2017-06-23 Innate Pharma S.A. Métodos y composiciones para aumentar la eficacia de anticuerpos terapéuticos utilizando compuestos para la potenciación de linfocitos NK
HN2004000285A (es) 2003-08-04 2006-04-27 Pfizer Prod Inc ANTICUERPOS DIRIGIDOS A c-MET
DK1673398T3 (da) 2003-10-16 2011-04-18 Micromet Ag Multispecifikke, deimmuniserede CD3-bindere
US7235641B2 (en) 2003-12-22 2007-06-26 Micromet Ag Bispecific antibodies
US20110020273A1 (en) 2005-04-06 2011-01-27 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Bispecific Immunocytokine Dock-and-Lock (DNL) Complexes and Therapeutic Use Thereof
MXPA06009253A (es) 2004-02-16 2007-04-18 Micromet Ag Moleculas de enlace menos inmunogenicas.
MX2007000387A (es) 2004-07-16 2007-03-28 Micromet Ag Polipeptidos de expresion mejorada.
US7560111B2 (en) 2004-07-22 2009-07-14 Genentech, Inc. HER2 antibody composition
JP2008514685A (ja) 2004-10-01 2008-05-08 メディジーン リミテッド 治療剤に連結した、非天然型ジスルフィド鎖間結合を含有するｔ細胞レセプター
DOP2006000029A (es) 2005-02-07 2006-08-15 Genentech Inc Antibody variants and uses thereof. (variantes de un anticuerpo y usos de las mismas)
CA2605024C (en) 2005-04-15 2018-05-22 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US9284375B2 (en) 2005-04-15 2016-03-15 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
JP2009500346A (ja) 2005-06-29 2009-01-08 ユニバーシティー・オブ・マイアミ 癌処置用の抗体−免疫細胞リガンド融合タンパク質
JP2009504787A (ja) 2005-08-19 2009-02-05 シーラス コーポレイション 抗体によって媒介される免疫応答の増強
PE20071101A1 (es) 2005-08-31 2007-12-21 Amgen Inc Polipeptidos y anticuerpos
CA2625440C (en) 2005-10-11 2023-06-13 Micromet Ag Compositions comprising cross-species-specific antibodies and uses thereof
AU2006301163B2 (en) 2005-10-14 2012-02-23 Innate Pharma Compositions and methods for treating proliferative disorders
JP2009513608A (ja) 2005-10-28 2009-04-02 ノボ・ノルデイスク・エー／エス エフェクターリンパ球と標的細胞とを結合する融合タンパク質
EP1945674A2 (en) 2005-11-03 2008-07-23 Genentech, Inc. Therapeutic anti-her2 antibody fusion polypeptides
JP2009514528A (ja) 2005-11-03 2009-04-09 フレッド ハッチンソン キャンサー リサーチ センター Ｎｋｇ２ｄ陽性ｃｄ４＋細胞による免疫応答の負の免疫調節法
DK1976886T3 (en) 2005-12-16 2015-03-02 Amgen Res Munich Gmbh Means and methods for the treatment of tumor diseases
EP1820513A1 (en) 2006-02-15 2007-08-22 Trion Pharma Gmbh Destruction of tumor cells expressing low to medium levels of tumor associated target antigens by trifunctional bispecific antibodies
MX363905B (es) 2006-06-12 2019-04-08 Aptevo Res & Development Llc Proteinas de union multivalentes monocatenarias con funcion efectora.
GB0614780D0 (en) 2006-07-25 2006-09-06 Ucb Sa Biological products
JP5161882B2 (ja) 2006-09-07 2013-03-13 クルセル ホランド ベー ヴェー インフルエンザウイルスｈ５ｎ１を中和しうるヒト結合性分子およびその使用
EP1900752A1 (en) 2006-09-15 2008-03-19 DOMPE' pha.r.ma s.p.a. Human anti-folate receptor alpha antibodies and antibody fragments for the radioimmunotherapy of ovarian carcinoma
NZ581395A (en) 2007-05-14 2012-08-31 Biogen Idec Inc Single-chain fc (scfc) regions, binding polypeptides comprising same, and methods related thereto
EP2014680A1 (en) 2007-07-10 2009-01-14 Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Recombinant, single-chain, trivalent tri-specific or bi-specific antibody derivatives
AU2008278803A1 (en) 2007-07-25 2009-01-29 Astrazeneca Ab Targeted binging agents directed to KDR and uses thereof - 035
CA2695374A1 (en) 2007-08-15 2009-02-19 Amunix, Inc. Compositions and methods for modifying properties of biologically active polypeptides
JOP20080381B1 (ar) 2007-08-23 2023-03-28 Amgen Inc بروتينات مرتبطة بمولدات مضادات تتفاعل مع بروبروتين كونفيرتاز سيتيليزين ككسين من النوع 9 (pcsk9)
BRPI0816785A2 (pt) 2007-09-14 2017-05-02 Adimab Inc bibliotecas de anticorpos sintéticos racionalmente desenhadas, e, usos para as mesmas
PL2222706T5 (pl) 2007-12-14 2017-09-29 Novo Nordisk As Przeciwciała przeciwko ludzkiemu NKG2D i ich zastosowania
WO2009089004A1 (en) 2008-01-07 2009-07-16 Amgen Inc. Method for making antibody fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
