BG64288B1 - 'ъ''ави на ов 'ля' про'...ин и м...'оди за 'яхно'о пол"-аван... - Google Patents

'ъ''ави на ов 'ля' про'...ин и м...'оди за 'яхно'о пол"-аван... Download PDF

Info

Publication number
BG64288B1
BG64288B1 BG103522A BG10352299A BG64288B1 BG 64288 B1 BG64288 B1 BG 64288B1 BG 103522 A BG103522 A BG 103522A BG 10352299 A BG10352299 A BG 10352299A BG 64288 B1 BG64288 B1 BG 64288B1
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
pyrrolo
pyrimidin
phenyl
protein
amino
Prior art date
Application number
BG103522A
Other languages
English (en)
Other versions
BG103522A (bg
Inventor
Michael B. Mann
Randy I. Hecht
Original Assignee
Amgen Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amgen Inc. filed Critical Amgen Inc.
Publication of BG103522A publication Critical patent/BG103522A/bg
Publication of BG64288B1 publication Critical patent/BG64288B1/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/5759—Products of obesity genes, e.g. leptin, obese (OB), tub, fat
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Description

Изобретението се отнася до състави на протеини тип Рс-ОВ, до методи за тяхното получаване и до приложението им. Изобретението се отнася до протеин, получен чрез генетичен или химичен синтез, при който имуноглобулиновата част Рс, нейна производна или аналог, са присъединени чрез синтез към Ν-терминалната част на протеин ОВ, на негова производна или аналог.
претенции, 6 фигури
ВС 64288 В1 (54) СЪСТАВИ НА “ОВ” СЛЯТ ПРОТЕИН И МЕТОДИ ЗА ТЯХНОТО ПОЛУЧАВАНЕ
Област на изобретението
Настоящото изобретение се отнася до състав на синтезирани протеини тип Рс-ОВ и методи за тяхното получаване и употреба.
Предшестващо състояние на техниката
Въпреки, че молекулярната основа на затлъстяването (на английски ΟΒΕ8ΙΤΥ) остава неизвестна до голяма степен, идентификацията на “ОВ-гена” и на протеина, кодиран като “ОВ-протеин” или “лептин”, хвърля известна светлина върху механизмите, които тялото следва, за да регулира отлагането на мазнини. Вж. РСТ, \УО 96/05309 (12/22/96), Рпедтап е1.ак; 7Ьап£ ек а!., ИаШге 372: 425 432 (1994); Вж. също корекцията към сп. МаШге 374: 479 (1995). Протеинът тип ОВ е активен в жив организъм (ϊη νϊνο), както на оЬ/оЬ - мутантни мишки (мишки, които затлъстяват вследствие на дефект при произвеждането на ОВ-генен продукт), така и на нормални, диви мишки.
Биологичната активност се проявява сама по себе си, между другото и като загуба на тегло. Виж за общо разглеждане на въпроса: Вагппа£а, “ОЬехе”- протеините предизвикват отслабване на мишки, Заепсе 269: 475-456 (1995). ОВ-протеинът, неговите производни и тяхното използване като модулатори за контрол на теглото и затлъстяване на животни, включително на бозайници и хора, са изложени в по-голяма степен в РСТ IV О 96/05309 (12/22/96), включена тук като цитат, включително и фигурите.
Другите биологични въздействия на ОВпротеина не са добре охарактеризирани. Известно е, например, че при оЬ/оЬ - мутантните мишки, даването на ОВ-протеин води до известно намаляване на нивата на серумен инсулин и на серумна глюкоза. Известно е също и това, че приемането на ОВ-протеин води до намаляване на телесните тлъстини. Това е наблюдавано както при оЬ/оЬ - мутантни мишки, така също и при незатлъстели нормални мишки. Ре11еутоип1ег ек ак, Заепсе 269: 540-543 (1995); На1аа$ екак, Заепсе 269:543-546 (1995). Вижте също СатНеИ екак, Заеспе 269:546549 (1995) (Периферно и централно въвеждане на микрограмови дози за редуцирано усвояване на храни и отслабване, предизвиквано от ОВ-протеини при мишки тип оЬ/оЬ и мишки, чието затлъстяване е предизвикано от диета, но не и при затлъстели мишки тип дЬ/дЬ). В нито един от тези доклади не са наблюдавани случаи на токсичност, даже и при най-високите дози.
Въпреки обещанието за клинично прилагане на ОВ-протеина, начинът на действието му в жив организъм не е изяснен. Информацията за рецептора ОВ показва свързване с висок афинитет на ОВ-протеина, открит в хипоталамуса на плъх, което показва наличие на разполагане на ОВ-рецептор. 81ерЬепх ека!., ИаТиге 377:530-532. Мишката ОЬ/ОЬ проявява фенотип, който е идентичен с този на мишката оЬ/оЬ, т.е. екстремно затлъстяване и диабет тип II; счита се, че този фенотип се дължи на дефектен ОВ-рецептор, особено след като мишката ОЬ/ОЬ не успява да реагира при въвеждане на протеин ОВ. Виж по-горе 81ерЬепх екак
С напредъка на технологиите на рекомбинантна ДНК достъпността на рекомбинантните протеини за терапевтична употреба предизвика напредък във формулирането на протеинови състави и в тяхното химическо модифициране. Една от целите на такова модифициране е защитата и намаленото разлагане на протеина. Синтезираните протеини и химическото присъединяване могат да блокират значително даден протеолитичен ензим от физически контакт с основната верига на протеина и по този начин да го предпазят от разлагане. При известни обстоятелства допълнителните предимства представляват повишаване на стабилността, удължаване на времето на присъствието на терапевтичния протеин в кръвообращението и повишаване на биологичната му активност.
Един обзор, който описва модификацията на протеина и синтезираните протеини, е този на Ргапах, Росих оп СгочЦЬ РасЮгх 3:410 (май 1992) (публикуван от Медехспрк Μοιιηίνΐβνν СоиП, Рпет Вагпе! Ьапе, Ьопсюп N20, ои), ию.
Една такава модификация е използването на Рс - областта от имуноглобулини. Антителата съдържат две функционално независими части, една променлива област известна като РаЬ, която свързва антиген и една константна област, известна като Рс, която осигурява връзката с двигателните функции, като компле2 ментни (свързващи) или фагоцитни клетки. Частта Рс на имуноглобулина има дълъг полуживот в плазмата, докато РаЬ-частта е краткотрайна. Сароп е1.а1.. ИаГиге 337:525-531 (1989).
Терапевтичните протеинови продукти са създадени с Рс-област, за да могат да осигуряват продължителен полуживот или да притежават функции, като свързване на рецептори с Рс, свързване на протеин А, допълващо фиксиране и пренос през плацента, всички те присъстват при Рс-протеините на имуноглобулините, Ιά. Например, Рс-участъкът на едно антитяло тип ΙβΟΙ е присъединено чрез синтез към Ν-терминала на СБЗО-Ь, една молекула, която свързва рецепторите СБЗО, открити върху туморните клетки на болестта на Ηοφβΰη, по анапластичните клетки на лимфона, клетките от Т - клетъчна левкемия и други злокачествени видове клетки.
Виж υδ 5 480 981. 1Ь-10, едно противовъзпалително и антиотхвърлящо средство е свързано чрез синтез към миши Рсу2а, с оглед удължаване полуживота на цитокини с краткотрайна циркулация. ΖΗεηβ ек а1. ТЬе 1оигпа1 οί 1тпшпою£у 154:5590-5600 (1995). Изследванията дават и количествена оценка на използването на рецептора на туморния некротизиращ фактор, свързан с Рс-протеин от човешки ΙβΟΙ за лечение на пациенти със септичен шок. Р18сЬег, С. ек ак, Ν. Εηβΐ. I. Μεά. 334:1697-1702 (1996); Уап Ζββ, К. ек ак, ТЬе 1оигпа1 οί 1ттипою8у 156:2221-2230 (1996). Известно е свързване на Рс с рецептор СБ4 за получаване на терапевтичен протеин за лечение на СПИН. Вижте Сароп ек ак 1Ча1иге, 337: 525-531 (1989). Освен това, Ν-терминалът на интерлевкин 2 също е свързан чрез синтез към Рс-частта на ΙβΟΙ или ΙβΟ3 за преодоляване на краткотрайния живот на интерлевкин 2 и систематичната му токсичност. Вижте НагаН ек ак 1пнпипо1есЬпою£у, 1:95-105 (1995).
Благодарение на разпознаването на ОВ-протеина като обещаващ терапевтичен протеин, се яви необходимостта от разработване на състави, аналогични на ОВ, които да служат за клинична употреба в съчетание със или като заместители при предписване на ОВ-протеин. Такава една разработка би следвало да включва състави на ОВ-аналози, при които съставите на протеина и неговите химически модификации постигат намаляване на разлагането на протеина, повишена стабилност и време на циркулация. Настоящото изобретение осигурява такива състави.
Техническа същност на изобретението
Настоящото изобретение се отнася до състави на Рс-ОВ слят протеин, методи за получаване на такива състави и използването им. По-конкретно, настоящото изобретение се отнася до един генетичен слят протеин, съставен от Рс-участък или аналози на имуноглобулини, включени чрез синтез към Ν-терминалната част на ОВ-протеин или негови аналози. Слетият Рс-ОВ протеин е в състояние да димеризира чрез цистеиновите остатъци на Рс-участъка. Неочаквано, генетичната слята модификация с Рс при Ν-терминуса на ОВ-протеина показва преимущества в стабилността, скоростта на освобождаване в организма и намалено разлагане, които иначе не се проявяват при ОВ-протеина или при присъединяване на Рс към С-терминуса на ОВ-протеина. Изненадващо и от особена важност е, че модификацията при Ν-терминуса осигурява неочаквана защита на протеина от разлагане, удължава времето на циркулация и стабилността в сравнение с ОВ-протеина или в сравнение с модификацията с Рс на С-терминуса на ОВ - протеина. Такива неочаквани предимства от Рс-модификацията на ОВ-протеина биха благоприятствали консуматорите на ОВ-протеини, поради това, че тези изменения допринасят за намаляване на необходимите дози или на честотата на дозиране. По такъв начин, както е описано по-долу с повече подробности, настоящото изобретение има няколко аспекта, отнасящи се до генетичната модификация на протеините чрез свързване на Рс-терминуса към ОВ-протеина (или негови аналози), както и до специфичната модификация, получаване и методи за прилагане на такива препарати.
И така, в една от областите на приложение, настоящото изобретение осигурява един Рс-ОВ слят протеин, в който Рс е генетично свързан чрез синтез към Ν-терминуса на ОВпротеина ( или негови аналози). Освен това, Рс-участъкът може да бъде свързан също с Νтерминуса на ОВ-протеина (или негови аналози) чрез пептидни или химически свързващи средства, познати на специалистите. Както е отбелязано по-горе и е описано с повече подробности по-долу, Рс-ОВ слетият протеин притежава неочаквана защита срещу разлагане и повишено времето на циркулация и стабилност в сравнение с ОВ-протеина или С-терминус ОВРс слети протеини. Поради това, допълнителни аспекти на това изобретение включват не само състави на Рс-ОВ- слят протеин, но също и вериги на ДНК, кодиращи такива протеини, съответните вектори и клетки-гостоприемници, съдържащи такива вектори, като и двете групи са полезни за получаване на слетите протеини от настоящото изобретение.
Във втора област, настоящото изобретение осигурява методите за получаване на РсОВ слят протеин. Такива методи включват рекомбинантна ДНК-техника за получаване на рекомбинантни протеини. Освен това, тези понататъшни аспекти включват също и методи за ферментация и пречистване.
В една друга област на приложение, настоящото изобретение осигурява методи за лечение на наднормено тегло на хора и животни, включително модулиране и/или натрупване на мазнини чрез въвеждане на слят протеин от типа Рс-ОВ. Благодарение на характеристиките на слетите Рс-ОВ-протеини са създадени методи, които намаляват количеството и/или честотата на дозиране на ОВ-протеина, като се използва РсОВ средство за намаляване на теглото.
В друг един аспект, настоящото изобретение осигурява терапевтични методи за лечение на съпътстващите заболявания, свързани с наднорменото тегло, като диабет, дис- или хиперлипидемии, артериосклероза, артериална плака, намаление или предотвратяване на образуването на жлъчни камъни, инсулт, а така също и повишаване на чувствителността спрямо инсулин и/или повишаване на масата на немастните тъкани.
В един друг аспект, настоящото изобретение осигурява също и съответни сходни фармацевтични състави от Рс-ОВ протеини, техни аналози и производни, за прилагане в споменатите по-горе терапии.
Описание на приложените фигури
Фигура 1 - рекомбинантна миша теЮВ двойноверижна ДНК (5Е(). ГО. ΝΟδ.: 1 и 2) и аминокиселинна последователност (δΕζ). ГО. Νο. 3).
Фигура 2 - рекомбинантна човешка теЮВ аналогова двойноверижна ДНК (δΕζ). ГО. N08.: 4 и 5) и аминокиселинна последователност (8Е<2. ГО. Νο. 6)
Фигура 3 (А-С) - ракомбинантна човешка те1Рс-ОВ двойноверижна ДНК (8Е().
ГО. Ν0δ.:7 и 8) и аминокиселинна последователност (8Е(). ГО. Νο. 9).
Фигура 4 (А-С) - рекомбинантна човешка те1Рс-ОВ вариантна (двойноверижна) ДНК (8Е<2. ГО. N08.: 10 и 11) и аминокиселинна последователност (8Е<2· ГО. Νο. 12).
Фигура 5 (А-С) - рекомбинантна човешка те1Рс-0В вариантна (двойноверижна) ДНК (δΕ<2. ГО. Νθ8.:13 и 14) и аминокиселинна последователност (8Е(2. ГО. Νο. 15).
Фигура 6 (А-С) - рекомбинантна човешка те1Рс-0В вариантна (двойноверижна) ДНК (8Εζ). ГО. N08.: 16 и 17) и аминокиселинна последователност (5Е<2· ГО. Νο. 18).
Подробно описание на изобретението
Настоящото изобретение се отнася до съставите на сляти протеини тип Рс-ОВ, методите за тяхното получаване и приложение. Поконкретно, настоящото изобретение се отнася до генетично или химично сливане на Рс-участък от имуноглобулини към Ν-терминална част на ОВ протеин. Неочаквано, сливането на Рс към Ν-терминуса на ОВ-протеин показва предимства, които не се наблюдават при ОВпротеина или при сливане на Рс към С-терминнуса на ОВ-протеина. Изненадващо, модифицираният при Ν-терминуса Рс-ОВ протеин осигурява неочаквана защита от разлагане, повишено време на циркулация и повишена стабилност на продукта. По-долу са описани съответно слетият протеин тип Рс-ОВ и неговите аналози или производни, както и съответните методи за прилагането и получаването им.
Състави
Рс-последователността на рекомбинантната човешка последователност Рс-ОВ, показана в 8Е(2. ГО. N0. 9 (вижте фиг. 3), може да бъде избрана от тежката верига на човешки имуноглобулин ΐ£θ-1, вижте ЕШзоп, Γίν. е!.а1., Νιιοίεϊο АсШз Кез. 10: 4071-4079 (1982), или някоя друга последователност, известна на специалистите (например други класове тип ΐ£θ, например включващи, но без да се ограничават само до тях, 1&С-2, ΙβΟ-З и ΙβΟ-4 или други имуноглобулини). Варианти, аналози или други производни на Рс-частта могат да бъдат конструирани например чрез провеждане на различни замествания на остатъци или последователности.
Цистеинови остатъци могат да бъдат заличени или заместени с други аминокиселини, за да се предотврати образуването на дисулфидни напречни връзки при Рс-последователностите. В частност, аминокиселината в положение 5 от δΕ<}. ГО. N0. 9 е цистеинов остатък. Рекомбинантната последователност РсОВ на 8Ед. ГО. Νο. 9 е протеин Рс-ОВ с 378та аминокиселини, (без да броим метиониновия остатък). Първата аминокиселинна последователност за рекомбинантния Рс-ОВ протеин от фиг. 3 е означена, като +1 с метионин в положение -1.
Цистеиновият остатък в положение 5 може да се отстрани или да се замести с една или повече аминокиселини. Цистеиновият остатък може да бъде заместен с аланинов остатък в положение 6, като дава вариантната аминокиселинна последователност от фиг. 4 (8Ε(2· ГО. N0. 12). Рекомбинантният Рс-ОВ - протеин от фиг. 4 представлява 378-аминокиселинен Рс-ОВ-протеин (без да се брои метиониновия остатък). Първата аминокиселинна последователност за рекомбинантния протеин РсОВ от фиг. 4 се означава като +1 с метионин в положение - 1.
По същия начин, цистеинът в положение 5 на 8Е(2. ГО. N0. 9 би могъл да бъде заместен със серин или друг аминокиселинен остатък или да бъде делетиран. Може да бъде получен и вариант или аналог чрез делетиране на аминокиселини в положения 1, 2, 3, 4 и 5, както е станало с варианта в 8Е(2. ГО. N0. 15 (вж. фиг. 5). Заместванията в тези положения също могат да бъдат правени и попадат в обхвата на това изобретение. Рекомбинантният РсОВ-протеин от фиг. 5 се означава като +1, с метионин в положение -1.
Могат да бъдат провеждани още и модификации, въвеждащи четири замествания на аминокиселини за отмиване на сайта на свързване на Рс-рецептора и на комплементния (С1ц) сайт на свързване. Тези вариантни модификации от 8Е9- ГО. N0. 15 биха включвали левкин в положение 15, заместен с глутамат, глутаматът в положение 98 да бъде заместен с аланин и лизините в положения 100 и 102, заместени с аланини (вж. фиг. 6 и 8Е0. ГО. N0. 18). Рекомбинантният Рс-ОВ-протеин от фиг. 6 е 373 аминокиселинен Рс-ОВ-протеин (без да се брои метиониновият остатък). Първата аминокиселинна последователност за рекомбинантия Рс-ОВ протеин от фиг. 6 се означава , като +1 с метионин в положение -1.
