CN105219767B - 大豆转化事件shzd32‑01及其应用方法 - Google Patents

大豆转化事件shzd32‑01及其应用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种包含大豆转化事件SHZD32‑01的大豆植株和种子以及该大豆转化事件SHZD32‑01中独特的DNA分子，本发明也提出了该大豆植株部分、种子及其产品的应用方法；所述大豆转化事件SHZD32‑01含有下列核酸序列中的至少1个核酸分子：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9及其完全互补序列；所述应用方法包括产生耐草甘膦除草剂大豆的方法、产生大豆商品产品的方法和在田间控制杂草的大豆种植方法。本发明的大豆株系含有SHZD32‑01大豆转化事件，表现出很强的草甘膦耐受性，有助于对杂草的控制，大豆转化事件SHZD32‑01的DNA检测对于鉴定样品中的大豆转化事件SHZD32‑01并应用于含有该DNA的大豆育种具有非常价值。

Description

大豆转化事件SHZD32-01及其应用方法
技术领域
本发明是关于一个新的大豆的转化事件，被称为SHZD32-01。该事件对除草剂草甘膦(Glyphoste)表现出较强的耐受性。本发明还涉及到与转化事件SHZD32-01有关的大豆植株部分、种子及其产品的应用方法。
背景技术
大豆(Glycince max)是重要的经济作物。大豆对除草剂的耐性是一个重要的农艺性状，特别是对草甘膦除草剂的耐性。草甘膦(N-phosphonomethylglycine)是一种植物物种的广谱除草剂，是孟山都公司生产的产品农达(Roundup.RTM.)除草剂中的主要成分，是一种在环境中半衰期短的安全型除草剂。当草甘膦喷施于植物表面时，草甘膦会***地进入整个植物。草甘膦的植物毒性是由于它对莽草酸途径的抑制，而莽草酸是芳香族氨基酸合成的前体，草甘膦能够抑制植物中5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的合成。
草甘膦的耐性能够通过对草甘膦亲和力较低的突变体而获得，这种突变体在草甘膦存在时仍然能够表现代谢活性(U.S.Pat.Nos.5,633,435、5,094,945、4,535,060和6,040,497)。通过酶在植物组织中对草甘膦的降解(U.S.Pat.No.5,463,175)也能够赋予细胞对草甘膦的耐受性。这些基因被用于生产耐草甘膦转基因作物，因此使用草甘膦可以有效地控制杂草而不会对作物造成损害。耐草甘膦基因工程已经用于玉米(U.S.Pat.No.5,554,798)、小麦(U.S.Pat.No.6,689,880)、棉花(U.S.Pat.No.6,740,488)、大豆(WO 9200377)和油菜(US Patent Appl.20040018518)等作物。耐草甘膦转基因和耐其它除草剂转基因，如bar基因，(Toki el al.,1992；Thompson et al.,1987，耐除草剂草铵膦)也是有用的选择标记或评价标记，利用与其他农艺性状的连锁为筛选提供有用的表型。
外源基因的表达受其在染色***置的影响，由于外源基因的***位点不同，转化体表现差异很大，因此要筛选大量的转化体来鉴定出引入外源基因最优化表达的转化事件。在不同的转化事件中已经观察到在不同组织中导入基因的表达水平具有较大范围的变异。也存在不同的时空表达模式，如在不同的植物组织中转基因的相关表达也会不同，因此需要从成千上万的转化体中筛选出一个转基因表达水平符合商业化应用的转化事件。一个具有理想表达水平和模式的转化体，可以将该转基因通过有性杂交的传统方法导入其他遗传背景中，杂交后代可以保持原转化体外源转基因的性状表达。该策略可以确保目的基因在大量适应当地生长的优良品种中可靠表达。
检测特殊的转化事件可以通过鉴定有性杂交后代植株或种子是否含有转基因，另外，检测特殊转化事件的方法对遵守批准上市前的规定和要求是必要的，同时有利于进行转基因作物的食品标识。使用任何核酸检测方法，如聚合酶链式反应(PCR)或利用多聚核酸探针的DNA杂交方法都可以检测是否含有转基因。这些检测方法一般都关注常用的转基因元件，如启动子，终止子，标记基因等，但对于辨别不同的转化事件是无效的，特别是使用同一个DNA载体的转化事件更是无法分析，除非***转基因附近的染色体DNA序列(旁侧DNA)是已知的。例如Windels等人1999年对耐除草剂转基因大豆40-3-2使用了跨越***基因和旁侧序列的一对引物进行转化事件的检测，一个引物特异地包括了***基因的序列，另一个引物包括了侧翼序列(美国专利号为：6,893,826；6,825,400；6,740,488；6,733,974和6,689,880；6,900,014和6,818,807)。
发明内容
本发明提供一种大豆转化事件SHZD32-01及其应用方法，大豆SHZD32-01是由一个大豆栽培种衍生而来，具有对草甘膦除草剂的耐受性，同时提供来自转化事件SHZD32-01的大豆植株部分、种子及其产品的应用方法。
本发明提出一个新的被命名为SHZD32-01的耐草甘膦的大豆转化事件，以及含有该事件植株部分、种子和由植株、植株部分、种子和产品而来的产品。
本发明提出一种在含有事件SHZD32-01的大豆细胞基因组中含有的新的DNA分子，能够用多种方法鉴定样品中这种新的DNA分子。
本发明中提出一个重组的DNA分子，存在于所述大豆转化事件SHZD32-01中，包括下列所给出的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9以及该SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:9完全互补序列中的至少一个核酸序列。
所述的重组DNA分子，包括核酸序列SEQ ID NO:1。
所述的重组DNA分子，包括核酸序列SEQ ID NO:2。
所述的重组DNA分子，包括核酸序列SEQ ID NO:3。
所述的重组DNA分子，包括核酸序列SEQ ID NO:4。
