ES2724575T3 - Vacunas de virus bovino líquidas estables - Google Patents

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Zhisong Qiao
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Abstract

Una vacuna líquida estable que comprende un virus bovino vivo atenuado, el 5 - 40 % (p/v) de un alcohol de azúcar y de 0,15 a 0.75 M de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en arginina, ácido glutámico y glicina, así como cualquier combinación de los mismos; en donde la vacuna estable líquida varía en pH desde pH 6,0 hasta pH 8,0, en donde el virus bovino vivo atenuado se selecciona del grupo que consiste en virus de diarrea vírica bovina (BVDV), virus de rinotraqueítis infecciosa bovina, virus paragripal tipo 3, virus sincitial respiratorio bovino, virus de la fiebre del valle del Rift y coronavirus respiratorio bovino y cualquier combinación de los mismos.

Description

DESCRIPCIÓN
Vacunas de virus bovino líquidas estables
Campo de la invención
La presente invención se refiere a vacunas bovinas líquidas estables que comprenden un virus bovino vivo atenuado. La invención también se refiere a la fabricación de tales vacunas y métodos de vacunación de sujetos animales.
Antecedentes
Existe una cantidad significativa de virus que pueden infectar el ganado bovino. Tales virus incluyen virus de diarrea vírica bovina tipos 1 y 2, (BVDV1, o alternativamente, BVD1; y BVDV2, o alternativamente, BVD2), virus de rinotraqueítis infecciosa bovina (IBR), parainfluenza tipo 3 (PI3), virus sincitial respiratorio bovino (BRSV), virus de fiebre del valle del Rift (RVFV) y coronavirus respiratorio bovino (BRCV). Además, existe una cantidad de bacterias que también pueden infectar el ganado bovino, incluidas Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica, Histophilus somni y Mycoplasma bovis.
Ahora se acepta ampliamente que el mejor modo de prevenir enfermedades debidas a infecciones bacterianas o víricas en bovinos es vacunarlos frente a estos virus. Por otra parte, se pueden administrar vacunas bacterianas o de virus atenuado vivo multivalentes que limiten el número de inyecciones de vacunas requeridas. Por consiguiente, existen disponibles en el mercado vacunas de virus vivo multivalentes que protegen frente a BVDV1 y BVDV2, IBR, PI3 y/o BRSV. Sin embargo, hasta ahora, los virus de ganado bovino atenuados han sido inestables cuando se almacenan en soluciones líquidas. Por lo tanto, la mayoría de las vacunas de virus atenuadas vivo se liofilizan, es decir, se secan por congelación, antes de su almacenamiento a largo plazo. El virus bovino vivo atenuado se mezcla comúnmente como una suspensión en agua con un agente protector, se congela y, a continuación, se deshidratada mediante sublimación y secado secundario durante el proceso de liofilización. Las bajas temperaturas de la congelación y secado por sublimación, junto con las bajas relaciones de superficie con respecto a volumen implicadas, pueden requerir largos periodos de secado y, de este modo, un aumento significativo del tiempo y los costes de fabricación.
Además, hay inconsistencias inherentes en los grandes procesos de secado comerciales debido a: la incapacidad de ajustar la temperatura de almacenamiento por toda la totalidad de la carga del producto, tasas de congelación variables por todo el secador, efectos de borde y efectos de energía radiante. El aumento de la temperatura de secado para reducir los tiempos de secado a menudo no resulta una opción puesto que la temperatura de secado tiene que permanecer significativamente por debajo de la temperatura de transición vítrea de la matriz de proteínas protectora. Por otra parte, los largos tiempos de secado inconsistentes y/o las altas temperaturas de secado llevan, a menudo, al daño estructural de los virus vivos atenuados, junto con una pérdida significativa de su actividad biológica.
En consecuencia, para justificar la pérdida inherente de eficacia, se almacenan vacunas bovinas liofilizadas que comprenden virus vivos atenuados con títulos aumentados. Sin embargo, tales títulos aumentados pueden llevar a situaciones adversas significativas si el proceso de liofilización realmente lleva a una menor pérdida de actividad de lo anticipado. Por lo tanto, se requiere un gran cuidado para formular una vacuna que contenga un título de virus que no sea solo segura por debajo de la cantidad que lleva a situaciones adversas, sino que también mantenga una suficiente eficacia en vista de la pérdida de título de virus debido a la liofilización y posterior almacenamiento.
Adicionalmente, existe una limitación con respecto al tamaño de los viales de liofilización y/o cantidad de dosis contenidas dentro de tales viales debido a los tamaños del retén estándar relativamente pequeño para las partes superiores de estos viales. Por lo tanto, grandes volúmenes de líquido se vuelven complicados de sublimar a través de las aberturas relativamente pequeñas. Además, un vial grande requiere que el usuario transfiera de algún modo una gran cantidad de diluyente a la torta liofilizada de un modo estéril, mientras que la rehidratación de muchas viales más pequeñas resulta simplemente inconveniente. De hecho, cualquier alternativa resulta particularmente molesta en un entorno de engorde en el que residen los destinatarios de la vacuna, por ejemplo, el ganado bovino. Por lo tanto, existe la necesidad de nuevas vacunas de virus bovino vivo atenuado que pueden retener de forma fiable sus títulos de virus a un nivel seguro y eficaz.
La citación de cualquier referencia en el presente documento no debe interpretarse como una admisión de que tal referencia está disponible como "anterior a la técnica" en el momento de la solicitud.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a una vacuna bovina líquida estable que comprende un virus bovino vivo atenuado, 5 - 40 % (p/v) de un alcohol de azúcar y de 0,15 a 0.75 M de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en arginina, ácido glutámico y glicina, así como cualquier combinación de los mismos; en donde la vacuna estable líquida varía en pH desde pH 6,0 hasta pH 8,0, en donde el virus bovino vivo atenuado se selecciona del grupo que consiste en virus de diarrea vírica bovina (BVDV), virus de rinotraqueítis infecciosa bovina, virus paragripal tipo 3, virus sincitial respiratorio bovino, virus de la fiebre del valle del Rift y coronavirus respiratorio bovino y cualquier combinación de los mismos.
La presente invención se refiere también a un método de preparación de dicha vacuna estable líquida. La vacuna estable líquida de acuerdo con la invención es adecuada para su uso en la vacunación de un bovino frente a un virus bovino.
Para superar las deficientes de las vacunas actuales, la presente invención proporciona vacunas de virus bovino vivo atenuado líquidas estables así como sus composiciones inmunogénicas correspondientes. Las vacunas de virus bovino vivo atenuado líquidas estables de la presente invención puede permanecer eficaces durante períodos prolongados tales como 9 meses o más (por ejemplo aproximadamente de 1 hasta 3 años). También se describe en el presente documento métodos de administración de tales vacunas a un animal y métodos de prevención de una enfermedad en un animal mediante la administración de una vacuna de la presente invención.
En el presente documento se describen vacunas líquidas estables que comprenden un virus bovino vivo atenuado, incluidas vacunas multivalentes que comprenden un virus vivo. En determinadas realizaciones, el virus vivo es un virus atenuado. En otras realizaciones el virus vivo es un virus recombinante. En realizaciones particulares, el virus es tanto atenuado como recombinante. El recombinante también puede codificar una proteína heterogénea. En realizaciones particulares de este tipo, la proteína heterogénea es un virus, parásito o antígeno bacteriano.
La vacuna de acuerdo con la invención comprende del 5 al 40 % (p/v) de un alcohol de azúcar. En determinadas realizaciones, la vacuna comprende del 10 al 30 % (p/v) de un alcohol de azúcar. En realizaciones particulares, la vacuna comprende del 15 al 25 % (p/v) de un alcohol de azúcar. En realizaciones relacionadas la vacuna comprende del 10 al 20 % (p/v) de un alcohol de azúcar. En otras realizaciones, la vacuna comprende del 20 al 25 % (p/v) de un alcohol de azúcar. En realizaciones más particulares, la vacuna comprende del 12 al 18 % (p/v) de un alcohol de azúcar. En otras realizaciones aún más particulares, la vacuna comprende aproximadamente el 15 % (p/v) de un alcohol de azúcar. En realizaciones relacionadas, la vacuna comprende aproximadamente el 23 % (p/v) de un alcohol de azúcar. En determinadas realizaciones, las vacunas de virus líquidas estables de la presente invención comprenden dos o más alcoholes de azúcar, siendo la cantidad total del alcohol de azúcar en las vacunas líquidas estables del 5­ 40 % (p/v). En realizaciones relacionadas, las vacunas de virus líquidas estables comprenden dos o más alcoholes de azúcar, siendo la cantidad total del alcohol de azúcar en las vacunas líquidas estables del 10-30 % (p/v).
En realizaciones particulares de las vacunas de virus líquidas estable de la presente invención el alcohol de azúcar es sorbitol. En una realización alternativa de este tipo, el aditivo de azúcar es manitol. En realizaciones relacionadas, las vacunas líquidas estables comprenden adicionalmente un aditivo de azúcar que es un azúcar sin alcohol, en donde la cantidad total del alcohol de azúcar y el azúcar sin alcohol en la vacuna líquida estable es del 10-40 % (p/v). En realizaciones relacionadas la vacuna comprende del 10- 25 % (p/v) de alcohol de azúcar y del 5-20 % (p/v) de un azúcar sin alcohol. En realizaciones más particulares, la vacuna comprende del 10-20 % (p/v) de alcohol de azúcar y del 7,5-15 % (p/v) de un azúcar sin alcohol. En una de dichas realizaciones, el azúcar sin alcohol, el aditivo de azúcar es trehalosa. En otras realizaciones más, el azúcar sin alcohol, el aditivo de azúcar es dextrosa. En otras realizaciones más, el azúcar sin alcohol, el aditivo de azúcar es sacarosa. En una realización particular de este tipo, el aditivo de azúcar es una combinación de sacarosa (azúcar sin alcohol) y sorbitol (alcohol de azúcar). En una realización particular de este tipo, el aditivo de azúcar es una combinación de 10-20 % de sorbitol y 5-15 % de sacarosa. En una realización aún más particular de este tipo, el aditivo de azúcar es una combinación de 15 % de sorbitol y 10 % de sacarosa. En realizaciones particulares el azúcar sin alcohol, el aditivo de azúcar es realmente una combinación de dos o más de azúcar sin alcohol, aditivos de azúcar.
Las vacunas líquidas estables de la presente invención pueden variar en pH de pH 6,0 a pH 8,0. En determinadas realizaciones, el intervalo de pH es de pH 6,5 a pH 7,8. En realizaciones particulares el intervalo de pH es de pH 6,8 a pH 7,5. En realizaciones más particulares el intervalo de pH es de pH 7,0 a pH 7,4. En otra realización aún más particular el pH es de 7,2.
Las vacunas líquidas estables de la presente invención pueden comprender un tampón. En una realización particular de este tipo, el tampón comprende de 2,5 a 50 mM de fosfato, por ejemplo, fosfato sódico (NaPHOS) o fosfato potásico (KPHOS). En una realización relacionada, el tampón comprende de 5 a 25 mM de fosfato. En realizaciones particulares, el tampón comprende de 10 a 20 mM de fosfato.
En aún otras realizaciones el tampón (es decir, la solución de tampón) puede comprender de 0,15 a 0,75 M de arginina. En realizaciones particulares, el tampón comprende de 2,5 a 50 mM de fosfato y de 0,15 a 0,75 M de arginina. En realizaciones más particulares, el tampón comprende de 5 a 25 mM de fosfato y de 0,15 a 0,75 M de arginina. En realizaciones aún más particulares, el tampón comprende de 10 a 20 mM de fosfato y de 0,3 a 0,5 M de arginina. En otras realizaciones el tampón comprende de 2,5 a 50 mM de fosfato. En una realización relacionada, el tampón comprende de 5 a 25 mM de Tris. En realizaciones particulares, el tampón comprende de 10 a 20 mM de Tris. En realizaciones relacionadas el tampón Tris comprende histidina.
