KR20000069617A - Ｏｂ 융합 단백질 조성물과 그 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Fc - OB 융합 단백질 조성물, 이러한 조성물의 제조방법과 이의 용도에 관한 것이다. 특히 본 발명은 OB 단백질, 유도체 또는 유사체의 N- 말단 부분에 융합된 Fc 면역글로불린 부위, 유도체 또는 유사체를 함유하는 유전 또는 화학 융합 단백질에 관한 것이다.

Description

ＯＢ 융합 단백질 조성물과 그 제조 방법{OB FUSION PROTEIN COMPOSITIONS AND METHODS}

비만증의 분자 근거는 크게 알려져 있지 않지만, "OB 유전자" 와 암호화 단백질("OB 단백질" 또는 "렙틴")의 동정은 체지방 침적을 조절하는데 신체 사용에 관한 메카니즘을 분명하게 했다. 참조, PCT 공보, WO 96/05309(12/22/96) 프리드맨 등 ; 장 등, Nature 372 : 425-432(1994) ; 참조, Correction at Nature 374 : 479 (1995). OB 단백질은 정상 야생형 마우스는 물론 ob/ob 돌연변이 마우스에서 생체내 활성을 갖는다. 생물학적 활성은 그 자체 다른 것 사이에서 중량 감량을 나타낸다. 참조 일반적으로, 바리나가, "Obses" Protein Slims Mice, Science 269 : 475 - 456 (1995). 포유류와 사람을 포함한 동물의 지방과다증과 체중 조절을 위한 조절체로서 OB 단백질, 유도체와 이들의 용도는 PCT 공보 WO 96/05309(12/22/96)에 더 상세히 기재되어 있으며, 이는 도면을 포함하여, 참조적으로 여기에 인용되었다.

다른 OB 단백질의 생물학적 효과는 잘 특징되어 있지 않다. 예를들면, ob/ob 돌연변이 마우스에, OB 단백질을 투여하면 혈청 인슐린 수준과, 혈청 글루코오스 수지의 감소를 가져옴을 알 수 있다. 또한 OB 단백질을 투여하면 체지방의 감소를 가져옴을 알 수 있다. 이것은 비-비만의 정상 마우스 및 ob/ob 돌연변이 마우스에서 관찰되었다. 펠리마운터 등., Science 269 : 540-543 (1995) ; 할라아스 등., Science 269 : 543-546 (1995), 참조 캠프필드 등., Science 269 : 546-549 (1995)(db/db 비만 마우스가 아닌 ob/ob 와 식이-유도 비만 생쥐의 체중과 OB 단백질 감소 음식 섭취의 마이크로그람 투여량을 말초와 중추 투여). 이들 보고서에서는 가장 높은 투여량에서 조차 독성에 관한 것은 아무것도 관찰되지 않았다.

OB 단백질의 임상적 사용의 전망에도 불구하고, 생체내 OB 단백질의 활동 방식은 선명하게 설명되어 있지 않다. OB 수용체에 관한 정보에서는 OB 수용체 위치를 나타내는, 랫 시상하부에서 검출된 OB 단백질의 높은 친화성 결합을 나타낸다. 스테펜스 등., Nature 377 : 530-532. db/db 마우스는 ob/ob 마우스와 같이 동일한 표현형, 즉, 극한 비만증과 형 Ⅱ 당뇨증을 나타내며 ; 이 표현형은 불량한 OB 수용체 때문이라고 생각되며, 특히 그 이유는 db/db 마우스가 OB 단백질 투여에 반응하지 않기 때문이다. 참조 스테펜스 등., 상기 기재.

재조합 DNA 방법의 향상으로, 치료용 재조합 단백질의 이용성에서도 단백질 제제와 화학적 변이에 향상을 가져왔다. 이러한 변이의 목적 중 하나는 단백질 보호와 붕해를 줄이는 것이다. 융합 단백질과 화학적 부착은 단백질 골격 그 자체와 물리적 접촉에서 효과적으로 단백질 분해 효소를 차단하므로서 붕해를 방지한다. 부가적인 장점은 어떠한 환경하에서, 안정성, 순환시간과 치료 단백질의 생물학적 활성을 증가시키는 것이다. 이들 재검토하여 보면, 단백질 변이와 융합 단백질은 프란시스의 Focus on Growth Factors 3 : 4-10 (1992년 5월)에 기재되어 있다(영국 올드 런던 엔20 프리언 바아넷 레인 마운트뷰 코오트, 메디스크립 발행).

이러한 변이의 하나는 면역글로불린의 Fc 부위의 사용에 있다. 항체는 두 기능적 독립 부분, 즉 항원과 결합하는 "Fab" 로 알려진 가변영역과, 전충 세포 또는 식세포와 같은 대사 인자 기능에 결합을 제공하는 "Fc" 로서 알려진 불변 영역을 갖는다. 면역글로불린의 Fc 부분은 긴 플라스마 반감기를 갖는 반면에, Fab 는 짧은 반감기를 갖는다. 케이폰 등., Nature 337 : 525-531 (1989).

치료 단백질 생성물을, Fc 영역을 사용하여 구성하여서 더 긴 반감기를 제공하거나 또는 모두가 면역글로불린의 Fc 단백질에 존재하는 Fc 수용체 결합, 단백질 A 결합, 보체 결합 반응과 경태반전달과 같은 기능을 갖는다. 상기와 동일. 예를들면 IgG1 항체의 Fc 부위는 호지킨의 질병 종양 세포, 퇴행성 림프종 세포, T-세포 백혈병 세포와 기타 악성 세포형으로 표현되는 CD30 수용체와 결합하는 분자를 CD30-L 의 N-말단 단부에 융합시킨다. 참조. 미국특허 제 5,480,981 호 IL-10, 항염증제와 항거부제를 마우스 Fcγ2a 에 융합시켜서 세포질의 짧은 순환 반감기를 시킨다. 또한 연구로 사람 IgG1 의 Fc 단백질과 결합된 종양괴사 인자 수용체를 사용하여 패혈 충격을 갖는 환자를 치료하는 것을 평가한다. 피숴. 시. 등., N. Engl. J. Med., 334 : 1697-1702 (1996) ; 반지, 케이. 등., The Journal of Immunology, 156 : 2221-2230 (1996). 또한 Fc 를 CD4 수용체에 융합시켜서 에이즈 치료용 치료 단백질을 제조한다. 참조. 인터루킨 2 의 N-말단을 IgG1 또는 IgG3 의 Fc 부분에 융합시켜서 인터루킨 2 의 짧은 반감기와 이의 전신 독성을 극복한다. 참조. 하빌 등., Immunotechnology, 1 : 95-105 (1995).

유망한 치료 단백질로서의 OB 단백질의 동정으로 인하여, OB 단백질 투여와 함께 또는 그 대신 임상용 OB 유사체 조성물을 개발하는 것이 필요하다. 이와 같은 개발에 단백질 제제와 화학적 변이가 단백질 붕해 감소, 안정성과 주기시간 증가를 이루는 OB 유사체 조성물이 포함된다. 본 발명에서는 이러한 조성물을 제공한다.

발명의 요약

본 발명은 Fc-OB 융합 단백질, 이러한 조성물의 제조 방법과 이의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 OB 단백질 또는 유사체의 N-말단 부분에 융합되는 면역글로불린의 Fc 부위 또는 유사체를 함유하는 유전 융합 단백질에 관한 것이다. Fc-OB 융합 단백질은 Fc 부위의 시스테인 잔기를 경유하여 이합체화할 수 있다. 예상외로, OB 단백질의 N-말단에서 Fc 와의 유전 융합 변이는 OB 단백질에서 또는 OB 단백질의 C-말단에 Fc 와의 융합에서는 보지 못한 안정성, 청소율과 붕해 감소의 장점을 나타낸다. 더욱이, 놀랍게도 N-말단 변이는 OB 단백질과 또는 OB 단백질 C-말단에서 Fc 변이와 비교했을때, 예상외의 붕해로부터의 단백질 보호를 제공하고, 순환시간과 안정성이 증가한다. OB 단백질로의 Fc 변이에서 나온 이러한 예상외의 장점은 이러한 변화가 더 낮은 투약량이 요구되거나 또는 빈번한 투약을 감소시키므로서, OB 단백질 소비자에게 유익하다. 따라서, 하기에서 더 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 OB 단백질(또는 이의 유사체)에 Fc 부위의 융합을 통한 단백질의 유전적 변이 및 특이한 변이체, 제조와 이의 사용방법에 관한 여러가지 특징을 갖는다.

따라서, 제일 특징으로, 본 발명은 Fc 가 OB 단백질(또는 이의 유사체)의 N-말단에 유전적으로 융합되는 Fc-OB 융합 단백질을 제공한다. 더불어, Fc 부분은 본 분야에 공지되어 있는 펩티드 또는 화학적 링커를 통하여 OB 단백질(또는 이의 유사체)의 N-말단에 연결될 수 있다. 상술한 바 있고 하기에서 더 상세히 설명하는 바와 같이, Fc-OB 단백질은 OB 단백질 또는 C-말단 OB-Fc 융합 단백질과 비교했을때 붕해로부터의 예상외의 보호와 증가된 순환 시간과 안정성을 갖는다. 그러므로, 본 발명의 다른 특징에는 Fc-OB 융합 단백질 뿐만 아니라, 이러한 단백질을 암호화하는 DNA 서열, 본 발명의 융합 단백질을 제조하는 데 유용한 관련 벡터와 이러한 벡터를 함유하는 숙주 세포를 포함한다.

본 발명의 제이 특징에서는 Fc-OB 융합 단백질의 제조방법을 제공한다. 이러한 방법에는 재조합 단백질을 제조하기 위한 재조합 DNA 방법이 있다. 더욱이 이와 같은 특징에는 발효와 정제 방법이 포함된다.

본 발명의 다른 특징에서는 Fc-OB 융합 단백질을 투여하여 지방 침적의 조절을 포함한 개인 또는 동물의 초과 중량을 처리하는 방법을 제공한다. Fc-OB 융합 단백질 특성으로 인하여, 이 방법에서 Fc-OB 중량 감소제를 사용하므로서 OB 단백질의 투여량 및/또는 투약회수의 감소가 기대된다.

본 발명의 또 다른 특징에서는 당뇨병, 이상지방혈증 또는 지방과다혈증, 동맥 경화증, 동맥 플라크와 같은 초과 지방과 연관되는 동시-이병율의 치료, 담석형성의 감소 또는 예방, 스토크와 인슐린 민감도의 증가 및/또는 마른 조직 질량의 증가에 대한 요법을 제공한다.

또한 본 발명의 다른 특징에서는 상기 치료에 사용하기 위한, Fc-OB 단백질의 관련된 제약학적 조성물, 이의 유사체와 유도체를 제공한다.

본 발명은 Fc-OB 융합 단백질 조성물, 그 제조방법과 이의 용도에 관한 것이다.

도 1 재조합 마우스 metOB(이중쇄) DNA(서열 번호 : 1 과 2)와 아미노산 서열(서열 번호 : 3).

도 2 재조합 사람 metOB 유사체(이중쇄) DNA(서열 번호 : 4 와 5)와 아미노산 서열(서열 번호 : 6).

도 3(A - C) 재조합 사람 metFc-OB(이중쇄) DNA(서열 번호 : 7 과 8)와 아미노산 서열(서열 번호 : 9).

도 4(A - C) 재조합 사람 metFc-OB 변이체(이중쇄) DNA(서열 번호 : 10 과 11)와 아미노산 서열(서열 번호 : 12).

도 5(A - C) 재조합 사람 metFc-OB 변이체(이중쇄) DNA(서열 번호 : 13 과 14)와 아미노산 서열(서열 번호 : 15).

도 6(A - C) 재조합 사람 metFc-OB 변이체(이중쇄) DNA(서열 번호 : 16 과 17)와 아미노산 서열(서열 번호 : 18).

본 발명은 Fc-OB 융합 단백질 조성물, 이러한 조성물의 제조방법과 이의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 OB 단백질의 N-말단부분에 면역글로불린의 Fc 부분의 유전적 또는 화학적 융합에 관한 것이다. 예상외로, OB 단백질의 N-말단에서 Fc 의 융합은 OB 단백질에서 또는 OB 단백질의 C-말단에서의 Fc 융합에서는 보지 못한 장점을 갖는다. 놀랍게도, N-말단 변이 Fc-OB 단백질은 예상하지 못한 붕해로부터의 단백질 보호, 순환시간 증가와 안정성 증가를 제공한다. 따라서, Fc-OB 융합 단백질과 이의 유사체 또는 유도체 및 관련되는 사용과 제조 방법은 하기에서 더 상세히 설명한다.

조 성 물

서열 번호 : 9 에 열거된 재조합 사람 Fc-OB 서열의 Fc 서열은 사람 면역글로불린 IgG-1 중쇄에서 선택하며, 참조 엘리선, 제이. 더블유. 등., Nucleic Acids Res. 10 : 4071-4079(1982), 또는 본 분야에 공지되어 있는 다른 Fc 서열(예를들어 IgG2, IgG3 와 IgG4 에 한정하는 것은 아니나 이들을 포함하는 기타 IgG 류 또는 기타 면역글로불린).

Fc 부분의 변이체, 유사체 또는 유도체는 예를들어 잔기 또는 서열의 여러 치환에 의하여 구성될 수 있다.

시스테인 잔기를 삭제하거나 또는 다른 아미노산으로 대치하여 Fc 서열의 이황화물 교차 결합의 형성을 방지할 수 있다. 특히, 서열 번호 : 9 의 위치 5 에서 아미노산은 시스테인 잔기이다. 서열 번호 : 9 의 재조합 Fc-OB 서열은 378 아미노산 Fc-OB 단백질이다(메티오닌 잔기는 계산하지 않는다). 도 3 의 재조합 Fc-OB 단백질의 첫째 아미노산 서열은 -1 위치에서 메티오닌과 +1 로서 언급된다.

하나는 위치 5 에서 시스테인 잔기를 제거하거나 이를 하나 또는 그 이상의 아미노산과 치환할 수 있다. 도 4 의 변이체 아미노산 서열(서열 번호 : 12)을 나타내는 위치 6 에서 시스테인 잔기를 알라닌 잔기로 치환할 수 있다. 도 4 의 재조합 Fc-OB 단백질은 378 아미노산 Fc-OB 단백질이다(메티오닌 잔기는 계산하지 않는다). 도 4 의 재조합 Fc-OB 단백질의 첫째 아미노산 서열은 -1 위치에서 메티오닌과 +1 로서 언급된다.

또한 서열 번호 : 9 의 위치 5 에서 시스테인은 세린 또는 다른 아미노산 잔기로 치환되거나 또는 삭제될 수 있다. 또한 변이체 또는 유사체도 서열 번호 : 15 의 변이체(도 5 참조)로 위치 1, 2, 3, 4 와 5 에서 아미노산을 삭제하여 제조할 수 있다. 이러한 위치들에서 치환은 본 발명의 범위내에서 이루어지고 범위내에 있을 수 있다. 도 5 의 재조합 Fc-OB 단백질은 373 아미노산 Fc-OB 단백질이다(메티오닌 잔기는 계산하지 않는다). 도 5 의 재조합 Fc-0B 단백질의 첫째 아미노산 서열은 -1 위치에서 메티오닌과 +1 로서 언급된다.

또한 변이를 행하여 Fc 수용체 결합 부위와 보체(C1q) 결합 부위를 제거하는 네 아미노산 치환기를 주입할 수 있다. 서열 번호 : 15 로부터 이들 변이체 변성물에는 글루타민산염으로 위치 15 에서 치환된 로이신, 위치 98 에서 알라닌으로 치환된 글루타민산염과 위치 100 과 102 에서 알라닌으로 치환된 글루타민산염이 있다(참조 도 6 과 서열 번호 : 18). 도 6 의 재조합 Fc-OB 단백질의 첫째 아미노산 서열은 -1 위치에서 메티오닌과 +1 로서 언급된다.

