JP6470704B2 - 優良イベントee−gm3及び生物学的試料におけるそのようなイベントを識別するための方法及びキット - Google Patents
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Description
本出願は2010年7月23日に出願された米国仮特許出願61/367,227号;2009年11月23日に出願された米国仮特許出願61/263,690号;及び2009年11月23日に出願された欧州特許出願EP09014564.0号の優先権を主張し、これらの開示内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、ダイズゲノムの特定の箇所において、特定の形質転換イベントを保有することにより、特に、除草剤耐性を付与する蛋白をコードする遺伝子の存在により特徴付けられる、トランスジェニックダイズ植物、植物性物質及び種子に関する。本発明のダイズ植物は除草剤の非存在下における非形質転換ダイズ系統と同等の種々異なる遺伝子的背景における作物学的性能、遺伝子的安定性及び機能に除草剤耐性表現型を組み合わせている。本発明は更に生物学的試料中に形質転換イベントEE−GM3を特に含む植物性物質の存在を識別するための方法及びキットを提供する。
i)植物発現可能なプロモーターの制御下にグリホセート耐容EPSPS酵素をコードするZea maysに由来する修飾されたepsps遺伝子を含む第1のキメラ遺伝子;及び、
ii)植物発現可能なプロモーターの制御下にHPPD阻害剤除草剤耐容酵素をコードするPseudomonas fluorescensに由来する修飾されたhppd遺伝子を含む第2のキメラ遺伝子;
を含む外来性DNAを含む。
a)外来性DNAの存在が、植物の他の所望の特性、例えば作物学的性能又は商業的価値を犠牲にしないこと;
b)安定に受け継がれ、そしてそのアイデンティティーの管理のための適切なツールを開発することのできる十分定義された分子配置によりイベントが特徴付けられること;
c)イベントを担持する植物が通常の作物学的使用において曝露される可能性のある環境条件の範囲において商業的に許容できるレベルで、イベントのヘテロ接合(又は半接合)及びホモ接合条件の両方において、正確、適切及び安定な空間的及び時間的な表現型の発現を目的の遺伝子が示すこと;
の1つ以上、好ましくは2つ以上、好都合には全てである。
− 自身の3’末端において5’フランキング配列(ヌクレオチド1からヌクレオチド1451までの配列番号2)における植物DNAから選択される少なくとも17個の連続ヌクレオチド、好ましくは20個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む17ntから200ntまでの長さの範囲のオリゴヌクレオチド(5’フランキング配列を認識するプライマー);又は、
− 自身の3’末端において3’フランキング配列(ヌクレオチド241からヌクレオチド1408までの配列番号3の相補体)における植物DNAから選択される少なくとも17個の連続ヌクレオチド、好ましくは20個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む17ntから200ntまでの長さの範囲のオリゴヌクレオチド(3’フランキング配列を認識するプライマー);又は、
− 自身の3’末端において挿入されたDNA配列(ヌクレオチド1452からヌクレオチド1843までの配列番号2の相補体)から選択される少なくとも17個の連続ヌクレオチド、好ましくは20個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む17ntから200ntまでの長さの範囲のオリゴヌクレオチド(外来性DNAを認識するプライマー);又は、
− 挿入されたDNA配列(ヌクレオチド1からヌクレオチド240までの配列番号3)から選択される少なくとも17個の連続ヌクレオチド、好ましくは20個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む17ntから200ntまでの長さの範囲のオリゴヌクレオチド;又は、
− 挿入されたDNAフラグメント又はその相補体(ヌクレオチド位置1452から16638までの配列番号1又は配列番号11)から選択される少なくとも17個の連続ヌクレオチド、好ましくは20個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む17ntから200ntまでの長さの範囲の適当なオリゴヌクレオチド。
a.5’フランキング配列認識プライマー:
− ヌクレオチド264からヌクレオチド283までの配列番号2のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド266からヌクレオチド285までの配列番号2のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド1240からヌクレオチド1259までの配列番号2のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド265からヌクレオチド285までの配列番号2のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド265からヌクレオチド283までの配列番号2のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド1239からヌクレオチド1259までの配列番号2のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド1241からヌクレオチド1259までの配列番号2のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド1244からヌクレオチド1263までの配列番号2のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド1248からヌクレオチド1267までの配列番号2のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド1250からヌクレオチド1269までの配列番号2のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド262からヌクレオチド279までの配列番号2のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド263からヌクレオチド279までの配列番号2のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド264からヌクレオチド285までの配列番号2のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド266からヌクレオチド283までの配列番号2のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド1238からヌクレオチド1259までの配列番号2のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド1242からヌクレオチド1259までの配列番号2のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド1243からヌクレオチド1263までの配列番号2のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド1245からヌクレオチド1263までの配列番号2のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド1247からヌクレオチド1267までの配列番号2のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド1249からヌクレオチド1269までの配列番号2のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド1249からヌクレオチド1267までの配列番号2のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド263からヌクレオチド285までの配列番号2のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド267からヌクレオチド283までの配列番号2のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド1242からヌクレオチド1263までの配列番号2のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド1243からヌクレオチド1259までの配列番号2のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド1246からヌクレオチド1267までの配列番号2のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド1246からヌクレオチド1263までの配列番号2のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド1248からヌクレオチド1269までの配列番号2のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド1250からヌクレオチド1271までの配列番号2のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド1250からヌクレオチド1267までの配列番号2のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド1241からヌクレオチド1263までの配列番号2のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド1245からヌクレオチド1267までの配列番号2のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド1247からヌクレオチド1269までの配列番号2のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド1247からヌクレオチド1263までの配列番号2のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド1249からヌクレオチド1271までの配列番号2のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド1242からヌクレオチド1261までの配列番号2のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド1241からヌクレオチド1261までの配列番号2のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド1243からヌクレオチド1261までの配列番号2のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド1240からヌクレオチド1261までの配列番号2のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド1244からヌクレオチド1261までの配列番号2のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド1239からヌクレオチド1261までの配列番号2のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド1245からヌクレオチド1261までの配列番号2のヌクレオチド配列
b.5’フランキング配列認識プライマーと共に使用するための外来性DNA配列認識プライマー
