BR112015002981B1

BR112015002981B1 - Vacina estável em meio líquido, uso de vírus canino ou felino atenuado vivo, e, método para fabricar a vacina estável em meio líquido

Info

Publication number: BR112015002981B1
Application number: BR112015002981-7A
Authority: BR
Inventors: Kevin O'Connell; Zhisong Qiao
Original assignee: Intervet International B.V
Priority date: 2012-08-21
Filing date: 2013-08-16
Publication date: 2023-03-14
Also published as: RU2015109724A; MX2015002316A; JP6259457B2; BR112015002981A2; CA3178388A1; EP2887957B1; NZ704584A; CN104640566B; AU2013305082A1; RU2641970C2; MX360431B; EP2887957A1; CN104640566A; US20150246114A1; US9526780B2; US20140056942A1; JP2015526450A; CA2879733C; CA2879733A1; US9314519B2

Abstract

VACINA ESTÁVEL EM MEIO LÍQUIDO, E, MÉTODOS PARA VACINAÇÃO DE UM CANINO, E PARA FABRICAR A VACINA ESTÁVEL EM MEIO LÍQUIDO. A presente invenção descreve vacinas estáveis em meio líquido que compreendem um vírus vivo atenuado, 10 a 30% de aditivo de açúcar e um aminoácido. A presente invenção também descreve a produção dessas vacinas e métodos para proteger um animal pela administração de tais vacinas.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica prioridade sob o 35 U.S.C. § 119(e) dos pedidos provisórios Norte-Americanos Nos. de Série 61/691.507, depositado em 21 de agosto de 2012; e 61/777.164, depositado em 12 de março de 2013, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência em suas totalidades.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção refere-se às vacinas estáveis em meio líquido que compreendem um vírus vivo atenuado. A invenção refere-se também à fabricação de tais vacinas e métodos de indivíduos animais.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] Há um número significativo de vírus que podem infectar cães e/ou gatos. Embora os sintomas devido às infecções por vírus correspondentes por exemplo, podem incluir sintomas tipo resfriado brando, outros podem ser rapidamente fatais, como no caso do vírus da cinomose (CDV) [consulte, por exemplo, US2010/0196420]. De fato, o CDV desencadeia uma infecção multissistêmica que pode envolver os sistemas ocular, respiratório, gastrintestinal, do tegumento e nervoso. A taxa de mortalidade relacionada ao parvovírus canino (CPV) também é relativamente elevada [consulte, por exemplo, US2009/0010955]. O CPV é, primariamente, um patógeno entérico que infecta cães, especialmente cães jovens, e é caracterizado por diarreia aguda, febre e leucopenia em cães e filhotes com mais de 4 a 5 semanas de idade. Até mesmo os filhotes mais jovens podem sofrer de doença do miocárdio. O vírus da cinomose e o parvovírus canino são os dois mais importantes vírus caninos para os quais deve-se proteger os cães/filhotes.

[004] Outros vírus caninos incluem: o vírus parainfluenza canino (CPI), que é um vírus altamente contagioso que provoca doenças respiratórias que contribuem para a contração de doenças respiratórias superiores e traqueobronquite infecciosa; adenovirus canino tipo 1 (CAV1), que induz a hepatite infecciosa; e o vírus influenza canino (CIV), que é altamente contagioso e pode causar um tipo grave de doença respiratória. CIV foi relatado como sendo capaz de causar 100% de infecção com 80% de morbidade, e até 5 a 8% de mortalidade em infecções graves [Crawford et al., Science 310(5747):482-485 (2005); U.S. 7.959.929 B2]. Da mesma forma, há vários vírus felinos que afligem os gatos, incluindo o calicivírus felino (FCV), o vírus da leucemia felina (FeLV), o vírus da panleucopenia felina (FPLV), o coronavirus felino (FCoV) e o vírus da rinotraqueíte felina (FVR).

[005] Atualmente, é amplamente aceito que a melhor maneira de prevenir a doença devido a infecções causadas por vírus caninos ou felinos é vaciná-los contra estes vírus. De fato, as vacinas contra o vírus da cinomose reduziram significativamente a prevalência da doença correspondente. Da mesma forma, a hepatite canina infecciosa tem sido extremamente limitada pelas vacinas contra o adenovírus-2 canino (CAV2). O uso de CAV2 atenuado vivo em vacinas, ao invés do CAV1 intimamente relacionado, elimina as preocupações sobre a nefrite intersticial e a opacidade da cómea observada em cães que foram inoculados com o CAV1 atenuado vivo [Taguchi etal., Can Vet J 52(9): 983-986 (2011)].

[006] Além disso, as contra vírus vivo atenuado polivalentes podem ser administradas com segurança, que limitam o número de injeções de vacina necessárias. Da mesma forma, há várias vacinas de vírus vivo atenuado polivalentes comercialmente disponíveis que protegem contra a cinomose, hepatite infecciosa canina, parvovirus canino e o vírus parainfluenza canino. Além disso, novas vacinas polivalentes adicionalmente protegem contra o vírus influenza canino, da mesma forma.

[007] Até então, os vírus caninos e felinos atenuados eram instáveis quando armazenados em soluções líquidas. Portanto, a maioria das vacinas de vírus canino ou felino vivo atenuado são liofilizadas, ou seja, secas por congelamento, antes de serem armazenadas em longo prazo. O vírus canino ou felino atenuado vivo é comumente misturado como uma suspensão em água com um agente protetor, congelado e, em seguida, desidratado por sublimação e secagem secundária, durante o processo de liofilização. As baixas temperaturas do congelamento e da secagem por sublimação, juntamente com as baixas razões de superfície em relação ao volume envolvidas, podem requerer períodos de secagem mais longos e, dessa forma, custos e tempo de fabricação signifícativamente maiores.

[008] Além disso, há inconsistências inerentes em grandes processos de secagem comerciais devido à incapacidade de ajustar a temperatura de prateleira em toda a carga de produto, taxas de congelamento variáveis ao longo da secagem, efeitos de borda e efeitos de energia radiante. O aumento da temperatura de secagem para reduzir os tempos de secagem muitas vezes não é uma opção, uma vez que a temperatura de secagem deve permanecer signifícativamente abaixo da temperatura de transição vítrea da matriz de proteína protetora. Além disso, longos tempos de secagem inconsistentes e/ou altas temperaturas de secagem muitas vezes levam a danos estruturais ao vírus vivo atenuado, juntamente com uma perda significativa de suas atividades biológicas.

[009] Por conseguinte, para responder pela perda inerente de eficácia, as vacinas caninas e/ou felinas liofilizadas que compreendem os vírus vivos atenuados são armazenadas com títulos mais elevados. No entanto, tais títulos aumentados podem levar a eventos adversos significativos, caso o processo de liofilização efetivamente leve a uma perda de atividade menor do que a prevista. Portanto, muito cuidado é necessário para formular uma vacina para conter um título virai que não está com segurança abaixo da quantidade que leva a eventos adversos, mas que também mantém eficácia suficiente tendo em vista a perda de título virai devido à liofílização e posterior armazenamento. Portanto, há uma necessidade de novas vacinas de vírus canina e/ou felino atenuadas que possam confiavelmente reter os seus títulos virais a um nível seguro e eficaz.

[0010] A citação de qualquer referência neste documento não deve ser interpretada como uma admissão de que tal referência está disponível como "técnica anterior" para o presente pedido.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0011] A fim de superar as deficiências das atuais vacinas, a presente invenção fornece novas vacinas de vírus vivo atenuado estáveis em líquidos, bem como as suas correspondentes composições imunogênicas. Em certas modalidades, o vírus vivo atenuado é um vírus canino vivo atenuado. Em outras modalidades, o vírus vivo atenuado é um vírus felino vivo atenuado. A presente invenção fornece também métodos de administração de tais vacinas para um animal. A presente invenção fornece ainda métodos de prevenção de uma doença em um animal através da administração de uma vacina da presente invenção. Em modalidades particulares, o animal é um canino. Em outras modalidades, o animal é um felino.

[0012] Dessa forma, a presente invenção fornece vacinas estáveis em meio líquido que compreendem um vírus vivo atenuado. Em certas modalidades, o vírus vivo atenuado é um vírus recombinante. Em modalidades particulares desse tipo, o vírus recombinante é utilizado como um vetor recombinante que codifica uma proteína heterogênea. Em modalidades mais particulares desse tipo, a proteína heterogênea é um antígeno virai ou bacteriano.

[0013] Em modalidades particulares, a vacina compreende um aditivo de açúcar e um aminoácido. Em certas modalidades desse tipo, a vacina compreende de 10 a 30% de aditivo de açúcar. Em modalidades particulares, a vacina compreende de 12 a 27% de aditivo de açúcar. Em certas modalidades, a vacina compreende de 15 a 25% de aditivo de açúcar. Em modalidades relacionadas, a vacina compreende de 15 a 20% de aditivo de açúcar. Em outras modalidades, a vacina compreende de 20 a 25% de aditivo de açúcar. Em modalidades mais particulares, a vacina compreende de 16 a 18% de aditivo de açúcar. Em modalidades ainda mais particulares, a vacina compreende 17% de aditivo de açúcar.

[0014] Em modalidades particulares das vacinas de vírus estáveis em líquido da presente invenção, o aditivo de açúcar é sacarose. Em outras modalidades, o aditivo de açúcar é sorbitol. Em ainda outras modalidades, o aditivo de açúcar é manitol. Em ainda outras modalidades, o aditivo de açúcar é trealose. Em ainda outras modalidades, o aditivo de açúcar é dextrose. Em modalidades particulares, o aditivo de açúcar é, na verdade, uma combinação de dois ou mais aditivos de açúcar. Em uma modalidade particular desse tipo, o aditivo de açúcar é uma combinação de sacarose e sorbitol. Em uma modalidade mais particular desse tipo, o aditivo de açúcar é uma combinação de 15% de sacarose e 10% de sorbitol.

