BR0211920B1 - preparações adequadas para tratamento do solo e de sementes de planta, processos para preparação das referidas preparações, para preparação de microorganismos, para tratamento de solo, para tratamento de sementes de plantas, bem como para melhorar e manter a estrutura do solo. - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PREPARA- ÇÕES ADEQUADAS PARA TRATAMENTO DO SOLO E DE SEMENTES DE PLANTA, PROCESSOS PARA PREPARAÇÃO DAS REFERIDAS PREPA- RAÇÕES, PARA PREPARAÇÃO DE MICROORGANISMOS, PARA TRATA- MENTO DE SOLO, PARA TRATAMENTO DE SEMENTES DE PLANTA, BEM COMO PARA MELHORAR OU MANTER A ESTRUTURA DO SOLO".

CAMPO TÉCNICO

A presente invenção refere-se a(os) produto(s) contendo micro- organismo(s) vivo(s) adequado(s) para tratamento do solo, microorganismos que se multiplicam sob circunstâncias climáticas e naturais diferentes, bem como ao procedimento para a produção dos produtos, ainda procedimento para o tratamento do solo e plantas com os produtos.

Em mais detalhes, a invenção refere-se a um procedimento para a preparação de produtos a partir de qualquer um dos microorganismos es- pecificados abaixo, ou a partir de uma mistura deles.

Ainda, a invenção refere-se a um procedimento para a criação de culturas dos microorganismos a serem usados. Os objetos da invenção são os próprios microorganismos, também.

Em mais detalhes, a presente invenção refere-se a um procedi- mento para o tratamento do solo e plantas com um produto contendo pelo me- nos um dos microorganismos Azospirillum brasilense ssp. SW51 (NCAIM IPI B 001293), Azotobacter vinelandii spp. M657 (NCAIM IPI B 001291), Pseudomo- nas fíuorescens var. SW11 (NCAIM IPl B 001296), Bacillus polymyxa var. SW 17 (NCAIM IPI B 001295), Bacillus megaterium var. M326 (NCAIM IPI B 001301), ainda aos produtos que se multiplicam e existem no ambiente da plan- ta em questão contendo os microorganismos listados e sua produção.

FUNDAMENTOS DA TÉCNICA

O meio natural do solo é o ecossistema de auto-regulagem das plantas e microorganismos, sob circunstâncias naturais, a existência do pri- meiro determina aquela dos outros. Quando o equilíbrio desenvolvido duran- te a evolução é alterado por atividades humanas (aragem profunda, fertiliza- ção natural e artificial, uso de agentes de proteção de planta, etc.) em sua estrutura e função, mudanças de efeito não-previsto podem acontecer. Para o desenvolvimento de populações de microorganismos necessários para o cultivo ótimo de uma dada planta cultivada, em diferentes solos e sob cir- cunstâncias climáticas diferentes, um tempo de seleção durando longos anos é necessário. Os microorganismos determinantes da população de mi- croorganismo favorável, no entanto, podem ser transportados no solo e as circunstâncias necessárias para cultivo ótimo podem ser criadas dentro de um-dois dias. O resultado disso é rendimento maior, sem causar danos ao ecossistema natural. Os microorganismos úteis e dominantes que existem no ambiente de uma dada planta importante do ponto de vista econômico podem ser determinados através de experimentos de laboratório e esses podem ser individualmente multiplicados, produzidos através de métodos industriais, e podem ser trazidos de volta para o solo em proporção adequada.

Regularidades importantes podem ser encontradas no ecossis- tema do solo e microorganismos. O número de microorganismos é diferente e espécies diferentes podem ser identificadas no ambiente imediato do sis- tema de raiz das plantas vivas (risoesfera) e das sementes em germinação (espermatosfera) do que mais longe delas. A propagação das bactérias no ambiente das raízes é influenciada por muitos fatores. Esses fatores depen- dem da região, qualidade do solo, composição da população de microorga- nismo e das circunstâncias climáticas.

A fonte de carbono a ser encontrada no solo se torna ativa princi- palmente e na maioria devastadora usando a energia solar, com fotossíntese.

O ciclo de nitrogênio é mais complicado do que aquele do car- bono. Processos biológicos e químicos têm um efeito sobre a transformação de nitrogênio. Na natureza, o nitrogênio gasoso em uma condição chamada inerte é dominante, e o chamado nitrogênio fixo (nitrato, nitrito, amônia) está presente em uma quantidade limitada.

Para a mineralização do gás nitrogênio, primeiro de tudo, a Iiga- ção de nitrogênio biológica é responsável. Uma vez que em um hectare a quantidade do nitrogênio molecular perfaz 6-7x108 ton, isso significa uma fonte inesgotável para a ligação de nitrogênio. O interesse dos especialistas é com relação aos seres vivos que se ligam ao nitrogênio, isto é, com rela- ção aos seres vivos que podem reduzir o nitrogênio molecular em amônia, dentre outros, o conhecimento desses microorganismos e a utilização ade- quada de suas propriedades podem assegurar, de uma maneira ambiental- mente amistosa, a parada da fome em todo o mundo.

Algumas bactérias que ligam nitrogênio fixam o nitrogênio em condição viva livre, mas várias bactérias são capazes de fixação de nitrogê- nio apenas combinadas com outras plantas superiores.

O ciclo do fósforo, contrário àquele do nitrogênio, é praticamente fechado sob circunstâncias naturais. A entrada e saída são idênticas, o fluxo é suave, o ar não será contaminado com fósforo. Finalmente, este elemento se acumula nas águas, mares e apenas uma leve quantidade deste volta para a terra (por exemplo, na forma de guano).

Nas células vivas do solo o fósforo se acumula em compostos orgânicos, a mineralização desses acontece com uma alta velocidade (3-8 g/m2/ano). A solubilidade - desse modo sua acessibilidade para as plantas - dos compostos fosforosos emergentes é diferente, apenas 5% dos 400-1200 mg de fósforo detectáveis em cada 1 kg dos sólidos médios estão disponí- veis. A modificação de certos compostos fosforosos é de 500-2000 anos.

Ao transportar alguns grupos de microorganismos fosfonolíticos no solo, os compostos fosforosos complexos, que não são acessíveis para a planta, podem ser trazidos em solução. Se os microorganismos trazidos no solo "funcionarem", e os teores de minerais do solo forem satisfatórios, o uso de fertilizantes contendo fosfato não é necessário ou pode ser considera- velmente reduzido.

Para crescerem, as plantas precisam - especialmente no mo- mento do amadurecimento da safra - de potássio em uma quantidade consi- derável. Os cultivadores de plantas põem potássio no solo suprindo o fertili- zante com proporção de potássio. Este fertilizante pode ser disponibilizado dos minerais de potássio por meio dos microorganismos que liberam íon de potássio.

Até onde as plantas estão envolvidas, os microorganismos que se multiplicam no solo biossintetizam os compostos fisiologicamente ativos, desses os compostos mais importantes sendo: fito-hormônios, auxinas (áci- do indol-3-acético), etileno, giberelinas, cinetinas, etc. Alguns grupos Pseu- domonas, na presença de ferro em uma leve quantidade, produzem os cha- mados sideróforos, que podem recolher ferro. Como uma conseqüência dis- so, os outros, bactérias fitopatogênicas ou fungos, uma vez que esses não podem utilizar o ferro dos sideróforos, sofrem inibição devido à falta de ferro, por outro lado, esses sideróforos, no solo com falta de ferro, significante- mente estimulam o crescimento das plantas, uma vez que ao se ligarem ao ferro, esses diretamente provêem o ferro à planta.

Para a solução do problema acima,várias versões técnicas fo- ram elaboradas; vários microorganismos são descritos na literatura especial em detalhes.

Inventores Húngaros descreveram a preparação de culturas de nutrição em pó (patente Húngara HU 143.391), culturas de Azobacter chroo- coccum e Rhizobium meliloti (patente Húngara HU 188.434), culturas de alga (patente Húngara HU 195.068) e culturas de Azobacter chroococcum novamente, bem como a preparação das culturas de microorganismos Baci- Ilus megaterium (patente Húngara HU 207.751). O Azobacter chroococcum foi depositado sob o N0 de depósito 00238, o Bacillus megaterium sob o N0 de série NCAIM IPI B 1140. Em mais detalhes, nas patentes Húngaras HU 188.434 e HU 207.751, os autores descrevem a limpeza através de fermen- tação da mistura dos microorganismos acima depositados. De acordo com a patente Húngara HU 213 163, os autores completam a cultura dos microor- ganismos da HU 207.751 com carbóxi-metil-celulose. Os inventores Húnga- ros na HU 1671/96 descrevem culturas contendo os microorganismos Azos- pirillum Iipoferum ssp., Azobacter vinelandi sp., Pseudomonas fluorescens ssp. e Bacillus megaterium ssp.

