JP6778235B2 - 昆虫抵抗性および除草剤耐性ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１ - Google Patents

昆虫抵抗性および除草剤耐性ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１ Download PDF

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Description

優先権の主張：本開示は、２０１２年６月２５日出願の米国特許仮出願第６１／６６３
，７００号の優先権を主張するものである。その中の情報は完全に組み込まれる。
Ｃｒｙ１ＦおよびＣｒｙ１Ａｃ ｓｙｎｐｒｏ（Ｃｒｙ１Ａｃ）をコードする遺伝子は
、昆虫抵抗性、例えば、鱗翅目の昆虫に対する抵抗性をトランスジェニック植物に付与す
ることができ、ＰＡＴ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）をコードする
遺伝子は、除草剤ホスフィノトリシン（グルホシネート）に対する耐性をトランスジェニ
ック植物に付与することができる。ＰＡＴは、昆虫抵抗性トランスジェニック作物の作出
における選択マーカーとして、および除草剤グルホシネートに対する商業的なレベルの耐
性をトランスジェニック植物に付与するための両方に使用するために、ダイズにおいて首
尾よく発現されている。
植物における導入遺伝子の発現は、おそらくクロマチン構造（例えば、ヘテロクロマチ
ン）のため、または組み込み部位に近い転写調節エレメント（例えば、エンハンサー）の
近傍にあることに起因して、植物ゲノムにおけるそれらの位置の影響を受けることが公知
である（Weisingら、Ann. Rev. Genet 22巻：421〜477頁、1988年）。同時に、ゲノム内
の異なる位置に導入遺伝子が存在することが、植物の全体的な表現型に違ったふうに影響
を及ぼす。この理由のために、多くの場合、対象の導入された遺伝子の最適な発現を特徴
とする特定の導入遺伝子イベントを同定するためには、多数の導入遺伝子イベントをスク
リーニングすることが必要である。例えば、植物および他の生物体において、イベント間
で導入された遺伝子の発現のレベルが広範に変動する可能性があることが観察された。発
現の空間パターンまたは時間パターンにも差があることがある。例えば、種々の植物組織
における導入遺伝子の相対的な発現量の差は、導入される遺伝子構築物中に存在する転写
調節エレメントから予測されるパターンに対応しない可能性がある。このために、何百か
ら何千もの異なるイベントを作出し、それらのイベントを、導入遺伝子の所望の発現レベ
ルおよび発現パターンを有する単一のイベントについて商業目的のためにスクリーニング
することが一般的である。導入遺伝子の発現の所望のレベルまたはパターンを有するイベ
ントは、従来の育種方法を使用して、有性異系交雑によって導入遺伝子を他の遺伝的背景
に遺伝子移入するために有用である。そのような交雑の後代は、元の形質転換体の導入遺
伝子の発現特性を維持する。この戦略を使用して、その土地の生長条件によく適合する多
数の品種における信頼性の高い遺伝子発現を確実にする。
有***雑の後代が対象の導入遺伝子または導入遺伝子の群を含有するかどうかを決定す
るために、特定のイベントの存在を検出することができることが望ましい。さらに、特定
のイベントを検出するための方法は、例えば、組換え作物に由来する食物の市販前承認お
よび表示を必要とする規制に合致するため、または、環境のモニタリング、圃場内の作物
の形質のモニタリング、または作物収穫で得られる生産物のモニタリングにおいて使用す
るため、ならびに、規制条項および契約条項に従う関係者のコンプライアンスを確実にす
ることにおいて使用するために役立つ。
トランスジェニックイベントの存在は、これらに限定されないが、核酸プローブを使用
したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはＤＮＡのハイブリダイゼーションを含めた当
技術分野で公知の任意の核酸検出方法によって検出することが可能である。これらの検出
方法では、一般に、多くのＤＮＡ構築物に関して、コード領域を交換することができるの
で、プロモーター、ターミネーター、マーカー遺伝子などの遺伝エレメントを使用するこ
とに焦点を合わせることも多い。結果として、そのような方法は、挿入された異種ＤＮＡ
に近接する隣接ＤＮＡのＤＮＡ配列が既知でなければ、異なるイベント、特に、同じＤＮ
Ａ構築物または非常に類似した構築物を使用して作出されたイベント間を識別するために
は有用でない可能性がある。例えば、イベント特異的なＰＣＲアッセイは、トウモロコシ
イベントＤＡＳ−５９１２２−７について米国特許出願第２００６／００７０１３９号に
記載されている。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を同定するための
単純かつ識別力のある方法を有することが望ましい。
本開示の実施形態は、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１と称されダ
イズの細胞のゲノム内の特定の部位に挿入されている、本明細書に記載のｃｒｙ１Ｆｖ３
（ｃｒｙ１Ｆ）、ｃｒｙ１Ａｃ ｓｙｎｐｒｏ（ｃｒｙ１Ａｃ）およびｐａｔ ｖ６（ｐ
ａｔ）を含む、新しい昆虫抵抗性かつ除草剤耐性のトランスジェニックダイズ形質転換イ
ベントに関する。代表的なダイズ種子は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に、パラグラフ［００３３］において識別される受
託番号で寄託されている。このイベントを含有するダイズ植物のＤＮＡは、ダイズゲノム
内の挿入ＤＮＡの位置を特徴付ける本明細書に記載の接合部／隣接配列を含む。配列番号
１および配列番号２は、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１に特徴的で
ある。より詳細には、配列番号１のｂｐ１２７３／１２７４、配列番号２のｂｐ１７５／
１７６および３１６／３１７、にある接合部を取り囲む配列が、ダイズイベントｐＤＡＢ
９５８２．８１６．１５．１に特徴的である。下のパラグラフ［００１２］には、ダイズ
イベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含有するダイズのＤＮＡの特性であるこ
れらの接合部を含む配列の例が記載されている。
一実施形態では、本開示は、シュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia inclu
dens）（ダイズシャクトリムシ）に対して抵抗性であり、配列番号１のｂｐ１２５８〜１
２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；
配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２の
ｂｐ１２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択される１
つまたは複数の配列、ならびにその相補物を含むゲノムを有するダイズ植物またはその部
位を提供する。別の実施形態では、本開示は、そのような植物の種子を提供する。
別の実施形態では、本開示は、昆虫を昆虫抵抗性ダイズ植物に曝露させて、それにより
昆虫を防除するステップを含む、昆虫を防除する方法であって、ダイズ植物がダイズイベ
ントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１が存在することの特徴である配列番号１のｂｐ
１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３
〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；
配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群から
選択される１つまたは複数の配列；ならびにその相補物を含有するゲノムを有する方法を
提供する。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１にｃｒｙ１Ｆ ｖ３（ｃ
ｒｙ１Ｆ）遺伝子およびｃｒｙ１Ａｃ ｓｙｎｐｒｏ（ｃｒｙ１Ａｃ）遺伝子が存在する
ことにより、例えば、シュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）（
ダイズシャクトリムシ）、アンチカルシア・ゲムマタリス（Anticarsia gemmatalis）（
ハッショウマメイモムシ（velvetbean caterpillar））、エピノチア・アポレマ（Epinot
ia aporema）、オモイデス・インジカタス（Omoides indicatus）、ラチプルシア・ヌ（R
achiplusia nu）、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）、スポドプテ
ラ・コスモイデス（Spodoptera cosmoides）、スポドプテラ・エリダニア（Spodoptera e
ridania）、ヘリオチス・ビレセンス（Heliothis virescens）、ヘリコベルパ・ゼア（He
liocoverpa zea）、スピロソーマ・ビルギニカ（Spilosoma virginica）およびエラスモ
パルパス・リグノセルス（Elasmopalpus lignosellus）に対する抵抗性が付与される。
別の実施形態では、本開示は、ダイズ作物において雑草を防除する方法であって、グル
ホシネート除草剤をダイズ作物に施用するステップを含み、前記ダイズ作物が、配列番号
１のｂｐ１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ
１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜
１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５からな
る群から選択される１つまたは複数の配列；ならびにその相補物を含有するゲノムを有す
るダイズ植物を含み、これらの配列が、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５
．１の存在に特徴的である、方法を提供する。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６
．１５．１にｐａｔ遺伝子が存在することにより、グルホシネート除草剤に対する耐性が
付与される。
別の実施形態では、本開示は、ダイズＤＮＡを含む試料においてダイズイベントｐＤＡ
Ｂ９５８２．８１６．１５．１を検出する方法であって、
（ａ）前記試料を、配列番号１のｂｐ１〜１２７３内の隣接配列またはその相補物に選択
的に結合する、長さが少なくとも１０ｂｐである第１のプライマー、および配列番号１の
ｂｐ１２７４〜１５７７内の挿入断片配列またはその相補物に選択的に結合する、長さが
少なくとも１０ｂｐである第２のプライマーと接触させ、前記プライマー間に生成したア
ンプリコンについてアッセイするステップ、または
（ｂ）前記試料を、配列番号２のｂｐ１〜１７５内の挿入断片配列またはその相補物に選
択的に結合する、長さが少なくとも１０ｂｐである第１のプライマー、および配列番号２
のｂｐ１７６〜１６８７内の隣接配列またはその相補物に選択的に結合する、長さが少な
くとも１０ｂｐである第２のプライマーと接触させるステップ、および
（ｃ）前記プライマー間に生成したアンプリコンについてアッセイするステップ
を含む方法を提供する。
別の実施形態では、本開示は、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を
検出する方法であって、
（ａ）前記試料を、配列番号１のｂｐ１〜１２７３および配列番号２のｂｐ１７６〜１６
８７からなる群から選択される隣接配列およびその相補物に選択的に結合する第１のプラ
イマー；ならびに配列番号３、またはその相補物に選択的に結合する第２のプライマー；
と接触させるステップと、
（ｂ）前記試料をポリメラーゼ連鎖反応に供するステップと、
（ｃ）前記プライマー間に生成したアンプリコンについてアッセイするステップと
を含む方法を提供する。
別の実施形態では、本開示は、ダイズ植物を育種する方法であって、第１の植物と第２
のダイズ植物を交雑させて第３のダイズ植物を作出するステップであり、前記第１の植物
が配列番号１のｂｐ１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番
号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂ
ｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２
７５からなる群から選択される１つまたは複数の配列；ならびにその相補物を含むＤＮＡ
を含む、ステップと、前記第３のダイズ植物を、配列番号１のｂｐ１２５８〜１２８８；
配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号
１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２
５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５およびその相補物を含むＤＮＡの存在
についてアッセイするステップとを含む方法を提供する。
別の実施形態では、本開示は、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１に
特徴的である、単離されたＤＮＡ分子を提供する。そのような分子は、配列番号１および
２に加えて、配列番号１のｂｐ１２７３〜１２７４および配列番号１のｂｐ１２７３／１
２７４接合部から各方向に少なくとも１０ｂｐを含む、長さが少なくとも２５ｂｐの分子
；配列番号２の１７５〜１７６および配列番号２のｂｐ１７５／１７６接合部から各方向
に少なくとも１０ｂｐを含む、長さが少なくとも２５ｂｐのアンプリコン；を含む。例は
、配列番号１のｂｐ１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番
号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂ
ｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２
７５、ならびにその相補物である。
別の実施形態では、本開示は、ダイズの粒、種子、または種子ミールにおいて害虫を防
除する方法であって、前記粒、種子、または種子ミールが、配列番号１のｂｐ１２５８〜
１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３
；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２
のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択される
１つまたは複数の配列、ならびにその相補物を含むＤＮＡを含むことによって実証される
、前記粒、種子、または種子ミールにダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．
１を含めるステップを含む方法を提供する。
本開示の実施形態は、これらに限定されないが、花粉、胚珠、花、苗条、根、および葉
、ならびに栄養細胞の核、花粉細胞、種子および種子ミール、および卵細胞を含めた、ダ
イズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含有するダイズ植物の細胞および植
物の部位も包含する。
一部の実施形態では、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１は、例えば
、他の除草剤耐性遺伝子（複数可）および／または昆虫抑制タンパク質ならびに転写調節
配列（すなわち、ＲＮＡ干渉、ｄｓＲＮＡ、転写因子など）を含めた他の形質と組み合わ
せることができる。追加的な形質は、植物の育種、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８
１６．１５．１を含有するトランスジェニック植物の再形質転換、または相同組換えによ
る標的化組み込みによる新しい形質の付加によって植物ゲノムに掛け合わせることができ
る。
他の実施形態は、例えば、ｐａｔ遺伝子発現カセットを含めた、ダイズイベントｐＤＡ
Ｂ９５８２．８１６．１５．１を含むポリヌクレオチド配列を削除することを含む。ポリ
ヌクレオチド配列を削除したら、改変されたイベントを特定の染色体上の部位で再標的化
し、そこで追加的なポリヌクレオチド配列にダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．
１５．１を掛け合わせることができる。
一実施形態では、本開示は、配列番号１および配列番号２に記載の隣接配列間の第０３
染色体に位置するダイズ染色体上の標的部位を包含する。
一実施形態では、本開示は、配列番号１および２に記載のゲノム配列間、すなわち、配
列番号１のｂｐ１〜１２７３と配列番号２のｂｐ１７６〜１６８７の間の第０３染色体上
の位置に異種核酸を挿入するステップを含むトランスジェニックダイズ植物を作製する方
法を包含する。
さらに、本開示の実施形態は、試料（例えば、ダイズの）中の本主題のイベントの存在
を検出するためのアッセイも提供する。アッセイは、ダイズゲノムに挿入された組換え構
築物のＤＮＡ配列、および挿入部位に隣接しているゲノム配列に基づくことができる。ア
ッセイの実施において有用なキットおよび条件も提供される。
本開示の実施形態は、一部において、ｐＤＡＢ９５８２由来のＴ−ＤＮＡをトランスジ
ェニックダイズ系統に挿入することによって生じる境界領域のＤＮＡ配列のクローニング
および分析にも関する。これらの配列は独特である。挿入断片配列および接合部配列に基
づいて、イベント特異的なプライマーを生成することができ、これを生成した。ＰＣＲ分
析により、これらのイベント特異的なプライマーセットを用いて生成したＰＣＲアンプリ
コンを分析することによってこれらのイベントを同定することができることが実証された
。したがって、これらおよび他の関連する手順を用いて、本開示のイベントを含むダイズ
系統を一意的に同定することができる。
ある実施形態は、昆虫を昆虫抵抗性ダイズ植物に曝露させて、それにより昆虫を防除す
るステップを含む、昆虫を防除する方法であって、前記ダイズ植物が、配列番号１のｂｐ
１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３
〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；
配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群から
選択される配列を含むＤＮＡを含み、前記配列がダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１
６．１５．１の存在に特徴的である、方法を提供する。
ある実施形態は、シュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）、ア
ンチカルシア・ゲムマタリス（Anticarsia gemmatalis）、ヘリオチス・ビレセンス（Hel
iothis virescens）、またはスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）を
昆虫抵抗性ダイズ植物に曝露させ、それにより昆虫を防除するステップを含む、シュード
プルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）、アンチカルシア・ゲムマタリス
（Anticarsia gemmatalis）、またはスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiper
da）を防除する方法であって、前記ダイズ植物が、配列番号１のｂｐ１２５８〜１２８８
；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番
号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１
２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択される配列を含
むＤＮＡを含み、前記配列がダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の存在
に特徴的である、方法を提供する。
ある実施形態は、ダイズ作物において雑草を防除する方法であって、グルホシネート除
草剤をダイズ作物に施用するステップを含み、前記ダイズ作物が、配列番号１のｂｐ１２
５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１
３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列
番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択
される配列からなる群から選択される配列を含むＤＮＡを含むダイズ植物を含み、前記配
列がダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の存在に特徴的である、方法を
提供する。
ある実施形態は、配列番号１のｂｐ１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜
１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３
；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号
２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択される１つまたは複数の配列を含む単離された
ＤＮＡ配列を提供する。
ある実施形態は、ダイズ植物を育種する方法であって、第１の植物と第２のダイズ植物
を交雑させて第３のダイズ植物を作出するステップであり、前記第１の植物が配列番号１
の１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７