JP2011509687A (ja) 2008-01-22 2011-03-31 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド Ｒｏｎ抗体およびその使用
CA2725666A1 (en) 2008-06-03 2009-12-10 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US8067339B2 (en) 2008-07-09 2011-11-29 Merck Sharp & Dohme Corp. Surface display of whole antibodies in eukaryotes
US9273136B2 (en) 2008-08-04 2016-03-01 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Fully human anti-human NKG2D monoclonal antibodies
JP2012503490A (ja) 2008-09-26 2012-02-09 ワイス・エルエルシー 単鎖抗体ライブラリー設計
JP2012508017A (ja) 2008-11-07 2012-04-05 ファブラス エルエルシー 抗ｄｌｌ４抗体及びその使用
US10865233B2 (en) 2008-12-18 2020-12-15 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. NKG2D-fc for immunotherapy
CN106432503B (zh) 2008-12-19 2020-03-06 宏观基因有限公司 共价双抗体及其用途
EP2417159A1 (en) 2009-04-07 2012-02-15 Roche Glycart AG Bispecific anti-erbb-3/anti-c-met antibodies
WO2010132697A2 (en) 2009-05-13 2010-11-18 Genzyme Corporation Methods and compositions for treatment
US20130209514A1 (en) 2009-06-09 2013-08-15 Eli Gilboa Aptamer-targeted costimulatory ligand aptamer
US9050375B2 (en) 2009-07-06 2015-06-09 Hoffmann-La Roche, Inc. Bi-specific digoxigenin binding antibodies
UY32808A (es) 2009-07-29 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas como dominio variable dual y usos de las mismas
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
JP5792622B2 (ja) 2009-09-11 2015-10-14 タカラバイオ株式会社 ナチュラルキラー細胞の製造方法
CN107227335A (zh) 2009-10-27 2017-10-03 安进研发（慕尼黑）股份有限公司 用于施用CD19xCD3双特异性抗体的给药方案
US8999398B2 (en) 2009-11-06 2015-04-07 Transtarget Inc. Polyclonal bispecific antibody compositions and method of use
EP2332994A1 (en) 2009-12-09 2011-06-15 Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Trispecific therapeutics against acute myeloid leukaemia
AU2010330794A1 (en) 2009-12-18 2012-06-21 Amgen Inc. Wise binding agents and epitopes
US8796420B2 (en) 2009-12-31 2014-08-05 Avidbiotics Corp. Non-natural MIC proteins
US8658765B2 (en) 2009-12-31 2014-02-25 Avidbiotics Corp. Non-natural MIC proteins
US8802091B2 (en) 2010-03-04 2014-08-12 Macrogenics, Inc. Antibodies reactive with B7-H3 and uses thereof
CA2791658C (en) 2010-03-04 2019-10-01 Macrogenics, Inc. Antibodies reactive with b7-h3, immunologically active fragments thereof and uses thereof
TWI653333B (zh) 2010-04-01 2019-03-11 安進研究（慕尼黑）有限責任公司 跨物種專一性之ＰＳＭＡｘＣＤ３雙專一性單鏈抗體
SG184427A1 (en) 2010-04-20 2012-11-29 Genmab As Heterodimeric antibody fc-containing proteins and methods for production thereof
WO2011143545A1 (en) 2010-05-14 2011-11-17 Rinat Neuroscience Corporation Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
KR101834026B1 (ko) 2010-06-19 2018-03-02 메모리얼 슬로안-케터링 캔서 센터 항-ｇｄ2 항체
UY33492A (es) 2010-07-09 2012-01-31 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
DE102010039018B4 (de) 2010-08-06 2013-02-28 Technische Universität Dresden Anti-La Antikörper und ihre Anwendung zum Immunotargeting
WO2012020096A1 (en) 2010-08-13 2012-02-16 Medimmune Limited Monomeric polypeptides comprising variant fc regions and methods of use
CN103068846B9 (zh) 2010-08-24 2016-09-28 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 包含二硫键稳定性Fv片段的双特异性抗体
TWI560199B (en) 2010-08-31 2016-12-01 Sanofi Sa Peptide or peptide complex binding to α2 integrin and methods and uses involving the same
WO2012032080A1 (en) 2010-09-07 2012-03-15 F-Star Biotechnologische Forschungs- Und Entwicklungsges.M.B.H Stabilised human fc
RU2013115927A (ru) 2010-09-10 2014-10-20 Апексиджен, Инк. АНТИТЕЛА ПРОТИВ ИЛ-1β И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ
WO2012061558A2 (en) * 2010-11-04 2012-05-10 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
JP6167040B2 (ja) 2010-11-05 2017-07-19 ザイムワークス，インコーポレイテッド Ｆｃドメイン中に突然変異を有する、安定したヘテロ二量体抗体の設計
WO2012064792A2 (en) 2010-11-09 2012-05-18 Altimab Therapeutics, Inc. Protein complexes for antigen binding and methods of use