A aplicação e efeito dos microorganismos aplicados nos proce- dimentos mencionados acima são limitados pelo fato de que esses, sob cir- cunstâncias de cultivo diferentes, em solos de várias composições, sob cir- cunstâncias climáticas diferentes, sobrevivem apenas por um tempo curto, o ambiente e a risoesfera das várias plantas nem sempre criam condições ótimas.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

O propósito básico da invenção é a preparação de tais culturas de microorganismo, que, do ponto de vista de cultivo de planta e econômico, são de um efeito favorável, e que, ao mesmo tempo, podem sobreviver, se multiplicar e exercer seu efeito favorável em vários solos e em várias plan- tas, sob circunstâncias climáticas e de cultivo diferentes.

Foi surpreendentemente constatado que a multiplicação e a so- brevivência dos microorganismos favoravelmente influenciando o desenvol- vimento da planta, fixando o nitrogênio, mobilizando o fosfato, estimulando o crescimento da planta, melhorando a estrutura do solo, cultivados nos labo- ratório variam dependendo da natureza do solo, das condições de tempera- tura e da planta no ambiente imediato da planta. Grupos de microorganis- mos diferentes exercem seu efeito no solo ciernozjom, no solo de baixo teor de húmus, em loess, rural ou por exemplo em ambiente de solo argiloso. Durante os experimentos, foi provado que, embora sendo surpreendente, os outros grupos de microorganismos podem se multiplicar na risoesfera das várias plantas, ou próximo a ela e exercer seu efeito lá por um longo tempo.

Desse modo, os experimentos foram realizados para o isola- mento de tais microorganismos, os quais têm um efeito favorável no ambi- ente de uma dada planta sendo importante do ponto de vista econômico, até o ponto que seu cultivo seja de interesse. Adicionalmente, os experimentos foram também realizados para o isolamento dos microorganismos que po- dem mobilizar os íons de potássio e para a preparação de tais microorga- nismos - isolados do solo e modificados em laboratório, através de procedi- mentos de mutação - que podem propagar no momento de levar para o solo, em uma baixa temperatura, também, e que - mesmo sendo surpreendente para o especialista também - podem exercer seu efeito.

Além disso, foi estabelecido durante os experimentos que certos microorganismos que produzem polissacarídeos, de uma maneira surpreen- dente, mudam a estrutura do solo favoravelmente do ponto de vista agricul- tural, melhorando então a resistência à aridez.

Resumindo o experimento, era o objetivo da invenção isolar tais microorganismos que transmitem nitrogênio, fósforo, potássio à planta, bios- sintetizam hormônios de crescimento vegetais, biossintetizam polissacarí- deos melhorando a estrutura do solo, e que são capazes de propagar no período de semeadura e nos países de clima mais frio, também, e exercem seu efeito em vários solos e plantas. Ainda, era um objetivo da invenção produzir tais preparações, cujos conteúdos de microorganismos, no ambi- ente da planta, na risoesfera, ou diretamente dentre as células vegetais, através de fixação e mobilização de elementos de importância vital, bem como através da produção de fatores de crescimento vegetais e polissacarí- deos em um dado ambiente vegetal, promovem o desenvolvimento de uma da planta ou família de plantas, que tem como conseqüência poupar, de uma maneira que protege o ambiente, o uso de fertilizante.

O objetivo da presente invenção é o procedimento de cresci- mento referente aos microorganismos listados, as preparações contendo esses, ainda, a aplicação da(s) preparação(ões) contendo o(s) microorga- nismo(s) e concretamente os microorganismos.

A presente invenção é baseada no reconhecimento de que para a fabricação das preparações alvo, os microorganismos Azospirilium brasi- Iense ssp. SW51 (NCAIM IPI B 001293), Azobacter vinelandi ssp. M657 (NCAIM IPI B 001292), Pseudomonas fluorescens var. SW11 (NCAIM IPI B 001296), Bacillus poiymyxa var. SW17 (NCAIM IPI B 001295), Bacillus me- gaterium var. M326 (NCAIM IPI B 001291), Micrococcus roseus ssp. A21 (NCAIM IPI B 001294/, Bradyrhizobium japonieum var. PH25 (NCAIM IPI B 001302) e Streptomyees albus var. 0003 LP (NCAIM IPI B 001301) são os mais convenientes, os quais podem multiplicar nas baixas temperaturas do período de semeadura, que fornecem o nitrogênio às plantas, mobilizam fósforo, potássio, biossintetizam hormônios de crescimento e polissacarí- deos, desse modo eles foram isolados e foi elaborado um procedimento de crescimento para eles.

Com relação ao acima, entre 1998 e 1999 foram isolados na Eu- rapa microorganismos de solos e do ambiente de raiz de certas plantas, testados in vitro quanto à sua habilidade de fixação de nitrogênio, solubiliza- ção de fosfato e potássio, produção de polissacarídeo e biossintetização de hormônios vegetais, sistematicamente identificados os microorganismos se- lecionados, preparadas tais variantes através de tratamento por mutação, que propagam intensivamente em temperaturas abaixo de 20°C também, para o cultivo desses elaborada uma tecnologia de crescimento, e a partir de suas culturas preparações foram feitas, e provaram seu efeito sob o desen- volvimento vegetal e os rendimentos através de experimentos em estufa e campo.

As espécies e subespécies de Azospirillum, Azotobacter, Bra- dyrhizobium, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces e Micrococcus foram isoladas.

As espécies Azospirillum menos conhecidas são as bactérias de coloração variável Gram-negativas, que vivem no solo, que, sob circunstân- cias microaerofílicas (na presença de 1-2% de oxigênio), em contato íntimo com o sistema de raiz das plantas, podem reduzir o nitrogênio do ar em amônia, então o transmitem para as plantas. Alguns grupos biossintetizam hormônios vegetais, também.

Os grupos Azospirillum foram isolados do ambiente de raiz de milho, trigo, cevada e arroz cultivados em várias terras aráveis da Europa, em vários solos e da grama de campo de feno. A suspensão de bactérias derivada da amostra de solo foi dispersa no meio de cultura Nfb(II) e MM da composição dada mais tarde, então cultivada sob condições microaerofíli- cas. Após 72 horas, as culturas de Azospirillum foram identificadas. As cultu- ras de Azospirillum, diferindo das outras culturas de bactéria e fungo peque- nas, atingem um tamanho de cerca de 3 mm.

As culturas de Azospirillum sp., quando exponencialmente cres- cendo nos meios de ágar mole MM e Nb(II) líquidos da composição dada mais tarde, mostram a característica morfológica das células de Azospirillum. As células são vibróides e de forma S, e do tamanho 1-2 χ 2-4 pm. Para seu crescimento, elas precisam de biotina. Com base na observação microscópi- ca elas podem se mover rapidamente. Sua mobilidade pode ser atribuída ao seu flagelo polar. Em suas células, essas acumulam grãos de poli-beta- hidróxi-butirato e carotinas. O descoloramento avermelhado pode ser expli- cado pelo envelhecimento da cultura. Para seu crescimento pode-s usar áci- dos orgânicos, tal como ácido málico, ácido láctico, ácido pirorracêmico e ácido butanodióico, também. A fixação do nitrogênio do ar acontece sob cir- cunstâncias microaerófilas. Sob condições extremas, tal como no caso de seca, em valor de pH baixo ou alto, na falta de fonte de nitrogênio ou carbo- no, as células serão transformadas em cistos, onde não há nenhum flagelo, mas que contêm grãos de poli-beta-hidróxi-butirato e são circundados com polissacarídeo capsular. O espectro de utilização de fonte de carbono dos microorganismos é variável com relação às espécies: glicose de A. Amazo- nense + sacarose + inozitol + glicose de A. Brasilense + sacarose e inozitol-, o A. Irakense utiliza a glicose (+) e a sacarose (+), mas não o inozitol (-), fi- nalmente o A. Lipoferum apenas a glicose. Em meio livre de nitrogênio, o espectro da fonte de carbono utilizado é diferente em um grau maior, de modo que as quatro espécies acima podem ser distinguidas. O espectro da fonte de carbono utilizado do microorganismo isolado da invenção parcial- mente difere do neotipo ATCC 29.731 de A. Lipoferrum, A. Amazonense, A. Brasilense e A. Irakense (Holt, J.G. e colaboradores, Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 9a edição, 1994). Contrário aos grupos de tipo, esses aumentam apropriadamente na presença de 3,5% de cloreto de sódio, em ágar macio (será descrito mais tarde) suas imagens microscópicas são diferentes nos vários períodos do cultivo, sua produção de pigmento é mais intensa, por exemplo, em ágar de extrato de batata.