− ヌクレオチド1732からヌクレオチド1751までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1735からヌクレオチド1754までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1731からヌクレオチド1750までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1732からヌクレオチド1750までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1732からヌクレオチド1752までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1731からヌクレオチド1749までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1732からヌクレオチド1749までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1731からヌクレオチド1751までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1732からヌクレオチド1753までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1731からヌクレオチド1748までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1732からヌクレオチド1748までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1735からヌクレオチド1751までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1731からヌクレオチド1752までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1732からヌクレオチド1754までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1731からヌクレオチド1747までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1731からヌクレオチド1753までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1727からヌクレオチド1746までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1727からヌクレオチド1745までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1727からヌクレオチド1747までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1727からヌクレオチド1744までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1727からヌクレオチド1748までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1727からヌクレオチド1749までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1726からヌクレオチド1745までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1726からヌクレオチド1744までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1726からヌクレオチド1746までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1726からヌクレオチド1747までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1726からヌクレオチド1748までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1724からヌクレオチド1744までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1724からヌクレオチド1745までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1724からヌクレオチド1746までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1461からヌクレオチド1478までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1670からヌクレオチド1686までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1469からヌクレオチド1486までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1508からヌクレオチド1527までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1667からヌクレオチド1686までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1670からヌクレオチド1687までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1673からヌクレオチド1689までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1688からヌクレオチド1704までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1688からヌクレオチド1705までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1692からヌクレオチド1709までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1467からヌクレオチド1486までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1481からヌクレオチド1497までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1481からヌクレオチド1498までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1491からヌクレオチド1507までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1491からヌクレオチド1508までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1672からヌクレオチド1688までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1673からヌクレオチド1690までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1673からヌクレオチド1691までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1688からヌクレオチド1706までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1691からヌクレオチド1707までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1691からヌクレオチド1708までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1469からヌクレオチド1487までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1481からヌクレオチド1499までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1489からヌクレオチド1505までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1489からヌクレオチド1506までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1489からヌクレオチド1507までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1489からヌクレオチド1508までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1666からヌクレオチド1686までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1667からヌクレオチド1687までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1670からヌクレオチド1688までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1672からヌクレオチド1689までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1688からヌクレオチド1707までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1691からヌクレオチド1709までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1692からヌクレオチド1710までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1481からヌクレオチド1500までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1491からヌクレオチド1509までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1670からヌクレオチド1689までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1672からヌクレオチド1690までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1672からヌクレオチド1691までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1687からヌクレオチド1705までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1687からヌクレオチド1706までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1691からヌクレオチド1710までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1472からヌクレオチド1488までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1488からヌクレオチド1507までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1491からヌクレオチド1510までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1495からヌクレオチド1512までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1495からヌクレオチド1513までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1495からヌクレオチド1514までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1673からヌクレオチド1692までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1678からヌクレオチド1694までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1678からヌクレオチド1695までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1678からヌクレオチド1696までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1687からヌクレオチド1703までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1687からヌクレオチド1704までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1692からヌクレオチド1711までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1469からヌクレオチド1488までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1488からヌクレオチド1506までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1491からヌクレオチド1511までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1670からヌクレオチド1690までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1678からヌクレオチド1697までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1688からヌクレオチド1709までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1467からヌクレオチド1487までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1488からヌクレオチド1508までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1495からヌクレオチド1511までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1491からヌクレオチド1512までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1666からヌクレオチド1687までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1667からヌクレオチド1688までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1672からヌクレオチド1692までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1673からヌクレオチド1693までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1687からヌクレオチド1707までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1472からヌクレオチド1490までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1472からヌクレオチド1491までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1481からヌクレオチド1501までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1489からヌクレオチド1509までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1495からヌクレオチド1515までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1670からヌクレオチド1691までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1673からヌクレオチド1694までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1678からヌクレオチド1698までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1469からヌクレオチド1489までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1667からヌクレオチド1689までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1687からヌクレオチド1708までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1688からヌクレオチド1710までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1691からヌクレオチド1711までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1472からヌクレオチド1492までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1489からヌクレオチド1510までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1666からヌクレオチド1688までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1687からヌクレオチド1709までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1692からヌクレオチド1712までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1467からヌクレオチド1488までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1469からヌクレオチド1490までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1488からヌクレオチド1509までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1489からヌクレオチド1511までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1678からヌクレオチド1699までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1472からヌクレオチド1493までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1472からヌクレオチド1494までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1481からヌクレオチド1502までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1670からヌクレオチド1692までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1469からヌクレオチド1491までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1488からヌクレオチド1510までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1691からヌクレオチド1712までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1692からヌクレオチド1713までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1692からヌクレオチド1714までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1467からヌクレオチド1489までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1678からヌクレオチド1700までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1481からヌクレオチド1503までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド1691からヌクレオチド1713までの配列番号2のヌクレオチド配列の相補体
c.3’フランキング配列認識プライマー:
− ヌクレオチド828からヌクレオチド847までの配列番号3のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド830からヌクレオチド849までの配列番号3のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド828からヌクレオチド846までの配列番号3のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド828からヌクレオチド848までの配列番号3のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド830からヌクレオチド848までの配列番号3のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド830からヌクレオチド850までの配列番号3のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド828からヌクレオチド845までの配列番号3のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド830からヌクレオチド847までの配列番号3のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド828からヌクレオチド849までの配列番号3のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド830からヌクレオチド851までの配列番号3のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド828からヌクレオチド844までの配列番号3のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド830からヌクレオチド846までの配列番号3のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド828からヌクレオチド850までの配列番号3のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド830からヌクレオチド852までの配列番号3のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド992からヌクレオチド1009までの配列番号3のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド731からヌクレオチド752までの配列番号3のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド776からヌクレオチド795までの配列番号3のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド731からヌクレオチド753までの配列番号3のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド776からヌクレオチド794までの配列番号3のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド776からヌクレオチド796までの配列番号3のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド776からヌクレオチド793までの配列番号3のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド776からヌクレオチド797までの配列番号3のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド776からヌクレオチド792までの配列番号3のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド776からヌクレオチド798までの配列番号3のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド733からヌクレオチド752までの配列番号3のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド733からヌクレオチド753までの配列番号3のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド733からヌクレオチド754までの配列番号3のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド733からヌクレオチド755までの配列番号3のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド838からヌクレオチド854までの配列番号3のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド246からヌクレオチド263までの配列番号3のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド838からヌクレオチド855までの配列番号3のヌクレオチド配列の相補体
