AT394853B - Verfahren zur herstellung von neuen mitosanderivaten - Google Patents

Description

AT 394 853 B

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuen Mitosanderivaten der allgemeinen Formel

,0) in welcher A Amino, Methoxy, Hydroxy oder eine Gruppe der allgemeinen Formel

R R3R4N-c=n- B eine Gruppe der allgemeinen Formel

R R3R4N-C=N- R1 Wasserstoff, Niedrigalkyl oder Formyl und Wasserstoff oder Niedrigalkyl darstellt, R^ und R4 jeweils Niedrigalkyl darstellen oder gemeinsam mit dem Stickstoff, an welchen sie gebunden sind, einen Piperidin- oder Morpholinring bilden oder R^ mit R^ zu einem Pyirolidinring geschlossen ist, wobei jede der obengenannten Niedrigalkylgruppen 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält.

Diese Verbindungen sind bei experimentellen Tumoren bei Tieren wirksame Antitumorsubstanzen.

Gemäß „Chemical Abstracts“ ist der systematische Name für Mitomycin C: [laR-(laa,8ß,8aa,8ba)]-6-Amino-8-{[(aminocarbonyl)oxy]-methyl}-l,la,218,8a,8b-hexahydro-8a-methoxy-5-methyl-azirino[2',3,,3,4]-pyrrolo [l,2-a]indol-4,7-dion, gemäß welchem das Azirinopyrroloindolringsystem wie folgt numeriert wird: 7

Chemical Abstracts

Ein triviales Nomenklatursystem, welches in der Mitomycin-Literatur weitverbreitete Anwendung gefunden hat, identifiziert dasvorhergehendeRingsystem einschließlich mehrerer charakteristischer Substituenten des Mitomycins als Mitosan. -2-

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Dieses System ist zweckmäßig und genügt für eine Anzahl von einfachen Derivaten, wie jenen, die N-Substituenten an dem Stickstoffatom des Azirinoringes oder in den 7- oder 9a-Stellungen tragen trotz bestimmter Mehrdeutigkeiten und Mängel für die allgemeine Anwendung. Was die erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen betrifft, von welchen einige sowohl am Azirinoring-Stickstoffatom als auch am Seitenketten-Carbamoyl-Stickstoffatom Substituenten aufweisen, gibt es keine konventionelle Numerierung, um die Stellungen zu unterscheiden. Man hat sich daher hier dafür entschieden, unter Anwendung des Mitosan-Nomenklatursystems das Azirino-Stickstoffatom als N*a und das Carbamoyl-Stickstoffatom als N^zu bezeichnen. Was die stereochemische Konfiguration der erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen betrifft, so soll, wenn sie mitdem Grundnamen „Mitosan“ oder durch Strukturformeln bezeichnetwerden,ihrestereochemischeKonfiguration in gleicher Weise wie jene des Mitomycins C identifiziert werden.

Mitomycin C ist ein Antibiotikum, welches durch Fermentation hergestellt wird und derzeit von der „Food and Drug Administration“ zur Therapie von verbreiteten Adenocarcinomen des Magens oder der Bauchspeicheldrüse in erprobten Kombinationen mit anderen bewährten chemotherapeutischen Mitteln und zur palliativen Behandlung vertrieben werden, wenn andere Anwendungen versagt haben (Mutamycin ®, Bristol Laboratories, Syrakus, New York 13201, Physicians’ Desk Reference, 35. Ausgabe, 1981, S. 717 und 718). Mitomycin C und seine Herstellung durch Fermentation ist Gegenstand der US-PS 3 660 578.

