JP6599338B2 - Ｈｂｖ感染および関連症状の治療のための免疫エフェクター細胞表面抗原およびｈｂｖ抗原結合性の二重特異性または多重特異性ポリペプチド - Google Patents

Description

本発明は、（ａ）第一の抗原に結合するよう構成された６個の相補性決定領域（ＣＤＲ）の第一の組、および（ｂ）（ｂａ）第二の抗原に結合するよう構成された６個のＣＤＲの第二の組、または（ｂｂ）第二の抗原に結合可能なリガンド、を含むポリペプチドであって、（ｉ）前記第一の抗原がＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）小型表面抗原、ＨＢＶ中型表面抗原、およびＨＢＶ大型表面抗原から選択され、ならびに（ｉｉ）前記第二の抗原がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞や細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）などの免疫エフェクター細胞によって発現される表面抗原から選択されるポリペプチドに関する。

本明細書では、特許出願や製造者のマニュアルを含むいくつかの文献が引用されている。これらの文献の開示は、本発明の特許性に関連がないと考えられても、その全体が参照することにより本出願に組み込まれる。より詳細には、参照した全ての文献が、あたかも個々の文献のそれぞれが具体的にかつ個別に参照により組み込まれたと示されるのと同程度に、参照することにより本明細書に組み込まれる。

約３．５億人の人々が慢性的にＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に感染している。ＨＢＶ感染は肝硬変および肝細胞癌（ＨＣＣ）を引き起こす場合があり、これらによって年間約百万人の犠牲者が出ている（ゲイネム（Ｇａｎｅｍ）ら、Ｂ型肝炎ウイルス感染−自然な生長および臨床結果（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ ｈｉｓｔｏｒｙ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ）；３５０：１１１８−２９（２００４））。ＨＢＶの感染は現在、成人患者の約５％および新生児の約９０％において制御不能である。そのような場合、ＨＢＶ感染は慢性化する。考えられる原因としては細胞免疫応答が不十分であることが挙げられる。ＨＢＶ感染の治療に使用されている現在入手可能な抗ウイルス剤は、ウイルスの複製を阻害するものである。しかし、共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）が感染した肝細胞の核に残り、患者が投薬をやめるやいなやＨＢＶ感染の再活性化を引き起こすことがある。したがって、感染を完全に治癒するためには前記ｃｃｃＤＮＡを保有するＨＢＶ感染細胞の排除が不可欠となる（プロッツァー（Ｐｒｏｔｚｅｒ）ら、ネイチャー・レビューズ・イムノロジー（Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ）１２：２０１３−２１３（２０１２））。

しかし、そのようなＨＢＶ感染細胞の細胞傷害性排除（細胞傷害性Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞による）は起こらないかまたは十分に起こらない。

ＨＢＶのｃｃｃＤＮＡを保有する感染細胞はその表面にウイルス表面タンパク質を提示する。ウイルスが細胞内小胞に放出されてもいくつかのＨＢＶ表面タンパク質が小胞体の細胞内膜に組み込まれたままであるため、このような現象が起こると推定される。小胞輸送プロセスの過程において、前記細胞内膜は細胞膜と融合することがあり、その結果、感染細胞の表面にＨＢＶ表面タンパク質が提示される。

ボーネ（Ｂｏｈｎｅ）ら（Ｂ型肝炎ウイルス表面タンパク質に再指向されたＴ細胞による感染肝細胞の排除（Ｔ ｃｅｌｌｓ ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｌｉｍｉｎａｔｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．胃腸病学（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）、１３４：２３９−２４７（２００８））およびクレーブス（Ｋｒｅｂｓ）ら（Ｂ型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質を結合するキメラ抗原受容体を発現するＴ細胞のマウスにおけるウイルス複製の制御（Ｔ ｃｅｌｌｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｈａｔ Ｂｉｎｄｓ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ Ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｉｃｅ．）胃腸病学（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）（２０１３））によるとキメラ抗原受容体は、レトロウイルスを介して送達されてＴ細胞の表面に発現した場合に、ヒト一次Ｔ細胞およびマウスＴ細胞がＨＢＶ小型表面抗原を提示している肝細胞を認識し、かつ、複製中のＨＢＶ細胞を溶解できるようにする。

二重特異性抗体は主として腫瘍学の分野で使用されている。一例として、我々はハートマンら（抗ＣＤ１６／ＣＤ３０二重特異性抗体による難治性ホジキン病の治療、（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｗｉｔｈ ａｎ ａｎｔｉ−ＣＤ１６／ＣＤ３０ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ．）血液（Ｂｌｏｏｄ）８９：２０４２−７（１９９７））を参照する。

欧州特許第２５２４６９９Ａ１号には三機能性抗体が記載されている。これらの抗体は「機能的Ｆｃ部を有し」、「異なるサブクラスの免疫グロブリン重鎖から構成されねばならない」。一方、ホルニッグ（Ｈｏｒｎｉｇ）とファーバー・シュヴァルツ（Ｆａｒｂｅｒ−Ｓｃｈｗａｒｚ）は「抗体工学（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」（パトリック・シャンヌ（Ｐａｔｒｉｃｋ Ｃｈａｎｎｅｓ）編、ヒューマナ・プレス、２０１２）の４０章において、Ｆｃ部を持たないｓｃＦｖ構築物について述べている。

リャオ（Ｌｉａｏ）ら（腫瘍学レポート（Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ）３、６３７−６４４（１９９６））は、ヌードマウスにおいてヒト肝癌異種移植片を溶解するためにエフェクター細胞を再標的化する二重特異性モノクローナル抗体について記載している。記載されている二重特異性抗体は２つのハイブリドーマの融合体から産生される。この融合体は、２つの個別の抗体の重鎖／軽鎖の組み合わせを発現するハイブリドーマ細胞株を形成し、これにより２つの異なる重鎖が対合する可能性だけでなく、同一の重鎖が対合する可能性があり、単一特異性親抗体と二重特異性抗体の無作為な混合物が産生され得る。二重特異性抗体は重鎖および軽鎖を含み、二量体化して単鎖ポリペプチドでないＩｇ分子を形成する。

技術的課題は、従来技術の観点から、ＨＢＶ感染ならびに肝硬変または肝細胞癌のようなＨＢＶ感染によって引き起こされる症状を治療する、代替のまたは改良された手段および方法を提供することであることが理解される。細胞生物学の観点から述べると技術的課題は、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡを保有する細胞を根絶する手段および方法の提供であることが理解される。この技術的課題は添付の請求項によって解決される。

従って、本発明は第一の側面において（ａ）第一の抗原に結合するよう構成された６個の相補性決定領域（ＣＤＲ）の第一の組、および（ｂ）（ｂａ）第二の抗原に結合するよう構成された６個のＣＤＲの第二の組、または（ｂｂ）第二の抗原に結合可能なリガンド、を含むポリペプチドに関し、ここで、（ｉ）前記第一の抗原はＨＢＶ小型表面抗原、ＨＢＶ中型表面抗原、およびＨＢＶ大型表面抗原から選択され、ならびに（ｉｉ）前記第二の抗原はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞や細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）などの免疫エフェクター細胞によって発現される表面抗原から選択される、ポリペプチドに関する。

「ポリペプチド」という用語は、Ｎ末端を１つとＣ末端を１つ有する１本鎖を形成するアミノ酸の縮合重合体である分子を定義する。構成アミノ酸は天然に存在する２０種のタンパク新生アミノ酸を含む。好ましくは、前記ポリペプチドは前記天然に存在するタンパク新生アミノ酸のみからなる。とはいえこの用語は、前記天然に存在するタンパク新生アミノ酸に加えて、α−アミノ酸、β−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、セレノシステイン、セレノメチオニン、ヒドロキシプロリン、ピロールリジンおよびオルニチンから選択される天然に存在しないアミノ酸を２０％、１０％、５％、２％、または１％まで含む分子にも適用される。さらに、１つ以上、例えば２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸がリン酸化されていてもよいと理解される。リン酸化され得るアミノ酸としては特に、セリン、トレオニン、およびチロシンが挙げられる。また、グリコシル化のような当該分野で知られている他の翻訳後修飾を受けていてもよい。グリコシル化としては、通常アスパラギンに起こるＮ−結合型グリコシル化および通常セリンまたはトレオニン残基に起こるＯ−結合型グリコシル化が挙げられる。Ｎ末端および／またはＣ末端は、Ｎ末端用のアセチルおよびＣ末端用のアミンを含む保護基によって保護されていてもよい。前記ポリペプチドに含まれるアミノ酸間の結合型はアミド（ＣＯＮＨ）結合に限定される。「アミド結合」という用語は所定のアミノ酸のα−カルボキシル基を後続のアミノ酸のα−アミノ基に結合するペプチド結合を含む。「アミド結合」は、ポリペプチドの主鎖に含まれないアミド結合であるイソペプチド結合も含む。例えば、α−アミノ基の代わりに、リシンの側鎖アミノ基を含んでも良い。同様に、α−カルボキシル基の代わりに、グルタミン酸またはアスパラギン酸の側鎖カルボキシル基を含んでも良い。１つ以上、例えば２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のイソペプチド結合の発現が考えられる。しかしながら、構成アミノ酸がペプチド結合のみによって互いに結合しているポリペプチドが好ましい。

一般に、ポリペプチドにおけるアミノ酸の数に上限はない。配列表に例示されたポリペプチド配列から分かるように、本発明のポリペプチドは通常数百個のアミノ酸を含み、好ましくは２５０〜１０００、４００〜９００、または７００〜８００個のアミノ酸を含む。一般的に、一方のペプチドと他方のポリペプチドは区別され、ペプチドに含まれるアミノ酸は３０個以下であり、ポリペプチドには３０個を上回るアミノ酸が含まれる。

「相補性決定領域」という用語は「ＣＤＲ」と略され、当該分野で確立された意味を持つ。ＣＤＲは通常、約３〜約２５個のアミノ酸の短いサブ配列であり、抗原のエピトープを特異的に認識する能力を抗体に付与する。一般に、抗体軽鎖の可変ドメインは３つのＣＤＲを備え、抗体重鎖の可変ドメインも３つのＣＤＲを備える。ＣＤＲは通常、免疫グロブリンドメインの一部であるが、本発明においてはその点は求められていない。必要なのは前記複数のＣＤＲを含むアミノ酸配列であり、生理学的条件の下で折り畳まれた際に前記アミノ酸配列が前記複数のＣＤＲを空間的に近接させ、同種抗原の認識能力を保持することである。前述の空間的な近接および抗原結合を認識する能力は、前に開示した主な態様で使用されているように「抗原に結合するよう構成された」という用語で表される。「免疫グロブリンドメイン」という用語は当該分野で知られており、通常７０〜１００個のアミノ酸の配列を指し、７〜９個の逆並行β鎖による二層サンドイッチの三次元構造を想定している。

前記６個のＣＤＲの第一の組ならびに前記６個のＣＤＲの第二の組はそれぞれ結合部位を規定する。

本発明のポリペプチドには、前記第一の組および前記第二の組以外にさらなるＣＤＲは含まれないと理解される。

「抗原」という用語は当該分野で確立された意味を有する。この用語は、免疫グロブリンドメインに一般的に存在する６個のＣＤＲによって特異的に認識され、結合される分子を指す。前記ＣＤＲに認識され結合される抗原の特定の部分はエピトープとしても知られている。

「リガンド」という用語は当該分野で確立された意味を有する。リガンドは受容体と対になっている構造である。より具体的には、リガンドはその同族受容体に結合することが、好ましくは特異的に結合することができる。本発明によれば、前記リガンドは好ましくは免疫リガンドである。免疫リガンドは免疫エフェクター細胞の表面に存在する受容体に結合可能なリガンドである。前段で定義したように、好ましい免疫エフェクター細胞はＮＫ細胞およびＣＴＬである。免疫エフェクター細胞表面に存在するその同族受容体に結合した場合に、刺激効果および／または共刺激効果を発揮する免疫リガンドが好ましい。「活性化する」および「刺激する」という用語は本明細書では同じ意味で使用される。好ましい免疫リガンドが結合する受容体については以下に具体的に述べる。

ＨＢＶ Ｓ／Ｍ／Ｌ表面タンパク質は、ＨＢＶの外被（エンベロープ）の小型、中型、および大型表面タンパク質である（スティッブ（Ｓｔｉｂｂｅ）Ｗ、およびＷ．Ｈ．ゲルリヒ（Ｇｅｒｌｉｃｈ）、Ｂ型肝炎表面抗原の微量タンパク質および主要タンパク質の構造関係（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｉｎｏｒ ａｎｄ ｍａｊｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ）、ウイルス学ジャーナル（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ）、１９８３ ４６：６２６−６２８）。

３つのＨＢＶ表面抗原は１つの読み枠から転写・翻訳されるもので、Ｎ末端部分の長さが互いに異なる。従って、大型表面抗原は中型表面抗原にも小型表面抗原にも存在しない部分を含み、中型表面抗原は、大型抗原には含まれているが小型抗原には含まれていない部分を含む。小型抗原は中型抗原および大型抗原両方のＣ末端部分に含まれる配列からなる。

大型のＨＢＶ表面抗原は２通りの方法で細胞質膜に挿入できる。Ｎ末端またはＣ末端のどちらか一方が細胞外に位置してもよい。ＨＢＶ感染細胞内ではどちらの配置も見られる。

二つ目に示す抗原は免疫エフェクター細胞によって発現される表面抗原であり、好ましくはＮＫ細胞および／またはＣＴＬ特異的に発現される。免疫エフェクター細胞はＨＢＶ感染細胞に再指向化される細胞である。前記ＨＢＶ感染細胞はその表面に前述のＨＢＶ表面抗原を発現している。

本発明による結合は、具体的にはＣＤＲと抗原との間およびリガンドと抗原との間の結合は、特異的であることが特に好ましい。本発明で使用される「特異的に結合する」および「特異的結合」（「特異的に相互作用する」と同義）という用語は、これらの結合部位が、標的抗原のエピトープまたは構造と類似したエピトープまたは構造と交差反応を起こさない、または本質的に交差反応を起こさないことを意味する。調査対象となっている分子パネルの交差反応性は、例えば、標準的な条件における前記分子パネルと目的のエピトープとの結合ならびにいくつかのある程度（構造的におよび／または機能的に）近似のエピトープとの結合を評価することによって試験してもよい。検討課題（例えばタンパク質構造の特定のモチーフ）と関連のある状況において目的のエピトープに結合するが、その他のエピトープとは結合しないまたは本質的に結合しない分子のみが目的のエピトープに対して特異的であるとみなされる。

第一の側面は、項目（ａ）および（ｂａ）のみが前記ポリペプチドに含まれる結合部位である態様、ならびに（ａ）および（ｂｂ）のみが前記ポリペプチドに含まれる結合部位である態様を含んでいる。

慢性的なＨＢＶ感染は免疫寛容状態を特徴とする。より具体的には、患者のＣＴＬおよびＮＫ細胞が機能しても感染細胞の完全根絶、ＨＢＶ複製の完全制御、またはＨＢＶの完全排除が起こらない状態である。本発明のポリペプチドは、一方でＨＢＶ表面抗原を特異的に認識し、他方で免疫エフェクター細胞表面抗原を認識するという意味で二重特異性分子である。そのような二重特異性分子は免疫エフェクター細胞に人工的な特異性を付与していると理解される。実際に、ＣＴＬおよびＮＫ細胞は、本発明のポリペプチド（「二重特異性」とも呼ばれる）によって再標的化され、ＨＢＶ感染細胞に取り込まれてＨＢＶ感染細胞を死滅させる。