[0015] As vacinas estáveis em meio líquido da presente invenção podem ter um pH de 6,0 a 8,0. Em certas modalidades, a faixa de pH varia de 6,5 a 7,8. Em modalidades particulares, a faixa de pH varia de 6,8 a 7,5. Em modalidades mais particulares, a faixa de pH varia de 7,0 a 7,4. Em uma modalidade ainda mais particular, o pH é 7,2.

[0016] As vacinas estáveis em meio líquido da presente invenção podem compreender um tampão. Em uma modalidade particular desse tipo, o tampão compreende 2,5 a 50 mM de Tris. Em uma modalidade relacionada, o tampão compreende 5 a 25 mM de Tris. Em modalidades particulares, o tampão compreende 10 a 20 mM de Tris. Em ainda outras modalidades, o tampão pode compreender 2,5 a 50 mM de histidina. Em modalidades particulares, o tampão compreende 2,5 a 50 mM de Tris e 2,5 a 50 mM de histidina. Em modalidades mais particulares, o tampão compreende 5 a 25 mM de Tris e 5 a 25 mM de histidina. Em modalidades ainda mais particulares, o tampão compreende 10 a 20 mM de Tris e 10 a 20 mM de histidina. Em outras modalidades, o tampão compreende 2,5 a 50 mM de fosfato. Em uma modalidade relacionada, o tampão compreende 5 a 25 mM de fosfato. Em modalidades particulares, o tampão compreende 10 a 20 mM de fosfato.

[0017] As vacinas estáveis em meio líquido da presente invenção compreendem um aminoácido. Em certas modalidades, o aminoácido é arginina. Em outras modalidades, o aminoácido é metionina. Em ainda outras modalidades, o aminoácido é glicina. Em ainda outras modalidades, o aminoácido é ácido glutâmico. Em modalidades relacionadas, as vacinas estáveis em meio líquido compreendem tanto arginina quanto metionina. Em outras modalidades, as vacinas estáveis em meio líquido compreendem tanto arginina quanto glicina. Em ainda outras modalidades, as vacinas estáveis em meio líquido compreendem tanto glicina quanto metionina. Em modalidades relacionadas, as vacinas estáveis em meio líquido compreendem tanto ácido glutâmico quanto metionina. Em outras modalidades, as vacinas estáveis em meio líquido compreendem tanto ácido glutâmico quanto glicina. Em ainda outras modalidades, as vacinas estáveis em meio líquido compreendem tanto ácido glutâmico quanto arginina. Em modalidades relacionadas, as vacinas estáveis em meio líquido compreendem arginina, ácido glutâmico e metionina. Em outras modalidades, as vacinas estáveis em meio líquido compreendem arginina, ácido glutâmico e glicina. Em outras modalidades, as vacinas estáveis em meio líquido compreendem arginina, ácido glutâmico e metionina. Em ainda outras modalidades, as vacinas estáveis em meio líquido compreendem arginina, glicina e metionina. Em ainda outras modalidades, as vacinas estáveis em meio líquido compreendem arginina, glicina e metionina. Em modalidades particulares, as vacinas estáveis em meio líquido compreendem arginina, glicina, metionina e ácido glutâmico.

[0018] Em modalidades particulares, a concentração final de arginina, ácido glutâmico ou glicina na vacina estável em meio líquido varia de 0,15 a 0,6 M. Em modalidades relacionadas, a concentração final de arginina, ácido glutâmico ou glicina na vacina estável em meio líquido varia de 0,2 a 0,5 M. Em modalidades mais particulares, a concentração final de arginina, ácido glutâmico ou glicina na vacina estável em meio líquido varia de 0,25 a 0,35 M. Em modalidades ainda mais particulares, a concentração final de arginina, ácido glutâmico ou glicina na vacina estável em meio líquido é igual a 0,3 M.

[0019] Em modalidades particulares, a concentração combinada final de arginina e/ou ácido glutâmico e/ou glicina na vacina estável em meio líquido varia de 0,15 a 0,6 M. Em modalidades relacionadas, a concentração combinada final de arginina e/ou ácido glutâmico e/ou glicina na vacina estável em meio líquido varia de 0,2 a 0,5 M. Em modalidades mais particulares, a concentração combinada final de arginina e/ou ácido glutâmico e/ou glicina na vacina estável em meio líquido varia de 0,25 a 0,35 M. Em modalidades ainda mais particulares, a concentração combinada final de arginina e/ou ácido glutâmico e/ou glicina na vacina estável em meio líquido é igual a 0,3 M.

[0020] Em modalidades particulares, a concentração final de metionina na vacina estável em meio líquido varia de 0,025 a 0,3 M. Em modalidades relacionadas, a concentração final de metionina na vacina estável em meio líquido varia de 0,04 a 0,15 M. Em modalidades mais particulares, a concentração final de metionina na vacina estável em meio líquido varia de 0,06 a 0,09 M. Em modalidades ainda mais particulares, a concentração final de metionina na vacina estável em meio líquido é igual a 0,07 M.

[0021] As vacinas estáveis em meio líquido da presente invenção também podem compreender uma proteína estabilizadora. A proteína estabilizadora pode ser uma proteína intacta e/ou um hidrolisado de proteína, Em modalidades particulares, a proteína estabilizadora é gelatina. Em modalidades mais particulares, a proteína estabilizadora contida na vacina estável em meio líquido da presente invenção varia de 0,4 a 1,6%. Em modalidades alternativas, a proteína estabilizadora é um hidrolisado da caseína inteira. Em modalidades particulares desse tipo, a proteína estabilizadora contida na vacina estável em meio líquido da presente invenção varia de 0,5 a 2,0% de um hidrolisado de caseína inteira. Em certas modalidades, o hidrolisado de caseína inteira é um hidrolisado proteolítico da caseína inteira.

[0022] Além disso, as vacinas estáveis em meio líquido da presente invenção também podem compreender um álcool. Em modalidades particulares desse tipo, o álcool é o etanol. Em modalidades mais particulares, a vacina estável em meio líquido compreende de 0,25 a 1,0% de etanol. Em modalidades relacionadas, as vacinas estáveis em meio líquido da presente invenção também podem compreender sulfato de dextrana. Em modalidades particulares, a vacina estável em meio líquido compreende de 1 a 20 mM de sulfato de dextrana. Em modalidades mais particulares, a vacina estável em meio líquido compreende de 0,25 a 10 mM de sulfato de dextrana. Em modalidades ainda mais particulares, a vacina estável em meio líquido compreende 5 mM de sulfato de dextrana.

[0023] Além disso, as vacinas estáveis em meio líquido da presente invenção também podem compreender um agente quelante. Tais agentes quelantes podem incluir, mas não se limitam, ao: ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), ácido l,2-bis(o-aminofenóxi)etano- N,N,N',N'-tetracético (BAPTA), ácido etilenoglicoltetracético (EGTA), ácido dimercaptossuccínico (DMSA), ácido dietilenotriaminopentacético (DTPA) e ácido 2,3-dimercapto-l-propanossulfônico (DMPS). A concentração de tais agentes quelantes nas vacinas líquidas da presente invenção pode variar de cerca de 50 μM a 10 mM.

[0024] Em certas modalidades, o agente quelante é EDTA. Em modalidades particulares, a vacina estável em meio líquido compreende de 50 μM a 10 mM de EDTA. Em certas modalidades desse tipo, a vacina estável em meio líquido compreende de 50 a 200 μM de EDTA. Em outras modalidades, a vacina estável em meio líquido compreende de 250 μM a 7,5 mM de EDTA. Em ainda outras modalidades, a vacina estável em meio líquido compreende de 0,5 mM a 5,0 mM de EDTA. Em ainda outras modalidades, a vacina estável em meio líquido compreende de 1,0 mM a 3,0 mM de EDTA. Em modalidades mais particulares, a vacina estável em meio líquido compreende cerca de 2 mM de EDTA.

[0025] As vacinas estáveis em meio líquido da presente invenção podem compreender adicionalmente um adjuvante. Em modalidades particulares deste tipo, o adjuvante é fosfato de alumínio. Em outras tais modalidades, o adjuvante é o hidróxido de alumínio. Em ainda outras modalidades, o adjuvante é um adjuvante de copolímero de baixo peso molecular que pode formar reticulações em solução para se tomar um gel de alto peso molecular. Em ainda outras modalidades, o adjuvante é composto por partículas de gel de acrilato de sódio em água. Em ainda outras modalidades, o adjuvante é uma combinação de dois ou mais tais adjuvantes.

[0026] Em certas modalidades, as vacinas estáveis em meio líquido da presente invenção podem ainda compreender um sequestrador de radicais livres e/ou um antioxidante. Em modalidades relacionadas, as vacinas estáveis em meio líquido da presente invenção são mantidas em recipientes vedados, que têm um gás inerte como argônio, nitrogênio ou hélio acima do líquido (por exemplo, que foram novamente preenchidos com o gás inerte).

[0027] As vacinas estáveis em meio líquido da presente invenção podem compreender um vírus canino vivo atenuado. Em certas modalidades, o vírus canino vivo atenuado é o vírus da cinomose. Em outras modalidades, o vírus canino vivo atenuado é o adenovirus canino tipo 2. Em ainda outras modalidades, o vírus canino vivo atenuado é o parvovirus canino (CPV). Em uma modalidade particular desse tipo, o parvovirus canino é um parvovirus canino tipo 2 (CPV-2). Em ainda outra modalidade particular desse tipo, o parvovirus canino é um parvovirus canino tipo 2a (CPV-2a). Em ainda outra modalidade particular desse tipo, o parvovirus canino é um parvovirus canino tipo 2b (CPV-2b). Em ainda outra modalidade particular desse tipo, o parvovirus canino é um parvovirus canino tipo 2c (CPV-2c). Em uma modalidade específica deste tipo, o CPV-2c é o No. de acesso ATCC No. PTA- 13492. Em ainda outra modalidade, o parvovirus canino é um parvovirus canino recombinante que foi construído para compreender um genoma CPV-2c/CPV-2 heterogêneo, ou seja, a região que codifica as proteínas do capsídeo é de um isolado de CPV-2c e a região de codificação as proteínas não estruturais é de um isolado de CPV-2.