所述的重组DNA分子，包括核酸序列SEQ ID NO:9。
所述的重组DNA分子，包括核酸序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
所述的重组DNA分子，包括核酸序列SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
所述的重组DNA分子，这里所述重组DNA分子来自于大豆转化事件SHZD320-01,包含所述转化事件的代表性种子样本保存在中国典型培养物保藏中心(China Center forType Culture Collection,CCTCC),地址：中国武汉武汉大学，保藏日期：2015年8月18日，保藏编号为CCTCC NO:P201513；该保藏生物材料的分类命名为：大豆属栽培大豆种大豆SHZD32-01 Glycine max(L)Merr.。
本发明提出的重组DNA分子，这里所述重组DNA分子存在于大豆植株、大豆植物细胞、大豆种子、大豆植株部分或商品产品中。
本发明中提出的一种DNA引物或探针包含足够长的连续的核苷酸序列来自于SEQID NO:9或其互补序列，这里所述引物或探针是为诊断转化事件SHZD32-01的，这里所述DNA引物和探针能在严格杂交条件下与包含所给出的SEQ ID NO:1-4和SEQ ID NO:9中的一个核酸序列的DNA分子杂交，而不能在严格杂交条件下与不包含所给出的SEQ ID NO:1-4和SEQ ID NO:9中的一个核酸序列的DNA分子杂交。
本发明提出的一对DNA分子所包含的第一个DNA分子和与第一个DNA分子不同的第二个DNA分子，这里所述的第一个DNA分子和第二个DNA分子每个都包含一段足够长的连续的核苷酸序列来自SEQ ID NO:9，或与其完全互补的序列，作为DNA引物与转化事件SHZD32-01的DNA一起用于扩增反应产生诊断样本中大豆转化事件SHZD32-01的扩增产物。
本发明提出的一种检测样品中转化事件SHZD32-01的DNA分子存在的方法，所述方法包括：a)使上述样品的DNA与权利要求11中的DNA探针相接触；b)使上述样品和上述DNA探针置于严格杂交条件下；c)检测上述DNA探针与上述样品中DNA分子的杂交情况，上述DNA探针与上述DNA分子杂交，说明上述样品中存在大豆转化事件SHZD32-01的DNA分子。
本发明提出的一种检测样品中转化事件SHZD32-01的DNA分子存在的方法，所述方法包括：a)使上述样品的DNA与权利要求12中的这对DNA分子相接触；b)进行扩增反应产生含有所给出的SEQ ID 1-4和SEQ ID NO:9和其完全互补序列中一个核酸序列的扩增产物；c)检测上述反应中的DNA扩增产物，上述反应中有扩增产物，说明上述样品中存在大豆转化事件SHZD32-01的DNA分子。
本发明提出的一种DNA检测试剂盒包括一对引物或至少一个DNA探针，这里a)这对DNA引物包括至少一个DNA分子包含足够长的连续的核酸序列来自SEQ ID:9或其完全互补序列，这里的这对DNA引物能够产生诊断转化事件SNZD32-01的扩增片段；b)至少一个DNA探针是诊断转化事件SHZD32-01的。
本发明提出一种田间种植含有SHZD32-01的大豆，在田间用草甘膦除草剂处理杂草和含有SHZD32-01的大豆植株控制田间杂草生长。
本发明的技术方案是：
一种含有大豆转化事件SHZD32-01的大豆植株或其部分，其特征在于，大豆植株或其部分包含大豆转化事件SHZD32-01，其有代表性的种子保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:P201513。
一种所述的含有大豆转化事件SHZD32-01大豆植株的种子，其特征在于，所述的种子含有所述大豆转化事件SHZD32-01。
一种由所述的种子生产的大豆商品产品，其特征在于，所述商品产品包含所述大豆转化事件SHZD32-01。
所述商品产品进一步定义为食品、面粉、豆粕或油。
所述的大豆植株部分进一步定义为细胞、花粉、胚珠、花、芽、根或叶片。
所述的大豆植株进一步定义为包含所述大豆转化事件SHZD32-01的大豆植株的任何世代的后代植株，该后代植株包含所述大豆转化事件SHZD32-01。
所述大豆植株或其部分能够产生大豆转化事件SHZD32-01的诊断扩增。
所述诊断扩增包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。
一种大豆转化事件SHZD32-01包含种子，其特征在于，所述的种子能够产生所述大豆转化事件SHZD32-01的诊断扩增。
所述的大豆转化事件SHZD32-01的诊断扩增包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。
所述的食品、面粉、豆粕或油进一步定义为含有能够产生大豆转化事件SHZD32-01诊断扩增的核酸，当使用DNA扩增方法进行检测时，上述诊断扩增包含SEQ ID NO:1或SEQID NO:2。
一种产生耐草甘膦除草剂大豆的方法，其特征在于，包含将所述大豆转化事件SHZD32-01引入大豆基因组。
所述产生耐草甘膦除草剂大豆的方法包含下列步骤：(a)用第一种包含所述大豆转化事件SHZD32-01的大豆植株与第二种不含有所述大豆转化事件SHZD32-01的大豆植株进行杂交产生后代植株；和(b)筛选至少一个第一种含有所述大豆转化事件SHZD32-01并耐草甘膦的后代植株。
所述产生耐草甘膦除草剂大豆的方法进一步包含，通过所述第一种含有所述大豆转化事件SHZD32-01并耐草甘膦的后代植株自交，产生第二代后代植株，并选择至少一个含有所述大豆转化事件SHZD32-01的第一种植株的纯合体植株。
一种具有草甘膦耐受性大豆植株、种子或其含有DNA的包括草甘膦抗性蛋白G10-EPSPS和能够产生大豆转化事件SHZD32-01诊断扩增的部分。
所述的具有耐草甘膦耐受性大豆植株、种子或其含有DNA的部分，其特征在于，所述的大豆转化事件SHZD32-01的诊断扩增包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。