− ヌクレオチド245からヌクレオチド264までの配列番号3のヌクレオチド配列の相補体
d.3’フランキング配列認識プライマーと共に使用するための外来性DNA配列認識プライマー
− ヌクレオチド173からヌクレオチド192までの配列番号3のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド22からヌクレオチド41までの配列番号3のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド172からヌクレオチド192までの配列番号3のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド174からヌクレオチド192までの配列番号3のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド191からヌクレオチド210までの配列番号3のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド171からヌクレオチド192までの配列番号3のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド175からヌクレオチド192までの配列番号3のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド190からヌクレオチド210までの配列番号3のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド192からヌクレオチド210までの配列番号3のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド176からヌクレオチド192までの配列番号3のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド189からヌクレオチド210までの配列番号3のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド193からヌクレオチド210までの配列番号3のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド188からヌクレオチド210までの配列番号3のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド194からヌクレオチド210までの配列番号3のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド199からヌクレオチド218までの配列番号3のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド200からヌクレオチド218までの配列番号3のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド197からヌクレオチド218までの配列番号3のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド201からヌクレオチド218までの配列番号3のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド201からヌクレオチド220までの配列番号3のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド200からヌクレオチド220までの配列番号3のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド199からヌクレオチド220までの配列番号3のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド200からヌクレオチド221までの配列番号3のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド199からヌクレオチド221までの配列番号3のヌクレオチド配列
− ヌクレオチド150からヌクレオチド172までの配列番号3のヌクレオチド配列
アラクロル、ベンタゾン、トリフラリン、クロリムロン−エチル、クロランスラム−メチル、フェノキサプロプ、フォメサフェン、フルアジホップ、グリフォセート、イマザモックス、イマザキン、イマゼタピル、(S)メトラクロル、メトリブジン、ペンジメタリン、テプラロキシジム、イソキサフルトール。
ラムダ−シハロスリン、メトミル、パラチオン、チオカルブ、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、フルベンジアミド、リナキシピル、シアジピル、スピノサド、スピノトラム、エマネクチン−ベンゾエート、フィプロニル、エチプロール、デルタメトリン、β−シフルスリン、ガンマおよびラムダシハロスリン、4-[[(6-クロルピリジン-3-イル)メチル](2,2-ジフルオロエチル)アミノ]フラン-
2(5H)-オン、スピロテトラマト、スピノジクロフェン、トリフルムロン、フロニカミド、チオジカルブ、ベータ−シフルスリン。
アゾキシストロビン、シプロコナゾール、エポキシコナゾール、フルトリアフォル、ピラクロストロビン、テブコナゾール、トリフロキシストロビン、プロチオコナゾール、テトラコナゾール。
配列番号1:ベクターpSF10のSalIフラグメントヌクレオチド配列
配列番号2:EE−GM3中に除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAにフランキングしている5’領域を含むヌクレオチド配列
配列番号3:EE−GM3中に除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAにフランキングしている3’領域を含むヌクレオチド配列
配列番号4:プライマーSOY028
配列番号5:プライマーSOY029
配列番号6:プライマーSMP187
配列番号7:プライマーSTV019
配列番号8:アンプリコンのヌクレオチド配列
配列番号9:対照フラグメントの増幅のためのプライマー1(SOY01)
配列番号10:対照フラグメントの増幅のためのプライマー2(SOY02)
配列番号11:EE−GM3中の外来性DNA及び植物フランキング配列のヌクレオチド配列
配列番号12:プライマーSHA130
配列番号13:プライマーSHA178
1.1 2mEPSPS及びHPPD-Pf-W336キメラ遺伝子を含む外来性DNAの説明
プラスミドpSF10は約7,3kbのSalIフラグメント上に所在するキメラ2mepsps遺伝子及びキメラhppd-Pf-W336遺伝子を含有するpUC19由来クローニングベクターである。2つのSal1制限部位の間に含まれるDNAの完全な説明を以下の表1に示す。ヌクレオチド配列は配列番号1に示す。
約7.3kbのHPLC精製SalI線状化pSF10フラグメント(2mEPSPSグリホセート耐性遺伝子及びHPPD阻害剤耐性遺伝子HPPD−Pf−W336を含有する)を用いてダイズJack種の細胞内への直接遺伝子転移(Nickell, C. D., G. R. Noel, D. J. Thomas, and R. Waller. Registration of 'Jack' soybean. Crop Sci 1365. 30.1990)、ついで、形質転換された植物細胞をトランスジェニック繁殖性ダイズ植物に再生することにより、形質転換されたダイズ植物を得た。
− Jackと比較して類似の植物形態及び種子特性、
− Jackと比較してダイズの病気に対して変化が無いこと、及び、
− Jackと比較して種子の発芽に変化が無いこと、
を有することを示していた。
EE−GM3を含むダイズ植物で同様に顕著な作物耐性(10%未満の白化)が観察された。
EE−GM3優良イベントにおける除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAにフランキングする領域の配列を以下の通り決定した。
5’フランキング領域を含むと識別されるフラグメントを配列決定し、 そしてそのヌクレオチド配列を配列番号2に示す。ヌクレオチド1〜1451の配列は植物DNAに相当し、ヌクレオチド1452〜1843の配列は外来性DNAに相当する。
3’フランキング領域を含むと識別されるフラグメントを配列決定し、 そしてそのヌクレオチド配列を配列番号3に示す。ヌクレオチド1〜240の配列は外来性DNAに相当し、ヌクレオチド241〜1408の配列は植物DNAに相当する。
種々異なる分子手法を用いて除草剤耐性遺伝子を含む優良イベントEE−GM3の外来性DNAがヘッドトゥーヘッド方向の2つの部分的3’ヒストンAt配列とそれに続くヘッドトゥーテイル方向に配置したpSF10のSalIフラグメントの2つのほぼ完全なコピーを含有することが測定されている(図1参照)。
−ヌクレオチド1からヌクレオチド199まで:nt6760からnt6958までの配列番号1のヌクレオチド配列の相補体に相当するヌクレオチド配列;
−ヌクレオチド200からヌクレオチド624まで:nt6874からnt7298までの配列番号1のヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列;
−ヌクレオチド625からヌクレオチド7909まで:nt7からnt7291までの配列番号1のヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列;
−ヌクレオチド7910からヌクレオチド15163まで:nt12からnt7265までの配列番号1のヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列;及び、
−ヌクレオチド15164からヌクレオチド15187まで:nt217からnt240までの配列番号3のヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列(この配列はpSF10プラスミドDNA又はwt植物DNAの何れにも相当せず、従ってフィラーDNAと標記する)。
本外来性DNAは、直近上流において外来性DNAと近接して、ヌクレオチド1から1451までの配列番号2の5’フランキング配列により先行されており、そして、直近下流において外来性DNAと近接して、ヌクレオチド241からヌクレオチド1408までの配列番号3の3’フランキング配列により後続されている。
2.1. プライマー
優良イベント内部の配列を認識する特異的プライマーを開発した。
EE−GM3の3’フランキング領域内部の配列を認識するプライマーを開発した。次に第2のプライマーを、外来性DNAの配列内部において、プライマーが約263ヌクレオチドの配列に渡るように選択した。以下のプライマーがEE−GM3DNA上のPCR反応において特に明確で再現性のある結果をもたらすことがわかった。
SOY028: 5'-ATC.gCT.TTA.ACg.TCC.CTC.Ag -3 (配列番号 4)(標的:インサートDNA)
SOY029: 5' -CAA.ggC.CTC.gAg.A TT.A TC -3'(配列番号 5) (標的: 植物DNA)