Die Strukturen der Mitomycine A, B und C und von Porfiromycin wurden zuerst von J. S. Webb et al., Lederle Laboratories Division American Cyanamid Company, J. Amer. Chem. Soc. 84,31853187 (1962), veröffentlicht. Eine dieser chemischen Umwandlungen, die in diesen Strukturstudien angewendet wurden, um Mitomycin A und Mitomycin C miteinander in Beziehung zu bringen, war dieÜberfuhrung des ersteren, 7,9a-Dimethoxymitosan, durch Reaktion mit Ammoniak in das letztere, 7- Amino-9a-methoxymitosan. Die Verdrängung der 7-Methoxygruppe des Mitomycins A hat bewiesen, daß sie eine Reaktion von besonderem Interesse bei der Herstellung von antitumoraktiven Derivaten des Mitomycins C ist Die folgenden Artikel und Patente befassen sich jedes mit der Überführung von Mitomycin A in ein 7-substituiertes Amino-Mitomycin C-Derivat mit Antitumor-Wirksamkeit. Ziel der Erfindung ist es, Derivate herzustellen, die wirksamer sind und die insbesondere weniger toxisch sind als Mitomycin C:

Matsui et al. „The Journal of Antibiotics“, XXI, 189-198 (1968).

Kinoshitaet al. J. Med. Chem.“ 14,103-109 (1971).

Iyengar et al. J. Med. Chem.“ 24,975-981 (1981).

Iyengar, Sami, Remers und Bradner, Abstracts of Papers Annual Meeting of the American Chemical Society, Las

Vegas, Nevada, März 1982, Abstract Nr. MEDI72.

Die folgenden Patente behandeln die Herstellung von 7-substituierten Aminomitosan-Derivaten durch Umsetzung von Mitomycin A, Mitomycin B oder einem N^a-substituierten Derivat hievon mit einem primären oder sekundären Amin: US-PS 3 332 944, US-PS 3 420 846, US-PS 3 450 705, US-PS 3 514 452, US-PS 4 231 936, US-PS 4 268 676.

Mitomycin C-Derivate, welche einen substituierten Aminosubstituenten in der 7-Stellung aufweisen, wurden auch durch direkte Biosynthese hergestellt, d. h. durch Zusatz einer Reihe von primären Aminen zur Gärbrühe und Durchführung der herkömmlichen Mitomycin-Fermentation (C. A. Claridge et al. Abst. of the Annual Meeting of Amer. Soc. for Microbiology 1982, Abs. 028).

Mitomycin C ist das hauptsächliche, durch Fermentation hergestellte Mitomycin und stellt die im Handel verfügbare Form dar. Die derzeit übliche Technologie für die Umwandlung von Mitomycin C in Mitomycin A zur -3-

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Anwendung bei der Herstellung der semisynthetischen substituierten Aminoanaloga von Mitomycin C, die in den vorhergehenden Publikationen beschrieben werden, umfaßtdie Hydrolyse von Mitomycin C zu dem entsprechenden 7-Hydroxymitosan, einer in hohem Maße instabilen Verbindung, und die darauffolgende Methylierung dieser Substanz mitDiazomethan, welches eine sehr gefährliche Substanz darstellt. Die Verwendung von Diazomethan zur Methylierung des 7-O-Demethyl-mitomycin A, welches durch Hydrolyse von Mitomycin C gebildet wird, wird durch den Einsatz von 7-Acyloxymitosanen vermieden (Kyowa Hakko Kogyo KK Jap. PS J5 6073-085, Farmdoc. Nr. 56227 D/31).

Die erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen stellen einerseits eine neue Gruppe von Mono- und Bis-Amidinoanaloga von Mitomycin C dar. Bezogen auf das Mitosan bildet entweder das 7-Amino-Stickstoffatom und das N^-Carbamoyl-Stickstoffatom oder nur das letztere einen Teil eines Amidino-Substituenten. Andererseits liegt die Herstellung entsprechender Analoga von Mitomycin A, welche die Methoxygruppe in der 7-Stellung und die Amidinogruppe in der N^-Stellung aufweisen, ebenfalls im Rahmen der Erfindung.

Tautomere Formen von einigen der oben angegebenen Amidinogruppen werden von den vorher angegebenen Formeln ebenfalls umfaßt und ihre Herstellung liegt im Rahmen der Erfindung.

