CN110317087A

CN110317087A - 适用于南方贫瘠土壤的解磷固氮复合菌肥、制备方法及其应用

Info

Publication number: CN110317087A
Application number: CN201910675673.XA
Authority: CN
Inventors: 王志康; 洑香香; 陈紫云; 尚旭岚; 徐子恒
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2019-07-25
Filing date: 2019-07-25
Publication date: 2019-10-11

Abstract

本发明涉及南方贫瘠土壤的解磷固氮复合菌肥、制备方法及其应用，所述的复合菌肥由巨大芽孢杆菌、荧光假单胞菌、褐球固氮菌、巴西固氮螺菌中的至少两种菌组成。本发明筛选了适用于南方贫瘠黄棕壤的菌肥组合，并公开其培养方法，包括：将细菌接种在改良过的LB培养基上培养；将培养后的菌液稀释，然后按照不同细菌组合接种于待改良土壤中培养。本发明提出了一种适用于南方贫瘠黄棕壤的绿色且经济环保的施肥方式——生物菌肥，通过对细菌组合、培养时间等多个方面进行优化，根据土壤养分特性动态变化得出了一种较佳的施肥组合和施肥时间，为土壤可持续性改良体系奠定了基础，同时也对微生物菌的开发和利用具有重要意义。

Description

适用于南方贫瘠土壤的解磷固氮复合菌肥、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及适用于南方贫瘠土壤的解磷固氮复合菌肥、制备方法及其应用，属于土壤改良技术领域。

背景技术

土壤有效氮(N)、磷(P)含量是衡量土壤肥力的重要元素指标，植物体内蛋白质、磷酸的合成及能量循环等代谢过程都离不开N、P元素。在我国南方一些贫瘠山地，土壤有机质含量低，可供植物吸收利用的养分较少，严重影响了植物生长和养分循环利用。目前解决土壤缺氮少磷最广泛的方法仍然是施化肥，但长期不合理的施用化肥会对土壤环境带来严重的污染和不利影响，施加有机肥可以增加土壤中有机质含量，但其肥效较慢。因此，寻求一种新的生态环保途径来改善土壤肥力，提高农林作物产量和质量以及科学合理地施肥和提高肥料效率是未来农业研究的重点，同时也是发展循环农林业的重要技术手段。

生物菌肥作为一种新兴的绿色肥料，按应用类型可分为解磷菌，固氮菌和解钾菌，一般与有机肥混施可有效改良土壤。近几年来，生物菌肥的利用得到了迅速的发展，研究的侧重点主要在单菌种或成品菌肥的作用机理、土壤养分的改良以及立地生产力的提高等方面，其中以解磷菌和固氮菌应用最广。目前已经从土壤中分离出来的解磷菌主要有巨大芽孢杆菌 (Bacillus megaterium)和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，固氮菌主要有褐球固氮菌(Azotobacter chroococcum)和巴西固氮螺菌(Azospirillumbrasilence)等。虽然已有不少关于这些细菌的单独报道，但更多的是通过接种单一有益细菌来评价其土壤改良效果，关于多种菌混合的应用还较为少见。接种有益细菌在实际应用中也面临着一些问题，比如菌肥的土壤改良效果常因为细菌存活率较低而大打折扣，单次单菌接种也很难在土壤中形成大量菌群。

目前土壤改良以施化肥和有机肥为主，但存在生产耗能大、施用成本高、环境污染严重、土壤结构板结、土壤有效氮和有效磷含量普遍偏低等问题，这大大限制了农林业的可持续化发展，而这些生物菌肥具有无污染、可持续性高、可快速大量生产等特点，能够在一定程度上降低化肥的使用，被认为是实现土壤绿色改良的较好方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是改变传统的施肥方式，同时克服现有技术的缺陷(菌肥单一化)，提供一种适用于南方贫瘠土壤的解磷固氮复合菌肥、制备方法及其应用；利用四种有益细菌筛选适用于南方贫瘠山地土壤的菌肥组合、施用量和施肥时间，能够在较短时间内生产大量菌肥，该菌肥可有效改良土壤，且具有无污染、可持续性高等特点，同时也为工业化生产以及发展循环农林业奠定了基础。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：适用于南方贫瘠土壤的解磷固氮复合菌肥，其特征在于，所述的复合菌肥由巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium、荧光假单胞菌 Pseudomonas fluorescens、褐球固氮菌Azotobacter chroococcum、巴西固氮螺菌Azospirillum brasilense中的至少两种菌组成。