Alguns Azospirillums isolados estão próximos às espécies Azos- pirillum lipoferum, Azospirillum amazonense, Azospirillum brasilense bem como às espécies Azospirillum irakense, experimentos adicionais foram rea- lizados sobre eles enquanto selecionando um dos grupos de Azospirillum brasilense.

A partir das amostras de solo acima, microorganismos Azoto- bacter foram isolados de ágar macio Nfb(II), com cultivo seletivo, então em meio MM e Fjodorov dispersando e selecionando um de quatro subespécies com base em sua habilidade de fixação de nitrogênio e armazenados para experimentos adicionais. As células do grupo são pleiomorfas, de forma co- cóide. Na presença de oxigênio elas se movem rapidamente. Estas são Gram-negativas. Elas produzem pigmento verde-amarelado, fluorescente, em meio livre de oxigênio e utilizam apropriadamente a ramnose e meso- inozitol.

Sabe-se bem que a forma Rhizobiums produz nódulos nas raí- zes das papilionáceas, então, procriando entre as células vegetais, esses transmitem diretamente o nitrogênio fixado à planta. Espécies de Rhizobi- oum diferentes entram em contato com várias papilonáceas, com o feijão de soja o grupo Bradyrhizobium. Uma vez que esse é o solo de espécies Rhi- zobimum, que morrem após a colheita da plantação, isto é, não permane- cem em uma grande quantidade no solo, é aconselhável usar este grupo para tratamento de solo. Foi isolado o grupo Bradyrhizobium em 13 de julho da plantação de soja em Subasa próximo a Szeged-Kiskundorozsma. Das plantas que cresciam no loess, uma planta de bom desenvolvimento que foi selecionada e destacada da cavidade desenvolveu nódulos a partir de suas raízes. A variante psicrofílica do microorganismo isolado conforme dado no exemplo foi depositada.

Nas amostras de solo coletadas para a presente invenção foi procurado por microorganismos de mobilização de fosfato e os microorga- nismos selecionados foram testados a partir do ponto de vista sistemático.

Uma parte dos microorganismos provou ser a espécie Pseudomonas, a ou- tra parte provou ser Bacillus.

As Pseudomonas são células aeróbicas, Gram-negativas, de uma forma aderida fina, elas produzem o principal pigmento fluorescente do meio e são saprófitas. Nenhuma produção de carotina pode ser observada, elas não crescem a temperaturas acima de 40°C. Nos ágares gelatinosos a liquefação pode ser vista. A glicose é utilizada pelos grupos, o amido não. Embora as variantes dos grupos fluorescentes de Pseudomonas estejam sistematicamente em ligação íntima, certas heterogeneidades sistemáticas podiam ser observadas entre os microorganismos da invenção e os grupos do tipo: o microorganismo da invenção - caracteristicamente da Pseudomo- nas - apropriadamente utiliza a glicose, galactose, ácido acético, maltose, glicerina e o ácido pirorracêmico. Ele não utiliza a frutose, D-arabinose, maltose, lactose, amido e inulina. Contrário aos grupos de tipo, no entanto, esses são capazes de crescer em xilose, sacarose e até um certo grau, em sorbitol. Como uma fonte de carbono única, eles podem utilizar glicina.

Com base no acima, um dos microorganismos da invenção foi identificado como a espécie fluorescentes de Pseudomonas e verificado se alojar próximo às variantes pertencentes ao grupo Ill Biovar. O grupo foi chamado Pseudomonas fluorescent ssp.

Com base nas naturezas sistemáticas, exceto pelas células de Bacillus, que podem dissolver o fosfato insolúvel, algumas provaram ser Ba- cillus polymyxa, algumas provaram ser Bacillus megaterium. Alguns grupos foram selecionados para experimentos adicionais.

Dos minerais de potássio, para o isolamento dos microorganis- mos capazes de mobilizar o íon de potássio, microorganismos da superfície de minerais contendo potássio, feldspato e mucovita foram isolados, então testados como dado nos exemplos, em meio sólido, livre de potássio, para provar a mobilização de potássio. Aplicando o procedimento dado nos exemplos, através de tratamentos de mutação, um microorganismo identifi- cado como Streptomyces psychrophilic foi produzido e depositado.

Tal microorganismo foi isolado, também, o qual após os testes de DNS sistemático, morfológico e ribossômico provou ser Micrococcus ro- seus e mostrou um efeito vantajoso extraordinário durante os testes de ve- getal. Um dos grupos deste microorganismo foi depositado, grupo que foi transformado em laboratório.

A invenção é também baseada no fato de que os microorganis- mos de efeito favorável, plantados no solo, podem multiplicar o mais rápido possível no momento do desenvolvimento inicial das semeaduras e plantas, sob as condições climáticas no outono e início da primavera e em países de clima mais frio, também. Desse modo, os microorganismos foram tratados, isolados e mantidos de acordo com o acima conforme dado no Exemplo N0 4. Através de procedimentos reconhecidos, os mutantes e variantes au- mentando em temperaturas baixas foram isolados, também, quando depo- sitados no National Selection of Agricultural and Industrial Micro-organisms.

A invenção refere-se a tais preparações e procedimentos, atra- vés de aplicação deles, o rendimento das culturas de vegetais é aumentado. A produção é acompanhada por cultivo dos microorganismos isolados e testados de várias terras aráveis, do ambiente de várias plantas, existentes no ambiente de uma dada família de planta por um longo tempo, que propa- gam em baixas temperaturas, em vários solos, também, e usando a prepa- ração contendo a cultura sobre plantas relevantes, sobre as sementes, ou na terra arável delas. De acordo com a invenção, as preparações podem ser usadas através de tratamento do solo, das plantas ou das sementes de ve- getais com uma preparação, as quais contêm pelo menos um dos microor- ganismos que seguem: Azospirillum brasilense ssp. SW51 (NCAIM IPI B 001293), Azotobacter vinelandii ssp. M657 (NCAIM IP/ B 001292), Pseudo- monas fluorescent var. SW11 (NCAIM IPI B 001296), Bacillus polymyxa var. SW17 (NCAIM IPI B 001295), Bacillus megaterium var. M326 (NCAIM IPI B 001291), Micrococcus roseus ssp. A21 (NCAIM IPI B 001294), Bradyrhizo- bium japonieum var. PH25 (NCAIM IPI B 001302) e Streptomyees albus var. 0003 LP (NCAIM IPI B 000301).

Como um resultado do tratamento, o desenvolvimento das plan- tas será acelerado, essas serão mais resistentes aos patógenos, o forneci- mento de água da estrutura do solo e das plantas será melhorado e altos rendimentos são providos mesmo com uso reduzido de fertilizante ou sem uso de qualquer fertilizante.

É uma das vantagens mais importantes do procedimento de acordo com a invenção que através de sua implementação, durante o cultivo da planta, a aplicação de fertilizantes baseados em nitrogênio, fosfato e po- tássio será praticamente desnecessária ou ela pode ser reduzida para um grau considerável. O efeito de poluição ambiental dos fertilizantes é eviden- te. Os compostos biossintetizam nas células de microorganismo, promoven- do o desenvolvimento vegetal acelerado da planta tratada, o desenvolvi- mento da raiz e ao mesmo tempo com isso o fornecimento de água das plantas será aperfeiçoado, os microorganismos alimentados reprimem o desenvolvimento de microorganismos fitopatogênicos, os polissacarídeos que biossintetizam nas células de alguns dos microorganismos da invenção melhoram a estrutura do solo, o equilíbrio de água e a vida do solo especial e favoravelmente. As preparações de acordo com a invenção, sua prepara- ção e aplicação, contrário às preparações e procedimentos de preparação conhecidos do mesmo propósito e aplicação, são baseadas no uso de mi- croorganismos de vários efeitos, diferentes, isolados de vários solos, exer- cendo um efeito específico sob uma dada planta cultivada economicamente importante, microorganismos que podem se multiplicar nas baixas tempera- turas no outono e início da primavera e em áreas de clima mais frio, tam- bém.

