BR0112612B1 - misturas de polissacarìdeos sulfatados, processo de preparação das mesmas e composições farmacêuticas. - Google Patents
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Description
"MISTURAS DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS, PROCESSO DEPREPARAÇÃO DAS MESMAS E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS"
A presente invenção refere-se a misturas depolissacarídeos derivados de heparina, a seu processo de preparação e àscomposições farmacêuticas que contendo as mesmas.
A heparina é uma mistura de mucopolissacarídeossulfatados de origem animal, utilizada principalmente devido a suaspropriedades anticoagulantes e antitrombóticas.
No entanto, a heparina apresenta inconvenientes quelimitam as condições de sua utilização. Em particular, sua atividadeanticoagulante (atividade anti-IIa) importante pode ocasionar hemorragias.
Heparinas com baixo peso molecular obtidas por meio dedespolimerização básica de ésteres de heparina foram propostas(EP40144); no entanto, estes produtos também apresentam uma atividadeanti-IIa importante.
A invenção é relativa a misturas de polissacarídeosderivadas de heparina apresentando uma atividade mais seletivarelativamente ao fator X ativado (fator Xa) e ao fator II ativado (fator lia)do que a heparina.
A presente invenção também tem por objeto misturas depolissacarídeos sulfatados apresentando a estrutura geral dospolissacarídeos constitutivos da heparina e apresentando as característicasa seguir:
- eles apresentam um peso molecular médio de 1500 a 3000daltons, uma atividade anti-Xa de 100 a 150 Ul/mg, uma atividade anti-IIade 0 a 10 Ul/mg e uma relação atividade anti-Xa/atividade anti-IIasuperior a 10,
- os polissacarídeos constitutivos das misturas contêm de 2a 26 unidades repetitivas sacarídicas e apresentam uma unidade repetitivaácido glucurônico-4,5 insaturado 2-0-sulfato em uma de suasextremidades,
em forma de um sal de metal alcalino ou alcalino-terroso.
Como sal de metal alcalino ou alcalino-terroso, prefere-seos sais de sódio, potássio, cálcio e magnésio.
O peso molecular médio é determinado por meio decromatografia líquida de alta pressão utilizando-se duas colunas em série,por exemplo aquelas comercializadas sob o nome TSK G3000 XL e TSKG2000 XL. A detecção é realizada por meio de refratometria. O eluente éutilizado o nitrato de lítio e o consumo é de 0,6 ml/min. O sistema écalibrado com padrões preparados por meio de fracionamento daenoxaparina (AVENTIS) por meio de cromatografia sobre gel de agarose-poliacrilamida (IBF). Esta preparação é realizada de acordo com a técnicadescrita por Barrowcliffe et coll., Thromb. Res., 12, 27-36 (1977-78) ouD.A. Lane et coll., Thromb. Res., 12, 257-271 (1977-78). Os resultadossão calculados com auxílio do programa de computador GPC6 (Perkin Elmer).
A atividade anti-Xa é medida segundo o método amidolíticosobre um substrato cromogênico descrito por Teien et coll., Thromb. Res.,10, 399-410 (1977), utilizando como padrão o primeiro padrãointernacional das heparinas com baixo peso molecular.
A atividade anti-IIa é medida por meio da técnica descritapor Anderson L.O. et coll., Thromb. Res., 15, 531-541 (1979), utilizandocomo padrão o primeiro padrão internacional das heparinas com baixopeso molecular.
De preferência, as misturas como descritas acima apresentamuma atividade anti Xa compreendida entre 125 e 150 Ul/mg.
Mui particularmente, as misturas como descritas acimaapresentam uma atividade anti-Xa compreendida entre 140 e 150 Ul/mg eapresentam um peso molecular médio compreendido entre 2000 e 3000dalton.
De preferência, as misturas de acordo com a invençãoapresentam uma atividade anti-IIa de 0 a 5 Ul/mg.
Ainda mais preferivelmente, as misturas apresentam umarelação atividade anti-Xa/atividade anti-IIa superior a 25.
As misturas de oligossacarídeos de acordo com a invençãopodem ser preparadas por meio de despolimerização de um sal de amônioquaternário do éster benzílico da heparina em meio orgânico, com umabase orgânica forte com pka superior a 20 ou de imidazolato de sódio,transformação do sal de amônio quaternário do éster benzílico da heparinadespolimerizada em sal de sódio, saponificação do éster e, eventualmente,purificação.
O sal de amônio quaternário do éster benzílico da heparinaé, de preferência, o sal de benzetônio, de cetilpiridínio ou decetiltrimetilamônio.
A despolimerização é geralmente efetuada em um solventeorgânico inerte, como um solvente clorado (diclorometano, par exemple),o tetraidrofurano, o anisol, a uma temperatura de -20°C a 40°C.
Como base orgânica forte com pka superior a 20, pode-seutilizar o l,5,7triazabiciclo[4.4.0]dec-5-eno, a 2-ter-butilimino-2-dietilamino-l,3-dimetilperidro-l,3,2-diazafosforina, as bases da família daguanidina e dos fosfazenos.
As bases da família das guanidinas são, de preferência,aquelas de fórmula:
<formula>formula see original document page 4</formula>em que R1 é hidrogênio ou alquila, R2, R3, R4 e R5 idênticosou diferentes representam, cada um, um radical alquila.
Mais particularmente, Ri é hidrogênio e R2, R3, R4 e R5 sãoradicais metila.
As bases orgânicas fortes aparentadas com a família dosfosfazenos são definidas, por exemplo, de acordo com R. Schwesinger etcolL, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 26, 1167-1169 (1987), R. Schwesingeret coll., Angew. Chem. 105, 1420 (1993).
Dentre as bases da família dos fosfazenos utiliza-se, depreferência, aquelas de fórmula:
<formula>formula see original document page 5</formula>
em que os radicais de Rj a R7 são idênticos ou diferentes erepresentam radicais alquila.
