BR112020017605B1 - Cadeia pesada, anticorpos anti-trem-1, molécula biespecífica, imunoconjugado, composição e kit dos mesmos - Google Patents

Abstract

A presente Invenção refere-se a anticorpos, ou porções de ligação ao antígeno dos mesmos, que especificamente se ligam e inibem a sinalização de TREM-1, em que os anticorpos não se ligam a um ou mais Fc^Rs e não induzem as células mieloides a produzir citocinas inflamatórias. São também fornecidos usos de tais anticorpos, ou porções de ligação ao antígeno dos mesmos, em aplicações terapêuticas, tal como tratamento de doenças autoimunes.

Description

REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SUBMETIDA ELETRONICAMENTE POR MEIO DE EFS-WEB

[001] O teor da listagem de sequências eletronicamente submetida em arquivo de texto ASCII (Nome: 3338_092PC01_SeqListing.txt; Tamanho: 106,162 bytes; e Data de Criação: 27 de março de 2019) depositado com o pedido é no presente documento incorporado por referência em sua íntegra.

ANTECEDENTE DA INVENÇÃO

[002] TREM-1 é um receptor de ativação expresso em monócitos, macrófagos e neutrófilos. Estas células desempenham um papel central em doenças inflamatórias crônicas liberando citocinas e outros mediadores que conduzem a inflamação. mRNA de TREM-1 e expressão de proteína são super-regulados em pacientes com artrite reumática (RA) e doença do intestino inflamatória (IBD), e células positivas de TREM-l acumulam-se em sítios de inflamação, correlacionando-se com a severidade da doença. Veja Bouchonet al., Nature 410:1103-1107 (2001); Schenk et al., Clin Invest 117:3097-3106 (2007); e Kuaiet at al., Rheumatology 48:1352-1358 (2009). Proteína 1 de reconhecimento de peptidoglicano (PGLYRP1) expressa principalmente por neutrófilos ativados é um ligante para TREM-1 e mediam a sinalização de TREM-1 sob ligação.

[003] In vitro, envolvimento de TREM-1 desencadeia secreção de pro-citocinas inflamatórias incluindo TNF, IL-8, e proteína 1 quimiotática de monócito. Além disso, a sinalização de TREM-1 sinergiza com múltiplos receptores tipo Toll (TLRs) para também fomentar sinais pró-inflamatórios. Por sua vez, isto sub-regula a expressão de TREM-1, levando a um ciclo vicioso de aplificação da inflamação. Veja Bouchonet al., J. Immunol 164:4991-4995 (2000). Evidências crescents indicam que TLRs contribuem para o desenvolvimento e progresso de doenças inflamatórias crônicas tais como RA e IBD.

[004] mAbs anti-TREM-1 humanizados que inibem a função TREM-1 tanto humana quanto de cinomolgo foram descritos em outros lugares. Veja WO 2013/120553 A1 e WO 2016/009086 A1. No entanto, tais anticorpos ou têm perfil de viscosidade que pode dificultar o processo de fabricação ou têm outros problemas que podem limitar seu potencial terapêutico (por exemplo, tempestade de citocinas e ADCC). See Shire et al., J. Pharm. Sci. 93:1390-1402 (2004); e Warnckeet al., J Immunol. 188:4405-11 (2012). Consequentemente, existe uma necessidade de um anticorpo anti-TREM-1 que pode especificamente se ligar a, e inibir a função de TREM-1 mas sem as questões dos anticorpos anti-TREM-1 anteriores.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[005] São fornecidos no presente documento anticorpos isolados, tais como anticorpos monoclonais, em particular, antiorpos humanos (por exemplo, monoclonais), que especificamente se liga desencadeando receptor expresso em células mieloide 1 (TREM-1) e têm desejáveis propriedades fundionais. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada (VH), uma região variável de cadeia leve (VL), e uma região constante de cadeia pesada IgG1, em que a região constante de cadeia pesada de IgG1 compreende uma ou mais substituições de aminoácido em comparação com uma região constante de cadeia pesada de IgG1 do tipo selvagem (SEQ ID NO: 9). Em algumas modalidades, o anticorpo compete de modo cruzado com mAb 0318 para ligação ao TREM-1 de bloqueio e compreende uma região variável de cadeia pesada (VH), uma região variável de cadeia leve (VL), e uma região constante de cadeia pesada IgG1, em que a região constante de cadeia pesada de IgG1 compreende uma ou mais substituições de aminoácido em comparação com uma região constante de cadeia pesada de IgG1 do tipo selvagem (SEQ ID NO: 9).

[006] Em algumas modalidades, o anticorpo liga-se ao mesmo TREM-1 eptiope as mAb 0318. Em algumas modalidades, o anticorpo especificamente se liga a um epítopo de TREM-1 compreendendo um ou mais resíduos de aminoácido selecionados do grupo que consiste nos D38, V39, K40, C41, D42, Y43, T44, L45, E46, K47, F48, A49, S50, S51, Q52, K53, A54, W55, Q56, Y90, H91, D92, H93, G94, L95, e L96 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o anticorpo especificamente se liga a um epítopo de TREM-1 compreendendo aminoácidos D38 a L45, E46 a Q56, e/ou Y90 a L96 de SEQ ID NO: 1.

[007] Em algumas modalidades, a região constante de cadeia pesada de IgG1 do anticorpo descrito no presente documento compreende uma ou mais substituições de aminoácido selecionadas do grupo que consiste em K214R, L234A, L235E, G237A, D356E, e L358M, por numeração EU. Em algumas modalidades, a região constante de cadeia pesada de IgG1 compreende uma ou mais substituições de aminoácido selecionadas do grupo que consiste em K214R, L234A, L235E, G237A, A330S, P331S, D356E, e L358M, por numeração EU. Em algumas modalidades, a região constante de cadeia pesada de IgG1 compreende uma ou mais substituições de aminoácido selecionadas do grupo que consiste em K214R, C226S, C229S, e P238S, por numeração EU. Em algumas modalidades, a região constante de cadeia pesada de IgG1 compreende uma ou mais substituições de aminoácido selecionadas do grupo que consiste em S131C, K133R, G137E, G138S, Q196K, I199T, N203D, K214R,C226S, C229S, e P238S, por numeração EU.

[008] Em algumas modalidades, o anticorpo descrito no presente documento compreende uma cadeia pesada CDR1, CDR2, e CDR3 e uma cadeia leve CDR1, CDR2, e CDR3, em que a cadeia pesada CDR3 compreende DMGIRRQFAY (SEQ ID NO: 26) ou DMGIRRQFAY (SEQ ID NO: 26) exceto uma ou mais substituições. Em algumas modalidades, a cadeia pesada CDR3 compreende DQGIRRQFAY (SEQ ID NO: 72).

[009] Em algumas modalidades, o anticorpo descrito no presente documento compreende uma cadeia pesada CDR1, CDR2, e CDR3 e uma cadeia leve CDR1, CDR2, e CDR3, em que a cadeia pesada CDR2 compreende RIRTKSSNYATYYAASVKG (SEQ ID NO: 25) ou RIRTKSSNYATYYAASVKG (SEQ ID NO: 25) exceto uma ou mais substituições.

[0010] Em algumas modalidades, o anticorpo descrito no presente documento compreende uma cadeia pesada CDR1, CDR2, e CDR3 e uma cadeia leve CDR1, CDR2, e CDR3, em que a cadeia pesada CDR1 compreende TYAMH (SEQ ID NO: 24) ou TYAMH (SEQ ID NO: 24) exceto uma ou mais substituições.

[0011] Em algumas modalidades, o anticorpo descrito no presente documento compreende uma cadeia pesada CDR1, CDR2, e CDR3 e uma cadeia leve CDR1, CDR2, e CDR3, em que a cadeia leve CDR1 compreende RASQSVDTFDYSFLH (SEQ ID NO: 27) ou RASQSVDTFDYSFLH (SEQ ID NO: 27) exceto uma ou mais substituições. Em algumas modalidades, a cadeia leve CDR2 compreende RASNLES (SEQ ID NO: 28) ou RASNLES (SEQ ID NO: 28) exceto uma ou mais substituições. Em algumas modalidades, a cadeia leve CDR3 compreende QQSNQDPYT (SEQ ID NO: 29) ou QQSNQDPYT (SEQ ID NO: 29) exceto uma ou mais substituições.

[0012] Em algumas modalidades, a VH do anticorpo descrito no presente documento compreende uma sequência de aminoácido que é de pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou cerca de 100% idêntica à sequência de aminoácido mencionada como SEQ ID NO: 14. In somoe embodiments, a VL do anticorpo descrito no presente documento compreende uma sequência de aminoácido que é de pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou cerca de 100% idêntica à sequência de aminoácido mencionada como SEQ ID NO: 15. Em algumas modalidades, a VH e VL compreende SEQ ID NOs: 14 e 15, respectivamente.

[0013] Em algumas modalidades, o anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, ou SEQ ID NO: 53. Em algumas modalidades, a cadeia leve compreende SEQ ID NO: 54.

[0014] É fornecido no presente documento um anticorpo isolado que especificamente se liga a TREM-1, compreendendo uma cadeia pesada CDR1, CDR2, CDR3; uma cadeia leve CDR1, CDR2, CDR3; e uma região constante de cadeia pesada IgG1, em que a cadeia pesada CDR1, CDR2, e CDR3 compreende TYAMH (SEQ ID NO: 24), RIRTKSSNYATYYAASVKG (SEQ ID NO: 25), e DMGIRRQFAY (SEQ ID NO: 26), respectivamente; em que a cadeia leve CDR1, CDR2, e CDR3 compreende RASQSVDTFDYSFLH (SEQ ID NO: 27), RASNLES (SEQ ID NO: 28), e QQSNQDPYT (SEQ ID NO: 29), respectivamente; e em que a região constante de cadeia pesada de IgG1 compreende uma ou mais substituições de aminoácido selecionadas do grupo que consiste em L234A, L235E, e G237A, por numeração EU.

[0015] É fornecido no presente documento um anticorpo isolado que especificamente se liga a TREM-1, compreendendo uma cadeia pesada CDR1, CDR2, CDR3; uma cadeia leve CDR1, CDR2, CDR3; e uma região constante de cadeia pesada IgG1, em que a cadeia pesada CDR1, CDR2, e CDR3 compreende TYAMH (SEQ ID NO: 24), RIRTKSSNYATYYAASVKG (SEQ ID NO: 25), e DMGIRRQFAY (SEQ ID NO: 26), respectivamente; em que a cadeia leve CDR1, CDR2, e CDR3 compreende RASQSVDTFDYSFLH (SEQ ID NO: 27), RASNLES (SEQ ID NO: 28), e QQSNQDPYT (SEQ ID NO: 29), respectivamente; e em que a região constante de cadeia pesada de IgG1 compreende substituições de aminoácido selecionadas do grupo que consiste em L234A, L235E, G237A, A330S, e P331S, por numeração EU.

[0016] É fornecido no presente documento um anticorpo isolado que especificamente se liga a TREM-1, compreendendo uma cadeia pesada CDR1, CDR2, CDR3; uma cadeia leve CDR1, CDR2, CDR3; e uma região constante de cadeia pesada IgG1, em que a cadeia pesada CDR1, CDR2, e CDR3 compreende TYAMH (SEQ ID NO: 24), RIRTKSSNYATYYAASVKG (SEQ ID NO: 25), e DMGIRRQFAY (SEQ ID NO: 26), respectivamente; em que a cadeia leve CDR1, CDR2, e CDR3 compreende RASQSVDTFDYSFLH (SEQ ID NO: 27), RASNLES (SEQ ID NO: 28), e QQSNQDPYT (SEQ ID NO: 29), respectivamente; e em que a região constante de cadeia pesada de IgG1 compreende uma ou mais substituições de aminoácido selecionadas do grupo que consiste em K214R, C226S, C229S, e P238S, por numeração EU.

[0017] É fornecido no presente documento um anticorpo isolado que especificamente se liga a TREM-1, compreendendo uma cadeia pesada CDR1, CDR2, CDR3; uma cadeia leve CDR1, CDR2, CDR3; e uma região constante de cadeia pesada IgG1, em que a cadeia pesada CDR1, CDR2, e CDR3 compreende TYAMH (SEQ ID NO: 24), RIRTKSSNYATYYAASVKG (SEQ ID NO: 25), e DMGIRRQFAY (SEQ ID NO: 26), respectivamente; em que a cadeia leve CDR1, CDR2, e CDR3 compreende RASQSVDTFDYSFLH (SEQ ID NO: 27), RASNLES (SEQ ID NO: 28), e QQSNQDPYT (SEQ ID NO: 29), respectivamente; e em que a região constante de cadeia pesada de IgG1 compreende uma ou mais substituições de aminoácido selecionadas do grupo que consiste em S131C, K133R, G137E,G138S, Q196K, I199T, N203D, K214R, C226S, C229S, e P238S, por numeração EU.

[0018] Em algumas modalidades, TREM-1 compreende uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 7.

[0019] Em algumas modalidades, o anticorpo da presente invenção tem uma afinidade de ligação reduzida a FCYRI (CD64), FcYRIIA (CD32), FCYRIIB (CD32), FCYRIIIA (CD16a), FCYRIIIB (CD16b), ou qualquer combinação dos mesmos em comparação com um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácido como mencionado na SEQ ID NO: 76 e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácido como mencionado na SEQ ID NO: 54. Em algumas modalidades, o anticorpo tem uma afinidade de ligação reduzida a FCYRI (CD64) em pelo menos duas vezes, pelo menos três vezes, pelo menos quatro vezes, pelo menos cinco vezes, pelo menos seis vezes, pelo menos sete vezes, pelo menos oito vezes, pelo menos nove vezes, ou pelo menos 10 vezes em comparação com um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácido como mencionado na SEQ ID NO: 76 e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácido como mencionado na SEQ ID NO: 54.

[0020] Em algumas modalidades, o anticorpo descrito no presente documento é menos imunogênico em comparação com um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácido como mencionado na SEQ ID NO: 76 e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácido como mencionado na SEQ ID NO: 54. Em algumas modalidades, o anticorpo não agoniza a sinalização de TREM-1 em ligação a TREM-1 e na ausência de um estimulador. Em algumas modalidades, o anticorpo não induz a expressão de uma citocina inflamatória em células dendríticas imaturas (iDCs) quando as células são incubadas na presença do anticorpo e na ausência de um estimulador em comparação com um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácido como mencionado na SEQ ID NO: 76 e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácido como mencionado na SEQ ID NO: 54.

[0021] Em algumas modalidades, o anticorpo descrito no presente documento bloqueia a produção de uma citocina inflamatória em uma célula quando as células são ativadas na presença tanto do anticorpo, quando do estimulador. Em algumas modalidades, o estimulador é um ligante de TREM-1. Em algumas modalidades, a citocina inflamatória é selecionada do grupo que consiste em IL-6, TNF-α, IL-8, IL-1β, IL-12, proteína 1 tipo quitinase-3 (CHI3L1), e combinações das mesmas.

[0022] Em algumas modalidades, o anticorpo da presente invenção se liga a FcRn humano, FcRn cinomolgo, e/ou FcRn de camundongo de uma maneira dependente do pH. Em algumas modalidades, o anticorpo descrito no presente documento é mais termicamente estável em comparação com um anticorpo de referência compreendendo uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácido como mencionado na SEQ ID NO: 76 e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácido como mencionado na SEQ ID NO: 54, quando medido por um Calorímetro de varredura diferencial capilar (CAP-DSC). Em algumas modalidades, cerca de 10% a 20%, cerca de 20% a 30% (por exemplo, 24%), ou cerca de 30% a 40% do anticorpo é reversível quando é aquecido para 77°C. Em algumas modalidades, o anticorpo tem uma maior temperatura de fusão (Tm) em comparação com um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácido como mencionado na SEQ ID NO: 76 e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácido como mencionado na SEQ ID NO: 54.

[0023] Em algumas modalidades, o anticorpo descrito no presente documento tem uma menor viscosidade do que 5 cP, menor que 4 cP, menor que 3 cP, menor que 2,5 cP, menor que 2,4 cP, menor que 2,3 cP, menor que 2,2 cP, menor que 2,1 cP, menor que 2 cP, menor que 1,9 cP, menor que 1,8 cP, menor que 1,7 cP, menor que 1,6 cP, menor que 1,5 cP, menor que 1,4 cP, menor que 1,3 cP, menor que 1,2 cP, menor que 1,1 cP, menor que 1,0 cP, menor que 0,9 cP, menor que 0,8 cP, menor que 0,7 cP, menor que 0,6 cP, menor que 0,5 cP, menor que 0,4 cP, menor que 0,3 cP, menor que 0,2 cP, ou menor que 0,1 cP em uma concentração de 80 mg/mL. Em algumas modalidades, o anticorpo tem uma menor viscosidade do que 10 cP (por exemplo, 9 cP) em uma concentração de 130 mg/mL.

[0024] Em algumas modalidades, o anticorpo se liga a TREM-1 humano com um KD menor do que 4 nM (por exemplo, 3,4 nM) quando medido por Biacore. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga a TREM-1 cinomolgo com um KD menor do que 1 nM (por exemplo, 0,91 nM), quando medido por Biacore.

[0025] Em algumas modalidades, o anticorpo é monomérico quando observado por cromatografia líquida de alto desempenho por exclusão de tamanho (SE-HPLC). Em algumas modalidades, o anticorpo exibe risco mínimo de fragmentação quando observado por espectrometria de massa tandem de cromatografia líquida bidimensional (2D-LC/MS) ou análise de massa intacta usando espectrometria de massa tandem por cromatografia líquida (LC/MS). Em algumas modalidades, o anticorpo tem um ponto isoelétrico de 8 a 9 (por exemplo, 8,75).

[0026] Em algumas modalidades, o anticorpo é estável em uma formulação compreendendo histidina, sacarose, arginina, e NaCl. Em algumas modalidades, o anticorpo é estável durante pelo menos 2 meses em uma formulação compreendendo histidina a 20 mM, sacarose a 150 mM, 25 mM arginina, e 50 mMNaCl. Em algumas modalidades, a formulação está em um pH de 6,0 e/ou em que a formulação é armazenada a 4°C, 25°C, ou 40°C.

[0027] São também fornecidas aquimoléculas biespecíficas compreendendo um anticorpo anti-TREM-1 da presente invenção, ligada a uma molécula tendo uma segunda especificidade de ligação.

[0028] São fornecidos no presente documento ácidos nucleicos codificando o anticorpo descrito no presente documento, vetores compreendendo os ácidos nucleicos, e células transformadas com os vetores.

[0029] São fornecidos no presente documento imunoconjugados compreendendo os anticorpos anti-TREM-1 descrito no presente documento, ligado a um agente.

[0030] São fornecidas no presente documento composições compreendendo anticorpos anti-TREM-1, ou porções de ligação a antígeno dos mesmos, moléculas biespecíficas, ou imunoconjugados descritos no presente documento, e um veículo. São também fornecidos no presente documento kits compreendendo os anticorpos anti-TREM-1, ou porções de ligação a antígeno dos mesmos, moléculas biespecíficas, ou imunoconjugados descritos no presente documento, e instruções de uso.

[0031] É fornecido no presente documento um método de inibição da atividade de TREM-1 em um indivíduo em necessidade do mesmo, compreendendo administrar o anticorpo anti-TREM-1, a molécula específica, o ácido nucleico, o vetor, a célula, ou o imunoconjugado da presente invenção.

[0032] É fornecido no presente documento um método de tratamento de uma doença inflamatória ou uma doença autoimune em um indivíduo em necessidade do mesmo, compreendendo administrar o anticorpo anti-TREM-1, a molécula específica, o ácido nucleico, o vetor, a célula, ou o imunoconjugado da presente invenção. Em algumas modalidades, a doença inflamatória ou a doença autoimune é selecionada do grupo que consiste em uma doença do intestino inflamatória (IBD), Doença de Crohn (CD), colite ulcerativa (UC), síndrome do intestino irritável, artrite reumatoide (RA), psoríase, artrite psoriática, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), nefrite nefrite lúpica, vasculite, sepse, síndrome de resposta inflamatória sistêmica (SIRS), diabetes tipo I, Doença de Grave, esclerose múltipla (MS), miocardite autoimune, Doença Kawasaki, doença da artéria coronariana, doença pulmonar obstrutiva crônica, doença do pulmão intersticial, tireoidite autoimune, esclerodermia, esclerose sistêmica, osteoartrite, dermatite atópica, vitiligo, doença do enxerto versus hospedeiro, Síncrome de Sjogrens, nefrite autoimune, Síndrome de Goodpasture, polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica, alergia, asma, outras doenças autoimunes que são um resultado de inflamação aguda ou crônica, e quaisquer combinações das mesmas. Em algumas modalidades, o método também compreende administrar um ou mais produtos terapêuticos adicionais. Em algumas modalidades, as terapêuticas adicionais é um anticorpo anti-IP-10 ou um anticorpo anti-TNF-α.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS/FIGURAS

[0033] FIGs. 1A e 1B mostram que todas as variantes mAb 0318 ligam-se a TREM-1 humano e cinomolgo TREM-1 como o anticorpo mAb 0318 original (IgG4). FIG. 1A mostra os dados de adinidade de ligação para a variante 318-IgG1.3f para ambos os TREM-1 humanos (fileira de topo) e cinomolgo (fileira de base). A FIG. 1B mostra os dados de afinidade de ligação para diversas diferentes variedades de variantes mAb 0318 a TREM-1 humana. As diferentes variantes mostradas incluem: (i) 318-IgG1.1f, (ii) 318-IgG1.3f, (iii) 318-IgG4-Aba, (iv) 318-IgG1-Aba, e (v) 318-IgG1.1f (mutante M a Q). Os dados de afinidade de ligação para o anticorpo mAb 0318 (IgG4 A e B) foram fornecidos para propósitos de comparação na FIG. 1B.

[0034] As FIGs. 2A e 2B mostram a internalização de mAb 0318-IgG1.3f após ligação a TREM-1 expresso em monócitos de CD14+ em vários momentos após ligação a TREM-1. Na FIG. 2A, a expressão do receptor de TREM-1 0, 6, e 24horas após a ligação. Na FIG. 2B, a Expressão de receptor de TREM-1 foi analisada a 0, 4, e 20 horas após a ligação. FIG. 2B também fornece dados usando o anticorpo TREM26, que não compete com as variantes de anticorpo 0318 para ligação a TREM-1. O anticorpo TREM26 foi usado para avaliar o fato do receptor de TREM-1 uma vez que ele foi internalizado (por exemplo, se ele foi degradado ou reciclado novamente para a superfície).

[0035] FIG. 3 mostra que as variantes de mAb 0318 não agonizam a sinalização de TREM-1 quando medido pelo Ensaio de Célula Reporter de BWZ/hTREM-1 quando uma linhagem de célula reporter é incubada com ("Ambos") ou sem CHO-CD32 ("BWZ 36 apenas"). Os anticorpos variantes mostrados incluem: (i) 318-IgG1.1f ("IgG1.1f"), (ii) 318-IgG1.3f ("IgG1.3f"), (iii) 318-IgG4-Aba ("FcAba-4"), (iv) 318-IgG1- Aba ("FcAba-1"). O anticorpo MAB1278, um agonista conhecido da sinalização de TREM-1, foi usado como um anticorpo de controle positivo (veja a caixa inserida). o anticorpo 5C8 (controle de isótipo) foi usado como um controle negativo.

[0036] A FIG. 4 mostra a potência das diferentes varianes de mAb 0318 diferentes no bloqueio de produção mediada por TREM-1 de citoinas inflamatórias por diferentes células humanas diferentes. As variantes de anticorpo mAb 0318 mostradas na FIG. 4 inibem a liberação mediada por TREM-1 de citocinas inflamatórias (por exemplo, TNF-α, IL-6, ou IL-8) de diferentes tipos celulares humanos: PBMC, monócitos, neutrófilos, e Sangue total sedimentado de RBC (isto é, maioria de células sanguíneas vermelhas removidas usando o protocolo de sedimentação de RBC com base em dextrana como descrito nos Exemplos). Para produzir as citocinas inflamatórias, as células foram estimuladas com PGRP1 ligado à placa e peptidoglicano solúvel que não tem atividade TLR2 ("PGRP + PGN-Ecndss") ou neutrófilos estimulados por forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) expressano PGRP1 ("PMA-Stim Neutrophil Endogenous PGRP"). Os anticorpos variantes mostrados incluem: (i) 0318-IgG4, (ii) 0318- IgG1.3f, (iii) 0318-IgG1.1f, (iv) 0318-IgG1-Aba, e (v) 318-IgG4-Aba. "N/D" indica que o nível de expressão da citocina inflamatória particular não foi determinada.

[0037] FIGs. 5A e 5B mostram a potência de mAb 0318-IgG1.3f para bloquear a produção de IL-8 de sangue total após estimulação com PGN com ou sem PGRP1 na presença de inibidor de NOD2. A FIG. 5A fornece os dados de inibição gerados usando o ensaio de farmacodinâmicas de sangue total, como descrito nos Exemplos. A IG. 5B fornece os dados de inibição gerados usando o ensaio de citocina intracelular de sangue total como descrito nos Exemplos.

[0038] As FIGs. 6A a 6C mostram os níveis de expressão de RNA de proteína 1 tipo quitinase-3 ("CHI3L1") (FIG. 6A), IL-1β (FIG. 6B), e IL-6 (FIG. 6C) de sangue total estimulado na presença de concentrações variáveis de mAb 0318-IgG1.3f (0-1 nM). Sangue total foi coletado de três diferentes doadores (#126, #290, e #322) e estimulado com PGRP1 solúvel e peptidoglicano solúvel que não possui atividade de TLR2 ("PGRP Solúvel + PGN-Ecndss Solúvel"). Em cada uma das FIGs. 6A a 6C, os níveis de expressão de RNA (y- eixo) são mostrados como ambos % de inibição (coluna direita) e ΔΔCt (diferença entre o valor de um gene de referência e o valor da amostra teste) (coluna esquerda). As diferentes concentrações do anticorpo 0318-IgG1.3f são mostradas no eixo x.

[0039] A FIG. 7 mostra o perfil de concentração de viscosidade de ambos os 318-IgG1.1f (quadrado) e os anticorpos variantes 318- IgG1.3f (círculo). O perfil de viscosidade foi gerado deo esquema de diluição usando o viscômetro dinâmico Rheosense m-VROC usando uma varredura de cisalhamento de 3 pontos para cada ponto em temperature constante. A linha sólida fornece o melhor ajuste de curva não linear para os dados mostrados. A linha pontilhada mostra o nível máximo de viscosidade permitido para eficácia.

[0040] A FIG. 8 mostra que ambos os anticorpos variantes 318-IgG1.1f e o 318-IgG1.3f têm baixo a médio risco de imunogenicidade. VL6 (IL-21RmAb imunogênico) e KLH (hemocianina lapa em buraco de fechadura) foram usados como controles positivos. Avastina foi usada como um controle negativo.

[0041] As FIGs. 9A e 9B mostram que todas as variantes mAb 0318 são capazes de se ligarem a FcRn (humano (preto), cino (branco), e preto (cinza)) de uma maneira dependente do pH. A FIG. 9A fornece a ligação de FcRn % de Rmax (capacidade de ligação de FcRn máxima). FIG. 9B fornece a ligação de FcRn como sensorgramas. As variantes de anticorpo 0318 mostradas incluem: (i) IgG1-Aba, (ii) IgG4-Aba, (iii) IgG1.1f, e (iv) IgG1.3f. O anticorpo mAb 0318 (IgG4) é também mostrado para propósitos de comparação.

[0042] As FIGs. 10A e 10B mostra que todas as variantes de anticorpo mAb 0318 demonstram ligação diminuída a um ou mais dos FCYRS humanos (isto é, CD64, variante CD32a-H131, variante CD32a- R131, CD32b, variante CD16a-V158, e variante CD16B-NA2). A FIG. 10A mostra a afinidade de ligação como % de Rmax (capacidade maxima de FCYR). A FIG. 10B mostra os sensogramas. As variantes de anticorporpo 0318 mostradas incluemn: (i) IgG1-Aba, (ii) IgG4-Aba, (iii) IgG1.1f, e (iv) IgG1.3f. O anticorpo mAb 0318 (IgG4) é mostrado para propósitos de comparação. Anticorpo 1F4-hIgG1f, que é conhecido ligar-se a múltiplos FCYRS, foi usado como um controle.