WO2012088290A2 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Abbott Laboratories Tri-variable domain binding proteins and uses thereof
KR102147548B1 (ko) 2011-02-25 2020-08-24 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 ＦｃγＲＩＩｂ 특이적 Ｆｃ 항체
ES2668895T3 (es) 2011-03-16 2018-05-23 Amgen Inc. Variantes de Fc
EA201791693A1 (ru) 2011-03-25 2018-05-31 Гленмарк Фармасьютикалс С.А. Гетеродимерные иммуноглобулины
WO2015070061A1 (en) 2013-11-07 2015-05-14 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Anti-wt1/hla bi-specific antibody
US8846042B2 (en) 2011-05-16 2014-09-30 Fabion Pharmaceuticals, Inc. Multi-specific FAB fusion proteins and methods of use
JP6145088B2 (ja) 2011-05-21 2017-06-07 マクロジェニクス，インコーポレーテッド 脱免疫化血清結合ドメイン及び血清半減期を延長するためのその使用
CN103857699B (zh) 2011-05-24 2016-08-31 泽恩格尼亚股份有限公司 多价和单价多特异性复合物及其用途
US8852599B2 (en) 2011-05-26 2014-10-07 Bristol-Myers Squibb Company Immunoconjugates, compositions for making them, and methods of making and use
WO2012175613A1 (en) 2011-06-21 2012-12-27 Innate Pharma NKp46-MEDIATED NK CELL TUNING
DE102011118022B4 (de) 2011-06-30 2018-01-18 Gemoab Monoclonals Gmbh Antikörper gegen das Prostata-spezifische Stammzellenantigen und dessen Verwendung
TWI687441B (zh) * 2011-06-30 2020-03-11 中外製藥股份有限公司 異源二聚化多胜肽
JP5938473B2 (ja) 2011-07-22 2016-06-22 アフィメート テラポイティクス アーゲー 多価抗原結合Ｆｖ分子
US10040853B2 (en) 2011-09-09 2018-08-07 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods and compositions involving NKG2D inhibitors and cancer
CA3186007A1 (en) 2011-09-30 2013-04-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Ion concentration-dependent binding molecule library
JP6322411B2 (ja) 2011-09-30 2018-05-09 中外製薬株式会社 複数の生理活性を有する抗原の消失を促進する抗原結合分子
LT2794658T (lt) 2011-12-19 2017-05-10 Synimmune Gmbh Bispecifinė antikūno molekulė
US10633451B2 (en) 2012-02-03 2020-04-28 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific antibody molecules with antigen-transfected T-cells and their use in medicine
CN104254544B (zh) 2012-02-08 2017-04-26 Igm生物科学有限公司 Cdim结合蛋白及其用途
GB201203442D0 (en) 2012-02-28 2012-04-11 Univ Birmingham Immunotherapeutic molecules and uses
US9029510B2 (en) 2012-03-30 2015-05-12 Sorrento Therapeutics, Inc. Fully human antibodies that bind to VEGFR2 and methods of use thereof
NZ630551A (en) 2012-04-20 2017-11-24 Merus Nv Methods and means for the production of ig-like molecules
US9163090B2 (en) 2012-05-07 2015-10-20 Cellerant Therapeutics, Inc. Antibodies specific for CLL-1
JPWO2013180200A1 (ja) 2012-05-30 2016-01-21 中外製薬株式会社 標的組織特異的抗原結合分子
JP6628966B2 (ja) 2012-06-14 2020-01-15 中外製薬株式会社 改変されたＦｃ領域を含む抗原結合分子
EP2863946A4 (en) * 2012-06-21 2016-04-13 Sorrento Therapeutics Inc ANTIGEN-BINDING PROTEINS THAT BIND TO C-MET
RU2639287C2 (ru) 2012-06-27 2017-12-20 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Способ отбора и получения высокоселективных и мультиспецифичных нацеливающих групп с заданными свойствами, включающих по меньшей мере две различные связывающие группировки, и их применения
US20140154253A1 (en) 2012-07-13 2014-06-05 Zymeworks Inc. Bispecific Asymmetric Heterodimers Comprising Anti-CD3 Constructs
US20140072581A1 (en) 2012-07-23 2014-03-13 Zymeworks Inc. Immunoglobulin Constructs Comprising Selective Pairing of the Light and Heavy Chains
WO2014022540A1 (en) 2012-08-02 2014-02-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
EP3586874A1 (en) 2012-08-14 2020-01-01 IBC Pharmaceuticals, Inc. T-cell redirecting bispecific antibodies for treatment of disease
NZ630563A (en) 2012-09-27 2017-04-28 Merus Nv Bispecific igg antibodies as t cell engagers
WO2014079000A1 (en) 2012-11-21 2014-05-30 Wuhan Yzy Biopharma Co., Ltd. Bispecific antibody
US9951145B2 (en) 2012-11-27 2018-04-24 Ajou University Industry—Academic Cooperation Foundation CH3 domain variant pair inducing formation of heterodimer of heavy chain constant region of antibody at high efficiency, method for preparing same, and use thereof