Las vacunas líquidas estables de la presente invención comprenden un aminoácido seleccionado de arginina, ácido glutámico, glicina y cualquier combinación de los mismos. En determinadas realizaciones como se ha detallado anteriormente, el aminoácido es arginina. En otras realizaciones, el aminoácido es glicina. En otras realizaciones más, el resto de aminoácido es ácido glutámico. En otras realizaciones, las vacunas líquidas estables comprenden tanto arginina como glicina. En otras realizaciones, las vacunas líquidas estables comprenden tanto ácido glutámico como glicina. En otras realizaciones más, las vacunas líquidas estables comprenden tanto ácido glutámico como arginina.
En realizaciones relacionadas, las vacunas líquidas estables comprenden arginina, ácido glutámico y glicina.
En realizaciones particulares, la concentración final de arginina o ácido glutámico, o glicina en la vacuna líquida estable es de 0,15 a 0,75 M. En realizaciones relacionadas, la concentración final de arginina, o ácido glutámico, o glicina en la vacuna líquida estable es de 0,25 a 0,75 M. En realizaciones más particulares, la concentración final de arginina o ácido glutámico, o glicina en la vacuna líquida estable es de 0,2 a 0,6 M. En realizaciones más particulares, la concentración final de arginina o ácido glutámico, o glicina en la vacuna líquida estable es de 0,2 a 0,5 M. En aún otras realizaciones, la concentración final de arginina, o ácido glutámico, o glicina en la vacuna líquida estable es de 0,25 a 0,45 M.
En otras realizaciones aún más particulares, la concentración final de arginina o ácido glutámico, o glicina en la vacuna líquida estable es de aproximadamente 0,45 M. En otras realizaciones particulares, la concentración final de arginina, o ácido glutámico, o glicina en la vacuna líquida estable es de aproximadamente 0,3 M.
En realizaciones particulares, la concentración combinada final de arginina junto con ácido glutámico y/o glicina en la vacuna líquida estable es de 0,15 a 0,75 M. En realizaciones relacionadas, la concentración final de arginina junto con ácido glutámico y/o glicina en la vacuna líquida estable es de 0,25 a 0,75 M. En otras realizaciones, la concentración combinada final de arginina junto con ácido glutámico y/o glicina en la vacuna líquida estable es de 0,2 a 0,6 M. En realizaciones más particulares, la concentración combinada final de arginina junto con ácido glutámico y/o glicina en la vacuna líquida estable es de 0,3 a 0,5 M. En aún otras realizaciones, la concentración final de arginina y ácido glutámico, o glicina en la vacuna líquida estable es de 0,25 a 0,45 M.
En otras realizaciones aún más particulares, la concentración combinada final de arginina junto con ácido glutámico y/o glicina en la vacuna líquida estable es de aproximadamente 0,45 M. En otras realizaciones particulares, la concentración final de arginina junto con ácido glutámico y/o glicina en la vacuna líquida estable es de aproximadamente 0,3 M.
Las vacunas líquidas estables de la presente invención también pueden comprender una proteína estabilizadora. La proteína estabilizadora puede una proteína intacta y/o un hidrolizado de proteína. En realizaciones particulares la proteína estabilizadora es gelatina. En realizaciones más particulares, la proteína estabilizadora contenida por la vacuna líquida estable de la presente invención es de 0,4 a 1,6 % de gelatina. En realizaciones alternativas la proteína estabilizadora es un hidrolizado de caseína entera. En realizaciones particulares, este tipo de proteína estabilizadora contenida por la vacuna líquida estable de la presente invención es del 0,5-2,0 % de un hidrolizado de caseína entera. En determinadas realizaciones, el hidrolizado de caseína entera es un hidrolizado proteolítico de caseína entera. En otras realizaciones más, la proteína estabilizadora contenida por la vacuna líquida estable de la presente invención es lactoglobulina o un hidrolizado de lactalbúmina.
Además, las vacunas líquidas estables de la presente invención también pueden adicionalmente comprender un agente quelante. Tales agentes pueden incluir, aunque sin limitación a: ácido etilendiaminatetraacético (EDTa ), citrato, ácido 1,2-bis(o-aminofenoxi)etano-N,N,N',N'-tetraacético (BAPTA), ácido etilenglicol tetraacético (EGTA), ácido dimercaptosuccínico (DMSA), ácido dietilentriamina pentaacético (DTPA) y ácido 2,3-dimercapto-1-propanosulfónico (DMPS). La concentración de tales agentes quelantes en las vacunas líquidas de la presente invención puede variar de aproximadamente 50 pM a 10 mM.
En realizaciones particulares el agente quelante es ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). En determinadas realizaciones de este tipo, la vacuna líquida estable comprende de 0,050 a 1 mM de EDTA. En realizaciones particulares, la vacuna líquida estable comprende de 0,25 a 0,75 mM de EDTA. En realizaciones más particulares la vacuna líquida estable comprende aproximadamente 0,5 mM de EDTA.
En determinadas realizaciones las vacunas líquidas estables de la presente invención pueden comprender adicionalmente uno o más neutralizantes de radicales libres y/o antioxidantes como un componente. En una realización particular de este tipo, una vacuna de la presente invención comprende ácido ascórbico. En una realización particular de este tipo, la vacuna líquida estable comprende aproximadamente 0,5 mM de ácido ascórbico. En una realización relacionada, la vacuna comprende a/fa-tocoferol. En una realización particular de este tipo, la vacuna líquida estable comprende aproximadamente 0,5 mM de a/fa-tocoferol. En otra realización más, la vacuna comprende glutatión. En una realización particular de este tipo, la vacuna líquida estable comprende aproximadamente 3 mM de glutatión. En otra realización más, la vacuna comprende a/fa-tocoferol y ácido ascórbico. En aún otra realización, la vacuna comprende tanto a/fa-tocoferol como glutatión. En otra realización más, la vacuna comprende tanto glutatión como ácido ascórbico. En aún otra realización, la vacuna comprende ácido ascórbico, a/fa-tocoferol y glutatión.
En realizaciones relacionadas, las vacunas líquidas estables de la presente invención se mantienen en recipientes sellados. En realizaciones particulares de este tipo, las vacunas líquidas estables de la presente invención se mantienen en recipientes sellados que tienen un gas inerte tal como argón, nitrógeno o helio, por encima del líquido (por ejemplo, se han rellenado con el gas inerte).
Las vacunas líquidas estables de la presente invención pueden comprender adicionalmente un adyuvante. En realizaciones particulares de este tipo, el adyuvante es fosfato de aluminio. En otras tales realizaciones, el adyuvante es hidróxido de aluminio. En otras realizaciones más, el adyuvante es un adyuvante de copolímero de bajo peso molecular que puede formar reticulación en solución para convertirse en un gel de alto peso molecular. En otras realizaciones más, el adyuvante está formado por partículas de gel de acrilato de sodio en agua. En aún otras realizaciones, el adyuvante es una combinación de dos o más de tales adyuvantes.
En realizaciones particulares, las vacunas líquidas estables de la presente invención pueden comprender adicionalmente un detergente y/o un tensioactivo. En determinadas realizaciones de este tipo el tensioactivo es un copolímero en bloque de polioxietileno-polioxipropileno. En una realización particular de este tipo, la vacuna líquida estable comprende aproximadamente el 0,01 % de copolímero en bloque de polioxietileno-polioxipropileno. En una realización específica de este tipo, el copolímero en bloque de polioxietileno-polioxipropileno es PLUr On IC®F-68.
Las vacunas líquidas estables de la presente invención comprenden un virus bovino vivo atenuado seleccionado del grupo que consiste en virus de diarrea vírica bovina (BVDV), virus de rinotraqueítis infecciosa bovina, virus paragripal tipo 3, virus sincitial respiratorio bovino, virus de la fiebre del valle del Rift y coronavirus respiratorio bovino y cualquier combinación de los mismos.
En determinadas realizaciones, el virus bovino vivo atenuado es virus de rinotraqueítis infecciosa bovina (IBR). En otras realizaciones, el virus vivo atenuado es virus de diarrea vírica bovina tipo 1 (BVDV1). En otras realizaciones más el virus bovino vivo atenuado es virus de diarrea vírica bovina tipo 2 (BVDV2). En aún otras realizaciones, el virus bovino vivo atenuado es virus de parainfluenza tipo 3 (PI3). En aún otras realizaciones, el virus vivo atenuado es virus sincitial respiratorio bovino (BRSV). En aún otras realizaciones, el virus bovino vivo atenuado es coronavirus respiratorio bovino (BRCV). En aún otras realizaciones, el virus bovino vivo atenuado es un virus de fiebre del valle del Rift (RVFV).
Además, la presente invención proporciona vacunas líquidas estables que son vacunas multivalentes. Las vacunas multivalentes de la presente invención pueden contener cualquier combinación de virus bovinos. En determinadas realizaciones las vacunas multivalentes de la presente invención comprenden tanto virus bovinos inactivados y virus bovinos vivos atenuados. En una realización particular de este tipo, la vacuna multivalente comprende BVDV1 inactivado, BVDV2 inactivado y IBR inactivado, junto con PI3 vivo atenuado y BRSV vivo atenuado. En una realización relacionada, la vacuna multivalente comprende BVDV1 inactivado, BVDV2 inactivado y IBR inactivado, junto con PI3 vivo atenuado, BRSV vivo atenuado y BRCV vivo atenuado.
En otras realizaciones las vacunas multivalentes de la presente invención comprenden solo virus bovinos vivos atenuados. En realizaciones particulares, la vacuna multivalente comprende BVDV1 vivo atenuado y BVDV2 vivo atenuado. En otras realizaciones, la vacuna multivalente comprende BVDV1 vivo atenuado e IBR. En otras realizaciones más, la vacuna multivalente comprende BVDV1 vivo atenuado y PI3. En otras realizaciones más, la vacuna multivalente comprende BVDV1 vivo atenuado y BRSV vivo atenuado. En otras realizaciones más, la vacuna multivalente comprende BVDV1 vivo atenuado y BRCV vivo atenuado. En otras realizaciones, la vacuna multivalente comprende BVDV2 vivo atenuado y IBR vivo atenuado. En otras realizaciones más, la vacuna multivalente comprende BVDV2 vivo atenuado y PI3 vivo atenuado. En otras realizaciones más, la vacuna multivalente comprende BVDV2 vivo atenuado y BRSV vivo atenuado. En otras realizaciones más, la vacuna multivalente comprende BVDV2 vivo atenuado y BRCv vivo atenuado. En otras realizaciones más, la vacuna multivalente comprende IBR vivo atenuado y PI3 vivo atenuado. En otras realizaciones más, la vacuna multivalente comprende IBR vivo atenuado y BRSV vivo atenuado. En otras realizaciones más, la vacuna multivalente comprende IBR vivo atenuado y BRCV vivo atenuado. En otras realizaciones más, la vacuna multivalente comprende PI3 vivo atenuado y BRSV vivo atenuado. En otras realizaciones más, la vacuna multivalente comprende PI3 vivo atenuado y BRCV vivo atenuado. En otras realizaciones más, la vacuna multivalente comprende BRSV vivo atenuado y BRCV vivo atenuado.
En otras realizaciones más, la vacuna multivalente comprende RVFV vivo atenuado y BVDV1 vivo atenuado. En otras realizaciones más, la vacuna multivalente comprende RVFV vivo atenuado y BVDV2 vivo atenuado. En otras realizaciones, la vacuna multivalente comprende RVFV vivo atenuado e IBR. En otras realizaciones más, la vacuna multivalente comprende RVFV vivo atenuado y PI3. En otras realizaciones más, la vacuna multivalente comprende RVFV vivo atenuado y BRSV vivo atenuado. En otras realizaciones más, la vacuna multivalente comprende RVFV vivo atenuado y BRCV vivo atenuado.