一方の本発明のポリペプチドのＨＢＶ感染細胞への結合および他方の免疫エフェクター細胞の取り込みはどのような順序で行われてもよく、同時に行われてもよい。

具体的には、本発明のポリペプチドを注入または経口投与形態で全身的に使用すると、そのポリペプチドがＨＢＶに感染した標的細胞またはＨＢＶ抗原を発現している標的細胞に結合し、前記標的細胞に前記免疫エフェクター細胞を取り込ませられるようにすることが意図される。

とはいえ、本発明のポリペプチドを免疫エフェクター細胞（または前記エフェクター細胞を含む末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の個体群）と接触させて、前記エフェクター細胞に前記ポリペプチドを負荷させるようにすることも想定される。インビトロでまたはエキソビボで本発明のポリペプチドを負荷されたそのようなエフェクター細胞（またはそのように負荷されたエフェクター細胞を含むＰＢＭＣの個体群）をその後、ＨＢＶ感染またはＨＢＶ感染に関連し、下記に定義される症状を患っている患者に投与することができる。そのような投与は静脈内投与、例えば総肝動脈内投与であってもよい。前記免疫エフェクター細胞の表面抗原に結合している本発明によるポリペプチドを含む免疫エフェクター細胞も本発明の一側面である。この側面は以下により詳しく開示する。

このような死滅は、特に免疫細胞から分泌された抗ウイルス免疫伝達物質（例えばサイトカイン）と協働してＨＢＶ感染の根絶、ＨＢＶ感染の継続的な制御、またはＨＢＶ表面抗原を発現している腫瘍細胞の排除をもたらす。本発明による好ましいまたは例示的な二重特異性ポリペプチドは、驚くほど高い率で、ＨＢＶを複製する、またはＨＢＶ表面抗原を発現するＨＢＶ感染細胞または肝臓腫瘍細胞（肝癌細胞としても知られる）を死滅させる（本明細書に含めた実施例を参照されたい）。

本発明による二重特異性ポリペプチドが免疫エフェクター細胞に適した特異性を提供するとすれば、免疫エフェクター細胞の天然に固有の特異性またはそれらにおける抗原の発現は重要でない。そのため、多くの候補エフェクター細胞を再標的化できる可能性がある。さらに、本発明のポリペプチドの生物学的利用率および半減期は少なくともモノクローナル抗体のそれらと遜色ない。

好ましい態様において（ａ）前記６個のＣＤＲの第一の組は第一のｓｃＦｖ断片に含まれ、および／または（ｂ）（ｂａ）前記６個のＣＤＲの第二の組は第二のｓｃＦｖ断片に含まれ、または（ｂｂ）前記リガンドは免疫リガンドであり、好ましくはＮＫＧ２Ｄ／ＣＤ３１４（リガンドＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１−６など）、ＮＫｐ３０／ＮＣＲ３／ＣＤ３３７（リガンドＢ７−Ｈ６など）、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７（リガンド４−１ＢＢ−Ｌ／ＣＤ１３７Ｌなど）またはＯＸ４０／ＣＤ１３４（リガンドＯＸ４０−Ｌ／ＣＤ２５２など）に結合可能な免疫リガンドである。スラッシュ（「／」）は当該分野で確立された呼称同士を分けるために使用する。括弧内にはある属の抗原の好ましい代表例を記載している。

「ｓｃＦｖ」という用語は当該分野でよく確立されている。この略称は抗体の「単鎖可変領域」を表し、抗原のエピトープを特異的に認識し結合することができるポリペプチドを定義する。前述のように、３個のＣＤＲが抗体の軽鎖（Ｖ_L）の可変ドメインに含まれ、３個のＣＤＲが抗体の重鎖（Ｖ_H）の可変ドメインに含まれる。ｓｃＦｖでは、２つの可変ドメインがペプチドリンカーによって互いに連結されている。得られた融合構築物は単鎖ポリペプチドであり、これにより、ｓｃＦｖ分子の発現が容易となる。図１に模式図を示す。

「Ｖ_Hドメイン」および「Ｖ_Lドメイン」という用語は当該分野で提供されている定義に従って使用される。したがって、「Ｖ_Hドメイン」は免疫グロブリンの重鎖（Ｖ_H）の可変領域を指し、「Ｖ_Lドメイン」は免疫グロブリンの軽鎖（Ｖ_L）の可変領域を指す。一般に、Ｖ_HおよびＶ_Lドメインはそれぞれ３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、ここでＣＤＲとは、主に抗原の結合に関与する、大きなばらつきのある領域である。

ｓｃＦｖの可変領域同士を結合するために、またはｓｃＦｖを二量体形成領域および／またはスペーサー領域に、好ましくはＦｃに結合するために、好ましくはペプチドリンカーが使用される。通常、ペプチドリンカーの長さはアミノ酸３〜３０個分で、好ましくは、アミノ酸５〜２５個分または１０〜２０個分の長さである。好ましいリンカーは、それらが連結するドメインまたはポリペプチド（連結によって連続した一本鎖ポリペプチドが産生される）の構造および／または機能と干渉しない、または実質的に干渉しないものである。リンカーの例としては、好ましい本発明のポリペプチドにおいてＣＴＬのＶ_H／Ｖ_LドメインまたはＮＫ特異的ｓｃＦｖのＶ_H／Ｖ_Lドメインを連結する（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₃（配列番号４７）リンカーなどのグリシンに富むリンカー、および好ましい本発明のポリペプチドにおいてＨＢＶ表面抗原に特異的なｓｃＦｖのＶ_H／Ｖ_Lドメインを連結するために使用されるＹｏｌリンカー（配列番号４８；ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＶ、セルリー（Ｓｅｌｌｒｉｅ）ら、生化学および分子生物学ジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｖｏｌ．４０、Ｎｏ．６、２００７年１１月、ｐ．８７５〜８８０に記載）などがある。（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₄リンカー（配列番号４９）もまた、ＨＢＶ表面抗原に特異的なｓｃＦｖのＶ_H／Ｖ_Lドメインを連結するために使用することができる。

「抗体」という用語は本明細書で使用する場合、当該分野で確立された意味を持ち、好ましくはモノクローナル抗体を指す。モノクローナル抗体は例えば、ケーラーおよびミルスタイン、ネイチャー２５６（１９７５）、４９５、およびガルフレ（Ｇａｌｆｒｅ）、酵素学の方法（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ）７３（１９８１）、３によって最初に記載されたマウス骨髄腫細胞と免疫化した哺乳類由来の脾臓細胞の融合を含む技術に、当該分野で開発された変更を加えた技術によって調製することができる。さらに、前述のＨＢＶ表面タンパク質に指向化された抗体またはそれらの断片は例えば、ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）（１９８８）「抗体：実験の手引き（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」コールド・スプリング・ハーバー研究所出版局、に記載の方法を使用して得ることができる。キメラ抗体の産生は例えば、国際公開第８９／０９６２２号に記載されている。本発明において使用されるさらなる抗体の供給源は、いわゆる異種抗体である。マウスでヒト抗体を生産するなどの異種抗体を産生する一般的な原則は例えば、国際公開第９１／１０７４１号、国際公開第９４／０２６０２号、国際公開第９６／３４０９６号および国際公開第９６／３３７３５号に記載されている。本発明おいて使用される抗体またはそれらの対応する免疫グロブリン鎖は、当該分野で知られている標準的な技術（例えば、アミノ酸の欠失、挿入、置換、付加、および／または組換えおよび／または当該分野で知られているその他の修飾）を単独でまたは組み合わせて使用することによってさらに修飾することができる。そのような修飾をＤＮＡまたは免疫グロブリン鎖のアミノ酸配列の基礎をなすポリペプチド配列に導入する方法は当業者によく知られている。例えば、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ クローニング）：実験の手引き（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）コールド・スプリング・ハーバー実験所出版局、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９を参照されたい。ポリペプチドの修飾には、グリコシル化のような翻訳後修飾も含まれる。

さらに好ましい態様において、前記６個のＣＤＲの第一の組は前記第一の抗原のエピトープに結合し、そのエピトープは（ａ）前記ＨＢＶ小型表面抗原中に、（ｂ）前記ＨＢＶ小型表面抗原に含まれない前記ＨＢＶ大型表面抗原の部分中に、または（ｃ）前記ＨＢＶ小型表面抗原と構造が異なる前記ＨＢＶ大型表面抗原の部分中に、位置している。

項目（ａ）はＨＢＶ小型表面抗原に含まれるエピトープを指す。前述した小型、中型、および大型ＨＢＶ表面抗原の関係から、小型抗原の配列全体は中型および大型抗原に含まれる。一般に、小型表面抗原によって発現される三次元エピトープは中型表面抗原および／または大型表面抗原によっても発現されるが、必ずしもそうではない。

項目（ｂ）によると、前記ＨＢＶ大型表面抗原の前記部分は前記ＨＢＶ中型表面抗原にも含まれないことが好ましい。項目（ｃ）に関する「構造が異なる（ｖａｒｙｉｎｇ ｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」は、前記ＨＢＶ小型表面抗原の配列の一部分にあたる配列を含むか、またはそれらからなる前記ＨＢＶ大型表面抗原のエピトープを含み、ここで前記エピトープが前記ＨＢＶ小型表面抗原に発現していないことと理解される。項目（ｃ）によると、前記エピトープは、前記ＨＢＶ大型表面抗原の前記ＨＢＶ中型表面抗原とも構造が異なる部分にあることがさらに好ましい。

前記項目（ａ）、つまり前記第一の抗原が前記ＨＢＶ小型表面抗原であることが、本発明のすべての側面および態様との関連で特に好ましい。

項目（ｂ）および（ｃ）によると、ポリペプチドはＨＢＶの大型表面抗原を特異的に認識する。

さらに好ましい態様において、免疫エフェクター細胞によって発現される前記表面抗原は、ＣＤ３、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＮＫＧ２Ｄ、およびＮＫｐ３０／ＮＣＲ３から選択される。従って本発明は、（ａ）第一の抗原に結合するよう構成された６個の相補性決定領域（ＣＤＲ）の第一の組、および（ｂ）（ｂａ）第二の抗原に結合するよう構成された６個のＣＤＲの第二の組、または（ｂｂ）第二の抗原に結合可能なリガンド、を含むポリペプチドであって、（ｉ）前記第一の抗原がＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）小型表面抗原、ＨＢＶ中型表面抗原、およびＨＢＶ大型表面抗原から選択され、（ｉｉ）前記第二の抗原がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞や細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）などの免疫エフェクター細胞によって発現される表面抗原から選択されるポリペプチドを提供し、ここで（ｃ）前記６個のＣＤＲの第一の組は第一のｓｃＦｖ断片に含まれ、および（ｄ）（ｄａ）前記６個のＣＤＲの第二の組は第二のｓｃＦｖ断片に含まれ、または（ｄｂ）前記リガンドはＮＫＧ２Ｄ（例えばリガンドＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１−６）、ＮＫｐ３０（例えばリガンドＢ７−Ｈ６）、４−１ＢＢ（例えばリガンド４−１ＢＢ−Ｌ）、またはＯＸ４０（例えばリガンドＯＸ４０−Ｌ）に結合可能な免疫リガンドであって、ここで免疫エフェクター細胞によって発現される前記表面抗原は、ＣＤ３、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＮＫＧ２Ｄ、およびＮＫｐ３０から選択される。

ＣＤ３は、ＣＤ３−Ｔ細胞受容体複合体の一部分であるＣＤ３イプシロン鎖を表す（ボルスト Ｊ（Ｂｏｒｓｔ、Ｊ）ら、ヒトＴ３／Ｔ−細胞受容体複合体のデルタ鎖およびイプシロン鎖は異なるポリペプチドである（Ｔｈｅ ｄｅｌｔａ− ａｎｄ ｅｐｓｉｌｏｎ−ｃｈａｉｎｓ ｏｆ Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ Ｔ３／Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｒｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）、ネイチャー １９８４． ３１２：４５５−４５８）。

ＣＤ２８は主要なＴ細胞共刺激受容体である（レスラウアー Ｗ（Ｌｅｓｓｌａｕｅｒ、Ｗ）ら、Ｔ９０／４４（９．３抗原）、ヒトＴ細胞活性化機能を持つ細胞表面分子、欧州免疫学雑誌 １９８６． １６：１２８９−１２９６）。

４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）は活性化したＴ細胞およびＮＫ細胞の共刺激受容体である（クウォンＢ．Ｓ．（Ｋｗｏｎ、Ｂ．Ｓ．）ら、２つの誘導性Ｔ細胞遺伝子のｃＤＮＡ配列、米国科学アカデミー紀要、米国、１９８９ ８６：１９６３〜１９６７）。

ＯＸ４０（ＣＤ１３４）は二次共刺激受容体である（アークＲ． Ｈ．（Ａｒｃｈ、Ｒ． Ｈ．）ら、分子細胞生物学（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）１９９８ １８：５５８〜５６５）。４−１ＢＢおよびＯＸ４０は、ＴＮＦ受容体関連のリガンドに結合し、核内因子カッパＢを活性化させる腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ファミリーのメンバーである。

ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩａ）はＮＫ細胞、活性化した細胞傷害性Ｔ細胞のサブセット、および骨髄単球系の細胞型で発現する低親和性Ｆｃ受容体であり、ＩｇＧ分子のＦｃドメインに結合する（ラニアＬ．Ｌ．（Ｌａｎｉｅｒ、Ｌ．Ｌ．）ら、ＩｇＧに対するＦｃ受容体を発現する細胞傷害性ＣＤ３＋Ｔリンパ球の特有のサブセットの機能特性（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｕｎｉｑｕｅ ｓｕｂｓｅｔ ｏｆ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ＣＤ３＋ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｔｈａｔ ｅｘｐｒｅｓｓ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｆｏｒ ＩｇＧ）（ＣＤ１６／Ｌｅｕ−１１抗原）実験医学ジャーナル（Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．）１９８５、１６２：２０８９〜２１０６）。

ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）はＮＫ細胞で発現する細胞接着分子である（ラニアＬ．Ｌ．（Ｌａｎｉｅｒ、Ｌ．Ｌ．）ら、Ｌｅｕ−１９（ＣＤ５６）白血球分化抗原および神経細胞接着因子の同一性（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｏｆ Ｌｅｕ−１９ （ＣＤ５６） ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｄ ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）実験医学ジャーナル（Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．）１９８９、１６９：２２３３〜２２３８）。

ＮＫＧ２ＤはＮＫ細胞で発現する活性化受容体である（ホーチンスＪ（Ｈｏｕｃｈｉｎｓ、Ｊ．）ら、ヒトナチュラルキラー細胞にＩＩ型内在性膜タンパク質をコードする近縁ｃＤＮＡクローンファミリーであるＮＫＧ２のＤＮＡ配列解析（ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＮＫＧ２， ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｒｅｌａｔｅｄ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｙｐｅ ＩＩ ｉｎｔｅｇｒａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ）１９９１、実験医学ジャーナル（Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．）１７３：１０１７〜１０２０）。

ＮＫｐ３０（ＮＣＲ３）はＮＫ細胞で発現する受容体である（ペンデ Ｄ（Ｐｅｎｄｅ、Ｄ．）ら、ヒトナチュラルキラー細胞によって媒介される自然細胞傷害性に関係して誘発する新たなトリガー受容体であるＮＫｐ３０の同定および分子的特徴（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＫｐ３０， ａ ｎｏｖｅｌ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｎａｔｕｒａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｍｉｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ）２０００．実験医学ジャーナル １９２：３３７−３４６）。

ＣＤ３、ＣＤ２８、４−１ＢＢおよびＯＸ４０はＣＴＬの表面に発現する。本発明のポリペプチドがこれらの表面抗原のいずれかと結合するには、ＣＴＬの刺激または共刺激が必要となる。

ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０／ＮＣＲ３および４−１ＢＢはＮＫ細胞の表面に発現する。本発明のポリペプチドがこれら表面抗原のいずれかと結合するには、ＮＫ細胞の刺激または共刺激が必要となる。

ヒトＣＴＬに関しては、ＣＤ３およびＣＤ２８が好ましい。ヒトＮＫ細胞に関しては、ＣＤ１６およびＣＤ５６が好ましい。

前述の表面抗原は当該分野で確立された名称で呼ばれる（ケネスマーフィー（Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｍｕｒｐｈｙ）、ジェンウェイの免疫生物学（Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ）第７版、ガーランドサイエンス（Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、ウィリアムＥ．ポール（Ｗｉｌｌｉａｍ Ｅ． Ｐａｕｌ）、基礎免疫学（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｎｏｌｏｇｙ）第７版、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンスも参照のこと）。

さらに好ましい態様において、前記ポリペプチドは二量体化領域をさらに含む。前記二量体化領域は共有結合性二量体化および／または非共有結合性二量体化をもたらし得る。

二量体化によって、二重特異性二価抗体は二重特異性四価になる（または、異なる二重特異性抗体が産生細胞中で共発現した場合は四重特異性四価にさえもなる）。本明細書に記載の二重特異性四価の試薬は、そのＮ末端側およびそのＣ末端側それぞれに同型の２つの抗原分子を結合可能であるため、標準的な単一特異性抗体と同程度の増加された結合力を持つことが期待される。

特に好ましい態様において、本発明のポリペプチド２つを連結する前記二量体化領域はＩｇＧ重鎖のヒンジ領域からなるか、または抗体の重鎖の二量体化を担うシステイン残基を含む。好ましくは、前記二量体化領域はアミノ酸３２個分の長さのサブ配列、いわゆる重鎖のヒンジ領域
配列番号４３〜４６を参照のこと）からなり、かつ、抗体の重鎖の二量体化を担うシステイン残基（前記配列の下線部）を２つ含む。好ましくは、異常なジスルフィド架橋を防ぐために、自然抗体のＩｇＧ重鎖定常ドメインとＩｇＧ軽鎖定常ドメインとの間の分子間ジスルフィド結合を媒介するＩｇＧ重鎖のヒンジ領域内にある１つのシステイン残基をセリンに変異させる。

非共有結合性二量体化に好適な二量体化ドメインは当該分野で知られており、例としてはロイシンジッパーが挙げられる。

さらに好ましい態様では、前記ポリペプチドはさらにスペーサー領域を含み、前記スペーサー領域は好ましくはＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含み、前記スペーサー領域は（ｉ）前記第一のｓｃＦｖ断片と（ｉｉ）前記第二のｓｃＦｖ断片または前記ポリペプチドのアミノ酸配列中に含まれる前記組換えリガンドとの間に位置する。

ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメイン、特にＩｇＧ由来のＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを含むか、またはそれらからなるスペーサー領域が有利である。それらのプロテインＡと結合する能力により、産生細胞からの分泌効率が良くなり、および／または試薬から次の精製を行うことができる。

一方の前記ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインおよび他方の前記二量体化領域のどちらも、ＩｇＧの対応する領域から提供されてもよく、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ２分子、さらに好ましくはヒトＩｇＧ１またはｌｇＧ２（ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２）分子の対応する領域から提供されてもよい。ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよび二量体化ドメインを提供するｈＩｇＧ１分子の好ましいサブ配列は配列４３〜４６に見ることができる。好ましくは（およびこれは前述の配列に当てはまるが）、ｈＩｇＧ１の一部、具体的には前記ＣＨ２ドメインの複数の位置に、Ｆｃ受容体への結合を減少または消失させるために突然変異を誘発した（さらに下方に記載の配列では太字イタリック体で示した）。より一般的には、Ｆｃ領域、具体的にはＣＨ₂ドメインおよび／またはＣＨ₃ドメインの１つ以上の位置を変異させてＦｃ受容体への結合の減少または消失を起こしてもよい。そのような手法は当該分野で知られており、例えば、アーマー（Ａｒｍｏｕｒ）ら、Ｆｃγ受容体Ｉ結合活性と単球惹起活性を欠く組換えヒトＩｇＧ分子（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｌａｃｋｉｎｇ Ｆｃｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｉ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ）欧州免疫学雑誌 １９９９．２９：２６１３〜２６２４、およびラザール（Ｌａｚａｒ）ら、強化したエフェクター機能を有する改変抗体Ｆｃ変異体（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｃ ｖａｒｉａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）米国科学アカデミー紀要、米国、２００６、１０３：４００５〜４０１０に記載されている。抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）の誘発は本発明において好ましくないため、これらの手法が有利である。

言い換えると、抗体Ｆｃ断片を使用してスペーサー領域および二量体化領域を構築することができる。「Ｆｃ断片」という用語は当業者に知られており、パパインによる切断によって得られた、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むＩｇＧの断片を定義する。

前記第一のｓｃＦｖ断片と前記スペーサー領域との間および／または前記スペーサー領域と前記第二のｓｃＦｖ断片との間に、リンカー配列が存在する。本明細書の前段で開示したリンカー配列が好ましい。配列表に含まれるその好ましい配列（具体的には配列番号４３〜４６の配列）から分かるように、そのようなリンカー配列はグリシンまたはグリシンおよびセリンからなってよい。

図２は二量体化領域（ｈＩｇＧヒンジ領域）ならびに２つのｓｃＦｖ断片を互いに隔てているＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む、本発明の好ましいポリペプチドの分子構造を示している。

「ＣＨ２ドメイン」および「ＣＨ３ドメイン」という用語は当該分野で確立された意味を有する。それらの用語は、抗体重鎖の第二の定常ドメインおよび第三の定常ドメインを指す。

ポリペプチドに関して特に好ましい態様は、（ａ）第一の抗原に結合するよう構成された６個の相補性決定領域（ＣＤＲ）の第一の組、および（ｂ）（ｂａ）第二の抗原に結合するよう構成された６個のＣＤＲの第二の組、または（ｂｂ）第二の抗原に結合可能なリガンド、を含むポリペプチドであって、（ｉ）前記第一の抗原がＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）小型表面抗原、ＨＢＶ中型表面抗原、およびＨＢＶ大型表面抗原から選択され、（ｉｉ）前記第二の抗原がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞や細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）などの免疫エフェクター細胞によって発現される表面抗原から選択されるポリペプチドを提供し、ここで（ｃ）前記６個のＣＤＲの第一の組は第一のｓｃＦｖ断片に含まれ、および（ｄ）（ｄａ）前記６個のＣＤＲの第二の組は第二のｓｃＦｖ断片に含まれ、または（ｄｂ）前記リガンドは好ましくはＮＫＧ２Ｄ（例えばリガンドＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１−６）、ＮＫｐ３０（例えばリガンドＢ７−Ｈ６）、４−１ＢＢ（例えばリガンド４−１ＢＢ−Ｌ）、またはＯＸ４０（例えばリガンドＯＸ４０−Ｌ）に結合可能な免疫リガンドであって、ここで免疫エフェクター細胞よって発現される前記表面抗原は、ＣＤ３、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０および４−１ＢＢから選択され、ここで前記ポリペプチドは二量体化領域およびスペーサー領域をさらに含み、前記二量体化領域および前記スペーサー領域が好ましくは前段でさらに定義した態様であることが理解される。

さらに好ましい態様では、（ａ）前記６個のＣＤＲの第一の組は配列番号１〜６、７〜１２または１３〜１８の配列を有し、および／または（ｂ）前記６個のＣＤＲの第二の組は配列番号１９〜２４、２５〜３０、３１〜３６または３７〜４２の配列を有する。

当該分野で知られているように、さらに本明細書に含まれる配列表から明らかなように、前述した６個のＣＤＲの組のそれぞれにおけるＣＤＲは、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、次いで軽鎖ＣＤＲ３の順になっている。

配列表に使用されているＣ８、５Ｆ９、５Ａ１９、ＯＫＴ３、９．３、Ａ９およびＮＣＡＭ２９．２は各ＣＤＲの由来となった抗体を指し、それぞれ、好ましい抗ＨＢｓ抗体、第二の異なる抗ＨＢｓ抗体、抗ＨＢＶ大型表面抗原抗体、抗ヒトＣＤ３抗体、抗ヒトＣＤ２８抗体、抗ヒトＣＤ１６抗体、および抗ヒトＣＤ５６抗体を指す。「ＨＢｓ」はＨＢＶ小型表面抗原を指す。

特に好ましくは、前記ポリペプチドは、配列番号４３〜４６のいずれか１つのアミノ酸配列、または配列番号４３〜４６のいずれか１つと少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列を含むかまたはそのようなアミノ酸配列からなる。ただし、少なくとも８０％の同一性を示す前記アミノ酸配列のＣＤＲは、配列番号４３〜４６のいずれか１つとそれぞれ同一である。配列番号４３において、最後の３残基「ＧＮＳ」は欠失可能である。

配列同一性の好ましいレベルには、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％が含まれる。配列同一性を決定する手段および方法は当該分野でよく知られている。一対の配列の同一性を決定する好ましいアルゴリズムには例えば、マックギニスおよびメイデン（ＭｃＧｉｎｎｉｓ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ）、核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）３２、Ｗ２０〜Ｗ２５（２００４））に記載されている、基礎的な局所配列相同性検索ツール（Ｔｈｅ ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ））がある。

所定の配列（本件では配列番号４３〜４６の配列）における前記ＣＤＲの位置は、当該分野で確立された方法によって決定することができる。当該分野で確立された知られている方法としては、コチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）、カバット（Ｋａｂａｔ）およびルフラン（ＬｅＦｒａｎｃ）／ＩＭＧＴのそれぞれのシステムが挙げられる。相反する表示がない場合、前段で定義した特に好ましい態様によるＣＤＲは前段で定義したものであると理解される。すなわち、配列番号１〜６、７〜１２または１３〜１８の配列を有する第一の組、および配列番号１９〜２４、２５〜３０、３１〜３６または３７〜４２の配列を有する第二の組である。本明細書に添付の配列表に含まれる配列から分かるように、これら特定のＣＤＲ配列（さらに下方に転載した配列の下線部）は実際に配列番号４３〜４６の配列に含まれている。

配列番号１〜６の配列はＣＤＲを定義し、配列番号３７〜４０の配列はＨＢＶの小型表面抗原に含まれる特定のエピトープに結合可能な二重特異性ポリペプチドを定義する。このエピトープは、感染細胞およびビリオンそれぞれの表面に露出したａ−決定因子に位置する。「ａ−決定因子」という用語は、防御的な液性免疫応答を誘発する主要なエピトープが位置している、ＨＢＶの小型表面抗原中の領域を示すのに使用される。これらのＣＤＲならびに配列番号４３〜４６のポリペプチドは、すべてのＨＢＶ血清型に使用可能であるという利点を有する。

第二の側面において、本発明は前段で定義したポリペプチドをコードする核酸を提供する。ポリペプチドの好ましい態様が、対応する前記核酸の好ましい態様の元になる。

「核酸」という用語は当該分野で確立された意味を有するが、特に限定されない。好ましくは、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのようなＤＮＡならびにｍＲＮＡのようなＲＮＡである。好ましくはないが、ヌクレオチド誘導体の使用も想定され、ヌクレオチド誘導体としては、２’メチルヌクレオチドのような２’誘導化ヌクレオチド、ペプチド核酸中に生じるペプチドヌクレオチドなどが挙げられる。

第三の側面において本発明は、第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドを含むか、またはそれらからなる共有結合複合体であって、前記第一のポリペプチドと前記第二のポリペプチドの間に少なくとも１つの共有結合があり、好ましくは前記第一のポリペプチドのＣｙｓ残基と前記第二のポリペプチドのＣｙｓ残基との間に少なくとも１つのジスルフィド架橋があり、前記第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドが本発明によって定義されたものである、共有結合複合体を提供する。

好ましくは前記第一のポリペプチドと前記第二のポリペプチドの間に２つの共有結合があること、図２に図示するように２つのジスルフィド結合があることが好ましい。

第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドを含むか、またはそれらからなる複合体であって、前記第一ポリペプチドと前記第二のポリペプチドが互いに非共有結合されている複合体も提供される。

そのような共有結合複合体の例を図２に示す。前記複合体が二量体であることが好ましい。

第四の側面において本発明は、１つ以上の本発明よるポリペプチドおよび／または１つ以上の本発明による複合体を含むか、またはそれらからなる組成物を提供する。ただし前記組成物は少なくとも２つのポリペプチドを含み、その２つのポリペプチドはそれらが結合する前記第一の抗原および／または前記第二の抗原の点で互いに異なる。

前記第四の側面の好ましい態様において、前記２つのポリペプチドは、（ａ）（ｉ）ＨＢＶ小型表面抗原もしくは大型表面抗原およびＣＤ３に結合するポリペプチド、および（ｉｉ）ＨＢＶ小型表面抗原もしくは大型表面抗原およびＣＤ２８に結合するポリペプチド、または（ｂ）（ｉ）ＨＢＶ小型表面抗原もしくは大型表面抗原およびＣＤ１６に結合するポリペプチド、ならびに（ｉｉ）ＨＢＶ小型表面抗原もしくは大型表面抗原およびＣＤ５６に結合するポリペプチドである。

この好ましい態様の選択肢（ａ）ならびに（ｂ）のどちらも、特にＨＢＶ小型表面抗原に結合するポリペプチドに関する範囲で、陰性対照と比較して非常に高い、最大９５％の排除率を提供する。これにより、特にインビボ状態で反復投与後に、ＨＢＶ感染細胞またはＨＢＶ抗原陽性の腫瘍細胞を完全に根絶することが期待される。

２つの異なるＣＴＬマーカーまたはＮＫマーカーに結合する二重特異性分子を組み合わせて使用すると、相乗効果が得られることが分かっている。図３および図４Ｂは、二重特異性構築物を投与した際の特異的標的細胞の溶解の比較を示す。

特に好ましい態様において前記２つのポリペプチドは、（ａ）配列番号４３および４４の配列、または（ｂ）配列番号４５および４６の配列を含むか、またはそれらからなる。

配列番号４３〜４６の配列はそれぞれ、ホモ二量体が形成された場合に、２つのジスルフィド架橋の形成を可能にする。とはいえ、ヘテロ二量体も形成されるということも慎重に想定される。ヘテロ二量体の例としては、第一のポリペプチドがＨＢＶ表面抗原と免疫エフェクター細胞によって発現される第一のマーカーに結合し、第二のポリペプチドがＨＢＶ表面抗原および免疫エフェクター細胞の第二のマーカーに結合する、本発明の２つのポリペプチドの共有結合複合体が挙げられる。免疫エフェクター細胞の２つのマーカーは例えば、ＣＤ３およびＣＤ２８、あるいはＣＤ１６およびＣＤ５６であってよい。

さらなる側面において本発明は、１つ以上の本発明のポリペプチド、１つ以上の本発明の複合体、および／または１つ以上の本発明の組成物を含むか、またはそれらからなる医薬組成物を提供する。