[0043] FIGs. 11A a 11I mostra que os anticorpos variantes 0318 não são agonísticos em si próprios (isto é, na ausência de um estímulo), quando medido pela liberação de diferentes citocinas inflamatórias (por exemplo, IL-6, TNF-α, e IL-12) quando cultivadas com células dendríticas imaturas. As FIGs. 11A, 11B, e 11C fornecem a quantidade de IL-6 produzida para células dendríticas imaturas isoladas de doadores D179, D276, e D341, respectivamente. FIGs. 11D, 11E, e 11F fornecem a quantidade de TNF-α produzida por células dendríticas imaturas isoladas de doadores D179, D276, e D341, respectivamente. FIGs. 11G, 11H, e 11I fornecem a quantidade de IL-12 produzida para células dendríticas imaturas isoladas de doadores D179, D276, e D341, respectivamente. As variantes de anticorpo 0318 mostradas inclem: (i) IgG1.1f, (ii) IgG1.3f, e (iii) IgG1- Aba. As dosagens (μg/mL) dos anticorpos usados são mostradas em parênteres. As células dendríticas imaturas foram cultivadas com as variantes de ancicorpo anti-TREM-1 com e sem membrane CD32a expressando células CHO (para estimular a reticulação de Fc). Trímero de PGRP+PGN, CD40L ("Trímero"), e anticorpo agonista anti- CD40 de Pfizer ("CP870") foram usados como controles positivos. O anticorpo de ispótipo ("CHIL-6") foi usado como um controle negativo. A linha pontilhada mostra o menor limite de detecção para o ensaio.

[0044] A FIG. 12 mostra os farmacocinéticos de única dose de variante mAb 0318-IgG1.3f em um macaco cinomolgo seguindo administração subcutânea. Cada um dos animais recebeu uma das seguintes doses: (i) 0,1 mg/kg (n=4) ("1"), (ii) 0,5 mg/kg (n=4) ("2"), (iii) 2 mg/kg (n=3) ("3"), ou (iv) 10 mg/kg (n=4) ("4"). Os dados são mostrados como a média ± desvio padrão.

[0045] A FIG. 13 mostra o esquema de disposição de fármaco mediado pelo alvo usado para descrever a os dados farmacocinéticos (PK), farmacodinâmicos (PD), e de ocupação do receptor (RO) em macacos cinomolgos.

[0046] As FIGs. 14A e 14B mostram a densidade de receptor TREM-1 total sobre os monócitos (FIG. 14A) e granulócitos (FIG. 14B) após dose única (administração subcutâneous (sc) ou intravenosa (iv)) de variante mAb 0318-IgG1.3f em macado cinomolgo. A densidade de receptor TREM-1 é mostrada como uma percentage da densidade do receptor TREM-1 antes da administração do anticorpo. Cada um dos animais recebeu uma das seguintes doses: (a) 0,1 mg/kg (sc) (n=4) ("A"), (b) 0,5 mg/kg (n=4) (sc) ("B"), (c) 2 mg/kg (n=3) (sc) ("C"), (d) 2 mg/kg (n=3) (iv) ("D"), ou (e) 10 mg/kg (n=4) (sc) ("E"). Os dados são mostrados como a media ± desvio padrão.

[0047] As FIGs. 15A e 15B mostram a ocupação do receptor TREM-1 sobre os monócitos (FIG. 15A) e granulócitos (FIG. 15B) após única dose de variante mAb 0318-IgG1.3f em macaco cinomolgo. Os dados de ocupação do receptor são mostrados como uma percentagem do receptor TREM-1 total expressos nas células. Cada um dos animais recebeu uma das seguintes: (a) 0,1 mg/kg (sc) (n=4) ("A"), (b) 0,5 mg/kg (n=4) (sc) ("B"), (c) 2 mg/kg (n=3) (sc) ("C"), (d) 2 mg/kg (n=3) (iv) ("D"), ou (e) 10 mg/kg (n=4) (sc) ("E"). Os dados são mostrados como a média ± desvio padrão. A linha pontilhada mostra 85% de ocupação do receptor.

[0048] As FIGs. 16A e 16B mostram o observado (ciclo aberto) e modelo predito (linha sólida) PK (painel esquerdo superior), PD (painel direito superior), RO (painel esquerdo de base), e expressão de receptor de TREM-1 de superfície total (painel direito de base) após uma dose única de variante mAb 0318-IgG1.3f em macaco cinomolgo descrito por um modelo PK de 2 compartimentos com TMDD em compartimento central. Na FIG. 16A, cada um dos macacos recebeu uma única dose de 0,1 mg/kg do anticorpo subcutaneamente. Na FIG. 16B, os animais receberam uma dose única de 10 mg/kg do anticorpo subcutaneamente.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0049] De modo que a presente descrição possa ser mais facilmente entendida, certos termos são primeiro definidos. Definições adicionais são mencionadas em toda a descrição detalhada.

[0050] Deve ser observado que o termo "um, uma (a)" ou " um, uma (an)"entidade refere-se a uma ou mais daquela entidade; por exemplo, "uma sequência de nucleotídeo," é entendido representar uma ou mais sequências de nucleotídeo. Assim sendo, os termos "um, uma (a)" (ou " um, uma (an)"), "um ou mais," e "pelo menos um" podem ser usados alternadamente no presente documento.

[0051] Além disso, "e/ou" onde usado no presente documento deve ser tomado como descrição específica de cada uma das características específicas ou componentes com ou sem o outro. Desse modo, o termo "e/ou" como usado em uma frase como "A e/ou B" no presente documento é pretendido incluir "A e B," "A ou B," "A" (sozinho), e "B" (sozinho). Igualmente, o termo "e/ou" quando usado em uma frase tal como "A, B, e/ou C"é pretendido abranger cada um dos seguintes aspectos: A, B, e C; A, B, ou C; A ou C; A ou B; B ou C; A e C; A e B; B e C; A (sozinho); B (sozinho); e C (sozinho).

[0052] É entendido que onde quer que os aspectos sejam descritos no presente documento com a linguagem "compreendendo," de outra forma aspectos análogos descritos nos termos de "consistindo em" e/ou "consistindo essencialmente em" são também fornecidos.

[0053] A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento possuem o mesmo significado como comumente entendido por alguém versado na técnica, a qual esta descrição é relacionada. Por exemplo, o Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei- Show, 2a ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3a ed., 1999, Academic Press; e o Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press, fornecem alguém de experiência com um dicionário geral de muitos termos usados nesta descrição.

[0054] Unidades, prefixos, e símbolos são denotados em seu formulário aceito do Sistema Internacional de Unidades (SI).As variações numéricas são inclusive dos números definindo a variação. A não ser que de outra forma indicado, as sequências de nucleotídeo são escritas da esquerda para direita em orientação de 5' a 3'.As sequências de aminoácido são escritas da esquerda para a direita na orientação de amino a carbóxi. Os títulos fornecidos no presente documento não são limitações dos vários aspectos da descrição, a qual pode ser tida por referência à especificação como um todo. Consequentemente, os termos definidos imediatamente abaixo são mais completamente definidos com referência à especificação em sua totalidade.

[0055] O termo "cerca de" é usado no presente documento para significar aproximadamente, em torno de, por volta de, ou nas regiões de.Quando o termo "cerca de" é usado em conjunto com uma variação numérica, ele modifica esse intervalo estendendo os limites acima e abaixo os valores numéricos apresentados. Em geral, o termo "cerca de" pode modificar um valor numérico acima e abaixo do valor estabelecido por uma variância de, por exemplo, 10 por cento, acima ou abaixo (maior ou menor).

[0056] O termo "receptor de ativação expresso em células 1 mieloides" (também conhecido como TREM1, TREM-1, e CD354) refere-se a um receptor que é expresso em monócitos, macrófagos e neutrófilos. Ligante primário para TREM-1 inclui proteína 1 de reconhecimento de peptidoglicano (PGLYRP1), que pertence a uma família de proteínas de ligação de peptidoglicano (PGN) (PGRPs). Quando ativado, TREM-1 associa-se com a proteína adaptadora de sinalização contendo ITAM, DAP12.A sinalização a jusante pode incluir a ativação do fator de transcrição NFAT, causando uma super- regulação da produção de citocina pró-inflamatória. O termo "TREM-1" inclui quaisquer variantes ou isoformas de TREM-1 que são naturalmente expressas pelas células. Consequentemente, em algumas modalidades, os anticorpos descritos no presente documento podem reagir de modo cruzado com TREM-1 a partir da espécie que não a humana (por exemplo, TREM-1 de cinomolgo).

[0057] Três isoformas de TREM-1 humano foram identificadas. A isoforma 1 (Número de Acesso NP_061113.1; SEQ ID NO: 1) consiste em 234 aminoácidos e representa a sequência canonical.A Isoforma 2 (N° de Acesso NP_001229518.1; SEQ ID NO: 2) consiste em 225 aminoácidos e difere da sequência canonical em resíduos de aminoácido 201-234.Os resíduos de aminoácido codificam parte do domínio da transmembrana e do domínio citoplásmico. A Isoforma 3 (N° de Acesso NP_001229519; SEQ ID NO: 3) consiste em 150 aminoácidos, e é solúvel. Ela não possui os resíduos de aminoácido 151-234, que codifica o domínio de transmembrana, o domínio citoplásmico, e parte do domínio extracelular.Os resíduos de aminoácido 138-150 também diferem da sequência canonical acima descrita.

[0058] Abaixo estão as sequências de aminoácido das três conhecidas isoformas de TREM-1 humano. (A) A isoforma 1 de TREM-1 humano (N° de Acesso NP_061113,1; SEQ ID NO: 1; codificada pela sequência de nucleotídeo tendo o N° de Acesso NM_018643; SEQ ID NO: 4): MRKTRLWGLLWMLFVSELRAATKLTEEKYELKEGQTLDVKCDYTLEK FASSQKAWQIIRDGEMPKTLACTERPSKNSHPVQVGRIILEDYHDHG LLRVRMVNLQVEDSGLYQCVIYQPPKEPHMLFDRIRLVVTKGFSGTP GSNENSTQNVYKIPPTTTKALCPLYTSPRTVTQAPPKSTADVSTPDSE INLTNVTDIIRVPVFNIVILLAGGFLSKSLVFSVLFAVTLRSFVP (a sequência sinal é sublinhada); (B) A isoforma 2 de TREM-1 humano (N° de Acesso NP_001229518,1; SEQ ID NO: 2; codificada pela sequência de nucleotídeo tendo o N° de Acesso NM_001242589; SEQ ID NO: 5): MRKTRLWGLLWMLFVSELRAATKLTEEKYELKEGQTLDVKCDYTLEK FASSQKAWQIIRDGEMPKTLACTERPSKNSHPVQVGRIILEDYHDHG LLRVRMVNLQVEDSGLYQCVIYQPPKEPHMLFDRIRLVVTKGFSGTP GSNENSTQNVYKIPPTTTKALCPLYTSPRTVTQAPPKSTADVSTPDSE INLTNVTDIIRYSFQVPGPLVWTLSPLFPSLCAERM (a sequência sinal é sublinhada); (C) A isoforma 3 de TREM-1 humano (N° de Acesso NP_001229519; SEQ ID NO: 3; codificada pela sequência de nucleotídeo tendo o N° de Acesso NM_001242590; SEQ ID NO: 6): MRKTRLWGLLWMLFVSELRAATKLTEEKYELKEGQTLDVKCDYTLEK FASSQKAWQIIRDGEMPKTLACTERPSKNSHPVQVGRIILEDYHDHG LLRVRMVNLQVEDSGLYQCVIYQPPKEPHMLFDRIRLVVTKGFRCST LSFSWLVDS (a sequência sinal é sublinhada).

[0059] A proteína de TREM-1 cinomolgo (N° de Acesso XP_001082517; SEQ ID NO: 7)é prognosticada para ter a seguinte sequência de aminoácido: MRKTRLWGLLWMLFVSELRATTELTEEKYEYKEGQTLEVKCDYALEK YANSRKAWQKMEGKMPKILAKTERPSENSHPVQVGRITLEDYPDHG LLQVQMTNLQVEDSGLYQCVIYQHPKESHVLFNPICLVVTKGSSGTP GSSENSTQNVYRTPSTTAKALGPRYTSPRTVTQAPPESTVVVSTPGS EINLTNVTDIIRVPVFNIVIIVAGGFLSKSLVFSVLFAVTLRSFGP (a sequência sinal é sublinhada).

[0060] A presente descrição refere-se a anticorpos que especificamente ligam-se e bloqueiam a função de TREM-1.Os anticorpos bloqueiam a função de TREM-1 reduzindo/bloqueando a ativação deTREM-1 e a sinalização a jusante.

[0061] Os anticorpos anti-TREM-1 da presente descrição bloqueiam a sinalização de TREM-1 por meio de um ou uma combinação de vários diferentes mecanismos, bloqueando TREM-1 diretamente ou indiretamente. Em uma modalidade, os anticorpos previnem o ligante natural de TREM-1, proteína 1 de reconhecimento de peptidoglicano (PGLYRP1), a partir da criação de um complexo funcional com TREM-1. Em outra modalidade, os anticorpos bloqueiam TREM-1 prevenindo as moléculas de TREM-1 individual de formar dímeros ou multímeros. Em algumas modalidades, a dimerização ou multimerização de TREM-1 é reduzida ou prevenida por anticorpos anti-TREM-1 que são capazes de ligar-se a uma porção de TREM-1 que de outra forma estaria presente na interface de um dímero de TREM-1, desse modo prevenindo as moléculas de TREM-1 individual de associação uma com a outra. Em outras modalidades, a dimerização ou multimerização de TREM-1 é reduzida ou prevenida por anticorpos anti-TREM-1 que interferem com a interação de TREM- 1 com seu ligante.

[0062] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TREM-1 podem bloquear a ativação induzida por PGLYRP1 de TREM-1. PGLYRP1, uma altamente conservada proteína longa de 196 aminoácidos consistindo em um peptídeo sinal e um domínio de ligação de peptidoglicano, é expressa em neutrófilos e liberada sob sua ativação. A sequência de aminoácido de PGLYRP1 (N° de Acesso NP_005082.1; SEQ ID NO: 8) é fornecida abaixo:MSRRSMLLAWALPSLLRLGAAQETEDPACCSPIVPRNEWKALASEC AQHLSLPLRYVVVSHTAGSSCNTPASCQQQARNVQHYHMKTLGWC DVGYNFLIGEDGLVYEGRGWNFTGAHSGHLWNPMSIGISFMGNYMD RVPTPQAIRAAQGLLACGVAQGALRSNYVLKGHRDVQRTLSPGNQL YHLIQNWPHYRSP (a sequência sinal é sublinhada).

[0063] Consequentemente, em algumas modalidades, os anticorpos anti-TREM-1da presente descrição sub-regulam ou bloqueiam a liberação de citocinas proinflamatórias de células mieloides (por exemplo, células dendríticas e monócitos). Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TREM-1 bloqueiam a liberação de TNF-α, MIP-1beta, MCP-1, IL-1beta, GM-CSF, IL-6 e/ou IL-8 de macrófagos, neutrófilos, células de tecido sinoviale/ou uma célula repórter, como descrito no presente documento.

[0064] Ao mesmo tempo em que a liberação controlada de citocinas inflamatórias em resposta aos antígenos estranhos pode ser benéfica (por exemplo, montando uma resposta imune adaptativa eficaz), a liberação de citocina inflamatória em excesso pode ter consequências terríveis. Por exemplo, uma complicação clínica tóxica e comum que foi observada com a administração in vivode certos anticorpos contra os receptores imunes da superfície celular (por exemplo, os anticorpos CD3 anti-humano tal como OKT3) é a síndrome da liberação de citocina (CRS), a qual é associada com a liberação excessiva de várias citocinas (por exemplo, TNF-alfa, IFN- gama, e IL-2) na circulação. CRS pode ocorrer como um resultado da ligação simultânea dos anticorpos a seu antígeno cognato (por exemplo, CD3 em células T) (por meio da região variável do anticorpo) e os receptores de Fc (por exemplo, FCYRS) e/ou receptores de complemento (por meio da região constante do anticorpo) nas células acessórias (por exemplo, células apresentando antígeno).A interação resulta na ativação das células (por exemplo, células T e/ou células acessórias) e a liberação de várias citocinas que produzem uma resposta inflamatória sistêmica caracterizada por hipotensão, pirexia e rigores. Outros sintomas de CRS incluem febre, arrepios, náusea, vômito e dispneia.

[0065] Além de bloquear a produção induzida por PGLYRP1 de citocinas inflamatórias, em uma modalidade, os anticorpos anti-TREM- 1 da presente descrição reduzem a incidência de ou resulta em nenhuma incidência de síndrome de liberação de citocina quando administrados a um indivíduo em necessidade destes. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TREM-1não induzem a expressão de citocinas inflamatórias por células (por exemplo, células dendríticas) quando as células são incubadas na presença do anticorpo sozinho, comparado com um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácido como apresentado em SEQ ID NO: 76 e uma cadeia leve consistindo na sequência de aminoácido como apresentado na SEQ ID NO: 54. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TREM-1 têm diminuído a ligação a um ou mais FcyRs, que pode ajudar a reduzir o início de CSR.

[0066] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TREM-1 da presente descrição ligam-se igualmente a TREM-1 humano e TREM-1 de outras espécies. O termo "TREM-1", como no presente documento usado, desse modo abrange qualquer forma de ocorrência natural de TREM-1, que pode ser derivado de qualquer organismo adequado. Por exemplo, o TREM-1 para o uso como descrito no presente documento pode ser TREM-1 vertebrado, tal como TREM-1 mamífero, tal como TREM-1 de um primata (tal como um humano, um chimpanzé, um macaco cinomolgo, ou um macaco reso); um roedor (tal como um camundongo ou um rato), um lagomorfo (tal como um coelho), ou um artiodactil (tal como uma vaca, ovelha, porco ou camelo). Em certas modalidades, TREM-1 é SEQ ID NO: 1 (TREM-1 humano, isoforma 1). O TREM-1 pode ser uma forma madura de TREM-1, tal como uma proteína de TREM-1 que passou por um processamento pós- translacional dentro de uma célula adequada. Tal como uma proteína de TREM-1 madura pode, por exemplo, ser glicosilada. O TREM-1 pode ser uma proteína TREM-1 de tamanho natural.

[0067] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TREM-1 da presente descrição são anticorpos monoclonais, no sentido de que eles são diretamente ou indiretamente derivados de um único clone de um linfócito B. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TREM-1 são produzidos, analisados e purificados usando-se, por exemplo, os métodos descritos nos Exemplos de Publicação Internacional N°WO 2013/120553. Em resumo, um camundongo adequado tal como um camundongo nocaute (KO) TREM-1 ou TREM- l/TREM-3 é imunizado com TREM-1, um TREM-1 expressando a célula, ou uma combinação de ambos. Em outra modalidade, os anticorpos anti-TREM-1 são anticorpos policlonais, no sentido de que eles são mistura de anticorpos monoclonais como descrito no presente documento.

[0068] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TREM-1 da corrente descrição são recombinantemente expressos em células procarióticas ou eucarióticas. Em algumas modalidades, a célula procariótica é E. coli. Em certas modalidades, a eucariótica é uma levedura, inseto, ou célula de mamífero, tal como uma célula derivada de um organismo que é um primata (tal como um humano, um chimpanzé, um macaco cinomolgo ou um macaco reso), um roedor (tal como um camundongo ou um rato), um lagomorfo (tal como um coelho) ou um artiodactil (tal como uma vaca, ovelha, porco ou camelo).As linhagens celulares de mamífero adequadas incluem, porém não são limitadas a, células HEK293, células CHO, e células HELA.Os anticorpos anti-TREM-1, como descritos no presente documento, podem também ser produzidos por meio de outros métodos conhecidos pela pessoa versada na técnica, tal como exibição de fago ou exibição de levedura. Uma vez produzidos, osanticorpos podem ser avaliados ligando-se a, por exemplo, TREM-1 de tamanho natural ou mutantes deste nos Exemplos da Publicação Internacional N° WO 2013/120553.

[0069] O termo "anticorpo" como usado no presente documento se refere a uma proteína, derivada de uma sequência de imunoglobulina de linha germinativa, que é capaz de especificamente se ligar a um antígeno (TREM-1) ou uma porção deste. O termo inclui os anticorpos de tamanho natural de qualquer classe ou isotipo (isto é, IgA, IgE, IgG, IgM e/ou IgY) e qualquer cadeia única ou fragmento destes. Um anticorpo que especificamente liga-se a um antígeno, ou porção deste, pode ligar-se exclusivamente àquele antígeno, ou porção deste, ou ele pode ligar-se a um número limitado de antígenos homólogos, ou porções destes. Os anticorpos de tamanho natural normalmente compreendem pelo menos quatro cadeias de polipeptídeos: duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) que são interconectadas por ligações de dissulfeto. Uma subclasse de imunoglobulina de interesse farmacêutico particularé a família IgG.Em humanos, a classe IgG pode ser subdividida em 4 subclasses: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, com base na sequência de suas regiões constantes de cadeia pesada. As cadeias leves podem ser divididas em dois tipos, capa e lambda, com base nas diferenças em sua composição de sequência. As moléculas IgG são compostas de duas cadeias pesadas, interligadas por duas ou mais ligações de dissulfeto, e duas cadeias leves, cada qual ligada a uma cadeia pesada por uma ligação de dissulfeto. Uma cadeia pesada pode compreender uma região variável de cadeia pesada (VH) e até três regiões constantes de cadeia pesada (CH): CH1, CH2 e CH3. Uma cadeia leve pode compreender uma região variável de cadeia leve (VL) e uma região constante de cadeia leve (CL).As regiões VH e VL podem ser também subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões de determinação de complementaridade (CDRs), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões regiões de estrutura (FR). As regiões VH e VL são tipicamente compostas de três CDRs e quatro FRs, organizadas do terminal amino ao terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões hipervariáveis das cadeias pesada e leve formam um domínio de ligação que é capaz de interagir com um antígeno, enquanto a região constante de um anticorpo pode mediar a ligação da imunoglobulina aos fatores ou tecidos de hospedeiro, incluindo, porém não limitado a, várias células do sistema imune (células efetoras), receptores de Fc e o primeiro componente (C1q) do sistema de complemento clássico. Os anticorpos da corrente invenção podem ser isolados. O termo "anticorpo isolado" refere-se a um anticorpo que foi separado e/ou recuperado de outro(s) componente(s) no meio ambiente em que ele foi produzido e/ou que foi purificado a partir de uma mistura de componentes presentes no meio ambiente em que ele foi produzido. Certos fragmentos de ligação de antígeno dos anticorpos podem ser adequados no contexto da corrente invenção, como foi mostrado que a função de ligação de antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de tamanho natural.

[0070] O termo "porção de ligação a antígeno" de um anticorpo refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retém a capacidade de especificamente se ligar a um antígeno, tal como TREM-1, como descrito no presente documento. Exemplos de fragmentos de ligação de antígeno incluem Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, F(ab)S, Fv (tipicamente os domínios VL e VH de uma ramificação única de um anticorpo), Fv de cadeia única (scFv; ver, por exemplo, Bird et al., Science 242:42S-426 (1988); Huston et al., PNAS 85: 58795883 (1988)), dsFv, Fd (tipicamente os domínios VH e CH1), e fragmentos de dAb (tipicamente um domínio VH); domínios de VH, VL, VhH, e V-NAR; as moléculas monovalentes compreendendo um VH único e uma cadeia de VL único; minicorpos, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, e corpos capa (ver, por exemplo, Ill et al., Protein Eng 10:949-57 (1997)); IgG de camelo; IgNAR; bem como um ou mais CDRs isolados ou um paratopo funcional, onde os CDRs isolados ou os resíduos de ligação de antígeno ou polipeptídeos podem ser associados ou ligados juntos a fim de formar um fragmento de anticorpo funcional. Vários tipos de fragmentos de anticorpo foram descritos ou revistos em, por exemplo, Holliger e Hudson, Nat Biotechnol 2S:1126-1136 (2005); Publicação Internacional N° WO 2005/040219, e Publicações dos Estados Unidos Nos 2005/0238646 e 2002/0161201. Estes fragmentos de anticorpo podem ser obtidos usando-se técnicas convencionais conhecidas por aqueles versados na técnica, e os fragmentos podem ser avaliados pela utilidade da mesma maneira como os anticorpos intactos.

[0071] Um anticorpo "humano" (HuMAb) refere-se a um anticorpo tendo regiões variáveis em que ambas regiões de estrutura e CDR são derivadas de sequência de imunoglobulina de linha germinativas humana.Além disso, se o anticorpo contém uma região constante, a região constante também é derivada de sequência de imunoglobulina de linha germinativas humana. Os anticorpos anti-TREM-1 descritos no presente documento podem incluir resíduos de aminoácido não codificados pela sequência de imunoglobulina de linhas germinativas humanas (por exemplo, as mutações introduzidas por mutagênese específica do sítio ou aleatória in vitro ou por mutação somática in vivo).Entretanto, o termo "anticorpo humano", como no presente documento usado, não é pretendido incluir anticorpos em que as sequências CDR derivadas da linha germinativa de outras espécies de mamífero, tal como um camundongo, foram enxertadas nas sequências de estrutura humana. Os termos anticorpos "humano" e anticorpos "completamente humanos" são usados sinonimamente.

[0072] Um anticorpo "humanizado" refere-se a um anticorpo quimérico humano/não humano que contém uma ou mais sequências (regiões CDR ou partes destas) que são derivadas de uma imunoglobulina não humana.Um anticorpo humanizado é, desse modo, uma imunoglobulina humana (anticorpo recipiente) em que pelo menos os resíduos de uma região hipervariável do recipiente são substituídos pelos resíduos de uma região hipervariável de um anticorpo de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como de um camundongo, rato, coelho ou primata não humano,que possui a especificidade desejada, afinidade, composição de sequência e funcionalidade. Em alguns casos, os resíduos de FR da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Um exemplo de tal modificação é a introdução de uma ou mais, assim chamadas, mutações reversas, as quais são tipicamente resíduos de aminoácido derivados do anticorpo doador. A humanização de um anticorpo pode ser realizada usando-se técnicas recombinantes conhecidas pela pessoa versada na técnica (ver, por exemplo, Antibody Engineering, Methods in Molecular Biology, vol. 248, editado por Benny K. C. Lo). Uma estrutura recipiente humana adequada para ambos os domínios variáveis de cadeia leve e pesada pode ser identificada por, por exemplo, homologia estrutural ou sequência. Alternativamente, as estruturas de recipiente fixas podem ser usadas, por exemplo, com base no conhecimento da estrutura, propriedades biofísicas e bioquímicas. As estruturas recipientes podem ser da linha germinativa derivada de uma sequência de anticorpo madura. As regiões de CDR do anticorpo do doador podem ser transferidas por enxerto de CDR.O anticorpo humanizado enxertado de CDR pode ser também otimizado por, por exemplo, afinidade, funcionalidade e propriedades físicas pela identificação de posições de estrutura críticas, onde a reintrodução (mutação reversa) do resíduo de aminoácido do anticorpo doador possui impacto benéfico nas propriedades do anticorpo humanizado. Além do anticorpo doador derivado das mutações reversas, o anticorpo humanizado pode serplanejado pela introdução de resíduos da linha germinativa nas regiões de estrutura ou CDR, eliminação de epítopos imunogênicos, mutagênese direcionada ao sítio, maturação de afinidade, etc.

[0073] Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo recipiente ou no anticorpo doador. Estas modificações são feitas para também aperfeiçoar o desempenho do anticorpo. Em geral, um anticorpo humanizado compreenderá pelo menos um - tipicamente dois - domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as regiões de CDR correspondem àqueles de uma imunoglobulina não humana e em que todos ou substancialmente todos os resíduos de FR são aqueles de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado pode, opcionalmente, também compreender pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. O termo "derivado de anticorpo humanizado "refere-se a qualquer forma modificada do anticorpo humanizado, tal como um conjugado do anticorpo e outro agente ou anticorpo.

[0074] O termo "anticorpo humano recombinante," como no presente documento usado, inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por métodos recombinantes, tal como (a) anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico ou transcromossômico para os genes de imunoglobulina humana ou um hibridoma preparado destes, (b) anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo, por exemplo, de um transfectoma, (c) anticorpos isolados de uma biblioteca de anticorpo humano combinatória, recombinante, e (d) anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por quaisquer outros métodos que envolva a ligação de sequências de gene de imunoglobulina humana a outras sequências de DNA. Tais anticorpos humanos recombinantes compreendem regiões variáveis e constantes que utilizam sequência de imunoglobulina humana particular de linhas germinativas são codificados pelos genes de linhas germinativas, porém incluem recombinações subsequentes e mutações que ocorrem, por exemplo, durante a maturação do anticorpo. Como conhecido na técnica (ver, por exemplo, LonbergNature Biotech. 23(9): 1117- 1125 (2005)), a região variável contém o domínio de ligação de antígeno, que é codificado por vários genes que reorganizam-se para formar um anticorpo específico para um antígeno estranho. Além da reorganização, a região variável pode ser também modificada por múltiplas mudanças de aminoácido simples (referido como mutação somática ou hipermutação) para aumentar a afinidade do anticorpo com o antígeno estranho. A região constante mudará em outra resposta a um antígeno (isto é, mudança de isotipo).Portanto, as moléculas de ácido nucleico somaticamente mutadas e reorganizadas que codificam os polipeptídeos de imunoglobulina de cadeia leve e cadeia pesada em resposta a um antígeno, não podem ter identidade de sequência com as moléculas originais de ácido nucleico, porém, em vez disso, será substancialmente idêntica ou similar (isto é, tem pelo menos 80% de identidade).