Nas fórmulas precedentes, os radicais alquila contêm de 1 a6 átomos de carbono em cadeia reta ou ramificada.
Vantajosamente, a relação em mol entre base orgânica fortecom pka superior a 20 ou imidazolato de sódio/sal de amônio quaternário doéster benzílico da heparina está compreendida entre 0,2 e 5 e, de preferência,entre 1 e 4.
Mais particularmente, a taxa de esterificação do sal de amônioquaternário do éster benzílico da heparina está compreendida entre 50 e100% e, de preferência, entre 70 e 90%. Esta taxa de esterificaçãocorresponde ao percentual molar de esterificação dos ácidos urônicos daheparina.
A transformação do sal de amônio quaternário do ésterbenzílico da heparina despolimerizada em sal de sódio é efetuada,geralmente, por meio de tratamento do meio reacionai com uma soluçãoalcoólica de acetato de sódio e, de preferência, com uma solução a 10 %de acetato de sódio em metanol (peso/volume), a uma temperaturacompreendida entre 15 e 25°C. O equivalente em peso de acetatoadicionado é, de preferência, 3 vezes superior à massa de sai de amônioquaternário do éster benzílico da heparina empregada na reação dedespolimerização.
A saponificação é geralmente efetuada por meio de umhidróxido de metal alcalino de tal forma que a soda, a potassa, o hidróxidode lítio, em meio aquoso, a uma temperatura compreendida entre 0 e 20°Ce, de preferência, entre 0 e 10°C. Utilizar-se-á de maneira geral de 1 a 5equivalentes molares de hidróxido de metal alcalino. De preferência, asaponificação será realizada na presença de 2 a 3 equivalentes molares dehidróxido de metal alcalino.
O produto final pode eventualmente ser purificado por meiode qualquer método conhecido de purificação das heparinasdespolimerizadas e, principalmente, de acordo com o método descrito napatente EP 0037319. De preferência, purifica-se com peróxido dehidrogênio, em meio aquoso, a uma temperatura de 10 a 50°C. Depreferência, esta operação será realizada entre 20 e 40°C.
O sal de amônio quaternário do éster benzílico da heparinapode ser preparado de acordo com o esquema reacionai a seguir:
a) transformação da heparina em forma de sal de sódio comcloreto de benzetônio para se obter o heparinato de benzetônio,
b) esterificação do sal de benzetônio obtido previamentecom cloreto de benzila e tratamento com uma solução alcoólica de acetatode sódio para se obter o sal de sódio do éster benzílico da heparina,
c) trans-salificação do sal de sódio do éster benzílico daheparina a sal de amônio quaternário e, de preferência a sal de benzetônio,de cetilpiridínio ou de cetiltrimetilamônio
A reação da etapa a) é realizada em meio aquoso, por ação docloreto de benzetônio em excesso, sobre a heparina em forma de sal de sódio,a uma temperatura próxima de 15 a 25°C. De maneira vantajosa, a relaçãomolar entre cloreto de benzetônio/neparina em forma de sai de sódio estácompreendida entre 2 e 3 e, mais particularmente, em 2,5.
A heparina em forma de sal de sódio de saída utilizada é, depreferência, uma heparina de porco. Esta pode ser previamente purificadapara diminuir sua taxa de sulfato de dermatano de acordo com o processodescrito na patente FR2663639.
A esterificação da etapa b) é efetuada, de preferência, emum solvente orgânico clorado (clorofórmio, cloreto de metileno, parexemple), a uma temperatura compreendida entre 25 e 45°C e, depreferência entre 30 e 40°C. Em seguida, o éster em forma de sal de sódioé recuperado por meio de precipitação com acetato de sódio a 10% empeso/volume em um álcool, como o metanol. Emprega-se geralmente de 1a 1,2 volume de álcool por volume de meio reacional. A quantidade decloreto de benzila e o tempo de reação são adaptados para se obter umataxa de esterificação compreendida entre 50 e 100 % e, de preferência,entre 70 e 90 %. De maneira preferível, utiliza-se de 0,5 a 1,5 parte empeso de cloreto de benzila para 1 parte em peso de sal de benzetônio daheparina. Da mesma forma, de maneira preferível, o tempo de reação serácompreendido entre 10 e 35 horas.
A trans-salificação da etapa c) é efetuada com um cloreto deamônio quaternário e, de preferência, com cloreto de benzetônio, cloretode cetilpiridínio ou cloreto de cetiltrimetilamônio, em meio aquoso, a umatemperatura compreendida entre 10 e 25°C. De maneira vantajosa, arelação em mol entre cloreto de amônio quaternário/sal de sódio do ésterbenzílico da heparina está compreendida entre 2 e 3.
As misturas de acordo com a invenção em forma de sal desódio, podem ser transformadas em um outro sal de um metal alcalino oualcalino-terroso. Passa-se eventualmente de um sal a outro utilizando o método descrito na patente US4168377.
As misturas de acordo com a invenção não são tóxicas epodem, assim, ser utilizadas como medicamentos.
As misturas da presente invenção podem ser utilizadascomo agentes antitrombóticos. Em particular, eles são úteis para a prevenção das tromboses venosas, dos acidentes trombóticos arteriais,principalmente no caso de infarto do miocárdio. Elas também são úteis naprevenção e no tratamento da proliferação das células musculares lisas, daangiogênese, e como neuroprotetores da aterosclerose e da arteriosclerose.
A presente invenção refere-se também a composições farmacêuticas contendo, como princípio ativo, uma mistura depolissacarídeos de acordo com a invenção eventualmente em associaçãocom um ou vários excipientes inertes.
As composições farmacêuticas são, por exemplo, soluçõesinjetáveis por via subcutânea ou intravenosa. Elas também são úteis por via pulmonar (inalação).
A posologia pode variar em função da idade, do peso e doestado de saúde do paciente. Para um adulto, ela está geralmentecompreendida entre 20 e 100 mg por dia por via intramuscular ousubcutânea.