一种产生大豆商品产品的方法，其特征在于，包括：(a)获得权利要求1所述的大豆植株或部分；和(b)从所述大豆植株或其部分生产所述大豆商品产品。
所述的大豆商品产品被定义为食品、面粉、碎屑、分离蛋白或油。
一种在田间控制杂草的大豆种植方法，其特征在于，使用所述的包含大豆转化事件SHZD32-01的大豆植株，所述方法包括在田间使用一定剂量的草甘膦以有效地控制杂草的生长，所述大豆表现出耐草甘膦特性。
所述的在田间控制杂草的大豆种植方法，其特征在于，在大豆生长阶段从V1到R4期进行田间处理。
本发明提出一个被定名在SHZD32-01的大豆转化事件，对除草剂草甘膦具有很好的耐受性，其后代有代表性的种子保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC NO:P201513。本发明也提出新的与转化事件SHZD32-01有关的DNA分子以及这些DNA分子的使用方法。本发明也提出大豆转化事件SHZD32-01的种子，后代，植株部分，细胞和商品产品。本发明也提出大豆转化事件SHZD32-01的使用方法和生产抗草甘膦大豆的方法。
本发明提出与大豆转化事件SHZD32-01有关的重组DNA分子。这些重组DNA分子包含代表转化事件SHZD32-01转基因***侧翼序列的基因组DNA区域，和/或转基因***区域，和/或任何一个转基因***与侧翼序列之间的结合区的相邻序列。本发明还提出了作为引物和探针使用的诊断转化事件SHZD32-01的DNA分子和诊断大豆转化事件SHZD32-01存在的扩增产物。也公开了包含这些分子的大豆植株，植物细胞，植株部分，商品产品，后代和种子。
本发明提出了用于检测转化事件SHZD32-01的DNA存在和/或不存在的方法和试剂盒，本发明提出检测SHZD32-01的方法是通过将样品DNA与引物系列混合，让来自转化事件SHZD32-01的基因组DNA进行核酸扩增反应产生诊断大豆转化事件SHZD32-01的扩增DNA片段，进行核酸扩增反应并产生扩增的DNA产物，以及检测扩增的DNA存在和/或不存在。本发明也提出了一种检测SHZD32-01的方法是将样品DNA与探针接触，在杂交反应中来自大豆转化事件SHZD32-01的DNA会与对转化事件SHZD32-01具有特异DNA分子杂交，进行杂交反应，检测探针与DNA分子的杂交。本发明中试剂盒包含的方法和组成成分对检测来自转化事件SHZD32-01的DNA的存在是有用的。
本发明提出大豆转化事件SHZD32-01的大豆植株，种子，植物细胞，后代植株，植株部分，或来自植株，植物细胞，或的种子的商品产品。本发明也提出大豆植株，种子，植物细胞，植物部分，或商品产品含有重组DNA分子含有给出的SEQ ID:1-4和SEQ ID NO:9和其互补序列中的一个核酸序列。本发明也提出大豆植株，种子，植物细胞，后代植株，植株部分，或来自与植株或种子的商品产品含有大豆转化事件SHZD32-01并包含重组DNA分子，在DNA扩增反应中能够产生包括SEQ ID:1,SEQ ID:2的扩增产物。
本发明另一方面是在田间使用含有SHZD32-01的大豆植株控制杂草的方法，其方法包括田间种植含有转化事件SHZD32-01的大豆种子，所述有代表性的种子保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其编号为P201513。让上述种子萌发并利用有效的草甘膦施用剂量处理上述植株控制该田间杂草的生长。
根据本发明的另一方面，提出生产耐草甘膦大豆的方法包括以下步骤：(a)用一个含有转化事件SHZD32-01的耐草甘膦大豆亲本，与第二个没有草甘膦耐受性的亲本大豆进行杂交，产生纯合的后代植株；(b)筛选耐草甘膦的后代植株。详细可描述为，本发明提出通过有性杂交产生耐草甘膦植株和种子的方法是用含有转化事件SHZD32-01的耐草甘膦大豆与第二个大豆材料杂交产生种子，种植这些种子得到后代植株，用草甘膦处理这些后代植株，筛选得到抗草甘膦的后代植株。方法也包括，让这些筛选出的后代植株进行自交产生纯合的第二代后代植株，并从中选出抗草甘膦的植株。方法也包括用筛选出的后代植株与另外一个大豆植株(材料)进行有性杂交产生种子，种植这些种子得到第二代后代植株，用草甘膦处理这些第二代后代植株，筛选得到抗草甘膦的第二代后代植株。本发明提出的产生耐草甘膦植株和种子的方法，通过自交含有转化事件SHZD32-01的耐草甘膦大豆而产生种子，种植这些种子得到后代植株，用草甘膦处理这些后代植株，选择得到耐草甘膦的后代植株。育种方法可以包括用含有转化事件SHZD32-01的亲本植株与第二个也耐草甘膦的亲本大豆杂交，用在每个亲本中找到的与耐草甘膦表型在遗传上连锁的DNA分子标记筛选耐草甘膦后代。
本发明一个方面是提出来自于大豆转化事件SHZD32-01的植株或种子，或来自植物部分或种子的产品中转基因/基因组结合区域DNA的结构和检测方法。提出的DNA分子包含至少一个选自包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的转基因/基因组结合区，及其互补序列。结合区分子横跨包含异源DNA***到大豆细胞基因组的区域和***位点的旁侧序列的大豆基因组DNA。该结合区序列一方面被定义为分别包含核苷酸SEQ ID NO:9的824-844或3994-4014位置。本发明另一方面，结合区也可以定义为包含侧翼基因组和转基因部分的一个或多个序列，如下列给出的核苷酸序列SEQ ID NO:9中的804-844，774-844，824-864，824-894，774-894,3974-4014，3944-4014,3994-4034，3996-4014,3996-4066，或3946-4066。这些序列和包含这些序列的植物和种子构成本发明的另一方面。
本发明提出一个来自于大豆转化事件SHZD32-01的新DNA分子，包含转基因/基因组区域的SEQ ID NO.3，或其互补序列。大豆植株和种子的基因组中包含SEQ ID NO.3为本发明的一个方面，SEQ ID NO.3进一步包含完整的SEQ ID NO.1。