Os microorganismos de acordo com a invenção podem ser culti- vados em meio contendo como fonte de carbono, por exemplo, glicose, ami- do, sacarose, ou melaço, como fonte de nitrogênio solução de milho em in- fusão, caseína, extrato de levedura ou sais de amônio, ainda outros sais inorgânicos e sais dissociando nos íons de elementos traço, mas, como é evidente para os especialistas, quaisquer sais inorgânicos fontes de carbono e nitrogênio assimiláveis podem ser usados, o que torna possível a propaga- ção das bactérias de acordo com a invenção.

A cultura contendo os microorganismos de acordo com a inven- ção pode ser adicionada diretamente ao solo a ser tratado ou às plantas no meio usado para o cultivo, mas preparações mantendo o potencial biótico do microorganismo, dentre essas, as preparações contendo veículos que fixam as bactérias às sementes com forças de adesão, podem ser preparadas também. A quantidade de bactéria trazida para o solo pode variar entre 5x1011 e 5x1015 células por hectare, a quantidade celular favorável está en- tre 1012e 1013.

No Tratado de Budapeste, os microorganismos isolados da in- venção, identificados a partir de vários ambientes de vegetais, os quais po- dem multiplicar em baixas temperaturas, também, foram depositados no Na- tional Collection of Agricultural and Industrial Micro-organisms, onde estão Azotobacter vinelandii ssp. M657 (NCAIM IPIB 001292,

Pseudomonas fluorescens var. SW11 (NCAIM IPIB 001296), Bacillus polymyxa var. SW17 (NCAIM IPIB 001295), Bacillus megaterium var. M326 (NCAIM IPI B 001291), Micrococcus roseus ssp. A21 (NCAIM IPIB 001294), Bradyrhizobium japonieum var. PH25 (NCAIM IPI B 001302), Streptomyees albus var. 0003 LP (NCAIM IPIB 001301). O escopo de proteção também se estende aos grupos deposita- dos e aos seus mutantes artificiais e naturais, variantes ou aos tipos de gru- po dos microorganismos acima adquiridos de qualquer maneira conhecida, também.

A seguir a invenção será ilustrada com exemplos, sem limitar o escopo de proteção deles.

Nos exemplos as porcentagens são expressas em porcentagens em peso, a menos que de outro modo especificado.

MELHOR MODO DE REALIZAR A INVENÇÃO

Exemplo N0 1

Isolamento dos microorganismos que fixam o nitrogênio do ar a partir de vá- rios solos e do ambiente de várias plantas e prova de sua capacidade de fixação de nitrogênio

A espécie Azospirillum são as bactérias de coloração variável Gram-negativas, as quais são capazes de reduzir o nitrogênio do ar para amônia sob circunstâncias microaerófilas (na presença de 1-2% de oxigênio) e tornar disponível para as plantas.

Espécies Azospirillum foram isoladas de várias amostras de solo (solo de húmus, loess, sódico, marrom e negro, etc), do ambiente de raiz de várias plantas (cereais, girassol, milho, gramas, etc). Os atraentes químicos, tal como os ácidos orgânicos e açúcares, atraem os grupos Azospirillum através de quimiotaxia. Ajudadas por seus flagelos, as bactérias se movem em direção às raízes e quando as atingem, colonizam.

Das diluições de 10-, 100-, 1.000- e 10.000- vezes da dada amostra de solo feita com água destilada, estéril, suspensões de 100-100 μΙ foram pulverizadas em discos Petri contendo ágar macio MM e Nfb(II). A composição do meio MM é como segue:

K2HPO4 1,65 g/l KH2PO4 0,87 g/l MgSO4 x 7H20 0,29 g/l NaCI 0,18 g/l CaCI2 χ 2H20 0,07 g/l FeCI3 χ 6H20 0,01 g/l NaMoO4 χ 2H20 0,005 g/l MnSO4 χ H2O 0,00014 g/l ZnSO4 χ 7H20 0,007 g/l CuSO4 χ 5H20 0,000125 g/l CoSO4 χ 7H20 0,00014 g/l H3BO3 0,00003 g/l Glicose 5,0 g/l Sacarose 5,0 g/l Ágar bacto 20,0 g/l

A glicose foi esterilizada separadamente dos outros componen- tes do meio MM com autoclave (121 °C, 30 minutos), então misturada com eles após resfriamento para a temperatura de 60°C. O meio estéril foi ajus- tado para pH 7,4 com uma solução de NaOH 1N estéril.

As composições do meio Nfb(II) são como segue:

Ácido L-málico 5,0 g

Hidrogeno-fosfato de dipotássio 0,5 g

Sulfato de magnésio x7 água 0,2 g

Cloreto de sódio 0,1 g

Cloreto de cálcio 0,02 g

Solução de elemento traço* 2,0 ml Brometo de azul de timol (solução aquosa a 0,5% de material

dissolvido em 0,2 N de KOH) 2,0 ml

Solução de 1,564% de Fe-EDTA 4,0 ml

Solução de vitamina** 1,0 ml

Ágar 1,75g

O meio foi ajustado com solução de KOH aquosa 1N para pH 6,8.

*A composição da solução de elemento investigado é como segue:

Sulfato de ferro 11x7 H2O 200 mg

Cloreto de ferro 111x6 H2O 10 mg

Sulfato de manganês χ H2O 1 mg

Sulfato cúprico χ 5 H2O 2 mg

NaMoO4 x 2 H2O 1 mg

Cloreto de cobalto χ 6 H2O 2 mg

Sulfato de zinco χ 7 H2O 2 mg

Tetraborato de sódio χ 10 H2O 1 mg

P2O5 x 24 WO3 x H2O 0,5 mg

Nitrato de bismuto χ 5 H2O 0,1 mg

Cloreto de estanho 0,01 mg

Cloreto de selênio 0,01 mg

Iodeto de potássio 1 mg

Ácido cítrico 100 mg

Água destilada 1000 ml

**A composição da solução de vitamina é como segue: Vitamina C 50 mg

Vitamina B1 5 mg

Vitamina E 2 mg

Vitamina A 2 mg

Biotina 4 mg

Água destilada 100ml

As bactérias postas no meio a ser encontrado nas placas MM foram postas em termostatos anaeróbios, trocando o espaço de ar do ter- mostato por nitrogênio, então ajustadas para concentração de oxigênio de 1,6% com o refluxo de ar de quantidade satisfatória. As placas foram incu- badas em uma temperatura de 32°C, então após 72 horas os organismos Azospirillum foram identificados. Correspondendo à linha de diluição, na pla- ca espalhada com a suspensão diluída 10 vezes, um campo de bactéria contínuo foi desenvolvido, enquanto que da suspensão 10.000 vezes diluída geralmente 30-50 culturas se desenvolveram. As culturas de Azospirillum, diferindo de outras culturas de bactérias e fungos pequenas, atingiram um tamanho de cerca de 3 mm. Além das culturas, várias outras eram morfolo- gicamente similares às culturas de Azospirillum. Além dessas foram estuda- das algumas outras.

As culturas de ágar macio Nfb(II) foram postas em termostato aeróbio, no meio acima e sob as circunstâncias de cultivo acima, primeiro de tudo o Azospirillum se multiplica, e com morfologia reconhecível, característica.

Os vários grupos de bactéria Azospirillum adquiridos dos meios MM e Nfb(II) foram cultivados obedecendo à prática biológica, de uma ma- neira tal que a cultura bacteriana principal foi espalhada duas vezes em uma cultura, em um meio TAg completo. Os grupos de bactéria Azospirillum fo- ram purificados espalhando duas vezes em uma cultura em meio TAg líquido e armazenados na cultura do grupo. A suspensão de bactéria na temperatu- ra de -80°C foi considerada como a cultura de grupo e todos os experimen- tos foram iniciados a partir desta cultura.

A composição do meio TAg é como segue:

Bacto tripton (Difco) 1,0%

Extrato de levedura (Difco) 0,1 %

NaCl 0,5%

Ágar 2,5%

Após esterilização, as soluções aquosas dos compostos que seguem, na concentração final que segue, foram adicionadas:

0,1% de 0,1 M de CaCl2 x 6H20

0,1% de 0,1 M de MgCl2 x 6H20 0,2% de glicose (separadamente esterilizada)

Após esterilização o pH do meio foi ajustado para 7,0-7,2.