EA201500741A1 (ru) 2013-01-10 2016-01-29 Генмаб Б.В. ВАРИАНТЫ Fc-ОБЛАСТИ IGG1 ЧЕЛОВЕКА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
CN110981964B (zh) 2013-01-14 2023-09-15 Xencor股份有限公司 新型异二聚体蛋白
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
WO2014116846A2 (en) 2013-01-23 2014-07-31 Abbvie, Inc. Methods and compositions for modulating an immune response
PL2953972T3 (pl) 2013-02-05 2021-03-08 Engmab Sàrl Metoda wyboru przeciwciał przeciwko bcma
WO2014124326A1 (en) 2013-02-08 2014-08-14 Stem Centrx, Inc. Novel multispecific constructs
DK2961771T3 (da) 2013-02-26 2020-03-02 Roche Glycart Ag Bispecifikke, T-celle-aktiverende, antigenbindende molekyler, der er specifikke for CD3 og CEA
WO2014159940A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Macrogenics, Inc. Bispecific molecules that are immunoreactive with immune effector cells that express an activating receptor
EP3936521A1 (en) 2013-03-15 2022-01-12 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
EP2968545B1 (en) 2013-03-15 2019-03-06 Memorial Sloan Kettering Cancer Center High affinity anti-gd2 antibodies
WO2014165818A2 (en) 2013-04-05 2014-10-09 T Cell Therapeutics, Inc. Compositions and methods for preventing and treating prostate cancer
US10156574B2 (en) 2013-04-29 2018-12-18 Adimab, Llc Polyspecificity reagents, methods for their preparation and use
EP3415534A1 (en) 2013-05-10 2018-12-19 Numab Therapeutics AG Bispecific constructs and their use in the treatment of various diseases
US10174117B2 (en) * 2013-06-11 2019-01-08 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Anti-HER2 single domain antibodies, polypeptides comprising thereof and their use for treating cancer
TW201536810A (zh) 2013-07-15 2015-10-01 Novo Nordisk As 結合尿激酶纖維蛋白溶酶原活化物之抗體
PL3021869T3 (pl) 2013-07-16 2020-11-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Sposoby leczenia nowotworu z użyciem antagonistów wiązania osi PD-1 i inhibitorów TIGIT
WO2015013671A1 (en) 2013-07-25 2015-01-29 Cytomx Therapeutics, Inc. Multispecific antibodies, multispecific activatable antibodies and methods of using the same
JP6599338B2 (ja) 2013-09-16 2019-10-30 ヘルムホルツ・ツェントルム・ミュンヒェン・ドイチェス・フォルシュンクスツェントルム・フューア・ゲズントハイト・ウント・ウムベルト（ゲーエムベーハー） Ｈｂｖ感染および関連症状の治療のための免疫エフェクター細胞表面抗原およびｈｂｖ抗原結合性の二重特異性または多重特異性ポリペプチド
GB2518221A (en) 2013-09-16 2015-03-18 Sergej Michailovic Kiprijanov Tetravalent antigen-binding protein molecule
GB2519786A (en) 2013-10-30 2015-05-06 Sergej Michailovic Kiprijanov Multivalent antigen-binding protein molecules
DE102013019352A1 (de) 2013-11-13 2015-09-17 Elke Pogge Von Strandmann Tri-spezifische rekombinante Antikörperderivate zur Behandlung von malignen Erkrankungen durch Aktivierung einer NK-Zell-basierten Immunantwort
AU2014362238A1 (en) 2013-12-13 2016-06-09 Genentech, Inc. Anti-CD33 antibodies and immunoconjugates
WO2015095412A1 (en) 2013-12-19 2015-06-25 Zhong Wang Bispecific antibody with two single-domain antigen-binding fragments
CA2925677A1 (en) 2013-12-20 2015-06-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific her2 antibodies and methods of use
EP3083682B1 (en) 2013-12-20 2024-04-17 F. Hoffmann-La Roche AG Dual specific antibodies
SG11201605093VA (en) 2013-12-23 2016-07-28 Zymeworks Inc Antibodies comprising c-terminal light chain polypeptide extensions and conjugates and methods of use thereof
US10519251B2 (en) 2013-12-30 2019-12-31 Epimab Biotherapeutics, Inc. Fabs-in-tandem immunoglobulin and uses thereof
CN106062206A (zh) 2014-01-15 2016-10-26 酵活有限公司 双特异性cd3和cd19抗原结合构建体
PT3125934T (pt) 2014-03-05 2019-12-16 Ucl Business Plc Recetor de antigénio quimérico (car) com domínios de ligação a antigénio para a região constante beta do recetor de células t
CN106132439A (zh) 2014-03-31 2016-11-16 豪夫迈·罗氏有限公司 包含抗血管发生剂和ox40结合激动剂的组合疗法
US20170022291A1 (en) 2014-04-01 2017-01-26 Adimab, Llc Multispecific antibody analogs comprising a common light chain, and methods of their preparation and use