医薬組成物は、薬学上許容可能な担体、賦形剤および／または希釈剤をさらに含んでよい。好適な医薬担体、賦形剤および／または希釈剤は当該分野でよく知られており、リン酸緩衝生理食塩水、水、水中油型乳剤などの乳剤、様々な種類の湿潤剤、滅菌溶液などを含む。このような担体を含む組成物は、よく知られている標準的な方法によって製剤化することができる。これらの医薬組成物は好適な投与量を対象に投与することができる。好適な組成物の投与は例えば、静脈内、皮下または経口投与などの異なる方法で実施可能であり、これらの３つの選択肢が好ましく、さらに腹腔内、筋内、局所、皮内、鼻腔内または気管支内投与により実施可能である。経口投与用の製剤には錠剤およびシロップが含まれる。特に好ましくは、前記投与は注入により行われる。組成物は例えば、微粒子銃送達によって外部のまたは内部の標的部位に直接投与してもよい。投与計画は主治医および臨床的要因により決定される。医療業界ではよく知られているように、任意の患者への用量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与される具体的な化合物、性別、投与の時間および経路、総体的な健康状態、および他の併用される薬剤などの多くの要因によって決まる。タンパク質性の医薬活性物質が体重１キログラム当たりの投与量に１ｎｇ〜１０ｍｇ含まれていてもよい。しかし、特に前述の要因を考慮して、この例示した範囲を下回るまたは上回る投与量も予想される。その投与計画が持続点滴である場合にも、体重１キログラム当たり毎分１μｇ〜１０ｍｇの範囲内でなければならない。

静脈内投与が特に好ましい。

さらなる側面において本発明は、ＨＢＶ感染および／または前記ＨＢＶ感染に起因する症状を治療または予防する方法において使用される、本発明に記載のいずれか１つ以上のポリペプチド、本発明に記載の１つ以上の複合体、および／または本発明に記載のいずれか１つ以上の組成物を提供し、ここで前記ＨＢＶ感染に起因する症状は肝硬変、肝細胞癌、および肝臓癌から選択され、前記肝臓癌は１つ以上のＨＢＶ表面抗原の発現によって特徴付けられる。

さらなる側面において本発明は、ＨＢＶ感染および／または前記ＨＢＶ感染に起因する症状を治療または予防する方法を提供し、前記ＨＢＶ感染に起因する症状は肝硬変および肝細胞癌から選択され、前記方法は、治療上有効量または予防量の、１つ以上の本発明のポリペプチド、１つ以上の本発明の複合体、および／または１つ以上の本発明の組成物をそれぞれ、それを必要とする患者に投与することを含む。

前記医薬組成物、治療方法および前記治療方法において使用される前記ポリペプチド／複合体／組成物、前述のポリペプチド、複合体および／または組成物が、含まれるまたは使用される唯一の医薬的に活性な薬剤であることが好ましい。

とはいえ、併用療法において１つ以上のさらなる医薬的に活性な薬剤を組み入れることも慎重に想定される。そのようなさらなる医薬的に活性な薬剤は、インターフェロンまたは他の免疫調節剤（例えば、インターフェロンアルファ２ａまたは２ｂ、インターフェロンラムダなど）、ヌクレオシド／ヌクレオチド類似体のような直接作用する抗ウイルス剤（例えば、ラミブジン（エピビル−ＨＢＶ、ゼフィックスまたはヘプトジン）、アデホビルジピボキシル（ヘプセラ、プレベオン（Ｐｒｅｖｅｏｎ））、エンティカビル（バラクルード、Ｅｎｔａｌｉｖ）、テルビブジン（タイゼカ（Ｔｙｚｅｋａ）、セビボ）、テノホビル（ビリアード））、侵入阻害剤（例えば、ミルクルデックス（Ｍｙｒｃｌｕｄｅｘ）−Ｂなど）、他の抗ウイルス剤、またはインターロイキン−２のようなサイトカインから選択することができる。

さらなる側面において、本発明はＨＢＶ感染細胞を死滅させるインビトロ方法を提供し、前記方法は前記ＨＢＶ感染細胞を（ｉ）免疫エフェクター細胞および（ｉｉ）１つ以上の本発明のポリペプチド、１つ以上の本発明の複合体および／または１つ以上の本発明の組成物とともに培養することを含む。

インビトロ方法の好ましい態様において、前記免疫エフェクター細胞は、（ｉ）末梢血単核細胞に含まれる、または（ｉｉ）ＮＫ細胞および／またはＣＴＬであるか、またはそれらを含む。

さらなる側面において本発明は、インビトロまたはエキソビボ免疫エフェクター細胞を提供し、前記免疫エフェクター細胞は、当該免疫エフェクター細胞の表面抗原に結合している本発明のポリペプチドまたは本発明による複合体を含む。好ましい免疫エフェクター細胞および免疫エフェクター細胞によって発現される好ましい表面抗原は前段で定義した通りである。そのような免疫エフェクター細胞は、ＨＢＶ感染、肝硬変または肝細胞癌を患う患者への投与に有用である。したがって、それ自体の表面抗原、本発明のポリペプチドまたは本発明よる複合体に結合している免疫エフェクター細胞を含むか、またはそれからなる医薬組成物も提供される。ＨＢＶ感染、肝硬変または肝細胞癌の治療または予防に使用される、それ自体の表面抗原、本発明のポリペプチドまたは本発明よる複合体に結合している免疫エフェクター細胞も提供される。

本出願において開示される配列
配列番号１
Ｃ８ ＨＣ ＣＤＲ１
Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｌａ
配列番号２
Ｃ８ ＨＣ ＣＤＲ２
Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ
配列番号３
Ｃ８ ＨＣ ＣＤＲ３
Ａｌａ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ
配列番号４
Ｃ８ ＬＣ ＣＤＲ１
Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ
配列番号５
Ｃ８ ＬＣ ＣＤＲ２
Ａｓｐ Ａｓｐ Ｓｅｒ
配列番号６
Ｃ８ ＬＣ ＣＤＲ３
Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｖａｌ
配列番号７
５Ｆ９ ＨＣ ＣＤＲ１
Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｌａ
配列番号８
５Ｆ９ ＨＣ ＣＤＲ２
Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｔｈｒ
配列番号９
５Ｆ９ ＨＣ ＣＤＲ３
Ａｌａ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｓｐ Ｔｙｒ
配列番号１０
５Ｆ９ ＬＣ ＣＤＲ１
Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｔｈｒ
配列番号１１
５Ｆ９ ＬＣ ＣＤＲ２
Ｔｒｐ Ａｌａ Ｓｅｒ
配列番号１２
５Ｆ９ ＬＣ ＣＤＲ３
Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｔｈｒ
配列番号１３
５Ａ１９ ＨＣ ＣＤＲ１
Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ａｌａ
配列番号１４
５Ａ１９ ＨＣ ＣＤＲ２
Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ａｌａ
配列番号１５
５Ａ１９ ＨＣ ＣＤＲ３
Ａｌａ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ｔｙｒ
配列番号１６
５Ａ１９ ＬＣ ＣＤＲ１
Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｔｙｒ
配列番号１７
５Ａ１９ ＬＣ ＣＤＲ２
Ｔｒｐ Ａｌａ Ｓｅｒ
配列番号１８
５Ａ１９ ＬＣ ＣＤＲ３
Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｔｈｒ
配列番号１９
ＯＫＴ３ ＨＣ ＣＤＲ１
Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｔｈｒ
配列番号２０
ＯＫＴ３ ＨＣ ＣＤＲ２
Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｔｈｒ
配列番号２１
ＯＫＴ３ ＨＣ ＣＤＲ３
Ａｌａ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｔｙｒ
配列番号２２
ＯＫＴ３ ＬＣ ＣＤＲ１
Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｔｙｒ
配列番号２３
ＯＫＴ３ ＬＣ ＣＤＲ２
Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｓｅｒ
配列番号２４
ＯＫＴ３ ＬＣ ＣＤＲ３
Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｔｈｒ
配列番号２５
９．３ ＨＣ ＣＤＲ１
Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｇｌｙ
配列番号２６
９．３ ＨＣ ＣＤＲ２
Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｔｈｒ
配列番号２７
９．３ ＨＣ ＣＤＲ３
Ａｌａ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｔｙｒ
配列番号２８
９．３ ＬＣ ＣＤＲ１
Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ
配列番号２９
９．３ ＬＣ ＣＤＲ２
Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ
配列番号３０
９．３ ＬＣ ＣＤＲ３
Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｔｈｒ
配列番号３１
Ａ９ ＨＣ ＣＤＲ１
Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｔｒｐ
配列番号３２
Ａ９ ＨＣ ＣＤＲ２
Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｔｈｒ
配列番号３３
Ａ９ ＨＣ ＣＤＲ３
Ａｌａ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｖａｌ
配列番号３４
Ａ９ ＬＣ ＣＤＲ１
Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｙｒ
配列番号３５
Ａ９ ＬＣ ＣＤＲ２
Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ
配列番号３６
Ａ９ ＬＣ ＣＤＲ３
Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ｖａｌ
配列番号３７
ＮＣＡＭ２９．２ ＨＣ ＣＤＲ１
Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｇｌｙ
配列番号３８
ＮＣＡＭ２９．２ ＨＣ ＣＤＲ２
Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｉｌｅ
配列番号３９
ＮＣＡＭ２９．２ ＨＣ ＣＤＲ３
Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｔｙｒ
配列番号４０
ＮＣＡＭ２９．２ ＬＣ ＣＤＲ１
Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｔｙｒ
配列番号４１
ＮＣＡＭ２９．２ ＬＣ ＣＤＲ２
Ｔｒｐ Ａｌａ Ｓｅｒ
配列番号４２
ＮＣＡＭ２９．２ ＬＣ ＣＤＲ３
Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｔｈｒ
配列番号４３
Ｃ８−ｈＩｇＧ１Ｆｃ_mut−ＯＫＴ３
配列番号４４
Ｃ８ ｈＩｇＧ１Ｆｃ_mut−９．３
配列番号４５
Ｃ８ ｈＩｇＧ１Ｆｃ_mut−Ａ９
配列番号４６
Ｃ８ ｈＩｇＧ１Ｆｃ_mut−ＮＣＡＭ２９．２
配列番号４７
Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ
配列番号４８
Ａｌａ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｒｇ Ｖａｌ
配列番号４９
Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ

図面によって本発明を説明する。
ｓｃＦｖ断片は２つの可変ドメインを融合して得た。融合には、可変ドメインそれぞれの構造と干渉しないまたは実質的に干渉しない柔軟なペプチドリンカーを使用する。 ジスルフィド結合の形成による、本発明のポリペプチド２つの二量体化。各ポリペプチドはそれぞれ二重特異性二価抗体を含む。産生細胞の小胞体における自然抗体の二量体化により、２つの二重特異性二価抗体が同時に発現した場合、二重特異性四価抗体、または三重もしくは四重特異性四価抗体が形成される場合がある（図示せず）。 一種類の二重特異性抗体のみ投与した場合と、２種類のＣＴＬ特異的二重特異性抗体または２種類のＮＫ細胞特異的二重特異性抗体を同時投与した場合の相乗効果とにおける、肝癌標的細胞を産生するＨＢＶ表面抗原特異的な排除の比較。セルタイター・ブルー（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ）細胞生存率アッセイを使用した。 本発明の二重特異性抗体の存在下における免疫エフェクター細胞活性化の指標となるサイトカインの分泌。前述の二重特異性抗体の存在下または非存在下で、ＨＢＶ感染ＨｅｐａＲＧ細胞をＰＢＭＣと共培養した。 免疫エフェクター細胞と二重特異性抗体との共培養におけるＨＢＶ感染標的細胞特異的な排除。矢印はＰＢＭＣおよび二重特異性抗体の添加を示す。丸で表した曲線はＨＢｓを導入したＨｕＨ７−Ｓ細胞を示し、菱形で表した曲線はＨｕＨ７親肝癌細胞を示す。エクセリジェンス（ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ）リアルタイム細胞傷害性アッセイを使用する。０時間を基準として細胞指数を正規化した。 各ＨＢｓ反応性二重特異性抗体存在下でＰＢＭＣと共培養した標的細胞の生存率。二重特異性一本鎖抗体は標的細胞の溶解を媒介する。αＨＢｓ×αＣＤ３の刺激の効果。矢印はＰＢＭＣおよび二重特異性抗体の添加を示す。丸で表した曲線はＨＢｓを導入したＨｕＨ７−Ｓ細胞を示し、菱形で表した曲線はＨｕＨ７親肝癌細胞を示す。エクセリジェンス（ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ）リアルタイム細胞傷害性アッセイを使用する。０時間を基準として細胞指数を正規化した。 各ＨＢｓ反応性二重特異性抗体存在下でＰＢＭＣと共培養した標的細胞の生存率。二重特異性一本鎖抗体は標的細胞の溶解を媒介する。αＨＢｓ×αＣＤ３［ＦｃΔＡＤＣＣ］の刺激の効果。矢印はＰＢＭＣおよび二重特異性抗体の添加を示す。丸で表した曲線はＨＢｓを導入したＨｕＨ７−Ｓ細胞を示し、菱形で表した曲線はＨｕＨ７親肝癌細胞を示す。エクセリジェンス（ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ）リアルタイム細胞傷害性アッセイを使用する。０時間を基準として細胞指数を正規化した。 各ＨＢｓ反応性二重特異性抗体存在下でＰＢＭＣと共培養した標的細胞の生存率。二重特異性一本鎖抗体は標的細胞の溶解を媒介する。αＨＢｓ×αＣＤ２８の刺激の効果。矢印はＰＢＭＣおよび二重特異性抗体の添加を示す。丸で表した曲線はＨＢｓを導入したＨｕＨ７−Ｓ細胞を示し、菱形で表した曲線はＨｕＨ７親肝癌細胞を示す。エクセリジェンス（ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ）リアルタイム細胞傷害性アッセイを使用する。０時間を基準として細胞指数を正規化した。 各ＨＢｓ反応性二重特異性抗体存在下でＰＢＭＣと共培養した標的細胞の生存率。二重特異性一本鎖抗体は標的細胞の溶解を媒介する。αＨＢｓ×αＣＤ２８［ＦｃΔＡＤＣＣ］の刺激の効果。矢印はＰＢＭＣおよび二重特異性抗体の添加を示す。丸で表した曲線はＨＢｓを導入したＨｕＨ７−Ｓ細胞を示し、菱形で表した曲線はＨｕＨ７親肝癌細胞を示す。エクセリジェンス（ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ）リアルタイム細胞傷害性アッセイを使用する。０時間を基準として細胞指数を正規化した。 各ＨＢｓ反応性二重特異性抗体存在下でＰＢＭＣと共培養した標的細胞の生存率。二重特異性一本鎖抗体は標的細胞の溶解を媒介する。αＨＢｓ×αＣＤ３の刺激の効果（Ａ）とαＨＢｓ×αＣＤ２８の刺激の効果（Ｃ）を集約したグラフ。矢印はＰＢＭＣおよび二重特異性抗体の添加を示す。丸で表した曲線はＨＢｓを導入したＨｕＨ７−Ｓ細胞を示し、菱形で表した曲線はＨｕＨ７親肝癌細胞を示す。エクセリジェンス（ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ）リアルタイム細胞傷害性アッセイを使用する。０時間を基準として細胞指数を正規化した。 各ＨＢｓ反応性二重特異性抗体存在下でＰＢＭＣと共培養した標的細胞の生存率。二重特異性一本鎖抗体は標的細胞の溶解を媒介する。αＨＢｓ×αＣＤ３［ＦｃΔＡＤＣＣ］の刺激の効果（Ｂ）とαＨＢｓ×αＣＤ２８［ＦｃΔＡＤＣＣ］の刺激の効果（Ｄ）を集約したグラフ。矢印はＰＢＭＣおよび二重特異性抗体の添加を示す。丸で表した曲線はＨＢｓを導入したＨｕＨ７−Ｓ細胞を示し、菱形で表した曲線はＨｕＨ７親肝癌細胞を示す。エクセリジェンス（ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ）リアルタイム細胞傷害性アッセイを使用する。０時間を基準として細胞指数を正規化した。 ＨＢｓ反応性二重特異性抗体の存在下でＰＢＭＣと共培養した標的細胞の生存率。二重特異性抗体の併用により標的細胞は大量に死滅する。αＨＢｓ×αＣＤ３およびαＨＢｓ×αＣＤ２８の刺激の効果。矢印はＰＢＭＣおよび二重特異性抗体の添加を示す。丸で表した曲線はＨＢｓを導入したＨｕＨ７−Ｓ細胞を示し、菱形で表した曲線はＨｕＨ７細胞を示す。０時間を基準として細胞指数を正規化した。 ＨＢｓ反応性二重特異性抗体の存在下でＰＢＭＣと共培養した標的細胞の生存率。二重特異性抗体の併用により標的細胞は大量に死滅する。αＨＢｓ×αＣＤ３［ＦｃΔＡＤＣＣおよびαＨＢｓ×αＣＤ２８ ［ＦｃΔＡＤＣＣ］の刺激の効果。矢印はＰＢＭＣおよび二重特異性抗体の添加を示す。丸で表した曲線はＨＢｓを導入したＨｕＨ７−Ｓ細胞を示し、菱形で表した曲線はＨｕＨ７細胞を示す。０時間を基準として細胞指数を正規化した。 ＨＢｓ反応性二重特異性抗体の存在下でＰＢＭＣと共培養した標的細胞の生存率。二重特異性抗体の併用により標的細胞は大量に死滅する。αＨＢｓ×αＣＤ３およびαＨＢｓ×αＣＤ２８の刺激の効果。二重特異性抗体単体の効果と併用した場合の効果の比較。矢印はＰＢＭＣおよび二重特異性抗体の添加を示す。丸で表した曲線はＨＢｓを導入したＨｕＨ７−Ｓ細胞を示し、菱形で表した曲線はＨｕＨ７細胞を示す。０時間を基準として細胞指数を正規化した。 ＨＢｓ反応性二重特異性抗体の存在下でＰＢＭＣと共培養した標的細胞の生存率。二重特異性抗体の併用により標的細胞は大量に死滅する。αＨＢｓ×αＣＤ３およびαＨＢｓ×αＣＤ２８の刺激の効果。二重特異性抗体単体の効果と併用した場合の効果の比較。矢印はＰＢＭＣおよび二重特異性抗体の添加を示す。丸で表した曲線はＨＢｓを導入したＨｕＨ７−Ｓ細胞を示し、菱形で表した曲線はＨｕＨ７細胞を示す。０時間を基準として細胞指数を正規化した。 異なる濃度の二重特異性抗体の存在下でＰＢＭＣと共培養した標的細胞の生存率。αＨＢｓ×αＣＤ３抗体を含んでいる上清の５０μｌとαＨＢｓ×αＣＤ２８抗体を含んでいる上清５０μｌの混合液。標的細胞の溶解が２５μｌ／２５μｌ混合液より早く誘発されたことから、効果が投与量に依存することが分かった。矢印はＰＢＭＣおよび二重特異性抗体の添加を示す。丸で表した曲線はＨＢｓを導入したＨｕＨ７−Ｓ細胞を示し、菱形で表した曲線はＨｕＨ７細胞を示す。０時間を基準として細胞指数を正規化した。 異なる濃度の二重特異性抗体の存在下でＰＢＭＣと共培養した標的細胞の生存率。αＨＢｓ×αＣＤ３［ＦｃΔＡＤＣＣ］抗体を含んでいる上清の５０μｌとαＨＢｓ×αＣＤ２８［ＦｃΔＡＤＣＣ］抗体を含んでいる上清５０μｌの混合液。標的細胞の溶解が２５μｌ／２５μｌ混合液より早く誘発されたことから、効果が投与量に依存することが分かった。矢印はＰＢＭＣおよび二重特異性抗体の添加を示す。丸で表した曲線はＨＢｓを導入したＨｕＨ７−Ｓ細胞を示し、菱形で表した曲線はＨｕＨ７細胞を示す。０時間を基準として細胞指数を正規化した。 αＨＢｓ×αＣＤ３とαＨＢｓ×αＣＤ２８の混合液の存在下で異なる量のＰＢＭＣと共培養した標的細胞の生存率。２×１０⁵個のＰＢＭＣは１×１０⁵個のＰＢＭＣより有意に早くＨｕＨ７−Ｓ細胞を排除する。矢印はＰＢＭＣおよび二重特異性抗体の添加を示す。丸で表した曲線はＨＢｓを導入したＨｕＨ７−Ｓ細胞を示し、菱形で表した曲線はＨｕＨ７細胞を示す。０時間を基準として細胞指数を正規化した。 αＨＢｓ×αＣＤ３／αＨＢｓ×αＣＤ２８の混合液の存在下で様々な期間、ＰＢＭＣと共培養した標的細胞の生存率。図示した刺激期間経過後、二重特異性抗体を含んでいる上清を除去した。４時間の刺激では、標的細胞生存率がわずかに減少しただけであった（試験終了時の生存率７８．５％）。ＰＢＭＣを二重特異性抗体で８時間以上刺激したところ、標的細胞の排除が誘発された。８時間および１２時間刺激後の標的細胞の死滅は、２４時間または４８時間の刺激に比べてゆるやかであり、このことから、活性化が持続し、エフェクター細胞が再標的化されることが示唆された。しかし、４８時間刺激したＨｕＨ７−Ｓの試験終了時の生存率は、比較に価するものだった：８時間刺激：１４．７％、１２時間刺激：１１．７％、２４時間刺激：５．１％、４８時間刺激：３．２％）。矢印はＰＢＭＣおよび二重特異性構築物の添加を示す。ＨｕＨ７−Ｓ細胞の生存率動態を示す。０時間を基準として細胞指数を正規化した。 αＨＢｓ×αＣＤ３／αＨＢｓ×αＣＤ２８の存在下でＨｕＨ７−Ｓ／ＨｕＨ７細胞と共培養したＰＢＭＣの、様々な時点におけるＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α分泌。ＩＬ−２濃度は時間と共に増加し、２４時間後に濃度約１５５０ｐｇ／ｍｌでプラトーに達した。 αＨＢｓ×αＣＤ３／αＨＢｓ×αＣＤ２８の存在下でＨｕＨ７−Ｓ／ＨｕＨ７細胞と共培養したＰＢＭＣの、様々な時点におけるＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α分泌。ＩＦＮ−γの分泌は共培養後８時間〜１２時間の間に始まり、１２０００ｐｇ／ｍｌまで増加した（４８時間）。 αＨＢｓ×αＣＤ３／αＨＢｓ×αＣＤ２８の存在下でＨｕＨ７−Ｓ／ＨｕＨ７細胞と共培養したＰＢＭＣの、様々な時点におけるＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α分泌。ＴＮＦ−αの産生は４時間後にはすでに検出可能で、その後継続的に増加し、２４時間後にピークに達し（１７００ｐｇ／ｍｌ）、４８時間後には１４００ｐｇ／ｍｌに低下した。ＨＢｓがなくても（ＨｕＨ７細胞）ＴＮＦ−αの高いバックグラウンド分泌が検出され、これは４時間後に最高濃度に達し（およそ７０ｐｇ／ｍｌ）共培養４８時間後に９ｐｇ／ｍｌまで減少した。 ＰＢＭＣを二重特異性抗体の存在下でＨｕＨ７−Ｓ／ＨｕＨ７細胞と共培養した後のＬＡＭＰ−１染色。αＨＢｓ×αＣＤ３／αＨＢｓ×αＣＤ２８の存在下でＨｕＨ７−Ｓ（黒線）またはＨｕＨ７（灰色の線）細胞と共培養した後、エンドソームの脱顆粒マーカーＬＡＭＰ−１の表面発現をＣＤ４⁺Ｔ細胞上で検出した。 ＰＢＭＣを二重特異性抗体の存在下でＨｕＨ７−Ｓ／ＨｕＨ７細胞と共培養した後のＬＡＭＰ−１染色。αＨＢｓ×αＣＤ３［ＦｃΔＡＤＣＣ］／αＨＢｓ×αＣＤ２８［ＦｃΔＡＤＣＣ］の存在下でＨｕＨ７−Ｓ（黒線）またはＨｕＨ７（灰色の線）細胞と共培養した後、エンドソームの脱顆粒マーカーＬＡＭＰ−１の表面発現をＣＤ４⁺Ｔ細胞上で検出した。 ＰＢＭＣを二重特異性抗体の存在下でＨｕＨ７−Ｓ／ＨｕＨ７細胞と共培養した後のＬＡＭＰ−１染色。αＨＢｓ×αＣＤ３／αＨＢｓ×αＣＤ２８の存在下でＨｕＨ７−Ｓ（黒線）またはＨｕＨ７（灰色の線）細胞と共培養した後、エンドソームの脱顆粒マーカーＬＡＭＰ−１の表面発現をＣＤ８⁺Ｔ細胞上で検出した。 ＰＢＭＣを二重特異性抗体の存在下でＨｕＨ７−Ｓ／ＨｕＨ７細胞と共培養した後のＬＡＭＰ−１染色。αＨＢｓ×αＣＤ３［ＦｃΔＡＤＣＣ］／αＨＢｓ×αＣＤ２８［ＦｃΔＡＤＣＣ］の存在下でＨｕＨ７−Ｓ（黒線）またはＨｕＨ７（灰色の線）細胞と共培養した後、エンドソームの脱顆粒マーカーＬＡＭＰ−１の表面発現をＣＤ８⁺Ｔ細胞上で検出した。 αＨＢｓ×αＣＤ３／αＨＢｓ×αＣＤ２８の存在下で８時間、１２時間および２４時間、ＨｕＨ７−ＳまたはＨｕＨ７細胞と共培養したＰＢＭＣのＦＡＣＳ解析。ＩＦＮγ⁺／ＩＬ−２⁺／ＴＮＦα⁺／ＣＤ１５４⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞の割合。 αＨＢｓ×αＣＤ３／αＨＢｓ×αＣＤ２８の存在下で８時間、１２時間および２４時間、ＨｕＨ７−ＳまたはＨｕＨ７細胞と共培養したＰＢＭＣのＦＡＣＳ解析。ＩＦＮγ⁺／ＩＬ−２⁺／ＴＮＦα⁺／ＣＤ１５４⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞の割合。 αＨＢｓ×αＣＤ３／αＨＢｓ×αＣＤ２８の存在下で８時間、１２時間および２４時間、ＨｕＨ７−ＳまたはＨｕＨ７細胞と共培養したＰＢＭＣのＦＡＣＳ解析。ＩＦＮγ⁺、ＩＬ−２⁺および／またはＴＮＦα⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞のブール組み合わせゲート。 αＨＢｓ×αＣＤ３／αＨＢｓ×αＣＤ２８の存在下で８時間、１２時間および２４時間、ＨｕＨ７−ＳまたはＨｕＨ７細胞と共培養したＰＢＭＣのＦＡＣＳ解析。ＩＦＮγ⁺、ＩＬ−２⁺および／またはＴＮＦα⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞のブール組み合わせゲート。 αＨＢｓ×αＣＤ３［ＦｃΔＡＤＣＣ］／αＨＢｓ×αＣＤ２８［ＦｃΔＡＤＣＣ］の存在下で２４時間および４８時間、固定化ＨＢｓＡｇまたは可溶性ＨＢｓＡｇと共培養したＰＢＭＣのＦＡＣＳ解析。ＩＦＮγ⁺／ＩＬ−２⁺／ＴＮＦα⁺／ＣＤ１５４⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞の割合。 αＨＢｓ×αＣＤ３［ＦｃΔＡＤＣＣ］／αＨＢｓ×αＣＤ２８［ＦｃΔＡＤＣＣ］の存在下で２４時間および４８時間、固定化ＨＢｓＡｇまたは可溶性ＨＢｓＡｇと共培養したＰＢＭＣのＦＡＣＳ解析。ＩＦＮγ⁺／ＩＬ−２⁺／ＴＮＦα⁺／ＣＤ１５４⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞の割合。 αＨＢｓ×αＣＤ３［ＦｃΔＡＤＣＣ］／αＨＢｓ×αＣＤ２８［ＦｃΔＡＤＣＣ］の存在下で２４時間および４８時間、固定化ＨＢｓＡｇまたは可溶性ＨＢｓＡｇと共培養したＰＢＭＣのＦＡＣＳ解析。ＩＦＮγ⁺、ＩＬ−２⁺および／またはＴＮＦα⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞のブール組み合わせゲート。 αＨＢｓ×αＣＤ３［ＦｃΔＡＤＣＣ］／αＨＢｓ×αＣＤ２８［ＦｃΔＡＤＣＣ］の存在下で２４時間および４８時間、固定化ＨＢｓＡｇまたは可溶性ＨＢｓＡｇと共培養したＰＢＭＣのＦＡＣＳ解析。ＩＦＮγ⁺、ＩＬ−２⁺および／またはＴＮＦα⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞のブール組み合わせゲート。 ＨｕＨ７−Ｓ細胞（１１０．８ Ｓ／ＣＯ）、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞（４１．７ Ｓ／ＣＯ）、およびＨＢＶ感染ＨｅｐａＲＧ細胞（１６．５ Ｓ／ＣＯ）の上清におけるＨＢｓＡｇ。 二重特異性抗体の存在下でＰＢＭＣと共培養したＨＢＶ感染／非感染ＨｅｐａＲＧ細胞の生存率。αＨＢｓ×αＣＤ３は有意に標的細胞の溶解を媒介する。未処理細胞の試験終了時の生存率は６５．９％（ＨＢＶ＋）および６２．９％（ＨＢＶ−）である。矢印はＰＢＭＣおよび二重特異性構築物の添加を示す。丸で表した曲線はＨＢＶ感染ＨｅｐａＲＧ細胞を示し、菱形で表した曲線は非感染ＨｅｐａＲＧ細胞を示す。エクセリジェンスアッセイの０時間を基準として細胞指数を正規化した。 二重特異性抗体の存在下でＰＢＭＣと共培養したＨＢＶ感染／非感染ＨｅｐａＲＧ細胞の生存率。αＨＢｓ×αＣＤ３／αＨＢｓ×αＣＤ２８は有意に標的細胞の溶解を媒介する。未処理細胞の試験終了時の生存率は６５．９％（ＨＢＶ＋）および６２．９％（ＨＢＶ−）である。矢印はＰＢＭＣおよび二重特異性構築物の添加を示す。丸で表した曲線はＨＢＶ感染ＨｅｐａＲＧ細胞を示し、菱形で表した曲線は非感染ＨｅｐａＲＧ細胞を示す。エクセリジェンスアッセイの０時間を基準として細胞指数を正規化した。 二重特異性抗体で処置した動物における腫瘍サイズの減少。ＨＢＶ陽性のＨｅｐＧ２．２．１５皮下腫瘍を有するマウスを、ヒトＰＢＭＣおよび、αＨＢｓ×αＣＤ３とαＨＢｓ×αＣＤ２８二重特異性抗体の混合液で４日間連続して処置した。マウスを屠殺し、腫瘍サイズを分析した。