По подобен начин, един или повече тирозинови остатъка могат да бъдат заместени с фенилаланинови остатъци. Освен това се предвиждат и други варианти на аминокиселинни инсерции, делеции и/или замествания, всички попадащи в обсега на настоящото изобретение. Освен това измененията могат да бъдат във форма на изменени аминокиселини, като пептидомиметици или ϋ-аминокиселини. Протеинът Рс може да бъде свързан също към ОВпротеините от Рс-ОВ-протеина, чрез “линкерни” чстици, които могат да бъдат химически или аминокиселини с различна дължина. Такива химически линкери са добре известни на специалистите. Последователностите от аминокиселинните линкери могат да включват, без да са ограничени до следните групи:
(a) а1а, а1а, а1а;
(b) а1а, а1а, а1а, а1а;
(c) а1а, а1а, а1а, а1а, а1а;
(ά) в1у, ®1у (е) е1у, §1у, §1у;
(Г) е!у, е1у, £1у, £1у, е1у;
(8) «1У. б!у. 81У, 81У, ^У, 8>У> 8>У! (Ь) 81у-рго-81у;
(») 8*У» £1у, Рг°, 8>У, §1у; ф всякаква комбинация от компонентите (а) до (ϊ)
Частта ОВ от Рс-ОВ слетия протеин може да бъде подбрана от рекомбинантен миши протеин, представен в 8Е(2. ГО. N0. 3 (виж. фиг. 1) или рекомбинантен човешки протеин, както е даден по-горе от ΖΗαηβ е1. ак, ΝβΐιίΓε, (включен в този текст като цитат), или протеин, в който липсва глутаминилов остатък в положение 28. (Вижте ΖΗβηβ ек ак Ца1иге зирга, стр. 428). Може да се използва и аналог на рекомбинантен човешки ОВ-протеин, представен в 8Е(3. ГО. Νο. 6 (виж. фиг. 2), който съдържа: (1) аргинин на мястото на лизина в положение 35, и (2) левкин на мястото на изолевкина в положение 74. (Едно стенографско съкращение за този аналог представлява рекомбинантният човешки К=>1?5, 1=>Ь74). Аминокиселинните последователности за рекомбинантните човешки и рекомбинантните миши протеини или техни аналози със или без слятата Рс-част при Ν-терминуса на ОВ-протеина са представени по-долу с един метионилов остатък в положение -1; обаче, както и с всички останали настоящи протеини ОВ и техни ана5 лози, метиониловият остатък може и да отсъства.
Мишият протеин е съществено хомоложен на човешкия протеин, особено като напълно зрял протеин и особено в Ν-терминуса на молекулата. Може да се получи аналог на рекомбинантния човешки протеин чрез изменение (чрез заместване на аминокиселннни остатъци) в рекомбинантната човешка последователност на аминокиселините, които се отклоняват от мишата последователност. Тъй като рекомбинантният човешки протеин има биологична активност при мишките, един такъв аналог вероятно може да бъде активен и при хората. Например, прилагайки човешки протеин, съдържащ лизин при остатък 35 и един изолевцин при остатък 74, съгласно номерирането на 5Е(). ГО. N0.6, при което първата аминокиселина е валин, а аминокиселината в положение 146 е цистеин, една или повече аминокиселини в положения 32, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 89, 97,
100, 105, 106, 107, 108, 111,118,136,138,142 и 145 могат да се заместят с друга киселина. Може да се избере аминокиселината в съответното положение на мишия протеин (δΕ(2· ГО. ΝΟ. 3) или друга аминокиселина.
По-нататък могат да бъдат получени “консенсус” молекули, основаващи се на последователности на ОВ-протеин от плъхове. Мигакапй е1.а1., ВюсЬет. ВюрЬуз. Кея. Сотш. 209: 944-952 (1995), включен в текста като цитат. ОВ-протеинът от плъх се различава от ОВ-протеина на човека в следните позиции (използвайки номерацията на δΕζ). ГО. Νο. 6): 4, 32, 33, 35, 50, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100,
101, 102, 105, 106, 107,108,111,118,136,138 и 145. Една или повече аминокиселини от тези различаващи се позиции могат да бъдат заместени с друга аминокиселина. Подчертаните позиции са тези, при които мишият ОВ-протеин, както и ОВ-протеинът от плъхове са дивергентни на човешкия ОВ-протеин и следователно са особено подходящи за изменение. В едно или повече положения може да бъде заместена аминокиселина от съответния ОВ-протеин от плъх или друга аминокиселина.
Позициите на ОВ-протеин от плъх и от мишка, които се различават от зрелия човешки ОВ-протеин, са: 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 и 145. ОВ-протеин, съответстващ на δΕί^. ГО. ΝΟ.6, при който една или повече от горепосочените аминокиселини са заместени с друга аминокиселина, като аминокиселината, установена в съответната последователност от плъх или мишка, също може да бъде ефективна.
Освен това, аминокиселините, установени в ОВ-протеин от резус маймуна, които се отклоняват от зрелия човешки ОВ-протеин, са (с означения, отбелязани в скоби с една буква от съкратеното название на аминокиселината): 8 (δ), 35 (К), 48 (V), 53 (<2), 60 (I), 67 (Ν), 68 (Р, 89 (Р, 100 (Р, 108 (Е), 112 ГО) и 118 (Р. Тъй като рекомбинантният човешки ОВ-протеин е активен в синомолгус маймуни, човешки ОВ-протеин, съответстващ на 5Е0· ГО. ΝΟ.6 (с лизин в положение 35 и изолевцин в положение 74), с една или повече аминокиселини, различни от тези на резус маймуни, заместени с друга аминокиселина, като аминокиселините в скобите, може да се окаже ефективен. Трябва да се отбележи, че някои резусдивергентни аминокиселини са също и онези, установени в горните вещества от мишки (позиции 35, 68, 89, 100 и 112). Следователно, човек може да произведе консенсус молекула тип от мишка/резус/човек, която молекула (като използваме номерацията от δΕ(). ГО. ΝΟ. 6) с лизин в положение 35 и изолевцин в положение 74) притежава една или повече аминокиселини в положения, заместени с други аминокиселини: 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 и 145.
Други аналози могат да бъдат получени чрез делетиране на част от последователността от аминокиселини на протеина. Например, на зрелия протеин му липсва една лидерна последователност (-22 до -1). Могат да бъдат получени следните скъсени форми на човешки ОВ-протеинови молекули (използвайки номерацията на δΕ(). ГО. ΝΟ. 6):
(a) аминокиселини 98-146 (b) аминокиселини 1-32 (c) аминокиселини 40-116 (ά) аминокиселини 1 -99 и (свързани с)
112-146 (е) аминокиселини 1-99 и (свързани с) 112-146, с една или повече аминокиселини 1 ΙΟΙ 11, поставени между аминокиселини 99 и 112.
Освен това, скъсените форми може също и да са променили една или повече от аминокиселините, които са дивергентни (в ОВ6 протеина от плъх, мишка или резус) от човешкия ОВ-протеин. Освен това, всякакви изменения могат да бъдат под формата на изменени аминокиселини, като пептидомиметични или ϋ-аминокиселини.
Поради това настоящото изобретение обхваща синтезирани Рс-ОВ протеини, в които ОВ-протеинът е избран измежду:
(a) последователността от аминокиселини 1-146, както е представена чрез 8Е0. ГО. N0. 3 (по-долу) или в 8Е(2. ГО. N0. 6;
(b) аминокиселинната последователност 1-146, както е представена в 8Е(2. ГО. N0. 6 с един лизинов остатък в положение 35 и един изолевцинов остатък в положение 74;
(c) аминокиселинната последователност от подточка (Ь) с различна аминокиселина, заместена в едно или повече от следните позиции (използвайки номерацията, съответна на ЗЕ<3. ГО. N0. 6 и задържайки същата номерация даже в отсъствие на глутаминилов остатък в положение 28): 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 и 145;
(ά) аминокиселинната последователност от подточки (а), (Ь) или (с) като опция без глутаминилов остатък в положение 28;
(е) аминокиселинната последователност от подточки (а), (Ь), (с) или (ά) с метионилов остатък при Ν-терминнуса на веригата;
(ί) скъсен ОВ-протеинов аналог, избран между (като използваме номерацията на 8Е(2. ГО. ΝΟ. 6):
(ϊ) аминокиселини 98-146 (н) аминокиселини 1-32 (ш) аминокиселини 40-116 (ϊν) аминокиселини 1-99 и 112-146 (ν) аминокиселини 1-99 и 112-146 с една или повече аминокиселини 100-111, разположени между аминокиселини 99 и 112; и (νί) скъсеният ОВ-аналог от подточка (ϊ), в който една или повече аминокиселини 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 и 145 са заместени с друга аминокиселина;
(νπ) скъсеният аналог от подточка (ϋ), в който една или повече от аминокиселини 4, 8 и 32, са заместени с друга аминокиселина;
(νϊϋ) скъсеният аналог от подточка (ϊϋ), в който една или повече аминокиселини 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111 и 112, са заместени с друга аминокиселина;
(ίχ) скъсеният аналог от подточка (ΐν), в който една или повече аминокиселини 4,8,
32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118, 136, 138, 142 и 145, са заместени с друга аминокиселина;
(х) скъсеният аналог от подточка (ν), в който една или повече аминокиселини 4, 32,
33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 и 145, са заместени с друга аминокиселина;
(χϊ) скъсеният аналог от която и да е подточка (ΐ) - (χ), притежаващ метионилов остатък при Ν-терминуса на молекулата; и (β) ОВ-протеинът или производно аналог от която и да е подточка (а) до (ί), съставени от химическа група, свързана с протеинова група;
(H) производно от подточка (β), в която споменатата група е водоразтворима полимерна група;
(ΐ) производно на подточка (Ь), в която споменатият водоразтворим полимер от групата е полиетиленгликол.
(р производно на подточка (Н), в която водоразтворимият полимер от групата е полиамино-киселинна група;
(к) производно на подточка (Ь) до (р, в която указаната група е присъединена само към азотен край на споменатата протеинова група; и (I) ОВ-протеин, негов аналог или производно от която и да е от подточки (а) до (к), върху фармацевтично-приемлив носител.
Производни
От настоящите слети протеини тип РсОВ (тук терминът “протеин” се използва включително и за означаване на “пептид”, Рс, ОВ или аналози, като споменатите вече в текста, освен ако не е указано по друг начин) се получават производни чрез присъединяване на една или повече химически групи към групата на слетия протеин Рс-ОВ. Тези химически модифицирани производни могат да бъдат формулирани по-късно за вътрешно-артериално, вътрешно-перитонеално, мускулно, подкожно, интравенозно, орално, през носа, белодробно, локално приемане в организма или по други предписани начини, както е разгледано по-долу. Установено е, че химическата модификация на биологично активните протеини осигурява допълнителни предимства при известни обстоятелства, като повишаване на стабилността и времето на циркулация на терапевтичния протеин и намаляване на неговата имуногенност. Виж ЕГ8 4 179 337, Οβνίχ е1.ак, издаден на 18 декември 1979. За обзор по проблема, виж АЬисНо\У8к1 ека1. в Епгутех аз ϋηίβδ. (1. 8. Но1сегЪег£ апй 1. КоЬеПх, стр. 367-383 (1981)); Ргапсю е1.а1., по-горе.
Химическите съединения, подходящи за такава дериватизация, могат да бъдат подбрани измежду разните водоразтворими полимери. Избраният полимер трябва да бъде водоразтворим, така че протеинът, към който се присъединява, да не се утаява във водна среда, каквато е физиологичната среда. С предпочитание за терапевтична употреба на препарата от краен продукт, полимерът трябва да бъде фермацевтично приемлив. Специалистът в тази област може да избере желания полимер, въз основа на такива решения, като това дали конюгатът полимер/протеин ще се използва за терапия и ако това е така, каква е желаната дозировка, времето на циркулация, съпротивлението спрямо протеолизата и други условия. За настоящите протеини и пептиди ефективността на дериватизация може да се подсигури чрез въвеждане на производна в желана форма (например чрез осмотична помпа или още по-добре чрез инжектиране или преливане или да бъде допълнително формулирано за въвеждане например през устата, белия дроб или носа) и наблюдаване на биологичните въздействия, съгласно даденото описание тук.
Водноразтворимият полимер може да бъде избран от групата, състояща се например от полиетиленгликол, съполимери на етиленгликола и пропиленгликола, карбоксиметилцелулозата, декстран, поливинилов алкохол, поливинил пиролидон, поли-1, 3-диоксолан, поли1-3,6-триоксан, съполимер етилен/малеинов анхидрид, полиаминокиселини (или хомополимери или произволни съполимери) и декстран или поли (п-винил-пиролидон) полиетиленгликол, хомополимери на пропилей гликол, съполимери полипропиленов окис/етиленов окис, полиоксиетилирани полиоли и поливинил-алкохол. Полиетиленгликол-пропионалдехидът може да има предимства при производството, дължащи се на неговата стабилност във вода. Могат да бъдат използвани също и сукцинат, и стирол.
ОВ- или Рс-протеините, използвани за привеждане в лекарствена форма на Рс-ОВслетия протеин, могат да бъдат получени чрез присъединяване на полиаминокиселини или разклонени в точка аминокиселини, към веригата на ОВ - и Рс-протеина (или техните аналози). Например, полиаминокиселината може да бъде допълнителен носител на протеин, който, като Рс-протеинът, слят към ОВ-протеина или ОВ-аналога на настоящото изобретение, служи също и за повишаване на полуживота на циркулация на протеина като допълнение към предимствата, постигнати чрез горния Рс-ОВслят протеин. За терапевтичните или козметични цели на това изобретение, такива полиаминокиселини са онези, които генерират или не, неутрализираща антигенна реакция или други неблагоприятни реакции. Такива полиаминокиселини могат да бъдат подбрани от групата, която се състои от серумен албумин (като човешкия серумен албумин), допълнително антитяло или части от тях (напр. Рс-участък), или други полиаминокиселини, напр. лизини. Както е показано по-долу, мястото на присъединяване на полиаминокиселината може да бъде в Ν-терминнуса на групата на протеина Рс-ОВ, или С-терминуса, или други места между тях, като освен това може да бъде свързана чрез химическа “линкерна” арупа с протеина Рс-ОВ.
Полимерът може да бъде с произволно молекулно тегло и може да бъде разклонен или неразклонен. За полиетиленгликол предпочитаното молекулно тегло е между около 2 кБа и 100 кБа ( като терминът “около” показва, че при препаратите, получени с полиетиленгликол, някои видове ще тежат повече, а други - по-малко от заявеното молекулно тегло), с цел лесна манипулация и производство. Могат да се използват и други размери в зависимост от желания терапевтичен профил (например времетраенето на желаното освобождаване на лекарството в организма, въздействията, по отношение на биологичната активност, ако има такива, лекотата на манипулация, степента или липсата на антигенност и други известни ефекти на полиетиленгликола, до терапевтичен протеин или негов аналог).
Броят на полимерните молекули, присъединени по такъв начин, може да варира, като специалистите в областта са в състояние да осигурят въздействието върху съответната функция. Специалистът може да получи моно-производна или ди-, три-, тетра-, или друга комбинация на производни, със същите или други химически съединения (например полимери, като полиетиленгликоли с различно молекулно тегло). Пропорцията полимерни молекули към протеинови (или пептидни) молекули варира, както и техните концентрации в реакционната смес. Въобще, оптималното съотношение (с оглед ефикасността на реакцията по отношение на това, че не остава излишен нереагирал протеин или полимер) се определя по фактори, като желана степен на дериватизация (например моно-, ди-, три-, и пр.), молекулно тегло на избрания полимер, дали полимерът е разклонен или неразклонен, и реакционните условия.
Химическите съединения трябва да бъдат присъединени към протеина с нужното внимание към въздействията върху функционалните или антигенни области на протеина. Има редица методи на присъединяване, достъпни за специалистите в областта, например ЕР 0 401 384, приведен тук като източник (свързване на полиетиленгликол (ПЕГ) към С - С8Р), виж също МаПк е1 ак, Ехр. Нета1о1. 20:10281035 (1992) (съобщаващ за пегилиране на СМС8Р, използвайки трезилхлорид). Например, полиетиленгликолът може да бъде свързан ковалентно чрез аминокиселинни остатъци чрез реакционноспособна група, като свободна амино- или карбоксилна - група. Реакционноспособните групи са онези, към които може да се свърже дадена активирана полиетиленгликолова молекула. Аминокиселинният остатък, който има свободна аминогрупа, може да включи лизинови остатъци и Ν-терминалния аминокиселинен остатък. Съединенията, които имат свободна карбоксилна група, могат да съдържат остатъци от аспартова киселина, остатъци от глутаминова киселина, както и С-терминален аминокиселинен остатък. Сулфхидрилните групи също могат да бъдат използвани като реакционноспособни групи за присъединяване на полиетиленгликолова молекула (или молекули). Предпочитано за терапевтични цели е присъединяването към някаква аминогрупа, като присъединяване при Ν-терминал или лизинова група. Присъединяването към остатъци, важни за свързването на рецептори, трябва да се избягва, ако с препарата ще се цели свързване на рецептори.