Die oben angegebenen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) weisen bei Tierversuchen Antitumor-Wirksamkeit auf. Sie sind auch als Zwischenprodukte zur Herstellung von anderen Verbindungen mit Antitumor-Wirksamkeit bei Tieren geeignet.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der oben angegebenen Verbindungen der Formel I und ist dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel

worin R für NHj, OCH3 oder OH steht und R1 die oben genannte Bedeutung hat (Mitomycin C, Mitomycin A, 7-Hydroxy-9a-methoxymitosan oder ein N*a-substituiertes Derivat dieser Verbindungen), mit einem Amidacetal der Formel

L,

O *1 A O in welcher R , R und R die obige Bedeutung haben und jeder der Substituenten R° unabhängig voneinander für Niederalkyl oderCycloalkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen stehtoder die beiden Substituenten R^ gemeinsam eine Alkylengruppe bilden, die mitden angrenzenden Sauerstoffatomen und dem dazwischenliegenden Kohlenstoffatom eine cyclische Struktur mit 5 bis 6 Ringgliedern bildet, gelöst in einem wasserfreien, mit der Reaktion verträglichen flüssigen organischen Reaktionsmedium, bei 40° bis 65 °C umsetzt, bis sich ein Reaktionsprodukt bildet, in welchem B oder sowohl A als auch B in der allgemeinen Formel (I) für eine Amidinogruppe der allgemeinen Formel 2

R R3RdN-C*N-stehen.

Die bevorzugten erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen sind Mitosanderivate, bei welchen die 7-Aminogruppe in einer substituierten oder nicht-substituierten Amidinogruppe enthalten ist. Sie weisen eine kräftige -4-

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Antitumor-Wirksamkeit gegen experimentellen Tumor bei Tieren auf.

Die Reaktion von Amidacetalen mit primären Aminen ist wohlbekannt. Ihre Reaktion mit Mitomycin C, Mitomycin A oder deren N^-Alkylderivaten ist daher leicht durchzuführen. Es wird beispielsweise auf Η. E. Winberg, US-PS 3121084 und auf R. F. Adulla et al. „The Chemistry of Formamide Acetale“, Tetrahedron, Bd. 35. S 1720-24 (1979) verwiesen.

Vorzugsweise wird die Reaktion in einem flüssigen wasserfreien Reaktionsmedium, in welchem das Verdünnungsmittel einemit den Reaktionsbedingungen verträglicheHüssigkeitist, durchgeführt. Meist ist dieseein niedriger aliphatischer Halogenkohlenwasserstoff oder ein niedriges Alkanol oder gewünschtenfalls eine Mischung der beiden. Chloroform und Methanol und deren Mischungen sind gut geeignet. Die Reaktion wird bei einer Temperatur von 40° bis 65 °C solange durchgeführt, bis die Umsetzung vollständig ist.

Wenn ein großer Überschuß (etwa das 60-Fache) des Acetals verwendet wird, ist das vorherrschende gebildete Produkt das bis-Amidinoprodukt, d. s. jene Substanzen der allgemeinen Formel (I), in welchen sowohl A als auch B die Amidinogruppe umfassen. Als Nebenprodukt bildet sich manchmal das Nla-FormylderivaL Bei einer begrenzten Menge(etwadaslO-Fache)des Acetals entstehtaußerdembis- Amidinprodukt auch ein Mono-Amidinprodukt, d. i. ein Produkt der allgemeinen Formel I, in welcher A die Aminogruppe und B die Amidinogruppe darstellt. Mischungen der obigen Reaktionsprodukte werden leicht durch Chromatographie getrennt, wie in den folgenden Beispielen beschrieben wird.

Einige im Handel erhältliche Amidacetale, welche bei diesem Verfahren verwendet werden können, sind in Tabelle I angeführt, welche dem zitierten Artikel von Abdulla et al. S. 1685, entnommen ist.