根据本发明的另一方面，提出一个包含转基因/基因组区域的DNA分子SEQ IDNO.4，或者其互补序列，该DNA分子是大豆转化事件SHZD32-01所特有的新DNA分子。大豆植株和种子包含SEQ ID NO.4是本发明的另一个方面。SEQ ID NO.4进一步包含完整的SEQ IDNO.2。
来自SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4,或SEQ ID NO.9的任意核苷酸引物对，或与其互补的序列，当用于NDA扩增反应鉴定大豆转化事件SHZD32-01的衍生组织时，分别包含SEQID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.9任何部分的扩增是本发明另一个方面。在一个具体实施例中引物对可以由引物A(SEQ ID NO.5)和引物D(SEQ ID NO.8)组成。
本发明的另一方面是大豆植株，或种子，或来自于植株或种子的产品包含转化事件SHZD32-01，从大豆植株，或种子，或产品中分离基因组DNA，产生的扩增序列包含SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2。
本发明还有另一个方面是大豆植株，或种子，或来自植株或种子的产品包含转化事件SHZD32-01，从大豆植株，或种子，或产品中分离的基因组DNA在扩增反应中产生的扩增序列，这个DNA扩增方法中使用DNA引物分子为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。
本发明的另一方面是大豆植株，或种子，或产品，或来自植株或种子的商品包含转化事件SHZD32-01，分离大豆植株，或种子，或产品的基因组DNA，利用DNA扩增方法产生扩增片段，在这里的DNA扩增方法中使用引物分子SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8。产品或商品可以包含，没有限定，食品或饲料产品，或包含来自一种或多种含有转化事件SHZD32-01的下列产品：卵磷脂，脂肪酸，甘油，甾醇，食用油，去脂豆粕，大豆食品包括去脂和烘烤大豆膳食，豆浆豆腐，大豆粉，大豆组织蛋白，和大豆蛋白纤维。
根据本发明的另一方面，提出了检测样品中大豆转化事件SHZD32-01特异DNA存在的方法。该方法包括：(a)混合样品包括DNA与引物；(b)进行核酸扩增反应，产生扩增产物；(c)检测扩增产物，这里的扩增产物包含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2。使用含有DNA引物分子的试剂盒用于DNA扩增反应产生包含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的扩增是本发明的另一方面。
根据本发明的另一方面，提出了检测样品中大豆转化事件SHZD32-01特异DNA存在的方法。该方法包括：(a)混合样品包括DNA与能够在严格杂交条件下与转化事件SHZD32-01的基因组DNA进行杂交而不能在该条件下与对照大豆植株DNA杂交；(b)使样品和探针处于严格的杂交条件下；(c)检测探针和转化事件SHZD32-01DNA的杂交情况，这里所述探针包含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2。样品可以包含后代种子，植株，或包含转化事件SHZD32-01的植株部分，或任何来自含有转化事件SHZD32-01的下列产品：卵磷脂，脂肪酸，甘油，甾醇，食用油，去脂豆粕，大豆食品包括去脂和烘烤大豆膳食，豆浆豆腐，大豆粉，浓缩大豆蛋白，大豆分离蛋白，水解植物蛋白，大豆组织蛋白和大豆蛋白纤维。检测试剂盒包括的DNA探针序列包括一个含有与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2序列相同或互补的DNA序列是本发明的另一方面。试剂盒包含的DNA分子包含SEQ ID NO.18，SEQ ID NO.19，或SEQ ID NO.20，或者它们的互补序列，也是本发明的一个方面。
详细描述：
本发明涉及到一个新的被命名为SHZD32-01的耐草甘膦的大豆转化事件，以及含有该事件植株部分，种子和由植株,植株部分，种子和产品而产生的产品。本发明提出一种在含有事件SHZD32-01的大豆细胞基因组中含有的新的DNA分子，能够用多种方法鉴定样品中这种新的DNA分子。本发明提出一种田间种植含有SHZD32-01的大豆，在田间用草甘膦除草剂处理杂草和含有SHZD32-01的大豆植株控制田间杂草生长。
下列定义和方法为本发明提供更精确的解释。注释和词汇按照相关文献中的常规用法理解。
这里所述大豆(Glycine max)，包含所有育成的大豆品种或大豆材料。
这里所用的词汇“包含”意思为包括，但不限定于包括。
草甘膦是指N-phosphonomethylglycine及其盐类，草甘膦是农达(Roundup.RTM.)除草剂(孟山都公司)中的活性添加物质。用草甘膦除草剂处理是指用农达RoundupRoundup除草剂或任何其他包括含有草甘膦成分的除草剂。草甘膦的商业用配方实例包括，但不限定于孟山都公司出售的ULTRA,ULTRAMAX,CT,EXTRA,BIACTIVE,BIOFORCE, 和除草剂,以上这些都含有草甘膦的异丙铵盐；WEATHERMAX(草甘膦钾盐),孟山都公司作为除草剂DRY和出售,含有草甘膦铵盐；孟山都公司出售的GEOFORCE,含有草甘膦钠盐；先正达农作物保护出售的除草剂,含有草甘膦三甲基盐，除草剂还包括国内各农药厂家生产的含上述成分的除草剂，在使用上述任何草甘膦除草剂配方田间处理含有SHZD32-01的耐草甘膦大豆可以控制田间杂草的生长而对含有SHZD32-01的大豆植株的生长或产量没有影响。