Специалистът може да желае по-конкретно да получи Ν-терминален химически модифициран Рс-ОВ-свързан протеин. Използвайки полиетиленгликола, като илюстрация на настоящите състави, могат да се подбират разните молекули на полиетиленгликола (по молекулно тегло, разклонение и пр.), съотношението на молекулите полиетиленгликол към молекулите протеин (или пептид) в реакционната смес, типът на реакцията на пегилиране, която ще се провежда, както и метода на получаване на избрания протеин за Ν-терминално пегилиране. Методът за получаване на Ν-терминално пегилиран препарат (например, ако е необходимо разделяне на това съединение от други монопегилирани съединения) може да се състои в пречистване на материала, пегилиран при Ν-терминуса, от съвкупността на молекулите пегилиран протеин. Селективно химическо модифициране при Ν-терминуса може да се извърши чрез редуктивно алкилиране, което използва диференциалната реакционна способност на различни типове първични амино групи (лизин по отношение на Ν-терминалната група), достъпни за дериватизация в конкретен протеин. При подходящите условия на реакцията се постига съществено селективна дериватизация на протеина при Ν-терминус с карбоксилна група, съдържаща полимера. Например, може да се пегилира селективно Ν-терминуса на протеина чрез провеждане на реакцията при рН, което позволява да се използват различията в константите рКа на отделните ε-амино групи на лизиновите остатъци и на тези на α-амино групи на Ν-терминалния остатък на протеина. При такава селективна дериватизация се контролира присъединяването на водоразтворим полимер към даден протеин: конюгацията с полимера се извършва предимно при Ν-терминуса на протеина, като не се извършва значителна модификация на други реакционноспособни групи, такива като аминогрупите на страничната верига на лизина. Прилагайки редуктивно алкилиране, водоразтворимият полимер може да бъде от типа, който е описан горе, и трябва да има единичен реакционноспособен алдехид за присъединяване към протеина. Може да се използва полиетиленгликол пропионалдехид, съдържащ единична реакционноспособна алдехидна група.
Предпочита се Ν-терминално монопегилирано производно предвид лесното производство на терапевтичвното средство. Ν-терминалното пегилиране осигурява хомогенен продукт, тъй като охарактеризирането на продукта е опростено по отношение на ди-, три9 или други мултипегилирани продукти. Прилагането на горния редукционен алкилиращ процес за получаване на Ν-терминален продукт се предпочита, с оглед лесния начин на пазарно производство.
Комплекси
Синтезираните протеини тип Рс-ОВ, техните аналози или производни, могат да бъдат въведени в организма под форма на комплекси със свързващи състави. Такъв свръзващ състав може да има ефекта на средство, което даже удължава времето на циркулация към това, което е постигнато чрез синтезирания протеин Рс-ОВ, негов аналог или производна. Този състав може да бъде протеин (или синонимно, пептид). Един пример на свързване на протеин представлява рецепторът на Ов-протеин или част от него, като една разтворима част от него. Други свързващи протеини могат да се осигурят чрез проучване на ОВ-протеина или на Рс-ОВ-протеина в серум или чрез емпиричен скрининг за откриване на наличие на свързване. Използваните протеини за свързване обикновено не влияят върху способността на ОВпротеина, на Рс-ОВ-слетите протеини, или на техни аналози или производни, да се свързват към ендогенен ОВ-протеинов рецептор и/или да влияят върху предаването на сигнала.
Фармацевтични състави
Настоящото изобретение осигурява и методи за прилагане на фармацевтичните състави от Рс-ОВ-слети протеини и техни производни. Такива фармацевтични състави могат да бъдат предназначени за въвеждане в организма чрез инжекция, през устата, белия дроб, през носа, през кожата или по друг начин. Въобще изобретението разглежда подробно фармацевтични състави, съдържащи ефективни количества протеин или производни продукти на изобретението, заедно с фармацевтично приемливите разредители, защитни средства, разтворители, емулгатори, помощни средства и/или носители. Такива състави съдържат разредители с различно съдържание на буфери (напр. трис-солна киселина, ацетат, фосфат), рН и йонна сила; добавки, като детергенти и солюбилизиращи средства (напр. Т»ееп 80, Ро1узогЬа1е 80), антиокислители (напр. аскорбинова киселина, натриев метабисулфит), консерванти (напр. ТМтегзо!, бензилов алкохол) и пълнители (напр. лактоза, манитол); включване на материала в прахообразни препарати на полимерни съединения, като полимаслена киселина, полигликолова киселина и т.н. или в липозоми. Може да се използва и хилауронова киселина, като тя може да има самостоятелно действие на промотор на поддържана забавена циркулация. Такива състави могат да влияят на физичното състояние, стабилността, скоростта на освобождаване на лекарството ίη νίνο, скоростта на изчистване ϊη νϊνο от организма на тези протеини или техни 26 производни. Вижте например Кеппп£1оп’8 РЬагтасеийса1 Заепсез, 18ύι Ед. (1990, Маск РиЬ1. Со., ЕазЮп, РА 18042) стр. 1435-1712, които тук са посочени като цитирани източници за справка. Съставите могат да бъдат получени в течна фаза, но и като твърди прахове, напр. в лиофилизирана форма. Лекарствени форми със забавено отделяне, които се имплантират се разглеждат също така като трансдермални състави за проникване през кожата.
В това изобретение се планира използване и на орални твърди дозировъчни форми, които са описани най-общо в Кетш£1оп’$ РЬагшасеийса1 Зстепсез, 18ΐΗ Ед, 1990 (Маск РиЬ1. Со., ЕазЮп РА 18042) в Глава 89, посочена тук като справочен източник. Твърдите дозировъчни форми се изготвят като таблетки, капсули, хапчета, дражета, таблетки-бонбони, капсули или гранули. За формулиране на настоящите състави може да се използва също и липозомно или протеноидно включване в капсули (като например протеиноидни микросфери, описани в υδ 4 925 673). Може да се приложи и липозомно капсуловане, като липозомите бъдат дериватизирани с различни полимери (напр. υδ 5 013 556). Описание на възможните форми на дозиране под форма на твърди прахове за терапевтични цели е дадено от К. Маршал в: Модегп РЬагтасеийсз, Ед. Ьу С.8. Вапкег апд С.Т. КЬодез, глава 10, 1979, включена в този текст, като цитат. Въобще, формулирането трябва да включва Рс-ОВ- протеин (или негов аналог или производна) и инертни съставки, които позволяват запазването на препарата в стомашната среда и освобождаването му като биологично активен материал в червата.
Освен това, планирани са по-конкретно и форми на горните дериватизирани протеини за дозиране през устата. Синтезираните про10 теини Рс-ОВ могат да се модифицират химически, така че да се получи ефикасно лечение при въвеждане през устата. Въобще, предвижданата химическа модификация се състои в присъединяване на поне едно съединение към молекулата на протеина (или пептида), при което споменатата група позволява (а) инхибиране на протеолизата и (в) всмукване в кръвообращението през стомаха или червата. Освен това желателно е и повишението на общата стабилност на протеина и удължаване на времето на циркулация в тялото. Примери на такива съединения са: полиетилен гликолът, съполимерите на етиленгликола и пропиленгликола, карбоксиметилцелулозата, декстран, поливинилов алкохол, поливинилпиролидон и полипролин. АЪисЬкочгаю и БаУ18, 8о1иЬ1е Ро1утегЕпгуте Асюис18, 1п:Епгуте8 аз ϋηΐβ8, НосепЬег£ апд КоЪег1з, ебз, \У11еу-1п1ег8с1епсе, Νβτν Уогк, ΝΥ (1981), стр. 367-383; Иемутагк е1 ак I. Аррк ВюсЬет. 4: 185-189 (1982). Други полимери, които биха могли да се използват за случая са поли-1,3-диоксолан и поли-1,3,6-тиоксокан. Предпочитани за фармацевтична употреба са съединенията на полиетиленгликола, както е показано по-горе.
Мястото на освобождаване на лекарственото средство за Рс-ОВ-слятия протеин (негов аналог или производно) може да бъде стомахът, тънките черва (напр. дванадесетопръстникът, първата или втората част от тънките черва или дебелото черво. Специалистът в областта познава съставите, които не биха се разтворили в стомаха, и може да направи така, че материалът да се освобождава в дванадесетопръстника или другаде в червата. За предпочитане е освобождаването да избегне разлагащото въздействие на стомашната среда, или чрез защита на синтезираните протеини Рс-ОВ, техните аналози или производни, или чрез освобождаване на биологично активния материал извън стомашната среда, каквато среда са червата.
За да се осигури пълна гастростабилност, съществено е да се осигури обвивка, непроницаема поне при рН 5.0. Като пример за по-разпространени инертни съставки, използвани за ентерични обвивки, може да се посочат целулозният ацетат тримелитат (САТ), хидроксипропил-метил-целулозен фталат (НРМСР), НРМСР 50, НРМСР 55, поливинил-ацетат-фталат (РУАР), Еидгаек ЬЗОБ,
АциаТепс, целулозен ацетат-фталат (САР), Еидга£к Ь, ЕибгаяИ 8, 8Ье11ас. Тези покрития могат да бъдат прилагани и като смесени тънкослойни филми.
Покрития или смес от покрития могат да се прилагат и при таблетки, за които не са предвижда защита в стомаха. Те могат да представляват захарни покрития или покрития, които правят таблетките по-податливи при поглъщане. Капсулите могат да се състоят от твърда черупка (като желатиновата) за доставка на твърдо терапевтично средство, напр. пудра; при течните форми може да се използва мека желатинова обвивка. Материалът на черупката на капсулата може да представлява дебела нишестена хартия или друга храносмилаема обвивка. За хапчета, дражета, формени таблети или таблети-тритурати, могат да се прилагат методи на натрупване чрез навлажняване.
Терапевтичното средство може да бъде включено в състава под формата на множество частици като гранули или пелети с размер на частиците около 1 тт. Съставът на материала за въвеждане чрез капсули също би могъл да бъде пудра, слабо компримирани пръчици или даже таблетки. Терапевтичното средство може да бъде получено под налягане.
Могат да бъдат включени оцветители и ароматизиращи средства. Например, протеинът (или производната) могат да бъдат формулирани (чрез липозомно или микросферично капсуловане), а след това да бъдат включени в храносмилаем продукт, като охладен сироп, съдържащ оцветители и ароматизатори.
Обемът на терапевтичното средство може да бъде увеличен, а то може да бъде и разредено с инертен материал. Като разредители могат да се използват въглехидрати, поспециално манитол, α-лактоза, анхидро-лактоза, целулоза, захароза, модифицирани декстрани и нишесте. Някои неорганични соли също могат да бъдат използвани като пълнители, включително калциев трифосфат, магнезиев карбонат и натриев хлорид. Някои пазарнодостъпни разредители са Ра81-Р1о, Εηάεχ, 8ТАКх 1500, Епсотрге88 и Ανϊοείΐ.
В състава от твърди дозировъчни форми на лекарството могат да бъдат включени дезинтегриращи средства. Като дезинтегриращи средства могат да се използват следните материали, без да се ограничаваме само до тях: скорбяла, включително търговски дезин11 тегрант, на база нишесте, Ехрю1аЬ, натриев нишестен глюконат, Амберлит, натриева карбоксиметилцелулоза, ултрамилопектин, натриев алгинат, желатин, обелки от портокали, киселинна карбоксиметил-целулоза, естествена гъба и бентонит. Друга форма на дезинтегриращи средства са неразтворимите катионоактивни обменни смоли. Могат да бъдат използвани прахообразни смоли, като агар, Кагауа или трагакант. Алгиновата киселина и нейната натриева сол са също подходящи като дисинтегранти.
За поддържане на терапевтичното средство във форма на твърда таблетка може да се използват свързващи средства, като материали от природни продукти, напр. акация, трагакант, скорбяла и желатин. Други материали са метилцелулозата (МС), етилцелулозата (ЕС) и карбоксиметил-целулозата (СМС). Както поливинилпиролидона (РУР), така и хидроксипропилметил-целулозата (НРМС) могат да се прилагат в алкохолни разтвори за гранулиране на терапевтични средства.
В състава на терапевтичното средство може да бъде включен антифрикционен агент, за избягване на слепване по време на процеса на производство на състава. Като слой между терапевтичното средство и стената на формата могат да бъдат използвани смазващи средства, например стеаринова киселина, включително нейните магнезиеви и калциеви соли, политетрафлуоретилен (РТГЕ), течен парафин, растителни масла и восъци, но без да се ограничаваме до тях. Могат да се използват също и разтворими смазочни средства, като лаурил сулфат, магнезиев лаурил сулфат, полиетиленгликол с различни молекулни тегла, СагЬо^ах 4000 и 6000.
Може да се добавят също плъзгащи се средства, които подобряват свойствата на течливост на лекарството по време на получаване на състави, като се помогне прегрупирането по време на компресия. Такива вещества са скорбяла, талк, пирогенен силициев окис и хидратиран силикоалуминат.
Като мокрещо средство за подпомагане на разтварянето на терапевтичното вещество във водна среда може да се добави повърх ностно активно вещество (ПАВ). Като ПАВ може да се включи анионен детергент, като натриев лаурилеулфат, диоктил натриев сулфосукцинат и диоктил натриев сулфонат. Могат да се използват и катийонни детергенти, като бензалкониев хлорид или бензетониев хлорид. Списъкът на потенциални нейоногенни детергенти, които могат да се включат в състава, като ПАВ, съдържа лауромакрогол 400, полиоксил 40 стеарат, полиоксиетилен на хидрирано рициново масло марка 10, 50 и 60, глицеринов моностеарат, полисорбат 40, 60, 65 и 80, естер на мастна киселина захароза, метилцелулоза и карбоксиметилцелулоза. Тези ПАВ биха могли да присъстват в състава на протеина или производната, самостоятелно или в смес в различни съотношения.
Добавки, които повишават потенциално всмукването на протеина (или производните му), са например от мастните киселини олеиновата киселина, линоловата и линоленовата киселина.
Може да е желателно и получаването на рецептура за регулирано освобождаване на лекарството. То може да бъде включено в инертна матрица, която позволява освобождаването да става чрез дифузия или чрез екстракция, например в смоли. Бавно разлагащи матрици също могат да се включват в съставите, напр. алгинати, полизахариди. Друга форма на контролирано освобождаване на този терапевтик е чрез метода, основан на терапевтична система Орос (А1га Согрогабоп), напр. лекарството се затваря в полупропусклива мембрана, която позволява проникване на вода и изтласкване на лекарството навън през един единствен малък отвор, вследствие на осмотичен ефект. Някои покрития за вътрешна употреба също имат забавящо освобождаването действие.
При приготвяне на състави могат да бъдат използвани и други покрития. Те включват разни видове захари, които могат да бъдат приложени в барабани за нанасяне на покрития върху таблети. Терапевтичното средство може също да се добави и в таблетка с тънкослойно покритие, като използваните за целта материали се разделят на две групи: Първите са неентерични материали, включващи метилцелулоза, етилцелулоза, хидроксиетилцелулоза, метил-хидроксиетил-целулоза, хидроксиоропилцелулоза, хидроксипропил-метил-целулоза, натриева карбоксиметилцелулоза, провидон и полиетилен гликоли. Втората група се състои от ентерични материали, които са найчесто естери на фталовата киселина.
За осигуряване на оптимално покритие с тънък слой може да се наложи използва12 не на смес от материали. Нанасянето на покритието се провежда в барабанни наслоители или във флуидизиран слой, както и чрез компресия.