内因性配列をターゲティングするプライマーは好ましく
はPCRカクテルに包含される。これらのプライマーは未知試料において、そしてDNA陽性対照において、内部対照として使用される。内因性プライマー対を用いた場合の陽性結果(413bpのPCR増幅フラグメントの存在)は発生させるべきPCR産物のためのゲノムDNA調製において十分な品質のアンプルDNAがあることを示している。内因性プライマーは以下の内因性アクチンダイズ遺伝子を認識するように選択した。
SOY01 5'-gTC.AgC.CAC.ACA.gTg.CCT.AT -3' (配列番号 9)
SOY02 5'-gTT.ACC.gTA.CAg.gTC.TTT.CC -3' (配列番号 10)
PCR反応で予測される増幅されるフラグメントは以下の通りである。
プライマー対SOY01-SOY02の場合:413bp(内因性対照)
プライマー対SOY028-SOY029の場合:263bp(EE−GM3優良イベント)
鋳型DNAはEdwards et al. (Nucleic Acid Research, 19, p1349, 1991)に従ってリーフパンチ葉片から調製した。他の方法で調製したDNAを使用する場合、鋳型の種々異なる量を利用するテストランを実施しなければならない。通常はゲノム鋳型DNA50ngが最良の結果をもたらす。
誤った陽性又は陰性を回避するためには以下の陽性及び陰性対照がPCRランに包含されなければならない。
− マスターミックス対照(DNA陰性対照)。これは反応にDNAを加えないPCRである。予測される結果であるPCR産物無しが観察される場合、これはPCRカクテルに標的DNAが混在していなかったことを指す。
− DNA陽性対照(トランスジェニック配列を含有することがわかっているゲノムDNA試料)。この陽性対照の増幅の成功は標的配列の増幅を可能にする条件下にPCRがランされたことを示す。
− 野生型DNA対照。これは与えられた鋳型DNAが非トランスジェニック植物から調製されたゲノムDNAであるPCRである。予測される結果であるトランスジェニックPCR産物の増幅無し、ただし内因性PCR産物の増幅有りが観察される場合、これはゲノムDNA試料中に検出可能なトランスジーンのバックグラウンド増幅が無いことを示している。
最適な結果は以下の条件下に得られた(最適な結果のための種々の条件を記載する場合、そのような条件の例を与えることを意味する。当然ながら当業者は条件、試薬及びパラメーターを変更する場合があり、例えば他のTaqポリメラーゼを用いて所望の結果を達成しても良い)。
−25μl反応用PCRミックスは下記のものを含有する。
20ng鋳型DNA
2.5μLの10x増幅緩衝液(Taqポリメラーゼの製造元により供給)
0.5μLの10mMdNTP類
0.4μLのSOY01(10ピコモル/μL)
0.4μLのSOY02(10ピコモル/μL)
0.7μLのSOY028(10ピコモル/μL)
0.7μLのSOY029(10ピコモル/μL)
0.1μLのTaqDNAポリメラーゼ(5単位/μL)
25μL定容とする水
−最適な結果のために従うべき熱サイクリングプロファイルは以下の通りである。
95℃4分間
次いで: 95℃1分間
57℃1分間
72℃2分間
5サイクル
次いで: 92℃30秒
57℃30秒
72℃1分間
25サイクル
次いで: 72℃10分間
PCRの結果を最適に可視化するために、PCR試料10〜20μLを適切な分子量マーカー(例えば100bpラダーPharmacia)と共に1.5%アガロースゲル(Trisホウ酸塩緩衝液)上にアプライしなければならないとした。
単一のPCRラン及び単一のPCRカクテルの内部におけるトランスジェニック植物DNA試料から得られたデータは、1)DNA陽性対照が予測されたPCR産物(トランスジェニック及び内因性のフラグメント)を示し、2)DNA陰性対照がPCR増幅に関して陰性(フラグメント無し)であり、そして3)野生型DNA対照が予測された結果(内因性フラグメント増幅)を示すことが成立しない限り許容してはならないとした。
上記したEE−GM3に関するPCR Identification Protocolに従った場合、予測されるサイズのトランスジェニック及び内因性PCR産物の目視可能な量を示すレーンは、ゲノム鋳型DNAの調製元の相当する植物がEE−GM3優良イベントを受け継いでいることを示している。トランスジェニックPCR産物の何れかの目視可能な量を示さず、そして内因性PCR産物の目視可能な量を示しているレーンは、ゲノム鋳型DNAの調製元の相当する植物が優良イベントを含まないことを示している。内因性およびトランスジェニックのPCR産物の目視可能な量を示さないレーンはゲノムDNAの質及び/又は量がPCR産物を発生させることができなかったことを示している。これらの植物は採点することができない。ゲノムDNA調製は反復しなければならず、そして適切な対照を用いながら新たなPCRランを実施しなければならない。
未知物のスクリーニングを試みる前に、全ての適切な対照を用いたテストランを実施する。開発されたプロトコルは実験室間で異なる場合がある要素(鋳型DNA調製、TaqDNAポリメラーゼ、プライマーの品質、dNTP類、サーモサイクラー等)。
内因性配列の増幅はプロトコルにおける重要な役割を果たす。1つは既知トランスジェニックゲノムDNA鋳型における内因性及びトランスジェニックの配列の両方の等モル量を増幅するPCR及び熱サイクリングの条件を得ることである。ターゲティングされる内因性フラグメントが増幅されない場合、又は、ターゲティングされる配列がアガロースゲル電気泳動で判断した場合に同じ臭化エチジウム染色強度で増幅されない場合は、PCR条件の最適化が必要な場合がある。
一部がEE−GM3を含む多くのダイズ植物に由来する葉材料を上記したプロトコルに従って試験した。優良イベントEE−GM3由来及びダイズ野生型由来の試料をそれぞれ陽性及び陰性対照として採取した。
図2は多くのダイズ植物試料上のEE−GM3に関して、優良イベントPCR Identification Protocolを用いて得られた結果を示す。レーン2及び3の試料は263bpのバンドが検出されていることから優良イベントEE−GM3を含有することがわかり、レーン4〜8の試料はEE−GM3を含んでいない。レーン6及び7は同じ除草剤耐性キメラ遺伝子を用いて得られた他のダイズ形質転換イベントに由来する試料を含み;レーン8は野生型ダイズ植物由来のDNAを含有し、そしてレーン9は陰性対照(水)試料を示し、レーン1及び10は分子量マーカー(100bpラダー)を示す。
判別PCR(dPCR)アッセイをバルク化種子中のEE−GM3の低レベルの存在を検出するためにセットアップする。非トランスジェニック種子のバルク中のトランスジェニック種子の0.4%(w/w)の最低レベルが反復可能な条件下に良好に検出できた。従って検出限界を0.4%(w/w)と決定した。
以下のプライマーをこの標的PCR反応に適用する。
T−DNA配列にターゲティングされたフォワードプライマー:
SHA130 5'- CTA.TAT.TCT.ggT.TCC.AAT.TTA.TC -3' (配列番号l2)
3’フランキング配列にターゲティングされたリバースプライマー:
SMP178 5'- TgA.ggC.ACg.TAT.TgA.TgA.CC- 3'(配列番号13)
これらのプライマーからPCR反応において予測される増幅されたフラグメントは115bpである。
変更したGentra PuregeneDNA精製抽出キット(Qiagen)に従って粉砕バルク化種子から調製した鋳型DNA約200ngに対して標的PCR反応を実施した。他の方法で調製したDNAを使用する場合、EE−GM3の既知相対レベルを有する試料を用いたテストランを実施しなければならない。
内因性配列にターゲティングしたバリデーションされたレファレンス系のPCR反応は、理想的には、誤った陰性結果を回避するためにPCR分析に対するDNA試料の適性を検証するために、別個のPCRランにおいて実施しなければならない。
未知試験試料に関しては、PCR実験は理想的には適切な陽性及び陰性対照試料、即ち如何に記載するものを包含しなければならない。
− マスターミックス対照(DNA陰性対照)。これは反応にDNAを加えないPCRである。標的及びレファレンス系の反応の両方に関して予測される結果(PCR産物無し)が観察される場合、これはPCRカクテルに標的DNAが混在していなかったことを指す。
− DNA陽性対照(トランスジェニック配列を含有することがわかっているゲノムDNA試料)。この陽性対照の増幅の成功は標的配列の増幅を可能にする条件下にPCRがランされたことを示す。
− 同様に野生型DNA対照をこのPCRに加えることができる。これは与えられた鋳型DNAが非トランスジェニック植物から調製されたゲノムDNAであるPCRである。予測される結果であるトランスジェニックPCR産物の増幅無し、ただし内因性PCR産物の増幅有りが観察される場合、これはゲノムDNA試料中に検出可能なトランスジーンのバックグラウンド増幅が無いことを示している。
最適な結果は以下の条件下に得られる。
当然ながら、他のTaqポリメラーゼも使用することができ、そしてその場合、条件を供給元の推奨に従って変えることができる。
−25μl反応用PCRミックスは下記のものを含有する。
200ngの鋳型DNA
5μLの5x反応緩衝液
0.25μLの20mMdNTP類
0.7μLのSHA130(10ピコモル/L)
0.4μLのSMP178(10ピコモル/L)
0.1μLのGO−TaqDNAポリメラーゼ(5単位/L)
25μL定容とする水
−最適な結果のために従うべき熱サイクリングプロファイルは以下の通りである。
95℃4分間
次いで: 95℃1分間
57℃1分間
72℃2分間
5サイクル
次いで: 92℃30秒
57℃30秒
72℃1分間
30サイクル
次いで: 72℃10分間
PCRの結果を最適に可視化するために、PCR産物25μLを適切な分子量マーカー(例えば50bpラダー)と共に1.5%アガロースゲル(Trisホウ酸塩緩衝液)上にアプライしなければならないとした。
上記したPCR法に従う場合、予測されるサイズの標的及びレファレンス系のPCR産物の目視可能な量を示すレーンはゲノム鋳型DNAの調製元の被験試料が標的反応の検出限界より高いEE−GM3優良イベントのレベルを含有していたことを示す。
標的PCR産物の目視可能な量を示さないが、レファレンス系PCR産物の目視可能な量を示すレーンはゲノム鋳型DNAの調製元の被験試料が標的反応の検出限界より低いEE−GM3のレベル優良イベントを含有していたことを示す。
内因性及びトランスジェニックのPCR産物の目視可能な量を示さないレーンはゲノムDNAの質及び/又は量がPCR産物を発生させることができなかったことを示している。これらの植物は採点することができない。ゲノムDNA調製は反復しなければならず、そして適切な対照を用いながら新たなPCRランを実施しなければならない。
EE−GM3の特異的組み込みフラグメントは、配列番号8のヌクレオチド配列を有するアンプリコンをもたらす特異的プライマーSOY028(配列番号4)及びSOY029(配列番号5)を用いたPCR増幅によるか、又は、化学合成により得られ、そして標識される。この組み込みフラグメントを、生物学的試料中のEE−GM3の検出のための特異的プローブとして使用する。核酸は標準的操作法に従って試料から抽出される。次にこの核酸をハイブリッドの形成を可能にするように最適化されたハイブリダイゼーション条件下に特異的プローブと接触させる。次にハイブリッドの形成が検出され、試料中のEE−GM3核酸の存在を示す。場合により、試料中の核酸は、特異的プローブとの接触よりも前に特異的プライマーを用いて増幅される。或いは、組み込みフラグメントの代わりに特異的プローブと接触させる前に核酸を標識する。場合により試料との接触の前に特異的プローブを固体担体(例えば限定しないがフィルター、ストリップ又はビーズ)に結合させる。
4.1.プライマー
優良イベントの挿入の前の野生型遺伝子座のヌクレオチド配列を認識する2つのプライマーを、それらが相互に指向し、そして除草剤耐性遺伝子を中間に含む外来性DNAの挿入部位を有するように設計した。このプライマーセットは、外来性DNA配列に相補でありフランキングDNAを指向している第3のプライマーと一緒になって、EE−GM3特異的配列並びに野生型配列の同時PCR増幅を可能とする。
以下のプライマーがEE−GM3DNA上の接合生殖性採点PCR反応において特に明確で再現性のある結果をもたらすことがわかった。