“转化事件”是通过转化将异源DNA导入植物细胞，如载有外源基因的载体将该外源基因***植物基因组而获得再生植株而获得的群体，根据外源基因***植物基因组的特殊位点进行选择。事件是指原始的转化体及包括异源DNA的转化体的后代。转化事件也指通过转化体与另一个品种杂交获得的带有外源DNA和侧翼序列DNA的后代。转化事件也指将含有***基因和侧翼序列的原始转化体的DNA通过与含有这个***DNA的亲本和不含有这个***的亲本进行有性杂交导入到后代中，使后代得到该***基因。
“重组DNA分子”是指自然界不存在的DNA分子，在人类的干预下创造的DNA分子，是两个异源的DNA分子人工合成为一个多聚核苷酸序列。本发明将外源基因导入到大豆基因组中与***位点的大豆基因组结合，形成重组的DNA分子。
耐草甘膦大豆的培育最初是通过含有耐草甘膦转化事件SHZD32-01的转基因大豆植株的第一个亲本，或是与有耐草甘膦表型的上述植株杂交的后代，与第二个没有草甘膦的耐受性亲本进行有性杂交，产生多个杂交一代植株；用草甘膦处理的方法筛选耐草甘膦的后代植株。这一步骤进一步包括用耐草甘膦的后代植株与第二个或第三个大豆亲本进行回交，用草甘膦进行后代筛选，或使用与该性状相关的分子标记进行筛选获得耐草甘膦的大豆植株。所用的分子标记包括已经鉴定出的事件SHZD32-01的转基因***位点的5’和3’的结合区DNA分子。
育种方法包括可以用2个不同的转化植株进行杂交产生后代包括2个独立分离的外源转基因，与一个亲本进行回交，用之前所述方法与非转基因植株进行杂交，无性繁殖，以及在已知文献中叙述的用于不同性状和作物的常用育种方法。
探针是一种分离的核苷酸，附着在常规的检测标记或报告分子上，如放射性同位素，配体，化学荧光剂，或酶。探针与靶核苷酸的一条链互补，本发明的探针是与含转化事件SHZD32-01的基因组DNA的一条链互补，无论DNA来自含有该事件的大豆植株或种子，或样品，或植株或种子的提取物。
本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸，核糖核酸，还包括聚酰胺和其它与靶DNA序列特异结合的探针材料用于检测靶DNA序列的存在。
引物是分离的多聚核苷酸序列，退火后与互补的靶多聚核苷酸链进行杂交，在引物与靶多聚核苷酸链之间相互结合，而后在多聚酶的作用下沿着靶链进行延长。本发明的引物对用于聚合酶链式反应，或常规的核酸扩增方法进行靶多聚核酸分子的扩增使用。
探针或引物一般是11个或更多，18个或更多，24或30个或更多的多聚核苷酸，在严格的杂交条件控制下，探针和引物与靶核苷酸分子进行特异杂交。本发明的探针与引物与靶分子的序列完全一致，尽管探针不同于靶序列，用常规方法设计探针序列保持它与靶序列在严格条件下有杂交的能力。
探针和引物制备方法参照Sambrook等(1989)；Ausubel等(1992)；和Innis等(1990)，根据已知序列使用计算机程序进行引物设计(Version 0.5,.COPYRGT.1991,Whitehead Institute for Biomedical Research,Cambridge,Mass.)。
引物和探针是根据这里公布的侧翼序列和***基因序列而设计(SEQ ID NOS:1-4and 9)，用来确认和纠正常规方法公布的测序结果，例从含有转化事件SHZD32-01的种子分离相关的DNA分子，确定核酸分子的序列。另外关于从含有转基因***和侧翼序列的转化事件SHZD32-01的细胞基因组中分离相关的DNA，这些分子的部分和片段被用作引物或探针。
本发明的核酸探针和引物在严格的条件下与靶DNA序列杂交。任何常规的核酸杂交和扩增都能用于鉴定样品中转化事件SHZD32-01的特异DNA序列的存在。核酸分子或片段在一定的条件下能和其他的核酸分子特异地杂交。如果两个核酸分子能形成反向平行的，双链核苷酸结构，并具有足够的长度在高度严格的条件下保持这一结构，上述两个核酸分子就能特异的和另一个杂交。如果核酸分子显示出完全的互补，就称一个核酸与另一个核酸分子是互补的。当分子的每一个核苷酸与另一个分子都互补，就称这个分子的核苷酸与另一个分子完全互补。如果两个分子杂交足够稳定保持在至少常规低严格条件下退火，称之为微弱互补。同样地，如果分子之间能够在高度严格的条件下杂交足够的稳定保持到退火，就称为互补。Sambrook等(1989)和Haymes等(1985)对常规严格条件有所描述。不是完全互补也是允许的，这并不完全排除分子能够形成双链结构。要使核酸分子作为引物使用，需要有足够的互补序列，才能够在特殊的溶剂和盐的浓度条件下形成稳定的双链结构。
这里所使用的，基本同源序列是核酸序列是在高度严格条件下比较，能特异地与互补的核酸序列杂交。适当严格条件是改进DNA杂交条件，如6倍的氯化钠/柠檬酸钠(SSC)在45℃，随后用2倍的SSC在50℃洗涤，在John Wiley&Sons,N.Y.(1989)的分子生物学流程(Current Protocols in Molecular Biology)6.3.1-6.3.6.有所叙述。如在洗涤步骤中盐的浓度能从低严格条件的大约2.0倍SSC，50℃，到高严格条件的大约0.2倍SSC，50℃。另外，在洗涤步骤中的温度能从地严格条件的室温，大约22℃，到高严格条件的大约65℃。温度和盐浓度都可以变化，或者温度，或者盐浓度可以不变而另外一个条件改变。在一个优选实施例中，本发明中的一个核酸和前面给出的SEQ ID NOS:1-4,和9以及互补序列或任意片段的一个或多个核酸分子序列或片段在中度严格条件下杂交，2.0倍SSC，65℃。在一个特别优选实施例中，本发明的核酸分子与前面给出的SEQ ID NOS:1-4,和9及其互补序列或任意片段中的一个或多个核酸序列在高度严格条件下特异杂交。本发明的一个方面，本发明一个优选的核酸分子标记包含前面提出的核酸序列SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或者其互补序列或任意一个片段。本发明的另一个方面，本发明一个优选的核酸标记具有与前面提出的SEQID NO.1或SEQ ID NO.2或者其互补序列或两者中任意一个片段80％和100％，或者90％和100％的序列一致性。分子标记的DNA分子包含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或者其互补序列或两者任意一个片段用作植物育种的分子标记鉴定杂交的后代，与Cregan等(1997)所描述的简单序列重复DNA标记分析方法相同。探针和目标DNA的杂交能用已知的任何一种方法实现，这些包括，但不限定于荧光标记，放射性标记，抗体标记和化学发光标记。