За настоящия протеин (както и за неговите производни) се предвиждат и състави за пулмонарно захранване. Протеинът (или неговото производно) се внася в дробовете на бозайника при вдишване, като преминава в кръвообръащението през епителния слой на дроба. (Други доклади върху този начин са тези на Αφεί е( ак, РНагтасеийса! КезеагсЬ 7: 565-569 (1990); АсЦе! е! а1.1п1егпайопа1 Доигпа1 οί РЬагтасеийсак 63: 135-144 (1990) (1еиргоН4е асе1а1е); Вгацие! е1 ак, 1оигпа1 οί Сагбюуазсиюг РЬагтасоюяу 13 (зирр1. 5), 143-146 (1989) (епйо1ЬеНп-1); НиЬЬагО е! ак Аппа1з οί 1п1егпа1 МесИсте 3: 206-212 (1989) (а1рНа1апГПгурзт); 5тИЬ е1 а1,1. СНп. ΙηνεδΙ. 84: 11451146 (1989) (а1рЬа-1-рго1ета8е); Οδλνεϊη εί а1., АегозоНгаПоп οί Рго1е1пз”, Ρπκεεάΐηβδ οη Кезрнаюгу ϋπΐβ ОеНуегу II КеузЮпе, Союгадо, МагсЬ, 1990 (гесотЬтап! Ьитап βΓοχνίΗ Ногтопе); ОеЬ8 е1 ак, ТЬе 1оигпа1 οί 1ттипоюву 140: 3482-3488 (1988) ООДеИегоп-ватта- апд Штог песго818 1ас1ог а1рНа) апб Р1акг е! ак, υδ Ра1еп1 Νο. 5 284 656 (вгапиюсу1е союпу зНти1аНпв (асТОг).
В практиката на това изобретение се предвижда прилагане на широк спектър от механични устройства, разчетени за дозиране през белите дробове на терапевтични продукти, включително, без да са ограничени до тях, на пулверизатори, инхалатори с отмерване на дозата, прахови инхалатори, с които са запознати специалистите в областта.
Някои конкретни примери на устройства, достъпни за пазара и подходящи за практиката на това изобретение, са пулверизаторът Ултравент, производство на фирмата МаШпскгосИ, 1пс. δί. Ьошз, Μϊ88θνιπ; пулверизаторът Акорн II, производство на Магциез! МесНас1 Ргос1ис18, Επβίεννοοά, Союгасю; инхалатор с отмерена доза Вентолин, на фирмата С1ахо 1пс., КезеагсЬ Τπβηβίε Рагк, ΝοΠΗ СагоНпа; както и праховия инхалатор Спинхейлър, произведен от Ρϊδοηδ Согр., ВесИогб, МаззасЬизеПз.
Всички тези устройства изискват използване на състави, подходящи за дозиране на протеина ( или неговия аналог или производна). Обикновено всеки състав е конкретен за даден вид използвано устройство, и може да е свързан и с прилагане на подходящ материал за вдишване, добавен към спомагателните разредители и вещества, и/или носителите, използвани в терапията.
Протеинът (или неговата производна) е най-добре да се получат в прахообразна форма, като размерът на частиците е по-малък от 10 микрона, а най-добре между 0.5 и 5 микрона, с оглед най-ефективно вдишване в белия дроб.
Като носители могат да се използват въглехидрати като трехалоза, манитол, ксилитол, захароза, лактоза и сорбит. Други съставки за препарата могат да бъдат ОРРС, ϋΟΡΕ, О5РС и ООРС. Могат да се прилагат природни или синтетични ПАВ. Може да се работи с полиетиленгликол (даже освен това, че се използва и за получаване на производни на протеина или аналозите му). Декстрани, като циклодекстрана, биха могли също да бъдат използвани. Могат да се използват и жлъчни соли и други ускорители, целулоза и целулозни производни. Могат да се прилагат и аминокиселини, като използваните в буферни състави.
Освен това е предвидена и употребата на липозоми, микрокапсули или микросфери, инклузивни комплекси и други типове носители.
Съставите, подходящи за употреба в пулверизатори, струйни или ултразвукови средства, обикновено включват Рс-ОВ-протеин, техни аналози и производни, разтворени във вода с концентрации около 0.1 до 25 πΐβ биологично активен протеин на т1 разтвор. Освен това съставът може да съдържа и буфер като обикновена захар (напр. за стабилизиране на протеина и регулиране на осмотичното налягане). Съставът за пулверизиране може да включва и ПАВ за намаляване или защита от агрегиране на праха, индуцирано от повърхността, предизвикано вследствие диспергирането на разтвора при образуване на аерозоли.
Съставите за прилагане с инхалатор с отмерена доза обикновено съдържат фин прах, в чийто състав влиза протеин (или негова производна) , суспендирани в пропелант с помощта на ПАВ. Пропелант (веществото, улесняващо движението) може да бъде всеки конвенционален материал, използван за тази цел, като хлорофлуоровъглерод, хидрохлорофлуоровъглерод, хидрофлуоровъглерод или някой въглеводород, включително трихлорфлуорметан, диохлордифлуор-етан, дихлортетрафлуоретанол и 1,1,1,2-тетрафлуоретан или комбинации от тях. Подходящи ПАВ са сорбитан-триолеатът и соевият лецитин. Олеиновата киселина също може да бъде подходящо средство.
Съставите за лишаване от прахообразен инхалатор включват също така фино разпрашен материал, съдържащ протеина (или негова производна), също и пълнител, като лактоза, сорбитол, захар, манитол, трехалоза или ксилитол в количества, които благоприятват изтичането на праха от устройството, напр. 50 до 90 % тегл. от състава.
Предвижда се и вкарване на протеина (аналога или производното) през носа. Въвеждането през носа позволява преминаване на портеина в кръвообращението направо след въвеждане на терапевтичния продукт в носа, без да е необходимо да се отлага продуктът в белите дробове. Съставите за носа включват примери с декстран или циклодекстран. Предвижда се също внасяне на препарата през слизестите мембрани.
Дозиране
Специалистите в областта могат да осигурят ефективни дози чрез назначение и наблюдение на желания терапевтичен ефект. Благодарение на модификацията на Ν-терминуса на ОВ-протеина, настоящото изобретение постига неочаквана защита на протеина от разлагане и удължава времето на циркулация и стабилност, в сравнение с ОВ-протеина или модификацията на ОВ-протеина при С-терминуса. Следователно, специалистът в тази област може да установи от тези промени, че една ефективна дозировка може да изисква по-малки или по-рядко приемани дози.
Преимуществено съставът на молекулата трябва да бъде такъв, че дози между 0.10 т£/к£/ден и 10 Ц£/к£/ден да дават желания терапевтичен ефект. Ефективните дозировки могат да бъдат определени, като се използват диагностични инструменти за удължен период от време. Например, диагностик за измерване на количеството ОВ-протеин или Рс-ОВ-слят протеин в кръвта (плазмата или серума), може да бъде използван първоначално за определяне на ендогенните нива на протеина. Такива диагностични инструменти могат да бъдат във формата на биологична проба за антитела, като сандвичевата проба за антитела. Първоначално се оценява количеството на ендогенен ОВ-протеин, като се определя основното ниво.
Терапевтичните дозировки се определят като количествена оценка на ендогенния и екзогенен ОВ-протеин или Рс-ОВ-слят протеин (това е протеин, аналог или производна, установени вътре в тялото, като собствен ресурс или предписан), който продължава в хода на терапията. Поради това дозите могат да варират в хода на терапията, като първоначално се прилага относително по-висока доза, до момента, към който проличи терапевтичната полза, като след това този терапевтичен ефект само се поддържа с по-ниски дози.
Идеално е в ситуации, при които се цели само намаление на концентрацията на липиди в кръвта, при които се изисква само поддържане на намалението на концентрацията на липиди в кръвта или при които се изисква повишаване на телесната маса, дозата ще бъде недостатъчна, за да доведе до загуба на теглото. Ето защо, по време на началния етап на терапията на затлъстяло лице, могат да се приемат дози, при които се постига сваляне на теглото и спадане на концентрацията на кръвните липиди или редуциране на затлъстелите тъкани за сметка на повишаване на немастните такива. След като веднъж се постигне достатъчна загуба на теглото, може да се предпише друга доза, която е достатъчна, за да предпази от повторно повишаване на теглото и все пак да бъде достатъчна за поддържане на желаните нива на липидите в кръвта или повишаване на немастната тъканна маса (или предпазване от стопяване на малката мастна маса). Тези дози могат да бъдат намерени по емпиричен път, тъй като въздействието на ОВ- и РсОВ-протеините е обратимо (напр. СашНеШ е! а1. Заеспе 269: 546-549 (1995) на 547). Следователно, ако се наблюдава дозиране, водещо до загуба на тегло, когато загубата на тегло не е желана, тогава би следвало да се предпише по-ниска доза, за да се постигнат желаните концентрации на липидите в кръвта или да се повиши масата на тъканите, като при това се запази желаното тегло.
За да се повиши чувствителността на дадено лице по отношение на инсулина, могат да бъдат взети предвид подобни аргументи. Може да се постигне достатъчно увеличаване на масата на немастната тъкан без загуба на тегло, така че да се намали количеството на инсулина (или възможно амилин, тиазолидинедиони или други лекарства за лечение на диабет), което би могло да се предпише на дадено лице за лечение на диабета.
Същите решения за дози могат да се вземат и за повишаване на общата сила. Може да се постигне повишаване на мускулната маса, съпроводено с появата на по-голяма мускулна сила при дози, които са недостатъчни, за да предизвикват загуба на тегло. Други предимства, като повишаване на броя на червените кръвни телца (и окисляването на кръвта) и намаляване на резорбцията на костно вещество или остеопороза, също могат да бъдат постигнати без загуба на тегло.
Комбинации
Настоящите методи могат да бъдат използвани заедно с други медикаменти, например като тези, които са полезни при лечението на диабета (например инсулин, а възможно е и тиазолидинедиони, амилин или техни антагонисти) , холестерин и медикаменти, предизвикващи понижаване на кръвното налягане (като тези, които намаляват нивото на липидите в кръвта или други медикаменти за сърдечно-съдовите заболявания), както и медикаменти, повишаващи активността (напр. амфетамини). Могат да се използват и средства, потискащи апетита (като тези, които влияят на концентрацията на серотонина или невропептида Υ). Такова приемане на лекарството може да бъде едновременно или поредно.
Освен това, настоящите методи могат да бъдат използвани заедно с хирургически процедури, като козметични операции, предвидени да променят външния вид на тялото (напр. липосукция или лазерни операции, предвидени за намаляване на телесната маса). Здравният ефект на сърдечната хирургия може да бъде повишен чрез прилагане на съответни състави и методи, предмет на изобретението (например с поставяне на байпаси или други операции, планирани за облекчаване на положението, предизвиквано от блокиране на кръвоносните съдове чрез мастни отлагания като артериалната плака). Методите за отстраняване на жлъчни камъни (ултразвукави или лазерни методи), също могат да бъдат използвани преди, по време или след изпълнение на настоящите терапевтични методи. Освен това, настоящите методи могат да бъдат използвани в допълнение към хирургическата намеса или терапия на счупени кости, увредени мускули или други терапии, които биха се подобрили от повишаване на масата на мускулната тъкан.
За по-пълна илюстрация на изобретението представяме следните примери, които в никакъв случай не ограничават неговия обхват: ПРИМЕР 1. Прилагане на миши Рс-ОВ протеин чрез подкожна инжекция
Този пример показва, че подкожната инжекция на миши Рс-ОВ протеин води до намаление на теглото на нормалната мишка. На нормални ( незатлъстели ) ΟΏ1 мишки беше предписан миши Рс-ОВ протеин чрез подкожни инжекции за период от 22 дни. Доза от 10 т£ протеин / к£ телесно тегло имаше в резултат 14% (+/- 1.1%) намаление на основното тегло чрез инжекции в 22 дневен срок. Доза от РВ8 имаше в резултат 3.9% (+/- 3.3%) загуба от основното тегло при 22-дневен срок на инжектиране. Загубата в тегло при инжектиране на 10 м£ Рс-ОВ протеин / к§ телесно тегло / ден при затлъстели мишки СО1 имаше в резултат 10% (+/-4.3%) загуба на основно тегло; при доза на РВ8 резултатите бяха 8.7% (+/- 1.3%) загуба от основното тегло на 22 ия ден от инжекциите.
По-долу са дадени в % различията в основното тегло на СО1 мишки на възраст 8 седмици:
Таблица!. Загуба на тегло след подкожни инжекции
Време (дни) Разтворител (РВ5) рекоминантен слаби мишки Рс-ОВ слят протеин рекомбинантен затлъстели мишки Рс-ОВ слят протеин
1-2 -0.44 +/- 1.1 -3.6+/- 0.41 -1.03 +/- 1.36
3-4 -1.07 +/-0.13 -6.8 +/- 1.5 -2.7 +/- 1.1
5-6 -0.13+/- 1.1 -9.5 +/- 1.2 -4.9 +/- 0.95
7-8 -0.92+/- 0.29 -12.5 +/- 1.6 -7.7 +/- 2.9
9-10 1.6 +/- 1.3 -12.6+/- 1.9 -8.2 +/- 2.9
11-12 -1.98 +/- 1 -13.6+/- 1.96 -8.6 +/- 2.9
13-14 -5.2+/- 1.3 -14.6+/- 1.7 -10.1 +/- 3.6
15-16 -8.6+/- 0.1 -14.5+/- 2 -9.4 +/- 2.2
17-18 -8.5 +/- 0.64 -16.1 +/- 1.8 -9.6 +/- 2.99
19-20 -4.1 +/- 0.99 -16+/- 1.5 -10.4 +/-3.3
21-22 -3.9 +/- 3.3 -14.1 +/-1.1 -10.0 +/- 4.3
Както може да се види, в края на 22-рия ден на инжектиране, животните, получавали РсОВ протеин, са загубили над 14.3% от телесното си тегло за мишки с нормално тегло и 10% от телесното си тегло за затлъстели мишки, в сравнение с животните, получавали само разтворител и в сравнение с контролните мишки.
Изненадващ е резултатът, че животните, получавали Рс-ОВ протеин в продължение на 22 дни, продължили да отслабват до 28мия ден, 4 дни след последната инжекция. На нормалните (незатлъстели) мишки СБ1 е предписвано по 10 πΐβ протеин / к£ телесно тегло / дневно миши Рс-ОВ протеин чрез подкожни инжекции в продължение на 22 дни, с резултат % загуба на основното телесно тегло на 28ия ден в сравнение с 14% загуба в тегло на
22-рия ден. Подобна е картината при затлъстелите мишки Οϋΐ, получавали по 10 ш£ миши Рс-ОВ протеин в продължение на дни и имащи в резултат загуба на основното си тегло 10 % и 13% на 28-ия ден. На 3445 тия ден теглото се запазило с 10% загуба при затлъстелите мишки, а тези с нормално тегло възстановили 5 % от загубеното тегло. Резултатите при контролните мишки от 22-рия до 34тия ден са около 4% при затлъстелите и 7% уве50 личение на теглото за слабите мишки.
ПРИМЕР 2. Прилагане на човешки протеин Рс-ОВ чрез подкожна инжекция в мишки С57.
Този пример демонстрира как подкожното инжектиране на човешки протеин Рс-ОВ води до загуба на тегло в нормални мишки.
На нормални мишки (незатлъстели) тип С57 се дава хуманен протеин тип Рс-ОВ посред- 5 ством подкожно инжектиране в продължение на 7-дневен период. Доза от 10 Ш£ протеин/к£ тегло/ден довежда до 12 % (+/- 1.3 %) загуба от основното тегло към 7-мия ден на инжектиране. Доза от 1 Ш£ протеин /к£ телесно 10 тегло/ден води до 8.9 % (+/- 1.5%) загуба от основното тегло към 7-мия ден на инжектиране. Загубата на тегло при употреба на 10 ш£ протеин /к£ телесно тегло/ден човешки протеин ОВ в затлъстели мишки С57 води до 1.1 % (+/0.99%) загуба от основното тегло и дозиране на 1 Ш£ протеин/к£ тегло/ден води до 2.5 % (+/1.1%) загуба на основно тегло, и двата случая важат за 7-мия ден на инжектиране.
Резултати
По-долу са дадени процентните разлики (%) от основното тегло при мишки тип С57 (на възраст 8 седмици):
Таблица 2. Загуба на тегло след подкожна инжекция
Време (дни) Разтворител (РВ8) рекомбинантен Рс-ОВ слят протеин рекомбинантен Рс-ОВ протеин
1-2 0.258 +/- 1.3 -6.4+/- 1.6 -2.1 +/- 0.91
3-4 2.2 +/- 1.1 -12.1 +/- 1.5 -0.78+/- 0.36
5-6 4.5 +/- 2 -11.5+/- 1.5 -1.7+/- 0.6
7-8 7.0 +/- 2.1 -11.9+/- 1.6 0.1 +/- 1.2
9-10 9.0 +/- 1.9 -11.5+/- 1.3 7.2+/- 2.7
11-12 10 +/- 3.8 -9 +/- 1.4 10.9+/- 2.9
13-14 12.5+/- 4.4 -9.5+/- 1.6 12.3 +/- 6.4
15-16 11.1 +/- 1.0 -3.0+/- 1.5 10.3+/- 3.3
17-18 17.2 +/- 3.6 8.0+/- 1.3 13.3+/- 3.4
Както може да се види, в края на ден 17 след 7-дневен режим на подкожно инжектиране при доза 10 т^/к^/ден, животните, получаващи протеин Рс-ОВ, възстановяват до 8 % от телесното си тегло. Животни, получаващи дози от 1 т£/к£/ден след 7 дни подкожно инжектиране се връщат на 6.4 % от телесното си тегло след 12 дни.
Тези изследвания показват също, че по време на периодите на възстановяване от ден 7 до ден 22, след последната инжекция на ден 7-ми, възстановяването на телесното тегло е по-бавно при мишките тип С57, които са били третирани с протеин Рс-ОВ, отколкото при нетретираните мишки. Това предполага, че протеинът Рс-ОВ не се изхвърля така бързо, както протеинът ОВ, при което се предизвиква един удължен ефект на загуба на тегло.
ПРИМЕР 3. Реакция по отношение на дозата на мишки СР7, третирани със слят РсОВ протеин.
Едно допълнително изследване показва, че се явява реакция на дозата при непрекъснато въвеждане на протеин Рс-ОВ. В това изследване, затлъстели мишки С57, тежащи 3540 β се третират с рекомбинантен човешки протеин тип Рс-ОВ, прилагайки методи, сходни на тези от горния пример.
Резултатите са представени на таблица долу, ( като % загуба телесно тегло в сравнение с основното тегло, измерено по-горе):
Таблица 3. Реакция спрямо дозата при непрекъснато въвеждане
Доза Време % намаление телесно тегло
0.25 Ш£/к£/ден Ден 5 4
0.5 т£/к£/ден Ден 5 12
1 ш£/к£/ден Ден 5 16
