CN107325821A - 一种防治西瓜枯萎病的生物质炭基微生物菌剂及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种防治西瓜枯萎病的生物质炭基微生物菌剂及其制备方法与应用，该菌剂包含以下组分：生物质炭、凹凸棒土、西瓜枯萎病生防细菌、过磷酸钙或硝基腐殖酸、无菌水；该菌剂的制备方法为：将生防菌液吸附在生物质炭上，再加入凹凸棒土和过磷酸钙或硝基腐殖酸混匀，加入适量无菌水调和、造粒，自然条件下干燥通风处，干燥后即可得到该菌剂，菌剂中活菌数≥50亿cfu/g，颗粒直径为3~6 mm，pH值6.5~7.5；本发明菌剂具有改善土壤理化性质，提高土壤酶活性，促进作物生长和提高作物产量等功能，并对西瓜枯萎病害具有较好防治作用。

Description

一种防治西瓜枯萎病的生物质炭基微生物菌剂及其制备方法 与应用

技术领域

本发明涉及农业技术领域的生物质炭搭载微生物的菌剂，特别是一种适用于多种设施地作物的固体微生物菌剂的制备方法及其在防治西瓜枯萎病害方面的应用。

背景技术

近年来我国设施蔬菜迅速发展，种植面积达5832.6万亩，设施栽培条件下，地表长期覆盖栽培改变了土壤原有的生态环境，土壤常处于高温、高湿、高蒸发、无雨水淋溶的封闭循环代谢环境中，土壤的理化性状和生物学特性发生变化，土壤板结、孔隙度降低，土壤盐分表积现象明显，土壤质量持续恶化加剧。加之农药、化肥过量施用和沉积，土壤重金属和抗生素等有毒有害物质逐渐累积，微生物种群数量及结构变化，土壤生物毒性增强，从而导致土壤酸化、次生盐渍化和土传病害加重的连作生产障碍矛盾突出，成为制约设施栽培蔬菜持续、高效发展的主要因素。

目前防治连作障碍的农业措施主要有：（1）实施轮作。轮作和间套轮作是解决连作障碍最为简单和有效的方法。通过与病原菌非寄主植物的轮作，或者在高温连作病害易发时期错栽种，土壤中的病原菌数可以得到显著的降低，但是在很多情况下为了提高经济效益，又不得不进行某些蔬菜的连作，此方法往往得不到切实的执行。（2）土壤消毒。土壤消毒包括化学药剂消毒和物理消毒法。化学药剂方法主要包括使用***、多菌灵或五氯硝基苯拌土或者用硫磺粉杀菌，也可以用药液喷浇或者拌药土沟施、穴施处理土壤；或者采用溴甲烷熏蒸土壤。物理方法主要是采用高温或者低温使有害菌的数量减少。夏季高温季节，灌水后高温闷棚，也可采用给土壤同高温蒸汽杀虫灭菌，可以大大减少土传病虫害的数量。低温冷冻法，北方冬季严寒，不能利用的保护地，可以撤掉膜后深翻土壤，冻死病菌及虫卵。土壤消毒法一般在杀灭病虫害的同时也对一些有益生物造成毁灭性伤害，特别是化学消毒法，价格昂贵，持效期短，还有可能破坏土壤结构及环境污染，防治效果不理想，不利于大面积推广。（3）抗性品种的应用。病虫害加重是导致作物连作障碍的重要因素，选育具有抗性的新品种以及对难以育成抗病品种的作物采用抗性砧木进行嫁接栽培，可以有效防止多种土传病害和线虫的危害。但是由于抗病品种资源的限制以及选育周期等问题，抗病品种的选育工作远远滞后于病害发生的速度；嫁接的方法有效解决土传病害的同时，也带来作物产品品质和口感下降等问题。（4）合理施肥。目前生产上应用的专用肥对于减轻作物连作障碍效果明显，此外，增施有机肥也是减轻连作障碍的有效措施。连作障碍的产生涉及到作物、土壤、环境等生物的、非生物的诸多复杂因素，加上这些因素的相互影响，使得解决这一问题更加复杂，任何单一的措施或通过少数几个措施都很难收到理想的效果。因此，解决设施栽培蔬菜生产连作障碍的关键是改善土壤理化性状，增加土壤有益微生物种群的数量，提高土壤肥力。