또한, 하나 또는 그 이상의 티로신 잔기는 페닐알라닌 잔기에 의하여 좋게 치환될 수 있다. 더불어, 다른 변이체 아미노산 삽입, 삭제 및/또는 치환도 본 발명의 범위내에 속하는 것으로 이해될 것이다. 더욱이, 변성물은 펩티드의태물 또는 D-아미노산과 같은 변성된 아미노산 형태로 있을 수 있다. 또한, Fc 단백질은 화학적이거나 길이가 변하는 아미노산이거나 여부에 따라 "링커" 성분에 의하여 Fc-OB 단백질의 OB 단백질에 연결될 수 있다. 이러한 화학적 링커는 본 분야에 잘 알려져 있다. 아미노산 링커 서열은 한정되는 것은 아니나 다음과 같은 것이 있다 :

(a) ala, ala, ala ;

(b) ala, ala, ala, ala ;

(c) ala, ala, ala, ala, ala ;

(d) gly, gly ;

(e) gly, gly, gly ;

(f) gly, gly, gly, gly, gly ;

(g) gly, gly, gly, gly, gly, gly, gly ;

(h) gly-pro-gly ;

(i) gly, gly, pro, gly, gly ;

(j) 부부분 (a) 내지 (i) 의 조합.

Fc-OB 융합 단백질의 OB 부분은 서열 번호 : 3 에 열거된 재조합 랫(도 1 참조), 또는 장 등., 상기, Nature(여기에 참고로 인용)에 열거된 재조합 사람 단백질 또는 위치 28 에서 글루타미닐 잔기가 없는 것 (참조 장. 등., 상기, Nature 페이지 428)에서 선택한다. 또한 (1) 위치 35 에서 리신 대신 알기닌 ; (2) 위치 74 에서 이소루신 대신에 로이신을 함유하는 서열 번호 : 6(도 2 참조)에 열거된 재조합 사람 OB 단백질 유사체를 사용할 수 있다(이 유사체의 속기 약어는 재조합 사람 R- 〉 L³⁵, I- 〉 L⁷⁴이다). 재조합 사람과 재조합 마우스 단백질 또는 OB 단백질의 N-말단에서 융합된 Fc 부분을 갖거나 갖지 않는 유사체의 아미노산 서열은 -1 위치에서 메티오닐 잔기와 하기에 열거했으며 ; 그러나, 존재하는 OB 단백질과 유사체 어느 것에 있어서, 메티오닐 잔기는 없다.

마우스 단백질은 더욱이 N-말단에서 특히 숙성 단백질로서 실질적으로 사람 단백질과 동일하거나 마우스 서열에서 벗어나는 아미노산을, 재조합 사람 서열로 변형하여(아미노산 잔기를 치환하는 것과 같이) 재조합 사람 단백질의 유사체를 제조할 수 있다. 재조합 사람 단백질이 마우스에서 생물학적 활성을 갖기 때문에, 이러한 유사체는 사람에게서의 활성과 비슷하다. 예를들면, 서열 번호 : 6 의 번호에 따라 잔기 35 에서 리신과 잔기 74 에서 이소루신을 갖는 사람 단백질을 사용하여 위치 32, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 89, 97, 100, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 와 145 에서 하나 또는 그 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환할 수 있으며, 여기서 첫째 아미노산은 발린이고, 위치 146 에서 아미노산은 시스테인이다. 마우스 단백질의 대응하는 위치에서 아미노산(서열 번호 : 3) 또는 다른 아미노산을 선택할 수 있다.

랫 OB 단백질 서열을 기초로 한 "공통" 분자를 더 제조할 수 있다. 여기에 참고문헌으로 인용되어 있는 무라카미 등., Biochem. Biophys. Res. Comm. 209 : 944-952 (1995) 문헌을 참조하라. 랫 OB 단백질은 다음 위치(서열 번호 : 6 의 번호 사용) : 4, 32, 33, 35, 50, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 101, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138 과 145 에서 사람 OB 단백질과 다르다. 이들의 서로 다른 위치에서 하나 또는 그 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환할 수 있다. 굵은 글씨의 위치는 랫 OB 단백질은 물론 마우스 OB 단백질이 사람 OB 단백질과 다른 부위로서 특히 변성에 적합하다. 하나 또는 그 이상의 위치에서, 해당 랫 OB 단백질에서 나온 아미노산, 또는 다른 아미노산을 치환할 수 있다.

숙성한 사람 OB 단백질과 다른 랫 및 마우스 OB 단백질에서의 위치는 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 와 145 이다. 해당 랫 또는 마우스 서열에서 발견된 아미노산과 같은, 다른 아미노산으로 대치된 하나 또는 그 이상의 상기 아미노산을 갖는 서열 번호 : 6 에 따른 OB 단백질은 효과가 있다.

더불어, 숙성한 사람 OB 단백질과 다른 붉은 털 원숭이에서 발견된 아미노산(동정은 한 문자의 아미노산 약어로 괄호안에 나타냈다)은 8(S), 35(R), 48(V), 53(Q), 60(I), 66(I), 67(N), 68(L), 89(L), 100(L), 108(E), 112(D) 와 118(L)이다. 재조합 사람 OB 단백질은 게잡이 원숭이에서 활성이기 때문에, 괄호안의 아미노산과 같은 다른 아미노산으로 대치된 하나 또는 그 이상의 붉은 털 원숭이 발산 아미노산을 갖는 서열 번호 : 6 에 따른 사람 OB 단백질(위치 35 에서 리신과 위치 74 에서 이소루신을 갖는다)은 효과적이다. 어떠한 붉은 털 원숭이 발산 아미노산이 상기 마우스에서 발견된 것(위치 35, 68, 89, 100 과 112)임을 알 수 있다. 따라서, 다른 아미노산으로 대치된 위치 : 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 와 145 에서 하나 또는 그 이상의 아미노산을 갖는 마우스/붉은 털 원숭이/사람 공통 분자(위치 35 에서 리신과 위치 74 에서 이소루신을 갖는 서열 번호 : 6 의 번호를 사용하여)를 제조할 수 있다.

다른 유사체는 단백질 아미노산 서열의 일부분을 삭제하여 제조할 수 있다. 예를들면, 숙성한 단백질에는 선도서열(-22 내지 -1)이 없다. 다음 절단된 형태의 사람 OB 단백질 분자(서열 번호 : 6 의 번호 사용)를 제조할 수 있다 :

(a) 아미노산 98 - 146

(b) 아미노산 1 - 32

(c) 아미노산 40 - 116

(d) 아미노산 1 - 99 와 (연결되는) 112 - 146

(e) 아미노산 1 - 99 및 아미노산 99 와 112 사이에 위치하는 하나 또는 그 이상의 아미노산 100 - 111 을 갖는 (연결되는) 112 - 146.

더불어, 절단된 형태는 사람 OB 단백질과 다른(랫, 마우스 또는 붉은 털 원숭이 OB 단백질에서) 하나 또는 그 이상의 아미노산을 변성시킬 수 있다. 더욱이, 변성물은 펩티드의태물 또는 D-아미노산과 같은, 변성된 아미노산 형태로 존재할 수 있다.

그러므로, 본 발명은 OB 단백질을 다음 것에서 선택하는 Fc-OB 융합 단백질을 포함한다 :

(a) 서열 번호 : 3(하기) 또는 서열 번호 : 6 에 열거된 아미노산 서열 1 - 146 ;

(b) 위치 35 에서 리신 잔기와 위치 74 에서 이소루신 잔기를 갖는 서열 번호 : 6 에 열거된 아미노산 서열 1 - 146 ;

(c) 하나 또는 그 이상의 다음 위치(서열 번호 : 6 에 따른 번호를 사용하고 위치 28 에서 글루타미닐 없이 동일한 번호 보유) : 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 와 145 에서 치환된 다른 아미노산을 갖는 부부분(b)의 아미노산 서열 ;

(d) 위치 28 에서 글루타미닐 잔기를 임의로 갖지 않는 부부분(a), (b) 또는 (c)의 아미노산 서열 ;

(e) N-말단에서 메틸오닐 잔기를 갖는 부부분 (a), (b), (c) 또는 (d) 의 아미노산 서열 ;

(f) 다음 중에서 선택한 절단형 OB 단백질 유사체(서열 번호 : 6 의 번호를 사용) :

(ⅰ) 아미노산 98 - 146

(ⅱ) 아미노산 1 - 32

(ⅲ) 아미노산 40 - 116

(ⅳ) 아미노산 1 - 99 와 112 - 146

(ⅴ) 아미노산 99 와 112 사이에 위치하는 하나 또는 그 이상의 아미노산을 갖는 아미노산 1 - 99 와 112 - 146 ;

(ⅵ) 다른 아미노산으로 치환된 하나 또는 그 이상의 아미노산 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 와 145 를 갖는 부부분(ⅰ)의 절단된 OB 유사체 ;

(ⅶ) 다른 아미노산으로 치환된 하나 또는 그 이상의 아미노산 4, 8 과 32 를 갖는 부부분(ⅱ)의 절단된 유사체 ;

(ⅷ) 다른 아미노산으로 대치된 하나 또는 그 이상의 아미노산 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111 과 112 를 갖는 부부분(ⅲ)의 절단된 유사체 ;

(vⅸ) 다른 아미노산으로 대치된 하나 또는 그 이상의 아미노산 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118, 136, 138, 142 와 145 를 갖는 부부분(ⅳ)의 절단된 유사체 ;

(ⅹ) 다른 아미노산으로 대치된 하나 또는 그 이상의 아미노산 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 와 145 를 갖는 부부분(ⅴ)의 절단된 유사체 ;

(xi) N-말단 메틸오닐 잔기를 갖는 부부분(i) - (x) 중 어느 것의 절단된 유사체 ;

(g) 단백질 성분에 연결되는 화학 성분으로 이루어지는 부부분(a) 내지 (f) 중 어느 것의 OB 단백질 또는 유사체 유도체 ;

(h) 상기 화학 성분이 수용성 중합체 성분인 부부분(g)의 유도체 ;

(i) 상기 수용성 중합체 성분이 폴리에틸렌 글리콜인 부부분(h)의 유도체 ;

(j) 상기 수용성 중합체 성분이 폴리아미노산 성분인 부부분(h)의 유도체 ;

(k) 상기 성분이 상기 단백질 성분의 단독 N-말단에 부착되는 부부분(h) 내지 (j)의 유도체 ;

(l) 제약학적으로 용인가능한 담체에서의 부부분(a) 내지 (k) 중 어느 것의 OB 단백질, 유사체 또는 유도체.

유 도 체

이 Fc-OB 융합 단백질(여기에서 "단백질" 이란 용어는 다른 표시가 없는 한, 하기에 기재된 것과 같은, "펩티드", Fc, OB 또는 유사체를 포함하여 사용된다)은 Fc-OB 단백질 성분에 하나 또는 그 이상의 화학 성분을 부착시켜서 유도한다. 이러한 화학적으로 변이된 유도체는 하기와 같은 동맥내, 복강내, 근육내 피하, 정맥내, 경구, 코, 허파, 국소 투여 또는 기타 투여 경로용으로 제제할 수 있다.

생물학적 활성 단백질의 화학적 변이는 치료 단백질의 안정성과 순환시간 증가와 면역원성 감소와 같은, 어떠한 환경하에서 부가적인 장점을 제공함을 알 수 있다. 참조 1979.12.18 자 발행된, 데이비스 등., 미국특허 제 4,179,337 호 재검토에 있어, 참조 아부코스키 등., Enzymes as Drug(제이. 에스. 홀서버그와 제이. 로버트스, 편집. 페이지 367-383 (1981)) ; 프란시스 등., 상술한것.

이러한 유도화에 적합한 화학 성분은 여러가지 수용성 중합체 중에서 선택한다. 선택된 중합체는 부착되는 단백질이 생리적 환경과 같은, 수성 환경에서 침전하지 않도록 수용성이어야 한다. 바람직하기로는, 치료적 최종 생성물 제조에 사용함에 있어서, 중합체는 제약학적으로 수용할 수 있어야 한다. 본 분야의 전문가는 중합체/단백질 접합체를 치료적으로 사용할 수 있는지 여부를 고려하고 원하는 투약량, 순환시간, 단백질 가수분해에 대한 내성등을 고려하여 이를 근거로 원하는 중합체를 선택할 수 있을 것이다. 존재하는 단백질과 펩티드에 있어서, 유도화 효과는 원하는 형태의 유도체를 투여하여서(즉, 삼투압 펌프에 의하여, 또는 더 바람직하기로는 주사 또는 주입에 의하여 또는 예를들어 경구, 허파, 코 방출용으로 제제하여)와 여기에 기재된 생물학적 효과를 관찰하여 확인할 수 있다.

수용성 중합체는 예를들어, 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥소탄, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레 무수물 공중합체, 폴리아미노산(동종중합체 아니면 랜덤 공중합체)과, 덱스타란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 동종중합체, 폴리프로필렌 산화물/에틸렌 산화물 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올과 폴리비닐 알코올에서 선택할 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 이의 물에서의 안정성으로 인하여 제조에서 장점을 갖는다. 또한, 석신산염과 시트렌도 사용할 수 있다.

Fc-OB 융합 단백질을 제제하는데 사용되는 OB 또는 Fc 단백질은 Fc 또는 OB 단백질(또는 유사체) 성분에 폴리아미노산 또는 분지점 아미노산을 부착시켜서 제조할 수 있다. 예를들면, 폴리아미노산은 부가적 담체 단백질이며, 이는 본 발명의 OB 단백질 또는 OB 유사체에 융합되는 Fc 와 같이 상기 Fc-OB 융합 단백질을 통하여 이루어지는 장점과 더불어 단백질의 순환 반감기를 증가시키는 것이다. 본 발명의 치료적 또는 미용적 목적에 있어서, 이러한 폴리아미노산은 항원성 반응 또는 다른 역 반응의 중화를 일으키지 않는 것이어야 한다. 이와 같은 폴리아미노산은 혈청 알부민(사람 혈청 알부민 같은것), 부가적 항체 또는 이의 부분(예를들어, Fc 부위), 또는 기타 폴리아미노산, 예를들어 리신에서 선택한다. 하기에서 표시한 바와 같이, 폴리아미노산의 부착 위치는 Fc-OB 단백질 성분의 N-말단 또는 C-말단에 또는 다른 장소 사이에 있고, 또한 Fc-OB 단백질에 화학적 "링커" 성분에 의하여 연결될 수 있다.

중합체는 분자량을 갖고 분지 또는 비분지될 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜에 있어서, 바람직한 분자량은 취급과 제조에 용이한 약 2 kDa 와 약 100 kDa 사이에 있다("약" 이란 용어는 폴리에틸렌 글리콜의 제조에서, 몇몇 분자가 언급된 분자량보다 더 많이, 약간 적게 무게가 나가는 것을 나타낸다). 다른 크기는 원하는 치료 형태(예를들어, 원하는 서방기간, 생물학적 활성이 있으면, 그 효과, 취급용이, 항원성의 정도 또는 결여와 치료 단백질이나 유사체에 대한 폴리에틸렌 글리콜의 기타 알려진 효과)에 따라 사용할 수 있다.

부착되는 중합체 분자의 수는 변할수 있으며, 분 분야의 전문가는 기능에 관한 효과를 확인할 수 있다. 동일 또는 다른 화학성분(예를들어, 다른 중량의 폴리에틸렌 글리콜과 같은 중합체)으로, 모노-유도화 할 수 있고, 또는 유도화의 디-, 트리-, 테트라 또는 어떤 조합을 제공할 수 있다. 단백질(또는 펩티드)에 대한 중합체 분자의 비율은 반응 혼합물에서 이들의 농도에 따라 변하게 된다. 일반적으로, 최적의 비율(미반응 단백질 또는 중합체를 초과하지 않는 반응의 효능에 의하여)은 원하는 유도화의 정도(예를들어, 모노, 디-, 트리-, 등), 원하는 중합체의 분자량, 중합체가 분지되는지 또는 비분지되는지 여부와 반응조건과 같은 인자에 의하여 측정하게 된다.

