EA009126B1

EA009126B1 - Микроорганизмы для обработки почвы и способ их получения

Info

Publication number: EA009126B1
Application number: EA200400309A
Authority: EA
Inventors: Дьердь Ботонд Кишш; Иштван Отт
Original assignee: Агро. Био Хангери Кфт.
Priority date: 2001-08-13
Filing date: 2002-08-12
Publication date: 2007-10-26
Also published as: BR0211920B1; HU230555B1; EA200400309A1; CA2457154A1; CO5560603A2; MXPA04001383A; US20050060930A1; YU14004A; CN1315758C; JP2005500413A; EP2233458A2; AU2009200523A1; HRP20040126B1; US7842494B2; HRP20040126A2; KR100940615B1; RS52487B; ZA200401142B; UA86178C2; EP1919848A1

Abstract

Настоящее изобретение относится к продукту(ам), содержащему(им) микроорганизм(ы), приемлемому для обработки почвы, микроорганизмам, размножающимся при различных климатических и природных условиях, а также способу получения продуктов и, кроме того, способу обработки почвы и растений продуктами. Более подробно, изобретение относится к способу получения продуктов из любого из микроорганизмов, указанных конкретно ниже, или из их смеси. Кроме того, изобретение относится к способу получения культур микроорганизмов, которые должны быть использованы. Предметом изобретения являются также сами микроорганизмы. Более подробно, изобретение относится к способу обработки почвы и растений продуктом, содержащим по меньшей мере один из микроорганизмов Azospirillum brasilense ssp. SW51 (NCAIM/P/В 001293), Azotobacter vinelandii spp. M657 (NCAIM/P/В 001292), Pseudomonas fluorescens var. SW11 (NCAIM/P/В 001296), Bacillus polymyxa var. SW17 (NCAIM/P/В 001295/, Bacillus megaterium var. M326 (NCAIM/P/В 001301/ и, кроме того, продуктам, содержащим перечисленные микроорганизмы, размножающихся и существующих в среде рассматриваемого растения и их получению.

Description

Настоящее изобретение относится к продукту(ам), содержащим живой микроорганизм(ы), подходящий для обработки почвы, микроорганизмам, размножающимся при различных климатических и природных условиях, а также к способу получения продуктов, а кроме того, к способу обработки почвы и растений такими продуктами.

Более подробно изобретение относится к способу получения продуктов из любых микроорганизмов, указанных ниже, или из их смеси.

Кроме того, изобретение относится к способу создания культур микроорганизмов, которые должны быть использованы. Предметом изобретения являются также сами микроорганизмы.

Более подробно изобретение относится к способу обработки почвы и растений продуктом, содержащим по меньшей мере один из микроорганизмов Λζοφίπΐΐιιιη Ьтакйеике ккр. 8\ν51 (Ν0ΛΙΜ /Р/ В 001293), Άζο^α^τ У1ие1аийй крр. Μ657 (Ν0ΛΙΜ /Р/ В 001291), Ркеийотоиак Пиотексеик уат. 8XV11 (Ν0ΛΙΜ /Р/ В 001296), ВасШик ро1утуха уат. 8ν17 (Ν0ΛΙΜ /Р/ В 001295), ВасШик теда1епит уат. Μ326 (Ν0ΛΙΜ /Р/ В 001301), а кроме того, к продуктам размножающихся и существующих в окружающей среде рассматриваемого растения перечисленных микроорганизмов и их получению.

Предпосылки создания изобретения

Природная среда почвы представляет собой саморегулирующуюся экосистему растений и микроорганизмов в природных условиях, причем существование растений определяет существование микроорганизмов. Когда баланс, развитый в ходе эволюции, изменяется в результате деятельности человека (глубокая вспашка, внесение природных и искусственных удобрений, использование средств защиты растений и т.д.), в его структуре и функции могут иметь место изменения непредвиденного действия. Для развития популяций микроорганизмов, необходимых для оптимального культивирования конкретного культивируемого растения на различных почвах и при различных климатических условиях, необходимо время селекции, длящееся в течение многих лет. Однако детерминантные микроорганизмы благоприятной популяции микроорганизмов, которые могут быть перенесены в почву и окружающую среду, необходимые для оптимальной культивации, могут быть созданы за 1-2 дня. Результатом этого является более высокий урожай без пагубного нарушения природной экосистемы. Полезные и доминантные микроорганизмы, существующие в окружающей среде конкретного растения, важного с экономической точки зрения, могут быть определены лабораторными экспериментами и могут быть индивидуально размножены, получены промышленными способами и могут быть возвращены в почву в подходящей пропорции.

В экосистеме почвы и микроорганизмов можно обнаружить важные закономерности. Количество микроорганизмов является различным, и различные виды могут быть идентифицированы в непосредственной окружающей среде корневой системы живых растений (ризосфере) и прорастающих семенах (сперматосфере), в сравнении с более удаленными от них участками. На размножение бактерий в окружающей среде корней влияет много факторов. Эти факторы зависят от региона, качества почвы, состава популяции микроорганизмов и климатических условий.

Источник углерода, который может быть обнаружен в почве, образуется, прежде всего, и в преобладающем количестве посредством использования солнечной энергии, в результате фотосинтеза.

Цикл азота является более сложным, чем цикл углерода. На превращение азота оказывают влияние биологические и химические процессы. В природе газообразный азот в так называемом инертном состоянии является доминантным, а так называемый фиксированный азот (нитрат, нитрит, аммиак) присутствует в ограниченном количестве.

За минерализацию газообразного азота, прежде всего, несет ответственность связывание биологического азота. Так как на 1 га количество молекулярного азота составляет 6-7х 10⁸ т, это означает наличие неисчерпаемого источника для связанного азота. Интерес экспертов направлен в сторону связывающих азот живых организмов, т.е. в сторону живых организмов, которые могут восстановить молекулярный азот в аммиак, так как среди прочего знание таких микроорганизмов и адекватное использование их свойств может обеспечить благоприятным для окружающей среды образом прекращение распространенного в мире голода.

Некоторые связывающие азот бактерии фиксируют азот в свободном живом состоянии, но многочисленные бактерии способны фиксировать азот только в комбинации с другими, высшими растениями.

Фосфорный цикл, в противоположность циклу азота, является практически закрытым в природных условиях. Вход и вывод являются одинаковыми, поток является слабым, и воздух не может быть загрязнен фосфором. Наконец, данный элемент аккумулируется в водных источниках, морях и только небольшое количество его возвращается в почву (например, в форме гуано).

В живых клетках почвы фосфор аккумулируется в органических соединениях, минерализация их происходит с высокой скоростью (3-8 г/м²/год). Растворимость, а таким образом, их доступность для растений, образующихся соединений фосфора является различной, только 5% из 400-1200 мг фосфора, обнаруживаемого в каждом 1 кг средних почв, является доступным. Круговорот некоторых соединений фосфора составляет 500-2000 лет.

В результате переноса некоторых фосфонолитических групп микроорганизмов в почву комплексные фосфорные соединения, которые являются недоступными для растения, могут быть переведены в раствор. Если указанные микроорганизмы выполняют «функцию» почвы и минеральное содержание почвы является удовлетворительным, использование удобрений, содержащих фосфат, не является необ

- 1 009126 ходимым или может быть значительно снижено.

Для роста растений необходимо, а особенно во время созревания сельскохозяйственной культуры, значительное количество калия. Земледельцы, возделывающие растения, вносят калий в почву путем внесения удобрения, содержащего калий. Такое удобрение может быть сделано доступным из минеральных соединений калия при помощи микроорганизмов, высвобождающих ион калия.

Когда речь идет о растениях, микроорганизмы, размножающиеся в почве, биосинтезируют физиологически активные соединения, среди которых наиболее важными являются фитогормоны, ауксины (индол-3-уксусная кислота), этилен, гиббереллины, кинетины и т.д. Некоторые группы Ркеибошоиак в присутствии небольшого количества железа продуцируют так называемые сидерофоры, которые могут собирать железо. Вследствие этого другие, фитопатогенные бактерии и грибы, которые не могут использовать железо из сидерофоров, испытывают ингибирование вследствие отсутствия железа, а, с другой стороны, эти сидерофоры в почве с отсутствием железа значительно стимулируют рост растений, так как, связывая железо, они непосредственно обеспечивают растения железом.

Для решения указанных выше проблем было разработано несколько технических решений; несколько микроорганизмов описано в специальной литературе во всех подробностях.

Авторы венгерских патентов описали получение порошкообразных культур нитрификации (патент Венгрии НИ 143391), культур ЛхоЬае1ег сйгоососсиш и ВЫхоЬшт теШой (патент Венгрии НИ 188434), культур водорослей (патент Венгрии НИ 195068) и снова культур ЛхоЬас1ег сйгоососсиш, а также получение культур микроорганизмов ВасШик шедаБегшш (патент Венгрии НИ 207751). ЛхоЬас1ег сйгоососсиш депонирован под № 00238, 1Не ВасШик тедаБегшт под № ΝΟΆΙΜ/Р/В 1140. Более подробно в патентах Венгрии НИ 188434 и Ни 207751 авторы описали ферментацию, при которой получают смесь депонированных выше микроорганизмов. Согласно патенту Венгрии НИ 213163 авторы дополнили культуру микроорганизмов патента НИ 207751 карбоксиметилцеллюлозой. Авторы патента Венгрии НИ 1671/96 описали культуры, содержащие микроорганизмы ЛхокрйШит НроГегит ккр., ЛхоЬас1ег уше1аибп кр., Ркеиботопак йиогексеик ккр. и ВасШик тедаБегшт ккр.

Применение и действие микроорганизмов, применяемых в указанных способах, ограничиваются тем фактом, что они при различных условиях культивирования, в почвах различного состава, в различных климатических условиях остаются живыми только в течение короткого промежутка времени, окружающая среда и ризосфера различных растений не всегда создает оптимальные условия.