Os exemplos a seguir ilustram a invenção.
Exemplo A: Preparação do sal de benzetônio do éster benzílico daheparina
Heparinato de benzetônio
A uma solução de 10 g de heparina em forma de sal desódio em 100 ml de água a uma temperatura próxima de 20°C, adiciona-seuma solução de 25 g de cloreto de benzetônio em 125 m] de água. Oproduto é filtrado, lavado com água e secado.
Ester benzílico de heparina (sal de sódio)
A uma solução de 20 g de heparinato de benzetônio em 80 mlde cloreto de metileno, adiciona-se 16 ml de cloreto de benziia. A solução éaquecida a uma temperatura de 30°C durante 12 horas. Adiciona-se então 108ml de uma solução a 10 % de acetato de sódio no metanol, filtra-se, lava-secom metanol e seca-se. Obtém-se assim 7,6 g de éster benzílico de heparinaem forma de sal de sódio cuja taxa de esterificação é de 77 %.
Éster benzílico de heparina (sal de benzetônio)
Em um erlenmeyer A de 2 litros, introduz-se 36 g (0,0549mol) de éster benzílico de heparina (sal de sódio) e 540 ml de águadestilada. Após homogeneização a uma temperatura de aproximadamente20°C, obtém-se uma solução amarela clara. Sob agitação magnética,prepara-se em um erlenmeyer B de 1 litro, uma solução de 64,45 g (0,1438mol) de cloreto de benzetônio e de 450 ml de água. A solução doerlenmeyer B é despejada em aproximadamente 35 minutos numa soluçãodo erlenmeyer A sob agitação. Observa-se a formação de um precipitadobranco abundante. O erlenmeyer B é enxaguado com 200 ml de águadestilada e introduz-se água de lavagem no erlenmeyer A. Entãointerrompe-se a agitação e deixa-se depositar a suspensão durante 12horas. A parte límpida do sobrenadante é removida e descartada. Sobre oprecipitado sedimentado (aspecto de caldo cremoso), adiciona-se 560 mlde água e agita-se durante 20 minutos. Deixa-se re-sedimentar oprecipitado durante aproximadamente 30 minutos. O sobrenadante éremovido e descartado (560 ml). Sobre o precipitado sedimentado, renova-se esta operação de lavagem por duas vezes com aproximadamente 560 mlde água destilada. Na última operação de lavagem, deixa-se o precipitadoem suspensão e filtra-se sobre vidro frito 3. Em seguida a torta é lavadacom 4 vezes 200 ml de água destilada. O ?olido branco úmido écentrifugado depois secado sob pressão reduzida (2,7 kPa), a umatemperatura próxima de 60°C. Após 12 horas de secagem, obtém-se 87,5 gde éster benzílico de heparina, sal de benzetônio. O rendimento obtido éde 94,9 %.
Exemplo 1
Despolimerizacão e transformação em sal de sódio
Em um erlenmeyer A de 50 ml, introduz-se 28 ml dediclorometano. Sob agitação, carrega-se lentamente 4 g (0,00238 mol) deéster benzílico de heparina (taxa de esterifícação: 77 %, sal de benzetônio)obtido como descrito no exemplo A. Após dissolução completa, adiciona-se 1,32 g (0,00948 mol) de l,5,7-triazabiciclo[4.4.0]dec-5-eno. Agita-se auma temperatura próxima de 20°C, durante 3 horas e 30 minutos. Duranteeste tempo, prepara-se a 4°C em um erlenmeyer B, uma solução de 12 g deacetato de sódio em 120 ml de metanol. Sob agitação magnética, a misturareacional do erlenmeyer A é despejada numa solução metanólica deacetato de sódio. Ocorre um precipitado amarelo gelatinoso quasetranslúcido. A agitação é então interrompida e deixa-se decantar asuspensão durante uma hora. A parte límpida do sobrenadante é removidae descartada (62 ml). Sobre o precipitado sedimentado (aspecto de caldocremoso amarelo), adiciona-se 50 ml de metanol e agita-se durante 20minutos. Deixa-se re-sedimentar o precipitado durante aproximadamente30 minutos. O sobrenadante é removido e descartado (49 ml). Sobre oprecipitado sedimentado, adiciona-se 50 ml de metanol e agita-se durante20 minutos. Em seguida, o precipitado em suspensão é filtrado sobre vidrofrito 4. A torta amarela de ouro obtida é lavada em seguida com 2 vezesml de metanol. Em seguida, o sólido úmido é centrifugado sob pressãoreduzida (2,7 kPa), a uma temperatura próxima de 60°C. Após 12 horas desecagem, obtém-se 1,21 g de heparina despolimerizada (éster de benzila,sal de sódio). O rendimento obtido é de 77,2 %.
Saponificacão
Em um erlenmeyer de 25 ml, introduz-se 1,21 g (0,0018mol) da heparina despolimerizada (éster de benzila, sal de sódio) obtidapreviamente e 11 mi de água. Sob agitação magnética, introduz-se 0,18 ml(0,0018 mol) de lixívia de soda a 30 %. Após adição, a mistura é resinadaa 4°C e agitada durante 2 horas. Adiciona-se 1,43 g de NaCl e neutraliza-se a solução com a adição de HCI a 1 mol/1 (14 ml). A mistura étransvasada para um erlenmeyer de 100 ml e adiciona-se 52 ml demetanol. Observa-se a formação de um precipitado amarelo. Pára-se entãoa agitação e deixa-se a suspensão sedimentar durante 12 horas a umatemperatura próxima de 20°C. O sobrenadante é removido em seguida, edescartado (44 ml). Sobre o precipitado sedimentado (aspecto de caldocremoso amarelo), adiciona-se 25 ml de metanol e agita-se durante 20minutos. Deixa-se re-sedimentar o precipitado durante aproximadamente30 minutos. O sobrenadante é removido e descartado (21 ml). Sobre oprecipitado sedimentado, adiciona-se 25 ml de metanol e agita-se durante20 minutos. Em seguida, o precipitado em suspensão é filtrado sobre vidrofrito 3. A torta amarela clara obtida é lavada em seguida com 2 vezes 10ml de metanol. O sólido úmido é centrifugado, depois secado sob pressãoreduzida (2,7 kPa), a uma temperatura próxima de 60°C. Após 12 horas desecagem, obtém-se 0,66 g de heparina despolimerizada bruta (sal desódio). O rendimento obtido é de 60 %.