[0075] Um "anticorpo quimérico" refere-se a um anticorpo em que as regiões variáveis são derivadas de uma espécie e as regiões constantes são derivadas de outras espécies, tal como um anticorpo em que as regiões variáveis são derivadas de um anticorpo de camundongo e as regiões constantes são derivadas de um anticorpo humano.

[0076] Em uma modalidade, os anticorpos anti-TREM-1 da corrente descrição são anticorpos IgG. Um "anticorpo IgG", por exemplo, um IgG1 humano, como usado no presente documento, possui, em certas modalidades, a estrutura de um anticorpo IgG de ocorrência natural, isto é, ele possui o mesmo número de cadeias pesadas e leves e ligações de dissulfeto como um anticorpo IgG de ocorrência natural da mesma subclasse. Por exemplo, o anticorpo IgG1 de TREM-1 consiste em duas cadeias pesadas (HCs) e duas cadeias leves (LCs), em que as duas cadeias pesadas e cadeias leves são ligadas pelo mesmo número e localização de pontes de dissulfeto que ocorrem em anticorpo IgG1 de ocorrência natural (a não ser que o anticorpo tiver sido mutado para modificar as pontes de dissulfeto).

[0077] Como no presente documento usado, "isótipo" refere-se a classe de anticorpo (por exemplo,anticorpo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD, e IgE) que é codificada pelos genes da região constante de cadeia pesada.

[0078] "Alotipo" refere-se às variantes de ocorrência natural dentro de um grupo de isotipo específico, as quais variantes diferem em alguns aminoácidos (ver, por exemplo,Jefferis et al., mAbs 1:1 (2009)).Os anticorpos anti-TREM-1 descritos no presente documento podem ser de qualquer alotipo.Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TREM-1 são do alotipo "IgG1.3f", o qual compreende uma ou mais substituições de aminoácido selecionados do grupo consistindo em L234A, L235E, e G237A, pela numeração EU, como comparado a um isotipo de IgG1 tipo silvestre (por exemplo, SEQ ID NO: 9). Em outras modalidades, os anticorpos anti-TREM-1 são do alotipo "IgG1.1f", o qual compreende uma ou mais substituições de aminoácido selecionados do grupo consistindo em L234A, L235E,G237A, A330S, e P331S, pela numeração EU, quando comparado a um isotipo IgG1 tipo silvestre (por exemplo, SEQ ID NO: 9). Em certas modalidades, os anticorpos anti-TREM-1 são do alotipo "IgG1-Aba", o qual compreende uma ou mais substituições de aminoácido selecionados do grupo consistindo em K214R, C226S, C229S, e P238S, pelo numeração EU, quando comparado a um isotipo IgG1 tipo silvestre (por exemplo, SEQ ID NO: 9).Em outras modalidades, os anticorpos anti-TREM-1 são do alotipo "IgG4-Aba", o qual compreende o domínio CH1 de um isotipo IgG4 tipo silvestre (por exemplo, SEQ ID NO: 10) e os domínios CH2 e CH3 de IgG1. Em algumas modalidades, o anticorpo de alotipo IgG4-Aba compreende uma ou mais substituições de aminoácido selecionados do grupo consistindo em S131C, K133R, G137E, G138S, Q196K, I199T, N203D, K214R,C226S, C229S, e P238S, pela numeração EU, quando comparado a um isotipo IgG1 tipo silvestre (por exemplo, SEQ ID NO: 9).

[0079] As frases "um anticorpo reconhecendo um antígeno" e "um anticorpo específico para um antígeno" são usados alternadamente no presente documento com o termo "um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno."

[0080] Um "anticorpo isolado," como no presente documento usado, é pretendido referir-se a um anticorpo que foi separadoe/ou recuperado de outro(s) componente(s) no meio ambiente em que ele foi produzido e/ou que foi purificado de uma mistura de componentes presentes no meio ambiente em que ele foi produzido.

[0081] Uma "função efetora" refere-se à interação de uma região Fc de anticorpo com um receptor ou ligante de Fc, ou um evento bioquímico que resulta deste. As "funções efetoras" exemplares incluem a ligação de C1q, citotoxicidade dependente de complemento (CDC), ligação do receptor de Fc, funções efetoras mediadas por FCYR tal como ADCC e fagocitose mediada por célula dependente de anticorpo (ADCP), e a subregulação de um receptor de superfície celular (por exemplo, receptor de célula B; BCR).Tais funções efetoras geralmente requerem a região Fc ser combinada com um domínio de ligação (por exemplo,um domínio variável de anticorpo). Em uma modalidade, os anticorpos anti-TREM-1 da corrente descrição compreendem as regiões Fc que não ligam-se a um ou mais FCYRS e, portanto falta a função efetora (isto é, sem efetor).

[0082] Um "receptor Fc" ou "FcR" é um receptor que liga-se à região Fc de umaimunoglobulina. FcRs que liga-se a um anticorpo IgG compreende receptores da família FCYR, incluindo variantes alélicas e alternativamente formas emendadas destes receptores. A família FcyRconsiste em três ativações (FcyRI, FcyRIII, e FcyRIV em camundongos; FcyRIA, FcyRIIA, e FcyRIIIA em humanos) e um receptor inibitório (FcyRIIB).Várias propriedades de FcyRs humano são conhecidas na técnica. A maioria de tipos de célula efetora inata coexpressam um FcyR de ativação e o FcyRIIB inibitório, enquanto que as células exterminadoras naturais (NK) seletivamente expressam um receptor Fc de ativação (FcyRIII em camundongos e FcyRIIIA em humanos), porém não o FcyRIIB inibitório em camundongos e humanos. IgG1 humano liga-se a maioria dos receptores Fc humano e é considerado equivalente para IgG2a de murino com relação aos tipos de receptores Fc de ativação que ele se liga.

[0083] Uma "região Fc" (região cristalizável de fragmento) ou "domínio Fc" ou "Fc" refere-se à região de terminal C da cadeia pesada de um anticorpo que media a ligação da imunoglobulina aos tecidos hospedeiros ou fatores, incluindo a ligação aos receptores Fc localizados em várias células do sistema imune (por exemplo, células efetoras) ou ao primeiro componente (C1q) do sistema de complemento clássico. Desse modo, uma região Fc compreende a região constante de um anticorpo excluindo o primeiro o domínio de imunoglobulina da região constante (por exemplo, CH1 ou CL).

[0084] No IgG, a região Fc compreende domínios de imunoglobulina CH2 e CH3 e a articulação entre os domínios CH1 e CH2.Embora a definição dos limites da região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina deve variar, como definido no presente documento, a região Fc de cadeia pesada de IgG humano é definida para estender de um resíduo de aminoácido D221 para IgG1, V222 para IgG2, L221 para IgG3 e P224 para IgG4 ao terminal de carbóxi da cadeia pesada, em que a numeração é de acordo com o índice EU como em Kabat. O domínio CH2 de uma região Fc de lgG humano estende-se do aminoácido 237 ao aminoácido 340, e o domínio CH3 é posicionado na lateral do terminal C de um domínio CH2 em uma região Fc, isto é, ele estende-se do aminoácido 341 ao aminoácido 447 ou 446 (se o resíduo de lisina do terminal C for ausente) ou 445 (se a glicina do terminal C e os resíduos de lisina forem ausentes) de um IgG. Como no presente documento usado, a região Fc pode ser um Fc de sequência nativa, incluindo qualquer variante alotípica, ou um Fc variante (por exemplo, um Fc de ocorrência não natural). Fc pode também referir-se a esta região em isolamento ou no contexto de um polipeptídeo de proteína compreendendo Fc tal como uma "proteína de ligação compreendendo uma região Fc," também referida como uma "proteína de fusão de Fc" (por exemplo, um anticorpo ou imunoadesão).

[0085] Uma "região Fc de sequência nativa" ou "Fc de sequência nativa" compreende uma sequência de aminoácido que é idêntica à sequência de aminoácido de uma região Fc encontrada na natureza. As regiões Fc humano de sequência nativa incluem uma região Fc de lgG1 humano de sequência nativa; região Fc de lgG2 humano de sequência nativa; região Fc de lgG3 humano de sequência nativa; e região Fc de lgG4 humano de sequência nativa bem como variantes de ocorrência natural destas. Fc de sequência nativa inclui os vários alotipos de Fcs (ver,por exemplo,Jefferise outro(s),mAbs 1: 1 (2009)).

[0086] Uma "região Fc de sequência variante" ou "Fc de ocorrência não natural" compreende uma modificação, tipicamente para alterar uma ou mais de suas propriedades funcionais, tais como soro meia vida, fixação de complemento, ligação de receptor Fc, estabilidade de proteínae/ou citotoxicidade celular dependente de antígeno, ou falta destes, entre outros. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TREM-1da presente descrição podem ser quimicamente modificados (por exemplo, uma ou mais porções químicas podem ser ligadas ao anticorpo) ou ser modificados para alterar sua glicosilação, novamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo. Em uma modalidade, o anticorpo anti-TREM-1 é um isotipo de IgG1 e carrega um domínio Fc modificado compreendendo uma ou mais, e talvez todas das seguintes mutações que resultarão na afinidade diminuída para certos receptores Fc (L234A, L235E, e G237A) e na fixação de complemento mediada por C1q reduzida (A330S e P331S), respectivamente (numeração de resíduo de acordo com o índice EU).

[0087] Os termos "articulação," "domínio de articulação," "região de articulação," e "região de articulação de anticorpo" refere-se ao domínio de uma região constante de cadeia pesada que liga o domínio CH1 ao domínio CH2 e inclui as porções superiores, médias e inferiores da articulação (Roux et al., J Immunol 161:4083 (1998)). A articulação fornece níveis variantes de flexibilidade entre a ligação e as regiões efetoras de um anticorpo e também fornece sítios para ligação de dissulfeto intermolecular entre as duas regiões constantes de cadeia pesada. Como no presente documento usado, uma articulação inicia em Glu216 e termina em Gly237 de todos os isotipos de IgG (Roux et al., J Immunol 161:4083 (1998)). A sequência de articulações de IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4 tipo silvestre são conhecidas na técnica (por exemplo, Publicaçao PCT Internacional n° WO 2017/087678). Em uma modalidade, a região de articulação de CH1 dos anticorpos anti- TREM-1 é modificada tal que o número de resíduos de cisteína na região de articulação seja alterado, por exemplo, aumentado ou diminuído. Este método é descrito também, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos n° 5.677.425.

[0088] A região constante pode ser modificada para estabilizar o anticorpo, por exemplo, para reduzir o risco de um anticorpo bivalente separando em dois fragmentos de VH-VL monovalentes. Por exemplo, em uma região constante de IgG4, o resíduo S228 (numeração do resíduo de acordo com o índice EU) pode ser mutado a um resíduo de prolina (P) para estabilizar a formação de ponte de dissulfeto de cadeia pesada inter na articulação (ver, por exemplo, Angale outro(s),MolImmunol. 30: 105-8(1995)). Os anticorpos ou fragmentos destes podem também ser definidos em termos de suas regiões determinantes de complementaridade (CDRs). O termo "região determinante de complementaridade" ou "região hipervariável", quando usado no presente documento, refere-seàs regiões de um anticorpo em que os resíduos de aminoácido envolvidos na ligação de antígeno são situados. A região de hipervariabilidade ou CDRs pode ser identificada como as regiões com a mais alta variabilidade nos alinhamentos de aminoácido dos domínios variáveis de anticorpo. A base de dados pode ser usada para identificação de CDR tal como a base de dados de Kabat, as CDRs, por exemplo, sendo definidas como compreendendo os resíduos de aminoácido 24-34 (CDR1), 5059 (CDR2) e 89-97 (CDR3) do domínio variável de cadeia leve, e 3135 (CDR1), 50-65 (CDR2) e 95-102 (CDR3) no domínio variável de cadeia pesada; (Kabat et al. 1991; Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Edição, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação de NIH n° 91-3242). Alternativamente, as CDRs podem ser definidas como aqueles resíduos de um "ciclo hipervariável" (resíduos 26-33 (L1), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 196: 901-917 (1987)). Tipicamente, a numeração dos resíduos de aminoácido nesta região é realizada pelo método descrito em Kabat et al., supra. As frases tais como "posição de Kabat", "resíduo de Kabat", e "de acordo com Kabat" no presente documento referem-se a este sistema de numeração para os domínios variáveis de cadeia pesada ou domínios variáveis de cadeia leve. usando-se o sistema de numeração de Kabat, a real sequência de aminoácido linear de um peptídeo pode conter menos ou aminoácidos adicionais correspondendo a uma diminuição de, ou inserção em,uma estrutura (FR) ou CDR do domínio variável.Por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada pode incluir inserções de aminoácido (resíduo 52a, 52b e 52c de acordo com Kabat) após o resíduo 52 de CDR H2 e resíduos inseridos (por exemplo, os resíduos 82a, 82b, e 82c, etc. de acordo com Kabat) após o resíduo 82 de FR de cadeia pesada.A numeração de Kabat dos resíduos pode ser determinada por um anticorpo fornecido pelo alinhamento nas regiões de homologia da sequência do anticorpo com uma sequência numerada por Kabat "padrão".

[0089] O termo "epítopo" ou "determinante antigênico" refere-se a um sítio em um antígeno (por exemplo, TREM-1) ao qual uma imunoglobulina ou anticorpo especificamente liga-se, por exemplo, como definido pelo método específico usado para identificá-lo. Os epítopos podem ser formados igualmente a partir de aminoácidos contíguos (normalmente um epítopo linear) ou aminoácidos não contíguos justapostos pela duplicação terciária de uma proteína (normalmente um epítopo conformacional). Os epítopos formados de aminoácidos contíguos são tipicamente, porém não sempre, retidos na exposição a solventes de desnaturação, enquanto que os epítopos formados por duplicação terciária são tipicamente perdidos no tratamento com solventes de desnaturação. Um epítopo tipicamente inclui pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos em uma única conformação espacial. Os métodos para determinar que os epítopos são ligados por um anticorpo fornecido (isto é, mapeamento de epítopo) são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, ensaios de imunoprecipitação e imunomanchamento, em que os peptídeos contíguos ou sobreposição de (por exemplo,de TREM-1) são testados pela reatividade com um anticorpo fornecido (por exemplo,anticorpo anti-TREM-1).Os métodos de determinação de conformação especial de epítopos incluem técnicas na técnica e aqueles descritos no presente documento,por exemplo, cristalografia de raio-x, análise mutacional de antígeno, ressonância magnética nuclear bi-dimencional e HDX-MS (ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)).

[0090] O termo "liga-se ao mesmo epítopo" com referência a dois ou mais anticorpos significa que osanticorpos ligam-se ao mesmo segmento de resíduos de aminoácido, como determinado por um método fornecido. As técnicas para determinar se os anticorpos ligam-se ao "mesmo epítopo em TREM-1" com os anticorpos descritos no presente documento incluem, por exemplo, métodos de mapeamento de epítopo, tal como, análise de raio-xde cristais de complexos antígeno:anticorpo que fornecem resolução atômica do epítopo e espectrometria de massa de permuta de hidrogênio/deutério (HDX- MS). Outros métodos monitoram a ligação do anticorpo aos fragmentos de antígeno ou variações mutadas do antígeno onde perde ligação devido a uma modificação de um resíduo de aminoácido dentro da sequência de antígeno é frequentemente considerada uma indicação de um componente de epítopo. Além disso, os métodos combinatórios computacionais para o mapeamento de epítopo podem também ser usados. Estes métodos contam com a capacidade do anticorpo de interesse para os peptídeos pequenos específicos de afinidade isolada de bibliotecas de peptídeo de exibição de fago combinatório. Os anticorpos tendo o mesmo VH e VL ou o mesmo CDR1, 2 e 3 sequências são esperados ligarem-se ao mesmo epítopo.

[0091] Os anticorpos que "competem com outro anticorpo para ligação a um alvo" referem-se aosanticorpos que inibem (parcialmente ou completamente) a ligação do outro anticorpo ao alvo.Se dois anticorpos competem um com o outro para ligação a um alvo, isto é, se e para aquela extensão um anticorpo inibe a ligação do outro anticorpo a um alvo, podem ser determinados usando-se experimentos de competição conhecidos, por exemplo, análise de ressonância de plásmon de superfície BIACORE® (SPR). Em certas modalidades, um anticorpo compete com, e inibe a ligação de outro anticorpo a um alvo em pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100%.O nível de inibição ou competição pode ser diferente dependendo do qual o anticorpo é o "anticorpo de bloqueio" (isto é, o anticorpo frio que é incubado primeiro com o alvo).Os ensaios de competição podem ser conduzidos como descritos, por exemplo, em Ed Harlow and David Lane, Cold Spring HarbProtoc ; 2006; doi: 10.1101/pdb.prot4277 or in Chapter 11 of "Using Antibodies" by Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA 1999.Doisanticorpos "competição cruzada" se osanticorpos bloqueiam um ao outro da mesma forma por pelo menos 50%, isto é,independentemente se um ou outro anticorpo é contatado primeiro com o antígeno no experimento de competição.

[0092] Como no presente documento usado, os termos "ligação específica," "ligação seletiva," "seletivamente liga-se," e "especificamente liga-se," referem-se à ligação de anticorpo a um epítopo em um antígeno predeterminado. Tipicamente, o anticorpo (i) liga-se com uma constante de dissociação de equilíbrio (KD) de aproximadamente menos do que 10-7 M, tal como aproximadamente menos do que 10-8 M, 10-9 M ou 10-10 M ou ainda inferior quando determinado por, por exemplo,tecnologia de ressonância de plásmon de superfície (SPR) em um instrumento BIACORE® 2000 usando-se o antígeno predeterminado, por exemplo, TREM-1 humano recombinante, como o analito e o anticorpo como o ligante, ou análise Scatchard de ligação ao anticorpo às células positivas de antígeno, e (ii) liga-se ao antígeno predeterminado com a afinidade que é pelo menos duas vezes maior do que sua afinidade para ligação a um antígeno não específico (por exemplo, BSA, caseína) diferente do antígeno predeterminado ou um antígeno estritamente relacionado. Consequentemente, um anticorpo que "especificamente liga-se a um TREM-1 humano" refere-se a um anticorpo que liga-se TREM-1 humano ligado à célula ou solúvel com um KDde 10-7 M ou menos, tal como aproximadamente menos do que 10-8 M, 10-9 M ou 10-10 M ou ainda menor. Um anticorpo que "reage cruzado com TREM-1 cinomolgo" refere-se a um anticorpo que se liga ao TREM-1 cinomolgo com um KD de 10-7 M ou menos, tal comoaproximadamente menos do que 10-8 M, 10-9 M ou 10-10 M ou ainda menor. Em certas modalidades, taisanticorpos que não reagem cruzado com o TREM-1 de uma espécie não humana exibe essencialmente ligação indetectável contra estas proteínas em ensaios de ligação padrão.

[0093] O termo "especificidade de ligação" no presente documento se refere à interação de uma molécula tal como um anticorpo, ou fragmento deste, com um antígeno exclusivo único, ou com um número limitado de antígenos altamente homólogos (ou epítopos).Ao contrário, os anticorpos que são capazes de especificamente se ligarem ao TREM-1 não são capazes de ligarem-se às moléculas dissimilares. Os anticorpos de acordo com a invenção podem não ser capazes de ligação a Nkp44, a proteína relacionada com a célula p44 exterminadora natural.

[0094] A especificidade de uma interação e o valor de uma constante de ligação de equilíbrio pode ser determinada diretamente por métodos bem conhecidos. Os ensaios padrões para avaliar a capacidade de ligantes (tais como os anticorpos) para ligar seus alvos são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, ELISAs, manchamentos do Oeste, RIAs, e análise de citometria de fluxo.Os cinéticos de ligação e afinidade de ligação do anticorpo podem também ser avaliados por ensaios padrões conhecidos na técnica, tal como SPR.

[0095] Os ensaios de ligação competitivos para determinar se dois anticorpos competem ou competem de modo cruzado para ligação incluem: competição para ligar ao TREM-1 expressando as células mieloides, por exemplo, por citometria de fluxo, tal como descrito nos Exemplos. Outros métodos incluem: SPR (por exemplo, BIACORE®), radioimunoensaio (RIA) indireto ou direto de fase sólida, imunoensaio (EIA) de enzima indireta ou direta de fase sólida, ensaio de competição sanduíche (ver, Stahlie et al, Methods in Enzymology 9:242 (1983)); EIA de biotina-avidina direto de fase sólida (ver, Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986)); ensaio rotulado direto de fase sólida, ensaio sanduíche rotulado direto de fase sólida (ver, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); RIA de rótulo direto de fase sólida usando-se 1125 rótulos (ver, Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988));EIA de biotina-avidina direto de fase sólida (Cheung et al., Virology 176:546 (1990)); e RIA rotulado direto. (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990)).

[0096] Como no presente documento usado, o termo "compartimento" é definido usando-se um anticorpo de referência. Se um segundo anticorpo é incapaz de se ligar a um antígeno ao mesmo tempo como o anticorpo de referência, o segundo anticorpo é dito pertencer ao mesmo "compartimento" como o anticorpo de referência. Neste caso, a referência e o segundo anticorpo competitivamente ligam-se a mesma parte de um antígeno e são chamados "anticorpos de competição". Se um segundo anticorpo é capaz de ligar-se a um antígeno ao mesmo tempo como o anticorpo de referência, o segundo anticorpo é dito pertencer a um "compartimento" separado.Neste caso, a referência e o segundo anticorpo não competitivamente ligam-se a mesma parte de um antígeno e são chamados "anticorpos de não competição".

[0097] O anticorpo "armazenamento" não fornece informação a cerca do epítopo. Os anticorpos de competição, isto é, osanticorpos pertencendo ao mesmo "compartimento" podem ter epítopos idênticos, epítopos de sobreposição ou ainda epítopos separados. O último é o caso em que o anticorpo de referência ligado a seu epítopo no antígeno pega o espaço requerido para o segundo anticorpo para contatar o seu epítopo no antígeno ("bloqueio estérico"). Os anticorpos de não competição geralmente possuem epítopos separados.

[0098] O termo "afinidade de ligação" no presente documento se refere a uma avaliação da força de uma interação não covalente entre as duas moléculas, por exemplo, um anticorpo, ou fragmento deste, e um antígeno. O termo "afinidade de ligação" é usado para descrever interações monovalentes (atividade intrínsica).

[0099] A afinidade de ligação entre as duas moléculas, por exemplo, um anticorpo, ou fragmento deste, e um antígeno, através de uma interação monovalente pode ser quantificada pela determinação da constante de dissociação de equilíbrio (KD). Por sua vez, KD pode ser determinado pela medição dos cinéticos de dissociação e formação de complexo, por exemplo, pelo método SPR. As constantes de taxa correspondendo a associação e a dissociação de um complexo monovalente são referidas como a constante de taxa de associação ka (ou kon) e constante de taxa de dissociação kd (ou k0ff), respectivamente. KDé relacionado a ka e kd através da equação KD = kd / ka. Seguindo a definição acima, as afinidades de ligação associadas com diferentes interações moleculares, tal como comparação da afinidade de ligação de diferentes anticorpos para um antígeno fornecido, podem ser comparadas por comparação dos valores de KD para os complexos anticorpo/antígeno individuais.

[00100] Como no presente documento usado, o termo "afinidade alta" para um anticorpo IgG refere-se a um anticorpo tendo um KD de 10-8 M ou menos, 10-9 M ou menos, ou 10-10 M ou menos para um antígeno alvo. Entretanto, a ligação de "afinidade alta" pode variar para outros isotipos de anticorpo. Por exemplo, a ligação de "afinidade alta" para um isotipo IgM refere-se a um anticorpo tendoum KD de 10-10 M ou menos, ou 10-8 M ou menos.

[00101] O termo "EC50" no contexto de um ensaio in vitro ou in vivo usando-se um fragmento de ligação deanticorpo ou antígeno deste, refere-se à concentração de um anticorpo ouuma porção de ligação de antígeno deste que induz uma resposta que seja 50% da resposta máxima, isto é, meio caminho entre a resposta máxima e a linha base.

[00102] O termo "ocorrência natural" como usado no presente documento, quando aplicado a um objeto, refere-se ao fato de que um objeto pode ser encontrado na natureza. Por exemplo, uma sequência de polipeptídeo ou polinucleotídeo que esteja presente em um organismo (incluindo vírus) que pode ser isolado de uma fonte na natureza e que não foi intencionalmente modificado pelo homem no laboratório é de ocorrência natural.

[00103] Um "polipeptídeo" refere-se a uma cadeia compreendendo pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivamente ligados, sem nenhum limite superior no comprimento da cadeia. Um ou mais resíduos de aminoácido na proteína pode conter uma modificação tal como, porém não limitado a, glicosilação, fosforilação ou formação de ligação de dissulfeto. Uma "proteína" pode compreender um ou mais polipeptídeos.

[00104] O termo "molécula de ácido nucleico," como no presente documento usado, é pretendido incluir moléculas de DNA e moléculas de RNA.Uma molécula de ácido nucleico pode ser de filamento único ou filamento duplo, e pode ser cDNA.

[00105] As "substituições de aminoácido conservador" referem-se às substituições de um resíduo de aminoácido com um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral similar. As famílias de resíduos de aminoácido tendo cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais acídicas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina,prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Em certas modalidades, um resíduo de aminoácido não essencial previsto em um anticorpo anti-TREM-1 é substituído com outro resíduo de aminoácido da mesma família de cadeia lateral. Os métodos de identificar nucleotídeo e substituições conservadoras de aminoácido que não eliminam a ligação de antígeno são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993);Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); e Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997)).

[00106] Para os ácidos nucleicos, o termo "homologia substancial" indica que dois ácidos nucleicos, ou as sequências designadas destes, quando idealmente alinhados e comparado, são idênticos, com deleções ou inserções de nucleotídeo apropriadas, em pelo menos cerca de 80% dos nucleotídeos, pelo menos cerca de 90% a 95%, ou pelo menos cerca de 98% a 99,5% dos nucleotídeos. Alternativamente, a homologia substancial existe quando os segmentos hibridizariam sob condições de hibridização seletivas, ao complemento do filamento.

[00107] Para os polipeptídeos, o termo "homologia substancial" indica que dois polipeptídeos, ou as sequências designadas destes, quando otimamente alinhadas e comparadas, são idênticos, com as deleções ou inserções de aminoácido apropriadas, em pelo menos cerca de 80% dos aminoácidos, em pelo menos cerca de 90% a 95%, ou pelo menos cerca de 98% a 99,5% dos aminoácidos.

[00108] A percentagem de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (isto é, % de homologia = # de posições idênticas/total # das posições x 100), levando em consideração o número de espaços, e o comprimento de cada espaço, que precisa ser introduzido para o ótimo alinhamento das duas sequências. A comparação das sequências e a determinação da percentagem de identidade entre as duas sequências podem ser obtidas usando-se um algoritmo matemático, como descrito nos exemplos não limitantes abaixo.

[00109] A percentagem de identidade entre as duas sequências de nucleotídeo pode ser determinada usando-se o programa GAP no pacote do software GCG (disponível em worldwideweb.gcg.com), usando-se uma matriz NWSgapdna.CMP e um peso de espaço de 40, 50, 60, 70, ou 80 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6.A percentagem de identidade entre as duas sequências de nucleotídeo ou aminoácido pode também ser determinada usando-se o algoritmo de E. Meyers and W. Miller (CABIOS, 4: 11-17 (1989)) o qual foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), usando-se uma tabela de resíduo de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de espaço de 12 e uma penalidade de espaço de 4. Além disso, a percentagem de identidade entre as duas sequências de aminoácido pode ser determinada usando-se o algoritmo Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) o qual foi incorporado no programa GAP no pacote de software GCG (disponível em worldwideweb.gcg.com), usando-se uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de espaço de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6.

[00110] As sequências de ácido nucleico e proteína, descritas no presente documento, podem também ser usadas como uma "sequência de indagação" para realizar uma pesquisa contra a base de dados pública para, por exemplo, identificar as sequências relacionadas. Tais pesquisas podem ser realizadas usando-se os programas NBLAST e XBLAST (versão 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. As pesquisas de nucleotídeo BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, pontuação = 100, comprimento da palavra = 12 para obter as sequências de nucleotídeo homólogas às moléculas de ácido nucleico descritas no presente documento. As pesquisas de proteína BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, pontuação = 50, comprimento da palavra = 3 para obter as sequências de ácido nucleico homólogas às moléculas de proteína descritas no presente documento. Para obter os alinhamentos intervalados para comparação de propósitos, BLAST intervalado pode ser utilizado como descrito em Altschule outro(s), (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Quando utilizando os programas BLAST e BLAST intervalado, os parâmetros básicos dos respetivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser usados. Ver worldwideweb.ncbi.nlm.nih.gov.