UA117289C2 (uk) 2014-04-02 2018-07-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Мультиспецифічне антитіло
DK3126383T3 (en) 2014-04-03 2019-04-01 Igm Biosciences Inc MODIFIED J-CHAIN
JP2017512765A (ja) 2014-04-11 2017-05-25 メディミューン，エルエルシー 二重特異性ｈｅｒ２抗体
EP2930188A1 (en) 2014-04-13 2015-10-14 Affimed Therapeutics AG Trifunctional antigen-binding molecule
EP2942629A1 (en) 2014-05-08 2015-11-11 Universität Würzburg Predictive markers for successful cancer immunotherapy
GB201409558D0 (en) 2014-05-29 2014-07-16 Ucb Biopharma Sprl Method
EP3148580B1 (en) 2014-05-29 2021-01-20 MacroGenics, Inc. Tri-specific binding molecules that specifically bind to multiple cancer antigens and methods of use thereof
CA2952727A1 (en) 2014-06-27 2015-12-30 Innate Pharma Multispecific nkp46 binding proteins
WO2015197582A1 (en) 2014-06-27 2015-12-30 Innate Pharma Monomeric multispecific antigen binding proteins
JP6702893B2 (ja) 2014-06-27 2020-06-03 イナート・ファルマ・ソシエテ・アノニムＩｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａ Ｐｈａｒｍａ Ｓ．Ａ． 多重特異的抗原結合タンパク質
BR112016030740A2 (pt) 2014-07-01 2018-02-20 Pfizer Inc. diacorpos heterodiméricos biespecíficos e seus usos
US9777073B2 (en) 2014-07-21 2017-10-03 Wuhan Yzy Biopharma Co., Ltd. Construction and application of bispecific antibody EpCAM×CD3
CN106999556B (zh) 2014-07-21 2021-07-30 武汉友芝友生物制药有限公司 细胞因子诱导的杀伤细胞的双特异性抗体介导的癌症治疗
US9777061B2 (en) 2014-07-21 2017-10-03 Novartis Ag Treatment of cancer using a CD33 chimeric antigen receptor
AU2015301460B2 (en) 2014-08-14 2021-04-08 Novartis Ag Treatment of cancer using GFR alpha-4 chimeric antigen receptor
EP2985294A1 (en) 2014-08-14 2016-02-17 Deutsches Krebsforschungszentrum Recombinant antibody molecule and its use for target cell restricted T cell activation
JO3663B1 (ar) 2014-08-19 2020-08-27 Merck Sharp & Dohme الأجسام المضادة لمضاد lag3 وأجزاء ربط الأنتيجين
WO2016032334A1 (en) 2014-08-28 2016-03-03 Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Lumc Cd94/nkg2a and/or cd94/nkg2b antibody, vaccine combinations
ES2688035T3 (es) 2014-08-29 2018-10-30 Gemoab Monoclonals Gmbh Receptor de antígeno universal que expresa células inmunes para direccionamiento de antígenos múltiples diversos, procedimiento para fabricación del mismo y utilización del mismo para tratamiento de cáncer, infecciones y enfermedades autoinmunes
CA2966397A1 (en) 2014-11-03 2016-05-12 Merck Patent Gmbh Methods for generating bispecific shark variable antibody domains and use thereof
ES2764111T3 (es) 2014-12-03 2020-06-02 Hoffmann La Roche Anticuerpos multiespecíficos
DK3227311T3 (da) 2014-12-05 2022-03-07 Xyphos Biosciences Inc Indsættelige, variable fragmenter af antistoffer og modificerede A1- A2-domæner af NKG2D-ligander
US20160176983A1 (en) 2014-12-17 2016-06-23 Intrexon Corporation Intercalated single-chain variable fragments
WO2016097408A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Biotecnol Limited Fusion protein comprising three binding domains to 5t4 and cd3
NZ733580A (en) 2015-01-02 2024-02-23 Takeda Pharmaceuticals Co Bispecific antibodies against plasma kallikrein and factor xii
BR112017015136A2 (pt) 2015-01-14 2018-01-30 Compass Therapeutics Llc polipeptídeo de construto de ligação ao antígeno imunomodulador multiespecífico, construto de ligação ao antígeno imunomodulador multiespecífico, conjugado, composição farmacêutica, método para tratar um indivíduo com câncer, método para inibir ou reduzir o crescimento de câncer, composição, célula, método de fazer um polipeptídeo de construto de ligação ao antígeno imunomodulador multiespecífico, vetor ou conjunto de vetores e kit
TW201627322A (zh) 2015-01-26 2016-08-01 宏觀基因股份有限公司 抗-ｄｒ５抗體和包括其ｄｒ５-結合結構域的分子
AU2016219785B2 (en) 2015-02-20 2021-10-28 Ohio State Innovation Foundation Bivalent antibody directed against NKG2D and tumor associated antigens
MA41613A (fr) 2015-02-23 2018-01-02 Abbvie Stemcentrx Llc Récepteurs antigéniques chimériques anti-dll3 et procédés d'utilisation desdits récepteurs