关于用特异的扩增引物对靶核酸序列进行扩增(如PCR)，“严格反应条件”是指使引物对只与靶核酸序列杂交，一个引物可以与模板DNA结合，在热扩增反应中优先产生独特的扩增产物。
“(与靶序列)特异结合”是指引物和探针在严格杂交条件下只与含有靶序列样品中的靶序列杂交。
“扩增的DNA”或“扩增产物”是指靶序列核酸扩增的产物，是核酸模板的一部分。例如，确定来自有性杂交的大豆植株是否含有转化事件SHZD32-01，或者从田间取到的大豆样本是否含有转化事件SHZD32-01，或者大豆提取物，食品，面粉或油是否含有转化事件SHZD32-01。从大豆植株组织样品或提取物中提取DNA，用一对引物进行核酸扩增，第一个引物来自基因组序列邻近异源转基因DNA***位点，第二个引物来自于***的异源转基因DNA序列，经过扩增产生诊断该转化事件的扩增产物。扩增产物具有一定的长度和序列来诊断该转化事件。扩增产物的长度范围从这对引物结合的长度加上一个核苷酸对，或者加上大约50核苷酸碱基对，或者加上大约250个碱基对，或者加上大约350个碱基对，或者更多。
另外，引物可以来自于***序列两端的旁侧序列，产生的扩增片段包括整个***的核苷酸序列。引物的位置可以距离***基因DNA序列有一定的距离，距离为1个到2万个碱基对。“扩增产物”指在DNA热扩增反应下形成的产物。
核酸扩增反应可通过任何一种已知的核酸扩增反应方法完成，包括聚合酶链式反应(PCR)。各种扩增方法的技术已公布并在Innis等(1990)的美国专利号为4,683,195和4,683,202的专利中有所描述。PCR扩增方法已经能够扩增到22kb的基因组DNA和42kb的噬菌体DNA(Cheng等,1994)。这些方法以及其他已知的PCR扩增方法应用于本发明中。***的异源DNA序列或大豆转化事件SHZD32-01的侧翼序列可以通过利用这里给出的序列设计引物，通过分子扩增的方法从转化事件中分离出来，用标准的DNA测序方法验证和修正PCR产物或分离的克隆。
利用这里公布的核酸序列和描述或已知的DNA检测方法开发DNA检测试剂盒。试剂盒对于鉴定样品中的大豆转化事件并应用于含有该DNA的大豆育种是非常有价值的。检测该转化事件DNA使用的引物或探针，是与SEQ ID NO.1-4和9同源或互补的，或者DNA引物或探针与包含在转基因元件中的DNA同源或互补，这些DNA序列能够作为引物用于DNA扩增反应或作为探针用于DNA杂交方法。大豆基因组中转基因元件的DNA结构如图1所示：中豆32大豆基因组转基因***侧翼序列的5’端，接下来是终止子(没有T-DNA左边界序列),草甘膦抗性基因G10-EPSPS，拟南芥叶绿体信号肽序列,增强子，启动子，来自土壤农杆菌T-DNA的右臂的一部分,以及相邻的大豆中豆32基因组转基因***侧序列的3’端。大豆转化事件SHZD32-01中的转基因元件的DNA分子可以作为DNA扩增中的引物分子，这些引物分子能够用作引物系列的部分引物，也包括来自转基因***侧翼序列的DNA引物分子。大豆转化事件SHZD32-01是由大豆株系中豆32由农杆菌介导法产生的。
本发明具有如下的有益效果：
本发明通过农杆菌介导法将外源抗除草剂转基因***到大豆(Glycine max)基因组，创造了独特的DNA分子，并公布了该DNA分子的部分序列。本发明的大豆株系含有SHZD32-01转化事件,表现出很强的草甘膦耐受性，耐草甘膦大豆转化事件的发明将有助于对杂草的控制。转化事件DNA的检测对于鉴定样品中的大豆转化事件并应用于含有该DNA的大豆育种是非常有价值的。
附图说明
图1为大豆SHZD32中转基因在大豆基因组***示意图。
保藏生物材料的分类命名为：大豆属栽培大豆种大豆SHZD32-01 Glycine max(L)Merr.，保存在中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection,CCTCC),地址：中国武汉武汉大学，保藏日期：2015年8月18日，保藏编号为CCTCC NO:P201513。
具体实施方式
下面为本发明的实施例，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。在不背离本发明基本精神和观点的前提下，在公布的实施例中进行一些改动仍然能够得到相似或相同的结果。
实施例1
SHZD32-01基因组特异DNA扩增
从大豆转化事件SHZD32-01的组织中提取DNA，包括大豆种子、营养组织或食品。用生工的DNA提取试剂盒从组织中分离DNA，方法见该DNA提取试剂盒的说明书。或用CTAB法提取DNA。
从含有大豆转化事件SHZD32-01的植株基因组中扩增出的，包括T-DNA***5’末端的部分基因组侧翼序列的PCR扩增产物，该DNA产物包含SEQ ID NO.3。所设计的PCR引物一个与转基因***的5'末端基因组侧翼序列杂交(DNA引物A，SEQ ID NO.5；如FIG.1)，与之配对第二个引物(DNA引物B，SEQ ID NO.6)位于转基因终止子区域(见于SEQ ID NO.9)。
从含有大豆转化事件SHZD32-01的植株基因组扩增出的，包括T-DNA***3’末端的部分基因组侧翼序列的PCR扩增产物，该DNA产物包含SEQ ID NO.4。PCR所用的一个引物设计为与转基因***3’端的基因组侧翼序列杂交(DNA引物D,SEQ ID NO.8)，第二个引物(DNAprimer C,SEQ ID NO.7)位于启动子与载体的之间的序列。