화학 성분은 단백질의 기능적 또는 항원성 영역에 관한 효과를 고려하여 단백질에 부착된다. 본 분야의 전문가가 이용할 수 있는 부착 방법은 여러가지가 있다. 예를들면, 여기에 참고적으로 혼입한 EP 0 401 384 참조 말리크 등., Exp. Hematol. 20 : 1028-1035 (1992)(염화 트레실을 이용한 GM-CSF 의 페길화보고), 예를들면 폴리에틸렌 글리콜은 유리 아미노 또는 카르복실기와 같은 반응기를 통하여 아미노산 잔기에 공유가로 결합된다. 반응기는 활성화된 폴리에틸렌 글리콜 분자가 결합될 수 있는 것이다. 유리 아미노기를 갖는 아미노산 잔기에는 리신 잔기와 N-말단 아미노산 잔기가 있다. 유리 카르복실기를 갖는 것에는 아스팔트산 잔기, 글루탐산 잔기와 C-말단 아미노산 잔기가 있다. 또한, 술프하드릴기도 폴리에틸렌 글리콜 분자를 부착시키는 반응기로 사용할 수 있다. N-말단 또는 리신기에서 부착하는 것과 같이, 아미노기에서 부착하는 것이 치료용으로 바람직하다. 수용체 결합에 중요한 잔기에서의 부착은 수용체 결합을 원하면 피해야 한다.

N-말단에서 화학적으로 변이된 Fc-OB 융합 단백질이 특히 필요하다. 본 조성물의 예시로서 폴리에틸렌 글리콜을 사용할 때는, 여러가지 폴리에틸렌 글리콜 분자(분자량, 분지화 등에 의하여), 반응 혼합물에서 단백질(또는 펩티드) 분자에 대한 폴리에틸렌 글리콜 분자의 비율, 실행되는 페길화 반응의 형과, 선택된 N-말단 페길화 단백질을 얻는 방법에서 선택한다. N-말단 페길화 제조를 얻는 방법(즉, 필요하면 이 성분을 다른 모노페길화 성분을 분리)은 페길화 단백질 분자로 부터 N-말단 페길화 물질을 정제하여 이루어진다. 선택적 N-말단 화학적 변이는 특별한 단백질의 유도화에 이용할 수 있는 다른 형의 일차 아미노기(N-말단에 대한 리신)의 차별적 반응성을 이용한 환원성 알킬화에 의하여 성취될 수 있다. 중합체를 함유하는 카르보닐기로 N-말단에서 단백질의 선택적 유도화는, 적당한 반응 조건하에서, 성취된다. 예들들면 리신 잔기의 ε-아미노기와 단백질의 N-말단 잔기의 α-아미노기 사이의 pKa 의 이점을 얻도록 하는 pH 에서 반응을 행하므로서 단백질을 선택적으로 N-말단 페길화할 수 있다. 이와같은 선택적 유도화에 의하여 단백질에 수용성 중합체를 부착하는 것을 조절하며 : 중합체와의 접합은 단백질의 N-말단에서 우세하게 일어나고 리신 측쇄 아미노기와 같은, 다른 반응기의 현저한 변이는 일어나지 않는다. 환원성 알킬화를 사용하면, 수용성 중합체는 상술한 형으로 되고, 단백질에 결합하는 단일의 반응성 알데히드를 갖는다. 단일의 반응성 알데히드를 함유하는 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드를 사용할 수 있다.

N-말단 모노페길화 유도체는 쉽게 치료제를 제조하는데 바람직하다. N-말단 페길화는 생성물의 특성이 디-, 트리- 또는 기타 다수- 페길화 생성물에 비하여 단순화되기 때문에 동질의 생성물을 확보한다. N-말단 생성물의 제조에서 상기 환원성 알킬화 공정을 사용하면 상업적 제조가 용이한 것이 바람직하다.

복 합 체

Fc-OB 융합 단백질, 이의 유사체 또는 유도체 결합 조성물에 복합하여 투여될 수 있다. 이러한 결합 조성물은 Fc-OB 융합 단백질, 유사체 또는 유도체로 성취하는 것보다 순환 시간을 길게하는 효과를 갖는다. 이러한 조성물에는 단백질(또는 같은 의미로, 펩티드)이 있다. 결합 단백질의 예를들면 OB 단백질 수용체 또는 이의 용해성 부분과 같은 이의 부분이 있다. 다른 결합 단백질은 혈청에서 OB 단백질 또는 Fc-OB 단백질을 검사하여, 또는 결합 존재에 대하여 실험적으로 선별하여 확인할 수 있다. 사용된 결합 단백질은 OB 단백질, Fc-OB 융합 단백질, 또는 이들의 유사체 또는 유도체의 능력에 대체적으로 간섭 받지 않으므로 내인성 OB 단백질 수용체에 결합하고 신호 전달을 효과적으로 달성한다.

제약학적 조성물

본 발명은 Fc-OB 융합 단백질과 유도체의 제약학적 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 이러한 제약학적 조성물은 주사로 투여하거나, 또는 경구, 허파, 코, 경피에 투여할 수 있고, 또한 다른 형태로 투여할 수 있다. 일반적으로, 제약학적으로 수용할 수 있는 희석제, 방부제, 가용화제, 유화제, 보조제 및/또는 담체와 함께 유효량의 본 발명의 단백질 또는 유도체 생성물을 함유하는 제약학적 조성물은 본 발명에 포함된다. 이러한 조성물은 여러가지 완충제 함량(예를들어, Tris-HCl, 초산염, 인산염), pH 와 이온 강도를 갖는 희석제 ; 청정제와 가용화제와 같은 첨가제(예를들어, Tween 80, polysorbate 80), 산화방지제(예를들어, 아스코르브산, 메타아황산 나트륨), 방부제(예를들어, 티머졸, 벤질 알코올)과 증량물질(예를들어, 락토오스, 만니톨) ; 폴리락트산, 폴리글리콜산 등과 같은 중합체 화합물의 미립자 제제에 또는 리포솜에 혼합한 물질을 포함한다. 또한 하이라우론산도 사용할 수 있고, 이는 순환에 있어 지속적인 기간을 촉진하는 효과를 갖는다. 이러한 조성물은 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출율과 존재하는 단백질과 유도체의 생체내 청소율에 영향을 미친다. 참조. 예를들면, 여기에 참고적으로 혼입되어 있는 Remington's pharmaceutial Sciences, 18 판 (1990, 펜실베니아 18042, 이스톤, 마크 출판사) 페이지 1435-1712. 조성물은 액체 형태로 제조할 수 있고, 또한 동결건조 형태와 같은, 건조 분말로 할 수 있다. 이식형 서방성 제제는 경피제제인 것으로 생각된다.

이는 경구 고체 투약 형태로 여기서 사용하고, 이는 여기에 참고적으로 혼입되어 있는 Remingtion's Pharmaceutical Sciences, 18 판, 1990(펜실베니아 18042, 이스톤, 마크 출판사) 89 장에 기재되어 있다. 고체 투약 형태에는 정제, 캡슐, 환제, 트로키제 또는 함당정제, 카시에 또는 펠릿이 있다. 리포솜 또는 단백질 캡슐화를 사용하여 본 조성물을 제제할 수 있다(예를들어, 단백질 미소립자는 미국특허 제 4,925,673 호에 보고되어 있다). 리포솜 캡슐화를 사용할 수 있고 리포솜은 여러가지 중합체로 유도될 수 있다(예를들면, 미국특허 제 5,013,556 호). 치료용으로 가능한 고체 투약 형태는 마샬 케이. : 지. 에스. 벤커와 시. 티. 로드스에 의하여 편집된 Modern Pharmaceutics 에 기재되어 있고 이는 여기에 참고적으로 혼입되어 있다. 일반적으로 제제는 Fc-OB 융합 단백질(또는 유사체나 유도체)와, 위 주변을 보호하고, 장에서 생물학적 활성 물질을 방출하도록 하는 불활성 성분을 포함한다.

특히 상기 유도된 단백질의 경구 투약 형태를 포함한다. Fc-OB 융합 단백질을 화학적으로 변이시켜 유도체의 경구 투여가 효능이 있도록 한다. 일반적으로, 생각되는 화학적 변이는 단백질(또는 펩티드)분자 그 자체에 최소한 하나의 성분을 부착시키는 것이고, 여기서 상기 성분은 (a) 단백질 가수분해의 억제 ; (b) 위 또는 장으로부터 혈류로 흡입을 가능하게 한다. 이는 단백질 전체 안정성의 증가와 몸체에서 순환 시간의 증가를 가져온다. 이러한 성분의 예를들면, 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸 셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈과 폴리프로린이 있다. 아부코우스커와 데이비스, 용해성 중합체-효소 첨가제, 뉴욕, 뉴욕시 윌리-인터사이언스, 호센버그와 로버트 편집. "Enzymes as Drugs", (1981) 페이지 367-383 ; 뉴마크 등., J. Appl. Biochem. 4 : 185-189 (1982). 사용할 수 있는 다른 중합체로는 폴리-1, 3-디옥소탄과 폴리-1, 3, 6-티옥소칸이 있다. 상기에서 표시한, 제약학적 용도에 바람직한 것으로는 폴리에틸렌 글리콜 성분이 있다.

Fc-OB 융합 단백질, 유사체 또는 유도체에 있어서, 방출 위치는 위, 소장(예를들어, 십이지장, 공장 또는 화장), 또는 대장이 있다. 본 분야의 전문가는 위에서는 용해하지 않으나, 물질을 십이지장에 또는 장의 어떤 다른 곳에 방출하는 제제를 이용할 수 있다. 바람직하게, 방출은 Fc-OB 융합 단백질, 유사체 또는 유도체의 보호에 의하여, 아니면 장에서와 같은, 위 주변 이상으로 생물학적 활성 물질의 방출에 의하여, 위 주변의 유해한 작용을 피하는 것이다.

전체 위 내성을 확보하기 위하여, 최소한 pH 5.0 까지 불투과할 수 있는 제피가 필수적이다. 장용성 제피로서 사용되는 통상의 불활성 성분의 예를들면 셀룰로오스 아세테이트 트리멜리테이트(CAT), 히드록시프로필메틸셀룰로오스 프탈레이트(HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트(PVAP), Eudragit L30D, 아콰터릭(Aquateric), 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트(CAP), Eudragit L, Eudra'git S 와 셀락이 있다. 이들 제피는 혼합된 막으로서 사용할 수 있다.

또는 제피 또는 제피의 혼합물은 정제에 사용할 수 있으며, 이는 위를 보호하지 못한다. 이것은 함당 제피 또는 복용하기 더 쉬운 정제를 만드는 제피를 포함한다. 캡슐은 건조 치료제, 즉 분제 투여용 경질 껍질(젤라틴과 같은것)로 이루어질 수 있고 ; 액체 형태에 있어서는, 연질 젤라틴 껍질을 사용할 수 있다. 카시에의 껍질 재료는 농후한 전분 또는 기타 식용지가 있다. 환제, 함당정제, 성형 정제 또는 습제 정제에 있어서, 수분 집중 방법을 사용한다.

치료제는 약 1 mm 입자크기의 과립 또는 펠릿 형태로 미세한 다중입자로서 제제에 포함시킬 수 있다. 캡슐 투여용 물질의 제제는 분제, 가볍게 압축된 플러그로 또는 정제로 할 수 있다. 치료제는 압축하여 제조할 수 있다.

착색제와 향미로는 모두 포함시킬 수 있다. 예를들면, 단백질(또는 유도체)을 (리포솜 또는 미소립자 캡슐화에 의하여) 제제한 다음 착색제와 향미료를 함유하는 냉동 음료와 같은 식용 제품에 함유시킨다.

불활성 물질로 치료제의 체적을 증가 또는 희석시킬 수 있다. 이러한 희석제에는 탄수화물, 특히 만니톨, α-락토스, 무수 락토스, 셀룰로오스, 수크로오스, 변성 덱스트란과 전분이 있다. 또한, 어떠한 무기염도 삼인산 칼슘, 탄산 마그네슘과 염화 나트륨을 포함하여 충전제로서 사용할 수 있다. 통상적으로 이용할 수 있는 희석제에는 Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress 와 Avicell 이 있다.

붕해제는 고체 투약 형태로 치료제의 제제에 포함시킬 수 있다. 붕해제로서 사용되는 물질은 전분, Explotab 을 주성분으로 한 통상의 붕해제를 함유하는 전분이 있으나 이것에 한정되는 것은 아니다. 나트륨 전분 글리콜레이트, 암버라이트, 알긴산 나트륨, 젤라틴, 오렌지 껍질, 산 카르복시메틸 셀룰로오스, 천연 스폰지와 벤토나이트 모두를 사용할 수 있다. 다른 형태의 붕해제로서는 불용성 양이온 교환 수지가 있다. 검 분말을 붕해제로서와 결합제로서 사용할 수 있고, 이들에는 한천, 카리야 또는 트라가칸트와 같은 검 분말이 있다. 또한 알긴산과 이의 나트륨염도 붕해제로서 유용하다. 치료제를 함께 유지하기 위하여 결합제를 사용하여 경질 정제를 형성시키고 이것에는 아라비아 고무, 트라가칸트 전분과 젤라틴과 같은 천연물에서 나온 물질이 있다. 다른 것으로는 메틸 셀룰로오스(MC), 에틸 셀룰로오스(EC)와 카르복시메틸 셀룰로오스(CMC)가 있다. 폴리비닐 피롤리돈(PVP)과 히드록시프로필메틸 셀룰로오스(HPMC)를 둘다 알코올 용액에서 사용하여 치료제를 과립할 수 있다.

제제공정에서 점착을 방지하기 위하여 치료 제제에 마찰감소제를 함유시킨다. 윤활제는 치료제와 다이 벽 사이의 층에 사용하고, 이들은 한정되어 있는 것은 아니다. 스테아르산과 이의 마그네슘 및 칼슘염, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 액체 파라핀, 식물성유와 왁스가 있다. 또한 황산 타우릴 나트륨, 황산 타우릴 마그네슘, 여러가지 분자량의 폴리에틸렌 글리콜, Carbowax 4000 과 6000 과 같은 용해성 윤활제도 사용할 수 있다.

제제하는 동안 약제의 유동성을 개량하고 압축하는 동안 재배열을 촉진하는 활택제를 첨가할 수 있다. 활택제에는 전분, 활석, 발열 실리카와 수화된 실리코알루미네이트가 있다.

수성 분위기에서 치료제의 용해를 촉진하기 위하여, 계면활성제를 습윤제로서 첨가할 수 있다. 계면활성제에는 황산 타우릴 나트륨, 술포석신산 나트륨 디옥틸과 술폰산 나트륨 디옥틸과 같은 음이온성 청정제가 있다. 양이온 청정제를 사용할 수 있으며 염화 벤즈알코늄 또는 염화 벤즈에토뮴이 있다. 계면활성제로서 제제에 포함될 수 있는 우수한 비이온성 청정제를 열거하면, 라우로머크로골(lauromacrogol) 400, 폴리옥시 40 스테아르산염, 폴리옥시 에틸렌 수소화 피마자유 10, 50 과 60, 모노스테아르산 글리세롤, 폴리솔베이트 40, 60, 65 와 80, 수크로오스 지방산 에스테르, 메틸 셀룰로오스와 카르복시메틸 셀룰로오스가 있다. 이들 계면활성제는 단백질 또는 유도체의 제제에 단독 또는 다른 비율의 혼합물로서 존재할 수 있다.

단백질(또는 유도체)의 흡입을 아주 강하게하는 첨가제의 예를들면 지방산 올레산, 리놀레산과 리놀렌산이 있다.

방출이 조절되는 제제가 바람직하다. 확산 아니면 침출메카니즘에 의하여 방출을 허용하는 불활성 기질, 예를들어, 검에 약제를 혼합할 수 있다. 서서히 변성하는 기질, 예를들어, 알긴산염, 다당류를 제제에 혼합할 수 있다. 이러한 치료제의 방출을 조절하는 다른 형태는 오로스(Oros) 치료장치(알자 코포레이션)를 근거로한 방법에 의하는 것이 있으며, 즉 삼투압 작용으로 인하여 물이 단일 소개구를 통하여 약제를 주입하고 밀어내도록 하는 반투과성 막으로 약제를 밀봉한다. 또한 몇몇 장용성 제피도 서방성 작용을 갖는다.

제제에 다른 제피를 사용할 수 있다. 이들에는 제피기에 사용할 수 있는 여러가지 당분이 있다. 치료제는 막으로 피복된 정제로 공급할 수 있고 이 예에서 사용된 물질은 2 그룹으로 나누어진다. 첫째는 비장용성 물질이고 이들에는 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 히드록시에틸 셀룰로오스, 메틸히드록시-에틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 히드록시프로필-메틸 셀룰로오스, 나트륨 카르복시-메틸 셀룰로오스, 프로비돈과 폴리에틸렌 글리콜이 있다. 둘째 그룹은 통상 프탈상의 에스테르인 장용성 물질로 이루어진다.

