JP5792622B2 - ナチュラルキラー細胞の製造方法 - Google Patents
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Description
なお、本願は、2009年9月11日出願の日本国特許出願第2009−210178号に対して優先権を主張するものであり、日本国特許出願第2009−210178号の全内容を本願に組み込むものである。
[1]ナチュラルキラー細胞及び/又はナチュラルキラー細胞に分化し得る細胞を含有する細胞集団を、生物応答修飾剤及び増殖能を奪う処理が施された細胞の存在下で拡大培養する工程を包含することを特徴とする、ナチュラルキラー細胞を含有する細胞集団の製造方法、
[2]生物応答修飾剤が細菌由来製剤である、[1]記載の方法、
[3]生物応答修飾剤が、OK−432、BCG、Streptcoccus pyogenes、Corynebacterium parvum及びこれらの細胞壁骨格からなる群より選択される細菌由来製剤である、[2]記載の方法、
[4]増殖能を奪う処理が施された細胞が、末梢血単核球細胞、T細胞、T細胞サブセット及びB細胞からなる群より選択される細胞に増殖能を奪う処理を施したものである、[1]〜[3]いずれか記載の方法、
[5]増殖能を奪う処理が施された細胞が、人為的に拡大培養されたT細胞に増殖能を奪う処理を施したものである、[4]記載の方法、
[6]増殖能を奪う処理が施された細胞が、ナチュラルキラー細胞又はナチュラルキラー細胞に分化し得る細胞と同一の個体に由来する細胞である、[1]〜[5]いずれか記載の方法、
[7]増殖能を奪う処理が施された細胞の存在下で拡大培養する工程において、当該細胞を添加することを複数回実施することを特徴とする、[1]〜[6]いずれか記載の方法、
[8]ナチュラルキラー細胞及び/又はナチュラルキラー細胞に分化し得る細胞として末梢血単核球細胞が使用される、請求項[1]〜[6]いずれか記載の方法、
[9][1]〜[8]いずれか記載の方法により得られる細胞集団、
[10][9]記載の細胞集団より分離されるNK細胞を含有する細胞亜集団、
[11][9]記載の細胞集団及び/又は[10]記載の細胞亜集団を含有する医薬、
[12]医薬の製造のための、[9]記載の細胞集団及び/又は[10]記載の細胞亜集団の使用、
[13]有効量の[9]記載の細胞集団及び/又は[10]記載の細胞亜集団を対象に投与する工程を含む、疾患の治療方法又は予防方法、
[14][9]記載の細胞集団及び/又は[10]記載の細胞亜集団を凍結し、凍結した細胞集団及び/又は細胞亜集団を解凍後、サイトカイン存在下で培養する工程を包含するナチュラルキラー細胞を含有する細胞集団及び/又は細胞亜集団の製造方法、ならびに
[15]ナチュラルキラー細胞及び/又はナチュラルキラー細胞に分化し得る細胞を含有する単離及び/又は純化した細胞集団を、生物応答修飾剤の存在下で拡大培養する工程を包含することを特徴とする、ナチュラルキラー細胞を含有する細胞集団の製造方法、
に関する。
以下、本発明を具体的に説明する。
増殖能を奪う処理が施された細胞は、細胞***、DNA合成といった増殖に関わる能力を失ったか、あるいは当該能力が低下した細胞であるため、処理しない細胞と比較して増殖能が低下している。例えば、放射線処理を行った細胞は、増殖能が低下しているが、処理直後は生細胞と同様の形態及び形質を示し、サイトカイン等のタンパク質を分泌する代謝能を維持している。
本発明のNK細胞の製造方法は、NK細胞及び/又はNK細胞に分化し得る細胞を含有する細胞集団を、生物応答修飾剤及び増殖能を奪う処理が施された細胞の存在下で拡大培養する工程を包含することを特徴とする方法である。本発明のNK細胞の製造方法によれば、従来の方法に比べて、拡大培養率、NK細胞の含有率、及びNK細胞が有する細胞傷害活性が極めて高い細胞集団を安定して調製することが可能である。ここで拡大培養率とは、培養開始時と比較しての増殖倍率を意味し、培養開始時の細胞数で培養終了時の細胞数を除し、さらに継代時に継代に使用した細胞数の割合で除して算出した倍率である。
フィブロネクチン由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドの存在下で培養する細胞集団は、T細胞又はT細胞の前駆細胞を含有する細胞集団であればよく、末梢血、骨髄液、臍帯血、リンパ液などの体液を使用することができる。またこれらの体液、各臓器又は器官から分離した細胞集団、例えば、PBMC、T細胞、T細胞サブセット又はこれらの混合物が使用できる。なお、治療を目的として生体に移植されるNK細胞を調製する際には、これらの細胞又は細胞集団は、後述の「NK細胞及び/又はNK細胞に分化し得る細胞」と同一の個体、すなわち同一のドナー由来のものとすることができる。特に好適には、「NK細胞及び/又はNK細胞に分化し得る細胞」と「増殖能を奪う処理が施された細胞」はともに患者自身に由来するものであることが望ましい。
また、温熱処理により増殖能を奪う処理を実施する場合、処理温度及び処理時間は細胞の増殖能が失われる量であれば特に限定はないが、例えば、40〜55℃、好ましくは42〜50℃で、例えば、0.1〜8時間、好ましくは0.2〜4時間である。
また、NK細胞及び/又はNK細胞に分化し得る細胞を含有する細胞集団の培養において、NK細胞及び/又はNK細胞に分化し得る細胞濃度に特に限定はないが、例えば、1〜1×108cells/mL、好適には1×101〜5×107cells/mL、さらに好適には1×102〜2×107cells/mLが例示される。当該細胞集団と増殖能を奪う処理が施された細胞集団の細胞数の比は、特に限定はないが、例えば、1:0.1〜20、好適には1:1〜10である。
さらに、本発明は、上記本発明のNK細胞の製造方法で得られたNK細胞を含有する細胞集団及び前記細胞集団から分離された細胞亜集団を提供する。また、本発明は、当該細胞集団及び/又は細胞亜集団を有効成分として含有する医薬(治療剤)、当該細胞集団及び/又は細胞亜集団の医薬の製造のための使用、ならびに有効量の当該細胞集団及び/又は細胞亜集団を対象に投与する工程を含む疾患の治療方法又は予防方法を提供する。
NK細胞のマルチファンクション能は、一般に、インターフェロン(IFN)−γもしくは腫瘍壊死因子(TNF)−αなどのサイトカインの産生、又はCD107aなどの細胞表面抗原により細胞集団の免疫応答を評価することが可能である。本発明で製造されるNK細胞を含有する細胞集団は、複数のサイトカイン産生又は細胞表面抗原を示す細胞を高含有し、マルチファンクション能を有するマルチファンクション性細胞集団として細胞免疫療法において極めて有用である。
また本発明の細胞集団を適当なサイトカイン、例えばインターフェロンα(IFN−α)と共存させることにより、その細胞傷害性を増強させることができ、当該処理された細胞集団は、さまざまながん細胞に対して細胞傷害性を発揮することが可能になる。
本発明の細胞集団に遺伝子を導入してもよい。例えば、標的物質に対する親和性タンパク質[例えば、T細胞受容体(TCR)、抗体、レセプターなど]、細胞表面抗原、酵素、シグナル伝達分子(例えば、サイトカイン)、これらの機能的ドメイン(例えば、抗体又はTCRの可変領域、一本鎖抗体、レセプターのシグナル伝達ドメイン)、又はこれらの機能的ドメインを有するキメラタンパク質をコードする遺伝子を導入してもよい。なお、遺伝子の導入手段には特に限定はなく、公知の遺伝子導入方法により適切なものを選択して使用することができる。前記の遺伝子導入方法としては、ウイルスベクターを使用する方法、又は該ベクターを使用しない方法のいずれも本発明に使用できる。それらの方法の詳細については、既に多くの文献が公表されている。
また、疾患の治療に用いるための本発明の細胞集団も本発明に包含される。
以下に実施例を示して本発明をさらに具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
(1)PBMCの分離及び保存
インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナーにおいて、成分採血を実施した(ここでいう成分採血とは、単核球採取を目的とした採血である)。得られた成分採血液をダルベッコPBS(インビトロジェン社製又は日水製薬社製;以下、DPBSと記載する)又は1%ヒト血清アルブミン(製剤名 ブミネート:バクスター社製、以下、HSAと記載する)を含む生理食塩水(以下、1%HSA/生理食塩水と記載する)で約2倍希釈した後、Ficoll−Paque PREMIUM又はFicoll−Paque PLUS(いずれもGEヘルスケア バイオサイエンス社製)15mLの上に希釈した成分採血液を30mLずつそれぞれ重層して、700×g、室温で20分間遠心した。遠心後、分離した層のうち、PBMC層をピペットで回収し、RPMI1640培地又は1%HSA/生理食塩水を用いて45mLにフィルアップした後、650×g、4℃にて10分間遠心し、上清を除去した。同様に、600×g、500×gと段階的に遠心Gを落としながら順次遠心操作を行い、計3回洗浄を繰り返し、PBMCを採取した。
実施例1−(1)で調製した必要量のPBMCを5%ヒトAB型血清、0.1mM NEAA mixture、1mM Sodium pyruvate、2mM L−グルタミン(全てLonza社製)、1% ペニシリン−ストレプトマイシン(ギブコBRL社製)又は100μg/mL 硫酸ストレプトマイシン(明治製菓社製)を含むRPMI1640培地(以下、5HRPMIと記載する)に懸濁後、X線照射装置を使用し3400R(29.8Gy)のX線を照射した(このX線照射後の細胞を以下、PBMC AICと記載する)。調製したPBMC AICを2×106cells/mLとなるように5HRPMIに懸濁した。
5HRPMIに2×106cells/mLとなるように実施例1−(1)で調製したPBMC(PBMC AICと同一ドナー由来)を懸濁後、Responder細胞とした。24穴細胞培養プレート(ベクトン ディッキンソン社製又はコーニング社製)に、上記Responder細胞及びPBMC AICを0.5mL/ウェルずつ添加し、計1mL/ウェルとした(AIC刺激群)。この際、PBMC AICを添加しない群(AIC非刺激群)を作製した。
各ウェルにOK−432(製剤名 ピシバニール:中外製薬社製)を終濃度0.05KE/mLとなるように添加した。全てのウェルに終濃度500U/mLとなるようにIL−2(製剤名 プロロイキン:カイロン社製又はノバルティス社製)を添加し、これらのプレートを5%CO2存在下、37℃で培養を開始した(培養0日目)。2日目には、各ウェルに5HRPMIを1mLずつ添加し、終濃度500U/mLとなるようにIL−2を添加した。
すなわち、拡大培養時にOK−432及びAICを組み合わせることにより、高い拡大培養率でNK細胞が得られることが明らかとなった。
実施例1−(3)で調製した培養開始後14日目の細胞についてCD3陰性CD56陽性細胞含有比率(以下、NK細胞含有比率と記載する)をフローサイトメーター(Cytomics FC500:ベックマンコールター社製)で解析した。すなわち、培養開始後14日目の細胞をDPBSで洗浄した後、細胞を1%ウシ血清アルブミン(シグマ社製、以下、BSAと記載)を含むDPBS(以下、1%BSA/DPBSと記載)中に懸濁し、FITC標識又はPC5標識マウス抗ヒトCD3抗体及びRD1標識マウス抗ヒトCD56抗体(全てベックマンコールター社製)を添加した。同様に、各細胞集団の一部に、ネガティブコントロールとしてFITC標識マウスIgG1/RD1標識マウスIgG1/PC5標識マウスIgG1(ベックマンコールター社製)を添加した。各々の抗体を添加後、4℃で30分インキュベートした。インキュベート後、細胞を0.1%BSAを含むDPBS(以下、0.1%BSA/DPBSと記載する)で洗浄し、再度DPBSに懸濁した。これらの細胞をフローサイトメトリーに供し、CD3陰性かつCD56陽性細胞群をNK細胞として、NK細胞含有比率を算出した。結果を表2に示す。