更优选的，所述的复合菌肥由荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens、巴西固氮螺菌 Azospirillum brasilense组成；或者，所述的复合菌肥由巨大芽孢杆菌Bacillusmegaterium、荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens、褐球固氮菌Azotobacterchroococcum、巴西固氮螺菌 Azospirillum brasilense组成；再或者，所述的复合菌肥由巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium、荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens组成。

单次施用所述的解磷固氮复合菌肥时各菌浓度为1×10⁸～1×10⁹CFU·mL^-1(该浓度指各个单独菌在解磷固氮复合菌肥(即，混合菌液)中的浓度；当两种菌混合形成解磷固氮复合菌肥，两种菌的体积比为1：1；当四种菌混合形成解磷固氮复合菌肥，四种菌的体积比为1：1： 1：1。

在单次施用解磷固氮复合菌肥时，每300g黄棕壤土需要施加至少5mL混合菌液，且在混合菌液中各菌浓度为1×10⁸～1×10⁹CFU·mL^-1。例如，当所述的复合菌肥由荧光假单胞菌 Pseudomonas fluorescens、巴西固氮螺菌Azospirillum brasilense组成时，至少5mL混合菌液 (其中荧光假单胞菌浓度为1×10⁸～1×10⁹CFU·mL^-1，巴西固氮螺菌浓度为1×10⁸～1×10⁹ CFU·mL^-1)均匀分布于300g黄棕壤中(均匀分布是通过以下方式实现的：混合菌液施加于黄棕壤表面，通过翻耕黄棕壤使混合菌液与一定厚度的黄棕壤混匀)。

所述的贫瘠土壤为南方贫瘠黄棕壤。

本发明还提供一种适用于南方贫瘠土壤的解磷固氮复合菌肥的制备方法，其特征在于，步骤如下：

将前述的解磷固氮复合菌肥中的至少两种细菌接种在改良过的LB培养基上，培养24-48h，其中改良过的LB培养基的配方为：pH:7.0，胰蛋白胨10g/L,酵母膏5g/L,NaCl 10g/L, MnSO₄·H₂O 5mg/L,K₂HPO₄ 0.8g/L,MgSO₄·7H₂O 0.1g/L,CaSO₄·2H₂O 0.1g/L,FeCl₃2mg/L；改良过的LB培养基相对于普通LB培养基(胰蛋白胨10g/L,酵母膏5g/L,NaCl 10g/L)额外添加了固氮菌和解磷菌所需要的微量元素和其它养分，能够促进复合菌快速生长扩繁。培养后各菌液可适当稀释，将前述的解磷固氮复合菌肥对应的各菌液混合形成混合菌液，混合菌液中各菌的浓度为1×10⁸～1×10⁹CFU·mL^-1。本发明还涉及一种适用于南方贫瘠土壤的解磷固氮复合菌肥的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)选取两种解磷菌—巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium、荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens和两种固氮菌—褐球固氮菌Azotobacter chroococcum、巴西固氮螺菌Azospirillum brasilense进行土壤改良；

2)将步骤1)中的四种细菌接种在改良过的LB培养基上，培养24-48h，其中改良过的 LB培养基的配方为：pH:7.0，胰蛋白胨10g/L,酵母膏5g/L,NaCl 10g/L,MnSO₄·H₂O 5mg/L, K₂HPO₄ 0.8g/L,MgSO₄·7H₂O 0.1g/L,CaSO₄·2H₂O 0.1g/L,FeCl₃ 2mg/L；

3)将经步骤2)培养后的四种菌液根据菌液浓度—OD值的标准曲线稀释至同一浓度，各菌的浓度范围为1×10⁸～1×10⁹CFU·mL^-1，然后按照不同细菌组合接种于待改良土壤中，细菌组合方式为：单独、两两组合，四种细菌混合；无菌条件下培养60d；其中，待改良土壤为黄棕壤表层土；