물질의 혼합물을 사용하여 최적의 필름 코팅을 제공한다. 필름 코팅은 팬 코팅기에서 또는 유동층에서 또는 압축코팅에 의하여 실시한다.

여기서 단백질(또는 이의 유도체)은 허파로 방출되는 것으로 생각된다. 단백질(또는 유도체)은 흡입되는 동안 포유류의 폐로 방출되어 혈류에 따라 폐 표면 상피로 통과한다(이의 다른 보고서로서는 에드제이 등., Pharmaceutical Research 7 : 565-569 (1990) ; 에드제이 등., International Journal of Pharmaceutics 63 : 135-144 (1990)(초산 류프로리드) ; 브태퀘트 등., Journal of cardiouascular Pharmacology 13 (Suppl. 5) : S. 143-146 (1989)(엔도텔린-1) ; 허바아드 등., Annals of Internal Medicine 3 : 206-212 (1989)(α 1-항트립신) ; 스미스 등., J. Clim. Invest. 84 : 1145-1146 (1989)(α-1-단백질분해 효소) ; 오스웨인 등., "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery Ⅱ, 1990, 3 월 콜로라도 키스톤(재조합 사람 성장 호르몬) ; 뎁스 등., The Journal of Immunology 140 : 3482-3488 (1988)(인터페론-γ 와 종양괴사인사 α)와 플레츠 등., 미국특허 제 5,284,656 호(과립구 군체 자극인자)가 있다).

본 발명을 실시하는데 있어, 한정되어 있는 것은 아니다. 분무기, 측정된 투여량 흡입기와 분말 흡입기를 포함하여, 치료제품의 허파 방출을 위하여 설계된 광범위한 기계장치를 사용하며, 이들 모두는 본 분야의 전문가에게 잘 알려져 있다.

본 발명을 실시하는데 적합한 통상적으로 이용할 수 있는 장치의 특수한 예를 몇가지 들면 미조우리. 세인트 루이스의 말린크로트 인코포레이티드에 의하여 제조된, Ultravent 분무기 ; 콜로라도, 인글우드의 머퀘스트 메디칼 프로덕츠에 의하여 제조된, Acorn Ⅱ 분무기 ; 너스 카로리나, 리서치 트리앵글 파크의 글락소 인코포레이티드에 의하여 제조된 Ventolin 측정된 투여량 흡입기 ; 메사추세츠, 베드포드, 피선스 코포레이션에 의하여 제조된, Spinhaler 분말 흡입기가 있다.

이러한 모든 장치는 단백질(또는 유사체나 유도체)을 분산시키는데 적합한 제제의 사용을 필요로 한다. 대표적으로, 각 제제는 사용된 장치의 형에 대하여 특수하고 치료에 유용한 희석제, 보조제 및/또는 담체와 더불어, 적당한 추진제의 사용을 포함한다.

단백질(또는 유도체)은 원위 폐로 가장 효과적으로 방출하기 위하여, 10 ㎛(또는 미크론) 이하, 가장 바람직하게는 0.5 - 5 ㎛ 의 평균 입자 크기를 갖는 입자 형태로 제조하는 것이 가장 유리하다.

담체에는 트레할로오스, 만니톨, 크실리톨, 수크로오스, 락토오스와 솔비톨과 같은 탄수화물이 있다. 제제에 사용하는 다른 성분으로는 DPPC, DOPE, DSPC 와 DOPC 가 있다. 천연 또는 합성 계면활성제가 사용된다. 폴리에틸렌 글리콜을 사용한다(단백질 또는 유사체를 유도하는데 이의 사용은 별 문제로 한다). 시클로덱스트란과 같은 덱스트란을 사용하고, 담즙염과 다른 관련 증폭제를 사용한다. 셀룰로오스와 셀룰로오스 유도체를 사용하고, 완충제 제제에 사용하는 것과 같은 아미노산을 사용한다.

또한, 리포솜, 마이크로캡슐 또는 미소립자, 내포 복합물 또는 다른 형의 담체를 사용한다.

제트 또는 초음파, 분무기에 사용하는데 적합한 제제는 대체로 용액 ㎖ 당 약 0.1 - 25 ㎎ 의 생물학적 활성 단백질의 농도로 물에 용해되는, Fc-OB 단백질, 이의 유사체 또는 유도체를 함유한다. 또한 제제는 완충제와 단당류를 포함하며(예를들어, 단백질 안정화와 삼투압 조절을 위하여), 분무기 제제는 계면활성제를 함유함으로서 에어로솔 형성에 있어 용액의 분무에 의하여 일어나는 단백질의 유도되는 표면 응집을 감소시키거나 방지시킨다.

측정된 투여량 흡입 장치에 사용하는 제제는 일반적으로 계면활성제의 보조로 추진제에 현탁된 단백질(또는 유도체)을 함유하는 미세 분말을 함유한다. 추진제는 클로로플루오로탄소, 하이드로클로로플루오로탄소, 하이드로플루오로탄소 또는 트리클로로플루오로메탄, 디클로로디플루오로메탄, 디클로로페트라플루오로에탄올과, 1,1,1,2-테트라플루오로에탄을 포함한 탄화수소 또는 이들의 조합물과 같은 본 목적에 사용되는 통상적인 물질이 있다. 적당한 계면활성제로는 트리올레산 솔비탄과 대두 레시틴이 있다. 또한 올레산은 계면활성제로서 유용하다.

분말 흡입 장치로부터 분산한 제제는 단백질(또는 유도체)을 함유하는 미세 건조 분말을 함유하고 또한 장치로부터 분말의 분산을 용이하게하는 양으로, 예를들어 제제의 50 - 90 중량 % 로, 락토오스, 솔비톨, 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 크실리톨과 같은 증량제를 함유한다.

또한 단백질(또는 유사체나 유도체)을 코에 방출한다. 코 방출은 폐에 생성물을 침적시킬 필요없이, 코에 치료 생성물을 투여한 후 직접 혈류로 단백질이 통과하도록 하는 것이다. 코 방출용 제제에는 덱스트란 또는 시클로덱스트란을 갖는 것이 있다. 다른 점막으로의 운반을 통하여 방출이 이루어진다.

투 약 량

본 분야의 전문가는 투여와 원하는 치료 효과를 관찰하므로서 유효한 투약량을 확인할 수 있게 될 것이다. 본 발명은 OB 단백질의 N-말단 변이로 인하여, 붕해로부터 예상외의 단백질 보호를 제공하고 OB 단백질 또는 C-말단 변이의 OB 단백질과 비교 했을때, 순환 시간과 안정성이 증가한다. 그러므로, 본 분야의 전문가는 유효한 투약량은 더 낮은 투여량 또는 더 적은 투여 회수를 가져오는 변화를 확인하게 될 것이다.

바람직하기로는, 분자의 제제가 약 0.10 ㎍/㎏/일과 10 ㎎/㎏/일 사이에서 원하는 치료 효과를 가져오도록 하는 것이다. 유효한 투약량은 진단 기구를 시간이상으로 사용하여 측정할 수 있다. 예를들면, 혈액(또는 플라스마나 혈청)에서 OB 단백질 또는 Fc-OB 융합 단백질의 양을 측정하는 진단을 먼저 사용하여 단백질의 내인성 수준을 측정한다. 이와 같은 진단 기구는 항체 샌드위치 검정과 같은, 항체 검정 형태로 할 수 있다. 내인성 OB 단백질의 양은 초기에 정량하고, 기준선을 측정하다. 치료 투약량은 내인성 및 외인성 OB 단백질 또는 Fc-OB 융합 단백질(즉, 자체 -생성되거나 아니면 투여된, 신체내에서 발견된 단백질, 유사체 또는 유도체)의 정량을 치료 과정에서 계속하여 측정한다. 그러므로 투약량은 치료과정에서 변할 수 있고, 치료 효과가 보일때까지 초기에는 비교적 높은 투약량을 사용하고, 더 낮은 투약량을 사용하여 치료 효과를 유지한다.

단지 혈액 지질수준의 감소를 원하거나, 혈액지질 수준의 감소 유지를 원하거나, 또는 마른 체중의 증가를 원하는 경우에, 투약량을 불충분하게하여 중량 감소를 가져오도록 한다. 따라서, 비만한 사람의 초기 치료 과정에서, 투약량을 투여하므로서, 감량과 부수하는 혈액지질 수준 저하 또는 부수하는 지질 조직 감소/마른 중량 증가를 성취한다. 일단 충분한 감량이 성취되면 재 - 증대 중량을 방지하는데 충분하고, 원하는 혈액 지질 수준 또는 마른 중량 증가(또는 마른 중량 수분감소의 방지)를 유지하는데 충분한 투약량을 투여할 수 있다. 이러한 투약량은 OB 또는 Fc-OB 단백질의 효과가 상반될 수 있으므로, 실험적으로 측정한다[예를들어, 캠프필드 등., Science 269 : 546-549 (1995) 547 에서]. 따라서, 감량을 원하지 않으면 감량을 가져오는 투약량을 관찰하여, 더 낮은 투여량을 투여하여 원하는 혈액 지질 수준 또는 마른 조직 중량의 증가를 성취하고, 원하는 중량을 유지한다.

인슐린에 대한 개체의 민감성의 증가에 있어서는, 비슷한 투약량을 고려할 수 있다. 감량없이 마른 증가는 당뇨병 치료를 위하여 개체에 투여되는 인슐린(또는, 아밀린, 티아졸리딘디온 또는 기타 우수한 당뇨병 치료 약제)의 양을 충분히 감소시킴으로서 성취할 수 있다.

전력 체력을 증가시키기 위하여, 비슷한 투약량을 고려할 수 있다. 전체 체력의 증가에 부수하는 마른 중량 증가는 감량을 가져오는 불충분한 투여량으로 성취할 수 있다. 적혈구의 증가(와 혈액의 산화) 및 골흡수 또는 골다공증의 감소와 같은 기타 이점은 감량없이 성취될 수 있다.

조합물

본 방법은 당뇨병 치료에 유용한 약제(예를들어, 인슐린, 가능한 티아졸리딘디온, 아밀린 또는 이들의 길항물질), 콜레스테롤과 혈압 강하 약제(혈액 지질 수준 또는 다른 심장약을 감소시키는 약제와 같은 것)와, 활성 증가 약제(예를들어, 암페타민)와 같은 다른 약제와 함께 사용할 수 있다. 식욕 억제제(세로토닌 또는 뉴로펩티드 Y 의 수준에 영향을 미치는 것)를 사용할 수 있다. 이와같은 투여는 동시에 또는 순차적으로 행할 수 있다.

더불어, 본 발명은 전체 신체 외양의 변경을 위하여 계획된 미용수술(예를들어, 체중 감소를 위하여 계획된 지방흡입 또는 레이저 수술)과 같은 외과 방법과 함께 사용할 수 있다. 동맥 플라크와 같은, 지방 침적에 의한 혈관 차단으로 일어나는 유해한 증상을 제거하기 위하여 계획된 우회 수술 또는 기타 수술과 같은, 심장 수술의 건강이점은 본 조성물과 방법을 동시에 사용하여 증가시킬 수 있다. 또한, 초음파 또는 레이저 방법과 같은 담석 제거 방법은 본 치료 방법 과정 동안 또는 그 전후에 사용할 수 있다. 더욱이, 본 방법은 골절손상, 근육의 수술이나 치료 또는 마른 조직 중량의 증가에 의하여 개량되는 기타 치료에 보조적으로 사용할 수 있다.

다음 실시예는 본 발명을 더 완전하게 예시한 것이고, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예 1 : 피하주사를 통한 마우스 Fc-OB 단백질의 사용

이 실시예는 마우스 Fc-OB 단백질의 피하 주사로 정상 마우스의 감량이 일어나는 것을 나타낸다. 정상(비-비만)CD1 마우스에 22 일 기간동안 피하 주사를 통하여 마우스 Fc-OB 단백질을 투여한다. 10 ㎎ 단백질/㎏ 체중/일의 투약량은 주사 22 일에 기준 중량에서 14 %(+/-1.1 %) 감소를 가져왔다. PBC 의 투약량은 주사 22 일에 기준 중량에서 3.9 %(+/-3.3 %) 감소를 가져왔다. 비만 CD1 마우스에 10 ㎎ 단백질/㎏ 체중/일의 Fc-OB 단백질을 사용하면 감량은 기준 중량에서 10 %(+/-4.3 %) 감소를 가져왔고 PBC 의 투약량은 주사 22 일에 기준 중량에서 8.7 %(+/-1.3 %) 감소를 가져왔다.

CD1 마우스의 기준 중량 차이 퍼센트(%)는 하기에 표시했다(나이 8 주) :

피하요법 22 일 끝에, Fc-OB 단백질을 받은 동물은 PBS 부형제만을 받은 동물과 비교했을 때와 기준선과 비교했을 때, 마른 체중의 14.1 % 와 비만체중의 10 % 이상이 감소했음을 볼 수 있다.

놀랍게도, 22 일 까지 Fc-OB 단백질을 받은 동물은 최종 주사 4 일후, 28 일 까지 계속하여 체중 상승이 느슨하다. 22 일에 중지한 피하주사를 통하여 10 ㎎ 단백질/㎏ 체중/일의 마우스 Fc-OB 단백질을 투여한 정상(비-비만) CD1 마우스는 22 일에 14 % 감소한 것과 비교했을 때 28 일에 기준 중량에서 21 % 감소를 가져왔다. 또한, 22 일에 중지한 10 ㎎ 단백질/㎏ 체중/일의 마우스 Fc-OB 단백질을 투여한 비만 CD1 마우스는 22 일에 10 % 감소한 것과 비교했을 때 28 일에 기준 중량에서 13 % 감소를 가져왔다. 34 일에 감량은 비만 마우스에서 10 % 감소로 유지되었고 여기서 마른 마우스는 5 % 감소로 회복했다. 22 일 내지 34 일에서 각 시스템의 비교물은 비만 마우스에서 4 % 와 마른 마우스에서 7 % 증대를 평균적으로 가져왔다.

실시예 2 : C57 마우스에 피하 주사를 통한 사람 Fc-OB 단백질의 사용

이 실시예는 사람 Fc-OB 단백질의 피하주사로 정상 마우스에서 감량이 일어남을 나타낸다. 정상(비-비만)C57 마우스에 7 일 기간 동안 피하주사를 통하여 사람 Fc-OB 단백질을 투여한다. 10 ㎎ 단백질/㎏ 체중/일의 투약량으로 주사 7 일에 기준 중량에서 12 %(-/-1.3 %) 감소를 가져온다. 1㎎ 단백질/㎏ 체중/일의 투약량으로 주사 7 일에 기준 중량에서 8.9 %(+/-11.5 %) 감소를 가져온다. 비만 C57 마우스에 10 ㎎ 단백질/㎏ 체중/일의 사람 OB 단백질을 사용하면 감량은 기준 중량에서 1.1 %(+/-0.99 %) 감소를 가져오고 1 ㎎ 단백질/㎏ 체중/일의 투약량으로 주사 7 일에 기준 중량에서 2.5 %(+/-1.1 %)를 가져온다.

결과

C57 마우스의 기준 중량차이 퍼센트(%)는 하기에 표시했다(나이 8 주) :

10 ㎎/㎏/일로 피하요법 7 일 후 17 일 끝에, Fc-OB 단백질을 받은 동물이 이들의 체중 8 % 까지 회복함을 볼 수 있다. 피하요법 7 일 후 1㎎/㎏/일의 투약량을 받은 동물이 12 일 후 체중의 6.4 % 까지 되돌아왔다.

또한 이러한 연구는 7 일에 최종 주사한 후 7 일 내지 22 일의 회복 기간동안 체중 회복이 OB 처리 마우스에서 보다 Fc-OB 처리 C57 마우스에서 더 느림이 나타났다. 이것은 Fc-OB 단백질이 OB 단백질 만큼 빠르게 나타내지 못하여 연장된 감량 효과를 일으키는 것으로 생각된다.