実施例1−(3)で調製した培養開始後14日目の細胞について、細胞傷害活性を測定した。細胞傷害活性は、Calcein−AMを用いた細胞傷害活性測定法〔リヒテンフェルズ R.ら(Lichtenfels R.et al.)、J. Immunol. Methods、第172巻、第2号、第227〜239頁(1994)〕にて評価した。すなわち慢性骨髄性白血病細胞株K562細胞(ヒューマンサイエンス研究資源バンク JCRB0019)、バーキットリンパ腫細胞株Daudi細胞(ヒューマンサイエンス研究資源バンク JCRB9071)、バーキットリンパ腫細胞株Raji(ヒューマンサイエンス研究資源バンク IFO50046)をそれぞれ1〜2×106cells/mLとなるように5%ウシ胎児血清を含むRPMI1640培地に懸濁後、終濃度25μMとなるようにCalcein−AM(同仁化学研究所社製)を添加し、37℃で1時間培養した。細胞をCalcein−AMを含まない培地にて洗浄後、Calcein標識標的細胞とした。
すなわち、培養時にOK−432及びAICを組み合わせることにより、高い細胞傷害活性を発揮するNK細胞を含む細胞集団が効率よく拡大され、大量に得られることが明らかとなった。
(1)PBMC AICの調製
実施例1−(2)と同様の方法でPBMC AICを調製した。ただし、X線照射量を3400R(29.8Gy)及び8000R(70.2Gy)として、2種のPBMC AICをそれぞれ調製した。
実施例1−(3)と同様の方法で、NK細胞の拡大培養を行った。ただし、OK−432を添加しない群、PBMC AICを添加しない群及びPBMC AICの代わりに、等量のPBMC(X線未照射)を添加する群を作製した。培養開始7日目には各ウェルの細胞液を5HRPMIを用いて2倍希釈し、各ウェルに終濃度500U/mLとなるようにIL−2を添加した後、新しい24穴細胞培養プレートに細胞液2mLを移した。9日目及び13日目に同様の継代操作を行った。なお、9日目及び11日目の細胞液の希釈倍率は、それぞれ4倍及び2倍とした。各継代日に、終濃度500U/mLとなるようにIL−2を添加した。14日目まで培養を継続し、トリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。さらに、実施例1−(4)と同様の方法で、NK細胞含有比率を解析した。結果を表4に示す。
(1)抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチンの固定化プレートの作製
12穴細胞培養プレートに終濃度5μg/mLの抗ヒトCD3抗体(製剤名:オルソクローンOKT3注、ヤンセンファーマ社製)及び終濃度25μg/mLのレトロネクチン(登録商標名、タカラバイオ社製)を含むACD−A液(テルモ社製)を0.45mL/ウェルずつ添加して必要ウェル数作製し、5%CO2存在下、37℃で5時間インキュベートした。なお、抗CD3抗体/レトロネクチン固定化プレートは使用直前にDPBSで2回、RPMI1640培地で1回洗浄した。
1%ヒトAB型血清(Lonza社製)を含むGT−T551(タカラバイオ社製;以下、1HGT−T551と記載する)に、1×106cells/mLとなるように実施例1−(1)で調製したPBMCを懸濁した。実施例3−(1)で調製した抗ヒトCD3抗体/レトロネクチン固定化プレートに1HGT−T551を4.77mL/ウェル添加しておき、前記の細胞懸濁液を0.53mL/ウェルずつ添加して必要ウェル数作製した。続いて終濃度200U/mLとなるように各ウェルにIL−2を添加し、これらのプレートを5%CO2存在下、37℃で培養を開始した(培養0日目)。培養開始4日目に、培養液を1HGT−T551を用いて適宜希釈後、T75細胞培養フラスコ(コーニング社製)に移した。このフラスコに終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加し、7日目まで培養を継続した(以下、抗CD3抗体/レトロネクチン刺激により拡大培養して得られたT細胞をRN−Tと記載する)。
実施例1−(2)と同様の方法でAICを調製した。ただし、AICとして実施例1−(1)と同様の方法で調製したPBMC及び実施例3−(2)で調製した培養開始7日目のRN−Tのそれぞれに、3400R(29.8Gy)のX線を照射した(以下、このX線照射後のRN−TをRN−T AICと記載する)。調製したPBMC AIC及びRN−T AICを2×106cells/mLとなるように1%ヒトAB型血清を含むCellGro SCGM(CellGenix社製;以下、1HCellGroと記載する)又は5%ヒトAB型血清を含むCellGro(以下、5HCellGroと記載する)に懸濁して、以下の実験で使用した。
実施例1−(3)と同様の方法でNK細胞の拡大培養を行った。ただし、培養用培地として1HCellGro又は5HCellGroを使用し、AICとして実施例3−(3)で調製したPBMC AIC及びRN−T AICを使用した。
培養開始2日目に、各ウェルに1HCellGro又は5HCellGroを1mLずつ添加し、終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した。5日目に、各ウェルに終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した。7日目に、各ウェルの細胞液を1HCellGro又は5HCellGroを用いて3倍希釈し、新しい24穴細胞培養プレートに希釈した細胞液2mLを移した。9日目及び13日目に同様の継代操作を行った。なお、9日目及び13日目目の細胞液の希釈倍率はそれぞれ5倍及び4倍とした。こうして、培養開始16日目まで培養を継続した。各継代日にはそれぞれ各ウェルに終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した。培養開始後16日目にトリパンブルー染色法によって生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。さらに、実施例1−(4)と同様の方法で、NK細胞含有比率を解析した。結果を表5に示す。
(1)抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチンの固定化プレートの作製
実施例3−(1)と同様の方法で抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチン固定化プレートを作製した。
実施例3−(2)と同様の方法で、RN−Tの拡大培養を行った。ただし、培養期間は19日間とし、培養開始4日目以降、1HGT−T551を用いて適宜希釈し、各継代日ごとに終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加して培養を継続した。
実施例3−(3)と同様の方法でAICを調製した。実施例4−(2)において培養されたRN−Tについて、培養開始6、13及び19日目に回収した細胞にX線照射装置を使用して3400R(29.8Gy)のX線を照射して1HCellGroに懸濁して以下の実験に使用した。
実施例1−(3)と同様の方法でNK細胞の拡大培養を行った。ただし、培養用培地として1HCellGroを使用し、AICとして実施例4−(3)で調製した各RN−T AICを使用した。
培養開始2日目に、各ウェルに1HCellGroを1mLずつ添加し、終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した。
5日目に、各ウェルに終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した。7日目に、各ウェルの細胞液を1HCellGroを用いて3倍希釈し、新しい24穴細胞培養プレートに希釈した細胞液2mLを移した。9、13、16及び20日目に同様の継代操作を行った。なお、9、13、16及び20日目の細胞液の希釈倍率は、それぞれ5倍、3倍、5倍及び2倍とした。各継代日に、各ウェルに終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した。培養開始7日目及び13日目に、それぞれ実施例4−(3)で調製したRN−T AICを1×106cells/ウェルずつ添加した。培養開始後16日目、20日目及び22日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表6に示す。
また、NK細胞の培養期間中におけるRN−T AICでの刺激回数が多くなるに従って、高いNK細胞拡大培養率が得られた。
すなわち、AICによる刺激によりNK細胞の増殖性が高くなることが明らかとなり、ゆえにNK細胞培養時にRN−T AICを組み合わせることにより、高い拡大培養率でNK細胞が得られることが明らかとなった。
(1)抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチンの固定化プレートの作製
実施例3−(1)と同様の方法で抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチン固定化プレートを作製した。
実施例4−(2)と同様の方法で、RN−Tの拡大培養を行った。
実施例3−(3)と同様の方法でAICを調製した。実施例5−(2)において培養開始7及び14日目にそれぞれ回収したRN−Tに、X線照射装置を使用して3400R(29.8Gy)のX線を照射し、5HCellGroに懸濁して、以下の実験に使用した。
実施例1−(3)と同様の方法でNK細胞の拡大培養を行った。ただし、培養用培地として5HCellGroを使用し、AICとして実施例5−(3)で調製した各RN−T AICを使用した。
培養開始2日目に、各ウェルに5HCellGroを1mLずつ添加し、終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した。
5日目に、各ウェルに終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した。7日目に、各ウェルの細胞液を5HCellGroを用いて3倍希釈し、新しい24穴細胞培養プレートに希釈した細胞液2mLを移した。同様の継代操作を9日目、13日目、16日目及び20日目に行い、22日目まで培養を継続した。なお、9、13、16及び20日目の細胞液の希釈倍率は、それぞれ3倍、2.5倍、4倍及び2倍とした。各継代日に各ウェルに5HCellGroを1mLずつ添加し、終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した。7日目に実施例5−(4)で調製したRN−T AICを1×106cells/ウェルずつ添加した。培養開始後20日目及び22日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表7に示す。
すなわち、NK細胞培養時にOK−432とRN−T AICによる複数回刺激を組み合わせることにより、高い拡大培養率でNK細胞が得られることが明らかとなった。
実施例1−(4)と同様の方法で、実施例5−(4)で調製した培養開始後22日目の細胞について、NK細胞含有比率を測定した。結果を表8に示す。
実施例1−(5)と同様の方法で、実施例5−(4)で調製した培養開始後22日目の細胞について、その細胞傷害活性を測定した。ただし、標的細胞としてK562及びDaudiを使用した。細胞傷害活性測定の結果を表9に示す。
すなわち、NK細胞培養時にてOK−432と複数回のRN−T AIC刺激とを組み合わせることにより、より高い細胞傷害活性を発揮するNK細胞を含む細胞集団が効率よく得られることが明らかとなった。
(1)抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチンの固定化プレートの作製
実施例3−(1)と同様の方法に従って、抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチン固定化プレートを作製した。
実施例4−(2)と同様の方法で、RN−Tの拡大培養を行った。ただし、培養期間は14日間とした。
実施例3−(3)と同様の方法でAICを調製した。実施例6−(2)において培養開始7及び14日目にそれぞれ回収したRN−TにX線照射装置を使用して1000R(8.8Gy)、2000R(17.6Gy)、3400R(29.8Gy)又は5500R(48.2Gy)のX線を照射し、5HCellGroに懸濁して、以下の実験に使用した。
実施例1−(3)と同様の方法でNK細胞の拡大培養を行った。ただし、培養用培地として5HCellGroを使用し、AICとして実施例6−(3)で調製した各RN−T AICを使用した。
培養開始1日目又は3日目に、各ウェルに5HCellGroを1mLずつ添加し、終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した。