Purificação
Em um erlenmeyer de 10 ml, introduz-se 0,66 g de heparinadespolimerizada bruta obtida previamente e 5,9 ml de água destilada. Amistura é levada a 40°C sob agitação magnética. Com a adição de soda a0,1 mol/1, eleva-se o pH a entre 9 e 10 e adiciona-se 33 microlitros de umasolução aquosa de peróxido de hidrogênio a 30 %. Após aproximadamente2 horas de agitação, adiciona-se 0,65 g de cloreto de sódio A mistura éneutralizada em seguida com a adição de HCl a 0,1 mol/1. Em seguida, asolução é filtrada e transvasada para um erlenmeyer de 25 ml. Despeja-se23,3 ml de metanol. Observa-se a formação de um precipitado branco. Emseguida, a agitação é interrompida e deixa-se sedimentar a suspensãodurante 12 horas a uma temperatura próxima de 20°C. Em seguida, osobrenadante é removido, depois descartado (5 ml). Sobre o precipitadosedimentado (aspecto de caldo cremoso), adiciona-se 5 ml de metanol eagita-se durante 20 minutos. Deixa-se o precipitado re-sedimentar duranteaproximadamente 30 minutos. O sobrenadante é removido e descartado (5ml). Sobre o precipitado sedimentado, adiciona-se 5 ml de metanol eagita-se durante 20 minutos. Em seguida, o precipitado em suspensão éfiltrado sobre vidro frito 3. Em seguida, a torta branca obtida é lavada com2 vezes 5 ml de metanol. O sólido úmido é centrifugado, depois secado,sob pressão reduzida (2,7 kPa), a uma temperatura próxima de 60°C. Após12 horas de secagem, obtém-se 0,51 g de uma mistura purificada depolissacarídeos (sal de sódio). O rendimento obtido é de 77,2 %.
As características desta mistura são as seguintes:
Peso molecular médio: 1600 daltons
Atividade anti-Xa: 94 UI/mg
Atividade anti-IIa: <0,1 UI/mg
Relação atividade anti-Xa/atividade anti-IIa: > 100
Exemplo 2
Despolimerizacão e transformação em sal de sódio
Em um erlenmeyer A de 100 ml, introduz-se 70 ml dediclorometano. Sob agitação, carrega-se lentamente 10 g (0,00595 mol) deéster benzílico de heparina (taxa de esterificação: 77 %, sal de benzetônio)obtido como descrito no exemplo A. Após dissolução completa, adiciona-se 1,7 ml (0,00587 mol) de 2-ter-butilimino-2-dietilamino-l,3-dimetil-peridro-l,3,2-diazafosforina. A uma temperatura próxima de 20°C deixa-se a reação prosseguir durante aproximadamente 3 horas e 30 minutos.Durante este tempo, prepara-se a 4°C, em um erlenmeyer B, uma soluçãode 30 g de acetato de sódio em 300 ml de metanol. Sob agitaçãomagnética, a mistura reacionai do erlenmeyer A é despejada numa soluçãometanólica de acetato de sódio. Ocorre um precipitado amarelo gelatinosoquase-translúcido. Em seguida, a agitação é interrompida e deixa-se asuspensão decantar durante uma hora. A parte límpida do sobrenadante éremovida e descartada (204 ml). Sobre o precipitado sedimentado (aspectode caldo cremoso amarelo), adiciona-se 125 ml de metanol e agita-sedurante 20 minutos. Deixa-se re-sedimentar o precipitadoaproximadamente 30 minutos. O sobrenadante é removido e descartado(162 ml). Sobre o precipitado sedimentado, adiciona-se 125 ml de metanole agita-se durante 20 minutos. Em seguida, o precipitado gelatinoso emsuspensão é filtrado sobre vidro frito 3. A torta gelatinosa amarela obtidaé lavada em seguida com 2 porções de 63 ml de metanol. O sólidogelatinoso é centrifugado, depois secado sob pressão reduzida (2,7 kPa), auma temperatura próxima de 60°C. Após 12 horas de secagem, obtém-se3,34 g de heparina despolimerizada (éster de benzila, sal de sódio). Orendimento obtido é de 85,3 %.Saponifícacão
Saponifica-se 1,67 g de heparina despolimerizada (éster debenzila, sal de sódio) previamente obtida de acordo com o processo desaponificação descrito no exemplo 1. Obtém-se 0,94 g de um pó amareloclaro. O rendimento de heparina despolimerizada bruta (sal de sódio) é de61 %.
Purificação
Purifica-se 0,94 g de heparina despolimerizada bruta (sal desódio) previamente obtida de acordo com o processo de purificaçãodescrito no exemplo 1. Obtém-se 0,71 g de um pó branco. O rendimento éde 75,5 %.
A mistura purificada de polissacarídeos (sal de sódio)obtida apresenta as características a seguir:
Peso molecular médio: 2500 DaltonsAtividade anti-Xa: 146,6 Ul/mgAtividade anti-IIa: 2,15 Ul/mgRelação atividade anti-Xa/atividade anti-IIa: 68
Exemplo 3
Despolimerizacão e transformação em sal de sódio
Em um erlenmeyer A de 50 ml, introduz-se 28 ml dediclorometano. Sob agitação, carrega-se lentamente 4 g (0,00238 mol) deéster benzílico de heparina (taxa de esterificação: 77 %, sal de benzetônio)obtido de acordo com o exemplo A. Após dissolução completa eresfriamento a 2°C, adiciona-se 0,333 g (0,00239 mol) de 1,5,7-triazabiciclo[4.4.0]dec-5-eno. A uma temperatura próxima de 20°C, deixa-se a reação prosseguir durante aproximadamente 3 horas e 30 minutos.