Описание изобретения

Основной целью изобретения является получение таких культур почвенных микроорганизмов, которые, с точки зрения культивирования растений и экономической точки зрения, оказывают благоприятное действие и которые, в то же самое время, могут выживать, размножаться и проявлять свое благоприятное действие в различных почвах и на различных растениях в различных климатических условиях и условиях культивирования.

Неожиданным образом было обнаружено, что размножение и выживание микроорганизмов, благоприятно влияющие на развитие растения, фиксацию азота, мобилизацию фосфата, стимуляцию роста растения, улучшения структуру почвы при культивировании в лабораторных условиях, варьируют в зависимости от характера почвы, температурных условий в непосредственной близости от растений. Различные группы микроорганизмов проявляют свое действие в черноземной почве, в почве с низким содержанием гумуса, в лёссе, в усадебной почве или, например, в глинистой почве. В ходе экспериментов авторами данного изобретения было доказано, что, как это ни было неожиданно, другие группы микроорганизмов могут размножаться в ризосфере различных растений или вблизи от нее и проявлять свое действие там в течение длительного времени.

Поэтому проводили эксперименты для выделения таких микроорганизмов, которые оказывают благоприятное действие в среде конкретного растения, что является важным с экономической точки зрения, поскольку речь идет о его культивировании. Кроме того, проводили также эксперименты для выделения микроорганизмов, которые могут мобилизовать ионы калия, и для получения таких микроорганизмов, выделенных из почвы и измененных процедурами мутации в лабораторных условиях, которые могут также размножаться во время введения их в почву, а также при низкой температуре и которые, как бы ни было также неожиданным даже для эксперта, могут оказывать благоприятное действие.

Кроме того, авторами заявлено в ходе экспериментов, что некоторые микроорганизмы, продуцирующие полисахариды, неожиданным образом изменяют структуру почвы благоприятно с сельскохозяйственной точки зрения, таким образом повышая устойчивость к засухе.

Подводя итоги экспериментальной работы, авторы изобретения указывают, что их целью было выделение таких микроорганизмов, которые передают азот, фосфор, калий в растения, биосинтезируют растительные гормоны роста, биосинтезируют полисахариды, улучшающие структуру почвы, и которые способны также размножаться в период посева и в странах с более холодным климатом, а также проявляют их действие в различных почвах и растениях. Кроме того, авторы изобретения намеревались получить такие препараты с таким содержанием микроорганизма в среде растения, в ризосфере или непосредственно среди растительных клеток посредством фиксации и мобилизации элементов жизненной важности, а также посредством продуцирования растительных факторов роста и полисахаридов в конкретном растительном окружении, которое активирует развитие конкретного растения или семейства растений,

- 2 009126 вследствие чего можно экономить, таким образом, защищая окружающую среду, применяемые удобрения.

Предметом настоящего изобретения является способ культивирования, относящийся к перечисленным микроорганизмам, препараты, содержащие их, кроме того, применение препарата(ов), содержащего(их) микроорганизм(ы), и, конкретно, микроорганизмы.

Настоящее изобретение основано на том, что для получения рассматриваемых препаратов наиболее подходящими язляются микроорганизмы Λζοδρίπΐΐιιιη Ьга811еи8е 88р. 8^51 (Ν0ΆΙΜ /Р/ В 001293), Лхо1оЬас1сг уше1апбп 8рр. М657 (Ν0ΆΙΜ /Р/ В 001292), Р8еиботопа8 Диоге8сеи8 уаг. 8^11 (Ν0ΆΙΜ /Р/ В 001296), ВасШи8 ро1утуха уаг. 8^17 (Ν0ΆΙΜ /Р/ В 001295), ВасШи8 тедаЮгшт уаг. М326 (Ν0ΆΙΜ /Р/ В 001291), М1сгососси8 го8еи8 8рр. А21 (Ν0ΛΙΜ /Р/ В 001294), В^аάу^ЫζоЬ^ит _)арошсит уаг. РН25 (Ν0ΛΙΜ /Р/ В 001302) и 81гер1отусе8 а1Ьи8 уаг. 0003 ЬР (Ν0ΛΙΜ /Р/ В 001301), которые могут размножаться при низкой температуре в период сева, которые поставляют азот растениям, мобилизуют фосфор, калий, биосинтезируют гормоны роста и полисахариды, следовательно, авторы изобретения выделили их и разработали для них способ выращивания.

В свете указанного выше, между 1998 и 1999гг. авторы изобретения выделили в Европе из почвы и среды вокруг корней некоторых растений микроорганизмы, испытали ίη νίΙΐΌ их способность фиксировать азот, солюбилизировать фосфат и калий, продуцировать полисахарид и биосинтезировать растительные гормоны, идентифицировали систематически выбранные микроорганизмы, мутационной обработкой получили такие варианты, которые интенсивно размножаются при температурах ниже 20°С, а также разработали технологию выращивания для их культивирования и из их культур получили препараты и показали их действие на развитие растений и урожаи при помощи экспериментов в оранжерее и в полевых условиях.

Были выделены виды и подвиды Λζо8р^^^11ит, ΛζоΐоЬасΐе^, В^аάу^ЫζоЬ^ит, Р8еиботопа8, Вас111и8, 81гер1отусе8 и Мюгососсш.

Наименее известным видом Λζо8р^^^11ит являются бактерии грамотрицательного вариабельного окрашивания, живущие в почве, которые в микроаэрофильных условиях (в присутствии 1-2% кислорода) в тесной связи с корневой системой растений могут восстанавливать азот воздуха до аммиака и затем переносить его к растениям. Некоторые группы биосинтезируют также растительные гормоны.

Эти группы Λζо8р^^^11ит были выделены из окружения корней кукурузы, пшеницы, ячменя, ржи, выращиваемых на различных сельскохозяйственных угодьях Европы, в различных почвах, и травы сенокосных угодий. Суспензию бактерий, полученную из пробы почвы, диспергировали на культуральные среды ΝίΕ(ΙΙ) и ММ состава, указанного ниже, затем культивировали в микроаэрофильных условиях. Спустя 72 ч культуры Λζо8р^^^11ит идентифицировали. Культуры (колонии) Λζо8р^^^11ит, отличающиеся от других небольших культур бактерий и грибов, достигают размера приблизительно 3 мм.

Культуры Λζо8р^^^11ит 8р., экспоненциально растущие в среде мягкого агара с жидкими ММ и №(ΙΙ), состав которых приведен ниже, проявляют морфологию, характерную для клеток Λζо8р^^^11ит. Клетки являются виброидными и имеют 8-форму и размер 1-2х2-4 мкм. Для их роста они нуждаются в биотине. На основе микроскопического наблюдения установлено, что они могут быстро перемещаться. Их подвижность может быть связана с их полярными жгутиками. В их клетках они аккумулируют гранулы поли-бета-гидроксибутирата и каротины. Исчезновение красноватого цвета может быть объяснено старением культуры. Для усиления их роста они могут использовать также органические кислоты, такие как малеиновая кислота, молочная кислота, пирорацемическая кислота и бутандиовая кислота. Фиксация азота воздуха имеет место в микроаэрофильных условиях. В экстремальных условиях, таких как в случае засухи, при низкой или высокой величине рН, в отсутствие источника азота или углерода, клетки будут трансформироваться в цисты, на которых не имеется жгутиков, но которые содержат гранулы поли-бетагидроксибутирата и окружены капсулярным полисахаридом. Спектр утилизации источника углерода микроорганизмов варьирует в зависимости от вида: А. Аиимопеп8е утилизирует глюкозу (+), сахарозу (+), инозит (+), А. Вга811еп8е утилизирует глюкозу (+), сахарозу (+) и не утилизирует инозит (-), А. Еакегъе утилизирует глюкозу (+) и сахарозу (+), но не инозит (-), наконец, А. Ь1роГегит утилизует только глюкозу. В среде без азота спектр утилизации источника углерода отличается до значительной степени, так что вышеуказанные четыре вида могут быть другими. Спектр утилизации источника углерода выделенного авторами изобретения микроорганизма частично отличается от неотипа АТСС 29,731 А. Ь1роГеггит, А. Λтаζоηеη8е, А. Вга8Шеп8е и А. Еакете (Ной, 1.6. апб со11аЬога1ог8. Вегдеу8 Мапиа1 оГ Ие1егттаДуе Вас1епо1оду. 9'¹' ебйюп, 1994). В противоположность другим группам этого типа, они надлежащим образом растут в присутствии 3,5% хлорида натрия в мягком агаре (это будет описано ниже), их микроскопические картины различаются в различные периоды культивирования, их продуцирование пигмента является более интенсивным, например, в картофельном агаре.

Некоторые выделенные Λζо8р^^^1^ит являются близкими к видам Λζо8р^^^11ит НроГешт, Λζо8р^^^11ит атаζсηеη8е, Λζо8р^^^11ит Ьга811еп8е, а также виду Λζо8р^^^11ит пакеп8е, авторы изобретения провели дополнительные эксперименты на Λζо8р^^^11ит, выбрав одну из групп Λζо8р^^^11ит Ьга811еп8е.

Из вышеуказанных почвенных образцов микроорганизмы ΛζоΐоЬасΐе^ выделяли на ИГЬ(П)-мягком агаре, с селективным культивированием, затем на ММ и среде Федорова распределением и отбором одного из подвидов на основе его способности фиксировать азот и сохраняли его для дальнейших экспериментов.

- 3 009126

Клетки данной группы являются плейоморфными, имеют коккоидную форму. В присутствии кислорода они передвигаются быстро. Они являются грамотрицательными. На среде без азота указанные микроорганизмы образуют флуоресцирующий, желтовато-зеленый пигмент, они хорошо утилизируют рамнозу и мезоинозит.

