BR112019012947A2 - moléculas de ácido nucleico, dna, plantas, produto de soja, métodos para produção de um produto de soja, para proteção de plantas, para produção de uma planta, para identificação, pares de iniciadores, para confirmação da pureza de sementes, para determinação do estado de zigosidade, para redução da perda de rendimento e para aumento do rendimento de plantas, processo para controle de ervas daninhas, uso, sondas, estojo e método de detecção da presença do evento de elite - Google Patents
moléculas de ácido nucleico, dna, plantas, produto de soja, métodos para produção de um produto de soja, para proteção de plantas, para produção de uma planta, para identificação, pares de iniciadores, para confirmação da pureza de sementes, para determinação do estado de zigosidade, para redução da perda de rendimento e para aumento do rendimento de plantas, processo para controle de ervas daninhas, uso, sondas, estojo e método de detecção da presença do evento de elite Download PDFInfo
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Abstract
a invenção proporciona plantas, material de planta e sementes de soja transgênicos específicos, caracterizados pelo fato de que estes produtos abrigam um evento de transformação específico de resistência a nematódeos e tolerância a herbicidas em uma localização específica no genoma da soja. são também proporcionadas ferramentas que permitem a identificação rápida e inequívoca do evento em amostras biológicas.
Description
“MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO, DNA, PLANTAS, PRODUTO DE SOJA, MÉTODOS PARA PRODUÇÃO DE UM PRODUTO DE SOJA, PARA PROTEÇÃO DE PLANTAS, PARA PRODUÇÃO DE UMA PLANTA, PARA IDENTIFICAÇÃO, PARES DE INICIADORES, PARA CONFIRMAÇÃO DA PUREZA DE SEMENTES, PARA DETERMINAÇÃO DO ESTADO DE ZIGOSIDADE, PARA REDUÇÃO DA PERDA DE RENDIMENTO E PARA AUMENTO DO RENDIMENTO DE PLANTAS, PROCESSO PARA CONTROLE DE ERVAS DANINHAS, USO, SONDAS, ESTOJO E MÉTODO DE DETECÇÃO DA PRESENÇA DO EVENTO DE ELITE”
Referência Cruzada com Pedidos Relacionados [0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório dos E.U.A. No. de Série 62/437,862, depositado a 22 de dezembro, 2016, Pedido Provisório dos E.U.A. No. de Série 62/481,284, depositado a 4 de abril, 2017 e Pedido Provisório dos E.U.A. No. de Série 62/487,707, depositado a 20 de abril, 2017, os conteúdos dos quais são aqui incorporados por referência na sua totalidade.
Área da Invenção [0002] Esta invenção se relaciona com novos ácidos nucleicos e plantas, material de planta e sementes de soja transgênicos, caracterizados pelo fato de que abrigam um evento de transformação específico, particularmente pela presença de genes conferindo resistência a nematódeos e tolerância a herbicidas, em uma localização específica no genoma da soja. As plantas de soja da invenção combinam o fenótipo de resistência a nematódeos e tolerância a herbicidas com um desempenho agronômico, estabilidade genética e funcionalidade em diferentes fundos genéticos equivalentes ao fundo genético de soja não transformado correspondente na ausência de herbicida(s) inibidor(es) de HPPD ou infestação por nematódeos. Esta invenção proporciona adicionalmente métodos e estojos para identificação da presença de material de
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2/149 planta compreendendo especificamente evento de transformação EE-GM4 em amostras biológicas.
Antecedentes da Invenção [0003] A expressão fenotípica de um transgene em uma planta é determinada tanto pela estrutura do gene ou genes por si próprios e pela sua localização no genoma de planta. Ao mesmo tempo, a presença do transgene ou “T-DNA inserido” em diferentes localizações no genoma influenciará o fenótipo global da planta em diferentes modos. A introdução agronomicamente ou industrialmente bem-sucedida de um traço comercialmente interessante em uma planta por manipulação genética pode ser um procedimento moroso dependente de diferentes fatores. A transformação e regeneração reais de plantas geneticamente transformadas são somente os primeiros em uma série de passos de seleção, que incluem caracterização genética extensiva, introgressão e avaliação em ensaios de campo, levando eventualmente à seleção de um evento de elite.
[0004] A identificação inequívoca de um evento de elite se está tornando crescentemente importante tendo em vista a discussão sobre Novo Alimento/Ração, segregação de produtos GMO e não GMO e a identificação de material protegido. Idealmente, tal método de identificação é tanto rápido como simples, sem a necessidade de um cenário laboratorial extensivo. Além do mais, o método deve proporcionar resultados que permitam determinação inequívoca do evento de elite sem interpretação por especialistas, mas que permanecem após escrutínio por especialistas se necessário. Ferramentas específicas para uso na identificação do evento de elite EE-GM4 em amostras biológicas são descritas aqui.
[0005] Em esta invenção, EE-GM4 foi identificado como um evento de elite a partir de uma população de plantas de soja transgênicas no desenvolvimento de soja resistente a nematódeos (Glycine max)
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3/149 compreendendo um gene codificando tolerância a inibidores de 4-hidróxi fenilpiruvato dioxigenase (HPPD) combinado com um gene conferindo resistência a nematódeos, cada um sob controle de um promotor expressível em plantas.
[0006] O plantio de variedades de EE-GM4 de soja resistentes aos nematódeos e tolerantes a herbicidas proporciona aos produtores novas opções para controle de nematódeos e ervas daninhas, usando herbicidas inibidores de HPPD, tais como herbicida isoxaflutol (IFT), topramezona ou mesotriona (MST). Os herbicidas inibidores de HPPD oferecem uma opção alternativa de controle de ervas daninhas para o produtor de soja para ajudar a gerir espécies problemáticas de ervas daninhas e como um modo de ação alternativo para ajudar a desacelerar a disseminação de ervas daninhas resistentes a herbicidas.
[0007] O nematódeo dos cistos da soja (SCN) Heterodera glycines (Ichinohe), um problema global para a produção de soja, é uma ameaça contínua aos produtores. Desde a sua primeira detecção nos EUA em 1954 de um condado único na Carolina do Norte, o SCN se disseminou para quase todos os estados produtores de soja nos Estados Unidos e é estimado que cause mais do que 1,2 bilhões de dólares em perdas anuais de rendimento nos EUA, o tornando o patógeno de soja mais danificante aí. O SCN foi em primeiro lugar detectado no Brasil nos 1990s iniciais e se disseminou desde aí ao longo da América do Sul e é uma dos patógenos mais importantes no Brasil causando perdas em praticamente todas as regiões de cultura do Brasil. Similarmente, o SCN continua a se disseminar ao longo de regiões produtoras de soja da China com detecção em 15 províncias e estimativas de perdas de rendimento de mais do que 120 milhões de dólares. Um estudo multianual no estado de lowa, EUA (2001 a 2015) onde quase todas as variedades de soja resistentes a SCN contêm resistência a SCN de PI 88788, descobriu que a virulência das
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4/149 populações de SCN aumentou ao longo dos anos, resultando em densidades aumentadas de populações de SCN no final das estações e rendimentos reduzidos de variedades de soja resistentes a SCN com a fonte de resistência PI88788 (Mitchum (2016), Phytopathology 106 (12): 1444-1450, Allen et al. (2017) Plant Health Progr. 18:19-27, Arias et al. (2017) www.researchgate.net/publication/266907703_RESISTANCE_TO_SOYBEAN_ CYST_NEMATODE_GENETICS_AND_BREEDING_IN_BRAZIL; McCarville et al. (2017) Plant Health Progress 18: 146-155).
[0008] O nematódeo de lesões radiculares Pratylenchus brachyurus se tern tornado um patógeno crescentemente importante de soja. Tem uma ampla gama de hospedeiros e está amplamente distribuído em regiões tropicais e subtropicais, especialmente no Brasil, África e sul dos Estados Unidos. Pratylenchus brachyurus se tem tornado uma preocupação entre produtores de algodão e soja na região de Cerrado do Brasil e é considerado o principal patógeno da soja na região. Na soja, este nematódeo pode reduzir rendimentos 30 a 50%, com maiores danos sendo observados em solos arenosos. O uso de variedades de soja resistentes seria o melhor modo para controlar este nematódeo, no entanto, variedades resistentes a P. brachyurus não foram identificadas até à data. Embora vários genótipos de soja tenham sido estudados para resistência a Pratylenchus brachyurus, e alguns cultivares identificados com tolerância aumentada, o cultivo de cultivares resistentes contra P.brachyurus é difícil devido ao fato de que este nematódeo é polifágico e não tem uma interação próxima com seus hospedeiros (Machado (2014) Current Agricultural Science and Technology 20: 26-35; Antonio et al. (2012) Soil productivity losses in area infested by the nematoid of the root lesions in Vera, MT. Em: Brazilian Congress of Soy, 6, 2012, Cuiabá. Abstracts. Londrina: Embrapa Soja, 4 pp; Rios et al. (2016) Ciência Rural 46: 580-584; Lima et al., 2017, Capítulo 6 no livro: Soybean - The Basis of Yield, Biomass and
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Productivity; Editado por Minobu Kasai, ISBN 978-953-51-3118-2, Impressão ISBN 978-953-51-3117-5, InTech; Inomoto et al. (2011) Sucessão de culturas sob pivô central para controle de fitonematoides: variação populacional, patogenicidade e estimativa de perdas. Tropical Plant Pathology 36: 178-185).
[0009] É conhecido que a proteção de plantas contra nematódeos tais como SCN pode ajudar as plantas a mais bem lidar com outros estresses tais como composição/conteúdo do solo, condições do tempo, estresse de patógenos, aplicações de herbicidas, etc.. Particularmente quanto tais outros estresses dão um fenótipo que é facilmente visto, tais como clorose/amarelecimento das folhas, o efeito do controle de SCN é mais fácil de se ver enquanto de outro modo a infestação por SCN não é frequentemente “visível” ao produtor. P.ex., quando as plantas de soja têm Síndrome da Morte Súbita (SDS) ou Clorose com Deficiência em Ferro (IDC), a proteção de SCN resultará em plantas que são mais verdes ou têm sintomas de SDS/IDC menos graves. Apesar de esforços extensivos de investigação e rastreamento de variedades, a deficiência em ferro permanece um desafio em grandes áreas de produção de soja no Centro norte dos E.U.A.. A importância deste problema tem aumentado devido à produção expandida de soja em solos suscetíveis à deficiência em ferro e a possíveis interações com mudanças de sistema de cultura. A deficiência em ferro ocorre em solos com elevado pH e carbonatos, mas a expressão de deficiência em ferro é altamente variável no espaço devido a interações com propriedades do solo espacialmente variáveis tais como conteúdo de umidade, salinidade, disponibilidade de ferro e outras concentrações de micronutrientes e metais. Adicionalmente, a expressão de deficiência em ferro interage com fatores bióticos tais como fixação de nitrogênio, pragas, doenças e com estresses induzidos pela gestão tais como aplicação de herbicidas. A seleção de variedades é o meio mais importante para gerir a deficiência em ferro, mas a seleção de variedades é complicada por um grande
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6/149 genótipo por interação ambiental relacionada com tolerância à clorose (Hansen etal. (2004) Soil Sci. Plant Nutr. 50 (7): 983-987).
[00010] A síndrome da morte súbita (SDS) da soja foi em primeiro lugar descoberta em 1971 no Arkansas e desde aí foi confirmada ao longo da maioria das áreas de cultivo da soja dos EUA. A SDS é uma doença fúngica que também ocorre em um complexo de doença com o nematódeo dos cistos da soja (SCN). A SDS está entre as doenças com origem no solo mais devastantes da soja nos EUA. Quando esta doença ocorre na presença de SCN, os sintomas ocorrem mais cedo e são mais graves. A SDS é causada por fungos com origem no solo dentro de um grupo do complexo de espécies Fusarium solani. Na América do Norte, Fusarium virguliforme, anteriormente Fusarium solani f. sp. glycines, é o agente causativo. Na América do Sul, F. brasiliense, F. cuneirostrum, F. tucumaniae e F. virguliforme causam sintomas de SDS. Embora cultivares de soja que são menos suscetíveis à SDS tenham sido desenvolvidos, nenhuns cultivares altamente resistentes estão disponíveis. O fungo pode infetar raízes de plântulas de soja imediatamente após plantio, mas acima do solo os sintomas de SDS raramente aparecem até as plantas de soja terem alcançado etapas reprodutoras. O fungo produz toxinas nas raízes que são translocadas para as folhas. Os primeiros sintomas notáveis da SDS são amarelecimento e desfolhamento de folhas superiores. Se a doença se desenvolver inicialmente na estação, as flores e vagens jovens serão abortados. Quando a doença se desenvolve mais tarde, a planta produzirá menos sementes por vagem ou sementes mais pequenas. Quando mais cedo a doença grave se desenvolver, mais o rendimento é reduzido. Como o fungo da SDS pode persistir no solo durante períodos longos, áreas maiores de um campo mostrarão sintomas da doença cada estação de cultivo até a maioria do campo ser afetada (Westphal etal. (2008). Sudden Death Syndrome of Soybean. The Plant Health Instructor. DOI: 10.1094/PH I-1-2008-0102-01,
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7/149 www.apsnet.org/edcenter/intropp/lessons/fungi/ascomycetes/Pages/SuddenDe ath.aspx).
[0011 ] Correntemente, nenhumas plantas de soja geneticamente manipuladas para resistência a nematódeos são comercializadas. Plantas de soja compreendendo um ou mais genes de tolerância a herbicidas foram divulgadas na técnica. W02006/130436 descreve um evento de soja tolerante ao glifosato compreendendo um gene epsps e WO2011/034704 descreve um evento de soja tolerante ao dicamba. WO2012/082548 descreve plantas de soja compreendendo tanto um gene hppd como pat. WO2011/063411 descreve um evento de soja com tolerância a inibidores de HPPD e glifosato, enquanto WO2011/063413 descreve plantas de soja com tolerância a inibidores de HPPD, glufosinato e glifosato. WO2011/066384 descreve um evento de soja com tolerância a 2,4-D e glufosinato, enquanto WO2012/075426 descreve um evento de soja com tolerância a 2,4-D, glufosinato e glifosato e WO2017/059795 descreve um evento de soja com tolerância ao glifosato. W02009/064652 descreve um evento de soja com resistência a insetos lepidópteros e WO2013/016527 descreve um evento de soja com resistência a insetos lepidópteros e tolerância ao glufosinato.
[0012] Genes e proteínas de HPPD que conferem tolerância melhorada a herbicidas inibidores de HPPD foram divulgados, p.ex., em WO2015138394, WO2015135881, WO2014043435, e a atividade nematicida de proteínas Cry foi descrita em, p.ex., WO2010027805, WO2010027809, WO2010027804, WO2010027799, WO2010027808 e em W02007147029.
[0013] Nenhuma das divulgações da técnica prévia ensina ou sugere um evento de elite na soja compreendendo um gene Cry ativo em nematódeos e, certamente, não um evento de elite na soja compreendendo um gene Cry ativo em nematódeos combinado com um gene conferindo tolerância a inibidores de HPPD.
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8/149 [0014] É conhecido na técnica que a obtenção de um evento de transformação de elite comercial em plantas de soja com desempenhos agronômicos aceitáveis não é por nenhum modo direta.
Sumário das Modalidades Preferenciais da Invenção [0015] Esta invenção proporciona um ácido nucleico codificando uma proteína Cry14Ab-1, tal como a sequência codificando cry14Ab-1 .bde SEQ ID No. 7 ou uma sequência codificando uma proteína Cry14Ab nematicida tendo pelo menos 95, 96, 97, 98 ou pelo menos 99% de identidade de sequências com SEQ ID No.7. É também proporcionado aqui um ácido nucleico codificando uma proteína HPPD-4, tal como a sequência codificando hppdPf-4Pa de SEQ ID No. 9 ou uma sequência tendo pelo menos 95, 96, 97, 98 ou pelo menos 99% de identidade de sequências com SEQ ID No. 9, em que a referida sequência codifica uma proteína HPPD proporcionando tolerância a herbicidas inibidores de HPPD quando expressa em uma planta. São também proporcionados aqui um gene cry14Ab- 1.b quimérico compreendendo a sequência de SEQ ID No. 11 a partir da posição de nucleotídeo 131 até à posição de nucleotídeo 5276, ou o seu complemento, ou um gene cry14Ab-1.b quimérico compreendendo a sequência de SEQ ID No. 11 a partir da posição de nucleotídeo 412 até à posição de nucleotídeo 3969 operacionalmente ligados a um promotor expressível em plantas, ou uma sequência codificando uma proteína Cry14Ab nematicida tendo pelo menos 95, 96, 97, 98 ou pelo menos 99% de identidade de sequências com a sequência de SEQ ID No. 11 a partir da posição de nucleotídeo 131 até à posição de nucleotídeo 5276, ou o seu complemento, ou com a sequência de SEQ ID No. 11 a partir da posição de nucleotídeo 412 até à posição de nucleotídeo 3969 (operacionalmente ligadas a um promotor expressível em plantas). É adicionalmente proporcionado um gene hppdPf-4Pa quimérico compreendendo a sequência de SEQ ID No. 11 a partir da posição de nucleotídeo 5382 até à posição de nucleotídeo 7621, ou o seu complemento, ou
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9/149 compreendendo a sequência de SEQ ID No. 11 a partir da posição de nucleotideo 5589 até à posição de nucleotídeo 6665 operacionalmente ligado a um promotor expressível em plantas, ou uma sequência tendo pelo menos 95, 96, 97, 98 ou pelo menos 99% de identidade de sequências com a sequência de SEQ ID No. 11 a partir da posição de nucleotídeo 5382 até à posição de nucleotídeo 7621 ou seu complemento, ou com a sequência de SEQ ID No. 11 a partir da posição de nucleotídeo 5589 até à posição de nucleotídeo 6665 (quando operacionalmente ligadas a um promotor expressível em plantas), em que a referida sequência codifica uma proteína HPPD proporcionando tolerância a herbicidas inibidores de HPPD quando expressa em uma planta, bem como um ácido nucleico compreendendo o referido cry14Ab-1.b quimérico e o referido gene hppdPf-4Pa quimérico. Estes ácidos nucleicos ou genes são úteis para transformar plantas tais como soja, algodão, milho, arroz, colza e trigo, tal que controlem nematódeos e/ou tenham tolerância a herbicidas inibidores de HPPD.
[0016] É também proporcionada aqui uma molécula de DNA quimérica compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 11 a partir da posição de nucleotídeo 131 até à posição de nucleotídeo 7941 ou uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com ela. Em uma modalidade, esta molécula de DNA codifica uma proteína tolerante a um inibidor de HPPD e uma proteína negativamente afetando nematódeos de pragas de plantas, tais como SCN, RKN ou nematódeos de Pratylenchus spp.. Em uma modalidade, esta molécula de DNA quimérica codifica a proteína de SEQ ID No. 8 ou uma proteína de controle de nematódeos pelo menos 99% idêntica a ela e a proteína de SEQ ID No. 10 ou uma proteína tolerante a inibidores de HPPD pelo menos 99% idêntica a ela. São também proporcionadas plantas, sementes ou células, tais como plantas, sementes ou células de soja, transformadas para conter uma tal molécula de DNA, e o uso de uma tal molécula
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10/149 de DNA para tornar as plantas ou sementes, tais como plantas ou sementes de soja, resistentes a nematódeos e tolerantes a herbicidas inibidores de HPPD.
[0017] A presente invenção se relaciona com uma planta de soja transgênica, sua parte de planta, semente, célula ou tecido, compreendendo, estavelmente integrado em seu genoma, um cassete de expressão que compreende um gene de resistência a nematódeos compreendendo a sequência codificante do gene cry14Ab-1.b e um gene de tolerância a herbicidas compreendendo a sequência codificante do gene hppdPf-4Pa (ambos como descrito no Exemplo 1.1 e como representado em SEQ ID No. 7 e 9, respectivamente), que proporcionam resistência a nematódeos parasitários de plantas tais como nematódeo dos cistos da soja e tolerância a um herbicida inibidora de HPPD tal como isoxaflutol, topramezona ou mesotriona. Na ausência de herbicida inibidor de HPPD e pressão de nematódeos, tal planta de soja tem um desempenho agronômico que é substancialmente equivalente à linhagem isogênica não transgênica. Quando encontram pressão de nematódeos dos cistos da soja (SCN) afetando o desempenho de plantas no campo, as plantas da invenção terão um fenótipo agronômico superior em comparação com uma planta não transgênica. Igualmente, na presença de ervas daninhas, após aplicação de um herbicida inibidor de HPPD ao qual é proporcionada tolerância, as plantas da invenção terão um fenótipo agronômico superior em comparação com plantas que não foram tratadas com herbicidas.
[0018] De acordo com a presente invenção, a planta de soja ou sua semente, células ou tecidos compreendem o evento de elite EE-GM4. Em uma modalidade, o evento de elite EE-GM4 compreende a sequência de qualquer um de SEQ ID No. 1, 3, 5 ou 24 ou a sequência de qualquer um de SEQ ID No. 2, 4, 6 ou 25. Em uma modalidade, EE-GM4 compreende a sequência de qualquer um de SEQ ID No. 1,3,5 ou 24 e a sequência de qualquer um de SEQ ID No. 2, 4, 6 ou 25 e a sequência codificando cry14Ab-1.b de SEQ
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ID No. 7 e a sequência codificando hppdPf-4Pa de SEQ ID No. 9. Em uma modalidade, o evento de elite EE-GM4 é um DNA estranho (ou T-DNA inserido) inserido em uma posição específica no genoma da soja, como está contido na semente de referência depositada na ATCC sob o número de depósito PTA123624. Em uma modalidade, tal T-DNA inserido em EE-GM4 compreende um gene codificando Cry14Ab-1 quimérico e um gene codificando HPPD-4. Em outra modalidade, o referido evento é caracterizado pela sequência de junção 5' de SEQ ID No. 1 ou 3 ou pela sequência de junção 3' de SEQ ID No. 2 ou 4; ou pela sequência de junção 5' de SEQ ID No. 1 ou 3 e pela sequência de junção 3' de SEQ ID No. 2 ou 4. Em uma modalidade, DNA genômico contendo EEGM4, quando analisado usando uma reação em cadeia da polimerase (“PCR” aqui) com dois iniciadores compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 12 e SEQ ID No. 13, respectivamente, originando um fragmento de DNA de 126 pb. Em uma modalidade, DNA genômico contendo EE-GM4, quando analisado usando PCR com dois iniciadores compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 20 e SEQ ID No. 21, respectivamente, originando um fragmento de DNA de 90 pb.
[0019] Em uma modalidade é proporcionada aqui uma planta de soja, sua célula, parte de planta, semente ou descendência, compreendendo cada uma o evento de elite EE-GM4 em seu genoma, tendo a semente de referência compreendendo o referido evento sido depositada na ATCC sob o número de depósito PTA-123624. Em uma modalidade, uma planta ou semente compreendendo EE-GM4 é obtenível por propagação de e/ou cruzamento com uma planta de soja cultivada a partir da semente depositada na ATCC sob o número de depósito PTA-123624.
[0020] Mais especificamente, a presente invenção se relaciona com uma planta de soja transgênica, sua parte de planta, pólen, semente, célula ou tecido, o DNA genômico da qual é caracterizado pelo fato de que, quando
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12/149 analisado em PCR como descrito aqui, usando pelo menos dois iniciadores dirigidos contra a região formada por uma parte da região flanqueante de T-DNA 5' ou 3' de EE-GM4 e parte do T-DNA inserido, um fragmento é amplificado que é específico do evento EE-GM4. Os iniciadores podem ser dirigidos contra a região flanqueante de T-DNA 3' dentro de SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO. 25 ou DNA genômico de planta da soja a jusante da mesma e contígua com ela e o TDNA inserido a montante da mesma e contígua com ela. Os iniciadores podem ser também dirigidos contra a região flanqueante de T-DNA 5' dentro de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO. 24 ou DNA genômico de planta da soja a montante da mesma e contígua com ela e o T-DNA inserido a jusante da mesma e contígua com ela. Em uma modalidade, tais iniciadores compreendem a ou consistem (essencialmente) na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13 ou de SEQ ID No. 20 e SEQ ID No. 21 ou de SEQ ID NO. 26 e SEQ ID NO. 28 ou de SEQ ID NO. 27 e SEQ ID NO. 29, respectivamente (p.ex., um par de iniciadores compreendendo um iniciador contendo na sua extremidade 3' extrema a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 12 e um iniciador contendo na sua extremidade 3' extrema a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 13 ou um par de iniciadores compreendendo um iniciador contendo na sua extremidade 3' extrema a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 20 e um iniciador contendo na sua extremidade 3' extrema a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 21 ou um par de iniciadores compreendendo um iniciador contendo na sua extremidade 3' extrema a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 26 e um iniciador contendo na sua extremidade 3' extrema a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 28 ou um par de iniciadores compreendendo um iniciador contendo na sua extremidade 3' extrema a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 27 e um iniciador contendo na sua extremidade 3' extrema a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 29) e originam um fragmento de DNA de entre 50 e 1000 pb, tal como um fragmento de 126 pb ou de 90 pb.
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13/149 [0021] A semente de referência compreendendo o evento de elite da invenção foi depositada na ATCC sob o número de acesso PTA-123624. Uma modalidade da invenção é o evento de elite EE-GM4 como contido na semente depositada sob o número de acesso PTA-123624, que quando introduzido em uma planta de soja proporcionará resistência a nematódeos e tolerância a herbicidas, particularmente resistência ao nematódeo dos cistos da soja (Heterodera glycines, “SON” aqui) e/ou nematódeos causadores de lesões (nematódeo causador de lesões como usado aqui se refere a nematódeos de pragas da soja de Pratylenchus spp., incluindo mas não se limitando a Pratylenchus brachyurus) e tolerância a inibidores de HPPD tais como isoxaflutol, topramezona ou mesotriona. As plantas com EE-GM4 desta invenção também controlam o nematódeo dos nódulos radiculares (nematódeo dos nódulos radiculares como usado aqui se refere a nematódeos de pragas da soja de Meloidogyne spp., incluindo mas não se limitando a Meloidogyne incognita, Meloidogyne arenaria, Meloidogyne hapla ou Meloidogyne javanica ou qualquer sua combinação), nematódeo reniforme (Rotylenchulus reniformis) e nematódeo Lança (Hoplolaimus spp. tais como H. columbus, H. galeatus e H. magnistylus). Estão incluídas em esta invenção variantes mínimas deste evento tais como um evento de soja com tolerância a inibidores de HPPD e resistência a nematódeos SCN que tem uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5% ou pelo menos 99,9% de identidade de sequências com a sequência de nucleotídeos de EEGM4 como contida na semente depositada na ATCC sob o número de depósito PTA-123624 ou um evento de soja com tolerância a inibidores de HPPD e resistência a nematódeos SCN que tem uma sequência de nucleotídeos diferindo em 1 a 200, 1 a 150, 1 a 100, 1 a 75, 1 a 50, 1 a 30, 1 a 20, 1 a 10 ou 1 a 5 nucleotídeos da sequência de nucleotídeos de EE-GM4 como contida na semente depositada do depósito de ATCC PTA-123624 ou que tem uma
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14/149 sequência de nucleotídeos diferindo em 1 a 200, 1 a 150, 1 a 100, 1 a 75, 1 a 50, 1 a 30, 1 a 20, 1 a 10 ou 1 a 5 nucleotídeos da sequência de nucleotídeos formada pelas seguintes sequências de nucleotídeos consecutivos (5' para 3'): SEQ ID No. 5 ou SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 11 a partir da posição de nucleotídeo 188 até à posição de nucleotídeo 7368 e SEQ ID No. 6 ou SEQ ID No. 25. Em uma modalidade, EE-GM4 compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5% ou pelo menos 99,9% de identidade de sequências com a sequência formada pelas seguintes sequências de nucleotídeos consecutivos (5' para 3'): SEQ ID No. 5 ou 24, SEQ ID No. 11 a partir da posição de nucleotídeo 188 até à posição de nucleotídeo 7368 e SEQ ID No. 6 ou 25. Devido a variação genética natural, diferenças de bases de DNA únicas e pequenas inserções e deleções em sequências de DNA homólogas (p.ex., polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNP)) são comumente encontradas em plantas da mesma espécie (Zhu et al. (2003) Genetics 163: 1123-1134).
[0022] A semente do número de depósito de ATCC PTA-123624 é um lote de sementes puras de sementes transgênicas homozigotas quanto ao evento de elite EE-GM4 da invenção, que cultivarão em plantas resistentes a nematódeos, por meio do que as plantas são também tolerantes a um inibidor de HPPD tal como isoxaflutol, topramezona ou mesotriona. A semente ou semente de descendência obtenível a partir da semente depositada (p.ex., após cruzamento com outras plantas de soja com um fundo genético diferente) pode ser semeada e a semente ou as plantas em cultura podem ser tratadas com um inibidor de HPPD tal como isoxaflutol, topramezona ou mesotriona como descrito aqui ou pode ser testada quanto à presença de EE-GM4 como descrito aqui para se obterem plantas compreendendo o evento de elite da invenção. A invenção se relaciona adicionalmente com células, sementes, tecidos, descendência e
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15/149 descendentes de uma planta compreendendo o evento de elite cultivadas a partir da semente depositada na ATCC tendo o número de acesso PTA-123624. A invenção se relaciona com plantas obteníveis a partir de (tal como por propagação de e/ou cruzamento com) uma planta de soja compreendendo o evento de elite da invenção (tal como uma planta cultivada a partir da semente depositada na ATCC tendo o número de acesso PTA-123624 ou uma planta compreendendo a sequência codificando hppdPf-4Pa de SEQ ID No. 9 e a sequência codificando cry14Ab-1.b de SEQ ID No. 7 localizadas entre a sequência de SEQ ID No. 1,3, 5 ou 24 e a sequência de SEQ ID No. 2, 4, 6 ou 25 ou uma planta compreendendo a sequência codificando HPPD de SEQ ID No. 9 e a sequência codificando de cry14Ab-1.b de SEQ ID No. 7 localizadas entre qualquer uma das sequências de SEQ ID No. 1,3 ou 5 e as sequências de qualquer um de SEQ ID No. 2, 4 ou 6). A invenção se relaciona também com plantas e sementes de descendência obtidas a partir das plantas ou semente acima e que compreendem a sequência de SEQ ID No. 1 e a sequência de SEQ ID No. 2 ou a sequência de SEQ ID No. 3 e a sequência de SEQ ID No. 4 ou a sequência de SEQ ID No. 5 e a sequência de SEQ ID No. 6 ou a sequência de SEQ ID No. 24 e a sequência de SEQ ID No. 25.
[0023] A invenção se relaciona adicionalmente com um método para identificação de uma planta transgênica, ou suas células ou tecidos, compreendendo o evento de elite EE-GM4, método esse que é baseado na identificação da presença de sequências de DNA caracterizantes ou aminoácidos codificados por tais sequências de DNA na planta, células ou tecidos transgênicos. De acordo com uma modalidade preferencial da invenção, tais sequências de DNA caracterizantes são sequências de 15 pb ou pelo menos 15 pb, preferencialmente 20 pb ou pelo menos 20 pb, o mais preferencialmente 30 pb ou mais que compreendem o local de inserção do evento, i.e., uma sequência contendo tanto uma parte do T-DNA inserido contendo um inibidor de
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HPPD e transgene de resistência a nematódeos como uma parte da região flanqueante de T-DNA 5' ou 3' contígua com ela que se prolonga para o genoma de planta da soja, permitindo identificação específica do evento de elite. A invenção se relaciona também com plantas, sementes e células compreendendo o evento EE-GM4 como identificado aqui.
[0024] A presente invenção se relaciona adicionalmente com métodos para identificação do evento de elite EE-GM4 em amostras biológicas, métodos esses que são baseados em iniciadores ou sondas que reconhecem especificamente a sequência flanqueante de T-DNA 5' e/ou 3' e o T-DNA inserido contíguo com ela. Quaisquer outros métodos para identificar EE-GM4, p.ex., para identificar suas sequências caracterizantes específicas, estão também incluídos aqui, tais como sequenciamento de genoma inteiro ou parcial (dirigido).
[0025] Mais especificamente, a invenção se relaciona com um método para identificação do evento de elite EE-GM4 em amostras biológicas compreendendo amplificação de uma sequência de um ácido nucleico presente nas referidas amostras biológicas, usando uma reação em cadeia da polimerase com pelo menos dois iniciadores ou uma reação em cadeia da polimerase com pelo menos dois iniciadores e uma sonda, em que um destes iniciadores reconhece a região flanqueante de T-DNA 5' ou 3' em EE-GM4, o outro iniciador reconhece uma sequência dentro do T-DNA compreendendo os genes de tolerância a herbicidas e resistência a nematódeos que é contígua com a referida região flanqueante de T-DNA 5' ou 3', preferencialmente para se obter um fragmento de DNA de 50 a 1000 pb em tamanho. Em uma modalidade, um primeiro iniciador reconhece a região flanqueante de T-DNA 5' em EE-GM4 e um segundo iniciador reconhece uma sequência dentro do T-DNA compreendendo os genes de tolerância a herbicidas e resistência a nematódeos que é contígua com a e a jusante da referida região flanqueante de T-DNA 5' ou
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17/149 um primeiro iniciador reconhece a região flanqueante de T-DNA 3' em EE-GM4 e um segundo iniciador reconhece uma sequência dentro do T-DNA compreendendo os genes de tolerância a herbicidas e resistências a nematódeos que é contígua com a e a montante da referida região flanqueante de T-DNA 3', para se obter um fragmento de DNA característico do evento de elite EE-GM4. Em uma modalidade, o referido método de reação em cadeia da polimerase compreende adicionalmente o uso de uma sonda que reconhece o DNA amplificado pelos referidos iniciadores, p.ex., o DNA de junção compreendendo parte do T-DNA inserido e parte do DNA flanqueando o referido T-DNA em EE-GM4 (no lado 5' ou 3' do evento, como aplicável, tal como uma sonda compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 14 ou 22 aqui), de modo a detectar o produto de amplificação produzido pelos referidos iniciadores. Os iniciadores podem reconhecer uma sequência dentro da região flanqueante de T-DNA 5' de EE-GM4 (SEQ ID No. 5, a partir da posição de nucleotídeo 1 até à posição de nucleotídeo 227, ou SEQ ID No. 24 a partir da posição de nucleotídeo 1 até à posição de nucleotídeo 1058) ou dentro da região flanqueante de T-DNA 3' de EE-GM4 (complemento de SEQ ID No. 6 a partir da posição de nucleotídeo 254 até à posição de nucleotídeo 501 ou SEQ ID No. 25 a partir da posição de nucleotídeo 254 até à posição de nucleotídeo 1339) e uma sequência dentro do T-DNA inserido (SEQ ID No. 5 a partir da posição de nucleotídeo 228 a 398, ou SEQ ID No. 6 a partir da posição de nucleotídeo 1 até à posição de nucleotídeo 253 ou SEQ ID No. 23 a partir da posição de nucleotídeo 1059 até à posição de nucleotídeo 8663 ou o seu complemento), respectivamente. O iniciador reconhecendo a região flanqueante de T-DNA 5' ou 3' pode compreender a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 26 ou SEQ ID No. 27 e o iniciador reconhecendo uma sequência dentro do T-DNA inserido pode compreender a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 28 ou SEQ ID No.
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18/149 descrito aqui. Esta invenção se relaciona também com qualquer par de iniciadores específico do evento e o DNA específico amplificado usando tal par de iniciadores, como pode ser obtido por um perito na técnica ou como pode ser obtido a partir de fontes comerciais.
[0026] A presente invenção se relaciona mais especificamente com um método para identificação do evento de elite EE-GM4 em amostras biológicas, método esse que compreende amplificação de uma sequência de um ácido nucleico presente em uma amostra biológica, usando uma reação em cadeia da polimerase com dois iniciadores compreendendo a ou consistindo (essencialmente) na sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 12 e SEQ ID No. 13, respectivamente, para se obter um fragmento de DNA de 126 pb ou com dois iniciadores compreendendo a ou consistindo (essencialmente) na sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 20 e SEQ ID No. 21, respectivamente, para se obter um fragmento de DNA de 90 pb. Igualmente plantas compreendendo o evento de elite EE-GM4 assim identificado estão incluídas em esta invenção.
[0027] A presente invenção se relaciona adicionalmente com sequências flanqueantes de T-DNA específicas de EE-GM4 descritas aqui, que podem ser usadas para desenvolver métodos de identificação específicos de EEGM4 em amostras biológicas. Tais sequências flanqueantes de T-DNA específicas podem ser também usadas como material de controle de referência em ensaios de identificação. Mais particularmente, a invenção se relaciona com as regiões flanqueantes de T-DNA 5' e/ou 3' de EE-GM4 que podem ser usadas para o desenvolvimento de iniciadores e sondas específicos como adicionalmente descrito aqui. São também adequadas como material de referência moléculas de ácido nucleico, preferencialmente de cerca de 150-850 pb, compreendendo a sequência que pode ser amplificada por iniciadores compreendendo a ou consistindo (essencialmente) a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 12 e SEQ ID No. 13 ou de SEQ ID No. 20 e SEQ ID No. 21.