[00111] Os ácidos nucleicos podem estar presentes nas células inteiras, em um lisado celular, ou em uma forma parcialmente purificada ou substancialmente pura. Um ácido nucleico é "isolado" ou "tornado substancialmente puro" quando purificado longe de outros componentes celulares ou outros contaminantes, por exemplo, outros ácidos nucleicos celulares (por exemplo,as outras partes do cromossoma) ou proteínas, por técnicas padrões, incluindo o tratamento alcalino/SDS, bandagem CsCl, cromatografia de coluna, eletroforese gel de agarose e outros bem conhecidos na técnica. Ver, F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, Nova York (1987).

[00112] Os ácidos nucleicos, por exemplo, cDNA, podem ser mutados, de acordo com as técnicas padrões para fornecer as sequências de gene.Para as sequências de codificação, estas mutações, podem afetar a sequência de aminoácido como desejado. Em particular, as sequências de DNA substancialmente homólogas a, ou derivadas de nativo V, D, J, constante, mudanças e outras tais sequências descritas no presente documento são contempladas (onde "derivado" indica que uma sequência é idêntica ou modificada de outra sequência).

[00113] O termo "vetor," como no presente documento usado, é pretendido referir-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual ela foi ligada. Um tipo de vetor é um "plasmídeo," que se refere a um ciclo de DNA de filamento duplo circular em que os segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que os segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira em que eles são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem bacteriana de replicação e vetores de mamífero epissômicos).Outros vetores (por exemplo, vetores de mamífero não epissômicos) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira na introdução na célula hospedeira, e desse modo, são replicados junto com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais eles são operativamente ligados. Tais vetores são referidos no presente documento como "vetores de expressão recombinantes" (ou simplesmente, "vetores de expressão"). Em geral, os vetores de expressão de utilidade nas técnicas de DNA recombinantes são frequentemente na forma de plasmídeos.Na presente especificação, "plasmídeo" e "vetor" podem ser usados alternadamente como o plasmídeo é a forma mais comumente usada de vetor. Entretanto, também incluídas são outras formas de vetores de expressão, tais como vetores virais (por exemplo, retroviroses defectivas de replicação, adenovirosese vírus adeno-associado), que servem funções equivalentes.

[00114] O termo "célula hospedeira recombinante" (ou simplesmente "célula hospedeira"), como no presente documento usado, é pretendido referir-se a uma célula que compreende um ácido nucleico que não está naturalmente presente na célula, e pode ser uma célula em que um vetor de expressão recombinante foi introduzido. Deve ser entendido que tais termos são pretendidos referirem-se não apenas à célula objeto particular, porém à progênie de uma tal célula. Por causa de certas modificações, pode ocorrer nas gerações sucessoras, devido à mutação ou influências comportamentais, tal progênie não pode, de fato, ser idêntica à célula de origem, porém ainda é incluída dentro do escopo do termo "célula hospedeira" como usado no presente documento.

[00115] Como no presente documento usado, o termo "ligado" refere-se à associação de duas ou mais moléculas. A ligação pode ser covalente ou não covalente. A ligação também pode ser genética (isto é, recombinantemente fundida). Tais ligações podem ser obtidas usando-se uma ampla variedade de técnicas reconhecidas, tais como conjugação química e produção de proteína recombinante.

[00116] Como no presente documento usado, "administrar" refere- se à introdução física de uma composição compreendendo um agente terapêutico a um indivíduo, usando-se qualquer um dos vários métodos e sistemas de liberação conhecidos por aqueles versados na técnica. Diferentes rotinas de administração para os anticorpos anti- TREM-1 descritos no presente documento incluem intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, espinhal ou outras rotinas parenterais de administração, por exemplo, por injeção ou infusão. A frase "administração parenteral" como usada no presente documento significa métodos de administração diferentes de administração enteral e tópica, normalmente por injeção, e inclui, sem limitação, infusão e injeção intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intratecal, intralinfática, intralesional, intracapsular, intraorbital,intracardíaca, intradérmica, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intrarticular, subcapsular, subaracnoide, intraespinhal, epidural e intraesternal, bem como eletroporaçãoin vivo. Alternativamente, um anticorpo descrito no presente documento pode ser administrado por meio de uma rotina não parenteral, tal como uma rotina tópica, epidérmica ou mucosal de administração, por exemplo, intranasalmente, oralmente, vaginalmente, retalmente,sublingualmente ou topicamente. A administração pode também ser realizada, por exemplo, uma vez, uma pluralidade de vezes e/ou durante um ou mais períodos estendidos.

[00117] Como no presente documento usado, os termos "inibe" ou "bloqueia" (por exemplo, referindo-se à inibição/bloqueio da ligação do ligante de TREM-1 ao TREM-1 nas células) são usados alternadamente e abrangem igualmente a inibição/bloqueio parcial e completa. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TREM-1 inibe a ligação do ligante de TREM-1 ao TREM-1 por pelo menos cerca de 50%, por exemplo, cerca de 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, ou 100%,determinado, por exemplo,como também descrito no presente documento. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TREM-1 inibe a ligação do ligante de TREM-1 ao TREM-1 por não mais do que 50%, por exemplo, por cerca de 40%, 30%, 20%, 10%, 5% ou 1%, determinado, por exemplo, como também descrito no presente documento.

[00118] Os termos "tratar," "tratando," e "tratamento," como no presente documento usados, referem-se a qualquer tipo de intervenção ou processo realizado em, ou administrando um agente ativo ao indivíduo com o objetivo de reverter, aliviar, melhorar, inibir ou retardar ou prevenir a progressão, desenvolvimento, severidade ou recorrência de um sintoma, complicação, condição ou indícios bioquímicos associados com uma doença ou realçar a sobrevivência geral. O tratamento pode ser de um indivíduo tendo uma doença ou um indivíduo que não tem uma doença (por exemplo, para profilaxia).

[00119] O termo "dose eficaz" ou "dosagem eficaz" é definido como uma quantidade suficiente para obter, ou pelo menos parcialmente obter, um efeito desejado. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" ou "dosagem terapeuticamente eficaz" de um fármaco ou agente terapêutico é qualquer quantidade do fármaco que, quando usado sozinho ou em combinação com outro agente terapêutico, promove a regressão da doença evidenciada por uma diminuição na severidade dos sintomas da doença, um aumento na frequência e duração dos períodos livre dos sintomas da doença, ou uma prevenção do comprometimento ou incapacidade devido à aflição da doença. Uma dosagem ou quantidade terapeuticamente eficaz de um fármaco inclui uma "quantidade profilaticamente eficaz" ou uma "dosagem profilaticamente eficaz", que é qualquer quantidade do fármaco que, quando administrado sozinho ou em combinação com outro agente terapêutico a um indivíduo em risco de desenvolver uma doença ou de sofrer uma recorrência da doença, inibe o desenvolvimento ou recorrência da doença. A capacidade de um agente terapêutico de promover a regressão da doença ou inibir o desenvolvimento ou recorrência da doença pode ser avaliada usando-se uma variedade de métodos conhecidos pelo medico versado, tais como em indivíduos humanos durante testes clínicos, em sistemas modelos de animal preditivos de eficácia em humanos, ou ensaiando a atividade do agente em ensaios in vitro.

[00120] O termo "paciente" inclui humanos e outros indivíduos mamíferos que recebem o tratamento profilático ou terapêutico.

[00121] Como no presente documento usado, o termo "indivíduo" inclui qualquer humano ou animal não humano. Por exemplo, os métodos e composições descritos no presente documento podem ser usados para tratar um indivíduo tendo câncer. O termo "animal não humano" inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, tais como primatas não humanos, ovelha, cachorro, vaca, galinhas, anfíbios, répteis, etc.

[00122] Como no presente documento usado, os termos "ug" e "uM" são usados alternadamentecom "μg" e "μM," respectivamente.

[00123] Vários aspectos descritos no presente documento são descritos em mais detalhes nas subseções a seguir.

I. Anticorpos Anti-TREM-1

[00124] São descritos no presente documento anticorpos, por exemplo, anticorpos completamente humanos, os quais são caracterizados por propriedades ou características funcionais particulares. Por exemplo, os anticorpos da presente descrição especificamente ligam-se ao TREM-1 humano, e mais especificamente, um domínio particular (por exemplo, um domínio funcional) dentro do domínio extracelular de TREM-1 humano. Em uma modalidade, os anticorpos especificamente ligam-se ao sítio no TREM-1 ao qual o ligante de TREM-1 (por exemplo, PGLYRP1) ligase. Em certas modalidades, os anticorpos são anticorpos antagonistas, isto é, eles inibem ou suprimem a atividade de TREM-1 (isto é, não agonizam na ligação) sobre as células, por exemplo, monócitos, macrófagos e neutrófilos. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TREM-1 reagem cruzado com TREM-1 de um ou mais primatas não humanos, tal como o TREM-1 cinomolgo. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TREM-1 bloqueiam a produção de citocinas inflamatórias (por exemplo, IL-6, TNF-α, IL-8, IL-1β, IL-12, e combinações destas) por células (por exemplo, macrófagos, células dendríticas, neutrófilos) em ativação. Em outras modalidades, os anticorpos anti-TREM-1 compreendem as regiões Fc que não se ligam a um ou mais FcYRs.Em outras modalidades, os anticorpos anti-TREM-1 não induzem a liberação de citocinas proinflamatórias por células mieloides (por exemplo, células dendríticas) e, desse modo, reduzem ou previnem o início da tempestade de citocina inflamatória após a administração dos anticorpos anti-TREM-1 a um indivíduo em necessidade destes.

[00125] Em algumas modalidades, os anticorpos particulares anti- TREM-1 descritos no presente documento são anticorpos, por exemplo, anticorpos monoclonais, recombinantes e/ou humanos, que competem de modo cruzado com mAb 0318 para ligação a um TREM- 1 humano. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TREM-1 também compete cruzado com mAb 0318 para a ligação ao TREM-1 cinomolgo. Em outras palavras, os anticorpos anti-TREM-1da presente descrição pertencem ao mesmo "compartimento" como mAb 0318 em certas modalidades.

[00126] O anticorpo mAb 0318 possui uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo SEQ ID NO: 14 e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo SEQ ID NO: 15.Ver Publicação Internacional N°2016/009086. O mAb 0318 também possui uma cadeia pesada CDR1, CDR2, e CDR3, que corresponde aos aminoácidos 31-35, 50-68, e 101-110 de SEQ ID NO: 14,respectivamente. A cadeia leve CDR1, CDR2, e CDR3 do anticorpo mAb 0318 corresponde aos aminoácidos 24-38, 54-60, e 93-101 de SEQ ID NO: 15.

[00127] Consequentemente, em algumas modalidades, o anticorpo anti-TREM-1 da presente descrição compreende VH e VL de SEQ ID NOs: 14 e 15, respectivamente. Em outra modalidade, o VH do anticorpo anti-TREM-1 compreende uma sequência CDR1 de aminoácidos 31-35 (TYAMH) de SEQ ID NO: 14, em que um dos aminoácidos pode ser substituído por um aminoácido diferente. Em certas modalidades, VH do anticorpo anti-TREM-1 compreende uma sequência CDR2 dos aminoácidos 50-68 (RIRTKSSNYATYYAASVKG) de SEQ ID NO: 14, em que um, dois ou três dos aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente. Em algumas modalidades, o VH do anticorpo anti-TREM-1 compreende uma sequência CDR3 de aminoácidos 101-110 (DMGIRRQFAY) de SEQ ID NO: 14, em que um, dois ou três dos aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente.

[00128] Em algumas modalidades, o VL do anticorpo anti-TREM-1 compreende uma sequência de CDR1 de aminoácidos 24-38 (QQSNQDPYT) de SEQ ID NO: 15, em que um, dois ou três dos aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente. Em outras modalidades, o VL do anticorpo anti-TREM-1 compreende uma sequência de CDR2 dos aminoácidos 54-60 (RASNLES) de SEQ ID NO: 15, em que um ou dois dos aminoácidos podem ser substituídos com um aminoácido diferente. Em algumas modalidades, o VL do anticorpo anti-TREM-1 compreende uma sequência CDR3 dos aminoácidos 93-101 (QQSNQDPYT) de SEQ ID NO: 15, em que um ou dois dos aminoácidos podem ser substituídos com um aminoácido diferente.

[00129] Os resíduos de metionina em CDRs dos anticorpos podem ser oxidados, resultando na degradação química potencial e consequente redução na potência do anticorpo. Consequentemente, os anticorpos anti-TREM-1 descritos no presente documento podem ter um ou mais resíduos de metionina nos CDRs de cadeia pesada e/ou leve substituídos com os resíduos de aminoácido que não sofrem de degradação oxidativa. Em algumas modalidades, os resíduos de metionina dentro do CDR1 e CDR3 de cadeia pesada são substituídos com os resíduos de aminoácido que não passam por degradação oxidativa (por exemplo, glutamina ou leucina). Consequentemente, em uma modalidade, o VH do anticorpo anti-TREM-1 compreende uma sequência CDR3 de aminoácidos 101-110 (DQGIRRQFAY) de SEQ ID NO: 81 ou aminoácidos 101-110 (DLGIRRQFAY) de SEQ ID NO: 82. Em outras modalidades, o VH do anticorpo anti-TREM-1 compreende uma sequência de CDR1 de aminoácidos 31-35 (TYAQH) de SEQ ID NO: 83 ou aminoácidos 31-35 (TYALH) de SEQ ID NO: 84. Similarmente, em algumas modalidades, os sítios de desamidação podem ser removidos dos anticorpos anti-TREM-1, particularmente nos CDRs.

[00130] Em algumas modalidades, o VH e VL do anticorpo anti- TREM-1 compreende umas sequências de VH e VL dos anticorpos anti-TREM-1 descritas na Publicação Internacional N°WO 2017/152102 A2, a qual é incorporada no presente documento por referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, o VL do anticorpo anti-TREM-1 compreende uma sequência de CDR1 selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 9-27 de WO 2017/152102, uma sequência CDR2selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 28-40 de WO 2017/152102, e/ouuma sequência de CDR3 selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 41-119 de WO 2017/152102. Em uma modalidade, o VH do anticorpo anti-TREM- 1 compreende uma sequência de CDR1 selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 120-143 de WO 2017/152102, uma sequência de CDR2 selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 144-172 de WO 2017/152102, e/ou uma sequência de CDR3 selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 173-247 de WO 2017/152102.

[00131] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TREM-1 da presente descrição compreendem CDR e/ou sequências de região variável que possuam pelo menos 80% de identidade (por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 95%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% de identidade) para o CDR e/ou sequências de região variável do anticorpo mAb 0318.

[00132] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TREM-1 compreendem uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo SEQ ID NOs: 14 e 15, respectivamente. Em algumas modalidades, os anticorpos anti- TREM-1compreendem uma cadeia pesada (HC) e uma cadeia leve (LC), em que a HC compreende SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, ou SEQ ID NO: 53. Em algumas modalidades, a LC compreende SEQ ID NO: 54.

[00133] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TREM-1 da presente descrição compreendem uma região variável de cadeia pesada (VH) selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 396475 de WO 2017/152102 e/ou uma região variável de cadeia leve (VL) selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 316-395 de WO 2017/152102.

[00134] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TREM-1 compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada e a cadeia leve compreende sequências de aminoácido como mostrado na Tabela 7. Em algumas modalidades, o anticorpo anti- TREM-1 compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácido mencionada como SEQ ID NO: 50 e uma cadeia leve compreende a sequência de aminoácido mencionada como SEQ ID NO: 54. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TREM-1 compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácido mencionada como SEQ ID NO: 51 e uma cadeia leve compreende a sequência de aminoácido mencionada como SEQ ID NO: 54. Em algumas modalidades, o anticorpo anti- TREM-1 compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácido mencionada como SEQ ID NO: 52 e uma cadeia leve compreende a sequência de aminoácido mencionada como SEQ ID NO: 54. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TREM-1 compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácido mencionada como SEQ ID NO: 53 e uma cadeia leve compreende a sequência de aminoácido mencionada como SEQ ID NO: 54.

[00135] Cadeias Leves e Pesadas compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, ou 80% idêntica a qualquer das cadeias leves e pesadas mencionadas no presente documento, por exemplo, SEQ ID NOs: 50 a 54 podem ser usadas para formar os anticorpos anti-TREM-1 tendo as características desejadas, por exemplo, aquelas também descritas no presente documento.

[00136] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TREM-1 da presente invenção compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácido mencionada como SEQ ID NO: 50, 51, 52, ou 53 and em que a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácido mencionada como SEQ ID NO: 54.

[00137] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TREM1 compreende uma região constante de cadeia pesada, em que a região constante de cadeia pesada compreende uma ou mais substituições de aminoácido selecionadas do grupo que consiste em K214R, L234A,L235E, G237A, D356E, L358M, e qualquer combinação das mesmas por numeração EU. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TREM- 1 compreende uma região constante de cadeia pesada, em que a região constante de cadeia pesada compreende uma ou mais substituições de aminoácido selecionadas do grupo que consiste em K214R, L234A, L235E, G237A, A330S, P331S, D356E, L358M, e qualquer combinação das mesmas por numeração EU. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TREM-1 compreende uma região constante de cadeia pesada, em que a região constante de cadeia pesada compreende uma ou mais substituições de aminoácido selecionadas do grupo que consiste em K214R, C226S, C229S,P238S, e qualquer combinação das mesmas por numeração EU. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TREM-1 compreende uma região constante de cadeia pesada, em que a região constante de cadeia pesada compreende uma ou mais substituições de aminoácido selecionadas do grupo que consiste em S131C, K133R, G137E,G138S, Q196K, I199T, N203D, K214R, C226S, C229S, P238S, e qualquer combinação das mesmas por numeração EU.

[00138] Em uma modalidade, o anticorpo anti-TREM-1 é capaz de variantes de ligação de TREM-1 (por exemplo, TREM-1 isoformas 2 e 3, SEQ ID NOs: 2 e 3, respectivamente), como determinado usando, por exemplo, ressonância de plasmônio de superfície. Em outra modalidade, o anticorpo anti-TREM-1 é capaz de ligar TREM-1 de cinomolgo (SEQ ID NO: 7), como determinado usando, por exemplo, ressonância de plasmónio de superfície.

[00139] Em algumas modalidades, anticorpos anti-TREM-1 descritos no presente documento se ligam ao TREM-1 humano com afinidade elevada, por exemplo, como determinado por BIACORE™ (por exemplo, como descrito nos Exemplos), com um KD de 10-7 M ou menos, 10-8 M ou menos, 10-9 M (1 nM) ou menos, 10-10 M ou menos, 10-11 M ou menos, 10-12 M ou menos, 10-12 M a 10-7 M, 10-11 M a 10-7 M, 10-10 M a 10-7 M, ou 10-9 M a 10-7 M. Em algumas modalidades, anticorpos anti-TREM-1 descritos no presente documento se ligam ao cyno TREM-1, por exemplo, como determinado por BIACORE™ (por exemplo, como descrito nos Exemplos), com um KD de 10-7 M ou menos, 10-8 M ou menos, 10-9 M ou menos, 10-10 M ou menos, 10-11 M ou menos, 10-12 M ou menos, 10-12 M a 10-7 M, 10-11 M a 10-7 M, 10-10 M a 10-7 M, ou 10-9 M a 10-7 M.

[00140] Em uma modalidade, os anticorpos da presente invenção ligam anti-TREM-1 a um ou mais dos mesmos epítopos como o anticorpo mAb 0318. Em algumas modalidades, o anticorpo anti- TREM-1 é capaz de especificamente ligar (i) pelo menos um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste em A21, T22, K23, L24, T25, E26, e qualquer combinação doss mesmos e (ii) pelo menos um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste em A49, S50, S51, Q52, K53, A54, W55, Q56, 157, 158, R59, D60, G61, E62, M63, P64, K65, T66, L67, A68, C69, T70, E71, R72, P73, S74, K75, N76, S77, H78, P79, V80, Q81, V82, G83, R84, 185, e qualquer combinação dos mesmos e (iii) pelo menos um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste em C113, V114, 1115, Y116,Q117, P118, P119, e qualquer combinação dos mesmos de TREM-1 humano (por exemplo, Isoforma 1, SEQ ID NO: 1). Veja WO 2016/009086.

[00141] Em uma modalidade, o anticorpo anti-TREM-1 é capaz de especificamente se ligar aos aminoácidos D38 a F48 de SEQ ID NO: 1 (TREM-1 humano), como determinado usando, por exemplo, HX-MS ou difração de raio X. Em algumas modalidades, o anticorpo anti- TREM-1 tem um epítopo compreendendo um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, ou todos os resíduos de aminoácido D38, V39, K40, C41, D42, Y43, T44, e L45 de SEQ ID NO: 1 (TREM-1 humano) e um, dois,ou todos os resíduos de aminoácido selecionados do grupo que consiste nos E46, K47, e F48 de SEQ ID NO: 1 (TREM-1 humano), como determinado usando, por exemplo, HX-MS or difração de raio X. Em certas modalidades, o anticorpo anti-TREM-1 tem um epítopo compreendendo um, dois, três, ou todos os resíduos de aminoácido selecionados do grupo que consiste em D42, E46, D92, e H93 de SEQ ID NO: 1 (TREM-1 humano), como determinado usando variantes de TREM-1 e ressonância de plasmônio de superfície.

[00142] Em uma modalidade, o anticorpo anti-TREM-1 da presente invenção tem um epítopo compreendendo pelo menos os resíduos de aminoácido E46 e/ou D92 de SEQ ID NO: 1 (TREM-1 humano), como determinado usando variantes de TREM-1 e ressonância de plasmon de superfície. Em outra modalidade, o anticorpo anti-TREM-1 compreende um, dois, ou todos os resíduos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em L31, 186 e V101 de SEQ ID NO: 1 (TREM-1 humano). Em certas modalidades, o anticorpo anti- TREM-1 é capaz de especificamente se ligar a um polipeptídeo compreendendo resíduos de aminoácido E19 a L26 de TREM-1 de macaco cynomolgus (SEQ ID NO: 7), como determinado usando, por exemplo, HX-MS ou difração de raio X.

[00143] Em uma modalidade, o anticorpo anti-TREM-1 é capaz de especificamente se ligar a TREM-1 humano, em que o epítopo do anticorpo compreende um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, ou todos os resíduos de aminoácido selecionados do grupo que consiste em V39, K40, C41, D42, Y43, L45, E46, K47, F48, e A49 de SEQ ID NO: 1.

[00144] Em uma modalidade, o anticorpo anti-TREM-1 é capaz de especificamente se ligar a TREM-1 humano, em que o epítopo do anticorpo compreende o D42 de SEQ ID NO: 1. Em outras modalidades, o anticorpo anti-TREM-1 é capaz de especificamente se ligar a TREM-1 humano, em que o epítopo do anticorpo compreende o E46 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o epítopo do anticorpo pode compreender os V39, C41, D42, Y43, L45 de SEQ ID NO: 1. Em outras modalidades, o epítopo do anticorpo pode compreender o E46, K47 e A49 de SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade específica, o epítopo do anticorpo anti-TREM-1 pode também compreender o F48 de SEQ ID NO: 1.

[00145] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TREM-1 tem um perfil de viscosidade similar àquele do anticorpo mAb 0318. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TREM-1 da presente invenção tem uma menor viscosidade do que 5 cP, menor que 4 cP, menor que 3 cP, menor que 2,5 cP, menor que 2,4 cP, menor que 2,3 cP, menor que 2,2 cP, menor que 2,1 cP, menor que 2 cP, menor que 1,9 cP, menor que 1,8 cP, menor que 1,7 cP, menor que 1,6 cP, menor que 1,5 cP, menor que 1,4 cP, menor que 1,3 cP, menor que 1,2 cP, menor que 1,1 cP, menor que 1,0 cP, menor que 0,9 cP, menor que 0,8 cP, menor que 0,7 cP, menor que 0,6 cP, menor que 0,5 cP, menor que 0,4 cP, menor que 0,3 cP, menor que 0,2 cP, ou menor que 0,1 cP em uma concentração de 80 mg/mL. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TREM-1 tem uma viscosidade menor do que 10 cP (por exemplo, 9 cP) em uma concentração de 130 mg/mL.

[00146] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TREM-1 da presente invenção compreende mutações, em que um ou mais resíduos negativamente carregados nas regiões CDR1 e CDR3 leves do anticorpo são substituídos com resíduos não carregados. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TREM-1 compreende uma substituição em um ou mais de resíduos de aminoácido D1, D30, D33, D74, D98, E27, e E97 de SEQ ID NO: 15 com um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo em glicina, alanina, serina, asparagina, glutamina, treonina, cisteína e tirosina. Estas mutações são referidas no presente documento como mutações de "emplastro de carga".

[00147] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TREM-1 da presente invenção compreende mutações na área de interação Fab-Fab de SEQ ID NO: 14 para reduzir a dimerização Fab-Fab. Foi mostrado anteriormente com o anticorpo mAb 0318 que, como os anticorpos compreendem dois Fabs, a multimerização pode impactar a viscosidade. Estas mutações são referidas como mutações de "interação Fab-Fab". Em certas modalidades, o anticorpo anti-TREM-1 compreende uma mutação em qualquer um dos resíduos Y32, R52, S55, S56, N57, A59, M102, I104 e R106 de SEQ ID NO: 14 ou F32, D33, Y34, Y53, R54, e D98 de SEQ ID NO 15 com um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo em glicina, alanina, serina, asparagina, glutamina, treonina, cisteína, lisina, arginina, triptofano, histidina e tirosina.

[00148] Em uma modalidade, o anticorpo anti-TREM-1 como descrito no presente documento compreende uma mutação na posição 32 de SEQ ID NO: 15, em que a fenilalanina é mutada para aminoácido selecionado de resíduos de aminoácido glicina, serina, treonina, cisteína, alanina, valina, leucina, isoleucina e metionina. Tal mutação é baseada na observação de que uma substituição Ala na posição Y90 de SEQ ID NO: 1 melhorou a afinidade de SEQ ID NO: 3 para TREM-1. A Y90 foi descoberta interagir com um resíduo de fenilalanina de SEQ ID NO: 15. Mutações de SEQ ID NO: 15 a fim de melhorar a interação Fab-TREM-1 são referidas como mutações de "interação Fab-TREM-1". São fornecidos no presente documento anticorpos anti-TREM-1 cujas regiões variáveis são ligadas (por exemplo, covalentemente ligadas ou fundidas) a uma Fc, por exemplo, uma Fc de IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4, que pode ser de qualquer alótipo ou isoalótipo, por exemplo, para IgG1: G1m, G1m1(a), G1m2(x), G1m3(f), G1m17(z); para IgG2: G2m, G2m23(n); para IgG3: G3m, G3m21(g1), G3m28(g5), G3m11(b0), G3m5(b1), G3m13(b3),G3m14(b4), G3m10(b5), G3m15(s), G3m16(t), G3m6(c3), G3m24(c5), G3m26(u), G3m27(v); e para K: Km, Km1, Km2, Km3 (veja, por exemplo, Jeffries et al. (2009) mAbs 1:1). Em algumas modalidades, as regiões variáveis dos anticorpos anti-TREM-1 descritos no presente documento são ligadas a uma Fc menos efetora ou principalmente menos efetora, por exemplo, IgG1. Em algumas modalidades, as regiões variáveis dos anticorpos anti-TREM-1 são ligadas a uma Fc que tem ligação reduzida ou é incapaz de se ligar a uma ou mais FCYRS.

[00149] Em uma modalidade, um domínio VH do anticorpo anti- TREM-1 descrito no presente documento pode ser fundido ao domínio constante de um IgG humano (isto é, Fc), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4, que é de ocorrência natural ou modificada, por exemplo, como também descrito no presente documento. Por exemplo, um domínio VH pode compreender uma sequência de aminoácido de qualquer domínio VH descrito no presente documento fundido a um IgG humano, por exemplo, um IgG1, região constante, tal como, a seguinte sequência de aminoácido de domínio constante de IgG1 humano de tipo selvagem: ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT SGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKV DKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS PGK (SEQ ID NO: 9) ou aquela de uma variante alotípica de SEQ ID NO: 9 e ter as seguintes sequências de aminoácido:ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT SGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKV DKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS PGK (SEQ ID NO: 77; resíduos de aminoácido específicos de alotipo estão em negrito e sublinhado).