Как хорошо известно, ΚΙιίζοΝιιιη образуют клубеньки на корнях мотыльковых, и затем распространяясь среди растительных клеток, они непосредственно переносят фиксированный азот в растения. С разными мотыльковыми разные виды К1ШоЬшт вступают в связь, например с соей вступает в связь группа Вгабуг1ШоЬшт. Поскольку эта группа является единственным таким видом К1ШоЬшт. который погибает после сбора урожая сельскохозяйственных культур, т.е. она не остается в большом количестве в почве, рекомендуется использовать эту группу для обработки почвы. Авторы выделили группу Вгабуг1ШоЬшт 13-го июля в растениях сои в 8иЬаза около 8ζедеά-Κ^зкиηάо^оζзта. Из растений, растущих в лёссе, выбирали хорошо развивающееся растение и отделяли хорошо развитые клубеньки от его корней. Психрофильный вариант микроорганизма, выделенный, как приведено в примере, депонировали.

В собранных пробах почвы авторы изобретения проводили поиск на фосфатмобилизующие микроорганизмы и тестировали выбранные микроорганизмы с систематической точки зрения. Доказано, что часть микроорганизмов является видом Рзеиботопаз, доказано, что другая является видом ВасШиз.

Рзеиботопаз являются грамотрицательными аэробными клетками, имеющими форму тонких палочек, они продуцируют на большинстве сред флуоресцентный пигмент и являются сапрофитом. Не удалось наблюдать продуцирование каротина, они не растут при температуре выше 40°С. На желатиновом агаре можно было видеть разжижение. Глюкоза утилизируется выделенными авторами группами, а крахмал не утилизируется. Хотя варианты групп фосфоресцирующих Рзенбошопаз находятся систематически в тесной связи, некоторую систематическую гетерогенность можно наблюдать между микроорганизмами авторов и типовыми группами: микроорганизм авторов, что характерно для Рзенбошопаз. хорошо утилизирует глюкозу, галактозу, уксусную кислоту, мальтозу, глицерин и пирорацемическую кислоту. Он не утилизирует фруктозу, И-арабинозу, мальтозу, лактозу, крахмал и инулин. Однако, в противоположность типовым группам, они способны расти на ксилозе, сахарозе и в некоторой степени на сорбите. В качестве единственного источника углерода они могут утилизировать глицин.

На основе вышеуказанного, один из микроорганизмов авторов изобретения был идентифицирован как вид Рзеиботопаз Ниогезсеп!, и обнаружено, что он может быть помещен вблизи вариантов, принадлежащих к группе Вюуаг III. Авторы назвали группу как Рзеиботопаз Ниогезсеп! ззр.

На основе систематических характеристик клеток ВасШиз, которые могут растворять нерастворимый фосфат, доказано, что некоторые являются ВасШиз ро1утуха, доказано, что некоторые являются ВасШиз теда!егшт. Некоторые группы были отобраны для дальнейших экспериментов.

Для выделения микроорганизмов, способных мобилизовать ионы калия, из минералов калия микроорганизмы выделяли с поверхности минералов, содержащих калий, полевого шпата и мусковита, затем тестировали, как указано в примерах, на твердой, не содержащей калий среде для доказательства мобилизации калия. Посредством использования процедуры, приведенной в примерах, при помощи мутационных обработок был получен и депонирован микроорганизм, индентифицированный как 8!гер!отусез рзусйгорЫйс.

Авторы изобретения выделили также микроорганизм, который, как было доказано после систематических, морфологических тестов и теста рибосомной ДНК, является Мюгососсиз гозеиз и обнаруживает чрезвычайно благоприятное действие в ходе растительных тестов. Одна из групп этого микроорганизма была депонирована, эта группа была трансформирована в лабораторных условиях.

Изобретение основано также на том факте, что микроорганизмы с благоприятным действием, высаженные в почву, могут также размножаться так быстро, насколько это возможно, во время начального развития посевов и растений, в климатических условиях осени и ранней весны, а также в странах более холодного климата. Таким образом, микроорганизмы обрабатывали, выделяли и выдерживали в соответствии с вышеописанным, как указано в примере № 4. При помощи общепринятых процедур выделяли мутанты и варианты, размножающиеся при низких температурах, а также затем их депонировали в Национальную коллекцию сельскохозяйственных и промышленных микроорганизмов.

Изобретение относится к таким препаратам и способам, посредством применения которых повышается урожай растительных культур. Получение сопровождается также культивированием микроорганизмов, выделенных и тестированных из различных пахотных земель, из среды различных растений, существующих в среде конкретного семейства растений в течение длительного времени, размножающихся при низких температурах в различных почвах, и внесением препарата, содержащего культуру, на рассматриваемые культуры, на семена или в пахотные земли для них. В соответствии с изобретением препараты могут быть использованы для обработки почвы, растений или семян растений препаратом, который содержит по меньшей мере один из следующих микроорганизмов: Αζозр^^^11ит Ьгазйепзе ззр. 8ν51 (Ν0ΑΙΜ /Р/ В 001293), ΑζоΐоЬасΐе^ уше1апбп зрр. М657 (Ν0ΑΙΜ /Р/ В 001292), Рзеиботопаз Ниогезсепз уаг. 8\ν 11 (Ν0ΑΙΜ /Р/ В 001296), ВасШиз ро1утуха уаг. 8ν17 (Ν0ΑΙΜ /Р/ В 001295), ВасШиз теда1епит уаг. М326 (Ν0ΑΙΜ /Р/ В 001291), Мюгососсиз гозеиз зрр. Α21 (Ν0ΑΙΜ /Р/ В 001294), Вгабуг^оЬшт _)арошсит уаг. РН25 (Ν0ΑΙΜ /Р/ Р 0012...) и 81гер1отусез а1Ьиз уаг. 0003 ЬР (Ν0ΑΙΜ /Р/ В 0012...).

В результате обработки развитие растений будет ускориваться, они будут более устойчивыми к патогенам, водоснабжение структуры почвы и растений будет улучшаться и будут обеспечиваться высокие

- 4 009126 урожаи даже при пониженном использовании удобрения или в отсутствие любого удобрения.

Одним из более важных преимуществ способа по данному изобретению является то, что при осуществлении его в ходе культивирования растения применение удобрений на основе азота, фосфата и калия может быть практически ненужным или может быть снижено в значительной степени. Загрязняющее действие удобрения на окружающую среду является очевидным. Соединения, биосинтезирующиеся в клетках микроорганизмов, стимулирующих развитие растений, ускоряют развитие обработанного растения, развитие корней, и в то же самое время с этим будет улучшаться водоснабжение растений, развивающиеся микроорганизмы подавляют развитие фитопатогенных микроорганизмов, полисахариды, биосинтезирующиеся в клетках некоторых из полученных авторами микроорганизмов, особенно благоприятно улучшают структуру почвы, водный баланс и жизнь почвы. Препараты по данному изобретению, их получение и применение, в противоположность известным препаратам и способам получения для такой же цели и применения, основаны на использовании микроорганизмов с различными, другими действиями, выделенных из различных почв, оказывающих специальное действие на рассматриваемое экономически важное культивируемое растение, а также микроорганизмов, которые могут размножаться при низких температурах осенью и ранней весной и на ареалах с более холодным климатом.

Микроорганизмы по изобретению могут быть культивированы на среде, содержащей в качестве источника углерода, например, глюкозу, крахмал, сахарозу или мелассу, в качестве источника азота жидкость после замочки кукурузы, казеин, дрожжевой экстракт или аммониевые соли, кроме того, другие неорганические соли и соли, диссоциирующие на ионы микроэлементов, но, как это очевидно для специалистов, можно было использовать любые ассимилируемые источники углерода и азота, неорганические соли, которые делают возможным размножение бактерий данного изобретения.

Культура, содержащая микроорганизмы настоящего изобретения, может быть добавлена непосредственно в почву, которая должна быть обработана, или к растениям в среде, используемой для культивирования, но могут быть также приготовлены препараты, сохраняющие биологический потенциал этого микроорганизма, в том числе препараты, содержащие носители, фиксирующие бактерии на семенах посредством сил адгезии. Количество бактерий, внесенных в почву, может варьировать между 5х10^п и 5х 10¹⁵ клеток на гектар, благоприятное количество клеток составляет от 10¹² до 10¹³.

В соответствии с Будапештским соглашением (ВибарсЧ Лдгссшсп!) авторы депонировали выделенные, идентифицированные из различных растительных сред микроорганизмы, которые могли также размножаться при низкой температуре, в Национальную коллекцию сельскохозяйственных и промышленных микроорганизмов, где эти микроорганизмы зарегистрированы под следующими номерами депозитов:

Λζοφίπΐΐιιιη Ьга811еп8е 88р. 8^51 (Νί’ΑΙΜ /Р/ В 001293),

ΑζоΐоЬасΐе^ уше1апбн 8рр. М657 (Νί,’ΛΙΜ /Р/ В 001292),

Р8еибошопа8 Диоге8сеп8 гаг. 8^11 (Νί’ΑΙΜ /Р/ В 001296),

Васй1и8 ро1утуха гаг. 8^17 (Νί’ΑΙΜ /Р/ В 001295),

Васй1и8 теда(егшт гаг. М326 (Νί’ΑΙΜ /Р/В 001291),

М1сгососси8 го8еи8 8рр. Α21 (Νί’ΑΙΜ /Р/В 001294),

Вгабуг1ШоЬшт_]арошсит гаг. РН25 (Νί’ΑΙΜ /Р/ В 001302) и 8(гер(отусе8 а1Ьи8 гаг. 0003 ЬР (Νί’ΑΙΜ /Р/ В 001301).

Область защиты распространяется на депонированные группы, а также на их искусственные и природные мутанты, варианты или на линии групп вышеуказанных микроорганизмов, полученных любым известным способом.