发明内容

本发明的目的是提供不含有对环境有害物质，具有肥效好，抗逆性强，具有土壤改良性质和改善土壤微生态结构等综合效果的一种防治西瓜枯萎病的生物质炭搭载微生物的菌剂，可有效防治西瓜枯萎病害，本发明是这样实现的：

一种防治西瓜枯萎病害的生物质炭基微生物菌剂，包括固相组分和液相组分；

固相组分：以质量百分比计，生物质炭40-50%，凹凸棒土20-25%，以过磷酸钙或硝基腐殖酸补足余量；

液相组分：包括生防细菌发酵液（菌含量为1~9×10¹² cfu/mL）和无菌水；

其中，生防细菌发酵液与固相组分的体积质量比（L/Kg）为0.01-0.03:1;无菌水的质量为固相组分质量的30-50%，菌剂中生防菌的活菌数≥50亿cfu/g。

进一步，本发明中所述生防细菌为西瓜枯萎病的生防细菌，具体可以为特基拉芽孢杆菌、死谷芽孢杆菌、栖稻假单胞菌或枯草芽孢杆菌中的一种或多种。

进一步，本发明中，所述生物质炭是这样获得的：以稻壳、作物秸秆等农业废弃物为原料，用高温开启式管式炉在400-700℃厌氧条件下保温处理1-2 小时，自然冷却至室温，研磨并过40目筛，121℃灭菌1h，即获得生物质炭。

进一步，本发明中，所述凹凸棒土为农用凹凸棒土缓释造粒剂，优选以质量百分比计，二氧化硅含量50.4%、氧化铝氧化是9.8%，氧化铁4%，氧化锰0.04%，氧化钾1.0%，氧化钙1.8%，氧化镁0.04%，灼碱13.8%，余量为土质成分；过磷酸钙为市售过磷酸钙颗粒肥，优选其中80%～95%溶于水，有效磷含量≥12%。

本发明所述防治西瓜枯萎病的生物质炭基微生物菌剂的制备方法，其具体步骤如下：

步骤一，将生防细菌发酵制成菌含量为10¹² cfu/mL的发酵液，备用；

步骤二，将生物质炭与生防细菌发酵液混匀，使生防细菌充分被生物质炭吸附，混匀。

步骤三，将固相组分（生物质炭、凹凸棒土、过磷酸钙或/和硝基腐殖酸）按比例在无菌条件下混合均匀，再加入无菌水充分搅拌，然后转移到圆盘造粒机中制备颗粒剂，颗粒直径为3~6 mm，pH值6.5~7.5，取出颗粒于自然条件下通风干燥至颗粒湿度≤20%（约3-4天），菌剂中生防菌的活菌数≥50亿cfu/g，即获得所述生物质炭基微生物菌剂。

进一步，本发明所述防治西瓜枯萎病的生物质炭基微生物菌剂的制备方法中，步骤一中生防细菌发酵液指：将生防细菌接种于LB液体培养基中，37±1℃，200rpm摇床培养至菌含量为10¹² cfu/mL（约48 小时）；

如本发明所述生物质炭基微生物菌剂在防治西瓜枯萎病中的应用。

进一步，发明所述生物质炭基微生物菌剂在防治西瓜枯萎病中的应用是指：该菌剂在西瓜苗2片真叶移栽时穴施，每株用量100g。

本发明中，所述的LB液体培养基为：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，加水至1L，pH 7.0-7.5。

本发明利用生物炭的改良土壤性能及有效吸附土壤微生物的特点，利用其丰富的炭源，适宜的孔隙结构以及保水等优点，以生物质炭搭载植物内生生防细菌，制成优良的设施栽培土壤改良剂，既能达到改良土壤性能，又能在作物根际引入有益微生物目的。

与现有技术相比，本发明以稻壳、农作物秸秆等废弃物为原料，材料易得，制备方法简单，使用方便；能够有效提高生防菌的存活时间；增加土壤有益菌的数量，增强土壤酶活力，提高土壤肥力，对如西瓜枯萎病等多种土传病害具有较强的预防与治疗作用。