[0028] Em ainda outras modalidades, o vírus canino vivo atenuado é o vírus parainfluenza canino.

[0029] Em modalidades particulares, p vírus parainfluenza canino é um vetor recombinante. Em modalidades mais particulares, o vírus parainfluenza canino recombinante codifica e expressa uma proteína heterogênea. Em certas modalidades desse tipo, a proteína heterogênea é um antígeno não canino. Em modalidades mais particulares, o antígeno é um antígeno virai ou bacteriano de aves domésticas. Em certas modalidades, o vírus parainfluenza canino recombinante é um vírus parainfluenza 5 recombinante.

[0030] Em ainda outras modalidades, o vírus canino vivo atenuado é o coronavirus canino. Em ainda outras modalidades, o vírus canino vivo atenuado é o pneumovírus canino. Em ainda outras modalidades, o vírus canino vivo atenuado é o vírus da hepatite canina infecciosa. Em ainda outras modalidades, o vírus canino vivo atenuado é o vírus da herpes canina. Em ainda outras modalidades, o vírus canino vivo atenuado é o vírus da raiva. Em ainda outras modalidades, o vírus canino vivo atenuado é o vírus minuto canino. Em ainda outras modalidades, o vírus canino vivo atenuado é o vírus influenza canino. Em modalidades alternativas, o vírus vivo atenuado é um vírus da pseudorraiva.

[0031] As vacinas estáveis em meio líquido da presente invenção podem compreender um vírus felino vivo atenuado. Em certas modalidades, o vírus felino vivo atenuado é o vírus da herpes felina (FHV). Em outras modalidades, o vírus felino vivo atenuado é o calicivírus felino (FCV). Em ainda outras modalidades, o vírus felino vivo atenuado é o pneumovírus felino (FPN). Em ainda outras modalidades, o vírus felino vivo atenuado é o parvovirus felino (FPV). Em ainda outras modalidades, o vírus felino vivo atenuado é o vírus da leucemia felina (FeLV). Em ainda outras modalidades, o vírus felino vivo atenuado é o vírus da peritonite infecciosa felina (FIPV). Em ainda outras modalidades, o vírus felino vivo atenuado é o vírus da imunodeficiência felina (FeLV). Em ainda outras modalidades, o vírus felino vivo atenuado é o vírus da doença de boma (BDV). Em ainda outras modalidades, o vírus felino vivo atenuado é o vírus influenza felino. Em ainda outras modalidades, o vírus felino vivo atenuado é o vírus da panleucopenia felina (FPLV). Em ainda outras modalidades, o vírus felino vivo atenuado é o coronavirus felino (FCoV). Em ainda outras modalidades, o vírus felino vivo atenuado é o vírus da rinotraqueíte felina (FVR).

[0032] Além disso, a presente invenção fornece vacinas estáveis em meio líquido que são vacinas polivalentes. Em modalidades particulares, as vacinas polivalentes da presente invenção compreendem apenas vacinas de vírus vivo atenuado. Tais vacinas polivalentes podem conter qualquer combinação de vírus vivos atenuados. Em modalidades particulares desse tipo, a vacina polivalente compreende um vírus da cinomose atenuado e um parvovirus canino vivo atenuado. Em modalidades relacionadas, a vacina polivalente compreende um vírus da cinomose vivo atenuado e um adenovirus canino tipo 2 vivo atenuado. Em outras modalidades, a vacina polivalente compreende um vírus da cinomose vivo atenuado e um vírus parainfluenza canino vivo atenuado. Em ainda outras modalidades, a vacina polivalente compreende um vírus da cinomose vivo atenuado, um parvovirus canino vivo atenuado e um vírus parainfluenza canino vivo atenuado. Em ainda outras modalidades, a vacina polivalente compreende um vírus da cinomose vivo atenuado, um parvovirus canino vivo atenuado e um adenovirus canino tipo 2 vivo atenuado.

[0033] Em ainda outras modalidades, a vacina polivalente compreende um vírus da cinomose vivo atenuado, um vírus parainfluenza canino vivo atenuado e um adenovirus canino tipo 2 vivo atenuado. Em ainda outras modalidades, a vacina polivalente compreende um vírus da cinomose vivo atenuado, um parvovirus canino vivo atenuado, um vírus parainfluenza canino vivo atenuado e um adenovirus canino tipo 2 vivo atenuado. Em modalidades particulares, a vacina polivalente compreende um vírus da cinomose vivo atenuado, um parvovirus canino vivo atenuado, um vírus parainfluenza canino vivo atenuado, um adenovirus canino tipo 2 vivo atenuado e um coronavirus canino vivo atenuado. Em modalidades relacionadas, a vacina polivalente compreende um vírus da cinomose vivo atenuado, um parvovirus canino vivo atenuado, um vírus parainfluenza canino vivo atenuado, um adenovirus canino tipo 2 vivo atenuado e um coronavirus felino vivo atenuado. Em modalidades particulares desse tipo, a vacina polivalente compreende um vírus da cinomose vivo atenuado, um adenovirus canino tipo 2 vivo atenuado, um parvovirus canino vivo atenuado, um vírus parainfluenza canino vivo atenuado e um vírus influenza canino vivo atenuado.

[0034] Em outras modalidades, a presente invenção fornece vacinas estáveis em meio líquido que são vacinas polivalentes que compreendem um adenovirus canino tipo 2 vivo atenuado e um vírus parainfluenza canino vivo atenuado. Em ainda outras modalidades, a vacina polivalente compreende um adenovirus canino tipo 2 vivo atenuado e um parvovirus canino vivo atenuado. Em ainda outras modalidades, a vacina polivalente compreende um parvovirus canino vivo atenuado e um vírus parainfluenza canino vivo atenuado. Em ainda outras modalidades, a vacina polivalente compreende um adenovirus canino tipo 2 vivo atenuado, um parvovirus canino vivo atenuado e um vírus parainfluenza canino vivo atenuado. Em modalidades particulares desse tipo, a vacina polivalente compreende um adenovirus canino tipo 2 vivo atenuado, um parvovirus canino vivo atenuado, um vírus da cinomose vivo atenuado, um adenovirus canino tipo 2 vivo atenuado, um parvovirus vírus parainfluenza canino vivo atenuado e um vírus influenza canino vivo atenuado.

[0035] Altemativamente, as vacinas estáveis em meio líquido da presente invenção podem compreender adicionalmente um vírus exterminado e/ou uma bactéria exterminada (por exemplo, uma bacterina) e/ou uma subfração de uma bacterina. Dessa forma, qualquer uma das vacinas estáveis em meio líquido da presente invenção que compreendem uma ou mais vacinas de vírus vivo atenuado pode compreender adicionalmente um vírus exterminado e/ou uma bactéria exterminada, e/ou uma subfração de uma bacterina. Em modalidades particulares, o vírus exterminado é um vírus influenza canino. Em outras modalidades, o vírus exterminado é um pneumovírus canino. Em ainda outras modalidades, o vírus exterminado é um coronavirus canino. Em ainda outras modalidades, a vacina estável em meio líquido da presente invenção pode compreender dois ou mais desses vírus caninos exterminados.

[0036] Em certas modalidades, a bactéria exterminada é uma Bordetella bronchiseptica. Em ainda outras modalidades, a bactéria exterminada é uma espécie Mycoplasma. Em ainda outras modalidades, a bactéria exterminada é uma Ehrlichia canis. Em ainda outras modalidades, a bactéria exterminada é uma espécie Anaplasma. Em ainda outras modalidades, a bactéria exterminada é uma Leptospira. Em uma tal modalidade, a Leptospira é Leptospira canicola. Em outra modalidade, a Leptospira é Leptospira grippotyphosa. Em ainda outra modalidade, a Leptospira é Leptospira hardjo. Em ainda outra modalidade, a Leptospira é Leptospira icterohaemorrhagiae. Em ainda outra modalidade, a Leptospira é Leptospira pomona. Em ainda outra modalidade, a Leptospira é Leptospira interrogans. Em ainda outra modalidade, a Leptospira é Leptospira autmnalis. Em ainda outra modalidade, a Leptospira é Leptospira bratislava. Em ainda outras modalidades, a vacina estável em meio líquido da presente invenção pode compreender dois ou mais desses tipos de bactérias. Em uma modalidade particular, a vacina estável em meio líquido compreende Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira Pomona e Leptospira icterohaemorrhagia.

[0037] A presente invenção fornece adicionalmente métodos para ajudar na proteção de um felino ou canino contra uma doença clínica que é derivada de uma infecção de vírus canino ou felino, compreendendo administrar uma vacina da presente invenção ao animal. Em certas modalidades, a administração é realizada pela mucosa. Em outras modalidades, a administração é realizada por via parenteral. Em ainda outras modalidades, a administração é realizada por via intradérmica. Em ainda outras modalidades, a administração é realizada transdermicamente. Em modalidades mais específicas, uma vacina da presente invenção é administrada ao animal por via subcutânea. Em outras modalidades específicas, uma vacina da presente invenção é administrada ao animal por via intramuscular. A presente invenção também inclui o uso de vacinas primárias e/ou de reforço.