WO2016135041A1 (en) 2015-02-26 2016-09-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Fusion proteins and antibodies comprising thereof for promoting apoptosis
WO2016142768A1 (en) 2015-03-10 2016-09-15 Eureka Therapeutics, Inc. Ror2 antibody
CN107223135B (zh) 2015-03-16 2021-11-02 亥姆霍兹慕尼黑中心-德国环境健康研究中心(Gmbh) 用于治疗hbv感染和相关病症的三特异性结合分子
SG10201913158PA (en) 2015-04-03 2020-02-27 Eureka Therapeutics Inc Constructs targeting afp peptide/mhc complexes and uses thereof
CN107921090A (zh) 2015-04-06 2018-04-17 苏伯多曼有限责任公司 含有从头结合结构域的多肽及其用途
ES2899227T3 (es) 2015-04-07 2022-03-10 Alector Llc Anticuerpos anti sortilina y métodos de uso de los mismos
KR102405104B1 (ko) 2015-04-13 2022-06-07 화이자 인코포레이티드 치료 항체 및 그의 용도
WO2016166139A1 (en) 2015-04-14 2016-10-20 Eberhard Karls Universität Tübingen Bispecific fusion proteins for enhancing immune responses of lymphocytes against tumor cells
WO2016187220A2 (en) 2015-05-18 2016-11-24 Five Prime Therapeutics, Inc. Anti-ror1 antibodies
EP3095792A1 (en) 2015-05-19 2016-11-23 Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München T cell receptor with specificity for myeloperoxidase peptide and uses thereof
WO2016191305A1 (en) 2015-05-22 2016-12-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Btn3a ectodomain proteins and methods of use
DK3303394T3 (da) 2015-05-29 2020-07-06 Agenus Inc Anti-ctla-4-antistoffer og fremgangsmåder til anvendelse deraf
MY188049A (en) 2015-05-29 2021-11-12 Bristol Myers Squibb Co Antibodies against ox40 and uses thereof
WO2016201389A2 (en) 2015-06-12 2016-12-15 Alector Llc Anti-cd33 antibodies and methods of use thereof
US20160361360A1 (en) 2015-06-12 2016-12-15 Immunomedics, Inc. Disease therapy with chimeric antigen receptor (car) constructs and t cells (car-t) or nk cells (car-nk) expressing car constructs
JP6840682B2 (ja) * 2015-06-23 2021-03-10 イナート・ファルマ・ソシエテ・アノニムＩｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａ Ｐｈａｒｍａ Ｓ．Ａ． 多重特異的抗原結合タンパク質
US10113003B2 (en) 2015-06-23 2018-10-30 Innate Pharma Multispecific NK engager proteins
CN107849105B (zh) 2015-07-06 2021-09-17 Ucb生物制药有限责任公司 Tau结合抗体
WO2017011342A1 (en) 2015-07-10 2017-01-19 Abbvie Inc. Igm-or-ige-modified binding proteins and uses thereof
EP3322735A4 (en) 2015-07-15 2019-03-13 Zymeworks Inc. BISPECIFIC ANTIGEN-BINDING CONSTRUCTS CONJUGATED TO A MEDICINAL PRODUCT
CA2992539A1 (en) 2015-07-16 2017-01-19 Cellerant Therapeutics, Inc. Cysteine-substituted immunoglobulins
TW202346349A (zh) 2015-07-31 2023-12-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Dll3及cd3抗體構築體
AU2016322934A1 (en) 2015-09-14 2018-04-12 Compass Therapeutics Llc Compositions and methods for treating cancer via antagonism of the CD155/TIGIT pathway and TGF-beta
JP7034066B2 (ja) 2015-10-02 2022-03-11 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 共刺激ｔｎｆ受容体に対する二重特異性抗体
EP3368575A2 (en) 2015-10-29 2018-09-05 Alector LLC Anti-siglec-9 antibodies and methods of use thereof
EP3371227B8 (en) 2015-11-04 2022-04-06 City of Hope Chimeric antigen receptors targeting her2
EP3373952A4 (en) 2015-11-10 2019-05-22 Fred Hutchinson Cancer Research Center NKG2D decoys
WO2017081190A1 (en) * 2015-11-13 2017-05-18 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Anti- nkg2d single domain antibodies and uses thereof
JP7091250B2 (ja) 2015-12-28 2022-06-27 イナート・ファルマ・ソシエテ・アノニム ＮＫｐ４６結合タンパク質の可変領域
EP3402519A4 (en) * 2016-01-13 2020-01-08 Compass Therapeutics LLC MULTI-SPECIFIC IMMUNOMODULATOR BINDING CONSTRUCTIONS
US20210198368A1 (en) 2016-01-21 2021-07-01 Novartis Ag Multispecific molecules targeting cll-1
WO2017142928A1 (en) 2016-02-17 2017-08-24 Macrogenics, Inc. Ror1-binding molecules, and methods of use thereof
JP2019510812A (ja) 2016-02-26 2019-04-18 イミュネクサス・ピーティーワイ・リミテッド 多重特異性分子
JP7082604B2 (ja) 2016-03-21 2022-06-08 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド 多重特異性および多機能性分子ならびにその使用
WO2017165683A1 (en) 2016-03-23 2017-09-28 Novartis Ag Cell secreted minibodies and uses thereof