4日目又は5日目に、各ウェルに終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した。7日目に、各ウェルの細胞液を5HCellGroを用いて9倍希釈し、新しい24穴細胞培養プレートに希釈した細胞液2mLを移し、それぞれ実施例6−(3)で調製したRN−T AICを1×106cells/ウェルずつ添加した。前記の、細胞液を希釈して、希釈した細胞液2mLを新たなプレートに移す継代操作を、11日目、14日目、15日目、17日目又は18日目に行い、培養開始21日目まで培養を継続した。なお、11、14、15、17及び18日目の細胞液の希釈倍率は、それぞれ5倍、3倍、4倍、4倍及び2倍とした。各継代日に各ウェルに終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した。7日目にはそれぞれ実施例6−(3)で調製したRN−T AICを1×106cells/ウェルずつ添加した。培養開始後21日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表10に示す。
すなわち、NK細胞培養時にX線照射量の異なるRN−T AICを組み合わせても、高い拡大培養率でNK細胞が得られることが明らかとなった。
実施例1−(4)と同様の方法で、実施例6−(4)で調製した培養開始後21日目の細胞について、NK細胞含有比率を測定した。結果を表11に示す。
すなわち、NK細胞培養時にOK−432とAICを組み合わせることにより、高含有比率でNK細胞を含む細胞集団が得られることが明らかとなった。
(1)PBMCを用いたAICの調製
実施例1−(2)と同様の方法でPBMC AICを調製した。
実施例1−(3)と同様の方法で、NK細胞の拡大培養を行った。ただし、培養用基本培地として、5HRPMI、5%ヒトAB型血清及び0.2%HSAを含むGT−T503(タカラバイオ社製;以下、5H0.2%HSA/GT−T503と記載する)又は5HCellGroを使用した。
培養開始7日目に各ウェルの細胞液をそれぞれの培養用基本培地を用いて3倍希釈し、各ウェルに終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した後、新しい24穴細胞培養プレートに希釈した細胞液2mLを移した。9日目に、同様に3倍希釈した細胞液2mLを新しい24細胞培養プレートに移し、さらに11日目に5倍希釈した細胞液4mLを新しい12穴細胞培養プレートに移した。各継代日に各ウェルに終濃度200U/mLとなるようにIL−2をそれぞれ添加した。培養開始15日目まで培養を継続し、培養開始後15日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を12に示す。
実施例7−(2)で調製した培養開始後15日目の細胞について、実施例1−(4)と同様の方法でNK細胞含有比率を解析した。結果を表13に示す。
(1)抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチンの固定化プレートの作製
実施例3−(1)と同様の方法で抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチン固定化プレートを作製した。
実施例6−(2)と同様の方法で、RN−Tの拡大培養を行った。
実施例8−(2)で調製したRN−Tを用いて、実施例5−(3)と同様の方法でAICを調製した。ただし、X線照射後のRN−T AICは、1HCellGro、1%ヒトAB型血清を含むGT−T502(タカラバイオ社製;以下、1HGT−T502と記載する)、1%ヒトAB型血清及び0.2%HSAを含むGT−T503(タカラバイオ社製;以下、1H0.2%HSA/GT−T503と記載する)にそれぞれに懸濁して、以下の実験に使用した。
実施例1−(3)と同様の方法でNK細胞の拡大培養を行った。ただし、培養用基本培地として、培養開始時には1HCellGroを使用し、培養開始7日目又は9日目以降の培地を1HGT−T502又は1H0.2%HSA/GT−T503に変更する群も設定した。また培養開始14日目に培地を1HGT−T502に変更するする群、さらに培養開始時から終了時まで1HCellGroと1HGT−T502を比率1:1で混合した基本培地(以下、1HCellGro/GT−T502と記載する)を使用する群も設定した。
培養開始4日目に、各ウェルに終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した。7日目に、各ウェルの細胞液を各培養用培地を用いて3倍希釈し、新しい24穴細胞培養プレートに細胞液2mLを移した。同様の継代を9日目、14日目及び18日目に実施し、22日目まで培養を継続した。なお、9、14及び18日目の細胞液の希釈倍率は、それぞれ5倍、3倍及び2倍とした。各継代日に各ウェルに終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した。培養開始7日目にそれぞれ実施例8−(3)で調製したRN−T AICを1×106cells/ウェルずつ添加した。
培養開始後14日目、18日目及び21日目にトリパンブルー染色法によって生細胞数をそれぞれ計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表14に示す。
実施例8−(4)で調製した培養開始後21日目の細胞について、実施例1−(4)と同様の方法でNK細胞含有比率を解析した。結果を表15に示す。
以上のとおり、培養途中で培地を変更した場合であっても、本発明によれば、高い比率でNK細胞を含む細胞集団を効率よく取得できることが明らかになった。
(1)抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチンの固定化CultiLife(登録商標) 215の作製
培養面積を86cm2になるようにシールしたガス透過性培養バッグCultiLife 215(タカラバイオ社製)に終濃度5μg/mLの抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチンを含むACD−A液を10.4mL添加し、5%CO2存在下、37℃で5時間インキュベートした。抗CD3抗体/レトロネクチン固定化CultiLife 215を、使用直前に1%HSA/生理食塩水で3回洗浄した。
インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナーにて、30mL分のへパリン加採血を実施した。得られた血液を700×g、室温で20分間遠心し、遠心後の上清である血漿画分とPBMCを含む細胞画分とに分離した。血漿画分は、56℃にて30分間非働化処理を行い、900×g、4℃で30分間遠心し、その上清を非働化済み自己血漿(以下、血漿と記載する)として、以後の工程で使用した。
実施例9−(2)で分離したPBMC 1.2×107cellsを1HGT−T551 120mLに懸濁し、実施例9−(1)で作製した抗CD3抗体及びレトロネクチン固定化CultiLife 215に添加した。終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加し、5%CO2存在下、37℃で培養を開始した(培養0日目)。培養開始4日目に、各CultiLife 215内の細胞液を懸濁し、40mLを培養面積を430cm2となるようにシールした何も固定化していないガス透過性培養バッグCultiLife(登録商標) Eva(タカラバイオ社製)に移した。この際、1HGT−T551を292.6mL添加し、CultiLife Eva内の総液量を336mLとし、終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した後、5%CO2中37℃で培養した。培養を7日目まで継続し、7日目に必要量の培養RN−Tを分取(AIC材料として、以後の工程で使用する)後、バッグ内に残った細胞液と等量の無血漿GT−T551及び終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した。11日目にCultiLife Eva内の細胞液を無血漿GT−T551を用いて2倍希釈した後、終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した。14日目に必要量のRN−Tを分取し、AIC材料として以後の工程で使用した。
実施例9−(3)で調製したRN−Tを用いて、実施例5−(3)と同様の方法でAICを調製した。培養開始7日目のRN−Tを用いて調製したRN−T AICを2×106cells/mLとなるように0.8%血漿を含むCellGro(以下、0.8%血漿/CellGroと記載する)に懸濁し、また、培養開始14日目のRN−Tを用いて調製したRN−T AICを4×106cells/mLとなるように0.8%血漿/CellGroに懸濁した。
ガス透過性培養バッグCultiLife(登録商標) Spin(タカラバイオ社製)に、実施例9−(2)で調製したPBMC及び実施例9−(4)で調製したRN−T AIC(培養開始7日目のRN−Tを用いて調製したもの)をそれぞれ3×107cellsずつ添加し、終濃度200U/mLとなるようにIL−2を、終濃度0.05KE/mLとなるようにOK−432をそれぞれ添加し、0.8%血漿/CellGroを用いて最終的に総液量を30mLとした。細胞液を添加した培養バッグを5%CO2存在下、37℃で培養を開始した(培養0日目)。培養開始2日目に、培養バッグに0.8%血漿/CellGroを30mL添加し、終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した。4日目に、培養バッグに終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した。7日目に、培養バッグ内の総細胞数をトリパンブルー染色法により算出後、細胞液30mLをCultiLife 215に移し、実施例9−(4)で調製したRN−T AIC(培養開始14日目のRN−Tを使用したもの)を細胞数比が1:1になるように添加した。この培養バッグに終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した後、0.8%血漿/CellGroを用いて総液量が180mLとなるようにした。11日目に、CultiLife 215内の細胞液90mLをCultiLife Evaに移し替え0.8%血漿及び0.2%HSAを含むGT−T503(以下、0.8%血漿/0.2%HSA/GT−T503と記載する)を用いて5倍希釈し総液量を450mLとした後、終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した。13日目には、CultiLife Eva内の細胞液225mLを0.26%血漿及び0.2%HSAを含むGT−T503(以下、0.26%血漿/0.2%HSA/GT−T503と記載する)を用いて3倍希釈し総液量を675mLとした後、終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した後、CultiLife Evaに移し替えた。培養は16日目まで継続した。培養開始後13及び16日目にそれぞれサンプリングした細胞についてトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表16に示す。
実施例9−(5)で調製した培養開始後16日目の細胞について、実施例1−(4)と同様の方法でNK細胞含有比率を解析した。ただし、PC5標識マウス抗ヒトCD16抗体(ベックマンコールター社製)を組み合わせて、CD3陽性CD56陰性細胞(T細胞)及びCD16陽性CD56陽性細胞含有比率についても併せて解析した。結果を表17に示す。
実施例9−(5)で調製した培養開始後16日目の細胞について、実施例1−(5)と同様の方法で、細胞傷害活性を測定した。ただし、標的細胞として、下表のK562、Daudi、食道扁平上皮癌細胞株T.Tn、乳腺癌由来細胞株MCF7、肺がん細胞株A549、メラノーマ細胞株A375、胃癌細胞株MKN45及び大腸癌細胞株HT29を使用し、E/T比30、10、3、1について測定を行った。細胞傷害活性測定の結果を表18に示す。
すなわち本発明によりCD3陰性CD56陽性CD16陽性の表現型を示し、高い細胞傷害性を有する細胞集団を高い純度で得ることが可能になった。