Авторы иллюстрируют изобретение примерами без ограничения ими области защиты.

В примерах проценты выражены в массовых процентах, если не оговорено особо.

Лучший способ выполнения изобретения

Пример 1. Выделение микроорганизмов, фиксирующих азот воздуха, из различных почв и из среды окружения различных растений и подтверждение их фиксирующей азот способности.

Виды Αζо8р^^^11ит являются бактериями грамотрицательного вариабельного окрашивания, которые способны восстановить азот воздуха до аммиака при микроаэрофильных условиях (в присутствии 1-2% кислорода) и сделать его доступным для растений.

Виды Αζо8р^^^11ит выделили из различных почвенных проб (гумуса, лёсса, натриевой почвы, бурой почвы и черной почвы и т.д.), из среды, окружающей корни различных растений (злаковых, подсолнечника, кукурузы, травы и т.д.). Химические аттрактанты, такие как органические кислоты и сахара, привлекают группы Αζо8р^^^11ит за счет хемотаксиса. При помощи их жгутиков бактерии двигаются по направлению к корням и, достигнув их, заселяют.

Из 10-, 100-, 1000- и 10000-кратных разведений данной пробы почвы, приготовленных со стерильной, дистиллированной водой, 100-100 мкл суспензии распределяли на чашках Петри, содержащих ММи ХГЬ(П)-мягкий агар. Состав ММ-среды был следующим.

К₂НРО₄ 1,65 г/л

КН₂РО₄ 0,87 г/л

Μ§8Ο₄χ7Η₂Ο 0,29 г/л

- 5 009126 №С1

СаС12х2Н2О

БеС1₃х6Н₂О №МоО₄х2Н₂О

Ми8О₄хН₂О

2и8О₄х7Н₂О

Си8О4х5Н2О

С08О4Х7Н2О

Н₃ВО₃

Глюкоза

Сахароза

Бактоагар

0,18 г/л

0,07 г/л

0,01 г/л

0,005 г/л

0,00014 г/л

0,007 г/л

0,000125 г/л

0,00014 г/л

0,00003 г/л 5,0 г/л 5,0 г/л

20,0 г/л

Глюкозу стерилизовали отдельно от других компонентов ММ-среды в автоклаве (121°С, 30 мин), затем смешивали с другими компонентами после охлаждения до температуры 60°С. рН стерильной смеси устанавливали до 7,4 стерильным 1н. раствором ЫаОН.

Состав Ы1Ь(11)-среды был следующим.

Ь-Яблочная кислота

Дикалийгидрофосфат

Сульфат магниях7Н₂О

Хлорид натрия

Хлорид кальция

Раствор микроэлементов*

Бромтимоловый синий (водный раствор

0,5% материала, растворенного в 0,2н. КОН)

Раствор 1,564% Бе-ЕИТА

Раствор витаминов**

Агар

5,0

0,5

0,2

0,1 г

г г г

0,02 г 2,0 мл

2,0 мл

4,0 мл

1,0 мл

1,75 г

Устанавливали рН среды до 6,8 при помощи 1н. водного раствора КОН.

* Состав раствора микроэлементов был следующим. Ферро-11-сульфатх7Н₂О Ферро-111-сульфатх6Н₂О

Сульфат марганцахН₂О

Сульфат меди(11)х5Н₂О №МоО₄х2Н₂О

Хлорид кобальтах 6Н₂О

Сульфат цинках 7Н₂О

Тетраборат натриях 10Н₂О

Р;О. 24\\'О; 11;О

Нитрат висмутах5Н₂О

Хлорид олова

Хлорид селена

Иодид калия

Лимонная кислота

Дистиллированная вода

200 мг мг мг мг мг мг мг мг

0,5 мг

0,1 мг

0,01 мг

0,01 мг мг

100 мг

1000 мл **Состав раствора витаминов был следующим.

Витамин С

Витамин В1

Витамин Е

Витамин А

Биотин

Дистиллированная вода мг мг мг мг мг

100 мл

Бактерии, внесенные в среду, которые должны быть обнаружены на ММ-планшетах, помещали в анаэробные термостаты заменой воздушного пространства термостата на азот, затем устанавливали концентрацию кислорода 1,6% с использованием достаточного количества воздуха. Планшеты инкубировали при температуре 32°С, затем спустя 72 ч организмы Λζοφίπΐΐιιιη идентифицировали. В соответствии с

- 6 009126 линией разведения на планшете, на котором распределяли суспензию с 10-кратным разведением, образовалось непрерывное поле бактерий, тогда как суспензия с 10000-кратным разведением обычно давала 3050 колоний (культур). Колонии Λζοδρίπΐΐιιιη. отличающиеся от других небольших бактерий и культур грибов, достигали размера приблизительно 3 мм. Из этих культур несколько культур были морфологически подобными культурам Αζοφίπΐΐιιιη. Из них некоторые дополнительно изучались авторами изобретения.

Культуры на МЪ(П)-мягком агаре помещали в аэробный термостат в указанной выше среде, и в указанных выше условиях культивирования первыми из всех размножились Αζοφίπΐΐιιιη с узнаваемой характеристичной морфологией.

Различные группы бактерий Αζο8ρ^^^11ит, полученные на ММ- и Ы1Ь(11)-среде, выращивали в соответствии с микробиологической практикой таким образом, что первичную культуру бактерий наносили 2 раза на одну культуру на полной среде ТАд. Группы бактерий Αζοφίπΐΐιιιη очищали распределением 2 раза на одной культуре в жидкой среде ТАд и сохраняли в групповой культуре. Суспензию бактерий при температуре -80°С считали групповой культурой и все эксперименты начинали из этой культуры.

Состав среды ТАд был следующим.

Бактотриптон (Όίίεο) 1,0%

Экстракт дрожжей (Όίίεο) 0,1%

ЫаС1 0,5%

Агар 2,5%

После стерилизации добавляли водные растворы следующих соединений со следующей конечной концентрацией:

0,1% 0,1М СаС1₂х6Н₂О

0,1% 0,1М МдС1₂х6Н₂О

0,2% глюкозы (отдельно стерилизованной)

После стерилизации рН среды регулировали до 7,0-7,2.

Корневую колонизацию можно определить простым экспериментом. На корнях кукурузного и пшеничного растений, обработанных бактериями Αζο8ρ^^^11ит, высеянными в стерильном перлите (сосуд диаметром 15 см) с клетками равного количества (1 х 10¹⁰ клеток на сосуд), микроскопический подсчет показал, что было выявлено существенно больше клеток Αζο8ρ^^^11ит, чем в контролях. Колонизация на корнях происходит на основе специфичного механизма распознавания. В ходе колонизации клетки Λζοδρίπΐΐιιιη проникают в матрикс корней, и здесь они, посредством их активной фиксации азота, могут компенсировать часть азота, необходимую для основного растения (ассоциативная фиксация азота). Это доказали ростом большего количества зеленой массы кукурузы и пшеницы, инкубированных с группами Αζο8ρ^^^11ит, в ходе лабораторных экспериментов авторов, результаты которых приводятся подробно далее. Αζοφίπΐΐιιιηδ продуцируют также растительные гормоны и материалы, стимулирующие рост. Увеличение этих материалов и их благотворное влияние на основное растение может быть доказано повышенной герменативной эффективностью и более интенсивным ростом растения в экспериментах, проводимых в лабораторных условиях.

Морфологические характеристики выделенных видов Αζοδρίπΐΐιιιη находятся в общей части описания.

При селективном культивировании на МЪ(П)-мягком агаре, в отличие от селективного культивирования на ММ-среде без азота, микроорганизмы Αζοφίπΐΐιιιη выделяли из образцов пахотной почвы. Было обнаружено, что эти группы в соответствии с систематическими характеристиками и спектром утилизации источника углерода являются Αζοφίπΐΐιιιη Ъгакйеике, фиксирующими молекулярный азот воздуха в большей степени, чем 8^5-01-07, затем, как описано ниже, выделили также варианты, размножающиеся при низких температурах и биосинтезирующие полисахарид, и один из них депонировали.

Для выделения группы ΑζοΙοΒ-ιοΙΟΓ кроме использования ΝίΒ(ΙΙ)- и ММ-среды, состав которых приведен выше, образцы почвы культивировали также в среде Федорова, где ΑζοΙοΒ-ιοΙΟΓ обнаружили характеристичные морфологические свойства. Среда Федорова имеет следующий состав.

Дигидрофосфат калия 0,03%

Гидрофосфат кальция 0,02%

Сульфат калия 0,02%

Сульфат магниях7Н₂О 0,03%

Карбонат кальция 0,5%

Хлорид натрия 0,05%

Хлорид железа(Ш) 0,02%

Молибденат натрия 0,0002%

Маннит 2,0%

Бактоагар 2,0% рН среды перед стерилизацией регулировали 1н. раствором гидроксида натрия до 7,0.

При селективном культивировании на МЪ(П)-мягком агаре, затем на среде ММ без азота и среде Федорова при селективном культивировании микроорганизмы АюЮЬаеГОг выделили из почвенных об

- 7 009126 разцов пахотных участков. Было обнаружено, что эти группы в соответствии с систематическими характеристиками и спектром утилизации источника углерода являются Лхо1сЬас1сг уте1апбн. фиксирующим молекулярный азот воздуха в большей степени. чем М65-01-34, затем. как описано ниже. выделили также варианты. размножающиеся при низких температурах. и один из них был депонирован авторами.