Durante este tempo, prepara-se a 4°C, em um erlenmeyer B, uma soluçãode 12 g de acetato de sódio em 120 ml de metanol. Sob agitaçãomagnética, a mistura reacional do erlenmeyer A é despejada numa soluçãometanólica de acetato de sódio. Ocorre um precipitado amarelo. Emseguida, a agitação é interrompida e deixa-se a suspensão decantar duranteuma hora. A parte límpida do sobrenadante é removida e descartada (90ml). Sobre o precipitado sedimentado (aspecto de caldo cremoso amarelo),adiciona-se 50 ml de metanol e agita-se durante 20 minutos. Deixa-se oprecipitado re-sedimentar durante aproximadamente 30 minutos. Osobrenadante é removido e descartado (61 ml). Sobre o precipitadosedimentado, adiciona-se 50 ml de metanol e agita-se durante 20 minutos.Em seguida, o precipitado em suspensão é filtrado sobre vidro frito 4. Emseguida, a torta obtida é lavada com 2 vezes 25 ml de metanol. O sólidoúmido é centrifugado, depois secado sob pressão reduzida (2,7 kPa), auma temperatura próxima de 60°C. Após 12 horas de secagem, obtém-se1,19 g de heparina despolimerizada (éster de benzila, sal de sódio). Osólido é de cor amarela intensa. O rendimento obtido é de 75,9 %.
Saponifícacão
Saponifica-se 1,19 g de heparina despolimerizada (éster debenzila, sal de sódio) previamente obtida de acordo com o processo desaponificação descrito no exemplo 1. Obtém-se 0,78 g de um pó amareloclaro. O rendimento de heparina despolimerizada bruta (sal de sódio) é de71,5 %.
Purificação
Purifica-se 0,78 g de heparina despolimerizada bruta (sal desódio) previamente obtida de acordo com o método de purificação descritono exemplo 1. Obtém-se 0,58 g de um pó branco. O rendimento é de 72,5 %.
A mistura purificada de polissacarídeos (sal de sódio) obtidaapresenta as características a seguir:
Peso molecular médio: 2700 Daltons
Atividade anti-Xa: 100,1 Ul/mg
Atividade anti-IIa: 3,3 Ul/mg
Relação atividade anti-Xa/atividade anti-IIa: 27,3
Exemplo 4
Despolimerizacão e transformação em sal de sódio
Em um erlenmeyer A de 50 ml, introduz-se 28 ml dediclorometano. Sob agitação, carrega-se lentamente 4 g (0,00238 mol) deéster benzílico da heparina (taxa de esterificação: 77 %, sal de benzetônio)obtido como descrito no exemplo A. Após dissolução completa e a 2°C,adiciona-se 0,6 ml (0,00222 mol) de 2-ter-butilimino-tris(dimetilamino)fosforano. A uma temperatura próxima de O0C5 deixa-sea reação prosseguir durante aproximadamente 3 horas e 30 minutos.Durante este tempo, prepara-se, a 4°C, em um erlenmeyer B, uma soluçãode 12 g de acetato de sódio em 120 ml de metanol. Sob agitaçãomagnética, a mistura reacional do erlenmeyer A é despejada numa soluçãometanóiica de acetato de sódio. Ocorre um precipitado amarelo gelatinosoquase translúcido. Em seguida, a agitação é interrompida e deixa-se asuspensão decantar durante uma hora. A parte límpida do sobrenadante éremovida e descartada (108 ml). Sobre o precipitado sedimentado (aspectode caldo cremoso amarelado), adiciona-se 50 ml de metanol e agita-sedurante 20 minutos. Deixa-se o precipitado re-sedimentar duranteaproximadamente 30 minutos. O sobrenadante é removido e descartado(60 ml). Sobre o precipitado sedimentado, adiciona-se 50 ml de metanol eagita-se durante 20 minutos. Em seguida, o precipitado branco amareladoem suspensão é filtrado em vidro frito 4. Em seguida, a torta obtida élavada com 2 vezes 25 ml de metanol. O sólido é centrifugado, depoissecado sob pressão reduzida (2,7 kPa), a uma temperatura próxima de60°C. Após 12 horas de secagem, obtém-se 1,22 g de heparinadespolimerizada (éster de benzila, sal de sódio). O rendimento obtido é de77,8 %.
Saponificacão
Saponifica-se 1,22 g de heparina despolimerizada (éster debenzila, sal de sódio) previamente obtida de acordo com o protocolo desaponificação descrito no exemplo 1. Obtém-se 0,69 g de um pó amarelomuito claro. O rendimento de heparina despolimerizada bruta (sal desódio) é de 61,6 %.
Purificação
Purifica-se 0,69 g de heparina despolimerizada bruta (sal desódio) previamente obtida de acordo com o protocolo de purificaçãodescrito no exemplo 1. Obtém-se 0,67 g de um pó branco. O rendimento éde 97,1 %.