(1)抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチンの固定化プレートの作製
実施例3−(1)と同様の方法で抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチン固定化プレートを作製した。
実施例6−(2)と同様の方法で、RN−Tの拡大培養を行った。ただし、NK細胞培養を行う際に材料となるPBMCを提供するドナーと同一ドナー由来PBMCからRN−Tを培養するもの(以下自己RN−Tと記載)、及び異なるドナー由来PBMCからRN−Tを培養するもの(以下非自己RN−Tと記載)をそれぞれ培養した。
実施例10−(2)で調製した自己RN−T及び非自己RN−Tそれぞれを用いて、実施例5−(3)と同様の方法でX線照射細胞を調製した。
実施例1−(3)と同様の方法でNK細胞の拡大培養を行った。ただし、培養用培地として5HCellGroを使用し、AICとして実施例10−(3)で調製した自己RN−TX線照射細胞(RN−T AICと同義)及び非自己RN−TX線照射細胞を使用した。
培養開始2日目に、各ウェルに5HCellGroを1mLずつ添加し、終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した。4日目に、各ウェルに終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した。7日目に、各ウェルの細胞液を5HCellGroを用いて3倍希釈し、新しい24穴細胞培養プレートに細胞液2mLを移した。9日目に、各ウェルの細胞液を同様に3倍希釈し、新しい24穴細胞培養プレートに希釈した細胞液2mLを移した。さらに、11日目に、各ウェルの細胞液を同様に2.5倍希釈し、新しい12穴細胞培養プレートに希釈した細胞液4mLを移した。各継代日に各ウェルに終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した。これらの細胞の培養は15日目まで継続した。培養開始後11及び15日目にそれぞれサンプリングした細胞についてトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表19に示す。
異なるドナーの2種のリンパ球細胞を混合すると、自己細胞を混合した際には起こらない非自己混合リンパ球反応(Allogeneic mixed lymphocyte reaction;以下、Allo−MLRと記載する)により、非自己抗原を認識してリンパ球が増殖することが一般的に知られ、X線照射非自己細胞はフィーダー細胞として汎用されている。しかし、X線照射非自己細胞の代わりに、X線照射自己細胞であるRN−T AICをNK細胞培養時に用いた場合にも同様のNK細胞拡大培養効果が得られたことは、驚くべきことである。さらには、培養後のNK細胞を当該ドナーに投与する医療の安全性の点からも、自己由来のRN−T AICをNK培養時に用いることは、その安全性を著しく向上させることになる。
実施例10−(4)で調製した培養開始後15日目の細胞について、実施例9−(6)と同様の方法でNK細胞含有比率及びCD16陽性CD56陽性細胞比率を解析した。結果を表20に示す。
すなわち、OK−432及び自己RN−T AICを組み合わせたNK細胞培養方法は、高いNK細胞含有比率及びCD16陽性NK細胞比率を有し、かつ安全性の高いNK細胞が得られる方法であることが明らかとなった。
(1)PBMCを用いたX線照射細胞の調製
実施例1−(1)で調製したPBMCを用いて、実施例3−(3)と同様の方法でPBMC AICを調製した。調製したPBMC AICを5HCellGroに懸濁し、以下の実験で使用した。
実施例1−(3)と同様の方法でNK細胞の拡大培養を行った。ただし、培養用培地として5HCellGroを使用し、AICとして実施例11−(1)で調製したPBMC AICを使用した。
培養開始7日目に、各ウェルの細胞液を5HCellGroを用いて8倍希釈し、新しい24穴細胞培養プレートに細胞液2mLを移した。この際、各ウェルに実施例11−(1)で調製したPBMC AIC 1×106cellsを添加し、終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した。同様の継代操作を10日目及び15日目に実施した。なお、10日目及び15日目の細胞液の希釈率は、それぞれ6倍及び3倍とした。さらに、18日目に、各ウェルの細胞液を同様に4倍希釈し、新しい12穴細胞培養プレートに希釈した細胞液を4mL移した。各継代日に終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した。これらの細胞を培養開始22日目まで培養を継続し、その一部についてトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果(拡大培養率)を表21に示す。
実施例11−(2)で調製した培養開始後22日目の細胞について、実施例9−(6)と同様の方法でNK細胞含有比率及びCD16陽性CD56陽性細胞比率を解析した。ただし、この際、FITC標識マウス抗ヒトCD34抗体(ベクトン ディッキンソン社製)、PE標識マウス抗ヒトCD117抗体(R&D systems社製)及びFITC標識マウス抗ヒトCD94抗体(eBioscience社製)を用いて、CD34陽性CD117陽性細胞及びCD94陽性CD56陽性含有比率についても同様に解析した。結果を表22に示す。
NK細胞はその表面抗原の発現により4つの分化段階に分けられることが知られているが、その中でも特にCD56陽性、CD16陽性、CD34陰性、CD117陰性かつCD94陽性細胞は最終分化段階の細胞にみられる表現型であり、高い細胞傷害活性を発揮する成熟化NK細胞であることが知られている。
すなわち、本発明の方法により、成熟化したNK細胞が効率的に得られることが明らかとなり、本発明により成熟NK細胞の効率良い製造方法が提供された。
(1)抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチンの固定化プレートの作製
実施例3−(1)と同様の方法で抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチン固定化プレートを作製した。
実施例6−(2)と同様の方法で、RN−Tの拡大培養を行った。ただし、培養開始7日目以降は無血漿GT−T551を使用した。
実施例12−(2)で調製したRN−Tを用いて、実施例5−(3)と同様の方法でRN−T AICを調製した。ただし、培養開始7日目のRN−Tは、0.8%ヒトAB型血清を含むCellGro(以下、0.8HCellGroと記載)に懸濁し、14日目のRN−Tは0.8%ヒトAB型血清を含むGT−T502(以下、0.8HGT−T502と記載)に懸濁した後、以下の実験に使用した。
実施例1−(3)と同様の方法でNK細胞の拡大培養を行った。ただし、OK−432又はRN−T AICを添加しない群も設定した。また培養用基本培地として、培養開始時から4日目までは0.8HCellGroを使用し、7日目には0.8HGT−T502を、13日目には0.29%ヒトAB型血清を含むGT−T502(以下、0.29HGT−T502と記載)を使用した。培養開始1日目には、各ウェルに0.8HCellGro1mL及び終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した。4日目には、各ウェルに終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した。7日目には、各ウェルの細胞液を0.8HGT−T502を用いて6倍希釈し、新しい24穴細胞培養プレートに細胞液2mLを移した。同様の継代操作を11日目及び13日目にそれぞれ実施し、17日目まで培養を継続した。なお、10日目及び15日目の細胞液の希釈は、それぞれ0.8HGT−T502による5倍希釈、0.29HGT−T502による3倍希釈とした。培養開始7日目には一部条件については、実施例12−(3)で調製したRN−T AICを1×106cells/ウェルずつ添加した。
培養開始後11日目、13日目及び17日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数をそれぞれ計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表23に示す。
実施例12−(4)で調製した培養開始後17日目の細胞について実施例9−(6)と同様の方法で、NK細胞含有比率、CD3陽性CD56陰性細胞比率、及びCD16陽性CD56陽性細胞を解析した。結果を表24に示す。
培養開始前のPBMC及び実施例12−(4)で調製した培養開始後17日目の細胞について、それぞれ実施例9−(6)と同様の方法でNK細胞含有比率を解析した。また、実施例12−(4)で得られた拡大培養率(総細胞換算)を用いて、培養開始時のNK細胞数と比較して、培養17日目におけるNK細胞拡大培養率を算出した(以下の式(2)を参照のこと)。結果を表25に示す。
(1)NK細胞集団の拡大培養
実施例9−(5)と同様の方法でNK細胞の拡大培養を行った。ただし、培養13日目には、CultiLife Eva内の細胞液225mLを0.29%血漿及び0.2%HSAを含むGT−T503(以下、0.29%血漿/0.2%HSA/GT−T503と記載する)を用いて3倍希釈し総液量を675mLとした後、終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加し、CultiLife Evaに移し替えた。培養15日目に、培養バッグに終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した。培養18日目に、CultiLife Eva内の細胞液338mLを0.29%血漿/0.2%HSA/GT−T503を用いて総液量を675mLとした後、終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加し、CultiLife Evaに移し替えた。培養は20日目まで継続した。培養開始後18及び20日目にそれぞれサンプリングした細胞について、トリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表26に示す。
実施例13−(1)で調製した培養開始後20日目の細胞について、実施例9−(6)と同様の方法で、T細胞含有比率、NK細胞含有比率及びCD16陽性CD56陽性細胞含有比率を解析した。ただし、この際、FITC標識マウス抗ヒトNKp44抗体(SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY社製)、FITC標識マウス抗ヒトNKp46抗体(R&D Systems社製)、FITC標識マウス抗ヒトCD25抗体(DakoCytomation社製)、及びPC5標識マウス抗ヒトCD62L抗体(ベックマンコールター社製)を用いて、NKp44陽性CD56陽性細胞、NKp46陽性CD56陽性細胞、CD25陽性CD56陽性細胞及びCD62L陽性CD56陽性細胞含有比率についても解析した。結果を表27に示す。
NKp44及びNKp46は、natural cytotoxicity receptor(NCR)ファミリーに属し、NK細胞による細胞傷害活性にそれぞれ関与していると言われる。NKp44は静止期NK細胞には発現せず活性化NK細胞だけに発現し、NKp46はNK細胞にのみ発現するNK細胞共通の表面抗原であり、CD25はIL−2で刺激され、活性化したNK細胞に発現する。CD62Lはリンパ球のホーミングの際に重要な役割を果たし、血流から炎症部位への集積にも関与することが知られている。
すなわち、本発明の方法により、成熟化かつ活性化したNK細胞が効率的に得られることが明らかとなり、本発明により成熟NK細胞の効率よい製造方法が提供された。
(1)抗CD3抗体/レトロネクチン刺激T細胞の拡大培養