En realizaciones relacionadas, la vacuna multivalente comprende BVDV1 vivo atenuado, BVDV2 vivo atenuado y virus IBR vivo atenuado. En aún otras realizaciones, la vacuna multivalente comprende BVDV1 vivo atenuado, BVDV2 vivo atenuado y virus PI3 vivo atenuado. En aún otras realizaciones, la vacuna multivalente comprende BVDV1 vivo atenuado, BVDV2 vivo atenuado y BRSV vivo atenuado. En aún otras realizaciones, la vacuna multivalente comprende BVDV1 vivo atenuado, BVDV2 vivo atenuado y BRCV vivo atenuado. En otras realizaciones, la vacuna multivalente comprende BVDV1 vivo atenuado, virus IBR vivo atenuado y virus PI3 vivo atenuado. En aún otras realizaciones, la vacuna multivalente comprende BVDV1 vivo atenuado, virus IBR vivo atenuado y BRSV vivo atenuado. En aún otras realizaciones, la vacuna multivalente comprende BVDV1 vivo atenuado, virus IBR vivo atenuado y BRCV vivo atenuado. En aún otras realizaciones, la vacuna multivalente comprende BVDV2 vivo atenuado, virus IBR vivo atenuado y virus PI3 vivo atenuado. En aún otras realizaciones, la vacuna multivalente comprende BVDV2 vivo atenuado, virus IBR vivo atenuado y BRSV vivo atenuado. En aún otras realizaciones, la vacuna multivalente comprende BVDV2 vivo atenuado, virus IBR vivo atenuado y BRCV vivo atenuado. En aún otras realizaciones, la vacuna multivalente comprende BVDV1 vivo atenuado, virus PI3 vivo atenuado y BRSV vivo atenuado.
En aún otras realizaciones, la vacuna multivalente comprende BVDV1 vivo atenuado, virus PI3 vivo atenuado y BRCV vivo atenuado. En aún otras realizaciones, la vacuna multivalente comprende BVDV2 vivo atenuado, virus PI3 vivo atenuado y BRSV vivo atenuado. En aún otras realizaciones, la vacuna multivalente comprende BVDV2 vivo atenuado, virus PI3 vivo atenuado y BRCV vivo atenuado. En aún otras realizaciones, la vacuna multivalente comprende BVDV1 vivo atenuado, BRSV vivo atenuado y BRCV vivo atenuado. En aún otras realizaciones, la vacuna multivalente comprende BVDV2 vivo atenuado, BRSv vivo atenuado y BRCV vivo atenuado.
En otras realizaciones más, la vacuna multivalente comprende IBR vivo atenuado, PI3 vivo atenuado y BRSV vivo atenuado. En otras realizaciones más, la vacuna multivalente comprende IBR vivo atenuado, PI3 vivo atenuado y BRCV vivo atenuado. En otras realizaciones más, la vacuna multivalente comprende IBR vivo atenuado, BRSV vivo atenuado y BRCV vivo atenuado. En otras realizaciones más, la vacuna multivalente comprende PI3 vivo atenuado, BRSV vivo atenuado y BRCV vivo atenuado.
En otras realizaciones, la vacuna multivalente comprende BVDV1 vivo atenuado, BVDV2 vivo atenuado, virus IBR vivo atenuado y virus PI3 vivo atenuado. En aún otras realizaciones, la vacuna multivalente comprende BVDV1 vivo atenuado, BVDV2 vivo atenuado, virus IBR vivo atenuado y BRSV vivo atenuado. En aún otras realizaciones, la vacuna multivalente comprende BVDV1 vivo atenuado, BVDV2 vivo atenuado, virus IBR vivo atenuado y BRCV vivo atenuado. En aún otras realizaciones, la vacuna multivalente comprende BVDV1 vivo atenuado, BVDV2 vivo atenuado, virus PI3 vivo atenuado y BRSV vivo atenuado. En aún otras realizaciones, la vacuna multivalente comprende BVDV1 vivo atenuado, BVDV2 vivo atenuado, virus PI3 vivo atenuado y BRCV vivo atenuado. En aún otras realizaciones, la vacuna multivalente comprende BVDV1 vivo atenuado, BVDV2 vivo atenuado, BRCV vivo atenuado y BRCV vivo atenuado.
En aún otras realizaciones, la vacuna multivalente comprende BVDV1 vivo atenuado, virus IBR vivo atenuado, virus PI3 vivo atenuado y BRSV vivo atenuado. En aún otras realizaciones, la vacuna multivalente comprende BVDV1, virus IBR vivo atenuado, virus PI3 vivo atenuado y BRCV vivo atenuado. En aún otras realizaciones, la vacuna multivalente comprende BVDV1, virus PI3 vivo atenuado, BRSV vivo atenuado y BRCV vivo atenuado. En aún otras realizaciones, la vacuna multivalente comprende BVDV2 vivo atenuado, virus IBR vivo atenuado, virus PI3 vivo atenuado y BRSV vivo atenuado. En aún otras realizaciones, la vacuna multivalente comprende BVDV2, virus IBR vivo atenuado, virus PI3 vivo atenuado y BRCV vivo atenuado. En aún otras realizaciones, la vacuna multivalente comprende BVDV2, virus PI3 vivo atenuado, BRSV vivo atenuado y BRCV vivo atenuado. En aún otras realizaciones, la vacuna multivalente comprende IBR vivo atenuado, virus PI3 vivo atenuado, BRSV vivo atenuado y BRCV vivo atenuado.
En aún otras realizaciones, la vacuna multivalente comprende BVDV1 vivo atenuado, BVDV2 vivo atenuado, virus IBR vivo atenuado, virus PI3 vivo atenuado y BRSV vivo atenuado. En aún otras realizaciones, la vacuna multivalente comprende BVDV1 vivo atenuado, BVDV2 vivo atenuado, virus IBR vivo atenuado, virus PI3 vivo atenuado y BRCV vivo atenuado. En aún otras realizaciones, la vacuna multivalente comprende BVDV1 vivo atenuado, BVDV2 vivo atenuado, virus IBR vivo atenuado, BRSV vivo atenuado y BRCV vivo atenuado. En aún otras realizaciones, la vacuna multivalente comprende BVDV1 vivo atenuado, BVDV2 vivo atenuado, virus PI3 vivo atenuado, BRSV vivo atenuado y BRCV vivo atenuado. En aún otras realizaciones, la vacuna multivalente comprende BVDV1 vivo atenuado, virus IBR vivo atenuado, virus PI3 vivo atenuado, BRSV vivo atenuado y BRCV vivo atenuado. En aún otras realizaciones, la vacuna multivalente comprende BVDV2 vivo atenuado, virus IBR vivo atenuado, virus PI3 vivo atenuado, BRSV vivo atenuado y BRCV vivo atenuado. En realizaciones particulares de este tipo, la vacuna multivalente comprende BVDV1 vivo atenuado, BVDV2 vivo atenuado, virus PI3 vivo atenuado, virus IBR vivo atenuado, BRSV vivo atenuado y BRCV vivo atenuado.
Las vacunas líquidas estables de la presente invención pueden comprender adicionalmente un virus y/o bacteria inactivada (por ejemplo, una bacterina o una bacteria atenuada) y/o una subfracción de una bacterina.
Por consiguiente, cualquiera de las vacunas líquidas estables de la presente invención que comprenden una o más vacunas de virus vivo pueden comprender adicionalmente un virus inactivado y/o atenuado o bacteria inactivada y/o una subfracción de una bacterina, por ejemplo, con uno o más de antígenos bacterianos atenuados o inactivados tales como Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica, Histophilus somni y Mycoplasma bovis.
La presente invención es adecuada para su uso en métodos de ayuda en la protección de un bovino frente a una enfermedad clínica que aparece a partir de una infección de virus bovino que comprende la administración de una vacuna de la presente invención al animal. Por consiguiente, la presente invención es adecuada para su uso en métodos que comprenden la administración a un bovino cualquier vacuna líquida estable de la presente invención. En determinadas realizaciones, la administración se realiza mucosamente (por ejemplo, mediante vía intranasal u oral). En otras realizaciones, la administración se realiza parenteralmente. En aún otras realizaciones, la administración se realiza intradérmicamente. En aún otras realizaciones, la administración se realiza transdérmicamente. En realizaciones más específicas, una vacuna de la presente invención se administra al animal subcutáneamente. En otras realizaciones específicas, una vacuna de la presente invención se administra al animal intramuscularmente. La presente invención puede usarse como vacunas principales y/o de refuerzo.
En realizaciones particulares, el método comprende la administración a un bovino una vacuna líquida estable de la presente invención que comprende un virus vivo atenuado. En determinadas realizaciones, el método de vacunación de un bovino es frente a uno o más virus que incluyen BVDV1, y/o BVDV2, y/o IBR, y/o PI3, y/o BRSV, y/o RVFV, y/o BRCV, y/o cualquier combinación de los mismos y frente a una bacteria frente a Pasteurella multocida, y/o Mannheimia haemolytica, y/o Histophilus somni y/o Mycoplasma bovis y/o cualquier combinación de los mismos, que comprende la combinación de una vacuna líquida estable que comprende BVDV1, y/o BVDV2, y/o IBR, y/o PI3, y/o BRSv , y/o RVFV, y/o BRCV y/o cualquier combinación de los mismos, con una formulación bacteriana que comprende Pasteurella multocida, y/o Mannheimia haemolytica, y/o Histophilus somni, y/o Mycoplasma bovis y/o cualquier combinación de los mismos para formar una vacuna de combinación y, a continuación, la administración de la vacuna de combinación al bovino.
En una realización específica, la vacuna líquida estable comprende BVDV1 vivo atenuado, BVDV2 vivo atenuado y virus IBR vivo atenuado. En otras realizaciones, la vacuna líquida estable comprende BVDV1 vivo atenuado, BVDV2 vivo atenuado, virus PI3 vivo atenuado y BRSV vivo atenuado. En otras realizaciones más, la vacuna líquida estable comprende BVDV1 vivo atenuado, BVDV2 vivo atenuado, virus PI3 vivo atenuado, virus IBR vivo atenuado y BRSV vivo atenuado. En otras realizaciones más, la vacuna líquida estable comprende BVDV1 vivo atenuado, BVDV2 vivo atenuado, virus PI3 vivo atenuado, virus IBR vivo atenuado, BRSV vivo atenuado y BRCV vivo atenuado.
Cualquiera de las vacunas de virus bovino vivo atenuado líquidas estables de la presente invención también se puede combinar con uno o más antígenos bacterianos atenuados o inactivados tales como Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica, Histophilus somni y Mycoplasma bovis. En determinadas realizaciones, el/los antígeno(s) bacteriano(s) es una formulación por separado, por ejemplo, una vacuna, antes de combinarse con la vacuna de virus bovino vivo atenuado líquida estable de la presente invención y la posterior administración de la vacuna combinada al sujeto animal.
En una realización particular, la vacuna líquida estable comprende BVDV1 vivo atenuado, BVDV2 vivo atenuado, virus PI3 vivo atenuado, virus IBR vivo atenuado y BRSV vivo atenuado (más o menos BRCV vivo atenuado) que se combina con Pasteurella multocida vivo atenuado, Mannheimia haemolytica vivo atenuado y Histophilus somni vivo atenuado. En realizaciones particulares de este tipo, la vacuna de virus líquida estable y la vacuna bacteriana viava atenuada se almacenan en recipientes por separado y se combinan antes de la administración de la vacuna combinada al sujeto animal.
En el presente documento se describen kits que comprenden un primer recipiente que comprende una vacuna de virus bovino vivo atenuado líquida estable de la presente invención y un segundo recipiente que comprende una vacuna bacteriana bovina. En una tal realización el primer recipiente comprende una vacuna de virus bovino vivo atenuado líquida estable que comprende uno o más de BVDV1 vivo atenuado, un BVDV2 vivo atenuado, un virus PI3 vivo atenuado, un virus IBR vivo atenuado, un BRSV vivo atenuado, un RVFV vivo atenuado o un BRCV vivo atenuado y el segundo recipiente comprende una vacuna bacteriana bovina que comprende uno o más de un Pasteurella multocida, un Mannheimia haemolytica, un Mycoplasma bovis y un Histophilus somni. En determinadas realizaciones, la vacuna bacteriana bovina se almacena como un liofilizado. En realizaciones particulares, la vacuna bacteriana bovina es una vacuna bacteriana bovina viva en la que todos los antígenos bacterianos son antígenos vivos atenuados. En otras realizaciones, la vacuna bacteriana bovina comprende al menos un antígeno bacteriano inactivado. En una realización más particular de este tipo todos los antígenos bacterianos son antígenos bacterianos inactivados. En determinadas realizaciones, el kit también contiene instrucciones sobre el modo de almacenamiento y/o combinación y/o modo de administración de las vacunas del kit.