A mistura purificada de polissacarídeos (sal de sódio)obtida apresenta as características a seguir:
Peso molecular médio: 2900 Daltons
Atividade anti-Xa: 145,2 Ul/mg
Atividade anti-IIa: 4,5 Ul/mg
Relação atividade anti-Xa/atividade anti-IIa: 32,6
Exemplo 5
Despolimerização e transformação em sal de sódio
Em um balão A de 50 ml, introduz-se 28 ml dediclorometano. Sob agitação, carrega-se lentamente 4 g (0,00238 mol) deheparinato de benzila (taxa de esterificação de 77 %, sal de benzetônio).Após dissolução completa e a 40°C, adiciona-se 0,95 g (0,00949 mol) de imidazolato de sódio. Com o refluxo do diclorometano, deixa-se a reaçãoprosseguir durante aproximadamente 4 horas. Durante este tempo,prepara-se, a 4°C, em um erlenmeyer B, uma solução de 12 g de acetato desódio em 120 ml de metanol. Sob agitação magnética, a mistura reacionaldo erlenmeyer A é despejada numa solução metanólica de acetato de sódio. Ocorre um precipitado amarelo gelatinoso quase translúcido. Emseguida, a agitação é interrompida e deixa-se a suspensão decantar duranteuma hora. A parte límpida do sobrenadante laranja é removida edescartada (88 ml). Sobre o precipitado sedimentado (aspecto de caldocremoso laranja), adiciona-se 50 ml de metanol e agita-se durante 20 minutos. Deixa-se o precipitado re-sedimentar durante aproximadamente30 minutos. O sobrenadante é removido e descartado (51 ml). Sobre oprecipitado sedimentado, adiciona-se 50 ml de metanol e agita-se durante20 minutos. O precipitado laranja em suspensão é filtrado em seguidasobre vidro frito 4. Em seguida, a torta obtida é lavada com 2 vezes 25 mlde metanol. O sólido é centrifugado, depois secado sob pressão reduzida(2,7 kPa), a uma temperatura próxima de 60°C. Após 12 horas desecagem, obtém-se 1,34 g de heparina despolimerizada (éster de benzila,sal de sódio). O rendimento obtido é de 76,6 %.
Saponifícação
Saponifica-se 1,2 g de heparina despolimerizada (éster debenzila, sal de sódio) previamente obtida de acordo com o protocolo desaponifícação descrito no exemplo 1. Obtém-se 0,63 g de um pó bege. Orendimento de heparina despolimerizada bruta (sal de sódio) é de 52,5 %.
Purificação
Purifica-se 0,63 g de heparina despolimerizada bruta (sal desódio) previamente obtida de acordo com o método de purificação descritano exemplo 1. Obtém-se 0,42 g de um pó branco bege. O rendimento é de66,7 %.
A mistura purificada de polissacarídeos (sal de sódio)obtida apresenta as características a seguir:
Peso molecular médio: 2250 Daltons
Atividade anti-Xa: 134,5 Ul/mg
Atividade anti-IIa: 1,5 Ul/mg
Relação atividade anti-Xa/atividade anti-IIa: 90,5
Exemplo 6
Despolimerização e transformação em sal de sódio
Em um erlenmeyer A de 50 ml, introduz-se 28 ml dediclorometano. Sob agitação, carrega-se lentamente 4 g (0,00238 mol) deéster benzílico de heparina (taxa de esterificação: 77 %, sal de benzetônio)obtido como descrito no exemplo A. Após dissolução completa, adiciona-se 1,33 g (0,00956 mol) de l,5,7-triazabiciclo[4.4.0]dec-5-eno. Agita-se auma temperatura próxima de 20°C, durante 3 horas e 30 minutos. Duranteeste tempo, prepara-se, a 4°C, em um erlenmeyer B, uma solução de 12 gde acetato de sódio em 120 ml de metanol. Sob agitação magnética, amistura reacional do erlenmeyer A é despejada numa solução metanólicade acetato de sódio. Ocorre um precipitado amarelo gelatinoso quasetranslúcido. Em seguida, a agitação é interrompida e deixa-se a suspensãodecantar durante uma hora. A parte límpida do sobrenadante é removida edescartada (56 ml). Sobre o precipitado sedimentado (aspecto de caldocremoso amarelo), adiciona-se 60 ml de metanol e agita-se durante 20minutos. Deixa-se o precipitado re-sedimentar durante aproximadamente30 minutos. O sobrenadante é removido e descartado (70 ml). Sobre oprecipitado sedimentado, adiciona-se 50 ml de metanol e agita-se durante15 minutos. Em seguida, o precipitado em suspensão é filtrado sobre vidrofrito 4. A torta amarela de ouro obtida é lavada em seguida com 2 vezes50 ml de metanol. O sólido úmido é centrifugado, depois secado sobpressão reduzida (2,7 kPa), a uma temperatura próxima de 60°C. Após 12horas de secagem, obtém-se 0,92 g de heparina despolimerizada (éster debenzila, sal de sódio). O rendimento obtido é de 64 %.
Saponifícacão
Em um erlenmeyer de 25 ml, introduz-se 0,92 g (0,0014mol) da heparina despolimerizada (éster de benzila, sal de sódio) obtidapreviamente e 17,5 ml de água. Sob agitação magnética, introduz-se 0,38ml (0,00379 mol) de lixívia de soda a 30 %. Após adição, a mistura émantida a uma temperatura próxima de 20°C e agitada durante 5 horas.Adiciona-se 1,8 g de NaCl e neutraliza-se a solução com a adição de HCIconcentrado (volume final da solução de aproximadamente 18 ml). Amistura é transvasada para um erlenmeyer de 100 ml e adiciona-se 46 mlde metanol. Observa-se a formação de um precipitado amarelo. Emseguida, a agitação é interrompida e deixa-se a suspensão sedimentardurante 12 horas a uma temperatura próxima de 20°C. Em seguida, osobrenadante é removido, depois descartado (52 ml). Sobre o precipitadosedimentado (aspecto de caldo cremoso amarelo), adiciona-se 25 ml demetanol e agita-se durante 20 minutos. Deixa-se o precipitado re-sedimentar durante aproximadamente 1 hora. O sobrenadante é removido edescartado (27 ml). Sobre o precipitado sedimentado, adiciona-se 25 ml demetanol e agita-se durante 1 hora aproximadamente. Em seguida, oprecipitado em suspensão é filtrado sobre vidro frito 4. Em seguida, a tortaobtida é lavada com 2 vezes 10 ml de metanol. O sólido úmido écentrifugado, depois secado sob pressão reduzida (2,7 kPa), a umatemperatura próxima de 60°C. Após 3 horas de secagem, obtém-se 0,42 gde heparina despolimerizada bruta (sal de sódio). O rendimento obtido éde 45,6 %.