実施例9−(2)と同様の方法で分離したPBMC1.2×107cellsを1HGT−T551 120mLに懸濁し、実施例9−(1)と同様の方法で作製した抗CD3抗体及びレトロネクチン固定化CultiLife 215に添加し、終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加し、5%CO2存在下、37℃で培養を開始した(培養0日目)。培養開始4日目に、CultiLife 215内の細胞液を懸濁し、30mLを培養面積が320cm2となるようにシールした何も固定化していないガス透過性培養バッグCultiLife Evaに移した。この際、1HGT−T551を220mL添加し、CultiLife Eva内の総液量を250mLとし、終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した後、5%CO2中37℃で培養した。培養を7日目まで継続し、7日目に必要量の培養RN−Tを分取(AIC材料として、以後の工程で使用する)後、バッグ内に残った細胞液と等量の無血漿GT−T551及び終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した。11日目にCultiLife Eva内の細胞液を無血漿GT−T551を用いて2倍希釈した後、終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した。14日目に、必要量のRN−Tを分取し、AIC材料として以後の工程で使用した。
実施例14−(1)で調製したRN−Tを用いて、実施例5−(3)と同様の方法でAICを調製した。培養開始7日目のRN−Tを用いて調製したRN−T AICを2×106cells/mLとなるように、培養開始14日目のRN−Tを用いて調製したRN−T AICを4×106cells/mLとなるように、それぞれ0.8%血漿/CellGroに懸濁した。
実施例9−(5)と同様の方法でNK細胞集団の拡大培養を行った。ただし、培養開始時にはCultiLife 215を使用し、13日目の希釈操作を14日目に実施した。培養は18日目まで継続した。培養開始後18日目にサンプリングした細胞について、トリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表28に示す。
実施例14−(3)で調製した培養開始後18日目の細胞について、実施例9−(6)と同様の方法で、T細胞含有比率、NK細胞含有比率及びCD16陽性CD56陽性細胞含有比率を解析した。ただし、PE標識マウス抗ヒトNKG2D抗体(ベックマンコールター社製)を組み合わせて、CD56陽性NKG2D陽性細胞含有比率についても併せて解析した。結果を表29に示す。
実施例14−(3)で調製した培養開始後18日目の細胞について、実施例1−(5)と同様の方法で、細胞傷害活性を測定した。ただし、標的細胞としてK562及びA549をそれぞれ使用し、E/T比10、3、1及び0.3について測定を行った。細胞傷害活性測定の結果を表30に示す。
すなわち、本発明により、CD3陰性CD56陽性CD16陽性の表現型を示し、高い細胞傷害性を有する細胞集団を高い純度で得ることが可能になった。
(1)PBMCを用いたAICの調製
実施例1−(2)と同様の方法でPBMC AICを調製した。ただし、調製したPBMC AICを2×106cells/mLとなるように0.8HCellGroに懸濁して、以下の実験に使用した。
実施例1−(3)と同様の方法でNK細胞の拡大培養を行った。ただし、培養用培地として0.8HCellGroを使用し、AICとして実施例15−(1)で調製したPBMC AICを使用した。
培養開始1日目に、各ウェルに0.8HCellGroを1mLずつ添加し、終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した。3日目に、各ウェルに終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した。7日目に、各ウェルの細胞液を0.8HCellGroを用いて6倍希釈し、新しい24穴細胞培養プレートに希釈した細胞液1.674mLを移した。10日目に、各ウェルの細胞液を0.8HGT−T502を用いて5倍希釈し、新しい24穴細胞培養プレートに希釈した細胞液2mLを移した。各継代日に各ウェルに終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した。培養開始14日目の細胞を5HRPMIを用いて1×106cells/mLとなるよう調製し、インターフェロン(IFN)アルファ(製剤名 スミフェロン:大日本住友製薬;以下、IFN−αと記載する)を終濃度1000U/mLとなるように添加し、37℃、5%CO2インキュベーター内で1時間静置した。この細胞液を洗浄した後、5HRPMIで懸濁した(IFNα処理)。この際、IFN−αを添加しない群(IFNα未処理)も作製した。
実施例15−(2)で調製した培養開始後14日目の細胞について、実施例1−(5)と同様の方法で、細胞傷害活性を測定した。ただし、標的細胞としてK562、A549及びHT29を使用し、E/T比10、3、1及び0.3について測定を行った。細胞傷害活性測定の結果を表31に示す。
(1)抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチンの固定化プレートの作製
実施例3−(1)と同様の方法で抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチン固定化プレートを作製した。
実施例3−(2)と同様の方法で、RN−Tの拡大培養を行った。
実施例16−(2)で培養したRN−Tを5HRPMIで5×106cells/mLとなるように調製し、1.5mLチューブ(ワトソン社製又はトレフ社製)に0.6mLずつ移し、45℃で1時間ウォーターバスを用いて温熱処理を行った。処理した細胞液を回収、遠心した後、上清を除去し、0.8HCellGroで2、4及び10×106cells/mLとなるようにそれぞれ調整した(以下、この温熱処理後のRN−T細胞を温熱処理RN−Tと記載する)。
実施例12−(4)と同様の方法でNK細胞の拡大培養を行った。ただし、培養開始時には12穴細胞培養プレートに、Responder細胞及び実施例16−(3)で各細胞濃度に調整した温熱処理RN−Tを0.95mL/ウェルずつ添加し、計1.9mL/ウェルとした。この際、温熱処理RN−T条件及びOK−432のみを添加する群(以下、対照群と記載)を設定した。実施例12−(4)における13日目の操作を当該実施例においては14日目に行い、18日目まで培養を継続した。培養用基本培地として、培養開始時7日目までは0.8HCellGroを使用し、11日目には0.8HGT−T502を、14日目には0.3HGT−T502を使用した。培養開始後18日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。さらに、実施例1−(4)と同様の方法で、NK細胞含有比率を解析した。結果を表32に示す。
すなわち、NK細胞培養時にOK−432及び温熱処理RN−Tを組み合わせることで高い拡大培養率で高純度のNK細胞が得られることが明らかとなった。
(1)NK細胞集団の拡大培養
実施例16−(4)と同様の方法で、NK細胞の拡大培養を行った。ただし、培養開始時にはResponder細胞及び実施例5−(3)と同様の方法で調製したAICを0.95mL/ウェルずつ添加し、計1.9mL/ウェルとした。20日目まで培養を継続し、18日目には血清を含まないGT−T502を用いて2倍希釈した後、終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した。
実施例1−(5)と同様の方法で実施例17−(1)で調製した培養開始20日目の細胞について、細胞傷害活性を測定した。ただし、乳癌細胞株であるBT−474、SKBR3、及び胃癌細胞株NCI−N87を使用し、1%BSA/DPBSを用いて1×106cells/mLとなるよう調製した各細胞株にトラスツズマブ製剤(製剤名 ハーセプチン注射用:中外製薬社製)を終濃度10μL/mLとなるよう添加し、4℃で30分間インキュベートした。これを遠心、洗浄した後、2×106cells/mLとなるよう5%ウシ胎児血清を含むRPMI1640培地で調製した細胞液を標的細胞とした。この際、E/T比は10、3及び1とし、トラスツズマブ製剤を添加しない群も作製した。細胞傷害活性測定の結果を表33に示す。
(1)抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチンの固定化プレートの作製
実施例3−(1)と同様の方法で抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチン固定化プレートを作製した。ただし、抗CD3抗体/レトロネクチン固定化プレートは、使用直前にDPBSで2回、GT−T551で1回洗浄した。
実施例3−(2)と同様の方法で、RN−Tの拡大培養を行った。
実施例18−(2)で調製したRN−Tを用いて、実施例3−(3)と同様の方法でAICを調製した。ただし、培養開始7日目に回収したRN−Tは、X線照射後0.8HCellGroに懸濁して、以下の実験に使用した。
実施例12−(4)と同様の方法でNK細胞の拡大培養を行った。ただし、添加するRN−T AIC細胞数をResponder細胞に対して1倍、5倍及び10倍にそれぞれ設定し、全ての群にOK−432を添加した。また、培養用基本培地として、培養開始時から11日目までは0.8HCellGroを使用し、実施例12−(4)における4、7及び13日目の操作を当該実施例では5、8及び15日目にそれぞれ行った。培養開始後18日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。さらに、実施例1−(4)と同様の方法で、NK細胞含有比率を解析した。結果を表34に示す。
すなわち、RN−T AIC量依存的にNK細胞の増殖性が高くなることが明らかとなり、NK細胞培養時においてRN−T AICが好適に使用されることが明らかとなった。
(1)抗CD3抗体/レトロネクチン刺激T細胞の拡大培養
実施例14−(1)と同様の方法で、抗CD3抗体/レトロネクチン刺激T細胞の拡大培養を行った。
実施例19−(1)で調製したRN−Tを用いて、実施例14−(2)と同様の方法でAICを調製した。
実施例14−(3)と同様の方法でNK細胞集団の拡大培養を行った。
実施例19−(3)で調製した16日目の細胞を1×108cells/vialとなるように実施例1−(1)と同様にCP−1/HSAを用いて液体窒素中にて保存した。
実施例19−(4)で凍結保存した細胞を37℃のウォーターバスで急速解凍後GT−T502を用いて洗浄した。これらの細胞を約2×106cells/mLとなるように0.2H GT−T503を用いて調整し、12穴細胞培養プレートに4mLずつ添加した。また、これらのプレートにIL−2を0(非添加群)、200又は1000U/mLとなるように添加し、5%CO2存在下、37℃で一晩インキュベーションした。
実施例19−(3)及び(5)で調製した細胞を用いて、実施例1−(5)と同様の方法により標的細胞A549及びA375に対して凍結保存前後の細胞傷害活性を測定した。ただし、E/T比は10とした。結果を表35に示す。
すなわち、凍結解凍後のNK細胞を一晩培養することにより活性が回復し、更にIL−2を添加することによって細胞傷害活性が高くなることが明らかとなった。
(1)抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチンの固定化プレートの作製
実施例18−(1)と同様の方法で、抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチン固定化プレートを作製した。
実施例3−(2)と同様の方法で、RN−Tの拡大培養を行った。
実施例20−(2)で調製したRN−Tを、実施例16−(3)と同様の方法で温熱処理RN−Tを調製した。ただし、温熱処理時の温度は45及び48℃とし、処理時間は0.5、1、2又は4時間を設定し、処理時の細胞濃度は0.8HCellGroで2×106cells/mLとなるように調整した。
実施例12−(4)と同様の方法でNK細胞の拡大培養を行った。ただし、AICの代わりに温熱処理RN−Tを用いOK−432添加を組み合わせた群、及びOK−432のみを添加する群(以下、対照群と記載する)を設定した。実施例12−(4)での1及び13日目の操作を当該実施例においては2及び14日目にそれぞれ行い、培養開始後16日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。さらに、実施例1−(4)と同様の方法で、NK細胞含有比率を解析した。結果を表36に示す。