附图说明

图1为本发明防治西瓜枯萎病的生物质炭基微生物菌剂颗粒图片；

图2为本发明防治西瓜枯萎病的生物质炭基微生物菌剂货架期检测结果示意图；

图3为本发明防治西瓜枯萎病的生物质炭基微生物菌剂施用后生防菌在土壤中的存活数量示意图；

图4为本发明防治西瓜枯萎病的生物质炭基微生物菌剂对土壤酶活性的影响结果示意图；

图5为发明防治西瓜枯萎病的生物质炭基微生物菌剂对西瓜苗期生长的影响及对枯萎病的防治效果示意图。

具体实施方式

为帮助更好地理解本发明思想的实质，以下通过具体实施例详细说明本发明的实施方案，并非是不作为对本发明实施范围的限定。

下述实施例中死谷芽孢杆菌、特基拉芽孢杆菌、枯草杆菌分离至健康的番茄植株，由江苏省农业科学院产地环境研究室纯化、鉴定、保存。西瓜枯萎病菌分离至发病西瓜植株，由江苏农科学院质量安全所产地环境研究室分离纯化保存。

实施例中涉及的原料及培养基：

LB液体培养基（1L）：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，加水至1L，pH 7.0-7.5；

LB固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂粉20g，，加水至1L，pH 7.0-7.5，121℃灭菌20min，冷却备用；

LB平板：将LB固体培养基在微波炉中融化，冷却至50℃左右，在无菌操作台中倒入灭菌培养皿中，冷却得LB平板；

凹凸棒土：购自常州鼎邦矿产品科技有限公司的农用凹凸棒土缓释造粒剂；其中二氧化硅含量50.4%、氧化铝氧化是9.8%，氧化铁4%，氧化锰0.04%，氧化钾1.0%，氧化钙1.8%，氧化镁0.04%，灼碱13.8%，余量为土质成分；

过磷酸钙为市售过磷酸钙颗粒肥：购自中化化肥有限公司，其中80%～95%溶于水，有效磷含量≥12%。

实验器材：

高温开启式管式炉购自中国科学院上海光学精密机械研究所，型号SG-GL1100K；

实施例1 制备防治西瓜枯萎病的生物质炭基微生物菌剂

步骤一，取纯化后的生防细菌（特基拉芽孢杆菌和死谷芽孢杆菌），接入到LB液体培养基中，37±1℃摇床（150 rpm）培养48小时，获得菌含量为10¹² cfu/mL的生防细菌发酵液，备用。

步骤二，以稻壳为原料，采用高温开启式管式炉500℃（具体实施过程中，管式炉温度可以控制在400-700℃范围内）厌氧条件下制得生物质炭，粉碎过40目筛，在121℃灭菌锅内灭菌1h（具体实施过程中，可根据实际情况灭菌1-2h）后取出，获得稻壳生物质炭，备用。

步骤三，取总量为20Kg的稻壳生物质炭、凹凸棒土和过磷酸钙（稻壳生物质炭、凹凸棒土和过磷酸钙按照4:2:1的质量比配比），取步骤一中生防菌发酵液0.2L，与物质炭混合均匀，使生物质炭充分吸附生防菌；然后加入余下组分，混合均匀，加入占固相组分总量50%的无菌水搅拌混匀后，转移到有机肥圆盘造粒机中，220v、45 r/min、2 小时制备颗粒剂，微生物菌肥颗粒大小为3~6 mm，然后在室内25℃下通风干燥3-4天，湿度≤20%。即可得到生物质炭基微生物菌剂（如图1所示），菌剂中生防菌活菌数约为56亿cfu/g。

在具体实施过程中，可以选择特基拉芽孢杆菌、死谷芽孢杆菌、栖稻假单胞菌或枯草芽孢杆菌中的一种或多种制备生防菌发酵液，只要确保菌剂中生防菌含量为10¹² cfu/mL，均可实现发明之目的；无菌水加入量可以在固相组分质量30-50%的范围内选择。

本实施例中所使用的是以稻壳制备的生物质炭，具体操作中，也可以使用其他植物秸秆制备的生物质炭。

实施例2 菌剂的货架期试验

(1) 将实施例1步骤一获得的生防细菌发酵液用生理盐水进行稀释使其与步骤三获得的生物质炭基微生物菌剂的初始均量相同，含菌量均为约56亿cfu/g，室温密封保存。

(2)生防细菌发酵液及生物质炭基微生物菌剂中生防菌数量测定：取50 mL生防细菌发酵液（或50g 生物质炭基微生物菌剂），加入无菌水定容至1000 mL，放入摇床30℃ 200r/min震荡30min；取10 mL溶液到100 mL容量瓶中，定容到100 mL，再10倍稀释5次后，取100uL在LB平板上涂板，30℃ 倒置培养12 h，统计菌落数，设置3次重复；每毫升发酵液（每克菌剂）中的活菌数=(a*n*v₁)/(v₂*m)，公式中a:平板菌落计数平均值，n:稀释倍数，v₁：品初始稀释体积，v₂：涂平板的稀释菌液体积，m：取样体积。