３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０
；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群か
ら選択される１つまたは複数の配列、ならびにその相補物を含むＤＮＡを含む、ステップ
と、前記第３のダイズ植物を、配列番号１の１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２
２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１
４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配
列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択される１つまたは複数の配列、ならびに
その相補物を含むＤＮＡの存在についてアッセイするステップとを含む方法を提供する。
ある実施形態は、配列番号１のｂｐ１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜
１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３
；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号
２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択される少なくとも１つの配列、ならびにその相
補物を含む接合部配列を含む単離されたＤＮＡ分子を提供する。ある実施形態は、シュー
ドプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）（ダイズシャクトリムシ）に対
して抵抗性であり、配列番号１のｂｐ１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜
１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３
；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号
２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列、な
らびにその相補物を有するＤＮＡを含む、ダイズ植物またはその部位を提供する。
ある実施形態は、ダイズミール、ダイズ粉（soy flour）、ダイズタンパク質濃縮物、
およびダイズ油（soy oil）からなる群から選択される生産品である、ダイズ植物または
その部位に由来する組成物を提供する。
ある実施形態は、ダイズの粒、種子、ミール、または粉において害虫を防除する方法で
あって、前記粒、種子、ミール、または粉が配列番号１のｂｐ１２５８〜１２８８；配列
番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１の
ｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜
２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択される１つまたは複数
の配列、ならびにその相補物を含むＤＮＡを含むことによって実証される、前記粒、種子
、ミール、または粉にダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含めるステ
ップを含む方法を提供する。
ある実施形態は、そのゲノム内に、配列番号１のｂｐ１２５８〜１２８８；配列番号１
のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１
０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５
；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択されるＤＮＡ配列、ならびに
その相補物を含むダイズ種子を提供する。別の実施形態は、そのゲノム内にダイズイベン
トｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１のｃｒｙ１Ｆ、ｃｒｙ１Ａｃおよびｐａｔを含み
、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＰＴ
Ａ−１２５８８の下で寄託されている代表的なダイズ種子を有するダイズ種子を提供する
。別の実施形態は、これらの２つの実施形態のいずれかのダイズ種子を生長させることに
よって作出されるダイズ植物を提供する。別の実施形態は、このダイズ植物によって産生
されるダイズ種子であって、そのゲノム内に、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕ
ｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＰＴＡ−１２５８８の下で寄託されているダイズ
種子に存在するものであるダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１のｃｒｙ
１Ｆ遺伝子、ｃｒｙ１Ａｃ遺伝子およびｐａｔ遺伝子を含む種子を提供する。別の実施形
態は、花粉、胚珠、花、苗条、根、および葉からなる群から選択され、前記イベントを含
む、このダイズ植物の部位を提供する。別の実施形態は、ダイズミール、ダイズ粉（soy
flour）、およびダイズ油（soy oil）からなる群から選択される生産品である、ダイズ植
物またはその部位に由来する組成物を提供する。
さらなる実施形態では、ダイズ植物は、配列番号１４に対して少なくとも９５％の配列
同一性を有するＤＮＡ配列を含む。ある実施形態は、グルホシネート除草剤に対する耐性
を示し、前記耐性が前記イベントまたは前記ゲノムにおいてコードされるタンパク質の発
現に起因するものである、上記の実施形態の植物の後代ダイズ植物を提供する。
別の実施形態は、配列番号１４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＤＮＡ
配列を含むゲノムを含むダイズ種子を提供する。別の実施形態は、このダイズ種子を生長
させることによって作出される植物を提供する。
ある実施形態は、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含むトランス
ジェニックダイズ植物またはその部位であって、代表的なダイズ種子がＡｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＰＴＡ−１２５８８の下
で寄託されているダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含む、トランス
ジェニックダイズ植物またはその部位を提供する。
種子寄託物
本開示の一部として、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含むダイ
ズ系統の少なくとも２５００種子がＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒ
ｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、２０１１０に寄託され、制限なく一般に公開されている（
しかし、特許権に支配される）。ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５８８と称される寄託物
は、Ｄｏｗ ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ ＬＬＣ ｏｎ ２３／Ｆｅｂｒｕａｒｙ／２０
１２を代表して作製された。この寄託物は、特許手続のための種子寄託物に関するブタペ
スト条約の条項に従い、その下で作製されたものであり、また、それに従い、その下で維
持される。
配列の簡単な説明
配列番号１はダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１についての５’ＤＮ
Ａ隣接境界配列である。ヌクレオチド１〜１２７３はゲノム配列である。ヌクレオチド１
２７４〜１５７７は挿入断片配列である。
配列番号２は、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１についての３’Ｄ
ＮＡ隣接境界配列である。ヌクレオチド１〜１７５は挿入断片配列である。ヌクレオチド
１７６〜３１６は、ｐＤＡＢ９５８２から再配置された配列である。ヌクレオチド３１７
〜１６８７はゲノム配列である。
配列番号３は、ｐＤＡＢ９５８２のＴ鎖のＤＮＡ配列であり、下の表１において注釈を
付けている。
配列番号４は、５’境界ゲノムＤＮＡを確認するためのオリゴヌクレオチドプライマー
８１６１５＿ＦＷ２である。
配列番号５は、３’境界ゲノムＤＮＡを確認するためのオリゴヌクレオチドプライマー
８１５１６＿ＲＶ１である。
配列番号６は、３’境界ゲノムＤＮＡを確認するためのオリゴヌクレオチドプライマー
８１５１６＿ＲＶ２である。
配列番号７は、３’境界ゲノムＤＮＡを確認するためのオリゴヌクレオチドプライマー
８１５１６＿ＲＶ３である。
配列番号８は、５’境界ゲノムＤＮＡを確認するためのオリゴヌクレオチドプライマー
５’ＩＲＥｎｄ−０１である。
配列番号９は、５’境界ゲノムＤＮＡを確認するためのオリゴヌクレオチドプライマー
５’ＩＲＥｎｄ−０２である。
配列番号１０は、５’境界ゲノムＤＮＡを確認するためのオリゴヌクレオチドプライマ
ーＡｔＵｂｉ１ＯＲＶ１である。
配列番号１１は、５’境界ゲノムＤＮＡを確認するためのオリゴヌクレオチドプライマ
ーＡｔＵｂｉ１ＯＲＶ２である。
配列番号１２は、３’境界ゲノムＤＮＡを確認するためのオリゴヌクレオチドプライマ
ー３ＴＡＴＥｎｄ０５である。
配列番号１３は、３’境界ゲノムＤＮＡを確認するためのオリゴヌクレオチドプライマ
ー３’ＰＡＴＥｎｄ０６である。
配列番号１４は、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の予測される配
列である。５’ゲノム隣接配列、ｐＤＡＢ９５８２Ｔ鎖挿入断片、および３’ゲノム隣接
配列を含む。
ｃｒｙ１Ｆ ｖ３、ｃｒｙ１Ａｃ ｓｙｎｐｒｏおよびｐａｔ ｖ６遺伝子発現カセットを含有するｐＤＡＢ９５８２のプラスミドマップである。 ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の５’境界配列および３’境界配列を確認するためのプライマーの位置を示す図である。 ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１におけるゲノム配列配置を示す図である。
イベントダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１挿入物の両端を配列決定
し特徴付けた。イベント特異的なアッセイを開発した。イベントは、ダイズゲノム（ダイ
ズの第０３染色体）上にマッピングされた。イベントを別の優良な系統に、遺伝子移入し
得る。
上の背景技術のセクションにおいて言及されている通り、導入遺伝子の植物ゲノムへの
導入および組み込みは、いくつかのランダムなイベントを伴う（したがって発現される所
与の挿入物について「イベント」と称する）。すなわち、多くの形質転換技法、例えば、
アグロバクテリウム（Agrobacterium）形質転換、微粒子銃形質転換（すなわち遺伝子銃
）、および炭化ケイ素媒介性形質転換（すなわちＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標））などを用い
ると、導入遺伝子がゲノム内のどこに挿入されるかは予測不可能である。したがって、挿
入断片の両側の隣接植物ゲノムＤＮＡを同定することは、所与の挿入イベントを有する植
物を同定するために重要であり得る。例えば、挿入断片と宿主ゲノムとの接合領域にわた
ってＰＣＲアンプリコンを生成するＰＣＲプライマーを設計することができる。このＰＣ
Ｒアンプリコンを使用して、独特のまたは別個の種類の挿入イベントを同定することがで
きる。
本開示の実施形態の説明に役立つように、また当業者がこれらの実施形態を実施する指
針となるために、本明細書において定義および例が提供される。特に断りのない限り、用
語は、当業者による従来の使用法に従って理解される。米国特許法施行規則第１．８２２
条に明記されているＤＮＡ塩基の命名法を使用する。
本明細書で使用される場合、用語「後代」は、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１
６．１５．１を含む親植物の任意の世代の子孫を意味する。
トランスジェニック「イベント」は、植物細胞を異種ＤＮＡ、すなわち、対象の導入遺
伝子を含む核酸構築物で形質転換すること、植物のゲノムに導入遺伝子を挿入することに
よって生じる植物の集団を再生させること、および特定のゲノム上の位置への挿入を特徴
とする特定の植物を選択することによって作出される。用語「イベント」は、元の形質転
換体および異種ＤＮＡを含むその形質転換体の後代を指す。用語「イベント」は、その後
代がゲノムＤＮＡ／導入遺伝子ＤＮＡを含む、形質転換体と別の品種との間の有性異系交
雑によって作出される後代も指す。反復親との戻し交雑を繰り返した後であっても、形質
転換された親由来の挿入された導入遺伝子ＤＮＡおよび隣接ゲノムＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ
／導入遺伝子ＤＮＡ）は、交雑の後代において同じ染色体上の位置に存在する。用語「イ
ベント」は、元の形質転換体由来のＤＮＡ、および挿入ＤＮＡを含む一方の親系統（例え
ば、元の形質転換体および自殖によって生じる後代）と挿入ＤＮＡを含有しない親系統と
の有***雑の結果として、対象の導入遺伝子を含む挿入ＤＮＡを受け取る後代に伝達され
ることが予測され得る挿入ＤＮＡおよび挿入ＤＮＡのすぐ近接の隣接ゲノム配列を含むそ
の後代も指す。
「接合部配列」または「境界の配列」は、ゲノムに挿入されたＤＮＡが、挿入点に隣接
するダイズのネイティブなゲノム由来のＤＮＡに連結している点にわたり、植物の遺伝物
質中の一方または他方の接合部配列の特定または検出は、十分にイベントに特徴的である
。本明細書に記載のダイズイベントにおける挿入物にわたるＤＮＡ配列および同様の長さ
の隣接ＤＮＡが包含される。そのような特徴的な配列の特定の例が本明細書において提供
されるが、挿入物の接合部、または挿入物とゲノム配列との接合部とオーバーラップする
他の配列も特徴的であり、本開示の実施形態に従って使用することができる。
本開示の実施形態は、そのような隣接配列、接合部配列、および挿入断片配列を使用し
てイベントを特定することに一部関する。関連するＰＣＲプライマーおよびアンプリコン
は、本開示の実施形態に包含される。本開示の実施形態に従って、挿入ＤＮＡおよびその
端までわたるアンプリコンを使用するＰＣＲ分析方法を使用して、対象の登録商標を持つ
トランスジェニックダイズ系統に由来する商業化されたトランスジェニックダイズの品種
または系統を検出または特定することができる。
隣接／接合部配列は、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１に特徴的で
ある。これらの配列に基づいて、イベント特異的なプライマーを生成した。ＰＣＲ分析に
より、これらのイベント特異的なプライマーセットを用いて生成したＰＣＲアンプリコン
を分析することによって、異なるダイズ遺伝子型においてこれらのダイズ系統を同定する
ことができることが実証された。したがって、これらおよび他の関連する手順を用いて、
これらのダイズ系統を一意的に同定することができる。本明細書において同定される配列
は独特である。
本開示の実施形態の検出技法は、植物育種と併せて、１つまたは複数の追加的な対象の
形質を後代に与える取り組みにおいて、対象のイベントを含む親植物を別の植物系統と交
雑した後に、どの後代植物が所与のイベントを含むかを決定するために特に有用である。
これらのＰＣＲ分析方法は、ダイズの育種計画ならびに品質管理、特に商業化されたトラ
ンスジェニックダイズ種子に有益である。これらのトランスジェニックダイズ系統のＰＣ
Ｒ検出キットも、現在製造され、使用することができる。これは、製品登録および製品管
理にも有益である。
さらに、隣接ダイズ／ゲノム配列を使用して、それぞれの挿入断片の遺伝子位置を特異
的に同定することができる。この情報を使用して、それぞれのイベントに特異的な分子マ
ーカー系を作製することができる。これらは、育種戦略を加速させるために、および連鎖
データを確立するために使用することができる。
さらに、隣接配列の情報を使用して、導入遺伝子の組み込みプロセス、ゲノムの組み込
み部位の特性、イベントの選別、導入遺伝子およびそれらの隣接配列の安定性、ならびに
遺伝子発現（特に遺伝子サイレンシング、導入遺伝子のメチル化パターン、位置の影響、
およびＭＡＲＳ［マトリックス付着領域］などの潜在的な発現関連エレメントなどに関連
する）を試験し、特徴付けることができる。
本開示全てに照らして、本開示の実施形態は、パラグラフ［００３３］において識別さ
れるＡＴＣＣ寄託番号の下で入手可能な種子を包含することが明白でなければならない。
本開示の実施形態は、パラグラフ［００３３］において識別されるＡＴＣＣ寄託番号で寄
託された種子から生長させた除草剤耐性ダイズ植物も包含する。本開示の実施形態は、前
記植物の部位、例えば、葉、組織試料、前記植物体によって生産される種子、花粉なども
包含する（植物のこれらの部分は、ｃｒｙ１Ｆ、ｃｒｙ１Ａｃ、ｐａｔ、ならびに配列番
号１および配列番号２を含む）。
さらに、本開示の実施形態は、寄託されている種子から生長させた植物の後裔植物およ
び／または後代植物、好ましくは除草剤耐性ダイズ植物であって、本明細書に記載の検出
可能な野生型接合部／隣接配列を含むゲノムを有する植物も包含する。本明細書で使用さ
れる場合、用語「ダイズ」は、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘを意味し、ダイズ植物を用いて育
種することができるその全品種を包含する。
本開示は、本開示の植物を少なくとも一方の親として使用して交雑を行うプロセスをさ
らに包含する。例えば、本開示は、本明細書において例示されている植物のいずれかを一
方の親または両親として有するＦｉハイブリッド植物を包含する。また、本開示のそのよ
うなＦｉハイブリッドによって生産される種子も本開示の範囲内である。本開示は、例示
した植物と、異なる（例えば、純系の親）植物を交雑し、得られたハイブリッド種子を収
穫することによってＦｉハイブリッド種子を作出するための方法を包含する。本開示は、
雌親または雄親のいずれかである、例示した植物を包含する。得られる植物の特性は、親
植物を慎重に考察することによって改良することができる。
本開示の昆虫抵抗性／グルホシネート耐性ダイズ植物は、本明細書で言及されている系
統の任意の１つの種子から生長させたダイズ植物からなる第１の親ダイズ植物と、第２の
親ダイズ植物との有***雑を最初に行い、それによって複数の第１の後代植物を作出する
こと；次いで、グルホシネートに対して抵抗性である第１の後代植物を選択すること；第
１の後代植物を自殖させ、それによって、複数の第２の後代植物を作出すること；次いで
、第２の後代植物から、グルホシネートに対して抵抗性である植物を選択することによっ
て育種することができる。これらのステップは、第１の後代植物または第２の後代植物を
第２の親ダイズ植物または第３の親ダイズ植物と戻し交雑することをさらに含んでよい。
次いで本開示のダイズ種子を含むダイズ作物、またはその後代を植え付けることができる
。
２つの異なるトランスジェニック植物を交配して、それぞれ独立に分離して付加された
２つの外因性遺伝子を含有する子孫を作出することもできることがまた理解される。適切
な後代を自殖させることにより、付加された外因性遺伝子のどちらについてもホモ接合性
である植物を作出することができる。栄養繁殖のように、親植物との戻し交雑および非ト
ランスジェニック植物との異系交雑も意図されている。種々の形質および作物のために一
般に使用される他の育種方法は当技術分野で公知である。反復親である望ましいホモ接合
性の栽培品種または純系統に、単純に遺伝した、高度に遺伝性の形質の遺伝子を伝達する
ために戻し交雑育種が使用されてきた。伝達される形質の供給源は、供与親と称されてい
る。生じた植物は、反復親（例えば、栽培品種）の属性および供与親から伝達された望ま
しい形質を有することが予測される。最初の交雑の後、供与親の表現型を保有する個体を
選択し、反復親と繰り返し交雑（戻し交雑）する。生じた親は、反復親（例えば、栽培品
種）の属性および供与親から伝達された望ましい形質を有することが予測される。
同様に、本開示の実施形態の昆虫抵抗性／グルホシネート耐性ダイズ植物を、当技術分
野で公知の方法を用いて追加的な導入遺伝子で形質転換することができる。形質転換技法
、例えば、アグロバクテリウム（Agrobacterium）形質転換、微粒子銃形質転換（すなわ
ち遺伝子銃）、および炭化ケイ素媒介性形質転換（すなわちＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標））
などを用いて、追加的な導入遺伝子（複数可）をダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１
６．１５．１のゲノムに導入することができる。新しく挿入された導入遺伝子を含有する
トランスジェニック植物の選択および特徴付けを完了して、本開示の実施形態のｃｒｙ１
Ｆ遺伝子、ｃｒｙ１Ａｃ遺伝子、ｐａｔ遺伝子に加えて、新規の導入遺伝子の安定な組み
込み体を含有する植物を同定することができる。
本開示の実施形態のＤＮＡ分子は、マーカー利用育種（ＭＡＢ）法において分子マーカ
ーとして使用することができる。本開示の実施形態のＤＮＡ分子は、当技術分野で公知の
通り、遺伝的に連鎖している作物学的に有用な形質を特定する方法（例えば、ＡＦＬＰマ
ーカー、ＲＦＬＰマーカー、ＲＡＰＤマーカー、ＳＮＰおよびＳＳＲなど）において使用
することができる。ＭＡＢ法を使用して、本開示の実施形態のダイズ植物（またはその後
代および任意の他のダイズの栽培品種または品種）との交雑の後代において昆虫抵抗性お
よび除草剤耐性形質を追跡することができる。ＤＮＡ分子はこの形質についてのマーカー
であり、当技術分野で周知のＭＡＢ法を使用して、本開示の実施形態の少なくとも１つの
ダイズ系統、またはその後代が親または祖先であったダイズ植物における除草剤抵抗性形
質（複数可）を追跡することができる。本開示の実施形態の方法を使用して、対象イベン