Способность фиксировать азот группами Λζοδρίπΐΐιιιη и ЛхоЬасЮг определяли также способом восстановления ацетилена. В соответствии со способом (Όί1\\ΌΠ1ι М.Г. 1. Вюсйет. Вюрйуз. Ас1а. 27. 285. 1996) ацетилен вводили инъекцией шприцем в культуру в закрытой чашке. затем после инкубации 12 ч 0.25 мл газовой смеси впрыскивали в колонку Ргорак N газового хроматографа Регкш-Е1тег. Концентрацию ацетилена и этилена газовой смеси определяли детектором с ионизацией водородным пламенем. Из высоты пиков ацетилена и этилена можно определенно сделать вывод по ферментной комплексной активности нитрогеназы. Группы АгозрггШит и Аго1оЬас1ег авторов восстанавливали за 1 ч ацетилен в количестве между 15 и 85 нмоль в этилен.

Группу ВгабубЛоЬннп выделили 13 июля 2000 из растений сои в 8иЬаза. вблизи от ^едебК^зкиηбο^οζзта. Из растений. выращенных в лёссе. отбирали хорошо развивающееся растение и из его корней удаляли хорошо развитые клубеньки. Клубеньки промывали стерильной. дистиллированной водой. измельчали. затем частицы суспендировали в физиологическом солевом растворе. Из суспензии в стерильных условиях готовили серийные разведения и распределяли их на полной среде. Способность фиксировать азот растущих культур после инкубации 48 ч так называемым тестом для симбиотических растений определяли следующим образом: поверхность семян коммерческой люцерны (Мебкадо заДуа) стерилизовали термообработкой 2 ч при температуре 72°С и осторожным промыванием 20% раствором Нуро. затем давали им возможность прорасти в среде дистиллированной воды. содержащей 1% агара. Проростки помещали в 1.5% косой агар С1Ьзоп (см. ниже) и выращивали в теплице в течение недели. Растения возраста 1 недели инокулировали клетками каждой культуры бактерий и выращивали в теплице в течение дополнительных 8 недель. Из групп. относящихся к трем растениям. проявляющим заметное оптимальное развитие (масса в сухом состоянии частей растений выше корней 22-26 мг. в противоположность массе контрольных растений 3-5 мг). отбирали три и на основе их свойств. важных с точки зрения морфологии и систематики. авторы назвали их ВгабубГОоЬшт )аропкит уаг. РН-2-1-3.

Пример 2. Выделение фосфат- и калийсолюбилизирующих микроорганизмов.

Образцы почвы собирали в разных частях света. водные суспензии образцов распределяли по среде ТАд (см. выше). затем тестировали выделенные материалы культур Рзеиботопаз и ВасШиз и клеточную морфологию.

Различные группы Рзеиботопаз и ВасШиз очищали в соответствии с микробиологической практикой распределением первичной культуры бактерий несколько раз на единственной культуре на полной среде ТАд. Группы бактерий выращивали и сохраняли очищенными с распределением в жидкой и твердой средах ТАд.

Свойства микроорганизмов по мобилизации фосфата испытывали в среде питательного агара (Охо1б). содержащего 1% гидроксиапатита и дополненного модифицированной средой Р1коузкауа (НР) и 10% трикальцийфосфата и глюкозой (0.2%).

Состав среды. используемой в ходе экспериментов. является следующим.

Модифицированная среда Р1коузкауа:

Гидроксиапатит 1.0% (ΝΗ₄)₂8Ο₄ 0.05% №101 0.02%

КС1 0.02%

Мд8О₄х7Н₂О 0.01%

Экстракт дрожжей 0.05%

Агар 1.5%

Глюкоза (стерилизованная отдельно) 1.0%

После стерилизации к среде добавляли растворы следующих соединений:

1% 20 мг/100 мл Ге8О₄х7Н₂О

1% 40 мг/100 мл Мп8О₄хН₂О

Перед стерилизацией рН среды устанавливали до 7.2.

№юхд: питательный агар (Охо1б). приготовленный в соответствии с инструкциями производителя. +0.2% глюкозы.

Во время тестирования солюбилизирующей фосфат способности групп. выбранных в ходе предварительных экспериментов в среде Р1коузкауа (НР) культуры. выращиваемые на протяжении 3-4 дней при температуре 30°С. давали кольца растворения 29 и 38 мм. Клеточные суспензии одинаковых групп. полученные из ТАд-скошенного агара с 1 мл дистиллированной воды. прикапывали в отверстия. сделанные на планшетах №охд. дополненных 10% трикальцийфосфатом (0.1 мл/отверстие). При инкубации культур при температуре 30°С на протяжении 2-3 дней можно было наблюдать хорошо видимые кольца растворения. Размер их был 24 мм при использовании групп Рзеиботопаз. тестированных детально. и 26 мм. когда авторы использовали группы ВасШиз. средний размер был до 34 мм.

Доказано. что каждая индивидуальная группа Рзеиботопаз и некоторые группы ВасШиз обладают

- 8 009126 интенсивными солюбилизирующими фосфат свойствами. Эти группы несут оба варианта неорганического фосфата, хорошо детектируемые по растворению, так что можно утверждать, что они обладают превосходными солюбилизирующими фосфаты свойствами.

На основе систематических характеристик и спектра утилизации углерода было обнаружено, что 14 микроорганизмов Рзеиботопаз и 25 микроорганизмов ВасШиз, выбранных на основе тестов, являются Рзеиботопаз Йиогезсепсе и ВасШиз ро1утуха, а также ВасШиз теда!епит, которые обозначены в следующем порядке: 1-1-14, 8Ш17-1-15 и М32-1-10, затем, как указано ниже, были также выделены и депонированы варианты, размножающиеся при низкой температуре и биосинтезирующие полисахариды в больших количествах.

Выделение микроорганизмов, мобилизующих ионы калия, выполняли, как описано выше, с отличием, заключающемся в исключении хлорида калия из среды Р1коузкауа (НР) состава, приведенного выше, и добавлении 1% полевого шпата, измельченного в мелкий порошок, и слюдяного сланца вместо гидроксиапатита.

В окружающих микроорганизм культурах, превращающих минералы, не растворимые в воде, полностью или частично в растворимую форму, будет образовываться прозрачная зона.

Некоторые из них были выбраны, и на основе систематических характеристик, морфологических свойств и спектра утилизации источника углерода было показано, что они являются ВасШиз и 81гер1отусез, 15 групп авторов были обозначены как № 1-015-0003, и затем, как описано ниже, были также выделены варианты, размножающиеся при низкой температуре, и один из них был депонирован.

Пример 3. Выделение микроорганизмов, продуцирующих сидерофоры и растительные гормоны.

Способность групп, выделенных, как описано в примерах 1 и 2, продуцировать сидерофоры и гормоны, тестировали с использованием среды Кшд В. Среда имеет следующий состав.

Пептон 2%

Глицерин 1%

К₂НРО₄ 0,15%

М_ё8О4х7Н2О 0,15%

Агар 2%

Перед стерилизацией рН среды устанавливали до 7,2 раствором гидроксида натрия.

Группы Рзеиботопаз, продуцирующие сидерофоры, также фиксируют ионы железа, которые они переносят к растениям в бедной железом почве. Кроме того, они ингибируют размножение некоторых фитопатогенных микроорганизмов, таких как 1-гмина сага!оуога, так как они не могут утилизировать фиксированное железо. Авторы тестировали продуцирование сидерофор ингибированием роста группы МС1061 ЕзсйепсЫа со11. Клеточные суспензии двух групп из агаровой культуры получали с дистиллированной водой, затем культивировали прикапыванием на не содержащий железо и содержащий железо (1 мкМ ГеС1₃х7Н₂О) планшет Кшд В (30-50 мкл) в течение 48 ч при температуре 28°С с последующим опрыскиванием планшета культурой Е. со11 МС1061, полученной из ТАд-агара, и продолжением инкубации в течение дополнительных 28 ч при температуре 28°С. Вокруг культур можно было наблюдать различные зоны ингибирования. Результаты средних четырех экспериментов показаны в табл. 1. В качестве отрицательного контроля использовали ВасШиз теда!епит, в качестве положительного контроля использовали Рзеиботопаз йиогезсепз.

Таблица 1 МикроорганизмЕ1К1пд В

Зона ингибированияОКхпд В + 1 мкМ ГеС1з

Зона ингибированияШЗИ1-1-б,

8М1-1-12

Р. £1иогез.

В. тедабег.□++++ ++ +

□□ □*Степень ингибирования: - отсутствие, + низкое, ++ и +++ высокое и очень высокое

В ходе тестирования продуцирования сидерофор с тоЪ4 и группой положительного контроля наблюдали значительную зону ингибирования, которая исчезала в присутствии ионов железа.

Как указано выше, некоторые группы Рзеиботопаз продуцируют растительные гормоны. Выбранные микроорганизмы тестировали на то, способны ли они биосинтезировать гиббереллиновую кислоту в

- 9 009126

ТАд-среде приведенного выше состава. Тесты проводили с использованием стандарта А гиббереллиновой кислоты (81дта) тонкослойной хроматографией на силикагеле (Мегск) (40 г/мл), экстракцией культур этилацетатом и последующей экстракцией двойным объемом раствора гидроксидкарбонат натрия, затем снова раствором с этилацетатом с рН 2,5. В остатке выпаривания экстракта найдены следующие группы величин К_Р пятен около стандарта.

Таблица 2

Группа	Кг	Размер пятна (мм²)
Стандарт	0,41	24
3Ν1-1-6	0,46	17
М32-1-9	0,42	27
Р. Пиог.	0,49	14
В. шедаС.	0,57	7

Были выбраны группы, обозначенные 8^1-1-6 и М32-1-9 (они продуцируют приблизительно 3-15 г гормона на миллиметр).

Группы, описываемые в общей части, тестировали и идентифицировали с систематической точки зрения.

Пример 4. Выделение микроорганизмов, продуцирующих экстрацеллюлярный полисахарид.

4А. Отбор Вгас1уг1п/о1шпп.