(3)货架期检测取样时间持续12个月。

(4)实验结果如图2所示，由图2可见，发酵液在第7个月检测时，活菌数为1.0×10⁷cfu/mL，而生物质炭基微生物菌剂在第12个月检测时，活菌数为1.4×10⁸ cfu/g，利用秸秆生物质炭搭载微生物制成生物质炭基微生物菌剂后，显著延长了货架期。

实施例3生物质炭基微生物菌剂施用后对土壤酶活性的影响

(1)为了排除土壤中杂菌的干扰，首先将生物质炭基微生物菌剂中的芽孢杆菌进行抗生素标记：将芽孢杆菌接种于含1μg/mL利福平的LB平板上，逐步增加利福平的浓度至300μg/mL，筛选出能稳定生长且生理特性与原始菌株一致的抗生素抗性菌株， 按照实施例1的步骤制备生物质炭基微生物菌剂；

(2)设置2个处理：

A.取大田土10 kg，按照质量百分比2%的比例加入步骤（1）获得的生物质炭基微生物菌剂，混匀后放置到室温密封保存；

B.抗性菌株按照实施例1中步骤一方法制备生防细菌发酵液，按照处理A中菌的总量接入10 kg大田土壤中，混匀室温密封保存；

(3)生防菌在土壤中的存活数量测定：测定方法同实施例2中步骤（2）；

(4)土壤酶活性测定：上述处理30天后，各处理取10 g 土样，测定土壤中纤维素酶、中性蛋白酶、蔗糖酶、脲酶、过氧化氢酶、脱氢酶活性酶活性，实验步骤参见苏州科铭生物技术有限公司土壤酶测定试剂盒说明书（http://www.cominbio.com/a/chanpinzhanshi/ziyoupinpaishijihe/turangxilie/）。

(5)生防菌在土壤中的存活数量结果如图3所示，表明接种生防菌发酵液处理7天时检测活菌数为6.72×10⁹ cfu/g，但是随着时间的延长，活菌数迅速下降，到120天时活菌数仅为2.5×10⁸ cfu/g；而生物质炭基微生物菌剂处理的有效活菌数则是一个由缓慢释放到数量迅速增长在缓慢下降的过程，在处理7天时检测活菌数只有7.03×10⁹ cfu/g，但是处理21天时活菌数达到峰值9.83×10⁹ cfu/g，之后活菌数缓慢下降到处理120天时，有效活菌数仍有2.98×10⁹ cfu/g，说明利用生物质炭搭载芽孢杆菌制成的菌剂能够显著延长生防菌在土壤中的存活时间。

(6)土壤酶活性结果如图4所示，图4中，NS为大田土；B为菌液(处理B)；BC为菌剂（处理A）；

由图4可见，使用本发明生物质炭基微生物菌剂处理后显著增强了土壤中纤维素酶、蔗糖酶、脲酶、过氧化氢酶、脱氢酶活性酶的活性，但是中性蛋白酶活性降低，这可能不利于土壤中大分子蛋白降解为氨基酸等产物。

实施例4 西瓜苗期生长及枯萎病防治效果盆栽试验

盆栽试验在江苏省农业科学院日光温室内进行。设4个处理：

A. 灭菌土+接种西瓜枯萎病菌；

B. 灭菌土+接种西瓜枯萎病菌+生物质炭基微生物菌剂辅料（无菌，具体为实施例1中制备生物质炭基微生物菌剂的辅料，即不含生防菌成分，其他成分含量同实施例1获得的生物质炭基微生物菌剂，添加量为灭菌土质量的0.5%）；

C. 灭菌土+西瓜枯萎病菌+0.5%的生物质炭基微生物菌剂（实施例1中制备的生物质炭基微生物菌剂，添加量为灭菌土质量的0.5%）；

D. 灭菌土+西瓜枯萎病菌+2%生物质炭基微生物菌剂（为实施例1中制备的生物质炭基微生物菌剂，添加量为灭菌土质量的2%）。

供试西瓜品种为苏创1号。

试验具体步骤如下：

(1)将西瓜种子表面消毒后，无菌水浸泡过夜，30 ℃恒温2d催芽。露白后播种于穴盘，待小苗长至2片真叶时，移栽至内径10 cm，高15 cm，内装灭菌土壤的塑料杯中。