A colonização da raiz pode ser detectada através de um simples experimento. Na raiz de planta de milho e trigo tratada com bactéria Azospi- ríllum, semeada em perlita estéril (pote de diâmetro de 15 cm) e células de número igual (1x1010 células por pote), com base em contagem microscópi- ca, essencialmente mais células de Azospirillum foram detectadas do que nos controles. A colonização da raiz acontece com base em um mecanismo de reconhecimento específico. Durante a colonização, as células de Azospi- rillum penetram na matriz da raiz e essas lá - por meio de sua fixação de nitrogênio ativa - podem cobrir uma parte da necessidade de nitrogênio da planta principal (fixação de nitrogênio associativa). Isso foi provado pelo crescimento de massa verde mais alta de milho e trigo inoculados com gru- pos AzospirHIum durante os experimentos de laboratório da presente inven- ção, cujos resultados são detalhados mais tarde. Os Azospirillums produzem hormônios vegetais e materiais que promovem o crescimento, também, o surgimento desses materiais e seu efeito favorável sobre a planta principal podem ser mostrados com a eficiência de germinação maior e com o cres- cimento da planta mais intenso, com os experimentos realizados sob cir- cunstâncias de laboratório.

As características morfológicas das espécies de Azospirillum isoladas são encontradas na parte geral da invenção.

No ágar macio Nfb(II) com cultivo seletivo, então em meio MM livre de nitrogênio com cultivo seletivo, microorganismos de Azospirillum fo- ram isolados de amostras de solo de terra lavrada. Esses grupos foram veri- ficados ser Azospirillum brasilense de acordo com as características siste- máticas e o espectro de utilização de fonte de carbono, fixando o nitrogênio molecular do ar para um grau amplo com SW5-01-07, então, conforme des- crito mais tarde, variantes multiplicando em temperaturas baixas também, biossintetizando polissacarídeo, foram isoladas, e uma dessas foi depositada.

Para o isolamento dos grupos de Azotobacter, em adição ao uso dos meios Nfb(II) e MM da composição dada acima, as amostras de solo foram cultivadas em meio Fjodorov, também, onde os Azotobacters mostram propriedades morfológicas características. A composição do meio Fjodorov é como segue:

Dihidrogeno-fosfato de potássio 0,03%

Hidrogeno-fosfato de cálcio 0,02%

Sulfato de potássio 0,02%

Sulfato de magnésio x7 aqv. 0,03%

Carbonato de cálcio 0,5%

Cloreto de sódio 0,05%

Cloreto férrico/lll 0,02%

Molibdenato de sódio 0,0002%

Manitol 2,0%

Ágar bacto 2,0%

O pH do meio antes da esterilização foi ajustado com solução de

hidróxido de sódio 1N para 7,0.

Em ágar macio Nfb(II) com cultivo seletivo, então em meio livre de nitrogênio MM e Fjodorov com cultivo seletivo, microorganismos de Azo- tobacter foram isolados de amostras de solo de terra arada. Esses grupos foram verificados ser Azotobacter vinelandii de acordo com as naturezas sistemáticas e o espectro de utilização de fonte de carbono, fixando o nitro- gênio molecular do ar em uma grande extensão com a marca M65-01-34, conforme descrito mais tarde, variantes multiplicando em uma baixa tempe- ratura foram isoladas também e uma dessas depositadas pela requerente.

A capacidade de fixação de nitrogênio dos grupos Azospirillum e Azobacter foi determinada através do método de redução de acetileno tam- bém. De acordo com o método (Dilworth, M.J., J. Biochem. Biophys. Acta, 27, 285, 1996), acetileno foi injetado na cultura em um prato fechado com um injetor, então, após incubação por 12 horas, 0,25 ml de mistura de gás foi injetado na coluna Propak N do cromatógrafo de gás Perkin-Elmer. A concentração de acetileno e etileno da mistura de gás foi determinada atra- vés de um detector de ionização de chama de hidrogênio. A partir da altura dos picos de acetileno e etileno, poderia ser definitivamente concluída a ati- vidade complexa da enzima da nitrogenase. Os grupos de Azospirillum e Azotobacter reduziram, dentro de 1 hora, acetileno de uma quantidade entre 15 e 85 nmol em etileno.

O grupo Bradyrhizobium foi isolado em 13 de julho de 2000 de plantas de soja de Subasa localizado próximo a Szeged-Kiskundorozsma. Das plantas crescendo no Ioess uma planta se desenvolvendo bem foi sele- cionada e dessas raízes os nódulos bem desenvolvidos foram removidos. Os nódulos foram lavados com água estéril, destilada, espremidos, então as partículas foram suspensas em solução salina fisiológica. A partir da sus- pensão, sob condições estéreis, séries de diluição foram preparadas e es- palhadas em meio completo. A capacidade de fixação de nitrogênio das culturas crescendo após a incubação de 48 horas através de um chamado teste de planta simbiótico foi determinada como segue: a superfície das se- mentes medic comerciais (Medicago sativa) foi esterilizada através de trata- mento com calor de 2 horas feito em uma temperatura de 72°C e através de enxágue cuidadoso com uma solução Hypo de 20%, então germinadas em um meio de água destilada contendo 1% de ágar. As plantinhas foram pos- tas em ágar oblíquo Gibson 1,5% (veja mais tarde) e cultivadas em estufa por uma semana. As plantas de uma semana de vida foram inoculadas com as células de uma cultura bacteriana cada uma e cultivadas em estufa por mais oito semanas. A partir dos grupos pertencentes às três plantas mostrando um desenvolvimento proeminentemente alto (peso seco das partes acima da raiz 22-26 mg, contrário ao peso das plantas de controle de 3-5 mg), três foram selecionadas e com base em suas propriedades impor- tantes do ponto de vista morfológico e sistemático, foram chamadas Bra- dyrhizobium japonicum var. PH-2-1-3.

Exemplo N° 2

Isolamento de microorganismos de solubilização em fosfato e potássio

As amostras de solo foram coletadas em várias partes do mun- do, as suspensões aquosas das amostras espalhadas em meio TAg (vide acima), então os materiais isolados de cultura de Pseudomonas e Bacillus e morfologia celular foram testados.

Os vários grupos de Pseudomonas e Bacillus foram purificados obedecendo à prática microbiológica propagando a cultura bacteriana princi- pal várias vezes em uma única cultura, em um meio TAg completo. Os gru- pos bacterianos foram aumentados e armazenados purificados com espa- Ihamento em meio TAg líquido e sólido.

As propriedades de mobilização de fosfato dos microorganismos foram testadas em um meio Ágar Nutriente (Oxoid) contendo 1% de hidróxi- apatita, completado com Pikovskaya modificado (HP) e 10% de fosfato de tricálcio e glicose (0,2%).

A composição dos meios usados durante os experimentos é como segue:

Meio Pikovskaya modificado:

<table>table see original document page 21</column></row><table>

As soluções dos compostos que seguem foram adicionadas ao meio após esterilização:

1 % de 20 mg/100 ml de FeSO4 χ 7H20

1% de 40 mg/100 ml de MnSO4 χ H2O

Antes da esterilização o meio foi ajustado para pH: 7,2.

Naoxg: Ágar Nutriente (Oxoid) preparado de acordo com as ins- truções do fabricante + 0,2% de glicose.

Durante o teste da capacidade de solubilização de fosfato dos grupos selecionados durante os experimentos preliminares em meio Piko- vskaya (HP), as culturas que cresceram dentro de 3-4 dias em uma tempe- ratura de 30°C produziram anéis de solução de 29 e 38 mm. As suspensões celulares dos mesmos grupos obtidos de ágar oblíquo TAg, com 1 ml de água destilada, foram derramadas em furos feitos em placas Naoxg com- pletadas com 10% de fosfato de tricálcio (0,1 mg/furo). Incubando as cultu- ras em uma temperatura de 30°C, dentro de 2-3 dias anéis de solução bem visíveis podem ser observados. O tamanho deles era 24 mm quando usando os grupos Pseudomonas testados em detalhes e 26 mm quando foram usa- dos os grupos Bacillus, o tamanho médio perfazia 34 mm.

Cada grupo Pseudomonas individual e alguns grupos Bacillus provaram ter propriedades de solubilização de fosfato intensas. Os grupos carregam ambas variantes de fosfato inorgânicas bem detectáveis em solu- ção, de modo que pode ser dito que eles têm excelentes propriedades de solubilização de fosfato.

Com base em suas características sistemáticas e no espectro de utilização de carbono, os quatorze organismos de Pseudomonas e os vinte e um de Bacillus selecionados com base nos testes foram verificados ser Pseudomonas fluorescens e Bacillus polymyxa bem como Bacillus megate- rium, que foram marcados na seqüência de ordem que segue: SW1-1-14, SW17-1-15 e M32-1-10, então, conforme dado mais tarde, variantes multipli- cando em baixa temperatura, também, e biossintetizando polissacarídeo em grandes quantidades foram isoladas e depositadas.