También se proporcionan métodos de fabricación de cualquiera y todas las vacunas líquidas estables de la presente invención. En determinadas realizaciones, el método comprende la combinación de un cantidad terapéuticamente eficaz de un virus vivo atenuado con un 5-40 % de aditivo de azúcar, (por ejemplo, alcohol de azúcar o una combinación de un alcohol de azúcar con un azúcar sin alcohol), un aminoácido y una solución tamponada a un pH 6,0 a pH 8,0 para formar una vacuna líquida estable, en donde el aminoácido puede ser arginina, glicina, ácido glutámico o combinaciones de arginina, glicina y/o ácido glutámico. La arginina y/o glicina y/o ácido glutámico tiene una concentración final de 0,15 a 0,75 M en la vacuna líquida estable. En realizaciones particulares, la cantidad terapéuticamente eficaz de un virus vivo atenuado es una cantidad terapéuticamente eficaz de un virus bovino vivo atenuado. En realizaciones específicas de este tipo, la cantidad terapéuticamente eficaz de un virus bovino vivo atenuado incluye cantidades terapéuticamente eficaces de BVDV1 vivo atenuado, BVDV2 vivo atenuado, virus PI3 vivo atenuado, virus IBR vivo atenuado y BRSV vivo atenuado. En una realización particular de este tipo, la cantidad terapéuticamente eficaz de un virus bovino vivo atenuado incluye cantidades terapéuticamente eficaces de BVDV1 vivo atenuado, BVDV2 vivo atenuado, virus PI3 vivo atenuado, virus IBR vivo atenuado, BRSV vivo atenuado y BRCV vivo atenuado.
La presente invención proporciona adicionalmente métodos de almacenamiento de cualquiera de las vacunas de virus bovino líquidas estables de la presente invención durante un período de 9 meses, o 12 meses, o 15 meses, o 18 meses, o 24 meses, o 30 meses, o incluso más tiempo que comprende tomar una vacuna de virus bovino líquida estable de la presente invención y almacenarla a entre aproximadamente 0 °C a aproximadamente 7 °C durante 9 meses, o 12 meses, o 15 meses, o 18 meses, o 24 meses, o 30 meses o incluso más tiempo, permaneciendo la vacuna de virus bovino líquida estable eficaz durante todo el respectivo tiempo de almacenamiento de 9 meses, o 12 meses, o 15 meses, o 18 meses, o 24 meses, o 30 meses, o incluso más tiempo.
Estos y otros aspectos de la presente invención se comprenderán mejor en referencia a la siguiente descripción detallada.
Descripción detallada de la invención
Puesto que las vacunas de virus bovino líquidas estables de la presente invención comprenden virus bovinos vivos atenuados, hasta la fecha, se hubiera necesitado un cuidado particular durante la formulación de la vacuna para mantener el título de los virus atenuados a un nivel que sea seguro por debajo del cual puede llevar a un evento adverso significativo. De hecho, la mayoría de vacunas de virus bovino vivo atenuado se liofilizan y la liofilización puede llevar a disminuciones sustanciales en la eficacia de las vacunas de virus vivo atenuado tanto debido al proceso de liofilización sí mismo, así como con el tiempo durante un almacenamiento de largo plazo.
La presente invención ha superado este problema proporcionando vacunas bovinas líquidas estables que permanecen eficaces, incluso durante su almacenamiento, sin necesidad de aumentar el título inicial del antígeno vírico vivo atenuado por encima de un nivel fiablemente seguro. Como beneficio adicional, la presente invención proporciona un medio para disminuir los costes de fabricación de las vacunas proporcionado mediante la reducción significativa de la cantidad de virus bovinos vivos atenuados necesarios para fabricar tal vacuna segura y eficaz. Además, las vacunas de virus bovino vivo atenuado de la presente invención son más convenientes de usar que sus homólogos liofilizados. Por consiguiente, la presente invención proporciona vacunas de virus bovino vivo atenuado seguras y eficaces que pueden almacenarse como líquidos a temperaturas refrigeradas y aún permanecer estables durante de 12 a 18 meses y/o de 18 a 24 meses y/O incluso más tiempo.
Más sorprendentemente, las vacunas de virus bovino vivo líquidas estables pueden incluir virus bovinos de cualquier tipo. Por lo tanto, las vacunas de virus vivo líquidas estables pueden incluir virus bovinos tanto con envoltura como sin envoltura. Además, las vacunas de virus vivo líquidas estables de la presente invención pueden incluir virus bovinos vivos atenuados que tienen genomas de ARN unicatenarios, genomas de ADN unicatenarios o genomas de ADN bicatenarios. Además, en casos particulares, por ejemplo, con el uso de RVFV vivo atenuado, también se pueden usar vacunas de virus bovino vivo líquidas estables para vacunas ovejas y cabras.
El uso de términos en singular por la conveniencia en la descripción no está, de ningún modo, previsto para que sea limitante. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a un “aditivo de azúcar” incluye referencia a uno o más de tales aditivos de azúcar, a menos que se especifique de otra manera. El uso del término el plural tampoco pretende ser limitante, a menos que se especifique de otra manera. De forma similar, un compuesto químico que puede referirse como un ácido o su base correspondiente, a menos que se especifique de otro modo, cuando se denota en el presente documento está previsto para significar cualquier forma del compuesto. Por lo tanto, el uso del término ácido glutámico se refiere para incluir glutamato y viceversa.
Como se usa en el presente documento, una "vacuna" es una composición que es adecuada para su aplicación a un animal (que incluye, en determinadas realizaciones, seres humanos) que cuando se administra al animal induce una respuesta inmunitaria lo suficientemente fuerte para ayudar mínimamente en la protección de una enfermedad clínica que surge de una infección con un microorganismo de tipo silvestre, es decir, los suficientemente fuerte para ayudar en la prevención de la enfermedad clínica y/o previniendo, aliviando o curando la enfermedad clínica. A menos que se indique expresamente lo contrario, el uso del término vacuna incluye vacunas multivalentes.
Como se usan en el presente documento, una "vacuna multivalente" es una vacuna que comprende dos o más antígenos diferentes. En una realización particular de este tipo, la vacuna multivalente estimula el sistema inmunitario del destinatario frente a dos o más patógenos diferentes.
Como se usan en el presente documento, una vacuna "líquida estable" es una vacuna mantenida como un líquido (incluida una vacuna multivalente líquida) que permanece eficaz durante al menos un año cuando se almacena a o por debajo de 7 °C (por ejemplo, en un refrigerador estándar, y/o a 0 °C - 7 °C). En realizaciones particulares, una vacuna líquida estable permanece eficaz cuando se almacena a o por debajo de 7 °C durante al menos 1,5 años. En realizaciones más particulares, una vacuna líquida estable permanece eficaz cuando se almacena a o por debajo de 7 °C durante al menos 2 años. En realizaciones aún más particulares una vacuna líquida estable permanece eficaz cuando se almacena a o por debajo de 7 °C durante al menos 2,5 a 3 años.
Como se usan en el presente documento, los términos "proteger", "que protege", "proporcionar protección ", "que proporciona protección a" y "ayuda en la protección" no requieren la protección completa de cualquier indicación de infección. Por ejemplo, "ayuda en la protección" puede significar que la protección es suficiente de modo que, después del estímulo, los síntomas de la infección subyacente son al menos reducidos, y/o al menos una o más de las causas o mecanismos celulares, fisiológicas, o bioquímicas subyacentes que causan los síntomas se reducen y/o eliminan. Se comprende que "reducido" tal como se usa en este contexto, significa con respecto al estado de la infección, incluyendo el estado molecular de la infección, no solo el estado fisiológico de la infección.
El término "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a la cantidad de una composición que cuando se administra a un bovino reduce significativamente la probabilidad y/o grado de una infección/infestación debido a un patógeno dado.
"Metafilaxis" es la medicación en masa en tiempo de un grupo entero de animales para eliminar o minimizar un brote inesperado de enfermedad, por ejemplo, en uno o más animales con alto riesgo de infección/infestación. En una realización particular, terneros con alto riesgo son ganado con poco peso, mezclados, de largo recorrido con historiales de salud desconocidos.
El término "quimioprofilaxis" se refiere a la administración de un medicamento/tratamiento, por ejemplo, una o más composiciones profilácticas, con el fin de prevenir o reducir la infección/infestación vírica, bacteriana y/o parasitaria; y/o prevenir o reducir enfermedades y/o síntomas asociados con esa infección/infestación.
El término "composición profiláctica" se refiere a cualquier agente usado de forma singular o en combinación con otros agentes que reduce significativamente la probabilidad y/o grado de una infección/infestación debido a un patógeno dado en un bovino. En una tal realización el bovino se encuentra en alto riesgo de desarrollar enfermedad respiratoria bovina, después del mezclado, transporte, cambios temporales, cambios en la nutrición y/u otros factores estresantes que pueden iniciar un síntoma y/o enfermedad relacionada con la presencia de los patógenos víricos, bacterianos o parasitarios comúnmente asociados con bovinos, dirigidos por el agente o combinación de agentes.
Como se usan en el presente documento, la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" es una cantidad de un antígeno dado, por ejemplo, un virus bovino vivo atenuado, que es suficiente para proporcionar protección y/o ayuda en la protección del patógeno frente al cual protege el antígeno que está siendo administrado, cuando se proporciona en una única administración y/o cuando realmente, se proporciona como una administración inicial con una o más administración/es de refuerzo posterior(es).
Como se usan en el presente documento, una vacuna "eficaz" comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un antígeno dado. Una vacuna "eficaz" retiene título suficiente para un antígeno dado para que cumpla con los requisitos reguladores de ese antígeno según la jurisdicción donde se administra la vacuna, por ejemplo, la administración de una vacuna en los Estados Unidos está regida por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA).
Como se usan en el presente documento, el término "farmacéuticamente aceptable" se usa de forma adjetiva para referirse a que el nombre modificado es adecuado para su uso en un producto farmacéutico. Cuando se usa, por ejemplo, para describir un excipiente en una vacuna farmacéutica, caracteriza el excipiente como que es compatible con los otros ingredientes de la composición y no desventajosamente perjudicial para el destinatario previsto.
El término "transportador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el compuesto. Tales transportadores farmacéuticamente aceptables pueden ser líquidos estériles, tales como agua y/o aceites, incluidos aquellos de origen en el petróleo, animales, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Agua o soluciones salinas de soluciones acuosas y azúcar acuoso, por ejemplo, soluciones de dextrosa y/o glicerol se pueden emplear como transportadores, particularmente para soluciones inyectables. Además, el transportador puede ser y/o comprender una solución hidrocoloide y/o polimérica, por ejemplo, para espesar las vacunas bovinas que se deben pulverizar sobre el ganado bovino, por ejemplo, terneros.
Como se usan en el presente documento, un "adyuvante" es una sustancia que es capaz de favorecer o amplificar la cascada de episodios inmunológicos, llevando finalmente a una mejor respuesta inmunológica, es decir, la respuesta corporalmente integrada a un antígeno. Un adyuvante, en general, no se requiere para que se produzca la respuesta inmunológica, pero favorece o amplifica esta respuesta.
Como se usan en el presente documento, "administración sistémica" es la administración en el sistema circulatorio del organismo (que comprende el sistema cardiovascular y linfático), afectando, de este modo, el organismo en su totalidad en lugar de un locus específico tal como el tracto gastrointestinal (mediante, por ejemplo, administración por vía oral o rectal) y el sistema respiratorio (mediante, por ejemplo, administración por vía intranasal). La administración sistémica puede realizarse, por ejemplo, administrándose a tejido muscular (intramuscular), en la dermis (intradérmica, transdérmica o supradérmica), por debajo de la piel (subcutánea), por debajo de la mucosa (submucosa), en las venas (intravenosa) etc.
"Administración parenteral" incluye inyecciones subcutáneas, inyecciones submucosas, inyecciones intravenosas, inyecciones intramusculares, inyecciones intradérmicas e infusión.