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19/149 [0028] A invenção se relaciona adicionalmente com métodos de identificação quanto à presença de EE-GM4 em amostras biológicas com base no uso de tais iniciadores ou sondas específicos. Os iniciadores podem compreender, consistir ou consistir essencialmente em uma sequência de nucleotídeos de 17 a cerca de 200 nucleotídeos consecutivos selecionada da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 227 ou SEQ ID No. 24 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 1058 ou do complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID 6 a partir do nucleotídeo 254 até ao nucleotídeo 501 ou do complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 25 a partir do nucleotídeo 254 até ao nucleotídeo 1339, combinada com iniciadores, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência de nucleotídeos de 17 a cerca de 200 nucleotídeos consecutivos selecionada da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 11 a partir do nucleotídeo 17 até ao nucleotídeo 7621 ou do seu complemento ou da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 23 a partir do nucleotídeo 1059 até ao nucleotídeo 8663, tal como uma sequência de nucleotídeos de 17 a cerca de 200 nucleotídeos consecutivos selecionada da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 a partir do nucleotídeo 228 até ao nucleotídeo 398 ou da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 6 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 253, ou do seu complemento, ou da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 11 a partir da posição de nucleotídeo 17 até à posição de nucleotídeo 7621 ou do seu complemento. Os iniciadores podem também compreender estas sequências de nucleotídeos localizadas na sua extremidade 3' extrema e compreendem adicionalmente sequências não relacionadas ou sequências derivadas a partir das sequências de nucleotídeos mencionadas, mas compreendendo não correspondências. Em uma modalidade, os iniciadores, como usados aqui, podem ser também idênticos ao DNA alvo ou ao seu complemento, em que o referido DNA alvo é um híbrido contendo sequências de
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20/149 nucleotídeos de diferentes origens, que não ocorrem em tal combinação na natureza.
[0029] A invenção se relaciona adicionalmente com estojos para identificação do evento de elite EE-GM4 em amostras biológicas, compreendendo os referidos estojos pelo menos um par de iniciadores ou sonda que reconhece especificamente a região flanqueante de T-DNA 5'ou3'eoTDNA inserido compreendendo um gene de tolerância a herbicidas e resistência a nematódeos contíguo com ela em EE-GM4.
[0030] O estojo da invenção pode compreender, adicionalmente a um iniciador que reconhece especificamente a região flanqueante de T-DNA 5' ou 3' de EE-GM4, um segundo iniciador que reconhece especificamente uma sequência dentro do T-DNA inserido compreendendo um gene de tolerância a herbicidas inibidores de HPPD e resistência a nematódeos de EE-GM4, para uso em um protocolo de identificação de PCR. Os estojos da invenção podem compreender pelo menos dois iniciadores específicos, um dos quais reconhece uma sequência dentro da região flanqueante de T-DNA 5' de EE-GM4 ou uma sequência dentro da região flanqueante de T-DNA 3' de EE-GM4 e o outro que reconhece uma sequência dentro do T-DNA inserido compreendendo um gene de tolerância a herbicidas inibidores de HPPD e resistência a nematódeos. O iniciador reconhecendo a região flanqueante de T-DNA 5' pode compreender a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 21 e o iniciador reconhecendo o TDNA inserido pode compreender a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 20 ou o iniciador reconhecendo a região flanqueante de T-DNA 3' pode compreender a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 13 e o iniciador reconhecendo o T-DNA inserido pode compreender a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 12 ou qualquer outro iniciador ou combinação de iniciadores como descrito aqui. O estojo pode adicionalmente compreender uma sonda reconhecendo uma sequência localizada entre o iniciador reconhecendo a região
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21/149 flanqueante de T-DNA 5'eo iniciador reconhecendo a sequência dentro do TDNA inserido ou reconhecendo uma sequência localizada entre o iniciador reconhecendo a região flanqueante de DNA 3' e o iniciador reconhecendo a sequência dentro do T-DNA inserido, tal como uma sonda compreendendo a sequência de SEQ ID No. 14 ou uma sonda compreendendo a sequência de SEQ ID No. 22.
[0031] A invenção se relaciona adicionalmente com um estojo para identificação do evento de elite EE-GM4 em amostras biológicas, compreendendo o referido estojo os iniciadores de POR compreendendo a ou consistindo (essencialmente) na sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 12 e SEQ ID No. 13 ou sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 20 e SEQ ID No. 21 para uso no protocolo de PCR de EE-GM4 descrito aqui. O referido estojo compreendendo os iniciadores compreendendo a ou consistindo (essencialmente) na sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 12 e SEQ ID No. 13 pode adicionalmente compreender uma sonda compreendendo a ou consistindo (essencialmente) na sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 14 e o referido estojo compreendendo os iniciadores compreendendo a ou consistindo (essencialmente) na sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 20 e SEQ ID No. 21 pode adicionalmente compreender uma sonda compreendendo a ou consistindo (essencialmente) na sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 22. O referido estojo pode adicionalmente compreender tampão e reagentes tais como qualquer um ou cada um dos seguintes compostos: dNTPs, (Taq) DNA polimerase, MgCb, estabilizantes e, opcionalmente, um corante.
[0032] A invenção se relaciona também com um estojo para identificação do evento de elite EE-GM4 em amostras biológicas, estojo esse que compreende uma sonda específica compreendendo ou consistindo (essencialmente) em uma sequência que corresponde a (ou é complementar com) uma sequência tendo 80% a 100% identidade de sequências com uma
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22/149 região específica de EE-GM4, em que tal região específica compreende parte da região flanqueante de T-DNA 5' ou 3' de EE-GM4 e parte do T-DNA inserido contíguo com ela. Em uma modalidade, a sequência da sonda corresponde a uma região específica compreendendo parte da região flanqueante de T-DNA 5' ou 3' de EE-GM4 e parte do T-DNA inserido contíguo com ela. O mais preferencialmente, a sonda específica compreende ou consiste (essencialmente) em (ou é complementar com) uma sequência tendo 80% a 100% de identidade de sequências com a sequência de qualquer um de SEQ ID No. 1,3 ou 5 ou uma sequência tendo 80% a 100% de identidade de sequências com a sequência de qualquer um de SEQ ID No. 2, 4 ou 6. Em uma modalidade, a sonda específica compreende ou consiste (essencialmente) em (ou é complementar com) uma sequência tendo 80% a 100% de identidade de sequências com uma parte de pelo menos 50 nucleotídeos contíguos da sequência de SEQ ID No. 5 ou uma sequência tendo 80% a 100% de identidade de sequências com uma parte de pelo menos 50 nucleotídeos contíguos da sequência de SEQ ID No. 6, em que cada uma da referida parte de SEQ ID No. 5 ou 6 compreende sequências de T-DNA inserido e sequências flanqueantes de T-DNA de comprimento aproximadamente igual.
[0033] De acordo com outro aspecto da invenção são divulgadas moléculas de DNA compreendendo comprimento suficiente de polinucleotídeos tanto das sequências flanqueantes de T-DNA como do T-DNA inserido de EEGM4, de modo a serem úteis como iniciador ou sonda para a detecção de EEGM4 ou para caracterizar plantas compreendendo o evento de elite EE-GM4. Tais sequências podem compreender qualquer um de pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20 ou pelo menos 30 nucleotídeos ou podem compreender qualquer um de 9, 10, 15, 20 ou 30 nucleotídeos da sequência flanqueante de T-DNA e um número similar de nucleotídeos do T-DNA inserido de EE-GM4, em cada lado do local de junção, respectivamente, e isto em
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23/149 qualquer um dos ou ambos os locais de junção 5' e 3' do evento EE-GM4. O mais preferencialmente, tais moléculas de DNA compreendem a sequência de qualquer um de SEQ ID No. 1,3 ou 5 ou a sequência de qualquer um de SEQ ID No. 2, 4 ou 6. Em uma modalidade, tais moléculas de DNA compreendem a sequência de SEQ ID No. 23, 24 ou 25. Em um aspecto da invenção são proporcionadas plantas e sementes de soja compreendendo tais moléculas de DNA específicas.
[0034] Os métodos e estojos englobados pela presente invenção podem ser usados para diferentes propósitos tais como os, mas não se limitados aos, seguintes: para identificar a presença ou determinar o limiar (inferior) de EEGM4 em plantas, material de planta ou em produtos tais como, mas não se limitando a, produtos alimentares ou de ração (frescos ou processados) compreendendo ou derivados a partir de material de planta; adicionalmente ou alternativamente, os métodos e estojos da presente invenção podem ser usados para identificar material de planta transgênico para propósitos de segregação entre material transgênico e não transgênico; adicionalmente ou alternativamente, os métodos e estojos da presente invenção podem ser usados para determinar a qualidade (/.e., percentagem de material puro) de material de planta compreendendo EE-GM4.
[0035] A invenção se relaciona adicionalmente com as regiões flanqueantes de T-DNA 5' e/ou 3' de EE-GM4 bem como com os iniciadores e sondas específicos desenvolvidos a partir das sequências flanqueantes de TDNA 5'e/ou 3' de EE-GM4.
[0036] A invenção se relaciona também com DNA genômico obtido a partir de plantas compreendendo o evento de elite EE-GM4, particularmente DNA genômico compreendendo sequências específicas do evento EE-GM4, tal como uma das ou ambas as sequências de junção de EEGM4 (contendo uma parte de DNA flanqueando T-DNA e T-DNA inserido
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24/149 contíguo com ele, característico de EE-GM4), p.ex., qualquer uma das sequências de SEQ ID No. 1,3, 5 ou 24 e/ou qualquer uma das sequências de SEQ ID No. 2, 4, 6 ou 25. Tal DNA genômico pode ser usado como material de controle de referência nos ensaios de identificação aqui descritos.
[0037] É também proporcionada aqui uma planta de soja transgênica resistente a nematódeos e tolerante a herbicidas, ou suas células, sementes ou descendência, compreendendo cada uma pelo menos um evento de elite, o referido evento de elite compreende um T-DNA inserido compreendendo:
i) um primeiro gene quimérico que compreende um gene cry14Ab1.b derivado a partir de Bacillus thuringiensis codificando uma proteína Cry14Ab1 sob o controle de um promotor expressível em plantas, tal como um gene quimérico compreendendo um promotor expressível em plantas e a sequência codificante de SEQ ID No. 7 e ii) um segundo gene quimérico que compreende um gene hppdPf4Pa modificado a partir de Pseudomonas codificando uma enzima HPPD mais tolerante sob o controle de um promotor expressível em plantas, tal como um quimérico compreendendo um promotor expressível em plantas e a sequência codificante de SEQ ID No. 9.
[0038] Em uma modalidade, o referido evento de elite compreende os nucleotídeos 1 a 227 de SEQ ID No. 5 ou 1 a 1058 de SEQ ID No. 24 imediatamente a montante do e contíguo com o referido T-DNA inserido e os nucleotídeos 254 a 501 de SEQ ID No. 6 ou os nucleotídeos 254 a 1339 de SEQ ID No. 25 imediatamente a jusante do e contíguo com o referido T-DNA inserido.
[0039] Em uma modalidade adicional, o referido evento de elite é obtenível por cruzamento com uma planta de soja cultivada a partir da semente
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25/149 de referência compreendendo o referido evento tendo sido depositado na ATCC sob o número de depósito PTA-123624.
[0040] Em outra modalidade, o DNA genômico da referida planta de soja, ou suas células, partes, sementes ou descendência, quando analisado usando PCR com dois iniciadores compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 12 e SEQ ID No. 13, respectivamente, origina um fragmento de DNA de 126 pb ou, quando analisado usando PCR com dois iniciadores compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 20 e SEQ ID No. 21, respectivamente, origina um fragmento de DNA de 90 pb.
[0041] É também proporcionado aqui um método para identificação de uma planta de soja transgênica, ou suas células, partes, semente ou descendência, com resistência a nematódeos, tais como resistência a SCN e/ou Pratylenchus e/ou nematódeos de nódulos radiculares e/ou reniformes, e tolerância a um herbicida inibidor de HPPD, tal como isoxaflutol, topramezona ou mesotriona, em amostras biológicas, compreendendo o referido método amplificação de um fragmento de DNA de entre 50 e 150 pb a partir de um ácido nucleico presente em amostras biológicas usando uma reação em cadeia da polimerase com pelo menos dois iniciadores, reconhecendo um dos referidos iniciadores a região flanqueante de T-DNA 5' do evento de elite EEGM4, compreendendo a referida região flanqueante de T-DNA 5' a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 227 ou de SEQ ID No. 24 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 1058, ou reconhecendo a região flanqueante de T-DNA 3' do referido evento, compreendendo a referida região flanqueante de T-DNA 3' a sequência de nucleotídeos do complemento de SEQ ID No. 6 a partir do nucleotídeo 254 até ao nucleotídeo 501 ou a sequência de nucleotídeos do complemento de SEQ ID No. 25 a partir do nucleotídeo 254 até ao nucleotídeo 1339, reconhecendo o outro iniciador dos referidos iniciadores uma sequência dentro do T-DNA inserido
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26/149 compreendendo a sequência de nucleotídeos do complemento de SEQ ID No. 5 a partir do nucleotideo 228 até ao nucleotideo 398 ou a sequência de nucleotídeos SEQ ID No. 6 a partir do nucleotideo 1 até ao nucleotideo 253 ou em que o referido T-DNA inserido compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 11 a partir da posição de nucleotideo 17 até à posição de nucleotideo 7621 ou o seu complemento.
[0042] É também proporcionado aqui um estojo para identificação de uma planta de soja transgênica, ou suas células, partes, semente ou descendência, com resistência a nematódeos e tolerância a um herbicida inibidor de HPPD, em amostras biológicas, compreendendo o referido estojo um iniciador reconhecendo a região flanqueante de T-DNA 5' do evento de elite EE-GM4, compreendendo a referida região flanqueante de T-DNA 5' a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 a partir do nucleotideo 1 até ao nucleotideo 227 ou de SEQ ID No. 24 a partir do nucleotideo 1 até ao nucleotideo 1058 ou um iniciador reconhecendo a região flanqueante de T-DNA 3' do referido evento de elite, compreendendo a referida região flanqueante de T-DNA 3' a sequência de nucleotídeos do complemento de SEQ ID No. 6 a partir do nucleotideo 254 até ao nucleotideo 501 ou a sequência de nucleotídeos do complemento de SEQ ID No. 25 a partir do nucleotideo 254 até ao nucleotideo 1339 e um iniciador reconhecendo uma sequência dentro do T-DNA inserido, compreendendo o T-DNA inserido a sequência de nucleotídeos do complemento de SEQ ID No. 5 a partir do nucleotideo 228 até ao nucleotideo 398 ou a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 6 a partir do nucleotideo 1 até ao nucleotideo 253 ou compreendendo ao referido T-DNA inserido a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 11 a partir da posição de nucleotideo 17 até à posição de nucleotideo 7621 ou o seu complemento.
[0043] Em uma modalidade da invenção, o T-DNA inserido do evento de elite EE-GM4, como usado aqui, compreende a sequência de
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27/149 nucleotídeos de SEQ ID No. 5 a partir do nucleotídeo 228 até ao nucleotídeo 398 ou seu complemento e a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 6 a partir do nucleotídeo 254 até ao nucleotídeo 501 ou seu complemento ou compreende uma sequência com pelo menos 95, 98, 99, 99,5 ou 99,9% de identidade de sequências de SEQ ID No. 11 a partir da posição de nucleotídeo 17 até à posição de nucleotídeo 7621 ou seu complemento.
[0044] É também proporcionada aqui uma planta, célula de planta, tecido ou semente de soja, compreendendo em seu genoma uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeos de qualquer um de SEQ ID No. 1,3, 5 ou 24 ou uma sequência de nucleotídeos de 80 a 100% de identidade de sequências com ela e/ou SEQ ID No. 2, 4, 6 ou 25, ou uma sequência de nucleotídeos de 80 a 100% de identidade de sequências com ela, e uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99, 99,5 ou pelo menos 99,9% de identidade de sequências com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 11 a partir da posição de nucleotídeo 188 até à posição de nucleotídeo 7368 ou o seu complemento.
[0045] Uma modalidade desta invenção proporciona uma planta, célula de planta, tecido ou semente de soja, compreendendo em seu genoma uma molécula de ácido nucleico hibridando sob condições de estringência padrão com a sequência de nucleotídeos de qualquer um de SEQ ID No. 1,3 ou 5 ou o seu complemento ou hibridando com a sequência de nucleotídeos de qualquer um de SEQ ID No. 2, 4 ou 6 ou o seu complemento.
[0046] É também proporcionada aqui uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com a sequência de nucleotídeos de qualquer um de SEQ ID No. 1,3, 5 ou 24, ou o seu complemento, ou com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências
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28/149 com a sequência de nucleotídeos de qualquer urn de SEQ ID No. 2, 4, 6 ou 25, ou o seu complemento, ou uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo uma sequência de nucleotídeos hibridando sob condições de estringência padrão com a sequência de nucleotídeos de qualquer um de SEQ ID No. 1,3, 5 ou 24 ou o seu complemento, ou com a sequência de nucleotídeos de qualquer um de SEQ ID No. 2, 4, 6 ou 25 ou o seu complemento.
[0047] É também proporcionada aqui uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 7 ou o seu complemento ou uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo una sequência de nucleotídeos hibridando sob condições de estringência padrão com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 7 ou o seu complemento, em que tal molécula de ácido nucleico codifica uma toxina nematicida ativa em nematódeos dos cistos e/ou nematódeos formadores de lesões e/ou nematódeos dos nódulos radiculares e/ou nematódeo reniforme, tais como Heterodera glycines e/ou Pratylenchus brachyurus e/ou Meloidogyne incognita e/ou Rotylenchulus reniformis. Em uma modalidade, tal molécula de ácido nucleico está operacionalmente ligada a uma molécula de ácido nucleico compreendendo um promotor expressível em plantas (heterólogo) de modo a formar um gene quimérico. É também proporcionado aqui o uso da referida molécula de ácido nucleico em plantas ou sementes transformadas para controlar nematódeos patogênicos em plantas. É adicionalmente proporcionado aqui um método de controlar nematódeos dos nódulos radiculares tais como Meloidogyne incognita, Meloidogyne arenaria, Meloidogyne hapla ou Meloidogyne javanica, particularmente Meloidogyne incognita, compreendendo uso de uma proteína Cry14Ab ou um DNA codificando uma proteína Cry14Ab ou uma planta ou semente contendo o referido DNA sob o controle de um promotor
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29/149 expressível em plantas, em que a referida proteína Cry14Ab é a proteína compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID No. 8 ou uma proteína com pelo menos 96% ou pelo menos 98 ou pelo menos 99% de identidade de sequência com ela ou uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID No. 8 a partir da posição de aminoácido 1 até à posição de aminoácido 706 ou uma proteína com pelo menos 96% ou pelo menos 98 ou pelo menos 99% de identidade de sequências com ela. É adicionalmente proporcionado aqui um método de controlar nematódeos reniformes (Rotylenchulus reniformis), compreendendo uso de uma proteína Cry14Ab ou um DNA codificando uma proteína Cry14Ab, ou uma planta ou semente contendo o referido DNA, sob o controle de um promotor expressível em plantas, em que a referida proteína Cry14Ab é a proteína compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID No. 8 ou uma proteína com pelo menos 96% ou pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com ela ou uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID No. 8 a partir da posição de aminoácido 1 até à posição de aminoácido 706 ou uma proteína com pelo menos 96% ou pelo menos 98 ou pelo menos 99% de identidade de sequências com ela.
[0048] É também proporcionada aqui uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 11 a partir da posição de nucleotídeos 131 até à posição de nucleotídeos 7941 ou uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com ela, em que a referida molécula de ácido nucleico codifica uma proteína Cry14Ab nematicida e uma proteína HPPD tolerante a inibidores de HPPD. Em uma modalidade, essa molécula de ácido nucleico codifica a proteína de SEQ ID No. 8 ou uma proteína pelo menos 99% idêntica a ela e a proteína de SEQ ID No. 10 ou uma proteína pelo menos 99% idêntica a ela.
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30/149 [0049] É também proporcionada aqui uma célula de planta de soja compreendendo em seu genoma o evento de elite EE-GM4 que é um TDNA inserido em um lócus definido, em que o evento de elite EE-GM4 é como contido na semente de referência depositada na ATCC sob o número de depósito PTA-123624, em que o referido gene codificando Cry14Ab-1 quimérico e um gene codificando HPPD-4 quimérico e em que o referido evento de elite é caracterizado pela sequência de junção 5' de SEQ ID No. 1 ou 3 e pela sequência de junção 3' de SEQ ID No. 2 ou 4; ou tal célula que é uma célula de semente, ou tal célula, em que o DNA genômico da referida célula, quando analisado usando PCR com dois iniciadores compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID 12 e SEQ ID 13, respectivamente, origina um fragmento de DNA de 126 pb.
[0050] A invenção proporciona uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeos do evento de elite EE-GM4 como contido na semente de referência depositada na ATCC sob o número de depósito PTA-123624, em que o referido evento de elite compreende um gene codificando Cry14Ab-1 quimérico e um gene codificando HPPD-4 quimérico e compreende a sequência de SEQ ID No. 1 ou 3 e a sequência de SEQ ID No. 2 ou 4.
[0051] A invenção proporciona também uma molécula de ácido nucleico compreendendo em ordem as seguintes sequências de nucleotídeos: a) a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO. 5 a partir do nucleotídeo 1 até 227 ou uma sequência pelo menos 99% idêntica a ela, b) a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 11 a partir do nucleotídeo 188 até ao nucleotídeo 7368 ou uma sequência pelo menos 99% idêntica a ela e c) a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO. 6 a partir do nucleotídeo 254 até ao nucleotídeo 501 ou uma sequência pelo menos 99% idêntica a ela, tal como tal molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência b) que é pelo menos 99,5% ou
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31/149 pelo menos 99,9% idêntica à sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 11 a partir do nucleotídeo 188 até ao nucleotídeo 7368.
[0052] A invenção proporciona também uma molécula de ácido nucleico compreendendo em ordem as seguintes sequências de nucleotídeos: a) a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO. 24 a partir do nucleotídeo 1 até 1058 ou uma sequência pelo menos 99% idêntica a ela, b) a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 23 a partir do nucleotídeo 1059 até ao nucleotídeo 8663 ou uma sequência pelo menos 99% idêntica a ela e c) a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO. 25 a partir do nucleotídeo 254 até ao nucleotídeo 1339 ou uma sequência pelo menos 99% idêntica a ela, tal como tal molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência b) que é pelo menos 99,5% ou pelo menos 99,9% idêntica à sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 23. De acordo com a invenção é também proporcionado um método para produção de um produto de soja, compreendendo obtenção de semente de soja compreendendo o evento de elite EE-GM4 como descrito acima e produção do produto de soja a partir dela. Em uma modalidade, o produto de soja em um tal método é ou compreende farelo de soja, sementes trituradas, farinha ou flocos ou óleo de soja, proteína de soja, lecitina, leite de soja, tofu, margarina, biodiesel, biocompósito, adesivo, solvente, lubrificante, limpador, espuma, tinta, tintura, vela ou um produto alimentar ou de ração contendo óleo de soja ou proteína de soja. Em outra modalidade, tal produto de soja compreende um ácido nucleico específico do evento de elite EE-GM4. Em uma modalidade, o referido ácido nucleico específico do evento de elite EE-GM4 compreende a sequência de SEQ ID No. 1 ou 3 ou a sequência de SEQ ID No. 2 ou 4.
[0053] É também proporcionado aqui um produto de soja produzido a partir da semente compreendendo o evento de elite EE-GM4 como descrito acima, em que o referido produto de soja é ou compreende farelo de soja, sementes trituradas, farinha ou flocos e compreende ácidos nucleicos
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32/149 específicos do evento de elite EE-GM4, em que os referidos ácidos nucleicos são detectáveis usando os métodos como descrito aqui. Em uma modalidade, o referido ácido nucleico específico do evento de elite EE-GM4 compreende a sequência de SEQ ID No. 1 ou 3 ou a sequência de SEQ ID No. 2 ou 4. Em outra modalidade, o referido ácido nucleico específico do evento de elite EE-GM4 compreende a sequência de SEQ ID No. 5 ou 24 ou a sequência de SEQ ID No. 6 ou 25. Em uma modalidade, o referido ácido nucleico específico do evento de elite EE-GM4 compreende a sequência de SEQ ID No. 5 ou 24 e a sequência de SEQ ID No. 6 ou 25.
[0054] É também proporcionado aqui o uso de semente de soja compreendendo o evento de elite EE-GM4 para se obter um produto de soja, em que o referido evento de elite compreende a sequência de qualquer um de SEQ ID NO. 1,3, 5 ou 24 e/ou a sequência de qualquer um de SEQ ID No. 2, 4, 6 ou 25. Em uma modalidade, em tal uso, o produto de soja é qualquer um de farelo de soja, sementes de soja trituradas, farinha de soja ou flocos de soja.
[0055] Adicionalmente é proporcionado aqui um método para produção de uma planta ou semente de soja compreendendo o evento de elite EE-GM4 combinado com outro lócus/gene de resistência a SCN, tal como por combinação do evento de elite EE-GM4 com outro lócus/gene de resistência a SCN ocorrendo na mesma planta/semente de soja e plantio da semente compreendendo EE-GM4 e referido outro lócus/gene de resistência a SCN. Em uma modalidade, as plantas, células ou sementes da invenção contêm um ou mais toc/7genes de resistência a SCN que ocorrem na soja, para se obter uma combinação de diferentes fontes de resistência a SCN nas plantas, células ou sementes de soja da invenção. Vários loci ou genes de resistência a SCN da soja são conhecidos e um ou mais desses podem ser combinados com EE-GM4 na mesma planta, célula ou semente, tal como qualquer um dos genes/loci de resistência a SCN das fontes de resistência PI 88788, PI 548402 (Peking), PI
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437654 (Hartwig ou CystX®), ou qualquer sua combinação, ou um ou mais dos toc/7genes de resistência a SCN nativos rhg1, rhg1-b, rhg2, rhg3, Rhg4, Rhg5, qSCN11, cqSCN-003, cqSCN-005, cqSCN-006, cqSCN-007 ou qualquer urn dos loci de resistência a SCN identificados em qualquer um dos cromossomos da soja 1,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ou 20 ou qualquer sua combinação (Kim et al. 2016, Theor. Appl. Genet. 129 (12): 2295-2311; Kim e Diers 2013, Crop Science 53: 775-785; Kazi etal. 2010, Theor. Appl. Gen. 120 (3): 633-644; Glover et al. 2004, Crop Science 44 (3): 936-941; www.soybase.org; Concibido etal. 2004, Crop Science44:1121-1131; Webb et al. 1995, Theor. Appl. Genet. 91: 574-581). Igualmente, em uma modalidade, as plantas ou sementes da invenção contêm EE-GM4 quando combinadas com um ou mais loci de resistência a SCN na soja obtidos a parti de qualquer uma das fontes de resistência a SCN PI 548316, PI 567305, PI 437654, PI 90763, PI 404198B, PI 88788, PI 468916, PI 567516C, PI 209332, PI 438489B, PI 89772, Peking, PI 548402, PI404198A, PI 561389B, PI 629013, PI 507471, PI 633736, PI 507354, PI 404166, PI 437655, PI 467312, PI 567328, PI 22897 ou PI 494182. A Tabela 3 anexada aqui proporcionada uma lista abrangente de acessos de soja relatados como resistentes a SCN, dos quais os genes/loci de resistência a SCN (um ou vários) podem ser combinados com EE-GM4 da invenção na mesma planta, célula ou semente de soja.
Tabela 3.
| C21340 | I404192C | I438498 | I507451 | I548974 | I567771C | I68465 |
| C31685 | I404198A | I438503A | I 507470 | I 548975 | I 567773 | I68622 |
| I101404A | I404198B | I458506 | I 507471 | I 548981 | I603587A | I70027 |
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| 1153229 | I 407022 | I 458510 | I 507475 | I 548982 | I605743B | I 70213 |
| I 153297 | I 407221 | I 458519A | I 507476 | I 548988 | I 606416A | I 70229 |
| I 153303 | I 407729 | I 458520 | I507686C | I 549031 | I 606420 | I 70251 |
| I 157430 | I 416762 | I 461509 | I 509095 | I 553040 | I 606424 | I 70519 |
| I 157444 | I 417091 | I464888A | I 509100 | I 553047 | I 606430 | I 71161 |
| I 16790 | I 423927 | I 464910 | I 511813 | I 559370 | I 606435 | I 79620 |
| I17852-B | I 424387 | I 464912 | I 518772 | I561389B | I 606436 | I 79712 |
| I 181558 | I 424595 | I464925B | I 522186 | I 56563 | I 606437 | I 80834-2 |
| I 200495 | I 437654 | I 467312 | I 522236 | I 567305 | I 606439 | I 82308 |
| I 209332 | I 437655 | I 467327 | I 533605 | I567325B | I 606441 | I 84664 |
| I 22897 | I 437679 | I 467332 | I 540556 | I 567328 | I 606443 | I 84751 |
| I 232993 | I 437690 | I 468903 | I 543855 | I567333A | I 612610 | I 84807 |
| I 303652 | I 437725 | I 468915 | I 54620-2 | I 567354 | I 612611 | I 84896 |
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| 1339868B | I 437770 | I 468916 | I 548316 | I567360 | I612612A | I 87631-1 |
| 1339871A | I 437793 | I468916 | I 548349 | I567387 | I612614 | I88788 |
| I346298 | I 437844A | I494182 | I548376 | I567488B | I612615 | I89008 |
| |347544A | I 437904 | I 495017C | I548402 | I567491A | I612616 | I89772 |
| I371610 | I 438342 | I 506862 | I548402S | I567516C | I612617A | I89783 |
| I 378690 | I 438489B | I507354 | I548456 | I567676A | I62202 | I90763 |
| I398682 | I438491 | I 507422 | I548655 | I567726 | I629013 | I91102 |
| I399061 | I 438496B | I507423 | I548665 | I567737 | I633736 | I 92576 |
| I404166 | I 438497 | I 507443 | I 548970 | I567741 | I63468 | I92595 |
| I 96549 |
[0056] É também proporcionado aqui um método para proteção de plantas de soja emergentes da competição por ervas daninhas, compreendendo tratamento de um campo no qual sementes contendo o evento de elite EE-GM4 como descrito acima foram semeadas, com um herbicida inibidor de HPPD, em que as plantas são tolerantes ao herbicida inibidor de HPPD. Em uma modalidade, em tal método, o herbicida inibidor de HPPD é isoxaflutol, topramezona ou mesotriona.
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36/149 [0057] É também proporcionado aqui método para proteção de plantas de soja emergentes da competição por ervas daninhas, compreendendo tratamento de um campo a ser plantado com plantas de soja compreendendo o evento de elite EE-GM4 como descrito acima com um herbicida inibidor de HPPD, antes de as plantas de soja serem plantadas ou as sementes serem semeadas, seguido por plantio ou semeaduradas referidas plantas ou sementes de soja no referido campo pré-tratado, em que as plantas são tolerantes ao herbicida inibidor de HPPD.
[0058] É também proporcionado aqui um método para controle de ervas daninhas em um campo de plantas de soja compreendendo o evento de elite EE-GM4 como descrito acima, compreendendo tratamento do referido campo com uma quantidade eficaz de um herbicida inibidor de HPPD, em que as plantas são tolerantes a tal herbicida.
[0059] É ainda adicionalmente proporcionado aqui o uso de uma planta de soja transgênica, sua semente ou descendência, para controlar ervas daninhas em um campo de soja, em que cada uma da referida planta, semente ou descendência compreende o evento de elite EE-GM4 em seu genoma, em que EE-GM4 que é um T-DNA inserido em um lócus definido, como contido na semente de referência depositada na ATCC sob o número de depósito PTA123624, em que o referido T-DNA inserido compreende um gene codificando Cry14Ab-1 quimérico e um gene codificando HPPD-4 quimérico e em que o referido evento de elite é caracterizado pela sequência de junção 5' de SEQ ID No. 1 ou 3 e pela sequência de junção 3' de SEQ ID No. 2 ou 4. Em uma modalidade, em tal uso, a planta de soja transgênica, sua semente ou descendência, é resistente a nematódeos e/ou tolerante a um herbicida inibidor de HPPD. Em uma modalidade, o referido T-DNA compreende um gene codificando Cry14Ab-1 quimérico e um gene codificando HPPD-4 quimérico e o
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37/149 referido evento de elite é caracterizado pela sequência de junção 5' de SEQ ID No. 5 e pela sequência de junção 3' de SEQ ID No. 6.
[0060] É também proporcionado aqui o uso de uma planta ou semente de soja compreendendo o evento de elite EE-GM4 em seu genoma para cultivar uma planta resistente a nematódeos e/ou tolerante a herbicidas, em que o referido evento de elite EE-GM4 é um T-DNA inserido em um lócus definido, como contido na semente de referência depositada na ATCC sob o número de depósito PTA-123624, em que o referido T-DNA inserido compreende um gene codificando Cry14Ab-1 quimérico e um gene codificando HPPD-4 quimérico e em que o referido evento de elite é caracterizado pela sequência de junção 5' de SEQ ID No. 1 ou 3 e pela sequência de junção 3' de SEQ ID No. 2 ou 4. Em uma modalidade, em tal uso, a planta ou semente de soja é resistente a nematódeos SCN e/ou tolerante a um herbicida inibidor de HPPD. Em uma modalidade, o referido T-DNA compreende um gene codificando Cry14Ab-1 quimérico e um gene codificando HPPD-4 quimérico e o referido evento de elite é caracterizado pela sequência de junção 5' de SEQ ID No. 5 ou 24 e pela sequência de junção 3' de SEQ ID No. 6 ou 25.
[0061] É também proporcionado aqui o uso de uma semente de soja compreendendo o evento de elite EE-GM4 para se obter um produto de soja, em que EE-GM4 é como descrito acima.
[0062] É proporcionado aqui um método para produção de uma planta ou semente de soja compreendendo o evento de elite EE-GM4, compreendendo cruzamento de uma planta compreendendo EE-GM4 com outra planta de soja e plantio da semente compreendendo EE-GM4 obtida a partir do referido cruzamento. Em uma modalidade, tal método inclui o passo de aplicação de um herbicida inibidor de HPPD à referida semente ou planta.
[0063] De acordo com esta invenção é também proporcionado o uso de uma semente de soja compreendendo o evento de elite EE-GM4 como
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38/149 descrito acima, e um herbicida inibidor de HPPD, para controlar ervas daninhas em um campo de soja, e o uso de uma semente de soja compreendendo o evento de elite EE-GM4 em um método de cultivo de soja tolerante a herbicidas inibidores de HPPD, em que a referida semente é como descrita acima.
[0064] É adicionalmente proporcionado o uso do evento de elite EE-GM4 como descrito acima para conferir resistência a nematódeos e/ou tolerância a um herbicida inibidor de HPPD a uma planta ou semente de soja, e o uso de uma planta ou semente de soja compreendendo o evento de elite EEGM4, em combinação com um herbicida inibidor de HPPD, para cultivo de soja.
[0065] É também proporcionado aqui um par de iniciadores específico de EE-GM4, bem como estojos ou métodos usando tal par de iniciadores, em que pelo menos um iniciador do referido par está etiquetado (tal como com uma fração detectável (heteróloga) ou rastreável que é adicionada ao iniciador) ou em que a extremidade 5' de pelo menos um dos referidos iniciadores compreende uma ou mais não correspondências ou uma sequência de nucleotídeos não relacionadas com as sequências flanqueantes 5’ ou 3' de EE-GM4 ou não relacionadas com a sequência de T-DNA de EE-GM4; ou em que pelo menos um dos referidos iniciadores compreende uma sequência de nucleotídeos na sua extremidade 3' abrangendo a região de união entre as sequências flanqueantes de T-DNA e as sequências de T-DNA, estando a referida região de união aos nucleotídeos 227-228 em SEQ ID No. 5, nucleotídeos 1058-1059 em SEQ ID No. 24 ou aos nucleotídeos 253-254 em SEQ ID No. 6 ou 25, contanto que os 17 nucleotídeos consecutivos na extremidade 3' não sejam derivados exclusivamente a partir do T-DNA ou sequências flanqueantes de T-DNA em SEQ ID Nos. 5 ou 24 ou 6 ou 25; ou em que pelo menos um dos referidos iniciadores compreende uma sequência que é entre 80 e 100% idêntica a uma sequência dentro da região flanqueante 5' ou 3' de EE-GM4 ou dentro do T-DNA inserido de EE-GM4, respectivamente, e a
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39/149 referida sequência iniciadora compreende pelo menos uma não correspondência com a referida região flanqueante 5' ou 3' ou o referido T-DNA, contanto que pelo menos uma não correspondência permita ainda a identificação específica do evento de elite EE-GM4 com estes iniciadores sob condições de detecção otimizadas (p.ex., condições de PCR otimizadas); ou em que a sequência de nucleotídeos de pelo menos um dos referidos iniciadores compreende a sequência de nucleotídeos de um ácido nucleico fundido com um ácido nucleico de outra origem ou seu complemento.