すなわち、NK細胞培養時にOK−432及びRN−T温熱処理細胞を組み合わせることで、高い拡大培養率で高純度のNK細胞が得られることが明らかとなった。
(1)抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチンの固定化プレートの作製
実施例18−(1)と同様の方法で抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチン固定化プレートを作製した。
実施例3−(2)と同様の方法で、RN−Tの拡大培養を行った。
実施例21−(2)で調製したRN−Tを、1又は2×106cells/mLとなるようにGT−T551を用いて懸濁した。200mL分離バッグ(テルモ社製)に調製した細胞液50mLを移し、45℃で0.25又は0.5時間ウォーターバスを用いて温熱処理を行った。ただし、細胞濃度2×106cells/mLの条件では、45℃で0.5時間の温熱処理のみ行った。温熱処理後の細胞液を50mLコニカルチューブ(コーニング社製)に回収し、440×g、室温で5分間遠心した。遠心後、上清を除去し、0.8HCellGroに2×106cells/mLとなるように細胞を懸濁した。
実施例12−(4)と同様の方法でNK細胞の拡大培養を行った。ただし、培養開始時には12穴細胞培養プレートに、Responder細胞及び実施例21−(3)で調製した温熱処理RN−Tを0.95mL/ウェルずつ添加し、計1.9mL/ウェルとした。3日目に、各ウェルに0.8HCellGro1.9mLを添加した。7日目に、各ウェルの細胞液を0.8HCellGroを用いて6倍希釈し、新しいT25細胞培養フラスコ(ファルコン社製またはコーニング社製)に細胞液1.4mLを移し、立てて培養した。同様の継代操作を11日目及び14日目に実施し、17日目まで培養を継続した。なお、11日目び14日目の細胞液の希釈は、それぞれ0.8HGT−T502による5倍希釈、0.29HGT−T502による3倍希釈とした。培養開始後17日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。さらに、実施例1−(4)と同様の方法で、NK細胞含有比率を解析した。結果を表37に示す。
すなわち、NK細胞培養時にOK−432及びRN−T温熱処理細胞を組み合わせることによって、高い拡大培養率と高純度のNK細胞が得られることが明らかとなった。
(1)抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチンの固定化プレートの作製
実施例18−(1)と同様の方法で、抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチン固定化プレートを作製した。
実施例3−(2)と同様の方法で、RN−Tの拡大培養を行った。
実施例18−(3)と同様の方法で、AICの調製を行った。
実施例21−(4)と同様の方法で、NK細胞の拡大培養を行った。ただし、温熱処理細胞の代わりに実施例22−(3)で調製したAICを使用し、実施例21−(4)における3日目の操作を当該実施例では2日目に行い、培養を22日目まで継続した。
実施例22−(4)で調製した培養開始後22日目の細胞を、エフェクター細胞として3×106cells/mLとなるように5HRPMIで希釈後、96穴細胞培養プレートの各ウェルに100μL/ウェルずつ分注しておき、これらに1×106cells/mLとなるように調製した標的細胞(K562)を100μL/ウェルずつ添加した。この際、標的細胞(T)に対するエフェクター細胞(E)の比、すなわちE/T比は、3とした。PE/Cy5標識マウスCD107a抗体(abcam社製)を1μL/ウェルずつ添加し、37℃1時間インキュベーションした。さらに、BrefeldinA(シグマ社製)を終濃度10μg/mLとなるように添加後、37℃3時間インキュベーションした。インキュベーション後のプレートを250×g、5分遠心し、上清を除去後、1%BSA/DPBS中に懸濁し、ECD標識マウス抗ヒトCD3抗体及びPC7標識マウス抗ヒトCD56抗体(全てベックマンコールター社製)を添加した。同様に、各細胞集団の一部には、ネガティブコントロールとしてFITC標識マウスIgG1/RD1標識マウスIgG1/PC5標識マウスIgG1(ベックマンコールター社製)を添加した。各々の抗体を添加した後で、4℃で30分インキュベートし、その後、細胞を0.1%BSA/DPBSで洗浄した。細胞内サイトカイン測定のために、IntraPrep(ベックマンコールター社製)を使用した。細胞の固定化及び膜透過処理を目的としてIntraPrepReagentを使用した後、FITC標識マウス抗ヒトTNF−α抗体(BD Biosciences社製)及びPE標識マウス抗ヒトIFN−γ抗体(ベックマンコールター社製)を添加した。各々の抗体を添加した後で、室温で15分インキュベートした。インキュベーション後のプレートを250×g、5分遠心し、上清を除去後、0.1%BSA/DPBSで懸濁した。これらの細胞をフローサイトメトリーに供し、CD3陰性及びCD56陽性細胞群をNK細胞として、NK細胞中のCD107a、TNF−α及びIFN−γ陽性率を算出して、マルチファンクション能の解析を行った。CD107a、TNF−α及びIFN−γのうち3つを同時に発現する細胞を+++、うち2つを発現する細胞を++、うち1つを発現する細胞を+、いずれも発現しない細胞を−として、マルチファンクション性を解析した。結果を表38に示す。
すなわち、当該培養法で培養したNK細胞は高い多機能性を有し、その機能は腫瘍細胞と混合した際さらに高くなることが明らかとなり、機能性の高いNK細胞であることが示された。
(1)抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチンの固定化プレートの作製
実施例18−(1)と同様の方法で抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチン固定化プレートを作製した。
実施例3−(2)と同様の方法で、RN−Tの拡大培養を行った。
実施例23−(2)で調製したRN−Tを、2×106cells/mLとなるように5HRPMIを用いて懸濁した。15mLコニカルチューブ(コーニング社製)に調製した細胞液5mLを移し、マイトマイシンC(製剤名:マイトマイシン協和S、協和発酵キリン社製)を終濃度10又は20μg/mLとなるように添加し、37℃で0.5又は1.0時間インキュベーションした。反応後、440×g、室温で5分間遠心した。遠心後、上清を除去し、5HRPMIを用いて同様に2回洗浄を行った後、0.8%HCellGroを用いて2×106cells/mLとなるように調整した。
実施例21−(4)と同様の方法で、NK細胞の拡大培養を行った。ただし、温熱処理細胞の代わりにマイトマイシンC処理細胞条件群を設定した。また、対照群はOK−432のみ添加した。実施例21−(4)における3日目の操作を当該実施例では1日目に行い、培養を18日目まで継続した。培養開始後18日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。さらに、実施例1−(4)と同様の方法で、NK細胞含有比率を解析した。結果を表39に示す。
すなわち、NK細胞培養時にOK−432及びマイトマイシンC処理RN−T細胞を組み合わせることで、高い拡大培養率で高純度のNK細胞が得られることが明らかとなった。
(1)抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチンの固定化プレートの作製
実施例18−(1)と同様の方法で、抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチン固定化プレートを作製した。また、抗ヒトCD3抗体のみを固定化するプレートも作製した。
実施例3−(2)と同様の方法で、RN−Tの拡大培養を行った。また、同様に、実施例24−(1)で作製した抗ヒトCD3抗体のみを固定化したプレートを用いて、抗CD3抗体刺激により拡大培養したT細胞(以下OKT3−Tと記載)も調製した。
実施例18−(3)と同様の方法で、RN−T AICの調製を行った。この際、実施例24−(2)で調製したOKT3−Tを用いて、AICを同様に調製した(以下、OKT3−T AICと記載する)。
実施例23−(4)と同様の方法で、NK細胞の拡大培養を行った。ただし、実施例24−(3)で調製したRN−T AIC、OKT3−T AIC、又は実施例1−(2)と同様の方法で調製したPBMC AICを初日に添加する群も設定した。また、培養7日目にもRN−T AIC、OKT3−T AIC又はPBMC AICを1×106cells/フラスコずつ添加した。また、OK−432のみを添加したものを対照群とした。培養開始後18日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。さらに、実施例1−(4)と同様の方法で、NK細胞含有比率を解析した。結果を表40に示す。
すなわち、NK細胞培養時に用いるAICをOKT3−T又はRN−Tにすることによって、高い拡大培養率で高純度のNK細胞が得られることが明らかとなった。
また、AICを調製するためにPBMCを使用することはその分血液を多量に必要とするが、少量の血液から拡大培養したOKT3−T又はRN−Tを使用することで、患者本人への肉体的負担を低減しながら、より純度の高い高機能NK細胞を大量に得ることができる。よって、当該発明により、より肉体的負担の少ないNK拡大培養技術が利用可能となる。
(1)抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチンの固定化プレートの作製
実施例24−(1)と同様の方法で、抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチン固定化プレート、ならびに抗ヒトCD3抗体のみを固定化するプレートを作製した。
実施例24−(2)と同様の方法で、RN−T及びOKT3−Tの拡大培養を行った。
実施例16−(3)と同様の方法で、温熱処理細胞の調製を行った。この際、実施例25−(2)で調製したOKT3−Tを用いて同様に温熱処理細胞を調製した(以下、温熱処理OKT3−T細胞と記載する)。
実施例24−(4)と同様の方法で、NK細胞の拡大培養を行った。ただし、実施例25−(3)で調製した温熱処理RN−T細胞及び温熱処理OKT3−T細胞を使用するか、または対照群としてOK432のみ添加する群も設定した。培養開始後18日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。さらに、実施例9−(6)と同様の方法で、NK細胞含有比率及びCD16陽性CD56陽性細胞含有比率を解析した。結果を表41に示す。
すなわち、NK細胞培養時に用いる温熱細胞をRN−Tにすることによって、より高い拡大培養率で高純度、高機能のNK細胞が得られることが明らかとなった。
(1)マウスと群構成
NOD/scidマウス(日本クレア社製)7週齢、雌16匹を、以下の表42に示す群構成とした。ヒトNK細胞投与群はB−D群である。なお、各群はN=4とした。
抗アシアロGM1抗体処理は、NOD/scidマウスにおいてマウスNK細胞を除去し、ヒト細胞の生着を高めることが知られている。A549の接種前日及びヒトNK細胞1回目投与前日に、抗アシアロGM1抗体溶液(和光純薬社製)20μLを0.4%HSA含有生理食塩水(大塚製薬社製)0.38mLで希釈し、全量をマウスの腹腔内に投与した。
NOD/scidマウスの全群にX線照射(3Gy)し、麻酔下で右鼠蹊部を9平方センチメントール程剃毛し、RPMI1640培地に5×107cells/mLとなるように調製したA549を0.1mL皮下接種した。
実施例14−(3)と同様の方法で、ヒトNK細胞の拡大培養を行った。ただし、培養16日目に、終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加し、18日目に、CultiLife Eva内の細胞液338mLを0.2%HSA/GT−T503を用いて総液量を675mLとした後、終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加し、CultiLife Evaに移し替えた。培養は、21日目まで継続した。
腫瘍接種7日後、9日後及び12日後の計3回、以下の処置を行った。