トを有する任意のダイズ品種を特定することができる。
本開示の実施形態は、本開示に例示された植物を用いて育種するステップを含む、昆虫
抵抗性／除草剤耐性ダイズ植物を作出する方法を包含する。より詳細には、前記方法は、
本開示に例示された２つの植物、または本開示に例示された１つの植物と任意の他の植物
とを交雑するステップを含んでよい。好ましい方法は、前記交雑の後代を、本開示の実施
形態に従って検出可能なイベントおよび好都合な品種性能（例えば、収量）について前記
後代を分析することによって選択するステップをさらに含む。例えば、本開示の実施形態
を用いて、他の望ましい形質、例えば、農業形質、病害に対する耐性もしくは抵抗性、線
形動物に対する耐性もしくは抵抗性および成熟日を含む植物を用いた育種サイクルを通し
て本主題のイベントを追跡することができる。対象イベントおよび所望の形質を含む植物
を検出し、特定し、選択し、例えば育種のさらなるラウンドに直ちに使用することができ
る。対象イベント／形質は、さらなる昆虫抵抗性形質（複数可）および／または別の除草
剤耐性形質と育種を通じて組み合わせ、本開示の実施形態に従って追跡することもできる
。後者の実施形態は、本主題のイベントを、シュードプルシア・インクルデンス（Pseudo
plusia includens）（ダイズシャクトリムシ）、アンチカルシア・ゲムマタリス（Antica
rsia gemmatalis）（ハッショウマメイモムシ（velvetbean caterpillar））、エピノチ
ア・アポレマ（Epinotia aporema）、オミオデス・インディカタ（Omiodes indicata）、
ラチプルシア・ヌ（Rachiplusia nu）、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugi
perda）、スポドプテラ・コスモイデス（Spodoptera cosmoides）、スポドプテラ・エリ
ダニア（Spodoptera eridania）、ヘリオチス・ビレセンス（Heliothis virescens）、ヘ
リコベルパ・ゼア（Heliocoverpa zea）、スピロソーマ・ビルギニカ（Spilosoma virgin
ica）およびエラスモパルパス・リグノセルス（Elasmopalpus lignosellus）を含めた鱗
翅目の種に対する抵抗性を付与するｃｒｙ１Ｆ遺伝子およびｃｒｙ１Ａｃ遺伝子と組み合
わせて含む植物である。
したがって、本開示の実施形態は、例えば、グリホサート抵抗性（例えば、抵抗性植物
または細菌のＥＰＳＰＳ、ＧＯＸ、ＧＡＴ）、グルホシネート抵抗性（例えば、ｄｓｍ−
２、ｂａｒ）、アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）阻害性除草剤への抵抗性（例えば、イミダ
ゾリノン［イマゼタピルなど］、スルホニル尿素系、トリアゾロピリミジンスルホンアニ
リド、ピリミジニルチオベンゾエート系、および他の化学物質［Ｃｓｒ１、ＳｕｒＡなど
］）、ブロモキシニル抵抗性（例えば、Ｂｘｎ）、ＨＰＰＤ（４−ヒドロキシルフェニル
−ピルビン酸−ジオキシゲナーゼ）酵素の阻害剤に対する抵抗性、フィトエンデサチュラ
ーゼ（ＰＤＳ）の阻害剤に対する抵抗性、光化学系ＩＩ阻害性除草剤に対する抵抗性（例
えば、ｐｓｂＡ）、光化学系Ｉ阻害性除草剤に対する抵抗性、プロトポルフィリノーゲン
オキシダーゼＩＸ（ＰＰＯ）阻害性除草剤に対する抵抗性（例えば、ＰＰＯ−１）、フェ
ニル尿素除草剤に対する抵抗性（例えば、ＣＹＰ７６Ｂ１）、ジカンバ分解酵素（例えば
、ＵＳ２００３０１３５８７９を参照されたい）をコードする形質と組み合わせることが
でき、その他のものを、単独で、または多数の組合せで積み重ねて、雑草のシフト（weed
shift）および／または上述のクラスの任意の除草剤に対する抵抗性を有効に制御する、
または妨げる能力をもたらすことができる。
さらに、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１に、１つまたは複数の追
加的なインプット形質（例えば、昆虫抵抗性、病原体抵抗性、もしくはストレス耐性など
）またはアウトプット形質（例えば、生産量の増加、油プロファイルの改良、繊維品質の
改良など）を組み合わせることができる。したがって、本開示の実施形態を使用して、任
意の数の作物害虫を柔軟かつ費用効果的に制御する能力を伴う改良された作物の品質の完
全な作物パッケージをもたらすことができる。
植物細胞の特定の染色体上の部位内に、相同組換えによってポリヌクレオチド配列を組
み込むための方法は、当技術分野の範囲内で記載されている。例えば、参照により本明細
書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９／０１１１１８８Ａ１号に記載の部位特異
的な組み込みでは、ドナーポリヌクレオチド配列の染色体上の標的への導入を媒介するた
めのリコンビナーゼまたはインテグラーゼの使用が記載されている。さらに、参照により
本明細書に組み込まれる国際特許出願第ＷＯ２００８／０２１２０７号には、１つまたは
複数のドナーポリヌクレオチド配列をゲノムの特定の位置内に組み込むためのジンクフィ
ンガー媒介相同組換えが記載されている。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第
６７２０４７５号に記載のＦＬＰ／ＦＲＴ、または参照により本明細書に組み込まれる米
国特許第５６５８７７２号に記載のＣＲＥ／ＬＯＸなどのリコンビナーゼの使用を利用し
て、ポリヌクレオチド配列を特定の染色体上の部位に組み込むことができる。最終的に、
ドナーポリヌクレオチドを特定の染色体上の位置に標的化するためのメガヌクレアーゼの
使用が、Puchtaら、PNAS USA 93巻（1996年）5055〜5060頁）に記載されている。
植物細胞内に部位特異的に組み込むための他の方法は、一般に、公知であり、適用可能
である（Kumarら、Trends in Plant Sci. 6巻（4号）（2001年）155〜159頁）。さらに、
いくつかの原核生物および下等真核生物において同定された部位特異的な組換え系を植物
における使用に適用することができる。そのような系の例としては、これらに限定されな
いが、酵母であるジゴサッカロマイセス・ロキシー（Zygosaccharomyces rouxii）のｐＳ
Ｒ１プラスミ由来のＲ／ＲＳリコンビナーゼ系（Arakiら（1985年）J. Mol. Biol. 182巻
：191〜203頁）、およびファージＭｕのＧｉｎ／Ｇｉｘ系（MaeserおよびKahlmann（1991
年）Mol. Gen. Genet. 230巻：170〜176頁）が挙げられる。
本開示の一部の実施形態では、既存のトランスジェニックイベントに近接して新しい導
入遺伝子（複数可）を組み込む、または掛け合わせることが望ましい。トランスジェニッ
クイベントは、単一の挿入部位、正常なメンデル分離および安定発現、ならびに、多数の
環境区域における、およびそれ全てにわたる除草剤耐性および農業生産力を含めた効力の
優れた組合せなどの独特の特性に基づいて選択された好ましいゲノム遺伝子座と考えるこ
とができる。組み込まれた導入遺伝子を含む後代植物は、既存の形質転換体の導入遺伝子
の発現特性を維持すべきである。さらに、組み込まれたイベントを含む後代植物のゲノム
隣接配列および染色体上の位置はすでに同定されているので、以前に開発された、イベン
トを検出し、確認するためのアッセイを、イベントを含む後代植物に利用することができ
る。最終的に、既存の導入遺伝子の近くに連結された特定の染色体上の位置に新しい導入
遺伝子を組み込むことにより、従来の育種方法を使用した有性異系交雑による導入遺伝子
の他の遺伝的背景への遺伝子移入が促進される。
本開示の一部の実施形態では、トランスジェニックイベントからポリヌクレオチド配列
を削除することが望ましい場合がある。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国
特許出願公開第２０１１／０１９１８７７号に記載の導入遺伝子の削除では、染色体に組
み込まれたトランスジェニックイベントから、遺伝子発現カセットからなるポリヌクレオ
チド配列を除去するためのジンクフィンガーヌクレアーゼの使用が記載されている。除去
されるポリヌクレオチド配列は、選択マーカーであってよい。ポリヌクレオチド配列を削
除および除去したら、改変されたトランスジェニックイベントを、ポリヌクレオチド配列
を挿入することによって再標的化することができる。ポリヌクレオチド配列を削除し、そ
の後、改変されたトランスジェニックイベントを再標的化することにより、選択マーカー
の再使用、または特定の遺伝子が発現することによって生じる、植物のトランスクリプト
ームに対する意図されたものではない変化を克服する能力などの利点がもたらされる。
本開示は、本明細書において、異種核酸を挿入するために使用することができ、ダイズ
ゲノム内の第０３染色体上の特定の部位を開示している。したがって、本開示の実施形態
は、対象とする異種核酸をこの予め確立した標的部位に、またはこの標的部位の付近に導
入するための方法を提供する。本開示の実施形態は、開示されている標的部位またはその
ような部位の概ね近くに挿入された任意の異種ヌクレオチド配列を含むダイズ種子および
／またはダイズ植物も包含する。そのような標的化組み込みを実現するための１つの選択
肢は、本明細書において例示されているｐａｔ発現カセットの代わりに異なる挿入断片を
削除することおよび／または置換することである。この一般的な点について、例えば、ま
たこれらに限定することなく、本開示の実施形態に従って標的化相同組換えを使用するこ
とができる。
本明細書で使用される場合、遺伝子、イベントまたは形質を「掛け合わせること」は、
所望の形質を１つのトランスジェニック系統に組み合わせることを指す。植物育種家は、
それぞれが所望の形質を有する親同士の交雑を行い、次にこれらの所望の形質を両方とも
有する子孫を同定することによってトランスジェニック形質を掛け合わせる。遺伝子を掛
け合わせるための別の方法は、形質転換の間に、２種以上の遺伝子を同時に植物の細胞核
に移入することによる。遺伝子を掛け合わせるための別の方法は、トランスジェニック植
物を、対象とする別の遺伝子を用いて再形質転換することによる。例えば、遺伝子を掛け
合わせることを用いて、例えば、２種以上の異なる昆虫形質、昆虫抵抗性形質（複数可）
および病害抵抗性形質（複数可）、２種以上の除草剤への抵抗性形質、および／または昆
虫抵抗性形質（複数可）および除草剤抵抗性形質（複数可）を含めた２種以上の異なる形
質を組み合わせることができる。対象の遺伝子に加えて選択マーカーを使用することも、
遺伝子を掛け合わせることと考えることができる。
「相同組換え」とは、２つのヌクレオチド配列が相互作用して（組み換えられて）新し
い組換えＤＮＡ配列を形成し得る類似したヌクレオチド配列を含有する対応する部位を有
するヌクレオチド配列の任意の対の間の反応を指す。類似したヌクレオチド配列の部位は
、本明細書ではそれぞれが「相同配列」と称される。一般に、相同組換えの頻度は、相同
配列の長さが増加するにつれて増加する。したがって、相同組換えは、同一には満たない
２つのヌクレオチド配列間で起こり得るが、組換え頻度（または効率）は、２つの配列間
の相違が増加するにつれて減退する。組換えは、ドナー分子および標的分子のそれぞれの
１つの相同配列を使用して実現することができ、それによって「単一乗換え」組換え産物
を生成することができる。あるいは、標的ヌクレオチド配列およびドナーヌクレオチド配
列のそれぞれに２つの相同配列を置くことができる。ドナー上の２つの相同配列と標的上
の２つの相同配列との間の組換えにより、「２重乗換え」組換え産物が生成する。ドナー
分子上の相同配列が、操作される配列（例えば、対象の配列）に隣接する場合、標的分子
との２重乗換え組換えにより、対象の配列が元々標的分子上の相同配列の間にあったＤＮ
Ａ配列と交換された組換え産物がもたらされる。２重乗換え組換えイベントによって標的
とドナーとの間でＤＮＡ配列を交換することは、「配列交換」と称される。
本開示の実施形態の好ましい植物、または種子は、そのゲノム内に、本明細書において
同定される、作動的なｃｒｙ１Ｆヌクレオチド配列、ｃｒｙ１Ａｃ ｓｙｎｐｒｏヌクレ
オチド配列およびｐａｔヌクレオチド配列と、本明細書において同定される、挿入断片の
両側の少なくとも２０〜５００以上の連続した隣接ヌクレオチドを一緒に含む。別段の指
定のない限り、隣接配列に言及する場合、それは配列番号１および２について特定された
ものを指す。これらの隣接配列の全部または一部は、イベントを含む親系統の有***雑の
結果として挿入ＤＮＡを受け取る後代に伝達されることが予測され得る。
本開示の実施形態は、本開示の実施形態の植物の再生可能な細胞の組織培養物を包含す
る。また、そのような組織培養物から再生された植物も、特に前記植物が例示されている
品種の形態学的性質および生理的性質の全てを発現することができる場合、包含される。
本開示の実施形態の好ましい植物は、寄託されている種子から生長させた植物の生理的特
性および形態学的特性の全てを有する。本開示の実施形態は、そのような種子および対象
の品質形質を保有する種子の後代をさらに含む。
本明細書で使用される場合、「系統」は、少なくとも１つの形質について、個体間で遺
伝的変異をほとんど示さない、または示さない植物の群である。そのような系統は、何世
代か自家受粉させ、選択すること、または組織または細胞の培養技法を使用して、単一の
親から栄養繁殖させることによって創出することができる。
本明細書で使用される場合、用語「栽培品種」および「品種」は同義であり、商業生産
のために使用される系統を指す。
「安定性」または「安定な」は、所与の構成要素に関しては、構成要素が代々、好まし
くは、少なくとも３世代維持されることを意味する。
「商業的有用性」は、従来の農業設備を使用して農業者が作物を生産することができる
ように、および従来の圧搾および抽出用設備を使用して記載の構成要素を有する油を種子
から抽出することができるように良好な植物生長力および高い稔性を有することと定義さ
れる。
「作物学的に優良」は、系統が対象イベント（複数可）に起因する昆虫抵抗性および除
草剤耐性に加えて、例えば生産量、成熟度、病害抵抗性などの望ましい作物学的特性を有
することを意味する。これらの作物学的特性およびデータポイントの全てを使用して、そ
のような植物を、そのような植物を定義するために使用する特性の範囲内の一点として、
または一端もしくは両端で特定することができる。
本開示に照らして当業者に理解されるように、検出キットの好ましい実施形態は、例え
ば、「接合部配列」または「移行部配列」（ダイズゲノムの隣接配列と挿入断片配列が接
する場所）を対象とし、かつ／またはそれを含むプローブおよび／またはプライマーを含
んでよい。これは、例えば、一方のまたは両方の接合部配列（挿入断片と隣接配列が接す
る場所）を同定するために設計されたポリヌクレオチドプローブ、プライマー、および／
またはアンプリコンを含む。１つの一般的な設計は、隣接領域内でハイブリダイズする１
つのプライマー、および挿入断片内でハイブリダイズする１つのプライマーを有する。そ
のようなプライマーは、多くの場合、およそ、それぞれの長さが少なくとも約１５残基で
ある。この配置を用いて、プライマーを使用して、本開示の実施形態のイベントの存在を
示す検出可能なアンプリコンを生成／増幅することができる。これらのプライマーを使用
して、上に示されている接合部配列にわたる（およびそれを含む）アンプリコンを生成す
ることができる。
隣接配列に「接している」プライマー（複数可）は、一般には、約１２００塩基を越え
て、または接合部を越えてハイブリダイズするようには設計されない。したがって、典型
的な隣接プライマーは、挿入断片の最初から隣接配列に入って１２００塩基の範囲内のど
ちらかの鎖の少なくとも１５残基を含むように設計され得る。すなわち、配列番号１の塩
基対１〜１２７３および／または配列番号２の塩基対１７６〜１６８７由来の（またはそ
れとハイブリダイズする）適切なサイズの配列を含むプライマーは、本開示の実施形態の
範囲内である。挿入プライマーは、配列番号１４の挿入断片のどこにでも、塩基対１２７
３から１８７３および１３０５８から１３６５８のどこにでも同様に設計することができ
、また、例えば、そのようなプライマーの設計のために非排他的に使用することができる
。
当業者は、さまざまな標準のハイブリダイゼーションおよび／またはＰＣＲの条件の下
で、ハイブリダイズするようにプライマーおよびプローブを設計することができ、ここで
プライマーまたはプローブが例示された配列と完全に相補的ではないことも認識されよう
。すなわち、ある程度のミスマッチまたは縮重が容認され得る。およそ２０ヌクレオチド
のプライマーについて、例えば、一般には、ミスマッチ塩基がアンプリコンと逆のプライ
マーの内部または末端にある場合、１または２ヌクレオチド程度は逆の鎖と結合しなくて
よい。種々の適切なハイブリダイゼーション条件が以下に提供される。イノシンなどの合
成ヌクレオチド類似体は、プローブにも使用することができる。ペプチド核酸（ＰＮＡ）
プローブ、ならびにＤＮＡプローブおよびＲＮＡプローブも使用することができる。重要
なのは、そのようなプローブおよびプライマーが、本開示の実施形態のイベントの存在に
対して特徴的である（独自に特定し、区別することができる）ことである。
ＰＣＲ増幅において、例えば、軽微な配列決定のエラーを生じる可能性があるエラーが
起こり得ることに留意するべきである。すなわち、別段の指定のない限り、本明細書にお
いて列挙されている配列は、ダイズのゲノムＤＮＡから長いアンプリコンを生成し、次い
でそのアンプリコンをクローニングし、配列決定することによって決定した。ゲノムＤＮ
Ａから配列決定するために十分なアンプリコンを生成するために必要な多数回の増幅を考
慮すると、このように生成し、決定した配列においてわずかな差異および軽微な不一致が
見いだされることは珍しいことではない。当業者は、これらの型の一般的な配列決定のエ
ラーまたは不一致に起因して必要になる調整はいずれも本開示の実施形態の範囲内である
ことを認識し、留意するべきである。
例えば、イベントを創出する間に配列を挿入する場合、いくらかのゲノム配列が欠失す
ることは珍しくないことにも留意すべきである。したがって、本主題の隣接配列と、例え
ばＧＥＮＢＡＮＫに列挙されているゲノム配列との間にもいくらかの差異が出現する可能
性がある。
ＤＮＡ配列「挿入断片」の構成成分が図面に例示されており、以下の実施例においてよ
り詳細に考察されている。これらの構成要素のＤＮＡポリヌクレオチド配列、またはその
断片を、本開示の実施形態の方法においてＤＮＡプライマーまたはプローブとして使用す
ることができる。
本開示の一部の実施形態では、ダイズ植物由来の植物および種子などにおける導入遺伝
子／ゲノムの挿入領域の存在を検出するための組成物および方法が提供される。本明細書
において提供される本主題の５’導入遺伝子／ゲノムの挿入領域接合部配列（配列番号１
の塩基対１〜１２７３と配列番号１４の塩基対１〜１２７３の間）、そのセグメント、な
らびに例示された配列の相補物およびその任意のセグメントを含むＤＮＡ配列が提供され
る。本明細書において提供される本主題の３’導入遺伝子／ゲノムの挿入領域接合部配列
（配列番号２の塩基対１７６〜１６８７と配列番号１４の塩基対１３６５９〜１５１７０
の間）、そのセグメント、ならびに例示された配列の相補物およびその任意のセグメント
を含むＤＮＡ配列が提供される。挿入領域の接合部配列は、ゲノムに挿入された異種ＤＮ
Ａと、挿入部位に隣接しているダイズの細胞由来のＤＮＡの接合部にわたる。そのような
配列は、所与のイベントに対して特徴的であり得る。
これらの挿入断片および境界の配列に基づいて、イベント特異的なプライマーを生成す
ることができる。ＰＣＲ分析により、これらのイベント特異的なプライマーセットを用い
て生成したＰＣＲアンプリコンを分析することによって、異なるダイズ遺伝子型において
本開示の実施形態のダイズ系統を同定することができることが実証された。これらおよび
他の関連する手順を用いて、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含む
ダイズ系統を一意的に同定することができる。したがって、そのようなプライマー対に由
来するＰＣＲアンプリコンは独特であり、これらのダイズ系統を同定するために使用する
ことができる。
一部の実施形態では、新規の導入遺伝子／ゲノムの挿入領域の連続した断片を含むＤＮ
Ａ配列は本開示の態様である。導入遺伝子挿入断片配列の十分な長さのポリヌクレオチド
および３つの上述のダイズ植物の１つまたは複数由来のダイズのゲノム配列の十分な長さ
のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ配列および／またはこれらのダイズ植物の１つまたは複
数に対して特徴的なアンプリコン産物を生成するためのプライマー配列として有用である
配列が包含される。
関連する実施形態は、本明細書において特定されるＤＮＡ配列（例えば、配列番号１お
よびそのセグメントなど）の導入遺伝子部分の少なくとも１０、１１、１２、１３、１４
、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、またはそれ以
上の連続したヌクレオチドを含むＤＮＡ配列、またはその相補物、およびこれらの配列由
来の同様の長さのダイズの隣接ＤＮＡ配列、またはその相補物に関する。そのような配列
は、ＤＮＡ増幅方法において、ＤＮＡプライマーとして有用である。これらのプライマー
を使用して生成されるアンプリコンは、本明細書で言及されるダイズイベントのいずれか
に対して特徴的である。したがって、本開示の実施形態は、そのようなＤＮＡプライマー
によって生成されるアンプリコンも包含する。
本開示の実施形態は、試料中の、本明細書で言及されるダイズイベントに対応するＤＮ
Ａの存在を検出する方法も包含する。そのような方法は、（ａ）ＤＮＡを含む試料を、こ
れらのダイズイベントの少なくとも１つ由来のＤＮＡを用いた核酸の増幅反応において使
用したとき、前記イベント（複数可）に対して特徴的であるアンプリコンを生成するプラ
イマーセットと接触させるステップと；（ｂ）核酸の増幅反応を実施し、それによって、
アンプリコンを生成するステップと；（ｃ）アンプリコンを検出するステップとを含んで
よい。
本開示の実施形態の別の検出方法は、試料中の、前記イベントに対応するＤＮＡの存在
を検出する方法であって、（ａ）ＤＮＡを含む試料を、ストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション条件下で前記ダイズイベントの由来のＤＮＡとハイブリダイズさせ、ストリン