Purificação
Em um erlenmeyer de 10 ml introduz-se 0,42 g de heparinadespolimerizada bruta obtida previamente e 3,8 ml de água destilada. Amistura é levada a 38°C sob agitação magnética. Com a adição de soda a0,1 mol/1, eleva-se o pH entre 9 e 10
e adiciona-se 25 microlitros de uma solução aquosa deperóxido de hidrogênio a 30 %. Após aproximadamente 2 horas e 30minutos de agitação, adiciona-se 0,5 g de cloreto de sódio. A mistura éneutralizada em seguida com a adição de HCl a 0,1 mol/1. Em seguida, asolução filtrada e transvasada para um erlenmeyer de 25 ml. Despeja-se11,3 ml de metanol. Observa-se a formação de um precipitado branco. Emseguida, a agitação é interrompida e deixa-se a suspensão sedimentardurante 12 horas a uma temperatura próxima de 20°C. Em seguida, osobrenadante é removido, depois descartado (9,8 ml). Sobre o precipitadosedimentado (aspecto de caldo cremoso), adiciona-se 5 ml de metanol eagita-se durante 15 minutos. Deixa-se o precipitado re-sedimentar duranteaproximadamente 3 horas. O sobrenadante é removido e descartado (6,2ml). Sobre o precipitado sedimentado, adiciona-se 5 ml de metanol eagita-se durante 20 minutos. Em seguida, o precipitado em suspensão éfiltrado sobre vidro frito 3. Em seguida, a torta branca obtida é lavada com2 vezes 5 ml de metanol. O sólido úmido é centrifugado, depois secadosob pressão reduzida (2,7 kPa), a uma temperatura próxima de 60°C. Apósaproximadamente 2 horas e 20 minutos de secagem, obtém-se 0,39 g deheparina despolimerizada pura (sal de sódio). O rendimento obtido é de92,8 %.
As características da heparina despolimerizada assim obtidasão as seguintes:
Peso molecular médio: 1950 daltons
Atividade anti-Xa: 115,6 Ul/mg
Atividade anti-IIa: < 2 Ul/mg
Relação atividade anti-Xa/atividade anti-IIa: > 57
Exemplo 7
Despolimerizacão e transformação em sal de sódio
Em um reator A de 400 ml, introduz-se 140 ml dediclorometano. Sob agitação, carrega-se lentamente 20 g (0,0119 mol) deéster benzílico de heparina (taxa de esterificação: 77 %, sal de benzetônio)obtido como descrito no exemplo A. Após dissolução completa, mede-se oteor de água do meio reacional segundo o método de Karl Fisher. O valorobtido é de 0,1 % de água. Adiciona-se então 3,5 ml (0,0121 mol) de 2-ter-butilimino-2-dietilamino-1,3 -dimetil-peridro-1,3,2-diazafosforina. Auma temperatura próxima de 25°C, deixa-se a reação prosseguir duranteaproximadamente 24 horas. Durante este tempo, prepara-se, a 4°C, em umerlenmeyer B, uma solução de 30 g de acetato de sódio em 300 ml demetanol. Sob agitação magnética, a porção da mistura reacional do reatorA é despejada numa solução metanólica de acetato de sódio. Ocorre umprecipitado amarelo gelatinoso quase translúcido. A agitação é mantidadurante uma hora e deixa-se a suspensão decantar duranteaproximadamente 12 horas a 4°C. A parte límpida do sobrenadante éremovida e descartada (220 ml). Sobre o precipitado sedimentado ^aspectode caldo cremoso amarelo), adiciona-se 220 ml de metanol e agita-sedurante 50 minutos. Deixa-se o precipitado re-sedimentar duranteaproximadamente 40 minutos. O sobrenadante é removido e descartado(204 ml). Sobre o precipitado sedimentado, adiciona-se 204 ml de metanole agita-se durante 40 minutos. O precipitado gelatinoso em suspensão éfiltrado em seguida sobre vidro frito 3. A torta gelatinosa amarela obtida élavada em seguida com 2 porções de 100 ml de metanol. O sólidogelatinoso é centrifugado, depois secado sob pressão reduzida (2,7 kPa), auma temperatura próxima de 60°C. Após aproximadamente 12 horas desecagem, obtém-se 2,6 g de heparina despolimerizada (éster de benzila, salde sódio). O rendimento obtido é de 70,6 % (calculado com base naporção do meio reacional tratado).
Saponifícacão
Saponifica-se 2,6 g de heparina despolimerizada (éster debenzila, sal de sódio) previamente obtida de acordo com o processo desaponificação descrito no exemplo 1. Obtém-se 1,48 g de um pó amareloclaro. O rendimento de heparina despolimerizada bruta (sal de sódio) é de62,9 %.
Purificação
Em um erlenmeyer de 50 ml, introduz-se 1,48 g de heparinadespolimerizada bruta obtida previamente e 15 ml de água destilada. Amistura é levada a 40°C sob agitação magnética. Com a adição de soda a 1mol/1, eleva-se o pH a entre 9 e 10. A solução é filtrada sobre umamembrana filtrante com porosidade de 1 μιη. Adiciona-se em seguida 76microlitros de uma solução aquosa de peróxido de hidrogênio a 30 %.
Após aproximadamente 2 horas de agitação, adiciona-se 1,5 g de cloretode sódio. A mistura é neutralizada em seguida com a adição de HCl a 1mol/1. A solução é filtrada sobre uma membrana filtrante com porosidadede 1 μπι. Despeja-se 38 ml de metanol. Observa-se a formação de umprecipitado branco. Em seguida, a agitação é interrompida e deixa-se asuspensão sedimentar durante 1 hora a uma temperatura próxima de 20°C.