Tal como se usa en el presente documento "aditivo de azúcar" es un azúcar de 5 a 12 carbonos (por ejemplo, sacarosa, maltosa, trehalosa, dextrosa, lactosa, glucosa, fructosa, galactosa) o alcohol/poliol de azúcar (por ejemplo, sorbitol, manitol, arabitol, inositol, maltitol). Salvo que se indique específicamente lo contrario, el porcentaje (%) del aditivo de azúcar se proporciona como un peso (p) del aditivo de azúcar con respecto al volumen (v) de la vacuna, (p/v) en la vacuna.
Como se usa en el presente documento "azúcar no reductor" es un aditivo de azúcar que en medio acuoso básico no genera ningún compuesto que contiene un grupo aldehído. Ejemplos de azúcares no reductores incluyen sacarosa y trehalosa.
Como se usan en el presente documento, los términos "alcohol sin azúcar" y "azúcar sin alcohol" se usan indistintamente. Un aditivo de azúcar que es un "alcohol sin azúcar" (o "azúcar sin alcohol") tal como se usan en el presente documento, puede ser cualquier aditivo de azúcar que no es un alcohol de azúcar, por ejemplo, un azúcar no reductor.
Como se usa en el presente documento, salvo que se indique específicamente lo contrario, el porcentaje (%) de un aditivo sólido, por ejemplo, aditivo de azúcar o gelatina, en una vacuna se basa en una solución del 1 % siendo 1 g de sólido/100 ml de volumen de vacuna (p/v).
Como se usa en el presente documento, salvo que se indique específicamente lo contrario, el porcentaje (%) de un aditivo líquido, por ejemplo, etanol, en una vacuna se basa en una solución del 1 % siendo 1 ml de aditivo líquido/100 ml de volumen de vacuna (v/v).
Como se usa en el presente documento, el término, "aproximadamente", se usa indistintamente con el término "aproximadamente " y significa, en general, que un valor se encuentra dentro del veinticinco por ciento del valor indicado. salvo que se indique lo contrario, por ejemplo, una concentración de "aproximadamente" 2 mM de EDTA puede ser de 1,5 mM a 2,5 mM de EDTA.
Como se usa en el presente documento, salvo que se indique específicamente lo contrario, el valor del pH proporcionado es el valor pH determinado/medido a 25 °C.
Puesto que las vacunas líquidas estables de la presente invención varían idealmente en pH de pH 6,0 a pH 8,0, las vacunas líquidas estables de la presente invención pueden comprender un tampón. Los tampones para su uso en las vacunas líquidas estables de la presente invención incluyen, aunque no de forma limitante: fosfato de potasio, fosfato de sodio, Tris, Tris-Histidina, BIS-Tris, BIS-Tris-Propano, pirofosfato de sodio o potasio, imidazol, PIPES, ACES, MOPS, MOPSO, BES, TES, tricina, glicilglicina y HEPES. Los tampones pueden llevarse al pH deseado con el uso de cualquier contraión adecuado.
El hidrolizado de caseína entera que se puede usar en las vacunas líquidas estables de la presente invención puede obtenerse mediante una cantidad de procedimientos que incluyen, por ejemplo, como un hidrolizado de ácido o un hidrolizado enzimático. Tales hidrolizados contienen en la forma de aminoácidos mezclados y péptidos que tienen todos los aminoácidos originalmente presentes en la caseína. Un hidrolizado pancreático de caseína entera que se puede usar en las vacunas líquidas estables de la presente invención se comercializa como CASEIN HYDROLYSATE ENZYMATIC® por MP Biomedicals. Productos comparables se comercializan con el nombre de NZ-AMINE®, NZ-AMINE® A, NZ-AMINE® AS, y NZ-AMINE® B, y Tryptone bpor Sigma-Aldrich.
Ejemplos de hidrocoloides que pueden estar comprendidos por las vacunas de la presente invención incluyen: gelatina, polímeros de almidón y gomas, tales como goma xantano, carragenina y goma arábiga (goma de acacia).
Vacunas multivalentes: La presente invención proporciona vacunas multivalentes líquidas estables. Una vacuna bovina multivalente líquida estable de la presente invención puede incluir dos o más antígenos que incluyen uno o más de los siguientes virus bovinos vivos atenuados: BVDV1, BVDV2, virus PI3, virus IBR, BRSV, RVFV y/o BRCV. Tal como se ha señalado anteriormente, una vacuna bovina multivalente líquida estable de la presente invención también puede incluir uno o más de los siguientes virus: BVDV1, BVDV2, virus PI3, virus IBR, BRSV, RVFV y/o BRCV, junto con uno o más virus bovinos inactivados.
Además, una vacuna de virus bovino vivo atenuado líquida estable de la presente invención puede incluir uno o más antígenos bacterianos vivos atenuados o inactivados. En realizaciones relacionadas, La vacuna líquida estable de la presente invención se puede combinar con uno o más antígenos bacterianos vivos atenuados o inactivados a veces antes de su administración, pero posteriormente a su almacenamiento. En realizaciones específicas de este tipo, el/los antígeno(s) bacteriano(s) está(n) comprendido(s) por una vacuna (o bien monovalente o bien multivalente) y esa vacuna bacteriana bovina se combina con una vacuna de virus bovino vivo atenuado líquida estable de la presente invención antes de su administración. En una realización más específica, la vacuna de virus bovino vivo atenuado líquida estable puede usarse para licuar/solubilizar una vacuna bacteriana bovina secada por congelación antes de la administración de la vacuna combinada al sujeto animal. En otras realizaciones más, la vacuna de virus bovino vivo atenuado líquida estable y la vacuna bacteriana bovina atenuada y/o inactivada se administran secuencialmente.
Por consiguiente, una vacuna de virus bovino vivo atenuado líquida estable de la presente invención se puede combinar con una o más vacunas bacterianas vivas atenuadas o inactivadas que comprende un antígeno tal como Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica, Histophilus somni y Mycoplasma bovis antes de su administración al sujeto animal. Por lo tanto, en determinadas realizaciones la vacuna bacteriana atenuada comprende un Mannheimia hemolytica atenuado. En realizaciones particulares de este tipo, el Mannheimia hemolytica atenuado es un eliminador de leucotoxinas. En una realización específica de este tipo, el Mannheimia hemolytica atenuado es un Mannheimia hemolytica vivo avirulento en el que el gen que codifica la leucotoxina A se modificó para que le faltara la secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 34-378 de la proteína de leucotoxina A [véase, U.S. 6.331.303 B1].
En aún otras realizaciones la vacuna bacteriana atenuada comprende un Pasteurella multocida atenuado. En realizaciones más particulares, el Pasteurella multocida comprende una deleción en su gen hyaE. En una realización específica de este tipo, el Pasteurella multocida un Pasteurella multocida vivo avirulento en el que el gen que codifica la proteína hyaE se modificó para que le faltara la secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 239-359 de la proteína hyaE y/o que le faltan los nucleótidos 718-1084 [véase, U.S. 7.351.416 B2]. En aún otras realizaciones la vacuna bacteriana atenuada comprende un Histophilus somni atenuado. En realizaciones más particulares, el Histophilus somni es un Histophilus somni vivo avirulento que es un mutante de aroA.
En realizaciones particulares de los métodos de la presente invención, la vacuna bacteriana atenuada comprende tanto Mannheimia hemolytica atenuado como Pasteurella multocida atenuado. En una realización más específica, la composición antibacteriana es una vacuna bacteriana atenuada que comprende Mannheimia hemolytica vivo avirulento en el que gen que codifica la leucotoxina A se modificó para que le faltara la secuencia de nucleótidos que codifica aminoácidos 34-378 de la proteína de leucotoxina A y un Pasteurella multocida vivo avirulento en el que el gen que codifica la proteína hyaE se modificó para que le faltara la secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 239-359 de la proteína hyaE y/o que le faltan los nucleótidos 718-1084. En realizaciones más particulares de los métodos de la presente invención, la vacuna bacteriana atenuada comprende un Mannheimia hemolytica atenuado, un Pasteurella multocida atenuado, y un Histophilus somni avirulento.
Adyuvantes: Como se indicó anteriormente, las vacunas de la presente invención también pueden incluir un adyuvante. En realizaciones particulares, el adyuvante comprende una sal de aluminio. Se ha descrito el uso de sales de aluminio junto con las vacunas vírivas vivas. En realizaciones particulares, la sal de aluminio se escoge del grupo que consiste en fosfato de aluminio, fosfato de potasio de aluminio e hidróxido de aluminio. Otros adyuvantes bien conocidos incluyen aceites de hidrocarburo y saponinas. Un adyuvante de fosfato de aluminio es REHYDROPHOS® (General Chemical, Parsippany, Nueva Jersey). Ejemplos de adyuvantes de hidróxido de aluminio incluyen: REHYDROGEL®, REHYDROGEL® HPA o REHYDRo Ge L® LV (General Chemical, Parsippany, Nueva Jersey). Otros adyuvantes bien conocidos incluyen aceites de hidrocarburo, polímeros, saponinas y/o un adyuvante está formado por partículas de gel de acrilato de sodio en agua, por ejemplo, MONTANIDE™ PET GEL A™ (Seppic, París, Francia). Un adyuvante de copolímero de bajo peso molecular puede formar reticulación en solución para convertirse en un gel de alto peso molecular, por ejemplo, POLYGEN™ (MVP Laboratories, Omaha). Cuando se añade, la cantidad de adyuvante es normalmente entre aproximadamente el 1 % y el 20 % (v/v) en la vacuna. En realizaciones particulares, la cantidad de adyuvante es de entre el 2 % al 10 % (v/v).
Las vacunas de la presente invención también pueden contener un antibacteriano tal como un antibiótico. Ejemplos de tales antibióticos pueden incluir: 10-100 pg/ml de gentamicina, 0,5-5,0 pg/ml de anfotericina B, 10-100 pg/ml de tetraciclina, 10-100 unidades/ml de (micostatin), 10-100 unidades/ml de penicilina, 10-100 pg de estreptomicina, 10­ 100 pg de polimixina B y 10-100 pg de neomicina.
Administración de la vacuna: Las vacunas de virus líquidas estables de la presente invención pueden administrarse mediante cualquier medio convencional, por ejemplo, mediante administración sistémica, incluida administración parenteral tal como, sin limitación, administración subcutánea o intramuscular. Las vacunas de virus líquidas estables de la presente invención también pueden administrarse mediante administración de la mucosa, tal como administración intranasal, oral, intratraqueal, rectal y/u ocular. Como alternativa, las vacunas pueden administrarse mediante un parche cutáneo, en un implante de liberación retardada, escarificación o por administración tópica. Se contempla que una vacuna de virus estable de la presente invención también puede administrarse mediante el agua de bebida y/o alimentos del destinatario bovino.
Las vacunas (incluidas vacunas multivalentes) de la presente invención también pueden administrarse como parte de una terapia de combinación, es decir, una terapia que incluye, además de las vacunas mismas, la administración de uno o más agentes activos adicionales, terapias, etc. En ese caso, debe reconocerse la cantidad de vacuna que constituye una cantidad "terapéuticamente eficaz" puede ser más o menos que la cantidad de vacuna que constituiría una cantidad "terapéuticamente eficaz" si la vacuna se administrara en solitario. Otras terapias pueden incluir aquellas conocidas en la técnica, tales como, por ejemplo, analgésicos, medicamentos reductores de la fiebre, expectorantes, medicamentos antiinflamatorios, antihistamínicos y/o administración de fluidos.
En determinadas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, una vacuna de virus de la presente invención que es adecuada para la administración de la mucosa comprende un virus IBR atenuado. En realizaciones más particulares, la vacuna vírica de la presente invención que es adecuada para la administración de la mucosa comprende un virus IBR vivo atenuado, un BVDV1 vivo atenuado, un BVDV2 vivo atenuado, un virus PI3 vivo atenuado y un BRSV vivo atenuado.
El nivel de inmunogenicidad puede determinarse experimentalmente mediante titulación de dosis de vacuna y técnicas de estudio de estímulos generalmente conocidas en la técnica. Tales técnicas incluyen normalmente la vacunación de una cantidad de sujetos animales con la vacuna a distintas dosificaciones y, a continuación, estimular los sujetos animales con el virus virulento para determinar la dosis protectora mínima.