ジェントなハイブリダイゼーション条件下で対照のダイズ植物（対象のイベントがないＤ
ＮＡ）とハイブリダイズしないプローブと接触させるステップと；（ｂ）試料およびプロ
ーブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供するステップと；（ｃ）プロ
ーブのＤＮＡとのハイブリダイゼーションを検出するステップとを含む方法を包含する。
さらに別の実施形態では、本開示は、本開示の実施形態のダイズイベントｐＤＡＢ９５
８２．８１６．１５．１を含むダイズ植物を作出する方法であって、（ａ）第１の親ダイ
ズ系統（前記系統の植物にグルホシネート耐性を付与する本開示の実施形態の発現カセッ
トを含む）と第２の親ダイズ系統（この除草剤耐性形質を欠く）を有***雑し、それによ
って、複数の後代植物を作出するステップと；（ｂ）分子マーカーを使用することによっ
て後代植物を選択するステップとを含む方法を包含する。そのような方法は、場合によっ
て、後代植物を第２の親ダイズ系統と戻し交雑して、前記昆虫抵抗性およびグルホシネー
ト耐性形質を含む真の育種（true-breeding）ダイズ植物を作出するさらなるステップを
含んでよい。
本開示の別の態様によると、前記イベントを用いて交雑の後代の接合性を決定する方法
が提供される。前記方法は、ダイズＤＮＡを含む試料を本開示の実施形態のプライマーセ
ットと接触させるステップを含んでよい。前記プライマーは、前記ダイズイベント由来の
ゲノムＤＮＡを用いた核酸の増幅反応において使用したとき、前記ダイズイベントに対し
て特徴的である第１のアンプリコンを生成する。そのような方法は、核酸の増幅反応を実
施し、それによって、第１のアンプリコンを生成するステップと；第１のアンプリコンを
検出するステップと；ダイズＤＮＡを含む試料を、第２のプライマーセットと接触させる
ステップと（前記第２のプライマーセットは、ダイズ植物由来のゲノムＤＮＡを用いた核
酸の増幅反応において使用したとき、前記イベントのポリヌクレオチド配列を含まないネ
イティブなダイズのゲノムＤＮＡの内在性配列を含む第２のアンプリコンを生成する）；
核酸の増幅反応を実施し、それによって、第２のアンプリコンを生成するステップとをさ
らに含む。この方法は、第２のアンプリコンを検出するステップと、試料中の第１のアン
プリコンと第２のアンプリコンとを比較するステップであって、両方のアンプリコンが存
在することにより、試料が、導入遺伝子挿入物の接合性を示すステップとをさらに含む。
ＤＮＡ検出キットは、本明細書に開示されている組成物およびＤＮＡの検出の技術分野
で周知の方法を使用して開発することができる。このキットは、試料中の対象のダイズイ
ベントＤＮＡを特定するために有用であり、このＤＮＡを含有するダイズ植物を育種する
ための方法に適用することができる。キットは、例えば、本明細書に開示されているアン
プリコンと相補的であるＤＮＡ配列、または対象イベントの導入遺伝子の遺伝エレメント
に含有されるＤＮＡと相補的であるＤＮＡ配列を含有する。これらのＤＮＡ配列は、ＤＮ
Ａ増幅反応において、またはＤＮＡのハイブリダイゼーション方法においてプローブとし
て、使用することができる。キットは、検出方法を実行するために必要な試薬および材料
も含有することができる。
「プローブ」は、従来の検出可能な標識またはレポーター分子（例えば、放射性同位元
素、リガンド、化学発光剤、または酵素など）を付着させた単離された核酸分子である。
そのようなプローブは、標的核酸の鎖、本開示の実施形態の場合では、ダイズ植物由来で
あるかイベント由来のＤＮＡを含む試料由来であるかにかかわらず、前記ダイズイベント
の１つ由来のゲノムＤＮＡの鎖にハイブリダイズできる。本開示の実施形態によるプロー
ブは、デオキシリボ核酸またはリボ核酸だけでなく、標的ＤＮＡ配列に特異的に結合し、
その標的ＤＮＡ配列の存在を検出するために使用することができるポリアミドおよび他の
プローブ材料も含む。
「プライマー」は、核酸ハイブリダイゼーションによって標的ＤＮＡ鎖とアニーリング
してプライマーと標的ＤＮＡ鎖との間のハイブリッドを形成し、次いでポリメラーゼ、例
えば、ＤＮＡポリメラーゼによって標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長される、単離された／合成
された核酸である。本開示の実施形態のプライマー対は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）または他の従来の核酸の増幅方法によって標的核酸配列を増幅するためのそれ
らの使用を指す。
プローブおよびプライマーは、一般に、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３
、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、
２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４
０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３
、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、
６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８
０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３
、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１
０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１
１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１
２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１
３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１
４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１
５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１
６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１
７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１
８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１
９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２
０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２
１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２
２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２
３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２
４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２
５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２
６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２
７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２
８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２
９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３
０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３
１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３
２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３
３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３
４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３
５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３
６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３
７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３
８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３
９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４
０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４
１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４
２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４
３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４
４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４
５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４
６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４
７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４
８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４
９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、または１０００または２０００または
５０００ポリヌクレオチドまたはそれ以上の長さである。そのようなプローブおよびプラ
イマーは、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で標的配列と特異的にハイブ
リダイズする。好ましくは、本開示の実施形態によるプローブおよびプライマーは、標的
配列と完全な配列類似性を有するが、標的配列とは異なり、標的配列とハイブリダイズす
る能力を保持するプローブを従来の方法によって設計することができる。
プローブおよびプライマーを調製し、使用するための方法は、例えば、Molecular Clon
ing: A Laboratory Manual、第2版、1〜3巻Sambrookら編、Cold Spring Harbor Laborato
ry Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、1989年に記載されている。ＰＣＲのプライマー対
は、公知の配列から、例えば、その目的のためのコンピュータプログラムを使用すること
によって得ることができる。
本明細書に開示されている隣接ＤＮＡおよび挿入断片の配列に基づくプライマーおよび
プローブを使用して、従来の方法によって、例えば、そのような配列を再クローニングし
、配列決定することによって、開示されている配列を確認すること（および、必要であれ
ば、補正すること）ができる。
本開示の実施形態の核酸プローブおよびプライマーは、ストリンジェントな条件下で標
的ＤＮＡ配列とハイブリダイズする。任意の従来の核酸ハイブリダイゼーションまたは増
幅の方法を使用して、試料中のトランスジェニックイベント由来のＤＮＡの存在を特定す
ることができる。核酸分子またはその断片は、ある特定の状況下で他の核酸分子と特異的
にハイブリダイズすることができる。本明細書で使用される場合、２つの核酸分子は、２
つの分子が、逆平行の、二本鎖核酸構造を形成することができる場合、互いと特異的にハ
イブリダイズすることができると言える。核酸分子は、別の核酸分子と完全な相補性を示
す場合、その「相補物」であると言える。本明細書で使用される場合、分子は、分子の一
方のあらゆるヌクレオチドが、他方のヌクレオチドと相補的である場合、「完全な相補性
」を示すと言える。完全な相補性を示す分子は、一般に、従来の「高ストリンジェンシー
」条件下で互いにアニーリングしたままであることが可能になるのに十分な安定性で互い
とハイブリダイズする。従来の高ストリンジェンシー条件はSambrookら、1989年に記載さ
れている。
２つの分子は、少なくとも従来の「低ストリンジェンシー」条件下で、互いとアニーリ
ングしたままであることを可能にするために十分な安定性で互いとハイブリダイズするこ
とができる場合、「最小相補性」を示す。従来の低ストリンジェンシー条件は、Sambrook
ら、1989年に記載されている。核酸分子がプライマーまたはプローブとしての機能を果た
すためには、用いる特定の溶媒および塩濃度の下で安定な二本鎖構造を形成できるために
配列と最小相補性があると示すことのみが必要である。
用語「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェンシー条件」は、Sambrookら、
1989年、9.52〜9.55において考察されている特定のハイブリダイゼーション手順による、
核酸プローブの標的核酸（すなわち、対象とする特定の核酸配列）とのハイブリダイゼー
ションに関して機能的に定義される。Sambrookら、1989年、9.47〜9.52および9.56〜9.58
も参照されたい。
構想される適用に応じて、標的配列に対するハイブリダイゼーションの選択性のさまざ
まな程度を実現するために、ストリンジェントな条件のさまざまな条件またはプローブも
しくはプライマーのポリヌクレオチド配列の縮重を使用することができる。高い選択性を
必要とする適用のために、一般には、あるポリヌクレオチド配列と第２のポリヌクレオチ
ド配列をハイブリダイズさせるために比較的ストリンジェントな条件を用いることがある
。例えば、約５０℃〜約７０℃の温度で約０．０２Ｍ〜約０．１５ＭのＮａＣｌによって
もたらされるような比較的低塩かつ／または高温の条件を選択することがある。ストリン
ジェントな条件は、例えば、ハイブリダイゼーション濾過器を高ストリンジェンシー洗浄
緩衝液（０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、６５℃）で少なくとも２回洗浄することを
伴ってよい。ＤＮＡのハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件
、例えば、約４５℃で６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、その後
５０℃で２．０×ＳＳＣで洗浄することは、当業者に公知である。例えば、洗浄ステップ
における塩濃度は、低ストリンジェンシーである５０℃で約２．０×ＳＳＣから高ストリ
ンジェンシーである５０℃で約０．２×ＳＳＣまでから選択することができる。さらに、
洗浄ステップにおける温度は、低ストリンジェンシー条件である室温、約２２℃から高ス
トリンジェンシー条件である約６５℃まで増加させることができる。温度と塩との両方が
変動してよい、または、温度もしくは塩濃度のいずれかは、他方の変数が変化する一方で
一定に保たれてよい。そのような選択的な条件は、もしあれば、プローブと鋳型または標
的鎖との間のミスマッチを少し容認する。ハイブリダイゼーションによってＤＮＡ配列を
検出することは当業者に周知であり、米国特許第４，９６５，１８８号および同第５，１
７６，９９５号の教示は、ハイブリダイゼーション分析の方法の例である。
特に好ましい実施形態では、本開示の実施形態の核酸は、高ストリンジェンシー条件下
で、本明細書において例証または提案される、その相補物および断片を含めたプライマー
（またはアンプリコンもしくは他の配列）の１つまたは複数と特異的にハイブリダイズす
る。本開示の一態様では、本開示の実施形態のマーカー核酸分子は、本明細書において例
示された配列の１つに記載されている核酸配列、またはその相補物および／もしくは断片
を有する。
本開示の別の態様では、本開示の実施形態のマーカー核酸分子は、そのような核酸配列
と、８０％から１００％の間または９０％未満から１００％の間の配列同一性を共有する
。本開示の別の態様では、本開示の実施形態のマーカー核酸分子は、そのような配列と９
５％から１００％の間の配列同一性を共有する。そのような配列は、遺伝的交雑の後代を
特定するための植物育種方法において、マーカーとして使用することができる。プローブ
の標的ＤＮＡ分子とのハイブリダイゼーションは、当業者に公知の任意の数の方法によっ
て検出することができ；それらとしては、これらに限定されないが、蛍光タグ、放射性タ
グ、抗体ベースのタグおよび化学発光タグを挙げることができる。
特定の増幅プライマー対を使用する標的核酸配列の増幅（例えば、ＰＣＲによる）に関
して、「ストリンジェントな条件」は、プライマー対が、対応する野生型配列（またはそ
の相補物）を有するプライマーが結合し得る標的核酸配列のみとハイブリダイズすること
、および好ましくは特有の増幅産物、アンプリコンを生成することを可能にする条件であ
る。
用語「（標的配列）に特異的な」は、プローブまたはプライマーが、ストリンジェント
なハイブリダイゼーション条件下で、標的配列を含む試料中の標的配列のみとハイブリダ
イズすることを示す。
本明細書で使用される場合、「増幅されたＤＮＡ」または「アンプリコン」は、核酸鋳
型の一部である標的核酸配列の核酸増幅産物を指す。例えば、有***雑によって生じたダ
イズ植物が、本開示の実施形態のダイズ植物由来のトランスジェニックイベントゲノムＤ
ＮＡを含有するかどうかを決定するために、ダイズ植物の組織試料から抽出したＤＮＡを
、挿入された異種ＤＮＡの挿入部位の近接する植物のゲノム内の隣接配列に由来するプラ
イマー、および挿入された異種ＤＮＡに由来する第２のプライマーを含むプライマー対を
使用して、イベントＤＮＡの存在に対して特徴的であるアンプリコンを生成する核酸の増
幅方法に供することができる。アンプリコンは、ある長さであり、同じくイベントに対し
て特徴的である配列を有する。アンプリコンの長さは、プライマー対の全て合わせた長さ
足す１ヌクレオチド塩基対、および／またはプライマー対の全て合わせた長さ足す約２、
３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８
、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、
３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４
５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８
、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、
７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８
５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８
、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、
１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、
１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、
１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、
１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、
１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、
１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、
１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、
１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、
１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、
１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、
２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、
２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、
２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、
２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、
２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、
２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、
２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、
２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、
２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、
２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、
３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、
３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、