Группы ВгайугЫ/оЫиш РН2-1-3 распределяли в ТАд-среде, содержащей 1% глюкозы и 1% сахарозы (см. выше), и тестировали количество полисахарида (слизи) вокруг культур. Были выбраны группы РН2-11 и -2, биосинтезирующие полисахарид.

4В. Выделение ВасШиз.

Группы ВасШиз М32-1-10 и 8^17-1-15 распределяли в ТАд-среде, содержащей 1% глюкозы и 1% сахарозы (см. выше), и тестировали количество полисахарида (слизи) вокруг культур. Были выбраны группы М32-1-6,8 и -10 и 8^17-1-7,11 и -15, биосинтезирующие полисахарид.

На полной среде, содержащей глюкозу и сахарозу, биосинтезирующей большие количества полисахарида, трансформирующего культуральную среду в вязкий материал, доказано, что микроорганизм является М1сгососсиз гозеиз.

Выбранные группы в соответствии с тестами авторов биосинтезируют растворимый полисахарид сукциноглюконового типа известной структуры.

Пример 5. Выделение микроорганизмов, выносящих холод.

Микроорганизмы, отобранные в соответствии с примерами 1-4, обрабатывали агентом, вызывающим мутации, и радиацией. Суспензии микроорганизмов, полученные с дистиллированной водой, обрабатывали 0,01, 0,1, 1,0, 10 и 100 г/мл нитрозогуанидина в течение 1, 3, 5, 10 и 30 мин. После обработки клеточную суспензию центрифугировали, промывали 2 раза дистиллированной водой, затем клетки распределяли на культуральной среде ТАд, обработку повторяли выдерживанием клеточной суспензии в дистиллированной воде, содержащей 10⁹ микроорганизмов на миллиметр, в течение 1, 3, 5, 10 и 30 мин под УФ-лампой 15 Вт на расстоянии от нее 10 см. Клеточные суспензии распределяли на культуральной среде ТАд с серийным разведением.

ТАд-культуры инкубировали при температуре 18 °С в течение 192 ч с последующим выделением самых больших культур на ТАд-скошенных агарах, инкубированных при температуре 18°С.

После выращивания культуры контролировали и сохраняли.

После выделения отобранные и выдерживающие холод микроорганизмы отделяли и депонировали:

А/озршПит ЬгазПепзе ззр. 8^51 (ИСА1М /Р/ В 001293),

А/о1оЬас1ег уте1апйи зрр. М657 (ХСА1М /Р/ В 001292),

Рзеийотопаз йиогезсепз уаг. 8\\'11 (ИСА1М /Р/ В 001296),

ВасШиз ро1утуха уаг. 8Ш7 (ИСА1М /Р/ В 001295),

ВасШиз теда!епит уаг. М326 (ИСА1М /Р/ В 001291),

М1сгососсиз гозеиз зрр. А21 (ИСА1М /Р/ В 001294),

ВгадугЫ/оЬшт щрошсти уаг. РН25 (ИСА1М /Р/ В 001302) и 81гер1отусез а1Ьиз уаг. 0003 ГР (ИСА1М /Р/ В 001301).

Пример 6. Культивирование микроорганизмов.

6А. Культивирование на полной культуральной среде.

Из ТАд-культуральной среды были получены культуры на скошенном агаре, затем инкубированы при температуре 30°С в течение 48 ч. Культуры А/озр1п11шп, А/о1оЬас1ет, ВасШиз, Вгауг1и/оЬшт, Рзеидотопаз, 81гер1отусез или Мюгососсиз инокулировали в культуральной средой, обозначенной Та11 и имеющей следующий состав.

Глюкоза (отдельно стерилизованная в 50% водном растворе 0,5%

Меласса 1,5%

Жидкость после замочки кукурузы (50% сухого вещества) 1,5%

- 10 009126

Экстракт дрожжей С|51сх

Кислотный казеин

Сульфат аммония

Нитрат аммония

Карбонат кальция

Дигидрофосфат калия

Хлорид натрия

Сульфат магниях7Н₂О

Пальмовое масло

0,2%

0,1%

0,3%

0,1%

0,2%

100-100 мл части культуральной среды вносили в 500 мл колбы Эрленмейера, затем стерилизовали при температуре 121°С в течение 30 мин. Стерильную культуральную среду инокулировали микроорганизмами, выращенными на культурах скошенного агара, и культивирование культур проводили при температуре 25°С на вращающемся столе, действующем при вращении 260 об./мин, в течение 36 мин. Наблюдение за ростом проводили микроскопическим тестом, затем с использованием количества 5% инокулума проводили инокуляцию основной ферментативной культуральной среды ТаИ, имеющей следующий состав.

Глюкоза (отдельно стерилизованная в 50% водном растворе) 1,5%

Меласса 2,5%

Экстракт дрожжей Ск1сх 0,4%

Кислотный казеин 0,4%

Сульфат аммония 0,2%

Нитрат аммония 0,2%

Карбонат кальция 0,3%

Дигидрофосфат калия 0,2%

Хлорид натрия 0,1%

Сульфат магниях7Н₂О 0,2%

Раствор микроэлементов* 0,45%

Пальмовое масло 0,2% *Состав раствора микроэлементов приводится в примере 1.

Культуральную среду стерилизовали в колбах Эрленмейера на 100 мл, а ферментацию проводили в лабораторных ферментерах с общим объемом 10 л и эффективным объемом 5 л в условиях, указанных выше.

Культуры, помещенные в колбы, культивировали на вращающемся столе, тогда как в ферментерах культивирование проводили обычным образом с введением воздуха (объем/объем) и проведением турбосмешивания двойным вводом и вращением 360 об./мин, в течение 24 ч, когда число клеток на миллиметр, в зависимости от бактерий, достигало величин 4х10⁸-1,3х10⁹.

Для получения культур в больших количествах 10 л культур получали на культуральной среде Та11, имеющей указанный выше состав, в вышеуказанных условиях ферментации, затем 100 л стерилизованной культуральной среды Та11 и 100 л культуральной среды ТаИ инокулировали каждую 5-5 л. Культивирование продолжали в течение 24 ч в указанных выше условиях ферментации, затем культуры выращивали на культуральной среде Та1И в почве, 50 л культуры, выращенной на культуральной среде Та11, использовали для инокуляции 1000 л стерилизованной культуральной среды Та1И. Культивирование проводили в указанных выше условиях ферментации в течение 24 ч, после чего, как показала проверка, культура была готова для использования. В случае необычно интенсивного вспенивания в качестве противопенящегося агента добавляли 0,01% пропиленгликоля.

6В. Культивирование на полуминимальной культуральной среде.

Процедуру, указанную в примере 6, повторяли с тем отличием, что, вместо культуральной среды Та1И, использовали культуральную среду Та2И следующего состава.

Меласса 0,5%

Кислотный казеин 0,1%

Сульфат аммония 0,7%

Нитрат аммония 0,5%

Карбонат кальция 0,3%

Дигидрофосфат калия 0,3%

Хлорид натрия 0,1%

Сульфат магниях7Н₂О 0,2%

Раствор микроэлементов* 0,35%

Пальмовое масло 0,2% *Состав раствора микроэлементов находится в соответствии с составом раствора в примере 1.

- 11 009126

После завершения культивирований культуры содержат, в зависимости от бактерий, 1-7х10⁸ клеток на миллилитр.

Пример 7. Эксперименты улучшения структуры почвы и культивирования растений.

7А. Эксперименты для улучшения структур почвы.

Песчаную почву, собранную у ИапиЬе, около 8ош1уоз71§е1, и глинистые почвы из Ез^егдош помещали в лотки 90x90 см при толщине слоя 25 см. Песчаную почву обрабатывали 10 г нитрата аммония и 5 г фосфата кальция на лоток. В лоток высевали кукурузу в количестве 104 семян на лоток. При оценке авторы не брали данные пяти самых больших и пяти самых неразвитых растений. Измеряли массу корней, промытых дистиллированной водой с последующим высушиванием 2 дня при температуре 45 °С. Лоток № 1 обильно поливали, лоток № 2 при посеве обильно поливали, но совсем не поливали позднее. Лотки, обозначенные «а», инокулировали применяемыми в качестве микроорганизмов, биосинтезирующих полисахариды, культурами групп микроорганизмов ВасШиз ро1утуха уаг. 8^17 (ΝϋΆΙΜ /Р/ В 001295), ВасШиз шеда1епиш уаг. Μ326 (ΝϋΆΙΜ /Р/ В 001291), Мюгососсиз гозеиз зрр. А21 (ΝΟΑΙΜ /Р/ В 001294) и ВгабугЫ/оЬшт )аротсит уаг. РН25 (ΝΟΑΙΜ /Р/ В 001302), депонированных в Национальной коллекции сельскохозяйственных и промышленных микроорганизмов и полученных в соответствии с примером 6, в количестве 10⁸клеток на 1 м² из каждой бактерии. Обозначенные «Ь» лотки не обрабатывали микроорганизмами.

В табл. 3 показаны результаты, полученные на 33-й день после засевания. Результаты выражены как средние величины, вычисленные для одного растения.

Таблица 3

Почва	Лоток	Обработка	Высота растения (см)	Масса корневой системы (мг)
Песчан.	№1	А В	24 17	945 634
	№2	А В	18 11	8 66 757
Глинист.	№1	А В	27 23	1095 1213
	№2	А В	20 19	1012 689

В табл. 4 показана степень рассыпания и растрескивания неполитых песчаных и глинистых почв (лоток № 2). Термином «степень рассыпания» авторы обозначают, что основная часть фрагментов почвы рассыпалась на листе бумаги и не распадающиеся в ходе слабого встряхивания комочки имеют размер ниже 2 мм (-), между 2-5 мм (+) или больше 5 мм (++). Степень растрескивания поверхности почвы обозначают так, что отсутствие растрескиваний отмечают ++, слабое растрескивание обозначают +, тогда как в присутствии больших линий растрескивания характеристику растрескивания сухих почв обозначают -.