SMP187: 5'- ATA.TCA.ACC.CgT.AgC.TCg.AC-3'(配列番号6)
(標的:3’フランキング配列上流の野生型植物DNA)
SOY029 5' -CAA.ggC.CTC.gAg.ATT.ATC -3'(配列番号5)
(標的:3’フランキング配列の植物DNA)
5'- ggC.ATT.AAA.TTg.gTg.AAA.ATT.gC-3'(配列番号7)
(標的:インサートDNA)
PCR反応で予測される増幅されるフラグメントは以下の通りである。
プライマー対SMP187−SOY029の場合:319bp(野生型遺伝子座)
プライマー対STV019−SOY029の場合:706bp(EE−GM3遺伝子座)
鋳型DNAはEdwards et al. (Nucleic Acid Research, 19, pl349, 1991)に従ってリーフパンチ葉片から調製した。他の方法で調製したDNAを使用する場合、鋳型の種々異なる量を利用するテストランを実施しなければならない。通常はゲノム鋳型DNA25又は50ngが最良の結果をもたらす。
誤った陽性又は陰性を回避するためには以下の陽性及び陰性対照がPCRランに包含されなければならない。
− マスターミックス対照(DNA陰性対照)。これは反応にDNAを加えないPCRである。予測される結果であるPCR産物無しが観察される場合、これはPCRカクテルに標的DNAが混在していなかったことを指す。
− DNA陽性対照(トランスジェニック配列を含有することがわかっているゲノムDNA試料)。この陽性対照の増幅の成功は標的配列の増幅を可能にする条件下にPCRがランされたことを示す。
− 野生型DNA対照。これは与えられた鋳型DNAが非トランスジェニック植物から調製されたゲノムDNAであるPCRである。予測される結果であるトランスジェニックPCR産物の増幅無し、ただし内因性PCR産物の増幅有りが観察される場合、これはゲノムDNA試料中に検出可能なトランスジーンのバックグラウンド増幅が無いことを示している。
最適な結果は以下の条件下に得られた。明らかに、他のTaqポリメラーゼ、例えばGO−Taqも使用することができ、そしてその場合、条件を供給元の推奨に従って変えることができる。
−25μl反応用PCRミックスは下記のものを含有する。
xμLの鋳型DNA(25ng)
2.5μLの10x増幅緩衝液(Taqポリメラーゼの製造元により供給)
0.5μLの10mMdNTP類
0.5μLのSNP187(10ピコモル/μL)
0.5μLのSOY019(10ピコモル/μL)
1μLのSOY029(10ピコモル/μL)
0.1μLのTaqDNAポリメラーゼ(5単位/μL)
25μL定容とする水
−最適な結果のために従うべき熱サイクリングプロファイルは以下の通りである。
95℃4分間
次いで: 95℃1分間
57℃1分間
72℃2分間
5サイクル
次いで: 92℃30秒
57℃30秒
72℃1分間
25サイクル
次いで: 72℃10分間
PCRの結果を最適に可視化するために、PCR試料10〜20μLを適切な分子量マーカー(例えば100bpラダーPharmacia)と共に1.5%アガロースゲル(Trisホウ酸塩緩衝液)上にアプライしなければならないとした。
単一のPCRラン及び単一のPCRマスターミックスの内部におけるトランスジェニック植物DNA試料から得られたデータは、以下が成立しない限り許容してはならないとした。
−陽性対照が予測されたPCR産物を示す(トランスジェニック標的増幅);
−野生型陽性DNA対照が予測された結果を示す(野生型標的増幅);
−陰性対照がPCR増幅に関して陰性である(フラグメント無し)。
予測されたサイズのトランスジェニックPCR産物の目視可能な量を示し、そして野生型PCR産物の目視可能な量を示さないレーンは、ゲノムDNA鋳型の調製元の相当する植物がトランスジェニック遺伝子カセットに関してホモ接合であることを示している。
トランスジェニック及び野生型PCR産物の目視可能な量を示すレーンは、ゲノム鋳型DNAの調製元の相当する植物がトランスジェニック遺伝子カセットに関して半接合であることを示している。トランスジェニックPCR産物の目視可能な量を示さず、そして野生型PCR産物の目視可能な量を示しているレーンは、ゲノム鋳型DNAの調製元の相当する植物がアッセイ対象であるトランスジェニック配列を受け継いでおらず、従って野生型遺伝子座に関してホモ接合であることを示している。
トランスジェニック及び野生型のPCR産物の目視可能な量を示さないレーンはゲノムDNAの質及び/又は量がPCR産物を発生させることができなかったことを示している。これらの植物は採点することができない。ゲノムDNA調製は反復しなければならず、そして適切な対照を用いながら新たなPCRランを実施しなければならない。
図3は多くのダイズ植物試料上のEE−GM3に関する接合生殖性採点PCRを用いて得られた結果を示す。レーン2及び5中の試料は優良イベントEE−GM3に関して特徴的なPCRフラグメント(706bp)のみを含有していることがわかったのに対し、レーン4、6及び7の試料はwt遺伝子座の存在に関して特徴的なフラグメントのみを含有していた。レーン3,8及び9は両方のフラグメントを含有していた。従ってレーン2及び5はホモ接合型でEE−GM3を含有し、レーン3,8及び9は半接合型でEE−GM3を含有し、そしてレーン4、6及び7はホモ接合型でwt遺伝子座を含有している(EE−GM3については不対)。レーン10は陰性対照(水)試料を示し、そしてレーン1及び11は分子量マーカー(100bpラダー)を示す。
優良イベントEE−GM3は反復逆交雑により、商業的なダイズ栽培品種、例えば限定しないがダイズ栽培品種(Soybean Cultivar)7631014 (US2009252860);ダイズ栽培品種 7431014 (US2009252859);ダイズ栽培品種 7925084 (US2009252858);ダイズ栽培品種 7311153 (US2009252857);ダイズ栽培品種 S070159 (US2009252856);ダイズ栽培品種 7535357 (US2009246353);ダイズ栽培品種 S070160 (US2009246352);ダイズ栽培品種 26074414 (US2009249508);ダイズ栽培品種7509171 (US2009249507);ダイズ栽培品種 S070158 (US2009246351);ダイズ栽培品種 7511119 (US2009249506);ダイズ栽培品種 7113111 (US2009238945);ダイズ栽培品種 S06-02RM018047 (US7592518);ダイズ栽培品種 7013345 (US2009232957);ダイズ栽培品種 7041461 (US2009235376);ダイズ栽培品種 7549450 (US2009232956);ダイズ栽培品種 7317090 (US2009232955);ダイズ栽培品種 2N2V58015 (US2009226597);ダイズ栽培品種 7243182 (US2009226596);ダイズ栽培品種 7143182 (US2009226595);ダイズ栽培品種 7043182 (US2009220673);ダイズ栽培品種 S070157 (US2009222950);ダイズ栽培品種 306924721 (US2009220672);ダイズ栽培品種 7614385 (US2009220671);ダイズ栽培品種 7925118 (US2009214750);ダイズ栽培品種 7821295 (US2009214749);ダイズ栽培品種 7811336 (US2009214748);ダイズ栽培品種 S070150 (US2009214747);ダイズ栽培品種 6214260 (US2009214746);ダイズ栽培品種 S070152 (US2009214745);ダイズ栽培品種 7429331 (US2009214751);ダイズ栽培品種 26034631 (US2009208634);ダイズ栽培品種S07-03JR108674 (US7560621);ダイズ栽培品種 S07-03KL016279 (US7560620);ダイズ栽培品種 S06-CL959411 (US7554017);ダイズ栽培品種 SG3870NRR (US2009158453);ダイズ栽培品種 HFPR-G (CA2645702);ダイズ栽培品種 S06-02JR423016 (US7521606);ダイズ栽培品種 S06-01JR119814 (US7518039);ダイズ栽培品種S06-01JR119448 (US7518038);ダイズ栽培品種 6540220 (US2009055960);ダイズ栽培品種 S060292 (US2009055959);ダイズ栽培品種 S050228 (US2009055958);ダイズ栽培品種 S06-02JR423003 (US7491873);ダイズ栽培品種S06-02JR423005 (US7491872);ダイズ栽培品種 S06-02JR409114 (US7485782);ダイズ栽培品種 S06-SJ144056 (US7473823);ダイズ栽培品種 (US7470835);ダイズ栽培品種 6910450 (US2008282369);ダイズ栽培品種 6223012 (US7446246);ダイズ栽培品種 6549250 (US7446245);ダイズ栽培品種 17731225 (US2008271204);ダイズ栽培品種 6928285 (US2008271203);ダイズ栽培品種 6736054 (US2008271169);ダイズ栽培品種 S060299 (US2008271199);ダイズ栽培品種 S060294 (US2008271202);ダイズ栽培品種 6943322 (US2008271201);ダイズ栽培品種 5343260 (US2008263719);ダイズ栽培品種 6439359 (US2008263704);ダイズ栽培品種 6238359 (US2008263703);ダイズ栽培品種 6547272 (US2008263702);ダイズ栽培品種 6929431 (US2008263701);ダイズ栽培品種 6703392 (US2008263700);ダイズ栽培品種 6044483 (US2008263699);ダイズ栽培品種 S050224 (US2008263698);ダイズ栽培品種 6719022 (US2008263697);ダイズ栽培品種 5826056 (US2008263696);ダイズ栽培品種 6265047 (US2008263724);ダイズ栽培品種 6928331 (US2008263695);ダイズ栽培品種 6719331 (US2008263694);ダイズ栽培品種 6636454 (US2008263693);ダイズ栽培品種 6226454 (US2008263718);ダイズ栽培品種 Q0073801 (US2008256657);ダイズ栽培品種 6326393 (US2008256652);ダイズ栽培品種 6408448 (US2008256651);ダイズ栽培品種 6449315 (US2008250524);ダイズ栽培品種 S060296 (US2008250523);ダイズ栽培品種 6012078 (US2008250522);ダイズ栽培品種 6342078 (US2008250521);ダイズ栽培品種 6419156 (US2008250520);ダイズ栽培品種 5723264 (US2008250519);ダイズ栽培品種 S050225 (US2008250518);ダイズ栽培品種 S060298 (US2008244783);ダイズ栽培品種 6935331 (US2008244782);ダイズ栽培品種 6819456 (US2008244787);ダイズ栽培品種 S060297 (US2008244781);ダイズ栽培品種 6135319 (US2008244786);ダイズ栽培品種 6819331 (US2008244780);ダイズ栽培品種 6137445 (US2008244779);ダイズ栽培品種 6917445 (US2008244778);ダイズ栽培品種 6111333 (US2008244777);ダイズ栽培品種 S050229 (US2008244776);ダイズ栽培品種 6114011 (US2008244775);ダイズ栽培品種 6900358 (US2008244784);ダイズ栽培品種 6345184 (US2008244774);ダイズ栽培品種 6836085 (US2008244773);ダイズ栽培品種 6635047 (US2008244772);ダイズ栽培品種 6139105 (US2008244771);ダイズ栽培品種 6434385 (US2008244770);ダイズ栽培品種 