３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、
３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、
３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、
３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、
３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、
３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、
３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、
３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、
４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、
４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、
４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、
４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、
４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、
４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、
４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、
４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、
４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、
４９９、または５００、７５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、
またはそれ以上のヌクレオチド塩基対（上に列挙されている増大のいずれかを足すまたは
引く）にわたってよい。あるいは、プライマー対は、挿入断片のヌクレオチド配列全体を
含むアンプリコンが生成されるように、挿入ＤＮＡの両側の隣接配列に由来してもよい。
植物のゲノム配列に由来するプライマー対のメンバーは、挿入ＤＮＡ配列からある距離に
位置してよい。この距離は、１ヌクレオチド塩基対から最大約２万ヌクレオチド塩基対ま
でにわたることができる。用語「アンプリコン」の使用は、ＤＮＡの熱増幅反応において
形成される可能性があるプライマー二量体を特に除外する。
核酸の増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含めた当技術分野で公知の種々の核
酸の増幅方法のいずれかによって実現することができる。種々の増幅方法が当技術分野で
公知であり、とりわけ、米国特許第４，６８３，１９５号および米国特許第４，６８３，
２０２号に記載されている。２２ｋｂに至るまでのゲノムＤＮＡを増幅するためにＰＣＲ
増幅方法が開発されてきた。これらの方法ならびにＤＮＡ増幅の技術分野で公知の他の方
法を、本開示の実施形態の実施において使用することができる。本明細書において提供さ
れる配列に由来するプライマーを使用してイベントからそのような配列を増幅し、その後
ＰＣＲアンプリコンまたはクローニングされたＤＮＡの標準のＤＮＡ配列決定を行うこと
により、本主題のダイズイベント由来の異種導入遺伝子ＤＮＡ挿入断片の配列または隣接
ゲノム配列を検証すること（および必要であれば、補正すること）ができる。
これらの方法によって生成されるアンプリコンは、複数の技法によって検出することが
できる。アガロースゲル電気泳動および臭化エチジウムを用いた染色は、ＤＮＡアンプリ
コンを検出する周知の一般的な方法である。別のそのような方法は、近接する隣接ゲノム
ＤＮＡ配列および挿入ＤＮＡ配列の両方とオーバーラップするＤＮＡオリゴヌクレオチド
を設計する遺伝子ビット分析（Genetic Bit Analysis）である。オリゴヌクレオチドは、
マイクロウェルプレートのウェル内に固定化されている。対象の領域のＰＣＲ後（挿入配
列内の１つのプライマーおよび近接する隣接ゲノム配列内の１つのプライマーを使用する
）、一本鎖のＰＣＲ産物は、固定化されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、ＤＮ
Ａポリメラーゼおよび予測される次の塩基に特異的な標識したｄｄＮＴＰを使用する一塩
基伸長反応の鋳型としての機能を果たし得る。結合した産物の分析は、蛍光シグナルの量
の定量化によって完了することができる。蛍光信号により、上首尾の増幅、ハイブリダイ
ゼーション、および一塩基伸長に起因して、挿入断片／隣接配列が存在することが示され
る。
別の方法は、Winge（Innov. Pharma. Tech. 00巻:18〜24頁、2000年）に記載されてい
るようなパイロシークエンス技法である。この方法では近接するゲノムＤＮＡと挿入ＤＮ
Ａの接合部とオーバーラップするオリゴヌクレオチドを設計する。このオリゴヌクレオチ
ドを、対象の領域（挿入配列内の１つのプライマーおよび隣接ゲノム配列内の１つのプラ
イマー）由来の一本鎖のＰＣＲ産物とハイブリダイズさせるために設計された、ＤＮＡポ
リメラーゼ、ＡＴＰ、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン５’−
ホスホ硫酸およびルシフェリンの存在下でインキュベートする。ｄＮＴＰを個々に加え、
それが取り込まれた結果、測定される光信号がもたらされる。光信号により、増幅、ハイ
ブリダイゼーション、および単一塩基または多塩基の伸長が上首尾であり、したがって導
入遺伝子挿入断片／隣接配列が存在することが示される。
蛍光偏光は、本開示の実施形態のアンプリコンを検出するために使用することができる
別の方法である。この方法に従って、オリゴヌクレオチドを、ゲノムの隣接ＤＮＡと挿入
ＤＮＡの接合部とオーバーラップするように設計する。このオリゴヌクレオチドを、対象
の領域（挿入ＤＮＡ内の１つのプライマーおよび隣接ゲノムＤＮＡ配列内の１つのプライ
マー）由来の一本鎖のＰＣＲ産物とハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光
標識したｄｄＮＴＰの存在下でインキュベートする。一塩基伸長により、ｄｄＮＴＰが取
り込まれる。蛍光標識したｄｄＮＴＰの取り込みは、蛍光光度計を使用して偏光の変化と
して測定することができる。偏光の変化は、増幅、ハイブリダイゼーション、および一塩
基伸長の成功によって、導入遺伝子挿入断片／隣接配列が存在することを示す。
ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、Ｆｏｓｔｅ
ｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）は、ＤＮＡ配列の存在を検出し、定量する方法である。簡
単に述べると、ゲノムの隣接と挿入ＤＮＡの接合部とオーバーラップするＦＲＥＴオリゴ
ヌクレオチドプローブを設計する。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入ＤＮ
Ａ配列内の１つのプライマーおよび隣接ゲノム配列内の１つのプライマー）を、耐熱性ポ
リメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下でサイクルにかける。特異的な増幅の間に、Ｔａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ校正機構により、ＦＲＥＴプローブ上のクエンチング部分から蛍光部
分が放出される。蛍光シグナルは、増幅およびハイブリダイゼーションの成功によって、
隣接配列／導入遺伝子挿入断片配列が存在することを示す。
ポリヌクレオチド配列の検出において使用するための分子ビーコンが記載されている。
簡単に述べると、隣接ゲノムＤＮＡと挿入ＤＮＡの接合部とオーバーラップするＦＲＥＴ
オリゴヌクレオチドプローブを設計する。ＦＲＥＴプローブの独特の構造により、蛍光部
分およびクエンチング部分が極めて近傍に保たれる二次構造が含有される。ＦＲＥＴプロ
ーブおよびＰＣＲプライマー（挿入ＤＮＡ配列内の１つのプライマーおよび隣接ゲノム配
列内の１つのプライマー）を、耐熱性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下でサイクルに
かける。ＰＣＲ増幅が上手くいった後、ＦＲＥＴプローブが標的配列にハイブリダイズす
ることにより、プローブの二次構造が除去され、蛍光部分およびクエンチング部分が空間
的に分離される。蛍光シグナルが結果として生じる。蛍光シグナルは、増幅およびハイブ
リダイゼーションの成功によって、隣接ゲノム配列／導入遺伝子挿入断片配列が存在する
ことを示す。
ダイズゲノム内の挿入するために優れた位置を開示し、本開示の実施形態は、この遺伝
子位置の概ね近くに少なくとも１つの非ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５
．１挿入断片を含むダイズ種子および／またはダイズ植物も含む。１つの選択肢は、本明
細書において例示されているダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１挿入断
片を異なる挿入断片で置換することである。一般的には、例えば、特定の実施形態におい
て、標的化相同組換えが使用される。この種類の技術は、例えば、ＷＯ０３／０８０８０
９Ａ２および対応する公開された米国特許出願（Ｕ．Ｓ．２００３０２３２４１０）の主
題である。したがって、本開示の実施形態は、本明細書において同定される隣接配列の全
てまたは認識できる部分が隣接する異種挿入断片（多コピーのｃｒｙ１Ｆ、ｃｒｙ１Ａｃ
またはｐａｔ遺伝子の代わりにまたはそれと一緒に）を含む植物および植物細胞を包含す
る（配列番号１のｂｐ１−１２７３および配列番号２のｂｐ１７６−１６８７）。ｃｒｙ
１Ｆ、ｃｒｙ１Ａｃまたはｐａｔの１つの追加的なコピー（または複数の追加的なコピー
）も、この／これらのように挿入の標的とすることができる。
本明細書において言及または引用された全ての特許、特許出願、仮出願、および刊行物
は、それらが本明細書の明確な教示と相反しない限りは、それらの全体が参照により本明
細書に組み込まれる。以下の実施例は、本開示の実施形態を実施するための手順を例示す
るため、および本開示のある特定の好ましい実施形態を実証するために含まれる。これら
の実施例は、限定するものと解釈されるべきではない。当業者には、以下の実施例に開示
されている技法は、それを実施するための好ましい方式を例示するために使用される特定
の手法を表していることが理解されたい。しかし、当業者には、本開示に照らして、本開
示の精神および範囲から逸脱することなく、なお同様または類似の結果を得ながら、これ
らの特定の実施形態において多くの変更を行うことができることが理解されたい。別段の
指定のない限り、全ての百分率は重量により、特に断りのない限り、全ての溶媒混合物の
割合は体積による。
別段の指定のない限り、以下の略語が使用されている。
ｂｐ 塩基対
℃ 摂氏温度
ＤＮＡ デオキシリボ核酸
ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸
ｋｂ キロベース
μｇ マイクログラム
μＬ マイクロリットル
ｍＬ ミリリットル
Ｍ モル質量
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＴＵ 植物転写単位または発現カセット
ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＳＣ 塩化ナトリウムとクエン酸ナトリウムとの混合物を含有する緩衝溶液、ｐＨ７．
０
ＴＢＥ トリス塩基、ホウ酸およびＥＤＴＡの混合物を含有する緩衝溶液、ｐＨ８．３．
（実施例）
ｃｒｙ１Ｆ、ｃｒｙ１ＡｃおよびＰＡＴダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１
５Ｊの形質転換および選抜
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含むトランスジェニックダイズ
（Glycine max）を、ダイズ子葉節の外植片をアグロバクテリウム媒介形質転換によって
生成した。Ｔ鎖ＤＮＡ領域内に選抜マーカー、ｐａｔｖ６および対象の遺伝子ｃｒｙ１Ｆ
ｖ３およびｃｒｙ１ Ａｃ ｓｙｎｐｒｏを含むバイナリーベクターｐＤＡＢ９５８２（
図１）を保有する武装解除したアグロバクテリウム株ＥＨＡ１０１（Hoodら、1993年）を
使用して形質転換を開始した。ｐＤＡＢ９５８２のＴ鎖ＤＮＡ配列は配列番号３に示され
、下の表１において注釈を付けている。
Zengら（2004年）の手順を改変して用いてアグロバクテリウム媒介形質転換を行った。
簡単に述べると、ダイズ種子（Ｍａｖｅｒｉｃｋ栽培品種）を基本培地上で発芽させ、子
葉節を単離し、アグロバクテリウムに感染させた。アグロバクテリウムを除去するために
、苗条誘導（shoot initiation）培地、苗条伸長培地、および発根培地にセフォタキシム
、チメンチンおよびバンコマイシンを補充した。グルホシネートによる選択を使用して、
形質転換されていない苗条の生長を阻害した。選択された苗条を、根を発生させるために
発根培地に移し、次に、小植物を順化させるために土壌混合物に移した。
選択された小植物の頂小葉にグルホシネートを塗布して推定形質転換体についてスクリ
ーニングした。スクリーニングされた小植物を温室に移して、気候順化させ、次に葉にグ
ルホシネートを塗布して耐性を再確認し、推定形質転換体であるとみなした。スクリーニ
ングされた植物の試料を採取し、選択マーカー遺伝子および／または対象の遺伝子を確認
するための分子解析を行った。Ｔ０植物を温室内で自家受精させてＴｉ種子を生じさせた
。
このイベント、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１は、独立した形質
転換分離株から生成した。Ｔｉ植物を戻し交雑し、その後の世代にわたって優良品種に遺
伝子移入した。イベントをその独特の特性、例えば、単一の挿入部位、正常なメンデル分
離、安定発現、ならびに昆虫抵抗性、除草剤耐性および農業生産力を含めた効力の優れた
組合せに基づいて選抜した。以下の実施例は、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６
．１５．１を特徴付けるために使用したデータを含有する。
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５Ｊにおけるタンパク質の発現の特徴付
け
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１において発現させた組換え型のＣ
ｒｙ１Ｆタンパク質、Ｃｒｙ１Ａｃタンパク質、およびＰＡＴタンパク質の生化学的性質
を特徴付けた。定量的酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）は、タンパク質の生化学的
性質を特徴付け、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１におけるこれらの
タンパク質の発現を確認するために用いることができる、当技術分野の範囲内で公知の生
化学的アッセイである。
実施例２．１：植物組織におけるＰＡＴタンパク質、Ｃｒｙ１Ｆタンパク質、およびＣ
ｒｙ１Ａｃタンパク質の発現
ダイズ組織の試料を試験植物から単離し、発現を解析するために調製した。０．５％ウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する界面活性剤Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）を含有
するリン酸緩衝生理食塩水溶液を用いてダイズ植物の組織からＰＡＴタンパク質を抽出し
た。植物組織を遠心分離し、水性上清を収集し、必要に応じて適切な緩衝液で希釈し、Ｐ
ＡＴ ＥＬＩＳＡキットをサンドイッチ形式で使用して解析した。キットは製造者（Ｅｎ
ｖｉｒｏｌｏｇｉｘ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＭＥ）の推奨プロトコールに従って使用した。
このアッセイにより、発現されたＰＡＴタンパク質の濃度を測定した。
界面活性剤Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水溶液を用い
てダイズ植物の組織からＣｒｙ１Ｆタンパク質を抽出した。植物組織を遠心分離し、水性
上清を収集し、必要に応じて適切な緩衝液で希釈し、Ｃｒｙ１Ｆ ＥＬＩＳＡキットをサ
ンドイッチ形式で使用して解析した。キットは製造者（Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ Ｄｉａｇｎ
ｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．、Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ）の推奨プロトコールに従って使用した。
このアッセイにより、発現されたＣｒｙ１Ｆタンパク質の濃度を測定した。
０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する界面活性剤Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢ
ＳＴ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水溶液を用いてダイズ植物の組織からＣｒｙ１Ａｃ
タンパク質を抽出した。植物組織を遠心分離し、水性上清を収集し、必要に応じて適切な
緩衝液で希釈し、Ｃｒｙ１Ａｃ ＥＬＩＳＡキットをサンドイッチ形式で使用して解析し
た。キットは製造者（Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ
ａｒｋ、ＤＥ）の推奨プロトコールに従って使用した。このアッセイにより、発現したＣ
ｒｙ１Ａｃタンパク質の濃度を測定した。
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１において、検出解析を実施して発
現の安定性および遺伝性を垂直方向（世代間）および水平方向（世代内の系列間）の両方
で調査した。
実施例２．２：植物組織におけるＣｒｙ１Ｆタンパク質、Ｃｒｙ１Ａｃタンパク質およ
びＰＡＴタンパク質の発現
上記のプロトコルを使用してダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１にお
けるＣｒｙ１Ｆタンパク質、Ｃｒｙ１Ａｃタンパク質およびＰＡＴタンパク質のレベルを
決定した。ダイズの葉組織から、可溶性の抽出可能なタンパク質を、定量的酵素結合免疫
吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）方法を使用して測定した。Ｔ２〜Ｔ６世代のダイズイベントｐ
ＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１で発現は安定であり（分離性でない）、系列全てにわ
たって一貫していた。表２に、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１にお
けるトランスジェニックタンパク質の平均発現レベルが列挙されている。
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の挿入断片および隣接境界領域に
おけるＤＮＡ配列のクローニングおよび特徴付け
ゲノムの挿入部位を特徴付け、説明するために、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８
１６．１５．１の隣接ゲノムＴ−ＤＮＡ境界領域の配列を決定した。１２７３ｂｐの５’
隣接境界配列（配列番号１）および１３７１ｂｐの３’隣接境界配列（配列番号２）を含
むダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１のゲノム配列を確認した。ダイズ
イベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の境界配列に基づくＰＣＲ増幅により、境
界領域がダイズ起源であること、および接合領域がダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８
１６．１５．１に独特の配列であることが検証された。接合領域をダイズイベントｐＤＡ
Ｂ９５８２．８１６．１５．１のイベント特異的な同定のために使用することができる。
さらに、Ｔ鎖の挿入部位を、形質転換されていないダイズのゲノム由来の同定された隣接
境界配列の領域に対応するゲノムの断片を増幅することによって特徴付けた。ダイズイベ
ントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を形質転換されていないゲノム配列と比較する
ことにより、Ｔ鎖の組み込みの間に元の遺伝子座から約２１ｂｐが欠失したことが明らか
になった。全体的に、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の挿入断片お
よび境界配列を特徴付けることにより、ｐＤＡＢ９５８２由来のＴ鎖のインタクトなコピ
ーがダイズゲノム内に存在することが示された。
実施例３．１：ダイズのゲノム配列の確認
５’隣接境界および３’隣接境界を第０３染色体由来のダイズ（Glycine max）全ゲノ
ムショットガン配列に対しアラインメントし、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６
．１５．１の導入遺伝子がダイズゲノムの第０３染色体に挿入されたことが示されている
。ダイズゲノムからダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の挿入部位を確
認するために、異なるプライマー対を用いてＰＣＲを行った（図２、表３、表４、および
表５）。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１由来のゲノムＤＮＡおよび
他のトランスジェニックダイズ系統または非トランスジェニックダイズ系統由来のゲノム