Los factores que afectan el régimen de dosificación preferente pueden incluir, por ejemplo, la especie o raza (por ejemplo, de un bovino), la edad, el peso, el sexo, la dieta, actividad, tamaño pulmonar y afección del sujeto; la vía de administración; la eficacia, seguridad y perfiles de duración de inmunidad de la vacuna usada en particular; si se usa un sistema de suministro; y si la vacuna se administra como parte de un fármaco y/o una combinación de vacunas. Por lo tanto, la dosificación realmente empleada puede variar para animales específicas y, por lo tanto, puede desviarse de las dosificaciones típicas establecidas anteriormente. La determinación de tales ajustes de dosificación se encuentra, en general, dentro de las destrezas del experto en la materia del desarrollo de vacunas usando medios convencionales. De forma similar, el volumen con el cual tal dosis puede administrarse se base normalmente entre 0,1 ml (normal para una aplicación intradérmica o transdérmica) y 5,0 ml. Un intervalo típico para el volumen de administración es de entre 0,2 y 2,0 ml y aproximadamente de 1,0 a 2,0 ml para la administración intramuscular o subcutánea.
Se contempla que la vacuna pueda administrarse al destinatario de la vacuna en una única vez o, alternativamente, dos o más veces en días, semanas, meses o años. En algunas realizaciones, la vacuna se administra al menos dos veces. En determinadas tales realizaciones, por ejemplo, la vacuna se administra dos veces, administrándose la segunda dosis (por ejemplo, de refuerzo) al menos 2 semanas después de la primera dosis. En realizaciones particulares, la vacuna se administra dos veces, administrándose la segunda dosis no más de 8 semanas después de la primera dosis. En otras realizaciones, la segunda dosis se administra desde 1 semana a 2 años después de la primera dosis, desde 1,5 semanas a 8 semanas después de la primera dosis o desde 2 a 4 semanas después de la primera dosis. En otras realizaciones, la segunda dosis se administra aproximadamente 3 semanas después de la primera dosis. En las realizaciones anteriores, la primera y posteriores dosificaciones pueden variar, tal como en cantidad y/o forma. Con frecuencia, sin embargo, las dosificaciones son las mismas en cantidad y forma. cuando se administra una única dosis, la cantidad de vacuna en esa dosis en solitario comprende, en general, una cantidad terapéuticamente eficaz de la vacuna. Cuando, sin embargo, se administra más de una dosis, las cantidades de vacuna en esas dosis juntas pueden constituir una cantidad terapéuticamente eficaz. Además, la vacuna puede administrarse inicialmente y, a continuación, se puede administrar un refuerzo de 2 a 12 semanas después, como se analiza anteriormente. Sin embargo, las administraciones posteriores de la vacuna pueden realizarse sobre una base anual (1 año) o bianual (2 años), independientemente de si se ha administrado un refuerzo o no.
La presente invención puede entenderse mejor con referencia al siguiente Ejemplo no limitante, que se proporciona como ejemplo de la invención. El siguiente Ejemplo se presenta para ilustrar de forma más completa las realizaciones de la invención. No debe interpretarse de ningún modo, sin embargo, como limitante del amplio alcance de la invención.
Ejemplo
Ejemplo 1
ESTABILIDAD DE VACUNAS DE VIRUS BOVINO LÍQUIDAS
INTRODUCCIÓN
Las vacunas son cruciales para prevenir enfermedades causadas por patógenos tanto en seres humanos como en animales. Sin embargo, de forma no sorprendente, el enfoque en el tipo de vacuna empleada en seres humanos difiere en el de los animales. Por lo tanto, para los seres humanos, muchas vacunas son vacunas monovalentes, es decir, que contiene un único agente inmunizante que proporciona protección frente a un solo patógeno. Por otro lado, las vacunas multivalentes son más prevalentes en la medicina veterinaria. Esto es particularmente verdadero para vacunas empleadas en la industria del ganado bovino, por ejemplo, por productores de ganado bovino para los que el coste de múltiples vacunaciones se convierte en un problema significativo. Por otra parte, reunir ganado bovino para su vacunación colocándolos a través de un dispositivo de aprisionamiento y condensando animales en una zona pequeña dentro de cercana proximidad de humanos crea un entorno estresante para los animales, que puede llevar a menudo a la supresión del sistema inmunitario, inapetencia y/o daños físicos al ganado bovino. Adicionalmente, cada administración de una vacuna puede producir potencialmente un efecto sobre los tejidos locales que rodean el sitio de inyección correspondiente.
Por consiguiente, una medicina veterinaria es deseable a menudo que se combine con tantos antígenos como sea posible en una única vacuna multivalente. Sin embargo, la formulación de tales vacunas multivalentes no es tan sencillo como uno podría imaginar. Por ejemplo, los antígenos de la vacuna en una formulación dada pueden mostrarse incompatibles. Además, las formulaciones que provocan un daño en el tejido local no son aceptable generalmente.
Por otra parte, las formulaciones de vacuna que pueden, de otro modo, llevar a la estabilidad líquida tienden a tener un contenido superior de sólidos disueltos. Las formulaciones de vacuna que tienen un contnido en sólido superior (en exceso del 30 al 40 %) se consideran, en general, como que son hipertónicas. La inyección subcutánea de una solución hipertónica puede provocar hinchamiento local, edema y posiblemente llevar a daño en el tejido. Adicionalmente, incluso si no hay daño en el tejido, el hinchamiento local o edema en el sitio de inyección aún puede resultar visualmente indeseable para el cliente. Las formulaciones hipertónicas no representan un gran problema para las vacunas multivalentes que se suministran intranasal u oralmente. Sin embargo, una formulación más deseada aún puede ser la que tenga un contenido de sólidos inferior puesto que se correlaciona, en general, con un coste inferior de bienes.
Materiales y métodos
Preparación de masificación de antígeno: Se produjeron dos conjuntos de cada antígeno vírico (BVDV1, BVDV2, PI3 e IBR). Un conjunto se cultivó en medio sin origen animal y el otro conjunto se cultivó en medio que contenía componentes de origen animal. Los datos en las Tablas 2A y 2B a continuación se obtuvieron usando virus que se cultivaron en medio que contenía componentes de origen animal.
A. Reactivos de reserva:
sacarosa al 80 % sorbitol al 70 %
trehalosa al 37,5 % L-arginina al 40 % (de HCI de L-arginina) L-metionina al 5 % 1M de ácido glutámico de monopotasio Pluronic F-68 al 10 % 0,5M de EDTA
1M de tampón de fosfato de potasio
B. Ajuste de pH. Las formulaciones en masa se dejaron mezclar durante 2-3 horas, a continuación, se separaron: 3,5 L se asignaron a 4 °C (intervalo bajo) y 4,5 L a 25 °C (intervalo elevado).
Intervalo bajo: la formulación se enfrió a 4 °C (mientras que se mezclaba cuando era posible) y el pH se ajustó a 7,25. La formulación se mantuvo, a continuación, durante la noche a 4 °C y el pH se revisó de nuevo a la mañana siguiente para asegurar que el pH se había estabilizado a 7,25. Si era necesario un ajuste mejor en cualquier punto se usó el ácido/base adecuado (K2HPO4 o KH2PO4).
Intervalo elevado: la formulación se calentó a 25 °C (mientras que se mezclaba cuando era posible) y el pH se ajustó a 7,25. La formulación se mantuvo, a continuación, durante la noche a 25 °C y el pH se revisó de nuevo a la mañana siguiente para asegurar que el pH se hubiera estabilizado a 7,25. Si era necesario un ajuste mejor en cualquier punto se usó el ácido/base adecuado (K2HPO4 o KH2PO4). El pH varía entre 15°, 25° y 37 °C su nominal, de modo que la formulación se amplió y almacenó en cada una de las 3 temp.
Medido de pH: el pH se midió usando una sonda de pH y medidor muy sensibles. El medidor muestra el pH en 3 cifras significativas a la derecha del decimal, Hay una sonda de temperatura separada con medidor y ambos deben encontrarse en la solución y estables. El ajuste toma una buena cantidad de tiempo, el pH es crucial para el experimento. Este medidor de pH es capaz de una curva de calibración de 5 puntos con 3 puntos siendo un mínimo absoluto.
C. Esterilización y rociado del filtro con argón: Una vez se ha realizado el ajuste de pH inicial todas las 7 formulaciones se esterilizaron con filtro usando un filtro de 0,2 pM (matriz de filtro preferente = PES simplemente debido a su capacidad de filtro mejorada). Actualmente la filtración se realiza usando vacío, un segundo beneficio del filtrado al vacío es la desgasificación adicional de la formulación.
Después de que la formulación se haya esterilizado con filtro se rocía con gas de argón para aumentar el agotamiento de O2 que proporcionará, con suerte, reactividad inferior de la formulación con el tiempo. Una vez se ha finalizado el rociado hay que asegurarse que hay un revestimiento de argón en su lugar antes de su almacenamiento (asegurar un sellado lo más hermético posible para su almacenamiento).
D. La mañana siguiente después de preparar la formulación, se confirma / ajusta el pH a 7,25 a la temperatura deseada (4 °C o 25 °C). Si se han realizado correctamente la formulación y los procedimientos anteriores el pH debe encontrarse cerca de 7,25. Con una incubación durante la noche el pH habrá variado ligeramente debido a la finalización de las reacciones químicas asociadas con el ajuste del pH más temprano y posterior desgasificación.
E. Descongelación de virus: Se deben usar las condiciones óptimas para descongelar el virus, normalmente una rápida descongelación en un baño de agua caliente con mezclado frecuente para evitar que el líquido en volumen se caliente, si es necesaria la descongelación. El proceso se finaliza cuando hay una pequeña cantidad de hielo en la formulación para mantener los elementos fríos hasta que está lista para su uso y para retirar el calor residual de la porción líquida. F. Agregación de virus a formulaciones en masa: Preparación de mezcla de vacuna: Se retiran 250 ml de formulaciones de 4° y 750 ml de formulaciones de 25 °C de masas de cada formulación (todas las 7 formulaciones) y se colocan en un recipiente adecuado (botellas de tapa de rosca de Nelgene). Cuando se añade el virus en un período de tiempo muy corto (unos pocos minutos) a continuación, el virus puede añadirse sin problemas adicionales. Cuando el virus no se añade inmediatamente, sebe colocarse un revestimiento de argón en su lugar para desplazar el O2 residual. Una vez se ha añadido el virus se debe colocar un revestimiento de argón en su lugar antes del mezclado. El gas de argón debe añadirse a la botella usando un caudal bajo.
G. Carga de las vacunas: Orden de carga de la formulación: La formulación de 4 °C debe cargarse siempre antes de la formulación hermana de 25 °C.
Métodos analíticos
Se llevan a cabo ensayos de cultivo celular en un entorno de células limpio. Las manipulaciones, diluciones y adición de medio se realiza en una vitrina de seguridad biológica de clase II en condiciones asépticas. Todas las placas, frascos, matraces, pipetas, puntas de pipetas y tubos de dilución deben esterilizarse antes de su uso. Todos los medios e ingredientes asociados deben ser estériles.