Em seguida, o sobrenadante é removido, depois descartado (37 ml). Sobreo precipitado, adiciona-se 37 ml de metanol e agita-se durante 45 minutos.
Deixa-se o precipitado re-sedimentar durante aproximadamente 45minutos. O sobrenadante é removido e descartado (34 ml). Sobre oprecipitado sedimentado, adiciona-se 34 ml de metanol e agita-se durante15 minutos. Em seguida, o precipitado em suspensão é filtrado sobre vidrofrito 3. Em seguida, a torta branca obtida é lavada com 2 vezes 25 ml demetanol. O sólido úmido é centrifugado depois secado sob pressãoreduzida (2,7 kPa), a uma temperatura próxima de 60°C. Após 12 horas desecagem, obtém-se 1,29 g de heparina despolimerizada pura (sal de sódio).
O rendimento obtido é de 87,2 %.
A heparina despolimerizada purificada (sal de sódio) obtidaapresenta as características a seguir:
Peso molecular médio: 2250 DaltonsAtividade anti-Xa: 149,6 Ul/mgAtividade anti-IIa: 0,85 Ul/mgRelação atividade anti-Xa/atividade anti-IIa: 176
Claims (21)
1. Misturas de polissacarídeos sulfatados possuindo aestrutura geral dos polissacarídeos constitutivos da heparina,caracterizadas pelo fato de que apresentam as características a seguir:- elas apresentam um peso molecular médio de 1500 a 3000daltons, uma atividade anti-Xa de 100 a 150 Ul/mg, uma atividade anti-IIa de- 0 a 10 UI/mg e uma relação atividade anti-Xa/atividade anti-IIa superior a 10,- os polissacarídeos constitutivos das misturas contêm de 2 a 26 unidades sacarídicas e apresentam uma unidade de ácido glucurônico-4,5insaturado 2-0-sulfato em uma de suas extremidades,em forma de um sal de metal alcalino ou alcalino-terroso.
2. Misturas de acordo com a reivindicação 1, caracterizadaspelo fato de que a atividade anti-Xa está compreendida entre 125 e 150UI/mg.
3. Misturas de acordo com a reivindicação 1 ou 2,caracterizadas pelo fato de que a atividade anti-Xa está compreendida entre- 140 e 150 Ul/mg e o peso molecular médio está compreendido entre 2000 e- 3000 dalton.
4. Misturas de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizadas pelo fato de que são em forma de sal de sódio, depotássio, de cálcio ou de magnésio.
5. Misturas de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 4, caracterizadas pelo fato de que apresentam uma atividade anti-IIade 0 a 5 Ul/mg.
6. Misturas de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 5, caracterizadas pelo fato de que apresentam uma relação atividadeanti-Xa/atividade anti-IIa superior a 25.
7. Processo de preparação das misturas como definidas nareivindicação 1, caracterizado pelo fato de que se despolimeriza um sal deamônio quaternário do éster benzílico da heparina em meio orgânico, comuma base orgânica forte com pka superior a 20 escolhida dentre as bases dafamília das guanidinas ou fosfazenos e de imidazolato de sódio, se transformao sal de amônio quaternário do éster benzílico da heparina despolimerizadaem sal de sódio, se saponifica o éster e, eventualmente, se purifica o produto.
8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que o sal de amônio quaternário do éster benzílico da heparina éo sal de benzetônio, de cetilpiridínio ou de cetiltrimetilamônio.
9. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que a base da família das guanidinas é 1,5,7-triazabiciclo[4.4.0]dec-5-eno.
10. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que a base da família dos fosfazenos é selecionada de 2-tert-butilimino-2-dietilamino-1,3-dimetilperidro-1,3,2-diazafosforina e 2-tert-butilimino-tris(dimetilamino)fosforano.
11. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que as bases da família das guanidinas são aquelas de fórmula:<formula>formula see original document page 25</formula>em que Ri é hidrogênio ou alquila, R2, R3, R4 e R5 idênticosou diferentes representam, cada um, um radical alquila, os radicais alquilapossuindo de 1 a 6 átomos de carbono em cadeia reta ou ramificada.
12. Processo de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que R1 é hidrogênio e R2, R3, R4 e R5 sãoradicais metila.
13. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que as bases da família dos fosfazenos são aquelas defórmula:<formula>formula see original document page 26</formula>em que os radicais de R1 a R7 são idênticos ou diferentes erepresentam radicais alquila contendo de 1 a 6 átomos de carbono, emcadeia reta ou ramificada.
14. Processo de acordo com uma das reivindicações de 7 a-13, caracterizado pelo fato de que a relação em mol entre base orgânicaforte com pka superior a 20 ou imidazolato de sódio/sal de amônioquaternário do éster benzílico da heparina está compreendida entre 0,2 e 5.
15. Processo de acordo com uma das reivindicações de 7 a 14,caracterizado pelo fato de que o sal de amônio quaternário do éster benzílico daheparina apresenta uma taxa de esterificação compreendida entre 50 e 100 %.
16. Processo de acordo com uma das reivindicações de 7 a 15,caracterizado pelo fato de que a transformação do sal de amônio quaternário doéster benzílico da heparina despolimerizada em sal de sódio é efetuada por meiode tratamento do meio reacional com uma solução alcoólica de acetato de sódio.
17. Processo de acordo com uma das reivindicações de 7 a 16,caracterizado pelo fato de que a saponificação é efetuada com um hidróxidode metal alcalino.
18. Processo de acordo com uma das reivindicações de 7 a 17,caracterizado pelo fato de que a purificação é efetuada com peróxido dehidrogênio.
19. Misturas de acordo com qualquer uma das reivindicações de-1 a 6, caracterizadas pelo fato de que são a título de medicamentos.
20. Misturas de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 6, caracterizadas pelo fato de que são a título de medicamentosantitrombóticos.
21. Composições farmacêuticas, caracterizadas pelo fato deque compreendem como princípio ativo uma mistura como definida em umadas reivindicações de 1 a 6.
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