실시예 3 : Fc-OB 융합 단백질로 처리한 CF7 마우스의 투약 반응

부가적인 연구로 Fc-OB 단백질의 계속적 투여로 투약 반응이 있음이 증명된다. 이 연구에서, 무게가 35 - 40 g 인 비만 CF7 마우스에 상기 실시예와 유사한 방법을 사용하여 재조합 사람 Fc-OB 단백질을 투여한다. 그 결과는 하기 표 3 에 표시했다(상기에서 측정한, 기준선과 비교한 체중 감소 %) :

0.25 ㎎/㎏/일 내지 1 ㎎/㎏/일의 투약량 증가로 4 % 내지 16 % 의 감량이 증가함을 볼 수 있다. 5 일에 1㎎/㎏/일의 투약량으로 16 % 의 체중 감소를 가져옴을 알 수 있다. 또한, 이들 연구는 Fc-OB 단백질이 빠르게 나타내지 못하여 연장된 감량 효과를 일으키는 것을 나타냈다.

실시예 4 : CD-1 마우스와 개에서 재조합 사람 Fc-OB 의 약동학

이 연구는 CD-1 마우스와 개에서 재조합 met Fc-OB 단백질의 약동학적 성질을 증명한다. 1 ㎎/㎏/일로 정맥내 또는 피하에 투약한 다음, 재조합 사람 met Fc-OB 단백질과 사람 met OB 단백질의 혈청 농도를 효소-결합 면역 흡착제 분석(ELISA)에 의하여 측정한다.

두 종에서, 더 높은 최고 혈청 농도와 더 큰 혈청 - 농도 - 곡선 - 하의(AUC) 지역에 의하여, 정량된, 노출의 증가를, 재조합 met-사람 OB 단백질과 비교하여 관찰한다. Fc-OB 는 재조합 met-사람 OB 단백질보다 더 낮은 전신 청소율을 갖는다. 이것으로 OB 단백질 이상의 Fc-OB 의 더 긴 반감기와 더 낮은 청소율을 볼 수 있다. 크기의 증가는 단백질의 안정성의 증가를 일으킬 뿐만 아니라, 신장 청소율의 효능 감소를 일으킨다. 결과적으로 Fc-OB 는 전신순환에서 더 느리게 나타난다. Fc-OB 단백질의 최대 시간, 최대 혈청 농도와 AUC 의 증가는 더 낮은 청소율을 이룬다. Fc-OB 단백질은 실질적으로 OB 단백질과 비교했을 때 더 높은 전신 노출을 일으킨다. 그 결과는 다음 표 4 에 표시했다.

실시예 5 :

이 실시예에서는 비만하지 않고 혈액 지질수준이 상승하지 않은 정상 마우스에서 사람 재조합 Fc-OB 단백질을 투여하면 콜레스테롤, 글루코오스와 트리글리세리드 수준의 저하를 가져옴을 증명한다. 더불어, 이 실시예에서는 이러한 수준들이 3 일 회복기간 이상 낮게 유지되는 것을 증명한다.

정상 CD1 마우스에 피하 주사를 통하여 재조합 사람 Fc-OB 단백질을 투여한다. 혈액 시료를 주사 최종일, 23 일 후 24 시간에 취한다. 상술한 바와 같이, 투여된 투약량에서 동물의 중량은 감소 했다. 표 5 에 표시된 바와 같이, 마우스는 비교물과 비교했을때 투약량 - 의존형 패션에서 혈청 콜레스테롤, 글루코오스와 트리글리세리드의 실질적인 감소를 가했다.

이들 데이터는 Fc-OB 단백질, 또는 이의 유사체나 유도체가 유효한 혈액 지질 저하제임을 증명한다.

실시예 6

비만사람 환자에게 감량을 위하여 Fc-OB 단백질 또는 유사체나 유도체를 투여한다. 또한 비반 환자는 200　㎎/100 ㎖ 이상의, 상승된 콜레스테롤 수준을 포함하여, 상승된 혈액 지질 수준을 가졌다. 환자는 Fc-OB 치료 과정에서 만족스러운 감량을 얻는다. Fc-OB 단백질 또는 유사체나 유도체의 유지 투약량을 비-비만 환자에게 투여하여, 200 ㎎/100 ㎖ 이하의, 낮은 콜레스테롤 수준을 포함하는 낮은 혈액 지질 수준을 유지한다. 투여되는 투약량은 그 이상의 감량을 가져오기에는 불충분하다. 투여는 만성적이다. 순환 Fc-OB 단백질 또는 유사체나 유도체의 수준은 OB 단백질(또는 항원성 공급원)에 대한 항체 분석과 같은, 진단 키트를 사용하여 감시할 수 있다.

실시예 7 :

비-비만 사람 환자에게 관상동맥 우회 수술 또는 기타 침습성 치료를 가하여 진전된 상태의 동맥 플라크 형성을 완화시킨다. 수술후, 환자에게 Fc-OB 단백질 또는 유사체나 유도체의 유지 투약량을 투여하여 동맥 플라크의 재 - 형성을 방지한다. 투약량은 감량을 가져오는데 불충분하고, 투여는 만성적이다. 순환 Fc-OB 단백질 유사체나 유도체의 수준은 OB 단백질(또는 다른 항원성 공급원)에 대한 항체 분석과 같은, 진단 키트를 사용하여 감시할 수 있다.

실시예 8 :

비-비만 사람 환자는 막힌 동맥에서 제한된 혈류로 인하여 고혈압을 갖는다. 환자에게 막힌 동맥으로 일어나는 동맥 플라크를 감소시키기위하여 충분한 Fc-OB 단백질, 또는 이의 유사체나 유도체의 투약량을 투여한다. 다음, 다른 동맥 플라크 형성과 고혈압에 대하여 환자를 감시한다. 환자에게서 증상이 재-발현하면, 감량을 가져오는데는 불충분하나, 혈류에 재저장하는데는 충분한 유효량을 Fc-OB 단백질, 유사체 또는 유도체를 재투여한다. 순환 Fc-OB 단백질 또는 유사체나 유도체의 수준은 Fc-OB 단백질(또는 다른 항원성 공급원)에 대한 항체 분석과 같은, 진단 키트를 사용하여 감시할 수 있다.

실시예 9 :

사람 환자가 담석을 가지면, 담석을 제거하지 않고 부가적 담석 형성을 피해야하고, 아니면 담석을 제거하고 담낭을 남게하고(예를들어, 레이저 또는 초음파 수술을 사용하여)부가적 담석 형성을 피해야한다. 환자에게 유효량의 Fc-OB 단백질, 이의 유사체 또는 유도체를 투여하여 부가적 담석의 축적 또는 담석의 재축적을 예방한다. 순환 Fc-OB 단백질 또는 유사체나 유도체의 수준은 Fc-OB 단백질(또는 다른 항원성 공급원)에 대한 항체 분석과 같은, 진단 키트를 사용하여 감시할 수 있다.

실시예 10 :

당뇨병 사람 환자에게는 당뇨병의 치료에 있어 감소된 투약량의 인슐린을 사용하는 것이 좋다. 환자에게 유효량의 Fc-OB 단백질, 이의 유사체 또는 유도체를 투여하여 마른 조직 중량의 증가를 가져 오도록한다. 인슐린 증가에 대한 환자의 민감성과, 당뇨병의 증상을 완화하는데 필요한 인슐린의 투약량은 필요한 인슐린 단위의 감소에 의하여, 아니면 매일 필요한 인슐린의 주사회수의 감소에 의하여, 감소된다. 순환 Fc-OB 단백질 또는 유사체나 유도체의 수준은 OB 단백질(또는 다른 항원성 공급원)에 대한 항체 분석과 같은, 진단 키트를 사용하여 감시할 수 있다.

실시예 11 :

비-비만 사람 환자에게는 마른 조직 중량으로 수분이 감소된 질병으로부터의 회복과 같은, 치료용의 마른 조직 중량의 증가가 필요하다. 환자에게 유효량의 Fc-OB 단백질, 이의 유사체 또는 유도체를 투여하여 원하는 마른 조직 중량의 증가를 가져오도록 한다. 마른 조직 중량의 증가는 DEXA 주사를 사용하여 감시한다. 순환 Fc-OB 단백질 또는 유사체나 유도체는 OB 단백질(또는 다른 항원성 공급원)에 대한 항체 분석과 같은, 진단키트를 사용하여 감시할 수 있다.

재료와 방법

동물. 야생형 CD1 마우스와 (+/+)C57B16 마우스를 상기 실시예들에서 사용한다. 최초 시점에서 마우스의 나이는 8 주이고, 동물은 안정된 중량을 갖는다.

급식과 중량 측정. 일정한 덩어리 먹이의 사용보다 더 정확하고 민감한 측정을 허용하는 먹이 분말 공급자(Allen town Caging and Equipment)의 분쇄된 마우스 먹이(PMI Feeds, Inc.)를 마우스에게 공급한다. 원하는 기간 동안, 매일 동일한 시간(2 : 00 p.m.)에 중량을 측정한다. 주사하기 전날에 체중을 기준 중량으로 정의한다. 사용된 마우스의 무게 18-22 그람이었다.

거처. 마우스를 단독 - 수용하고, 양호한 조건하에서 유지한다.

단백질 또는 부형제의 투여. 단백질(하기에 설명)또는 부형제(인산염 완충 염수, pH 7.4)를 피하주사 또는 정맥내에 투여한다.

비교물. 비교 동물은 부형제에 첨가되는 Fc-OB 융합 단백질 또는 OB 단백질없이 부형제만을 주사한 것이다.

단백질. 서열 ID. NUS. 1,2 와 3 은 마우스 재조합 OB DNA 와 단백질을 설명하고(도 1), 서열 ID. NOS. 4,5 와 6 은 재조합 사람 OB DNA 와 단백질을 설명한다(도 2). 상기한 바와같이, 서열 번호 : 6 에서와 같은 재조합 사람 OB 단백질은 위치 35 에서 리신 잔기와 위치 74 에서 이소류신 잔기를 갖는다. 더욱이, 재조합사람 단백질은 상기 장 등., Natuno 와 PCT 공보 WO 96/05309 (12/22/96)에 설명되어 있고(둘은 도면을 포함하여 참고적으로 인용되어 있다), 도 1 과 2 의 마우스와 사람 유사체 재조합 단백질은 본 치료방법과 약제의 제조방법의 Fc-OB 융합 단백질을 형성하는데 사용되는 OB 단백질을 예시한 것이다. 또한 다른 OB 또는 Fc 단백질 또는 이의 유사체나 유도체도 Fc-OB 융합 단백질을 형성하는데 사용할 수 있다.

여기서, 재조합 OB 단백질의 아미노산 서열의 제일 아미노산은 +1 로서 언급되고 발린이며, 위치 -1 에서 아미노산은 메티오닌이다. C-말단 아미노산은 번호 146(시스테인)이다(참조 도 1 과 2). 도 3 의 재조합 사람 Fc-OB 단백질의 제일 아미노산 서열은 +1 로서 언급되고, 글루타민산염이고, 위치 -1 에서 아미노산은 메티오닌이다. C-말단 아미노산은 번호 378(시스테인)이다. 도 4 의 재조합 사람 Fc-OB 단백질 변이체의 제일 아미노산 서열은 +1 로서 언급되고, 글루타민산염이고, 위치 -1 에서 아미노산은 메티오닌이다. C-말단 아미노산은 번호 378(시스테인)이다. 도 5 의 재조합 사람 Fc-OB 단백질 변이체의 제일아미노산 서열은 +1 로서 언급되고, 아스팔트산이고, 위치 -1 에서 아미노산은 메티오닌이다. C-말단 아미노산은 번호 373(시스테인)이다. 도 6 의 재조합 사람 Fc-OB 단백질 변이체의 제일 아미노산 서열은 +1 로서 언급되고, 아스팔트산이고, 위치 -1 에서 아미노산은 메티오닌이다. C-말단 아미노산은 번호 373(시스테인)이다.

발현 벡터와 숙주 균주

사용된 플라스미드 발현 벡터는 pAMG 21(ATCC 기탁번호 98113)이고, 이는 pCFM 1656(ATCC 기탁번호 69576)의 유도체이고 lux PR 촉진 유전자로부터 하류의 유전자를 삽입하는 적당한 제한 위치를 함유한다(참조 lux 발현계를 설명한 미국특허 제 5,169,318 호). 하기에서 설명하고 도 3-6 에 표시된 Fc-OB DNA 는 제한 엔도누클레아제 NdeI 와 BamHI 로 선형화된 발현 벡터 pAMG 21 로 창출되어 결찰되고(E. coli) 숙주 균주. FM5 로 형질전환된다. E. coli FM5 세포(ATCC 기탁번호 제 53911 호)는 캘리포니아 다우샌드 오크스의 암젠 인코포레이티드에서 E. coli K-12 균주로부터 유도했고(바크만, 등., Bacterial. Rer. 40 : 116-167 (1976))통합 람다 억제물질 유전자, cI857 을 함유한다(서스맨 등., C.R.Acad. Sci. 254 : 1517-1579 (1962)). 벡터 제조, 세포 형질 전환과 콜로니 선택은 표준 방법에 의하여 행한다(예를들어, 삼브룩 등., Molecular Cloning : 뉴욕, 콜드 스프링 하버, 콜드 스프링 하버 레버러토리 프레스의 실험 매뉴얼 2 판). 숙주 세포는 LB 배지에서 성장한다.

Fc-OB DNA 구성

플라스미드 pFc-A3(하기에 기재)는 아미노산 번호 99(Glu)에서 천연 카르복실 말단까지 사람 면역글로불린 IgG-1 중쇄의 서열 공급원으로서 작용한다. 사람 IgG-1 서열은 Gene bank(PO1857)에서 얻을 수 있다.

사람 OB 서열은 상기 장 등의 Nature 와 PCT 공보 WO 96/05309 에서와 상기에서 기재 했으며, 둘은 참고적으로 도면을 포함하여 여기에 인용했다. OB DNA 는 표준 클로닝 과정, 예를들어, 삼브룩 등., Mollcular Cloning : 뉴욕 콜드 스프링하버 콜드 스프링하버 래버러토리 프레스, 실험 매뉴열, 2 판을 사용하여 제한 엔도누클레아제 XbaI 와 BamHI 로 선형화된 발현 벡터 pCFM 1656 로 결찰된다. OB DNA 서열을 갖는 플라스미드 pCFM 1656 은 재조합 사람 OB 유전자의 서열 공급원으로서 작용한다.

이들 두 서열의 유전자 융합은 PCR 중복신장의 방법으로 행한다(호. 에스. 엔. 등, Site Directed Mutagenesis By Oyerlap Extension Using The Polymer Chain Reaction, 유전자 77 : 51-59 (1989)) PCR 의 생성물은 제한 엔도누클레아제 NdeI 로 분열하여 5'-cohesive 을 일으키고 제한 엔도누클레아제 BamHI 로 분열하여 3'-cohesive 말단을 일으킨다. 벡터, pAMG 21 은 유사하게 분열하다. 결찰은 융합단편과 선형화된 벡터로 행한다. 결찰된 DNA 를 전기영동에 의하여 이. 콜리. 숙주균주로 형질 전환시킨다. 카나마이신(50 ㎍/㎖)선택 한천판에서 생존하는 클론을 Fc-OB-크기 단백질의 발현으로 점검한다. 개체 클론에서 나온 플라스미드를 단되하고 부위를 부호화한 유전자의 서열을 검증한다.

