JP4897991B2 - 超低分子量ヘパリン組成物 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、4−エノピラノシルウロネート(4-enopyranosyl uronate)基を非還元末端に有する、限定された数のヘパリンフラグメントからなる、新規の低分子量ヘパリン組成物(HLMW)に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
ヘパリナ(Heparina)は動物由来のムコ多糖体硫酸塩であって、哺乳動物の腸あるいは肺(ウシ、子ヒツジ、ブタ)から抽出され、現在ではヒトの血栓塞栓症の予防や治療に利用されることがある。
【0003】
このヘパリンの使用は、非常に重症の大出血(very upsetting haemorrhaging)作用を伴うとともに、その毎日の投薬において、3回の皮下注射または静脈注射を伴うことから、非常に重大な欠点を有することがよく知られている。
【0004】
ここ数年間の推移では、以下に示すような、様々な化学的手法がヘパリンの解重合のために用いられている。
−酸性溶媒中での亜硝酸ナトリウムを用いた処理
−エステルのアルカリ処理
−酸素処理水(oxygenated water)の存在下で発生するフリーラジカルの利用
−β−脱離(a beta elimination)機構による、強塩基を用いた非水性溶媒中でのヘパリンの四級アンモニウム塩の処理。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
これらの方法は、操作の手順や状況によって、平均分子量や抗凝固活性(anti-coagulant activity )が変化するヘパリンフラグメントの混合物が得られるという、一定しない生産となってしまう。上記従来の技術で述べられているか、または商品化された低分子量ヘパリン(HLMW)は、様々な解重合手順によって得られている。これらの平均分子量(Mw)は、4,000ないし6,000ダルトンの範囲にある。
【0006】
現在では、次のことが認められている。すなわち、HLMWの抗血栓活性(anti-thrombic activity)は、主に、血漿タンパク質である抗トロンビンIII(anti-thrombin III)活性化作用、および活性化第X因子およびトロンビンの有力な阻害作用の能力によるものである。このようにして、ヘパリンの抗血栓活性は、上記各因子の阻害を特異的に調べるテストにより測定することができる。
【0007】
近年、様々な著作者による研究結果から次のことが分かっている。すなわち、4,800ダルトン未満(<4,800 Daltons )の中程度の分子量の短鎖からなるヘパリンのオリゴ糖鎖のフラグメントは、活性化第X因子への選択的な作用を有する一方、ファルマコペア(farmacopea)の手法を用いて測定される全体的な凝固にはほとんど影響を及ぼさないということである。
【0008】
さらに、以下のことも見い出されている。すなわち、超低分子量のフラグメントが強い抗Xa活性を有することが要求される場合には、米国特許4,981,955 号に記載しているように、抗トロンビンIII に結合する部位を攻撃する危険を冒さない、非水性溶媒中での選択的な解重合技術を用いることが好ましい。
【0009】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上述した背景技術および従来技術に鑑みてなされたものであって、非水性溶媒中での手順を用いた、制御されたヘパリンの解重合を提供するものであり、このヘパリンの解重合は、高い抗Xa活性および低い抗IIa活性を有する低分子量オリゴ糖鎖が豊富なHLMWの新たな種類(family)を得るものであって、該HLMWは、以下の一般式にて示される。
【0010】
【化2】
【0011】
(ただし、式中、nが1ないし12の間で変化し、R1=HまたはSO3Na、R2=SO3NaまたはCOCH3であり、*を付した炭素原子はR配置またはS配置の何れかの炭素原子である)上記のような超低分子量ヘパリンは、β−脱離の手順によって、非水性溶媒中でヘパリンを選択的に解重合させることによって得られる。
【0012】
本発明にかかる超低分子量ヘパリン組成物は、分子量が2,000ないし4,000ダルトンの範囲にあり、抗第Xa因子活性が少なくとも100I.U./mgに等しく、6量体糖鎖(hexasaccharide, n=1)から12量体糖鎖(dodecasaccharide,n=4)までに及ぶ低重合度のオリゴ糖鎖の割合が大きく、75%にも達しているということを特徴としている。
【0013】
このような組成物は、静脈及び動脈の血栓症の予防や治療において有用であって、抗血栓症剤として用いることができる。
【0014】
従来知られている、または市販で利用されているHLMWは、低分子量(low molecular mass)オリゴ糖鎖、特に、6量体糖鎖から12量体糖鎖までに及ぶ重合度のオリゴ糖鎖の割合が小さいものであった。