Potencia de BVDV1. Se usa una línea de células adecuada para el crecimiento de BVDV para este ensayo de titulación. Por ejemplo, células de células de riñón bovino de Madin-Darby (MDBK) se cultivan hasta confluencia en un matraz o frasco giratorio usando medio esencial modificado de Hanks (HMEN) complementado con Suero fetal bovino (FBS) al 5-10 %, L-glutamina y un antibiótico (gentamicina (12-25 pg/ml)). El medio se decanta desde un matraz/frasco giratorio de células de MDBK de cultivo sanas aproximadamente 24 antes del tiempo deseado de titulación vírica. Se aclara el suero que contiene medio del matraz/frasco giratorio usando tampón fosfato salino, pH 7,2 (PBS). Se decanta y reemplaza con una solución que contiene la cantidad adecuada de Tripsina/EDTA para soltar suavemente las células de la superficie del matraz/frasco giratorio. La cantidad de tripsina debe ajustarse al tamaño de la superficie del matraz o frasco giratorio. Se coloca el matraz/frasco giratorio que contiene las células tripsinizadas en una incubadora a 37 °C durante el suficiente tiempo para permitir que se separen las células. Cuando parece que las células están en el nivel correcto de separación, se añaden 5-20 ml de medio esencial de Eagle que contiene L-glutamina y gentamicina (EMEM). Se añade FBS al 5 % al EMEM para neutralizar la tripsina. Se pipetean las células para romper las agrupaciones. Se determina la densidad de células usando un hemocitómetro. Se puede determinar la viabilidad usando un 4 % de solución de azul de tripano. Se diluyen las células a 1 x 105 células por ml en EMEM con FCS al 5 % y se añaden 100 pl a cada pocillo de una placa de cultivo de tejido de 96 pocillos. Para evitar que se evapore el medio, se cubre la placa y se colocan las células en una incubadora humidificada configurada a 37 °C con CO2 al 5 %. Se preparan tubos para usarse para las diluciones de 10 veces para la titulación de virus añadiendo la cantidad apropiada de EMEM/5 % de suero a cada uno de los tubos. Se carga un tubo por separado con EMEM para el control negativo. Se realizan las diluciones de 10 veces de la muestra de virus en los tubos preparados. También se diluye una referencia preparada de BVDV de tipo 1 con título conocido en EMEM y se usa como control positivo. Se asegura que la placa de 96 pocillos es confluente con una monocapa sana de células de MDKB y se aplican 100 pl de cada una de las muestras de virus diluidas a los pocillos adecuados de la placa de células de MDBK de 96 pocillos. Se incluyen los controles negativos y positivos. Se reemplaza la tapa sobre la placa y se coloca en una incubadora humidificada de 37 °C, de CO2 al 5 % durante aproximadamente 4 días. Después de 4 días, se pueden leer las placas usando un microscopio invertido y examinando la placa para su efecto citopático (CPE) del virus sobre las células. Si la cepa de BVDV es una cepa no citopática, se puede usar el siguiente procedimiento para determinar el título del virus. Después de 4 días, se retiran las placas infectadas de la incubadora y se decanta el medio en un recipiente de residuos adecuado. Se aclara la monocapa 2 veces con PBS. Después de un segundo lavado, se retira el exceso de humead golpeando suavemente la placa contra papel absorbente. Se fijan los sustratos de células en una campana extractara con 50-200 pl/pocillo de 70 % de acetona/30 % de fijador de metanol y se deja que la placa se fije a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se decanta el fijado usado en un recipiente adecuado. Se retira el exceso de humedad golpeando suavemente la placa contra papel absorbente y se deja secar la placa al aire. Las placas fijadas pueden almacenarse a 2-7 °C durante hasta 30 días antes de la tinción. Para teñir las placas, se clara cada una con PBS y se golpetea el exceso de humedad. Se añaden 50-75 uL por pocillo de un anticuerpo dirigido específicamente hacia un BVDV1. Se reemplaza la tapa sobre las placas y se incuba con humedad a 37 °C en 5 % de CO2 durante 30-60 minutos. Se retiran las placas de la incubadora y se decanta el fluido que contiene el anticuerpo no unido. Se aclara la placa al menos 2X para retirar el anticuerpo no unido. Se añaden 50-75 pl de anticuerpo secundario etiquetado con isotiocianato fluorescente (FITC) diluido al nivel adecuado a cada pocillo de la placa usando una pipeta multicanal. Se reemplaza la cubierta y se incuban las placas en una incubadora humidificada de 37 °C, de CO2 al 5 % durante aproximadamente 30 minutos. Se retiran las placas de la incubadora, se retira la tapa y se decanta el anticuerpo etiquetados de FITC no unido. Se aclaran las placas con PBS dos veces y se golpean las placas sobre papel absorbente para retirar el exceso de humedad. Las placas pueden leerse inmediatamente usando un microscopio fluorescente con los filtros adecuados para el conjugado de FITC. El sustrato infectado contendrá células con un citoplasma que parece de color verde manzana y núcleos que son oscuros (no teñidos). Para una cepa citopática de BVDV1, se consideran los pocillos que muestran CPE obvio como positivos. Todos los pocillos de control negativo deben permanecer negativos y no postrar CPR o tinción positiva. Se calcula el título del virus mediante el método de Spearman-Karber y se dan a conocer como el log-10 TCID50/ml. El ensayo es válido si los controles negativos son negativos y el control positivo entra dentro del intervalo esperado de título para la muestra.
Potencia de BVDV2. El análisis de la potencia de BVDV2 se realiza exactamente igual que para BVDV1. Si la cepa es una cepa no citopática, entonces se debe usar un anticuerpo dirigido frente a la cepa de tipo 2. El virus de control positivo será BVDV2.
Potencia de IBR. Se usa una línea de células adecuada para el crecimiento de IBR para este ensayo de titulación. Por ejemplo, células de células de riñón bovino de Madin-Darby (MDBK) se cultivan hasta confluencia en un matraz o frasco giratorio usando medio esencial modificado de Hanks (HMEN) complementado con Suero fetal bovino (FBS) al 5-10 %, L-glutamina y un antibiótico (gentamicina (12-25 |jg/ml)). El medio se decanta desde un matraz/frasco giratorio de células de MDBK de cultivo sanas aproximadamente 24 antes del tiempo deseado de titulación vírica. Se aclara el suero que contiene medio del matraz/frasco giratorio usando tampón fosfato salino, pH 7,2 (PBS). Se decanta y reemplaza con una solución que contiene la cantidad adecuada de Tripsina/EDTA para soltar suavemente las células de la superficie del matraz/frasco giratorio. La cantidad de tripsina debe ajustarse al tamaño de la superficie del matraz o frasco giratorio. Se coloca el matraz/frasco giratorio que contiene las células tripsinizadas en una incubadora a 37 °C durante el suficiente tiempo para permitir que se separen las células (5-10 minutos). Cuando parece que las células están en el nivel correcto de separación, se añaden 5-20 ml de medio esencial de Eagle que contiene L-glutamina y gentamicina (EMEM). Se añade FBS al 5 % al EMEM para neutralizar la tripsina. Se pipetean las células para romper las agrupaciones. Se determina la densidad de células usando un hemocitómetro. Se puede determinar la viabilidad usando un 4 % de solución de azul de tripano. Se diluyen las células a 2,4 x 105 células por ml en EMEM con FCS al 5 % y se añaden 5 ml a cada pocillo de una placa de cultivo de tejido de 60 mm. Para evitar que se evapore el medio, se cubre la placa y se colocan las células en una incubadora humidificada configurada a 37 °C con CO2 al 5 %. Se preparan tubos para usarse para las diluciones de 10 veces para la titulación de virus añadiendo la cantidad apropiada de EMEM/5 % de suero a cada uno de los tubos. Se carga un tubo por separado con EMEM para el control negativo. Se realizan las diluciones de 10 veces de la muestra de virus en los tubos preparados. También se diluye una referencia preparada de IBR con título conocido en EMEM y se usa como control positivo. Se asegura que las placas de 60 mm son confluentes con una monocapa sana de células de MDBK. Se etiqueta cada placa con la identificación de la muestra y las diluciones a colocar en placas. A continuación, se decanta el medio desde cada una de las placas de 60 mm. Se inocula cada una de las placas con 100 j l de la muestra a someter a ensayo, incluidos los controles negativos y positivos. Se inclinan las placas hacia delante y hacia atrás para distribuir el inóculo. Se reemplaza la tapa sobre la placa y se coloca en una incubadora humidificada de 37 °C, de CO2 al 5 % durante aproximadamente 60 minutos antes para la absorción. Después de la absorción del virus, se añaden 5 ml de revestimiento de medio que consiste en medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM), con 5 % de FCS, L-glutamina, gentamicina y carboximetilcelulosa a cada placa de 60 mm. Después de 4 días, se decanta el medio de revestimiento de CMC de cada placa. Se aclara cada placa con agua y se decanta. Se añaden 2 ml (o lo suficiente para cubrir el fondo) de tinte violeta cristal a cada placa o pocillo y se incuba a temperatura ambiente (15-30 °C) durante 20-30 minutos. Se aclara suavemente la tinción de cada placa con agua fría. Se invierten las placas y se dejan secar las placas. Cuando las placas se han secado, se hace un recuento visual de las plaquetas sobre las placas usando un microscopio invertido. Se usan solo las diluciones que tienen número promedios de placas de entre 10 y 150 para determinar el título. Se calcula el título de virus de unidad formadora de placas (UFP)/0,1 ml mediante el siguiente cálculo: título de UFP/0,1 ml = Log1ü(promedio de plaquetas recontadas para cada dilución de cada título individual) Log-i0(factor de dilución). Se dan a conocer los títulos como Log-iü TCID50/ml. El ensayo es válido si el control negativo no muestra signos de plaquetas en los pocillos y el título de control positivo se encuentra dentro del intervalo esperado.
Potencia de BRSV. Se usa una línea de células adecuada para el crecimiento de BRSV para este ensayo de titulación. Por ejemplo, se cultivan células Vero en un matraz o un frasco giratorio hasta confluencia. Las células Vero pueden cultivarse sobre medio esencial modificado de Dulbecco (DMEM), complementado con antibióticos (gentamicina (12­ 50 jg/ml), suero bovino fetal (FBS al 5 %) y L-glutamina (2 mM). Se prepararon las placas de titulación aproximadamente 24 horas antes de que se necesitaran. El medio se decanta desde la monocapa sana de células Vero. Las células se aclaran con PBS. Se añade una pequeña cantidad de tripsina/EDTA al matraz/frasco giratorio para soltar las células de la superficie. El matraz/frasco giratorio, a continuación, se incuba a 37 °C durante 5-10 minutos, en cuyo tiempo se observan para la separación de la superficie. Se añade medio esencial modificado de Eagle con antibióticos, L-glutamina, aminoácidos no esenciales, hidrolizado de lactalbúmina (LAH al 0,05 %) y glucosa (0,3 %) al matraz (5-20 ml) que contiene tripsina/EDTA y las células se pipetean para romper las agrupaciones de células. Se usa un hemocitómetro para determinar el número de células, mediante el uso de un tinte de recuento para determinar el recuento de viabilidad de las células. Las células se diluyen a la concentración final de 1 x 105, mediante el uso de EMEM como diluyente. Mediante el uso de una pipeta multicanal, se añaden 100 j l de las células diluidas a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Se colocan las placas inoculadas en una incubadora humidificada a 37 °C, CO2 al 5 % y se deja que las células se unan y crezcan. Se preparan tubos para usarse para las diluciones de 10 veces para la titulación de virus añadiendo la cantidad apropiada de EMEM a cada uno de los tubos. Se carga un tubo por separado con EMEM para el control negativo. Se realizan las diluciones de 10 veces de la muestra de virus en los tubos preparados. También se diluye una referencia preparada de BRSV con título conocido en EMEM y se usa como control positivo.
Se asegura que la placa de 96 pocillos es confluente con una monocapa sana de células Vero y se aplican 100 j l de cada una de las muestras de virus diluidas a los pocillos adecuados de la placa de células Vero de 96 pocillos. Se incluyen los controles negativos y positivos. Se reemplaza la tapa sobre la placa y se coloca en una incubadora humidificada de 37 °C, de CO2 al 5 % durante aproximadamente 8 días antes de la evaluación. En el octavo día, se usa un microscopio invertido para evaluar cada pocillo de la placa de 96 pocillos para su efecto citopático (CPE). Se observa el control negativo en primer lugar para determinar la cantidad de residuos de fondo que es el nivel basal para cada pocillo. Se registra el número de pocillos positivos de CPE para cada dilución. Se calcula el título del virus mediante el uso del método de Spearman-Karber y se dan a conocer como Log-iQ TCID50/ml. El ensayo es válido si el control negativo no muestra signos de CPE en los pocilios y el título de control positivo se encuentra dentro del intervalo esperado.