Таблица 4

Почва	Обработка	Степень рассыпания	Степень растрескивания
Песчан.	А	+	+
	В	-	- или + .
Глинист.	А	++	+
	В	++ .	++

Из данных табл. 3 и 4 можно видеть, что присутствие микроорганизмов, биосинтезирующих полисахариды, улучшает развитие растений и является благоприятным для структуры почвы.

7В. Эксперименты на полях.

Эксперименты проводили на 1шргоуешеп1 апб СиШуайоп Тесйпо1о§1са1 81айоп о£ Μозоптадуа^оνа^ итуегзйу в 2000г. с 10 л смеси микроорганизмов на гектар, при случайном размещении в виде блоков и повторе 4 раза, с 10 л смеси микроорганизмов на гектар.

Тип экспериментальной почвы: регион ИапиЬе, толщина слоя 120-140 см, содержание гумуса 2,4%, количество осадков бедное.

Яровая пшеница

Содержание белка, %
Контроль	11,80
ΝΡΚ 200, кг/га	11, 87
ВасйоГИ А	11,96
Содержание белка, корректированное на сухое вещество, %
Контроль	\| 13,84

- 12 009126

ΝΡΚ 200, кг/га	13,91
ВасбоЕН А	14,00
Сырой глютен, %
Контроль	32,0
ΝΡΚ 200, кг/га	31,1
ВасбоЕН А	31,1
Масса тысячи зерен (г)
Контроль	36, 4
ΝΡΚ 200, кг/га	36,8
ВасЬоЕН А	36,4
Дробление, %
Контроль	50,5
ΝΡΚ 200, кг/га	50,0
ВасбоЕН А	49, 8
Величина падения (сек)
Контроль	278,3
ΝΡΚ 200, кг/га	281,5
ВасбоЕН А	272,5
Разравнивание глютена (см)
Контроль	2,75
ΝΡΚ 200, кг/га	3,25
ВасбоЕН А	2,75
Удлинение глютена (см)
Контроль	12,5
ΝΡΚ 200, кг/га	11, 8
ВасЪоЕН А	12,3
Индекс ге!епу
Контроль	30,0
ΝΡΚ 200, кг/га	30,3
ВасЬоЕН А	30,8
Способность поглощать воду на приборе Уа1ог1дгарИ (мл)
Контроль	31,3
ΝΡΚ 200, кг/га	31,6 .
ВасЬоЕН А	31,4

Величина, полученная на УаТоггдгарИ
Контроль	57,3
ΝΡΚ 200, кг/га	53,1
ВасбоЕН А	48,0
Объем листьев (см³)
Контроль	962, 5
ΝΡΚ 200, кг/га	977,5
ВасбоЕН А	1055,0
Морфологический	коэффициент хлеба
Контроль	2,38
ΝΡΚ 200, кг/га	2,46
ВасбоЕН А	2,32
Выход белка (кг/га)
Контроль	469, 8
ΝΡΚ 200, кг/га	498, 6
ВасбоЕН А	510,3
Высота растения (см)
Контроль	56,3
ΝΡΚ 200, кг/га	57,7
ВасбоГИ А	55,4
Урожай зерна, вычисленный для 13% влажности
	Урожай зерна % контроля т/га
Контроль	3,366 100,0
ΝΡΚ 200, кг/га	3,552 105,5
ВасЬоЕН А	3,617 107,5
Урожай зерна
	Урожай зерна % контроля т/га
Контроль	3,398 100,0
ΝΡΚ 200, кг/га	3,584 105,5
ВасбоЕН А	3,646 107,3
Содержание влаги урожая пшеницы, %
Контроль	\| 14,08

- 13 009126

ΝΡΚ 200, кг/га	14,00
ВасЬоЕП А	13,93
Масса для тестирования (кг)
Контроль	69, 8
ΝΡΚ 200, кг/га	70,4

Кукуруза

Сырой урожай сердцевины кукурузного початка (кг/участок)
	Сырой урожай сердцевины кукурузного початка (т/га)	% контроля
Контроль	5,725	100, 3
ΝΡΚ 200, кг/га	6, 848	119, 6
ВасбоЕН А	6, 495	113, 4
Урожай зерна, вычисленный на 14% влаги
	Урожай зерна (т/га)	% контроля
Контроль	5, 496	100,0
ΝΡΚ 200, кг/га	6, 614	120,3
ВасРоЕН А	6,175	112,3
Содержание влаги зерен, %
Контроль	18,40
ΝΡΚ 200, кг/га	17,78
ВасбоЕН А	19,63
Масса стебля
	Масса стебля (т/га)	% контроля
Контроль	2,672	100,0
ΝΡΚ 200, кг/га	3,016	112, 9
ВасбоРИ А	2, 886	108,0
Содержание влаги стебля, %
Контроль	26,1
ΝΡΚ 200, кг/га	25, 6
ВасбоЕН А	25, 9
Масса стебля, вычисленная на 14% влаги
	Масса стебля (т/га)	% контроля
Контроль	2,416	100, 0
ΝΡΚ 200, кг/га	2,740	113, 4

ВасбоЕН А	I 2,613	108,2
Число стеблей (тысяча шт/га)
Контроль	38,41
ΝΡΚ 200, кг/га	39,13
ВасЬоЕН А	39,86
Число стержней кукурузного початка на стебель (шт/участок)
Контроль	1, 04
ΝΡΚ 200, кг/га	1,10
ВасбоЕН А	1,05
Число стержней кукурузного початка (тысяча шт/га)
Контроль	39,86
ΝΡΚ 200, кг/га	42,93
ВасбоЕН А	42,03
Масса тысячи сырых зерен (г)
Контроль	255,2
ΝΡΚ 200, кг/га	259,2
ВасбоЕН А	263,3 . .... . .
Масса тысячи зерен при 14% влажности (г)
Контроль	245, 6
ΝΡΚ 200, кг/га	250, 9
ВасбоЕН А	251, 0
Масса	сырого материала для тестирования (кг)
Контроль	65,9
ΝΡΚ 200, кг/га	65,1
ВасбоЕН А	64,6
Масса одного стержня кукурузного початка (кг) при 14%
	влажности
Контроль	0,121
ΝΡΚ 200, кг/га	0,136
ВасбоЕН А	0,131
Число	зерен на стержень кукурузного початка
Контроль	493,5
ΝΡΚ 200, кг/га	545,1
ВасЬоЕН А	523,1

- 14 009126

Содержание влаги стержня кукурузного початка, %
Контроль	19,4
ΝΡΚ 200, кг/га	20,7
ВасЕоЕН А	18,9 . . 1
Масса стержня кукурузного початка (г)
Контроль	22,3
ΝΡΚ 200, кг/га	22,3
ВасДоЕН А	22,4
Индекс урожая
Контроль	44,1
ΝΡΚ 200, кг/га	41,5
ВасЬоЕН А	42,3

Сахарная свекла

Число плодов свеклы/га
Контроль	79891
ΝΡΚ 200, кг/га	81159
ВасЪоЕН А	83696
Урожай верхней части свеклы
	Урожай верхней части (т/га)	% контроля
Контроль	13,41	100,0
ΝΡΚ 200, кг/га	13,96	104,1
ВасЪоЕН А	15,38	114,7
Урожай корней
	Урожай корней (т/га)	% контроля
Контроль	30,46	100, 0
ΝΡΚ 200, кг/га	36, 74	120, 6
ВасГоЕН А	39,35	129, 2
Отношение верхняя часть/корни
	Отношение верхняя часть/корни	% контроля
Контроль	0,443	100,0
ΝΡΚ 200, кг/га	0,381	85,9
ВасРоЕН А	0,391	88,2
Средняя масса корней
	\| Средняя масса корней (дкг)	\| % контроля

Контроль	38,2	100,0
ΝΡΚ 200, кг/га	45,3	118,6
ВасДоЕН А	47,1	123, 5
% усвоения
	% усвоения	Контроль
Контроль	11,61	100,0
ΝΡΚ 200, кг/га	11,07	95,3
ВасЕоЕН А	10,59	91,3
Содержание Иа (мг/100 г свеклы)
Контроль	1, 94
ΝΡΚ 200, кг/га	2,28
ВасЬоЕН А	2,08
Содержание альфа-амино-Ν (мг/100 г свеклы)
Контроль	1,20
ΝΡΚ 200, кг/га	1,02
ВасйоЕН А	1,02 ........ ...... ... 1
Содержание К (мг/100 г свеклы)
Контроль	2,52
ΝΡΚ 200, кг/га	1,89
ВасЬоЕН А	2,10
Потери, %
Контроль	2,95
ΝΡΚ 200, кг/га	2,68
ВасЕоЕН А	2, 68
Содержание очищенного сахара
	Содержание очищенного сахара, %	% контроля
Контроль	8,66	100, 0
ΝΡΚ 200, кг/га	8,39	96, 9
ВасЬоЕН А	7,92	91,4
Брутто-выход сахара
	Брутто-выход сахара (т/га)	% контроля
Контроль	3,557	100,0
ΝΡΚ 200, кг/га	4,081	114,7

- 15 009126

ВасГоРИ А	4,181	117,5

	Нетто-урожай сахара (т/га)	Контроль
Контроль	2,656	100,0
ΝΡΚ 200, кг/га	3,091	116,4
ВасЪоРИ А	3,125	117,7

Пример 8. Получение препаратов, содержащих микроорганизмы настоящего изобретения.

А. Получение смеси микроорганизмов.