ＤＮＡを鋳型として使用した。５’境界配列が正確であることを確認するために、Ａｔ
Ｕｂｉ１０プロモーター遺伝子エレメント、例えば、ＡｔＵｂｉ１ＯＲＶ１に結合するよ
うに設計したプライマー、および、ダイズゲノムの第０３染色体上のクローニングされた
５’末端境界に結合するように設計したプライマー、８１６１５＿ＦＷ２と称されるプラ
イマーを、Ａｔ Ｕｂｉ１Ｏプロモーター遺伝子エレメントから５’末端境界配列にわた
るＤＮＡセグメントを増幅するために使用した。同様に、クローニングされた３’境界配
列を確認するために、ｐａｔ特異的なプライマー、例えば、３’ＰＡＴＥｎｄ０５、なら
びに、８１６１５＿ＲＶ１および８１６１５＿ＲＶ２と称される、クローニングされた３
’末端境界配列に従って設計したプライマーを、ｐａｔ遺伝子から３’境界配列にわたる
ＤＮＡセグメントを増幅するために使用した。予測されたサイズを有するＤＮＡ断片は、
各プライマー対を用いたダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１のゲノムＤ
ＮＡからのみ増幅されたが、他のトランスジェニックダイズ系統または非トランスジェニ
ック対照由来のＤＮＡ試料からは増幅されなかった。結果は、クローニングされた５’境
界配列および３’境界配列が、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１のＴ
鎖挿入断片の隣接境界配列であることを示している。
ダイズゲノム内のＤＮＡ挿入物をさらに確認するために、ダイズイベントｐＤＡＢ９５
８２．８１６．１５．１のＴ鎖挿入断片を含有しないゲノムＤＮＡにおいてダイズ境界配
列にわたるＰＣＲ増幅を完了した。５’末端境界配列に従って設計したプライマー８１６
１５＿ＦＷ２、および３’末端境界配列に対して設計した１つのプライマー８１６１５−
ＲＶ３を使用して、ｐＤＡＢ９５８２Ｔ鎖が組み込まれた遺伝子座を含有したＤＮＡセグ
メントを増幅した。予測通り、８１６１５＿ＦＷ２および８１６１５＿ＲＶ３のプライマ
ー対を用いて完了したＰＣＲ反応により、全ての他のダイズ対照系統からおよそ１．８ｋ
ｂのＤＮＡ断片が生じたが、ｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１からは生じなかった。
同定されたダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の５’境界配列および３
’境界配列を第０３染色体由来のダイズ（Glycine max）全ゲノムショットガン配列とア
ラインメントすることにより、元の遺伝子座からの約２１ｂｐの欠失が明らかになった（
図３）。これらの結果により、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の導
入遺伝子がダイズゲノムの第０３染色体の部位に挿入されたことが実証された。
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１のサザンブロットによる特徴付け
サザンブロット分析を使用して、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１
の組み込みパターンを確立した。これらの実験により、ｃｒｙ１Ａｃおよびｃｒｙ１Ｆ導
入遺伝子のダイズゲノム内への組み込みおよびその完全性を実証するデータが生成した。
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１は、プラスミドｐＤＡＢ９５８２由
来のｃｒｙ１Ａｃおよびｃｒｙ１Ｆ ＰＴＵの単一コピーを含有する全長の、単純な組み
込みイベントであると特徴付けられた。
サザンブロットのデータにより、Ｔ鎖断片がダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６
．１５．１のゲノムに挿入されたことが示唆された。詳細なサザンブロット分析を、ｐＤ
ＡＢ９５８２．８１６．１５．１のＴ鎖組み込み領域に含有されるｃｒｙ１Ａｃおよびｃ
ｒｙ１Ｆ遺伝子に特異的なプローブ、およびプラスミド内に位置する切断部位を有し、プ
ラスミドまたはプラスミドとダイズのゲノムＤＮＡの接合部にわたる断片（境界断片）内
にハイブリダイズ断片を生じる説明的な制限酵素を使用して行った。サザンハイブリダイ
ゼーションによって示された制限酵素とプローブの組合せについての分子量は、このイベ
ントに独特であり、その同定パターンを確立した。これらの分析により、ｃｒｙ１Ａｃお
よびｃｒｙ１ＦＰＴＵの再配置を伴わずにプラスミド断片がダイズのゲノムＤＮＡに挿入
されたことも示された。
実施例４．１
ダイズの葉の試料の収集およびゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の単離
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含有する個々のダイズ植物から
回収した葉組織からゲノムＤＮＡを抽出した。さらに、ｃｒｙ１Ａｃおよびｃｒｙ１Ｆ遺
伝子が存在しない物質系統の代表である遺伝的背景を含有する従来のダイズ植物であるＭ
ａｖｅｒｉｃｋからｇＤＮＡを単離した。標準のＣＴＡＢ法の後、凍結乾燥した葉組織か
ら個々のゲノムＤＮＡを抽出した。抽出した後、ＤＮＡを、Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ試薬（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して分光蛍光分析によって定量
した。
実施例４．２
ＤＮＡの消化および分離
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１をサザンブロットによって分子キ
ャラクタリゼーションするために、１０マイクログラム（１０μｇ）のゲノムＤＮＡを消
化した。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１および非トランスジェニッ
クダイズ系統であるＭａｖｅｒｉｃｋ由来のゲノムＤＮＡを、各ＤＮＡ試料にＤＮＡ１μ
ｇ当たりおよそ５ユニットの選択された制限酵素および対応する反応緩衝液を加えること
によって消化した。各試料を、およそ３７℃で一晩インキュベートした。単独消化のため
に、制限酵素ＡｓｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｓｉＩ、およびＮｄｅＩを個々に使用した（
Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）。二重消化のために
制限酵素ＮｏｔＩおよびＡｐａＬＩを一緒に使用した（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ
Ｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）。さらに、陽性ハイブリダイゼーション対照試料を、
プラスミドＤＮＡであるｐＤＡＢ９５８２を非トランスジェニックダイズ品種であるＭａ
ｖｅｒｉｃｋ由来のゲノムＤＮＡと混ぜ合わせることによって調製した。プラスミドＤＮ
Ａ／ゲノムＤＮＡ反応混液を、試験試料の場合と同じ手順および制限酵素を用いて消化し
た。
消化物を一晩インキュベートした後、Ｑｕｉｃｋ−Ｐｒｅｃｉｐ Ｐｌｕｓ ｓｏｌｕ
ｔｉｏｎ（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）２５μ
Ｌを加え、消化されたＤＮＡ試料を、イソプロパノールを用いて沈澱させた。沈澱したＤ
ＮＡペレットを、１×ローディング緩衝液（０．０１％ブロモフェノールブルー、１０．
０ｍＭのＥＤＴＡ、１０．０％グリセロール、１．０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５）１５μ
Ｌに再懸濁させた。次いで、ＤＮＡ試料および分子サイズマーカーを、０．４×ＴＡＥ緩
衝液（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を用いた０
．８５％未満のアガロースゲルにより、３５ボルトでおよそ１８〜２２時間、電気泳動し
て断片の分離を実現した。ゲルを臭化エチジウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂ
ａｄ、ＣＡ）で染色し、ＤＮＡを紫外線（ＵＶ）の下で可視化した
実施例４．３
サザン転写およびメンブレン処理
サザンブロット分析を基本的にＭｅｍｅｌｉｎｋら（１９９４年）に記載されている通
り実施した。簡単に述べると、ＤＮＡ断片を電気泳動によって分離し、可視化した後、ゲ
ルを、０．２５ＭのＨＣｌを用い、およそ２０分にわたって脱プリン化し、次いで、変性
溶液（０．４ＭのＮａＯＨ、１．５ＭのＮａＣｌ）におよそ３０分間、その後、中和溶液
（１．５ＭのＮａＣｌ、０．５Ｍのトリス、ｐＨ７．５）に少なくとも３０分間曝露させ
た。ナイロンメンブレンへのサザン転写を、１０×ＳＳＣを伴うウィッキング系を用いて
一晩実施した。転写後、ＵＶ架橋によってＤＮＡをメンブレンに結合させ、その後、メン
ブレンを２×ＳＳＣ溶液で簡単に洗浄した。このプロセスにより、ハイブリダイゼーショ
ンのためのサザンブロットメンブレンの準備ができた。
実施例４．４
ＤＮＡプローブの標識化およびハイブリダイゼーション
標識したプローブを使用してナイロンメンブレンに結合したＤＮＡ断片を検出した（表
６）。ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識されたヌクレオチド［ＤＩＧ−１１］−ｄＵＴＰを
、遺伝子エレメントに特異的なプライマーを使用してプラスミドｐＤＡＢ９５８２から増
幅されたＤＮＡ断片にＰＣＲに基づいて組み込むことによってプローブを生成した。ＰＣ
Ｒ合成によるＤＮＡプローブの生成を、ＰＣＲ ＤＩＧ Ｐｒｏｂｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）
を製造者の推奨手順に従って使用して行った。
標識したプローブをアガロースゲル電気泳動によって解析して、それらの質および数量
を決定した。次いで、基本的にＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｒｏｃｈ
ｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）に関して記載されてい
る手順を用いて、特異的な断片を検出するために、所望の量の標識したプローブをナイロ
ンメンブレン上の標的ＤＮＡとハイブリダイズさせるために使用した。簡単に述べると、
固定されたＤＮＡを含有するナイロンメンブレンブロットを２×ＳＳＣで簡単に洗浄し、
ハイブリダイゼーションビン中の予め温めたＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ Ｓｏｌｕｔｉｏ
ｎ２０〜２５ｍＬと、ハイブリダイゼーションオーブン内、およそ４５〜５５℃で約２時
間にわたってプレハイブリダイズさせた。次いで、プレハイブリダイゼーション溶液をデ
カントし、サーマルサイクラー中でおよそ５分間加熱することによって変性させた所望の
量の特異的なプローブを含有する予め温めたＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ Ｓｏｌｕｔｉｏ
ｎ約１５ｍＬと交換した。次いで、ハイブリダイゼーションステップをハイブリダイゼー
ションオーブン内、およそ４５〜５５℃で一晩行った。
プローブハイブリダイゼーションの最後に、プローブを含有するＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈ
ｙｂ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを清潔なチューブ内にデカントし、およそ−２０℃で保管した。
これらのプローブは、製造者の推奨手順に従って２回再使用することができた。メンブレ
ンブロットを簡単にすすぎ、清潔なプラスチック容器中で低ストリンジェンシー洗浄緩衝
液（２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）を用いて室温でおよそ５分にわたって２回洗浄し、そ
の後、高ストリンジェンシー洗浄緩衝液（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）を用いて２
回、それぞれおよそ６５℃で１５分間洗浄した。メンブレンブロットを、ＤＩＧ Ｗａｓ
ｈ ａｎｄ Ｂｌｏｃｋ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ
、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）の１×マレイン酸緩衝液を用いておよそ５分にわた
って簡単に洗浄した。その後、１×ブロッキング緩衝液で２時間にわたってブロッキング
し、同じく１×ブロッキング緩衝液中の抗ＤＩＧ−ＡＰ（アルカリホスファターゼ）抗体
（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）と一緒に最
低でも３０分間インキュベートした。１×洗浄緩衝液を用いて２〜３回洗浄した後、特異
的なＤＮＡプローブはメンブレンブロットに結合したままであり、ＤＩＧ標識されたＤＮ
Ａ標準物質を、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ
、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を製造者の推奨に従って使用して可視化した。１つ
または複数の時点でブロットを化学発光フィルムに曝露させて、ハイブリダイズした断片
を検出し、分子サイズ標準物質を可視化した。フィルムをＡＬＬ−Ｐｒｏ １００ Ｐｌ
ｕｓフィルム現像剤（Ｋｏｎｉｃａ Ｍｉｎｏｌｔａ、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）を用い
て現像し、画像をスキャンした。検出されたバンドの数およびサイズを各プローブについ
て実証した。記載の通りＤＩＧ検出後に可視化されるＤＩＧ−Ｌａｂｅｌｅｄ ＤＮＡ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｒｋｅｒ ＩＩ（ＤＩＧ ＭＷＭ ＩＩ）およ
びＤＩＧ−Ｌａｂｅｌｅｄ ＤＮＡ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｒｋｅｒ
ＶＩＩ（ＤＩＧ ＭＷＭ ＶＩＩ）を使用して、サザンブロット上にハイブリダイズし
た断片サイズを決定した。
実施例４．５
サザンブロットの結果
ｃｒｙ１Ａｃおよびｃｒｙ１ＦＰＴＵの公知の制限酵素部位に基づく、特定の消化物お
よびプローブに関して予測された断片サイズおよび観察された断片サイズが表７に示され
ている。これらの消化およびハイブリダイゼーションから２種類の断片を同定した：公知
の酵素部位がプローブ領域に隣接し、ｃｒｙ１Ａｃおよびｃｒｙ１ＦＰＴＵの挿入領域内
に完全に含有されている内部の断片、および公知の酵素部位がプローブ領域の一端に位置
し、第２の部位がダイズゲノム内にあると予測される境界断片。ほとんどの場合、ＤＮＡ
断片の組み込み部位はそれぞれのイベントに独特であるので、境界断片のサイズはイベン
トごとに変動する。境界断片により、組み込まれたＤＮＡに対して制限酵素部位を位置づ
ける手段およびＤＮＡ挿入物の数を評価する手段がもたらされる。ダイズイベントｐＤＡ
Ｂ９５８２．８１６．１５．１を含有するダイズの多世代に対して完了したサザンブロッ
ト分析により、プラスミドｐＤＡＢ９５８２由来の低コピー、インタクトなｃｒｙ１Ａｃ
およびｃｒｙ１ＦＰＴＵが、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１のダイ
ズゲノムに挿入されたことを示唆するデータがもたらされた。
制限酵素ＡｓｅＩおよびＮｓｉＩは、プラスミドｐＤＡＢ９５８２に独特の制限部位を
結合および分割する。続いて、これらの酵素を、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１
６．１５．１におけるｃｒｙ１Ａｃ遺伝子挿入断片を特徴付けるために選択した。７２８
６ｂｐより大きいまたは９４７９ｂｐより大きい境界断片は、それぞれＡｓｅＩおよびＮ
ｓｉＩで消化した後、プローブとハイブリダイズすることが予測された（表７）。それぞ
れＡｓｅＩおよびＮｓｉＩ消化を使用したとき、約８５００ｂｐおよび１００００より大
きいｂｐの単一のｃｒｙ１Ａｃハイブリダイゼーションバンドが観察された。プローブが
このサイズのバンドにハイブリダイズすることにより、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２
．８１６．１５．１のダイズゲノム内にｃｒｙ１Ａｃ遺伝子に対する単一の挿入部位が存
在することが示唆される。制限酵素ＮｏｔＩおよびＡｐａＬＩを、ｃｒｙ１Ａｃ植物転写
単位（ＰＴＵ、プロモーター／遺伝子／ターミネーター）を含有する断片を放出し、二重
消化をさせるために選択した（表７）。予測された４５５０ｂｐの断片は、ＮｏｔＩおよ
びＡｐａＬＩ二重消化した後、プローブを用いて観察された。酵素を用いてｐＤＡＢ９５
８２．８１６．１５．１試料を消化し、その後プローブとハイブリダイズさせることで得
られた結果により、プラスミドｐＤＡＢ９５８２由来のインタクトなｃｒｙ１ＡｃＰＴＵ
の単一コピーがダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１のダイズゲノムに挿
入されたことが示された。
制限酵素ＮｄｅＩおよびＮｓｉＩは、プラスミドｐＤＡＢ９５８２の制限部位に結合し
、切断する。続いて、これらの酵素を、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５
．１におけるｃｒｙ１Ｆ遺伝子挿入断片を特徴付けるために選択した。５５６９ｂｐより
大きい境界断片および９４７９より大きい境界断片は、それぞれＮｄｅＩおよびＮｓｉＩ
で消化した後、プローブとハイブリダイズすることが予測された（表７）。ＮｄｅＩおよ
びＮｓｉＩを使用したとき、それぞれ約７５００ｂｐおよび１００００ｂｐより大きい単
一のｃｒｙ１Ｆハイブリダイゼーションバンドが観察された。プローブがこのサイズのバ
ンドにハイブリダイズすることにより、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５
．１のダイズゲノム内にｃｒｙ１Ｆ遺伝子に対する単一の挿入部位が存在することが示唆
される。制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩを、ｃｒｙ１Ｆ植物転写単位（ＰＴＵ；プロモーター／
遺伝子／ターミネーター）を含有する断片を放出させるために選択した（表７）。予測さ
れた７７３２ｂｐの断片が、ＨｉｎｄＩＩＩ消化後にプローブを用いて観察された。ｐＤ
ＡＢ９５８２．８１６．１５．１試料を酵素で消化し、その後プローブとハイブリダイズ
させることで得られた結果により、プラスミドｐＤＡＢ９５８２由来のインタクトなｃｒ
ｙ１Ｆ ＰＴＵがダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１のダイズゲノムに
挿入されたことが示された。
実施例４．６：骨格配列が存在しないこと
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１にスペクチノマイシン抵抗性遺伝
子（ｓｐｅｃＫ）、Ｏｒｉ Ｒｅｐエレメントおよび複製開始タンパク質ｔｒｆＡ
（ＴＲｆ Ａエレメント）が存在しないことを検証するために、サザンブロット分析も行
った。適切な陽性対照（ＭａｖｅｒｉｃｋゲノムＤＮＡにｐＤＡＢ９５８２を付加したも
の）および陰性対照（ＭａｖｅｒｉｃｋゲノムＤＮＡ）をサザン分析に含めた場合、スペ
クチノマイシン抵抗性、Ｏｒｉ Ｒｅｐエレメントまたはｔｒｆ Ａエレメントに対する
特異的なハイブリダイゼーションは予測されなかった。ＮｓｉＩ消化し、ｓｐｅｃＲ特異
的なプローブとハイブリダイズさせた後、陽性対照試料（ＭａｖｅｒｉｃｋゲノムＤＮＡ
にｐＤＡＢ９５８２を付加したもの）において、１５３２０ｂｐの、１つの予測されたサ
イズのバンドが観察された。ｓｐｅｃＲプローブは陰性対照の試料およびダイズイベント
ｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の試料とはハイブリダイズしなかった。同様に、Ｎ
ｓｉＩ消化し、ｔｒｆＡプローブとハイブリダイズさせた後、１５３２０ｂｐの、１つの
予測されたサイズのバンドが陽性対照試料（ｐＤＡＢ９５８２プラスｍａｖｅｒｉｃｋ）
において検出されたが、陰性対照の試料およびダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６
．１５．１の試料では検出されなかった。ＮｄｅＩ消化し、ＯｒｉＲｅｐ特異的なプロー
ブとハイブリダイズさせた後、５３２９ｂｐの、別の予測されたサイズのバンドが陽性対
照試料（ＭａｖｅｒｉｃｋゲノムＤＮＡにｐＤＡＢ９５８２を付加したもの）において検
出されたが、陰性対照の試料およびダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１
の試料では検出されなかった。これらのデータは、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８
１６．１５．１にスペクチノマイシン抵抗性遺伝子、Ｏｒｉ Ｒｅｐエレメントおよび複
製開始タンパク質ｔｒｆＡが存在しないことを示している。
農業形質および収量圃場試験ならびに除草剤耐性
反復農業試験を実行して、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の農業
での有効性をヌル同質遺伝子系統であるＭａｖｅｒｉｃｋと比較した。圃場試験の大多数
について、米国全土にわたって地理的に別個の場所に設置し、そこでダイズイベントｐＤ
ＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含有するダイズ品種を栽培した。追加的な圃場試験を
これらの場所の外で完了し、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含有
するダイズ品種を、好ましくない場所で生長させることにより生じる潜在的なストレスに
曝露させるために選択した。少数の圃場試験の中での環境の変動性に起因して、いくつか
の現場では試験を中止した。
実験を、場所ごとの反復数２の完全乱塊法計画（randomized complete block design）