事件引物DNA用于产生诊断SHZD32-01大豆转化事件的扩增产物。这些事件引物包括，但不限定于用于描述DNA扩增方法引物A和B(SEQ ID NO.5和6)，以及事件引物C和D(SEQID NO.7和8)。另外任何来自于SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4,或与其互补的这些事件引物，可以分别被用于DNA扩增反应产生诊断SHZD32-01事件来源的组织的包含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的扩增产物使用适合的事件引物能产生SHZD32-01的诊断扩增。改变任何反应条件产生诊断转化事件SHZD32-01的产物都在常规的技术方法范畴之内。当推断一种提取物含有包含SHZD32-01的大豆植株或种子的DNA，或产品来自含有SHZD32-01的植物时，可用之作为模板，用DNA扩增方法产生大豆转化事件SHZD32-01的诊断扩增来鉴定SHZD32-01是否存在。
使用来自SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4序列的至少一个引物序列产生转化事件SHZD32-01的诊断扩增，使用PCR仪(ABI,2720)按照如下步骤进行扩增反应：
DNA提取：
取新鲜的大豆植株叶片，置于液氮中研磨成粉状。加入2×CTAB提取缓液500μl，浸透大豆植株的粉末并将离心管颠倒混匀，使植物粉末与CTAB充分混匀，于65℃水浴保温30～60min，每10min轻轻混匀一次。取出离心管，冷却至室温，加入500μl经4℃预冷的氯仿-异戊醇混合液(24:lv/v)，轻缓颠倒混匀，静置10min。4℃、12000r/min离心10min。取上清至另一新离心管中，加等体积事先于-20℃冰箱预冷的异丙醇，稍混匀后于冰箱中沉淀30min以上。4℃，12000r/min离心10min后，弃上清后并将离心管倒置于滤纸上，70％的乙醇洗涤沉淀2次，并于无菌操作台上吹干水分。；将DNA溶解在50μl TE缓冲液中，加入1μl的RNaseA(10mg/ml)，37℃温育15min，-20℃保存；用Spectrophotometer ND-1000检测DNA浓度，每次上样量为1.5μl。琼脂糖电泳检测DNA浓度：配制0.8％琼脂糖电泳液，加适量EB。电泳条件U＝120V，I＝140mA。
需要配置试剂：
CTAB提取液：2％CTAB，1.4mol/L NaCl，100mmol/L Tris-HCl、pH8.0，20mmol/LEDTA、pH8.0。
CTAB沉淀液：1％CTAB，50mmol/LTris-HCl、pH8.0，10mmol/L EDTA、pH8.0。
TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl、1mmol/L EDTA(pH8.0)。
PCR检测：PCR反应条件：94℃变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，扩增片段为725bp。
循环结束后72℃延伸10min，然后4℃保存。取PCR扩增产物10μl，1.2％琼脂糖凝胶电泳检测(含溴化乙锭)，电泳40min，紫外灯下观察照相。
实施例2
转基因/基因组序列测定及Southern杂交
PCR产物的DNA序列可提供用来设计引物或探针的DNA分子，用于鉴定含有转化事件SHZD32-01的大豆植株或种子。代表转基因/侧翼序列5'和3'的预期片段大小的PCR产物通过2.0％的琼脂糖凝胶电泳被分离出来。被分离出来的PCR产物含有5'和3'端的横跨转基因***到基因组之间的***结合区域。大豆转化事件SHZD32-01的5'和3'端的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳被纯化，按照DNA胶回收试剂盒(SK8131)操作，将DNA序列与琼脂糖基质分离出来。将DNA片段与pMD18-T载体连接起来，送测序公司测序。
DNA序列测定得到的核酸序列代表事件SHZD32-01转基因/基因组区域的核苷酸测序，见图1。鉴定结果见SEQ ID NO.9。SEQ ID NO.9中包含的基因组和转基因元件描述，见下表1。5'和3'端的侧翼序列包括于SEQ ID NO.9中，并在SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22列出。
结合序列是相对较短的核苷酸分子，是新的核酸分子，当进行多核苷酸分子检测时能够作为转化事件SHZD32-01的诊断分子。在结合部位的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2代表SHZD32-01一个***位点中转基因片段和基因组DNA每一方面10多聚核苷酸。较长或较短的多核苷酸结合序列从SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4中选择出来，接合分子(5'结合区SEQID NO.1和3'结合区SEQ ID NO.2)在DNA检测方法中作为DNA探针或DNA引物分子是十分有用的。检测转化事件的引物和探针专门用于大豆转化事件SHZD32-01的检测。引物分子被指定为SEQ ID NO.10,SEQ ID NO.11,SEQ ID NO.14，SEQ ID NO.15,SEQ ID NO.16，SEQ IDNO.17，探针分子被指定为SEQ ID NO.12，SEQ ID NO.13,SEQ ID NO.10,SEQ ID NO.11。另外用于从大豆食品中产生扩增产物的片段还包括SEQ ID NO.18-20。
表1含有SHZH32-01大豆基因组转基因/基因组片段(SEQ ID NO.9)的基因组和遗传元件
Southern Blot分析