4)持续测定土壤细菌存活率和土壤养分变化，综合考虑最适细菌组合。

前述的筛选方法，更具体的步骤如下：1)针对南方贫瘠黄棕壤缺氮、少有效磷的特点，选取了两种解磷菌(巨大芽孢杆菌：Bacillus megaterium；荧光假单胞菌：Pseudomonasfluorescens)和两种固氮菌(褐球固氮菌：Azotobacter chroococcum；巴西固氮螺菌：Azospirillum brasilense)进行土壤改良；2)将这四种细菌接种在改良过的LB培养基上，培养24-48h，其中培养基的配方为：pH:7.0，胰蛋白胨10g/L,酵母膏5g/L,NaCl 10g/L,MnSO₄·H₂O 5mg/L, K₂HPO₄ 0.8g/L,MgSO₄·7H₂O 0.1g/L,CaSO₄·2H₂O 0.1g/L,FeCl₃ 2mg/L；3)将培养后的菌液稀释至同一浓度(浓度范围为1×10⁸～1×10⁹CFU·mL^-1)，然后按照不同细菌组合(单独，两两组合，四种细菌混合)接种于待改良土壤中，无菌条件下培养60d；其中，待改良土壤取自南方贫瘠山地(N31°35′E119°09′)0-20cm土壤表层土，根据土壤学分类标准为贫瘠粘土；4) 持续测定土壤细菌存活率和土壤养分变化，综合考虑最适细菌组合。

本发明还提供解磷固氮复合菌肥的施用方法，步骤如下：解磷固氮复合菌肥施加于待改良黄棕壤表面，施加后翻耕黄棕壤，翻耕深度为5-20cm，使解磷固氮复合菌肥与5-20cm厚的黄棕壤充分混匀；解磷固氮复合菌肥的单次施用量为：每300g黄棕壤土需要施加至少5mL 解磷固氮复合菌肥(即混合菌液)、且在混合菌液中各菌浓度为1×10⁸～1×10⁹CFU·mL^-1；每隔30-45d重新施加一次解磷固氮复合菌肥，有助于其持续性改良土壤。

本发明的又一个目的是提供解磷固氮复合菌肥或前述的制备方法在改良贫瘠黄棕壤中的用途，以及前述的施用方法或前述的筛选方法在改良贫瘠黄棕壤中的用途。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明针对现有土壤管理措施(化肥、有机肥) 中污染大、利用率低、可持续性较差等问题，提出了一种适用于南方贫瘠黄棕壤的绿色且经济环保的施肥方式——生物菌肥，通过对细菌组合、培养时间等多个方面进行优化，根据土壤养分特性动态变化得出了一种较佳的施肥组合和施肥时间，为土壤可持续性改良体系奠定了基础，同时也对微生物菌的开发和利用具有重要意义。

附图说明

图1不同处理在培养30d和60d时的a.速效磷含量，b.酸性磷酸酶活性大小。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述。

本发明筛选了菌肥组合和施肥时间，主要包括以下步骤：

1、拮抗试验：将不同菌种(巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium、荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens、褐球固氮菌Azotobacter chroococcum、巴西固氮螺菌Azospirillum brasilense)进行两两混合培养。采用径向扩散法，置于LB培养基，在28℃培养箱内培养24h，观察培养基中不同细菌的生长数量和抑菌圈是否明显，从而判断两种细菌是否存在拮抗效应。结果如下(表1)：通过径向扩散法将含不同细菌的通用培养基培养24h后发现，各处理均无明显抑菌圈，且各细菌生长数量不受影响，两种细菌数量间无明显差异。因而可以推定它们在土壤内生长互相不受干扰，不同细菌之间不存在拮抗作用。

表1细菌混合培养拮抗效应分析

注：表中M:巨大芽孢杆菌，B:巴西固氮螺菌，C:褐球固氮菌，F:荧光假单胞菌，字母组合代表相应的菌液混合处理，下同。小写字母表示处理内细菌数量间差异性

2、土壤培养：按照不同菌液设置12个处理，其中包括单一菌种处理4个，两两混合菌种处理6个，四种细菌混合1个，对照是施等量的无菌水(表2)。土壤(即贫瘠黄棕壤)样品高压灭菌(121℃,15min)后，风干过筛装入上口径9.5cm、下口径8cm、高8.4cm的培养盒中；每盒称土300g，再次进行高压灭菌。将活化好(即经改良后的LB培养基中培养后)的菌液(通过测定OD值和标准浓度曲线确定磷细菌液和固氮菌液浓度一致为1×10⁸CFU·mL^-1，其中改良后的LB培养基的配方为：pH:7.0，胰蛋白胨10g/L,酵母膏5g/L,NaCl 10g/L, MnSO₄·H₂O5mg/L,K₂HPO₄ 0.8g/L,MgSO₄·7H₂O 0.1g/L,CaSO₄·2H₂O 0.1g/L,FeCl₃ 2mg/L)按照不同处理与盒中的土壤充分混匀，加入蒸馏水使土壤水分保持在田间持水量的60％左右；每个处理重复4次。封口之后放置在28℃培养箱在暗条件下培养60d，培养期间定期喷洒一定量无菌水以保证含水量基本不变。