として設定した。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含めて８種をエ
ントリーした。各小区画は作条２つ、長さ１２．５フィートからなり、３０インチ離して
植えた。季節を通して、圃場の小区画を通常の農業習慣の下で維持し、雑草がない状態に
保った。
試験用の種子はプエルトリコにおいて冬の間に冬季苗床で作出した。ダイズイベントｐ
ＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１およびＭａｖｅｒｉｃｋの種子を、種子が原因のいか
なる変動性も最小限にするために同じ苗床で生長させ、同様に処理した。次に、種子を北
アメリカに戻し、そこで包装し、種々の植え付け場所に分配した。季節を通していくつも
の農業特性を測定した。これらの特性およびデータを収集した生長段階は表８に列挙され
ている。
生育期の最後に、全ての場所からのデータを合わせ、全場所にわたる分析を実施した。
ＪＭＰ（登録商標）Ｐｒｏ ９．０．３（ＳＡＳ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を使用してデータ解
析を行った。解析のために混合モデルを使用し、エントリーを固定効果とみなし、場所、
エントリーごとの場所、および反復効果を変量とみなした。この解析からの最小二乗平均
が表９において報告されている。有意なエントリー効果が測定された変数についてはその
後にスチューデントのＴ検定を使用して平均分離（mean separation）を実施して、Ｍａ
ｖｅｒｉｃｋとダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の比較を行った。有
意性を決定するための確率水準はｐ＝０．０５に設定した。
開花までの日数、成熟度および種子１００個の重量を除き、測定された全ての形質につ
いてダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１とＭａｖｅｒｉｃｋの間で同等
性が示された。ダイズイベントｐＤＡＢ．８１６．１５．１はＭａｖｅｒｉｃｋの約２日
後に開花した。２日の遅延は生産者にとって大きな遅延ではなく、作物の生産力を損なう
ものではない。小区画内の植物のおよそ５０％が開花を示した時に小区画の開花とみなし
た。同様に、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５は季節の最後にＭａｖｅｒ
ｉｃｋの１日後に成熟したが、この遅延によって作物の生産力が損なわれるような著しい
農業上の差異は生じなかった。同様に、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５
の種子１００個の重量はＭａｖｅｒｉｃｋと統計学的に異なったが、これによって収量の
有意な減少は生じなかった。結果は、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５が
Ｍａｖｅｒｉｃｋとは発育の仕方が異なり得るが、差異は最小限であり、商業的に生長さ
せたダイズの正常範囲の外には出ないことを示している。
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の除草剤耐性を試験するために、
プエルトリコ、サンタイサベルにおける有効性試験において該イベントを植えた。ダイズ
イベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を作出するために最初に形質転換した栽培
品種Ｍａｖｅｒｉｃｋを各苗床に植え、実験に対照として含めた。Ｔ３苗床の種子はＴ２
段階における単一植物選択から得、Ｔ４苗床の種子はＴ３段階における単一植物選択から
得た。各世代において４系列のイベントを試験した。作条４つの広さ、７．５フィートの
長さの小区画に各系列を植えた。作条間の間隔は３０インチであった。プエルトリコの日
の短さを補償するために、小区画を光の下でおよそ２．５週間にわたって生長させた。各
苗床にグルホシネートを４１１ｇ ａｅ／ｈａの比率で噴霧した。対照植物であるＭａｖ
ｅｒｉｃｋの１つの小区画に、グルホシネートを同じ比率で噴霧し、第２の小区画には噴
霧せず、イベントに対する対照比較として使用した。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．
８１６．１５．１はグルホシネート除草剤施用に対する耐性を示した。対照的に、除草剤
処理に対して耐性のＭａｖｅｒｉｃｋ植物は存在しなかった。
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１についての殺虫活性の特徴付け
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１のＣｒｙ１Ａｃタンパク質および
Ｃｒｙ１Ｆタンパク質によってもたらされる、アンチカルシア・ゲムマタリス（Anticars
ia gemmatalis）（ハッショウマメイモムシ）、シュードプルシア・インクルデンス（Pse
udoplusia includens）（ダイズシャクトリムシ）、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodo
ptera frugiperda）（ツマジロクサヨトウ（fall armyworm））およびヘリオチス・ビレ
センス（Heliothis virescens）（タバコバッドワーム（tobacco budworm））を含めた鱗
翅目の昆虫を含めたダイズ害虫からの植物の保護のレベルを特徴付けるために、圃場およ
び温室での評価を行った。
およそ４週齢の植物に対して温室試験を行った。１５の植物を使用してダイズイベント
ｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１およびＭａｖｅｒｉｃｋ対照を評価した。試験した
各昆虫種（Ａ．ゲムマタリス（A. gemmatalis）、Ｐ．インクルデス（P. includes）、お
よびＳ．フルギペルダ（S. frugiperda）新生幼虫）について、合計４５のリーフディス
ク／植物／昆虫種のために各植物から３つのリーフディスクを切り取った。１．４ｃｍの
リーフパンチを２％の素寒天の上部の試験アリーナに置き、新生幼虫１匹を外寄生させ、
穴のあいたプラスチックの蓋で密閉した。
外寄生させた後に死亡率および葉の消費を評価した。穏やかな触針に反応しなかった幼
虫は死亡したとみなした。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含有す
る植物性材料上に置いた昆虫の死亡率は、Ｍａｖｅｒｉｃｋ対照上に置いた昆虫よりも有
意に高かった（スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）について死亡率
８６％、アンチカルシア・ゲムマタリス（Anticarsia gemmatalis）について死亡率１０
０％、シュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）について死亡率１
００％）。表１０。昆虫に消費されたリーフディスクの百分率を視覚的にスコアリングす
ることによって葉の損傷を評価した。温室での実験から得られた結果により、ダイズイベ
ントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１では、アンチカルシア・ゲムマタリス（Antica
rsia gemmatalis）、シュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）、
およびスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）の外寄生に対して、Ｍａ
ｖｅｒｉｃｋ対照植物と比較して有意に低い葉の損傷および高い昆虫の死亡率が持続した
ことが示された。
圃場で生長させたダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１植物の有効性評
価を、プエルトリコ、サンタイサベルの種子増加苗床小区画から葉の試料を収集し、これ
らの葉をバイオアッセイするためにＩＮ、インディアナポリスに送ることによって行った
。Ｔ３ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１植物のための苗床小区画は、
４つの作条に配置されたおよそ１８０の植物からなった。各作条は長さ２．３ｍであり、
７６．２ｃｍの間隔があけられ、個々の植物は各作条内に５．１ｃｍの間隔で植えられた
。***組織のおよそ４節下に位置する完全に増大した主茎の三出葉１枚のバイオアッセイ
を行った。三出葉組織をイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を有する１０の個
々のダイズ植物および１０の個々の「Ｍａｖｅｒｉｃｋ」植物から、切除した。葉を包装
して実験室に移した。実験室において、各三出葉から直径３．３３ｃｍのリーフディスク
１つまたは２つを押し抜き、合計１６のリーフディスクを準備した。各リーフディスクを
２％の寒天の上部の試験アリーナに置き、新生ヨトウガ（S. frugiperda）幼虫１匹を外
寄生させ、穴のあいたプラスチックの蓋で密閉した。リーフディスクを、制御された環境
のチャンバー内で７日間保持し、７日の時点で死亡率および葉の消費を評価した。穏やか
な触針に反応しない幼虫は死亡したとみなした。
外寄生させた後の死亡率および葉の消費を評価した。穏やかな触針に反応しなかった幼
虫を死亡したとみなした。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含有す
る植物性材料上に置いた昆虫の死亡率は、Ｍａｖｅｒｉｃｋ対照上に置いた昆虫（スポド
プテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）について死亡率０％）よりも有意に高
かった（スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）について死亡率６８％
）。表１０。昆虫に消費されたリーフディスクの百分率を視覚的にスコアリングすること
によって葉の損傷を評価した。この葉のバイオアッセイから得られた結果により、ダイズ
イベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１に曝露させたスポドプテラ・フルギペルダ
（Spodoptera frugiperda）の幼虫では、Ｍａｖｅｒｉｃｋ対照植物に曝露させたスポド
プテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）の幼虫よりも有意に低い葉の損傷およ
び昆虫の生存（高い昆虫の死亡率としても説明される）が持続したことが示された。
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の有効性を第１の圃場試験（表１
０の第１の圃場試験）において評価した。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１
５．１を含有する、Ｔ４世代からのダイズ種子、および形質転換されていないダイズ品種
Ｍａｖｅｒｉｃｋの種子を、完全乱塊法計画、反復数２で植えた。各反復小区画は作条２
つ、長さ２．３ｍおよび０．７６ｍの間隔からなった。作条内に、作条当たり種子４０個
を５．７ｃｍの間隔で植えた。試験種子を植え、一方の反復にグルホシネート除草剤を４
１１ｇ ａｅ／ｈａで噴霧し、他方の反復にはこれを噴霧せず、その結果、Ｍａｖｅｒｉ
ｃｋ植物に関して噴霧していない反復のみがバイオアッセイのために生存した。
ダイズ植物がＲ２生長段階になった時にバイオアッセイのために葉を収集した。バイオ
アッセイのために葉を収集する数日前に、同じ植物の１節下の葉（および古い葉）からリ
ーフパンチを取得し、Ｃｒｙ１Ａｃタンパク質およびＣｒｙ１Ｆタンパク質の発現につい
て、実施例２に記載のものと同様のＥＬＩＳＡ法を使用して分析した（表１２）。***組
織の４節下に位置し、損傷または変色の徴候が示されてない完全に増大した主茎の三出葉
をバイオアッセイのために切除した。反復当たり１５の植物のそれぞれから三出葉を１枚
切除した。葉を１５℃で保管し、バイオアッセイした。各三葉の小葉を切除し、ダイズイ
ベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の小葉のそれぞれの中心から直径３．３３ｃ
ｍのディスクを１枚切り取り、Ｍａｖｅｒｉｃｋの小葉それぞれから直径３．３３ｃｍの
ディスクを２枚切り取った。これらのリーフディスクをそれぞれ、３２ウェルのプラスチ
ックバイオアッセイトレーの別々の標識したウェルに入れた。各ウェルは寒天の薄い層を
含有した。新生Ｐ．インクルデンス（P. includens）の幼虫、新生Ａ．ゲムマタリス（A.
gemmatalis）の幼虫、または新生ヨトウガ（S. frugiperda）の幼虫１匹を各リーフディ
スク上に置いた。換気をもたらすためにバイオアッセイトレーを穴のあいた接着性のプラ
スチックシートで密閉した。各種について、幼虫３０匹をダイズイベントｐＤＡＢ９５８
２．８１６．１５．１からの葉組織に曝露させ、幼虫３０匹をＭａｖｅｒｉｃｋからの葉
組織に曝露させた。外寄生させたリーフディスクを保持するプラスチックトレーを２５℃
、相対湿度（ＲＨ）４０％で保持した。７日後に、幼虫について、死亡した（鋭い針を用
いて刺激しても動かない）か、発育が阻止された（Ｍａｖｅｒｉｃｋの葉の上に保持され
た幼虫よりもサイズが小さい）か、または生きている（サイズおよび刺激に対する応答が
正常である）かを決定した。
外寄生させた後の死亡率を評価した。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５
．１を含有する植物性材料上に置いた昆虫の死亡率は、Ｍａｖｅｒｉｃｋ対照上に置いた
昆虫よりも有意に高かった（スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）に
ついて死亡率９７％、アンチカルシア・ゲムマタリス（Anticarsia gemmatalis）につい
て死亡率１００％、およびシュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens
）について死亡率１００％）。表１０。この葉のバイオアッセイから得られた結果により
、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１に曝露させたスポドプテラ・フル
ギペルダ（Spodoptera frugiperda）、アンチカルシア・ゲムマタリス（Anticarsia gemm
atalis）、およびシュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）の幼虫
では、Ｍａｖｅｒｉｃｋ対照植物に曝露させたスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera
frugiperda）、アンチカルシア・ゲムマタリス（Anticarsia gemmatalis）、およびシュ
ードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）の幼虫よりも有意に低い昆虫
の生存（高い昆虫の死亡率としても説明される）が持続したことが示された。
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の有効性を第２の別の圃場試験（
表１０の第２の圃場試験）で評価した。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５
．１を含有する、Ｔ４世代からのダイズ種子および形質転換されていないダイズ品種Ｍａ
ｖｅｒｉｃｋの種子を完全乱塊法計画、反復数４で植えた。各反復小区画は作条４つ、長
さ６．１ｍおよび１．０２ｍの間隔からなった。作条内に、作条当たり種子１６０個を３
．８ｃｍの間隔で植えた。ネイティブな害虫集団を誘引するために試験小区画の間および
その周りの追加的な作条にＭａｖｅｒｉｃｋを植えた。
ダイズ植物がＲ２生長段階になった時にバイオアッセイのために葉を収集した。追加的
なバイオアッセイのための葉を、ダイズ植物がＲ５生長段階になった時に同じ植物から収
集した。各バイオアッセイのために葉を収集する数日前に、同じ植物の１節下の葉からリ
ーフパンチを取得し、Ｃｒｙ１Ａｃタンパク質およびＣｒｙ１Ｆタンパク質について実施
例２に記載のものと同様のＥＬＩＳＡ法を使用して分析した（表１２）。***組織の４節
下に位置し、損傷または変色の徴候が示されてない完全に増大した主茎の三出葉をバイオ
アッセイのために切除した。反復当たり１５の植物のそれぞれから三出葉を１枚切除し、
反復当たり三葉４枚をＰ．インクルデンス（P. includens）のバイオアッセイのために使
用し、反復当たり三葉４枚をヨトウガ（S. frugiperda）のバイオアッセイのために使用
し、反復当たり三葉４枚をＨ．ビレセンス（H. virescens）のバイオアッセイのために使
用し、反復当たり三葉３枚をＡ．ゲムマタリス（A. gemmatalis）のバイオアッセイのた
めに使用した。各三葉の両側の小葉を切除し、寒天の薄い層を含有する別々の標識したペ
トリ皿に入れた。Ｐ．インクルデンス（P. includens）、Ａ．ゲムマタリス（A. gemmata
lis）、ヨトウガ（S. frugiperda）、またはＨ．ビレセンス（H. virescens）の二齢の幼
虫２匹を各小葉上に置いた。Ｐ．インクルデンス（P. includens）、ヨトウガ（S. frugi
perda）、およびＨ．ビレセンス（H. virescens）については、幼虫６４匹をダイズイベ
ントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１およびＭａｖｅｒｉｃｋ植物からの葉組織に曝
露させた。Ａ．ゲムマタリス（A. gemmatalis）については、幼虫４８匹をダイズイベン
トｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１およびＭａｖｅｒｉｃｋ対照植物からの葉組織に
曝露させた。外寄生させた小葉を保持するペトリ皿を蓋で覆い、２５℃、ＲＨ４０％で保
持した。４日後に、幼虫について、死亡した（鋭い針を用いて刺激しても動かない）か、
瀕死である（幼虫は刺激には応答するが、端に置いても元に戻ることができない）か、発
育が阻止された（Ｍａｖｅｒｉｃｋの葉の上に保持された幼虫よりもサイズが小さい）か
、または生きている（サイズおよび刺激に対する応答が正常である）かを決定した。
Ｒ５段階でのバイオアッセイ手順は、ヨトウガ（S. frugiperda）およびＨ．ビレセン
ス（H. virescens）について、小葉３枚全てを各三葉から切除し、二齢の幼虫１匹を各小
葉上においたことを除いてＲ２段階で使用した手順と同じであった。これにより、ヨトウ
ガ（S. frugiperda）およびＨ．ビレセンス（H. virescens）の幼虫４８匹がダイズイベ
ントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１およびＭａｖｅｒｉｃｋからの小葉に曝露され
た。
Ｒ２の葉のバイオアッセイとＲ５の葉のバイオアッセイの両方について、外寄生させた
後の死亡率を評価した。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含有する
植物性材料上に置いた昆虫の死亡率は、Ｍａｖｅｒｉｃｋ対照上に置いた昆虫よりも有意
に高かった（スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）に関してＲ２の葉
のバイオアッセイについて死亡率６９％およびＲ５の葉のバイオアッセイについて死亡率
５４％、アンチカルシア・ゲムマタリス（Anticarsia gemmatalis）に関してＲ２の葉の
バイオアッセイとＲ５の葉のバイオアッセイの両方について死亡率１００％、ヘリオチス
・ビレセンス（Heliothis virescens）に関してＲ２の葉のバイオアッセイについて死亡
率９５％およびＲ５の葉のバイオアッセイについて死亡率７０％、ならびにシュードプル
シア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）に関してＲ２の葉のバイオアッセイに
ついて死亡率１００％およびＲ５の葉のバイオアッセイについて死亡率９８％）。表１０
。この葉のバイオアッセイから得られた結果により、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．
８１６．１５．１に曝露させたスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）
、アンチカルシア・ゲムマタリス（Anticarsia gemmatalis）、シュードプルシア・イン
クルデンス（Pseudoplusia includens）およびヘリオチス・ビレセンス（Heliothis vire
scens）の幼虫では、Ｍａｖｅｒｉｃｋ対照植物に曝露させたスポドプテラ・フルギペル
ダ（Spodoptera frugiperda）、アンチカルシア・ゲムマタリス（Anticarsia gemmatalis
）、シュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）およびヘリオチス・
ビレセンス（Heliothis virescens）の幼虫よりも有意に低い昆虫の生存（高い昆虫の死
亡率としても説明される）が持続したことが示された。
第２の圃場試験で生長させたダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１およ
びＭａｖｅｒｉｃｋダイズ植物からダイズのさやを収集し、Ｈ．ビレセンス（H. viresce
ns）の幼虫を用いてバイオアッセイした。各反復小区画内でランダムに選択した６つの植
物から主茎の一番上のさや２つを切除した。さやのセットそれぞれをプラスチックペトリ
皿に入れ、二齢のＨ．ビレセンス（H. virescens）の幼虫１匹を外寄生させた。ダイズイ
ベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１およびＭａｖｅｒｉｃｋ対照植物から収穫さ
れたさやのセットに幼虫２４匹が曝露されるように実験を設計した。ペトリ皿を上記の切
除した葉のバイオアッセイと同じ条件下で保持した。２日後に、葉のバイオアッセイにつ
いて記載されている手順を使用してＨ．ビレセンス（H. virescens）の幼虫の生存を観察