[0038] Em modalidades particulares, o indivíduo animal é um canino, e o método compreende a administração ao canino de uma vacina estável em meio líquido da presente invenção que compreende um vírus vivo atenuado. Em modalidades específicas, a vacina estável em meio líquido compreende um vírus da cinomose vivo atenuado, um adenovirus canino tipo 2 vivo atenuado, um parvovirus canino vivo atenuado e um vírus parainfluenza canino vivo atenuado. Em certas modalidades desse tipo, a vacina estável em meio líquido compreende um vírus da cinomose vivo atenuado, um adenovirus canino tipo 2 vivo atenuado, um parvovirus canino vivo atenuado, um vírus parainfluenza canino vivo atenuado e um vírus influenza canino vivo atenuado. Em outras modalidades desse tipo, a vacina estável em meio líquido compreende um vírus da cinomose vivo atenuado, um adenovirus canino tipo 2 vivo atenuado, um parvovirus canino vivo atenuado, um vírus parainfluenza canino vivo atenuado e um vírus influenza canino exterminado atenuado.

[0039] Métodos de fazer toda e qualquer uma das vacinas estáveis em meio líquido da presente invenção também são fornecidos. Em certas modalidades, o método compreende combinar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vírus vivo atenuado com um aditivo de açúcar de 10 a 30%, um aminoácido e uma solução tamponada em pH de 6,0 a 8,0, para formar uma vacina estável em meio líquido. O aminoácido pode ser arginina, glicina, ácido glutâmico, metionina ou combinações de arginina, glicina, ácido glutâmico e/ou metionina. Em modalidades particulares, a arginina e/ou glicina e/ou ácido glutâmico tem uma concentração final de 0,15 a 0,6 M na vacina estável em meio líquido. Em certas modalidades, a metionina tem uma concentração final de 0,025 M a 0,3 M na vacina estável em meio líquido. Em modalidades particulares, a quantidade terapeuticamente eficaz de um vírus vivo atenuado é uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vírus canino vivo atenuado. Em modalidades específicas deste tipo, a quantidade terapeuticamente eficaz de um vírus canino vivo atenuado inclui quantidades terapeuticamente eficazes de um vírus da cinomose vivo atenuado, um adenovirus canino tipo 2 vivo atenuado, um parvovirus canino vivo atenuado e um vírus parainfluenza canino vivo atenuado.

[0040] Estes e outros aspectos da presente invenção serão melhor avaliados por referência à seguinte Descrição Detalhada.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0041 ] Ao contrário das vacinas de vírus exterminados, as vacinas de vírus vivos estáveis em meio líquido da presente invenção são atenuadas. Até o momento, é necessário tomar especial cuidado ao formular tal vacina de vírus vivo atenuado para manter o título dos vírus atenuados em um nível que é seguramente inferior ao qual pode levar a um evento adverso significativo. De fato, a maioria das vacinas de vírus canino ou felino atenuado vivo são liofilizadas, e a liofilização pode levar a quedas substanciais na eficácia das vacinas de vírus vivo atenuado, tanto devido ao próprio processo de liofilização em si quanto ao longo do tempo, durante o armazenamento a longo prazo.

[0042] A presente invenção superou esse problema fornecendo vacinas estáveis em meio líquido que permanecem eficazes, mesmo durante o armazenamento, sem a necessidade de aumentar o título inicial do antígeno virai vivo atenuado acima de um nível seguro confiável. Como um benefício adicional, a presente invenção fornece um meio para reduzir o custo da fabricação das vacinas fornecidas, mediante a significativa redução da quantidade de vírus vivos atenuados necessária para fazer uma vacina segura e eficaz. Além disso, as vacinas de vírus vivo atenuado da presente invenção são mais convenientes de usar do que as suas contrapartes liofilizadas. Por conseguinte, a presente invenção fornece vacinas de vírus vivo atenuado seguras e eficazes que podem ser armazenadas como líquidos sob temperaturas refrigeradas e, ainda assim, permanecer estáveis durante 12 a 18 meses, ou até por mais tempo.

[0043] Além disso, surpreendentemente, as vacinas de vírus vivos estáveis em meio líquido da presente invenção podem incluir vírus caninos e/ou felinos de qualquer tipo. Assim, as vacinas de vírus vivos estáveis em meio líquido da presente invenção podem incluir tanto vírus envelopados quanto não envelopados. Além disso, as vacinas de vírus vivos estáveis em meio líquido da presente invenção podem incluir vírus vivos atenuados com genomas de RNA de fita simples, genomas de DNA de fita simples ou genomas de DNA de fita dupla.

[0044] Além disso, as vacinas de vírus vivos estáveis em meio líquido da presente invenção também podem compreender vetores caninos ou felinos recombinantes que estão sozinhos e/ou com outros tais vetores recombinantes, e/ou com vírus caninos ou felinos vivos atenuados, e/ou em combinação com bactérias exterminadas e/ou vírus caninos ou felinos exterminados. Tais vetores caninos ou felinos recombinantes podem codificar ainda um ou mais antígenos virais ou bacterianos heterólogos. Um exemplo particular de tal vetor recombinante é um vírus parainfluenza canino 5 recombinante, o qual foi recentemente descrito por Li et al., [J. of Virology 87(10) 5985-5993 (2013); incorporado por este documento como referência em sua totalidade].

[0045] Vectores recombinantes das vacinas de vírus vivos estáveis em meio líquido da presente invenção, como o vírus parainfluenza 5 recombinante, podem codificar um antígeno heterólogo de um vírus canino, um vírus felino, um vírus humano, um vírus símio, um vírus bovino, um vírus ovino, um vírus suíno e/ou um vírus de ave (por exemplo, um vírus de galinha). Em modalidades particulares, as vacinas de vírus vivos estáveis em meio líquido da presente invenção compreendem um vírus parainfluenza 5 recombinante que codifica um ou mais antígenos de um ou mais vírus de galinha.

[0046] Surpreendentemente, na presença de um quelante (por exemplo, EDTA 2 mM) e/ou de um adjuvante (por exemplo, fosfato de alumínio), as vacinas de vírus vivos estáveis em meio líquido da presente invenção retêm as suas estabilidades mesmo quando bactérias exterminadas são incluídas na formulação (por exemplo, consulte o exemplo 2 abaixo).Dessa forma, as vacinas de vírus vivos estáveis em meio líquido da presente invenção podem compreender adicionalmente um ou mais vírus caninos ou felinos exterminados e/ou bactérias (por exemplo, bacterinas), e/ou subfrações de uma bacterina.

[0047] O uso de termos no singular por conveniência na descrição não destina-se, de modo algum, a ser limitante. Desse modo, por exemplo, referência a um "aditivo de açúcar" inclui referência a um ou mais de tais aditivos de açúcar, a menos que seja especificado de outra forma. O uso de termos no plural também não se destina a ser limitante, a menos que seja especificado de outra forma. Da mesma forma, um composto químico que pode ser referido como um ácido ou sua base correspondente, a menos que seja especificado de outra forma, quando citado nesse documento, destina a significar qualquer forma do composto. Assim, o uso do termo ácido glutâmico tem o propósito de incluir glutamato e vice-versa.

[0048] Como usado na presente invenção, uma “vacina” é uma composição que é adequada para aplicação a um animal (incluindo, em determinadas modalidades, seres humanos) que, após a administração ao animal, induz uma resposta imunológica forte o suficiente para ajudar minimamente na proteção contra uma doença clínica que surge de uma infecção causada por um microrganismo tipo selvagem, ou seja, forte o suficiente para ajudar na prevenção da doença clínica, e/ou prevenir, melhorar ou curar a doença clínica. A menos que seja claramente indicado de outra forma, o uso do termo vacina inclui vacinas polivalentes.

[0049] Como usado na presente invenção, uma “vacina multivalente” é uma vacina que compreende dois ou mais antígenos diferentes. Em uma modalidade particular deste tipo, a vacina polivalente estimula o sistema imunológico do receptor contra dois ou mais patógenos diferentes.

[0050] Conforme utilizado na presente invenção, uma vacina “estável em meio líquido” é uma vacina mantida como um líquido (incluindo uma vacina polivalente líquida) que continua a ser eficaz pelo menos durante um ano, quando armazenada em ou abaixo de 7°C (por exemplo, em um refrigerador padrão, e/ou de 0°C a 7°C). Em modalidades particulares, a vacina estável em meio líquido permanece eficaz quando armazenada em ou abaixo de 7°C durante pelo menos 1,5 ano. Em modalidades mais particulares, a vacina estável em meio líquido permanece eficaz quando armazenada em ou abaixo de 7°C durante pelo menos 2 anos. Em modalidades ainda mais particulares, uma vacina estável em meio líquido permanece eficaz quando armazenada em ou abaixo de 7°C durante pelo menos 2,5 a 3 anos.

[0051] Como usado na presente invenção, os termos “protege”, “protegendo” ou “fornecendo proteção para” e “auxilia na proteção” não exige a proteção completa de qualquer indicação de infecção. Por exemplo, "auxilia na proteção" pode significar que a proteção é suficiente, de modo que, após o desafio, os sintomas da infecção subjacente são pelo menos reduzidos, e/ou que uma ou mais das causas celulares, fisiológicas ou bioquímicas diferentes, ou mecanismos que causam os sintomas, são reduzidos e/ou eliminados. Entende-se que “reduzido”, conforme utilizado neste contexto, significa em relação ao estado da infecção, incluindo o estado molecular da infecção, e não apenas o estado fisiológico da infecção.

[0052] Conforme utilizado na presente invenção, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" é uma quantidade de um determinado antígeno, por exemplo, de um vírus vivo atenuado, que é suficiente para fornecer proteção e/ou ajudar na proteção do patógeno contra o qual o antígeno está sendo administrado para proporcionar proteção, quando fornecido em uma única administração e/ou quando tencionado, fornecido como uma administração inicial com uma ou mais administração/administrações de reforço subsequentes.