[00150] Em uma modalidade, um domínio VH do anticorpo anti- TREM-1 descrito no presente documento pode compreender a sequência de aminoácido de qualquer domínio VH descrito no presente documento fundido a uma região constante menos efetora, por exemplo, as seguintes sequências de aminoácido de domínio constante de IgG1 humano menos efetoras:ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT SGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKV DKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS PGK (SEQ ID NO: 78; "IgG1,1f," compreendendo substituições L234A, L235E, G237A, A330S e P331S, por numeração EU, que são sublinhadas) ou ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT SGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKV DKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS PGK(SEQ ID NO: 79; "IgG1,3f", compreendendo substituições L234A, L235E e G237A, por numeração EU, que são sublinhadas).

[00151] Por exemplo, uma variante alotípica de IgG1 compreende um K97R, D239E, e/ou L241M (sublinhado e negritado acima) e a numeração de acordo com aquela em SEQ ID NOs: 77-79. Dentro da região pesada de comprimento total e de acordo com numeração EU, estas substituições de aminoácido são numeradas K214R, D356E e L358M. Em algumas modalidades, a região constante de um anticorpo anti-TREM-1 também compreende uma ou mais mutações ou substituições nos aminoácidos L117, A118, G120, A213 e P214 (sublinhados acima) como numerado em SEQ ID NO: 77-79, ou L234, A235, G237, A330 e P331, por numeração EU. Em outras modalidades, a região constante do anticorpo anti-TREM-1 compreende uma ou mais mutações ou substituições nos aminoácidos L117A, A118E, G120A, A213S, e P214S de SEQ ID NO: 77-79, ou L234A, L235E, G237A, A330S e P331S, por numeração EU. A região constante do anticorpo anti-TREM-1 pode também compreender uma ou mais mutações ou substituições L117A, A118E e G120A de SEQ ID NO: 9, ou L234A, L235E e G237A, por numeração EU.

[00152] Em algumas modalidades, um domínio VH dos anticorpos anti-TREM-1 descritos no presente documento compreende a sequência de aminoácido de qualquer domínio VH descrito no presente documento fundido a um domínio constante de IgG1 compreendendo as seguintes sequências de aminoácido:ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT SGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKV DKRVEPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP PSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK (SEQ ID NO: 11; "IgG1-Aba", compreendendo substituições K214R, C226S, C229S, e P238S, por numeração EU, que são sublinhadas); ou ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT SGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKV DKRVEPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP PSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK (SEQ ID NO: 12; "IgG4-Aba", compreendendo substituições S131C, K133R, G137E, G138S, Q196K, I199T, N203D, K214R,C226S, C229S, e P238S, por numeração EU, que são sublinhadas).

[00153] Um domínio VL descrito no presente documento pode ser fundido ao domínio constante de uma cadeia leve Kappa ou Lambda humana. Por exemplo, um domínio VL de um anticorpo anti-TREM-1 pode compreender a sequência de aminoácido de qualuqer domínio VL descrito no presente documento fundido a seguinte sequência de aminoácido de cadeia leve kappa de IgG1 humana:RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO: 13)

[00154] Em certas modalidades, a região constante de cadeia pesada compreende uma lisina ou outro aminoácido no terminal C, por exemplo, compreende os seguintes últimos aminoácidos: LSPGK (SEQ ID NO: 48) na cadeia pesada. Em certas modalidades, a região constante de cadeia pesada carece de um ou mais aminoácidos no terminal C, e tem, por exemplo, o LSPG de sequência de terminal C (SEQ ID NO: 49) ou LSP.

[00155] Em uma modalidade, a região variável do anticorpo anti- TREM-1 está ligada a uma Fc menos efetora ou principalmente menos efetora. Em certas modalidades, a região variável do anticorpo anti- TREM-1 está ligada a uma Fc selecionada do grupo consistindo em IgG1.1f, IgG1.3f, IgG1-Aba, e IgG4-Aba, como descrito no presente documento.

[00156] Geralmente, regiões variáveis descritas no presente documento podem ser ligadas a uma Fc compreendendo uma ou mais modificação, normalmente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo, como ligação ao receptor Fc, liberação de citocinas inflamatórias, meia-vida sérica, fixação de complemento e/ou citotoxicidade celular dependente de antígeno. Além disso, um anticorpo descrito no presente documento pode ser modificado quimicamente (por exemplo, uma ou mais porções químicas podem ser ligadas ao anticorpo) ou ser modificado para alterar sua glicosilação, para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo. Cada uma dessas modalidades é descrita em mais detalhes abaixo. A numeração dos resíduos na região Fc é a do índice EU de Kabat.

[00157] A região Fc abrange domínios derivados da região constante de uma imunoglobulina (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, e outras classes como IgA, IgD, IgE e IgM), incluindo um fragmento, análogo, variante, mutante ou derivado da região constante. A região constante de uma imunoglobulina é definida como um polipeptídeo de ocorrência natural ou produzido sinteticamente homólogo à região de terminal C da imunoglobulina, e pode incluir um domínio CH1, uma articulação, um domínio CH2, um domínio CH3, ou um domínio CH4, separadamente ou em combinação.

[00158] As moléculas de Ig interagem com várias classes de receptores celulares. Por exemplo, as moléculas de IgG interagem com três classes de recetores FCY (FCYR) específicos para a classe de anticorpos IgG, nomeadamente FCYRI, FCYRII, e FCYRIII. Foi relatado que as sequências importantes para a ligação de IgG aos receptores FCYR estão localizadas nos domínios CH2 e CH3. A meia-vida sérica de um anticorpo é influenciada pela capacidade desse anticorpo de se ligar a um receptor Fc (FcR).

[00159] Em uma modalidade, a região Fc dos anticorpos anti- TREM-1 é uma região Fc variante, por exemplo, uma sequência Fc que foi modificada (por exemplo, por substituição de aminoácido, deleção e/ou inserção) em relação a uma sequência Fc parental (por exemplo, um polipeptídeo Fc não modificado que é subsequentemente modificado para gerar uma variante), para fornecer características estruturais desejáveis e/ou atividade biológica.

[00160] Por exemplo, é possível fazer modificações na região Fc a fim de gerar uma variante Fc que (a) aumentou ou diminuiu a citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC), (b) aumentou ou diminuiu a citotoxicidade mediada por complemento (CDC), (c) aumentou ou diminuiu a afinidade para C1q e/ou (d) aumentou ou diminuiu a afinidade para um receptor Fc em relação à Fc parental. Essas variantes da região Fc geralmente compreenderão pelo menos uma modificação de aminoácido na região Fc. A combinação de modificações de aminoácidos é considerada particularmente desejável. Por exemplo, a região Fc variante pode incluir duas, três, quatro, cinco, etc. substituições nela, por exemplo, das posições da região Fc específicas no presente documento identificadas.

[00161] Uma região Fc variante também pode compreender uma alteração de sequência em que os aminoácidos envolvidos na formação da ligação de dissulfeto são removidos ou substituídos por outros aminoácidos. Essa remoção pode evitar a reação com outras proteínas contendo cisteína presentes na célula hospedeira usadas para produzir os anticorpos anti-TREM-1 descritos no presente documento. Mesmo quando os resíduos de cisteína são removidos, os domínios Fc de cadeia simples ainda podem formar um domínio Fc dimérico que é mantido junto de forma não covalente. Em outras modalidades, a região Fc pode ser modificada para torná-la mais compatível com uma célula hospedeira selecionada. Por exemplo, pode-se remover a sequência PA perto do terminal N de uma região Fc nativa típica, que pode ser reconhecida por uma enzima digestiva em E. coli, como a prolina iminopeptidase. Em outras modalidades, um ou mais sítios de glicosilação dentro do domínio Fc podem ser removidos. Resíduos que são tipicamente glicosilados (por exemplo, asparagina) podem conferir resposta citolítica. Esses resíduos podem ser deletados ou substituídos por resíduos não glicosilados (por exemplo, alanina). Em outras modalidades, sítios envolvidos na interação com o complemento, como o sítio de ligação C1q, pode ser removido da região Fc. Por exemplo, é possível deletar ou substituir a sequência EKK de IgG1 humano. Em certas modalidades, os sítios que afetam a ligação aos receptores Fc podem ser removidos, preferencialmente outros sítios que não os sítios de ligação do receptor de salvamento. Em outras modalidades, uma região Fc pode ser modificada para remover um sítio ADCC. Os sítios ADCC são conhecidos na técnica; veja, por exemplo, Sarmay et al., Molec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992) no que diz respeito aos sítios ADCC em IgG1. Exemplos específicos de domínios Fc variantes são descritos, por exemplo, em WO 97/34631 e WO 96/32478.

[00162] Em uma modalidade, a região da articulação de Fc é modificada de forma que o número de resíduos de cisteína na região da articulação seja alterado, por exemplo, aumentado ou diminuído. Este método é descrito mais detalhadamente na Patente Norte- americana No. 5.677.425 por Bodmer et al. O número de resíduos de cisteína na região de articulação de Fc é alterado para, por exemplo, facilitar a montagem das cadeias leves e pesadas ou aumentar ou diminuir a estabilidade do anticorpo. Em uma modalidade, a região de articulação Fc de um anticorpo é mutada para diminuir a meia-vida biológica do anticorpo. Mais especificamente, uma ou mais mutações de aminoácidos são introduzidas na região de interface do domínio CH2-CH3 do fragmento de articulação Fc de modo que o anticorpo tenha a ligação da proteína A Staphylococcyl (SpA) prejudicada em relação à ligação de SpA do domínio de articulação Fc nativo. Este método é descrito em mais detalhes na Patente Norte-americana No. 6.165.745 por Ward et al.

[00163] Em ainda outras modalidades, a região Fc é alterada substituindo pelo menos um resíduo de aminoácido com um resíduo de aminoácido diferente para alterar a(s) função(ões) efetora(s) do anticorpo. Por exemplo, um ou mais aminoácidos selecionados a partir de resíduos de aminoácido 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320, 322, 330, e/ou 331 pode ser substituído por um resíduo de aminoácido diferente de modo que o anticorpo tenha uma afinidade alterada para um ligante efetor, mas retenha a capacidade de ligação ao antígeno do anticorpo parental. O ligante efetor para o qual a afinidade é alterada pode ser, por exemplo, um receptor Fc ou o componente C1 do complemento. Este método é descrito em mais detalhes na Patente Norte-americana Nos. 5.624.821 e 5.648.260, ambas por Winter et al.

[00164] Em outro exemplo, um ou mais aminoácidos selecionados a partir dos resíduos de aminoácidos 329, 331 e 322 pode ser substituído por um resíduo de aminoácido diferente, de modo que o anticorpo tenha a ligação de C1q alterada e/ou reduzida ou abolido a citotoxicidade dependente do complemento (CDC). Este método é descrito em mais detalhes na Patente Norte-americana No. 6.194.551 por Idusogie et al.

[00165] Em outro exemplo, um ou mais resíduos de aminoácido nas posições de aminoácidos 231 e 239 são alterados para, assim, alterar a capacidade do anticorpo de fixar o complemento. Este método é descrito também na Publicação PCT WO 94/29351 de Bodmer et al.

[00166] Em ainda outro exemplo, a região Fc pode ser modificada para diminuir a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e/ou para diminuir a afinidade para um receptor FCY modificando um ou mais aminoácidos nas seguintes posições: 234, 235, 236, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 262,263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286,289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 301, 303, 305, 307, 309,312, 313, 315, 320, 322, 324, 325, 326, 327, 329, 330, 331, 332, 333,334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414,416, 419, 430, 433, 434, 435, 436, 437, 438 or 439. Substituições exemplares incluem 236A, 239D, 239E, 268D, 267E, 268E, 268F, 324T, 332D e 332E. Variantes exemplares incluem 239D/332E,236A/332E, 236A/239D/332E, 268F/324T, 267E/268F, 267E/324T e 267E/268F/324T. Outras modificações para realçar FCYR e interações de complemento incluem, porém não estão limitadas a, substituições 298 A, 333A, 334A, 326A, 2471, 339D, 339Q, 280H, 290S, 298D, 298V, 243L, 292P, 300L, 396L, 3051, e 396L. Estas e outras modificações são revisadas em Strohl, 2009, Current Opinion in Biotechnology 20: 685-691,

[00167] Outras modificações de Fc que podem ser feitas a Fcs são aquelas para reduzir ou ablacionar a ligação a proteínas do complemento e/ou FCYR, reduzindo ou ablando funções efetoras mediadas por Fc, como ADCC, ADCP e CDC. Modificações exemplares incluem, porém não são limitadas a, substituições, inserções e deleções na posiçãos 234, 235, 236, 237, 267, 269, 325, 328, 330 e/ou 331 (por exemplo, 330 e 331), em que a numeração é de acordo com o índice EU. Substituições exemplares incluem, porém não estão limitadas a, 234A, 235E, 236R, 237A, 267R, 269R, 325L, 328R, 330S e 331S (por exemplo, 330S e 331S), em que a numeração é de acordo com o índice EU. Uma variante Fc pode compreender 236R/328R. Outras modificações para reduzir FCYR e interações de complemento incluem substituições 297A, 234A, 235A, 237A, 318A, 228P, 236E, 268Q, 309L, 330S, 331 S, 220S, 226S, 229S, 238S, 233P, e 234V, bem como, remoção da glicosilação na posição 297 por meios mutacionais ou enzimáticos ou por produção em organismos, tais como, bactérias que não glicosilam proteínas. Estas e outras modificações são revisadas em Strohl, 2009, Current Opinion in Biotechnology 20: 685-691.

[00168] Opcionalmente, a região Fc pode compreender um resíduo de aminoácido de ocorrência não natural em posições adicionais e/ou alternativas conhecidas por alguém versado na técnica (veja, por exemplo, as Patentes Norte-americanas 5.624.821, 6.277.375,6.737.056, 6.194.551, 7.317.091, 8.101.720; Publicações Internacionais Nos. WO 00/42072; WO 01/58957; WO 02/06919; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752; WO 04/074455; WO 04/099249; WO 04/063351; WO 05/070963; WO 05/040217, WO 05/092925 e WO 06/020114).

[00169] As afinidades e propriedades de ligação de uma região Fc para seu ligante podem ser determinadas por uma variedade de métodos de ensaio in vitro (ensaios de base bioquímica ou imunológica) conhecidos na técnica incluindo, porém não limitados a, métodos de equilíbrio (por exemplo, ensaio de imunoabsorção ligado a enzima (ELISA), ou radioimunoensaio (RIA)), ou cinéticos (por exemplo, análise BIACORE), e outros métodos, como ensaios de ligação direta, ensaios de inibição competitiva, transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET), eletroforese em gel e cromatografia (por exemplo, filtração em gel). Estes e outros métodos podem utilizar um rótulo em um ou mais dos componentes sendo examinados e/ou usar uma variedade de métodos de detecção incluindo, porém não limitados a, rótulos cromogênicos, fluorescentes, luminescentes ou isotópicos. Uma descrição detalhada das afinidades de ligação e cinéticos pode ser encontrada em Paul, W. E., ed., Fundamental immunology, 4a Ed., Lippincott-Raven, Filadélfia (1999), que se concentra nas interações anticorpo-imunógeno.

[00170] Em certas modalidades, os anticorpos anti-TREM-1 da presente invenção compreendem uma Fc que tem ligação reduzida ou é incapaz de se ligar a FCYRS. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TREM-1 tem uma afinidade de ligação reduzida a FCYRI (CD64), FcYRIIA (CD32), FCYRIIB (CD32), FCYRIIIA (CD16a), FCYRIIIB (CD16b), ou qualquer combinação das mesmas em comparação com um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácido como mencionado na SEQ ID NO: 76 e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácido como mencionado na SEQ ID NO: 54. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TREM-1 tem uma afinidade de ligação reduzida a FcyRI (CD64) em pelo menos duas vezes, pelo menos três vezes, pelo menos quatro vezes, pelo menos cinco vezes, pelo menos seis vezes, pelo menos sete vezes, pelo menos oito vezes, pelo menos nove vezes, ou pelo menos 10 vezes em comparação com um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácido como mencionado na SEQ ID NO: 76 e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácido como mencionado na SEQ ID NO: 54.

[00171] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TREM-1 compreendem uma variante Fc de IgG1 compreendendo: (a) uma ou mais substituições de aminoácido selecionadas do grupo que consiste em L234A, L235E, G237A, e qualquer combinação das mesmas, por numeração EU; (b) uma ou mais substituições de aminoácido selecionadas do grupo que consiste em L234A, L235E, G237A,A330S, P331S, e qualquer combinação das mesmas por numeração EU; (c) uma ou mais substituições de aminoácido selecionadas do grupo que consiste em K214R, C226S, C229S, P238S, e qualquer combinação das mesmas por numeração EU; ou (d) uma ou mais substituições de aminoácido selecionadas do grupo que consiste em S131C, K133R, G137E, G138S, Q196K, I199T, N203D, K214R, C226S, C229S, P238S, e qualquer combinação das mesmas por numeração EU.

[00172] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TREM-1, como descrito no presente documento, tem (a) um isótipo IgG1 e compreende uma ou mais substituições de aminoácido na região Fc no resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo em: N297A, N297Q, D270A, D265A, L234A, L235A, C226S, C229S,P238S, E233P, L234V, P238A, A327Q, A327G, P329A, K322A,L234F, L235E, P331S, T394D, A330L, M252Y, S254T, T256E, L328E, P238D, S267E, L328F, E233D, G237D, H268D, P271G, A330R, e qualquer combinação dos mesmos, em que a numeração dos resíduos é de acordo com a numeração EU ou Kabat, ou compreende uma deleção de aminoácido na região Fc em uma posição correspondente a glicina 236; (b) um isótipo IgG2 e compreende uma ou mais substituições de aminoácido na região Fc em um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo em: P238S, V234A, G237A, H268A, H268Q, H268E, V309L, N297A, N297Q, A330S, P331S, C232S, C233S, M252Y, S254T, T256E e qualquer combinação dos mesmos, em que a numeração dos resíduos é de acordo com a numeração EU ou Kabat; ou (c) um isótipo IgG4 e compreende uma ou mais substituições de aminoácido na região Fc em um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo em: E233P, F234V, L234A / F234A, L235A, G237A, E318A, S228P, L236E, S241P, L248E, T394D, M252Y, S254T, T256E, N297A,N297Q, e qualquer combinação dos mesmos, em que a numeração dos resíduos é de acordo com a numeração EU ou Kabat. Em algumas modalidades, (a) a região Fc compreende ainda uma ou mais substituições adicionais de aminoácido em um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo em A330L, L234F; L235E, P331S e qualquer combinação dos mesmos, em que a numeração dos resíduos é de acordo com a numeração EU ou Kabat; (b) a região Fc compreende ainda uma ou mais substituições adicionais de aminoácido em uma posição selecionada do grupo consistindo em M252Y, S254T, T256E, e qualquer combinação das mesmas, em que a numeração dos resíduos é de acordo com numeração EU ou Kabat; ou (c) a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido S228P de acordo com a numeração EU ou Kabat. Veja WO 2017/152102.

[00173] Em certas modalidades, é escolhida uma Fc que tenha reduzida fixação do complemento. Uma Fc exemplar, por exemplo, Fc de IgG1, com fixação de complemento reduzida tem as seguintes duas substituições de aminoácido: A330S e P331S.

[00174] Em certas modalidades, é escolhida uma Fc que não tem essencialmente função efectora, isto é, que tenha uma ligação reduzida a FCYRS e uma fixação do complemento reduzida. Uma Fc exemplar, por exemplo, Fc de IgG1, que é não efetora compreende as seguintes cinco mutações: L234A, L235E, G237A, A330S e P331S.

II. Propriedades Físicas de Anticorpo

[00175] Os anticorpos anti-TREM-1, por exemplo, aqueles descritos no presente documento, têm algumas ou todas as características físicas dos anticorpos anti-TREM-1 específicos descritos no presente documento, tais como, as características descritas nos Exemplos.

[00176] Os sítios de glicosilação, particularmente dentro das regiões variáveis, podem resultar em aumento da imunogenicidade do anticorpo ou uma alteração da pK do anticorpo devido à ligação alterada do antígeno (Marshall et al., (1972) Annu Rev Biochem 41: 673-702; Gala e Morrison (2004) J. Immunol 172: 5489-94; Wallick et al., (1988) J Exp Med 168: 1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12: 43R-56R; Parekh et al., (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al., (2000) Mol Immunol 37: 697-706). A glicosilação é conhecida por ocorrer em motifs contendo uma sequência N-X-S/T. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TREM-1 da presente invenção não contêm ou possuem glicosilação de região variável reduzida. Isto pode ser alcançado pela seleção de anticorpos que não contêm o motif de glicosilação na região variável ou por mutação de resíduos na região de glicosilação. Consequentemente, em algumas modalidades, o anticorpo anti-TREM-1 como descrito no presente documento é menos imunogênico em comparação com um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácido como mencionado na SEQ ID NO: 76 e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácido como estabelecido na SEQ ID NO: 54.

[00177] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TREM-1 não contêm sítios de isomerismo de asparagina. A desamidação da asparagina pode ocorrer nas sequências N-G ou D-G e resultar na criação de um resíduo de ácido isoaspártico que introduz uma dobra na cadeia polipeptídica e diminui sua estabilidade (efeito do ácido isoaspártico).

[00178] Cada anticorpo terá um ponto isoelétrico único (pi), que geralmente cai na faixa de pH entre 6 e 9,5. O pi para um anticorpo IgG1 normalmente está dentro da faixa de pH de 7-9,5 e o pi para um anticorpo IgG4 normalmente está dentro da faixa de pH de 6-8. Especula-se que os anticorpos com um pi fora da faixa normal podem ter algum desdobramento e instabilidade sob condições in vivo. Assim, os anticorpos anti-TREM-1, como descrito no presente documento, podem conter um valor de pi que cai na faixa normal (por exemplo, 89). Isto pode ser obtido pela seleção de anticorpos com um pi na faixa normal ou pela mutação de resíduos de superfície carregados.

[00179] Cada anticorpo terá uma temperatura de fusão característica, com uma temperatura de fusão mais alta indicando maior estabilidade geral in vivo (Krishnamurthy R e Manning M C (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71). Geralmente, a TMi (a temperatura de desdobramento inicial) pode ser maior que 60 °C, maior que 65 °C, ou maior que 70 °C. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TREM-1 da presente invenção têm uma temperatura de fusão mais alta em comparação com um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 76 e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 54. Consequentemente, em algumas modalidades, os anticorpos anti- TREM-1 da presente invenção são termicamente estáveis em comparação com um anticorpo de referência compreendendo uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 76 e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 54, conforme medido, por exemplo, por um Calorímetro de Varredura Diferencial Capilar (CAP-DSC). O ponto de fusão de um anticorpo pode ser medido usando calorimetria de varredura diferencial (Chen et al., (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al., (1999) Immunol Lett 68:47-52) ou dicroísmo circular (Murray et al., (2002) J. Chromatogr Sci 40: 343-9). Em algumas modalidades, cerca de 10% a 20%, cerca de 20% a 30% (por exemplo, 24%), ou cerca de 30% a 40% do anticorpo é reversível quando é aquecido para 77 °C.

[00180] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TREM-1 da presente invenção não se degradam rapidamente. A degradação de um anticorpo pode ser medida usando eletroforese capilar (CE) e MALDI-MS (Alexander A J e Hughes D E (1995) Anal Chem 67:362632).

[00181] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TREM-1, conforme no presente documento descrito, apresentam efeitos de agregação mínimos, que podem levar ao desencadeamento de uma resposta imune indesejada e/ou propriedades farmacocinéticas alteradas ou desfavoráveis. Geralmente, os anticorpos são aceitáveis com agregação de 25% ou menos, 20% ou menos, 15% ou menos, 10% ou menos, ou 5% ou menos. A agregação pode ser medida por diversas técnicas, incluindo coluna de exclusão por tamanho (SEC), cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), e espalhamento dinâmico de luz (DLS). Em algumas modalidades, os anticorpos anti- TREM-1 da presente invenção são monoméricos conforme observado por cromatografia líquida de alto desempenho por exclusão de tamanho (SE-HPLC). Em algumas modalidades, os anticorpos anti- TREM-1 apresentam risco mínimo de fragmentação como observado por espectrometria de massa tandem de cromatografia líquida bidimensional (2D-LC/MS) ou análise de massa intacta usando espectrometria de massa tandem de cromatografia líquida (LC/MS).

III. Ácidos Nucleicos, Vetores e Células

[00182] Outro aspecto no presente documento descrito diz respeito às moléculas de ácido nucleico que codificam os anticorpos anti- TREM-1 descritos no presente documento. Os ácidos nucleicos podem estar presentes em células inteiras, em um lisado celular, ou em uma forma parcialmente purificada ou substancialmente pura. Um ácido nucleico é "isolado" ou "tornado substancialmente puro" quando purificado de outros componentes celulares ou outros contaminantes, por exemplo, outros ácidos nucleicos celulares (por exemplo, outro DNA cromossômico, por exemplo, o DNA cromossômico que está ligado ao DNA isolado na natureza) ou proteínas, por técnicas padrão, incluindo tratamento alcalino/SDS, banda CsCl, cromatografia de coluna, enzimas de restrição, eletroforese em gel de agarose e outras bem conhecidas na técnica. Veja, F. Ausubel, et al., Ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing e Wiley Interscience, Nova Iorque. Um ácido nucleico descrito no presente documento pode ser, por exemplo, DNA ou RNA e pode ou não conter sequências intrônicas. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é uma molécula de cDNA.

[00183] Ácidos nucleicos descritos no presente documento podem ser obtidos usando técnicas padrão de biologia molecular. Para anticorpos expressos por hibridomas (por exemplo, hibridomas preparados a partir de camundongos transgênicos portadores de genes de imunoglobulina humana conforme descrito abaixo), cDNAs que codificam as cadeias leves e pesadas do anticorpo feito pelo hibridoma podem ser obtidos por amplificação por PCR padrão ou técnicas de clonagem de cDNA. Para anticorpos obtidos de uma biblioteca de genes de imunoglobulina (por exemplo, usando técnicas de exibição de fago), o ácido nucleico que codifica o anticorpo pode ser recuperado da biblioteca.

[00184] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos descritos no presente documento são aqueles que codificam as sequências de VH e VL de anticorpos anti-TREM-1 da presente invenção. Sequências de DNA exemplares que codificam sequências VH e VL são estabelecidas em SEQ ID NOs: 58-61 e 62-65, respectivamente.

[00185] Um método para preparar um anticorpo anti-TREM-1 conforme descrito no presente documento pode compreender a expressão de uma cadeia pesada e as cadeias leves em uma linhagem celular compreendendo as sequências de nucleotídeos que codificam as cadeias leves e pesadas com um peptídeo sinal, por exemplo, SEQ ID NOs: 58-61 e 62-65, respectivamente. As células hospedeiras compreendendo estas sequências de nucleótidos estão no presente documento abrangidas.

[00186] Uma vez que os fragmentos de DNA que codificam os segmentos VH e VL são obtidos, esses fragmentos de DNA podem ser ainda manipulados por técnicas de DNA recombinante padrão, por exemplo, para converter os genes da região variável em genes de cadeia de anticorpo de comprimento total, em genes de fragmento Fab ou em um gene scFv. Nestas manipulações, um fragmento de DNA que codifica VL ou VH é operativamente ligado a outro fragmento de DNA que codifica outra proteína, tal como, uma região constante de anticorpo ou um ligante flexível. O termo "operativamente ligado", como usado neste contexto, pretende significar que os dois fragmentos de DNA são unidos de tal forma que as sequências de aminoácido codificadas pelos dois fragmentos de DNA permaneçam em estrutura.

[00187] O DNA isolado que codifica a região VH pode ser convertido em um gene de cadeia pesada de comprimento total por meio da ligação operacional do DNA que codifica VH a outra molécula de DNA que codifica regiões constantes de cadeia pesada (articulação, CH1, CH2 e/ou CH3). As sequências de genes humanos da região constante de cadeia pesada são conhecidas na técnica (veja, por exemplo, Kabat, EA, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, US Department of Health and Human Services, Publicação NIH No. 91-3242) e fragmentos de DNA abrangendo essas regiões podem ser obtidos por amplificação de PCR padrão. A região constante de cadeia pesada pode ser uma região constante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD, por exemplo, uma região constante de IgG2 e/ou IgG4. Para um gene de cadeia pesada de fragmento Fab, o DNA que codifica VH pode ser operativamente ligado a outra molécula de DNA que codifica apenas a região constante CH1 de cadeia pesada.