【0015】
本発明の成果であるヘパリン組成物の主な特徴は、そのようなオリゴ糖鎖の割合が大きく、75%にも達しているということである。さらに、このようなオリゴ糖鎖は、高い抗Xa活性(≧100I.U./mg)を有し、長い持続性と、高い抗血栓活性が得られる。
【0016】
上記のヘパリン組成物は、抗Xa活性が100ないし150I.U./mgの範囲にあり、抗第IIa因子活性が10I.U./mg以下である。
【0017】
本発明のヘパリン組成物の平均分子量は2,000ないし4,000ダルトンの範囲にあり、その組成は以下の通りである。
−分子量が2,000ダルトン未満のオリゴ糖鎖を25〜60%含んでおり;
−分子量が2,000ないし6,000ダルトンのオリゴ糖鎖を40〜75%含んでおり;
−分子量が6,000ダルトンを超えるオリゴ糖鎖を15%未満含んでいる。
【0018】
本発明のヘパリン組成物は、オリゴ糖鎖、すなわちヘパリンフラグメントの混合物からなっている。本発明の一部を形成するフラグメントのパーセンテージは以下の通りである。
−nが10ないし12の範囲にあるフラグメントを10%未満含んでおり;
−nが1ないし6の範囲にあるフラグメントを80〜90%含んでおり;
−nが7ないし9の範囲にあるフラグメントを15%未満含んでいる。
【0019】
【実施例】
本発明を、以下の各実施例によって説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【0020】
分子量(Mw)、分子分布(molecular distribution)、同じく抗第Xa因子活性は、モノグラフ第828号、『低分子量ヘパリン(“Heparin of low molecular weight ”)』第3版 ファルマコペア・エウロペア(Farmacopea Europea)に記載の手法によって決定した。
【0021】
〔実施例1〕
1kgの未分別ヘパリンナトリウムを7L(リットル:litres) の精製水に溶解した後、50重量(質量)/体積%(% w/v)の塩化ベンザルコニウム水溶液4.4Lを該ヘパリン溶液へ攪拌しながら添加した。
水を加えて体積を30Lにして、デカンテーション(傾瀉)した。
【0022】
次に、上澄液を取り除き、水を加えて体積を30Lにして、デカンテーション状態とした。
デカンテーション終了後、上澄液を取り除き、沈澱物を凍結乾燥(liophilised)した。
約2.7kgのヘパリンのベンザルコニウム塩(生成物A)が得られた。
【0023】
100gの生成物Aを300mlのジクロロメタンに溶解した後、トリトンBを以下の3ロットに分けて添加した。
−25mlのトリトンBを添加し、混合物を25℃で8時間放置した。
−25mlのトリトンBを添加し、混合物を25℃で16時間放置した。
−25mlのトリトンBを添加し、混合物を25℃で8時間放置した。
【0024】
上記溶液を、10重量/体積%の酢酸ナトリウムのメタノール溶液600mlで沈澱させ、沈殿物をメタノールで洗浄しながらの遠心分離によって回収した。
【0025】
該生成物を500mlの水に溶解し、0.1mol /L(0.1N)のHClで中和し、塩化ナトリウムを10重量/体積%の濃度に到達するまで添加した。沈殿は1.25Lのメタノールの添加によりもたらされた。
【0026】
次に、メタノールで洗浄しながらの濾過、および35℃での真空乾燥により沈澱物を回収したところ、33gの生成物Bが得られ、該生成物Bを10重量/体積%で水に溶解した。
【0027】
温度を25℃に設定し、塩化ナトリウムを添加して濃度を10重量/体積%にした。沈殿は2.5倍のメタノールの添加によってもたらされた。それから、メタノールで洗浄しながらの濾過、および35℃での真空乾燥により沈澱物を回収したところ、26gの精製された生成物が得られた。該生成物を5重量/体積%で水に溶解した。
【0028】
0.1mol /L(0.1N)のHClによりpHを6.6に調整し、塩化ナトリウムを添加して濃度を5重量/体積%とした。
沈殿は0.8倍のメタノールの添加によりもたらされた。
沈澱物を、メタノールで洗浄しながらの濾過により回収し、生成物を35℃で真空乾燥させた。
【0029】
上澄液を1.6倍のメタノールで沈澱させた。
メタノールで洗浄しながらの濾過、および35℃で真空乾燥により沈澱物を回収した。
上記プロセスの終了で、22gの生成物が得られた。
【0030】
〔実施例2〕
実施例1における生成物Bを得る方法を繰り返した。
20gの生成物Bを150mlの水に溶解し、50重量/体積%の塩化ベンザルコニウム水溶液100mlを添加した。
【0031】
次に、水を加えて該混合物の体積を500mlにした。該混合物をデカンテーション状態とした。
デカンテーション終了後、上澄液を取り除き、水を加えて体積を500mlにして、該混合物をデカンテーション状態とした。
【0032】
上澄液を取り除いた後、沈澱物を凍結乾燥させたところ、50gのベンザルコニウム塩が得られた。
得られた上記塩20gを60mlのジクロロメタンに溶解した。