Както може да се види, повишаването на дозата от 0.25 т£/к£/ден до 1 т£/к£/ден увеличава загубата на тегло от 4% на 16%. Забелязва се също, че в ден 5-ти доза от 1 мг/ кг/ден води до 16 % намаление на телесно тегло. Тези изследвания също показват бавно възстановяване на теглото до 0 %, подсказвайки, че протеинът Рс-ОВ не се отстранява от тялото и предизвиква удължаване на ефекта на загуба на тегло.
ПРИМЕР 4. Фармакокинетика на рекомбинантен човешки протеин Рс-ОВ в мишки и кучета тип СИ-1
Това изследване показва фармакокинетичните свойства на рекомбинантен човешки мета-Рс-ОВ-протеин в кучета и мишки тип Οϋ1. Следвайки интравенозно или подкожно дозиране на дози от 1 т£/к£/ден, се определят серумните концентрации рекомбинантен човешки протеин те1-Рс-ОВ и човешки те1-ОВ протеин чрез ензимносвързана имуносорбентна биологична проба (Е1Л8А).
И при двете вещества се наблюдава повишаване на въздействието, охарактеризирано количествено чрез по-високи пикови серумни концентрации и по-големите области под кривата на серумна концентрация (АиС) в сравнение с рекомбинантния човешки ОВ-протеин. Рс-ОВ има по-ниска скорост на систематично отстраняване, отколкото рекомбинантния те1-човешки ОВ-протеин. Това се вижда при по-ниската скорост на изхвърляне и по-продължителния полуживот на Рс-ОВ пред ОВпротеина. Повишаването в размер предизвиква не само повишаване на стабилността на протеина, но и понижаване на ефикасността на
4θ изхвърляне чрез бъбреците. Като резултат, РсОВ се изчиства по-бавно от систематичното кръвообращение. Повишението на пиковото време, пиковите серумни концентрации и А11С за Рс-ОВ-пртоеина се съгласуват с по-ниската скорост на изхвърляне от организма. Протеинът Рс-ОВ дава подкожно по-висока систематична реакция при сравняване с ОВ-протеина. Резултатите са показани по-долу в таблица 4:
Таблица 4.
Фармакокинетични свойства
Биол. видове Мишки СО-1 Мишки СО-1 Мишки СО-1 Мишки СО-1 Кучета Кучета
Начин на приемане Венозно Венозно Подкожно Подкожно Подкожно Подкожно
ОВпротеин Рс-ОВ протеин ОВпротеин Рс-ОВ протеин ОВпротеин Рс-ОВ протеин
Доза Ш£/к8 1 1 1 1 0.5 0.5
Пиково време (часа) 0.14 6 2.8 8
Пикова конц. в серума ш^/к^ 1520 7550 300 1120
АиС πβφ/ιηΐ 1470 366000 1230 132000 2200 52500
Полуживот (часа 0.491 21.4 0.388 2.13 22.9
Изхвърляне от организма шЬ/Н/к£ 681 2.73
ПРИМЕР 5. Този пример показва как в нормални мишки, които не са затлъстели и нямат повишени концентрации на липиди в кръвта, въвеждането на човешки рекомбинантен протеин Рс-ОВ води до понижаване на показанията за холестерин, кръвна захар и триглицериди. Освен това този пример показва, че тези нива остават ниски в рамките на тридневен период на възстановяване.
При нормални мишки тип СО1 се въ40 вежда рекомбинантен човешки протеин Рс-ОВ чрез подкожно инжектиране. След ден 23-ти, който е последният ден на инжектиране, се вземат проби на всеки 24 Н. Както обсъждахме по-горе, животните губят тегло при дозите, които са приели. Както е показано на таблица 5, мишките са имали съществено намаление на серумен холестерин, глюкоза и триглицериди в сравнение с контролните животни, като освен това скоростта на това намаление е зависела от големината на дозата:
Таблица 5
Доза Глюкоза Холестерин Триглицериди
Физиол.разтвор 232.6+/- 15.1 67.8 +/- 3.6 52.6+/- 3.7
1 те/кв/ден 225.8+/-29.1 54 +/- 5.6 43 +/- 8.7
10 те/кя/ден 193.2+/-21.4 53.4 +/-5.7 38 +/- 11
1 т^/ке/ на всеки 2 дни 242.0+/- 9.3 52.6 +/-4.4 40.8+/- 7.2
10 πίβΛβ на всеки 2 дни 197.4+/- 27.9 51.4 +/-5.9 29.8+/- 6.3
1 ιηβΛβ на всеки 3 дни 244.8+/- 19.5 60.8 +/- 7.3 54. +/- 7.1
10 т^/ке на всеки 3 дни 188. +/- 31.2 52.2 +/- 6.9 26.2+/- 10.7
Тези данни показват, че Рс-ОВ протеин или негов аналог или производно е ефективно средство за намаляване на кръвните липиди.
ПРИМЕР 6. На затлъстял пациент (човек) се въвежда човешки протеин тип Рс-ОВ или аналог или производно за целите на намаление на теглото. Затлъстелият пациент също има повишени нива на кръвната захар, включително повишени нива на холестерин, над 200 πΐβ/100 ш1. Пациентът постига задоволително намаление на теглото в рамките на терапията с РсОВ. На незатлъстял пациент се предписва поддържаща доза Рс-ОВ протеин или негов аналог или производно, за да се поддържа понижено ниво на кръвните липиди, включително понижени нива на холестерин, под 200 ιηβ/100 т1. Въведената доза е недостатъчна да предизвика понататъшно понижение на теглото. Въвеждането е хронично. Концентрациите на циркулиращ Рс-ОВ протеин или негов аналог или производно може да се записват, като се използва диагностичен комплект, като биологична проба с антитела срещу ОВ-протеина (или друг антигенен източник, ако е приложим).
ПРИМЕР 7: Незатлъстял пациент претърпява коронарна байпасна хирургия или друго инвазийно лечение за париране на напреднал етап на образуване на артериална плака. След хирургическата операция пациентът се лекува с поддържаща доза Рс-ОВ протеин или негов аналог или производно, за да избегне повторно образуване на артериална пла35 ка. Внесената доза е недостатъчна, за да доведе до загуба на теглото. Приемането на лекарството е хронично. Концентрациите на РсОВ протеин, на негови аналози или производни в кръвообръщението могат да бъдат кон40 тролирани чрез диагностичен комплект, съдържащ биологични проби антитела срещу ОВпротеин (или други антигенни източници, ако има такива).
ПРИМЕР 8. Незатлъстял пациент из45 питва свръх напрежение, дължащо се на намален приток на кръв от запушени артерии. На пациента се дава доза Рс-ОВ протеин или аналог или производно от него в достатъчно количество за намаляване на артериалните утайки, водещи до запушване на артерии. След това пациентът се наблюдава за образуване на следващи артериални утайки и хипертен20 зия. Ако състоянието се появи повторно, на пациентът се дава отново ефективно количество Рс-ОВ протеин, негов аналог или производно, достатъчно за възстановяване на кръвния поток, и все пак недостатъчно, за да доведе до загуба на тегло. Концентрациите на Рс-ОВ-протеин, негов аналог или производно в кръвообращението могат да се контролират с помощта на диагностичен комплект, съдържащ проби антитела срещу Рс-ОВ протеина (или друг антигенен източник, ако има такъв).
ПРИМЕР 9. Пациент страда от жлъчни камъни. Или жлъчните камъни не са извадени и трябва да се избегне образуване на допълнителни жлъчни камъни, или жлъчните камъни са отстранени, но жлъчният мехур остава (както например при използване на лазерна или ултразвукова хирургия) и трябва да се избегне образуването на допълнителни жлъчни камъни. На пациента се предписва ефективно количество Рс-ОВ протеин, негов аналог или производно, което трябва да доведе до предотвратяване на натрупване на допълнителни жлъчни камъни или повторно акумулиране на жлъчни камъни.
Концентрациите на Рс-ОВ-протеин, негов аналог или производно в кръвообращението могат да се контролират с помощта на диагностичен комплект, съдържащ проби антитела срещу протеина Рс-ОВ (или друг антигенен източник, ако има такъв).
ПРИМЕР 10. Пациент-диабетик желае да ползва намалени дози инсулин за лечение на диабет. На пациента се предписва ефективно количество Рс-ОВ протеин, негов аналог или производно, които водят до повишение на масата на немастната тъкан. Чувствителността на пациента спрямо инсулина се повишава и дозата на инсулина, необходима за париране симптомите на диабет се намаляват или като намаление на необходимите единици инсулин или като намаление на броя на инжекициите инсулин, необходими за деня. Концентрациите на Рс-ОВпротеин, негов аналог или производно в кръвообращението могат да се контролират с помощта на диагностичен комплект, съдържащ проби антитела срещу Рс-ОВ протеин (или друг антигенен източник, ако има такъв).
ПРИМЕР 11. Незатлъстял пациент желае повишаване на масата на немастната тъкан за терапевтични цели, като възстановяване от болест, която е намалила масата на немастната тъкан. На пациента се предписва ефективно количество Рс-ОВ протеин, негов аналог или производно, което води до желаното повишение на масата на немастната тъкан. Повишаването на масата на мускулната тъкан се наблюдава чрез сканиране ϋΕΧΑ. Концентрациите на Рс-ОВ-протеин, негов аналог или производно в кръвообращението могат да се контролират с помощта на диагностичен комплект, съдържащ проби антитела срещу Рс-ОВ протеина (или друг антигенен източник, ако има такъв).
Материали и методи
Животни. За горните примери бяха използвани диви мишки тип СО1 и мишки (+/+) С57В16. В началото на опитите мишките бяха на възраст 8 седмици и имаха стабилизирано тегло.
Хранене и измерване на теглото. На мишките се даваше смляна храна за гризачи (ΡΜΙ РеескДпс.) във вид на пудра (Алентън кафези и оборудване), което позволяваше поточно измерване и с по-голяма чувствителност, отколкото при използване на обикновената храна на кубчета. Теглото се измерваше всеки ден по едно и също време ( в 14 Ь ) в избрания период от време. Теглото в деня преди инжектиране се дефинира като основно тегло. Използваните мишки тежаха 18 - 20 β.
Клетки за мишките. Мишките се поставяха в единични клетки, в които се поддържаха добри условия.
Прилагане на протеин или вехикулум (носител). Протеинът (както е описан по-долу) или вехикулум (физиологичен разтвор с фосфат рН 7.4) се прилага чрез подкожни инжекции или интравенозно.
Контролни животнщ Това са животни, които са инжектирани само с вехикулум, без да се добавя към него нито Рс-ОВ слят протеин, нито ОВ-протеин.
Протеин. Последователността ГО Νο 1, 2 и 3 показва миши рекомбинантен ОВ ϋΝΑ и протеин (фиг. 1), а последователността ГО Νο 4, 5 и 6 - аналог рекомбинантен човешки ОВ ϋΝΚ и протеин ( фиг. 2). Както е отбелязано по-горе, рекомбинантният човешки ОВ протеин, както в 5Е() ГО ΝΟ 6, има лизинов остатък в позиция 35 и изолевцинов остатък в позиция 74. Освен това, рекомбинантният човешки протеин, описан от ΖΗπηβ е1 а1., №1иге, зирга. и РСТ публикация Υ/0 1996005309 (12/ 22/96) (и двете са дадени като справки с придружаващи фигури) ; мишите и човешки аналогови рекомбинантни протеини на фиг. 1 и 2 илюстрират протеин ОВ, който може да бъде използван при образуването на слят Рс-ОВ протеин при настоящите методи на лечение и производство на медикамента. Другите ОВ или РС протеини или аналози или производни на същия могат също да се използват за образуване на Рс-ОВ слят протеин.
Тук, първата аминокиселина от аминокиселинната последователност за рекомбинантен ОВ протеин се обозначава +1 и е валин, а аминокиселината в позиция -1 е метионин. С-терминалната аминокиселина е номер 146 (цистеин ) ( виж фиг. 1 и 2). Първата аминокиселинна последователност за рекомбинантен човешки Рс-ОВ протеин на фиг. 3 се означава като +1 и е глутамат, а аминокиселината в позиция -1 е метионин. С-терминалната аминокиселина е номер 378 (цистеин). Първата аминокиселинна последователност за рекомбинантен човешки Рс-ОВ протеин вариант на фиг. 4 се означава като +1 и е глутамат; аминокиселината в позиция -1 е метионин. С-терминалната аминокиселина е номер 378 (цистеин). Първата аминокиселинна последователност за рекомбинантен човешки Рс-ОВ протеин вариант на фиг. 5 се означава като +1 и е аспарагинова киселина, и аминокиселината в позиция -1 е метионин. С-терминалната аминокиселина е номер 373 (цистеин). Първата аминокиселинна последователност за рекомбинантен човешки Рс-ОВ протеин вариант на фиг. 6 се означава +1 и е аспарагинова киселина, а аминокиселината в позиция -1 е метионин. С-терминалната аминокиселина е номер 373 (цистеин).
Експресионен вектор и щам - гостоприемник
Използваният плазмиден експресионен вектор е рАМС21 (с номер по АТСС 98113), който произлиза от рСРМ1656 (с номер по АТСС 69576) и съдържа съответни рестрикционни сайтове за инсериране на гени дочт$1геат от 1их РК промотор ( Виж. υδ Νο 5, 169, 318 за описване на 1их експреснонна система). РсОВ ϋΝΚ, описана по-долу и показана на фиг.
3-6, беше създадена и се лигира към експресионния вектор рАМС21, линеализиран с рестрикционни ендонуклази ΝάεΙ и ВатН1 и трансформиран в Е.соН щам - гостоприемник,
РМ5. Клетките на Е.соН РМ5 бяха получени в Ат£еп 1пс., ТЬоизапд Оакз, Калифорния, от щам Е.соН К-12 (ВасЬтапп, е! ак, Вас1епа1 Κενίε\ν 40: 116-167 (1976) и съдържат интегриран ламбда репресорен ген с1857 ( 8иззтап е! ак, С.К, Асаск 8с1. 254: 1517-1579 (1962). Получаването на вектора, трансформирането на клетката, селекцията на колонията, бяха извършени с помощта на стандартни методи (например 8атЬгоок е! ак, Мо1еси1аг С1отп£: : А ЬаЬогаюгу тапиак 2-ро издание, СоИ δρπη£ НагЬог ЬаЬогаЮгу Ргезз, СоИ δρπηβ НагЬог, Ν.Υ.) Клетките - гостоприемници се култивират в ЬВ среда.
Конструиране на Рс-ОВ ДНК Плазмидът рРс-АЗ (описан по-долу) служи за източник на последователността на тежка верига на човешки имуноглобулин ΙβΟ-Ι от аминокиселина номер 99 (С1и) до естествения карбоксилен край. Последователността на човешки ΙβΟ-1 може да се получи от СепеЬапк (Р01857).
Човешката ОВ последователност е разгледана по-горе, а също и от ΖΗβηβ, е! ак, ИаШге, зирга. публикация на РСТ XV О 1996005309, и двете са включени за справка, с илюстрации. ОВ ДНК е лигирана в експресионния вектор рСРМ1656, линеаризиран с рестрикционни ендонуклази ХЬа1 и ВатН1, използвайки стандартните процедури за клониране, например Затгоок, е! ак, Мо1еси1аг С1оп1П£ А ЬаЬога1огу тапиа1, СоИ δρπηβ НагЬог ЬаЬогаЮгу Ргезз, СоЮ δρππβ НагЬог, Ν.Υ.) Плазмидът рСРМ1656, носещ последователността ОВ ДНК, служи като източник за рекомбинантен човешки ОВ ген.
Генетичното сливане на тези две последователности беше осъществено по метода на РСК удължаване с припокриване (Но, 8. Νη, е1 ак, в “Странично ориентиран мутагенезис чрез наслагване и разтягане с използване на полимеразна верижна реакция”, ген 77: 5159 (1989). Продуктът от РСК беше разцепен с рестрикционна ендонуклеаза ΝάβΙ, за да създаде 5’-леплив край и с рестрикционна ендонуклаза ВашН1, за да създаде 3’ -леплив край. Векторът рАМС21 бе разцепен по подобен начин. Лигирането се осъществява на слетия фрагмет и линеаризирания вектор. Лигираната ДНК се трансформира с електропорация в Е.соН щам - гостоприемник. Клоновете, оцелели върху селекционен агар (50 πΐβ/πιΐ), бяха проверени за поява на РсОВ-разменен. Изолира се плазмид от отделните клонове и проверява последователността на ген-кодиращата област.
При желание за допълнителни модификации на Рс-ОВ ген, отново се използва РСК техника , за да се извършат промените. Две групи промени бяха извършени в Ν-терминуса на Рс участъка на слятия протеин (8Ер. ГО. Νο 9), за да се създадат вариантите δΕ(2· ГО. Νο 12 и 15. Беше конструиран друг вариант, за да се въведат 4 аминокиселинни замествания за отстраняване на свързващия сайт за Рс-рецептора (левцин в позиция 15, заместен с глутамат) и комплементарния свързващ сайт (С1ц) (глутамат в позиция 98, заместен с аланин, лизин в позиция 100, заместен с аланин, и лизин в позиция 102, заместен с аланин ( Вижте Χϊη Х1ао ΖΗβηβ е1 ак, Журнал Иммунология 154:5590-5600(1995). Матрица на тази структура е δΕί^.Ιϋ.ΝοΙδ.
Конструиране на вектор рРс-АЗ
Плазмид рРс-АЗ, съдържащ областта, кодираща областта на частта Рс на човешки имуноглобулин ΙβΟ-1, тежка верига (Вижте ЕШзоп, 1.АУ. е1 ак, Нуклеинови киселини, Кез. 10: 4071 -4079 (1982)), от първата аминокиселина С1и - 99 на прекачената област до карбоксилния край плюс 5’-ΝοίΙ сайт на сливане и 3'-8а11 и ХЬа1 сайтове, се създава чрез РСК амплифициране на библиотека на човешки с ДНК от далак. РСК реакции бяха извършени в крайния обем от 100 т1, като бяха използвани 2 единици от Уеп1 ДНК полимераза в 20 тМ Тпз-НС1 (рН 8.8), 10 тМ Кс1, 10 тМ (ΝΗ4)2δΟ4, 2 тМ ΜβδΟ4, 0.1 % ΤπΙοη Х-100 с 400 тМ от всяка άΝΤΡ и 1 ηβ от с ДНК библиотеката, което трябва да се амилифицира заедно с 1 иМ от всеки праймер. Реакциите се инициират чрез денатурране при 95 °С в продължение на 2 πιϊη, последвани от 30 цикъла от 95 °С за 30, 55 °С за 30 з и 73 °С за 2 ιηΐη. Праймерът 5’ инкорпорира към ΝοΐΙ сайта непосредствено в 5’ спрямо първия остатък (С1и-99) на прикачения домен на ΙβΟ-1. Праймерът 3’ инкорпорира 5а11 и ХЬа1 сайтове. РСК продуктът със 717 базови двойки се смила с ΝοΙΙ и 8а11, полученият ДНК-ов фрагмент се изолира чрез електрофореза на 1 % агароза и се пречиства и клонира в ΝοίΙ, рВ1иезспр! II Κδ вектор (81га1а£епе) смлян със 8а11. Инсертът в получения плазмид рРс-АЗ се секвенира, за да се потвърди достоверността на РСК реакцията.