した。
ダイズのさやに外寄生させた後の死亡率を評価した。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２
．８１６．１５．１を含有するダイズのさやの上に置いた昆虫の死亡率はＭａｖｅｒｉｃ
ｋ対照のさやの上に置いた昆虫よりも有意に高かった（ヘリオチス・ビレセンス（Heliot
his virescens）に関するダイズのさやのバイオアッセイについて死亡率５０％）。表１
０。圃場で生長させたダイズのさやでのこのアッセイから得られた結果により、ダイズイ
ベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１に曝露させたヘリオチス・ビレセンス（Heli
othis virescens）の幼虫では、Ｍａｖｅｒｉｃｋ対照植物に曝露させたヘリオチス・ビ
レセンス（Heliothis virescens）の幼虫よりも有意に低い昆虫の生存（高い昆虫の死亡
率としても説明される）が持続したことが示された。
圃場において、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１およびＭａｖｅｒ
ｉｃｋ対照のダイズ植物の頂端部（２つ〜３つの増大している三出葉および未成熟のさや
の集団を有する主茎の一番上の部分）にＨ．ビレセンス（H. virescens）の卵を外寄生さ
せた。Ｈ．ビレセンス（H. virescens）の卵をおよそ２０個有するチーズクロスの切片を
各反復小区画内でランダムに選択した５つの植物（全部で２０の植物を試験した）の頂端
部に置き、プラスチックで覆った紙クリップを用いて定位置に保持した。布製のメッシュ
の袋を頂端部にかぶせ、メッシュの袋の開放端を主茎の周りでビニールタイを用いて固定
した。メッシュの袋の代表的なセットにおいて卵の孵化を毎日モニターした。全ての卵が
孵化した後に、５つの植物に取り付けた各メッシュの袋内で生きているＨ．ビレセンス（
H. virescens）の幼虫の数を計数した。
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１のダイズの頂端部の生きている昆
虫の幼虫の平均数は、Ｍａｖｅｒｉｃｋ対照の頂端部の昆虫よりも有意に低かった（ヘリ
オチス・ビレセンス（Heliothis virescens）に関するダイズの頂端部のバイオアッセイ
について０．００数の昆虫）。表１１。このアッセイから得られた結果により、ダイズイ
ベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１に曝露させたヘリオチス・ビレセンス（Heli
othis virescens）の幼虫では、Ｍａｖｅｒｉｃｋ対照植物に曝露させたヘリオチス・ビ
レセンス（Heliothis virescens）の幼虫よりも有意に少ない数の昆虫の生存が持続した
ことが示された。
試験小区画内のネイティブなＰ．インクルデンス（P. includens）の幼虫の計数を週に
１回、４週間にわたって行った。各小区画の中央の２つの作条から試料採取した。中央の
２つの作条の間のランダムに選択した位置に９１ｃｍ×９１ｃｍの白い布を置いた。シー
トの一端に近接する作条の区分内の植物を布の上に曲げ、１５回振って、存在するあらゆ
る昆虫を取り出した。布の逆端にある作条についてこのプロセスを繰り返した。幼虫を種
およびサイズごとに計数した。長さが６ｍｍ未満の幼虫を小さな幼虫として計数し、長さ
が６ｍｍ以上の幼虫を大きな幼虫として計数した。次の測定を行う前に布から全ての昆虫
を除去した。布を中央の２つの作条の間の第２のランダムに選択した位置に移動させ、試
料採取プロセスを繰り返し、これにより、各試料採取日に小区画当たり２つの副試料をも
たらした。
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の１．８２ｍの作条にわたって計
数された昆虫の平均数は、Ｍａｖｅｒｉｃｋ対照の１．８２ｍの作条にわたって計数され
た昆虫の数よりも有意に低かった（シュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia i
ncludens）について０．００数の昆虫）。表１１。このアッセイから得られた結果により
、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１へのシュードプルシア・インクル
デンス（Pseudoplusia includens）の外寄生は、Ｍａｖｅｒｉｃｋ対照植物に曝露させた
シュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）の外寄生よりも有意に少
ないことが示された。
これらの反復実験から得られた結果により、試験した全ての昆虫種について、ダイズイ
ベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１に曝露させた鱗翅目の幼虫では、Ｍａｖｅｒ
ｉｃｋ対照植物に曝露させた幼虫よりも有意に低い生存が持続したことが示された。した
がって、ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１はこの広い範囲の害虫に殺
虫活性を有する。
ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の予測される配列
配列番号１４にダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の予測される配列
が提供されている。この配列は、５’ゲノム隣接配列、ｐＤＡＢ９５８２の予測されるＴ
鎖挿入断片および３’ゲノム隣接配列を含有する。配列番号１４に関して、残基１〜１２
７３は５’ゲノム隣接配列であり、残基１２７４〜１３６５８はｐＤＡＢ９５８２Ｔ鎖挿
入の残基であり、１３６５９〜１３８２１はｐＤＡＢ９５８２プラスミドからの再配置の
残基であり、残基１３８２２〜１５１７０は３’隣接配列である。したがって挿入断片の
５’末端に関して接合部配列または移行部は配列番号１４の残基１２７３〜１２７４に生
じる。したがって挿入断片の３’末端に関して接合部配列または移行部は配列番号１４の
残基１３６５８〜１３６５９に生じる。
配列番号１４はダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の予測表示であり
、配列番号１、配列番号２、およびｐＤＡＢ９５８２のｔ鎖のアラインメントから組み立
てられたものであることに留意すべきである。ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６
．１５．１のＴ鎖挿入断片の実際の配列は配列番号１４からわずかに逸脱する可能性があ
る。Ｔ鎖挿入を植物細胞のゲノムに導入する形質転換プロセスの間に、挿入断片のいくつ
かの欠失または他の変更が起こることは珍しくない。さらに、ＰＣＲ増幅において、軽微
な配列決定のエラーを生じる可能性があるエラーが起こり得る。例えば、本明細書におい
て列挙されている隣接配列は、ダイズのゲノムＤＮＡからアンプリコンを生成し、次いで
アンプリコンをクローニングし、配列決定することによって決定した。ゲノムＤＮＡから
配列決定するために十分なアンプリコンを生成するために必要な多数回の増幅を考慮する
と、このように生成し、決定した配列においてわずかな差異および軽微な不一致が見いだ
されることは珍しいことではない。当業者は、これらの型の一般的な配列決定のエラーま
たは不一致に起因して必要になる調整はいずれも本開示の範囲内であることを認識し、留
意するべきである。したがって、本明細書において提供されるプラスミド配列の関連する
セグメントは、いくつかの軽微な変動を含んでよい。したがって、本開示の挿入断片配列
に対していくらかの範囲の同一性を有するポリヌクレオチドを含む植物は本開示の範囲内
である。配列番号１４の配列に対する同一性とは、本明細書で例示または記載されている
配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９
７％、９８％、９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列であってよい。隣接配
列プラス挿入断片配列の配列は、寄託された種子を照会することで確認することができる
。したがって、配列番号１４とダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の実
際のＴ鎖挿入との間のいくつかの差異を同定することができる。
本開示の原理が例示され、記載され、本開示は、そのような原理から逸脱することなく
取り合わせおよび詳細を改変することができることが当業者には明らかであるはずである
。我々は添付の特許請求の範囲の主旨および範囲内に入る全ての改変について特許請求す
る。
本明細書において引用されている刊行物および公開特許文書は全て、個々の刊行物または特許出願が具体的にかつ個別に参照により組み込まれることが示された場合と同じ程度に参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、以下の態様を含む。
[１]
昆虫を昆虫抵抗性ダイズ植物に曝露させて、それにより昆虫を防除するステップを含む、昆虫を防除する方法であって、前記ダイズ植物が配列番号１のｂｐ１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択される配列を含むＤＮＡを含み、前記配列が、ダイズイベント９５８２．８１６．１５．１の存在に特徴的である、方法。
[２]
前記昆虫がシュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）（ダイズシャクトリムシ）である、[１]に記載の方法。
[３]
前記昆虫がアンチカルシア・ゲムマタリス（Anticarsia gemmatalis）（ハッショウマメイモムシ）である、[１]に記載の方法。
[４]
前記昆虫がスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（ツマジロクサヨトウ）である、[１]に記載の方法。
[５]
前記昆虫がヘリオチス・ビレセンス（Heliothis virescens）（タバコバッドワーム）である、[１]に記載の方法。
[６]
ダイズ作物において雑草を防除する方法であって、グルホシネート除草剤をダイズ作物に施用するステップを含み、前記ダイズ作物が配列番号１のｂｐ１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択される配列を含むＤＮＡを含むダイズ植物を含み、前記配列がダイズイベント９５８２．８１６．１５．１の存在に特徴的である、方法。
[７]
配列番号１のｂｐ１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択される１つまたは複数の配列を含む単離されたＤＮＡ配列。
[８]
ダイズ植物を育種する方法であって、
第１のダイズ植物と第２のダイズ植物を交雑させて第３のダイズ植物を作出するステップであり、前記第１のダイズ植物が配列番号１の１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択される１つまたは複数の配列、ならびにその相補物を含むＤＮＡを含む、ステップと、前記第３のダイズ植物を、配列番号１のｂｐ１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択される１つまたは複数の配列およびその相補物を含むＤＮＡの存在についてアッセイするステップとを含む方法。
[９]
配列番号１のｂｐ１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択される少なくとも１つの配列およびその相補物を含む接合部配列を含む単離されたＤＮＡ分子。
[１０]
シュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）（ダイズシャクトリムシ）に対して抵抗性であり、配列番号１のｂｐ１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列およびその相補物を有するＤＮＡを含む、ダイズ植物またはその部位。
[１１]
[１０]に記載の植物の種子。
[１２]
ダイズミール、ダイズ粉、ダイズタンパク質濃縮物、およびダイズ油からなる群から選択される生産品である、[６]に記載のダイズ植物またはその部位に由来する組成物。
[１３]
ダイズの粒、種子、ミール、または粉において害虫を防除する方法であって、前記粒、種子、ミール、または粉が配列番号１のｂｐ１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；および配列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択される１つまたは複数の配列およびその相補物を含むＤＮＡを含むことによって実証される、前記粒、種子、ミール、または粉にダイズイベント９５８２．８１６．１５．１を含めるステップを含む方法。
[１４]
ゲノム内に、配列番号１のｂｐ１２５８〜１２８８；配列番号１のｂｐ１２２３〜１３２３；配列番号１のｂｐ１１７３〜１３７３；配列番号１のｂｐ１０７３〜１４７３；配列番号２のｂｐ１６０〜１９０；配列番号２のｂｐ１２５〜２２５；配列番号２のｂｐ７５〜２７５からなる群から選択されるＤＮＡ配列；ならびにその相補物を含むダイズ種子。
[１５]
[１４]に記載のダイズ種子から生長させたダイズ植物。
[１６]
花粉、胚珠、花、苗条、根、および葉からなる群から選択され、前記ダイズイベント９５８２．８１６．１５．１を含む、[１５]に記載のダイズ植物の部位。
[１７]
ダイズミール、ダイズ粉（soybean flour）、およびダイズ油（soybean oil）からなる群から選択される生産品である、[１５]に記載のダイズ植物またはその部位に由来する組成物。
[１８]
配列番号１４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を含むトランスジェニックダイズ植物。
[１９]
ダイズイベント９５８２．８１６．１５．１を含むトランスジェニックダイズ植物またはその部位であって、代表的なダイズ種子がＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＰＴＡ−１２５８８の下で寄託されているダイズイベント９５８２．８１６．１５．１を含む、トランスジェニックダイズ植物またはその部位。

Claims (19)

  1. 除草剤耐性および昆虫抵抗性を有するトランスジェニックダイズ植物であって、配列番号１４のヌクレオチド配列を含むダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含み、Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ１ＡｃおよびＰＡＴ遺伝子を発現することができる、トランスジェニックダイズ植物。
  2. 配列番号１４のヌクレオチド配列を含むダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含み、Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ１ＡｃおよびＰＡＴ遺伝子を発現することができるトランスジェニックダイズ植物またはその部位であって、前記トランスジェニックダイズ植物の種子がＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＰＴＡ−１２５８８の下で寄託されている、トランスジェニックダイズ植物またはその部位。
  3. 前記ダイズ植物またはその部位が、配列番号１の１２５８位〜１２８８位；配列番号１の１２２３位〜１３２３位；配列番号１の１１７３位〜１３７３位；配列番号１の１０７３位〜１４７３位；配列番号２の１６０位〜１９０位；配列番号２の１２５位〜２２５位；および配列番号２の７５位〜２７５位からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列、ならびにその相補物を有するＤＮＡを含む、請求項２に記載のトランスジェニックダイズ植物。
  4. 請求項１に記載の植物からのダイズ種子であって、前記ヌクレオチド配列を含むダイズ種子。
  5. 前記トランスジェニックダイズ植物が、シュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）（ダイズシャクトリムシ）に対して抵抗性であり、かつ、グルホシネート耐性である、請求項１〜３のいずれかに記載のトランスジェニックダイズ植物またはその部位。
  6. 配列番号１４のヌクレオチド配列を含み、除草剤耐性と昆虫抵抗性を有する、請求項４に記載の種子を生長させることによって作出されるトランスジェニックダイズ植物。
  7. 前記ヌクレオチド配列が、配列番号１の１２５８位〜１２８８位；配列番号１の１２２３位〜１３２３位；配列番号１の１１７３位〜１３７３位；配列番号１の１０７３位〜１４７３位；配列番号２の１６０位〜１９０位；配列番号２の１２５位〜２２５位；および配列番号２の７５位〜２７５位からなる群から選択されるヌクレオチド配列、ならびにその相補物を含む、請求項１に記載のトランスジェニックダイズ植物。
  8. 配列番号１４のヌクレオチド配列を含む、単離されたＤＮＡ分子。
  9. ダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１の接合部配列を含み、前記接合部配列が配列番号１の１２５８位〜１２８８位；配列番号１の１２２３位〜１３２３位；配列番号１の１１７３位〜１３７３位；配列番号１の１０７３位〜１４７３位；配列番号２の１６０位〜１９０位；配列番号２の１２５位〜２２５位；および配列番号２の７５位〜２７５位からなる群から選択される１つまたは複数のヌクレオチド配列、ならびにその相補物を含む、請求項８に記載の単離されたＤＮＡ分子。
  10. 請求項２、３および５のいずれかに記載のダイズ植物またはその部位に由来する組成物であって、ダイズミール、ダイズ粉、ダイズタンパク質濃縮物、およびダイズ油からなる群から選択される生産品であり、配列番号１の１２５８位〜１２８８位；配列番号１の１２２３位〜１３２３位；配列番号１の１１７３位〜１３７３位；配列番号１の１０７３位〜１４７３位；配列番号２の１６０位〜１９０位；配列番号２の１２５位〜２２５位；および配列番号２の７５位〜２７５位からなる群から選択される１つまたは複数のヌクレオチド配列、ならびにその相補物を含むＤＮＡを含む、組成物。
  11. 花粉、胚珠、花、苗条、根、および葉からなる群から選択され、配列番号１４のヌクレオチド配列を含む、請求項２に記載のダイズ植物の部位。
  12. ダイズ植物に除草剤耐性および２つの昆虫抵抗性形質を遺伝子移入する方法であって、請求項１に記載のダイズ植物を第２のダイズ植物と交雑させて第３のダイズ植物を作出するステップ、および前記第３のダイズ植物を、配列番号１の１２５８位〜１２８８位；配列番号１の１２２３位〜１３２３位；配列番号１の１１７３位〜１３７３位；配列番号１の１０７３位〜１４７３位；配列番号２の１６０位〜１９０位；配列番号２の１２５位〜２２５位；および配列番号２の７５位〜２７５位から選択される１つまたは複数のヌクレオチド配列ならびにその相補物を含むＤＮＡの存在についてアッセイするステップとを含む、方法。
  13. 昆虫を請求項１のトランスジェニックダイズ植物に曝露させて、それにより昆虫を防除するステップを含む、昆虫を防除する方法であって、前記トランスジェニックダイズ植物が配列番号１の１２５８位〜１２８８位；配列番号１の１２２３位〜１３２３位；配列番号１の１１７３位〜１３７３位；配列番号１の１０７３位〜１４７３位；配列番号２の１６０位〜１９０位；配列番号２の１２５位〜２２５位；および配列番号２の７５位〜２７５位からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡを含む、方法。
  14. 前記昆虫がシュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）（ダイズシャクトリムシ）、アンチカルシア・ゲムマタリス（Anticarsia gemmatalis）（ハッショウマメイモムシ）、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（ツマジロクサヨトウ）およびヘリオチス・ビレセンス（Heliothis virescens）（タバコバッドワーム）から選択される、請求項１３に記載の方法。
  15. ダイズ作物において雑草を防除する方法であって、グルホシネート除草剤をダイズ作物に施用するステップを含み、前記ダイズ作物が配列番号１の１２５８位〜１２８８位；配列番号１の１２２３位〜１３２３位；配列番号１の１１７３位〜１３７３位；配列番号１の１０７３位〜１４７３位；配列番号２の１６０位〜１９０位；配列番号２の１２５位〜２２５位；および配列番号２の７５位〜２７５位からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡを含む請求項１のトランスジェニックダイズ植物を含む、方法。
  16. Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ１ＡｃおよびＰＡＴ遺伝子を発現するＤＮＡ挿入物を含み、前記ＤＮＡ挿入物が前記挿入物の５’末端で配列番号１に隣接し、かつ、前記ＤＮＡ挿入物が前記挿入物の３’末端で配列番号２に隣接する、請求項１〜３および５〜７のいずれかに記載のトランスジェニックダイズ植物。
  17. ダイズの粒、種子、ミール、または粉において害虫を防除する方法であって、前記粒、種子、ミール、または粉を配列番号１４を含むＤＮＡを含むダイズイベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を含むダイズ植物から得ることを含む方法。
  18. 請求項１〜３、５〜７および１６のいずれかに記載のトランスジェニックダイズ植物を作出する方法であって、配列番号１４内のＣｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ１ＡｃおよびＰＡＴ遺伝子をコードする配列を含むヌクレオチド配列を用いてダイズ植物を形質転換するステップを含む、方法。
  19. 除草剤耐性と昆虫抵抗性を有するトランスジェニックダイズ作物を作出するための、請求項１〜３、５〜７および１６のいずれかに記載のトランスジェニックダイズ植物または請求項４に記載の種子の使用。
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