S060295 (US2008244769);ダイズ栽培品種 6035184 (US2008244768);ダイズ栽培品種 S060293 (US2008209590);ダイズ栽培品種 6733322 (US2008209594);ダイズ栽培品種 6421326 (US2008209593);ダイズ栽培品種 S060077 (US2008209589);ダイズ栽培品種 6600375 (US2008209592);ダイズ栽培品種 S06-CL821457 (US7420104);ダイズ栽培品種 S07-02KG294306 (US7414178);ダイズ栽培品種 S06-BA046119 (US7414175);ダイズ栽培品種 S07-02KG294307 (US7411114);ダイズ栽培品種 SG3865N (US2008189802);ダイズ栽培品種 6701475 (US7408097);ダイズ栽培品種 1335025 (US2008178316);ダイズ栽培品種 1686017 (US2008178315);ダイズ栽培品種 2388028 (US2008178314);ダイズ栽培品種 2387029 (US2008178313);ダイズ栽培品種 S06-WW152330 (US7388129);ダイズ栽培品種 6424090 (US7385118);ダイズ栽培品種 6723322 (US7385115);ダイズ栽培品種 SG4377NRR (US7385114);ダイズ栽培品種 S06-02JR111334 (US7381864);ダイズ栽培品種 6141287 (US7378577);ダイズ栽培品種 MT110501 (US7378576);ダイズ栽培品種 (US7378575);ダイズ栽培品種 S06-WW169267 (US7375261);ダイズ栽培品種 6223392 (US7371939);ダイズ栽培品種 S06-CL968413 (US7371937);ダイズ栽培品種S06-CL951107 (US7368636);ダイズ栽培品種 S06-MT9152077 (US7361810);ダイズ栽培品種 4211676 (US2008092253);ダイズ栽培品種 S06-M059029 (US7355101);ダイズ栽培品種 6548193 (US7345228);ダイズ栽培品種 6440261 (US7345227);ダイズ栽培品種 S060291 (US7342151);ダイズ栽培品種 S06-MT9206166 (US7339094);ダイズ栽培品種S06-WW013107 (US7339093);ダイズ栽培品種 S06-M03256 (US7335820);ダイズ栽培品種 6134466 (US7332656);ダイズ栽培品種S06-01JR123373 (US7329800);ダイズ栽培品種 S06-MT9211059 (US7326831);ダイズ栽培品種 26170838 (US2008016590);ダイズ栽培品種 306612412 (US2008016588);ダイズ栽培品種26660135 (US2008016587);ダイズ栽培品種 306734323 (US2008016586);ダイズ栽培品種 S06-01JR122235 (US7317144);ダイズ栽培品種 5900450 (US7314986);ダイズ栽培品種 S06-MT116260 (US7314984);ダイズ栽培品種 S06-SJ143606 (US7312381);ダイズ栽培品種 S06-98181-G01-35167 (US7309819);ダイズ栽培品種26082635 (US7304219);ダイズ栽培品種 BA922834 (US7304217);ダイズ栽培品種 01JR123480 (US7304216);ダイズ栽培品種 M061422 (US7304215);ダイズ栽培品種 17082821 (US2007277262);ダイズ栽培品種 17621620 (US2007277261);ダイズ栽培品種 00977706 (US2007277260);ダイズ栽培品種 S060182 (US2007277259);ダイズ栽培品種 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Claims (42)
- 配列番号2のヌクレオチド1431からヌクレオチド1462までのヌクレオチド配列又はその相補体を含む、核酸分子。
- 配列番号3のヌクレオチド220から261までのヌクレオチド配列又はその相補体を含む、核酸分子。
- 配列番号2のヌクレオチド配列又はその相補体を含む、請求項1記載の核酸分子。
- 配列番号3のヌクレオチド配列又はその相補体を含む、請求項2記載の核酸分子。
- 配列番号11のヌクレオチド配列、又は配列番号11に対して少なくとも99%配列同一性を有し、HPPD阻害剤及び/又はグリホセートに対する耐性をもたらすヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の核酸分子をEE−GM3遺伝子座において含む、ダイズゲノムDNAであって、該EE−GM3遺伝子座は、寄託番号NCIMB41659の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラHPPD PfW336コード遺伝子及びキメラ2mEPSPSコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座である、前記ダイズゲノムDNA。
- ダイズ植物、又はその細胞、部分、種子若しくは子孫であって、それぞれがHPPD阻害剤及び/又はグリホセートに対して耐性であり、そしてそれぞれが配列番号2のヌクレオチド1431からヌクレオチド1462までのヌクレオチド配列および配列番号3のヌクレオチド220から261までのヌクレオチド配列をEE−GM3遺伝子座においてそのゲノム中に含み、該EE−GM3遺伝子座は、寄託番号NCIMB41659の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラHPPD PfW336コード遺伝子及びキメラ2mEPSPSコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座である、前記ダイズ植物、又はその細胞、部分、種子若しくは子孫。
- 配列番号2および3の配列を含む、請求項7記載のダイズ植物、又はその細胞、部分、種子若しくは子孫。
- 配列番号11の配列を含む、請求項7記載のダイズ植物、又はその細胞、部分、種子若しくは子孫。
- ダイズ植物、細胞、部分、又は種子であって、それぞれがHPPD阻害剤及び/又はグリホセートに対して耐性であり、そしてそれぞれが優良イベントEE−GM3をそのゲノム中に含み、ここで前記優良イベントは、寄託番号NCIMB41659の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラHPPD PfW336コード遺伝子及びキメラ2mEPSPSコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座である、前記ダイズ植物、細胞、部分、又は種子。
- 請求項10記載のダイズ植物、細胞、部分、又は種子の子孫植物、細胞、部分、又は種子であって、配列番号2のヌクレオチド1431からヌクレオチド1462までのヌクレオチド配列および配列番号3のヌクレオチド220から261までのヌクレオチド配列を含む、前記子孫植物、細胞、部分、又は種子。
- 請求項10記載のダイズ植物、細胞、部分、又は種子、或いは該ダイズ植物の子孫であって、そのゲノムDNAが、それぞれ配列番号4及び配列番号5のヌクレオチド配列を含む2つのプライマーによるPCRを使用して分析した場合に、263bpのDNAフラグメントを与える、前記ダイズ植物、細胞、部分、又は種子、或いは該ダイズ植物の子孫。
- 請求項7〜12のいずれか一項に記載のダイズ植物、又はその細胞、部分、種子若しくは子孫から製造される、ダイズ製品。
- ダイズ穀粉、粉砕種子、ダイズ粉末、若しくはダイズフレークであるか、又はそれを含む、請求項13記載のダイズ製品。
- イベントEE−GM3に対して特異的であるアンプリコンを生成する核酸を含む、請求項13又は14記載のダイズ製品。
- 請求項7〜12のいずれか一項記載のダイズ植物、又はその細胞、部分、種子若しくは子孫を得ること、及びそれからダイズ製品を製造することを含む、ダイズ製品を製造する方法。
- 前記ダイズ製品が、ダイズ穀粉、粉砕種子、ダイズ粉末、若しくはダイズフレークであるか、又はそれを含む、請求項16記載の方法。
- 前記ダイズ製品が、イベントEE−GM3に対して特異的であるアンプリコンを生成する核酸を含む、請求項16又は17記載の方法。
- 雑草を抑制する方法であって、請求項7〜12のいずれか一項記載のダイズ種子を播種した圃場を、ダイズ植物が出芽する前であるが種子を播種した後に、HPPD阻害剤除草剤で処理することを含む、前記方法。
- 前記HPPD阻害剤除草剤がイソキサフルトールであり、ここで前記処理の後、グリホセート又はHPPD阻害剤−グリホセート混合物を植物の上面から出芽後除草剤として適用する、請求項19記載の方法。
- 雑草を抑制する方法であって、請求項7〜12のいずれか一項記載のダイズ植物を、HPPD阻害剤除草剤で当該植物の上面から処理することを含む、前記方法。
- 前記HPPD阻害剤除草剤が、グリホセートの処理と共に、その後、又はそれに先立って適用される、請求項21記載の方法。
- 発芽成長中の請求項7〜12のいずれか一項記載のダイズ植物を雑草による競合から保護する方法であって、前記ダイズ植物を植栽すべき圃場を、前記ダイズ植物を植栽するか又は種子を播く前に、HPPD阻害剤除草剤で処理し、続いて、予備処理された前記圃場に前記ダイズ植物を植栽するか又は種子を播くことを含む、前記方法。
- グリホセート又はHPPD阻害剤−グリホセート混合物を植物の上面から出芽後除草剤として適用する、請求項23記載の方法。
- 前記HPPD阻害剤除草剤がイソキサフルトール系除草剤である、請求項23記載の方法。
- 請求項7〜12のいずれか一項記載のダイズ植物又は種子を植栽又は播種した圃場において雑草を抑制する方法であって、
前記圃場を、有効量のHPPD阻害剤除草剤及び/又はグリホセートで処理することを含み、
前記ダイズ植物又は種子は、前記HPPD阻害剤除草剤及びグリホセートに耐性である、
前記方法。 - 請求項7〜12のいずれか一項記載のダイズ植物又は種子を植栽又は播種すべき圃場において雑草を抑制する方法であって、
前記植物又は種子を植栽又は播種すべき圃場を、有効量のHPPD阻害剤除草剤及び/又はグリホセートで処理し、続いて、前記圃場に前記植物又は種子を植栽又は播種することを含み、
前記植物又は種子は、前記HPPD阻害剤除草剤及びグリホセートに耐性である、
前記方法。 - 雑草を抑制する方法であって、
請求項7〜12のいずれか一項記載のダイズ種子を播種した圃場を、ダイズ植物が出芽する前であるが種子を播種した後に、有効量のHPPD阻害剤除草剤で処理することを含み、
前記植物は、前記HPPD阻害剤除草剤に耐性である、
前記方法。 - 前記HPPD阻害剤除草剤がイソキサフルトール系除草剤である、請求項26〜28のいずれか一項記載の方法。
- グリホセート及び/又はイソキサフルトール除草剤に耐性であるダイズ植物を製造する方法であって、
HPPD阻害剤及び/又はグリホセートに対する耐性を欠く第1のダイズ植物を請求項7〜12のいずれか一項記載のダイズ植物と交雑させることにより、HPPD阻害剤及び/又はグリホセートに対する耐性をダイズ植物のゲノム内に導入すること、および
グリホセート及び/又はイソキサフルトールに対して耐性である子孫植物を選択すること、を含む、
前記方法。 - 生物学的試料中の優良イベントEE−GM3の存在又は非存在を検出する方法であって、
前記方法は、2つの特異的プライマーを用いた前記優良イベントの特異的領域の検出を含み、
該プライマーの一方は、前記優良イベントの5’又は3’フランキング領域内の配列を特異的に認識し、他方のプライマーは、前記5’又は3’フランキング領域に隣接する外来性DNA内配列を特異的に認識し、或いは
前記方法は、前記優良イベントの5’又は3’フランキング領域の部分及びそれに隣接する外来性DNAの部分を特異的に認識する特異的プローブを用いた前記優良イベントの特異的領域の検出を含み、
前記5’フランキング領域は、配列番号2のヌクレオチド1からヌクレオチド1451までのヌクレオチド配列又はその相補体を含み、
前記3’フランキング領域は、配列番号3のヌクレオチド241からヌクレオチド1408までのヌクレオチド配列又はその相補体を含み、そして