O isolamento dos microorganismos mobilizando os íons de po- tássio foi realizado conforme acima descrito, com a diferença de exclusão do cloreto de potássio do meio Pikovskaya (HP) da composição dada acima e adicionando 1% de feldspato moído em pó fino e xisto de mica ao invés de hidróxi-apatita.

Ao redor das culturas de microorganismo trazendo os minerais insolúveis em água completamente ou parcialmente em solução uma zona transparente será formada.

Alguns desses foram selecionados e com base nas característi- cas sistemáticas, propriedades morfológicas e no espectro de utilização de fonte de carbono foram verificados ser Bacillus e Streptomyces, os 15 gru- pos da invenção foram marcados como N0 1-015-0003, e então, conforme descrito mais tarde, variantes multiplicando em baixa temperatura foram isoladas, também, e uma dessas foi depositada.

Exemplo N0 3

Isolamento de microorganismos produtores de sideróforos e hormônio vegetais

A capacidade de produção de sideróforo e hormônio dos grupos isolados conforme descrito nos Exemplo N0 1 e 2 foi testada usando o meio King Β. A composição deste é como segue:

Peptona 2%

Glicerina 1%

K2HPO4 0,15%

MgSO4X 7H20 0,15%

Ágar 2%

Antes da esterilização, o meio foi ajustado para pH 7,2, com so- lução de hidróxido de sódio.

Os grupos Pseudomonas produzindo os sideróforos fixam os íons de ferro, os quais eles transmitem para a planta em solo pobre em ferro, também. Além disso, eles inibem a propagação de alguns microorganismos fitopatogênicos, tal como Erwinia caratovora, uma vez que esses não podem utilizar o ferro fixado. Foi testada a produção de sideróforo através da inibi- ção do crescimento do grupo Escherichia coii MC1061. As suspensões ce- lulares dos dois grupos de cultura de ágar foram preparadas com água des- tilada, então cultivadas pingando em placa King B sem ferro e contendo ferro (1 μΜ FeCl3 χ 7H20) (30-50 μl) por 48 horas, em uma temperatura de 28°C, seguido por pulverização da placa com cultura MC1061 de E. Coii obtida de ágar TAg e continuando a incubação por mais 28 horas, em uma temperatu- ra de 28°C. Em volta das culturas, várias zonas de inibição podem ser ob- servadas. Os resultados da média de quatro experimentos são mostrados na Tabela N0 1 como controle negativo Bacillus megaterium, como controle po- sitivo Pseudomonas fiuorescens (foram usados). Tabela N0 1

<table>table see original document page 24</column></row><table>

* Extensão de inibição: - nenhuma; + baixa; ++ e +++ alta e muito alta.

Durante o teste da produção de sideróforo com o grupo mob4 e de controle positivo uma zona de inibição considerável foi observada, a qual cessou na presença de íons de ferro.

Conforme acima mencionado, alguns grupos Pseudomonas pro- duzem hormônios vegetais. Microorganismos selecionados foram testados para verificar se são capazes de biossíntese de ácido giberélico no meio TAg da composição dada acima. Os testes foram realizados usando ácido giberélico padrão A (Sigma), através de cromatografia de camada fina (Merck) de sílica-gel (40 pg/ml). Extração das culturas com acetato de etila foi seguida por extração com carbonato de hidróxido de sódio de volume duplo, então em uma solução de pH 2,5 com acetato de etila novamente. No resíduo de evaporação do extrato os grupos que seguem como um ponto de valor Rf próximo ao padrão foram encontrados: Tabela N0 2

<table>table see original document page 25</column></row><table>

Os grupos marcados com SW1-1-6 e M32-1-9 foram seleciona- dos (esses produzem aproximadamente 3-15 pg de hormônio por milímetro).

Os grupos conforme descrito na parte geral foram testados e identificados a partir do ponto de vista sistemático.

Exemplo N0 4

Isolamento de microorganismos produtores de polissacarídeo extracelular 4a. Seleção de Bradyrhizobium

Os grupos de Bradyrhizobium PH2-1-3 foram espalhados em meio TAg contendo 1% de glicose e 1% de sacarose (vide acima) e a quan- tidade de polissacarídeo (limo) testada em torno das culturas. Os grupos PH2-1-1 e -2 biossintetizando o polissacarídeo foram selecionados. 4B. Isolamento de Bacillus

Os Bacillus M32-1-10 e SW17-1-15 foram espalhados em meio TAg contendo 1% de glicose e 1% de sacarose (vide acima) e a quantidade de polissacarídeo (lodo) testada em torno das culturas. Os grupos M32-1-6.8 e 10 e SW17-1-7.11 e 15 biossintetizando o polissacarídeo foram seleciona- dos.

O microorganismo isolado provou ser Micrococcus roseus, em meio completo contendo glicose e sacarose está biossintetizando grandes quantidades de polissacarídeo transformando o meio de cultura em um ma- terial viscoso.

Os grupos selecionados, de acordo com os testes da presente invenção, estão biossintetizando polissacarídeo solúvel em água do tipo succionoglicona, de estrutura conhecida. Exemplo N° 5

Isolamento de microorganismos resistentes ao frio

Os microorganismos selecionados de acordo com os exemplos 1-4 foram tratados com agentes causadores de mutações e com radiação.

As suspensões dos microorganismos preparadas com água destilada foram tratadas com 0,01, 0,1, 1,0, 10 e 100 gg/ml de guanidina nitrosa por 1, 3, 5, 10 e 30 minutos. Seguindo o tratamento, a suspensão celular foi centrifuga- da, lavada com água destilada duas vezes, então as células espalhadas em meio de cultura TAg. O tratamento foi repetido com suspensão celular em água destilada contendo 109 microorganismos por milímetro, mantendo as células por 1, 3, 5, 10 e 30 minutos sob uma lâmpada UV de 15W, em uma distância de 10 cm delas. As suspensões celulares foram espalhadas em meio de cultura TAg, com diluição serial.

As culturas TAg foram incubadas em uma temperatura de 18°C por 192 horas, seguido por isolamento das culturas maiores em ágares oblí- quos TAg incubados em uma temperatura de 18°C.

As culturas em crescimento que seguem são controladas e mantidas.

Além dos isolados, microorganismos selecionados e de resistência ao frio foram separados e depositados:

AzospiriHum brasilense ssp. SW51 (NCAIMIP/ B 001293),

Azotobacter vinelandii ssp. M657 (NCAIM IPI B 001292,

Pseudomonas fluorescens var. SW11 (NCAIM IPIB 001296),

Bacilluspolymyxa var. SW17 (NCAIM IPIB 001295),

Bacillus megaterium var. M326 (NCAIM IPI B 001291),

Micrococcus roseus ssp. A21 (NCAIM IPIB 001294),

Bradyrhizobium japonieum var. PH25 (NCAIM IPl B 001302),

Streptomyees albus var. 0003 LP (NCAIM IPIB 001301).

Exemplo N0 6

Cultivo de Microorganismos

6A. Cultivo em meio de cultura completo:

A partir de meio de cultura TAg culturas de ágar oblíquo foram preparadas, então incubadas em uma temperatura de 30°C, por 48 horas. A partir de culturas de Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Brayrhizobium, Pseudomonas, Streptomyces ou Micrococcus foram inoculadas nos meios de cultura marcados - Tali - da composição que segue:

<table>table see original document page 27</column></row><table>

As porções de 100-100 ml do meio de cultura foram cheias em frascos Erlenmeyer de 500 ml, então esterilizadas em uma temperatura de 121 °C, por 30 minutos. Os meios de cultura estéreis foram inoculados com os microorganismos que cresceram em culturas de ágar oblíquo e o cultivo das culturas foi realizado em uma temperatura de 25°C, em uma mesa gira- tória trabalhando com 260 rotações por minuto, por 36 minutos. O cresci- mento foi observado com teste microscópico, então, usando uma quantidade de 5% dos inócuos, que foram inoculados nos meios de cultura de fermenta- ção principais Talfda composição que segue:

<table>table see original document page 27</column></row><table> Extrato de levedura Gistex 0,4%

Caseína ácida 0,4%

Sulfato de amônio 0,2%

Nitrato de amônio 0,2%

Carbonato de cálcio 0,3%

Dihidrogeno-fosfato de potássio 0,2%

Cloreto de sódio 0,1%

Sulfato de magnésio χ 7H20 0,2%

*Solução de elemento de traço 0,45%

Óleo de palma 0,2%

*Composição da solução de elemento traço está de acordo com

o Exemplo N0 1.