[0066] Outras modalidades de acordo com a invenção são resumidas nos seguintes parágrafos:
1. Método para identificação do evento de elite EE-GM4 em amostras biológicas, método esse que compreende detecção específica de EEGM4 com um par de iniciadores ou sonda específico que reconhece(m) especificamente a (pelo menos uma parte da) região contendo parte da região flanqueante de T-DNA 5' ou3'eo (pelo menos uma parte do) T-DNA contíguo com ela em EE-GM4.
2. O método do parágrafo 1, compreendendo o referido método amplificação de um fragmento de DNA de entre 50 e 1000 pb a partir de um ácido nucleico presente nas referidas amostras biológicas usando uma reação em cadeia da polimerase com pelo menos dois iniciadores, reconhecendo um dos referidos iniciadores a região flanqueante de T-DNA 5' do T-DNA inserido em EE-GM4, compreendendo a referida região flanqueante de T-DNA 5' a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 227 ou de SEQ ID No. 24 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 1058 ou reconhecendo a região flanqueante de T-DNA 3' do T-DNA inserido em EE-GM4, compreendendo a referida região flanqueante de T-DNA 3' a sequência de nucleotídeos do complemento de SEQ ID No. 6 a partir do nucleotídeo 254 até ao nucleotídeo 501 ou a sequência de nucleotídeos do
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40/149 complemento de SEQ ID No. 25 a partir do nucleotídeo 254 até ao nucleotídeo 1339, reconhecendo o outro iniciador dos referidos iniciadores uma sequência dentro do T-DNA inserido compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 a partir do nucleotídeo 228 até ao nucleotídeo 398 ou o seu complemento ou a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 6 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 253 ou a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 11 a partir do nucleotídeo 17 até ao nucleotídeo 7621 ou de SEQ ID No. 23 a partir da posição de nucleotídeo 1059 até à posição de nucleotídeo 8663 ou o seu complemento.
3. O método do parágrafo 2, em que o referido iniciador reconhecendo a região flanqueante de T-DNA 5' compreende uma sequência de nucleotídeos de 17 a 200 nucleotídeos consecutivos selecionada da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 227 ou de SEQ ID No. 24 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 1058 ou o referido iniciador reconhecendo a região flanqueante de T-DNA 3' de EE-GM4 compreende uma sequência de nucleotídeos de 17 a 200 nucleotídeos consecutivos selecionada da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 6 a partir do nucleotídeo 254 até ao nucleotídeo 501 ou a sequência de nucleotídeos do complemento de SEQ ID No. 25 a partir do nucleotídeo 254 até ao nucleotídeo 1339 e o referido iniciador reconhecendo uma sequência dentro do T-DNA inserido compreende 17 a 200 nucleotídeos consecutivos selecionados da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 a partir do nucleotídeo 228 até ao nucleotídeo 398 ou do seu complemento ou da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 6 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 253 ou do seu complemento ou da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 11 a partir do nucleotídeo 17 até ao nucleotídeo 7621 ou de SEQ ID No. 23 a partir da posição de nucleotídeo 1059 até à posição de nucleotídeo 8663 ou do seu complemento.
4. O método do parágrafo 2, em que o referido iniciador
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41/149 reconhecendo a região flanqueante de T-DNA 5' compreende na sua extremidade 3' extrema uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos selecionada da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 227 ou de SEQ ID No. 24 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 1058 ou o referido iniciador reconhecendo a região flanqueante de T-DNA 3' de EE-GM4 compreende na sua extremidade 3' extrema uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos selecionada da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 6 a partir do nucleotídeo 254 até ao nucleotídeo 501 ou a sequência de nucleotídeos do complemento de SEQ ID No. 25 a partir do nucleotídeo 254 até ao nucleotídeo 1339 e o referido iniciador reconhecendo uma sequência dentro do T-DNA inserido compreende na sua extremidade 3' pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos selecionados do complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 a partir do nucleotídeo 228 até ao nucleotídeo 398 ou da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 6 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 253 ou da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 11 a partir do nucleotídeo 17 até ao nucleotídeo 7621 ou de SEQ ID No. 23 a partir da posição de nucleotídeo 1059 até à posição de nucleotídeo 8663 ou do seu complemento.
5. O método do parágrafo 4, em que os referidos iniciadores compreendem a sequência de SEQ ID No. 12 e SEQ ID No. 13, respectivamente, ou a sequência de SEQ ID No. 20 e SEQ ID No. 21, respectivamente.
6. O método do parágrafo 5, método esse que compreende amplificação de um fragmento específico de EE-GM4 de 126 ou 90 pb usando PCR.
7. O método de qualquer um dos parágrafos 2 a 6, compreendendo adicionalmente o passo de hibridação de uma sonda específica do fragmento de DNA amplificado com os referidos pelo menos dois iniciadores.
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8. O método do parágrafo 7, em que a referida sonda reconhece parte da referida região flanqueante de T-DNA 5' e parte do T-DNA inserido contíguo com ela ou em que a referida sonda reconhece parte da referida região flanqueante de T-DNA 3' e parte do T-DNA inserido contíguo com ela ou reconhece parte da referida região flanqueante de T-DNA 5' e parte do TDNA inserido contíguo com ela, tal como em que a referida sonda compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 1 ou 3 ou SEQ ID No 2 ou 4.
9. O método do parágrafo 8, em que os referidos iniciadores compreendem a sequência de SEQ ID No. 12 e SEQ ID No. 13, respectivamente, e em que a referida sonda compreende a sequência de SEQ ID No. 14 ou em que os referidos iniciadores compreendem a sequência de SEQ ID No. 20 e SEQ ID No. 21, respectivamente, e em que a referida sonda compreende a sequência de SEQ ID No. 22.
10. Um estojo compreendendo um iniciador reconhecendo a região flanqueante de T-DNA 5' do T-DNA inserido em EE-GM4, compreendendo a referida região flanqueante de T-DNA 5' a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 227 ou de SEQ ID No. 24 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 1058 ou um iniciador reconhecendo a região flanqueante de T-DNA 3' do T-DNA inserido em EE-GM4, compreendendo a referida região flanqueante de T-DNA 3' a sequência de nucleotídeos do complemento de SEQ ID No. 6 a partir do nucleotídeo 254 até ao nucleotídeo 501 ou a sequência de nucleotídeos do complemento de SEQ ID No. 25 a partir do nucleotídeo 254 até ao nucleotídeo 1339 e um iniciador reconhecendo uma sequência dentro do T-DNA inserido, compreendendo o referido T-DNA inserido o complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 a partir do nucleotídeo 228 até ao nucleotídeo 398 ou da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 6 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 253 ou da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 11 a partir
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43/149 do nucleotídeo 17 até ao nucleotídeo 7621 ou de SEQ ID No. 23 a partir da posição de nucleotídeo 1059 até à posição de nucleotídeo 8663 ou do seu complemento.
11. O estojo do parágrafo 10, em que o referido iniciador reconhecendo a região flanqueante de T-DNA 5' compreende uma sequência de nucleotídeos de 17 a 200 nucleotídeos consecutivos selecionada da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 227 ou de SEQ ID No. 24 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 1058 ou o referido iniciador reconhecendo a região flanqueante de T-DNA 3' de EE-GM4 compreende uma sequência de nucleotídeos de 17 a 200 nucleotídeos consecutivos selecionada da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 6 a partir do nucleotídeo 254 até ao nucleotídeo 501 ou a sequência de nucleotídeos do complemento de SEQ ID No. 25 a partir do nucleotídeo 254 até ao nucleotídeo 1339 e o referido iniciador reconhecendo uma sequência dentro do T-DNA inserido compreende 17 a 200 nucleotídeos consecutivos selecionados do complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 a partir do nucleotídeo 228 até ao nucleotídeo 398 ou da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 6 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 253 ou da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 11 a partir do nucleotídeo 17 até ao nucleotídeo 7621 ou de SEQ ID No. 23 a partir da posição de nucleotídeo 1059 até à posição de nucleotídeo 8663 ou do seu complemento.
12. O estojo do parágrafo 10, em que o referido iniciador reconhecendo a região flanqueante de T-DNA 5' compreende na sua extremidade 3' extrema uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos selecionada da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 227 ou de SEQ ID No. 24 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 1058 ou o referido iniciador reconhecendo a região flanqueante de T-DNA 3' de EE-GM4 compreende na
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44/149 sua extremidade 3' uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos selecionada da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 6 a partir do nucleotídeo 254 até ao nucleotídeo 501 ou a sequência de nucleotídeos do complemento de SEQ ID No. 25 a partir do nucleotídeo 254 até ao nucleotídeo 1339 e o referido iniciador reconhecendo uma sequência dentro do T-DNA inserido compreende na sua extremidade 3' extrema pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos selecionados do complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 a partir do nucleotídeo 228 até ao nucleotídeo 398 ou da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 6 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 253 ou da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 11 a partir do nucleotídeo 17 até ao nucleotídeo 7621 ou de SEQ ID No. 23 a partir da posição de nucleotídeo 1059 até à posição de nucleotídeo 8663 ou do seu complemento.
13. O estojo do parágrafo 10 compreendendo um iniciador compreendendo a sequência de SEQ ID No. 12 e um iniciador compreendendo a sequência de SEQ ID No. 13 ou compreendendo um iniciador compreendendo a sequência de SEQ ID No. 20 e um iniciador compreendendo a sequência de SEQ ID No. 21.
14. O estojo do parágrafo 10, compreendendo adicionalmente uma sonda reconhecendo uma sequência entre o iniciador reconhecendo a região flanqueante de T-DNA 5'eo iniciador reconhecendo a sequência dentro do T-DNA inserido ou reconhecendo uma sequência entre o iniciador reconhecendo a região flanqueante de DNA 3' e o iniciador reconhecendo a sequência dentro do T-DNA inserido.
15. O estojo do parágrafo 14, em que a referida sonda reconhece parte da referida região flanqueante de T-DNA 5' e parte do T-DNA inserido contíguo com ela ou em que a referida sonda reconhece parte da referida região flanqueante de T-DNA 3 e parte do T-DNA inserido contíguo
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45/149 com ela.
16. O estojo do parágrafo 15, em que os referidos iniciadores compreendem a sequência de SEQ ID No. 12 e SEQ ID No. 13 e em que a referida sonda compreende a sequência de SEQ ID No. 14 ou em que os referidos iniciadores compreendem a sequência de SEQ ID No. 20 e SEQ ID No. 21 e em que a referida sonda compreende a sequência de SEQ ID No. 22.
17. Par de iniciadores adequado para uso em uma detecção específica de EE-GM4, compreendendo um primeiro iniciador compreendendo uma sequência que, sob condições de detecção otimizadas, reconhece especificamente uma sequência dentro da região flanqueante de T-DNA 5' ou 3' do T-DNA inserido em EE-GM4 e um segundo iniciador compreendendo uma sequência que, sob condições de sequência otimizadas, reconhece especificamente uma sequência dentro do T-DNA inserido em EE-GM4 contígua com a referida região 5' ou 3' flanqueante, compreendendo a referida região flanqueante de T-DNA a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 227 ou de SEQ ID No. 24 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 1058, compreendendo a referida região flanqueante de TDNA 3' a sequência de nucleotídeos do complemento de SEQ ID No. 6 a partir do nucleotídeo 254 até ao nucleotídeo 501 ou a sequência de nucleotídeos do complemento de SEQ ID No. 25 a partir do nucleotídeo 254 até ao nucleotídeo 1339, compreendendo o referido T-DNA inserido a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 a partir do nucleotídeo 228 até ao nucleotídeo 398 ou a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 6 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 253 ou a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 11 a partir do nucleotídeo 17 até ao nucleotídeo 7621 ou de SEQ ID No. 23 a partir da posição de nucleotídeo 1059 até à posição de nucleotídeo 8663 ou o seu complemento.
18. Um iniciador compreendendo na sua extremidade 3' extrema a sequência de SEQ ID No. 12 ou a sequência de SEQ ID No. 13 ou a
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46/149 sequência de SEQ ID No. 20 ou a sequência de SEQ ID No. 21.
19. Um par de iniciadores compreendendo um primeiro iniciador compreendendo na sua extremidade 3' extrema a sequência de SEQ ID No. 12 e um segundo iniciador compreendendo na sua extremidade 3' extrema a sequência de SEQ ID No. 13 ou compreendendo um primeiro iniciador compreendendo na sua extremidade 3' extrema a sequência de SEQ ID No. 20 e um segundo iniciador compreendendo na sua extremidade 3' extrema a sequência de SEQ ID No. 21.
20. O método do parágrafo 1, método esse que compreende hibridação de um ácido nucleico de amostras biológicas com uma sonda específica de EE-GM4.
21. O método do parágrafo 20, em que a sequência da referida sonda específica tem pelo menos 80% de identidade de sequência com uma sequência compreendendo parte da sequência flanqueante de T-DNA 5' ou da sequência flanqueante de T-DNA 3' de EE-GM4 e a sequência do T-DNA inserido contíguo com ela.
22. O método do parágrafo 21, em que a sequência da referida sonda específica compreende uma sequência com pelo menos 80% de identidade de sequências com a sequência de qualquer um de SEQ ID No. 1,3 ou 5 ou a sequência de qualquer um de SEQ ID No. 2, 4 ou 6 ou o complemento das referidas sequências.
23. O método do parágrafo 22, em que a referida sonda compreende a sequência de qualquer um de SEQ ID No. 1 ou 3 ou a sequência de qualquer um de SEQ ID No. 2 ou 4.
24. Um estojo para identificação do evento de elite EE-GM4 em amostras biológicas, compreendendo o referido estojo uma sonda específica, capaz de hibridar especificamente com uma região específica de EE-GM4.
25. O estojo do parágrafo 24, em que a sequência da referida
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47/149 sonda específica tem pelo menos 80% de identidade de sequência com uma sequência compreendendo parte da sequência flanqueante de T-DNA 5' ou parte da sequência flanqueante de T-DNA 3' e parte do T-DNA inserido contíguo com ela em EE-GM4.
26. O estojo do parágrafo 25, em que a sequência da referida sonda específica compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% de identidade de sequências com qualquer um de SEQ ID No. 1,3 ou 5 ou qualquer um de SEQ ID No. 2, 4 ou 6 ou o complemento das referidas sequências.
27. Uma sonda específica para a identificação do evento de elite EE-GM4 em amostras biológicas.
28. A sonda do parágrafo 27, que compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com uma sequência compreendendo parte da sequência flanqueante de T-DNA 5' ou parte da sequência flanqueante de T-DNA 3' e parte do T-DNA inserido contíguo com ela em EE-GM4 ou o seu complemento.
29. A sonda do parágrafo 28, que tem pelo menos 80% de identidade de sequências com a sequência de qualquer um de SEQ ID No. 1,3 ou 5 ou a sequência de qualquer um de SEQ ID No. 2, 4 ou 6 ou o complemento das referidas sequências ou a referida sonda compreendendo a sequência de qualquer um de SEQ ID No. 1,3 ou 5 ou a sequência de qualquer um de SEQ ID No. 2, 4 ou 6.
30. Uma sonda específica compreendendo uma sequência de nucleotídeos sendo essencialmente a qualquer um de SEQ ID No. 1,3 ou 5 ou qualquer um de SEQ ID No. 2, 4 ou 6 ou ao complemento das referidas sequências.
31. Uma sonda específica compreendendo a sequência de SEQ ID No. 1 ou 3 ou a sequência de SEQ ID No. 2 ou 4.
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32. Método para confirmação da pureza de sementes, método esse que compreende detecção específica de EE-GM4 com um iniciador ou sonda específico que reconhece especificamente a região flanqueante de TDNA 5' ou 3' e o T-DNA contíguo com ela em EE-GM4, em amostras de sementes.
33. O método do parágrafo 32, compreendendo amplificação de um fragmento de DNA de entre 50 e 1000 pb a partir de um ácido nucleico presente nas referidas amostras biológicas usando uma reação em cadeia da polimerase com pelo menos dois iniciadores, reconhecendo um dos referidos iniciadores a região flanqueante de T-DNA 5' do T-DNA inserido em EE-GM4, compreendendo a referida região flanqueante de T-DNA 5' a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 a partir do nucleotideo 1 até ao nucleotideo 227 ou de SEQ ID No. 24 a partir do nucleotideo 1 até ao nucleotideo 1058 ou a região flanqueante de T-DNA 3' do T-DNA inserido em EE-GM4, compreendendo a referida região flanqueante de T-DNA 3' a sequência de nucleotídeos do complemento de SEQ ID No. 6 a partir do nucleotideo 254 até ao nucleotideo 501 ou a sequência de nucleotídeos do complemento de SEQ ID No. 25 a partir do nucleotideo 254 até ao nucleotideo 1339, reconhecendo o outro iniciador dos referidos iniciadores uma sequência dentro do T-DNA inserido compreendendo o complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 a partir do nucleotideo 228 até ao nucleotideo 398 ou da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 6 a partir do nucleotideo 1 até ao nucleotideo 253 ou da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 11 a partir do nucleotideo 17 até ao nucleotideo 7621 ou da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 23 a partir da posição de nucleotideo 1059 até à posição de nucleotideo 8663 ou o seu complemento e hibridação de uma sonda específica do fragmento de DNA amplificado com os referidos pelo menos dois iniciadores.
34. O método do parágrafo 33, compreendendo amplificação
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49/149 de um fragmento de DNA de 126 pb e em que os referidos iniciadores compreendem a sequência de SEQ ID No. 12 e SEQ ID No. 13, respectivamente, e em que a referida sonda compreende a sequência de SEQ ID No. 14 ou amplificação de um fragmento de DNA de 90 pb e em que os referidos iniciadores compreendem a sequência de SEQ ID No. 20 e SEQ ID No. 21, respectivamente, e em que a referida sonda compreende a sequência de SEQ ID No. 22.
35. Método para rastreamento de sementes quanto à presença de EE-GM4, método esse que compreende detecção específica de EEGM4 com um par de iniciadores ou sonda específico que reconhece(m) especificamente a região flanqueante de T-DNA 5' ou3'eo T-DNA contíguo com ela em EE-GM4, em amostras de lotes de sementes.
36. O método do parágrafo 35, compreendendo amplificação de um fragmento de DNA de entre 50 e 1000 pb a partir de um ácido nucleico presente nas referidas amostras biológicas usando uma reação em cadeia da polimerase com pelo menos dois iniciadores, reconhecendo um dos referidos iniciadores a região flanqueante de T-DNA 5' do T-DNA inserido em EE-GM4, compreendendo a referida região flanqueante de T-DNA 5' a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 227 ou de SEQ ID No. 24 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 1058 ou a região flanqueante de T-DNA 3' do T-DNA inserido em EE-GM4, compreendendo a referida região flanqueante de T-DNA 3' a sequência de nucleotídeos do complemento de SEQ ID No. 6 a partir do nucleotídeo 254 até ao nucleotídeo 501 ou a sequência de nucleotídeos do complemento de SEQ ID No. 25 a partir do nucleotídeo 254 até ao nucleotídeo 1339, reconhecendo o outro iniciador dos referidos iniciadores uma sequência dentro do T-DNA inserido compreendendo o complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 a partir do nucleotídeo 228 até ao nucleotídeo 398 ou da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 6 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 253
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50/149 ou compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 11 a partir do nucleotídeo 17 até ao nucleotídeo 7621 ou de SEQ ID No. 23 a partir da posição de nucleotídeo 1059 até à posição de nucleotídeo 8663 ou o seu complemento e hibridação de uma sonda específica do fragmento de DNA amplificado com os referidos pelo menos dois iniciadores, tal como uma sonda compreendendo a sequência de SEQ ID No. 1 ou 3 ou SEQ ID No. 2 ou 4 ou o seu complemento.
37. O método do parágrafo 36, compreendendo amplificação de um fragmento de DNA de 126 pb e em que os referidos iniciadores compreendem a sequência de SEQ ID No. 12 e SEQ ID No. 13, respectivamente, e em que a referida sonda compreende a sequência de SEQ ID No. 14.
38. Um método para determinação do estado de zigosidade de uma planta, material de planta ou semente compreendendo o evento de elite EE-GM4, compreendendo o referido método amplificação de fragmentos de DNA de entre 50 e 1000 pb a partir de um ácido nucleico presente nas referidas amostras biológicas usando uma reação em cadeia da polimerase com pelo menos três iniciadores, reconhecendo dois dos referidos iniciadores especificamente DNA de planta pré-inserção, tal como um iniciador compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 18 e um iniciador compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 13, reconhecendo o terceiro dos referidos iniciadores uma sequência dentro do T-DNA inserido, tal como a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 12, tal como usando o referido método os referidos iniciadores em que os fragmentos de DNA de 126 e 108 pb são amplificados.
39. Um método de detecção da presença do evento de elite EE-GM4 em amostras biológicas através de hibridação com uma sonda de ácido nucleico etiquetada substancialmente complementar na qual a razão sonda:ácido nucleico alvo é amplificada através de reciclagem da sequência de ácido nucleico alvo, compreendendo o referido método:
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a) hibridação da referida sequência de ácido nucleico alvo com um primeiro oligonucleotídeo de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 a partir da posição de nucleotídeos 228 até à posição de nucleotídeos 245 ou seu complemento ou referido primeiro oligonucleotídeo de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 6 a partir da posição de nucleotídeos 236 até à posição de nucleotídeos 253 ou seu complemento;
b) hibridação da referida sequência de ácido nucleico alvo com um segundo oligonucleotídeo de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 a partir do nucleotídeo 210 até ao nucleotídeo 227 ou seu complemento ou o referido oligonucleotídeo de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 6 a partir do nucleotídeo 254 até ao nucleotídeo 271 ou seu complemento, em que os referidos primeiro e segundo oligonucleotídeos se sobrepõem em pelo menos um nucleotídeo e em eu qualquer um dos referidos primeiro ou segundo oligonucleotídeos é etiquetado para ser a referida sonda de ácido nucleico etiquetada;
c) divagem somente da sonda etiquetada dentro do dúplex sonda:sequência de ácido nucleico alvo com uma enzima que causa divagem seletiva da sonda resultando em dissociação do dúplex, deixando a sequência de alvo intata;
d) reciclagem da sequência de ácido nucleico alvo por repetição dos passos (a) a (c); e
e) detecção da sonda etiquetada clivada, determinando deste modo a presença da referida sequência de ácido nucleico alvo, e detecção do evento de elite EE-GM4 nas referidas amostras biológicas.
40. Uma planta de soja transgênica, ou suas células, partes, semente ou descendência, compreendendo cada uma o evento de elite EE-GM4
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52/149 em seu genoma, tendo a semente de referência compreendendo o referido evento sido depositada na ATCC sob o número de depósito PTA-123624.
41. A planta, semente, células, partes ou descendência de soja transgênicas do parágrafo 40, o DNA genômico da qual, quando analisado usando PCR quanto a EE-GM4 com dois iniciadores compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID 12 e SEQ ID 13 respectivamente, origina um fragmento de DNA de 126 pb.
42. Semente compreendendo o evento de elite EE-GM4, que é um T-DNA inserido em uma posição específica no genoma da soja, como está contido na semente depositada na ATCC sob o número de depósito PTA-123624 ou em derivados a partir dela.
43. Uma planta, parte de planta, célula ou tecido ou semente de soja compreendendo o evento de elite EE-GM4 obtenível a partir da semente do parágrafo 42.
44. Uma planta de soja, ou sua semente, células ou tecidos, cada uma compreendendo o evento de elite EE-GM4 em seu genoma, obtenível por propagação de e/ou cruzamento com uma planta de soja cultivada a partir da semente depositada na ATCC sob o número de depósito PTA-123624.
45. Uma semente de soja compreendendo o evento de elite EE-GM4, tendo sido a semente de referência compreendendo o referido evento depositada na ATCC sob o número de depósito PTA-123624.
46. Uma planta, célula ou tecido de soja transgênico, compreendendo o evento de elite EE-GM4 obtenível a partir da semente do parágrafo 45.
47. A célula de planta de soja de acordo com qualquer um dos parágrafos 40, 41,43, 44 e 46, que é uma célula de planta não autopropagante.
48. Um método para produção de uma planta ou semente de soja compreendendo o evento de elite EE-GM4 compreendendo cruzamento de
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53/149 uma planta de acordo com qualquer um dos parágrafos 40, 41,43, 44 e 46 com outra planta de soja e plantio da semente obtida a partir do referido cruzamento.
49. DNA genômico de soja compreendendo o evento de elite EE-GM4.
50. Uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos essencialmente similar à sequência de qualquer um de SEQ ID No. 1,3 ou 5 ou à sequência de qualquer um de SEQ ID No. 2, 4 ou 6, ou ao complemento das referidas sequências, tal como uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 99% ou pelo menos 99,5% de identidade de sequência com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 ou 6, ou o seu complemento, tal como a referida molécula de ácido nucleico que confere tolerância a um herbicida inibidor de HPPD e/ou resistência a SCN na soja.
51. A molécula de ácido nucleico do parágrafo 50 compreendendo a sequência de nucleotídeos de qualquer um de SEQ ID No. 1 ou 3 ou SEQ ID No. 2 ou 4, ou o complemento das referidas sequências, tal como tal molécula de ácido nucleico que também compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 7 e 9 ou uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 98% de identidade de sequências com ela, ou o seu complemento, ou tal molécula de ácido nucleico que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 11 a partir da posição de nucleotídeo 188 até à posição de nucleotídeo 7368 ou uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 98% de identidade de sequências com ela.
52. Uma planta de soja, sua célula, parte de planta, semente ou descendência compreendendo uma molécula de ácido nucleico de qualquer um destes parágrafos, tal como uma planta de soja, sua célula, parte de planta, semente ou descendência compreendendo uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 1, 3 ou 5 ou a
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54/149 sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 2, 4 ou 6 ou uma planta de soja, sua célula, parte de planta, semente ou descendência, compreendendo em seu genoma a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 3 e a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 4 ou uma planta de soja, sua célula, parte de planta, semente ou descendência, compreendendo em seu genoma a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 e a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 6 ou uma planta de soja, sua célula, parte de planta, semente ou descendência, compreendendo em seu genoma a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 24 e a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 25, tal como uma tal planta de soja compreendendo também um gene quimérico codificando Cry14Ab-1 e um quimérico codificando HPPD-4, particularmente tais genes quiméricos compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 7 e 9, respectivamente.
53. Uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeos de qualquer um de SEQ ID No. 1,3 ou 5 ou SEQ ID No. 2, 4 ou 6, tal como uma molécula de ácido nucleico, que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 e SEQ ID No. 6, ou o seu complemento, ou tal como uma molécula de ácido nucleico, que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 24 e SEQ ID No. 25 ou o seu complemento.
54. Uma planta, célula de planta, tecido ou semente de soja transgênico, compreendendo em seu genoma o evento EE-GM4 caracterizado por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos essencialmente similar à sequência de qualquer um de SEQ ID No. 1,3, 5 ou 24 ou à sequência de qualquer um de SEQ ID No. 2, 4 6 ou 25, ou ao complemento das referidas sequências, em que a referida planta de soja compreende também gene quimérico codificando Cry14Ab-1 e um quimérico codificando HPPD-4.
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55. Uma planta, célula, tecido ou semente de soja, compreendendo EE-GM4 e compreendendo no genoma das suas células uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 80%, 90%, 95% ou 100% de identidade de sequências com uma sequência de qualquer um de SEQ ID No. 1, 3 ou 5 ou uma sequência de qualquer um de SEQ ID No. 2, 4 ou 6, ou o complemento das referidas sequências, tal como uma planta de soja compreendendo também um gene quimérico codificando Cry14Ab-1 e um quimérico codificando HPPD-4 ou tal planta, célula, tecido ou semente de soja, compreendendo no genoma das suas células uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 80%, 90%, 95% ou 100% de identidade de sequências com a sequência de SEQ ID No. 24 ou SEQ ID No. 25.
56. Uma planta, célula de planta, tecido ou semente de soja, compreendendo em seu genoma uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 99% de identidade de sequências com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 ou 24 ou 6 ou 25, ou o seu complemento, ou tal planta, célula de planta, tecido ou semente de soja, compreendendo em seu genoma uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 99% de identidade de sequências com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 ou 24 e SEQ ID No. 6 ou 25 ou o seu complemento.
57. Uma planta, célula de planta, tecido ou semente de soja, compreendendo em seu genoma uma molécula de ácido nucleico hibridando sob condições de estringência padrão com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 ou 6 ou o seu complemento.
58. Uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 99% de identidade de sequências com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 ou 6, ou o seu complemento, tal como uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de
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56/149 nucleotídeos com pelo menos 99% de identidade de sequências com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 ou 24 e SEQ ID No. 6 ou 25 ou o seu complemento.
59. Molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos hibridando sob condições de estringência padrão com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 ou 6 ou o seu complemento.
60. A molécula de ácido nucleico de qualquer um dos parágrafos 50, 51, 58 e 59, que também compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 7 ou 9.
61. Um DNA quimérico compreendendo uma região flanqueante 5' de T-DNA, um T-DNA inserido e uma região flanqueante 3' de T-DNA, em que a sequência do referido T-DNA compreende a sequência de SEQ ID No. 11 a partir do nucleotídeo 188 até ao nucleotídeo 7368 ou uma sequência pelo menos 95, 96, 97, 98, 99 ou pelo menos 99,5% idêntica a ela ou em que a sequência do referido T-DNA inserido compreende a sequência de SEQ ID No. 7 e 9 e em que a referida região flanqueante 5' de T-DNA está localizada imediatamente a montante do e contígua com o referido T-DNA inserido e compreende a sequência de SEQ ID No. 5 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 227 ou uma sequência pelo menos 95, 96, 97, 98, 99 ou pelo menos 99,5% idêntica a ela ou de SEQ ID No. 24 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 1058 ou uma sequência pelo menos 95, 96, 97, 98, 99 ou pelo menos 99,5% idêntica a ela e em que a referida região flanqueante 3' de T-DNA está localizada imediatamente a jusante do e contígua com o referido T-DNA inserido e compreende a sequência de SEQ ID No. 6 a partir do nucleotídeo 254 até ao nucleotídeo 501 ou uma sequência pelo menos 95, 96, 97, 98, 99 ou pelo menos 99,5% idêntica a ela ou a sequência de nucleotídeos do complemento de SEQ ID No. 25 a partir do nucleotídeo 254 até ao nucleotídeo 1339 ou uma sequência pelo menos 95, 96, 97, 98, 99 ou pelo menos 99,5% idêntica a ela.
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62. Uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 98% de identidade de sequências com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 7 ou o seu complemento, tal como a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 7, tal como uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 11 a partir do nucleotídeo 131 até 5276 ou o seu complemento ou uma sequência codificando uma proteína Cry14Ab nematicida tendo pelo menos 95, 96, 97, 98 ou pelo menos 99% de identidade de sequências com SEQ ID No. 7 ou com a sequência de SEQ ID No. 11 a partir da posição de nucleotídeo 131 até à posição de nucleotídeo 5276 ou o seu complemento.
63. Uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 98% de identidade de sequências com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 9 ou o seu complemento, tal como a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 9, tal como uma molécula de DNA compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 11 a partir do nucleotídeo 5382 até 7621 ou o seu complemento ou uma sequência tendo pelo menos 95, 96, 97, 98 ou pelo menos 99% de identidade de sequências com SEQ ID No. 9 ou com a sequência de SEQ ID No. 11 a partir da posição de nucleotídeo 5382 até à posição de nucleotídeo 7621 ou o seu complemento, em que a referida sequência codifica uma proteína HPPD proporcionando tolerância a herbicidas inibidores de HPPD quando expressa em uma planta.
64. Um método de produção de um produto de soja, compreendendo obtenção de semente de soja compreendendo o evento de elite EE-GM4 como descrito acima e produção do produto de soja a partir dela.
65. O método do parágrafo 64, em que o produto de soja é ou compreende farelo, sementes trituradas, farinha ou flocos de soja.
66. O método do parágrafo 4 ou 65, em que tal produto de soja compreende um ácido nucleico específico do evento de elite EE-GM4, tal como
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58/149 tal produto que compreende um ácido nucleico que produz um diagnóstico de amplicon ou específico do evento EE-GM4, tal como a sequência de SEQ ID No. 1 ou 3 ou a sequência de SEQ ID No. 2 ou 4.
67. Um produto de soja, compreendendo o evento de elite EE-GM4 como descrito acima, tal como um produto de soja produzido a partir da planta, célula, parte, semente ou descendência de soja de qualquer um destes parágrafos.
68. O produto de soja do parágrafo 67, em que o produto de soja é ou compreende farelo, sementes trituradas, farinha ou flocos de soja.
69. O produto de soja do parágrafo 67 ou 68, em que o referido produto de soja compreende um ácido nucleico específico do evento de elite EEGM4, tal como tal produto que compreende um ácido nucleico que produz um diagnóstico de amplicon ou específico do evento EE-GM4, tal como a sequência de SEQ ID No. 1 ou 3 ou a sequência de SEQ ID No. 2 ou 4 ou seu complemento.
70. Um método para proteção de plantas de soja emergentes da competição por ervas daninhas, compreendendo tratamento de um campo no qual sementes contendo o evento de elite EE-GM4 como descrito em qualquer um destes parágrafos foram semeadas, com um herbicida inibidor de HPPD, em que as plantas são tolerantes ao herbicida inibidor de HPPD.
71. Um método para proteção de plantas de soja emergentes da competição por ervas daninhas, compreendendo tratamento de um campo a ser plantado com plantas de soja compreendendo o evento de elite EE-GM4 como descrito acima com um herbicida inibidor de HPPD, antes de as plantas de soja serem plantadas ou as sementes serem semeadas, seguido por plantio ou semeadura das referidas plantas ou sementes de soja no referido campo prétratado, em que as plantas são tolerantes ao herbicida inibidor de HPPD.
72. Um método para controle de ervas daninhas em um campo de plantas de soja compreendendo o evento de elite EE-GM4 como descrito acima,
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59/149 compreendendo tratamento do referido campo com uma quantidade eficaz de um herbicida inibidor de HPPD, em que as plantas são tolerantes ao herbicida inibidor de HPPD.
73. O método de qualquer um dos parágrafos 70 a 72, em que o herbicida inibidor de HPPD é isoxaflutol, topramezona ou mesotriona.
74. Uso de uma planta de soja transgênica, sua semente ou descendência, compreendendo o evento de elite EE-GM4 como descrito acima para produzir grão ou semente de soja.
75. Uso de uma planta ou semente de soja compreendendo o evento de elite EE-GM4 como descrito acima em seu genoma para cultivar uma planta resistente a nematódeos e/ou tolerante a herbicidas inibidores de HPPD.
76. Uso de uma semente de soja compreendendo o evento de elite EE-GM4 para se obter um produto de soja, em que EE-GM4 é como descrito acima, tal como em que tal produto de soja é ou compreende grão de soja triturado, farinha de soja, farelo de soja ou flocos de soja.
77. Uso de uma planta ou semente de soja compreendendo o evento de elite EE-GM4 como definido acima, em combinação com um herbicida inibidor de HPPD, para cultivo de um campo de soja ou para cultivo de uma cultura de soja.
78. Uma molécula de ácido nucleico obtenível a partir da semente depositada na ATCC sob o número de acesso PTA-123624, em que a referida molécula de ácido nucleico compreende a sequência de nucleotídeos de qualquer um de SEQ ID No. 1,3 ou 5 e a sequência de nucleotídeos de qualquer um de SEQ ID No. 2, 4 ou 6.
79. Uma planta, célula, parte de planta ou semente de soja, compreendendo cada uma em seu genoma o evento de elite EE-GM4, em que o referido evento de elite é o lócus genético compreendendo um T-DNA inserido contendo um gene codificando a proteína HPPD-4 quimérico e um gene
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60/149 codificando a proteína Cry14Ab-1 quimérico e sequências flanqueantes 5' e 3' imediatamente rodeando o referido T-DNA inserido, como encontrado na semente de referência depositada na ATCC sob o número de depósito PTA123624.
80. Uma planta de descendência, célula, parte de planta ou semente da planta, célula, parte de planta ou semente do parágrafo 79, em que a referida planta de descendência, célula, parte de planta ou semente compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 3 e a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 4.