Fc-OB 유전자의 부가적인 변이를 원하면, PCR 방법을 다시 사용하여 변화가 일어 나도록 한다. 두 세트의 변화를 융합 단백질(서열 번호 : 9)의 Fc 부분의 N-말단에서 행하여 변이체 서열 번호 : 12 와 15 를 일으킨다. 다른 변이체를 구성하여 4 개의 아미노산 치환기를 도입하므로서 Fc-수용체 결합부위(글루타민산염으로 치환된 위치 15 에서 류신)와, 보체(Clg)결합부위(알라닌으로 치환된 위치 98 에서 글루타민산염, 알라닌으로 치환된 위치 100 에서 리신과 알라닌으로 치환된 위치 102 에서 리신(참존, 크신 크시아오 젱 등, J. Immunol. 154 : 5590-5600 (1995))를 제거한다. 이러한 구성의 형태는 서열 번호 : 15 이고 생성한 변이체는 서열 번호 : 18 이다.

pFc-A3 벡터 구성

접번 도메인(hinge domain)의 제일 아미노산 Glu-99 에서 카르복실 말단 플러스 5'-Not1 융합 부위와 3'SalI 와 XbaI 부위까지, 사람 면역글로불린 IgG-1 중쇄(참조, 엘리선, 제이. 더블유. 등., Nucleic Acids Res. 10 : 4071-4079 (1982))의 Fc 부분을 부호화한 부위를 함유하는 플라스미드, pFc-A3 은 사람 비장 cDNA 라이브러리의 PCR 증폭에 의하여 만든다. PCR 반응물은 최종체적이 100 ㎖ 이고 20 mM Tris-Hcl(pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM(NH₄)₂SO₄, 2 mM MgSO₄, 400 mM 의 각 dNTP 를 갖는 0.1 % Triton X-100 과 1 μM 의 각 시발체와 함께 증폭되는 1 ng 의 cDNA 라이브러리에서 2 단위의 벤트 DNA 중합 효소를 사용한다. 2 분동안 95 ℃ 에서 변성시켜서 반응을 개시한 다음, 30 초 동안 95 ℃, 30 초동안 55 ℃ 와 2 분동안 73 ℃ 의 30 주기로 반응시킨다. 5'-시발체는 NotI 부위 직전 5' 를 IgG-1 의 접번 도메인(hinge domein)의 제일 잔기(Glu-99)에 혼합한 것이다. 3'-시발체는 SalI 와 XbaI 부위를 혼합한 것이다. 717 염기쌍 PCR 생성물은 NotI 와 SalI 로 소화시키고, 생성한 DNA 단편을 1 % 아가로오스를 통하여 전기 영동하여 단리시키고 정제하고 NotI, SalI-소화 pBluescript Ⅱ KS 벡터(층유전자)로 클론화한다. 생성한 플라스미드, pFc-A3 의 삽입을 계속하여 PCR 반응의 적합성을 확인한다.

제조방법

하기 제조방법을 사용하여 생물학적 활성 재조합 메티오닐 마우스 또는 사람 유사체 OB 단백질과 Fc-OB 융합 단백질을 제조한다. 유사한 방법을 사용하여 생물학적 활성 메티오닐 사람 OB 단백질을 제조한다.

발효공정

배치 발효 공정을 사용하고, 배지 조성은 다음과 같다.

우선 질소금원으로 이루어지는 배지의 일부분을 발효 용기에서 살균한다(25∼35 분동안 온도를 120∼123 ℃ 로 상승시킨다). 냉각하고, 탄소, 마그네슘, 인산염과 미량의 금속 금원을 무균으로 참가한다. 500 ㎖ 의 상기 재조합 마우스 단백질 - 생성 박테리아(LB 육즙에서 성장)를 하룻밤 배양하고 발효기에 첨가한다. 배양 흡광도(세포 밀도용 지시제로 600 ㎚ 에서 측정)가 15∼25 흡수 단위에 도달하면, 자동유도물질 용액(0.5 ㎎/㎖ 호모세린락톤)을 배양물에 가하여 재조합 유전자 발현을 유도한다. 발효공정을 부가적으로 10∼16 시간 계속한 다음, 원심분리로 육즙을 수확한다.

배지 조성 :

배치 : 34 g/ℓ 효모 추출액

78 g/ℓ 대두 펩톤

0.9 g/ℓ 염화 칼슘

5.0 g/ℓ 헥사포스

1.7 g/ℓ 시트르산

120 g/ℓ 글리세롤

0.5 g/ℓ MgSO₄·7H₂O

0.2 ㎖/ℓ 미량의 금속용액

0.5 ㎖/ℓ P2000 소포제

미량의 금속용액 :

염화제이철(FeCl₃·6H₂O) : 27 g/ℓ

염화아연(ZnCl₂·4H₂O) : 2 g/ℓ

염화코발트(CoCl₂·6H₂O) : 2 g/ℓ

몰리보덴산 나트륨(NaMoO₄·2H₂O) : 2 g/ℓ

염화 칼슘(CaCl₂·2H₂O) : 1 g/ℓ

황산 제이동(CuSO₄·5H₂O) : 1.9 g/ℓ

붕산(H₃BO₃) : 0.5 g/ℓ

염화망간(MnCl₂·4H₂O) : 1.6 g/ℓ

시트르산 나트륨 이수화물 : 73.5 g/ℓ

사람 Fc-OB 융합 단백질의 정제공정

사람 Fc-OB 융합 단백질의 정제는 다음 단계로 이루어진다(다른 언급이 없는한, 다음 단계는 4 ℃ 에서 행한다). 마우스와 사람 OB 단백질의 정제는 상기 PCT 공보 WO 96/05309 에 기재되어 있고, 이는 참고적으로 여기에 인용되어 있다.

1. 세포 페이스트. E. coli 세포 페이스트를 체적의 증류수에 5 회 현탁시킨다. 물에서 세포를 미소유동기로 2 회 통과 시켜서 더 파쇄한다. 파쇄된 세포를 J5-4.2 회전기를 갖는 베크만 JB-6 원심분리기에서 1 시간 동안 4.2 Krpm 으로 원심분리한다.

2. 내포 신체 세척 상기에서 나온 상청액을 제거하고 펠릿을 5 체적의 증류수에 재현탁시킨다. 혼합물을 단계 1 에서와 같이 원심분리한다.

3. 용해. 펠릿을 10 체적의 50 mM Tris, pH 8.5, 8M 구아니디 염솨수소산염, 10 mM 디티오트레이톨에 용해 시키고 실온에서 한 시간 동안 교반한다. 용액을 40 mM 시스타민 이염화수소산염으로하고 한 시간 동안 교반한다.

4. 단계 3 에서 나온 용액을 20∼30 체적의 다음 혼합 용액 : 50 mM Tris, pH 8.5, 0.8 M 알기닌, 2 M 요소와 4 mM 시스테인에 가한다. 혼합용액을 8 ℃ 에서 16 시간동안 교반한다.

5. 완충제 교환. 단계 4 에서 나온 용액을 농축하고 pH 8.5 10 mM Tris 로 다이아여과한다.

6. 산 침전. 단계 5 에서 나온 용액을 50 % 빙초산으로 pH 4.75 로 조정하고 실온에서 30 분동안 배양한다. 용액을 여과한다.

7. 양이온 교환 크로마토그래피. 단계 6 에서 나온 용액을 pH 7.0 으로 조정하고 10 ℃ 에서 CM 세파로오스 고속 유동컬럼에 충전한다. 20 컬럼 체적 기울기를 10 mM 인산염, pH 7.0 에서 0∼0.1 M NaCl 로 행한다.

8. 음이온 교환 크로마토그래피. 단계 7 에서 나온 CM 용출푸울을 pH 7.5, 5 mM Tris 로 5 배 희석하고 10 ℃ 에서 Q 세파로오스 고속 유동으로 충전한다. 20 컬럼 체적 기울기를 pH 7.5, 10 mM Tris 에서, 0∼0.2 M NaCl 로 행한다.

9. 소수성 상호작용 크로마토그래피. Q 세파로오스, 푸울을 0.75 M 황산 암모늄으로 만들고 실온에서 메틸 머크로프렙 소수성 상호작용 컬럼에 충전한다. 20 컬럼 체적 기울기를 pH 7.0, 10 mM 인산염에서, 0.75 M∼0M 황산 암모늄으로 행한다.

10. 완충제 교환. 단계 9 에서 나온 푸울을 필요에따라 농축하고 PBS 완충제에 대하여 투석한다.

본 발명을 바람직한 구성에 의하여 설명하며, 본 분야의 전문가는 변경과 수정을 할수 있음을 이해할 것이다. 그러므로 첨부된 특허청구의 범위는 특허청구된 본 발명의 범위내에 있는 이러한 상당하는 변경을 모두 커버하는 것이다.

SEQUENCE LISTING

(1) GENERAL INFORMATION:

(i) APPLICANT: Amgen Inc.

(ii) TITLE OF INVENTION: OB FUSION PROTEIN COMPOSITIONS AND

METHODS

(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 18

(iv) CORRESPONDENCE ADDRESS:

(A) ADDRESSEE: Amgen Inc.

(B) STREET: 1840 DeHavilland Drive

(C) CITY: Thousand Oaks

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AGATCTAAAC TCAAAATTGA AAATCTTCCT CCTTATTGTA TACCATGGCT AGGTCTTTCA 60

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TGGCCTTAGG GACCTGCCCC AGGACCTTCG TAGGGACATG TCGTGGCTTC AACAACGAGA 420

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Met Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys

1 5 10 15

Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val Ser

20 25 30

Ala Lys Gln Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro

35 40 45

Ile Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln

50 55 60

Val Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gln Asn Val Leu Gln Ile Ala Asn Asp

65 70 75 80

Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala Phe Ser Lys Ser

85 90 95

Cys Ser Leu Pro Gln Thr Ser Gly Leu Gln Lys Pro Glu Ser Leu Asp

100 105 110

Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser

115 120 125

Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Ile Leu Gln Gln Leu Asp Val Ser

130 135 140

Pro Glu Cys

145

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CATATGGTAC CGATCCAGAA AGTTCAGGAC GACACCAAAA CCTTAATTAA AACGATCGTT 60

ACGCGTATCA ACGACATCAG TCACACCCAG TCGGTGAGCT CTAAACAGCG TGTTACAGGC 120

CTGGACTTCA TCCCGGGTCT GCACCCGATC CTGACCTTGT CCAAAATGGA CCAGACCCTG 180

GCTGTATACC AGCAGATCTT AACCTCCATG CCGTCCCGTA ACGTTCTTCA GATCTCTAAC 240

GACCTCGAGA ACCTTCGCGA CCTGCTGCAC GTGCTGGCAT TCTCCAAATC CTGCCACCTG 300

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TACAGCACCG AAGTTGTTGC TCTGTCCCGT CTGCAGGGTT CCCTTCAGGA CATGCTTTGG 420

CAGCTGGACC TGTCTCCGGG TTGTTAATGG ATCC 454

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GTATACCATG GCTAGGTCTT TCAAGTCCTG CTGTGGTTTT GGAATTAATT TTGCTAGCAA 60

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CGACATATGG TCGTCTAGAA TTGGAGGTAC GGCAGGGCAT TGCAAGAAGT CTAGAGATTG 240

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GGTACCCGAA GTCCAGAACT CTGAGACCTG AGAGACCCGC CCCAGGACCT TCGTAGGCCA 360

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GTCGACCTGG ACAGAGGCCC AACAATTACC TAGG 454

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Met Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys

1 5 10 15

Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val Ser

20 25 30

Ser Lys Gln Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro

35 40 45

Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln

50 55 60

Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Leu Gln Ile Ser Asn Asp

65 70 75 80

Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser

85 90 95

Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly

100 105 110

Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser

115 120 125

Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu Asp Leu Ser

130 135 140

Pro Gly Cys

145

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GAGCAGTACA ACAGCACGTA CCGTGTGGTC AGCGTCCTCA CCGTCCTGCA CCAGGACTGG 300

CTGAATGGCA AGGAGTACAA GTGCAAGGTC TCCAACAAAG CCCTCCCAGC CCCCATCGAG 360

AAAACCATCT CCAAAGCCAA AGGGCAGCCC CGAGAACCAC AGGTGTACAC CCTGCCCCCA 420

TCCCGGGATG AGCTGACCAA GAACCAGGTC AGCCTGACCT GCCTGGTCAA AGGCTTCTAT 480

CCCAGCGACA TCGCCGTGGA GTGGGAGAGC AATGGGCAGC CGGAGAACAA CTACAAGACC 540

ACGCCTCCCG TGCTGGACTC CGACGGCTCC TTCTTCCTCT ACAGCAAGCT CACCGTGGAC 600

AAGAGCAGGT GGCAGCAGGG GAACGTCTTC TCATGCTCCG TGATGCATGA GGCTCTGCAC 660

AACCACTACA CGCAGAAGAG CCTCTCCCTG TCTCCGGGTA AAGTACCGAT CCAGAAAGTT 720

CAGGACGACA CCAAAACCTT AATTAAAACG ATCGTTACGC GTATCAACGA CATCAGTCAC 780

ACCCAGTCGG TGAGCTCTAA ACAGAAAGTT ACAGGCCTGG ACTTCATCCC GGGTCTGCAC 840

CCGATCCTGA CCTTGTCCAA AATGGACCAG ACCCTGGCTG TATACCAGCA GATCTTAACC 900

TCCATGCCGT CCCGTAACGT TATCCAGATC TCTAACGACC TCGAGAACCT TCGCGACCTG 960

CTGCACGTGC TGGCATTCTC CAAATCCTGC CACCTGCCAT GGGCTTCAGG TCTTGAGACT 1020

CTGGACTCTC TGGGCGGGGT CCTGGAAGCA TCCGGTTACA GCACCGAAGT TGTTGCTCTG 1080

TCCCGTCTGC AGGGTTCCCT TCAGGACATG CTTTGGCAGC TGGACCTGTC TCCGGGTTGT 1140

TAATGGATCC 1150

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GTATACCTTG GGTTTAGAAC ACTGTTTTGA GTGTGTACGG GTGGCACGGG TCGTGGACTT 60

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CTCGTCATGT TGTCGTGCAT GGCACACCAG TCGCAGGAGT GGCAGGACGT GGTCCTGACC 300

GACTTACCGT TCCTCATGTT CACGTTCCAG AGGTTGTTTC GGGAGGGTCG GGGGTAGCTC 360

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GGGTCGCTGT AGCGGCACCT CACCCTCTCG TTACCCGTCG GCCTCTTGTT GATGTTCTGG 540

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ATTACCTAGG 1150

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Met Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

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Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

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Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

35 40 45

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

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65 70 75 80

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

85 90 95

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

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Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

115 120 125

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

130 135 140

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

145 150 155 160

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

165 170 175

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

180 185 190

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

195 200 205

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

210 215 220

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Val Pro Ile Gln Lys Val Gln

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Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp

245 250 255

Ile Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu

260 265 270

Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp

275 280 285

Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg

290 295 300

Asn Val Ile Gln Ile Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu

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His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly

325 330 335

Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr

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Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp

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370 375

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(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: misc_feature

(B) LOCATION: 4

(D) OTHER INFORMATION: /note= "Met = ATG"

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:10:

CATATGGAAC CAAAATCTGC TGACAAAACT CACACATGTC CACCTTGTCC AGCTCCGGAA 60

CTCCTGGGGG GTCCTTCAGT CTTCCTCTTC CCCCCAAAAC CCAAGGACAC CCTCATGATC 120

TCCCGGACCC CTGAGGTCAC ATGCGTGGTG GTGGACGTGA GCCACGAAGA CCCTGAGGTC 180

AAGTTCAACT GGTACGTGGA CGGCGTGGAG GTGCATAATG CCAAGACAAA GCCGCGGGAG 240

GAGCAGTACA ACAGCACGTA CCGTGTGGTC AGCGTCCTCA CCGTCCTGCA CCAGGACTGG 300

CTGAATGGCA AGGAGTACAA GTGCAAGGTC TCCAACAAAG CCCTCCCAGC CCCCATCGAG 360

AAAACCATCT CCAAAGCCAA AGGGCAGCCC CGAGAACCAC AGGTGTACAC CCTGCCCCCA 420

TCCCGGGATG AGCTGACCAA GAACCAGGTC AGCCTGACCT GCCTGGTCAA AGGCTTCTAT 480

CCCAGCGACA TCGCCGTGGA GTGGGAGAGC AATGGGCAGC CGGAGAACAA CTACAAGACC 540

ACGCCTCCCG TGCTGGACTC CGACGGCTCC TTCTTCCTCT ACAGCAAGCT CACCGTGGAC 600

AAGAGCAGGT GGCAGCAGGG GAACGTCTTC TCATGCTCCG TGATGCATGA GGCTCTGCAC 660

AACCACTACA CGCAGAAGAG CCTCTCCCTG TCTCCGGGTA AAGTACCGAT CCAGAAAGTT 720

CAGGACGACA CCAAAACCTT AATTAAAACG ATCGTTACGC GTATCAACGA CATCAGTCAC 780

ACCCAGTCGG TGAGCTCTAA ACAGAAAGTT ACAGGCCTGG ACTTCATCCC GGGTCTGCAC 840

CCGATCCTGA CCTTGTCCAA AATGGACCAG ACCCTGGCTG TATACCAGCA GATCTTAACC 900

TCCATGCCGT CCCGTAACGT TATCCAGATC TCTAACGACC TCGAGAACCT TCGCGACCTG 960

CTGCACGTGC TGGCATTCTC CAAATCCTGC CACCTGCCAT GGGCTTCAGG TCTTGAGACT 1020

CTGGACTCTC TGGGCGGGGT CCTGGAAGCA TCCGGTTACA GCACCGAAGT TGTTGCTCTG 1080

TCCCGTCTGC AGGGTTCCCT TCAGGACATG CTTTGGCAGC TGGACCTGTC TCCGGGTTGT 1140

TAATGGATCC 1150

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:11:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 1150 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: double