[0053] Conforme utilizado na presente invenção, uma vacina “eficaz” compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um determinado antígeno.

[0054] Como usado na presente invenção, "farmaceuticamente aceitável" é usado como adjetivo para significar que o substantivo modificado é adequado para uso em um produto farmacêutico. Quando ele é usado, por exemplo, para descrever um excipiente em uma vacina farmacêutica, ele caracteriza o excipiente como sendo compatível com os outros ingredientes da composição, e não de forma desvantajosa e prejudicial para o receptor tencionado.

[0055] O termo "veículo" refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual o composto é administrado. Veículos farmaceuticamente aceitáveis podem ser líquidos estéreis, como água e/ou óleos, incluindo aqueles de origem petrolífera, animal, vegetal ou sintética, como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e similares. Água ou soluções salinas de solução aquosa, e soluções de dextrose e glicerol aquosas podem ser empregadas como veículos, particularmente para soluções injetáveis.

[0056] Como usado na presente invenção, um “adjuvante” é uma substância que é capaz de favorecer ou amplificar a cascata de eventos imunológicos, conduzindo por fim a uma melhor resposta imunológica, isto é, a resposta corporal integrada a um antígeno. Um adjuvante não é, em geral, necessário para que ocorra a resposta imunológica, mas favorece ou amplifica esta resposta.

[0057] Como usado na presente invenção, "administração sistêmica" é a administração no sistema circulatório do corpo (compreendendo o sistema cardiovascular e linfático), afetando deste modo o corpo como um todo, ao invés de um local específico, como o trato gastrintestinal (por exemplo, por meio de administração oral ou retal) e o sistema respiratório (através, por exemplo, da administração intranasal). A administração sistêmica pode ser realizada, por exemplo, através da administração no tecido muscular (intramuscular), na derme (intradérmica, transdérmica ou supradérmica), abaixo da pele (subcutânea), sob a mucosa (submucosa), nas veias (intravenosa), etc.

[0058] “Administração parenteral” inclui injeções subcutâneas, injeções na submucosa, injeções intravenosas, injeções intramusculares, injeções intradérmicas e infusão.

[0059] Como usado na presente invenção, o termo “canino” inclui todos os cães domésticos, Canis lupus familiaris ou Canis familiaris, a menos que seja indicado de outra forma.

[0060] O parvovirus canino "CPV" foi primeiramente isolado em 1978 e foi nomeado como CPV-2, para distingui-lo do vírus minuto parvovirus canino (CMV ou CPV-1). Aproximadamente um ano após o isolamento inicial do CPV-2, uma variante genética, CPV-2a, foi identificada. Em meados da década de 1980, uma segunda variante genética, CPV-2b, foi identificada. CPV-2a e CPV-2b logo deslocaram completamente o CPV-2. Atualmente, o CPV-2a já não é mais detectado nos Estados Unidos [Parrish e Kawaoka, Annu Rev. Microbiol., 59:553-586 (2005)]. Uma quarta variante do CPV nesta família, CPV 2c, foi descrita pela primeira vez em 2000 [consulte U.S. 8.227.593; U.S. 8.258.274; Hong et al., J. Vet. Diagn. Invest. (5): 535-9 (2007)]. O pedido provisório norte-americano 61/739.067, depositado em 19 de dezembro de 2013, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência em sua totalidade, descreve um isolado de CPV-2 específico atenuado (No. de acesso ATCC PTA-13492), que foi posteriormente depositado em 24 de janeiro de 2013 junto à Coleção Americana de Cultura de Células (ATCC) 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209, EUA, sob condições que satisfazem os requisitos do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito dos Microrganismos para fins de Instauração de Processos em Matéria de Patentes. Além disso, foi construído um parvovirus canino recombinante que compreende um genoma heterogêneo CPV-2c/CPV- 2, ou seja, a região de codifica as proteínas do capsídeo é derivada de um isolado de CPV-2c, e a região que codifica as proteínas não estruturais é derivada de um isolado de CPV-2 [WO2011107534 (Al); US 20120328652; WO2012007589 (Al), cujos conteúdos são incorporados, por meio deste, por referência em suas totalidades]. Conforme utilizado na presente invenção, uma vacina da presente invenção que compreende "parvovirus canino" pode compreender um ou mais destes tipos/variantes/isolados de CPV, incluindo o parvovirus canino recombinante recém-construído que compreende o genoma de CPV- 2c/CPV-2 heterogêneo.

[0061] Como usado na presente invenção, o termo “felino” refere-se a qualquer membro da família Felidae. Membros desta família incluem membros selvagens, de zoológico e domésticos, como qualquer membro as subfamílias Felinae, por exemplo, gatos, leões, tigres, pumas, jaguares, leopardos, leopardos-das-neves, panteras, leões das montanhas Norte- Americanas, chitas, linces, linces-pardos, caracais ou quaisquer cruzamentos das mesmas. Os gatos também incluem gatos domésticos, gatos de companhia de pura raça e/ou miscigenados, gatos de exposição, gatos de laboratório, gatos clonados e gatos selvagens ou assilvestrados.

[0062] Conforme utilizado na presente invenção, um "aditivo de açúcar" é um açúcar com 5 a 12 átomos de carbono (por exemplo, sacarose, maltose, trealose, glicose, lactose, glicose, frutose, galactose) ou açúcar álcool/poliol (por exemplo, sorbitol, manitol, arabitol, inositol, maltitol). Salvo especifícamente indicado de outra forma, a porcentagem (%) do aditivo de açúcar é fornecida como um peso (p) do aditivo de açúcar em relação ao volume (v) da vacina, (p/v) na vacina.

[0063] Conforme utilizado na presente invenção, a menos que seja definido de outra forma, a porcentagem (%) de um aditivo sólido, por exemplo, de um aditivo de açúcar ou gelatina, em uma vacina baseia-se em uma solução 1%, compreendendo 1 g de sólido/100 mL de volume de vacina (p/v).

[0064] Conforme utilizado na presente invenção, a menos que seja definido de outra forma, a porcentagem (%) de um aditivo líquido, por exemplo, etanol, em uma vacina baseia-se em uma solução 1%, sendo 1 mL de aditivo líquido/100 mL de volume de vacina (v/v).

[0065] Conforme utilizado na presente invenção, a menos que seja especificamente definido de outra forma, o valor de pH fornecido é o valor de pH determinado/medido a 25°C.

[0066] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “aproximadamente” é usado de modo intercambiável com o termo "cerca de", e significa que um valor está dentro do limite de vinte e cinco por cento do valor indicado, ou seja, uma concentração de EDTA de "cerca de" 2 mM pode ser de 1,5 mM a 2,5 mM de EDTA.

[0067] O hidrolisado da caseína inteira que pode ser usado nas vacinas estáveis em meio líquido da presente invenção pode ser obtido por vários procedimentos incluindo, por exemplo, como um hidrolisado ácido ou um hidrolisado enzimático. Tais hidrolisados contêm, na forma de aminoácidos e peptídeos misturados, todos os aminoácidos originalmente presentes na caseína. Um hidrolisado pancreático da caseína inteira que pode ser usado nas vacinas estáveis em meio líquido da presente invenção é vendido como CASEIN HYDROLYSATE ENZYMATIC®, junto à MP Biomedicals. Produtos comparáveis são vendidos com os nomes de NZ- AMINE®, NZ- AMINE® A, NZ-AMINE® AS e NZ-AMINE® B, e triptona, junto à Sigma-Aldrich.

[0068] Devido ao fato de o pH das vacinas estáveis em meio líquido da presente invenção idealmente variar de 6,0 a 8,0, as vacinas estáveis em meio líquido da presente invenção podem compreender um tampão. Tampões para uso nas vacinas estáveis em meio líquido da presente invenção incluem, mas não se limitam, a: Tris, Tris-histidina, BIS-Tris, BIS-Tris-propano, fosfato de potássio e/ou de sódio, piro fosfato de sódio ou potássio, imidazol, PIPES, ACES, MOPS, MOPSO, BES, TES, tricina, glicilglicina e HEPES. Os tampões podem ser ajustados até o pH desejado com o uso de qualquer contra-íon apropriado.

[0069] As vacinas da presente invenção podem conter um adjuvante ou, altemativamente, não conter um adjuvante, muitas vezes dependendo do(s) antígeno(s) que a vacina contém. Exemplos de adjuvantes para uso nas vacinas da presente invenção incluem fosfato de alumínio, por exemplo, REHYDROPHOS® (General Chemical, Parsippany, Nova Jersey) e/ou hidróxido de alumínio, por exemplo, REHYDROGEL®, REHYDROGEL®HPA ou REHYDROGEL®LV (General Chemical, Parsippany, Nova Jersey), e/ou um adjuvante de copolímero de baixo peso molecular que pode formar reticulações em solução para tomar-se um gel de alto peso molecular, por exemplo, POLYGENTM™ (MVP Laboratories, Omaha), e/ou um adjuvante composto por partículas de gel de acrilato de sódio em água, por exemplo, MONTANIDE™ PET GEL A™ (Seppic, Paris, França).

[0070] Quando adicionada, a quantidade do adjuvante varia geralmente entre 1% e 20% (v/v) na vacina. Em modalidades particulares, a quantidade do adjuvante varia entre cerca de 2% a 10% (v/v). No exemplo 2 fornecido abaixo, o adjuvante compreende cerca de 5% (v/v).

[0071] As vacinas da presente invenção também podem conter um quelante. Exemplos de quelantes apropriados incluem o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), ácido l,2-bis(o-aminofenóxi)etano- N,N,N’,N'-tetracético (BAPTA), ácido etilenoglicoltetracético (EGTA), ácido dimercaptossuccínico (DMSA), o ácido dietilenotriaminopentacético (DTPA), e o ácido 2,3-dimercapto-l-propanossulfônico (DMPS).