EP3443014A4 (en) 2016-04-15 2020-01-01 Zymeworks Inc. MULTI-SPECIFIC ANTIGEN-BINDING CONSTRUCTS AGAINST IMMUNOTHERAPEUTICS
SG11201808979UA (en) 2016-04-15 2018-11-29 Macrogenics Inc Novel b7-h3 binding molecules, antibody drug conjugates thereof and methods of use thereof
GB201610044D0 (en) 2016-06-08 2016-07-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
RU2022104399A (ru) 2016-06-14 2022-05-05 Ксенкор, Инк. Биспецифические антитела-ингибиторы контрольных точек
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
CN105906722B (zh) 2016-06-24 2020-02-07 安徽未名细胞治疗有限公司 一种Her2特异性嵌合抗原受体及其应用
AU2017319519A1 (en) 2016-09-01 2019-04-18 Immunomab, Inc. Bispecific antibodies
US20190225702A1 (en) 2016-10-14 2019-07-25 Harpoon Therapeutics, Inc. Innate immune cell trispecific binding proteins and methods of use
CN110267678A (zh) 2016-10-29 2019-09-20 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗mic抗体和使用方法
US11851491B2 (en) 2016-11-22 2023-12-26 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for TCR reprogramming using fusion proteins
JOP20190134A1 (ar) 2016-12-23 2019-06-02 Potenza Therapeutics Inc بروتينات رابطة لمولد ضد مضادة لنيوروبيلين وطرق استخدامها
CN110944651A (zh) 2017-02-08 2020-03-31 蜻蜓疗法股份有限公司 用于自然杀伤细胞激活的多特异性结合蛋白及其治疗癌症的治疗性用途
WO2018148447A1 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Adimab, Llc Antibody heavy chain variable domains targeting the nkg2d receptor
AU2018219348A1 (en) 2017-02-10 2019-08-29 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding BCMA, NKG2D and CD16
US20200024353A1 (en) 2017-02-10 2020-01-23 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding psma, nkg2d and cd16
CA3054079A1 (en) 2017-02-20 2018-08-23 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding her2, nkg2d and cd16
RU2019129174A (ru) 2017-02-20 2021-03-22 Драгонфлай Терапьютикс, Инк. Белки, связывающие cd33, nkg2d и cd16
KR20190120783A (ko) 2017-02-20 2019-10-24 드래곤플라이 쎄라퓨틱스, 인크. Gd2, nkg2d 및 cd16에 결합하는 단백질
SG11201907645PA (en) 2017-02-20 2019-09-27 Dragonfly Therapeutics Inc Proteins binding cd123, nkg2d and cd16
WO2018157147A1 (en) 2017-02-27 2018-08-30 Dragonfly Therapeutics, Inc. Multispecific binding proteins targeting caix, ano1, mesothelin,trop2, cea, or claudin-18.2
US20200179511A1 (en) 2017-04-28 2020-06-11 Novartis Ag Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
CA3064714A1 (en) 2017-05-23 2018-11-29 Dragonfly Therapeutics, Inc. A protein binding nkg2d, cd16 and a tumor-associated antigen
US20200157226A1 (en) 2017-05-23 2020-05-21 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding nkg2d, cd16 and a tumor-associated antigen
JP2020521448A (ja) 2017-05-23 2020-07-27 ドラゴンフライ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｎｋｇ２ｄ、ｃｄ１６、およびｒｏｒ１またはｒｏｒ２に結合するタンパク質
US20200165344A1 (en) 2017-07-31 2020-05-28 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding nkg2d, cd16 and flt3
CN113004391A (zh) 2017-08-16 2021-06-22 蜻蜓疗法股份有限公司 结合nkg2d、cd16和egfr、ccr4或pd-l1的蛋白质
EP3672993A4 (en) 2017-08-23 2021-10-27 Dragonfly Therapeutics, Inc. NKG2D, CD16 AND TUMOR-ASSOCIATED ANTIGEN BINDING PROTEINS
CA3112984A1 (en) 2017-09-07 2019-03-14 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding nkg2d, cd16 and a tumor-associated antigen
CN111432832A (zh) 2017-09-14 2020-07-17 蜻蜓疗法股份有限公司 结合nkg2d、cd16和c-型凝集素样分子-1(cll-1)的蛋白质
AU2019218125A1 (en) 2018-02-08 2020-08-20 Dragonfly Therapeutics, Inc. Combination therapy of cancer involving multi-specific binding proteins that activate natural killer cells
PE20220278A1 (es) 2018-02-08 2022-02-25 Dragonfly Therapeutics Inc Dominios variables de anticuerpos que se dirigen al receptor nkg2d
US20210101976A1 (en) 2018-02-20 2021-04-08 Dragonfly Therapeutics, Inc. Multi-specific binding proteins that bind cd33, nkg2d, and cd16, and methods of use
MX2020008683A (es) 2018-02-20 2020-12-07 Dragonfly Therapeutics Inc Dominios variables de anticuerpo que se dirigen a cd33 y sus usos.