81. A planta, célula, parte, semente ou descendência de soja do parágrafo 79, o DNA genômico da qual, quando analisado usando PCR com dois iniciadores compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 12 e SEQ ID No. 13 respectivamente, origina um fragmento de DNA de 126 pb.
82. A planta de qualquer um dos parágrafos acima que é tolerante a isoxaflutol e/ou topramezona e/ou mesotriona, tal como uma tal planta tolerante a isoxaflutol, topramezona e mesotriona.
83. Um método para produção de uma planta de soja resistente a SCN e tolerante a herbicidas inibidores de HPPD, compreendendo introdução de resistência a SCN e tolerância a herbicidas inibidores de HPPD no genoma de uma planta de soja por cruzamento de uma primeira planta de soja não tendo um gene codificando Cry14Ab-1 e não tendo um gene codificando HPPD-4 com a planta de soja de qualquer um dos parágrafos acima e seleção de uma planta de descendência resistente a SCN e tolerante a herbicidas inibidores de HPPD.
84. Uso de uma planta ou semente de soja compreendendo o evento de elite EE-GM4 como definido acima para se obter uma cultura de soja, tal como uma cultura de soja produzindo melhor quando infestada por nematódeos ou Síndrome da Morte Súbita.
85. Um método de produção de uma cultura de soja com resistência
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61/149 melhorada a nematódeos ou Síndrome da Morte Súbita, compreendendo os passos (a) plantio de um campo usando a semente como descrita em qualquer um dos parágrafos acima; e (b) coleta da semente de soja produzida nas plantas cultivadas a partir da referida semente e, opcionalmente, (c) aplicação ao campo plantado com as referidas sementes antes ou após emergência das sementes ou às referidas plantas de soja de uma ou mais doses de um herbicida inibidor de HPPD suficiente para matar ervas daninhas mas que seja tolerado pelas referidas sementes ou plantas de soja, tal como em que os referidos nematódeos são nematódeos de espécies de SCN ou espécies de Pratylenchus ou nematódeo dos nódulos radiculares ou nematódeos reniformes.
86. Uso da semente de soja descrita nos parágrafos acima para preparar um alimento ou contendo o evento de ração processado, em que o referido alimento ou gênero de ração processado compreende uma quantidade detectável de um ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 1 e/ou SEQ ID NO: 2 ou o seu complemento.
87. O uso do parágrafo 86, em que (i) o referido alimento ou o referido gênero de ração compreende farelo de soja, farinha de soja, flocos de soja ou óleo de soja; (ii) o referido ácido nucleico compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3 e/ou SEQ ID NO: 4 ou o seu complemento; ou (iii) o referido ácido nucleico compreende adicionalmente a sequência de nucleotídeos contida em SEQ ID NO: 7 e SEQ ID No. 9.
88. Uma planta, semente ou célula de soja compreendendo em seu genoma o evento de elite EE-GM4, em que o evento de elite EE-GM4 compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica à sequência apresentada em SEQ ID NO. 23, em que o referido evento de elite compreende um gene codificando HPPD-4 quimérico e um gene codificando Cry14Ab-1 quimérico, em que a referida planta, semente ou célula é tolerante a um herbicida inibidor de HPPD e tem resistência a SCN.
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89. A planta do parágrafo 88, em que o evento de elite EE-GM4 compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica à sequência apresentada em SEQ ID NO. 23.
90. A planta do parágrafo 88, em que o evento de elite EE-GM4 compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 99% idêntica à sequência apresentada em SEQ ID NO. 23.
91. Uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO. 23 ou uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 99% de identidade de sequências com SEQ ID NO. 23, que confere tolerância a um herbicida inibidor de HPPD e/ou resistência a nematódeos, tal como em que o referido nematódeo é um nematódeo de espécies de SCN ou espécies de Pratylenchus ou nematódeo dos nódulos radiculares ou nematódeos reniformes.
92. Uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 11 a partir da posição de nucleotídeo 131 até à posição de nucleotídeo 7941 ou uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com ela.
93. A molécula de ácido nucleico do parágrafo 92, que codifica uma proteína HPPD tolerante a um inibidor de HPPD e uma proteína negativamente afetando nematódeos de pragas de plantas, tais como SCN, RKN ou nematódeos de Pratylenchus spp..
94. Molécula de ácido nucleico do parágrafo 93, que codifica a proteína de SEQ ID No. 8 ou uma proteína pelo menos 99% idêntica a ela e a proteína de SEQ ID No. 10 ou uma proteína pelo menos 99% idêntica a ela.
95. Um método para controle de ervas daninhas e/ou nematódeos em um campo a ser plantado com plantas de soja, compreendendo os passos de: 1) tratamento do referido campo com um herbicida inibidor de HPPD tal como
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63/149 isoxaflutol, topramezona ou mesotriona e 2) plantio ou semeadura de plantas ou sementes de soja compreendendo evento de transformação de elite EE-GM4 como descrito acima no referido campo tratado, em que a semente de referência compreendendo o referido evento de elite está depositada na ATCC sob o número de depósito PTA-123624.
96. Um método de controle de ervas daninhas, caracterizado pelo fato de que compreende os passos de: 1) plantio de plantas ou sementes de soja tolerantes a um herbicida inibidor de HPPD tal como isoxaflutol, topramezona ou mesotriona, em um campo e 2) aplicação de um herbicida inibidor de HPPD, tal como isoxaflutol, topramezona ou mesotriona, ao referido campo antes do plantio das referidas plantas ou sementes ou às referidas plantas ou sementes de soja após plantio (pode ser antes de ou após germinação de sementes), em que as referidas plantas ou sementes compreendem evento de transformação de elite da soja EE-GM4 em seu genoma, estando a semente de referência compreendendo o referido evento de elite depositada na ATCC sob o número de depósito PTA-123624.
97. Um processo para controle de ervas daninhas, caracterizado pelo fato de que compreende os passos de: 1) tratamento de um campo a ser plantado com plantas de soja ou um campo a ser semeado com sementes de soja com um herbicida inibidor de HPPD, tal como isoxaflutol, topramezona ou mesotriona, antes de as plantas de soja serem plantadas ou as sementes serem semeadas, e 2) plantio de plantas de soja compreendendo evento de transformação de elite da soja EE-GM4 ou semeadura de sementes de soja compreendendo o evento de transformação de elite da soja EE-GM4 no referido campo pré-tratado, em que a semente de referência compreendendo o referido evento de transformação de elite da soja EE-GM4 está depositada na ATCC sob o número de depósito PTA-123624.
98. Um método para redução da perda de rendimento em um
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64/149 campo a ser plantado com plantas de soja, particularmente um campo que contém ou é esperado que contenha nematódeos tais como SCN, RKN ou Pratylenchus ou nematódeos reniformes ou uma sua combinação, compreendendo o passo de 1) obtenção de plantas ou semente compreendendo evento de transformação de elite EE-GM4 como descrito acima e 2) plantio ou semeadura de plantas ou sementes de soja, em que a semente de referência compreendendo o referido evento de elite está depositada na ATCC sob o número de depósito PTA-123624.
99. Um método para aumento do rendimento de plantas de soja quando plantadas em um campo contendo nematódeos tais como SCN, RKN ou Pratylenchus ou nematódeos reniformes ou uma sua combinação, compreendendo o passo de 1) obtenção de plantas ou semente compreendendo evento de transformação de elite EE-GM4 como descrito acima e 2) plantio ou semeadura de plantas ou sementes de soja, em que a semente de referência compreendendo o referido evento de elite está depositada na ATCC sob o número de depósito PTA-123624.
100. Um método para produção de uma planta ou semente de soja tolerante a um herbicida inibidor de HPPD, tal como isoxaflutol, topramezona ou mesotriona, ou para produção de uma planta ou semente de soja tolerante a nematódeos, tais como SCN, RKN ou Pratylenchus ou nematódeos reniformes, ou para produção de uma planta ou semente de soja tolerante a um herbicida inibidor de HPPD, tal como isoxaflutol, topramezona ou mesotriona, e tolerante a nematódeos, tais como SCN, RKN ou Pratylenchus ou nematódeos reniformes, caracterizado pelo passo de introdução no genoma de uma planta ou semente de soja do evento de transformação de elite da soja EE-GM4 como descrito acima e, opcionalmente, tratamento da referida planta ou semente com um herbicida inibidor de HPPD, tal como isoxaflutol, topramezona ou mesotriona ou, opcionalmente, tratamento do campo no qual a referida planta ou semente será
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65/149 plantada com um herbicida inibidor de HPPD, tal como isoxaflutol, topramezona ou mesotriona, e plantio da referida planta ou semente no referido campo prétratado.
101. Uma molécula de ácido nucleico que caracteriza especificamente o evento de transformação de elite da soja EE-GM4, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeos de qualquer um de SEQ ID No. 1,3 ou 5, que contém uma parte de DNA genômico da planta de soja e uma parte de DNA estranho inserido de EE-GM4 a jusante do mesmo e contíguo com ele e/ou caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeos de qualquer um de SEQ ID No. 2, 4 ou 6, que contém uma parte de DNA estranho inserido de EE-GM4 e uma parte de DNA genômico da planta de soja a jusante do mesmo e contíguo com ele.
102. Uma planta ou semente compreendendo EE-GM4 como descrito acima e compreendendo também tolerância ou resistência a SON, RKN ou nematódeos de Pratylenchus ou reniformes, ou uma sua combinação, como proporcionada por toc/7genes de resistência da soja.
103. A planta ou semente do parágrafo 102, em que a referida planta ou semente compreende EE-GM4 e qualquer um ou uma combinação dos alelos/toc/de resistência a SCN de PI 548316, PI 567305, PI 437654, PI 90763, PI 404198B, PI 88788, PI 468916, PI 567516C, PI 209332, PI 438489B, PI 89772, Peking, PI 548402, PI 404198A, PI 561389B, PI 629013, PI 507471, PI 633736, PI 507354, PI 404166, PI 437655, PI 467312, PI 567328, PI 22897 ou PI 494182.
104. Uma planta ou semente compreendendo EE-GM4 como descrito acima, compreendendo também tolerância a outros herbicidas, como proporcionada por genes de tolerância a herbicidas (genes ou transgenes da soja nativos ou mutados), tal como tolerância a herbicidas à base de glifosato, glufosinato, sulfonilureia, imidazolinona, inibidores de HPPD, dicamba, 2,4-D ou
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66/149 inibidores de PPO ou qualquer sua combinação.
105. A planta ou semente do parágrafo 103 em que a referida planta ou semente compreende EE-GM4 como descrito acima e uma ou mais dos seguintes eventos de transformação de soja conferindo tolerância a herbicidas: MST-FG072-3, SYN-000H2-5, DAS-68416-4, DAS-44406-6, MON-87708-9, MON89788, MON-04032-6, ACS-GM005-3, BPS-CV127-9, ACS-GM006-4, MON-87705-6 ou evento DP-305423-1.
106. Um método para reduzir a gravidade de efeitos da Síndrome da Morte Súbita ou Cloro em Deficiência em Ferro em plantas de soja na presença de infestação por SCN ou para aumentar o rendimento de plantas de soja em campos contendo SCN infestados por Síndrome da Morte Súbita ou em campos contendo SCN causando Clorose com Deficiência em Ferro na soja, método esse que compreende plantio de plantas de soja ou semeadura de sementes de soja compreendendo o evento de elite EE-GM4, em que a semente de referência compreendendo o referido evento de elite está depositada na ATCC sob o número de depósito PTA-123624.
Breve Descrição dos Desenhos [0067] Os seguintes Exemplos, não destinados a limitar a invenção às modalidades específicas descritas, podem ser entendidos em conjunção com as Figuras acompanhantes, incorporadas aqui por referência, nas quais:
Figura 1: Representação esquemática da relação entre as sequências de nucleotídeos e iniciadores citados. Barra preta: T-DNA inserido; barra pontilhada: DNA flanqueando o T-DNA. Setas pretas: iniciadores de oligonucleotídeo, seta quadriculada (a): gene cry14Ab-1.b quimérico (ver Tabela 1 para composição do gene quimérico); seta pontilhada (b): gene hppdPf4Pa quimérico (ver Tabela 1 para composição do gene quimérico); setas pretas: iniciadores de oligonucleotídeos; (c) se refere ao complemento da sequência de
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67/149 nucleotídeos indicada; linha preta: sondas de oligonucleotídeo (o número em baixo é o SEQ ID No. representativo). Os números em baixo das barras representando SEQ ID No. 5 e 6 são as posições de nucleotídeos dos diferentes elementos nas referidas sequências. Nota: o esquema não está desenhado à escala.
Figura 2: Método de ponto final para análise da identidade de EE-GM4.
[0068] A Figura 2 mostra um exemplo do resultado do método descrito no Exemplo 2.1 para uma série de amostras de soja contendo EE-GM4 e amostras de soja convencional. Para cada amostra, as razões S/B para ambas a reação específica de EE-GM4 e a reação endógena são exibidas. Em esta figura, as amostras marcadas “1-15” são amostras de soja contendo EE-GM4, as amostras marcadas “WT” são amostras de soja de tipo selvagem (não contendo EE-GM4) e as amostras marcadas “NTC” são os Controles Sem Molde. As barras verticais (brancas) marcadas com “a” mostram o sinal obtido para o evento EE-GM4, as barras verticais (escuras) marcadas com “b” mostram o sinal obtido para o gene de soja endógeno. A linha horizontal marcada com “1” é a razão entre Sinal e Fundo mínima para detectar o evento EE-GM4, a linha horizontal marcada com “2” é a razão entre Sinal e Fundo mínima para detectar a sequência de soja endógena, a linha horizontal marcada com “3” é a razão entre Sinal e Fundo mínima para amostra não alvo (sem DNA) (fluorescência de fundo).
Figura 3: Método de ponto final para identidade de EE-GM4 e zigosidade.
[0069] A Figura 3 mostra um exemplo do resultado do método descrito no Exemplo 2.2 para uma série de amostras de soja contendo EE-GM4 em um estado homozigoto, amostras de soja contendo EE-GM4 em um estado hemizigoto e amostras de soja convencional. Em esta figura:
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- Amostras dentro das linhas marcadas com “a”: amostras de soja contendo EE-GM4 em um estado homozigoto.
- Amostras dentro das linhas marcadas com “b”: amostras de soja contendo EE-GM4 em um estado hemizigoto
- Amostras dentro das linhas marcadas com “c”: amostras de soja não contendo EE-GM4
- Amostras dentro da caixa formada pelas linhas marcadas com “d”: amostras inconclusivas
Figura 4: Método de PCR em Tempo Real para análise da Presença a Baixo Nível de EE-GM4 [0070] A Figura 4 mostra um exemplo dos resultados do método de RT-PCR descrito no Exemplo 2.3 para análise da presença a baixo nível como realizada nas amostras de calibração. “a”, “b”, “c, “d”, “e” indicam os valores de Ct para as amostras de calibração “A”, “B”, “C”, “D”, Έ”, respectivamente. As amostras de calibração “A”, “B”, “C”, “D”, Έ” têm quantidades decrescentes de DNA de EE-GM4.
Figura 5: Resultados fito máx médios para tratamentos com herbicidas [0071 ] A Figura 5 mostra a média de dados de fitotoxicidade em planta máximos registrados para tratamento com herbicidas em vários ensaios de campo ao longo de 2 anos, para plantas de soja contendo o evento EE-GM4 em comparação com plantas de soja não transformadas/convencionais (Thorne). Os números entre ( ) em baixo de um tratamento dão o número de ensaios incluídos na barra, o número no topo de cada barra dá o valor de fitotoxicidade máxima médio para esse tratamento. Os tratamentos aplicados foram: IFT = isoxaflutol, MST = mesotriona, PE = pré-emergência, PO= pós-emergência (na etapa V2-V3, com adjuvantes concentrado de óleo de cultura e sulfato de amônio adicionados para aumentar a atividade de herbicidas). As taxas mostradas são
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69/149 em grama de ingrediente ativo/hectare (4x dose em pré-emergência, 2x dose em pós-emergência).
Figura 6. Rendimento de grãos de EE-GM4 em Thorne em campos infestados por SCN.
[0072] O EE-GM4 em fundo transformante original (Thorne) foi testado em 9 localizações diferentes ao longo de Iowa, Illinois, Indiana, Missouri e Tennessee em 2015 e 2016, em campos infestados por SCN (variando de infestação por SCN baixa a elevada). O ponto é o rendimento estimado do evento homozigoto para cada ensaio (como percentagem de diferença em relação ao nulo), as linhas horizontais representam os limites de confiança de 95% do contraste entre o evento homozigoto e o segregante nulo (se a linha não se sobrepor com a linha vertical aos 100 por cento de rendimento de segregante nulo, então o evento era significativamente diferente do segregante nulo). “Ao longo de Locs” é o rendimento estimado de uma análise combinada ao longo de todas as 9 localizações.
Figura 7. Rendimento de grãos de EE-GM4 em fundo suscetível de elite em campos infestados por SCN.
[0073] O EE-GM4 foi introgressado (BC2F3) em uma linha de MG I (grupo de maturidade I) de elite que é suscetível a SCN e foi testado em uma localização no Minnesota e uma localização no Dakota do norte em 2016 (cada uma com um elevado nível de infestação por SCN). O ponto é o rendimento estimado do evento homozigoto para cada ensaio (como percentagem de diferença em relação ao nulo), a linha horizontal em torno do ponto representa os limites de confiança de 95% do contraste entre o evento homozigoto e o segregado nulo (se a linha não se sobrepor com a linha vertical a 100 por cento de segregado nulo (/.e., sem diferença), então o evento era significativamente diferente do segregado nulo). “Ao longo de Locs” é o
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70/149 rendimento estimado de uma análise combinada ao longo de ambas as localizações.
Figura 8. Ensaio de estufa de resistência a Pratylenchus nos EUA [0074] As plantas de soja de elite com EE-GM4 controlam Pratylenchus brachyurus em ensaios de estufa nos EUA. As plantas com EEGM4 (“EE-GM4”) foram comparadas com outras linhas de soja de elite: uma linha de Grupo de Maturidade (MG)3 suscetível a SCN (“THORNE”), uma linha suscetível a SON MG3, uma linha suscetível a SCN MG 6.2 e uma linha suscetível a SCN MG9 (“Susc WT” mostra a média para estas 3 linhas), uma linha resistente a SCN MG3 (com o alelo de resistência rhg1 de PI88788, “SCN Res (PI88788)”) e uma linha resistente a SCN MG 6.2 com a resistência a SCN de rhg1 e Rhg4 de Peking (“SCN Res (Peking)”). Estão representados graficamente números médios de Pratylenchus em raízes 30 dias após infestação (5 plantas por entrada), mostrando também a variação observada ao longo de variedades (como tipicamente visto em ensaios de estufa). Os resultados mostram -85% de controle de Pratylenchus ao longo de linhas EEGM4. As linhas de soja com resistência a SCN nativa (de Peking ou PI88788) não controlam Pratylenchus brachyurus.
Figura 9. Ensaio de estufa de resistência a Pratylenchus no Brasil [0075] As plantas de soja com EE-GM4 (“EE-GM4”) reduzem significativamente Pratylenchus brachyurus em raízes de soja. Pratylenchus brachyurus foram isolados a partir de campos locais no Brasil. As plantas EEGM4 (em duas linhas de elite dos EUA diferentes (ambas grupo de maturidade 6.2, uma suscetível a SCN e uma com resistência a SCN Peking (“EE-GM4”)) e cinco linhas de soja brasileiras, com controle limitado de Pratylenchus (“linhas do Brasil”), uma linha brasileira, etiquetada como baixo Rf (fator reprodutor) para
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Pratylenchus (BRS 7380 (baixo Rf)”), uma linha de elite dos EUA (grupo de maturidade 6.2) que é suscetível a SCN (“SON Susc”) e uma linha de elite dos EUA de MG 6.2 com resistência a SCN Peking (“SCN Res (Peking)”) foram avaliadas quanto ao controle de Pratylenchus em um ensaio de estufa no Brasil. Estão representadas graficamente as médias dessas entradas, mostrando também a variação observada ao longo de variedades (como tipicamente visto em ensaios de estufa). Uma linha de soja brasileira (BRS 7380) mostrou - 89% de redução de Pratylenchus. As linhas EE-GM4 deram -79% de controle de Pratylenchus. As linhas de soja que transportam resistência nativa Peking a SCN não controlam Pratylenchus brachyurus.
Figura 10. Pontuações da Clorose com Deficiência em Ferro (IDC) para plantas EE-GM4 em comparação com nulos [0076] A Figura 10 mostra as pontuações de IDC de plantas de soja com EE-GM4 em uma localização (com elevada infestação por SCN). O ensaio foi um desenho em lotes subdivididos (4 lotes por entrada) olhando para o efeito do evento em 3 fundos diferentes (2 linhas de soja suscetíveis e 1 com resistência a SCN de PI88788). São mostradas as médias de pontuações de IDC para plantas com p evento EE-GM4 (“EE-GM4”) e o segregante nulo correspondente (“Nulo”, não tendo EE-GM4) ao longo de três fundos genéticos (1 resistente a SCN, 1 suscetível a SCN e o fundo Thorne suscetível a SCN). Uma barra representa 12 lotes totais. As linhas verticais indicam o erro padrão (“SEM” é o Erro Padrão da Média).
Descrição Detalhada das Modalidades Preferenciais da Invenção [0077] Em esta invenção, EE-GM4 foi identificado como um evento de elite a partir de uma população de plantas de soja transgênicas no desenvolvimento de soja (Glycine max) resistente a nematódeos compreendendo um gene codificando tolerância ao inibidor de 4-hidróxi
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72/149 fenilpiruvato dioxigenase (HPPD) combinado com urn gene conferindo resistência a nematódeos, cada um sob controle de um promotor expressível em plantas. Ferramentas específicas para uso na identificação do evento de elite EE-GM4 em amostras biológicas são descritas aqui.
[0078] A incorporação de uma molécula de DNA recombinante no genoma da planta resulta tipicamente de transformação de uma célula ou tecido. O local de incorporação particular é usualmente devido a integração aleatória.
[0079] O DNA introduzido no genoma da planta como resultado de transformação de uma célula ou tecido de planta com um DNA recombinante ou “DNA transform ante” e tendo origem em tal DNA transformante é doravante referido como “T-DNA inserido” compreendendo um ou mais transgenes”. Os transgenes de EE-GM4 são os genes de resistência a nematódeos e tolerância a herbicidas inibidores de HPPD. “DNA de planta” no contexto da presente invenção se referirá a DNA tendo origem na planta que é transformada. O DNA de planta será usualmente encontrado no mesmo lócus genético na planta de tipo selvagem correspondente. O T-DNA inserido pode ser caracterizado pela localização e pela configuração no local de incorporação da molécula de DNA recombinante no genoma de planta. O local no genoma de planta onde um DNA recombinante foi inserido é também referido como o “local de inserção” ou “local alvo”. A inserção do DNA recombinante na região do genoma de planta referido como “DNA de planta pré-inserção” (também chamado “lócus pré-inserção” aqui) pode estar associada a uma deleção de DNA de planta, referida como “deleção no local alvo”. Uma “região flanqueante” ou “sequência flanqueante” como usada aqui se refere a uma sequência de pelo menos 10 pb, pelo menos 20 pb, pelo menos 50 pb e até 5000 pb de DNA diferente do T-DNA introduzido, preferencialmente DNA do genoma de planta que está localizado imediatamente a montante do e contíguo com ou imediatamente a jusante do e contíguo com o
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T-DNA inserido. Os procedimentos de transformação levando à integração aleatória do T-DNA inserido resultará em transformantes com diferentes regiões flanqueantes, que são características e únicas para cada transformante. Quando o DNA recombinante é introduzido em uma planta através de cruzamento tradicional, seu local de inserção no genoma de planta, ou suas regiões flanqueantes, não será geralmente mudado.
[0080] Um “ácido nucleico (sequência/molécula) isolado” ou “DNA (sequência/molécula) isolado”, como usado aqui, se refere a um ácido nucleico ou DNA (sequência/molécula) que não está mais no ambiente natural a partir do qual foi isolado, p.ex., a sequência de ácido nucleico em outro hospedeiro bacteriano ou em um genoma de planta, ou um ácido nucleico ou DNA (sequência/molécula) fundido com DNA ou ácido nucleico (sequência/molécula) de outra origem, tal como quando contido em um gene quimérico sob o controle de um promotor expressível em plantas (heterólogo). Qualquer ácido nucleico ou DNA desta invenção, incluindo qualquer iniciador, pode também não ocorrer naturalmente, tal como um ácido nucleico ou DNA com uma sequência idêntica a uma sequência ocorrendo na natureza, mas tendo uma etiqueta (ausente da contrapartida ocorrendo naturalmente) ou com uma sequência tendo pelo menos uma adição ou substituição de nucleotídeos ou pelo menos uma deleção interna de nucleotídeos em comparação com um nucleotídeo naturalmente existente ou com uma sequência tendo uma identidade de sequências abaixo de 100% (não idêntica) com um ácido nucleico ou DNA naturalmente existente ou um seu fragmento ou um ácido nucleico ou DNA com uma sequência consistindo em sequências de nucleotídeos de diferentes origens que não ocorram em conjunto na natureza (um DNA quimérico ou híbrido) ou um ácido nucleico ou DNA sintético feito pelo homem com uma sequência diferente do ácido nucleico ou DNA natural ou um seu fragmento.
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74/149 [0081] Um evento é definido como um lócus genético (artificial) que, como resultado de manipulação genética, transporta um T-DNA inserido ou transgene compreendendo pelo menos uma cópia de um gene de interesse ou dos genes de interesse. Os estados alélicos típicos de um evento são a presença ou ausência do T-DNA inserido. Um evento é caracterizado fenotipicamente pela expressão do transgene ou transgenes. Ao nível genético, um evento é parte da constituição genética de uma planta. Ao nível molecular, um evento pode ser caracterizado pelo mapa de restrição (p.ex., como determinado por transferência de Western), pelas sequências flanqueantes a montante e/ou a jusante do transgene, pela localização de marcadores moleculares e/ou pela configuração molecular do transgene. Usualmente, a transformação de uma planta com um DNA transformante compreendendo pelo menos um gene de interesse leva a uma população de transformantes compreendendo uma multitude de eventos separados, cada um dos quais é único. Um evento é caracterizado pelo T-DNA inserido e pelo menos uma das sequências flanqueantes.
[0082] Um evento de elite, como usado aqui, é um evento que é selecionado de um grupo de eventos, obtidos por transformação com o mesmo DNA transformante, com base em uma ótima eficácia de traços e expressão superior, estabilidade do(s) transgene(s) e sua compatibilidade com características agronômicas ideais da planta compreendendo o(s) mesmo(s). Assim, os critérios para seleção de eventos de elite são um ou mais dos, preferencialmente dois ou mais dos, vantajosamente todos os seguintes:
a) eficácia de traços;
b) que a presença do T-DNA inserido não comprometa outras características desejadas da planta, tais como aquelas se relacionando com desempenho agronômico ou valor comercial;
c) que o evento seja caracterizado por uma configuração molecular bem definida que é estavelmente herdada e para a qual podem ser
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75/149 desenvolvidas ferramentas apropriadas para controle da identidade;
d) que o(s) gene(s) de interesse mostre(m) uma expressão fenotípica espacial e temporal correta, apropriada e estável, a um nível comercialmente aceitável em uma gama de condições ambientais nas quais é provável que as plantas transportando o evento estejam expostas em uso agronômico normal.
[0083] É preferencial que o T-DNA inserido esteja associado a uma posição no genoma de planta que permita introgressão fácil em fundos genéticos comerciais desejados.
[0084] O estado de um evento como um evento de elite é confirmado por introgressão do evento de elite em diferentes fundos genéticos relevantes e observação do cumprimento com um dos, dois dos, três dos ou todos os critérios, p.ex., a), b), c) e d) acima.
[0085] Um “evento de elite” se refere assim a um lócus genético compreendendo um T-DNA inserido, que cumpre os critérios acima descritos. Uma planta, material de planta ou descendência tal como sementes pode compreender um ou mais eventos de elite em seu genoma.
[0086] As ferramentas desenvolvidas para identificar um evento de elite ou a planta ou material de planta compreendendo um evento de elite, ou produtos que compreendem material de planta compreendendo o evento de elite, são baseadas nas características genômicas específicas do evento de elite, tais como um mapa de restrição específico da região genômica compreendendo o TDNA inserido, marcadores moleculares ou a sequência da(s) região(ões) flanqueante(s) do T-DNA inserido.
[0087] Logo que uma das ou ambas as regiões flanqueantes do T-DNA inserido tenha(m) sido sequenciada(s) podem ser desenvolvidos iniciadores e/ou sondas que reconhecem especificamente esta(s) sequência(s) no ácido nucleico (DNA ou RNA) de uma amostra por meio de uma técnica
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76/149 biológica molecular. Por exemplo, um método de PCR pode ser desenvolvido para identificar o evento de elite em amostras biológicas (tais como amostras de plantas, material de plante ou produtos compreendendo material de planta). Uma tal PCR é baseada em pelo menos dois “iniciadores” específicos, um reconhecendo uma sequência dentro da região flanqueante de T-DNA 5' ou 3' do evento de elite e o outro reconhecendo uma sequência dentro do T-DNA inserido. Os iniciadores têm preferencialmente uma sequência de entre 15 e 35 nucleotídeos que sob condições de PCR otimizadas “reconhecem especificamente” uma sequência dentro da região flanqueante de T-DNA 5' ou 3' do evento de elite e o T-DNA inserido do evento de elite, respectivamente, tal que um fragmento específico (“fragmento de integração” ou amplicon de discriminação) seja amplificado a partir de uma amostra de ácido nucleico compreendendo o evento de elite. Isto significa que somente o fragmento de integração visado, e nenhuma outra sequência no genoma de planta ou T-DNA inserido, é amplificado sob condições de PCR otimizadas.
[0088] Os iniciadores de PCR adequados para a invenção podem ser os seguintes:
oligonucleotídeos variando em comprimento a partir de 17 nt até cerca de 200 nt, compreendendo uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos, preferencialmente 20 nucleotídeos consecutivos, selecionada da sequência flanqueante de T-DNA 5' (SEQ ID No. 5 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 227 ou de SEQ ID No. 24 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 1058 ou sequências genômicas de planta a montante da mesma e contígua com ela) na sua extremidade 3’ (iniciadores reconhecendo sequências flanqueantes de T-DNA 5'); ou oligonucleotídeos variando em comprimento a partir de 17 nt até cerca de 200 nt, compreendendo uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos, preferencialmente 20 nucleotídeos
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77/149 consecutivos, selecionada da sequência flanqueante de T-DNA 3' (complemento de SEQ ID No. 6 a partir do nucleotídeo 254 até ao nucleotídeo 501 ou a sequência de nucleotídeos do complemento de SEQ ID No. 25 a partir do nucleotídeo 254 até ao nucleotídeo 1339 ou sequências genômicas de planta a jusante da mesma e contígua com ela) na sua extremidade 3’ (iniciadores reconhecendo sequências flanqueantes de T-DNA 3'); ou oligonucleotídeos variando em comprimento a partir de 17 nt até cerca de 200 nt, compreendendo uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos, preferencialmente 20 nucleotídeos consecutivos, selecionada das sequências de T-DNA inseridas (complemento de SEQ ID No. 5 a partir do nucleotídeo 228 até ao nucleotídeo 398 ou sequência de SEQ ID No. 6 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 253 ou a sequência de SEQ ID No. 11 a partir do nucleotídeo 17 até ao nucleotídeo 7621 ou a sequência de SEQ ID No. 23 a partir do nucleotídeo 1059 até ao nucleotídeo 8663 ou seu complemento) na sua extremidade 3’ (iniciadores reconhecendo TDNA inserido).
[0089] Será entendido que iniciadores reconhecendo as sequências flanqueantes de T-DNA 5' podem ser usados em uma reação PCR em conjunto com iniciadores reconhecendo o T-DNA inserido que são selecionados do complemento de SEQ ID No. 5 a partir do nucleotídeo 228 até ao nucleotídeo 398 ou sequências de T-DNA a jusante do mesmo e contíguo com ele, ao passo que iniciadores reconhecendo as sequências flanqueantes de T-DNA 3' podem ser usados em uma reação PCR em conjunto com iniciadores reconhecendo o T-DNA inserido que são selecionados da sequência de SEQ ID No. 6 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 253 ou T-DNA a jusante da mesma e contíguo com ela. Os iniciadores reconhecendo T-DNA inserido pode ser também selecionado da sequência de SEQ ID No. 11 a partir do nucleotídeo
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78/149 até ao nucleotídeo 7621 ou da sequência de SEQ ID No. 23 a partir do nucleotídeo 1059 até ao nucleotídeo 8663 ou do seu complemento.
[0090] Os iniciadores podem obviamente ser mais longos do que os 17 nucleotídeos consecutivos mencionados e podem, p.ex., ter 20, 21,30, 35, 50, 75,100,150, 200 nt em comprimento ou mesmo mais longos. Os iniciadores podem consistir inteiramente em sequência de nucleotídeos selecionada das sequências de nucleotídeos mencionada de sequências flanqueantes e sequências de T-DNA inseridas. No entanto, a sequência de nucleotídeos dos iniciadores na sua extremidade 5' (/.a, fora dos 17 nucleotídeos consecutivos na extremidade 3') é menos crítica. Assim, a sequência 5' dos iniciadores pode compreender ou consistir em uma sequência de nucleotídeos selecionada das sequências flanqueantes ou T-DNA inserido, como apropriado, mas pode reter várias (p.ex., 1,2, 5 ou 10) não correspondências em comparação com o T-DNA ou DNA flanqueando T-DNA. A sequência 5' dos iniciadores pode ser mesmo inteiramente uma sequência de nucleotídeos não relacionada com as sequências flanqueantes ou T-DNA inserido, tal como, p.ex., uma sequência de nucleotídeos representando um ou mais locais de reconhecimento de enzimas de restrição ou tal como sequências de nucleotídeos capazes de se ligarem a outros oligonucleotídeos, tais como oligonucleotídeos etiquetados, tais como cassetes de FRET (genômica de LGC; ver Semagn et al., 2014, Mol Breeding 33: 1-14, e US 7615620). Tais sequências não relacionadas ou sequências de DNA flanqueantes com não correspondências não devem ser preferencialmente mais longas de 100, mais preferencialmente não mais longas do que 50 ou mesmo 25 nucleotídeos. Os iniciadores podem ser também modificados com uma etiqueta, tal como uma etiqueta fluorescente.
[0091] Além do mais, os iniciadores adequados podem compreender ou consistir (essencialmente) em uma sequência de nucleotídeos na sua extremidade 3' abrangendo a região de união entre as sequências
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79/149 derivadas de região flanqueante de T-DNA 5' ou 3' e as sequências de T-DNA inseridas (localizadas nos nucleotídeos 227 e 228 em SEQ ID No. 5 e nucleotídeos 253 e 254 em SEQ ID No. 6 ou nucleotídeos 1058 e 1059 em SEQ ID No. 24 e nucleotídeos 253 e 254 em SEQ ID No. 25) contanto que os 17 nucleotídeos consecutivos localizados em 3' mencionados não sejam derivados exclusivamente a partir do T-DNA inserido ou das sequências flanqueantes de T-DNA em SEQ ID No. 5 ou 6 ou SEQ ID No. 24 ou 25.
[0092] Será também imediatamente claro ao especialista perito que os pares de iniciadores de PCR apropriadamente selecionados não devem também compreender sequências complementares entre si.
[0093] Para o propósito da invenção, o “complemento de uma sequência de nucleotídeos representada em SEQ ID No: X” é a sequência de nucleotídeos que pode ser derivada a partir da sequência de nucleotídeos representada por substituição dos nucleotídeos pelo seu nucleotídeo complementar de acordo com as regras de Chargaff (A<f>T; G<f>C) e leitura da sequência na direção 5' para 3', i.e., em direção oposta da sequência de nucleotídeos representada.
[0094] Exemplos de iniciadores adequados são as sequências de oligonucleotídeos de SEQ ID no. 13 ou SEQ ID No. 21 ou SEQ ID No. 26 ou 27 (iniciador reconhecendo sequências flanqueantes de T-DNA 3' ou 5') ou SEQ ID No. 14 ou SEQ ID No. 20 ou SEQ ID No. 28 ou 29 (iniciador reconhecendo TDNA inserido para uso com os iniciadores reconhecendo sequências flanqueantes de T-DNA 3' ou 5').
[0095] Preferencialmente, o fragmento amplificado tem um comprimento de entre 50 e 500 nucleotídeos, tal como um comprimento entre 50 e 150 nucleotídeos. Os iniciadores específicos podem ter uma sequência que é entre 80 e 100% idêntica a uma sequência dentro da região flanqueante de TDNA 5' ou 3' do evento de elite e ao T-DNA inserido do evento de elite,
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80/149 respectivamente, contanto que as não correspondências permitam ainda a identificação específica do evento de elite com estes iniciadores sob condições de PCR otimizadas. A gama de não correspondências permissíveis, no entanto, pode ser facilmente determinada experimentalmente e é conhecida de um perito na técnica.