O meio de cultura por 100 ml em frascos Erlen-meyer foram es- terilizados, e em fermentadores de laboratório de um volume bruto de 10 I de um volume líquido de 5 I, sob as circunstâncias dadas acima.

As culturas postas nos frascos foram cultivadas em mesa girató- ria, enquanto nos fermentadores da maneira comum, com secagem v/v e operando um misturador turbo com entrada dupla, girando 360 vezes por minuto, por 24 horas, enquanto que o número celular por milímetro - depen- dendo da bactéria - atinge os valores de 4x108 - 1,3-x109.

Para a preparação de culturas de quantidades maiores, 10 litros de cultura foram preparados no meio de cultura Tali da composição dada acima, sob as condições de fermentação dadas acima, então 100 litros de meio de cultura esterilizado Tali e 100 litros de Talfforam inoculados com 5-5 litros cada. O cultivo foi continuado por 24 horas, sob as circunstâncias de fermentação acima, então a cultura cresceu no meio de cultura Talf no solo, 50 litros da cultura que cresceu no meio de cultura Ta1 i foram usados para inocular 1000 litros de meio de cultura Talf esterilizado. O cultivo foi realizado sob as circunstâncias de fermentação acima por 24 horas, então, seguido pela inspeção, a cultura estava pronta para uso. No caso de uma espumação excepcionalmente intensa, 0,01% de polipropileno-glicol como agente antiespumante foi adicionado. 6Β. Cultivo de meio de cultura semimínimo:

O procedimento dado no Exemplo N0 6 foi repetido com a dife- rença que ao invés do meio de cultura Talf o meio de cultura Ta2f da com- posição que segue foi usado:

Glicose (separadamente esterilizada

<table>table see original document page 29</column></row><table>

* A composição da solução de elemento traço está de acordo com aquela no Exemplo N01.

Após o término dos cultivos, as culturas contêm, dependendo da bactéria, 1-7x108 células por mililitro.

Exemplo N0 7

Melhora da estrutura do solo e experimentos de cultivo de planta

7A. Experimentos para a melhora das estruturas do solo Solo arenoso coletado em Danube, próximo a Somlyósziget, e os solos de argila de Esztergom foram postos em bandejas de 90 χ 90 cm, a espessura das camadas era 25 cm. O solo arenoso foi tratado com 10 g de nitrato de amônio e 5 g de fosfato de cálcio por bandeja. O milho foi semea- do na bandeja, com 104 sementes por bandeja. Na avaliação não foram to- mados os dados das cinco plantas maiores e das cinco menos desenvolvi- das. O peso das raízes lavadas com água destilada seguindo uma disseca- ção de dois dias, em uma temperatura de 45°C, foi medido. A bandeja N° 1 foi abundantemente aguada, a bandeja N° 2 semeando abundantemente aguada mas não depois. As bandejas marcadas "a" foram inoculadas como microorganismos biossintetizando os polissacarídeos das culturas dos gru- pos de microorganismo Bacillus polymyxa var. SW17(NCAIM IPI B 001295), Bacillus megaterium var. M326 (NCAIM /P/B 001291), Micrococcus roseus ssp, A21 (NCAIM /P/B 001294) e Bradyrhizobium japonieum var. pH25 (NCAIM /P/B 001302), depositados no National Collection of the Agricultural and Industrial Micro-organisms, preparados de acordo com o Exemplo N0 6, com 108 células por um metro quadrado de cada bactéria. As bandejas mar- cadas com "b" não foram tratadas com microorganismos.

Na Tabela N0 3, os resultados obtidos no 33° dia seguindo a se- meadura são mostrados. Os resultados são expressos com os valores médi- os contados para uma planta.

Tabela N° 3

<table>table see original document page 30</column></row><table>

Na Tabela N° 4, a extensão de esfarelamento e quebra dos solos arenoso e de argila não aguados (bandejas N0 2) é mostrada. Por extensão do esfarelamento se quer dizer a maioria dos fragmentos de solo espalhados na folha de papel e que não desintegram durante uma leve agitação que são de um tamanho abaixo de 2 mm (-), entre 2,5 mm (+) ou acima de 5 mm (++). A extensão da quebra da superfície do solo é marcada de modo que a falta de quebras é marcada ++, as quebras leves são marcadas +, enquanto que a presença de linhas grandes de quebra, quebras características dos solos secos é marcada -.

Tabela N° 4

<table>table see original document page 31</column></row><table>

Pode ser visto a partir dos dados das Tabelas N0 3 e 4 que a presença dos microorganismos biossintetizando os polissacarídeos melhora o desenvolvimento das plantas e a estrutura de solo favorável.

7B. Experimentos de campo

Os experimentos foram realizados na Improvement and Cultiva- tion Technological Station of Mosonmagyaróvár University, em 2000, em disposições em bloco aleatórias repetidas quatro vezes, com 10 litros de mistura de microorganismo por hectare.

Tipo de solo experimental: região Danúbio, espessura: 120-140 cm, teor de húmus: 2,4%, chuva: pobre.

TRIGO PRIMAVERA

<table>table see original document page 31</column></row><table> <table>table see original document page 32</column></row><table> <table>table see original document page 33</column></row><table> <table>table see original document page 34</column></row><table>

MILHO

Plantação natural de espiga de milho (kg/parcela)

<table>table see original document page 34</column></row><table> <table>table see original document page 35</column></row><table> <table>table see original document page 36</column></row><table> BETERRABA SACARINA

<table>table see original document page 37</column></row><table> <table>table see original document page 0</column></row><table> <table>table see original document page 39</column></row><table>

Exemplo N0 8

Preparação de preparações contendo os microorganismos de acordo com a invenção

8A. Preparação de mistura de microorganismos:

As culturas de Azospirillum brasilense ssp. SW51 (NCAIM IPI B 001293), Azotobacter vinelandii ssp. M657 (NCAIM IPI B 001292), Pseudo- monas fluorescens var. SW11 (NCAIM IPI B 001296), Bacillus polymyxa var. SW17 (NCAIM IPI B 001295), Bacillus megaterium var. M326 (NCAIM IPI B 001291), Micrococcus roseus ssp. A21 (NCAIM IPI B 001294), Bradyrhizo- bium japonieum var. PH25 (NCAIM IPI B 001302) e Streptomyees albus var. 0003 LP (NCAIM IPI B 001301) preparadas de acordo com o Exemplo N0 6 foram misturadas otimamente em proporções iguais e aplicadas no solo a ser tratado, em uma quantidade entre 5 litros e 50 litros, otimamente em uma quantidade de 12 litros/ha, qualquer período livre de frio do ano, otimamente entre março e outubro.

8B. Preparação para o tratamento de monocotiledôneas

Seguindo o procedimento de acordo com o Exemplo N0 6, foi feita uma preparação com a diferença que os microorganismos que seguem foram usados:

Azospirillum brasilense ssp. SW51 (NCAIM IPI B 001293), Azo- tobaeter vinelandii ssp. M657 (NCAIM IPI B 001292), Pseudomonas flúores- cens var. SW11 (NCAIM IPI B 001296), Bacillus polymyxa var. SW17 (NCAIM IPI B 001295), Bacillus megaterium var. M326 (NCAIM IPI B 001291) e Streptomyces albus var. 0003 LP (NCAIM IPIB 001301). 8C. Preparação para o tratamento de dicotiledôneas Seguindo o método de acordo com o Exemplo N0 6 com a dife- rença que os microorganismos que seguem foram usados: Azospirillum brasilense ssp. SW51 (NCAIM IPI B 001293), Azotobaeter vi- nelandii ssp. M657 (NCAIM IPI B 001292), Pseudomonas fluoreseens var. SW11 (NCAIM IPI B 001296), Bacillus polymyxa var. SW17 (NCAIM IPI B 001295), Bacillus megaterium var. M326 (NCAIM IPI B 001291), Miero- eoceus roseus ssp. A21 (NCAIM IPI B 001294), Bradyrhizobium japonieum var. PH25 (NCAIM IPI B 001302) preparação de acordo com a invenção foi preparada.