[0072] Vacinas Polivalentes: A presente invenção fornece vacinas polivalentes estáveis em meio líquido. Por exemplo, uma vacina canina multivalente estável em meio líquido da presente invenção, por exemplo, pode incluir dois ou mais dos seguintes: vírus da cinomose, adenovirus canino tipo 2, parvovirus canino, vírus parainfluenza canino, vírus influenza canino, pneumovírus canino, coronavirus canino, vírus da herpes canina, vírus da hepatite canina infecciosa, vírus minuto canino, vírus da raiva e vírus da pseudorraiva. Tal vacinas estáveis em meio líquido também podem ser combinadas com um ou mais antígenos atenuados ou exterminados, como o vírus influenza canino, o coronavirus canino, Bordetella bronchiseptica, uma espécie de Mycoplasma, Ehrlichia canis, uma espécie de Anaplasma, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira hardjo, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona, Leptospira interrogans, Leptospira autmnalis e Leptospira Bratislava e armazenadas ou, alternativamente, antes da administração.

[0073] Além disso, uma vacina para felinos polivalente estável em meio líquido da presente invenção pode compreender um ou mais dos seguintes patógenos felinos: um vírus da herpes felina, calicivírus felino, pneumovírus felino, parvovirus felino, vírus da leucemia felina, vírus da peritonite infecciosa felina, vírus da imunodeficiência felina, vírus da doença de boma, vírus influenza felino e vírus da gripe aviária. Tais vacinas estáveis em meio líquido podem ser posteriormente combinadas com Chlamydophila felis e/ou Bartonella spp. combinadas ou exterminadas (por exemplo, B. henselae) e armazenadas, ou altemativamente antes da administração.

[0074] As vacinas da presente invenção também podem conter um antibacteriano, como um antibiótico. Exemplos de tais antibióticos podem incluir: gentamicina, de 10 a 100 μg/mL, anfotericina B, de 0,5 a 5,0 μg/mL, tetraciclina, de 10 a 100 μg/mL, nistatina (micostatina), de 10 a 100 unidades/mL, penicilina, de 10 a 100 unidades/mL, estreptomicina, de 10 a 100 μg, polimixina B, de 10 a 100 μg e neomicina, de 10a 100 μg.

[0075] Administração de vacina: As vacinas de vírus estáveis em líquido da presente invenção podem ser administradas por qualquer meio convencional, por exemplo, por administração sistêmica, incluindo por administração parenteral como, sem limitação, por administração subcutânea ou intramuscular. As vacinas de vírus estáveis em líquido da presente invenção também podem ser administradas por administração via mucosa, tal como por administração intranasal, oral, intratraqueal, retal e/ou ocular. Altemativamente, as vacinas podem ser administradas através de um emplastro de pele, por escarificação ou administração tópica. É contemplado que uma vacina de vírus estável em meio líquido da presente invenção também pode ser administrada através de água potável e/ou da comida dos indivíduos animais receptores. É adicionalmente contemplado que essas vacinas podem ser administradas sob a forma de um doce ou brinquedo.

[0076] As vacinas (incluindo vacinas polivalentes) da presente invenção também podem ser administradas como parte de uma terapia de combinação, ou seja, uma terapia que inclui, além da vacina em si, administrar um ou mais agentes ativos adicionais, terapias, etc. Naquele caso, deve-se reconhecer que a quantidade de vacina que constitui uma quantidade "terapeuticamente eficaz" pode ser mais ou menos do que a quantidade de vacina que constituiria uma quantidade "terapeuticamente eficaz" se a vacina fosse administrada sozinha. Outras terapias podem incluir aquelas conhecidas na técnica como, por exemplo, analgésicos, medicamentos redutores de febre, expectorantes, medicações anti-inflamatórias, anti-histaminas e/ou administração de fluidos.

[0077] O nível de imunogenicidade pode ser determinado experimentalmente por técnicas de estudo de titulação de dose desafio geralmente conhecidas na técnica. Tais técnicas incluem, tipicamente, a vacinação de vários indivíduos animais com a vacina em dosagens diferentes e, em seguida, o desafio dos indivíduos animais com o vírus virulento para determinar a dose mínima protetora.

[0078] Fatores que afetam o regime de dosagem preferencial podem incluir, por exemplo, a espécie ou raça (por exemplo, de um canino ou felino), idade, peso, sexo, dieta, atividade, tamanho do pulmão e condição do indivíduo; a via de administração; a eficácia, segurança e perfis de duração da imunidade da vacina particular usada; se um sistema de administração é usado; e se a vacina é administrada como parte de um fármaco e/ou combinação de vacina. Deste modo, a dose efetivamente empregada pode variar para animais específicos e, portanto, pode se desviar das dosagens típicas estabelecidas acima. A determinação de tais ajustes de dosagem está geralmente dentro da habilidade das pessoas versadas na técnica do desenvolvimento de vacina, usando meios convencionais.

[0079] Da mesma forma, o volume com o qual uma dose pode ser administrada normalmente situa-se entre 0,1 mL (típico para aplicação intradérmica ou transdérmica) e 5,0 mL. Uma faixa típica para o volume de administração está entre 0,2 e 2,0 mL, e de cerca de 1,0 a 2,0 mL para administração intramuscular ou subcutânea.

[0080] É contemplado que a vacina pode ser administrada ao receptor da vacina de uma única vez ou, altemativamente, duas ou mais vezes ao longo de dias, semanas, meses ou anos. Em algumas encarnações, a vacina é administrada pelo menos duas vezes. Em algumas de tais modalidades, por exemplo, a vacina é administrada duas vezes, com a segunda dose (por exemplo, um reforço), sendo administrada pelo menos 2 semanas após a primeira dose. Em modalidades particulares, a vacina é administrada duas vezes, com a segunda dose sendo administrada em até 8 semanas após a primeira dose. Em outras modalidades, a segunda dose é administrada de 1 semana a 2 anos após a primeira dose, de 1,5 semana a 8 semanas após a primeira dose, ou de 2 a 4 semanas após a primeira dose. Em outras modalidades, a segunda dose é administrada em cerca de 3 semanas após a primeira dose.

[0081] Nas modalidades acima, a primeira e as dosagens subsequentes podem variar, como em quantidade e/ou forma. Muitas vezes, no entanto, as doses são as mesmas em termos de quantidade e forma. Quando é administrada apenas uma única dosagem, a quantidade de vacina naquela dose somente geralmente compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz da vacina. Quando, no entanto, mais de uma dose é administrada, as quantidades de vacina naquelas doses combinadas podem constituir uma quantidade terapeuticamente eficaz. Além disso, uma vacina pode ser inicialmente administrada e, em seguida, um reforço pode ser administrado, por exemplo, de 2 a 12 semanas mais tarde. No entanto, as administrações subsequentes da vacina podem ser feitas em uma base anual (1 ano) ou bianual (2 anos), independentemente de se um reforço foi administrado ou não.

[0082] A presente invenção pode ser melhor compreendida por referência aos exemplos não limitantes a seguir, que são fornecidos como exemplificadores da invenção. Os exemplos a seguir são apresentados para ilustrar mais plenamente as modalidades da invenção. Eles não devem, no entanto, ser interpretados de nenhuma maneira como limitantes do amplo escopo da invenção.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 ESTABILIDADE DAS VACINAS DE VÍRUS CANINO EM MEIO LÍQUIDO Materiais e Métodos

[0083] Materiais: Sorbitol e sacarose de grau de cultura de células são compradas junto à Fisher Scientific. Cloridrato de L-arginina, L-metionina, L- histidina e cloreto de sódio de grau molecular, com uma pureza superior a 98%, são comprados junto à Sigma. Sulfato de dextrana, com peso molecular médio igual a 10.000, com uma pureza > 95%, é comprado junto à Sigma. Soluções de etanol grau biológico molecular (> 99%), TWEEN 80, TWEEN 20, Tris 1,0 M (pH 8,0) e EDTA (pH 8,0) são compradas junto à Sigma. Solução de eflorescência de gelatina 250 a 20% e solução de NZ amina AS a 7,61% foram preparadas a partir dos melhores reagentes comercialmente disponíveis.

[0084] Preparação do antígeno a granel: As soluções a seguir foram preparadas e esterilizadas por filtração em filtro de 0,2 μm: sacarose a 70%, sorbitol a 70%, L-arginina 1,0 M (pH 7,2), L-metioinina 5% e sulfato de dextrana 5 mM. Os antígenos a granel CDV, CAV2, CPV e CPI, com títulos entre 6,5 e 9,5 foram congelados a -80°C para serem descongelados imediatamente antes da mistura.

[0085] Mistura e enchimento da vacina em meio líquido'. O procedimento para fazer uma vacina líquida que compreende uma mistura de CDV, CAV2, CPV e CPI (1,0 mL por dose) é como a seguir: uma quantidade de dose de antígenos é misturada em diferentes formulações, conforme mostrado na tabela 1 abaixo, com títulos alvos de 5,0 a 7,5 (TCID50 Logic) para os antígenos virais. Preparar e marcar um recipiente esterilizado de 200 mL e, em seguida, adicionar cada estabilizador e componente excipiente ao recipiente, após a quantidade calculada com base na concentração final de cada componente, conforme mostrado na tabela 1 abaixo. Avolumar com água bidestilada (ddELO) até o volume alvo, para os estabilizantes e excipientes. Misturar na placa de agitação durante pelo menos 10 min até que todos os componentes sejam totalmente dissolvidos. Esfriar e manter a solução do estabilizador a 4°C, até os antígenos estarem prontos.