Potencia de PI3. Se usa una línea de células adecuada para el crecimiento de PI3 para este ensayo de titulación. Por ejemplo, se cultivan células Vero en un matraz o un frasco giratorio hasta confluencia. Las células Vero pueden cultivarse sobre medio esencial modificado de Dulbecco (DMEM), complementado con antibióticos (gentamicina (12­ 50 fig/ml), suero bovino fetal (FBS al 5 %) y L-glutamina (2 mM). El medio se decanta desde la monocapa sana de células Vero. Las células se aclaran con PBS. Se añade una pequeña cantidad de tripsina/EDTA al matraz/frasco giratorio para soltar las células de la superficie. El matraz/frasco giratorio, a continuación, se incuba a 37 °C durante 5-10 minutos, en cuyo tiempo se observan para la separación de la superficie. Se añade medio esencial modificado de Eagle con gentamicina, L-glutamina y FCS al 5 % al matraz (5-20 ml) que contiene tripsina/EDTA y las células se pipetean para romper las agrupaciones de células. Se usa un hemocitómetro para determinar el número de células, mediante el uso de un tinte de recuento (azul de tripano) para determinar el recuento de viabilidad de las células. Las células se diluyen a la concentración final de 1 x 105, mediante el uso de EMEM como diluyente. Mediante el uso de una pipeta multicanal, se añaden 100 f l de las células diluidas a cada pocillo de una placa de 96 pocillos.
Se colocan las placas inoculadas en una incubadora humidificada a 37 °C, CO2 al 5 % y se deja que las células se unan y crezcan. Se preparan tubos para usarse para las diluciones de 10 veces para la titulación de virus añadiendo la cantidad apropiada de EMEM a cada uno de los tubos. Se carga un tubo por separado con EMEM para el control negativo. Se realizan las diluciones de 10 veces de la muestra de virus en los tubos preparados. También se diluye una referencia preparada de PI3 con título conocido en EMEM y se usa como control positivo. Se asegura que la placa de 96 pocillos es confluente con una monocapa sana de células Vero y se aplican 100 f l de cada una de las muestras de virus diluidas a los pocillos adecuados de la placa de células Vero de 96 pocillos. Se incluyen los controles negativos y positivos. Se reemplaza la tapa sobre la placa y se coloca en una incubadora humidificada de 37 °C, de CO2 al 5 % durante aproximadamente 7 días antes de la evaluación. En el séptimo día, se usa un microscopio invertido para evaluar cada pocillo de la placa de 96 pocillos para su efecto citopático (CPE). Se observa el control negativo en primer lugar para determinar la cantidad de residuos de fondo que es el nivel basal para cada pocillo. Se registra el número de pocillos positivos de CPE para cada dilución. Se calcula el título del virus mediante el uso del método de Spearman Karber y se dan a conocer como Log-i0 TCID50/ml. El ensayo es válido si el control negativo no muestra signos de CPE en los pocillos y el título de control positivo se encuentra dentro del intervalo esperado.
Potencia de BRCV: Se cultivan células de MDBK mediante el uso de DMEM con L-glutamina, suero bovino fetal y antibióticos (medio de crecimiento) en un matraz o frasco giratorio hasta que se consigue una monocapa confluente de células sanas. Se decanta el matraz/frasco giratorio y se aclara con tampón fosfato salino (PBS). Se decanta el PBS y se añade suficiente tripsina que contiene solución para separar células de la superficie. Se coloca el cultivo de nuevo en una incubadora de 37 °C para proporcionar a las células tiempo para separarse. Una vez las células se separan de la superficie, se añade una cantidad de medio equivalente a 2 veces la cantidad de tripsina usada a las células. Las células se pipetean varias veces para romper las agrupaciones de células. Se realiza un recuento viable usando un hemocitómetro u otro método adecuado, usando azul de tripano para determinar el porcentaje de células no viables en la suspensión. La suspensión de células se diluye, a continuación en el medio de cultivo a 2 x 105 células/ml. Mediante el uso de una pipeta multicanal, se añaden 100 f l de la suspensión de células a cada pocillo de una placa de cultivo de tejido de 96 pocillos. Las placas sembradas se incuban a 37 °C, CO2 al 5 %, de humedad elevada hasta que se forma una monocapa a aproximadamente el 90-100 % de confluencia. Las muestras que contiene virus vivos se diluyen 10 veces en medio de inoculación (DMEM, L-glutamina, antibióticos y tripsina tipo IX). BRCV es un virus dependiente de tripsina y, de este modo, se debe añadir tripsina al medio de inoculación para que los virus infecten las células. No se debe añadir FBS al medio de dilución para virus dependientes de tripsina. Cuando las placas de 96 pocillos están listas, se decanta el medio de crecimiento y se lava la placa con PBS. Se retira el PBS de la placa de 96 pocillos que contiene la monocapa de MDBK de células y se aplica inmediatamente las muestras diluidas de virus a la placa. También se añade a la placa una serie de diluciones de un control positivo que contiene una cantidad conocida de virus. También se añade a la placa una serie de control negativo que contiene solo medio. Se incuban las placas a 37 °C, CO2 al 5 % durante cinco días. Después de 5 días, se retiran las placas de la incubadora y se observan las células, usando un microscopio, para el efecto citopático del virus (CPE). Los pocillos que muestran CPE se marcan como positivos, los pocillos con células intactas se consideran negativos. Se calculan los títulos del control positivo y las muestras mediante el método de Spearman-Karber y se dan a conocer como TCID50/ml. El ensayo es válido si los pocillos de control negativo no muestran signos de efecto citopático y el control positivo se encuentra dentro del intervalo esperado.
Resultados/Conclusión
Se prepararon formulaciones de estabilizador para vacunas de virus bovino y, a continuación se rociaron usando gas de argón, se esterilizaron con filtro usando filtros superiores de botella de PES de 0,2 um y se aplicó un revestimiento de gas de argón antes de su almacenamiento. El día de carga se añadió y mezcló el virus, la vacuna se dispensó, a continuación 1 ml en una ampolla de vidrio de 2,2 ml, se rellenó con gas de argón, se selló a la llama y se incubó. Se generaron vacunas monovalentes de BRSV, BVDV1 e IBR para cada combinación de estabilizador y se incubaron a bien 15 °C o bien 25 °C. PI3 se dejó fuera porque los resultados previos indicaron que el virus se comportaba de forma similar a BRSV. Este experimento preliminar mostró sorprendentemente que se podrían obtener niveles mejorados de éxito usando una combinación de sorbitol y arginina, así como una tendencia de estabilizadores más simplistas para tener un mejor rendimiento por todo el intervalo de virus sometidos a ensayo.
A continuación, se configuró un estudio de estabilidad acelerado (25 °C) y tiempo real (4 °C) para comparar múltiples formulaciones en vista del cribado de excipientes detallado anteriormente (véase Tabla 1). Se prepararon las formulaciones de estabilizador y, a continuación se rociaron usando gas de argón, se esterilizaron con filtro usando filtros superiores de botella de PED de 0,2 um y se aplicó un revestimiento de gas de argón antes de su almacenamiento. El día de la carga se agregó y mezcló el virus, a continuación se dispensó la vacuna 1 ml en una ampolla de vidrio de 2,2 ml, de rellenó con gas de argón, se selló a la llama y se incubó. Las muestras de combinación también se cargaron ~10 ml en viales de vacuna de vidrio y de plástico, se revistieron con gas de argón y se taponaron y se sellaron con engarzado.
En total, once formulaciones distintas demostraron ser candidatas potenciales de formulaciones líquidas estables de una vacuna de ganado bovino multivalente (Tabla 1). Estudios en tiempo real, por ejemplo, a 4 °C, se realizaron en formulaciones de vacunas multivalentes que comprenden BVDV1, BVDV2, iBr , PI3 y BRSV y formulaciones de vacunas monovalentes de BRCV. Los resultados de estos estudios se proporcionan en las Tablas 2A y 2B a continuación.
Se completó el ensayo de estabilidad en intervalos de tres meses. A los nueve meses, se llevó a cabo una evaluación sobre las formulaciones para estrechar el estudio. Los antígenos de vacuna más complicados de estabilizar parecieron ser BVDV1 e IBR. La interrupción del estudio de una formulación dada se basó, al menos en parte en aquellas que: habían perdido más de un log en título para cualquiera de los 5 antígenos de vacuna a los 9 meses; tenía resultados equivalentes con otra formulación y tenía los mismos ingredientes, pero en concentraciones superiores; y/o tenía las mismas formulaciones, pero tenía ingredientes adicionales que no parecían tener ningún afecto. Cualquier formulación que había tenido una caída repentinta en el título en un punto de tiempo se llevó a cabo durante un punto de tiempo adicional para determinar si era una inestabilidad real o la variabilidad en el ensayo (a menos que cumpliera cualquiera de los criterios de exclusión anteriores).
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El alcance de la presente invención no debe limitarse a las realizaciones específicas descritas en el presente documento. De hecho, a partir de la descripción anterior, diversas modificaciones de la invención, además de las descritas en este documento, serán obvias para los expertos en la técnica. Se pretende incluir dichas modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Una vacuna líquida estable que comprende un virus bovino vivo atenuado, el 5 - 40 % (p/v) de un alcohol de azúcar y de 0,15 a 0.75 M de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en arginina, ácido glutámico y glicina, así como cualquier combinación de los mismos; en donde la vacuna estable líquida varía en pH desde pH 6,0 hasta pH 8,0, en donde el virus bovino vivo atenuado se selecciona del grupo que consiste en virus de diarrea vírica bovina (BVDV), virus de rinotraqueítis infecciosa bovina, virus paragripal tipo 3, virus sincitial respiratorio bovino, virus de la fiebre del valle del Rift y coronavirus respiratorio bovino y cualquier combinación de los mismos.
2. La vacuna líquida estable de la reivindicación 1, en donde el alcohol de azúcar es sorbitol.
3. La vacuna líquida estable de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el aminoácido es arginina.
4. La vacuna líquida estable de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, que comprende adicionalmente un aditivo de azúcar que es un azúcar sin alcohol, en donde la cantidad total del alcohol de azúcar y el azúcar sin alcohol en la vacuna líquida estable es del 10 - 40 % (p/v).
5. La vacuna líquida estable de la reivindicación 4, en donde el azúcar sin alcohol se selecciona del grupo que consiste en sacarosa y trehalosa.
6. La vacuna líquida estable de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, que comprende adicionalmente un componente seleccionado del grupo que consiste en un antioxidante, un tensioactivo, un quelante y un tampón.
7. La vacuna líquida estable de la reivindicación 6 en donde el tampón comprende de 2,5 a 50 mM de fosfato de potasio.
8. La vacuna líquida estable de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 7, en donde el virus vivo atenuado es un BVDV seleccionado del grupo que consiste en un BVDV1, BVDV2, y BVDV1 y BVDV2.
9. La vacuna líquida estable de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 8, que comprende adicionalmente un virus bovino inactivado.
10. La vacuna líquida estable de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 9, que comprende adicionalmente una bacteria.
11. La vacuna líquida estable de la reivindicación 10 en donde la bacteria se selecciona del grupo que consiste en una Pasteurella multocida viva atenuada, una Mannheimia haemolytica viva atenuada, un Histophilus somni vivo atenuado, un Mycoplasma bovis vivo atenuado, una Pasteurella multocida inactivada, una Mannheimia haemolytica inactivada, un Histophilus somni inactivado y un Mycoplasma bovis inactivado y cualquier combinación de los mismos.
12. Un método de fabricación de una vacuna líquida estable, comprendiendo el método la combinación de una cantidad terapéuticamente eficaz de un virus bovino vivo atenuado y, opcionalmente, una bacteria, con 5 - 40 % (p/v) de alcohol de azúcar y de 0,15 a 0,75 M de arginina; en donde la vacuna estable líquida varía en pH desde pH 6,0 hasta pH 8,0, en donde el virus bovino vivo atenuado se selecciona del grupo que consiste en virus de diarrea vírica bovina (BVDV), virus de rinotraqueítis infecciosa bovina, virus paragripal tipo 3, virus sincitial respiratorio bovino, virus de la fiebre del valle del Rift y coronavirus respiratorio bovino y cualquier combinación de los mismos.
13. Vacuna líquida estable de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 -11 o tal como puede obtenerse mediante el método de acuerdo con la reivindicación 12, para su uso en la vacunación de un bovino frente a un virus bovino.
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