Методи за получаване
Методите за получаване, изложени подолу, са използвани за получаване на биологически активен рекомбинантен метионилов миши или човешки аналог на ОВ протеин и РсОВ с лети протеини. Подобни методи могат да до се използват за приготвянето на биологически активен човешки ОВ протеин.
Ферментационен процес
Беше използван ферментационен прои цес при една партида. Съставите на средата са дадени по-долу.
Част от средата, състояща се от първични азотни източници, беше стерилизирана (чрез повишаване на температурата до 120Ί23 “С в продължение на 25 - 35 ιηΐη) във ферментационен съд. При охлаждането бяха прибавени асептично въглерод, магнезий, фосфат и трасиращи метали. Култура от горния рекомбинантен миши протеин, произвеждащ бакте25 рии, престояла през нощта, в обем 500 тЬ (получени лабораторно), беше прибавена към ферментатора. Когато оптическата плътност на културата (измерена при 600 пт като индикатор за клетъчната плътност) достигна 15-25
ЗО абсорбционни единици, към културата се добави автоиндуциращ разтвор (0.5 тв/тЬ хомосерин лактон 1 тЬ / Ь), за да подтикне експресията на рекомбинантния ген. Ферментационният процес продължи още 10 - 16 Ь, след което бе отделен продуктът чрез центрофугиране.
Съставки на средата:
Партида: 34 β/Ь Екстракт от дрожди
78 β/Ь Соев пептон
0.9 β/Ь Калиев хлорид
5.0 β/Ь Хексафос
1.7 β/Ь Лимонена киселина
120 β/Ь Глицерин
0.5 β/Ь ΜβδΟ4 . 7Н2О
0,2 тЬ/Ь Разтвор на трасиращ метал
0.5 тЬ/Ь Р2000 противопенител
Разтвор на трасиращ метал
Ферохлорид (РеС13.6Н2О): 27 β/Ь
Цинков хлорид (ΖηΟ2.4Η20) 2 β/Ь
Кобалтов хлорид (СоС12. .6Н2О) 2 §/Ь
Натриев молибдат (НаМоО4.2Н2О) 2 β/Ь
Калциев хлорид (СаС12.2Н2О 1 β/ί
Меден сулфат (Си5О4.5Н2О) 1.9 в/Ь
Борна киселина (Н3ВО3) 0.5 β/ί
Манганов хлорид (МпС12 .4Н2О) 1.6 β/Ь
Натриев цитрат дихидрат 73.5 β/Ь
Процес на пречистване на човешки РсОВ слят протеин
Пречистването на човешки Рс-ОВ слят протеин беше извършено в няколко описани по-долу етапа, ( ако не е посочено друго, тези етапи на процеса са протекли при 4°С ). Пречистването на миши и човешки ОВ протеин е изложено в публикация на РСТ XVО 1996005309 по-горе, дадено тук като справка.
1. Клетъчна паста. Паста от Е.соН се суспендира в 5 -кратен обем дестилирана вода. Клетките във водата бяха допълнително разбити на два пъти с помощта на микрофлуидизатор. Разкъсаните клетки бяха центрофугирани при 4.2 к об./ιηΐη в продължение на 1 Н в Весктап ΙΒ-6 центрофуга ДВ-6 с ротор Ί5-4.2.
2. Промиване на инкузионни телца. Супернатантата, получена при горния процес се отстранява и пелетите (утайка) се суспендират в пет обема дестилирана вода. Сместа се центрофугира както в етап 1.
3. Солюбилизация. Плътната утайка се солюбилизира с 10 обема от 50 шМ 1п8, рН
8.5, 8 М гуванидин хидрохлорид, 10 тМ дитио треитол и сместа се разбърква в продължение на 1 Ь при стайна температура. Разтворът, състоящ се от 40 шМ цистамин дихидрохлорид, се разбърква в продължение на 1 Ь.
4. Разтворът от етап 3 се добавя до 2030 обема от разтвор за презареждане: 50 шМ 1п8, рН 8,5,0.8 М аргинин, 2 М урея, и 4 тМ цистеин. Този разтвор се бърка в продължение на 16 Н при 8 °С.
5. Буферен обмен. Разтворът от фаза се концентрира и диафилтрува в 10 тМ 1пз, рН 8,5.
6. Киселинно утаяване. Разтворът от етап 5 се довежда до рН 4,75 с 50% ледено студена киселина и се инкубира 30 ιηϊη при стайна температура. Разтворът се филтрува.
7. Катионообменна хроматография. Разтворът от етап 6 се довежда до рН 7.0 и се зарежда в колона със СМ Сефароза за бързо движение при 10°С. Прави се градиент 20 пъти обема на колоната при 10 тМ фосфат, рН 7.0, 0 до 0.1 М натриев хлорид.
8. Анионообменна хроматография. СМ елюатите от етап 7 се разреждат петкратно с тМ 1пз, рН 7.5 и се зареждат в колона с 9 СМ Сефароза за бързо движение при 10°С. Прави се градиент 20 пъти обема на колоната при 10 тМ 1пз, рН 7.5, 0 до 0.2 М натриев хлорид.
9. Хроматография с хидрофобно взаимодействие. Обединените сефарозни елюсати се обработват с 0.75 М амониев сулфат и се зареждат в метил Масгоргер колона за хидрофобно взаимодействие при стайна температура. Създава се градиент 20 пъти обема на колоната при 10 шМ фосфат, рН 7.0, 0.75 - 0 М амониев сулфат.
10. Буферен обмен. Обединените елюати от етап 9 се концентрират според необходимостта и се диализират срещу РВ8 буфер.
Доколкото настоящото изобретение бе описано, като предпочитан вариант за изпълнение разбираемост че, специалистите в областта могат да внасят вариации и модификации. Ето защо, приложените патентни претенции обхващат всички тези еквивалентни вариации, които влизат в обхвата на изобретението, как е посочено в патентните претенции.
СПИСЪК НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ (1) ОБЩА ИНФОРМАЦИЯ:
(ϊ) ЗАЯВИТЕЛ: Ман, Майкъл Б. Хехш, Ранди 1Капду I.
(и) ЗАГЛАВИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО:
СЪСТАВИ И МЕТОДИ ЗА СИНТЕЗ НА ПРОТЕИНИ ТИП “ОВ” (ш) БРОЙ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ: 18 (ίν) АДРЕС ЗА КОРЕСПОНДЕНЦИЯ:
(A) АДРЕСАТ: АМГЕН Инк..
(B) УЛИЦА: 1840 ϋβ НауШапд ϋπνβ (C) С1ТУ: ТЬоизапд Оакз (ϋ) ЩАТ: КАЛИФОРНИЯ (Е) СТРАНА: САЩ (Р) п.к.: 91320-1789 (ν) КОМПЮТЪРНА ФОРМА НА ТЕКСТА:
(A) СРЕДЕН ТИП: фЛОПИ ДИСК (B) КОМПЮТЪР: ΙΒΜ РС съвместим (C) ОПЕИРАНИОННА СИСТЕМА: РС4Х)5/М$-ОО8 (ϋ) СОФТУЕР : Патент издание # 1.0, Версия # 1.30 (νΐ) ТЕКУЩИ ДАННИ ЗА ЗАЯВКАТА:
(A) НОМЕР НА ЗАЯВКАТА: иЗ 08/770,973 (B) ДАТА НА ПОДАВАНЕ: 20-ОЕС-1996 (C) КЛАСИФИКАЦИЯ:
(νπί) ДАННИ ЗА ПРЕДСТАВИТЕЛ/АГЕНТ:
(A) ИМЕ: Кш§Ь1, МаПЪе^ XV.
(B) РЕГИСТРАЦИОНЕН НОМЕР: 36.846 (C) СПРАВКА/ ДОК. НОМЕР: А-416 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ 8ЕО ГО ΝΟ 1:
(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 491 базови двойки (B) ВИД: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ : дву (ϋ) ТОПОЛОГИЯ: линейна (Й) ВИД НА МОЛЕКУЛАТА: с ДНК (ϊχ) СВОЙСТВА:
(A) ИМЕ / КЛЮЧ : свойство “пизс” (B) МЯСТО: 41 (ϋ) ДРУГА ИНФОРМАЦИЯ : / Забележка = Ме1 = АТС (χΐ) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ : 8ЕО ГО N0:1:
ТСГАОАТТТО АОТПТААСТ ΊΠΤΑΟΑΑΟΟΑ ООААТААСАТ АТООТАССОА ТССАОАААОТ 60
ТСАООАСОАС АССААААССТ ТААТТААААС ОАТСОПАСО СОТАТСААСО АСАТСАОТСА 120
САСССАОТСО ОТСТССОСГА ААСАОСОТОТ ТАССООТСТО ОАСТТСАТСС СОООТСТОСА 180
СССОАТССТА АОСГТОТССА АААТООАССА ОАСССТОССТ ОТАТАССАОС АООТОТТААС 240
СГСССТОССО ТСССАОААСО ТГСТТСАОАТ СОСГААСОАС СТССАОААСС ТТСОСОАССТ 300
ОСГОСАССГО СГООСАТТСТ ССАААТССТО СГСССТОССО САОАССТСАО ОТСТГСАОАА 360
АССООААТСС СТООАСОООО ТССГООААОС АТСССГОТАС АОСАССОААО ТТОТГОСГСТ 420
ОТСССОТСТО САОООТГССС ТТСАООАСАТ ССТГСАОСАО СГООАСОТТТ СГССООААТО 480
ТГААТООАТС С 491 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ 8ЕЦ ГО N0:2:
(ΐ) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 491 базови двойки (B) ВИД: нуклеиноба киселина (C) ВЕРЙЖНОСТ : Д®У (О) ТОПОЛОГИЯ: линейна (и) ВИД НА МОЛЕКУЛАТА: сДНК (м) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ: 8Е0 ГО N0:2:
АОАТСТАААС ТСААААТТОА АААТСГГССГ ССГТАТТОТА ТАССАТООСГ АООТСТТТСА 60 АОТССТОСТО ТООТТТТООА АТТААТТТТО СТАОСААТОС С-САТАОТТОС ТОТАОТСАОТ 120 ОТОООТСАОС САОАООСОАТ ТТОТСОСАСА АТООССАОАС СТОААОТАОО ОСССАОАСОТ 180 ОООСГАООАТ ТСОААСАООТТГТАССТООТ СТОООАССОА САТАТООТСО ТССАСААГГО 240 ОАОООАСООС АОООТСГТОС ААОААОТСТА ©СОАТГОСТО ОАОСТСТТОО ААОСОСТООА 300 СОАСОТООАС ОАССОТААОАСОТТТАООАС ОАОООАСООС ОТСТООАОТС САОААОТСГГ 360 ТООССТТАОО ОАССТОСССС АООАССТГСО ТАОООАСАТО ТСОТООСГТС ААСААСОАОА 420 САОООСАОАС ОТСССААООО ААОТССТОТА ООААОТСОТСОАССГОСАААОАООССГТАС 480 ААТГАССТАО О 491 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ 8Е0 ГО N0:3:
(ΐ) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 147 аминокиселини (B) ВИЛ: аминокиселина (C) ВЕРИЖНОСЖ : неизвестна (Ώ) ТОПОЛОГИЯ: Неизвестна (п) ВИД НА МОЛЕКУЛАТА: протеин
0х) СВОЙСТВА:
(A) ИМЕ / КЛЮЧ : Протеин (B) МЯСТО: 1 (ϋ) ДРУГА ИНФОРМАЦИЯ : /Забележка = Ме1 (АТО) започва при -Г (и) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: ЗЕО ГО N0:3:
Ме! Уа1 Рго Пе С1п Ьуз Уа1 О1п Азр Азр ТЬг Ьуз ТЬг Ьеи Пе Ьуз
1 5 10 15
ТЬг Пе Уа1 ТЬг Ατβ Пе Азп Азр Пе Зег ΗΪ8 ТЬг О1п Зег Уа1 Зег
20 • 25 30
А1а Ьуз С1п АГ£ Уа1 ТЬг С1у Ьеи Азр РЬе Пе Рго О1у Ьеи ΗΪ8 Рго
35 40 45
Не Ьеи Зег Ьеи Зег Ьуз Ме! Азр О1п ТЬг Ьеи А1а Уа1 ТУг О1п СНп
50 1 55 60
Уа1 Ьеи ТЬг Зег Ьеи Рго Зег О1п Азп Уа1 Ьеи СНп Пе А1а Азп Азр
65 70 75 80
Ьеи О1и Азп Ьеи АГ£ Азр Ьеи Ьеи ΗΪ5 Ьеи Ьеи А1а РЬе Зег Ьуз Зег
85 90 95
Суз Зет Ьеи Рго ОЬп ТЬг Зег О1у Ьеи С1п Ьуз Рго О1и Зег Ьеи Азр
100 105 110
01у Уа1 Ьеи О1и А1а Зег Ьеи Тут Зег ТЬг О1и Уа1 Уа1 А1а Ьеи Зег
115 120 • 125
Аг£ Ьеи ОЬп О1у Зе! Ьеи С1п Азр Пе Ьеи О1п О1п Ьеи Азр Уа1 Зег
130 135 140
Рго О1и Суз 145 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ 5Е0 ГО N0:4: (ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 454 базови двойки (B) ВИД: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ Дву (ϋ) ТОПОЛОГИЯ: линейна (и) ВИД НА МОЛЕКУЛАТА :с ДНК (к) СВОЙСТВА:
(A) ИМЕ / КЛЮЧ : свойство “пизс” (B) МЯСТО: 4 (ϋ) ДРУГА ИНФОРМАЦИЯ: / Заб. = Ме! = АТС (и) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ: 5Е0 ГО N0:4:
САТАТООТАС СОАТССАОАА АОТТСАООАС ОАСАССАААА ССГТААТТАА ААСОАТССТТ 60 АСОСОТАТСА АСОАСАТСАО ТСАСАСССАО ТССОТОАОСГ СТАААСАОСО ТОТТАСАООС 120 СТООАСГГСА ТСССОООТСГ ОСАСССОАТС СТОАССГГОТ ССААААТООА ССАОАСССТС 180 ОСТОТАТАСС АОСАОАТСТТ ААССТССАТО ССОТСССОТА АСОТТСТТСА ОАТСТСТААС 240 ОАССТСОАОА АССТТСОССА ССТОСТОСАС ОТОСГООСАТ ТСГССАААТС СТОССАССТО 300 ССАТОООСГТ САОСТСТТОА ОАСГСГООАС ТСГСТОООСО ОООТССГООА АОСАТССООТ 360 ТАСАССАССО ААОТТОТГОС ТСГОТСССОТ СГОСАОООТТ СССГТСАООА САТОСТТТОО 420
САОСТООАСС ТОТСТССООО ТТОТТААТСО АТСС 454 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ 8Е0 П5 N0:5 :
(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 454 базови двойки (B) ВИД: нуклеинови Циселини (C) ВЕРИЖНОСТ · ДВУ (ϋ) ТОПОЛОГИЯ: линейна (н) ВИД НА МОЛЕКУЛАТА: с ДНК (за) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ 5ЕО ГО ΝΟ: 5 :
ОТАТАССАТО ОСТАООТСГТ ТСААОТССГО СТОТООТТТТ ООААТТААТТ ТГОСГАОСАА 60
ТССОСАТАОТ ТОСТОТАОТС АОТОТОООТС АСССАСГСОА ОАТТГОТСОС АСААТОТССО 120
ОАССТОААОТ АОООСССАОА СОТОООСГАО ОАСТООААСА ООТПТАССГ ООТСТОООАС 180
СОАСАТАТОО ТСОТСГАОАА ТГООАООТАС ООСАОООСАТ ТССААОААОТ СТАОАОАТГО 240
СТООАОСГСТ ТООААОСОСТ ООАСОАСОТО САСОАССОТА АОАООТТТАО ОАСООТООАС 300
ООТАСССОАА ОТССАОААСГ СТСАСАССТО АОАОАСССОС СССАООАССТ ТСОТАООССА 360
АТОТСОТООС ТТСААСААСО АОАСАССОСА ОАСОТСССАА ОООААОТССГ ОТАСОАААСС 420
ОТСОАССТОО АСАОАООССС ААСААТТАСС ТАОО 454 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ: 5ЕО ГО N0:6:
(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 147 аминокиселини (B) ВИД: аминокиселина (C) УСУКАНОСТ: неизвестна (ϋ) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (и) ВИД НА МОЛЕКУЛАТА: протеин (ίχ) СВОЙСТВО (A) ИМЕ / КЛЮЧ : протеин (B) МЯСТО: 1 (ϋ) ДРУГА ИНФОРМАЦИЯ : / Забележка: = Ме! < АТО) Започва при -1 (χί) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ 8Е0 ГО N0:6:
Ме! Уа1 Рго Пе С1п Ьуз Уа1 С1п Азр Азр ТЬг Ьуз ТЬг ' Ьеи Пе Ьуз
1 5 10 15
ТЬг Пе Уа1 ТЬг Аг£ Пе Азп Азр Пе Зег Ηίδ ТЬг С1п Зег Уа1 Зег
20 25 30
Зег Ьу5 С1п АГ£ Уа1 ТЬг С1у Ьеи Азр РЬе Пе Рго О1у Ьеи Ηίβ Рго
35 40 45
Не Ьеи ТЬг Ьеи Зег Ьуз Ме1 Азр С1п ТЬг Ьеи А1а Уа1 Туг ОЬп ОЬп 50 55 60
Пе Ьеи ТЬг 8ег Ме! Рго ЗегАг£ Αδη Уа1 Ьеи ОЬп Пе Зег Αδη Азр
65 70 75 80
Ьеи О1и Αδη Ьеи Аг£ Азр Ьеи Ьеи Ηίδ Уа1 Ьеи А1а РЬе Зег Ьуз Зег
85 90 95
Суз Ηίδ Ьеи Рго Тгр А1а Зег С1у Ьеи О1и ТЬг Ьеи Азр Зег Ьеи С1у
100 105 110
О1у Уа1 Ьеи О1и А1а Зег О1у Туг Зег ТЬг О1и Уа1 Уа1 А1а Ьеи Зег
115 120 125
Аг£ Ьеи СНп С1у Зег Ьеи СНп Азр Ме! Ьеи Тгр СНп Ьеи Азр Ьеи Зег
130 135 140
Рго О1у Суз
145
(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ 8ЕО ГО N0:7: (ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 1150 базови двойки (B) ВИД: нуклеинова киселина (С) ВЕРИЖНОСТ : двойна (О) ТОПОЛОГИЯ: линейна (и) ВИД НА МОЛЕКУЛАТА :с ДНК (ΐχ) СВОЙСТВА:
(A) ИМЕ / КЛЮЧ : миск - свойство (B) РАЗПОЛОЖЕНИЕ: 4 (ϋ) ДРУГА ИНФОРМАЦИЯ : / Забел: = Ме: = АТС (м) ОПИСАНИЕ НА: 5Б0 Ю N0:7:
САТАТССААС ССАААТСТТС ТСАСААААСТ САСАСАТОСС САССОТСССС АССАССГСАА 60
СТССТООООО ОАССОТСАСТ СТТССГСТТС СССССААААС ССААОСАСАС ССТСАТОАТС 120
ТСССООАССС СГОАООТСАС АТОСОТООТО ОТООАССТОА ОСС АСО ААО А СССГО АООТС 180
ААОТТСААСТ ООТАСОТООА СООСОТООАО ОТОСАТААТО ССААСАС ААА ССССССССАС 240 САССАОТАСА АСАОСАСОТ А СССТОТООТС АОСОТССГСА ССОТССТОСА ССАООАСТОО 300 СТОААТООСА АСОАСТАСАА ОТОСААССТС ТССААСАААО СССГСССАОС ССССАТССАО 360
ААААССАТСТ ССАААСССАА АОСССАСССС СОАОААССАС АООТОТАСАС ССТССССССА 420 ТССССССАТС АССТСАССАА СААССАОСТС АСССТСАССТ ОССГООТСАА АООСТТСТАТ 480 СССАСССАСА ТСОССОТООА ОТСОСАСАСС ААТССССАСС СССАСААСАА СГАСААОАСС $40
АСОССГСССО ТОСГООАСТС СОАСООСТСС ТТСГТССТСГ АСАОСААОСТ САССОТООАС 600
ААОАОСАООТ ООСАССАСОО ОААСОТСГТС ТСАТОСГССО ТОАТОСАТОА ООСГСТОСАС 660
ААССАСГАСА СОСАОААОАО ССТСГСССГС ТСГССОООТА ААСТАССОАТ ССАОАААОТТ 720
САСОАСОАСА ССААААССТТ ААТТААААСС АТСОТТАСОС ОТАТСААСОА САТСАСТСАС 780
АСССАОТСОО ТСАОСТСТАА АСАОАААСТТ АСАООССТОО АСГТСАТССС ООС-ТСТОСАС 840
ССОАТССГОА ССГТОТССАА ААТОСАССО АСССГООСГО ТАТАССАОСА ОАТСГТААСС 900
ТССАТОСССТ СССОТААСОТ ТАТССАОАТС ТСГААСОАСС ТСОАОААССГ ТСОССАССТС 960
СТОСАСОТОС ТООСАТТСГС САААТССГОС САССТОССАТ ОООСГТСАОО ТСТТОАОАСТ 1020
СГООАСГСГС ТООССООООТ ССГООААОСА ТССССТТ АС А ОС АССО ААСТ ТС-ТГОСТСТО 1080
ТСССОТСГОС АОСОТТСССТ ТСАООАСАТО СТТТООСАОС ТООАССТОТС ТССССОТТСТ 1140
ТААТССАТСС 1150
2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА 5ЕО Ю N0:8:
(Ϊ) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 115<о базови единици (B) ВИД: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ : двойна (и) 'ПЛЮЛО! ИЯ: линейна (и) ВИД НА МОЛЕКУЛАТА: сДНК (м) ОПИСАНИЕ НА: 8Е0 ГО N0:8 :
ОТАТАССТТС ССТТТАСААС АСТСТТТТСА СТСТСТАССС СТСССАСССС ТССТССАСТТ· 60
САССАССССС СТСССАСТСА СААССАСААС СССССТТТТС ССТТССТСТС ОСАСТАСТАС 120
АОСОССТССС САСТССАСТС ТАСССАССАС САССТОСАСТ СССТССТТСТ СОСАСТССАС 180
ТТСААСТТСА ССАТССАССТ СССССАССТС САССТАТТАС ССТТСТСТТТ СОССССССТС 240
СТССТСАТСТ ТСТССТССАТ СССАСАССАС ТСССАССАСТ СССАССАССТ ССТССТСАСС 300
СХСТТЛСССТ ТССТСАТСТТ САССТТССАС АССТТСТТТС СССАСССТСС ССОСТАССТС 360
ТТТТССТАСА СС7ТТСССТТ тсссстсссе сстсттсстс ТССАСАТСТС ССАССССССТ ' 420
АОСССССТАС ТССАСТССТТ СТТССТССАС ТСССАСТССА СССАССАСТТ ТСССААСАТА 480
соотссстст АСССССАССТ САСССТСТСС ТТАССССТСС СССТСТТСТТ САТСТТСТСС 540
ТССССАСССС АССАССТСАС ССТССССАСС ААСААССАСА ТСТССТТССА СТСССАССТС 600
ТТСТССТССА ссстсстссс СТТССАСААС АСТАССАССС АСТАССТАСТ СССАОЛССТО 660
ТТССТСАТСТ есстсттстс ОСАСАСССАС АСАСССССАТ ТТСАТОССТА ССТСТТТСАА 720
стсстостст ССТТТТССАА ТТААТТТТСС ТАССААТССС САТАСТТССТ СТАСТСАСТС 780
ТССОТСАССС АСТССАСАТТ ТОТСТТТСАА ТСТССССАСС ТСААОТАССС СССАОЛССТО 840
СССТАОСАСТ ССААСАССТТ ТТАССТССТС ТСССАСССАС АТАТССТССТ СТАСААТТСС 900
АССТАССССА ССССАТТССА АТАССТСТАС АСАТТССТСС АССТСТТССА АССССТССАС 960
СЛССТССАСС АСССТААСАС СТТТАССАСС СТОСАСССТА ССССААСТСС АСААСТСТСА 1020
САССТСАСАС АССССССССА ССАССТТССТ АССССААТСТ ССТСССТТСА АСААССАСАС 1080
АССССАСАСС ТСССААСССА АСТССТСТАС САААСССТСС АССТССАСАО АСССССААСА 1140
АТТАССТАСС 1150
(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА 8ЕОГО N0:9:
(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА (A) ДЪЛЖИНА: 379 аминокиселини (B) ВИД: аминокиселина (C) УСУКАНОСТ: неизвестна (ϋ) ТОПОЛОГИЯ: неизвестна (и) ВИД НА МОЛЕКУЛАТА: протеин (ίχ) СВОЙСТВА:
(А) ИМЕ/КЛЮЧ: протеин (3) РАЗПОЛОЖЕНИЕ:
(ϋ) ДРУГА ИНФОРМАЦИЯ: /забележка » Ме1 (АТО) Започва в -1 (χί) ОПИСАНИЕ НА: 8Е0 ГО N0:9:
Мее С1и Рго Ьуз 5ег Суз Азр Ьуз ТЬг Н1з Суз Рго Рго Суз Рго
1 5 10 15
А1а Рго С1и Ьви Ьви С1у С1у Рго 5ег Уа1 РЬ· Ьеи РЬ· Рго Рго Ьуз
20 25 30
Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Хеь Х1е ЗвГ Агд ТЬг Рго О1и Уа1 Тпг Суз ν·ι
35 40 45
ν·ι ν·ι Азр Уа1 5ег Н1з С1и Азр Рго С1и Уа1 Ьуз РЬ· Азп Тгр Туг
50 55 60
ν·ι Лзр С1у Уа1 С1и Уа1 Ηίβ Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и С1и
65 70 75 80
С1п
Туг Азп
Зег
ТНг
Туг
Агд
Уа1
Уа1
Зег νβΐ
Ьеи
ТНГ
Уа1
Ьеи
Нхз
01η
Азр Тгр
Ьеи
Азп
С1у
Ьуз
С1и
Туг
Ьуз
Суз
Ьуз νβΐ
Зег
АЗП
Ьуз
100
105
110
А1а
Ьеи Рго
А1а
Рго
11е
С1и
Ьуз
ТНг
Не
Зег
Ьуз
А1а
Ьуз
С1у
С1п
115
120
125
Рго
Агд С1и
Рго
С1п
Уа1
Туг
ТНг
Ьеи
РГО
Рго
Зег
Агд
Азр
01и
Ьеи
130
135
140
ТНг
Ьуз Азп
С1п
Уа1
Зег.
Ьеи
ТНг
Суз
Ьеи
Уа1
Ьуз
С1у
РНе
Туг
Рго
145
150
155
160
5ег
Азр 11е
А1а
Уа1
С1и
Тгр
С1и