[0096] A detecção de fragmentos de integração pode ocorrer de vários modos, p.ex., através de estimativa do tamanho após análise em gel. Os fragmentos de integração podem ser também diretamente sequenciados. Outros métodos específicos da sequência para detecção de fragmentos de DNA amplificados são também conhecidos na técnica. Os fragmentos de DNA amplificados podem ser também detectados usando sequências etiquetadas e detecção da etiqueta. Por exemplo, uma sonda etiquetada pode ser incluída na mistura reacional que se liga especificamente ao fragmento amplificado. Em uma modalidade, a sonda etiquetada (sonda de hibridação FRET) pode compreender uma etiqueta fluorescente e um extintor, tal que o cassete de FRET não esteja já extinto e emita fluorescência quando ligado ao produto de PCR, Alternativamente, um cassete de FRET etiquetado, i.e., um oligonucleotídeo etiquetado com uma etiqueta fluorescente e um extintor, pode ser incluído na mistura reacional que se liga especificamente a um dos iniciadores na mistura reacional, tal como um cassete de FRET dirigido a uma extensão 5' do iniciador usado na mistura reacional (ver, p.ex., Semagn etal., 2014, Mol Breeding 33:114, e US 7615620). A fluorescência pode ser medida usando métodos conhecidos na técnica. A fluorescência pode ser medida em tempo real, i.e., durante cada ciclo da reação PCR. A fluorescência pode ser também medida no final da reação PCR.
[0097] Como a sequência dos iniciadores e sua localização relativa no genoma são únicas para o evento de elite, a amplificação do fragmento de integração ocorrerá somente em amostras biológicas
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81/149 compreendendo o (o ácido nucleico do) evento de elite. Preferencialmente quando se realiza uma PCR para identificar a presença de EE-GM4 em amostras desconhecidas, um controle é incluído de um conjunto de iniciadores com os quais um fragmento dentro de um “gene de manutenção” da espécie de planta do evento pode ser amplificado. Os genes de manutenção são genes que são expressos na maioria dos tipos de células e que dizem respeito a atividades metabólicas básicas comuns a todas as células. Preferencialmente, o fragmento amplificado a partir do gene de manutenção é um fragmento que é maior do que o fragmento de integração amplificado. Dependendo das amostras a serem analisadas, outros controles podem ser incluídos.
[0098] Protocolos de PCR padrão são descritos na técnica, tal como em “PCR Applications Manual” (Roche Molecular Biochemicals, 2- Edição, 1999, ou 3â Edição, 2006) e outras referências. As condições ótimas para a PCR, incluindo a sequência dos iniciadores específicos, são especificadas em um “Protocolo de Identificação por PCR (ou Reação em Cadeia da Polimerase)” para cada evento de elite. É no entanto entendido que um número de parâmetros no Protocolo de Identificação por PCR pode necessitar de ser ajustado às condições laboratoriais específicas e pode ser modificado ligeiramente para se obterem resultados similares. Por exemplo, o uso de método diferente para preparação de DNA pode requerer ajuste, por exemplo, da quantidade de iniciadores, polimerase e condições de emparelhamento usadas. Similarmente, a seleção de outros iniciadores pode ditar outras condições ótimas para o Protocolo de Identificação por PCR. Estes ajustes serão no entanto aparentes a um perito na técnica e são além do mais detalhados em manuais de aplicação de PCR correntes tais como aquele citado acima.
[0099] Alternativamente, iniciadores específicos podem ser usados para amplificar um fragmento de integração que pode ser usado como uma “sonda específica” para identificação de EE-GM4 em amostras biológicas.
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O contato de ácido nucleico de uma amostra biológica, com a sonda, sob condições que permitam hibridação da sonda com seu fragmento correspondente no ácido nucleico, resulta na formação de um híbrido ácido nucleico/sonda. A formação deste híbrido pode ser detectada (p.ex., através de etiquetagem do ácido nucleico ou sonda), por meio do que a formação deste híbrido indica a presença de EE-GM4. Tais métodos de identificação baseados na hibridação com uma sonda específica (em um transportador de fase sólida ou em solução) foram descritos na técnica. A sonda específica é preferencialmente uma sequência que, sob condições otimizadas, híbrida especificamente com uma região compreendendo parte da região flanqueante de T-DNA 5' ou 3' do evento de elite do T-DNA inserido contíguo com ele (doravante referida como “região específica”). Preferencialmente, a sonda específica compreende uma sequência de entre 50 e 500 pb ou de 100 a 350 pb que é pelo menos 80% ou entre 80 e 85% ou entre 85 e 90% ou entre 90 e 95% ou entre 95% e 100% idêntica (ou complementar) ou é idêntica (ou complementar) à sequência de nucleotídeos de uma região específica de EE-GM4. Preferencialmente, a sonda específica compreenderá uma sequência de cerca de 15 a cerca de 100 nucleotídeos contíguos idêntica (ou complementar) com uma região específica do evento de elite.
[00100] Oligonucleotídeos adequados como iniciadores de PCR para detecção do evento de elite EE-GM4 podem ser também usados para desenvolver um protocolo à base de PCR para determinar o estado de zigosidade de plantas contendo o evento de elite. Para esta finalidade, dois iniciadores reconhecendo o lócus de tipo selvagem antes da integração são desenhados de um tal modo que são dirigidos na direção um do outro e têm o local de inserção localizado no meio dos iniciadores. Estes iniciadores podem conter iniciadores reconhecendo especificamente as sequências flanqueantes de T-DNA 5' e/ou 3' de EE-GM4. Este conjunto de iniciadores reconhecendo o
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83/149 lócus de tipo selvagem antes da integração, em conjunto com um terceiro iniciador complementar das sequências de DNA transformantes (T-DNA inserido), permite amplificação por PCR de diagnóstico simultânea do lócus específico de EE-GM4, bem como do lócus de tipo selvagem. Se a planta for homozigota quanto ao lócus transgênico ou ao lócus de tipo selvagem correspondente, a PCR de diagnóstico dará origem a um único produto de PCR típico, preferencialmente típico em comprimento, quanto ao lócus transgênico ou de tipo selvagem. Se a planta for hemizigota quanto ao lócus transgênico, dois produtos de PCR específicos do lócus aparecerão, refletindo a amplificação do lócus transgênico e de tipo selvagem.
[00101] Alternativamente, para se determinar o estado de zigosidade de plantas contendo o evento de elite, dois iniciadores reconhecendo o lócus de tipo selvagem antes da integração são desenhados de um tal modo que são dirigidos na direção um do outro e esse um iniciador reconhece especificamente as sequências flanqueantes de T-DNA 5' ou 3' contidas em SEQ ID No. 5 ou 6 ou em SEQ ID No. 24 ou 25 e esse um iniciador reconhece especificamente as sequências flanqueantes de T-DNA 3' ou 5' contidas dentro de SEQ ID No. 6 ou 5 ou dentro de SEQ ID No. 25 ou 24 ou reconhece especificamente o lócus pré-inserção. Para a corrente invenção, um par de iniciadores adequado reconhecendo o lócus de tipo selvagem antes da integração é um par de iniciadores contendo um iniciador compreendendo a ou consistindo (essencialmente) na sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 18 e um iniciador compreendendo a ou consistindo (essencialmente) na sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 13. Este conjunto de iniciadores, em conjunto com um terceiro iniciador complementar com sequências de DNA transformantes (TDNA inserido) ou complementar com sequências de DNA transformantes e as sequências flanqueantes de T-DNA 5' ou 3' contíguas com elas e em uma direção na direção do iniciador que reconhece especificamente as sequências
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84/149 flanqueantes de T-DNA 5' ou 3' (tal como um iniciador compreendendo a ou consistindo (essencialmente) a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 12, que está em uma direção na direção do iniciador compreendendo a ou consistindo (essencialmente) a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 13) permite a amplificação por PCR de diagnóstico simultânea do lócus específico de EE-GM4, bem como do lócus de tipo selvagem. Se a planta for homozigota quanto ao lócus transgênico ou ao lócus de tipo selvagem correspondente, a PCR de diagnóstico dará origem a um único produto de PCR típico quanto ao lócus transgênico ou de tipo selvagem. Se a planta for hemizigota quanto ao lócus transgênico, dois produtos de PCR específicos do lócus aparecerão, refletindo a amplificação do lócus transgênico e de tipo selvagem.
[00102] A detecção dos produtos de PCR típicos quanto ao lócus de tipo selvagem e transgênico pode ser baseada na determinação do comprimento dos produtos de PCR que podem ser típicos quanto ao lócus de tipo selvagem e transgênico. Alternativamente, a detecção dos produtos de PCR típicos quanto ao lócus de tipo selvagem e transgênico pode ser realizada por modificação do iniciador específico do lócus pré-inserção e por modificação do iniciador específico do T-DNA inserido e detecção de incorporação em um produto de PCR dos iniciadores modificados. Por exemplo, o iniciador específico do lócus pré-inserção e o iniciador específico do T-DNA inserido podem ser etiquetados usando uma etiqueta fluorescente, em que as etiquetas são diferentes para os dois iniciadores. A fluorescência pode ser detectada quando o iniciador é incorporado em um produto de PCR. Se a planta for homozigota quanto ao lócus transgênico ou ao lócus de tipo selvagem correspondente, a fluorescência pode ser detectada da etiqueta do iniciador específico do T-DNA inserido somente ou do iniciador específico do lócus pré-inserção somente. Se a planta for hemizigota quanto ao lócus transgênico a fluorescência pode ser detectada tanto da etiqueta do iniciador específico do T-DNA inserido como do
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85/149 iniciador específico do lócus pré-inserção, refletindo a amplificação do lócus transgênico e de tipo selvagem.
[00103] Alternativamente, o iniciador específico do lócus préinserção e o iniciador específico do T-DNA inserido podem ter uma extensão 5' que se liga especificamente a um cassete de FRET etiquetado, i.e., um oligonucleotídeo etiquetado com uma etiqueta fluorescente e um extintor, em que a extensão 5' e os cassetes de FRET correspondentes são diferentes para os dois iniciadores (ver, p.ex., Semagn et al., 2014, Mol Breeding 33: 1-14, e US 7615620). A fluorescência pode ser detectada quando o iniciador é incorporado em um produto de PCR e, subsequentemente, o cassete de FRET é incorporado no produto de PCR. Se a planta for homozigota quanto ao lócus transgênico ou ao lócus de tipo selvagem correspondente, a fluorescência pode ser detectada do cassete de FRET se ligando especificamente ao iniciador específico do TDNA inserido somente ou do cassete de FRET se ligando especificamente ao iniciador específico do lócus pré-inserção somente. Se a planta for hemizigota quanto ao lócus transgênico a fluorescência pode ser detectada tanto do cassete de FRET se ligando especificamente ao iniciador específico do T-DNA inserido e do cassete de FRET se ligando especificamente ao iniciador específico do lócus pré-inserção, refletindo a amplificação do lócus transgênico e de tipo selvagem.
[00104] Se a planta for homozigota quanto ao lócus transgênico ou ao lócus de tipo selvagem correspondente, a PCR de diagnóstico dará origem a um único produto de PCR típico, preferencialmente típico em comprimento, quanto ao lócus transgênico ou de tipo selvagem. Se a planta for hemizigota quanto ao lócus transgênico, dois produtos de PCR específicos do lócus aparecerão, refletindo a amplificação do lócus transgênico e de tipo selvagem.
[00105] Alternativamente, para se determinar o estado de zigosidade de plantas contendo o evento de elite, a presença do evento pode ser
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86/149 determinada em uma reação PCR de um modo quantitativo como descrito nos Exemplos. Para esta finalidade, dois iniciadores reconhecendo o evento EEGM4 são desenhados de um tal modo que são dirigidos na direção um do outro e em que um iniciador reconhece especificamente a sequência flanqueante de T-DNA 5' ou 3' contidas dentro de SEQ ID No. 5 ou 6 ou dentro de SEQ ID No. 24 ou 25 e em que um iniciador reconhece especificamente o T-DNA inserido dentro de SEQ ID no. 5 ou 6 ou dentro de SEQ ID No. 24 ou 25 ou dentro de SEQ ID No. 11 ou 23. Este conjunto de iniciadores permite amplificação por PCR do lócus específico de EE-GM4. O fragmento de DNA amplificado pode ser quantitativamente detectado usando uma sonda etiquetada que é incluída na mistura reacional que se liga especificamente ao fragmento amplificado. A sonda etiquetada pode compreender uma etiqueta fluorescente e um extintor, tal que a etiqueta não esteja já extinta e emita fluorescência quando ligado ao produto de PCR, A fluorescência pode ser medida em tempo real, i.e., durante cada ciclo da reação PCR, usando métodos conhecidos na técnica. O ciclo de PCR ao qual a fluorescência excede um certo nível limiar é uma medida para a quantidade de lócus específico de EE-GM4 na amostra biológica que é analisada, e o estado de zigosidade pode ser calculado com base em amostras homozigotos e heterozigotos de referência.
[00106] Alternativamente, o estado de zigosidade de plantas compreendendo EE-GM4 pode ser também determinado com base na análise do número de cópias, usando a química Taqman e princípios de PCR em Tempo Real. O método alternativo incluirá tipicamente uma reação específica de EEGM4 para quantificar o número de cópias de EE-GM4 e uma reação específica do gene endógena para normalização do número de cópias de EE-GM4. As amostras contendo o evento EE-GM4 em um estado homozigoto terá um número de cópias relativo que é duas vezes mais elevado do que amostras hemizigotas.
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As amostras azigotas não amplificarão a sequência de EE-GM4 em um tal método.
[00107] Além do mais, métodos de detecção específicos do evento de elite EE-GM4 que diferem de métodos de amplificação à base de PCR podem ser também desenvolvidos usando a informação de sequências específicas do evento de elite proporcionada aqui. Tais métodos de detecção alternativos incluem métodos de detecção de amplificação de sinal linear com base em divagem invasiva de estruturas particulares de ácido nucleico, também conhecida como tecnologia Invader™ (como descrito, p.ex., patentes dos EUA 5,985,557 “Invasive Cleavage of Nucleic Acids, 6,001,567 “Detection of Nucleic Acid sequences by Invader Directed Cleavage, incorporadas aqui por referência). Para esta finalidade, a sequência alvo é hibridada com um primeiro oligonucleotídeo de ácido nucleico etiquetado compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 a partir da posição de nucleotídeo 228 até à posição de nucleotídeo 245 ou seu complemento ou compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 6 a partir da posição de nucleotídeo 236 até à posição de nucleotídeo 253 ou seu complemento e é adicionalmente hibridada com um segundo oligonucleotídeo de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 a partir do nucleotídeo 210 até ao nucleotídeo 227 ou seu complemento ou compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 6 a partir do nucleotídeo 254 até ao nucleotídeo 271 ou seu complemento, em que os referidos primeiro e segundo oligonucleotídeos se sobrepõem em pelo menos um nucleotídeo.
[00108] A estrutura em dúplex ou triplex que é produzida por esta hibridação permite divagem de sonda específica com uma enzima (Cleavase®) deixando a sequência alvo intacta. A sonda etiquetada clivada é subsequentemente detectada, potencialmente através de um passo intermédio resultando em amplificação de sinal adicional.
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88/149 [00109] Em uma modalidade é proporcionado um método de detecção da presença do evento de elite EE-GM4 em amostras biológicas através de hibridação com uma sonda de ácido nucleico etiquetada substancialmente complementar na qual a razão sonda:ácido nucleico alvo é amplificada através de reciclagem da sequência de ácido nucleico alvo, compreendendo o referido método:
a) hibridação da referida sequência de ácido nucleico alvo com um primeiro oligonucleotídeo de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 a partir da posição de nucleotídeos 228 até à posição de nucleotídeos 245 ou seu complemento ou referido primeiro oligonucleotídeo de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 6 a partir da posição de nucleotídeos 236 até à posição de nucleotídeos 253 ou seu complemento;
b) hibridação da referida sequência de ácido nucleico alvo com um segundo oligonucleotídeo de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 a partir do nucleotídeo 210 até ao nucleotídeo 227 ou seu complemento ou o referido segundo oligonucleotídeo de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 6 a partir do nucleotídeo 254 até ao nucleotídeo 271 ou seu complemento, em que os referidos primeiro e segundo oligonucleotídeos se sobrepõem em pelo menos um nucleotídeo e em eu qualquer um dos referidos primeiro ou segundo oligonucleotídeos é etiquetado para ser a referida sonda de ácido nucleico etiquetada;
c) divagem somente da sonda etiquetada dentro do dúplex sonda:sequência de ácido nucleico alvo com uma enzima que causa divagem seletiva da sonda resultando em dissociação do dúplex, deixando a sequência de alvo intata;
d) reciclagem da sequência de ácido nucleico alvo por repetição
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89/149 dos passos (a) a (c); e
e) detecção da sonda etiquetada clivada, determinando deste modo a presença da referida sequência de ácido nucleico alvo, e detecção do evento de elite EE-GM4 nas referidas amostras biológicas.
[00110] Dois ácidos nucleicos são “substancialmente complementares”, como usado aqui, quando não são o complemento total entre si (como definido aqui), tal como quando suas sequências são pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% complementares entre si.
[00111] Um “estojo” como usado aqui se refere a um conjunto de reagentes para o propósito de realização do método da invenção, mais particularmente, a identificação do evento de elite EE-GM4 em amostras biológicas ou a determinação do estado de zigosidade de material de planta contendo EE-GM4. Mais particularmente, uma modalidade preferencial do estojo da invenção compreende pelo menos um ou dois iniciadores específicos, como descrito acima para identificação do evento de elite, ou três iniciadores específicos, ou dois iniciadores específicos e uma sonda específica, como descrito acima para a determinação do estado de zigosidade. Opcionalmente, o estojo pode adicionalmente compreender qualquer outro reagente descrito aqui no Protocolo de Identificação por PCR ou qualquer um dos outros protocolos como descrito aqui para detecção de EE-GM4. Alternativamente, de acordo com outra modalidade desta invenção, o estojo pode compreender uma sonda específica, como descrito acima, que híbrida especificamente com ácido nucleico de amostras biológicas para identificar a presença de EE-GM4 aí. Opcionalmente, o estojo pode adicionalmente compreender qualquer outro reagente (tal como mas não se limitando a tampão de hibridação, etiqueta) para identificação de EE-GM4 em amostras biológicas, usando a sonda específica.
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90/149 [00112] O estojo da invenção pode ser usado, e seus componentes podem ser especificamente ajustados, para propósitos de controle de qualidade (p.ex., pureza de lotes de sementes), detecção da presença ou ausência do evento de elite em material de planta ou material compreendendo ou derivado a partir de material de planta, tal como mas não se limitando a produtos alimentares ou de ração.
[00113] Como usada aqui, “identidade de sequências” no que diz respeito a sequências de nucleotídeos (DNA ou RNA) se refere ao número de posições com nucleotídeos idênticos dividido pelo número de nucleotídeos na mais curta das duas sequências. O alinhamento das duas sequências de nucleotídeos é realizado pelo algoritmo de Wilbur e Lipmann (Wilbur e Lipmann, 1983, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 80: 726) usando um tamanho de janela de 20 nucleotídeos, um comprimento de palavra de 4 nucleotídeos e uma penalidade de intervalo de 4. A análise auxiliada por computador e interpretação de dados de sequências, incluindo alinhamento de sequências como descrito acima, podem, p.ex., ser convenientemente realizadas usando o pacote de software de análise de sequências do Genetics Computer Group (GCG, University of Wisconsin Biotechnology Center). As sequências são indicadas como “essencialmente similares” quando tais sequências têm uma identidade de sequências de pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% ou pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5% ou pelo menos 99,9%. É claro que, quando é dito que sequências de RNA são essencialmente similares ou têm um certo grau de identidade de sequências com sequências de DNA, timidina (T) na sequência de DNA é considerada igual a uracila (U) na sequência de RNA. Igualmente é claro que pequenas diferenças ou mutações podem aparecer em sequências de DNA ao longo do tempo e que
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91/149 algumas não correspondências podem ser permitidas para os iniciadores ou sondas específicos do evento desta invenção, logo qualquer sequência de DNA indicada aqui em qualquer modalidade desta invenção para qualquer DNA flanqueante de T-DNA 3' ou 5' ou para qualquer inserção ou T-DNA inserida ou qualquer iniciador ou sonda desta invenção inclui também sequências essencialmente similares às sequências proporcionadas aqui, tais como sequências hibridando com ou com pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com a sequência dada para qualquer DNA flanqueante de T-DNA 3' ou 5', para qualquer iniciador ou sonda ou para qualquer inserção ou T-DNA inserido desta invenção, tal como uma sequência de nucleotídeos diferindo em 1 a 200, 1 a 150, 1 a 100, 1 a 75, 1 a 50, 1 a 30, 1 a 20, 1 a 10, 1 a 5 ou 1 a 3 nucleotídeos de qualquer dada sequência.
[00114] O termo “iniciador” como usado aqui engloba qualquer ácido nucleico que é capaz de iniciar a síntese de um ácido nucleico nascente em um processo dependente de molde, tal como PCR. Tipicamente, os iniciadores são oligonucleotídeos de 10 a 30 nucleotídeos, mas sequências mais longas podem ser empregues. Os iniciadores podem ser proporcionados em forma de fita dupla, embora a forma de fita única é preferencial. As sondas podem ser usadas como iniciadores, mas são desenhadas para se ligarem ao DNA ou RNA alvo e não necessitam de ser usadas em um processo de amplificação.
[00115] O termo “reconhecendo” como usado aqui quando se refere a iniciadores ou sondas específicos se refere ao fato de que os iniciadores ou sondas específicos hibridam especificamente com uma sequência de ácido nucleico no evento de elite sob as condições apresentadas no método (tais como as condições do Protocolo de Identificação por PCR), por meio do que a especificidade é determinada pela presença de controles positivos e negativos.
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92/149 [00116] O termo “hibridação” como usado aqui quando se refere a sondas específicas se refere ao fato de que a sonda se liga a uma região específica na sequência de ácido nucleico do evento de elite sob condições de estringência padrão. Condições de estringência padrão como usadas aqui se referem às condições para hibridação descritas aqui ou às condições de hibridação convencionais como descrito por Sambrook et al., 1989 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) que por exemplo podem compreender os seguintes passos: 1) imobilização de fragmentos de DNA genômico de planta em um filtro, 2) préhibridação do filtro durante 1 a 2 horas a 42 °C em formamida a 50%, 5 X SSPE, 2 X reagente de Denhardt e SDS a 0,1% ou durante 1 a 2 horas a 68 °C em 6 X SSC, 2 X reagente de Denhardt e SDS a 0,1 %, 3) adição da sonda de hibridação que foi etiquetada, 4) incubação durante 16 a 24 horas, 5) lavagem do filtro durante 20 min. à temperatura ambiente em 1X SSC, SDS a 0,1%, 6) lavagem do filtro três vezes durante 20 min. cada a 68 °C em 0,2 X SSC, SDS a 0,1% e 7) exposição do filtro durante 24 a 48 horas a filme de raios X a -70 °C com uma tela intensificante.
[00117] Como usada aqui, uma amostra biológica é uma amostra de uma planta, material de planta ou produtos compreendendo material de planta. O termo “planta” se destina a englobar tecidos de planta de soja (Glycine max), em qualquer etapa de maturidade, bem como quaisquer células, tecidos ou órgãos retirados a partir de ou derivados a partir de qualquer tal planta, incluindo sem limitação quaisquer sementes, folhas, caules, flores, raízes, células únicas, gâmetas, culturas de células, culturas de tecidos ou protoplastos. “Material de planta”, como usado aqui, se refere a material que é obtido ou derivado a partir de uma planta. Os produtos compreendendo material de planta se relacionam com alimento, ração ou outros produtos que são produzidos usando material de planta ou podem estar contaminados por material de planta.
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É entendido que, no contexto da presente invenção, tais amostras biológicas são testadas quanto à presença de ácidos nucleicos específicos de EE-GM4 implicando a presença de ácidos nucleicos nas amostras. Assim, os métodos referidos aqui para identificação do evento de elite EE-GM4 em amostras biológicas se relacionam com a identificação em amostras biológicas de ácidos nucleicos que compreendem o evento de elite.
[00118] Como usado aqui, “compreendendo” é para ser interpretado como especificando a presença das características, números inteiros, passos, reagentes ou componentes apresentados como referidos, mas não exclui a presença ou adição de uma ou mais características, números inteiros, passos ou componentes ou seus grupos. Assim, p.ex., um ácido nucleico ou proteína compreendendo uma sequência de nucleotídeos ou aminoácidos pode compreender mais nucleotídeos ou aminoácidos do que os citados de fato, i.e., estar embebido em um ácido nucleico ou proteína maior. Um gene quimérico compreendendo uma sequência de DNA que é funcionalmente ou estruturalmente definida pode compreender sequências de DNA adicionais, tais como sequências promotoras, líder, de reboque e/ou de terminação de transcrito (possivelmente também incluindo um DNA codificando um peptídeo de direcionamento ou trânsito).
[00119] A presente invenção se relaciona também com o desenvolvimento de um evento de elite EE-GM4 em plantas de soja compreendendo este evento, as plantas de descendência e sementes compreendendo o evento de elite EE-GM4 obtidas a partir destas plantas e com células de planta ou material de planta derivado a partir de plantas compreendendo este evento. As plantas compreendendo o evento de elite EEGM4 podem ser obtidas como descrito nos Exemplos. Esta invenção se relaciona também com semente compreendendo o evento de elite EE-GM4 depositada na ATCC sob o número de depósito PTA-123624 ou derivados da
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94/149 mesma compreendendo o evento de elite EE-GM4. “Derivados (de semente)”, como usados aqui, se referem a plantas que podem ser cultivadas a partir de tal semente, descendência resultando de autofecundação, cruzamento ou retrocruzamento, bem como células de plantas, órgãos, partes, tecidos, culturas de células, protoplastos e material de planta do mesmo.
[00120] As plantas ou material de planta de soja compreendendo EE-GM4 podem ser identificadas de acordo com qualquer um dos protocolos de identificação para EE-GM4 como descrito nos Exemplos, incluindo o método do Ponto Final para análise da identidade de EE-GM4 no Exemplo 2.1, o método do Ponto Final para análise da identidade e zigosidade de EE-GM4 como descrito no Exemplo 2.2 ou o método de PCR em Tempo Real para análise da Presença a Baixo Nível de EE-GM4 como descrito no Exemplo 2.3. Brevemente, DNA genômico de soja presente na amostra biológica é amplificado por PCR usando um iniciador que reconhece especificamente uma sequência dentro da sequência flanqueante de T-DNA 5' ou 3' de EE-GM4 tal como o iniciador com a sequência de SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID No. 21 e um iniciador que reconhece uma sequência no T-DNA inserido, tal como o iniciador com a sequência de SEQ ID No. 12 ou SEQ ID No. 20 ou com um iniciador que reconhece a sequência flanqueante de T-DNA 5' ou 3' de EE-GM4 e o T-DNA inserido contíguo com ela. Iniciadores de DNA que amplificam parte de uma sequência de soja endógena são usados como controle positivo para a amplificação por PCR. Se, após amplificação por PCR, o material originar um fragmento do tamanho esperado ou der origem a fluorescência da etiqueta fluorescente esperada, o material contém material de planta de uma planta de soja abrigando o evento de elite EE-GM4.
[00121] As plantas abrigando EE-GM4 são caracterizadas pela sua resistência a nematódeos, particularmente SCN, resistência a nematódeos formadores de lesões e/ou nódulos radiculares (“RKN”) e/ou nematódeos
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95/149 reniformes, bem como pela sua tolerância a inibidores de HPPD tais como isoxaflutol, topramezona ou mesotriona. As plantas de soja em diferentes variedades comercialmente disponíveis abrigando EE-GM4 são também caracterizadas por terem características agronômicas que são comparáveis às variedades comercialmente disponíveis isogênicas não transgênicas correspondentes, na ausência de aplicação de herbicidas inibidores de HPPD e infestação por SCN. Foi observado que a presença de um T-DNA inserido na região de inserção do genoma da planta de soja descrita aqui confere características fenotípicas e moleculares particularmente interessantes às plantas compreendendo este evento.
[00122] É também proporcionado aqui um método para produção de uma planta de soja resistente a SCN e tolerante a herbicidas inibidores de HPPD, compreendendo introdução de resistência a SCN e tolerância a herbicidas inibidores de HPPD no genoma de uma planta de soja por cruzamento de uma primeira planta de soja não tendo um gene codificando Cry14Ab-1 e não tendo um gene codificando HPPD-4 com uma planta de soja contendo EE-GM4 e seleção de uma planta de descendência resistente a SCN e tolerante a herbicidas inibidores de HPPD. A resistência a SCN pode ser medida usando ensaio de estufa de SCN padrão, p.ex., www.plantpath.iastate.edu/tylkalab/greenhouse-resistance-screening e www.plantmanagementnetwork.org/pub/php/review/2009/sce08/.
[00123] Uma modalidade desta invenção proporciona um evento de elite em plantas de soja, obtenível por inserção de 2 transgenes em uma localização específica no genoma da soja, evento de elite esse que confere resistência a nematódeos e tolerância a um herbicida inibidor de HPPD tal como isoxaflutol, topramezona ou mesotriona em tais plantas de soja e em que tal evento de elite tem um desempenho agronômico essencialmente similar a linhas isogênicas (como usadas aqui, “linhas isogênicas” ou “linhas quase isogênicas”
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96/149 são linhas de soja do mesmo fundo genético mas não tendo os transgenes, tais como plantas do mesmo fundo genético que a planta usada para transformação ou linhas irmãs segregates (“nulas”) tendo perdido os transgenes). Particularmente, a corrente invenção proporciona um evento de elite em plantas de soja, em que a inserção ou presença do referido evento de elite no genoma de tais plantas de soja não parece causar uma suscetibilidade aumentada à doença, não causa uma penalidade do rendimento ou não causa acamamento aumentado, em comparação com linhas isogênicas ou com linhas comerciais de soja. Consequentemente, a corrente invenção proporciona um evento de elite em plantas de soja, designado como EE-GM4, que resulta em plantas de soja que têm resistência melhorada a nematódeos e podem tolerar a aplicação de um herbicida inibidor de HPPD tal como isoxaflutol, topramezona ou mesotriona sem afetar negativamente o rendimento das referidas plantas de soja em comparação com linhas isogênicas, plantas de soja essas que não são estatisticamente significativamente diferentes na sua suscetibilidade à doença, ou acamamento, de plantas de soja isogênicas ou de cultivares comerciais de soja. Estas características tornam o corrente evento de elite uma ferramenta valiosa em um programa de controle de nematódeos e gestão da resistência a ervas daninhas. Em uma modalidade, o evento EE-GM4 é combinado com um ou mais eventos de soja proporcionando tolerância a qualquer um ou uma combinação de herbicidas à base de glifosato, à base de glufosinato, à base de inibidores de HPPD, à base de sulfonilureias ou imidazolinonas, inibidores de AHAS ou ALS e/ou tipo auxina (p.ex., dicamba, 2,4-D), tais como Evento EE-GM3 (também conhecido como FG-072, MST-FG072-3, descrito em WO2011063411, Petição de USDA-APHIS 09-328-01 p), Evento SYHT0H2 (também conhecido como 0H2, SYN-000H2-5, descrito em WO2012/082548 e 12-215-01 p), Evento DAS68416-4 (também conhecido como Enlist Soybean, descrito em WO2011 /066384 e WO2011/066360, Petição de USDA-APHIS 09-349-01p), Evento DAS-44406
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97/149 (também conhecido como Enlist E3, DAS-44406-6, descrito em WO2012/075426 e USDA-APHIS 11-234-01 p), Evento MON87708 (evento tolerante ao dicamba de Roundup Ready 2 Xtend Soybeans, descrito em WO2011/034704 e Petição de USDA-APHIS 10-188-01 p, MON-87708-9), Evento MON89788 (também conhecido como Genuity Roundup Ready 2 Yield, descrito em W02006/130436 e Petição de USDA-APHIS 06-178-01 p), Evento 40-3-2 (também conhecido como Roundup Ready, GTS 40-3-2, MON-04032-6, descrito na Petição de USDA-APHIS 93-258-01), Evento A2704-12 (também conhecido como LL27, ACS-GM005-3, descrito em W02006108674 e Petição de USDA-APHIS 96-068-01 p), Evento 127 (também conhecido como BPSCV127-9, descrito em WO2010/080829), Evento A5547-127 (também conhecido como LL55, ACS-GM006-4, descrito em W02006108675 e na Petição de USDA-APHIS 96-068-01 p), evento MON87705 (MON-87705-6, Vistive Gold, pedido de patente PCT publicado WO2010/037016, Petição de USDA-APHIS 09-201-01 p) ou evento DP305423 (também conhecido como DP-305423-1, pedido de patente PCT publicado W02008/054747, Petição de USDA-APHIS 06-354-01 p) ou EE-GM4 é combinado com uma combinação dos seguintes eventos: Evento MON98788 x MON87708 (também conhecido como Roundup Ready 2 Xtend Soybeans, MON-87708-9 x MON-89788-1), Evento HOS x Evento 40-3-2 (também conhecido como Plenish High Oleic Soybeans x Roundup Ready Soybeans), Evento EE-GM3 x EE-GM2 (também conhecido como FG-072xLL55, descrito em WO2011063413), Evento MON 87701 x MON 89788 (também conhecido como Intacta RR2 Pro Soybean, MON-87701-2 x MON-89788-1), DAS-81419-2 x DAS-44406-6 (também conhecido como Conkesta™ Enlist E3™ Soybean, DAS-81419-2 x DAS-44406-6), Evento DAS68416-4 x Evento MON 89788 (também conhecido como Enlist™ RoundUp Ready® 2 Soybean, DAS-68416-4 X MON-89788-1), Evento MON-87769-7 x Evento MON-89788-1 (também conhecido como Omega-3 X Genuity Roundup
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Ready 2 Yield Soybeans), Evento MON 87705 x Evento MON 89788 (também conhecido como Vistive Gold, MON-87705-6 x MON-89788-1) ou Evento MON87769 x Evento MON89788 (também conhecido como Omega-3 x Genuity Roundup Ready 2 Yield Soybeans, MON-87769-7 x MON-89788-1).
[00124] É também proporcionada aqui uma planta de soja ou sua parte compreendendo evento EE-GM4, que semente de soja representativa compreendendo evento EE-GM4 foi depositada sob o número de acesso da ATCC PTA-123624. São adicionalmente proporcionadas aqui sementes de tais plantas, compreendendo tal evento, bem como um produto de soja produzido a partir de tais sementes, em que o referido produto de soja compreende o evento EE-GM4. Tal produto de soja pode ser ou pode compreender farelo de soja, grão de soja triturado, flocos de soja, farinha de soja ou um produto compreendendo qualquer um destes produtos de soja processados. Particularmente, tal produto de soja compreende um ácido nucleico que produz um diagnóstico de amplicon do ou específico do evento EE-GM4, compreendendo tal amplicon a sequência de qualquer um de SEQ ID No. 1 ou 3 ou SEQ ID No. 2 ou 4. É também proporcionado um método para produção de um produto de soja, compreendendo obtenção de uma semente ou grão de soja compreendendo evento EE-GM4 e produção de tal produto de soja a partir dele. É também proporcionado aqui um método de obtenção de alimento, ração ou produtos industriais processados derivados a partir de grão de soja, tal como óleo de soja, proteína de soja, lecitina, leite de soja, tofu, margarina, biodiesel, biocompósitos, adesivos, solventes, lubrificantes, limpadores, espuma, tinta, tintura, velas, alimento ou produtos de ração (animal) contendo óleo de soja ou proteína de soja, compreendendo o referido método obtenção de grão compreendendo EEGM4 e produção do referido alimento, ração ou produto industrial processado. Em uma modalidade, este processo pode também incluir o passo de obtenção de uma semente ou planta de soja compreendendo evento EE-GM4, cultivo da
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99/149 referida semente ou planta em um campo e coleta de grão de soja. Opcionalmente, este método inclui aplicação de um herbicida inibidor de HPPD tal como IFT, topramezona ou mesotriona antes do plantio, antes da emergência, após emergência ou sobre o topo de plantas compreendendo EE-GM4. Em uma modalidade, os alimentos, ração ou produtos industriais processados derivados a partir de soja estão incluídos em esta invenção, tais como tais produtos processados que produzem um amplicon específico do evento EE-GM4 usando os métodos descritos aqui ou que compreendem a sequência de nucleotídeos de qualquer um de SEQ ID No. 1,3 ou 5 a SEQ ID No. 2, 4 ou 6.