8D. Fabricação de preparação seca em condição fria 2 litros de suspensão de microorganismo aquosa de acordo com o Exemplo N0 6 foram Iiofilizados em um equipamento de liofilização SP54 Gelman agindo de acordo com as instruções de uso do equipamento. O pó de microorganismo seco foi usado sozinho ou dependendo do uso, mistura- do com carbonato de cálcio, amido, glicose, ou celulose em proporções en- tre 1:1 e 1:100, então armazenando a preparação até o uso em uma tempe- ratura entre 4 e 10°C.

8E. Fabricação de preparação contendo veículo: Proporção otimamente igual das culturas preparadas no meio de cultura de acordo com o Exemplo N0 6 foi misturada com adubo orgânico, farinha de soja (tamanho de grão geral de peneira 4), metil celulose ou ami- do de batata de modo que a preparação contivesse 5 χ 108 - 1010, otima- mente 5 χ 109, células de microorganismo, então a preparação úmida ou a preparação seca em uma temperatura abaixo de 40°C, em quantidade 2 e 20, otimamente na quantidade de 5 kg/ha, foi aplicada no solo a ser tratado. Otimamente pelo menos 1013 células de microorganismo por hectare foram incorporadas ao solo. Sumário

O objeto da invenção são produtos e procedimento para o trata- mento do solo com bactérias para o aperfeiçoamento do crescimento das plantas e para aumento dos rendimentos, procedimentos para fabricação dos produtos, estoques de microorganismo servindo como uma base dos produtos, de multiplicação em baixa temperatura, biossintetização de polis- sacarídeos, e procedimento para a produção deles. Uma das células de mi- croorganismo de acordo com a invenção ou um composto delas será trans- portado para o solo ou fixado às sementes da planta.

Com o procedimento de acordo com a invenção, será transpor- tado um produto para o solo, produto que contém pelo menos um dos gru- pos bacterianos de solo que transformam o nitrogênio do ar em compostos disponíveis para as plantas, solubilizam os compostos de fosfato e potássio mineralizados e biossintetizam os materiais melhorando o desenvolvimento vegetal, produzem polissacarídeos otimamente influenciando a estrutura do solo, são isolados de vários solos e alterados em laboratório, de modo que rendimentos satisfatórios serão conseguidos, praticamente excluindo a apli- cação de fertilizantes onerosos.

Claims (13)

1. Preparações adequadas para tratamento do solo e sementes de planta, as quais contêm microorganismos vivos ou microorganismos ca- pazes de propagar-se em diferentes tipos de solo no ambiente de uma plan- ta, caracterizadas pelo fato de que contêm, em uma quantidade de 5 χ 10^6-10^11 células/g, a cultura de Bacillus megateríum var. M326 (NCAIM IPI B 001291) e opcionalmente um ou mais do seguintes microorganismos: Azospirillum brasilense ssp. SW51 (NCAIM IPI B 001293), Azo- tobacter vinelandii ssp. M657 (NCAIM IPI B 001292), Pseudo- monas fluorescens var. SW11 (NCAIM IPI B 001296), Bacillus polymyxa var. SW17 (NCAIM IPt B 001295), Micrococcus roseus ssp. A21 (NCAIM IPI B 001294), Bradyrhi- zobium japonicum var. PH25 (NCAIM IPI B 001302), e Strep- tomyees albus var. 0003 LP (NCAIM IPIB 001301), os ditos microorganismos propagándo também em baixa temperatura, abai- xo de 20°C, bem como em solos com baixo pH, abaixo de 5,0, depositados no National Collection of the Agricultural and Industrial Micro-organisms, Bu- dapeste, Hungria, com veículos úmidos ou secos aceitáveis do ponto de vis- ta agrícola e não-tóxicos para os microorganismos.

2. Preparações, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de que contêm 107-10^10 células/g de microorganismo.

3. Preparações, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de que contêm água e/ou farinha de soja e/ou amido e/ou celulose e/ou glicose ou os derivados deles como veículo.

4. Preparações, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizadas pelo fato de que contêm como microorganismo: Bacillus megateríum var. M326 (NCAIM IPIB 001291), Azotobaeter vinelandii ssp. M657 (NCAIM IPIB 001292), Azospirillum brasilense ssp. SW51 (NCAIM IPI B 001293), e Pseudomonas fluorescens var. SW11 (NCAIM IPI B 001296).

5. Processo para a preparação de preparações como definidas na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de cultivar separadamente ou jun- tos, em um meio de cultura contendo fonte de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, o microorganismo Bacillus megaterium var. M326 (NCAIM IP/ B 001291) e opcionalmente um ou mais dos seguintes microorganismos: Azospirillum brasilense ssp. SW51 (NCAIM IPI B 001293), Azo- tobacter vinelandii s$p. M657 (NCAIM IPI B 001292), Pseudo- monas fluorescens var. SW11 (NCAIM IPI B 001296), Bacillus polymyxa var. SW17 (NCAIM IPIB 001295), Micrococcus roseus ssp. A21 (NCAIM IPI B 001294), Bradyrtii- zobium japonieum var. PH25 (NCAIM IPI B 001302), e Strep- tomyees albus var. 0003 LP (NCAIM /P/ B 001301), depositados no National Collection of the Agricultural and Industrial Micro- organisms até atingirem o número de células entre 5 χ 107 e 5 χ 109 por mili- litro, opcionalmente misturando a cultura ou culturas obtidas em uma propor- ção específica ou opcionalmente depositando a(s) cultura(s) no veículo ou misturando com ele e opcionalmente Iiofilizando de uma maneira tradicional.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que são usados como fonte de carbono, glicose e/ou sacarose e/ou melaço, como fonte de nitrogênio, cloreto de amônio e/ou nitrato de amônio e/ou sulfato de amônio e/ou solução em infusão de milho e/ou hidrolisato de caseína, e como sal inorgânico, carbonato de cálcio e sais dissociando em íons de sódio, potássio, magnésio, cálcio, ferro, nitrato, cloreto, sulfato, car- bonato, fosfato e elementos traço.

7. Processo para a preparação de microorganismos que se propa- gam otimamente também em uma temperatura abaixo de 20°C e baixo pH, abaixo de 5,0, depositados no National Collection of the Agricultural and Indus- trial Micro-organisms, Budapeste, Hungria, sob os números que seguem: Bacillus megaterium var: M326 (NCAIM IPl B 001291), Azospirillum brasilense ssp. SW51 (NCAIM IPI B 001293), Azotobactervinelandii ssp. M657 (NCAIM IPIB 001292), Pseudomonas fluorescens var. SW11 (NCAIM IPI B 001296), Bacillus polymyxa var. SW17 (NCAIM IPIB 001295), Mierococeus roseus ssp. A21 (NCAIM IPI B 001294), Bradyrhizobium japonicum var. PH25 (NCAtM /P/B 001302), e Streptomyces albus var. 0003 LP (NCAIM /P/B 001301), caracterizado pelo fato de coletar amostra de solo dó ambiente de plantas, da camada superior (alto) de 40 cm de um dado tipo de solo, identificar os microorganismos selecionados, aplicar um tratamento com agentes de muta- ção, e isolar as variantes que se multiplicam também em baixa temperatura.

8. Processo para tratamento de solo com as preparações como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de aplicar transporte de células de microorganismos em quantidades entre 10^10 e 10^14, otimamente entre 10^11 e 10^12, por hectare ou no solo, no período sem frio.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de aplicar as células de microorganismos em quantidades entre 10^11 e -10^12, por hectare ou no solo.

10. Processo para o tratamento de sementes de planta, caracte- rizado pelo fato de tratar as sementes com uma preparação líquida como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, contendo os microorga- nismos ou a mistura deles.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a preparação como definida na reivindicação 1 ou 2, contém Bacilius megaterium var. M326 (NCAIM /P/ B 001291), Azotobacter vineian- diissp. M657 (NCAIM /P/ B 001292) e Bradyrhizobium japonicum var. PH25 (NCAIM/P/B 001302).

12. Processo para melhorar ou manter a estrutura do solo, ca- racterizado pelo fato de transportar os polissacarídeos de origem microbioló- gica através de produtos contendo cepas de Baciilus poiymyxa var. SW17 (NCAIM /P/ B 001295), Bacillus megaterium var. M326 (NCAIM /P/ B 001291), Micrococcus roseus ssp. A21 (NCAIM IPI B 001294) e opcional- mente Bradyrhizobium japonicum var. PH25 (NCAIM /P/ B 001302).

13. Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de aplicar Bacillus megaterium var. M326 (NCAIM /P/ B 001291) e Bradyrhizobium japonicum var. PH25 (NCAIM /P/ B 001302).