[00188] O DNA isolado que codifica a região VL pode ser convertido em um gene de cadeia leve de comprimento total (bem como, um gene de cadeia leve Fab) ligando operativamente o DNA que codifica VL a outra molécula de DNA que codifica a região constante de cadeia leve, CL. As sequências dos genes humanos de região constante de cadeia leve são conhecidas na técnica (veja, por exemplo, Kabat, EA, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immuno-Logical Interest, quinta edição, US Department of Health and Human Services, Publicação NIH No. 91-3242) e fragmentos de DNA que abrangem essas regiões podem ser obtidos por amplificação de PCR padrão. A região constante de cadeia leve pode ser uma região constante kappa ou lambda.

[00189] Outro aspecto descrito no presente documento se refere a células (por exemplo, células hospedeiras) que expressam (por exemplo, de forma recombinante) anticorpos anti-TREM-1 descritos no presente documento e polinucleotídeos relacionados e vetores de expressão. São no presente documento fornecidos também vetores compreendendo polinucleotídeos que compreendem sequências de nucleotídeos que codificam anticorpos anti-TREM-1 ou um fragmentodos mesmos. Em algumas modalidades, os vetores podem ser usados para expressar de forma recombinante anticorpos anti- TREM-1 dscritos no presente documento em células hospedeiras, por exemplo, em células de mamíferos. Em algumas modalidades, os vetores podem ser usados para terapia de gene.

[00190] Os vetores adequados para a invenção incluem vetores de expressão, vetores virais e vetores de plasmídeo. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor viral.

[00191] Como usado no presente documento, um vetor de expressão refere-se a qualquer construto de ácido nucleico que contém os elementos necessários para a transcrição e tradução de uma sequência de codificação inserida, ou no caso de um vetor viral de RNA, os elementos necessários para a replicação e tradução, quando introduzidos em uma célula hospedeira apropriada. Os vetores de expressão podem incluir plasmídeos, fagemídeos, vírus e derivados dos mesmos.

[00192] Os vetores de expressão da invenção podem incluir polinucleotídeos que codificam o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo descrito no presente documento. Em algumas modalidades, as sequências de codificação para o anticorpo ou a porção de ligação ao antígeno das mesmas estão operacionalmente ligadas a uma sequência de controle de expressão. Como usado no presente documento, duas sequências de ácido nucleico estão operacionalmente ligadas quando estão ligadas covalentemente de modo a permitir que cada sequência de ácido nucleico componente retenha a sua funcionalidade. Diz-se que uma sequência de codificação e uma sequência de controle de expressão de gene estão operativamente ligadas quando estão covalentemente ligadas de modo a colocar a expressão ou transcrição e/ou tradução da sequência de codificação sob a influência ou controle da sequência de controle de expressão de gene. Duas sequências de DNA são ditas operativamente ligadas se a indução de um promotor na sequência de expressão do gene 5' resultar na transcrição da sequência de codificação e se a natureza da ligação entre as duas sequências de DNA não (1) resultar na introdução de uma mutação mudança de estrutura, (2) interferir com a capacidade da região promotora para direcionar a transcrição da sequência de codificação, ou (3) interferir com a capacidade do transcrito de RNA correspondente de ser traduzido em uma proteína. Assim, uma sequência de expressão de gene seria operacionalmente ligada a uma sequência de ácido nucleico de codificação se a sequência de expressão de gene fosse capaz de efetuar a transcrição dessa sequência de ácido nucleico de codificação de modo que o transcrito resultante seja traduzido no anticorpo desejado ou porção de ligação ao antígeno do mesmo.

[00193] Os vetores virais incluem, porém não estão limitados a, sequências de ácido nucleico dos seguintes vírus: retrovírus, como o vírus da leucemia murina de Moloney, vírus do sarcoma murino Harvey, vírus do tumor mamário murino, vírus do sarcoma de Rous; lentivírus; adenovírus; vírus adeno-associado; vírus do tipo SV40; poliomavírus; vírus Epstein-Barr; papilaloma vírus; vírus do herpes; vírus vaccinia; vírus da poliomielite; e vírus de RNA, como um retrovírus. Pode-se usar prontamente outros vetores bem conhecidos na técnica. Certos vetores virais são baseados em vírus eucarióticos não citopáticos nos quais genes não essenciais foram substituídos pelo gene de interesse. Os vírus não citopáticos incluem retrovírus, cujo ciclo de vida envolve a transcrição reversa do RNA viral genômico em DNA com subsequente integração proviral no DNA celular do hospedeiro. Os retrovírus foram aprovados para ensaios de terapia genética em humanos. Mais úteis são aqueles retrovírus deficientes na replicação (isto é, capaz de direcionar a síntese das proteínas desejadas, mas incapaz de fabricar uma partícula infecciosa). Tais vetores de expressão retrovirais geneticamente alterados têm utilidade geral para a transdução de alta eficiência de genes in vivo. Protocolos padrão para a produção de retrovírus deficientes em replicação (incluindo as etapas de incorporação de material genético exógeno em um plasmídeo, transfecção de uma linhagem de células de empacotamento com plasmídeo, produção de retrovírus recombinantes pela linhagem de células de empacotamento, coleta de partículas virais de meios de cultura de tecidos, e infecção das células alvo com partículas virais) são fornecidos em Kriegler, M., Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, WH Freeman Co., Nova Iorque (1990) e Murry, E. J., Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J. (1991).

[00194] Em algumas modalidades, o vírus é um vírus adeno- associado, um vírus de DNA de fita dupla. O vírus adeno-associado pode ser modificado para ser deficiente em replicação e é capaz de infectar uma ampla faixa de tipos de células e espécies. Tem ainda vantagens, tais como estabilidade ao calor e ao solvente lipídico; altas frequências de transdução em células de diversas linhagens, incluindo células hematopoiéticas; e falta de inibição de superinfecção, permitindo assim várias séries de transduções. Alegadamente, o vírus adeno-associado pode se integrar-se ao DNA celular humano de uma maneira específica do sítio, minimizando, assim, a possibilidade de mutagênese de inserção e variabilidade da expressão do gene inserido, característica da infecção retroviral. Além disso, as infecções por vírus adeno-associados de tipo selvagem foram seguidas em cultura de tecido por mais de 100 passagens na ausência de pressão seletiva, o que implica que a integração genômica do vírus adeno- associado é um evento relativamente estável. O vírus adeno- associado também pode funcionar de maneira extracromossômica.

IV. Imunoconjugados

[00195] A presente invenção também fornece imunoconjugados compreendendo qualquer um dos anticorpos anti-TREM-1 descrito no presente documento. Em algumas modalidades, o imunoconjugado compreende um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno ligado a um agente. Em algumas modalidades, o imunoconjugado compreende uma molécula biespecífica descrita no presente documento ligada a um agente (por exemplo, como agente terapêutico ou um agente de diagnóstico).

[00196] Para fins de diagnóstico, os agentes apropriados são marcadores detectáveis que incluem radioisótopos, para imagens de corpo inteiro, e radioisótopos, enzimas, marcadores fluorescentes e outros marcadores de anticorpos adequados para o teste de amostras. Os marcadores detectáveis que podem ser ligados a qualquer anticorpo anti-TREM-1 descrito no presente documento podem ser qualquer um dos vários tipos usados atualmente no campo de diagnósticos in vitro, incluindo marcadores particulados incluindo soluções de metal como ouro coloidal, isótopos como I125 ou Tc99 apresentou, por exemplo, com um agente quelante peptídico do tipo N2S2, N3S ou N4, cromóforos incluindo marcadores fluorescentes, marcadores luminescentes, marcadores fosforescentes e similares, bem como, marcadores de enzimas que convertem um determinado substrato em um marcador detectável, e marcadores de polinucleotídeo que são revelados após amplificação, como por reação em cadeia de polimerase. Marcadores de enzimas adequados incluem peroxidase de rábano, fosfatase alcalina e similares. Por exemplo, o marcador pode ser a enzima fosfatase alcalina, detectada medindo a presença ou formação de quimioluminescência após a conversão de substratos de 1,2 dioxetano, como adamantil metóxi fosforilóxi fenil dioxetano (AMPPD), 3-(4-(metoxiespiro{1,2-dioxetano-3,2'-(5'-cloro)triciclo{3.3.1,1 3,7}decan}-4-il)fenil fosfato dissódico (CSPD), bem como, CDP e CDP-STAR® ou outros substratos luminescentes bem conhecidos por aqules na técnica, por exemplo, os quelatos de lantanídeos adequados, como Térbio (III) e Európio (III). O meio de detecção é determinado pelo marcador escolhido. Aparência do marcador ou de seus produtos de reação pode ser alcançada a olho nu, no caso onde o marcador é particulado e se acumular em níveis adequados, ou por meio de instrumentos como espectrofotômetro, luminômetro, fluorímetro e similares, tudo de acordo com a prática padrão.

[00197] Em algumas modalidades, os métodos de conjugação resultam em ligações que são substancialmente (ou quase) não imunogênicas, por exemplo, peptídeo- (isto é, amida-), sulfeto-, (estericamente impedido), dissulfeto-, hidrazona -, ligações de éter. Estas ligações são quase não imunogênicas e mostram estabilidade razoável no soro (veja, por exemplo, Senter, P. D., Curr. Opin. Chem. Biol. 13 (2009) 235-244; WO 2009/059278; WO 95/17886).

[00198] Dependendo da natureza bioquímica da porção e do anticorpo, diferentes estratégias de conjugação podem ser usadas. No caso de a porção ser de ocorrência natural ou recombinante entre 50 a 500 aminoácidos, existem procedimentos padrão em livros de texto que descrevem a química para a síntese de conjugados de proteínas, que pode ser facilmente seguida pelo técnico versado (veja, por exemplo, Hackenberger, CPR, e Schwarzer, D., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 47 (2008) 10030-10074). Em algumas modalidades, é utilizada a reação de uma porção de maleinimido com um resíduo de cisteína dentro do anticorpo ou da porção. Esta é uma química de acoplamento especialmente adequada no caso, por exemplo, de um fragmento Fab ou Fab' de um anticorpo ser usado. Alternativamente, em algumas modalidades, é realizado o acoplamento à extremidade de terminal C do anticorpo ou porção. A modificação de terminal C de uma proteína, por exemplo, de um fragmento Fab, pode ser realizada como descrito (Sunbul, M. e Yin, J., Org. Biomol. Chem. 7 (2009) 3361-3371).

[00199] Em geral, a reação específica do sítio e o acoplamento covalente são baseados na transformação de um aminoácido natural em um aminoácido com uma reatividade que é ortogonal à reatividade dos outros grupos funcionais presentes. Por exemplo, uma cisteína específica dentro de um contexto de sequência rara pode ser convertida enzimaticamente em um aldeído (veja Frese, M. A., e Dierks, T., Chem Bio Chem. 10 (2009) 425-427). Também é possível obter uma modificação de aminoácido desejada utilizando a reatividade enzimática específica de certas enzimas com um aminoácido natural em um determinado contexto de sequência (veja, por exemplo, Taki, M. et al., Prot. Eng. Des. Sel. 17 (2004) 119-126; Gautier, A. et al. Chem. Biol. 15 (2008) 128-136; e a formação catalisada por protease de ligações C - N é usada por Bordusa, F., Highlights em Bioorganic Chemistry (2004) 389-403). A reação de sítio específica e o acoplamento covalente também podem ser alcançados pela reação seletiva de aminoácidos terminais com reagentes modificadores apropriados.

[00200] A reatividade de uma cisteína de terminal N com benzonitrilas (veja Ren, H. et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48 (2009) 9658-9662) pode ser usada para atingir um acoplamento covalente específico ao sítio.

[00201] A ligação química nativa também pode contar com resíduos de cisteína de terminal C (Taylor, E. Vogel; Imperiali, B, Nucleic Acids and Molecular Biology (2009), 22 (Protein Engineering), 65-96).

[00202] US6437095 B1 descreve um método de conjugação que se baseia na reação mais rápida de uma cisteína dentro de um trecho de aminoácidos carregados negativamente com uma cisteína localizada em um trecho de aminoácidos carregados positivamente.

[00203] A porção também pode ser um peptídeo sintético ou mimetizador de peptídeo. No caso de um polipeptídeo ser sintetizado quimicamente, os aminoácidos com reatividade química ortogonal podem ser incorporados durante essa síntese (veja, por exemplo, de Graaf, A. J. et al., Bioconjug. Chem. 20 (2009) 1281-1295). Uma vez que uma grande variedade de grupos funcionais ortogonais está em jogo e pode ser introduzida em um peptídeo sintético, a conjugação de tal peptídeo a um ligante é química padrão.

[00204] A fim de obter um polipeptídeo monomarcado, o conjugado com estequiometria 1:1 pode ser separado por cromatografia de outros produtos colaterais de conjugação. Este procedimento pode ser facilitado pelo uso de um membro do par de ligação marcado com corante e um ligante carregado. Ao usar este tipo de membro de par de ligação marcado e altamente carregado negativamente, polipeptídeos monoconjugados são facilmente separados de polipeptídeos não marcados e polipeptídeos que carregam mais de um ligante, uma vez que a diferença de carga e peso molecular pode ser usada para separação. O corante fluorescente pode ser útil para purificar o complexo de componentes não ligados, como um ligante monovalente marcado.

[00205] Em algumas modalidades, a porção ligada a um anticorpo anti-TREM-1 é selecionada do grupo consistindo em uma porção de ligação, uma porção de marcação e uma porção biologicamente ativa.

[00206] Anticorpos anti-TREM-1 descritos no presente documento também podem ser conjugados a um agente terapêutico para formar um imunoconjugado, como um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC). Os agentes terapêuticos adequados incluem antimetabólitos, agentes alquilantes, aglutinates de sulco menor de DNA, intercaladores de DNA, reticuladores de DNA, inibidores de histona desacetilase, inibidores de exportação nuclear, inibidores de proteassoma, inibidores de topoisomerase I ou II, inibidores de proteína de choque térmico, inibidores de tirosina cinase, antibióticos e agentes antimitóticos. No ADC, o anticorpo e o agente terapêutico são preferivelmente conjugados por meio de um ligante clivável, como um ligante de peptidila, dissulfeto ou hidrazona. Em algumas modalidades, o ligante é um ligante de peptidila, tais como, Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala- Val, Lys-Lys, Pro-Val-Gly-Val-Val (SEQ ID NO: 80), Ala-Asn-Val, Val- Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Cit-Cit, Val-Lys, Lys, Cit, Ser, ou Glu. Os ADCs podem ser preparados conforme descrito na Patente Norte-americana Nos. 7.087.600; 6.989.452; e 7.129.261; Publicações PCT WO 02/096910; WO 07/038658; WO 07/051081; WO 07/059404; WO 08/083312; e WO 08/103693; Patente Norte-americana No. Publicações 20060024317; 20060004081; e 20060247295.

[00207] Os anticorpos anti-TREM-1, por exemplo, aqueles descritos no presente documento, também podem ser usados para detectar TREM-1, como o TREM-1 humano, por exemplo, TREM-1 humano em tecidos ou amostras de tecidos. Os anticorpos podem ser usados, por exemplo, em ensaio ELISA ou em citometria de fluxo. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-TREM-1 é contactado com células, por exemplo, células em um tecido, por um tempo adequado para que ocorra a ligação específica, e a seguir um reagente, por exemplo, um anticorpo que detecta o anticorpo anti-TREM-1, é adicionado. Ensaios exemplares são fornecidos nos Exemplos. O anticorpo anti-TREM-1 pode ser um anticorpo totalmente humano, ou pode ser um anticorpo quimérico, como um anticorpo com regiões humanas variáveis e regiões constantes murinas ou uma porção das mesmas. Métodos exemplares para detecção de TREM-1, por exemplo, TREM-1 humano, em uma amostra (amostra de célula ou tecido) compreendem (i) contatar uma amostra com um anticorpo anti-TREM-1, por um tempo suficiente para permitir a ligação específica do anticorpo anti- TREM-1 ao TREM-1 na amostra, e (2) contactar a amostra com um reagente de detecção, por exemplo, um anticorpo, que se liga especificamente ao anticorpo anti-TREM-1, tal como, à região Fc do anticorpo anti-TREM-1, para assim detectar o TREM-1 ligado pelo o anticorpo anti-TREM-1. As etapas de lavagem podem ser incluídas após a incubação com o anticorpo e/ou reagente de detecção. Anticorpos anti-TREM-1 para uso nesses métodos não precisam ser ligados a um marcador ou agentes de detecção, pois um agente de detecção separado pode ser usado.

[00208] Outros usos para anticorpos anti-TREM-1, por exemplo, como monoterapia ou terapia de combinação, são fornecidos em outro lugar neste documento, por exemplo, na seção referente a tratamentos de combinação.

V. Moléculas biespecíficas

[00209] Anticorpos anti-TREM-1 descritos no presente documento podem ser usados para formar moléculas biespecíficas. Um anticorpo anti-TREM-1, ou porções de ligação ao antígeno do mesmo, pode ser derivatizado ou ligado a outra molécula funcional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína (por exemplo, outro anticorpo ou ligante para um receptor) para gerar uma molécula biespecífica que se liga a pelo menos dois diferentes sítios de ligação ou moléculas alvo. Por exemplo, um anticorpo anti-TREM-1 pode ser ligado a um anticorpo ou scFv que se liga especificamente a qualquer proteína que pode ser usada como alvos potenciais para tratamentos combinados, como as proteínas descritas no presente documento (por exemplo, anticorpos para IP-10 ou TNF-α). O anticorpo descrito no presente documento pode, de fato, ser derivado ou ligado a mais de uma outra molécula funcional para gerar moléculas multiespecíficas que se ligam a mais de dois sítios de ligação diferentes e/ou moléculas alvo; tais moléculas multiespecíficas também são destinadas a serem abrangidas pelo termo "molécula biespecífica" como usado no presente documento. Para criar uma molécula biespecífica descrita no presente documento, um anticorpo descrito no presente documento pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outro modo) a uma ou mais outras moléculas de ligação, como outro anticorpo, fragmento de anticorpo, peptídeo ou mimético de ligação, de modo que resulta uma molécula biespecífica.

[00210] Consequentemente, fornecidas no presente documento são moléculas biespecíficas compreendendo pelo menos uma primeira especificidade de ligação para TREM-1 e uma segunda especificidade de ligação para um segundo epítopo alvo. Em algumas modalidades descritas no presente documento em que a molécula biespecífica é multiespecífica, a molécula pode incluir ainda uma terceira especificidade de ligação.

[00211] Em algumas modalidades, as moléculas biespecíficas dêscritas no presente documento compreendem como uma especificidade de ligação pelo menos um anticorpo, ou um fragmento de anticorpo do mesmo, incluindo, por exemplo, um Fab, Fab', F(ab')2, Fv, ou uma Fv de cadeia simples (scFv). O anticorpo também pode ser um dímero de cadeia leve ou cadeia pesada, ou qualquer fragmento mínimo do mesmo, tal como um Fv ou um construto de cadeia simples, como descrito em Ladner et al. Patente Norte-americana No. 4.946.778.

[00212] Embora os anticorpos monoclonais humanos sejam preferidos, outros anticorpos que podem ser usados nas moléculas biespecíficas no presente documento são os anticorpos monoclonais murinos, quiméricos e humanizados.

[00213] As moléculas biespecíficas no presente documento podem ser preparadas por meio da conjugação das especificidades de ligação dos constituintes usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, cada especificidade de ligação da molécula específica pode ser gerada separadamente e em seguida conjugadas entre si. Quando as especificidades de ligação são proteínas ou peptídeos, uma variedade de agentes de acoplamento ou reticulação podem ser usados para conjugação covalente. Exemplos de agentes de reticulação incluem proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil- tioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB), o- fenilenodimaleimida (oPDM), N- succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), e sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1- carboxilato (sulfo-SMCC) (ver, por exemplo, Karpovskyet al. (1984) J. Exp. Med. 160: 1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 8648). Outros métodos incluem aqueles descritos em Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83), e Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 23672375). Alguns agentes de conjugação são SATA e sulfo-SMCC, ambos disponíveis na Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

[00214] Quando as especificidades de ligação são anticorpos, eles podem ser conjugados por meio da ligação sulfidrila das regiões de articulação do terminal C das duas cadeias pesadas. Em algumas modalidades, a região de articulação é modificada para conter um número ímpar de resíduos sulfidrila, de preferência um, antes da conjugação.

[00215] Alternativamente, ambas as especificidades de ligação podem ser codificadas no mesmo vetor e expressas e montadas na mesma célula hospedeira. Este método é particularmente útil onde a molécula biespecífica é uma proteína de fusão mAb x mAb, mAb x Fab, mAb x (scFv)2, Fab x F(ab')2 ou ligante x Fab. Um anticorpo biespecífico pode compreender um anticorpo compreendendo um scFv no terminal C de cada cadeia pesada. Uma molécula biespecífica no presente documento descrita pode ser uma molécula de cadeia única compreendendo um anticorpo de cadeia única e um determinante de ligação, ou uma molécula biespecífica de cadeia única compreendendo dois determinantes de ligação. Moléculas biespecíficas podem compreender pelo menos duas moléculas de cadeia única. Os métodos de preparação das moléculas biespecíficas são descritos, por exemplo, na Patente Norte-americana No. 5.260.203; Patente Norte-americana N° 5.455.030; Patente Norte- americana No. 4.881.175; Patente Norte-americana No. 5.132.405; Patente Norte-americana No. 5.091.513; Patente Norte-americana No. 5.476.786; Patente Norte-americana No. 5.013.653; Patente Norte- americana No. 5.258.498; e Patente Norte-americana No. 5.482.858.

[00216] A ligação das moléculas biespecíficas a seus alvos específicos pode ser confirmada usando métodos reconhecidos na técnica, tal como ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), radioimunoensaio.

[00217] (RIA), análise FACS, bioensaio (por exemplo, inibição de crescimento), ou ensaio Western Blot. Cada um desses ensaios geralmente detecta a presença de complexos de proteína-anticorpo de interesse particular, usando um reagente marcado (por exemplo, um anticorpo) específico para o complexo de interesse.

VI. Kits

[00218] São fornecidos no presente documento kits compreendendo um ou mais anti-corpos anti-TREM-1 no presente documento descritos, ou porções de ligação ao antígeno dos mesmos, moléculas biespecíficas, ou imunoconjugados das mesmas. Em algumas modalidades, é no presente documento fornecido um pacote ou kit farmacêutico compreendendo um ou mais recipientes carregados com um ou mais dos ingredientes das composições farmacêuticas no presente documento descritas, tais como um ou mais anticorpos no presente documento fornecidos ou uma porção de ligação ao antígeno dos mesmos, opcional uma instrução de uso. Em algumas modalidades, os kits contêm uma composição farmacêutica descrita no presente documento e qualquer agente profilático ou terapêutico, tal como aqueles no presente documento descritos.

VII. Composições e Formulações

[00219] São também fornecidas no presente documento composições (por exemplo, composições farmacêuticas) e formulações compreendendo um ou mais dos anti-TREM-1 (incluindo polinucleotídeos, vetores, e células que codificam e/ou expressam os anticorpos anti-TREM-1) descritos no presente documento. Por exemplo, em uma modalidade, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais anticorpos anti- TREM-1 como no presente documento descrito, formulada juntamente com um transportador farmaceuticamente aceitável.

[00220] Tal como no presente documento utilizado, "transportador farmaceuticamente aceitável" inclui quaisquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardo da absorção, e similares que são fisiologicamente compatíveis. Em algumas modalidades, o transportador é adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, espinhal ou epidérmica (por exemplo, por injeção ou infusão). Dependendo da via de administração, o composto ativo, isto é, anticorpo, imunoconjugado, ou molécula biespecífica, pode ser revestido em um material para proteger o composto da ação de ácidos e outras condições naturais que podem inativar o composto.

[00221] Consequentemente, um dos objetivos da presente invenção é o de fornecer uma formulação farmacêutica que melhora a estabilidade dos anticorpos anti-TREM-1 e, desse modo, permite seu armazenamento por longo prazo. Em algumas modalidades, a formulação farmacêutica no presente documento descrita compreende: (a) um anticorpo anti-TREM-1; (b) um agente de tamponamento; (c) um agente de estabilização; (d) um sal; (e) um agente de volume; e/ou (f) um tensoativo. Em algumas modalidades, a formulação farmacêutica é estável por pelo menos 1 mês, pelo menos 2 meses, pelo menos 3 meses, pelo menos 6 meses, pelo menos 1 ano, pelo menos 2 anos, pelo menos 3 anos, pelo menos 5 anos ou mais. Em algumas modalidades, a formulação é estável quando armazenada a 4°C, 25°C, ou 40°C.

Agente de Tamponamento

[00222] Os agentes de tamponamento úteis para a presente invenção podem ser uma base ou ácido fraco usado para manter a acidez (pH) de uma solução próxima de um valor escolhido após a adição de outro ácido ou base. Agentes de tamponamento adequados podem maximizar a estabilidade das formulações farmacêuticas mantendo o controle do pH da formulação. Os agentes de tamponamento adequados também podem garantir a compatibilidade fisiológica ou otimizar a solubilidade. Reologia, viscosidade e outras propriedades também podem depender do pH da formulação. Os agentes de tamponamento comuns incluem, mas não estão limitados a, histidina, citrato, succinato, acetato e fosfato. Em algumas modalidades, um agente de tamponamento compreende histidina (por exemplo, L- histidina) com agentes de isotonicidade e, potencialmente, ajuste de pH com um ácido ou base conhecido na técnica. Em certas modalidades, o agente de tamponamento é a L-histidina. Em certas modalidades, o pH da formulação é mantido entre cerca de 2 e cerca de 10, ou entre cerca de 4 e cerca de 8.

Agente Estabilizante

[00223] Os agentes estabilizantes são adicionados a um produto farmacêutico para estabilizar esse produto. Esses agentes podem estabilizar proteínas de várias maneiras diferentes. Os agentes estabilizadores comuns incluem, mas não estão limitados a,aminoácidos tais como glicina, alanina, lisina, arginina, ou treonina, carboidratos tais como glicose, sacarose, trealose, rafmose, ou maltose, polióis tais como glicerol, manitol, sorbitol, ciclodextrinas ou dextranas de qualquer tipo e peso molecular, ou PEG. Em um aspecto da invenção, o agente de estabilização é escolhido a fim de maximizar a estabilidade do polipeptídeo FIX em preparações liofilizadas. Em certas modalidades, o agente estabilizador é sacarose e/ou arginina. Agente de volume

[00224] Os agentes de volume podem ser adicionados a um produto farmacêutico para adicionar volume e massa ao produto, desse modo facilitando dosagem precisa e manipulação do mesmo. Os agentes de volume comuns incluem, mas não estão limitados a, lactose, sacarose, glicose, manitol, sorbitol, carbonato de cálcio ou estearato de magnésio.

Tensoativo

[00225] Os tensoativos são substâncias anfipáticas com grupos liofílicos e liofóbicos. Um tensoativo pode ser aniônico, catiônico, zuiteriônico ou não iônico. Exemplos de tensoativos não iônicos incluem, mas não estão limitados a, etoxilato de alquila, nonilfenol etoxilato, etoxilato de amina, óxido de polietileno, óxido de polipropileno, álcoois graxos, tais como álcool cetílico ou álcool oleílico, cocamida MEA, cocamida MEA, polissorbatos ou óxido de dodecil dimetilamina. Em algumas modalidades, o tensoativo é polissorbato 20 ou polissorbato 80,

[00226] Em algumas modalidades, a formulação farmacêutica da presente invenção compreende: (a) cerca de 0,25 mg/mL a 250 mg/mL (por exemplo, 10 a 200 mg/mL) de um anticorpo anti-TREM-1; (b) cerca de histidina a 20 mM; (c) cerca de sacarose a 150 mM; (d) cerca de arginina a 25 mM; e (e) cerca de NaCl a 50 mM.

[00227] A formulação pode também compreender um ou mais de um sistema tampão, um conservante, um agente de tonicidade, um agente quelante, um estabilizante e/ou um tensoativo, bem como várias combinações dos mesmos. O uso de conservantes, agentes isotônicos, agentes quelantes, estabilizadores e tensoativos em composições farmacêuticas é bem conhecido pela pessoa versada. Pode ser feita referência a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edição, 1995.

[00228] Em algumas modalidades, a formulação farmacêutica é uma formulação aquosa. Tal formulação é tipicamente uma solução ou uma suspensão, mas também pode incluir coloides, dispersões, emulsões e materiais de múltiplas fases. O termo "formulação aquosa" é definido como uma formulação compreendendo pelo menos 50% p/p de água. Da mesma forma, o termo "solução aquosa" é definido como uma solução compreendendo pelo menos 50% p/p de água, e o termo "suspensão aquosa" é definido como uma suspensão compreendendo pelo menos 50% p/p de água.

[00229] Em algumas modalidades, a formulação farmacêutica é uma formulação liofilizada, à qual o médico ou o paciente adiciona solventes e/ou diluentes antes do uso.