前記外来性DNAは、配列番号2のヌクレオチド1452からヌクレオチド1843までのヌクレオチド配列若しくは配列番号3のヌクレオチド1からヌクレオチド240までのヌクレオチド配列又はそれらの相補体を含むか、或いは配列番号11のヌクレオチド1452からヌクレオチド16638までのヌクレオチド配列またはその相補体を含み
ここで前記優良イベントは、寄託番号NCIMB41659の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラHPPD PfW336コード遺伝子及びキメラ2mEPSPSコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座である、前記方法。 - 請求項31記載の方法であって、
少なくとも2つのプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応を用いて前記生物学的試料中に存在する核酸から50〜1000bpのDNAフラグメントを増幅させることを含み、
前記プライマーの一方は、EE−GM3中の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAの5’フランキング領域を認識するか、ここで前記5’フランキング領域は配列番号2のヌクレオチド1からヌクレオチド1451までのヌクレオチド配列を含む、またはEE−GM3中の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAの3’フランキング領域を認識し、ここで前記3’フランキング領域は配列番号3のヌクレオチド241からヌクレオチド1408までの相補体のヌクレオチド配列を含む、
前記プライマーの他方のプライマーは、配列番号2のヌクレオチド1452からヌクレオチド1843までの相補体のヌクレオチド配列または配列番号3のヌクレオチド1からヌクレオチド240までのヌクレオチド配列を含む、外来性DNA内の配列を認識するか、あるいは、
前記プライマーの他方のプライマーは、配列番号1のヌクレオチド188からヌクレオチド7252までのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含むか、または配列番号11のヌクレオチド1452からヌクレオチド16638までのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含む、外来性DNA内の配列を認識する、
前記方法。 - 請求項32記載の方法であって、
5’フランキング領域を認識する前記プライマーは、その最3’末端において、配列番号2のヌクレオチド1からヌクレオチド1451までのヌクレオチド配列から選択される少なくとも17個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、
EE−GM3の3’フランキング領域を認識する前記プライマーは、その最3’末端において、配列番号3のヌクレオチド241からヌクレオチド1408までのヌクレオチド配列の相補体のヌクレオチド配列から選択される少なくとも17個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、
外来性DNA内部の配列を認識する前記プライマーは、その最3’末端において、配列番号2のヌクレオチド1452からヌクレオチド1843までのヌクレオチド配列の相補体のヌクレオチド配列、または配列番号3のヌクレオチド1からヌクレオチド240までのヌクレオチド配列、または配列番号1のヌクレオチド188からヌクレオチド7252までのヌクレオチド配列もしくはその相補体、または配列番号11のヌクレオチド1452からヌクレオチド16638までのヌクレオチド配列もしくはその相補体から選択される少なくとも17個の連続ヌクレオチドを含む、あるいは
前記プライマーは、それぞれ配列番号5および配列番号4の配列、または、それぞれ配列番号7および配列番号5の配列を含む、
前記方法。 - EE−GM3の特異的検出における使用に適したプライマー対であって、
EE−GM3は、5’フランキング領域、外来性DNAおよび3’フランキング領域を含み、5’フランキング領域は外来性DNAの直近上流にありそれに近接しており、3’フランキング領域は外来性DNAの直近下流にありそれに近接しており、
前記プライマー対は、EE−GM3中の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAの5’フランキング領域内の配列を認識する第1のプライマーおよび5’フランキング領域に近接する挿入された外来性DNA内の配列を認識する第2のプライマーを含むか、またはEE−GM3中の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAの3’フランキング領域内の配列を認識する第1のプライマーおよび3’フランキング領域に近接する挿入された外来性DNA内の配列を認識する第2のプライマーを含み、
ここで前記5’フランキング領域は配列番号2のヌクレオチド1からヌクレオチド1451までのヌクレオチド配列を含み、前記外来性DNAは配列番号11のヌクレオチド1452からヌクレオチド16638までのヌクレオチド配列を含み、そして前記3’フランキング領域は配列番号3のヌクレオチド241からヌクレオチド1408までのヌクレオチド配列を含み、
ここでEE−GM3は、寄託番号NCIMB41659の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラHPPD PfW336コード遺伝子及びキメラ2mEPSPSコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座である、
前記プライマー対。 - 前記プライマーの一方が、配列番号2のヌクレオチド1からヌクレオチド1451までのヌクレオチド配列から選択される17から200個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列、または配列番号3のヌクレオチド241からヌクレオチド1408までのヌクレオチド配列の相補体のヌクレオチド配列から選択される17から200個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、請求項34に記載のプライマー対。
- 前記プライマーの一方が、その3’末端において、配列番号2のヌクレオチド1からヌクレオチド1451までのヌクレオチド配列から選択される17から200個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列、または配列番号3のヌクレオチド241からヌクレオチド1408までのヌクレオチド配列の相補体のヌクレオチド配列から選択される17から200個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、請求項34に記載のプライマー対。
- 配列番号5の配列をその最3’末端に含む第1のプライマーおよび配列番号4の配列をその最3’末端に含む第2のプライマーを含む、請求項34に記載のプライマー対。
- 請求項31記載の方法であって、
生物学的試料の核酸を、優良イベントの5’または3’フランキング領域の部分およびそれに近接する外来性DNAの部分を含む領域に特異的にハイブリダイズするEE−GM3特異的プローブとハイブリダイズさせることを含み、
前記特異的プローブは、EE−GM3の5’フランキング領域の部分または3’フランキング領域の部分およびそれに近接する外来性DNAの部分を含む配列あるいはその相補体と、少なくとも90%配列同一性を有する、
前記方法。 - 生物学的試料中の優良イベントEE−GM3を識別するための特異的プローブであって、
EE−GM3は、5’フランキング領域、外来性DNAおよび3’フランキング領域を含み、5’フランキング領域は外来性DNAの直近上流にありそれに近接しており、3’フランキング領域は外来性DNAの直近下流にありそれに近接しており、
該プローブは、EE−GM3中の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAの5’フランキング配列の部分もしくは3’フランキング領域の部分およびそれに近接する外来性DNAの部分を含む配列またはその相補体と、少なくとも90%配列同一性を有し、
ここで前記5’フランキング領域は配列番号2のヌクレオチド1からヌクレオチド1451までのヌクレオチド配列を含み、前記外来性DNAは配列番号11のヌクレオチド1452からヌクレオチド16638までのヌクレオチド配列を含み、そして前記3’フランキング領域は配列番号3のヌクレオチド241からヌクレオチド1408までのヌクレオチド配列を含み、
ここで前記優良イベントは、寄託番号NCIMB41659の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラHPPD PfW336コード遺伝子及びキメラ2mEPSPSコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座である、
前記プローブ。 - EE−GM3を特異的に認識するプライマー対またはプローブを含むキットであって、
前記プライマー対は、請求項34〜37のいずれか一項に記載のプライマー対であり、
前記プローブは、請求項39に記載のプローブである、
前記キット。 - 請求項31記載の方法であって、
前記生物学的試料が種子試料であり、
種子の純度を確認するか、またはEE−GM3の存在に関して種子をスクリーニングするためであり、
前記種子試料における、EE−GM3中の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAの5’または3’フランキング領域を特異的に認識する特異的プライマーまたはプローブによるEE−GM3特異的領域の検出を含む、
前記方法。 - 実質的に相補な標識された核酸プローブとのハイブリダイゼーションを介して生物学的試料中の優良イベントEE−GM3の存在を検出する方法であって、
標的核酸配列の再利用を介して該標的核酸配列の検出シグナルが増幅され、
下記工程:
a)前記標的核酸配列を、配列番号2のヌクレオチド1452からヌクレオチド1469までのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含む第1の核酸オリゴヌクレオチド、または配列番号3のヌクレオチド223からヌクレオチド240までのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含む第1の核酸オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせること;
b)前記標的核酸配列を、配列番号2のヌクレオチド1434からヌクレオチド1451までのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含む第2の核酸オリゴヌクレオチド、または配列番号3のヌクレオチド241からヌクレオチド258までのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含む第2の核酸オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせること、ここで前記第1および第2のオリゴヌクレオチドは少なくとも1つのヌクレオチドで重複しており、そしてここで前記第1または該第2のオリゴヌクレオチドのいずれかが標識されて前記標識された核酸プローブとなる;
c)デュプレックス解離をもたらす選択的プローブ切断を起こす酵素により、プローブ:標的核酸配列デュプレックス内の標識されたプローブのみを切断し、標的配列は未損傷のままとすること;
d)工程(a)から(c)を反復することにより標的核酸配列を再利用すること;および
e)切断された標識されたプローブを検出することにより、標的核酸配列の存在を決定すること;
を含み、
ここで前記優良イベントは、寄託番号NCIMB41659の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラHPPD PfW336コード遺伝子及びキメラ2mEPSPSコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座である、
前記方法。
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