US20220025037A1 (en) 2018-04-03 2022-01-27 Dragonfly Therapeutics, Inc. Antibody variable domains targeting dll3, and use thereof
EP3773676A4 (en) 2018-04-03 2022-05-18 Dragonfly Therapeutics, Inc. PROTEINS THAT BIND NKG2D, CD16 AND AN ANTIGEN ASSOCIATED WITH TUMORS, MDSCS AND/OR TAMS
JP2021523140A (ja) 2018-05-07 2021-09-02 ドラゴンフライ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｎｋｇ２ｄ、ｃｄ１６、及び腫瘍関連抗原に結合するタンパク質
JP2021523913A (ja) 2018-05-16 2021-09-09 ドラゴンフライ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｎｋｇ２ｄ、ｃｄ１６、及び線維芽細胞活性化タンパク質と結合するタンパク質
EA202091977A1 (ru) 2018-05-28 2021-02-09 Драгонфлай Терапьютикс, Инк. Мультиспецифические связывающие белки, которые связывают cd33, nkg2d и cd16, и способы применения
WO2020033702A1 (en) 2018-08-08 2020-02-13 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding nkg2d, cd16 and a tumor-associated antigen
EA202091888A1 (ru) 2018-08-08 2020-10-23 Драгонфлай Терапьютикс, Инк. Вариабельные домены антител, нацеленные на рецептор nkg2d
PE20211279A1 (es) 2018-10-23 2021-07-19 Dragonfly Therapeutics Inc Proteinas heterodimericas fusionadas con fc
SG11202108878VA (en) 2019-02-18 2021-09-29 Courier Therapeutics Inc BISPECIFIC FUSION PROTEIN USING ORTHOPOXVIRUS MAJOR HISTOCOMPATIBILITY COMPLEX (MHC) CLASS l-LIKE PROTEIN (OMCP) AND TUMOR-SPECIFIC BINDING PARTNER
CA3142513A1 (en) 2019-06-25 2020-12-30 Gilead Sciences, Inc. Flt3l-fc fusion proteins and methods of use
AR119393A1 (es) 2019-07-15 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a nkg2d
CA3152776A1 (en) 2019-08-30 2021-03-04 Dragonfly Therapeutics, Inc. Pharmaceutical formulations and dosage regimens for multi-specific binding proteins that bind her2, nkg2d, and cd16 for cancer treatment
CA3177024A1 (en) 2020-05-06 2021-11-11 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding nkg2d, cd16 and clec12a

Also Published As

Publication number Publication date
US20190359716A1 (en) 2019-11-28
IL268554A (en) 2019-09-26
KR20240023449A (ko) 2024-02-21
RU2019128060A3 (pt) 2021-06-10
SG11201907299XA (en) 2019-09-27
JP2020506971A (ja) 2020-03-05
AU2018219887A1 (en) 2019-08-22
WO2018148445A1 (en) 2018-08-16
EP3579848A4 (en) 2021-03-03
JP2022101709A (ja) 2022-07-06
US11834506B2 (en) 2023-12-05
EP3579848A1 (en) 2019-12-18
MX2019009468A (es) 2020-01-20
CA3221995A1 (en) 2018-08-16
CN110944651A (zh) 2020-03-31
RU2019128060A (ru) 2021-03-09
CA3053010A1 (en) 2018-08-16
KR20190118172A (ko) 2019-10-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11834506B2 (en) Multi-specific binding proteins that bind NKG2D, CD16, and a tumor-associated antigen for activation of natural killer cells and therapeutic uses thereof to treat cancer
US20230303702A1 (en) Combination therapy of cancer involving multi-specific binding proteins that bind nkg2d, cd16, and a tumor-associated antigen
US20200095327A1 (en) Antibody heavy chain variable domains targeting the nkg2d receptor
US11884732B2 (en) Proteins binding HER2, NKG2D and CD16
BR112021002278A2 (pt) proteínas que ligam nkg2d, cd16 e um antígeno associado a tumor
BR112019017758A2 (pt) proteínas multispecíficas de ligação ao alvo caixa, ano1, mesotelina, trop2, cea ou claudin-18.2
BR112020004489A2 (pt) proteínas de ligação ao nkg2d, cd16 e um antígeno associado a tumor
BR112019016424A2 (pt) proteínas de ligação a bcma, nkg2d e cd16
US20210130471A1 (en) Proteins binding cd33, nkg2d and cd16
BR112020005078A2 (pt) proteínas de ligação a nkg2d, cd16, e molécula 1 semelhante a lecitina de tipo c (cll-1)
US20200231700A1 (en) Proteins binding gd2, nkg2d and cd16
US20200024353A1 (en) Proteins binding psma, nkg2d and cd16
BR112019017237A2 (pt) proteínas que se ligam a cd123, nkg2d e cd16

Legal Events

Date Code Title Description
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]