表2细菌的土壤培养组合和试验方案

3、细菌生长及其存活量：土壤中微生物数量的动态变化：在培养后第5、10、15、25、30、45和60d，称取10g鲜土样，加90ml无菌水后在摇床振荡30min，取1mL混合液至10mL 离心管，加9mL无菌水，按此法依次稀释到10⁴、10⁵、10⁶和10⁷，各取0.2mL进行稀释涂平板，培养24h后数菌落数。

相关结果如下(表3)：总体上看，不同处理在不同培养时间的细菌数量变化较大。其中四种细菌混合处理初期数量较多(培养10d时达到了43.3×10⁶CFU/g)，后期有逐渐降低的趋势(培养60d降低到3.7×10⁶CFU/g)；而两种细菌混合处理在培养45～60d时细菌数量相对于其他处理较多，其中MF处理最大，达到了15.3×10⁶CFU/g，而CB处理持续性最佳，在60d 时依然在保持增长。单施处理中，处理C和处理B在培养后期数量均有一定增长，分别在60d 和45d达到了17.3×10⁶和15.3×10⁶CFU/g；而处理F和处理M细菌数量并没有增长的趋势，反而表现为逐渐减小，培养60d的细菌数量与培养5d相比分别降低了78.31％和35.71％。通过方差分析发现，处理MFCB在培养前期与其他处理差异性显著，细菌数量相对较多，而后期数量显著低于其他处理。

从这些结果可以看出，不同菌种组合在土壤中生长模式也不一样；30-45天左右大部分处理的细菌数量达到较大值；混施比单施效果要好，并且4种菌混施在短时间内就能形成大量菌群；解磷菌和固氮菌可能具有协同作用，能够在土壤中形成合作关系，促进彼此生长。

表3细菌数量(×10⁶CFU·g^–1土)随土壤培养时间动态变化

注：表中不同大写字母表示同一处理不同培养时间的细菌数量差异性达到p<0.05水平；不同小写字母表示同一培养时间不同处理的细菌数量差异性达到p<0.05水平。

4、土壤全碳、全氮、速效氮的测定：在培养中期(第30d)和末期(第60d)，称取适量土，鲜土用于测定速效氮，风干土用于测定土壤全氮全碳含量。

主要结果如下：与对照(施等量的无菌水)相比，处理MF,FB以及FC在30d时的土壤全氮含量显著提高，但在60d时不同处理间的差异性不显著。全碳的数据也与全氮的变化类似，在60d时处理间差异不显著，但是与30d时相比显著降低。比如处理M,C,MC在60d 时的全碳含量比30d时分别降低12.1％，7.4％，16.1％。从速效氮的数据上来看，所有菌种添加都提高了土壤速效氮含量，但是单独施固氮菌(比如处理C)对速效氮的提升效果并不明显。

表4土壤培养30d和60d时全碳、全氮以及速效氮的含量

注：不同小写字母表示在同一培养时间不同处理的养分含量差异达到p<0.05水平。*表示同一处理的30d 和60d的含量差异显著(p<0.05)

5、土壤速效磷和相关酶活性的测定：在培养中期(第30d)和末期(第60d)，称取适量鲜土用于测定速效磷含量及酸性磷酸酶活性。主要结果如下(图1)：图1a表示的是不同菌液处理后土壤有效磷在30d和60d的变化；图1b表示的是不同菌液处理后土壤酸性磷酸酶在30d和60d的变化。从整体上看，速效磷含量在较低的范围之内(1～5mg/kg)，虽然添加解磷菌和固氮菌在30d显著提高了土壤速效磷含量，但在60d时又显著降低到之前的水平(图1a)。同样地，酸性磷酸酶活性也表现为先增高后降低(图1b)。因此，合理的施肥组合固然重要，但是在施肥间隔时间上也要重视，即及时的补充菌种，保证其在土壤中的生长不受大的影响，保持较高的土壤改良效率。我们发现，30-45d时是补充菌剂的适宜时期。

总结：针对本发明所研究的南方贫瘠黄棕壤改良，我们发现(1)在菌种组合的选择上，混合菌种的效果比单菌效果要好；(2)从细菌存活和生长结果来看，30天到45天左右为施肥间隔较为合适；(3)综合各项土壤指标，比较合适的处理有MF(两种解磷菌混合)、FB(解磷菌和固氮菌混合)和MFCB(四种细菌混合)；(4)适宜于该四种细菌的培养基配方为pH:7.0，胰蛋白胨10g/L,酵母膏5g/L,NaCl 10g/L,MnSO₄·H₂O 5mg/L,K₂HPO₄ 0.8g/L, MgSO₄·7H₂O 0.1g/L,CaSO₄·2H₂O 0.1g/L,FeCl₃ 2mg/L。