実施例により本発明を説明する。
実施例１
実施例２の材料および方法

二重特異性抗体のクローニングおよび産生
ＶＨおよびＶκ／Ｖλサブタイプのすべてをカバーするプライマーセットを使用して、逆転写したｍＲＮＡのＰＣＲ増幅により各ハイブリドーマから抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ２８（９．３）、抗ＣＤ１６（Ａ９）および抗ＣＤ５６（ＮＣＡＭ２９．２）の可変重鎖および可変軽鎖をコードする相補ＤＮＡを得た。ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（インビトロジェン、ライフテクノロジーズ）に連結し、配列を決定した。抗ＨＢｓＡｇ ｓｃＦｖ Ｃ８をコドン最適化した形で、ｐＭＰ７１−Ｃ８プラスミドに入れた。５’側および３’側に適切な制限部位を有するプライマーを使用して、前述の抗体をコードしている可変重鎖および可変軽鎖のｃＤＮＡをグリシン−セリンリンカーと会合させてｓｃＦｖを構築した。ＯＫＴ３、９．３、Ａ９、およびＮＣＡＭ２９．２ ｓｃＦｖ（Ｎ末端側に（Ｇｌｙ）_3-4が伸長したもの）を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳＩＩ＋（ストラタジーン）に入っている、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメイン（ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３）をコードするｃＤＮＡの３’末端にクローニングした。このｃＤＮＡの５’末端は、グリシン−セリンリンカーＧｌｙＡｓｎＳｅｒ（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₃ＡｌａＳｅｒおよびストレプタグ（ＳｔｒｅｐＴａｇ）配列（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）においてで伸長されており、第二シリーズの構築物では３’末端が追加のグリシン−セリンリンカー（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₃で伸長されている。Ｃ８ ｓｃＦｖのコード配列を前述の５’グリシン−セリンリンカーの５’末端にクローニングした。完全なｓｃＦｖ−リンカー−ｈＩｇＧ１Ｆｃ−リンカー−ｓｃＦｖ配列を哺乳類の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）（インビトロジェン）にサブクローニングした。マキシプレップでプラスミドＤＮＡを調整し、ｐｅｑＦＥＣＴトランスフェクション試薬（ペックラボ）を用いてＨＥＫ２９３細胞を形質転換した。０．８〜１．０ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を使用して安定な形質転換体を選抜し、増殖させた。ＨＥＫ形質転換体の上清を回収し、ＥＬＩＳＡによって分泌された二重特異性抗体の濃度を分析し、また、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ特異的ペルオキシダーゼ標識抗体を使用したウェスタンブロット法分泌された抗体の完全性を分析した。

細胞培養条件およびＨＢＶ感染
ＨｕＨ７肝癌細胞（ナカバヤシら、１９８２、合成培地における分化型ヒト肝癌細胞株の成長（Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ Ｍｅｄｉｕｍ）、癌研究（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）４２：３８５８〜３８６３）およびＨＥＫ２９３細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、およびＬ−グルタミン（２ｍｍｏｌ／Ｌ）（すべてギブコ、ライフテクノロジー）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において維持した。

末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、ＬＳＭ１０７７リンパ球分離培地（ピーエーエーラボラトリーズ（ＰＡＡ））を使用した密度勾配遠心によってヘパリン化全血から分離した。１３ｍｌのＬＳＭ１０７７の上に、２５ｍｌの血液を層状に重ねた。室温で、２０００ｒｐｍで２０分間（連続して）遠心分離した後、ＰＢＭＣを回収し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、およびＬ−グルタミン（２ｍｍｏｌ／ｌ）（すべてギブコ）を添加したＲＰＭＩ １６４０培地で培養した。一晩の静止工程の後、ＰＢＭＣまたは選別したＮＫ細胞を使用して共培養実験を行った。

Ｌ−グルタミン（５ｍｍｏｌ／ｌ）、グルコース（０．０６％［ｗｔ／ｖｏｌ］）、ヘペス（２３ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ７．４）、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、ペニシリン（５０ＩＵ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、イノシン（３７μｍｏｌ／ｌ）、ヒドロコルチゾン（４．８μｇ／ｍｌ）、およびインスリン（１μｇ／ｍｌ）を添加したウイリアムスＥ培地（インビトロジェン有限会社、カールスルーエ、ドイツ）で、ＨｅｐａＲＧ細胞を維持した。ＤＭＳＯ（１．７５％）を添加した分化培地（ウイリアムスＥ培地（上述の通り）を使用して、ＨｅｐａＲＧ細胞を感染まで４週間にわたって分化させた。分化培地にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（５％）を加え、感染効率２００のＨＢＶストックをＨｅｐａＲＧ細胞に感染させた。一晩インキュベーションした後、感染に使用した種菌を除去し、分化培地に換えて６日間培養した。再指向化したＴ細胞との共培養では、分化培地からヒドロコルチゾンを含まない培地に交換して２日間たってから共培養を開始することでヒドロコルチゾンによる免疫抑制を避けた。

ＨＢＶ表面抗原をコードするプラスミドの導入
フュージーン（ＦｕＧｅｎｅ）形質転換試薬（プロメガ）を使用して、ＨｕＨ−７細胞に種々の表面抗原をコードしているプラスミドを導入した。９６ウェルプレートの８ウェルあたり１００μｌのＯｐｔｉＭＥＭ（ギブコ社）に、３μｌのフュージーンと１μｇのプラスミドＤＮＡを加えた。フュージーンがプラスミドＤＮＡに結合するように、形質転換溶液を１５分間室温でインキュベートした。さらにＯｐｔｉＭＥＭを加えて少なくとも２４時間インキュベートした後、１ウェルあたりの最終容量を１００μｌとしてウェルに加えた。

ＮＫ細胞の磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）
ヒトＣＤ５６⁺ＣＤ１６⁺ＮＫ細胞分離キット（ミルテニーバイオテク（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ））を使用してＮＫ細胞をＰＢＭＣから分離した。最初の陰性選定行程ではＮＫ細胞の表面には発現しない抗原に対するモノクローナル抗体を使用して、すべての非ＮＫ細胞を除去した。次の陽性選定行程では、酸化鉄マイクロビーズに結合させて磁場に保持されたモノクローナルＣＤ１６抗体によってＮＫ細胞を分離した。分離後、ＮＫ細胞を前述したのと同様にＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。

ＨＢＶ陽性標的細胞と再指向化エフェクター細胞の共培養
標的細胞を９６ウェルプレートにおいて最高培養密度で培養した。１００μｌの培地に１×１０⁵個のエフェクター細胞を入れ、これを１ウェルごとに加えた。二重特異性抗体を含むＨＥＫ上清を１００μｌずつ各ウェルに加えた。相乗効果を判定するために、二重特異性抗体上清を５０μｌずつ各ウェルに加えた。未処理の標的細胞を、培地２００μｌ、エフェクター細胞のみ、または二重特異性抗体のみでインキュベートしたものを陰性対照として使用した。

エフェクター細胞活性化の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
エフェクター細胞の活性化に起因するサイトカイン分泌をＥＬＩＳＡで検出した。ヒトＩＦＮ−γエライザマックス（ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ）（登録商標）（バイオレジェンド）を使用した。マジェラン（Ｍａｇｅｌｌａｎ）６プログラムおよびインフィニット（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ）Ｆ２００（テカン）を使用して４５０ｎｍの吸光度を検出した。

標的細胞の生存率アッセイ
共培養後の標的細胞生存率を、セルタイター・ブルー（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ）細胞生存率アッセイ（プロメガ）を使用して判定した。このアッセイは、生細胞がその代謝活性により酸化還元色素（レサズリン）を蛍光産物（レゾルフィン）に変換する能力に基づいている。生育不能な細胞では代謝能が急速に失われるため、蛍光シグナルは生成されない。上清を除去した後、２０％のセルタイター・ブルー試薬を含む無色のＤＭＥＭ１００μｌを各ウェルに加えて共培養を開始し、３７℃で２時間インキュベートした。蛍光シグナルはインフィニットＦ２００（テカン）を使用して５６０ｎｍで記録した。

実施例２
結果
実験の第一ラウンドでは、ＣＴＬ表面抗原ＣＤ３およびＣＤ２８に対する二重特異性抗体構築物、およびＮＫ細胞表面抗原ＣＤ１６およびＣＤ５６に対する二重特異性抗体構築物の活性を評価した。ＨＢＶ表面抗原を産生するプラスミド導入肝癌細胞株を使用した。ＨＢＶタンパク質の発現を確認した後、これらの標的細胞を免疫エフェクター細胞、すなわちＰＢＭＣおよび分離したＮＫ細胞、ならびに二重特異性抗体構築物とともに共培養した。ＰＢＭＣはＴ細胞を約７０％含むが、ＮＫ細胞は７％しか含まない。そこで、磁気によってＣＤ１６⁺ＣＤ５６⁺ＮＫ細胞を分離した。陰性対照として、ＨＢＶを含む上清およびサブウイルス粒子を含む上清と予めインキュベートしておいたＨＢＶ陰性標的細胞を用いた共培養を分析した。これを対照とすることで、ＨＢＶ粒子がＨＢＶ陰性標的細胞の表面に非特異的に結合することによるエフェクター細胞の活性化を除外した。さらに、二重特異性構築物非存在下でＨＢＶ陽性標的細胞を免疫エフェクター細胞と共培養し、非特異的な、バックグラウンドの細胞傷害性を評価した。二重特異性構築物の細胞傷害性効果を除外するために、二重特異性構築物の存在下における免疫エフェクター細胞を含まないＨＢＶ陽性標的細胞の培養も準備した。

これらの実験では、ＣＤ３特異的またはＣＤ２８特異的構築物の存在下で共培養した場合、最大７０００ｐｇ／ｍｌまでの炎症誘発性サイトカインインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）の分泌によって判定されるＣＴＬ特異的な活性化が示された。この効果はさらに、相乗効果を生むＣＤ３特異的およびＣＤ２８特異的構築物の同時投与によって高まった。

さらに二重特異性構築物は、ＨＢｓＡｇ産生ＨｕＨ７肝癌細胞株の特異的細胞傷害性排除を媒介し（図３）、標的細胞の生存率は、対照よりも９０％ほど低下した。この細胞傷害性反応は、ＰＢＭＣおよびＨＢＶ陽性標的細胞を、ＣＤ３およびＣＤ２８に対する二重特異性構築物の共培養した場合、ならびに分離したＮＫ細胞をＣＤ１６およびＣＤ５６に対する構築物と共培養した場合に認められた。ＣＴＬ特異的構築物およびＮＫ細胞特異的構築物を同時投与することで細胞傷害性効果は排除率９５％を超えるまで、さらに相乗的に増加した。ＣＴＬおよびＮＫ細胞それぞれについて、１５％〜４０％の非特異的なバックグラウンドの細胞傷害性が認められた。

実験の第二ラウンドでは、ＨＢＶ感染ＨｅｐａＲＧ肝癌細胞を使用した。この細胞株は４週間分化させた後にＨＢＶに感染させることでき、ＨＢＶ感染組織の自然な状態を映し出す。通常、ＨｅｐａＲＧ細胞の感染率は決して１００％には届かず、この感染細胞と非感染細胞の混合物は、抗ウイルス剤治療を受けている、遊離した細胞外ウイルス粒子存在下で感染細胞と非感染細胞の両方を有するＨＢＶ感染患者における状態を模倣する。

免疫エフェクター細胞と二重特異性構築物を同時投与した共培養において、ＨＢＶ感染ＨｅｐａＲＧ細胞は、６０，０００ｐｇ／ｍｌもの量のＩＦＮ−γを分泌することでＣＴＬおよびＮＫ細胞両者の効率的な活性化を媒介する（図４Ａ）。この実験では、ＮＫ細胞を分離または濃縮せずに共培養に使用した。

さらに、二重特異性抗体構築物は活性型免疫エフェクター細胞の細胞傷害性反応をもたらし、結果としてＨＢＶ感染標的細胞の特異的排除を誘導した（図４Ｂ）。ＮＫ細胞およびＣＴＬそれぞれにおいて５０％〜７０％の排除率が認められた。非特異的なバックグラウンドの細胞傷害性はこれらの実験では生じなかった。

実施例３
実施例４の方法
二重特異性抗体構築物がＴ細胞をＨＢＶ陽性細胞にうまく再標的化することの治療可能性を分析するために、インビトロでの共培養実験を実施し、詳細に分析した。ヒトＣＤ３（αＣＤ３）およびヒトＣＤ２８（αＣＤ２８）に対する一本鎖の結合ドメインを含む二重特異性抗体構築物および、追加で、定方向突然変異をそのＦｃスペーサードメインに有し、Ｆｃγ受容体との結合を回避することによって抗体依存性細胞傷害（ΔＡＤＣＣ）を抑止するであろう構築物を使用した。これらはナチュラルキラー細胞の非特異的な活性化を除外するための安全策として構築された。一方で、すべての二重特異性抗体構築物はＨＢＶ Ｓ−タンパク質（ＨＢｓＡｇ）特異的結合ドメインＣ８を有するものとした。健常提供者の新鮮な静脈血から分離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＨＢＶ感染の代替モデルとして種々のヒト肝癌細胞株と共培養した。ＨｕＨ７−Ｓ（ＨＢＶ Ｓ抗原遺伝子導入）を使用し、陰性対照としてはＨｕＨ７およびＨＢＶ感染細胞の母細胞株（mother cell line）を、また対照として感染させていないＨｅｐａＲＧ細胞を使用した。ＨＢＶマーカーの定量の対照にはＨｅｐＧ２．２．１５（ＨＢＶゲノムを導入した）細胞を使用した。二重特異性抗体構築物を提供するために、二重特異性抗体を含む産生細胞株の上清を加えた。二重特異性抗体が媒介する細胞傷害性による標的細胞生存率の経時変化を視覚化するにはエクセリジェンスシステム使用した。この技術によって、長期培養における細胞生存率の変化をリアルタイムに監視することができる。そこで、くし形金微小電極を含む特別に設計されたマイクロタイタープレートに標的肝癌細胞を播種し、電気インピーダンスを使用して、接着標的細胞の生存率を測定値として非侵襲的に監視した。細胞傷害性排除はインピーダンスの変化をもたらし、それは細胞生存率の監視に使用されるいわゆる細胞指数（ＣＩ）値に変換可能である。

標的細胞との共培養
０日目、９６ウェルプレート（Ｅ−Ｐｌａｔｅ ９６）の１ウェルごとに、３×１０⁴個のＨｕＨ７−Ｓ／ＨｕＨ７細胞を播種した。１日目、上清を除去し、１×１０⁵個の一次ヒトＰＢＭＣを１００μｌのＰＢＭＣ培地に入れたもの、または対照には１００μｌの培地のみを各ウェルに加えた。さらに、二重特異性抗体を含む上清１００μｌを単独でまたは併用して加えた。陰性対照としては、１００μｌのＤＭＥＭ培地をウェルに加え総量を２００μｌとした。共培養を４８時間または７２時間にわたり、エクセリジェンスシステムにより監視した。

ＨｅｐａＲＧ細胞はコンフルエントな状態まで増殖させ、２１日間分化させ、ＨＢＶに感染させてから免疫療法実験を行った。

ＨｅｐａＲＧ細胞の感染には、ＰＥＧを含む分化培地でウイルスストックを作製し、それを１ウェルあたり５０μｌずつ加えた。ＰＥＧの最終濃度は５％で、ウイルスストックの感染効率は２００に設定した（１ウェルあたり７．５×１０⁶個のウイルス粒子）。感染マスターミックスを加えてから１６時間後、残留しているウイルスを除去するために細胞をＰＢＳで３回洗浄した。分化培地を加え、培地は３日おきに合計１２日間にわたり取り替えた。培地を共培養培地（免疫抑制剤であるヒドロコルチゾンを含まない）に交換してから共培養実験を行った。ＨｅｐａＲＧ細胞が順調にＨＢＶ感染したかどうかは、感染細胞の上清中のＨＢｓＡｇ（アクスシム（Ａｘｓｙｍ））およびＨＢｅＡｇ（ＢＥＰ ＩＩＩシステム）を測定して確認した。

ＰＢＭＣの調製
共培養実験用のＰＢＭＣは全血から分離した。新鮮なヘパリン化血液をＲＰＭＩ洗浄培地で１：１に希釈した。２５ｍｌの希釈血液を１５ｍｌのパーコールの上に重ね、スイングローターを有する遠心分離機で、９６０ｇで２０分間連続して遠心分離した。分離したＰＢＭＣを５０ｍｌのＲＰＭＩ培地に移した。洗浄した後、細胞を１０ｍｌのＰＢＭＣ培地で再懸濁し、細胞数を計数した。確実に至適な条件となるように、濃度を２×１０⁶細胞／ｍｌに調製した。ＰＢＭＣは一晩３７℃で休ませた。

蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）
再指向化ＰＢＭＣのエフェクター機能を調べるために、ＦＡＣＳ解析を行った。これにより、炎症誘発性サイトカインＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＴＮＦ−αの分泌、ならびに活性化マーカーＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）および脱顆粒マーカーＬＡＭＰ−１（ＣＤ１０７ａ）の発現をそれぞれ分析した。サイトカイン産生の測定は、細胞内サイトカイン染色法を使用して行った。これには、０．２μｇ／ｍｌのブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）を細胞に加え、３７℃で４時間インキュベートした。

ＢＦＡは小胞体からゴルジ体への輸送を遮断し、その結果、サイトカインの開口分泌が阻害される。ＬＡＭＰ−１を同時染色する場合には、ＢＦＡを加える１時間前に抗体を添加した（ＬＡＭＰ−１が細胞表面へ移行できるようにするため）。次に、細胞を９６ウェルプレート（丸底）に移し、２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で二回洗浄した。生存細胞を染色し、死細胞を除去するために、制止判別用固定可能な近赤外死細胞染色キット（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ−ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ）を使用した。固定し、透過処理を行うために、細胞を１００μｌのサイトフィックス／サイトパーム（Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ）試薬に再懸濁し、氷冷しながら２０分間暗所でインキュベートした。洗浄後、細胞を調製しておいた抗体混合液に再懸濁するか、または体系的に補償するためにそれぞれ単色で染色のみ行った。染色は氷冷しながら暗所で３０分間行った。洗浄後、細胞を２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で再懸濁し、ＦＡＣＳ管に移してデータを取得した。データの取得はファクスカント（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ）ＩＩまたはＬＳＲフォルテッサ（Ｆｏｒｔｅｓｓａ）を使用して行った。ファクスディーヴァ（ＦＡＣＳ Ｄｉｖａ）ソフトウェアを使用してデータを記録し、フロージョー（ＦｌｏｗＪｏ）ソフトウェアを使用して解析を行った。

動物実験
二重特異性構築物の第一のインビボ試験として、免疫不全Ｒａｇ２／ＩＬ２Ｒγｎｕｌｌ−マウス（国際命名法：Ｂ１０；Ｂ６−Ｒａｇ２ｔｍ１Ｆｗａ ＩＩ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ）を使った実験を行った。生後６週のマウスに、ＨＢＶ遺伝子導入ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２．２．１５の細胞を５×１０⁶個注入した。細胞は動物の脇腹に皮下注入した。これにより、１４日間にわたって腫瘍が形成された。腫瘍内におけるＨＢＶウイルス血症を決定することで、ＨＢＶの複製を監視した。ヒトＰＢＭＣは新鮮なヒト臍帯血から分離し、細胞濃度を１ｍｌあたり０．２５×１０⁶個として、抗ヒトＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で予めコーティングしておいたしたプレート上で３日間刺激した。次いで細胞を、ＩＬ−２を３００Ｕ／ｍｌ含む細胞培養培地で７日間維持した。

腫瘍誘導の１４日後、マウス１匹あたり２×１０⁷個のＰＢＭＣをマウスの腹膜内に注入し、ＨＥＫ産生細胞の上清中のαＣＤ３／αＣＤ２８二重特異性抗体構築物をマウス尾静脈に１匹あたり１００μｌ、４日連続で注入した。腫瘍誘導後１８日目にマウスを屠殺し、腫瘍サイズを分析した。次いで、その後の分析のために血清および組織試料を保存した。

実施例４
二重特異性抗体は、標的細胞（ＨｕＨ７−Ｓ）を発現するＨＢＶ表面タンパク質の特異的排除を媒介する
二重特異性抗体構築物がＴ細胞を、標的細胞を発現するＨＢｓＡｇに対してうまく再標的化したかどうか、および標的細胞溶解を誘発しているかどうか調べるために、分離したＰＢＭＣを二重特異性抗体構築物の存在下でＨｕＨ７−Ｓ細胞と共培養した。ＨｕＨ７−Ｓ細胞には、ＨＢｓＡｇを発現するように遺伝子が安定に導入されており、それによりＨＢＶ感染肝細胞を模倣するものとなっていた。その結果、サブウイルス粒子が産生されて上清に分泌され、ＨＢｓＡｇが細胞膜に取り込まれる。非遺伝子導入ＨｕＨ７細胞を陰性対照として使用した。

個々の二重特異性抗体は標的細胞の死滅を誘発する
個々の二重特異性抗体がＴ細胞の活性化を刺激し、標的細胞の溶解を媒介可能であるかを分析するために、αＨＢｓ×αＣＤ３、αＨＢｓ×αＣＤ２８、αＨＢｓ×αＣＤ３［ＦｃΔＡＤＣＣ］またはαＨＢｓ×αＣＤ２８［ＦｃΔＡＤＣＣ］二重特異性四価抗体の存在下で、ＰＢＭＣをＨｕＨ７−Ｓ／ＨｕＨ７細胞と共培養した。単一の二重特異性抗体がエフェクター細胞を刺激することで、標的細胞を発現するＨＢｓＡｇが特異的に死滅した（図５）。ＣＤ３に対する二重特異性抗体は、ＣＤ２８に対する構築物よりも迅速かつ強力に標的細胞を排除し、αＣＤ３で処理したＨｕＨ７−Ｓ細胞の試験終了時の生存率はわずか６．４％（αＣＤ３ΔＡＤＣＣ：１５．５％）で、αＣＤ２８では４４．４２％（αＣＤ２８ΔＡＤＣＣ：４８．９％）であった。さらに、αＣＤ３ΔＡＤＣＣおよびαＣＤ２８ΔＡＤＣＣはそれぞれ、αＣＤ３およびαＣＤ２８に比べて、標的細胞の溶解を誘発するまでにより長い時間を要した。αＣＤ３ΔＡＤＣＣが媒介する死滅は共培養開始からおよそ３５時間後に始まったが、αＣＤ３の場合は１２時間後にはすでに標的細胞生存率の減少が認められた。αＣＤ２８ΔＡＤＣＣおよびαＣＤ２８が媒介する標的細胞の溶解においては、約２０時間のずれも観測された。αＣＤ３の刺激はＨＢｓＡｇ陰性ＨｕＨ７細胞でも検出可能な溶解を引き起こし、試験終了時の生存率は７８．１％と、非特異的活性化が認められた。ここには明記しないが、いくつかの実験では、αＣＤ３ΔＡＤＣＣの刺激の場合でも同様の結果が認められた。その他の二重特異性構築物の存在下で共培養したＨｕＨ７細胞生存率は１００％のままだった。

このデータから、個々の二重特異性抗体それぞれで刺激すると、さらなる共刺激なしで標的細胞の排除が引き起こされることが分かる。

二重特異性抗体は標的細胞の溶解を相乗的に媒介する
二重特異性構築物を併用すると活性が上がりその結果エフェクター細胞の細胞傷害性が増加するかどうかをさらに分析するため、αＣＤ３／αＣＤ２８またはαＣＤ３ΔＡＤＣＣ／αＣＤ２８ΔＡＤＣＣいずれかの組み合わせの存在下でＰＢＭＣをＨｕＨ７−Ｓ／ＨｕＨ７細胞と共培養した。図６に示すように、二重特異性構築物を併用すると標的細胞を発現するＨＢｓＡｇが大量に死滅し、残存生存率は１．２％（αＣＤ３／αＣＤ２８）および４．４％（αＣＤ３ΔＡＤＣＣ／αＣＤ２８ΔＡＤＣＣ）となったが、ＨｕＨ７細胞はほぼ排除されなかった（ＨｕＨ７細胞の試験終了時の生存率：αＣＤ３／αＣＤ２８：９２．４％；αＣＤ３ΔＡＤＣＣ／αＣＤ２８ΔＡＤＣＣ：１００．４％）。

標的細胞の死滅は約１１時間後にほぼ同時に始まった（図６Ａ、Ｂ）にもかかわらず、ここでも、αＣＤ３／αＣＤ２８が媒介する標的細胞の溶解は、Ｆｃ領域が変異した構築物が誘発する死滅より早かった。二重特異性抗体を併用すると、個々の二重特異性構築物が誘発する溶解に比べてより迅速に標的細胞が排除された（図６Ｃ、Ｄ）。これは、Ｔ細胞は個々の構築物の存在下においても１つのシグナルのみを受容するのではなく、ＣＤ３およびＣＤ２８に対する抗体が存在する場合は活性化および共刺激シグナルの両方を取得するためであると予想された。

従って、二重特異性構築物の併用は、標的細胞を発現するＨＢＶ表面タンパク質の特異的な溶解を相乗的に媒介する。

二重特異性抗体は濃度依存的に標的細胞の排除を媒介する
二重特異性抗体の量が標的細胞溶解に影響を及ぼすかを調べるために、２つの異なる量の二重特異性構築物を共培養に使用した。したがって、通常の量の抗体（合計１００μｌの上清、多量とする）およびその半量（合計５０μｌの上清、少量とする）を使用した。少量の二重特異性抗体も標的細胞の溶解を誘発できたが（ＨｕＨ７−Ｓ細胞の試験終了時の生存率：αＣＤ３／αＣＤ２８：１２．６％；αＣＤ３ΔＡＤＣＣ／αＣＤ２８ΔＡＤＣＣ：１５．９％）、多量の二重特異性抗体は残存生存細胞がわずか１．５％（αＣＤ３／αＣＤ２８）および２．１％（αＣＤ３ΔＡＤＣＣ／αＣＤ２８ΔＡＤＣＣ）で、標的細胞の排除をより迅速に（図７）引き起こした。ＨｕＨ７細胞はいずれの場合でも影響を受けなかった。αＣＤ３／αＣＤ２８またはαＣＤ３ΔＡＤＣＣ／αＣＤ２８ΔＡＤＣＣいずれかの併用によって濃度依存的な標的細胞の死滅が誘発された。

エフェクター細胞の濃度を上げると標的細胞の溶解が高まる
さらに、エフェクター細胞の数が標的細胞の排除に影響を及ぼすかどうかということも興味がもたれた。そこで、共培養に使用した通常量（１×１０⁵個）のＰＢＭＣと倍量（２×１０⁵個）とを比較した。図８に示すように、多量のＰＢＭＣはαＣＤ３／αＣＤ２８の存在下でＨｕＨ７−Ｓ細胞の溶解を有意に早く誘発し、試験終了時の生存率は１１．７％に比べて４．５％であったが、倍量のＰＢＭＣが存在する場合、死滅したＨｕＨ７細胞の量も多かった（ＨｕＨ７細胞の試験終了時の生存率：２×１０⁵ＰＢＭＣ：８３．８％；１×１０⁵ＰＢＭＣ：１０２．７％）。

このデータから、標的細胞の排除はエフェクター細胞の量に依存することが分かる。

二重特異性抗体はわずか８時間の共培養で標的細胞の死滅を媒介する
Ｔ細胞を活性化させてそれにより細胞傷害性を誘発するのに、二重特異性抗体が共培養中にどのくらいの時間存在する必要があるかを研究するために、二重特異性抗体を含む共培養の上清を共培養の様々な時点で除去し、新しいＤＭＥＭ標準培地を加えた。αＣＤ３／αＣＤ２８を含む上清を４時間後に除去した場合、ＰＢＭＣは標的細胞生存率のわずかな減少（７８．５％）のみを誘発し、標的細胞すべての溶解を引き起こすことはできなかった（図９）。二重特異性抗体を含む上清が８時間以上存在した場合、ＰＢＭＣは標的細胞の排除を引き起こすことができた。図１０に示すように、αＣＤ３／αＣＤ２８の刺激を８時間または１２時間続けた場合、２４時間または４８時間の場合と比較して、ＰＢＭＣが標的細胞の溶解を誘発するにはより長い時間を要したが、４８時間以降の効果はほぼ同様であった（ＨｕＨ７−Ｓ 試験終了時の生存率：８時間：１４．７％；１２時間：１１．７％、２４時間：５．１％、４８時間：３．２％）。

二重特異性抗体は、ＨＢｓＡｇまたはＨｕＨ７−Ｓ細胞との共培養中にＴ細胞のエフェクター機能を媒介する
共培養実験中のＴ細胞の活性化および機能を研究するために、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ解析のいずれかによりサイトカインの分泌を調べた。

二重特異性構築物はＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２の分泌を媒介する
時系列実験において、二重特異性抗体と接触したＰＢＭＣはいつサイトカインを分泌し始めるのか、および動態は時間経過と共にどのように変化するのかについて分析した。そこで、ＰＢＭＣおよびαＣＤ３／αＣＤ２８を加えてから４時間後、８時間後、１２時間後、２４時間後および４８時間後に共培養の上清を除去した。サイトカイン産生は、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを測定した。ＩＬ−２の分泌は時間が経つにつれて増加したが、４時間後にはＩＬ−２はほとんど検出されず、８時間後には濃度が３１６ｐｇ／ｍｌにまでなり、続く４時間においては、濃度はほぼ４倍になった（１１１９ｐｇ／ｍｌ）。２４時間〜４８時間の間ではさらなる増加は見られず、ＩＬ−２濃度は約１５５０ｐｇ／ｍｌでプラトーに達したようであった（図１０Ａ）。ＩＦＮ−γが分泌されるまでにはさらに時間がかかり（図１０Ｂ）、８時間後の検出レベルもまだかなり低かった。１２時間後にその濃度が１８００ｐｇ／ｍｌにまで増加したことから、８時間〜１２時間の間にＴ細胞がＩＦＮ−γの分泌を開始したことが分かる。その後（２４時間）、ＩＦＮ−γ産生の増加が観測され、濃度は約１００００ｐｇ／ｍｌまで増加した。最高濃度（１２０００ｐｇ／ｍｌ）は４８時間後に検出された。ＨＢｓＡｇ陰性細胞を使用した実験でも、ＩＬ−２およびＩＦＮγの濃度はいずれも経時的に増加し、４８時間後に最高濃度（ＩＬ−２：４５ｐｇ／ｍｌ；ＩＦＮγ：２００ｐｇ／ｍｌ）に達した。これも細胞生存率に関する知見と一致している。

ＴＮＦ−αの分泌（図１０Ｃ）も経時的に増加し、２４時間で最高濃度（１７００ｐｇ／ｍｌ）に達した。その後は減少に転じ、４８時間後には１４００ｐｇ／ｍｌになった。ＴＮＦ−αの分泌は他とは対照的により早く始まり、４時間後に約１００ｐｇ／ｍｌとなり、２４時間まで安定して上昇した。興味深いことにＨｕＨ７細胞におけるＴＮＦ−αの産生は正反対の挙動を示した。ＴＮＦ−αは他のサイトカインに比べてバックグラウンド濃度が非常に高く、４時間後に最高濃度（およそ７０ｐｇ／ｍｌ）を示し、時間の経過とともに低下して４８時間後にはわずか９ｐｇ／ｍｌになった。ＨＢｓＡｇ発現細胞との共培養中にαＣＤ３／αＣＤ２８と接触すると、ＰＢＭＣによるＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮ−Ｆαの分泌が誘発されるが、分泌動態は各サイトカインで異なる。