[0086] Descongelar o antígeno congelado em banho-maria a 37°C, agitando ocasionalmente até quase todo o gelo ser derretido. Alguns dos antígenos apresentam fragmentos de células visíveis na solução, dessa forma, deve-se homogeneizar bem os antígenos antes de pipetar. O antígeno descongelado deve ser mantido a 2 a 8°C durante no máximo 8 horas antes do uso. Adicionar uma quantidade adequada de CDV, CAV2, CPV e CPI ao recipiente marcado com as soluções de estabilizador. Misturar na placa de agitação, até os antígenos e estabilizantes serem homogeneamente misturados. Tentar evitar a formação de bolhas e espumas durante esta etapa de mistura. Medir o pH a 25°C e ajustar o pH com HC1 1M ou NaOH 1M, até o pH alvo se o pH não estiver compreendido entre 7,2 ±0,1. Manter a mistura da vacina a 2 a 8°C até dispensá-la no mesmo dia, ou colocar uma alíquota em um pequeno volume e congelá-la a <-70°C, para uso posterior. Dispensar 1 mL por frasco de uma mistura da vacina em frascos de ampola de vidro de 2 mL. Adicionar gás argônio aos frascos de ampola após encher, para ajudar a evitar a oxidação durante o armazenamento e, em seguida, termovedar a ampola. Marcar a ampola com o nome de amostra, o número do lote, a temperatura de armazenamento, a data e, em seguida, transferir para caixas e armazenar em temperatura diferente, conforme designado.

[0087] Teste de estabilidade em temperatura acelerada e em tempo real: Amostras líquidas foram armazenadas a 25°C ± 1°C e 4°C ± 1°C, respectivamente, nas incubadoras correspondentes. A temperatura foi definida em 25°C para os testes de estabilidade acelerada, enquanto que as amostras armazenadas a 4°C foram as amostras de estabilidade em tempo real. No ponto de tempo designado, 3 frascos de cada formulação foram obtidos, e o título de cada antígeno foi medido pelo ensaio de titulação baseado em cultura de células e reportado como a dose infecciosa em cultura de tecido mediana (TCID50), e/ou como 50% de uma dose infecciosa de anticorpo fluorescente (FAIDÍO).

Métodos Analíticos

[0088] Potência do CPI: Diluições de amostras de vírus são inoculadas em células de rim de cachorro (DK). Após 4 a 6 dias, as monocamadas são fixadas e maradas com antissoro de CPI conjugado com fluoresceína, e o título virai é calculado pelo método de Spearman-Karber [Cunningham, C.H. A Laboratory Guide in Virology, T edição, Burgess Publishing Co., Minneapolis, MN. (1973); Kaplan, M.M. E and Koprowski, H, Laboratory Techniques in Rabies, World Health Organization, Suíça, (1973)]

[0089] Potência do CDV: As diluições das amostras de vírus foram inoculadas em células Vero. Após 5 a 7 dias, monocamadas são observadas para efeito citopático, e o título virai é calculado pelo método de Spearman- Karber, como citado acima.

[0090] Potência do CA V2: As diluições das amostras de vírus foram inoculadas em células DK. Após 7 dias, as monocamadas são observadas para efeito citopático, e o título virai é calculado pelo método de Spearman- Karber, como citado acima.

[0091] Potência do CPV: As diluições das amostras de vírus foram inoculadas em células DK. Após 3 dias, as monocamadas são marcadas com antissoro de CPV conjugado com fluoresceína, e o título virai é calculado pelo método de Spearman-Karber, como citado acima.

Resultados

[0092] Ensaio de estabilidade acelerada a 25°C: Dois estudos foram realizados para o teste da formulação líquida. O primeiro estudo inclui as formulações L-001 a L-008 e o segundo estudo inclui as formulações L-009 a L-026. (Consulte a tabela 1 para obter detalhes das formulações). Amostras líquidas armazenadas em frascos de ampola de vidro vedados com 1 mL por frasco por dose são testadas em diferentes pontos de tempo, após o armazenamento a 25°C ou 4°C. Para as amostras sob armazenamento a 25°C, os dados de estabilidade para CDV, CAV2 e CPI são mostrados na tabela 2. O CPV não foi testado para o armazenamento a 25°C, uma vez que o CPV líquido é considerado como a fração mais estável entre os quatro vírus. Para o estudo 1, as amostras que foram incubadas a 25°C (L-001 a L-008), os dados no dia 0, semana 6 e semana 8 são utilizados para comparar as diferentes formulações. Para as amostras do estudo 2 que foram incubadas a 25°C (L- 009 a L-026), as amostras do dia 0, da semana 6 e da semana 12 são utilizadas para a triagem da formulação. Os pontos de tempo adicionais intermediários foram testados, e a tendência é semelhante. Com base na tendência de degradação, a estabilidade relativa de cada formulação é manualmente classificada como mostrado na tabela 2, com cinco "+" sendo a mais estável e um "+" sendo a menos estável. Cada fração virai é classificada individualmente e, em seguida, a classificação geral concilia todos os 3 vírus. Com base na classificação e na comparação, várias tendências foram observadas. Por conseguinte, entre os três sacarídeos testados (sacarose, sorbitol e glicerol), a contribuição estabilizante da sacarose e do sorbitol foram significativamente melhores do que a do glicerol. Há também uma forte preferência pela maior concentração de açúcar, com uma concentração de açúcar combinado de 17% a 25% apresentando o melhor desempenho do que as formulações com menos de 10%. Entre os estabilizantes das proteínas ou aminoácidos, os de L-arginina 0,3 M tiveram a maior contribuição de estabilidade, seguido pela metionina 1%, gelatina 0,8% e NZ amina 1%. Entre os outros estabilizantes, o sulfato de dextrana e os removedores de radicais livres (FRS) pareceram contribuir com a estabilidade das formulações de CPV, CDV, CAV2 e CPI líquidas e, embora a presença deles não altere significativamente o perfil de estabilidade, eles também não apresentaram efeitos negativos sobre a estabilidade. Portanto, em alguns casos, seria preferível que o sulfato de dextrana e/ou o FRS seja(m) incluído(s) na formulação para a estabilidade de armazenamento a longo prazo de uma vacina líquida de vírus vivo felino ou canino a 25°C. Por outro lado, verificou-se que o TWEEN 80 e o TWEEN 20 são prejudiciais para a estabilidade das formulações de vírus.

[0093] Teste de estabilidade a 4°C em tempo real: a estabilidade a longo prazo em tempo real das vacinas de CPV, CDV, CAV2 e CPI vivos a 4°C também foi monitorada, e os dados estão apresentados na tabela 3. O título virai projetado em 24 meses a 4°C é extrapolado a partir dos pontos de dados no mês 12 e no mês 18, para L-001 a L-008, e no mês 6 e 12 para L- 009 a L-026 (consulte a tabela 3 abaixo). O requisito de título da dose mínima para cada vírus na expiração está listado no final da tabela 3 abaixo, e é usado para determinar qual formulação pode fornecer um produto estável a 4°C. Existem dez formulações (L-009, L-011, L-012, L-014, L-15, L-016, L-018, L-019, L-025 e L-026) que eram altamente susceptíveis de produzir um produto estável, enquanto as formulações L-003 e L-007 têm grande potencial para produzir um produto estável com uma vida de prateleira de 2 anos a 4°C. Entre os quatro vírus examinados, CDV parece ser o mais lábil. Todas as dez formulações parecem ser capazes de proporcionar mais de 3 anos de estabilidade a 0 a 8°C para o CAV2, CPV e CPI, e pelo menos 2 anos de estabilidade a 0 a 8°C para o CDV.

EXEMPLO 2 ESTABILIDADE DAS VACINAS DE VÍRUS CANINO VIVO EM MEIO LÍQUIDO COM BACTÉRIAS EXTERMINADAS Materiais e métodos Materiais:

[0094] Sorbitol e sacarose de grau de cultura de células são compradas junto à Fisher. Cloridrato de L-arginina, L-metionina, L-histidina e cloreto de sódio de grau molecular, com uma pureza superior a 98%, são comprados junto à Sigma. Sulfato de dextrana, com peso molecular médio igual a 10.000, com uma pureza > 95%, é comprado junto à Sigma. Soluções de etanol grau biológico molecular (> 99%), Tween 80, Tween 20, Tris 1,0 M (pH 8,0) e EDTA (pH 8,0), gentamicina (50 mg/mL) e anfotericina B (25 mg/mL) são compradas junto à Sigma. Solução de eflorescência de gelatina 250 a 20% e solução de NZ amina AS a 7,61% foram preparadas intemamente.

Preparação do antígeno a granel:

[0095] As soluções a seguir foram preparadas e esterilizadas por filtração usando filtro de 0,2 μm: sacarose a 80%, sorbitol a 70%, arginina 1,0 M (pH 7,2), L-metioinina 5% e sulfato de dextrana 5 mM.

[0096] Os antígenos de DA2PPv a granel CDV, CAV2, CPV e CPI são obtidos com títulos a 6,7, 7,8, 8,0 e 9,2, respectivamente. Os antígenos a granel são congelados a -80°C, e são descongelados imediatamente antes da mistura.

[0097] Os antígenos de Leptospira a granel são obtidos com uma concentração de cerca de 2 x 1010 bactérias por mililitro. Os antígenos de Leptospira a granel são armazenados a 4°C.

Mistura e Enchimento da Vacina Líquida:

[0098] O procedimento para fazer a mistura da vacina de DA2PPv líquida (1,0 mL por dose) é como descrito a seguir: uma quantidade de dose de antígenos vai ser misturada em diferentes formulações conforme mostrado na tabela 4, com um título alvo de 5,5, 6,1, 6,0 e 7,0 para vírus CDV, CAV2, CPV e CPI, respectivamente, seguindo os procedimentos padrão para um produto CDV, CAV2, CPI e CPV (DA2PPv) multivalente. Para formulações com os quatro antígenos de leptospira, a concentração alvo de cada fração leptospira é igual a aproximadamente 1 x 109 células por mililitro. Um recipiente esterilizado de 200 mL é preparado e marcado e, em seguida, cada estabilizador e componente excipiente é adicionado ao recipiente, após a quantidade calculada com base na concentração final de cada componente, conforme mostrado na tabela 4 abaixo.