[00125] É também proporcionada aqui uma planta de soja, que é descendência de qualquer uma das plantas de soja acima, e que compreende o evento EE-GM4, tal como uma planta ou semente de descendência de qualquer uma das plantas de soja acima que compreende a sequência de SEQ ID No. 1 ou 3 ou a sequência de SEQ ID No. 2 ou 4 ou uma planta ou semente de descendência de qualquer uma das plantas de soja acima que compreende a sequência de SEQ ID No. 1 ou 3 e a sequência de SEQ ID No. 2 ou 4 ou uma planta ou semente de descendência de qualquer uma das plantas de soja acima que compreende a sequência de SEQ ID No. 5 ou SEQ ID No. 24 ou a sequência de SEQ ID No. 6 ou SEQ ID No. 25 ou uma planta ou semente de descendência de qualquer uma das plantas de soja acima que compreende a sequência de SEQ ID No. 5 ou SEQ ID No. 24 e a sequência de SEQ ID No. 6 ou SEQ ID No. 25.
[00126] É adicionalmente proporcionado aqui um método para produção de uma planta de soja resistente a nematódeos e tolerante ao herbicida isoxaflutol e/ou topramezona e/ou mesotriona, compreendendo introdução no genoma de tal planta do evento EE-GM4, particularmente por cruzamento de uma primeira planta de soja não tendo o evento EE-GM4 com uma planta de soja compreendendo EE-GM4 e seleção de uma planta de descendência
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100/149 resistente a nematódeos e tolerante ao herbicida isoxaflutol e/ou topramezona e/ou mesotriona.
[00127] É também proporcionada aqui uma planta de soja resistente a nematódeos e tolerante ao herbicida isoxaflutol, topramezona ou mesotriona com características agronômicas aceitáveis, compreendendo um Cry14Ab-1 e proteína HPPD-4 e capaz de produzir um diagnóstico de amplicon para o evento EE-GM4. São também proporcionados aqui os amplicons isolados específicos (fragmentos de sequências de DNA) como tal, que podem ser obtidos usando as ferramentas de detecção específicas descritas aqui, particularmente amplicons incluindo na sua sequência um fragmento de DNA tendo origem em DNA flanqueante de T-DNA 5 'ou 3' e o T-DNA inserido no genoma da planta por transformação, como definido aqui.
[00128] É adicionalmente proporcionado aqui um método para controle de ervas daninhas em um campo de plantas de soja compreendendo o evento EE-GM4 ou um campo a ser plantado com tais plantas de soja (em que as referidas plantas são plantadas no referido campo após tratamento), compreendendo tratamento do campo com uma quantidade eficaz de um herbicida inibidor de HPPD tal como um herbicida à base de isoxaflutol ou à base de topramezona ou à base de mesotriona, em que tais plantas são tolerantes a tal herbicida.
[00129] É adicionalmente proporcionado aqui um DNA compreendendo a sequência da SEQ ID No. 5 ou 6 ou uma sequência essencialmente similar a ela e qualquer planta, célula, tecido ou semente, particularmente de soja, compreendendo tal sequência de DNA, tal como uma planta, célula, tecido ou semente compreendendo EE-GM4. Está também incluída aqui qualquer planta, célula, tecido ou semente de soja, compreendendo a sequência de DNA (heteróloga ou estranha a uma planta, semente, tecido ou célula de soja convencional) de SEQ ID No. 5 ou 6 ou compreendendo uma
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101/149 sequência de DNA com pelo menos 99% ou 99,5% de identidade de sequências com a sequência de SEQ ID No. 5 ou 24 ou SEQ ID No. 6 ou 25.
[00130] É também descrito um DNA quimérico compreendendo um T-DNA inserido, em que a sequênciado referido T-DNA inserido compreende a sequência de SEQ ID No. 11 a partir do nucleotídeo 17 até ao nucleotídeo 7621 ou SEQ ID No. 23 a partir do nucleotídeo 1059 até ao nucleotídeo 8663 ou uma sequência com pelo menos 97, 98, 99, 99,5 ou pelo menos 99,9% de identidade de sequências com ela, flanqueada por uma região flanqueante de T-DNA 5' ou 3', em que a região flanqueante de T-DNA 5' imediatamente a montante do e contíguo com o referido T-DNA inserido é caracterizada por uma sequência compreendendo a sequência de SEQ ID No. 5 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 227 ou de SEQ ID No. 24 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 1058 em que a região flanqueante de T-DNA 3' imediatamente a jusante do e contíguo com o referido T-DNA inserido é caracterizada por uma sequência compreendendo a sequência de SEQ ID No. 6 a partir do nucleotídeo 254 até ao nucleotídeo 501 ou a sequência de nucleotídeos do complemento de SEQ ID No. 25 a partir do nucleotídeo 254 até ao nucleotídeo 1339. Em uma modalidade, a sequência do referido T-DNA inserido consiste na sequência de SEQ ID No. 11 a partir do nucleotídeo 17 até ao nucleotídeo 7621 ou SEQ ID No. 23 a partir do nucleotídeo 1059 até ao nucleotídeo 8663 ou uma sequência com pelo menos 97, 98, 99, 99,5 ou pelo menos 99,9% de identidade de sequências com ela, flanqueada por parte de uma região flanqueante de T-DNA 5' ou 3', em que a referida parte da região flanqueante de T-DNA 5' imediatamente a montante do e contíguo com o referido T-DNA inserido é caracterizada por uma sequência consistindo na sequência de SEQ ID No. 5 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 227 ou de SEQ ID No. 24 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 1058 ou uma sequência com pelo menos 97, 98, 99, 99,5 ou pelo menos 99,9% de identidade de sequências com ela e em que a referida parte da região
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102/149 flanqueante de T-DNA 3' imediatamente a jusante do e contíguo com o referido T-DNA inserido é caracterizada por uma sequência consistindo na sequência de SEQ ID No. 6 a partir do nucleotídeo 254 até ao nucleotídeo 501 ou a sequência de nucleotídeos do complemento de SEQ ID No. 25 a partir do nucleotídeo 254 até ao nucleotídeo 1339 ou uma sequência com pelo menos 97, 98, 99, 99,5 ou pelo menos 99,9% de identidade de sequências com ela.
[00131] DNA quimérico se refere a sequências de DNA, incluindo sequências reguladoras e codificantes que não são encontradas em conjunto na natureza. Conformemente, um DNA quimérico pode compreender regiões de DNA adjacentes umas às outras que são derivadas a partir de fontes diferentes ou que estão dispostas em um modo diferente daquele encontrado na natureza. Exemplos de um DNA quimérico são as sequências de SEQ ID No. 5 ou 6.
[00132] É também proporcionada aqui uma planta, célula de planta, tecido ou semente de soja transgênico, compreendendo em seu genoma o evento EE-GM4 caracterizado por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos essencialmente similar a SEQ ID No. 1 ou 3 e uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos essencialmente similar a SEQ ID No. 2 ou 4 ou o complemento das referidas sequências, bem como uma planta, célula de planta, tecido ou semente de soja, compreendendo em seu genoma o evento EE-GM4 caracterizado por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos essencialmente similar a SEQ ID No. 5 ou 24 e SEQ ID No. 6 ou 25 ou o complemento das referidas sequências.
[00133] É ainda adicionalmente proporcionada aqui uma planta, célula de planta, tecido ou semente de soja, compreendendo EE-GM4, caracterizado por compreender no genoma das suas células uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos
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99% ou 100% de identidade de sequências com qualquer urn de SEQ ID No. 1, 3, 5 ou 24 e uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com qualquer um de SEQ ID No. 2, 4, 6 ou 25 ou o complemento das referidas sequências.
[00134] O termo “isoxaflutol”, como usado aqui, se refere ao herbicida isoxaflutol [i.e., (5-ciclopropil-4-isoxazolil)[2-(metilsulfonil)-4(trifluorometil)fenil]metanona], ao seu metabolito ativo, dicetonitrila, e quaisquer misturas ou soluções compreendendo o referido composto. Herbicidas inibidores de HPPD úteis para aplicação no evento desta invenção são as dicetonitrilas, p.ex., 2-ciano-3-ciclopropil-1 -(2-metilsulfonil-4-trifluorometilfenil)-propano-1,3diona e 2-ciano-1 -[4-(meti Isu If oni l)-2-trif luorometilfen il]-3-( 1 metilciclopropil)propano-1,3-fiona; outros isoxazóis; e os pirazolinatos, p.ex., topramezona [i.e., [3-(4,5-di-hidro-3-isoxazolil)-2-metil-4-(metilsulfonil)fenil](5hidróxi-1-metil-1 H-pirazol-4-il)metanona] e pirassulfotol [(5-hidróxi-1,3dimetilpirazol-4-il(2-mesil-4-trifluorometilfenil)metanona]; ou mesotriona [2-[4(Metilsulfonil)-2-nitrobenzoil]ciclo-hexano-1,3-diona]; ou 2-cloro-3-(metilsulfanil)N-(1 -metil-1 H-tetrazol-5-il)-4-(trifluorometil)benzamida]; 2-metil-N-(5-metil-1,3,4oxadiazol-2-il)-3-(metilsulfonil)-4-(trifluorometil)benzamida; ou pirazofeno [2-[4(2,4-diclorobenzoil)-1,3-dimetilpirazol-5-ilóxi]acetofenona].
[00135] Em uma modalidade desta invenção, um campo a ser plantado com plantas de soja contendo o evento EE-GM4 pode ser tratado com um herbicida inibidor de HPPD, tal como isoxaflutol (IFT”), topramezona ou mesotriona ou com tanto um herbicida inibidor de HPPD como glifosato, antes de a soja ser semeada, que limpa o campo de ervas daninhas que são mortas pelo inibidor de HPPD e/ou glifosato, permitindo práticas de plantio direto, seguido por plantio ou semeadura da soja em esse mesmo campo pré-tratado posteriormente (aplicação de queima usando um herbicida inibidor de HPPD). A
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104/149 atividade residual do IFT protegerá também as plantas de soja emergentes e cultivadas da competição por ervas daninhas nas etapas de cultura iniciais. Logo que as plantas de soja tenham um certo tamanho, e as ervas daninhas tendam a reaparecer, um inibidor de HPPD ou uma mistura de um inibidor de HPPD com um herbicida seletivo (convencional) de soja ou uma mistura de inibidor de HPPD com um herbicida que não é seletivo em soja (p.ex., glifosato ou glufosinato) mas para o qual as plantas contêm um gene/lócus de tolerância tal que sejam tolerantes ao referido herbicida podem ser aplicadas como herbicidas pósemergente sobre o topo das plantas.
[00136] Em outra modalidade desta invenção, um campo no qual sementes contendo o evento EE-GM4 foram semeadas pode ser tratado com um herbicida inibidor de HPPD, tal como IFT, topramezona ou mesotriona, antes de as plantas de soja emergirem mas após as sementes serem semeadas (o campo pode ser tornando isento de ervas daninhas antes da semeadura usando outros meios, incluindo práticas convencionais de lavra do solo tais como aração, cinzelamento ou preparação de leitos de sementes), onde a atividade residual manterá o campo isento de ervas daninhas mortas pelo herbicida tal que as plantas de soja emergentes e cultivadas não tenham competição por ervas daninhas (aplicação pré-emergência de um herbicida inibidor de HPPD). Logo que as plantas de soja tenham um certo tamanho, e as ervas daninhas tendam a reaparecer, um inibidor de HPPD ou uma mistura inibidor de HPPD-herbicida seletivo (convencional) de soja ou uma mistura de inibidor de HPPD com um herbicida que não é seletivo em soja (p.ex., glifosato ou glufosinato) mas para o qual as plantas contêm um gene/lócus de tolerância tal que as referidas plantas sejam tolerantes ao referido herbicida podem ser aplicadas como herbicidas pósemergente sobre o topo das plantas. Em uma modalidade da invenção é proporcionado um processo para controle de ervas daninhas compreendendo semeadura em um campo de sementes de soja contendo EE-GM4 e tratamento
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105/149 do referido campo com um herbicida inibidor de HPPD antes de as plantas emergirem a partir da referida semente, mas após as sementes serem semeadas.
[00137] Em outra modalidade desta invenção, as plantas contendo o evento EE-GM4 podem ser tratadas com um herbicida inibidor de HPPD, tal como IFT, topramezona ou mesotriona, sobre o topo das plantas de soja que emergiram a partir das sementes que foram semeadas, que limpa o campo de ervas daninhas mortas pelo inibidor de HPPD, cuja aplicação pode ser em conjunto com (p.ex., em uma mistura de tanque de pulverização), seguida por ou precedida por um tratamento com um herbicida pós-emergente seletivo (convencional) de soja ou um herbicida que não é seletivo em soja (p.ex., glifosato ou glufosinato) mas para o qual as plantas contêm um gene/lócus de tolerância tal que as referidas plantas sejam tolerantes ao referido herbicida, sobre o topo das plantas (aplicação pós-emergência de um herbicida inibidor de HPPD (com ou sem o referido herbicida seletivo ou não seletivo de soja)).
[00138] Igualmente, de acordo com a corrente invenção, as plantas de soja abrigando EE-GM4 (que podem também conter outro evento/traço da soja de tolerância a herbicidas como descrito aqui) podem ser tratadas com, ou sementes de soja abrigando EE-GM4 podem ser revestidas com, qualquer inseticida, herbicida ou fungicida da soja.
[00139] Os seguintes exemplos descrevem o desenvolvimento e identificação do evento de elite EE-GM4, o desenvolvimento de diferentes linhas de soja compreendendo este evento e o desenvolvimento de ferramentas para a identificação específica do evento de elite EE-GM4 em amostras biológicas.
[00140] A não ser que apresentado de outro modo nos Exemplos, todas as técnicas recombinantes são levadas a cabo de acordo com protocolos padrão como descrito em “Sambrook J e Russell DW (eds.) (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3â Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
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Nova Iorque” e em “Ausubel FA, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA e Struhl K (eds.) (2006) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Nova Iorque”.
[00141 ] Os materiais e referências padrão são descritos em “Croy RDD (ed.) (1993) Plant Molecular Biology LabFax, BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford and Blackwell Scientific Publications, Oxford” e em “Brown TA, (1998) Molecular Biology LabFax, 2a Edição, Academic Press, San Diego”. Os materiais e referências padrão para reações em cadeia da polimerase (PCR) podem ser encontrados em “McPherson MJ e Moller SG (2000) PCR (The Basics), BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford” e em “PCR Applications Manual, 3â Edição (2006), Roche Diagnostics GmbH, Mannheim ou www.roche-appliedscience.com”.
[00142] Deve ser entendido que um número de parâmetros em qualquer protocolo lab tal como os protocolos de PCR nos Exemplos em baixo pode necessitar de ser ajustado às condições laboratoriais específicas e pode ser modificado ligeiramente para se obterem resultados similares. Por exemplo, o uso de um método diferente para preparação de DNA ou a seleção de outros iniciadores em um método de PCR pode ditar outras condições ótimas para o protocolo de PCR. Estes ajustes serão no entanto aparentes a um perito na técnica e são além do mais detalhados em manuais de aplicação de PCR correntes.
[00143] Na descrição e exemplos é feita referência às seguintes sequências na Listagem de Sequências anexada:
| SEQ ID No. 1: | junção 5' EE-GM4 |
| SEQ ID No. 2: | junção 3' EE-GM4 |
| SEQ ID No. 3: | junção 5' de EE-GM4 |
| SEQ ID No. 4: | junção 3' de EE-GM4 |
| SEQ ID No. 5: | região 5' de EE-GM4 |
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SEQ ID No. 6: região 3'de EE-GM4
SEQ ID No. 7: sequência codificando cry14Ab-1.b
SEQ ID No. 8: sequência de aminoácidos da proteína
Cry14Ab-1
SEQ ID No. 9: sequência codificando hppdPf-4Pa
SEQ ID No. 10: sequência de aminoácidos da proteína HPPD4
SEQ ID No. 11: plasmideo transformante pSZ8832 sequência entre fronteiras de T-DNA
| SEQ ID No. 12: | iniciador PRIM0937 |
| SEQ ID No. 13: | iniciador PRIM0938 |
| SEQ ID No. 14: | sonda TM1734 |
| SEQ ID No. 15: | iniciador SHA071 |
| SEQ ID No. 16: | iniciador SHA072 |
| SEQ ID No. 17: | sonda TM1428 |
| SEQ ID No. 18: | iniciador PRIM1652 |
| SEQ ID No. 19: | sonda TM2084 |
| SEQ ID No. 20: | iniciador PRIM0939 |
| SEQ ID No. 21: | iniciador PRIM0940 |
| SEQ ID No. 22: | sonda TM1735 |
| SEQ ID No. 23: | evento de soja EE-GM4 |
| SEQ ID No. 24: | sequência de junção 5' de EE-GM4 |
| SEQ ID No. 25: | sequência de junção 3' de EE-GM4 |
| SEQ ID No. 26: | iniciador GLPB173 |
| SEQ ID No. 27: | iniciador GLPB175 |
| SEQ ID No. 28: | iniciador GLPB167 |
| SEQ ID No. 29: | iniciador GLPB170 |
| SEQ ID No. 30: | sequência de lócus pré-inserção |
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Exemplos
1. Transformação de Glycine max com um gene de resistência a nematódeos e um de tolerância e herbicidas
1.1. Descrição do T-DNA inserido compreendendo os genes quiméricos cry14Ab-1.be hppdPf-4Pa [00144] Soja EE-GM4 foi desenvolvida através de transformação mediada por Agrobacterium usando o vetor pSZ8832 contendo cassetes de expressão de hppdPf-4Pa e cry14Ab-1.b:
(i) O gene hppdPf-4P mutante que codifica a proteína HPPD-4. A sequência codificando hppdPf-4Pa foi desenvolvida por introdução de mutações pontuais na posição 335 (substituição de Glu por Pro), na posição 336 (substituição de Gly por Trp), na posição 339 (substituição de Lys por Ala) e na posição 340 (substituição de Ala por Gin) em um DNA codificando a proteína HPPD derivada a partir da estirpe de Pseudomonas fluorescens A32. A expressão da proteína HPPD-4 confere tolerância a herbicidas inibidores de HPPD, tais como isoxaflutol ou mesotriona.
(ii) O gene cry14Ab-1.b codifica a proteína Cry14Ab-1. A expressão da proteína Cry14Ab-1 confere resistência a nematódeos tais como ao nematódeo dos cistos da soja Heterodera glycines.
[00145] O plasmídeo pSZ8832 é um vetor de transformação de plantas que contém um gene cry14Ab-/.b quimérico e um gene hppdPf-4Pa quimérico localizado entre a fronteira direita (RB) de T-DNA e a fronteira esquerda (LB) de T-DNA. Uma descrição dos elementos genéticos compreendidos no T-DNA entre a fronteira direita e a esquerda de T-DNA é dada na Tabela 1 em baixo. O sequenciamento confirmador do T-DNA (entre as fronteiras do T-DNA) deste plasmídeo resultou na sequência de SEQ ID No. 11. A sequência de nucleotídeos das sequências codificando cry14Ab-1.be hppdPf
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4Pa (mostrando a fita codificante) está representada em SEQ ID No. 7 e 9, respectivamente.
[00146] Tabela 1: Descrição dos elementos genéticos entre as fronteiras do T-DNA em pSZ8832 e posições de nucleotídeos em SEQ ID No.
11.
| Posição em SEQ ID No. 11 | Orientação | Descrição |
| 1 -130 | Sequência de poliligante: sequência usada em clonagem | |
| 131 - 400 | Sentido anti-horário | sequência incluindo a região não traduzida 3' do transcrito de 35S do Vírus do Mosaico da Couve-Flor (Sanfaçon etal., 1991, Genes & development, 5 (1), 141149) |
| 401 411 | Sequência de poliligante: sequência usada em clonagem | |
| 412 - 3969 | Sentido anti-horário | cry14Ab-1.b·. sequência codificante do gene da delta-endotoxina de Bacillus thuringiensis |
| 3970 - 5276 | Sentido anti-horário | PubiWAt: sequência incluindo a |
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| Posição em SEQ ID No. 11 | Orientação | Descrição |
| região promotora do gene da ubiquitina-10 de Arabidopsis thaliana (Grefen et al., 2010, The Plant journal, 64 (2), 355365) | ||
| 5277 - 5381 | Sequência de poliligante: sequência usada em clonagem | |
| 5382 - 5576 | Sentido anti-horário | sequência incluindo a região não traduzida 3' do transcrito de 35S do Vírus do Mosaico da Couve-Flor (Sanfaçon etal., 1991, Genes & development, 5 (1), 141149) |
| 5577 - 5588 | Sequência de poliligante: sequência usada em clonagem | |
| 5589 - 6665 | Sentido anti-horário | hppdPf-4Pa: sequência codificando uma 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenase variante derivada a partir de |
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| Posição em SEQ ID No. 11 | Orientação | Descrição |
| Pseudomonas fluorescens | ||
| 6666 - 7037 | Sentido anti-horário | TPotpY-1 Pf: sequência codificante de um derivado de peptídeo de trânsito otimizado (posição 55 mudada para Tyr), contendo sequência dos genes da pequena subunidade de RuBisCO de Zea mays e Helianthus annuus (Patente dos EUA 5510471) |
| 7038 - 7058 | Sequência de poliligante: sequência usada em clonagem | |
| 7059 - 7185 | Sentido anti-horário | sequência incluindo a sequência líder do RNA genômico do Vírus Etch do Tabaco (Allison et al., 1985, Virology, 147 (2), 309-316) |
| 7186 - 7191 | Sequência de poliligante: sequência usada em clonagem | |
| 7192 - | Sentido | sequência |
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| Posição em SEQ ID No. 11 | Orientação | Descrição |
| 7941 | anti-horário | incluindo a região promotora intensificada dupla do transcrito do genoma de 35S do Vírus do Mosaico da Couve-Flor (Kay et ai., 1987, Science, 236 (4806), 1299-1302) |
| 7942 - 8068 | Sequência de poliligante: sequência usada em clonagem |
1.2. Evento EE-GM4 [00147] O vetor de T-DNA pSZ8832 foi introduzido em
Agrobacterium tumefaciens e plantas de soja transformadas (var. Thorne) foram selecionadas usando tolerância a inibidores de HPPD de acordo com métodos conhecidos na técnica. As plantas sobreviventes foram depois autopolinizadas para gerar semente T1. Gerações subsequentes foram produzidas através de autopolinização ou através de cruzamento em outro germoplasma de soja.
1.2.1 Identificação do evento de elite EE-GM4 [00148] O evento de elite EE-GM4 foi selecionado com base em um procedimento de seleção extensivo (com base em parâmetros incluindo mas não se limitando a eficácia do traço na estufa e no campo, características moleculares e características agronômicas) de uma ampla gama de diferentes eventos de transformação obtidos usando os mesmos genes quiméricos. Foi descoberto que as plantas de soja contendo EE-GM4 tinham uma inserção dos transgenes em um lócus único no genoma das plantas de soja, tinham
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113/149 agronomia similar às plantas progenitoras usadas para transformação, não causavam penalidade no rendimento pela inserção do DNA transformante (em comparação com uma linha isogênica correspondente sem o evento, tal como uma linha de plantas “nula” obtida a partir de uma planta transformada na qual os transgenes não foram segregados), resultavam em uma redução significativa de fêmeas adultas infestando as raízes em um ensaio de estufa de SCN padrão e tinham rendimento melhorado sob elevada pressão de nematódeos SCN no campo em comparação com a linha nula isogênica não contendo EE-GM4. Adicionalmente, a tolerância à aplicação de herbicidas inibidores de HPPD foi medida em ensaios de campo, mas a tolerância herbicida não foi um critério de seleção para seleção do evento de elite.
1.2.1.1 Análise molecular do evento [00149] Resultados da transferência de Western mostraram que EE-GM4 contêm um único lócus transgênico que contém uma única cópia do gene quimérico cry14Ab-1.b e uma única cópia do gene quimérico hppdPf-4Pa. EE-GM4 não tem uma parte do promotor de 35S do gene quimérico hppdPf-4Pa (indicando que nem todo o T-DNA inteiro de SEQ ID No. 11 foi inserido no genoma da soja durante a transformação). Nenhuns fragmentos de PCR foram obtidos após análise de PCR usando iniciadores visando sequências do esqueleto do vetor que estão a flanquear a fronteira esquerda e direita do T-DNA bem como a sequência aadA. Igualmente, a presença de fragmentos de integração de EE-GM4 idênticos em múltiplas gerações de EE-GM4 demonstra a estabilidade estrutural do evento.
1.2.1.2 Herança do evento [00150] A herança da inserção de T-DNA inserido em gerações subsequentes por teste do genótipo de genes hppdPf-4Pa e cry14Ab-1.b por análise de PCR mostra que os genes hppdPf-4Pa e cry14Ab-1.b contidos dentro da inserção de EE-GM4 são herdados de um modo previsível e como esperado
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114/149 para uma inserção única. Estes dados são consistentes com princípios mendelianos e apoiam a conclusão de que o evento EE-GM4 consiste em uma única inserção integrada em um lócus cromossomal único dentro do genoma nuclear da soja.
[00151] Igualmente, a análise dos padrões de segregação de EEGM4 em gerações subsequentes após introgressão de EE-GM4 em 5 linhas de soja de elite confirmou segregação mendeliana normal. A Tabela 2 mostra a segregação observada de EE-GM4 em diferentes populações segregantes.
[00152] Tabela 2. Análise de segregação EE-GM4
| Progenitor | Geração | Observada | |||
| HH | Hemi | ||||
| 1 | Progenitor | BC2F2 | 437 | 863 | |
| 1 | Progenitor | BC3F2 | 101 | 201 | |
| 2 | Progenitor | BC2F2 | 52 | 127 | |
| 2 | Progenitor | BC3F2 | 14 | 41 | |
| 3 | Progenitor | BC2F2 | 41 | 76 | |
| 3 | Progenitor | BC3F2 | 21 | 31 | |
| 4 | Progenitor | F2 | 185 | 393 | |
| Progenitor | BC2F2 | 63 | 143 |
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| Progenitor | Geração | Observada | |
| HH | Hemi | ||
| 5 |
[00153] Na Tabela 2, ΉΗ” representa plantas homozigotas, “Hemi” plantas hemizigotas e “nulo” segregantes nulos tendo perdido EE-GM4 e “ns” significa não estatisticamente significativo (quanto a qualquer variação a partir de segregação normal/esperada). Em estes ensaios, o Progenitor 1 foi uma linha MG VI com resistência a SON de Rhg1 e Rhg4, o Progenitor 2 foi uma linha MG VI suscetível a SCN, o Progenitor 3 foi uma linha MG IX suscetível a SCN, o Progenitor 4 foi uma linha MG III com resistência a SCN de Rhg1 e o Progenitor 5 foi uma linha MG I suscetível a SCN.
1.2.1.3 Estabilidade da expressão de proteínas [00154] Os níveis de expressão de proteínas de proteínas HPPD4 e Cry14Ab-1 em plantas cultivadas em estufa foram determinados por ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA) em amostras de folha, raiz e semente coletadas a partir de diferentes gerações (p.ex., T4, T6 e BC2F3) de soja EEGM4. As proteínas HPPD-4 e Cry14Ab-1 exibem níveis médios de expressão similares em folha, raiz e semente ao longo de todas as gerações testadas. Quaisquer diferenças observadas nas concentrações de Cry14Ab-1 e HPPD-4 foram atribuídas à variabilidade planta-para-planta natural.
1.2.1.4 Desempenho agronômico e tolerância a herbicidas inibidores de HPPD [00155] Em ensaios de equivalência agronômica, plantas compreendendo EE-GM4 no fundo de transformação original (Thorne) foram comparadas com nulos segregantes (não tendo EE-GM4) e com plantas Thorne de tipo selvagem quando cultivadas na ausência de SCN. Os lotes não foram tratados com herbicidas de HPPD mas foram mantidos como isentos de ervas
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116/149 daninhas através do uso de herbicidas convencionais e remoção manual de ervas daninhas onde necessário. Nenhumas diferenças impactando o desempenho agronômico de um modo biologicamente significativo foram observadas entre as plantas contendo o evento e os nulos segregantes (não tendo EE-GM4) quando cultivadas em ensaios comparáveis em diferentes localizações quando se verificam características qualitativas de plantas tais como cor das flores, cor das vagens, cor das sementes e pubescência e características quantitativas como rendimento, altura, acamamento, suporte e dias até a maturidade. Consequentemente, as plantas compreendendo EE-GM4 mostraram características agronômicas normais comparáveis com as plantas não transgênicas correspondentes.
[00156] Ensaios adicionais com EE-GM4 no fundo de transformação de Thorne original foram conduzidos em 2017. Ensaios preliminares em que EE-GM4 estava em fundos genéticos MG1 e MG3 de elite foram também estabelecidos em um número limitado de localizações em 2017. Quando se verificaram características qualitativas de plantas tais como cor das flores, cor das vagens, cor das sementes e pubescência e características quantitativas como rendimento, altura, acamamento, suporte e dias até a maturidade foi descoberto um pequeno atraso (0,8 dias) na maturidade para plantas com EE-GM4, mas não foram observadas nenhumas diferenças agronomicamente significativas entre as plantas contendo o evento e os nulos segregantes (não tendo EE-GM4) em qualquer um dos três fundos genéticos, confirmando que as plantas compreendendo EE-GM4 mostraram características agronômicas normais.
[00157] A tolerância de plantas compreendendo EE-GM4 a herbicidas inibidores de HPPD foi testada em diferentes localizações no campo ao longo de 2 anos. Em estes ensaios foi descoberto que as plantas com EEGM4 tinham tolerância comercialmente relevante ao isoxaflutol (IFT) quando
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117/149 aplicado pré-emergência, mas os danos à cultura foram um pouco mais elevados para as aplicações pós-emergência de IFT. Estes ensaios mostraram também que as plantas contendo o evento EE-GM4 tinham tolerância comercialmente relevante à mesotriona (MST) quando aplicada pré-emergência ou quando aplicada pós-emergência. Todos os tratamentos pós-emergência foram na etapa V2-V3, com adjuvantes concentrado de óleo de cultura e sulfato de amônio adicionais para aumenta a atividade do herbicida.
[00158] A Fig. 5 mostra a média dos dados de fitotoxicidade (danos à planta) máximos registrados para tratamento com herbicidas em vários ensaios de campo ao longo de 2 anos, para plantas de soja contendo o evento EE-GM4 em comparação com plantas de soja não transformadas/convencionais. As plantas Thorne não transformadas de controle mostraram valores médios de fitotoxicidade máxima de cerca de 80 a 90% em estes mesmos ensaios, mostrando que estes herbicidas inibidores de HPPD não são tolerados pela soja (não GM). A “fitotoxicidade máxima” como usada aqui é a classificação de fitotoxicidade máxima registrada em qualquer observação durante a duração de um ensaio (com 3 a 4 observações por ensaio). Em aplicações existentes de controle de ervas daninhas, uma dose normal (1x) para isoxaflutol (IFT) em aplicação pré- ou pós-emergência e para MST em aplicação pós-emergência é 105 gr/ha e uma dose normal (1 x) para mesotriona em aplicação pré-emergência é 210 gr/ha. Consequentemente, em estes ensaios relatados na Fig. 5, as aplicações usadas em pré-emergência na Fig. 5 (420 gr/ha para IFT, 840 gr/ha para mesotriona) foram a 4 vezes a dose normal e, em pós-emergência (210 gr/ha para cada um de IFT e mesotriona), foram a 2 vezes a dose normal.
[00159] Igualmente, em vários ensaios de campo ao longo de 2 anos, as plantas de soja com o evento EE-GM4 tiveram boa tolerância na direção do composto inibidor de HPPD experimental 2-metil-N-(5-metil-1,3,4-oxadiazol2-il)-3-(metilsulfonil)-4-(trifluorometil)benzamida (patente dos EUA 9101141)
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118/149 quando aplicado pré-emergência a 400 gr de ai/ha ou pós-emergência a 200 gr de ai/ha, respectivamente (o valor médio de fitotoxicidade máxima para cada tratamento foi abaixo de 20%). Em estes ensaios, as plantas de soja com o evento EE-GM4 mostraram tolerância ao composto experimental 2-cloro-3(metilsulf ani I)-N-( 1 -metil-1 H-tetrazol-5-il)-4-(trifluorometil)benzamida (patente dos EUA 8481749) quando aplicado pós-emergência a 100-150 gr de ai/ha, mas a fitotoxicidade máxima média de 30% foi algo mais elevada do que para outros inibidores de HPPD. Todos os tratamentos pós-emergência foram na etapa V2V3, com adjuvantes concentrado de óleo de cultura e sulfato de amônio adicionais para aumenta a atividade do herbicida.
[00160] Classificações médias de fitotoxicidade máxima iguais ou muito similares que aquelas descritas na Fig. 5 foram obtidas para IFT quando se adicionaram os dados obtidos a partir de uma 3â estação de ensaios de campo de tolerância a herbicidas, aplicando herbicida de isoxaflutol às mesmas dosagens em pré ou pós a EE-GM4 quando em outra localização geográfica.
1.2.1.5 Resistência a nematódeos [00161] Ensaios de SCN padrão na estufa mostraram uma redução significativa de cistos de SCN em raízes de plantas contendo EE-GM4 quando comparadas com plantas de soja de tipo selvagem Thorne. Adicionalmente, ensaios de SCN padrão medindo o índice feminino na estufa mostraram também que as plantas de soja contendo o evento EE-GM4 e resistência a SCN nativa mostraram uma redução significativa de cistos de SCN em raízes em comparação com linhas de soja de elite resistentes a SCN sem EE-GM4. Quando EE-GM4 foi introgressado em uma linha de soja de elite com resistência à soja PI88788 (grupo de maturidade 3) ou em uma linha de soja de elite com resistência à soja Peking (grupo de maturidade 6.2), consistentemente um número reduzido de cistos de SCN nas raízes foi visto em comparação com raízes com resistência nativa sozinha.
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119/149 [00162] Em ensaios de campo ao longo de 2 anos em várias localizações, as plantas de soja contendo EE-GM4 deram um aumento significativo do rendimento em comparação com os segregantes nulos isogênicos em campos naturalmente infestados por SON. A Figura 6 mostra o rendimento de grãos de EE-GM4 no fundo transformante original (Thorne) como testado em 9 localizações diferentes ao longo de Iowa, Illinois, Indiana, Missouri e Tennessee em 2015 e 2016, em campos infestados por SCN (variando de infestação por SCN baixa a elevada). Ensaios adicionais com EE-GM4 no fundo transformante original (Thorne) foram conduzidos em 2017 em um total de 12 localizações com pressão variável (natural) de SCN. Ao longo de todos estes 12 ensaios, as plantas contendo EE-GM4 produziram uma média de rendimentos 8% mais elevados do que os segregantes nulos não tendo EE-GM4 (p = 0,02). A Fig. 7 mostra o rendimento de grãos de EE-GM4 quando introgressado (BC2F3) em uma linha de MG I (grupo de maturidade I) de elite que é suscetível a SCN e foi testado em uma localização no Minnesota e uma localização no Dakota do norte em 2016 (cada uma com elevado nível de infestação por SCN). A mesma linha MG I foi testada nas mesmas duas localizações (cada uma novamente com elevada infestação por SCN) e em um local de localização adicional no Wisconsin (tendo este último pressão moderada de SCN), e o rendimento de grãos de plantas contendo EE-GM4 foi consistentemente mais elevado do que os segregantes nulos correspondentes não tendo EE-GM4. Finalmente, estudos preliminares ao longo de três localizações com pressão de SCN moderada a elevada no Brasil em ensaios plantados tardiamente em 2017 mostraram um aumento médio significativo de 29% (p = 0,002) em uma linha de elite suscetível para plantas com EE-GM4 quando comparadas com o nulo segregante (não tendo EE-GM4). Devido à data de plantio posterior, os rendimentos globais em estes ensaios preliminares no Brasil tenderam a ser baixos e a variabilidade dentro de um ensaio foi algo elevada, o que pode ter
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120/149 influenciado a magnitude do aumento do rendimento, mas foi descoberto um aumento claramente significativo e visualmente observável do rendimento para plantas com EE-GM4. Consequentemente, o evento EE-GM4 confere um aumento significativo do rendimento em plantas de soja em campos infestados por SCN.