(2)四个处理组均添加土壤为300 g灭菌土，C与D处理组灭菌土中分别加入（占灭菌土质量百分比）0.5%和2%的实施例1步骤三获得的生物质炭基微生物菌剂。

(3)西瓜幼苗（2片真叶期）移栽的同时，在处理组A、B、C与D处理组中根灌20 ml 1×10⁷ cfu/mL西瓜枯萎病菌孢子悬浮液，接种西瓜枯萎病菌。

(4)接种病害真菌后，调查植物发病情况，待只接病原真菌组（A处理）60%的小苗出现发病症状后，结束试验，统计西瓜苗生长情况、病情指数及发病率。

(5)西瓜苗期枯萎病的防治效果实验结果如表1和图5所示：

表1生物质炭基微生物菌剂对西瓜苗期枯萎病的防治效果

由表1可见和图5（图5中A-D分别对应上述处理A-D）可见，接入实施例获得菌剂组（C、D处理））接种西瓜植株后能够有效防止西瓜枯萎病的发生，与A处理相比发病率显著下降70-85%左右，最高防效达74.6%。

(6)西瓜苗期生长影响结果如表2所示：

表2生物质炭基微生物菌剂对西瓜苗期生长的影响

注：A:接病菌；B: 接病菌+菌剂辅料；C：接病菌+0.5%菌剂；D：接病菌+2%菌剂。表中小写字母代表0.05水平差异显著性

试验结果表明，该菌剂能够显著抑制西瓜枯萎病菌对西瓜苗期生长的伤害，并能够促进西瓜苗期的生长，在土壤中加入2%该固体菌肥后，显著促进西瓜苗期株高、根长增长约75-90左右，促进鲜重及干重等生物量的增长55%左右。

Claims (8)

1.一种防治西瓜枯萎病的生物质炭基微生物菌剂，包括如下固相组分和液相组分；

固相组分：以质量百分比计，生物质炭40-50%，凹凸棒土20-25%，以过磷酸钙或硝基腐殖酸补足余量；

液相组分：包括生防细菌发酵液和无菌水；

其中，生防细菌发酵液与固相组分的体积质量比为0.01-0.03:1；无菌水的质量为固相组分质量的30-50%，菌剂中生防细菌的活菌数≥50亿cfu/g。

2.根据权利要求1所述一种防治西瓜枯萎病的生物质炭基微生物菌剂，其特征在于，所述生防细菌为特基拉芽孢杆菌、死谷芽孢杆菌、栖稻假单胞菌或枯草芽孢杆菌中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述一种防治西瓜枯萎病的生物质炭基微生物菌剂，其特征在于，所述生物质炭是这样获得的：以农业废弃物为原料，400-700℃厌氧条件下制得，冷却后研磨并过40目筛，121℃灭菌1-2h，即得所述生物质炭。

4.根据权利要求3所述一种防治西瓜枯萎病的生物质炭基微生物菌剂，其特征在于，所述农业废弃物为稻壳或秸秆中的一种或两种。

5.如权利要求1-4任一所述防治西瓜枯萎病的生物质炭基微生物菌剂的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

步骤一，将生防细菌发酵制成菌含量为10¹² cfu/mL生防细菌发酵液，备用；

步骤二，将生防细菌发酵液与生物质炭混匀，然后加入余下组分，混合均匀，制粒，颗粒直径为3~6 mm，pH值6.5~7.5，然后干燥至颗粒湿度≤20%，即获得所述防治西瓜枯萎病的生物质炭基微生物菌剂。

6.根据权利要求5所述防治西瓜枯萎病的生物质炭基微生物菌剂的制备方法，其特征在于，步骤一所述生防细菌发酵液是指：将生防细菌接种于液体LB培养基中，在37±1℃、200rpm摇床中培养至菌含量为10¹²cfu/mL。

7.如权利要求1-4任一所述防治西瓜枯萎病的生物质炭基微生物菌剂在防治西瓜枯萎病中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，将所述防治西瓜枯萎病的生物质炭基微生物菌剂在西瓜幼苗移栽时穴施入，每株用量100g，以防治西瓜枯萎病。