[0099] Avolumar com água bidestilada (dd) PLO até o volume alvo, para os estabilizantes e excipientes. Misturar na placa de agitação durante pelo menos 10 min até que todos os componentes sejam totalmente dissolvidos. Esfriar e manter a solução do estabilizador a 4°C, até os antígenos estarem prontos.

[00100] Descongelar o antígeno DA2PPv congelado em banho-maria a 37°C, agitando ocasionalmente até quase todo o gelo ser derretido. Alguns dos antígenos apresentam fragmentos de células visíveis na solução, dessa forma, deve-se homogeneizar bem os antígenos antes de pipetar. O antígeno descongelado deve ser mantido a 2 a 8°C durante no máximo 8 horas antes do uso. Adicionar uma quantidade adequada de CDV, CAV2, CPV e CPI ao recipiente marcado com as soluções de estabilizador. Tomar uma quantidade adequada de alíquota de antígenos de leptospira (lepto) 4 a granel à mistura de vacina. Misturar na placa de agitação, até os antígenos e estabilizantes serem homogeneamente misturados. Tentar evitar a formação de bolhas e espumas durante esta etapa de mistura. Medir o pH a 25°C e ajustar o pH com HC1 1M ou NaOH 1M até o pH alvo se o pH não estiver compreendido entre 7,2 ±0,1. Manter a mistura da vacina a 2 a 8°C até dispensá-la no mesmo dia, ou colocar uma alíquota em um pequeno volume e congelá-la a <-70°C, para uso posterior. Dispensar 1 mL por frasco de uma mistura da vacina em frascos de ampola de vidro de 2 mL. Encher os frascos de ampola com gás argônio após encher, para ajudar a evitar a oxidação durante o armazenamento e, em seguida, termovedar a ampola. Marcar a ampola com o nome de amostra, o número do lote, a temperatura de armazenamento, a data e, em seguida, transferir para caixas e armazenar em temperatura diferente, conforme designado. Teste de estabilidade em temperatura acelerada e em tempo real: Amostras líquidas de DA2PPv ou DA2PPv-Lepto 4 serão armazenadas em uma incubadora a 25 ± 1°C. A 25°C elas foram usadas como teste de estabilidade acelerada para fins de triagem. Em um ponto de tempo designado, 3 frascos de cada formulação serão recuperados, e o título de cada antígeno será medido por TCID50 ou FAID50 baseado em cultura de células.

Métodos analíticos: Potência de CPI:

[00101] O título virai de CPI na vacina DA2PPv será determinado. Em resumo, diluições do vírus serão inoculadas em células de rim de cachorro (células DK). Após 4 a 6 dias, as monocamadas serão fixadas e marcadas com antissoro de CPI conjugado com fluoresceína, e o título virai será calculado pelo método de Spearman-Karber (consulte o exemplo 1 acima).

Potência de CDV:

[00102] O título virai de CDV na vacina DA2PPv será determinado. Em resumo, diluições do vírus serão inoculadas em células Vero. Após 5 a 7 dias, as monocamadas serão observadas quanto ao efeito citopático, e o título virai será calculado pelo método de Spearman-Karber.

Potência de CA V-2:

[00103] O título virai de CAV-2 na vacina DA2PPv será determinado. Em resumo, diluições do vírus serão inoculadas em células DK. Após 7 dias, as monocamadas serão observadas quanto ao efeito citopático, e o título virai será calculado pelo método de Spearman-Karber.

Potência do CPV:

[00104] O título viral de CPV na vacina DA2PPv será determinado. Em resumo, diluições do vírus serão inoculadas em células DK. Após 3 dias, as monocamadas são marcadas com antissoro de CPV conjugado com fluoresceína, e o título virai é calculado pelo método de Spearman-Karber. Resultados e Conclusões

Teste de estabilidade acelerada a 25 °C:

[00105] As vacinas listadas na formulação da tabela 4 foram misturadas conforme descrito nos métodos acima. A formulação L-037 é a mesma que as formulações L-015 anteriormente identificadas acima (consulte a tabela 1), exceto que ela contém gentamicina e anfotericina B. As formulações L-040, 043-L e L-045 tanto as quatro frações de vírus canino vivo, ou seja, DA2PPv, quanto os quatro antígenos de Leptospira exterminados antígenos (Canicola, Grippo, Pomona e Ictero). As amostras de vacina em meio líquido foram armazenadas em frascos de ampola de vidro vedados com 1 mL por frasco por dose. Elas foram testadas em diferentes pontos de tempo após o armazenamento a 25°C. Os dados de estabilidade para CDV, CAV2 e CPI são mostrados na tabela 5. O CPV não foi testado para o armazenamento a 25°C, uma vez que o CPV líquido é considerado como a fração mais estável entre os quatro vírus vivos. Com base nos dados de estabilidade mostrados na tabela 5, observou-se o seguinte: 1) Os antibióticos, como conservantes, não afetam negativamente a estabilidade do vírus de DA2PPv na formulação L-015. 2) A presença dos quatro antígenos de Leptospira exterminados diminuiu a estabilidade do CDV e do CPI vivos atenuados na formulação líquida. 3) Um suplemento de EDTA 2 mM à formulação L-040 fornece uma formulação de DA2PPv estável mesmo na presença dos quatro antígenos de Leptospira exterminada. 4) Essa formulação líquida estável também pode ser usada para a combinação de DA2PPv com os quatro antígenos de Leptospira exterminada na presença dos adjuvantes REHYDROPHOS.

Claims

1. Vacina estável em meio líquido, caracterizada pelo fato de compreender um vírus canino ou felino atenuado vivo, 10 a 30% (p/v) de aditivo de açúcar, e um aminoácido; em que a vacina estável em meio líquido tem um pH entre 6,0 e 8,0; e em que o aminoácido é selecionado do grupo consistindo em arginina e metionina; em que quando o aminoácido é arginina, sua concentração final na vacina estável em meio líquido é igual a 0,15 a 0,6 M; em que quando o aminoácido é metionina, sua concentração final na vacina estável em meio líquido é igual a 0,025 a para 0,3 M; e em que o vírus canino ou felino atenuado vivo é selecionado a partir do grupo consistindo de um vírus da cinomose, um adenovírus, um parvovírus, um vírus da parainfluenza, ou qualquer combinação dos mesmos.

2. Vacina estável em meio líquido de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o vírus canino vivo atenuado é selecionado do grupo consistindo em um vírus da cinomose canina, adenovírus canino tipo 2, parvovírus canino, vírus parainfluenza canino ou qualquer combinação dos mesmos.

3. Vacina estável em meio líquido de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o parvovírus canino (CPV) é selecionado do grupo consistindo em CPV-2, CPV-2a, CPV-2b, CPV-2c e um CPV recombinante que compreende um genoma CPV-2c/CPV-2 heterogêneo.

4. Vacina estável em meio líquido de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o CPV-2c tem o número de acesso ATCC No. PTA 13492.

5. Vacina estável em meio líquido de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que o vírus parainfluenza canino é um vetor recombinante que codifica e expressa um antígeno heterogêneo.

6. Vacina estável em meio líquido de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 3, 4, ou 5, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um componente selecionado do grupo que consiste em 0,4 a 1,6% (p/v) de gelatina, 0,5 a 2,0% (p/v) de um hidrolisado proteolítico de caseína inteira, 0,25 a 1,0% (v/v) de etanol, um quelante, um tampão, um antibiótico, um adjuvante, e qualquer combinação dos mesmos.

7. Vacina estável em meio líquido de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o tampão é selecionado do grupo que consiste em 2,5 a 50 mM de tris e 2,5 a 50 mM de tris com 2,5 a 50 mM de histidina.

8. Vacina estável em meio líquido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, ou 7, caracterizada pelo fato de que o aditivo de açúcar é selecionado do grupo consistindo em sacarose, sorbitol e uma combinação de sucrose e sorbitol.

9. Vacina estável em meio líquido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 caracterizada pelo fato de que a vacina compreende adicionalmente e um vírus exterminado.

10. Vacina estável em meio líquido de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o vírus exterminado é selecionado do grupo consistindo em vírus influenza canino, pneumovírus canino, coronavírus canino ou qualquer combinação dos mesmos.

11. Uso de um vírus canino ou felino atenuado vivo, caracterizado pelo fato de ser na preparação de uma vacina estável em meio líquido como definida em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.

12. Uso de um vírus canino ou felino atenuado vivo, caracterizado pelo fato de ser na preparação de uma vacina estável em meio líquido como definida em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 para a vacinação de um canino contra vírus da cinomose canina, adenovírus canino tipo 2, parvovírus canino, e vírus parainfluenza canino.

13. Uso de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que a vacina é administrada por injeção subcutânea.

14. Método para fabricar a vacina estável em meio líquido como definida em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10, caracterizado pelo fato de compreender combinar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vírus canino ou felino atenuado vivo com um aditivo de açúcar de 10 a 30% (p/v), um aminoácido e uma solução tamponada em pH 6,0 a 8,0 para formar uma vacina estável em meio líquido, em que o aminoácido é selecionado do grupo consistindo em arginina e metionina; em que quando o aminoácido é arginina, sua concentração final na vacina estável em meio líquido é igual a 0,15 a 0,6 M; e em que quando o aminoácido é metionina, sua concentração final na vacina estável em meio líquido é igual a 0,025 a 0,3 M.