[00230] Composições farmacêuticas no presente documento descritas podem também ser administradas em terapia de combinação, isto é, combinada com outros agentes. Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir um anticorpo anti-TREM-1 no presente documento combinado com pelo menos um outro agente terapêutico. Exemplos de agentes terapêuticos que podem ser usados em terapia de combinação podem incluir outros compostos, fármacos,e/ou agentes usados para o tratamento de uma doença ou distúrbio (por exemplo, um distúrbio inflamatório). Tais compostos, fármacos, e/ou agentes podem incluir, por exemplo, fármacos antiinflamatórios ou anticorpos que bloqueiam ou reduzem a produção de citocinas inflamatórias. Em algumas modalidades, os agentes terapêuticos podem incluir um anticorpo anti-IP-10, um anticorpo anti-TNF-α (por exemplo, adalimumabe (HUMIRA®), golimumabe (SIMPONI®), infliximabe (REMICADE®), certolizumabe pegol (CIMZIA®)), interferon beta-1a (por exemplo, AVONEX®, REBIF®), interferon beta-1b (por exemplo, BETASERON®, EXTAVIA®), acetato de glatirâmero (por exemplo, COPAXONE®, GLATOPA®), mitoxantrona (por exemplo, NOVANTRONE®), fármacos anti-inflamatórios não esteroidais (NSAIDs), analgésicos, corticosteroides, e associações dos mesmos.

[00231] Os compostos farmacêuticos no presente documento mencionados podem incluir um ou mais sais farmaceuticamente aceitáveis. Um "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a um sal que retém a atividade biológica desejada do composto original e não confere quaisquer efeitos toxicológicos indesejados (ver, por exemplo, Berge, SM, et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19). Exemplos de tais sais incluem sais de adição de ácido e sais de adição de base. Os sais de adição de ácido incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos não tóxicos, como clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromídrico, iodídrico, forforoso e similares, bem como de ácidos orgânicos não tóxicos, tais como ácidos alifáticos mono- e dicarboxílicos, ácidos alcanóicos substituídos por fenila, ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfônicos alifáticos e aromáticos e similares. Os sais de adição de base incluem aqueles derivados de metais alcalinoterrosos, tais como sódio, potássio, magnésio, cálcio e similares, bem como de aminas orgânicas não tóxicas, tais como N,N'- dibenziletilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina,dietanolamina, etilenodiamina, procaína e similares.

[00232] Uma composição farmacêutica no presente documento descrita pode também incluir um antioxidante farmaceuticamente aceitável. Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e similares; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de ascorbila, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propila, alfa-tocoferol e similares; e (3) agentes quelantes de metais, tais como ácido cítrico, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico e similares.

[00233] Exemplos de transportadores aquosos e não aquosos adequados que podem ser usados nas composições farmacêuticas no presente documento descritas incluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol e similares), e misturas adequadas destes, vegetais óleos, tal como o óleo de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis, tal como o oleato de etila. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento, tal como a lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersões, e pelo uso de tensoativos.

[00234] Estas composições podem também conter adjuvantes, tais como conservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes e agentes dispersantes. A prevenção da presença de microrganismos pode ser assegurada tanto por procedimentos de esterilização, supra, quanto pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenol sórbico e similares. Também pode ser desejável incluir agentes isotônicos, tais como açúcares, cloreto de sódio e similares nas composições. Além disso, a absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser realizada pela inclusão de agentes que retardam a absorção como o monoestearato de alumínio e a gelatina.

[00235] Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional seja incompatível com o composto ativo, o uso do mesmo nas composições farmacêuticas no presente documento descritas é contemplado. Uma composição farmacêutica pode compreender um conservante ou pode ser desprovido de um conservante. Compostos ativos suplementares podem ser incorporados nas composições.

[00236] Composições terapêuticas tipicamente devem ser estéreis e estáveis sob as condições de fabricação e armazenamento. A composição pode ser formulada como solução, microemulsão, lipossoma ou outra estrutura ordenada adequada a alta concentração de fármaco. O transportador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido, e similares) e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como a lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. Em muitos casos, as composições podem incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser realizada incluindo na composição um agente que retarda a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.

[00237] Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando o composto ativo na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação dos ingredientes enumerados acima, como requerido, seguido por microfiltração por esterilização. Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando o composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos dentre aqueles enumerados no presente documento. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, alguns métodos de preparação são secagem a vácuo e secagem por congelamento (liofilização) que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução previamente filtrada estéril.

[00238] A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material transportador para produzir uma forma de dosagem única variará dependendo do indivíduo que está sendo tratado, e do modo particular de administração. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material transportador para produzir uma forma de dosagem única será geralmente a quantidade da composição que produz um efeito terapêutico. Geralmente, dos 100%, esta quantidade variará de cerca de 0,01% a cerca 99% de ingrediente ativo, de cerca de 0,1% a cerca de 70%, ou de cerca de 1% a cerca de 30% de ingrediente ativo em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.

[00239] Os regimes de dosagem são ajustados para fornecer a resposta desejada ideal (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, um bolus único pode ser administrado, diversas doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parenterais na forma de unidade de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A forma de unidade de dosagem como no presente documento utilizada refere- se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o transportador farmacêutico necessário. A especificação para as formas de unidade de dosagem no presente documento descritas são ditadas por, e diretamente dependentes de (a) as características únicas do composto ativo e o efeito terapêutico particular a ser alcançado, e (b) as limitações inerentes à técnica de composição de tal composto ativo para o tratamento da sensibilidade em indivíduos.

[00240] Para administração de um anticorpo anti-TREM-1, por exemplo, no presente documento descrita, a dosagem varia de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg, e mais usualmente 0,01 a 5 ou 10 mg/kg, do peso corporal do hospedeiro. Por exemplo, as dosagens podem ser de 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal ou 10 mg/kg de peso corporal ou dentro da faixa de 1 a 10 mg/kg. Um regime de tratamento exemplar envolve a administração uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada quatro semanas, uma vez por mês, uma vez a cada 3 meses ou uma vez a cada 3 a 6 meses. Os regimes de dosagem exemplificativos para um anticorpo anti-TREM-1 no presente documento incluem 1 mg/kg de peso corporal ou 3 mg/kg de peso corporal por via intravenosa de administração, com o anticorpo sendo dado usando um dos seguintes esquemas de dosagem: (i) a cada quatro semanas por seis dosagens, em seguida a cada três meses; (ii) a cada três semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal uma vez seguidos por 1 mg/kg de peso corporal a cada três semanas.

[00241] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TREM-1 é administrado em uma dose fixa (regime de dose fixa). Em outras modalidades, o anticorpo anti-TREM-1 é administrado em uma dose fixa com outro anticorpo. Em certas modalidades, o anticorpo anti- TREM-1 é administrado em uma dose com base no peso corporal.

[00242] Em alguns métodos, dois ou mais anticorpos monoclonais com especificidades de ligação diferentes são administrados simultaneamente, em cujo caso a dosagem de cada anticorpo administrado cai dentro dos intervalos indicados. Anticorpo é geralmente administrado em várias ocasiões. Intervalos entre dosagens únicas podem ser, por exemplo, semanalmente, mensalmente, a cada três meses ou anualmente. Intervalos podem também ser irregulares como indicado por medição de níveis sanguíneos de anticorpo para o antígeno alvo no paciente. Em alguns métodos, a dosagem é ajustada para alcançar uma concentração de anticorpo no plasma de cerca de 1 a 1000 μg/ml e em alguns métodos cerca de 25 a 300 μg/ml.

[00243] Um anticorpo pode ser administrado como uma formulação de liberação prolongada, em cujo caso a administração menos frequente é necessária. Dosagem e frequência variam dependendo da meia-vida do anticorpo no paciente. Em geral, anticorpos humanos mostram a meia-vida mais longa, seguidos por anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, e anticorpos não humanos. A dosagem e frequência de administração podem variar dependendo de se o tratamento é profilático ou terapêutico. Em aplicações profiláticas, uma dosagem relativamente baixa é administrada em intervalos relativamente infrequentes durante um longo período de tempo. Alguns pacientes continuam a receber tratamento para o resto de suas vidas. Em aplicações terapêuticas, uma dosagem relativamente alta em intervalos relativamente curtos é, às vezes necessária até a progressão da doença ser reduzida ou terminada, e até o paciente mostrar melhora completa ou parcial de sintomas da doença. Depois disso, ao paciente pode ser administrado um regime profilático.

[00244] Níveis de dosagem atuais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas descritas no presente documento podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja suficiente para alcançar a resposta terapêutica desejada para um paciente em particular, composição, e modo de administração, sem ser tóxica para o paciente. O nível de dosagem selecionado irá depender de uma variedade de fatores farmacocinéticos incluindo a atividade das composições particulares descritas no presente documento usadas, ou o éster, sal ou amida das mesmas, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto particular sendo usado, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições particulares usadas, a idade, sexo, peso, condição, saúde geral e histórico médico anterior do paciente sendo tratado, e fatores similares bem conhecidos nas técnicas médicas.

[00245] Uma composição descrita no presente documento pode ser administrada por meio de uma ou mais vias de administração usando uma ou mais de uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Como será apreciado pelo técnico versado, a via e/ou modo de administração irá variar dependendo dos resultados desejados. Vias de administração para os anticorpos anti-TREM-1 descritos no presente documento podem incluir via intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutânea, espinhal ou outras vias parenterais de administração, por exemplo, por injeção ou infusão. A frase "administração parenteral" como usada no presente documento significa outros modos de administração que não administração entérica e tópica, geralmente por injeção, e inclui, sem limitação, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intraespinhal, epidural e intraesternal.

[00246] Alternativamente, um anticorpo descrito no presente documento pode potencialmente ser administrado por meio de uma via não parenteral, tal como uma via tópica, epidérmica ou mucosa de administração, por exemplo, intranasalmente, oralmente, vaginalmente, retalmente, sublingualmente ou topicalmente.

[00247] Os compostos ativos podem ser preparados com veículos que irão proteger o composto contra liberação rápida, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, emplastros transdérmicos, e sistemas de liberação microencapsulada. Polímeros biodegradáveis, biocompatíveis podem ser usados, tais como acetato de etileno vinila, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, e ácido polilático. Muitos métodos para a preparação de tais formulações são patenteados ou geralmente conhecidos por aquele versado na técnica. Veja, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

[00248] Composições terapêuticas podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos na técnica. Por exemplo, em uma modalidade particular, uma composição terapêutica descrita no presente documento pode ser administrada com um dispositivo de injeção hipodérmica sem agulha, tal como os dispositivos descritos nas Patentes Norte-americanas Nos. 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; ou 4,596,556. Exemplos de implantes ou módulos bem conhecidos para uso com anticorpos anti- TREM-1 descritos no presente documento incluem: Patente Norte- americana No. 4,487,603, que divulga uma bomba de micro-infusão implantável para distribuição de medicação em uma taxa controlada; Patente Norte-americana No. 4,486,194, que divulga um dispositivo terapêutico para administrar medicamentos através da pele; Patente Norte-americana No. 4,447,233, que divulga uma bomba de infusão de medicação para liberação de medicação em uma taxa de infusão precisa; Patente Norte-americana No. 4,447,224, que divulga um aparato de infusão implantável de fluxo variável para liberação de fármaco contínua; Patente Norte-americana No. 4,439,196, que divulga um sistema de liberação de fármaco osmótico tendo compartimentos com múltiplas câmaras; e Patente Norte-americana No. 4,475,196, que divulga um sistema de liberação de fármaco osmótico. Estas patentes são incorporadas no presente documento por referência. Muitos outros tais implantes, sistemas de liberação, e módulos são conhecidos por aquele versado na técnica.

[00249] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-TREM-1 descritos no presente documento podem ser formulados para garantir distribuição apropriada in vivo. Por exemplo, a barreira hematoencefálica (BBB) exclui muitos compostos altamente hidrofílicos. Para garantir que os compostos terapêuticos descritos no presente documento cruzem a BBB (se desejado, por exemplo, para cânceres no cérebro), eles podem ser formulados, por exemplo, em lipossomas. Para métodos de fabricação de lipossomas, ver, por exemplo, Patentes Norte-Americanas 4,522,811; 5,374,548; e 5,399,331. Os lipossomas podem compreender uma ou mais porções que são seletivamente transportadas para células ou órgãos específicos, melhorando assim liberação de fármaco direcionada (ver, por exemplo, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Porções de direcionamento exemplares incluem folato ou biotina (ver, por exemplo, Patente Norte-americana No. 5,416,016 por Low et al.); manosídeos (Umezawaet al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun.153: 1038); anticorpos (P.G. Bloemanet al. (1995) FEBS Lett. 357: 140; M. Owaiset al. (1995) Antimicrob. AgentsChemother. 39: 180); receptor de proteína A de tensoativo (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134); pl20 (Schreieret al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); ver também K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346: 123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273.

VIII. Usos e Métodos

[00250] Os anticorpos anti-TREM-1 da presente invenção e as composições compreendendo tais anticorpos (por exemplo, composição farmacêutica, formulações, polinucleotídeos, vetores, e células) podem ser usados para o tratamento de uma doença inflamatória (por exemplo, inibindo atividade de TREM-1).

[00251] Consequentemente, em um aspecto, a presente invenção fornece métodos para tratamento de uma doença inflamatória em um indivíduo em necessidade do mesmo, compreendendo administrar uma dose terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-TREM-1 ao indivíduo. Exemplos de doenças inflamatórias que podem ser tratadas com os presentes anticorpos anti-TREM-1 incluem, porém não são limitados a, doença do intestino inflamatória (IBD), Doença de Crohn (CD), colite ulcerativa (UC), síndrome do intestino irritável, artrite reumatoide (RA), psoríase, artrite psoriática, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), nefrite nefrite lúpica, diabetes tipo I, Doença de Grave, esclerose múltipla (MS), miocardite autoimune, Doença Kawasaki, doença da artéria coronariana, doença pulmonar obstrutiva crônica, doença do pulmão intersticial, tireoidite autoimune, esclerodermia, esclerose sistêmica, osteoartrite, dermatite atópica, vitiligo, doença do enxerto versus hospedeiro, Síndrome de Sjogrens, nefrite autoimune, Síndrome de Goodpasture, polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica, alergia, asma e outras doenças autoimunes que são um resultado de inflamação aguda ou crônica.

[00252] Em uma modalidade, os anticorpos anti-TREM-1 são adequados para uso no tratamento de indivíduos com doença do intestino inflamatória. Doença do intestino inflamatória (IBD) é uma doença que pode afetar qualquer parte do trato gastrointestinal da boca ao ânus, causando uma ampla variedade de sintomas. IBD causa principalmente dor abdominal, diarréia (que pode sanguinolenta), vômito ou perda de peso, porém também pode causar complicações fora do trato gastrointestinal, tais como erupções cutâneas, artrite, inflamação do olho, fadiga e falta de concentração. Pacientes com IBD podem ser divididos em duas classes principais, aqueles com colite ulcerativa (UC) e aqueles com Doença de Crohn (CD). CD geralmente envolve o íleo e o cólon, ela pode afetar qualquer região do intestino, porém é frequentemente descontínua (áreas focalizadas de doença espalhadas por todo o intestino). UC sempre envolve o reto (colônica) e é mais contínua. Na CD, a inflamação é transmural, resultando em abscessos, fístulas e restrições, enquanto na UC, a inflamação está tipicamente confinada à mucosa. Não há cura farmacêutica ou cirúrgica conhecida para Doença de Crohn, enquanto alguns pacientes com UC podem ser curados por remoção cirúrgica do cólon. Opções de tratamento são restritas a controlar os sintomas, manter a remissão e prevenir recaídas. Eficácia em doença do intestino inflamatória na clínica pode ser medida como uma redução na pontuação de Índice de Atividade de Doença de Crohn (CDAI) para CD que é uma escala de pontuação com base em testes de laboratório e um questionário de qualidade de vida. Em modelos animais, eficácia é principalmente medida por aumento no peso e também um índice de atividade de doença (DAI), que é uma combinação de consistência e peso das fezes, e sangue nas fezes.

[00253] Em uma modalidade, os anticorpos anti-TREM-1 da presente invenção são adequados para uso no tratamento de indivíduos com artrite reumatoide. Artrite reumatoide (RA) é uma doença sistêmica que afeta quase se não todo o corpo e é uma das formas mais comuns de artrite. Ela é caracterizada por inflamação da articulação, que causa dor, rigidez, calor, vermelhidão e inchaço. Esta inflamação é uma consequência de células inflamatórias invadindo as articulações, e estas células inflamatórias liberam enzimas que podem digerir osso e cartilagem. Como resultado, esta inflamação pode levar a severos danos aos ossos e cartilagens e à deterioração das articulações e dores intensas, entre outros efeitos fisiológicos. A articulação envolvida pode perder sua forma e alinhamento, resultando em dor e perda de movimento. Existem vários modelos animais para artrite reumatoide conhecidos na técnica. Por exemplo, no modelo de artrite induzida por colágeno (CIA), os ratos desenvolvem uma artrite inflamatória que se assemelha à artrite reumatoide humana. Uma vez que CIA compartilha características imunológicas e patológicas similares com AR, isso a torna um modelo adequado para o rastreamento de compostos anti-inflamatórios humanos em potencial. Eficácia nesse modelo é medida por diminuição do inchaço nas articulações. Eficácia em RA na clínica é medida pela capacidade de reduzir sintomas em pacientes, que é medida como uma combinação de inchaço na articulação, taxa de sedimentação de eritrócitos, níveis de proteína C reativa e níveis de fatores séricos, tais como anticorpos anti-proteína citrulinada.

[00254] Em uma modalidade, os anticorpos anti-TREM-1 como descritos no presente documento são adequados para uso no tratamento de indivíduos com psoríase. Psoríase é um distúrbio inflamatório mediado por célula T da pele que pode causar desconforto considerável. Ela é uma doença para a qual atualmente não há cura e que afeta pessoas de todas as idades. Embora indivíduos com psoríase leve possam muitas vezes controlar sua doença com agentes tópicos, mais de um milhão de pacientes em todo o mundo necessitam de tratamentos com luz ultravioleta ou terapia imunossupressora sistêmica. Infelizmente, a inconveniência e riscos de radiação ultravioleta e as toxicidades de muitas terapias limitam seu uso a longo prazo. Além disso, pacientes geralmente tem recorrência de psoríase, e em alguns casos rebote logo após a interrupção da terapia imunossupressora. Um modelo recentemente desenvolvido de psoríase com base na transferência de células T CD4+ mimetiza muitos aspectos de psoríase humana e, portanto, pode ser usado para identificar compostos adequados para uso no tratamento de psoríase (Davenport et al., Internat. Immunopharmacol 2: 653-672, 2002). Eficácia neste modelo é medida pela redução em patologia de pele usando sistema de pontuação. Similarmente, eficácia em pacientes é medida por uma redução em patologia de pele.

[00255] Em uma modalidade, os anticorpos anti-TREM-1 são adequados para uso no tratamento de indivíduos com artrite psoriática. Artrite psoriática (PA) é um tipo de artrite inflamatória que ocorre em um subconjunto de pacientes com psoríase. Nestes pacientes, a patologia de pele/sintomas é acompanhados por um inchaço na articulação similar àquele visto em artrite reumatoide. Ela apresenta áreas desiguais, aumentadas e vermelhas de inflamação de pele com descamação. Psoríase frequentemente afeta as pontas dos cotovelos e joelhos, o couro cabeludo, o umbigo e ao redor das áreas genitais ou ânus. Aproximadamente 10% dos pacientes que tem psoríase também desenvolvem uma inflamação associada de suas articulações.

[00256] Nos termos da presente invenção, tratamentos profiláticos, paliativos, sintomáticos e/ou curativos podem representar aspectos separados da divulgação. Um anticorpo da invenção pode ser administrado parenteralmente, tal como intravenosamente, tal como intramuscularmente, tal como subcutaneamente. Alternativamente, um anticorpo da invenção pode ser administrado por meio de uma via não parenteral, tal como peroralmente ou topicamente. Um anticorpo da invenção pode ser administrado profilaticamente. Um anticorpo da invenção pode ser administrado terapeuticamente (sob demanda).

[00257] Os seguintes exemplos são oferecidos a título de ilustração e não como forma de limitação. Os conteúdos de todas as referências citadas ao longo deste pedido são expressamente incorporados no presente documento por referência.

EXEMPLOS Exemplo 1: Análise da Cinética de Interação para as Variantes de Anticorpo 318 para ambos, TREM-1 Humano e Cinomolgo por Ressonância de Plasma de Superfície

[00258] As cinéticas de ligação das variantes de mAb 0318 em relação a TREM-l-Fc humano (hTREM-1) e TREM-l-Fc cinomolgo (cTREM-1) foram determinadas. Estudos de ligação foram realizados em um Analisador ProteOn (BioRad) que mede interações moleculares em tempo real por meio de ressonância de plasma de superfície. Experimentos foram executados a 25°C e as amostras foram armazenadas a 15°C no compartimento de amostra. O sinal (RU, unidades de resposta) reportado pelo ProteOn está diretamente correlacionado com a massa nas superfícies de chip de sensor individual nas seis células de fluxo paralelo. O anticorpo monoclonal Fc anti-humano ou o anticorpo policlonal Fc anti-murino de kits de captura de Fc humano ou de camundongo Biacore foram imobilizados na direção horizontal em células de fluxo de um chip de sensor GLM de acordo com as instruções do fabricante. O nível de imobilização de anticorpo de captura foi aproximadamente 2600 a 6000 RU em cada experimento. A captura de anticorpos de camundongo monoclonais purificados ou anti-hTREM-1 recombinantemente expressos foi conduzida diluindo os anticorpos a 5 a 10 nM no tampão de execução (10 mM de Hepes 0,15 M de NaCI, 5 mM de EDTA, 0,05% de tensoativo P20, pH 7,4) seguido por injeção na direção vertical a 30 μl/min durante 60 seg, criando pontos intermediários de referência adjacentes a todas as células de fluxo com apenas anticorpo anti-Fc imobilizado. Isto tipicamente resultou em níveis de captura finais de anticorpos de teste de aproximadamente 100 a 300 RU e valores Rmax de analito de 30 a 90 RU. Ligação de proteínas hTREM-1 ou cTREM-1 foi conduzida injetando analito (antígeno) em todas as células de fluxo na direção horizontal para permitir análises comparativas de ligação a diferentes anticorpos anti-TREM-1 capturados em relação à ligação ao ponto intermediário de referência. Proteínas hTREM-1 ou cTREM-1 foram diluídas em série em 1: 3 a 1,2 a 100 nM ou em tampão de execução, injetadas a 100 μl/min durante 250 s e deixadas dissociar durante 600 s. A superfície de GLM foi regenerada após cada ciclo de injeção de analito por meio de duas injeções de 18 s de 10 mM de Glicina, pH 1,7 e 50 mM de NaOH a 100 μl/min. Esta etapa de regeneração removeu o anticorpo anti-TREM-1 e qualquer proteína TREM-1 ligada da superfície de anticorpo de captura imobilizada e permitiu a ligação subsequente do próximo par de amostra de interação. O procedimento de regeneração não removeu o anticorpo de captura anti-Fc diretamente imobilizado da superfície do chip.

[00259] Afinidade de ligação entre anticorpos e o antígeno foi quantificada pela determinação da constante de dissociação de equilíbrio (KD) determinada pela medição da cinética de formação e dissociação de complexo. As constantes de taxa correspondentes à associação e à dissociação de um complexo monovalente, tal como ka (taxa de associação) e kd (taxa de dissociação) foram recuperadas ajustando os dados ao modelo de Langmuir 1: 1 usando o software de avaliação ProteOn para análise de dados. KD está relacionado ao ka e kd através da equação KD = kd / ka.

[00260] Curvas de ligação foram processadas por dupla referência (subtração de sinais de superfície de referência bem como injeções de tampão em branco sobre anticorpos anti-TREM-1 capturados) antes da análise de dados. Isto permitiu correção de ruído do instrumento, mudança e movimentação de massa durante injeções de amostra.

[00261] Como mostrado na FIG. 1A e 1B, as variantes de mAb 0318 (isto é, 318-IgG1.1f, 318-IgG1.3f, 318-IgG4-Aba, e 318-IgG1- Aba) foram todas encontradas tendo afinidade similar em relação a TREM-l-Fc humano como mAb 0318-IgG4. A variante 0318-IgG1.3f também se liga a TREM-1 cinomolgo, embora com afinidade ligeiramente reduzida em comparação com TREM-1 humano. Ver FIG. 1A.

Exemplo 2: Análise de Internalização de mAb 0318-IgG1.3f após Ligação a Receptor de TREM-1

[00262] O anticorpo variante mAb 0318-IgG1.3f foi testado para sua internalização em monócitos humanos primários usando microscopia confocal de varredura a laser (dados não mostrados) e Análise de Citometria de Fluxo por Imageamento Amnis ImageStream®. Como mostrado na FIG. 2A, a 0 horas, TREM-1 é expresso principalmente na superfície dos monócitos. Entretanto, por 24 horas após ligação de anticorpo, uma percentagem significante (~36%) do receptor de TREM-1 (como evidenciado por manchamento de 0318-IgG1.3f) foi internalizada, sugerindo que após ligação de anticorpo mAb 0318- IgG1.3f, o complexo anticorpo-receptor inteiro é internalizado dentro da célula.

[00263] Em seguida, para determinar o destino do receptor de TREM-1 uma vez que ele foi internalizado, o anticorpo TREM26 (cat. No. 314902, Biolegend; Ver US20150274825 no parágrafo [0005]) foi usado para comparação. O anticorpo TREM26 não compete com as variantes de anticorpo 0318 descritas na presente invenção. Como mostrado na FIG. 2B, em comparação com 0 horas, houve uma redução significativa na expressão de TREM26+ (~51%) no ponto de tempo de 20 horas. Houve também uma redução significativa (4 vezes) em TREM26+ MFI (índice de fluorescência média) no ponto de tempo de 20 hora (após tratamento com mAb 0318-IgG1.3f), sugerindo que o receptor de TREM-1 foi degradado após internalização. Esta perda de expressão de receptor TREM-1 após exposição de anticorpo é reversível, no entanto, uma vez que o anticorpo é removido (dados não mostrados).

Exemplo 3: Análise das Variantes de mAb 0318 para Bloquear Eficientemente Ativação de TREM-1 Usando o Ensaio de Célula Repórter BWZ/hTREM-1

[00264] A capacidade das variantes de anti-TREM-1 mAb 0318 para inibir sinalização de TREM-1 humano foi determinada usando o ensaio de linhagem celular BWZ.36/hTREM-1DAP12:NFAT-LacZ (no presente documento também referida como "célula repórter BWZ/hTREM-1") como descrito em, por exemplo, Patente Norte- Americana No. 9,550,830 B2 e Publicação Internacional No. WO 2016/009086 A1. Resumidamente, aproximadamente 40,000 células hTREM-1/BWZ.36/cavidade foram colocadas em um fundo claro, placa preta de 96 cavidades na presença de 75 ng/ml de PGLYRP1 (SEQ ID NO: 8) com 2,5 μg/ml de PGN-ECndi (Cat. no. tlrl-kipgn, Invivogen San Diego, Calif., USA) para fornecer um sinal positivo submáximo, ou alternativamente na presença de um nível submáximo (1 μg/ml) de anticorpo monoclonal anti-TREM-1 absorvido em plástico (Cat. no. MAB1278, R&D Systems, Minneapolis, Minn., USA) para fornecer um sinal positivo.

[00265] As variantes de mAb 0318 (por exemplo, 0318-IgG1.3f; 0318-IgG1.1f; 0318-IgG1-Aba; e 0318-IgG4-Aba) foram titulados no ensaio começando em 10 μg/ml, com 5 diluições em série 2 vezes. O ensaio foi incubado durante a noite a 37°C, subsequentemente desenvolvido com Beta Glo (Cat. no. E4740, Promega Madison, Wis., USA), conforme o protocolo Beta Glo, e luminescência foi gravada. Dados foram traçados mostrando unidades luminescentes relativas a Beta Glo vs concentração de anticorpo de teste. mIgG1 de controle negativo não neutralizante (Cat. no. MAB002, R&D Systems Minneapolis, Minn., USA) e anticorpo anti hPGLYRP1 de cabra policlonal de controle positivo neutralizante (Cat. no. AF2590, R &D Systems, Minneapolis, Minn., USA) foram executados em cada placa de ensaio. O anticorpo MAB1278 (cat. no. MAB1278, R&D Systems; ver US20150274825 no parágrafo [0005]), um agonista conhecido da sinalização de TREM-1, foi também usado como um controle positivo (ver caixa inserida).

[00266] Como mostrado na FIG. 3, todas as variantes de mAb 0318 foram potentes na inibição de sinalização de TREM-1 humano como observado anteriormente com o anticorpo mAb 0318 IgG4 em Publicação Internacional No. WO 2016/009086 A1.