二重特異性構築物はＣＤ８⁺Ｔ細胞ならびにＣＤ４⁺Ｔ細胞を活性化する
ＰＢＭＣが細胞傷害性小胞体の脱顆粒も示すか分析するために、脱顆粒マーカーであるＬＭＡＰ−１（ＣＤ１０７ａ）の移行について調べた。αＣＤ３／αＣＤ２８またはαＣＤ３ΔＡＤＣＣ／αＣＤ２８ΔＡＤＣＣの存在下でＨｕＨ７−Ｓ／ＨｕＨ７細胞と共培養した後、ＣＤ８⁺Ｔ細胞はＬＡＭＰ−１染色の明らかな移行を示したが、αＣＤ３／αＣＤ２８よりもαＣＤ３ΔＡＤＣＣ／αＣＤ２８ΔＡＤＣＣと刺激した試料の方が、シグナルが強かった（図１１Ｃ、Ｄ）。興味深いことに、ＣＤ４⁺Ｔ細胞に関しても同様の結果が出た（図１１Ａ、Ｂ）。αＣＤ３／αＣＤ２８では、ＬＡＭＰ−１の移行はＣＤ８⁺Ｔ細胞においてさらに顕著に現れ、αＣＤ３ΔＡＤＣＣ／αＣＤ２８ΔＡＤＣＣでは正反対であった。

このデータから、ＣＤ８⁺Ｔ細胞だけでなくＣＤ４⁺細胞も、二重特異性抗体およびＨＢｓＡｇと接触すると細胞傷害性顆粒の分泌を誘発されることが分かる。

共培養実験後のＴ細胞の多機能性を調べるために、ＰＢＭＣおよびαＣＤ３／αＣＤ２８添加後８時間、１２時間および２４時間のＰＢＭＣを、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＴＮＦ−α、ならびに主にＣＤ４⁺Ｔ細胞に発現する活性化マーカーＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）について染色した（図１２）。ＣＤ４⁺Ｔ細胞では、ＩＦＮ−γ⁺Ｔ細胞（２４時間後 ９．３％）、ＩＬ−２⁺Ｔ細胞（２４時間後 １１．３％）、ＴＮＦ−α⁺Ｔ細胞（２４時間後 １４．７％）およびＣＤ１５４⁺Ｔ細胞（２４時間後 ２８．０％）が安定して増加した、主要な上昇は１２時間〜２４時間の間に起きた（図１２Ａ）。

ＣＤ８⁺Ｔ細胞も同じ結果となったが、ＩＦＮ−γ⁺およびＩＬ−２⁺細胞のパーセンテージはそれぞれ１８．４％および１１．３％でＣＤ４⁺Ｔ細胞のそれらより多かった。ＴＮＦ−α⁺およびＣＤ１５４⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞の量はそれぞれ１０．１％および６．２５％で、ＣＤ４⁺Ｔ細胞に比べて少なかった（図１２Ｂ）。ＨｕＨ７細胞と共培養したＰＢＭＣはいずれの試料でも活性化を示さなかった。ブール組み合わせゲートを使用して、サイトカインを分泌するＴ細胞のさらなる解析を行った（図１２Ｃ、Ｄ）。２４時間後、ＣＤ４⁺Ｔ細胞の３．１％およびＣＤ８⁺Ｔ細胞の２．１％がＩＦＮγ⁺、ＩＬ−２⁺およびＴＮＦα⁺となり、Ｔ細胞の多機能性を示唆した。したがって、αＣＤ３／αＣＤ２８はＨｕＨ７−Ｓ／ＨｕＨ７細胞との共培養している間にＰＢＭＣの活性化を媒介し、多機能なＣＤ４⁺Ｔ細胞およびＣＤ８⁺Ｔ細胞を生じる。

ＦＡＣＳ解析中に、抗体と死滅した標的細胞との非特異的な結合による偽陽性シグナルを検出してしまう可能性を排除するために、ＰＢＭＣを固定化したＨＢｓＡｇの存在下で培養した。加えて、ＨＢＶ感染患者の血液中には多量のＨＢｓＡｇが含まれているため、可溶性ＨＢｓＡｇの効果も調べた。ここでもＰＢＭＣをＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＴＮＦ−α、ならびにＣＤ１５４に関して染色したが、ＰＢＭＣおよびαＣＤ３ΔＡＤＣＣ／αＣＤ２８ΔＡＤＣＣ添加後２４時間および４８時間のみについて染色を行った（図１３）。ここでもＣＤ４⁺Ｔ細胞はＩＦＮ−γ⁺Ｔ細胞（２４時間後 ３．４％、４８時間後 ６．８％）、およびＣＤ１５４⁺Ｔ細胞（２４時間後 １７．２％、４８時間後 １９．９％）の増加を示した。ＩＬ−２⁺Ｔ細胞は２４時間後（５．５％）に比べて４８時間後（４．９％）は少なく、ＴＮＦ−α⁺Ｔ細胞も減少した（２４時間後 １４．９％、４８時間後 ８．１％）（図１３Ａ）。ＣＤ８⁺Ｔ細胞はＴＮＦ−α⁺Ｔ細胞（２４時間後 １２．６％、４８時間後 ７．４％）のみ減少を示し、この減少はＥＬＩＳＡでも観測された（図１０）。ＩＦＮ−γ⁺、ＩＬ−２⁺およびＣＤ１５４⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞のパーセンテージは２４時間〜４８時間の間に増加した（ＩＦＮγ⁺：２４時間後 ４．７％、４８時間後 ８．５％、ＩＬ−２⁺：２４時間後 ５．１％、４８時間後 ７．２％、ＣＤ１５４⁺：２４時間後 ８．３％、４８時間後 １０．４％）（図１３Ｂ）。ここでもＩＦＮ−γ⁺およびＩＬ−２⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞のパーセンテージはＣＤ４⁺Ｔ細胞のそれらを上回り、ＴＮＦ−α⁺およびＣＤ１５４⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞の量はＣＤ４⁺Ｔ細胞に比べて減少した。４８時間後も、一部のＴ細胞は可溶性のＨＢｓＡｇによって活性化したようで、ＴＮＦα⁺Ｔ細胞が１．１％（ＣＤ４⁺Ｔ細胞）および１．０％（ＣＤ８⁺Ｔ細胞）、ＣＤ１５４⁺Ｔ細胞が２．７％（ＣＤ４⁺Ｔ細胞）および３．１％（ＣＤ８⁺Ｔ細胞）、ＩＦＮγ⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞が１．２％およびＩＬ−２⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞が１．４％に達した。再びブールゲートを使用して、サイトカインを分泌するＴ細胞をさらに解析した（図１３Ｃ、Ｄ）。ＣＤ４⁺Ｔ細胞の０．３５％（２４時間後）および０．６３％（４８時間後）、ＣＤ８⁺Ｔ細胞の０．３％（２４時間後）および１．０％（４８時間後）がＩＦＮ−γ⁺、ＩＬ−２⁺およびＴＮＦ−α⁺で、Ｔ細胞が多機能化したことが示唆された。αＣＤ３ΔＤＣＣ／αＣＤ２８ΔＡＤＣＣは、固定化したＨＢｓＡｇ細胞と共培養している間にＰＢＭＣの活性化を媒介し、多機能性ＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺Ｔ細胞を生じる。可溶性のＨＢｓＡｇに起因する活性化は低いままである。

二重特異性抗体はＩＦＮγの分泌とＨＢＶ感染したＨｅｐａＲＧ細胞の死滅を媒介する
最後に興味がもたれたのは、二重特異性抗体はＴ細胞をＨＢＶ感染ＨｅｐａＲＧ細胞に再標的化できるかということであった。感染が成功したかどうかは、感染細胞の上清中のＨＢｓＡｇを測定して試験した。ＨｕＨ７−ＳまたはＨｅｐＧ２．２．１５細胞の結果と比べて、ＨＢＶ感染ＨｅｐａＲＧ細胞が産生したＨＢｓＡｇの濃度は非常に低かった。加えて、標準偏差がかなり高いことから分かるように、それぞれのウェルにおける値の変動が大きかった（図１４）。

それにもかかわらず感染は成功し、二重特異性抗体存在下におけるＰＢＭＣとＨｅｐａＲＧ細胞との共培養が行われた。図１５から分かるように、未処理の細胞の生存率は経時的に減少し、５６時間後の残存生存率は６５．９％（ＨＢＶ＋）および６２．９％（ＨＢＶ−）であった。それに比べて、αＣＤ３およびαＣＤ３／αＣＤ２８の併用はＨＢＶ感染ＨｅｐａＲＧ細胞の特異的な溶解を引き起こした。αＣＤ２８のみでは標的細胞の特異的排除を誘発することはできなかった。共培養中にαＣＤ３が存在した場合、ＨＢＶ感染細胞の生存率は２５．３％に減少し、一方で非感染ＨｅｐａＲＧ細胞は５３．５％であった（図１５Ａ）。αＣＤ３／αＣＤ２８でエフェクター細胞を刺激すると、大量のＨＢＶ感染ＨｅｐａＲＧ細胞が死滅したが（図１５Ｂ）、標的細胞の３７．５％は生存可能なままであった（非感染ＨｅｐａＲＧ細胞：６２．４％）。

したがって、αＣＤ３またはαＣＤ３／αＣＤ２８はＨＢＶ感染ＨｅｐａＲＧ細胞の特異的溶解を誘発する。

二重特異性抗体はインビボでＨＢＶ陽性腫瘍の減少を媒介する
ヒトＨＢＶを導入した肝癌細胞株ＨｅｐＧ２．２．１５を注入し、皮下にＨＢＶ陽性腫瘍を発生させた免疫不全マウスに、ヒトＰＢＭＣおよび、ＣＤ３とＣＤ２８に対する二重特異性構築物を注入した（図１６）。処置をした動物では、未処置の動物または偽処置（動物にＰＢＭＣとＰＢＳを投与）した動物と比べて、腫瘍サイズの顕著な減少が見られた。処置した動物の腫瘍サイズは約５０パーセント減少した。

Claims (20)

1. （ａ）第一の抗原に結合するよう構成された６個の相補性決定領域（ＣＤＲ）の第一の組、および
   （ｂ）（ｂａ）第二の抗原に結合するよう構成された６個のＣＤＲの第二の組、または
   （ｂｂ）第二の抗原に結合可能なリガンド、
   を含むポリペプチドであって、
   前記６個のＣＤＲの第一の組が配列番号１〜６、又は７〜１２の配列を有し、および前記６個のＣＤＲの第二の組が配列番号１９〜２４、２５〜３０、３１〜３６または３７〜４２の配列を有し、ここで、６個のＣＤＲの組のそれぞれにおけるＣＤＲの順番が重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、および軽鎖ＣＤＲ３であり、
   前記ＣＤＲは、免疫グロブリンドメインの一部である、ポリペプチド。
2. 請求項１に記載のポリペプチドであって、（ａ）前記６個のＣＤＲの第一の組が第一のｓｃＦｖ断片に含まれ、および／または
   （ｂ）（ｂａ）前記６個のＣＤＲの第二の組が第二のｓｃＦｖ断片に含まれ、もしくは
   （ｂｂ）前記リガンドが免疫リガンドである、ポリペプチド。
3. 前記免疫リガンドは、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０／ＮＣＲ３、４−１ＢＢまたはＯＸ４０に結合可能である、請求項２に記載のポリペプチド。
4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、二量体化領域をさらに含み、前記二量体化領域は、共有結合二量体化および／または非共有結合二量体化のために提供される、ポリペプチド。
5. 請求項２〜４のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、前記ポリペプチドがスペーサー領域をさらに含み、前記スペーサー領域が、
   （ｉ）前記第一のｓｃＦｖ断片と、
   （ｉｉ）前記第二のｓｃＦｖ断片または前記ポリペプチドのアミノ酸配列中の前記リガンドとの間に位置する、ポリペプチド。
6. 前記スペーサー領域がＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む、請求項５に記載のポリペプチド。
7. 前記ＣＨ２ドメインおよび／またはＣＨ３ドメインの１つ以上の位置を変異させてＦｃ受容体への結合の減少または消失を起こさせる、請求項６に記載のポリペプチド。
8. 請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、前記ポリペプチドが配列番号４３〜４６のいずれか１つのアミノ酸配列または配列番号４３〜４６のいずれか１つと少なくとも９５％の同一性を示すアミノ酸配列を含むか、またはそのようなアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲには置換が位置しない、ポリペプチド。
9. 請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
10. 第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドを含むか、またはそれらからなる複合体であって、ここで、前記第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドが請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドであり、
    （ａ）前記第一のポリペプチドと前記第二のポリペプチドの間に少なくとも１つの共有結合があるか、または
    （ｂ）前記第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドが互いに非共有結合されている、複合体。
11. 前記第一のポリペプチドのＣｙｓ残基と前記第二のポリペプチドのＣｙｓ残基との間に少なくとも１つのジスルフィド架橋がある、請求項１０に記載の複合体。
12. 請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドを１つ以上および／または請求項１０または１１に記載の複合体を１つ以上含むか、またはそれらからなる組成物であって、ただし、前記組成物は少なくとも２つのポリペプチドを含み、前記２つのポリペプチドが、それらが結合する前記第一の抗原および／または前記第二の抗原の点で互いに異なっている、組成物。
13. 請求項１２に記載の組成物であって、前記２つのポリペプチドが
    （ａ）（ｉ）ＨＢＶ小型表面抗原およびＣＤ３に結合するポリペプチド、および
    （ｉｉ）ＨＢＶ小型表面抗原およびＣＤ２８に結合するポリペプチドであるか、または
    （ｂ）（ｉ）ＨＢＶ小型表面抗原およびＣＤ１６に結合するポリペプチド、および
    （ｉｉ）ＨＢＶ小型表面抗原およびＣＤ５６に結合するポリペプチドであり、
    前記ＨＢＶ小型表面抗原は、ＨＢＶの外被（エンベロープ）の小型表面タンパク質である前記組成物。
14. 請求項１０または１１に記載の複合体であって、前記複合体が、二重特異性、三重特異性または四重特異性である四価抗体を含むか、または、二重特異性、三重特異性または四重特異性である四価抗体からなる、複合体。
15. 請求項１２または１３に記載の組成物であって、前記組成物が、二重特異性、三重特異性または四重特異性である四価抗体を含むか、または、二重特異性、三重特異性または四重特異性である四価抗体からなる、組成物。
16. 請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドを１つ以上、請求項１０、１１または１４に記載の複合体を１つ以上、および／または請求項１２、１３または１５に記載の組成物を１つ以上含むか、またはそれらからなる医薬組成物。
17. ＨＢＶ感染および／または前記ＨＢＶ感染に起因する症状を治療または予防する方法において使用するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の１つ以上のポリペプチドであって、前記ＨＢＶ感染に起因する症状が肝硬変、肝細胞癌、および肝臓癌から選択され、前記肝臓癌が１つ以上のＨＢＶ表面抗原の発現によって特徴付けられる、ポリペプチド。
18. ＨＢＶ感染および／または前記ＨＢＶ感染に起因する症状を治療または予防する方法において使用するための、請求項１０、１１または１４に記載の１つ以上の複合体であって、前記ＨＢＶ感染に起因する症状が肝硬変、肝細胞癌、および肝臓癌から選択され、前記肝臓癌が１つ以上のＨＢＶ表面抗原の発現によって特徴付けられる、複合体。
19. ＨＢＶ感染および／または前記ＨＢＶ感染に起因する症状を治療または予防する方法において使用するための、請求項１２、１３または１５に記載の１つ以上の組成物であって、前記ＨＢＶ感染に起因する症状が肝硬変、肝細胞癌、および肝臓癌から選択され、前記肝臓癌が１つ以上のＨＢＶ表面抗原の発現によって特徴付けられる、組成物。
20. インビトロまたはエキソビボ免疫エフェクター細胞であって、前記免疫エフェクター細胞の表面抗原に結合した請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項１０、１１または１４に記載の複合体を有する、インビトロまたはエキソビボ免疫エフェクター細胞。