Культуры Αζозр^^^11ит ЬгазПепзе ззр. 8ν51 (Ν0ΑΙΜ /Р/ В 001293), ΑζоΐоЬасΐе^ уте1апПп зрр. М657 (Ν0ΑΙΜ /Р/ В 001292), РзеиПотопаз Ниогезсепз уаг. 8ν11 (Ν0ΑΙΜ /Р/ В 0С1296), ВасШиз ро1утуха уаг. 8ν17 (Ν0ΑΙΜ /Р/ В 001295), ВасШиз те§а!епит уаг. М326 (Ν0ΑΙΜ /Р/ В 001291), Мюгососсиз гозеиз зрр. Α21 (Ν0ΑΙΜ /Р/ В 001294), ВгаПу1^оЬшт заротсит уаг. РН25 (Ν0ΑΙΜ /Р/ В 001302) и 81гер1отусез а1Ьиз уаг. 0003 Б-Р (Ν0ΑΙΜ /Р/ В 001301), полученные в соответствии с примером 6, смешивали, оптимально в равных пропорциях, и вносили в почву, которую нужно было обработать, в количестве между 5 и 50 л, оптимально в количестве 12 л/га в любой период года без заморозков, оптимально между мартом и октябрем.

8В. Получение для обработки однодольных растений.

Получение проводили по процедуре примера 6 с тем отличием, что применяли следующие микроорганизмы: Αζозр^^Шит ЬгазПепзе ззр. 8ν51 (Ν0ΑΙΜ /Р/ В 001293), ΑζоΐоЬасΐе^ уте1апПп зрр. М657 (Ν0ΑΙΜ /Р/ В 001292), РзеиПотопаз Ниогезсепз уаг. 8ν11 (Ν0ΑΙΜ /Р/ В 001296), ВасШиз ро1утуха уаг. 8ν17 (Ν0ΑΙΜ /Р/ В 001295), ВасШиз те§а!епит уаг. М326 (Ν0ΑΙΜ /Р/ В 001291) и 81гер1отусез а1Ьиз уаг. 0003 РР (ΝϋΑΙΜ /Р/ В 001301).

8С. Получение для обработки двудольных растений.

Получение проводили по способу примера 6 изобретения с тем отличием, что применяли следующие микроорганизмы: Αζозр^^Шит ЬгазПепзе ззр. 8ν51 (NСΑIΜ /Р/ В 0С1293), ΑζоΐоЬасΐе^ уте1апПп зрр. М657 (Νί'ΆΙΜ /Р/ В 0С1292), РзеиПотопаз Ниогезсепз уаг. 8ν11 (Νί'ΆΙΜ /Р/ В 001296), ВасШиз ро1утуха уаг. 8ν17 (NСΑIΜ /Р/ В 001295), ВасШиз те§а!епит уаг. М326 (NСΑIΜ /Р/ В 001291), Мюгососсиз гозеиз зрр. Α21 (NСΑIΜ /Р/ В 001294), ВгаПу1^оЬшт заротсит уаг. РН25 (NСΑIΜ /Р/ В 001302).

8Ό. Получение препарата, высушенного в условиях замораживания.

л водной суспензии микроорганизмов по примеру 6 лиофилизировали в оборудовании для лиофилизации Ое1тап 8Р54, действуя по инструкциям эксплуатации оборудования. Порошок сухих микроорганизмов использовали как таковой или, в зависимости от применения, смешивали с карбонатом кальция, крахмалом, глюкозой или целлюлозой в пропорции между 1:1 и 1:100, затем препарат хранили до использования при температуре между 4 и 10°С.

8Е. Получение препарата, содержащего носитель.

В оптимальном случае равную пропорцию культур, полученных на культуральной среде в соответствии с примером 6, смешивали с органическим компостом, соевой мукой (общий размер гранул 4 меш), метилцеллюлозой или картофельным крахмалом так, чтобы препарат содержал 5х10⁸-10¹⁰, оптимально 5х10⁹ клеток микроорганизмов, затем сырой препарат или препарат, высушенный при температуре ниже 40°С, в количестве 2-20, оптимально в количестве 5 кг/га, вводили в почву, которую нужно было обработать. Оптимально в почву вводили по меньшей мере 10¹³ клеток микроорганизмов на гектар.

Резюме

Предметом изобретения являются продукты и способ обработки почвы бактериями для повышения роста растений и для повышения урожая, способы получения продуктов, исходных микроорганизмов, служащих в качестве основы продуктов, размножающихся при низкой температуре, биосинтезирующих полисахариды, и способы их получения. Клетки одного из микроорганизмов по изобретению или их соединение будет переноситься в почву или фиксироваться в семенах растений.

По способу настоящего изобретения продукт доставляют в почву, причем продукт содержит по меньшей мере одну из групп почвенных бактерий, превращающих азот воздуха в соединения, доступные для растений, солюбилизирующих минерализованные фосфатные соединения и соединения калия и биосинтезирующие материалы, улучшающие развитие растений, продуцирующих полисахариды, оптимально влияющие на структуру почвы, причем микроорганизмы выделены из различных почв и изменены в лабораторных условиях так, чтобы можно было достичь удовлетворительных урожаев и практически исключить применение дорогих удобрений.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Штамм микроорганизма Αζозр^^Шит ЬгазПепзе ззр. 8ν51 (NСΑIΜ/Р/Β 001293), оптимально размножающийся при температурах ниже 20°С и рН 5, используемый для получения препаратов для обработки почвы.
2. Штамм микроорганизма ΑζоЬасΐе^ уте1апПп ззр. М657 (NСΑIΜ/Р/Β 001292), оптимально раз

- 16 009126 множающийся при температурах ниже 20°С и рН 5, используемый для получения препаратов для обработки почвы.
3. Штамм микроорганизма Р8еийотопа8 Пиоге8сеп8 гаг. 8XV11 (ΝΟΑΙΜ/Р/В 001296), оптимально размножающийся при температурах ниже 20°С и рН 5, используемый для получения препаратов для обработки почвы.
4. Штамм микроорганизма ВасШи8 ро1утуха гаг. 8ν17 (ΝΟΑΙΜ/Р/В 001295), оптимально размножающийся при температурах ниже 20°С и рН 5, используемый для получения препаратов для обработки почвы.
5. Штамм микроорганизма ВасШи8 тедЯепит гаг. Μ326 (ΝΟΑΙΜ/Р/В 001291), оптимально размножающийся при температурах ниже 20°С и рН 5, используемый для получения препаратов для обработки почвы.
6. Штамм микроорганизма Μκιό^^^ го8еи8 88р. Α21 (ΝΟΑΙΜ/Р/В 001294), оптимально размножающийся при температурах ниже 20°С и рН 5, используемый для получения препаратов для обработки почвы.
7. Штамм микроорганизма Вгайуг1ШоЬшт _]арошсит гаг. РН25 (ΝΟΑΙΜ/Р/В 001302), оптимально размножающийся при температурах ниже 20°С и рН 5, используемый для получения препаратов для обработки почвы.
8. Штамм микроорганизма 81гер1отусе8 а1Ьи8 гаг. 0003 ЬР (ΝΟΑΙΜ/Р/В 001301), оптимально размножающийся при температурах ниже 20°С и рН 5, используемый для получения препаратов для обработки почвы.
9. Способ получения микроорганизмов по любому из пп.1-8, заключающийся в обработке исходных микроорганизмов нитрозо-гуанидином и ультрафиолетовым облучением в качестве мутагенов и выделении нужных штаммов, размножающихся при низкой температуре.
10. Препарат, используемый для обработки почвы, содержащий по меньшей мере один из штаммов микроорганизмов по любому из пп.1-8, в количестве 5х10⁶-10^п клеток на грамм препарата, и сырой или сухой приемлемый сельскохозяйственный носитель, нетоксичный для микроорганизмов.
11. Препарат по п.10, в котором носитель представляет собой воду, и/или соевую муку, и/или крахмал, и/или целлюлозу, и/или глюкозу, или их производные.
12. Способ получения препарата, используемого для обработки почвы по любому из пп.10-11, заключающийся в раздельном или совместном культивировании на питательной среде, содержащей источник углерода и азота и неорганические соли по меньшей мере одного из штаммов микроорганизма по любому из пп.1-8 до достижения числа клеток каждого штамма между 5х10⁷ и 5х10⁹ на миллилитр, и, при необходимости, смешивании полученных культур в определенных пропорциях, и, при необходимости, нанесении культуры (культур) на носитель или смешивании с ним, и, при необходимости, лиофилизации полученного препарата.
13. Способ по п.12, где в качестве источника углерода используют глюкозу, и/или сахарозу, и/или мелассу, в качестве источника азота используют хлорид аммония, и/или нитрат аммония, и/или сульфат аммония, и/или жидкость после замачивания кукурузы, и/или гидролизат казеина и в качестве неорганических солей используют карбонат кальция и соли, диссоциирующие на натрий-, калий-, магний-, кальций-, ферро-, нитрат-, хлорид-, сульфат-, карбонат-, фосфат-ионы, и, при необходимости, микроэлементы.
14. Способ обработки почвы препаратом по любому из пп.10-11, характеризующийся нанесением препарата на почву или введением препарата в почву в период без заморозков из расчета от 10¹⁰ до 10¹⁴клеток на гектар.
15. Способ улучшения или сохранения структуры почвы, характеризующийся в обработке почвы препаратом по любому из пп.10-11, где микроорганизм выбран из числа микроорганизмов, продуцирующих полисахариды, предпочтительно из числа микроорганизмов, продуцирующих сукциноглюкон, таких как ВасШи8 ро1утуха гаг. 8ν17 (ΝΟΑΙΜ/Р/В 001295), ВасШи8 теда!егшт гаг. Μ326 (ΝΟΑΙΜ/Р/В 001291), Μκιό^^^ го8еи8 88р. А21 (ΝΟΑΙΜ/Р/В 001294), ВгайуйШоЬшт _)арошсит гаг. РН25 (Νί,ΑΙΜ/Р/В 001302) и их смесей.