Exemplo 4: Análise in vitro da potência das variantes de anticorpo mAb 0318 na inibição da produção mediada por TREM-1 de citocinas inflamatórias por diferentes células humanas primárias

[00267] Para também avaliar as propriedades antagônicas das variantes de mAb 0318 anti-TREM-1, sua potência para bloquear a liberação de várias citocinas inflamatórias (por exemplo, TNF-α, IL-6, ou IL-8) de células primárias humanas ativadas foram avaliadas. Monócitos primários, neurotrófilos e células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isolados de sangue total humano e estimulados com PGRP1 ligado à placa e peptidoglicano solúvel (PGN-ECndss; uma forma de peptidoglicano sem a atividade de TLR2).

[00268] Como mostrado na FIG. 4, todas as variantes de mAb 0318 (isto é, IgG1.3f, IgG1.1f, IgG1-Aba, e IgG4-Aba) eram potentes (valores de IC50 na faixa de ~ 10 a 20 pM) na inibição da liberação mediada por TREM -1 de TNF-α de PBMC e monócitos. A potência dessas variantes do mAb 0318 foi semelhante à observada com o anticorpo mAb 0318-IgG4. O anticorpo mAb 0318-IgG1.3f também foi potente na inibição da produção de IL-6 (valor de IC50 de ~ 32 pM). Para neutrófilos, a variante de mAb 0318-IgG1.3f parecia ser melhor em comparação com o anticorpo mAb 0318-IgG4 no bloqueio da produção de IL-8 mediada por TREM-1 a partir de neutrófilos. (Veja a FIG. 4).

[00269] Como demonstração adicional das propriedades antagonistas das variantes do anticorpo mAb 0318 anti-TREM-1, um ensaio de co-cultura de monócitos-neutrófilos também foi usado. PGRP1 associado a neutrófilos, quando co-cultivado com monócitos, pode ligar receptores TREM-1, resultando na produção de TNF-α derivado de monócitos. Como mostrado na FIG. 4, todas as variantes do anticorpo mAb 0318 bloquearam efetivamente esta ativação endógena (valores de IC50 variando de 19 a 44 pM). Resultados semelhantes foram observados com sangue total sedimentado com RBC. (See FIG. 4).

Exemplo 5: Análise in vitro da potência de mAb 0318-IgG1.3f para bloquear a produção de IL-8 a partir de sangue total estimulado

[00270] Um dos principais desafios para o desenvolvimento de um ensaio de farmacodinâmica de sangue total (PD) para medir as propriedades antagonistas das variantes do anticorpo anti-TREM-1 é a alta base resultante da estimulação PGN. Para ajudar a resolver essa questão, o sangue total foi estimulado com PGRP1 + PGN pré- complexado na presença de inibidor de NOD2 (para bloquear citocinas de fundo produzidas por estimulação de NOD2 por PGN). Os níveis de IL-8 foram medidos usando o ensaio farmacodinâmico de ligação de ligante padrão (HTRF®) (FIG. 5A) ou um ensaio de manchamento de citocina intracelular (ICS) (FIG. 5B).

[00271] Como mostrado na FIGs. 5A e 5B, o anticorpo 0318-IgG1.3f bloqueou efetivamente a produção de IL-8 mediada por TREM-1 com inibição percentual variando de cerca de 60 a 90% (ver FIG. 5A). Os valores de IC50 observados (valor médio de 12 pM com HTRF e 19,6 pM com ICS) foram semelhantes aos observados com outros ensaios funcionais (por exemplo, ver Exemplo 4).

Exemplo 6: Análise in vitro da potência de mAb 0318-IgG1.3f para bloquear a expressão de mRNA de diferentes mediadores inflamatórios em sangue total estimulado

[00272] Para demonstrar adicionalmente as propriedades antagônicas do mAb 0318-IgG1.3f, os níveis de expressão de mediadores inflamatórios selecionados (isto é, proteína 1 tipo quitinase 3 ("CHI3L1"), IL1β, e IL6) foram medidos por PCR em tempo real (qPCR). Resumidamente, sangue total humano coletado em tubos de EDTA de três voluntários saudáveis normais (doador # 126, 290, e 322) foi estimulado com hPGRPI pré-complexado (50 μg/ml) e PGN- ECndss (10 μg/ml) (Invivogentlrl- ksspgn) durante a noite na presença de concentrações variáveis de mAb 0318-IgG1.3f (0 a 1 nM). Após a estimulação, o plasma foi removido e congelado para medições de citocinas. O mRNA foi isolado das amostras usando o MagMax-96 Blood Isolation Kit (ThermoFisherAM1837) de acordo com o protocolo do fabricante. O mRNA isolado foi então convertido em cDNA utilizando SuperScriptVILO Master Mix (Thermo Fisher 11755250). Em seguida, qPCR foi realizada usando as seguintes sondas: HPRT1 (Hs99999909_m1) (Thermo Fisher 4351370), CHI3L1 (Hs01072228_m1) (Thermo Fisher 4331182), IL1β (Hs00174097_m1) (Thermo Fisher 4331182), e IL6 (Hs00985639_m1) (Thermo Fisher 4331182) e TaqMan Fast Universal Master Mix (2x) (Thermo Fisher 4366072). Os valores de expressão gênica foram normalizados para HPRT1 e os valores de ΔΔCT foram gerados. Os resultados foram então plotados e os valores de IC50 foram determinados.

[00273] Como mostrado na FIGs. 6A-6C e de acordo com os exemplos anteriores, o mAb 0318-IgG1.3f foi capaz de inibir a expressão mediada por TREM-1 de diferentes mediadores inflamatórios em sangue total humano. A inibição parece ser dependente da dose. Os valores de IC50 são mostrados na Tabela 1 abaixo.

[00274] Coletivamente, os resultados acima demonstram que as variantes do anticorpo mAb 0318 descritas na presente invenção são antagônicas e podem bloquear efetivamente a produção de citocinas inflamatórias mediada por TREM-1 a partir de várias células humanas. Tabela 1.

Exemplo 7: Viscosidade das Variantes de mAb 0318

[00275] A amostra foi trocada por tampão e dialisada na formulação de escolha (histidina a 20 mM , sacarose a 150 mM, arginina a 25 mM, cloreto de sódio a 50 mM, pH 6,0), seguido por concentração usando filtros de corte de peso molecular centrífugo Amicon Ultra. O estado de agregação das amostras foi medido por cromatografia de exclusão de tamanho para controlar as mudanças potenciais na monomericidade após a concentração, que não foram observadas. A viscosidade dependente da concentração foi determinada usando um viscosímetro de solução RheoSense m-VROC usando uma varredura de cisalhamento ascendente de 3 pontos para cada concentração medida. A concentração foi determinada medindo a absorbância a 280 nm por nanoDrop usando séries de diluição e extrapolação.

[00276] Como mostrado na FIG. 7, ambas as variantes 318-IgG1.1f e 318-IgG1.3f tinham perfil de viscosidade semelhante em uma concentração de cerca de 130 mg/mL, a variante 0318-IgG1.3f apresentou um valor de viscosidade em torno de 9 cP. Tal perfil de viscosidade espelhava de perto o observado anteriormente com mAb 0318-IgG4 (ver publicação International No. WO 2016/009086).

Exemplo 8: Potencial de imunogenicidade das variantes de mAb 0318

[00277] Como mostrado na FIG. 8 e Tabela 2 (abaixo), as variantes 318-IgG1.1f e 318-IgG1.3f tinham risco baixo a médio de imunogenicidade em pacientes humanos. Apenas cerca de 22 a 30% do doador teve respostas imunogênicas (conforme medido pela proliferação de células T CD4 + in vitro) a esses anticorpos. A imunogenicidade para as variantes 0318-IgG1-Aba e 0318-IgG4-Aba foi de 10% e 42,5%, respectivamente. Consulte a Tabela 2 (abaixo). Em contraste, o mAb 0318-IgG4 foi muito mais imunogênico (55%) em pacientes humanos. KLH (hemocinina lapa de buraco de fechadura) e VL6 (IL-21RmAb), que foram usados como controles positivos, foram altamente imunogênicos em pacientes humanos (100% e 40%, respectivamente).Tabela 2.

Exemplo 9: Análise de ligação das variantes de mAb 0318 a FcRn usando ressonância de plasma de superfície (SPR)

[00278] Para determinar se as diferentes variantes de mAb 0318 eram capazes de se ligar a FcRn, os receptores FcRn (camundongo, humano, e cyno) foram imobilizados em um chip biossensor BIAcoreCM5 (GE Healthcare Bioscience, Uppsala, Suécia) por meio de acoplamento de amina a um nível de 400 Unidades de Resposta (RU). O ensaio foi realizado à temperatura ambiente com PBS, 0,05% Tween-20™ pH 6,0 (GE Healthcare Bioscience) como tampão de corrida e de diluição. As diferentes variantes do mAb 0318 (200 nM) foram injetadas a uma taxa de fluxo de 50 μL/min em temperatura ambiente em pH 6,0. O tempo de associação foi de 180 segundos, a fase de dissociação (também em pH 6,0) levou 360 segundos. A regeneração da superfície do chip de volta à linha de base foi alcançada por uma injeção curta de Tris a 50 mM, pH 8,0 e NaCl a 150 mM. A avaliação dos dados de SPR foi realizada por comparação da altura do sinal de resposta biológica em 180 segundos após a injeção e 300 segundos após a injeção. Os parâmetros correspondentes são o nível máximo de RU (180 segundos após a injeção) e a estabilidade tardia (300 segundos após o final da injeção).

[00279] Como mostrado na FIGs. 9A e 9B, as variantes do anticorpo mAb 0318 (IgG1-Aba mod, IgG4-Aba mod, IgG1.1f, e IgG1.3f) foram todas capazes de se ligar a humanos, camundongos e cyno FcRn de uma maneira dependente do pH. Isso também foi verdadeiro para o anticorpo mAb 0318 (IgG4).

Exemplo 10: Análise de ligação das variantes de mAb 0318 a um ou mais FCYRS

[00280] Como discutido anteriormente, a administração in vivo de anticorpos a certos receptores imunes da superfície celular tem o potencial de induzir a liberação de citocinas, que pode resultar na indução de uma complicação clínica comum e tóxica conhecida como síndrome de liberação de citocinas (RSC). Devido à preocupação de que o envolvimento de FCYR poderia levar a potencial atividade agonística de TREM-1 por meio de reticulação, mAb 0318-IgG4 foi reprojetado em um dos formatos variantes descritos na presente invenção (isto é, IgG1.1f, IgG1. 3f, IgG1-Aba, ou IgG4-Aba). Então, a capacidade das variantes do anticorpo 0318 para se ligarem a diferentes FcyRs foi avaliada.

[00281] Como mostrado na FIGs. 10A e 10B, as variantes 318- IgG1.1f e 318-IgG1.3f tinham ligação mínima a todos os FcyRs (isto é, FcyRI (CD64), FcyRIIA (variantes CD32a-H131 e CD32a-R131), FcyRIIB (CD32b), FcyRIIIA (CD16a-V158 variant), e FcyRIIIB (variante CD16b-NA2)). As variantes 318-IgG1-Aba e 318-IgG4-Aba não se ligaram a FcyRIIA, FcyRIIB, FcyRIIIA, e FcyRIIIB, mas se ligaram a FcyRI. Em contraste, o mAb 0318 (IgG4) mostrou ligação significativa a todos os FcyRs.

Exemplo 11: Análise da indução de citocinas inflamatórias pelas variantes do mAb 0318

[00282] Para determinar se o tratamento in vivo com as variantes do mAb 0318 apresenta risco de síndrome de liberação de citocinas, o sangue total foi coletado de 8 doadores humanos e os monócitos foram isolados. Em seguida, os monócitos foram diferenciados em células dendríticas imaturas plaqueando os monócitos (4x106 células/poço) e cultivando-os em um meio de diferenciação contendo IL-4 e GM-CSF (100 ng / mL). Por volta dos dias 2 a 3 pós- plaqueamento, aproximadamente metade do meio de diferenciação foi substituído por meio fresco. No dia 7, as células foram colhidas e a eficiência de diferenciação foi avaliada por meio da análise da expressão de CD14 nas células usando citômetro de fluxo. A seguir, as células dendríticas imaturas foram semeadas em uma placa de fundo plano (0,8x105 células/ poço) e as variantes de mAb 0318 foram adicionadas aos respectivos poços (com ou sem CHO-CD32a). Células dendríticas imaturas estimuladas com PGRP + PGN foram usadas como controle positivo. As células foram então incubadas durante a noite a 37 °C. No dia seguinte, os sobrenadantes foram colhidos dos poços e a quantidade de TNF-α, IL-6, e IL-12 produzida foi avaliada usando um ensaio ELISA.

[00283] Os resultados de doadores representativos são mostrados nas FIGs. 11A a 11I. A adição das diferentes variantes de mAb 0318 (0318-IgG1.1f, 0318-IgG1.3f, e 0318-IgG1,1 Aba) resultou em IL-6 mínimo (FIGs. 11A, 11B, e 11C), TNF-α (FIGs. 11D, 11E, e 11F), e produção de IL-12 (FIGs. 11G, 11H, e 11I) pelas células dendríticas imaturas. Estes resultados, juntamente com aqueles do Exemplo 9, demonstram que os anticorpos anti-TREM-1 no presente documento descritos têm um baixo risco de induzir uma síndrome de liberação de citocina quando administrados a pacientes in vivo.

Exemplo 12: Características adicionais das variantes mAb 0318

[00284] As características biofísicas da variante 0318-IgG1.3f são fornecidas na Tabela 3 (abaixo). Tabela 3. Características biofísicas do anticorpo anti-TREM-1 0318-IgG1.3f

[00285] As propriedades biofísicas da variante mAb 0318-IgG1.3f são favoráveis para o desenvolvimento clínico. A identidade do anticorpo foi confirmada por análise de espectrometria de massa (Análise de massa intacta & Mapeamento de Peptídeos). O anticorpo era> 96% monomérico conforme testado por cromatografia de exclusão de tamanho. Um único local de N-glicosilação foi confirmado em N301 em um perfil de glicano de cadeia pesada com um correspondente ao perfil de glicano de anticorpos monoclonais expressos em CHO (G0F, G1F, e G2F). A estabilidade térmica (Tm1 = 66,2 ° C; Tm2 = 78,4 ° C; Tm3 = 83,2 ° C) e a reversibilidade térmica (24% a 77 °C) do mAb 0318-IgG1.3f estava dentro da faixa de um anticorpo monoclonal IgG1,3 humano típico.

[00286] As características de estabilidade da variante mAb 0318- IgG1.3f são fornecidas na Tabela 4 (abaixo).Tabela 4. Estabilidade do anticorpo anti-TREM-1 0318-IgG1.3f

[00287] Nenhum problema de estabilidade física foi observado durante o estresse de congelamento-descongelamento (3 ciclos) a 150 mg/mL na formulação descrita (histidina a 20 mM, sacarose a 150 mM, cloreto de sódio a 50 mM, arginina a 25 mM, pH 6,0). Os estudos de degradação forçada na formulação estudada a 150 mg/mL foram configurados a 4, 25, e 40 °C (até 3 meses). As modificações químicas de CDR permaneceram baixas em todas as condições de temperatura e não afetaram a atividade, conforme determinado pelo SPR. A desamidação de VSNK ficou abaixo das expectativas em comparação com outros anticorpos monoclonais na estrutura IgG1.3f (aumento de 3%/mês a 40 °C de armazenamento), as alterações foram dependentes do tempo e da temperatura. Todas as outras modificações químicas (oxidação, desamidação, isomerização) também permaneceram baixas como monitoradas durante os estudos de estabilidade. Digno de nota, o armazenamento a 40 °C indica uma formação de variantes HMW e LMW (demonstrando 1,2%/mês e 2,4%/mês, respectivamente). As mudanças observadas dependeram do tempo e da temperatura, de modo que o HMW aumentou 0,25%/mês, o qual o LMW permaneceu inalterado sob armazenamento de 4 °C durante o período de estudo. A baixa formação LMW sob armazenamento de 40 °C foi caracterizada por 2D- LC/MS com medições de massa precisas de alta resolução como a espécie cumulativa de 1 perda de Fab, bem como o braço de Fab, putativamente em uma sequência conservada na região de articulação superior.

Exemplo 13: Estudo PK/TK /PD para a variante de mAb 0318- IgG1.3f em macacos Cynomolgus

[00288] Um estudo de farmacocinética (PK), toxicocinética (TK) e farmacodinâmica (PD) de dose única foi conduzido em macacos Cynomolgus para o anticorpo 0318-IgG1.3f anti-TREM-1. Alguns dos animais receberam 2 mg/kg do anticorpo 0318-IgG1.3f por via intravenosa (n=3). Outros animais receberam uma das seguintes doses do anticorpo 0318-IgG1.3f por via subcutânea: (i) 0 mg/kg (isto é, controle) (n=4), (ii) 0,1 mg/ kg (n = 4), (iii) 0,5 mg/kg (n=4), (iv) 2 mg/kg (n=3), ou (v) 10 mg/kg (n=4). Após a administração do anticorpo, a farmacocinética, os anticorpos anti-fármacos (ADA), a ocupação do receptor TREM-1 (RO) e as respostas de farmacodinâmica ex vivo foram examinadas em pontos de tempo pré- determinados.

Farmacocinética (PK)

[00289] Para avaliar a farmacocinética, as concentrações séricas do anticorpo 0318-IgG1.3f foram avaliadas nos animais com um ensaio de ligação ao ligante usando uma proteína TREM-1 recombinante biotinilada como o reagente de captura e um anticorpo policlonal de cabra anti-TREM-1 comercial como reagente de detecção.

[00290] Como mostrado na FIG. 12, a farmacocinética do anticorpo 0318-IgG1.3f foi determinada como não linear entre 0,1 e 10 mg/kg, predominantemente devido à depuração mediada pelo alvo (isto é, internalização e degradação do anticorpo após ligação ao receptor TREM-1; ver o Exemplo 2).

[00291] Os parâmetros farmacocinéticos baseados em análise não compartimental são apresentados nas Tabelas 5 (administração intravenosa) e 6 (administração subcutânea). Resumidamente, um aumento de 100 vezes na dose resultou em um aumento de 830 vezes nas exposições séricas (AUCs). Consulte a Tabela 6. A depuração após a dose IV de 2 mg/kg foi de 0,1 ± 0,02 mL/h/kg e semelhante a outros mAbs baseados em IgG1 em macacos. Consulte a Tabela 4. O Vss a 36 ± 5 mL/kg foi semelhante ao volume do plasma, indicando distribuição extravascular limitada. A meia-vida do anticorpo 0318-IgG1.3f aumentou de 2 dias para a dose de 0,1 mg/kg para 10 dias com 2 e 10 mg/kg (administração de dose única subcutânea). Consulte a Tabela 6. A biodisponibilidade do anticorpo 0318-IgG1.3f após a administração subcutânea (2 mg/kg) foi alta em 84%. Tabela 5. Parâmetros de PK de mAb 0318-IgG1.3f em Macaco* Número de macacos examinados que mostraram ADA persistente.Tabela 6. Parâmetros PK de mAb 0318-IgG1.3f em macacos* Número de macacos examinados que mostraram ADA persistente.

Anticorpos Antifármacos (ADA)

[00292] Embora o ADA sérico tenha sido detectado na maioria dos macacos (16 de 18) após a dose única (independentemente da via de administração), a exposição do anticorpo 0318-IgG1.3f e a ocupação do receptor TREM-1 (RO) não foi comprometida na maioria dos animais de ADA positivos. Ver Tabelas 4 e 5. O declínio acelerado na exposição terminal do anticorpo 0318-IgG1.3f que foi acompanhado com a formação de ADA foi observado apenas em dois macacos (um em 0,1 mg/kg de grupo de dose no dia 7 e um em 0,5 mg/kg dose- grupo no dia 21). Uma vez que o ADA afetou a exposição nestes dois macacos na fase terminal, os pontos de dados correspondentes foram eliminados para análise de PK.

Ocupação do receptor TREM-1 (RO) e níveis totais do receptor TREM-1

[00293] Em seguida, foi avaliada a ocupação dos receptores TREM- 1 expressos nos monócitos e granulócitos do sangue periférico. Como mostrado nas FIGs. 15A e 15B, para todas as doses testadas, a percentagem de receptores TREM-1 ocupados (isto é, ligados ao anticorpo anti-TREM-1) foi semelhante entre os monócitos e os granulócitos. Além disso, a duração da ocupação do receptor parecia ser dependente da dose do anticorpo 0318-IgG1.3f administrado aos animais. Com 0,5 mg/kg, houve > 85% RO observada por até 2 semanas após a administração do anticorpo. Em contraste, com 2 e 10 mg/kg, > 85% dos receptores TREM-1 permaneceram ocupados por pelo menos 1 mês após a administração.

[00294] Após a dosagem do anticorpo 0318-IgG1.3f, os níveis totais do receptor TREM-1 foram reduzidos em monócitos e granulócitos. Ver FIGs. 14A e 14B. Conforme discutido anteriormente, esta redução é presumivelmente devido ao aumento da renovação do receptor após a ligação do anticorpo. A diminuição da expressão do receptor TREM-1 de superfície foi reversível e a duração da perda do receptor de superfície foi correlacionada com a duração da ocupação do receptor pelo menos nas doses examinadas.

[00295] Os níveis de TREM-1 solúvel (sTREM-1) pareceram aumentar 10 a 50 vezes após a dose única da variante mAb 0318 mAb-IgG1.3f em todos os grupos de dose testados. (Dados não mostrados). Não está claro se o aumento nos níveis de sTREM-1 estava relacionado à administração do anticorpo anti-TREM-1 ou ao manejo geral dos animais durante o curso do estudo. Em qualquer caso, uma vez que as concentrações do fármaco excederam em muito (> 1000 vezes) os níveis de sTREM-1, o alvo solúvel não deve efetuar a ligação da variante mAb 0318 mAb-IgG1.3f à superfície celular TREM-1.

Exemplo 14: Estudo PK/TK/PD para a variante mAb 0318-IgG1.3f em macacos Cynomolgus, descrita por um modelo PK de 2 compartimentos com TMDD em compartimento central

[00296] Os dados de PK, RO, níveis de receptor total e PD de macaco foram descritos usando um modelo de PK de 2 compartimentos com disposição de fármaco mediada por alvo saturável (TMDD) no compartimento central para acomodar a PK não linear observada (ver Exemplo 12 e FIG. 13). Um modelo inibitório de efeito direto foi usado para descrever a resposta de PD. Este modelo foi capaz de capturar efetivamente o curso de tempo de PK/RO/PD observado nos macacos. Os pontos finais observados (círculo aberto) e previstos pelo modelo (linha sólida) são fornecidos nas FIGs. 16A (dosagem subcutânea de 0,1 mg/kg) e 16B (dosagem subcutânea de 10 mg/kg). A Tabela 7 fornece os parâmetros PK/PD estimados. Quando as exposições ao soro da variante mAb 0318- IgG1.3f e os dados de RO de TREM-1 foram reunidos de todos os macacos, foi observado um aumento dependente da concentração em RO. Ver FIGs. 16A e 16B. Um modelo Emax usado para descrever a relação concentração-RO, estimada in vivo RO EC50 em 1,6 ± 0,2 nM.Tabela 7. Estimativas de parâmetros do modelo PK/PD usado para descrever dados de Macaco PK/TK/PD e estimativas de parâmetros humanos projetadosTabela 8.

[00297] Este pedido PCT reivindica o benefício de prioridade do Pedido Provisional Norte-americano No. 62/651.605, depositado em 2 de abril de 2018, que é no presente documento incorporado por referência em sua íntegra.

Claims (25)

1. Cadeia pesada caracterizada por compreender SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 ou SEQ ID NO: 85.

2. Cadeia pesada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender a SEQ ID NO: 50.

3. Cadeia pesada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender a SEQ ID NO: 85.

4. Anticorpo isolado que se liga especificamente a TREM-1, caracterizado por compreender uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende a SEQ ID NO: 85 e em que a cadeia leve compreende a SEQ ID NO: 54.

5. Anticorpo isolado que se liga especificamente a TREM-1, caracterizado por compreender uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende a SEQ ID NO: 50 e em que a cadeia leve compreende a SEQ ID NO: 54.

6. Anticorpo isolado que se liga especificamente a TREM-1, caracterizado por compreender uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende a SEQ ID NO: 51 e em que a cadeia leve compreende a SEQ ID NO: 54.

7. Anticorpo isolado que se liga especificamente a TREM-1, caracterizado por compreender uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende a SEQ ID NO: 52 e em que a cadeia leve compreende a SEQ ID NO: 54.

8. Anticorpo isolado que se liga especificamente a TREM-1, caracterizado por compreender CDR1, CDR2, CDR3 de uma cadeia pesada; CDR1, CDR2, CDR3 de uma cadeia leve; e uma região constante de cadeia pesada de IgG1,em que os CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada compreende TYAMH (SEQ ID NO: 24), RIRTKSSNYATYYAASVKG (SEQ ID NO: 25) e DMGIRRQFAY (SEQ ID NO: 26), respectivamente; em que os CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve compreende RASQSVDTFDYSFLH (SEQ ID NO: 27), RASNLES (SEQ ID NO: 28) e QQSNQDPYT (SEQ ID NO: 29), respectivamente;em que a região constante de cadeia pesada de IgG1 compreende três ou mais substituições de aminoácidos compreendendo L234A, L235E e G237A, por numeração EU e em que a cadeia pesada não possui uma lisina C-terminal.

9. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL), em que a VH compreende a SEQ ID NO: 14 e a VL compreende a SEQ ID NO: 15.

10. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende a SEQ ID NO: 85 e em que a cadeia leve compreende a SEQ ID NO: 54.

11. Anticorpo isolado que se liga especificamente a TREM- 1, caracterizado por compreender CDR1, CDR2, CDR3 de uma cadeia pesada; CDR1, CDR2, CDR3 de uma cadeia leve; e uma região constante de cadeia pesada de IgG1, em que os CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada compreende TYAMH (SEQ ID NO: 24), RIRTKSSNYATYYAASVKG (SEQ ID NO: 25) e DMGIRRQFAY (SEQ ID NO: 26), respectivamente; em que os CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve compreende RASQSVDTFDYSFLH (SEQ ID NO: 27), RASNLES (SEQ ID NO: 28) e QQSNQDPYT (SEQ ID NO: 29), respectivamente; em que a região constante de cadeia pesada de IgG1 compreende três ou mais substituições de aminoácidos compreendendo L234A, L235E e G237A, por numeração EU, ou em que a região constante de cadeia pesada de IgG1 compreende três ou mais substituições de aminoácidos e uma ou mais deleções de aminoácidos, em que as substituições compreendem L234A, L235E e G237A, por numeração EU.

12. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL), em que a VH compreende a SEQ ID NO: 14 e a VL compreende a SEQ ID NO: 15.

13. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por compreender uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 ou SEQ ID NO: 85; e em que a cadeia leve compreende a SEQ ID NO: 54.

14. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a região constante da cadeia pesada de IgG1 tem três substituições, em que as substituições são L234A, L235E e G237A, por numeração EU.

15. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a região constante de cadeia pesada de IgG1 tem três substituições, em que as substituições são L234A, L235E e G237A, por numeração EU, e um resíduo de lisina C-terminal da região constante de cadeia pesada de IgG1 é presente.

16. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a região constante de cadeia pesada de IgG1 tem três substituições, em que as substituições são L234A, L235E e G237A, por numeração EU, e em que a cadeia pesada não possui um resíduo de lisina C-terminal.

17. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por compreender uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende a SEQ ID NO: 85 e em que a cadeia leve compreende a SEQ ID NO: 54.

18. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por compreender uma cadeia pesada, em que a cadeia pesada não possui um resíduo de lisina C-terminal.

19. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a região constante da cadeia pesada de IgG1 tem três substituições, em que as substituições são L234A, L235E e G237A, por numeração EU.

20. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a região constante de cadeia pesada de IgG1 tem três substituições, em que as substituições são L234A, L235E e G237A, por numeração EU, e um resíduo de lisina C-terminal da região constante de cadeia pesada de IgG1 é presente.

21. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a região constante de cadeia pesada de IgG1 tem três substituições, em que as substituições são L234A, L235E e G237A, por numeração EU, e em que a cadeia pesada não possui um resíduo de lisina C-terminal.

22. Molécula biespecífica caracterizada pelo fato de compreende o anticorpo como definido na reivindicação 11ligado a uma molécula tendo uma segunda especificidade de ligação.

23. Imunoconjugado caracterizado pelo fato de que compreende anticorpo como definido na reivindicação 11, ligado a um agente.

24. Composição caracterizada pelo fato de que compreende anticorpo como definido na reivindicação 11, e um veículo.

25. Kit caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo como definido na reivindicação 11, e uma instrução para uso.