A群には、4%HSA含有生理食塩水を0.3mL尾静脈投与した。B群には、4%HSA含有生理食塩水にて3.33×107cells/mLに調製したヒトNK細胞を0.3mL尾静脈投与した。C群には、実施例(15)−2と同様の方法でIFNα処理を行ったヒトNK細胞を4%HSA含有生理食塩水にて3.33×107cells/mLに調製し、0.3mL尾静脈投与した。D群には、4%HSA含有生理食塩水にて1.00×108cells/mLに調製したヒトNK細胞を0.1mL腫瘍内投与した。
各個体における腫瘍体積を腫瘍接種後42日目に、電子ノギスを用いて測定した。その結果を表43に示す。
腫瘍体積を、以下の式(3):
以上の結果により、当該培養法で培養したヒトNK細胞投与による治療が極めて有効であることが確認された。
(1)マウスと群構成
NOD/scidマウス7週齢、雌20匹を、以下の表45に示す群構成とした。ヒトNK細胞投与群はB−E群である。なお、各群はN=4とした。
A549接種前日に、抗アシアロGM1抗体溶液20μLを0.4%HSA含有生理食塩水0.38mLで希釈し、全量をマウスの腹腔内に投与した。
NOD/scidマウスの全群にX線照射(3Gy)し、RPMI1640培地に6.6×106cells/mLとなるように調製したA549を0.3mL尾静脈投与した。
実施例26−(4)と同様の方法で、NK細胞の拡大培養を行った。ただし、培養21日目に、CultiLife Eva内の細胞液338mLを0.2%HSA/GT−T503を用いて総液量を675mLとした後、終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した。培養は23日目まで継続した。
培養開始18日目、21日目及び23日目の細胞を、実施例15−(2)と同様の方法でIFNαで処理した群を作製した(IFN−α処理NK細胞)。ただし、GT−T503で5×107cells/mLとなるよう調製した細胞液を用いてIFNα処理をした。同様に、IL−2を終濃度1000U/mLとなるように添加するか(IL−2処理NK細胞)又はIFN−αとIL−2をそれぞれ終濃度1000U/mLとなるように添加(IFNα+IL−2処理NK細胞)する条件を設定し、それぞれ37℃、5%CO2インキュベーター内で1時間静置した。その他に、37℃、5%CO2インキュベーター内で1時間静置のみの条件を設定した。
ヒトNK細胞及び各処理ヒトNK細胞を、4%HSA含有生理食塩水を用いて3.33×107cells/mLに調製した。
腫瘍投与したのち、3日後、6日後及び8日後の計3回、以下の処置を行った。
A群には、4%HSA含有生理食塩水を0.3mL尾静脈投与した。B群にはヒトNK細胞を、C群にはIFNα処理ヒトNK細胞を、D群にはIL−2処理ヒトNK細胞を、E群にはIFNα+IL−2処理ヒトNK細胞を、それぞれ0.3mL尾静脈投与した。
各個体における腫瘍投与後31日目の肝重量を測定した。その結果を表46に示す。
(1)抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチン固定化プレートの作製
実施例18−(1)と同様の方法で、抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチン固定化プレートを作製した。
実施例3−(2)と同様の方法で、RN−Tの拡大培養を行った。
実施例18−(3)と同様の方法でRN−T AICを調製した。
実施例1−(1)と同様の方法でPBMCの分離を行い、凍結保存を実施せずにNK細胞拡大培養に使用した。分離したPBMCを0.8HCellGroで2×106cellsとなるように調製し、0.25mLずつ48穴細胞培養プレート(コーニング社製)に添加した。実施例28−(3)で調製したRN−T AICを0.25mLずつ添加し、OK−432を終濃度0.05KE/mL、IL−2を終濃度200U/mLとなるように添加し、培養を開始した。
培養開始2日目に、プレートの各ウェルに0.8HCellGroを0.5mLずつ添加し、終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した。4日目に、各ウェルに終濃度200U/mLとなるようにIL−2を添加した。7日目には、各ウェルの細胞液を0.8HCellGroを用いて6倍希釈し、新しい24穴細胞培養プレートに希釈した細胞液1.596mLを移した。11日目に、各ウェルの細胞液を0.8HGT−T502を用いて5倍希釈し、新しい24穴細胞培養プレートに希釈した細胞液1.330mLを移した。14日目には、0.3HGT−T502を用いて3倍希釈し、新しい24穴細胞培養プレートに希釈した細胞液2.0mLを移し、18日目まで培養を継続した。当該実施例において、以下、本法をA法と記載する。
(参考文献 Aliciら、BLOOD、2008年、第111巻、第3155−3162頁、及び米国公開第2003/0068306号公報)
実施例1−(1)と同様の方法でPBMCの分離を行い、凍結保存を実施せずにNK細胞拡大培養に使用した。分離したPBMCを、5HCellGroで0.5×106cells/mLとなるように調整し、1mLずつ48穴細胞培養プレートに添加した。OKT−3を終濃度10ng/mL、IL−2を終濃度500U/mLとなるように添加し、培養を開始した。
培養5日目に細胞を500×gで5分間遠心分離した後、上清を捨て、2mLの5HCellGroで懸濁した。全量を新しい24穴細胞培養プレートに添加後、IL−2を終濃度500U/mLとなるように添加した。培養7日目、9日目、11日目、13日目及び15日目に細胞液1mLを新しい24穴細胞培養プレートに移し、1mLの5HCellGroを添加した後、IL−2を終濃度500U/mLとなるように添加した。18日目まで培養を継続した。当該実施例において、以下、本法をB法と記載する。
実施例28−(4)及び実施例28−(5)のNK細胞集団の拡大培養において、実施例14−(4)と同様の方法で、T細胞含有比率、NK細胞含有比率、CD16陽性CD56陽性細胞含有比率及びNKG2D陽性CD56陽性細胞含有比率を解析した。結果を表47に示す。
実施例28−(4)及び実施例28−(5)で調製した培養開始後18日目の細胞について、実施例14−(5)と同様の方法で、細胞傷害活性を測定した。結果を表48に示す。
すなわち本発明の方法により拡大培養されたNK細胞集団は、他の培養法と比較して、CD3陰性CD56陽性細胞の純度が高く、高い比率でCD16及びNKG2Dを発現しており、高い細胞傷害性を有する高機能性NK細胞集団であることが明らかとなった。
(1)抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチン固定化プレートの作製
実施例18−(1)と同様の方法で抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチン固定化プレートを作製した。
実施例3−(2)と同様の方法で、RN−Tの拡大培養を行った。
実施例18−(3)と同様の方法で、RN−T AICを調製した。
実施例1−(1)と同様の方法でPBMCの分離を行い、凍結保存を実施せずにCD3陰性CD56陽性細胞の純化に使用した。5×107個の細胞を0.4mLの0.5%BSA及び2mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA、ナカライテスク社製)を添加したDPBS(以下セレクションバッファーと記載)に懸濁し、0.1mLのCD3マイクロビーズ(ミルテニーバイオテク社製)を添加し、4℃で15分間インキュベートした。セレクションバッファーを5mL添加し、300×gで10分間遠心分離した後、上清を除き、0.5mLのセレクションバッファーに懸濁した。あらかじめ磁場に固定し、3mLのセレクションバッファーを通したLSカラム(ミルテニーバイオテク社製)に細胞懸濁液を通し、3mLのセレクションバッファーでカラムを3回洗浄することで、カラムへの非結合画分を回収し、3.5×107個のCD3陰性細胞を得た。
実施例29−(4)で純化したCD3陰性CD56陽性細胞を0.8HCellGroで2×106cellsとなるように調製し、0.25mLずつ48穴細胞培養プレートに添加した。AICは添加又は非添加条件で実施し、添加条件では実施例29−(3)で調製したRN−T AICを0.25mLずつ添加し、非添加条件では0.8HCellGroを0.25mLずつ添加した。OK−432を終濃度0.05KE/mL、IL−2を終濃度200U/mLとなるように添加し、培養を開始した。
培養開始2日目以降、培養を実施例28−(4)と同様に実施した。当該実施例において、以下、本法をA’法と記載する。
(参考文献Koehlら、BLOOD Cells,Molecules,and Diseases、2004年、第33巻、第261−266頁)
実施例29−(4)で純化したCD3陰性CD56陽性細胞を、10%ヒトAB型血清を含むX−VIVO 10培地(以下10HX−VIVOと記載)で1×106cells/mLとなるように調製し、0.5mLずつ48穴細胞培養プレートに添加した。IL−2を終濃度1000U/mLとなるように添加し、培養を開始した。
培養3日目に0.5mLの10HX−VIVOを添加し、IL−2を終濃度1000U/mLとなるように添加した。培養6日目に細胞液全量を新しい24穴細胞培養プレートに移した後、1mLの10HX−VIVOを添加し、IL−2を終濃度1000U/mLとなるように添加した。9日目、12日目及び15日目に培養上清1mLを除去し、1mLの10HX−VIVOを添加した後、IL−2を終濃度1000U/mLとなるように添加した。18日目まで培養を継続した。当該実施例において、以下、本法をC法と記載する。
実施例29−(5)及び実施例29−(6)のNK細胞集団の拡大培養において、培養開始後18日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。また、実施例14−(4)と同様の方法で、T細胞含有比率、NK細胞含有比率、CD16陽性CD56陽性細胞含有比率及びNKG2D陽性CD56陽性細胞含有比率を解析した。結果を表49に示す。
実施例29−(5)及び実施例29−(6)で調製した培養開始後18日目の細胞について、実施例1−(5)と同様の方法で、細胞傷害活性を測定した。ただし、標的細胞としてA549を使用し、E/T比10、3、1及び0.3について測定を行った。細胞傷害活性測定の結果を表50に示す。
すなわち、本発明によるNK細胞拡大培養では、培養開始細胞として純化した末梢血CD3陰性CD56陽性細胞を用いた場合においても、他の培養法と比較して顕著に高い拡大培養率を示し、高い細胞傷害性を有するNK細胞を高純度で培養できることが明らかとなった。
(1)抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチンの固定化プレートの作製
実施例18−(1)と同様の方法で、抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチン固定化プレートを作製した。
実施例3−(2)と同様の方法で、RN−Tの拡大培養を行った。
実施例18−(3)と同様の方法で、RN−T AICを調製した。
実施例29−(4)と同様の方法で、CD3陰性CD56陽性細胞を純化した。
NK細胞集団の拡大培養を、PBMC又は純化したCD3陰性CD56陽性細胞を用いて実施した。PBMCを用いた拡大培養は、実施例28−(4)と同様の方法によって実施した。また、純化したCD3陰性CD56陽性細胞を用いた拡大培養は、実施例29−(5)と同様に実施した。ただし、AIC添加条件のみ実施した。
実施例30−(5)のNK細胞集団の拡大培養において、培養開始後18日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表51に示す。
実施例14−(4)と同様の方法で、実施例30−(4)の純化した末梢血CD3陰性CD56陽性細胞及び実施例30−(5)の培養後の細胞にて、T細胞含有比率、NK細胞含有比率及びCD16陽性CD56陽性細胞含有比率を解析した。結果を表52に示す。
実施例30−(4)の純化した末梢血CD3陰性CD56陽性細胞及び実施例30−(5)の培養後細胞にて、実施例14−(5)と同様の方法で細胞傷害活性を測定した。結果を表53に示す。
すなわち本発明は、末梢血CD3陰性CD56陽性細胞の機能性を高める効果のある培養法であることが明らかとなった。