5mlのトリトンBを添加し、該混合物を35℃で8時間放置した。
【0033】
次に、上記溶液を、10重量/体積%の酢酸ナトリウムのメタノール溶液120mlで沈澱させ、沈澱物をメタノールで洗浄しながらの遠心分離により回収した。
【0034】
得られた上記生成物を100mlの水に溶解し、0.1mol /L(0.1N)のHClで中和して、塩化ナトリウムを10重量/体積%の濃度に到達するまで添加した。沈殿は250mlのメタノールの添加によりもたらされた。
【0035】
メタノールで洗浄しながらの濾過、および35℃での真空乾燥により沈澱物を回収した。
上記プロセスの終了で、6.3gの生成物が得られた。
【0036】
〔実施例3〕
まず、実施例2で得られた生成物5gを、5重量/体積%の濃度となるように水に溶解した。
【0037】
0.1mol /L(0.1N)のHClでpHを6.6に調整し、塩化ナトリウムを5重量/体積%の濃度に到達するまで添加した。
沈殿は1.5倍のメタノールの添加によりもたらされた。
【0038】
次に、メタノールで洗浄しながらの濾過、および35℃での真空乾燥により沈澱物を回収した。
上記プロセスの終了で、3gの生成物が得られた。
【0039】
〔実施例4〕
実施例1における生成物Bを得る方法を繰り返した。
【0040】
20gの生成物Bを150mlの水に溶解し、50重量/体積%の塩化ベンザルコニウム水溶液100mlを添加した。
それから、水を加えて該混合物の体積を約500mlにした。
【0041】
その後、上澄液を取り除いて、水を加えて体積を500mlにして、該混合物をデカンテーション状態とした。
上澄液を取り除いて、水を加えて容量を500mlにして、該混合物をデカンテーション状態とした。
【0042】
その後、上記により得られた上記塩20gを60mlのジクロロメタンに溶解し、トリトンBを以下の2ロットに分けて添加した。
−5mlのトリトンBを添加し、35℃で8時間放置。
−5mlのトリトンBを添加し、35℃で16時間放置。
【0043】
上記の溶液を、10重量/体積%の酢酸ナトリウムのメタノール溶液120mlで沈澱させ、沈澱物をメタノールで洗浄しながらの遠心分離により回収した。
【0044】
得られた上記生成物を100mlの水に溶解し、0.1mol /L(0.1N)のHClで中和し、塩化ナトリウムを10重量/体積%の濃度に到達するまで添加した。250mlのメタノールを添加して沈澱させた。
【0045】
メタノールで洗浄しながらの濾過、および35℃での真空乾燥により沈澱物を回収した。
上記プロセスの終了で、8.7gの生成物が得られた。
【0046】
〔実施例5〕
まず、実施例4で得られた生成物5gを5重量/体積%となるように水に溶解した。
【0047】
0.1mol /L(0.1N)のHClでpHを6.6に調整し、塩化ナトリウムを5重量/体積%の濃度に到達するまで添加した。
次に、沈殿は0.93倍のメタノールの添加によりもたらされた。
【0048】
その後、メタノールで洗浄しながらの濾過により沈澱物を回収し、35℃で真空乾燥させた。
上澄液を2倍のメタノールで沈澱させた。
【0049】
メタノールで洗浄しながらの濾過、および35℃での真空乾燥により沈澱物を回収した。
その結果、4gの生成物が得られた。
【0050】
【表1】
【0051】
【表2】
【0052】
【発明の効果】
以上のように、本発明にかかるヘパリン組成物は、以下の一般式で表され、
【0053】
【化3】
【0054】
(ただし、式中、nが1ないし12の間で変化し、R1がHまたはSO3Naであり、R2がSO3NaまたはCOCH3であり、*を付した炭素原子はR配置またはS配置の何れかの炭素原子である)非常に分子量の低いものである。
【0055】
それゆえ、このような組成物は、静脈及び動脈の血栓症の予防や治療において有用であって、抗血栓症剤として用いることができる。
Claims (4)
- 以下の一般式で表され、
平均分子量(Mw)が2,000ないし4,000ダルトンの範囲にあり、分子量が2,000ダルトン未満のオリゴ糖鎖を25ないし60%含んでおり、40ないし75%のオリゴ糖鎖の分子量が2,000ないし6,000ダルトンの範囲にあり、15%未満のオリゴ糖鎖の分子量が6,000ダルトンより大きく、
10%未満のフラグメントのnが10ないし12の範囲にあり、80〜90%のフラグメントのnが1ないし6の範囲にあり、15%未満のフラグメントのnが7ないし9の範囲にあることを特徴とするヘパリン組成物。 - オリゴ糖鎖またはヘパリンフラグメントの混合物からなることを特徴とする請求項1記載のヘパリン組成物。
- 抗Xa活性が100ないし150I.U./mgの範囲にあり、抗第IIa因子活性が10I.U./mg以下であることを特徴とする請求項1または2記載のヘパリン組成物。
- 抗血栓症剤として使用可能であることを特徴とする請求項1ないし3の何れか1項に記載のヘパリン組成物。
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