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:11:

GTATACCTTG GTTTTAGACG ACTGTTTTGA GTGTGTACAG GTGGAACAGG TCGAGGCCTT 60

GAGGACCCCC CAGGAAGTCA GAAGGAGAAG GGGGGTTTTG GGTTCCTGTG GGAGTACTAG 120

AGGGCCTGGG GACTCCAGTG TACGCACCAC CACCTGCACT CGGTGCTTCT GGGACTCCAG 180

TTCAAGTTGA CCATGCACCT GCCGCACCTC CACGTATTAC GGTTCTGTTT CGGCGCCCTC 240

CTCGTCATGT TGTCGTGCAT GGCACACCAG TCGCAGGAGT GGCAGGACGT GGTCCTGACC 300

GACTTACCGT TCCTCATGTT CACGTTCCAG AGGTTGTTTC GGGAGGGTCG GGGGTAGCTC 360

TTTTGGTAGA GGTTTCGGTT TCCCGTCGGG GCTCTTGGTG TCCACATGTG GGACGGGGGT 420

AGGGCCCTAC TCGACTGGTT CTTGGTCCAG TCGGACTGGA CGGACCAGTT TCCGAAGATA 480

GGGTCGCTGT AGCGGCACCT CACCCTCTCG TTACCCGTCG GCCTCTTGTT GATGTTCTGG 540

TGCGGAGGGC ACGACCTGAG GCTGCCGAGG AAGAAGGAGA TGTCGTTCGA GTGGCACCTG 600

TTCTCGTCCA CCGTCGTCCC CTTGCAGAAG AGTACGAGGC ACTACGTACT CCGAGACGTG 660

TTGGTGATGT GCGTCTTCTC GGAGAGGGAC AGAGGCCCAT TTCATGGCTA GGTCTTTCAA 720

GTCCTGCTGT GGTTTTGGAA TTAATTTTGC TAGCAATGCG CATAGTTGCT GTAGTCAGTG 780

TGGGTCAGCC ACTCGAGATT TGTCTTTCAA TGTCCGGACC TGAAGTAGGG CCCAGACGTG 840

GGCTAGGACT GGAACAGGTT TTACCTGGTC TGGGACCGAC ATATGGTCGT CTAGAATTGG 900

AGGTACGGCA GGGCATTGCA ATAGGTCTAG AGATTGCTGG AGCTCTTGGA AGCGCTGGAC 960

GACGTGCACG ACCGTAAGAG GTTTAGGACG GTGGACGGTA CCCGAAGTCC AGAACTCTGA 1020

GACCTGAGAG ACCCGCCCCA GGACCTTCGT AGGCCAATGT CGTGGCTTCA ACAACGAGAC 1080

AGGGCAGACG TCCCAAGGGA AGTCCTGTAC GAAACCGTCG ACCTGGACAG AGGCCCAACA 1140

ATTACCTAGG 1150

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:12:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 379 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(C) STRANDEDNESS: unknown

(D) TOPOLOGY: unknown

(ii) MOLECULE TYPE: protein

(ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: Protein

(B) LOCATION: 1

(D) OTHER INFORMATION: /note= "Met (ATG) starts at -1"

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:12:

Met Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

20 25 30

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

35 40 45

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

50 55 60

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

65 70 75 80

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

85 90 95

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

100 105 110

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

115 120 125

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

130 135 140

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

145 150 155 160

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

165 170 175

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

180 185 190

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

195 200 205

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

210 215 220

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Val Pro Ile Gln Lys Val Gln

225 230 235 240

Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp

245 250 255

Ile Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu

260 265 270

Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp

275 280 285

Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg

290 295 300

Asn Val Ile Gln Ile Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu

305 310 315 320

His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly

325 330 335

Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr

340 345 350

Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp

355 360 365

Met Leu Trp Gln Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys

370 375

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:13:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 1135 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: double

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: misc_feature

(B) LOCATION: 4

(D) OTHER INFORMATION: /note= "Met = ATG"

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:13:

CATATGGACA AAACTCACAC ATGTCCACCT TGTCCAGCTC CGGAACTCCT GGGGGGTCCT 60

TCAGTCTTCC TCTTCCCCCC AAAACCCAAG GACACCCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG 120

GTCACATGCG TGGTGGTGGA CGTGAGCCAC GAAGACCCTG AGGTCAAGTT CAACTGGTAC 180

GTGGACGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCGC GGGAGGAGCA GTACAACAGC 240

ACGTACCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTC CTGCACCAGG ACTGGCTGAA TGGCAAGGAG 300

TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGCCCTC CCAGCCCCCA TCGAGAAAAC CATCTCCAAA 360

GCCAAAGGGC AGCCCCGAGA ACCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCG GGATGAGCTG 420

ACCAAGAACC AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTATCCCAG CGACATCGCC 480

GTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACGCC TCCCGTGCTG 540

GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AAGCTCACCG TGGACAAGAG CAGGTGGCAG 600

CAGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATG CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACGCAG 660

AAGAGCCTCT CCCTGTCTCC GGGTAAAGTA CCGATCCAGA AAGTTCAGGA CGACACCAAA 720

ACCTTAATTA AAACGATCGT TACGCGTATC AACGACATCA GTCACACCCA GTCGGTGAGC 780

TCTAAACAGA AAGTTACAGG CCTGGACTTC ATCCCGGGTC TGCACCCGAT CCTGACCTTG 840

TCCAAAATGG ACCAGACCCT GGCTGTATAC CAGCAGATCT TAACCTCCAT GCCGTCCCGT 900

AACGTTATCC AGATCTCTAA CGACCTCGAG AACCTTCGCG ACCTGCTGCA CGTGCTGGCA 960

TTCTCCAAAT CCTGCCACCT GCCATGGGCT TCAGGTCTTG AGACTCTGGA CTCTCTGGGC 1020

GGGGTCCTGG AAGCATCCGG TTACAGCACC GAAGTTGTTG CTCTGTCCCG TCTGCAGGGT 1080

TCCCTTCAGG ACATGCTTTG GCAGCTGGAC CTGTCTCCGG GTTGTTAATG GATCC 1135

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:14:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 1135 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: double

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:14:

GTATACCTGT TTTGAGTGTG TACAGGTGGA ACAGGTCGAG GCCTTGAGGA CCCCCCAGGA 60

AGTCAGAAGG AGAAGGGGGG TTTTGGGTTC CTGTGGGAGT ACTAGAGGGC CTGGGGACTC 120

CAGTGTACGC ACCACCACCT GCACTCGGTG CTTCTGGGAC TCCAGTTCAA GTTGACCATG 180

CACCTGCCGC ACCTCCACGT ATTACGGTTC TGTTTCGGCG CCCTCCTCGT CATGTTGTCG 240

TGCATGGCAC ACCAGTCGCA GGAGTGGCAG GACGTGGTCC TGACCGACTT ACCGTTCCTC 300

ATGTTCACGT TCCAGAGGTT GTTTCGGGAG GGTCGGGGGT AGCTCTTTTG GTAGAGGTTT 360

CGGTTTCCCG TCGGGGCTCT TGGTGTCCAC ATGTGGGACG GGGGTAGGGC CCTACTCGAC 420

TGGTTCTTGG TCCAGTCGGA CTGGACGGAC CAGTTTCCGA AGATAGGGTC GCTGTAGCGG 480

CACCTCACCC TCTCGTTACC CGTCGGCCTC TTGTTGATGT TCTGGTGCGG AGGGCACGAC 540

CTGAGGCTGC CGAGGAAGAA GGAGATGTCG TTCGAGTGGC ACCTGTTCTC GTCCACCGTC 600

GTCCCCTTGC AGAAGAGTAC GAGGCACTAC GTACTCCGAG ACGTGTTGGT GATGTGCGTC 660

TTCTCGGAGA GGGACAGAGG CCCATTTCAT GGCTAGGTCT TTCAAGTCCT GCTGTGGTTT 720

TGGAATTAAT TTTGCTAGCA ATGCGCATAG TTGCTGTAGT CAGTGTGGGT CAGCCACTCG 780

AGATTTGTCT TTCAATGTCC GGACCTGAAG TAGGGCCCAG ACGTGGGCTA GGACTGGAAC 840

AGGTTTTACC TGGTCTGGGA CCGACATATG GTCGTCTAGA ATTGGAGGTA CGGCAGGGCA 900

TTGCAATAGG TCTAGAGATT GCTGGAGCTC TTGGAAGCGC TGGACGACGT GCACGACCGT 960

AAGAGGTTTA GGACGGTGGA CGGTACCCGA AGTCCAGAAC TCTGAGACCT GAGAGACCCG 1020

CCCCAGGACC TTCGTAGGCC AATGTCGTGG CTTCAACAAC GAGACAGGGC AGACGTCCCA 1080

AGGGAAGTCC TGTACGAAAC CGTCGACCTG GACAGAGGCC CAACAATTAC CTAGG 1135

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:15:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 374 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(C) STRANDEDNESS: unknown

(D) TOPOLOGY: unknown

(ii) MOLECULE TYPE: protein

(ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: Protein

(B) LOCATION: 1

(D) OTHER INFORMATION: /note= "Met (ATG) starts at -1"

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:15:

Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

1 5 10 15

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

20 25 30

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

35 40 45

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

50 55 60

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

65 70 75 80

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

85 90 95

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

100 105 110

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

115 120 125

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

130 135 140

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

145 150 155 160

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

165 170 175

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

180 185 190

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

195 200 205

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

210 215 220

Ser Pro Gly Lys Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr

225 230 235 240

Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln

245 250 255

Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly

260 265 270

Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val

275 280 285

Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln Ile

290 295 300

Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe

305 310 315 320

Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp

325 330 335

Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val

340 345 350

Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu

355 360 365

Asp Leu Ser Pro Gly Cys

370

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:16:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 1135 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: double

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: misc_feature

(B) LOCATION: 4

(D) OTHER INFORMATION: /note= "Met = ATG"

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:16:

CATATGGACA AAACTCACAC ATGCCCACCG TGCCCAGCTC CGGAACTCGA AGGTGGTCCG 60

TCAGTCTTCC TCTTCCCCCC AAAACCCAAG GACACCCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG 120

GTCACATGCG TGGTGGTGGA CGTGAGCCAC GAAGACCCTG AGGTCAAGTT CAACTGGTAC 180

GTGGACGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCGC GGGAGGAGCA GTACAACAGC 240

ACGTACCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTC CTGCACCAGG ACTGGCTGAA TGGCAAAGCT 300

TACGCATGCG CGGTCTCCAA CAAAGCCCTC CCAGCCCCCA TCGAGAAAAC CATCTCCAAA 360

GCCAAAGGGC AGCCCCGAGA ACCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCG GGATGAGCTG 420

ACCAAGAACC AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTATCCCAG CGACATCGCC 480

GTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACGCC TCCCGTGCTG 540

GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AAGCTCACCG TGGACAAGAG CAGGTGGCAG 600

CAGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATG CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACGCAG 660

AAGAGCCTCT CCCTGTCTCC GGGTAAAGTA CCGATCCAGA AAGTTCAGGA CGACACCAAA 720

ACCTTAATTA AAACGATCGT TACGCGTATC AACGACATCA GTCACACCCA GTCGGTGAGC 780

TCTAAACAGA AAGTTACAGG CCTGGACTTC ATCCCGGGTC TGCACCCGAT CCTGACCTTG 840

TCCAAAATGG ACCAGACCCT GGCTGTATAC CAGCAGATCT TAACCTCCAT GCCGTCCCGT 900

AACGTTATCC AGATCTCTAA CGACCTCGAG AACCTTCGCG ACCTGCTGCA CGTGCTGGCA 960

TTCTCCAAAT CCTGCCACCT GCCATGGGCT TCAGGTCTTG AGACTCTGGA CTCTCTGGGC 1020

GGGGTCCTGG AAGCATCCGG TTACAGCACC GAAGTTGTTG CTCTGTCCCG TCTGCAGGGT 1080

TCCCTTCAGG ACATGCTTTG GCAGCTGGAC CTGTCTCCGG GTTGTTAATG GATCC 1135

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:17:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 1135 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: double

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:17:

GTATACCTGT TTTGAGTGTG TACGGGTGGC ACGGGTCGAG GCCTTGAGCT TCCACCAGGC 60

AGTCAGAAGG AGAAGGGGGG TTTTGGGTTC CTGTGGGAGT ACTAGAGGGC CTGGGGACTC 120

CAGTGTACGC ACCACCACCT GCACTCGGTG CTTCTGGGAC TCCAGTTCAA GTTGACCATG 180

CACCTGCCGC ACCTCCACGT ATTACGGTTC TGTTTCGGCG CCCTCCTCGT CATGTTGTCG 240

TGCATGGCAC ACCAGTCGCA GGAGTGGCAG GACGTGGTCC TGACCGACTT ACCGTTTCGA 300

ATGCGTACGC GCCAGAGGTT GTTTCGGGAG GGTCGGGGGT AGCTCTTTTG GTAGAGGTTT 360

CGGTTTCCCG TCGGGGCTCT TGGTGTCCAC ATGTGGGACG GGGGTAGGGC CCTACTCGAC 420

TGGTTCTTGG TCCAGTCGGA CTGGACGGAC CAGTTTCCGA AGATAGGGTC GCTGTAGCGG 480

CACCTCACCC TCTCGTTACC CGTCGGCCTC TTGTTGATGT TCTGGTGCGG AGGGCACGAC 540

CTGAGGCTGC CGAGGAAGAA GGAGATGTCG TTCGAGTGGC ACCTGTTCTC GTCCACCGTC 600

GTCCCCTTGC AGAAGAGTAC GAGGCACTAC GTACTCCGAG ACGTGTTGGT GATGTGCGTC 660

TTCTCGGAGA GGGACAGAGG CCCATTTCAT GGCTAGGTCT TTCAAGTCCT GCTGTGGTTT 720

TGGAATTAAT TTTGCTAGCA ATGCGCATAG TTGCTGTAGT CAGTGTGGGT CAGCCACTCG 780

AGATTTGTCT TTCAATGTCC GGACCTGAAG TAGGGCCCAG ACGTGGGCTA GGACTGGAAC 840

AGGTTTTACC TGGTCTGGGA CCGACATATG GTCGTCTAGA ATTGGAGGTA CGGCAGGGCA 900

TTGCAATAGG TCTAGAGATT GCTGGAGCTC TTGGAAGCGC TGGACGACGT GCACGACCGT 960

AAGAGGTTTA GGACGGTGGA CGGTACCCGA AGTCCAGAAC TCTGAGACCT GAGAGACCCG 1020

CCCCAGGACC TTCGTAGGCC AATGTCGTGG CTTCAACAAC GAGACAGGGC AGACGTCCCA 1080

AGGGAAGTCC TGTACGAAAC CGTCGACCTG GACAGAGGCC CAACAATTAC CTAGG 1135

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:18:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 374 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(C) STRANDEDNESS: unknown

(D) TOPOLOGY: unknown

(ii) MOLECULE TYPE: protein

(ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: Protein

(B) LOCATION: 1

(D) OTHER INFORMATION: /note= "Met (ATG) starts at -1"

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:18:

Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Glu

1 5 10 15

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

20 25 30

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

35 40 45

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

50 55 60

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

65 70 75 80

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

85 90 95

Gly Lys Ala Tyr Ala Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

100 105 110

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

115 120 125

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

130 135 140

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

145 150 155 160

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

165 170 175

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

180 185 190

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

195 200 205

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

210 215 220

Ser Pro Gly Lys Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr

225 230 235 240

Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln

245 250 255

Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly

260 265 270

Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val

275 280 285

Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln Ile

290 295 300

Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe

305 310 315 320

Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp

325 330 335

Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val

340 345 350

Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu

355 360 365

Asp Leu Ser Pro Gly Cys

370

Claims (19)

1. R₁-R₂와 R₁-L-R₂(여기서 R₁은 Fc 단백질 또는 이의 유사체이고, R₂는 OB 단백질 또는 이의 유사체이며, L 은 링커이다) 중에서 선택한 식을 갖는 단백질.
2. 제 1 항에 있어서, Fc, 유사체 또는 유도체는 다음 중에서 선택함을 특징으로 하는 단백질 :

   (a) 서열 번호 : 9, 12, 15 와 18 에 기술된 Fc 아미노산 서열 ;

   (b) 하나 또는 그 이상의 다음 위치에서 치환되거나 또는 삭제된 다른 아미노산을 갖는 부부분 (a)의 아미노산 서열(서열 번호 : 9 에 따른 번호 사용) :

   (ⅰ) 알라닌 또는 세린 잔기로 치환된 하나 또는 그 이상의 시

   스테인 잔기 ;

   (ⅱ) 페닐알라닌 잔기로 치환된 하나 또는 그 이상의 티로신 잔

   기 ;

   (ⅲ) 위치 5 에서 알라닌으로 치환된 아미노산 ;

   (ⅳ) 위치 20 에서 글루타민산염으로 치환된 아미노산 ;

   (ⅴ) 위치 103 에서 알라닌으로 치환된 아미노산 ;

   (ⅵ) 위치 105 에서 알라닌으로 치환된 아미노산 ;

   (ⅶ) 위치 107 에서 알라닌으로 치환된 아미노산 ;

   (ⅷ) 위치 1, 2, 3, 4 또는 5 에서 삭제된 아미노산 ;

   (ⅸ) Fc 수용체 결합 부위를 제거하기 위하여 치환 또는 삭제된

   하나 또는 그 이상의 잔기 ;

   (ⅹ) 보체 (C1q)결합 부위를 제거하기 위하여 치환 또는 삭제

   된 하나 또는 그 이상의 잔기 ;

   (xi) 부부분(i-x)의 조합물 ;

   (c) N-말단에서 메티오닐 잔기를 갖는 부부분(a) 또는 (b)의 아미노산

   서열 ;

   (d) 단백질 성분에 연결된 화학 성분으로 이루어지는 부부분 (a) 내지

   (c) 중 어느 것의 Fc 단백질, 유사체 또는 유도체 ;

   (e) 상기 화학 성분이 수용성 중합체 성분인 부부분(d)의 유도체 ;

   (f) 상기 수용성 중합체 성분이 폴리에틸렌 글리콜인 부부분(e)의 유

   도체 ;

   (g) 상기 수용성 중합체 성분이 폴리아미노산인 부부분(e)의 유도체 ;

   (h) 상기 수용성 중합체 성분이 단독으로 상기 단백질 성분의 N-말

   단에 부착되는 부부분(e)의 유도체.
3. 제 1 항에 있어서, OB 단백질, 유사체 또는 유도체는 다음 중에서 선택함을 특징으로 하는 단백질 :

   (a) 서열 번호 : 3 또는 서열 번호 : 6 에 기술된 아미노산 서열 1- 146 ;

   (b) 위치 35 에서 리신 잔기와 위치 74 에서 이소루신 잔기를 갖는 서열 번호 : 6 에 기술된 아미노산 서열 1- 146 ;

   (c) 하나 또는 그 이상의 다음 위치 : 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 와 145 에서 치환된 다른 아미노산을 갖는 부부분(b)의 아미노산 서열(서열 번호 : 6 에 따른 번호 사용) ;

   (d) 위치 28 에서 글루타미닐 잔기를 임의로 갖지 않는 부부분(a), (b) 또는 (c)의 아미노산 서열 ;

   (e) N-말단에서 메티오닐 잔기를 갖는 부부분(a), (b), (c) 또는 (d)의 아미노산 서열 ;

   (f) 다음 중에서 선택한 절단된 OB 단백질 유사체(위치 35 에 리신 잔기를 가지며 위치 74 에 이소루신 잔기를 갖는 서열 번호 : 6 에 따른 번호 사용) :

   (ⅰ) 아미노산 98 - 146

   (ⅱ) 아미노산 1 - 32

   (ⅲ) 아미노산 40 - 116

   (ⅳ) 아미노산 1 - 99 와 112 - 146

   (ⅴ) 아미노산 99 와 112 사이에 순서대로 위치하는 하나 또는

   그 이상의 아미노산 100 - 111을 갖는 아미노산 1 - 99 와

   112 - 146 ; 및

   (ⅵ) 다른 아미노산으로 치환된 하나 또는 그 이상의 아미노산

   100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 와

   145 를 갖는 부부분(f) (i)의 절단된 OB유사체 ;

   (ⅶ) 다른 아미노산으로 치환된 하나 또는 그 이상의 아미노산

   4, 8 과 32 를 갖는 부부분 (f) (ii)의 절단된 유사체 ;

   (ⅷ) 다른 아미노산으로 치환된 하나 또는 그 이상의 아미노산

   50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102,

   105, 106, 107, 108, 111 과 112 를 갖는 부부분(f) (iii)의

   절단된 유사체 ;

   (ⅵx) 다른 아미노산으로 치환된 하나 또는 그 이상의 아미노산

   4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77,

   78, 89, 97, 112, 118, 136, 138, 142 와 145 를 갖는 부부분(f)

   (iv)의 절단된 유사체 ;

   (ⅹ) 다른 아미노산으로 치환된 하나 또는 그 이상의 아미노산

   4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77,

   78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136,

   138, 142 와 145 를 갖는 부부분(f)(v)의 절단된 유사체 ;

   (xi) N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 부부분(f) (i)-(x) 중 어느 것

   의 절단된 유사체 ;

   (g) 단백질 성분에 연결된 화학 성분으로 이루어진 부부분(a) 내지 (f) 중 어느 것의 OB 단백질 또는 유사체나 유도체 ;

   (h) 상기 화학 성분이 수용성 중합체 성분인 부부분(g)의 유도체 ;

   (i) 상기 수용성 중합체 성분이 폴리에틸렌 글리콜인 부부분(h)의 유도체 ;

   (j) 상기 수용성 중합체 성분이 폴리아미노산 성분인 부부분(h)의 유도체 ;

   (k) 상기 수용성 중합체 성분이 단독으로 상기 단백질 성분의 N-말단에 부착되는 부부분(h)의 유도체.
4. 제 1 항에 있어서, 링커 서열이 글리신, 아스파라긴, 세린, 트레오닌과 알라닌 중에서 선택한 하나 또는 그 이상의 아미노산임을 특징으로 하는 단백질.
5. 제 1 항에 있어서, 링커는 다음 중에서 선택함을 특징으로 하는 단백질 :

   (a) ala, ala, ala ;

   (b) ala, ala, ala, ala ;

   (c) ala, ala, ala, ala, ala ;

   (d) gly, gly ;

   (e) gly, gly, gly ;

   (f) gly, gly, gly, gly, gly ;

   (g) gly, gly, gly, gly, gly, gly, gly ;

   (h) gly - pro - gly ;

   (i) gly, gly, pro, gly, gly ;

   (j) 화학 성분 ;

   (k) 부부분(a) 내지 (j)의 조합물.
6. OB 단백질, 이의 유사체 또는 유도체의 N-말단에 융합된, Fc 단백질, 이의 유사체 또는 유도체를 함유하는 융합 단백질.
7. R₁이 Fc 단백질 또는 이의 유사체이고, R₂가 OB 단백질 또는 이의 유사체이며, L 이 링커인 R₁-R₂와 R₁-L-R₂에서 선택한 식을 갖는 단백질을 암호화하는 핵산 서열.
8. 제 7 항에 있어서, 다음 중에서 선택한 Fc , 유사체 또는 유도체 부분을 갖는 단백질을 암호화함을 특징으로 하는 핵산 서열:

   (a) 서열 번호 : 9, 12, 15 와 18 에 기술한 Fc 아미노산 서열 ;

   (b) 하나 또는 그 이상의 다음 위치에서 치환되거나 삭제된 다른 아미노산을 갖는 부부분(a)의 아미노산 서열(서열 번호 : 9 에 따른 번호 사용) :

   (ⅰ) 알라닌 또는 세린 잔기로 치환된 하나 또는 그 이상의

   시스테인 잔기 ;

   (ⅱ) 페닐알라닌 잔기로 치환된 하나 또는 그 이상의 티로신 잔

   기 ;

   (ⅲ) 위치 5 에서 알라닌으로 치환된 아미노산 ;

   (ⅳ) 위치 20 에서 글루타민산염으로 치환된 아미노산 ;

   (ⅴ) 위치 103 에서 알라닌으로 치환된 아미노산 ;

   (ⅵ) 위치 105 에서 알라닌으로 치환된 아미노산 ;

   (ⅶ) 위치 107 에서 알라닌으로 치환된 아미노산 ;

   (ⅷ) 위치 1, 2, 3, 4 또는 5 에서 삭제된 아미노산 ;

   (ⅸ) Fc 수용체 결합 부위를 제거하기 위하여 치환되거나 삭제된

   하나 또는 그 이상의 잔기 ;

   (x) 보체(Clq) 결합 부위를 제거하기 위하여 치환되거나 삭제된

   하나 또는 그 이상의 잔기 ;

   (xi) 부부분 i-x 의 조합물 ;

   (c) N- 말단에서 메티오닐 잔기를 갖는 부부분(a) 또는 (b)의 아미노산 서열 ;

   (d) 단백질 성분에 연결되는 화학 성분으로 이루어진 부부분 (a) 내지 (c) 중 어느 것의 Fc 단백질, 유사체 또는 유도체 ;

   (e) 상기 화학 성분이 수용성 중합체 성분인 부부분(d)의 유도체 ;

   (f) 상기 수용성 중합체 성분이 폴리에틸렌 글리콜인 부부분(e)의 유도체 ;

   (g) 상기 수용성 중합체 성분이 폴리아미노산 성분인 부부분(e)의 유도체 ;

   (h) 상기 수용성 중합체 성분이 단독으로 상기 단백질 성분의 N-말단에 부착되는 부부분(a)의 유도체.
9. 제 7 항에 있어서 다음 중에서 선택한 OB 단백질, 유사체 또는 유도체 부분을 갖는 단백질을 암호화함을 특징으로 하는 핵산 서열 :

   (a) 서열 번호 : 3 또는 서열 번호 : 6 에 기술한 아미노산 서열 1 - 146 ;

   (b) 위치 35 에서 리신 잔기와 위치 74 에서 이소루신 잔기를 갖는 서열 번호 : 6 에 기술한 아미노산 서열 1 - 146 ;

   (c) 하나 또는 그 이상의 다음 위치 : 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 와 145 에서 치환된 다른 아미노산을 갖는 부부분 (b)의 아미노산 서열(서열 번호 : 6 에 따른 번호 사용) ;

   (d) 위치 28 에서 글루타미닐 잔기를 임의로 갖지 않는 부부분 (a), (b) 또는 (c)의 아미노산 서열 ;

   (e) N-말단에서 메티오닐 잔기를 갖는 부부분(a), (b), (c) 또는 (d)의 아미노산 서열 ;

   (f) 다음 :

   (ⅰ) 아미노산 98 - 146

   (ⅱ) 아미노산 1 - 32

   (ⅲ) 아미노산 40-116

   (ⅳ) 아미노산 1 - 99 와 112 - 146

   (ⅴ) 아미노산 99 와 112 사이에 순서대로 위치하는 하나 또는 그

   이상의 아미노산 100 - 111 을 갖는 아미노산 1 - 99 와

   112 - 116 ; 및

   (ⅵ) 다른 아미노산으로 치환된 하나 또는 그 이상의 아미노산

   100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 와

   145 를 갖는 부부분 (f) (i)의 절단된 OB 유사체 ;

   (ⅶ) 다른 아미노산으로 치환된 하나 또는 그 이상의 아미노산

   4, 8 과 32 를 갖는 부부분(f) (ii)의 절단된 유사체 ;

   (ⅷ) 다른 아미노산으로 치환된 하나 또는 그 이상의 아미노산

   50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100,

   102, 105, 106, 107, 108, 111 과 112 를 갖는 부부분(f) (iii)

   의 절단된 유사체 ;

   (vix) 다른 아미노산으로 치환된 하나 또는 그 이상의 아미노산

   4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77,

   78, 89, 97, 112, 118, 136, 138, 142 와 145 를 갖는 부부분(f)

   (iv)의 절단된 유사체 ;

   (x) 다른 아미노산으로 치환된 하나 또는 그 이상의 아미노산

   4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77,

   78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136,

   138, 142 와 145 를 갖는 부부분(f) (v) 의 절단된 유사체 ;

   (xi) N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 부부분(f) (i)-(x) 중 어느 것

   의 절단된 유사체 중에서 선택한 절단된 OB 단백질 유사체(

   위치 35 에서 리신 잔기와, 위치 74 에서 이소루신 잔기를

   갖는 서열 번호 : 6의 번호 사용) ;

   (g) 단백질 성분에 연결된 화학 성분으로 이루어지는 부부분 (a) 내지 (f) 중 어느 것의 OB 단백질 또는 유사체나 유도체 ;

   (h) 상기 화학 성분이 수용성 중합체 성분인 부부분(g)의 유도체 ;

   (i) 상기 수용성 중합체 성분이 폴리에틸렌 글리콜인 부부분(h)의 유도체 ;

   (j) 상기 수용성 중합체 성분이 폴리아미노산 성분인 부부분(h)의 유도체 ;

   (k) 상기 수용성 중합체 성분이 단독으로 상기 단백질 성분의 N-말단에 부착되는 부부분(h)의 유도체.
10. 제 7 항에 있어서, Gly, Asn, Ser, Thr 과 Ala 중에서 선택한 하나 또는 그 이상의 아미노산의 링커 서열을 수반하는 단백질을 암호화함을 특징으로 하는 핵산 서열.
11. 제 7 항에 있어서, 다음 중에서 선택한 링커를 수반하는 단백질을 암호화함을 특징으로 하는 핵산 서열:

    (a) ala, ala, ala ;

    (b) ala, ala, ala, ala ;

    (c) ala, ala, ala, ala, ala ;

    (d) gly, gly ;

    (e) gly, gly, gly ;

    (f) gly, gly, gly, gly, gly ;

    (g) gly, gly, gly, gly, gly, gly, gly ;

    (h) gly-pro- gly ;

    (i) gly, gly, pro, gly, gly ;

    (j) 화학 성분 ;

    (k) 부부분 (a) 내지 (j)의 조합물.
12. OB 단백질, 이의 유사체 또는 유도체의 N-말단에 융합된, Fc 단백질, 이의 유사체 또는 유도체를 갖는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열.
13. 제 7 항 또는 제 12 항에 따른 핵산 서열을 함유하는 벡터.
14. 제 13 항에 있어서, 벡터가 제 7 항 또는 제 12 항에 따른 핵산 서열과 pAMG 21 임을 특징으로 하는 벡터.
15. 제 13 항의 벡터를 함유하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포.
16. 적당한 조건하에서, 제 15 항의 숙주 세포를 배양하는 단계와 생성된 단백질을 단리하는 단계를 포함하는, 제 1 항 또는 제 6 항의 단백질을 제조하는 방법.
17. 제 16 항에 있어서, 생성된 단백질을 정제하는 단계를 더 포함함을 특징으로 하는 제조방법.
18. 제약학적으로 용인가능한 희석제, 보조제 또는 담체에 유효량의 제 1 항 또는 제 6 항에 따른 단백질을 함유하는 제약학적 조성물.
19. 제 1 항 또는 제 6 항의 단백질의 치료학적 유효량을 투여함을 포함하는, 과대체중, 당뇨병, 높은 혈액지질수준, 동맥경화증, 동맥 플라크, 담석 형성의 감소 또는 방지, 불충분한 마른 조직 중량, 인슐린에 대한 불충분한 민감도에서 선택한 질환의 치료방법.