(1)抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチン固定化プレートの作製
実施例18−(1)と同様の方法で、抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチン固定化プレートを作製した。
実施例12−(2)と同様の方法で、RN−Tの拡大培養を行った。ただし、培養期間は15日間とした。
実施例31−(2)で調製したRN−Tを用いて、実施例5−(3)と同様の方法でAICを調製した。ただし、培養開始8日目のRN−Tを用いて調製したRN−T AICを2×106cells/mLとなるように、培養開始15日目のRN−Tを用いて調製したRN−T AICは1×106cells/mLとなるように、それぞれ0.8HCellGroに懸濁した。
実施例17−(1)と同様の方法でNK細胞の拡大培養を行った。ただし、培養7日目には、各ウェルの細胞液1.4mLを新しいT25細胞培養フラスコに移し、0.8HCellGroを用いて6倍希釈した。同様の継代操作を11日目及び14日目に実施し、16日目まで培養を継続した。培養11日目及び14日目の細胞液の希釈は、それぞれ0.8HGT−T502による5倍希釈、0.3HGT−T502による3倍希釈とした。培養開始7日目に実施例31−(3)で調製した2種のRN−T AICをそれぞれ2.5×106cells/フラスコずつ添加した。培養開始後16日目まで培養を継続した。当該実施例及び実施例32において、以下、本法をA’’法と記載する。
T25細胞培養フラスコに終濃度1μg/mLのLEAF purified anti−human CD16(BioLegend社製;以下、抗ヒトCD16抗体と記載する)を含むDPBSを0.57mL/フラスコずつ添加して、必要本数のフラスコを作製し、5%CO2存在下、37℃で一晩インキュベートした。なお、抗ヒトCD16抗体固定化フラスコは、使用直前にDPBSで2回洗浄した。
(参考文献 特許公開第2007−297291号公報、特許第4275680号公報)
実施例1−(1)と同様の方法で調製したPBMCを、1×106cells/mLとなるように5%ヒトAB型血清を含むAIM V Medium(インビトロジェン社製、以下5HAIM Vと記載)で懸濁後、実施例31−(5)で作製した抗ヒトCD16抗体固定化フラスコに1.7mL/フラスコずつ添加した。各フラスコにOK−432を終濃度0.01KE/mL、IL−2を終濃度700U/mLとなるように添加し、これらのフラスコを5%CO2存在下、39℃で培養を開始した(培養0日目)。ただし、1日目以降、これらのフラスコを5%CO2存在下、37℃で培養した。4日目に、各フラスコの細胞液を全量回収し、320×g、室温で遠心した後、上清を除去した。各フラスコより回収した細胞をそれぞれ1×106cells/mLとなるように5HAIM Vで懸濁後、新しいT25細胞培養フラスコに全量添加した。6日目に、各フラスコの細胞液を0.1×106cells/mL、計1.3mL/フラスコとなるように5HAIM Vを用いて希釈し、新しいT25細胞培養フラスコに添加した。11日目に、各フラスコへ5HAIM Vを2.6mL添加し、計3.9mL/フラスコとした。上記培養4日目、6日目及び11日目に加え、14日目には各フラスコヘIL−2を終濃度700U/mLとなるように添加し、16日目まで培養を継続した。当該実施例において、以下、本法をD法と記載する。
24穴細胞培養プレートに終濃度0.1μg/mLの抗ヒトCD3抗体及び終濃度20μg/mLのRAT ANTI HUMAN CD52(AbD Serotec社製;以下、抗ヒトCD52抗体と記載する)を含むDPBSを0.5mL/ウェルずつ添加して必要ウェル数を作製し、4℃で一晩静置した。なお、抗ヒトCD52抗体/抗ヒトCD3抗体固定化プレートは、使用直前にDPBSで2回洗浄した。
(参考文献 特許公開第2006−340698号公報)
実施例1−(1)と同様の方法で調製したPBMCを1×106cells/mLとなるようにKBM540(コージンバイオ社製)で懸濁後、実施例31−(7)で作製した抗ヒトCD52抗体/抗ヒトCD3抗体固定化プレートに、1mL/ウェルずつ添加した。3日目に、各フラスコへKBM540を1mLずつ添加し、計2mL/フラスコとした。5日目に、各フラスコの細胞液1mLを新しい6穴細胞培養プレート(ベクトン ディッキンソン社製又はコーニング社製)に移し、KBM540を用いて11倍希釈した。同様の継代操作を9日目及び14日目に実施し、それぞれの細胞液の希釈はKBM540による2倍希釈とした。上記培養3日目、5日目、9日目及び14日目に加え、7日目及び11日目には各ウェルヘIL−2を終濃度200U/mLとなるように添加し、16日目まで培養を継続した。当該実施例において、以下、本法をE法と記載する。
実施例31−(4)、実施例31−(6)及び実施例31−(8)のNK細胞集団の拡大培養において、培養開始後16日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表54に示す。
実施例31−(4)、実施例31−(6)及び実施例31−(8)で調製した培養開始後16日目の細胞について、実施例14−(4)と同様の方法で、CD3陽性CD56陰性細胞(T細胞)、CD3陰性CD56陽性細胞(NK細胞)、CD16陽性CD56陽性細胞含有比率及びCD56陽性NKG2D陽性細胞含有比率を解析した。ただし、この際、FITC標識マウス抗ヒトCD69抗体(eBioscience社製)、及びFITC標識マウス抗ヒトCXCR3抗体(R&D Systems社製)を用いて、CD69陽性CD56陽性細胞含有比率及びCXCR3陽性CD56陽性細胞含有比率を解析した。結果を表55に示す。
実施例31−(4)、実施例31−(6)及び実施例31−(8)で調製した培養開始後16日目の細胞について、実施例14−(5)と同様の方法で、細胞傷害活性を測定した。細胞傷害活性測定の結果を表56に示す。
すなわち、本発明A’’法は、既知のNK細胞培養方法であるD法及びE法と比較して、CD3陰性CD56陽性CD16陽性の表現型を示し、より高い細胞傷害性を有する細胞集団を純度良く得ることが可能な培養方法であることが明らかとなった。
(1)抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチン固定化プレートの作製
実施例18−(1)と同様の方法で、抗ヒトCD3抗体及びレトロネクチン固定化プレートを作製した。
実施例31−(2)と同様の方法で、RN−Tの拡大培養を行った。
実施例31−(3)同様の方法で、AICを調製した。
実施例31−(4)と同様の方法で、NK細胞の拡大培養を行った(A’’法)。
12穴細胞培養プレートに終濃度1μg/mLの抗ヒトCD16抗体を含むDPBSを0.217mL/ウェルずつ添加して、必要ウェル数を作製し、5%CO2存在下、37℃で一晩インキュベートした。なお、抗ヒトCD16抗体固定化プレートは、使用直前にDPBSで2回洗浄した。
(参考文献 特許公開第2007−297291号公報、特許第4275680号公報)
実施例1−(1)と同様の方法で調製したPBMCを1×106cells/mLとなるように0.8HCellGroで懸濁後、実施例32−(5)で作製した抗ヒトCD16抗体固定化プレートに、1.9mL/ウェルずつ添加した。各ウェルにOK−432を終濃度0.05KE/mL、IL−2を終濃度200U/mLとなるように添加し、5%CO2存在下、39℃で培養を開始した(培養0日目)。ただし、1日目以降、5%CO2存在下37℃で培養した。2日目に、各ウェルへ0.8HCellGroを1.9mLずつ添加し、計3.8mL/ウェルとした。4日目に、各ウェルの細胞液を全量回収し、320×g、室温で遠心した後、上清を除去した。各ウェルより回収した細胞を3.8mLの0.8HCellGroで懸濁後、新しい12穴細胞培養プレートに全量添加した。7日目に、各フラスコの細胞液1.4mLを0.8HCellGroで6倍希釈し、新しいT25細胞培養フラスコに添加した。上記培養2日目、4日目及び7日目に加え、11日目及び14日目に各フラスコヘIL−2を終濃度200U/mLとなるように添加し、16日目まで培養を継続した。当該実施例において、以下、本法をD’法と記載する。
24穴細胞培養プレートに、終濃度0.1μg/mLの抗ヒトCD3抗体及び終濃度20μg/mLの抗ヒトCD52抗体を含むDPBSを0.95mL/ウェルずつ添加して必要ウェル数を作製し、4℃で一晩静置した。なお、抗ヒトCD52抗体/抗ヒトCD3抗体固定化プレートは、使用直前にDPBSで2回洗浄した。
(参考文献 特許公開第2006−340698号公報)
実施例1−(1)と同様の方法で調製したPBMCを1×106cells/mLとなるように0.8HCellGroで懸濁後、実施例32−(7)で作製した抗ヒトCD52抗体/抗ヒトCD3抗体固定化プレートに、1.9mL/ウェルずつ添加した。3日目に、各ウェルへ0.8HCellGroを1.9mLずつ添加し、計3.8mL/ウェルとした。5日目に、各フラスコの細胞液1.4mLを0.8HCellGroで6倍希釈し、新しいT25細胞培養フラスコに添加した。同様の継代操作を9日目、11日目及び14日目に実施し、16日目まで培養を継続した。培養9日目、11日目及び14日目の細胞液の希釈は、それぞれ0.8HCellGroによる2倍希釈、0.8HGT−T502による5倍希釈、及び0.3HGT−T502による3倍希釈とした。上記培養3日目、5日目、9日目、11日目及び14日目に加え、7日目に各フラスコヘIL−2を終濃度200U/mLとなるように添加し、16日目まで培養を継続した。当該実施例において、以下、本法をE’法と記載する。
実施例32−(4)、実施例32−(6)及び実施例32−(8)で調製した培養開始後16日目の細胞について、実施例31−(10)と同様の方法で、CD3陽性CD56陰性細胞(T細胞)、CD3陰性CD56陽性細胞(NK細胞)、CD16陽性CD56陽性細胞含有比率、CD56陽性NKG2D陽性細胞含有比率、CD69陽性CD56陽性細胞含有比率及びCXCR3陽性CD56陽性細胞含有比率を解析した。結果を表57に示す。
実施例32−(4)、実施例32−(6)及び実施例32−(8)で調製した培養開始後16日目の細胞について、実施例14−(5)と同様の方法で、細胞傷害活性を測定した。ただし、E/T比3、1及び0.3について測定を行った。細胞傷害活性測定の結果を表58に示す。
すなわち、本発明であるA’’法は、既知のNK細胞培養方法であるD’法及びE’法と比較して、CD3陰性CD56陽性CD16陽性の表現型を示し、より高い細胞傷害性を有する細胞集団を純度良く得ることが可能な培養方法であることが明らかとなった。よって、本発明の培養方法(NK細胞刺激方法)は、同じ培養用培地条件下においても、既知のNK細胞培養方法(NK細胞刺激方法)よりも極めて優れた発明であり、高い治療効果が期待できる免疫療法を提供することができることが示唆された。
Claims (6)
- ナチュラルキラー細胞及び/又はナチュラルキラー細胞に分化し得る細胞を含有する細胞集団を、細菌由来製剤及び人為的に拡大培養された細胞に増殖能を奪う処理を施した細胞の存在下で拡大培養する工程を包含することを特徴とする、ナチュラルキラー細胞を含有する細胞集団の製造方法であって、細菌由来製剤が、BCG、Streptcoccus pyogenes、Corynebacterium parvum及びこれらの細胞壁骨格からなる群より選択される、方法。
- 細菌由来製剤が、OK−432である、請求項1記載の方法。
- 人為的に拡大培養された細胞に増殖能を奪う処理を施した細胞が、末梢血単核球細胞、T細胞、T細胞サブセット及びB細胞からなる群より選択される細胞である、請求項1または2記載の方法。
- 人為的に拡大培養された細胞に増殖能を奪う処理を施した細胞が、ナチュラルキラー細胞又はナチュラルキラー細胞に分化し得る細胞と同一の個体に由来する細胞である、請求項1〜3いずれか1項に記載の方法。
- 人為的に拡大培養された細胞に増殖能を奪う処理を施した細胞の存在下で拡大培養する工程において、当該細胞を添加することを複数回実施することを特徴とする、請求項1〜4いずれか1項に記載の方法。
- ナチュラルキラー細胞及び/又はナチュラルキラー細胞に分化し得る細胞として末梢血単核球細胞が使用される、請求項1〜5いずれか1項に記載の方法。
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