[00163] Em um estudo preliminar para avaliar o efeito do evento EE-GM4 no rendimento quando combinado com resistência a SCN nativa, uma série de populações F3 foi desenvolvida a partir do cruzamento único de EEGM4 com uma linha convencional MG III de elite transportando o gene de resistência rhg1 de PI88788. Nas populações F3, uma população “empilhada” que é homozigota quanto tanto ao evento EE-GM4 como ao alelo rhg1 foi comparada com uma população homozigota quanto apenas ao alelo rhg1 (não tendo EE-GM4). Ensaios de campo preliminares foram estabelecidos com estas populações em 2016 em três localizações com infestação moderada a elevada de SCN. Ao longo de todas as três localizações, a população “empilhada” (plantas homozigotas quanto ao evento EE-GM4 e ao alelo rhg1) produziu rendimentos 8% maiores do que a população transportando somente o alelo rhg 1 (p = 0,05). Estes resultados proporcionam indicações preliminares que a adição do evento a variedades com resistência convencional a SCN pode melhorar os rendimentos sob níveis moderados a elevados de pressão de SCN.
[00164] A condição de ensaios de campo sob infestação moderada a elevada por SCN é desafiante devido a muito fatores que têm um impacto nos resultados. As densidades de populações de SCN dentro de campos podem variar substancialmente e logo o impacto global de SCN no rendimento pode também variar de um lote para o seguinte (ver, p.ex., www.plantmanagementnetwork.org/pub/php/review/2009/sce08/). Tipos de solos favoráveis, boa fertilidade e chuva adequada podem mitigar o impacto de infestação por SCN na planta de soja e podem minimizar os impactos no
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121/149 rendimento mesmo sob elevadas populações de SCN. Muitos campos com populações muito elevadas de SCN tendem a ter solos fracos e assim menor potencial de rendimento, tornando difícil distinguir impactos significativos no rendimento. Assim, os dados de rendimento de ensaios de campo de SCN podem ser deveras variáveis e não se esperaria ver melhorias significativas no rendimento em todos os ensaios com elevadas populações de SCN. As tendências globais ao longo de ensaios são os critérios mais relevantes para avaliação do desempenho de um evento.
[00165] Ensaios de campo de SCN que foram feitos com plantas contendo EE-GM4 foram estabelecidos em campo com infestação natural por SCN. As unidades experimentais consistiram em um lote de campo contendo 2 a 4 linhas espaçadas com intervalo de 0,76 m e variando de 3,8 a 9,1 m em comprimento. O número de linhas por lote e comprimento dos lotes variariam de localização para localização com base no tamanho do campo e configurações do equipamento. Os lotes foram semeados a 26 sementes por metro e logo cada unidade experimental continha entre 200 e 960 sementes. Os lotes foram randomizados no campo usando um desenho de lotes subdivididos e lotes subsubdivididos. Os desenhos de lotes subdivididos são bem ajustados para ajudar a minimizar o efeito de elevada variabilidade no tipo de solo ou populações de SCN que é comum em campos infestados por SCN. Em ensaios de campo de SCN, plantas compreendendo EE-GM4 foram plantadas em um sublote próximo de, ou muito próximo de, um sublote acompanhante contendo plantas nulas segregantes (sem EE-GM4). A proximidade íntima dos dois lotes ajuda a minimizar o efeito de variabilidade de campos (SCN) na estimativa da diferença entre as plantas com e sem evento EE-GM4. A maioria dos ensaios foi replicada quatro vezes, mas alguns foram replicados três vezes e alguns foram replicados cinco ou seis vezes.
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122/149 [00166] Igualmente foram observadas infestações moderadas a graves de Síndrome da Morte Súbita (SDS) em duas localizações (Indiana e lowa) em 2016 onde as plantas com EE-GM4 foram testadas em campo. Os lotes em estas duas localizações foram classificados quanto à incidência e gravidade de sintomas de SDS e o índice de Doença (DX) de SDS foi calculado usando o “Método SIIIC de Pontuação de SDS” (www.scnresearch.info/462.pdf). As classificações de DX em plantas homozigotas quanto ao evento EE-GM4 foram 43% mais baixas no Indiana e 33% mais baixas no lowa do que no segregado nulo suscetível (não tendo EE-GM4), indicando que o evento estava proporcionando proteção contra infeção por SDS. SDS e SCN estão frequentemente intimamente associados no campo e mostrarão algumas interações na planta (ver, p.ex., www.soybeanresearchinfo.com/pdf_docs/sdsupdate.pdf e www.apsnet.org/edcenter/intropp/lessons/fungi/ascomycetes/page s/suddendeath.aspx).
[00167] Em 2017, as pontuações de Clorose com Deficiência em Ferro (IDC) foram reunidas em plantas com EE-GM4 (e seus segregantes nulos) em uma localização nos EUA (com elevada infestação por SCN) onde foram observados sintomas de IDC. O ensaio foi um desenho de lotes subdivididos olhando para o efeito do evento em três fundos diferentes. As classificações de IDC foram tomadas como descrito por Cianzio et al. (1979) Crop Science 19: 644-646. A Fig. 10 mostra as médias de pontuações de IDC para plantas com o evento EE-GM4 e aquelas para os segregantes nulos correspondentes (não tendo EE-GM4) ao longo de três fundos genéticos (1 resistente a SCN (resistência PI88788), 1 suscetível a SCN e o fundo Thorne suscetível a SCN). Foram encontradas pontuações de IDC mais baixas para plantas contendo EEGM4 em comparação com seus segregantes nulos. Consequentemente, EE
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GM4 consegue reduzir a gravidade foliar de IDC em um ensaio de campo onde plantas de soja são desafiadas por SCN e IDC.
[00168] Igualmente, sementes Thorne não transformadas e EEGM4 foram germinadas e plantadas na estufa para verificar controle do nematódeo formador de lesões, Pratylenchus brachyurus. Nematódeos Pratylenchus brachyurus (# 1500/planta, diferentes etapas de desenvolvimento) foram aplicados às plantas quando 2 semanas de idade. 30 dias após aplicação, os nematódeos Pratylenchus foram extraídos a partir das raízes e contados. O número médio de nematódeos encontrados nas raízes de plantas contendo EEGM4 foi comparado com o número médio de nematódeos Pratylenchus encontrados em raízes de plantas Thorne de tipo selvagem. Em média foram encontrados cerca de 80-90% menos nematódeos Pratylenchus em raízes de plantas contendo EE-GM4 quando comparadas com as raízes de controle Thorne, indicando controle significativo de nematódeos formadores de lesões pelo evento de soja EE-GM4.
[00169] A Figura 8 mostra resultados de um ensaio de estufa de Pratylenchus brachyurus nos EUA, comparando as linhas de elite com EE-GM4 em 5 linhas de soja de elite (uma suscetível a (MG 1), uma resistente a SCN (PI88788, MG 3), uma suscetível a SCN (MG 6.2), uma resistente a SCN (Peking, MG 6.2) e uma suscetível a SCN (MG 9)) com linhas de soja dos EUA suscetíveis e SCN e resistentes a SCN. As plantas de soja foram cultivadas em pequenos vasos cônicos e mantidas em estufas com temperatura variando entre 25-32 °C. Nematódeos Pratylenchus brachyurus, obtidos a partir da Carolina do sul e aumentados na estufa, foram usados para inocular plantas na etapa de desenvolvimento V2-V3. Aproximadamente 1500 ovos + adultos foram inoculados por planta e cada entrada tinha 5 plantas. 30 dias após infestação, os nematódeos e os ovos foram extraídos a partir das raízes e contados. Cada entrada foi operada em duas experiências independentes. Enquanto as linhas
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124/149 de soja dos EUA suscetíveis a SCN e resistentes a SCN não tivessem mostrado controle de Pratylenchus, as plantas com EE-GM4 mostraram cerca de 85% de controle de Pratylenchus.
[00170] A Figura 9 mostra resultados de um ensaio de estufa de Pratylenchus brachyurus no Brasil, comparando plantas de soja com EE-GM4 com linhas de soja do Brasil sem resistência e 1 linha com baixo Rf e plantas suscetíveis e resistentes a SCN. As linhas de soja foram cultivadas em pequenos vasos cônicos e mantidas em estufas com temperatura variando entre 25-32 °C. Nematódeos Pratylenchus brachyurus, obtidos a partir de campos do Brasil e aumentados na estufa, foram usados para inocular plantas na etapa de desenvolvimento V2-V3. Aproximadamente 1000 ovos + adultos foram inoculados por planta e cada entrada tinha 5 plantas. 30 dias após infestação, os nematódeos e os ovos foram extraídos a partir das raízes e contados. Os resultados mostrados são de uma única experiência. Uma linha de soja brasileira (BRS 7380), etiquetada como tendo um baixo fator reprodutor para Pratylenchus, mostra cerca de 89% de redução de Pratylenchus. As plantas com EE-GM4 deram -97% de controle de Pratylenchus. As linhas de soja que transportam resistência nativa a SCN (rhg1 + Rhg4) não controlam Pratylenchus brachyurus.
[00171] Igualmente, as plantas contendo EE-GM4 podem ser usadas para controlar nematódeos dos nódulos radiculares (RKN) tais como Meloidogyne incognita. Embora a população de Meloidogyne incognita não infeste a soja de tipo selvagem Thorne muito bem, as plantas Thorne com EEGM4 mostram uma redução adicional no número de ovos/massa radicular de RKN em média, em comparação com plantas Thorne não transformadas.
1.2.2 Identificação das regiões flanqueantes e T-DNA inserido do evento de elite EE-GM4
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125/149 [00172] A sequência das regiões flanqueando o T-DNA inserido e o T-DNA contíguo com ela no evento de elite EE-GM4 estão mostrados na Listagem de Sequências anexada.
1.2.2.1 Região flanqueante de T-DNA 5' [00173] Um fragmento identificado como compreendendo a região flanqueante de T-DNA 5' de EE-GM4 foi sequenciado e sua sequência de nucleotídeos está representada em SEQ ID No. 5, nucleotídeos 1-227. Esta região flanqueante de T-DNA 5' é constituída por sequências genômicas de soja correspondendo à sequência de lócus pré-inserção (SEQ ID No. 5, nucleotídeos 1-227). A região de junção 5' compreendendo parte da sequência de T-DNA inserida e parte da sequência flanqueante 5' de T-DNA contígua com ela está representada em SEQ ID No. 1 e 3.
1.2.2.2 Região flanqueante de T-DNA 3' [00174] Um fragmento identificado como compreendendo a região flanqueante de T-DNA 3' de EE-GM4 foi sequenciado e sua sequência de nucleotídeos está representada em SEQ ID No. 6, nucleotídeos 254-501. Esta região flanqueante de T-DNA 3' é constituída por sequências genômicas de soja correspondendo à sequência de lócus pré-inserção (SEQ ID No. 6, nucleotídeos 254-501). A região de junção 3' compreendendo parte da sequência de T-DNA inserida e parte da sequência flanqueante 3' de T-DNA contígua com ela está representada em SEQ ID No. 2 e 4.
1.2.2.3 T-DNA inserido de EE-GM4 [00175] O T-DNA inserido contíguo com a região flanqueante de T-DNA 5' acima foi sequenciado e sua sequência de nucleotídeos está representada em SEQ ID No. 5, nucleotídeos 228-398. Igualmente, o T-DNA inserido contíguo com a região flanqueante de T-DNA 3' acima foi sequenciado e sua sequência de nucleotídeos está representada em SEQ ID No. 6, nucleotídeos 1-253. Durante a transformação, 970 pb de DNA genômico foram
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126/149 deletados na sequência de lócus pré-inserção, e estes foram replicados pelo TDNA inserido.
[00176] O sequenciamento da região de T-DNA no plasmídeo de transformação pSZ8832 (a parte entre as fronteiras de T-DNA) resultou na sequência relatada em SEQ ID No. 11. A sequência de gene cry14Ab-1.b quimérico (compreendendo o promotor de Ubi 10 e a região não traduzida 3' de 35S) está representada em SEQ ID No. 11 a partir dos nucleotídeos 131-5276 (sentido anti-horário). A sequência de T-DNA inserida na região flanqueante 5' em SEQ ID No. 5 (nucleotídeos 228-398) é idêntica à sequência de nucleotídeos em SEQ ID No. 11 a partir do nucleotídeo 17 até ao nucleotídeo 187 e a sequência de T-DNA inserida na região flanqueante 3' em SEQ ID No. 6 (nucleotídeos 1 -253) é idêntica à sequência de nucleotídeos em SEQ ID No. 11 a partir do nucleotídeo 7369 até ao nucleotídeo 7621. Consequentemente, a extremidade 5' do T-DNA inserido em EE-GM4 corresponde ao nucleotídeo 17 na sequência de plasmídeo de transformação de SEQ ID No. 11 e a extremidade 3' do T-DNA inserido em EE-GM4 corresponde ao nucleotídeo 7621 na sequência de plasmídeo de transformação de SEQ ID No. 11. O T-DNA inserido em EE-GM4 entre a sequência de SEQ ID No. 5 e a sequência de SEQ ID No. 6 está contido na semente depositada na ATCC sob o número de depósito PTA123624 e tem uma sequência essencialmente similar ou idêntica à sequência de SEQ ID No. 11 a partir do nucleotídeo 188 até ao nucleotídeo 7368.
[00177] O lócus pré-inserção para o evento EE-GM4 pode ser determinado a partir de soja de tipo selvagem var. Thorne com base nas sequências flanqueantes de T-DNA 5' e 3' proporcionadas aqui (SEQ ID No. 5 a partir do nt 1 até ao nt 227 e SEQ ID No. 6 a partir do nt 254 até ao nt 501) por métodos conhecidos na técnica. A sequência de lócus pré-inserção no genoma da soja corresponde às seguintes sequências em ordem: posição de nucleotídeo 1 até à posição de nucleotídeo 227 em SEQ ID No. 5, uma deleção de 970 nt e
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127/149 posição de nucleotideo 254 até à posição de nucleotideo 501 em SEQ ID No. 6. A sequência de lócus pré-inserção completa é dada em SEQ ID No. 30, em que os nt 1 -1000 são sequências genômicas flanqueantes 5', os nt 1001 -1970 são a deleção no local alvo e 1971-2970 são sequências genômicas flanqueantes 3'.
1.2.3. Confirmação das regiões flanqueantes e T-DNA inserido do evento de elite EE-GM4 [00178] A amplificação por PCR usando iniciadores visados ao DNA de planta a montante e a jusante do T-DNA inserido e ao T-DNA inserido em EE-GM4 confirmou e prolongou as sequências flanqueantes 5' e 3'.
[00179] 1.2.3.1. reação específica de EE-GM4 com sequência de junção 5' [00180] Dois iniciadores, GLPB173 e GLPB167, foram desenhados para amplificar um amplicon de aproximadamente 5059 pb abrangendo a região de junção da sequência flanqueante de T-DNA 5' com o fragmento de inserção de T-DNA para o evento EE-GM4. A sequência do iniciador GLPB173 tem origem na sequência de referência de soja de Glycine max Williams 82.a2.v1.
[00181] Iniciador direto visado à sequência flanqueante 5' de TDNA de EE-GM4:
GLPB173 5’-CTTCATCTCCCCgTTAAAgTg-3’ (SEQ ID No.
26)
Iniciador reverso visado à sequência de T-DNA inserido de EEGM4:
GLPB167 5’-TACAACgTgCTCgCTATTCC-3’ (SEQ ID No.
28)
Composição da mistura reacional para a reação com sequência de junção 5':
μΙ_ Tampão AccuPrime™ PCR II (Thermo Scientific)
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128/149 μΙ_ iniciador direto (10 pmol/pL) μΙ_ iniciador reverso (10 ριτιοΙ/μΙ_)
0,75 μΙ_ DNA Polimerase AccuPrime™ Taq High Fidelity (2 υ/μΙ_; Thermo Scientific) ng DNA molde
Água até 50 μΙ_
Condições de termociclagem para a reação com sequência de junção 5':
| Tempo | Temperatura | ||
| 1 min. | 94 °C | ||
| Seguido por: | 30 seg. | 94 °C | |
| 30 seg. | 57 °C | ||
| 7 min. | 68 °C | ||
| Durante 30 ciclos | |||
| Seguido por: | 10 min. | 4 °C | |
| Para sempre | 10 °C |
[00182] A sequência da sequência flanqueante 5' de T-DNA prolongada que foi obtida e que é contígua com e a montante de parte do T-DNA inserido como mostrado em SEQ ID No. 5 está mostrada em SEQ ID No. 24.
[00183] 1.2.3.2. reação específica de EE-GM4 com sequência de junção 3' [00184] Dois iniciadores, GLPB170 e GLPB175, foram desenhados para amplificar um amplicon de aproximadamente 5141 pb abrangendo a região do fragmento de inserção de T-DNA para o evento EE-GM4 com a sequência flanqueante de T-DNA 3'. A sequência do iniciador GLPB175 tem origem na sequência de referência de Glycine max Williams 82.a2.v1.
[00185] Iniciador direto visado à sequência de T-DNA inserido de EE-GM4:
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129/149
GLPB170 5’-TCTCggTATCAgCgTTCTTg-3’ (SEQ ID No.
29)
Iniciador reverso visado à sequência flanqueante 3' de T-DNA de
EE-GM4:
GLPB175 5’-gTTgTCAACAATgACCAgAAg-3’ (SEQ ID No.
27)
Composição da mistura reacional para a reação com sequência de junção 3':
μΙ_ Tampão AccuPrime™ PCR II (Thermo Scientific) μΙ_ iniciador direto (10 pmol/pL) μΙ_ iniciador reverso (10 ριτιοΙ/μΙ_)
0,75 μΙ_ DNA Polimerase AccuPrime™ Taq High Fidelity (2 υ/μΙ_; Thermo Scientific) ng DNA molde
Água até 50 μΙ_
Condições de termociclagem para a reação com sequência de junção 3':
| Tempo | Temperatura |
| 1 min. | 94 °C |
| Seguido por: | 30 seg. 94 °C |
| 30 seg. | 57 °C |
| 7 min. | 68 °C Durante 30 ciclos |
| Seguido por: | 10 min. 4 °C Para sempre 10 °C |
[00186] A sequência da sequência flanqueante 3' de T-DNA prolongada que foi obtida e é contígua com e a jusante de parte do T-DNA inserido como mostrado em SEQ ID No. 6 está mostrada em SEQ ID No. 25.
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130/149 [00187] Uma vez que os amplicons resultantes nas 2 reações acima se sobrepuseram, isto permitiu uma reconstrução da sequência do T-DNA inserido de EE-GM4 e das sequências flanqueantes 5' e 3' prolongadas, que está mostrada em SEQ ID No. 23. A sequência flanqueante de T-DNA 5' em SEQ ID No. 23 é a partir da posição de nucleotídeo 1 até à posição de nucleotídeo 1058 (correspondendo a sequências genômicas de lócus préinserção), a sequência de T-DNA inserida é a partir da posição de nucleotídeo 1059 até à posição de nucleotídeo 8663 e a sequência flanqueante de T-DNA 3' em SEQ ID No. 23 é a partir da posição de nucleotídeo 8664 até à posição de nucleotídeo 9749 (correspondendo a sequências genômicas de lócus préinserção).
2. Desenvolvimento de Protocolos de Identificação para EE-GM4
2.1 Método de ponto final para análise da identidade de EEGM4 [00188] Este método descreve um método de detecção por reação em cadeia da polimerase para analisar a presença de sequências de DNA específicas do evento EE-GM4 em amostras de DNA obtidas a partir de amostras biológicas, tais como materiais de planta (p.ex., folha ou semente) usando procedimentos de extração de DNA padrão.
[00189] A descrição do método delineia o desenho do método, incluindo as sequências de iniciadores e sondas de oligonucleotídeos, a composição da mistura reacional, as condições de termociclagem requeridas para realizar a reação e os cenários do leitor fluorescente encontrados apropriados para detecção de amplicons. Proporciona também recomendações gerais sobre a natureza e uso de amostras de controle. Adicionalmente é proporcionada orientação para análise e interpretação de dados, incluindo um exemplo de um resultado do método tomando em consideração as
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131/149 recomendações sobre o uso de materiais de controle e a orientação para análise de dados.
2.1.1. Desenho do método [00190] O método usa a química Taqman para amplificar e detectar duas sequências alvo: uma reação específica de EE-GM4 determina a presença do evento, uma reação específica do táxon valida os resultados negativos para a reação específica do evento.
2.1.1.1. Reação específica de EE-GM4 [00191] Dois iniciadores, PRIM0937 e PRIM0938, foram desenhados para amplificar um amplicon de 126 pb abrangendo a região de junção da sequência flanqueante 3' com o fragmento de inserção de T-DNA para o evento EE-GM4.
[00192] Uma sonda, TM1734, usando FAM como etiqueta fluorescente e BHQ1 como extintor, foi desenhada para detectar a sequência amplificada.
[00193] Iniciador direto visado à sequência de T-DNA de EE-GM4: PRIM0937 5’- gAgACTgTATCTTTgATATTTTTggAgTAgA -3’ (SEQ ID No. 12)
Iniciador reverso visado à sequência flanqueante 3' de T-DNA de EE-GM4:
PRIM0938 5’- CTgAgTCgATCAAAACCAATCAAT -3’ (SEQ ID No. 13)
Sonda visada à junção de T-DNA de EE-GM4 e sua sequência flanqueante 3':
TM1734 FAM 5’- AAgTgTgTCgTgCTCCACCAgTTATCACA 3’ BHQ1 (SEQ ID No. 14)
2.1.1.2. Reação específica do táxon
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132/149 [00194] Dois iniciadores, SHA071 e SHA072, foram desenhados para amplificar urn amplicon de 74 pb da sequência do gene lectinal endógena de soja.
[00195] Uma sonda, TM1428, usando JOE como etiqueta fluorescente e BHQ1 como foi desenhada para detectar a sequência amplificada.
[00196] Iniciador direto visado à sequência do gene da Lectina 1 endógena:
| SHA071 | 5’- CCAgCTTCgCCgCTTCCTTC -3’ (SEQ | ID | |
| No. 15) | |||
| Iniciador | inverso visado à sequência do gene da Lectina | 1 | |
| endógena: | |||
| SHA072 | 5'- gAAggCAAgCCCATCTgCAAgCC -3' (SEQ | ID |
No. 16)
Sonda visada à sequência do gene da Lectina 1 endógena:
TM1428 JOE 5’- CTTCACCTTCTATgCCCCTgACAC -3’
BHQ1 (SEQ ID No. 17)
2.1.2. Composição da mistura reacional
5,0 pL 2x PerfeCta qPCR FastMix II, ROX
0,5 pL PRIM0937 [10 pmol/pL]
0,5 pL PRIM0938 [10 pmol/pL]
0,5 pL SHA071 [10 pmol/pL]
0,5 pL SHA072 [10 pmol/pL]
0,1 pL TM1734[10 pmol/pL]
0,1 pL TM1428 [10 pmol/pL] x pL DNA molde (20 ng*)
Água até 10 pL
Notas:
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133/149 • A 2x PerfeCta qPCR FastMix II, ROX foi fornecida pela Quanta Bioscience. Outros tampões de enzima podem ser usados mas o desempenho deve ser verificado.
• Os iniciadores e sondas etiquetadas foram pedidos com Integrated DNA Technologies • * A quantidade de DNA molde por reação pode variar mas deve ser verificada
2.1.3. Condições de termociclagem
Tempo Temperatura min.95 °C
Seguido por: 3 seg. 95 °C seg.60 °C
Durante 35 ciclos
Seguido por: Para sempre10°C
Notas:
• As condições de termociclagem foram validadas para uso em um ciclador térmico BIORAD C1000. Outro equipamento pode ser usado mas o desempenho deve ser verificado.
2.1.4. Cenários de comprimentos de onda e larguras de banda
| Excitação | Emissão |
| FAM | 495 nm ± 5 nm 517 nm ± 5 nm |
| JOE | 530 nm ± 5 nm 555 nm ± 5 nm |
| ROX | 581nm±5nm 607 nm ± 5 nm |
Notas:
• Os cenários de comprimentos de onda e larguras de banda foram validados para uso em um leitor de placas Tecan M1000. Outro equipamento e cenários podem ser usados mas o desempenho deve ser verificado.
Petição 870190057512, de 21/06/2019, pág. 287/331
134/149
2.1.5. Amostras de controle
As seguintes amostras de controle devem ser incluídas na experiência para validar os resultados de amostras de teste:
• Controle positivo: uma amostra de DNA contendo as sequências alvo e endógenas • Controle negativo: uma amostra de DNA contendo somente a sequência endógena • Controle sem molde: uma amostra de água (sem DNA)
2.1.6. Análise de dados • Para todas as amostras, a razão entre Sinal fluorescente e Fundo (S/B) é calculada para ambas as reações alvo e endógenas.
• As amostras de controle devem dar o resultado esperado, i.e.:
o O controle positivo deve ser pontuado “detectado” o O controle negativo deve ser pontuado “não detectado” o O controle sem molde deve somente mostrar níveis de fundo fluorescente • Uma amostra é pontuada como se segue:
o Detectado: a S/B alvo e a S/B endógena excedem uma razão limiar aceitável, p.ex., 2 o Não detectado: a S/B alvo está abaixo de uma razão limiar aceitável, p.ex., 1,3 e, adicionalmente, a S/B endógena excede uma razão limiar aceitável, p.ex., 2 o Inconclusivo: as S/B alvo e endógena estão abaixo de um limiar aceitável, p.ex., 1,3 [00197] A Figura 2 mostra um exemplo do resultado do método para uma série de amostras de soja contendo EE-GM4 e amostras de soja
Petição 870190057512, de 21/06/2019, pág. 288/331
135/149 convencional. Para cada amostra, as razões S/B para ambas a reação específica de EE-GM4 e a reação endógena são exibidas.
2.2 Método de ponto final para análise da identidade de EEGM4 e zigosidade [00198] Este método descreve um método de detecção por reação em cadeia da polimerase para analisar a presença e o estado de zigosidade de sequências de DNA específicas do evento EE-GM4 em amostras de DNA obtidas a partir de amostras biológicas, tais como materiais de planta (p.ex., folha ou semente) usando procedimentos de extração de DNA padrão.
[00199] A descrição do método delineia os reagentes de reação, as sequências de iniciadores e sondas de oligonucleotídeos, as condições de termociclagem requeridas para realizar a reação e os cenários do leitor fluorescente encontrados apropriados para detecção de amplicons. Proporciona também recomendações gerais sobre a natureza e uso de amostras de controle. Adicionalmente é proporcionada orientação para análise e interpretação de dados, incluindo um exemplo de um resultado do método tomando em consideração as recomendações sobre o uso de materiais de controle e a orientação para análise de dados.
[00200] É notado que o desempenho do método para análise da zigosidade pode ser dependente da variedade devido à natureza da sequência de lócus pré-inserção. Portanto, a verificação do desempenho é requerida para cada variedade na qual o evento é introgressado. Para casos de desempenho inadequado, um método de PCR em Tempo Real baseado na análise do número de cópias pode ser usado. P.ex., uma tal análise do número de cópias pode usar a química Taqman e princípios de PCR em Tempo Real para quantificar o número de cópias relativas de uma sequência específica de EE-GM4. O método alternativo incluirá tipicamente uma reação específica de EE-GM4 para quantificar o número de cópias de EE-GM4 e uma reação específica do táxon
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136/149 para normalização do número de cópias de EE-GM4. As amostras contendo a sequência de inserção de EE-GM4 em um estado homozigoto terão um número de cópias relativas que é duas vezes mais elevado do que amostras hemizigotas. As amostras azigotas não amplificarão a sequência de EE-GM4 em tal método.
2.2.1. Desenho do método [00201] O método usa a química Taqman para amplificar e detectar duas sequências alvo: uma reação específica de EE-GM4 determina a presença do evento, uma reação específica do lócus pré-inserção determina a presença do lócus pré-inserção do evento.
[00202] A detecção somente da sequência específica de EE-GM4 indica a presença do evento EE-GM4 em um estado de zigosidade homozigota.
[00203] A detecção somente da sequência específica de EE-GM4 e específica do lócus pré-inserção indica a presença do evento EE-GM4 em um estado de zigosidade hemozigota.
[00204] A detecção somente da sequência específica do lócus pré-inserção indica a ausência do evento EE-GM4.
2.2.1.1. Reação específica de EE-GM4 [00205] Dois iniciadores, PRIM0937 e PRIM0938, foram desenhados para amplificar um amplicon de 126 pb abrangendo a região de junção da sequência flanqueante 3' de T-DNA com o fragmento de inserção de T-DNA para o evento EE-GM4.
[00206] fluorescente e BHQ1
Uma sonda, TM1734, usando FAM como etiqueta como extintor, foi desenhada para detectar a sequência amplificada.
[00207]
Iniciador direto visado à sequência de T-DNA de EE-GM4:
PRIM0937 5’- gAgACTgTATCTTTgATATTTTTggAgTAgA -3’ (SEQ ID No. 12)
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137/149
Iniciador reverso visado à sequência flanqueante 3' de T-DNA de EE-GM4:
PRIM0938 5’- CTgAgTCgATCAAAACCAATCAAT -3’ (SEQ ID No.
13)
Sonda visada à junção de T-DNA de EE-GM4 e sua sequência flanqueante 3':
TM1734 FAM 5’- AAgTgTgTCgTgCTCCACCAgTTATCACA -3’ BHQ-1 (SEQ ID No. 14)
2.2.1.2. reação específica do lócus pré-inserção [00208] Dois iniciadores, PRIM1652 e PRIM0938, foram desenhados para amplificar um amplicon de 108 pb abrangendo a junção do lócus pré-inserção e da sequência flanqueante 3' do lócus pré-inserção de EEGM4.
[00209] Uma sonda de MGB, TM2084, usando VIC como etiqueta fluorescente e o MGB-NFQ como extintor, foi desenhada para detectar a sequência amplificada.
[00210] Iniciador direto visado à sequência do lócus pré-inserção de EE-GM4:
PRIM1652 5’gAgAAgTTTCAATACTAATAgTATCAATACTCAgAAT -3’ (SEQ ID No. 18)
Iniciador reverso visado à sequência flanqueante 3' de T-DNA de EE-GM4:
PRIM0938 5’- CTgAgTCgATCAAAACCAATCAAT -3’ (SEQ ID No. 13)
Sonda de tipo selvagem visando a função de lócus pré-inserção e sequência flanqueante 3':
TM2084 VIC 5’- CgAgTATTAgCCATATTTA -3’ MGB-NFQ (SEQ ID No. 19)
Petição 870190057512, de 21/06/2019, pág. 291/331
138/149
2.2.2. Composição da mistura reacional
| 5,0 | μΙ- | 2χ PerfeCta qPCR FastMix II, ROX |
| 0,4 | μΙ- | PRIM1652 [10 pmol/pL] |
| 0,4 | μΙ- | PRIM0938 [10 pmol/pL] |
| 0,1 | μΙ- | PRIM0937[10 pmol/pL] |
| 0,2 | μΙ- | TM2084[10 pmol/pL] |
| 0,05 | μΙ- | TM1734[10 pmol/pL] |
| X | μΙ- | DNA molde (20 ng*) |
Água até 10 μΙ_
Notas:
• A 2x PerfeCta qPCR FastMix II, ROX foi fornecida pela Quanta Bioscience. Outros tampões de enzima podem ser usados mas o desempenho deve ser verificado.
• Os iniciadores e sondas etiquetadas foram pedidos com Integrated DNA Technologies • * A quantidade de DNA molde por reação pode variar mas deve ser verificada
2.2.3. Condições de termociclagem
Tempo Temperatura min.95 °C
Seguido por: 3 seg.95 °C seg. 60 °C
Durante 35 ciclos
Seguido por: Para sempre10°C
Notas:
• As condições de termociclagem foram validadas para uso em um ciclador térmico BIORAD C1000. Outro equipamento pode ser usado mas o desempenho deve ser verificado.
Petição 870190057512, de 21/06/2019, pág. 292/331
139/149
2.2.4. Cenários de comprimentos de onda e larguras de banda
| FAM | Excitação | Emissão 495 nm ± 5 nm | 517 | |
| nm ± 5 nm | ||||
| JOE | 530 nm ± 5 nm | 555 | ||
| nm ± 5 nm | ||||
| ROX | 581 nm ± 5 nm | 607 |
nm ± 5 nm
Notas:
• Os cenários de comprimentos de onda e larguras de banda foram validados para uso em um leitor de placas Tecan M1000. Outro equipamento e cenários podem ser usados mas o desempenho deve ser verificado.
2.2.5. Amostras de controle
As seguintes amostras de controle devem ser incluídas na experiência para validar os resultados de amostras de teste:
• Controle homozigoto: uma amostra de DNA contendo a sequência alvo em um estado homozigoto • Controle hemozigoto: uma amostra de DNA contendo a sequência alvo em um estado hemozigoto • Controle de tipo selvagem: uma amostra de DNA não contendo a sequência alvo • Controle sem molde: uma amostra de água
2.2.6. Análise de dados • Para todas as amostras, a razão entre Sinal fluorescente e Fundo (S/B) é calculada para ambas as reações alvo e de lócus pré-inserção.
• As amostras de controle devem dar o resultado esperado, i.e.:
Petição 870190057512, de 21/06/2019, pág. 293/331
140/149 ο Ο controle homozigoto deve ser pontuado “homozigoto” o O controle hemozigoto deve ser pontuado “hemozigoto” o O controle de tipo selvagem deve ser pontuado “tipo selvagem” o O controle sem molde deve somente mostrar níveis de fundo fluorescente • Uma amostra é pontuada como se segue:
o homozigoto: a S/B alvo excede uma razão limiar aceitável,
p.ex., 2 e a S/B do lócus pré-inserção está abaixo de uma razão limiar aceitável,
p.ex., 1 o hemizigoto: ambas as S/B alvo e do lócus pré-inserção excedem uma razão limiar aceitável, p.ex., 2 o tipo selvagem: a S/B alvo está abaixo de uma razão limiar aceitável, p.ex., 1 e a S/B do lócus pré-inserção excede uma razão limiar aceitável, p.ex., 2 o Inconclusivo: as S/B alvo e do lócus pré-inserção estão abaixo de um limiar aceitável, p.ex., 1 [00211] A Figura 3 mostra um exemplo do resultado do método para uma série de amostras de soja contendo EE-GM4 em um estado homozigoto, amostras de soja contendo EE-GM4 em um estado hemizigoto e amostras de soja convencional.
2.3. Método de PCR em Tempo Real para análise da Presença a Baixo Nível de EE-GM4 [00212] O método descreve um método de detecção para analisar a Presença a Baixo Nível de sequências de DNA do evento EE-GM4 obtidas a partir de materiais de planta a granel (p.ex., folha ou semente) ou materiais processados (p.ex., produtos alimentares ou de ração produzidos a partir de grão
Petição 870190057512, de 21/06/2019, pág. 294/331
141/149 de soja processado, contendo DNA de EE-GM4) usando procedimentos de extração de DNA padrão.
[00213] A descrição do método delineia os reagentes de reação, as sequências de iniciadores e sondas de oligonucleotídeos e as condições de termociclagem requeridas para realizar a reação. Proporciona também recomendações gerais sobre o uso simultâneo de um método específico do táxon para apoiar análise de dados e interpretação dos resultados. Adicionalmente são proporcionadas recomendações sobre a natureza e uso de amostras de controle.
[00214] É notado que métodos alternativos podem estar disponíveis para o propósito pretendido, incluindo mas não se limitando a métodos de PCR com gotículas digitais. Os métodos de PCR com gotículas digitais usam métodos de Ponto Final para análise da identidade de eventos, como descrito na seção 1.1, em combinação com princípios de subamostragem na amostra de DNA extraída. Em este método, a presença a baixo nível do evento é determinada com base na razão de subamostras de DNA consideradas positivas e negativas para a sequência do evento.
2.3.1 Desenho do método [00215] O método usa a química Taqman e princípios de PCR em Tempo Real para detectar ou quantificar baixos níveis de EE-GM4 em uma amostra de DNA.
[00216] Dois iniciadores, PRIM0939 e PRIM0940, são desenhados para amplificar um amplicon de 90 pb abrangendo a região de junção da sequência flanqueante 5' de T-DNA com o fragmento de inserção de T-DNA para o evento EE-GM4.
[00217] Uma sonda, TM1735, usando FAM como etiqueta fluorescente e BHQ1 como extintor, é desenhada para quantificar a sequência amplificada.
Petição 870190057512, de 21/06/2019, pág. 295/331
142/149 [00218] Iniciador direto visado à sequência de T-DNA de EE-GM4:
PRIM0939 5’- CCATTgTgCTgAATAggTTTATAgCT -3’ (SEQ ID
No. 20)
Iniciador reverso visado à sequência flanqueante 5' de T-DNA de
EE-GM4:
PRIM0940 5’- gACAAATACTACTTTgTTAAgTTTAgACCCC -3’ (SEQ ID No. 21)
Sonda visada à junção de T-DNA de EE-GM4 e sua sequência flanqueante 5':
TM1735 FAM 5’- TgATAgAgCgCCTgggCCTAACTTTCTAAA 3’ BHQ-1 (SEQ ID No. 22)
| 2.3.2. | Composição da mistura reacional | |
| 10,0 | μΙ- | 2χ PerfeCta qPCR Fastmix II, Low ROX |
| 0,5 | μΙ- | PRIM0939 [10 pmol/pL] |
| 0,5 | μΙ- | PRIM0940 [10 pmol/pL] |
| 0,5 | μΙ- | TM1735 [10 pmol/pL] |
| X | μΙ- | DNA molde (200 ng*) |
Água até 20 μΙ_
Notas:
• A 2x PerfeCta qPCR FastMix II, LOW ROX foi fornecida pela Quanta Bioscience. Outros tampões de enzima podem ser usados mas o desempenho deve ser verificado.