含有SHZD32-01的植物基因组DNA和对照大豆基因组DNA(每个大约15mug)被各种限制性酶消化(140U)在150ul的总体积包含15ul的buffer(NEB,Beverly,Mass.).限制性核酸内切酶,如,BamH Ⅰ，Pst Ⅰ，HindⅢ，和Xba Ⅰ用于SHZD32-01的Southern分析。核酸内切酶在适当的温度下消化至少6小时。孵育后，DNA用3M醋酸钠和2.5体积的乙醇沉淀。接下来DNA用70％的乙醇洗涤，干燥并重新悬浮在40mul的TBE中。在样品中加入Loading buffer(0.2倍)，然后在琼脂糖凝胶(0.8％)上30瓦电泳16-18小时。凝胶被溴化乙锭染色，用去嘌呤溶液处理(0.125N HCL)10分钟，用变性溶液处理，(0.5M氢氧化钠,1.5M氯化钠)30分钟，最后用中和溶液(0.5M Trizma base,1.5M氯化钠)处理30分钟。DNA被转到杂交-N膜上(Amersham Pharmacia Biotech,Buckingamshire,England)用吸水纸(Schleicher andSchuell,Dassel,Germany)吸4-6小时然后用紫外光照固定到膜上。
膜用20ml的DIG Easy Hyb溶液预杂交在45℃下2-4hours。带有标记的DNA探针与SEQ ID NO.1,或SEQ ID NO.2,或SEQ ID NO.3,或SEQ ID NO.4,或其他序列的一部分同源或互补，没有结合的核酸被去掉。用10ml预热的DIG Easy Hyb，含有变性探针的溶液代替预杂交液。印记在45℃杂交16-18小时。
印记在低严格溶液(5.times.SSC,0.1.times.SDS)在45℃下被洗掉，再次重复用较高的严格溶液在65℃下重复洗涤(0.1.times.SSC,0.1％SDS)。印记曝光。这些例证了的方法和条件在检测样品中DNA的时可以适当改变。
实施例3
杂草控制
用含有SHZD32-01的大豆在田间控制杂草的生长。田间种植含有SHZD32-01的大豆种子，种子萌发成为植株，用配方含有草甘膦的除草剂处理田间的植株。草甘膦配方的有效剂量以大约0.25lb ae/A(草甘膦酸平衡的含量，磅/垧)到3或更高的剂量用于田间。应用范围从约0.75lb ae/A到1.5lb ae/A在生育季根据需要在田间处理一次或多次控制杂草的生长。从草甘膦处理的植株上收获含有SHZD32-01的种子。
上述公开并在权利要求书中引证的上海交通大学保藏的代表SHZD32-01的大豆种子保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC),中国湖北省武汉市武汉大学校内，邮政编码430072，该保藏生物材料的分类命名为：大豆属栽培大豆种大豆SHZD32-01Glycine max(L)Merr.，保藏编号为CCTCC NO:P201513，保藏日期为2015年8月18日，保存期为三十年(自保藏中心收到之日起计算)，期满前收到提供培养物样品的请求后再延续保存五年。
以上所述本发明的原理，技术熟练人员能够显而易见地在不偏离这些原则的前提下在程序安排和细节上加以改变。我们的权利要求包括在不偏离本发明权利要求的范围和精神的所有改变。

Claims (7)

1.一种产生耐草甘膦除草剂大豆的方法，其特征在于，包含将大豆转化事件SHZD32-01引入大豆基因组；上述转化事件有代表性的种子保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:P201513；所述耐草甘膦大豆，其特征在于，包含大豆转化事件SHZD32-01，含有蛋白G10-EPSPS，能够产生大豆转化事件SHZD32-01的诊断扩增，诊断扩增包含SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包含下列步骤：(a)用第一种包含所述大豆转化事件SHZD32-01的大豆植株与第二种不含有所述大豆转化事件SHZD32-01的大豆植株进行杂交产生后代植株；和(b)筛选至少一个第一种含有所述大豆转化事件SHZD32-01并耐草甘膦的后代植株。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，进一步包含，通过所述第一种含有所述大豆转化事件SHZD32-01并耐草甘膦的后代植株自交，产生第二代后代植株，并选择至少一个含有所述大豆转化事件SHZD32-01的植株的纯合体。
4.一种产生大豆商品产品的方法，其特征在于，包括：(a)获得含有大豆转化事件SHZD32-01的大豆植株或部分；和(b)从所述含有大豆转化事件SHZD32-01大豆植株或其部分生产所述大豆商品产品。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的大豆植株或部分被定义为大豆植株、种子、细胞、花粉、胚珠、花、芽、根或叶片，包含所述转化事件SHZD32-01，能够产生所述大豆转化事件SHZD32-01的诊断扩增；所述的商品产品包括食品、非食品大豆粉末、非食品大豆碎屑、非食品分离蛋白或非食品油，包含所述转化事件SHZD32-01，能够产生所述大豆转化事件SHZD32-01的诊断扩增；所述的大豆植株，其特征在于，进一步定义为包含所述大豆转化事件SHZD32-01的大豆植株的任何世代的后代植株，该后代植株包含所述大豆转化事件SHZD32-01，能够产生所述大豆转化事件SHZD32-01的诊断扩增；所述种子，其特征在于，该种子包含所述大豆转化事件SHZD32-01，能够产生所述大豆转化事件SHZD32-01的诊断扩增；由权利要求4所述的种子生产的大豆商品产品，其特征在于，所述商品产品包含所述大豆转化事件SHZD32-01，能够产生所述大豆转化事件SHZD32-01的诊断扩增；所述大豆转化事件SHZD32-01的诊断扩增，是当使用DNA扩增方法进行检测时，上述诊断扩增包含SEQID NO:1或SEQ ID NO:2。
6.一种在田间控制杂草的大豆种植方法，其特征在于，使用包含大豆转化事件SHZD32-01的大豆植株，所述方法包括在田间使用一定剂量的草甘膦以有效地控制杂草的生长，所述大豆表现出耐草甘膦特性。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在大豆生长阶段从V1到R4期进行田间处理。
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