Claims (5)

  1. Зег
    АЗП
    01у
    С1п
    Рго
    01и
    АЗП
    АЗП
    165
    170
    175
    Туг
    Ьуз ТНг
    ТНг
    Рго ?го
    Уа1
    Ьеи
    Азр
    Зег
    Азр
    С1у
    Зег
    РНе
    РНе
    Ьеи
    180
    185
    190
    Туг
    Зег Ьуз
    Ьеи ти ·*
    Уа1
    Азр
    Ьуз
    Зег
    Агд
    Тгр
    С1п
    01п
    С1у
    Азп
    Уа1
    195
    200
    205
    РНе
    5ег Суз
    Зег
    Уа1 мес
    ΚΪ8
    С1и
    А1а
    Ьеи
    Нхз
    АЗП
    Ηίβ
    Туг
    ТНг
    С1п
    210
    215
    220
    Ьуз
    5ег Ьеи
    Зег
    Ьеи
    Зег
    РГО
    С1у
    Ьуз νβΐ
    Рго
    Ие
    С1п
    Ьуз
    Уах
    С1п
    225
    230
    235
    240
    Азр
    Азр ТНг
    Ьуз
    ТНг
    Ьеи
    Не
    Ьуз
    ТНг
    Ие
    Уа1
    ТНг
    Агд
    Не
    АЗП
    Азр
    245
    250
    255
    Не
    Зег Нхз
    ТНг · -¾
    Зег
    Уа1
    Зег
    Зег
    Ьуз π
    ьуз \'а1
    ТНг
    С1у
    Ьеи
    260
    265
    270
    Азр
    РНе Не
    Рго
    01·/
    Ьеи
    ΗΪ3
    Рго
    Не
    Ьеи
    ТНлг
    Ьеи
    Зег
    Ьуз
    Мес
    Азр
    ‘275
    280
    285
    С1п
    ТНг Ьеи
    А1а
    Уад
    Туг
    С1п
    С1п
    Не
    Ьеи
    ТНг
    Зег
    Мес
    РГО
    Зег
    Агд
    290
    295
    300
    Азп νβΐ Не
    С1п
    Не
    Зег
    Азп
    Азр
    Ьеи
    О1и
    Азп
    Ьеи
    Агд
    Азр
    Ьеи
    Ьеи
    305
    310
    315
    320
    Н1з
    Уа1 Ьеи
    А1а
    РНе
    Зег
    Ьуз
    Зег
    Суз
    ΗΪ5
    Ьеи
    Рго
    Тгр
    А1а
    Зег
    С1у
    325
    330
    335
    Ьеи
    С1и ТНг
    Ьеи
    Азр
    Зег
    Ьеи
    О1у
    С1у νβΐ
    Ьеи
    С1и
    А1а
    Зег
    С1у
    Туг
    340
    345
    350
    Зег
    ТНг С1и
    Уа1
    Уа1
    А1а
    Ьеи
    Зег
    Агд
    Ьеи
    С1п
    С1у
    Зег
    Ьеи
    О1п
    Азр
    355
    360
    365
    Мес
    Ьеи Тгр
    С1п
    Ьеи
    Азр
    Ьеи
    Зег
    Рго
    С1у
    Суз
    370 375 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА: 5ЕСГО N0:10:
    (ί) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
    (A) ДЪЛЖИНА: 1150 базови двойки (B) ВИД: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ : двойна (ϋ) ТОПОЛОГИЯ :линейна (и) ВИД НА МОЛЕКУЛАТА: с ДНК (ΐχ) СВОЙСТВА (A) ИМЕ/ КЛЮЧ : миск - свойства (B) РАЗПОЛОЖЕНИЕ: 4 (ϋ) ДРУГА ИНФОРМАЦИЯ: /Забел. = Μεΐ = АТС (XI) ОПИСАНИЕ НА: 8Е0 ГО N0:10:
    САТАТССААС
    СААААТСТСС
    ТСАСААААСТ
    САСАСАТСТС
    САССТТСТСС
    АССТССССАА стсстссссс
    СТССТТСАСТ
    СТТССТСТТС
    СССССААААС
    ССААССАСАС
    ССТСАТСАТС
    120
    ТСССССАССС
    СТСАССТСАС
    АТСССТССТС
    СТСОАССТСА
    СССАССААСА
    СССТСАССТС
    180
    ААСТТСААСТ
    ССТАССТССА
    СССССТССАС
    СТССАТААТС
    ССААСАСААА
    ССССССССАС
    240
    САССАСТАСА
    АСАССАССТА ссстстсстс
    АСССТССТСА
    СССТССТССА
    ССАССАСТСС
    300
    СТОААТСССА
    АОСАСТАСАА
    СТОСААССТС
    ТССААСАААС
    СССТСССАСС
    ССССА7ССАС
    360
    ААААССАТСТ
    ССАААСССАА
    АС-СССАСССС
    СОАСААССАС
    АССТСТАСАС
    СС7ССССССА
    420
    ТСССОССАТС
    АОСТСАССАА
    СААССАССТС
    АСССТСАССТ
    СССТССТСАА
    АСССТТСТАТ
    480
    СССАСССАСА
    ТССССОТОСА
    СТСССАСАСС
    ААТССССАСС
    СССАСААСАА
    СТАСААСАСС
    540
    АСОССТСССС
    ТССТССАСТС
    ССАССССТСС
    ТТСТТССТС?
    АСАССААСС7
    САСССТССАС
    600
    ААСАССАССТ
    СССАССАССС
    СААССТСТТС
    ТСАТССТССС
    ТСАТССАТСА
    СССТСТССАС
    660
    ААССАСТАСА
    СССАСААСАС
    ССТСТСССТС
    ТСТСССССТА
    ААСТАСССАТ
    ССАСАААСТТ
    720
    САССАССАСА
    ССААААССТТ
    ААТТААААСС атссттассс
    СТАТСААССА
    САТСАСТСАС
    780
    АСССАСТССС
    ТСАССТСТАА
    АСАСАААСТТ
    АСАССССТОС
    АСТТСАТССС
    СССТСТССАС
    840
    СССАТССТСА
    ССТТОТССАА
    ААТССАССАС
    АСССТОССТС
    7А7АССАССА
    САТСТТААСС
    900
    7ССА70ССС7 СССОТААССТ ТАТССАОАТС ТСТААСОАСС ТССАСААССТ ТССССАССТО 960 СТОСАССТСС ТСССАТТСТС САААТССТСС САССТСССАТ ССССТТСАСС ТСТТСАСАСТ 1020 СТССАСТСТС.ТСОССССОСТ ССТССААССА ТССССТТАСА ССАСССААСТ ТСТТСС7СТС 1080 ТССССТСТСС АСССТТСССТ ТСАССАСАТС СТТТСОСАСС ТССАССТСТС ТССССС-7ТСТ 1140 ТААТОСАТСС 1150 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ 5Е0 ГО N0:11:
    (ϊ) ХАР АКТЕРИСГИед ЦА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
    (A) ДЪЛЖИНА: 1150 базови двойни (B) ВИД: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ : двойна (ϋ) ТОПОЛОГИЯ: линейна (и) ВИД НА МОЛЕКУЛАТА: с! ДНК (χΐ) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: $Е0 ГО N0:11:
    СТАТАССТТС СТТТТАСАСС
    АСТСТТТТСА
    СТСТСТАСАС
    ОТССААСАСС
    ССАСС-ССТТ
    САССАССССС САССААСТСА
    СААССАСААС сссссттттс
    ССТТССТСТС
    ССАСТАСТАС
    120
    АСССССТССС САСТССАСТС
    ТАСССАССАС
    САССТССАСТ ссстссттст
    СССАСТССАС
    180
    ТТСААСТТСА ССАТССАССТ
    СССССАССТС
    САССТАТТАС
    ССТТСТС.ТТТ сссссссстс
    240
    СТССТСАТСТ ТСТССТССАТ
    СССАСАССАС
    ТСССАССАСТ
    СССАССАССТ сстсстсасс
    300
    САСТТАСССТ ТССТСАТ.СТТ
    САСОТТССАС
    АССТТСТТТС
    СССАСССТСС
    СССССАССТС
    360
    ТТТТССТАСА ОСТТТСССТТ тсссотсссс сстсттсстс
    ТССАСАТСТС
    ССАССССССТ
    420
    АССССССТАС ТССАСТССТТ
    СТТССТССАС
    ТСССАСТССА
    СССАССАСТТ
    ТСССААСАТА
    480
    СССТСССТОТ АССОССАССТ
    САСССТСТСС
    ТТАССССТСС ссстсттстт
    САТСТТСТСС
    540
    ТССССАСССС АССАССТСАС
    ССТОСССАСС
    ААСААССАСА
    ТСТССТТССА
    СТСССАССТС
    600
    ТТСТССТССА СССТССТССС .СТТССАСААС
    АСТАССАССС
    АСТАССТАСТ
    СССАСАССТС
    660
    ТТССТСАТСТ ссстсттстс
    ССАСАСССАС
    АСАСССССАТ
    ТТСАТСССТА
    ОСТСТТТСАА
    720
    СТССТССТСТ ССТТТТССЛА
    ТТААТТТТСС
    ТАССАЛТССС
    САТАСТТССТ
    СТАСТСАСТС
    780
    ТСССТСАССС АСТССАОАТТ
    ТСТСТТТСАА
    ТСТССССАСС
    ТСААСТАССС
    СССАСАССТС
    840
    СССТАССАСТ ССААСАССТТ
    ТТАССТССТС
    ТСОСАСССАС
    АТАТССТССТ
    СТАСААТТОС
    900
    АССТАССССА ССССАТТССА АТАССТСТАС
    АСАТТОСТСС
    АССТСТТССА
    АССССТССАС
    960
    САССТССАСС. АСССТААСАС
    СТТТАССАСС
    СТССАСССТА
    ССССААСТСС
    АСААСТСТСА
    1020
    САССТСАСАС АССССССССА
    ССАССТТССТ
    АССССААТСТ
    ССТСССТТСА
    АСААССАСАС
    1080
    АССССДСАСС ТСССААСССА
    АТТАССТАОС
    АСТССТСТАС
    САААСССТСС
    АССТССАСАС асссссааса
    1140
    1150
    64282 местен фенил) (% 6-алкилтио, или (в даден случай заместен фенил) С, 6-алкокси;
    където терминът “в даден случай заместен фенил” означава фенил, в даден случай заместен с един или повече от следните заместители: а) С, 6-алкилова група, Ь) С[ алкокси група, с) фенокси група, ά) хидрокси група, фенил-С, 6-алкил, ί) халоген, β) група с формула ΝΚ10ΚΗ, в която К)0 и К|( означават независимо един от друг водород, С, алкил, фенил, С, в-алканоил, (С(^-алкокси) карбонил, 5-хидрокси-1 -фенил-3-пиразолил или бензоил, който в даден случай е заместен с С, -алкил, С, -алкокси или халоген, Н) група с формула -СОК9, в която К9 означава хидрокси група, 6-алкокси, фенокси, или група с формула ΝΚΙ0Κ|Ρ в която К|0 и Кн имат посочените по-горе значения, ί) фталимидо група, в даден случай заместена с халоген или ΐ) фениловият пръстен е кондензиран с бензен до образуване на нафтилов пръстен.
    3. Съединения съгласно претенции 1 и 2, в които:
    1% е С3 6-алкилова група, С3 8-циклоалкилова група или С5 7-циклоалкенилова група, при което алкиловата, циклоалкиловата и циклоалкениловата групи са в даден случай заместени с една или повече хидрокси групи, при условие, че хидрокси групата не е разположена при въглеродния атом, присъединен към азота.
    4. Съединения съгласно претенция 1, в които К1 е изопропил, трет.бутил, пентил, 2хидроксиетил, циклопентил, неопентил, 2хидроксициклопентил, 4-хидроксициклопент2-енил, 3-хидроксициклопентил, 2,3,4-трихидроксициклопентил, 1,3-дихидроксипроп-2-ил или 2,3-дихидроксипропил.
    5. Съединения съгласно претенции от 1 до 4, в които К2 е водород или халоген.
    6. Съединения съгласно претенции от 1 до 5, в които К2 е водород или хлор.
    7. Съединения съгласно претенции от 1 до 6, в които
    К3 означава група с формула (а) в която фениловият пръстен е в даден случай допълнително заместен и
    А означава Ο, ΝΗ8Ο2, ИНСО или 8(О)р, в която р е 0, 1 или 2 и К5 означава в даден случай заместен фенил.
    8. Съединения съгласно претенции от 1 до 7, в които А означава ΝΗ8Ο2.
    9. Съединения съгласно претенции от 1 до 8, в които А означава 1ЧНС0.
    10. Съединения съгласно претенции от 1 до 9, в които А означава О или 8.
    11. Съединения съгласно претенции от 1 до 10, в които А означава О.
    12. Съединения съгласно претенции от 1 до 11, в които К3 означава 2-феноксифенил, 3-феноксифенил, 4-феноксифенил, 4(фенилтио) фенил, 4- (4-метоксифенокси)фенил, 4-(фенилсулфинил)фенил, 4-(фенилсулфонил) фенил, 4-(4-хидроксифенокси)-фенил,
    4- (бензенсулфонамидо)фенил, 4- (бензамидо)фенил, 4-(4-ацетамидофенокси)фенил, 4(2-нитрофенокси)фенил, 4-(4-аминофенокси)фенил, 4-(3-аминофенокси)фенил, 4-(2аминофенокси)-фенил, 4-(3-ацетамидофенокси)фенил, 4- [4- (Ν-метилацетамидо) -фенокси] фенил, 4-(2-ацетамидофенокси)фенил,
    4- (2-ацетамидо-4-нитрофенокси) фенил ,4-(3карбокси-4-нитрофенокси)фенил, 4-(2-карбокси-4-нитрофенокси)фенил, 4-(4-трифлуорометил-2-нитрофенокси)фенил, 4-бензамидо-3-метоксифенил, 4-бензамидо-З-хидроксифенил, 4-бензенсулфонамидо-З-метоксифенил, 4-бензенсулфонамидо-З-хидроксифенил,
    3-хидрокси-4-(4-трет.бутилбензенсулфонамидо)фенил, 4-(2-хидроксифенокси)фенил, 4(4-хлоробензамидо) -3-хидроксифенил, 4- (3метокси-4-нитрофенокси)фенил, 4-(4-метоксикарбонил-2-нитрофенокси)фенил, 4-(4карбокси-2-нитрофенокси)фенил, 4-(5-хлоро2-нитрофенокси)фенил или 4-[4-нитро-2(2,2-диметилпропионамидо)фенокси]фенил.
    13. Съединения съгласно претенции 1 или 2, в които
    К] означава метил, етил, пропил, изопропил, бутил, трет. бутил, бензил или 2хидроксиетил,
    К2 е водород, метил, халоген, хидрокси или фенил и
    К3 означава 2-феноксифенил, 3-феноксифенил, 4-феноксифенил, 4-(4-хлоро-Ифталимидо)-3-толил, 3-хлоро-4-(3-хлорофенокси)фенил, 4-(4-метиламинофениламино)фенил, 4- (4-метиламинофениламино) -2метоксифенил, 4-(4-метиламинобензил)фе35
    64282 нил, 4-анилино-2-метоксифенил, 3-хидрокси4-(4-метилбензамидо)фенил, 3-хидрокси-4-(2метоксибензамидо) фенил, 4-(4-хлоробензамидо)-3-хидроксифенил, З-хидрокси-4-(2-нафталенсулфонамидо)фенил, З-хидрокси-4- [4(трет.бутил)бензенсулфонамидо] -фенил, 4[Ν- (5-хидрокси-1 -фенилпиразол-3-ил) амино] фенил или 4-феноксикарбониламино-Зхидроксифенил.
    14. Съединения съгласно претенция 1, в които съединения с формула I са представени с формула 1Ь и техни фармацевтично приемливи соли, в която
    Е( означава водород, С, 6-алкилова група, С3 8-циклоалкилова група, С5 7-циклоалкенилова група, или (в даден случай заместен фенил) С( 6-алкил, при което алкиловата, циклоалкиловата и циклоалкениловата групи са в даден случай заместени с една или повече групи с формула ОЕД, в която КА означава водород или С) 6-алкилова група, при условие, че групата с формула ОЕА не е разположена при въглеродния атом, присъединен към азота;
    Е2 означава водород или халоген;
    К означава, С, -алкил, С, .-алкокси група, халоген или хидрокси;
    Е е С, .-алкил, С, .-алкокси, халоген, хидрокси, нитро или група с формула ΝΕ10ΕΗ, в която Е10 и Кн означават независимо един от друг водород, С[ 6-алкил, фенил, С( 6-алканоил, (С16-алкокси) карбонил или Еу е група с формула -СОЕ9, в която Е9 означава хидрокси група, С2 6-алкокси, фенокси, или група с формула ΝΕ10ΕΗ, в която К10 и Ен имат посочените по-горе значения и т и η независимо един от друг означават 0, 1 или 2.
    15. Съединения съгласно претенция 14, в които
    Е! означава С[ 6-алкил, С3 8-циклоалкилова група или С5 7-циклоалкенилова група, при което алкиловата, циклоалкиловата и циклоалкениловата групи са в даден случай заместени с една или повече групи с формула ОЕА, в която Ед означава водород или С| 6-алкилова група, при условие, че групата с формула ОЕа не е разположена при въглеродния атом, присъединен към азота.
    16. Съединения съгласно претенции 14 или 15, в които
    Е, е изопропил, трет.бутил, 2-хидроксиетил, циклопентил, неопентил, 2-хидроксициклопентил, 4-хидроксициклопент-2енил, 3-хидроксициклопентил, 2,3,4-трихидроксициклопентил, 1,3-дихидроксипроп-2-ил или 2,3-дихидроксипропил.
    17. Съединения съгласно претенции от 14 до 16, в които Е2 е водород или хлор.
    18. Съединения съгласно претенции от 14 до 17, в които Εχ е хидрокси или С алкокси група.
    19. Съединения съгласно претенции от 14 до 18, в които Ку е С, 4-алкил, С, 4-алкокси, нитро, ацетамидо, амино, Ν-метилацетамидо, карбокси, хидрокси или халоген.
    20. Съединения съгласно претенции от 14 до 19, в които т е 0 или 1.
    21. Съединения съгласно претенция 20, в които т е 0.
    22. Съединения съгласно претенции от 14 до 21, в които η е 0 или 1.
    23. Съединения съгласно претенции от 14 до 22, в които η е 0 или 1 и К е хидрокси, амино или ацетамидо група.
    24. Съединение, избрано от:
    7-трет.бутил-5- (4-феноксифенил) -7Нпироло [2,З-д] пиримидин-4-иламин
    7-трет.бутил-6-хлоро-5- (4-феноксифенил) -7Н-пироло [2,З-д] -пиримидин-4-иламин
    7-изопропил-5-(4-феноксифенил)-7Нпироло [2,З-д] пиримидин-4-иламин
    7-циклопентил-5- (4-феноксифенил) 7Н-пироло [2,З-д] пиримидин-4-иламин
    5- (4-бифенилил) -7-трет.бутил-7Н-пироло [2,З-д] -пиримидин-4-иламин
    7-неопентил-5- (4-феноксифенил) -7Нпироло[2,3-д] пиримидин-4-иламин
    7-трет.бутил-5-[4-(фенилтио)фенил] 7Н-пироло [2,З-д] пиримидин-4-иламин
    7-трет.бутил-5- [4- (4-метоксифенокси)фенил] -7Н-пироло [2,З-д] пиримидин-4иламин
    64282
    7-трет.бутил-5 - [4 - (фенилсулфиния) фенил] -7Н-пироло [2,3-ά] -пиримидин-4иламин
    7-трет.бутил-5- [4-(фенилсулфонил) фенил] -7Н-пироло [2,3-ά] -пиримидин-4-иламин
    4- [4-(4-амино-7-трет.бутил-7Н-пироло [2,3-ά] пиримидин-5-ил) -фенокси] фенол
    1Ч-[4-(4-амино-7-изопропил-7Н-пироло [2,3-ά] пиримидин-5-ил) -фенил] бензенсулфонамид
    М-[4-(4-амино-7-изопропил-7Н-пироло [2,3-ά] пиримидин-5-ил) -фенил] бензенамид
    Г4-{4-[4-(4-амино-7-трет.бутил-7Н-пироло [2,3-ά] пиримидин-5-ил)фенокси] фенил}ацетамид
    7-изопропил-5- [4- (2-нитрофенокси) фенил] -7Н-пироло [2,3-ά] пиримидин-4-иламин
    5- [4- (4-аминофенокси) фенил] - 7Нтрет,бутил-7Н-пироло [2,3-ά] пиримидин-4иламин
    5-[4-(3-аминофенокси)фенил] -7Нтрет.бутил-7Н-пироло [2,3-ά] пиримидин-4иламин
    5- [4-(2-аминофенокси)фенил] -7Нтрет.бутил-7Н-пироло [2,3-ά] пиримидин-4иламин
    М-{3-[4-(4-амино-7-трет.бутил-7Н-пироло [2,3-ά] пиримидин-5-ил)фенокси] фенил}ацетамид
    N-{4- [4- (4-амино-7 -трет.бутил-7Н-пироло [2,3-ά] пиримидин-5-ил)фенокси] фенил}Ν-метилацетамид
    N-{2- [4-(4-амино-7-изопропил-7Н-пироло [2,3-ά] пиримидин-5-ил)фенокси] фенил}ацетамид
    1Ч-{2-[4-(4-амино-7-изопропил-7Н-пироло [2,3-ά] пиримидин-5-ил)фенокси] -5нитрофенил [ацетамид
    5- [4-(4-амино-7-изопропил-7Н-пироло [2,3-ά] пиримидин-5-ил) -фенокси] -2нитробензоена киселина
  2. 2- [4- (4-амино-7-изопропил-7Н-пироло [2,3-ά] пиримидин-5-ил) -фенокси] -5нитробензоена киселина
    2- [4-амино-5- (4-феноксифенил) -7Нпироло [2,3-ά] пиримидин-7-ил) етанол
    2- [4-амино-5- (4-феноксифенил) -7Нпироло [2,3-ά] пиримидин-7-ил)циклопентанол
    4-[4-амино-5-(4-феноксифенил)-7Нпироло [2,3-ά] пиримидин-7-ил)циклопент-2енол
    6- хлоро-7-циклопентил-5- (4-феноксифенил) -7Н-пироло [2,3-ά] пиримидин-4-иламин
    5- (4-феноксифенил) -7- (2-фенил-1,3диоксан-5-ил) -7Н-пироло- [2,3-ά] пиримидин4-ил-амин
  3. 3- [4-амино-5-(4-феноксифенил)-7Нпироло [2,3-ά] пиримидин-7-ил ] циклопентанол
  4. 4- [4-амино-5-(4-феноксифенил)-7Нпироло [2,3-ά] пиримидин-7-ил] циклопентан1,2,3-триол
    7- циклопентил-5-(2-феноксифенил)7Н-пироло [2,3-ά] пиримидин-4-иламин
    7-циклопентил-5-(3-феноксифенил)7Н-пироло [2,3-ά] пиримидин-4-иламин
    2- [4-амино-5- (4-феноксифенил) -7Нпироло[2,3-б] пиримидин-7-ил] пропан-1,3диол
    3- [4-амино-5- (4-феноксифенил) -7Нпироло [2,3-ά] пиримидин-7-ил] пропан-1,2диол
    М-[4-(4-амино-7-циклопентил-7Н-пироло [2,3-ά] пиримидин-5-ил) -2-метоксифенил]бензамид
    Ν- [4-(4-амино-7-циклопентил-7Н-пироло [2,3-ά] пиримидин-5-ил)-2-метоксифенил]бензамид
    Ν- [4- (4-амино-7-циклопентил-7Н-пироло [2,3-ά] пиримидин-5-ил) -2-метоксифенил] бензенсулфонамид
    Ν- [4-(4-амино-7-циклопентил-7Н-пироло [2,3-ά] пиримидин-5-ил)-2-хидроксифенил] бензенсулфонамид
    Ν- [4-(4-амино-7-циклопентил-7Н-пироло [2,3-ά] пиримидин-5-ил) -2-хидроксифенил] -4-трет.бутилбензенсулфонамид
    7-циклопентил-5- [4- (2-метокси) феноксифенил] пироло [2,3-ά] пиримидин-4-иламин
    2- [4- (4-амино-7-циклопентил-7Н-пироло [2,3-ά] пиримидин-5-ил) -фенокси] фенол
    7-изопропил-5- [4- (З-метокси-4-нитрофенокси)фенил] -7Н-пироло [2,3-ά] пиримидин-4-иламин метил 4- [4- (4-амино-7-изопропил-7Нпироло [2,3-ά] пиримидин-5-ил)фенокси] -3нитробензоат
    4- [4- (4-амино-7Н-пироло [2,3-ά] пиримидин-5-ил)фенокси] фенол
    Ν - [4- (4-амино-7-циклопентил-7Нпироло [2,3-ά] пиримидин-5-ил) -2-хидроксифенил] -4-трет.бутилбензенсулфонамид
    64282
    7-циклопентил-5-[4-(2-метокси)феноксифенил] -7Н-пироло [2,3-ά] пиримидин-4-иламин
    Ν- [4- (4-амино-7-циклопентил-7Н-пироло [2,3-ά] пиримидин-5-ил) -2-хидроксифе- 5 нил] -4-хлоробензамид
  5. 5-(4-феноксифенил)-7Н-пироло [2,3ά] пиримидин-4-иламин
    5- [4- (5-хлоро-2-нитрофенокси) фенил] 7-изопропил-7Н-пироло [2,3-ά] пиримидин-4- |θ иламин
    М-{2-[4-(4-амино-7-изопропил-7Н-пироло [2,3-ά] пиримидин-5-ил)фенокси] -5нитрофенил}-2,2-диметилпропионамид и негови фармацевтично приемливи соли.
    25. Фармацевтичен състав, характеризиращ се с това, че съдържа терапевтично ефективно количество от съединение с формула I или негова сол, съгласно всяка една от претенции от 1 до 24, заедно с фармацевтично приемлив разредител или носител.
    26. Съединение с формула I, съгласно всяка една от претенции от 1 до 24, за използване като медикамент.
    27. Съединение с формула 1, съгласно 25 всяка една от претенции от 1 до 24, за използване при лечение на неопластични пролиферативни заболявания и заболявания на имунната система.
    28. Използване на съединения с фор- 30 мула I, съгласно всяка една от претенции от до 24, за получаване на медикамент за лечение на пролиферативни заболявания и/или заболявания на имунната система.
    29. Метод за получаване на съедине- 35 ние с формула 1, характеризиращ се с това, че
    а) съединение с формула II в която Кр К2 и К3 имат описаните по-горе значения, кондензира с формамид при температура в границите от 50 до 250С, в даден случай в присъствие на катализатор, или
    Ь) съединение с формула V в която Кр К2 и К3 имат описаните по-горе значения и Υ означава отцепваща се група, взаимодейства с амоняк или амониева сол, при температура в граници от 15-250 С, или
    с) съединение с формула VIII в която К, и К2 имат описаните погоре значения и X означава халоген, взаимодейства със съединение с формула Κ,ΟΗ до получаване на съединение с формула I, в която К3 означава групата АК5, в която А означава О, или
    ά) съединение с формула IX
    IX в която К[ и К2 имат описаните погоре значения, взаимодейства със съединение с формула К5Х, в което X означава халоген, до получаване на съединение с формула I, в която К3 означава групата АК3, в която А означава О.
    Формула II
    Издание на Патентното ведомство на Република България 1113 София, бул. ”Д-р Γ. М. Димитров” 52-Б
    Експерт: Св. Йорданова Редактор: Р. Георгиева
    Пор. № 42348
    Тираж: 40 СР
BG103522A 1996-12-20 1999-06-23 'ъ''ави на ов 'ля' про'...ин и м...'оди за 'яхно'о пол"-аван... BG64288B1 (bg)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US77097396A 1996-12-20 1996-12-20
PCT/US1997/023183 WO1998028427A1 (en) 1996-12-20 1997-12-11 Ob fusion protein compositions and methods