• O iniciador e sondas etiquetadas foram pedidos com Integrated DNA Technologies • * A quantidade de DNA molde por reação pode variar mas deve ser verificada
2.3.3. Condições de termociclaqem
Tempo Temperatura
Petição 870190057512, de 21/06/2019, pág. 296/331
143/149 min.95 °C
Seguido por: 3 seg.95 °C seg. 60 °C **
Durante 40 ciclos
Seguido por: Para sempre10°C
Notas:
• ** A leitura fluorescente é realizada em cada ciclo, após finalização do passo de alongamento do iniciador a 60 °C • As condições de termociclagem foram validadas para uso em um dispositivo de PCR em Tempo Real VHA7 e Quantstudio 7 Outro equipamento pode ser usado mas o desempenho deve ser verificado.
2.3.4. Método específico do táxon [00219] Um método de detecção por PCR em Tempo Real visando uma sequência endógena deve ser realizado simultaneamente em uma quantidade idêntica de DNA molde como usado no método de PCR em Tempo Real específico alvo. O resultado do método específico do táxon deve ser usado para apoiar a análise e interpretação dos dados, i.e., para normalizar a quantidade de DNA de entrada e para validar quaisquer resultados negativos para a reação específica do alvo.
2.3.5. Amostras de teste, Amostras de calibração e amostras de controle • É recomendado que todas as amostras de teste sejam analisadas em duplicado.
• Um conjunto de amostras de calibração é incluído na experiência para gerar curvas padrão para ambos os métodos específico do alvo e táxon.
• Adicionalmente, as seguintes amostras de controle são incluídas:
Petição 870190057512, de 21/06/2019, pág. 297/331
144/149 o Controle positivo: uma amostra de DNA contendo a sequência alvo ao nível do Limite de Detecção, o Controle negativo: uma amostra de DNA contendo somente a sequência endógena (sem EE-GM4) o Controle sem molde: uma amostra de água
2.3.6. Análise de dados • Para todas as amostras, os valores de ciclos limiares (/.e., valores de Ct) são determinados para ambos os métodos específicos do alvo e táxon. Um ciclo limiar é definido como o número de ciclagem ao qual a representação gráfica de amplificação para uma dada amostra alcança um limiar de sinal definido (ver figura em baixo) • As fórmulas de curva padrão são calculadas para ambos os métodos específicos do alvo e táxon usando os valores de Ct e a quantidade de cópias de genoma das amostras de calibração • Os parâmetros de curva padrão devem cumprir os critérios de aceitação para declive e linearidade (R2), p.ex.
o -3,2 < declive < -3,6 o R2 > 0,98 • Para todas as amostras, o número de cópias no genoma para o método alvo e endógeno é calculado usando análise de regressão linear.
• A quantidade de presença a baixo nível em relação à quantidade total de DNA específico do táxon é determinada por cálculo da % de razão dos números de cópias no genoma para o método específico do alvo e táxon.
• As amostras de controle devem dar o resultado esperado, i.e.:
o O controle positivo deve ser pontuado “detectado” o O controle negativo deve ser pontuado “não detectado”
Petição 870190057512, de 21/06/2019, pág. 298/331
145/149 ο Ο controle sem molde deve somente mostrar níveis de fundo fluorescente • Uma amostra é pontuada como se segue:
o Detectado: a presença a baixo nível está acima do limite de detecção para todos os replicados, tomando em consideração a incerteza da medição do método o Não detectado: a presença a baixo nível está abaixo do limite de detecção para todos os replicados, tomando em consideração a incerteza da medição do método o Inconclusivo: as amostras replicadas são pontuações inconsistentes [00220] A Figura 4 mostra um exemplo do resultado do método realizado nas amostras de calibração.
3. Introgressão de EE-GM4 em cultivares preferenciais [00221] O evento de elite EE-GM4 foi introduzido por retrocruzamento repetido em seis linhas de soja de elite diferentes. As linhas foram selecionadas para representarem uma gama de maturidades: duas linhas de MG I, uma linha de MG III, duas linhas de MG VI e uma linha de MG IX. Uma das linhas MG I e a linha MG III continham o alelo de resistência nativa Rhg1 de PI 88788 e uma das linhas MG VI transportava os alelos de resistência nativa Rhg1 e Rhg4 de PI 437654. As outras três linhas eram suscetíveis a SCN.
[00222] Igualmente, em teste inicial, em várias experiências, não foram observadas nenhumas diferenças biologicamente significativas para os níveis de expressão de proteína Cry14Ab-1 ou HPPD-4 medidos em folhas de plantas cultivadas em estufa (como medido com ELISA ou transferência de Western (somente foi vista variação normal do ensaio)) e não foram vistas nenhumas diferenças significativas nos resultados padrão do ensaio de SCN de estufa (medindo a % de redução nos cistos de SCN vs. o controlo de Thorne),
Petição 870190057512, de 21/06/2019, pág. 299/331
146/149 quando o evento EE-GM4 foi introgressado a partir do fundo de Thorne em outros fundos de germoplasma de soja (de diferente maturidade, em diferentes etapas de introgressão), em comparação com o que foi encontrado no fundo de Thorne. Enquanto, em uma experiência inicial, o evento EE-GM4 em um fundo de plantas de soja BC2F3 de maturidade 9.1 mostrou uma expressão mais baixa de proteína Cry14Ab-1, não foram descobertas nenhumas diferenças biologicamente significativas na expressão de proteína Cry14Ab-1 no que diz respeito a EE-GM4 no fundo de Thorne quando esta experiência foi repetida com um número maior de plantas dessa maturidade.
[00223] A introgressão do evento de elite EE-GM4 em outros cultivares de soja não influencia significativamente qualquer uma das características fenotípicas ou agronômicas desejáveis destes cultivares (nenhum arrasto de ligação) enquanto a expressão dos transgenes cumpre níveis comercialmente aceitáveis. Isto confirma o estado do evento EE-GM4 como um evento de elite.
[00224] Além do mais, o evento de elite EE-GM4 é vantajosamente combinado com outros eventos de transformação de elite da soja. Plantas particularmente úteis de acordo com a invenção são plantas contendo EE-GM4 combinado com outro evento de transformação da soja, ou uma combinação de mais do que um outro evento de transformação da soja, tais como aqueles listados nas bases de dados de várias agências reguladoras nacionais ou regionais, incluindo mas não se limitando a Evento MON87751 (descrito em WO2014201235 e Petição de USDA-APHIS 13-337-01 p), Evento pDAB8264.42.32.1 (descrito em WO2013010094), Evento DAS-81419-2 (também conhecido como Conkesta™ Soybean, descrito em WO2013016527 e Petição de USDA-APHIS 12-272-01 p), Evento EE-GM3 (também conhecido como FG-072, MST-FG072-3, descrito em WO2011063411, Petição de USDAAPHIS 09-328-01 p), Evento SYHT0H2 (também conhecido como 0H2, SYN
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147/149
000H2-5, descrito em WO2012/082548 e 12-215-01 p), Evento DAS-68416-4 (também conhecido como Enlist Soybean, descrito em WO2011/066384 e WO2011/066360, Petição de USDA-APHIS 09-349-01 p), Evento DAS-81615-9 (descrito em WO2014004458), Evento DAS-44406-6 (também conhecido como Enlist E3, DAS-44406-6, descrito em WO2012/075426 e USDA-APHIS 11-23401 p), Evento MON87708 (Xtend Soybeans, descrito em WO2011/034704 e Petição de USDA-APHIS 10-188-01 p), Evento MON89788 (também conhecido como Genuity Roundup Ready 2 Yield, descrito em W02006/130436 e Petição de USDA-APHIS 06-178-01 p), Evento DAS-14536-7 (descrito em WO2012/075429), Evento 40-3-2 (também conhecido como RoundUp Ready, MON-04032-6, descrito em Petição de USDA-APHIS 93-258-01), Evento A2704-12 (também conhecido como LL27, ACS-GM005-3, descrito em W02006108674 e Petição de USDA-APHIS 96-068-01 p), Evento 127 (também conhecido como BPS-CV127-9, descrito em WO2010/080829), Evento A5547127 (também conhecido como LL55, ACS-GM006-4, descrito em W02006108675 e na Petição de USDA-APHIS 96-068-01 p), Evento MON87754 (também conhecido como Vistive III, MON-87754-1, descrito em WO2010/024976), Evento HOS (também conhecido como DP-305423-1, Plenish High Oleic Soybean, descrito em W02008054747), Evento MON87701 (também conhecido como MON-87701-2, descrito em W02009064652 e Petição de USDA-APHIS 09-082-01 p), Evento MON 87705 (também conhecido como MON-87705-6, descrito em WO2010/037016 e Petição de USDA-APHIS 09-201-01 p), Evento MON87712 (também conhecido como MON-87712-4, descrito em WO2012/051199), Evento pDAB4472-1606 (também conhecido como Evento 1606, descrito em WO2012/033794), Evento 3560.4.3.5 (também conhecido como DP-356043-5, descrito em W02008/002872), Evento MON87769 (também conhecido como MON-87769-7, descrito em W02009102873 e na Petição de USDA-APHIS 09-183-01 p) ou qualquer
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148/149 combinação de EE-GM4 com vários destes outros eventos de soja transgênica, tal como uma combinação de EE-GM4 com qualquer uma das seguintes combinações: Evento MON98788 x MON87708 (também conhecido como Roundup Ready 2 Xtend Soybeans, MON-87708-9 x MON-89788-1), Evento HOS x Evento 40-3-2 (também conhecido como Plenish High Oleic Soybeans x Roundup Ready Soybeans), Evento EE-GM3 x EE-GM2 (também conhecido como FG-072xLL55, descrito em WO2011063413), Evento MON 87701 x MON 89788 (também conhecido como Intacta RR2 Pro Soybean, MON-87701-2 x MON-89788-1), DAS-81419-2 x DAS-44406-6 (também conhecido como Conkesta™ Enlist E3™ Soybean, DAS-81419-2 x DAS-44406-6), Evento DAS81419-2 x Evento DAS-68416-4 (descrito em W02013016516), Evento DAS68416-4 x Evento MON 89788 (também conhecido como Enlist™ Roundllp Ready® 2 Soybean, DAS-68416-4 X MON-89788-1), Evento MON-87769-7 x Evento MON-89788-1 (também conhecido como Omega-3 X Genuity Roundup Ready 2 Yield Soybeans), MON 87705 x MON 89788 (também conhecido como Vistive Gold, MON-87705-6 x MON-89788-1), MON 87769 x MON 89788 (também conhecido como Omega-3 x Genuity Roundup Ready 2 Yield Soybeans, MON-87769-7 x MON-89788-1).
[00225] Como usado nas reivindicações em baixo, a não ser que de outro modo claramente indicado, o termo “planta” se destina a englobar tecidos de plantas, em qualquer etapa de maturidade, bem como quaisquer células, tecidos ou órgãos retirados a partir de ou derivados a partir de qualquer tal planta, incluindo sem limitação quaisquer sementes, folhas, caules, flores, raízes, células únicas, gâmetas, culturas de células, culturas de tecidos ou protoplastos.
[00226] A semente de referência compreendendo o evento de elite EE-GM4 foi depositada na ATCC (10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209) em 9 de novembro, 2016, sob o número de acesso da ATCC PTA
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123624, e a sua viabilidade foi confirmada. Nomes alternativos para EE-GM4 são evento GMB471 ou BCS-GM471-2.
[00227] A descrição acima da invenção se destina a ser ilustrativa e não limitante.
[00228] Várias mudanças ou modificações nas modalidades descritas podem ocorrer aos peritos na técnica. Estas podem ser feitas sem se afastar do espírito ou escopo da invenção.
Claims (68)
- REIVINDICAÇÕES1. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos essencialmente similar à sequência de qualquer um de SEQ ID No. 1,3 ou 5 ou à sequência de qualquer um de SEQ ID No. 2, 4 ou 6 ou ao complemento das referidas sequências.
- 2. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 99% de identidade de sequências com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 3, 4, 5, 6, 24 ou 25 ou o seu complemento.
- 3. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeos de qualquer um de SEQ ID No. 1 ou 3 ou SEQ ID No. 2 ou 4, ou o complemento das referidas sequências, ou compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 1 ou 3 e SEQ ID No. 2 ou 4, ou o seu complemento.
- 4. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,2 ou 3, caracterizado pelo fato de que que também compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 7 e 9 ou o seu complemento.
- 5. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 11 a partir da posição de nucleotídeo 188 até à posição de nucleotídeo 7368 ou uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 98% ou pelo menos 99% ou pelo menos 99,5% ou pelo menos 99,9% de identidade de sequência com ela.
- 6. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 ou 24 e SEQ ID No. 6 ou 24 ou o seuPetição 870190057512, de 21/06/2019, pág. 304/3312/16 complemento.
- 7. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO obtenível a partir da semente depositada na ATCC sob o número de acesso PTA-123624, em que a referida molécula de ácido nucleico caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeos de qualquer um de SEQ ID No. 1, 3 ou 5 e a sequência de nucleotídeos de qualquer um de SEQ ID No. 2, 4 ou 6.
- 8. DNA genômico de soja caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1,2, 3, 4, 5, 6 ou 7.
- 9. PLANTA, célula, parte de planta, semente de soja ou sua descendência, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1,2, 3, 4, 5, 6 ou 7.
- 10. PLANTA, célula, parte de planta, semente de soja ou sua descendência, caracterizado pelo fato de que compreende em seu genoma a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 3 e a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 4.
- 11. PLANTA, célula, parte de planta, semente de soja ou sua descendência, caracterizado pelo fato de que compreende em seu genoma a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 e a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 6 ou a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 24 e a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 25.
- 12. PLANTA, célula, parte de planta, semente ou descendência, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que também compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 7 e 9 ou a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 23 a partir da posição de nucleotídeos 1059 até à posição de nucleotídeos 8663.
- 13. PLANTA, célula, parte de planta ou semente de soja,Petição 870190057512, de 21/06/2019, pág. 305/3313/16 caracterizado pelo fato de que compreende cada uma em seu genoma o evento de elite EE-GM4, em que o referido evento de elite é o lócus genético compreendendo um T-DNA inserido contendo um gene codificando a proteína HPPD-4 quimérico e um gene codificando a proteína Cry14Ab-1 quimérico e sequências flanqueantes 5' e 3' imediatamente rodeando o referido T-DNA inserido, como encontrado na semente de referência depositada na ATCC sob o número de depósito PTA-123624.
- 14. PLANTA de descendência, célula, parte de planta ou semente da planta, célula, parte de planta ou semente, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a referida planta de descendência, célula, parte de planta ou semente compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 3 e a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 4.
- 15. A PLANTA, célula, parte, semente ou descendência de soja, de acordo com a reivindicação 13, o DNA genômico da qual, quando analisado usando PCR com dois iniciadores caracterizados pelo fato de que compreender a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 12 e SEQ ID No. 13 respectivamente, origina um fragmento de DNA de 126 pb.
- 16. PLANTA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9,10,11,12,13,14 ou 15, caracterizado pelo fato de que é tolerante a isoxaflutol ou mesotriona.
- 17. PRODUTO DE SOJA produzido a partir da planta, célula, parte, semente ou descendência de soja, caracterizado pelo fato de que conforme definida em qualquer uma das reivindicações 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16.
- 18. PRODUTO DE SOJA, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que é ou compreende farelo de soja, sementes trituradas, farinha de soja ou flocos de soja.
- 19. PRODUTO DE SOJA, de acordo com qualquer uma dasPetição 870190057512, de 21/06/2019, pág. 306/3314/16 reivindicações 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que o referido produto de soja compreende um ácido nucleico que produz um diagnóstico de amplicon do ou específico do evento EE-GM4.
- 20. MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE UM PRODUTO DE SOJA, caracterizado pelo fato de que compreende obtenção da planta ou célula, parte, semente ou descendência de soja, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, e produção de tal produto de soja a partir dela.
- 21. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o referido produto de soja é ou compreende farelo de soja, sementes trituradas, farinha de soja ou flocos de soja.
- 22. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 ou 21, caracterizado pelo fato de que o referido produto de soja compreende um ácido nucleico que produz um diagnóstico de amplicon do ou específico do evento EE-GM4.
- 23. PROCESSO PARA CONTROLE DE ERVAS DANINHAS, caracterizado pelo fato de que compreende tratamento de um campo no qual as sementes de soja, conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, foram semeadas com um herbicida inibidor de HPPD, antes de as plantas de soja emergirem mas após as sementes serem semeadas.
- 24. PROCESSO PARA CONTROLE DE ERVAS DANINHAS, caracterizado pelo fato de que compreende tratamento das plantas de soja, conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 9,10,11,12,13,14,15 ou 16, com um herbicida inibidor de HPPD sobre o topo das plantas.
- 25. MÉTODO PARA PROTEÇÃO DE PLANTAS de soja emergentes, conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, da competição por ervas daninhas, caracterizado pelo fatoPetição 870190057512, de 21/06/2019, pág. 307/3315/16 de que compreende tratamento de um campo a ser plantado com as referidas plantas de soja com um herbicida inibidor de HPPD, antes de as plantas de soja serem plantadas ou as sementes serem semeadas, seguido por plantio ou semeadura das referidas plantas de soja ou sementes no referido campo prétratado.
- 26. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23, 24 ou 25, caracterizado pelo fato de que o referido herbicida inibidor de HPPD é isoxaflutol ou mesotriona.
- 27. MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE UMA PLANTA de soja resistente a SCN e/ou tolerante a herbicidas inibidores de HPPD, caracterizado pelo fato de que compreende introdução de resistência a SCN e/ou tolerância a herbicidas inibidores de HPPD no genoma de uma planta de soja por cruzamento de uma primeira planta de soja não tendo um gene codificando Cry14Ab-1 e não tendo um gene codificando HPPD-4 com a planta de soja, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, e seleção de uma planta de descendência resistente a SCN e/ou tolerante a herbicidas inibidores de HPPD.
- 28. USO da planta, semente, parte, célula ou descendência, caracterizado pelo fato de que conforme definida em qualquer uma das reivindicações 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, para produzir semente de soja.
- 29. USO de uma planta ou semente de soja, caracterizado pelo fato de que conforme definida em qualquer uma das reivindicações 9,10,11,12, 13,14,15 ou 16, para cultivar uma planta resistente a nematódeos e/ou tolerante a herbicidas inibidores de HPPD.
- 30. USO de uma semente de soja, caracterizado pelo fato de que conforme definida em qualquer uma das reivindicações 9,10,11,12,13,14, 15 ou 16, para obter um produto de soja, em que o referido produto de soja é ou compreende grão de soja triturado, farinha de soja, farelo de soja ou flocos dePetição 870190057512, de 21/06/2019, pág. 308/3316/16 soja.
- 31. MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE UMA PLANTA ou semente de soja caracterizado pelo fato de que compreende o evento de elite EE-GM4, compreendendo cruzamento de uma planta, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 9,10,11,12,13,14,15 ou 16, com outra planta de soja e plantio da semente compreendendo EE-GM4 obtida a partir do referido cruzamento.
- 32. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 11 a partir da posição de nucleotídeos 131 até à posição de nucleotídeos 7941 ou uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com ela, em que a referida molécula de ácido nucleico codifica uma proteína Cry14Ab nematicida e uma proteína HPPD tolerante a inibidores de HPPD.
- 33. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que codifica a proteína de SEQ ID No. 8 ou uma proteína pelo menos 99% idêntica a ela e a proteína de SEQ ID No. 10 ou uma proteína pelo menos 99% idêntica a ela.
- 34. MÉTODO PARA IDENTIFICAÇÃO do evento de elite EEGM4 em amostras biológicas, método esse caracterizado pelo fato de que compreende detecção de uma região específica de EE-GM4 com um par de iniciadores específico ou uma sonda específica que reconhece especificamente a região contendo parte da região flanqueante de T-DNA 5' ou 3' e parte do TDNA contíguo com ela em EE-GM4.
- 35. PAR DE INICIADORES adequado para uso em uma detecção específica de EE-GM4, caracterizado pelo fato de que compreende um primeiro iniciador compreendendo uma sequência que, sob condições de detecção otimizadas, reconhece especificamente uma sequência dentro daPetição 870190057512, de 21/06/2019, pág. 309/3317/16 região flanqueante de T-DNA 5' ou 3' do T-DNA inserido em EE-GM4 e um segundo iniciador compreendendo uma sequência que, sob condições de sequência otimizadas, reconhece especificamente uma sequência dentro do TDNA inserido em EE-GM4 contígua com a referida região 5' ou 3' flanqueante, compreendendo a referida região flanqueante de T-DNA a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 227 ou de SEQ ID No. 24 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 1058, compreendendo a referida região flanqueante de T-DNA 3' a sequência de nucleotídeos do complemento de SEQ ID No. 6 a partir do nucleotídeo 254 até ao nucleotídeo 501 ou a sequência de nucleotídeos do complemento de SEQ ID No. 25 a partir do nucleotídeo 254 até ao nucleotídeo 1339, compreendendo o referido T-DNA inserido o complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 a partir do nucleotídeo 228 até ao nucleotídeo 398 ou a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 6 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 253 ou a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 11 a partir da posição de nucleotídeo 17 até à posição de nucleotídeo 7621 ou o seu complemento ou a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 23 a partir da posição de nucleotídeo 1059 até à posição de nucleotídeo 8663 ou o seu complemento.
- 36. PAR DE INICIADORES, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o primeiro iniciador compreende uma sequência de nucleotídeos de 17 a 200 nucleotídeos consecutivos selecionada da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 227 ou de SEQ ID No. 24 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 1058, ou do seu complemento, ou compreende uma sequência de nucleotídeos de 17 a 200 nucleotídeos consecutivos selecionada da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 6 a partir do nucleotídeo 254 até ao nucleotídeo 501 ou da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 25 a partir do nucleotídeo 254 até ao nucleotídeo 1339, ou do seu complemento, e em que o segundo iniciadorPetição 870190057512, de 21/06/2019, pág. 310/3318/16 compreende uma sequência de nucleotídeos de 17 a 200 nucleotídeos consecutivos selecionada da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 a partir do nucleotídeo 228 até ao nucleotídeo 398 ou do seu complemento ou da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 6 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 253 ou do seu complemento ou da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 11 a partir da posição de nucleotídeo 17 até à posição de nucleotídeo 7621 ou do seu complemento ou da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 23 a partir da posição de nucleotídeo 1059 até à posição de nucleotídeo 8663 ou do seu complemento.
- 37. PAR DE INICIADORES, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o primeiro iniciador compreende na sua extremidade 3' extrema uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos selecionada da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 227 ou de SEQ ID No. 24 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 1058, ou do seu complemento, ou compreende na sua extremidade 3' extrema uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos selecionada da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 6 a partir do nucleotídeo 254 até ao nucleotídeo 501 ou da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 25 a partir do nucleotídeo 254 até ao nucleotídeo 1339, ou do seu complemento, e em que o segundo iniciador compreende na sua extremidade 3' extrema pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos selecionados da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 a partir do nucleotídeo 228 até ao nucleotídeo 398 ou do seu complemento ou da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 6 a partir do nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 253 ou do seu complemento ou da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 11 a partir da posição de nucleotídeo 17 até à posição de nucleotídeo 7621 ou do seu complemento ou da sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 23 a partir da posição de nucleotídeo 1059 até à posição de nucleotídeo 8663 ouPetição 870190057512, de 21/06/2019, pág. 311/3319/16 do seu complemento.
- 38. PAR DE INICIADORES, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o referido primeiro iniciador compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 13 ou SEQ ID No. 21 ou em que o referido segundo iniciador compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 12 ou SEQ ID No. 20, respectivamente.
- 39. PAR DE INICIADORES, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que compreende um primeiro iniciador compreendendo na sua extremidade 3' extrema a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 13 ou a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 21 ou compreendendo um segundo iniciador compreendendo na sua extremidade 3' extrema a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 12 ou a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 20.
- 40. PAR DE INICIADORES, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 ou 39, caracterizado pelo fato de que amplifica um fragmento específico de EE-GM4 de 126 ou 90 pb usando PCR.
- 41. PAR DE INICIADORES caracterizado pelo fato de que compreende um primeiro iniciador compreendendo na sua extremidade 3' extrema a sequência de SEQ ID No. 13 e um segundo iniciador compreendendo na sua extremidade 3' extrema a sequência de SEQ ID No. 12 ou compreendendo um primeiro iniciador compreendendo na sua extremidade 3' extrema a sequência de SEQ ID No. 21 e um segundo iniciador compreendendo na sua extremidade 3' extrema a sequência de SEQ ID No. 20.
- 42. SONDA específica para a identificação do evento de elite EE-GM4 em amostras biológicas, caracterizado pelo fato de que a referida sonda reconhece especificamente uma sequência compreendendo parte da sequência flanqueante de T-DNA 5' de EE-GM4 e parte do T-DNA inserido a jusante da mesma e contígua com ela, T-DNA inserido a jusante da mesma e contíguo comPetição 870190057512, de 21/06/2019, pág. 312/33110/16 ela ou reconhece especificamente uma sequência compreendendo parte da sequência flanqueante de T-DNA 3' de EE-GM4 e parte do T-DNA inserido a montante da mesma e contígua com ela ou o seu complemento.
- 43. SONDA específica para a identificação do evento de elite EE-GM4 em amostras biológicas, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% de identidade de sequências com uma sequência compreendendo parte da sequência flanqueante de T-DNA 5' e parte do T-DNA inserido a jusante da mesma e contígua com ela, ou o seu complemento, ou parte da sequência flanqueante de T-DNA 3' e parte do T-DNA inserido a montante da mesma e contígua com ela em EE-GM4 ou o seu complemento.
- 44. SONDA, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que tem pelo menos 80% de identidade de sequências com a sequência de SEQ ID No. 1 ou 3 ou a sequência de SEQ ID No. 2 ou 4 ou o seu complemento.
- 45. SONDA, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de qualquer um de SEQ ID No. 1,3 ou 5 ou a sequência de qualquer um de SEQ ID No. 2, 4 ou 6 ou o seu complemento.
- 46. SONDA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 42, 43, 44 ou 45, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de SEQ ID No. 3 ou a sequência de SEQ ID No. 4.
- 47. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que compreende o referido método amplificação de um fragmento de DNA de entre 50 e 1000 pb a partir de um ácido nucleico presente nas referidas amostras biológicas usando uma reação em cadeia da polimerase com pelo menos dois iniciadores, em que os referidos pelo menos dois iniciadores são os iniciadores, conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 35,Petição 870190057512, de 21/06/2019, pág. 313/33111/1636, 37, 38, 39, 40 ou41.
- 48. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente o passo de hibridação de uma sonda específica do fragmento de DNA amplificado com os referidos pelo menos dois iniciadores.
- 49. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que a referida sonda reconhece parte da região flanqueante de TDNA 5' e parte do T-DNA inserido contíguo com ela ou em que a referida sonda reconhece parte da região flanqueante de T-DNA 3 e parte do T-DNA inserido contíguo com ela.
- 50. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que os referidos iniciadores compreendem a sequência de SEQ ID No. 12 e SEQ ID No. 13, respectivamente, e em que a referida sonda compreende a sequência de SEQ ID No. 14 ou em que os referidos iniciadores compreendem a sequência de SEQ ID No. 20 e SEQ ID No. 21, respectivamente, e em que a referida sonda compreende a sequência de SEQ ID No. 22.
- 51. ESTOJO adequado para uso em uma detecção específica de EE-GM4, caracterizado pelo fato de que compreende o par de iniciadores, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 35, 36, 37, 38, 39, 40 ou 41.
- 52. ESTOJO, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma sonda específica do fragmento de DNA amplificado pelo referido par de iniciadores.
- 53. ESTOJO, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que a referida sonda reconhece parte da região flanqueante de TDNA 5' e parte do T-DNA inserido contíguo com ela ou em que a referida sonda reconhece parte da região flanqueante de T-DNA 3' e parte do T-DNA inserido contíguo com ela.Petição 870190057512, de 21/06/2019, pág. 314/33112/16
- 54. ESTOJO, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que os referidos iniciadores compreendem a sequência de SEQ ID No. 12 e SEQ ID No. 13 e em que a referida sonda compreende a sequência de SEQ ID No. 14 ou em que os referidos iniciadores compreendem a sequência de SEQ ID No. 20 e SEQ ID No. 21 e em que a referida sonda compreende a sequência de SEQ ID No. 22.
- 55. ESTOJO adequado para uso em uma detecção específica de EE-GM4, caracterizado pelo fato de que compreende a sonda, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 42, 43, 44, 45 ou 46.
- 56. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 34, método esse caracterizado pelo fato de que compreende hibridação de um ácido nucleico das referidas amostras biológicas com a sonda, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 42, 43, 44, 45 ou 46.
- 57. MÉTODO PARA CONFIRMAÇÃO DA PUREZA DE SEMENTES, ou para rastreamento de sementes quanto à presença do evento de elite EE-GM4, método esse caracterizado pelo fato de que compreende detecção de uma região específica de EE-GM4 com o par de iniciadores, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 36, 37, 38, 39, 40 ou 41, ou a sonda, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 42, 43, 44 ou 45, em amostras da referida semente.
- 58. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que compreende amplificação de um fragmento de DNA de 126 pb e em que os referidos iniciadores compreendem a sequência de SEQ ID No. 12 e SEQ ID No. 13, respectivamente, e em que a referida sonda compreende a sequência de SEQ ID No. 14 ou amplificação de um fragmento de DNA de 90 pb e em que os referidos iniciadores compreendem a sequência de SEQ ID No. 20 e SEQ ID No. 21, respectivamente, e em que a referida sonda compreende a sequência de SEQ ID No. 22.Petição 870190057512, de 21/06/2019, pág. 315/33113/16
- 59. UM MÉTODO DE DETECÇÃO DA PRESENÇA DO EVENTO DE ELITE EE-GM4 em amostras biológicas através de hibridação com uma sonda de ácido nucleico etiquetada substancialmente complementar na qual a razão sonda:ácido nucleico alvo é amplificada através de reciclagem da sequência de ácido nucleico alvo, caracterizado pelo fato de que compreende o referido método:a) hibridação da referida sequência de ácido nucleico alvo com um primeiro oligonucleotídeo de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 a partir da posição de nucleotídeos 228 até à posição de nucleotídeos 245 ou seu complemento ou referido primeiro oligonucleotídeo de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 6 a partir da posição de nucleotídeos 236 até à posição de nucleotídeos 253 ou seu complemento;b) hibridação da referida sequência de ácido nucleico alvo com um segundo oligonucleotídeo de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 5 a partir do nucleotídeo 210 até ao nucleotídeo 227 ou seu complemento ou o referido oligonucleotídeo de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 6 a partir do nucleotídeo 254 até ao nucleotídeo 271 ou seu complemento, em que os referidos primeiro e segundo oligonucleotídeos se sobrepõem em pelo menos um nucleotídeo e em que qualquer um de dos referidos primeiro ou segundo oligonucleotídeos é etiquetado para ser a referida sonda de ácido nucleico etiquetada;c) divagem somente da sonda etiquetada dentro do dúplex sonda:sequência de ácido nucleico alvo com uma enzima que causa divagem seletiva da sonda resultando em dissociação do dúplex, deixando a sequência de alvo intata;d) reciclagem da sequência de ácido nucleico alvo por repetiçãoPetição 870190057512, de 21/06/2019, pág. 316/33114/16 dos passos (a) a (c); ee) detecção de sonda etiquetada clivada, determinando deste modo a presença da referida sequência de ácido nucleico alvo.
- 60. MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO DO ESTADO DE ZIGOSIDADE de uma planta, material de planta ou semente caracterizado pelo fato de que compreende o evento de elite EE-GM4, compreendendo o referido método amplificação de fragmentos de DNA de entre 50 e 1000 pb a partir de um ácido nucleico presente nas referidas amostras biológicas usando uma reação em cadeia da polimerase com pelo menos três iniciadores, reconhecendo especificamente dois dos referidos iniciadores DNA de planta pré-inserção, reconhecendo o terceiro dos referidos iniciadores uma sequência dentro do TDNA inserido.
- 61. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que os referidos dois iniciadores reconhecendo especificamente DNA de planta pré-inserção são um iniciador compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 18 e um iniciador compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 13 e em que o iniciador reconhecendo uma sequência dentro do T-DNA inserido é um iniciador compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 12.
- 62. MÉTODO PARA DETECÇÃO DA PRESENÇA DO EVENTO DE ELITE EE-GM4 em amostras biológicas, ou para determinação do estado de zigosidade de uma planta, material de planta ou semente caracterizado pelo fato de que compreende EE-GM4, em que o referido método é como descrito em qualquer um dos Exemplos 2.1,2.2 ou 2.3.
- 63. MÉTODO PARA REDUÇÃO DA PERDA DE RENDIMENTO em um campo a ser plantado com plantas de soja, particularmente um campo que contém, conteve ou é esperado que contenha nematódeos ou ovos de nematódeos tais como SCN, RKN ou Pratylenchus ou nematódeos reniformesPetição 870190057512, de 21/06/2019, pág. 317/33115/16 ou seus ovos, compreendendo o passo de 1) obtenção de plantas ou semente caracterizado pelo fato de que compreende evento de transformação de elite EEGM4 e 2) plantio ou semeadura de plantas ou sementes de soja, em que a semente de referência compreendendo o referido evento de elite está depositada na ATCC sob o número de depósito PTA-123624.
- 64. MÉTODO PARA AUMENTO DO RENDIMENTO DE PLANTAS de soja quando plantadas em um campo contendo nematódeos ou ovos de nematódeos tais como SCN, RKN ou Pratylenchus ou nematódeos reniformes ou seus ovos, caracterizado pelo fato de que compreende o passo de 1) obtenção de plantas ou semente compreendendo evento de transformação de elite EE-GM4 e 2) plantio ou semeadura de plantas ou sementes de soja, em que a semente de referência compreendendo o referido evento de elite está depositada na ATCC sob o número de depósito PTA-123624.
- 65. MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE UMA PLANTA ou semente de soja tolerante a um herbicida inibidor de HPPD, tal como isoxaflutol ou mesotriona, ou para produção de uma planta ou semente de soja tolerante a nematódeos, tais como SCN, RKN ou Pratylenchus ou nematódeos reniformes, ou para produção de uma planta ou semente de soja tolerante a um herbicida inibidor de HPPD, tal como isoxaflutol ou mesotriona, e tolerante a nematódeos, tais como SCN, RKN ou Pratylenchus ou nematódeos reniformes, caracterizado pelo passo de introdução no genoma de uma planta ou semente de soja do evento de transformação de elite da soja EE-GM4 e, opcionalmente, tratamento da referida planta ou semente com um herbicida inibidor de HPPD, tal como isoxaflutol ou mesotriona ou, opcionalmente, tratamento do campo no qual a referida planta ou semente será plantada com um herbicida inibidor de HPPD, tal como isoxaflutol ou mesotriona, e plantio da referida planta ou semente no referido campo pré-tratado.
- 66. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO que caracterizaPetição 870190057512, de 21/06/2019, pág. 318/33116/16 especificamente o evento de transformação de elite da soja EE-GM4, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeos de qualquer um de SEQ ID No. 1,3 ou 5, que contém uma parte de DNA genômico da planta de soja e uma parte de DNA estranho inserido de EE-GM4 a jusante do mesmo e contíguo com ele ou que compreende a sequência de nucleotídeos de qualquer um de SEQ ID No. 2,4 ou 6, que contém uma parte de DNA estranho inserido de EE-GM4 e uma parte de DNA genômico da planta de soja a jusante do mesmo e contíguo com ele.
- 67. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 ou 31, caracterizado pelo fato de que compreende o passo de aplicação de um inibidor de HPPD, tal como isoxaflutol, topramezona ou mesotriona, à semente de soja que irá crescer na referida planta ou ao campo onde a referida semente é para ser plantada ou sobre o topo da referida planta.
- 68. MÉTODO PARA AUMENTAR O RENDIMENTO DE PLANTAS de soja em campos contendo SCN infestados por Síndrome da Morte Súbita ou em campos contendo SCN causando Clorose com Deficiência em Ferro na soja, método esse caracterizado pelo fato de que compreende plantio de plantas ou semeadura de sementes compreendendo o evento de elite EE-GM4, em que a semente de referência compreendendo o referido evento de elite está depositada na ATCC sob o número de depósito PTA-123624.
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