以上所述仅是本发明的优选施肥组合及时间，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.适用于南方贫瘠土壤的解磷固氮复合菌肥，其特征在于，所述的复合菌肥由巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium、荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens、褐球固氮菌Azotobacter chroococcum、巴西固氮螺菌Azospirillum brasilense中的至少两种菌组成。

2.根据权利要求1所述的适用于南方贫瘠土壤的解磷固氮复合菌肥，其特征在于，所述的复合菌肥由荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens、巴西固氮螺菌Azospirillumbrasilense组成；

或者，所述的复合菌肥由巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium、荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens、褐球固氮菌Azotobacter chroococcum、巴西固氮螺菌Azospirillum brasilense组成；

再或者，所述的复合菌肥由巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium、荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens组成。

3.根据权利要求1所述的适用于南方贫瘠土壤的解磷固氮复合菌肥，其特征在于：

单次施用所述的解磷固氮复合菌肥时，各单菌浓度为1×10⁸～1×10⁹CFU·mL^-1；当两种菌混合形成解磷固氮复合菌肥，两种菌的体积比为1：1；当四种菌混合形成解磷固氮复合菌肥，四种菌的体积比为1：1：1：1。

4.根据权利要求1所述的适用于南方贫瘠土壤的解磷固氮复合菌肥，其特征在于：所述的贫瘠土壤为黄棕壤。

5.一种适用于南方贫瘠土壤的解磷固氮复合菌肥的制备方法，其特征在于，步骤如下：

将权利要求1或2所述的解磷固氮复合菌肥中的至少两种细菌接种在改良过的LB培养基上，培养24-48h，其中改良过的LB培养基的配方为：pH:7.0，胰蛋白胨10g/L,酵母膏5g/L,NaCl 10g/L,MnSO₄·H₂O 5mg/L,K₂HPO₄ 0.8g/L,MgSO₄·7H₂O 0.1g/L,CaSO₄·2H₂O 0.1g/L,FeCl₃2mg/L；将权利要求1或2所述的解磷固氮复合菌肥对应的各菌液混合形成混合菌液，混合菌液中各菌的浓度为1×10⁸～1×10⁹CFU·mL^-1。

6.一种适用于南方贫瘠土壤的解磷固氮复合菌肥的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)选取两种解磷菌—巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium、荧光假单胞菌Pseudomonasfluorescens和两种固氮菌—褐球固氮菌Azotobacter chroococcum、巴西固氮螺菌Azospirillum brasilense进行土壤改良；

2)将步骤1)中的四种细菌接种在改良过的LB培养基上，培养24-48h，其中改良过的LB培养基的配方为：pH:7.0，胰蛋白胨10g/L,酵母膏5g/L,NaCl 10g/L,MnSO₄·H₂O 5mg/L,K₂HPO₄ 0.8g/L,MgSO₄·7H₂O 0.1g/L,CaSO₄·2H₂O 0.1g/L,FeCl₃ 2mg/L；

3)将经步骤2)培养后的四种菌液根据菌液浓度—OD值的标准曲线稀释至同一浓度，然后按照不同细菌组合接种于待改良土壤中，细菌组合方式为：单独、两两组合，四种细菌混合；无菌条件下培养60d；其中，待改良土壤为黄棕壤表层土；

7.权利要求1-4任意一项所述的解磷固氮复合菌肥的施用方法，其特征在于，步骤如下：解磷固氮复合菌肥施加于待改良黄棕壤表面，施加后翻耕黄棕壤，翻耕深度为5-20cm，使解磷固氮复合菌肥与5-20cm厚的黄棕壤充分混匀；解磷固氮复合菌肥的单次施用量为：每300g黄棕壤土施加至少5mL混合菌液，且在混合菌液中各菌浓度为1×10⁸～1×10⁹CFU·mL^-1；每隔30-45d重新施加一次解磷固氮复合菌肥。

8.权利要求1-4任意一项所述的解磷固氮复合菌肥或权利要求5所述的制备方法在改良贫瘠黄棕壤中的用途。

9.权利要求7所述的施用方法或权利要求6所述的筛选方法在改良贫瘠黄棕壤中的用途。