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG103522A BG103522A (bg) 2000-03-31
BG64288B1 true BG64288B1 (bg) 2004-08-31

Family

ID=25090296

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG103522A BG64288B1 (bg) 1996-12-20 1999-06-23 'ъ''ави на ов 'ля' про'...ин и м...'оди за 'яхно'о пол"-аван...

Country Status (26)

Country Link
EP (2) EP1835030A1 (bg)
JP (2) JP4175668B2 (bg)
KR (1) KR100937550B1 (bg)
CN (1) CN1195858C (bg)
AR (2) AR009436A1 (bg)
AT (1) ATE351910T1 (bg)
AU (1) AU5606098A (bg)
BG (1) BG64288B1 (bg)
BR (1) BR9713755A (bg)
CA (1) CA2275183A1 (bg)
CZ (1) CZ298203B6 (bg)
DE (1) DE69737266T2 (bg)
DK (1) DK0954588T3 (bg)
EA (2) EA004790B1 (bg)
ES (1) ES2280083T3 (bg)
HK (1) HK1021388A1 (bg)
HU (1) HU227088B1 (bg)
IL (1) IL130396A (bg)
NO (2) NO324506B1 (bg)
NZ (1) NZ514145A (bg)
PL (1) PL194159B1 (bg)
PT (1) PT954588E (bg)
RS (1) RS49927B (bg)
SK (1) SK287578B6 (bg)
WO (1) WO1998028427A1 (bg)
ZA (1) ZA9711239B (bg)

Families Citing this family (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6936439B2 (en) 1995-11-22 2005-08-30 Amgen Inc. OB fusion protein compositions and methods
CA2358862A1 (en) * 1995-11-22 1997-05-29 Amgen Inc. Methods of increasing lean tissue mass using ob protein compositions
US20030040467A1 (en) 1998-06-15 2003-02-27 Mary Ann Pelleymounter Ig/ob fusions and uses thereof.
US6620413B1 (en) 1995-12-27 2003-09-16 Genentech, Inc. OB protein-polymer chimeras
US6541604B1 (en) 1996-01-08 2003-04-01 Genentech, Inc. Leptin receptor having a WSX motif
US7074397B1 (en) 1996-01-08 2006-07-11 Genentech, Inc. Method for enhancing proliferation or differentiation of a cell using ob protein
ATE223229T1 (de) * 1997-04-17 2002-09-15 Amgen Inc Zusammensetzungen aus konjugaten des stabilen, aktiven, menschlichen ob proteins mit der fc kette von immunoglobulinen und damit zusammenhängende verfahren
US20020019352A1 (en) * 1997-04-17 2002-02-14 David N. Brems Stable, active, human ob protein compositions and methods
JP4394279B2 (ja) 1998-03-09 2010-01-06 ジーランド ファーマ アクティーゼルスカブ 酵素加水分解に対する傾向が減少した薬理学的に活性なペプチド複合体
US6420339B1 (en) 1998-10-14 2002-07-16 Amgen Inc. Site-directed dual pegylation of proteins for improved bioactivity and biocompatibility
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US7488590B2 (en) 1998-10-23 2009-02-10 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
DE69934425T2 (de) 1998-10-23 2007-09-27 Amgen Inc., Thousand Oaks Thrombopoietin substitute
US8106098B2 (en) 1999-08-09 2012-01-31 The General Hospital Corporation Protein conjugates with a water-soluble biocompatible, biodegradable polymer
US6808902B1 (en) 1999-11-12 2004-10-26 Amgen Inc. Process for correction of a disulfide misfold in IL-1Ra Fc fusion molecules
EP1274730A2 (en) * 2000-04-21 2003-01-15 Amgen, Inc. Integrin/adhesion antagonists
US6677136B2 (en) 2000-05-03 2004-01-13 Amgen Inc. Glucagon antagonists
US20020090646A1 (en) * 2000-05-03 2002-07-11 Amgen Inc. Calcitonin-related molecules
EP1366455B1 (en) 2001-02-19 2008-07-02 MERCK PATENT GmbH Method for identification of t-cell epitopes and use for preparing molecules with reduced immunogenicity
WO2002079415A2 (en) 2001-03-30 2002-10-10 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
JP2002306163A (ja) * 2001-04-11 2002-10-22 Chemo Sero Therapeut Res Inst 大腸菌を宿主とする遺伝子組換えヒトトロンビンの調製方法
ATE475094T1 (de) 2001-10-22 2010-08-15 Amgen Inc Verwendung von leptin zur behandlung von lipoatrophie im menschen und verfahren zur bestimmmung einer prädisposition gegenüber der behandlung
ATE486842T1 (de) 2002-03-12 2010-11-15 Merck Sharp & Dohme Substituierte amide
US20030191056A1 (en) 2002-04-04 2003-10-09 Kenneth Walker Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins
JP3936673B2 (ja) * 2003-06-02 2007-06-27 国立大学法人群馬大学 Ｃｄ４７部分ペプチドと抗ｓｈｐｓ−１モノクロナール抗体
AU2005203962C1 (en) 2004-01-05 2012-11-08 Antisoma Research Limited Interleukin-12 targeted to oncofoetal fibronectin
US8076288B2 (en) 2004-02-11 2011-12-13 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Hybrid polypeptides having glucose lowering activity
CA2555894A1 (en) 2004-02-11 2005-08-25 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Pancreatic polypeptide family motifs and polypeptides comprising the same
MX2007000216A (es) 2004-07-08 2007-03-15 Amgen Inc Peptidos terapeuticos.
WO2006016276A2 (en) 2004-08-03 2006-02-16 Innate Pharma S.A. Therapeutic and diagnostic methods and compositions targeting 4ig-b7-h3 and its counterpart nk cell receptor
US20090156474A1 (en) 2004-11-01 2009-06-18 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating obesity and obesity related diseases and disorders
US8394765B2 (en) 2004-11-01 2013-03-12 Amylin Pharmaceuticals Llc Methods of treating obesity with two different anti-obesity agents
EA014647B1 (ru) * 2005-08-11 2010-12-30 Амилин Фармасьютикалз, Инк. Гибридные полипептиды с селектируемыми свойствами
US8008453B2 (en) 2005-08-12 2011-08-30 Amgen Inc. Modified Fc molecules
AU2006303440B2 (en) 2005-10-21 2011-09-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for the recombinant expression of a polypeptide
US20070179094A1 (en) 2006-01-31 2007-08-02 Bayer Schering Pharma Ag Modulation of MDL-1 activity for treatment of inflammatory disease
WO2009149379A2 (en) 2008-06-05 2009-12-10 Regents Of The University Of Michigan Use of leptin for the treatment of fatty liver diseases and conditions
AU2010238858A1 (en) 2009-04-22 2011-12-08 Merck Patent Gmbh Antibody fusion proteins with modified FcRn binding sites
EP2464377B1 (en) 2009-08-14 2016-07-27 The Government of the United States of America as represented by The Secretary of the Department of Health and Human Services Use of il-15 to increase thymic output and to treat lymphopenia
DK3241558T3 (da) 2010-09-28 2021-04-26 Aegerion Pharmaceuticals Inc Højopløselige leptiner
US20140256621A1 (en) 2011-07-08 2014-09-11 Astrazeneca Pharmaceuticals Lp Engineered poypeptides having enhanced duration of action and reduced immunogenicity
ES2942483T3 (es) 2011-10-05 2023-06-01 Oned Mat Inc Materiales activos de nanoestructuras de silicio para baterías de iones de litio y procesos, composiciones, componentes y dispositivos relacionados con los mismos
HUE040496T2 (hu) 2012-09-27 2019-03-28 Childrens Medical Ct Corp Vegyületek elhízás kezelésére és alkalmazási eljárásaik
HUE042196T2 (hu) 2013-11-26 2019-06-28 Childrens Medical Ct Corp Vegyületek elhízás kezelésére és alkalmazási eljárásaik
US20170209408A1 (en) 2014-04-03 2017-07-27 The Children's Medical Center Corporation Hsp90 inhibitors for the treatment of obesity and methods of use thereof
HRP20231076T1 (hr) 2016-09-12 2023-12-22 Amryt Pharmaceuticals Inc. Postupci detektiranja neutralizirajućih protutijela protiv leptina
CN110183530A (zh) * 2019-06-21 2019-08-30 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 瘦素免疫原、杂交瘤细胞、单克隆抗体、多克隆抗体及应用
CN112618698B (zh) * 2019-10-08 2021-10-08 北京东方百泰生物科技股份有限公司 一种人白细胞介素10-Fc融合蛋白的注射制剂

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
AU3382595A (en) * 1994-07-29 1996-03-04 Smithkline Beecham Corporation Novel compounds
US6309853B1 (en) * 1994-08-17 2001-10-30 The Rockfeller University Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof
JPH0870875A (ja) * 1994-09-05 1996-03-19 Tosoh Corp 組換えアルカリフォスファタ−ゼ融合タンパク質
GB9511935D0 (en) * 1995-06-13 1995-08-09 Smithkline Beecham Plc Novel compound
CA2358862A1 (en) * 1995-11-22 1997-05-29 Amgen Inc. Methods of increasing lean tissue mass using ob protein compositions
RU2178307C2 (ru) * 1995-12-27 2002-01-20 Джинентех Инк. Производные ов-протеина

Also Published As

Publication number Publication date
BG103522A (bg) 2000-03-31
HUP0000302A3 (en) 2005-12-28
EA004791B1 (ru) 2004-08-26
JP2008289487A (ja) 2008-12-04
DK0954588T3 (da) 2007-05-14
KR20000069617A (ko) 2000-11-25
CZ298203B6 (cs) 2007-07-18
SK287578B6 (sk) 2011-03-04
IL130396A0 (en) 2000-06-01
PL194159B1 (pl) 2007-05-31
CN1195858C (zh) 2005-04-06
EP0954588A1 (en) 1999-11-10
HUP0000302A2 (hu) 2000-06-28
NO992779D0 (no) 1999-06-08
CZ9902036A3 (cs) 2000-10-11
BR9713755A (pt) 2000-02-01
YU27999A (sh) 2000-10-30
KR100937550B1 (ko) 2010-01-19
DE69737266T2 (de) 2007-11-08
NO324506B1 (no) 2007-11-05
WO1998028427A1 (en) 1998-07-02
PT954588E (pt) 2007-03-30
HU227088B1 (en) 2010-06-28
DE69737266D1 (de) 2007-03-08
NO20071415L (no) 1999-08-19
CN1246154A (zh) 2000-03-01
AR059907A2 (es) 2008-05-07
CA2275183A1 (en) 1998-07-02
EP1835030A1 (en) 2007-09-19
EA200100216A1 (ru) 2001-08-27
HK1021388A1 (en) 2000-06-09
EA199900575A1 (ru) 2000-02-28
JP4175668B2 (ja) 2008-11-05
IL130396A (en) 2011-09-27
EP0954588B1 (en) 2007-01-17
NO992779L (no) 1999-08-19
EA004790B1 (ru) 2004-08-26
JP4659068B2 (ja) 2011-03-30
AU5606098A (en) 1998-07-17
ATE351910T1 (de) 2007-02-15
PL334242A1 (en) 2000-02-14
ES2280083T3 (es) 2007-09-01
AR009436A1 (es) 2000-04-12
SK77499A3 (en) 2001-04-09
NZ514145A (en) 2003-08-29
JP2001512417A (ja) 2001-08-21
NO325096B1 (no) 2008-02-04
RS49927B (sr) 2008-09-29
ZA9711239B (en) 1998-06-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BG64288B1 (bg) &#39;ъ&#39;&#39;ави на ов &#39;ля&#39; про&#39;...ин и м...&#39;оди за &#39;яхно&#39;о пол&#34;-аван...
US7112659B2 (en) OB fusion protein compositions and methods
JP4227325B2 (ja) Ｏｂ蛋白組成物を用いる非脂肪組織重増加方法
JP4854851B2 (ja) 改善された生物活性と生体適合性のためのタンパク質の部位特異的二重ポリエチレングリコール化
US7524940B2 (en) OB protein compositions and methods
JP4173913B2 (ja) Ｏｂタンパク質組成物を用いて血中脂質レベルを減少させ又は減少した血中脂質レベルを維持する方法
JP4086908B2 (ja) 安定かつ活性なヒトＯＢタンパク質と抗体Ｆｃ鎖とのコンジュゲートを含む組成物および方法
US7208577B2 (en) Methods of increasing lean tissue mass using OB protein compositions
JP4824663B2 (ja) 安定かつ活性なヒトＯＢタンパク質と抗体Ｆｃ鎖とのコンジュゲートを含む組成物および方法
CA2263826A1 (en) Methods of increasing sensitivity of an individual to ob protein by upregulating ob protein receptor
MXPA99001875A (en) Methods of increasing sensitivity of an individual to ob protein by upregulating ob protein receptor
AU2004202448A1 (en) OB Fusion Protein Compositions and Methods
AU2645100A (en) Methods of reducing or maintaining reduced levels of blood lipids using OB protein compositions