Tabelle I

Einige im Handel erhältliche Amid-Acetale

Acetal Struktur A (ca3) ^xs(cai3) 2 B C 7* (ch3) 2nch (cc^-c-ay 2 D (CCH^ 2 E (ay^T2 J * 0-CH2 F (ca,) ^CH (O-CH t33 G H (CSJfCa 2

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Die Schmelzpunkte wurden auf einem Thomas-Hoover-Kapillar-Schmelzpunktapparat bestimmt und sind unkorrigieit. Die Temperaturen sind in °C angegeben. Die kemmagnetischen Protonen-Resonanzspektren (NMR) wurden, wenn nicht anders angegeben, auf einem Varian XLIOO-Spektrometer in Pyridin-dg bestimmt. Die Infrarotspektren (IR) wurden an Kaliumbromid-Preßlingen mit einem Beckmann 4240-Spektrometer erhalten. Die -5-

AT 394 853 B IR-Werte vmax sind in cm'1 angegeben. Die UV-Spektren wurden mit einem Varian-Cary 219-Spektrophotometer bestimmt.

Die Dünnschichtchromatographie (DSC) wird auf vorbeschichteten 0,25 mm-Silikagelplatten unter Verwendung von UV-Licht als Mittel zur Sichtbarmachung durchgeführt. Flash-Chromatographie wird unter Verwendung von Silica Woelm (32-63 pm) durchgeführt. Lösungsmittel werden unter vermindertem Druck und unterhalb von 50 °C abgedampft.

Beispiel 1 7-[(Dimethylammo)methylen]imino-N -(dimethylamino)-methylen-9a-methoxymitosan (Verbindung V) 7-[(Dimethylamino)methylen]imino-N^-(dimethylamino)-methylen-Nla-fonnyl-9a-methoxymitosan (Verbindung VI)

Mitomycin C

V VI

Zu einer Suspension von 500 mg (1,50 mM) Mitomycin C in 25 ml Chloroform werden insgesamt 9,6 ml (2,4 ml Anteile nach 0, 18, 21 und 23 Stunden) Ν,Ν-Dimethylformamid-dimethylacetal hinzugefügt und die Suspension wird41 Stunden bei etwa 50 °C gerührt. Nach dem Abdampfen desLösungsmittels und des überschüssigen Reaktionsmittels unter vermindertem Druck wird ein dunkelgrüner Rückstand erhalten; DSC (Dünnschichtchromatographie, Methylenchlorid/Methanol 20:1) zeigt die Abwesenheit von Mitomycin C und die Anwesenheit von zwei neuen grünen Komponenten (Rf=0,16 und 0,22). Die Hauptkomponente (Rf=0,16) wird durch Flash-Chromatographie unter Verwendung von Methylenchlorid/Methanol 20:1 als Eluierungsmittel in Form eines grünen Feststoffes (340mg, 51,5 %) isoliert, welcher nach dem Lösen in Diethylether und nachfolgende Zugabe von Hexan die Verbindung V in Form eines dunkelgrünen amorphen Pulvers ergibt NMR (Pyridin d5, δ); 2,18 (s, 3H), 2,70 (bs, 1H), 2,76 (s, 3H), 2,82 (s, 3H), 2,86 (s, 6H), 3,22 (s, 3H), 3,30 (bs, 1H) 3,60 (d, J=12Hz), 4,12 (dd, 1H, J=10,4 Hz), 4,43 (d, 1H, J=12 Hz), 4,90 (bs, 1H), 5,10 (t, 1H, J=10Hz), 5,52 (dd, 1H, J=10,4 Hz), 7,85 (s, 1H), 8,64 (s, 1H). IR(KBr)vmax, cm-1: 3300,2930,1675,1620,1545,1230,1060. UV(H20)Xmax,nm: 390 und 244.

Analyse: Ber. für C21H28N6p5: C=56,71, H=6,08; N=18,90 Gef.: C=56,20;H=6,28; N=17,88.

Das Nebenprodukt (Rf=0,22), das (180 mg, 25,35 %) beim Ausfällen aus Diethylether und Hexan in Form eines amorphen Feststoffes isoliert wurde, wurde als Verbindung VI identifiziert. -6-

AT 394 853 B NMR (Pyridin d5, δ): 2,20 (s, 3H), 2,60-3,00 (3 Singletts, 12H), 3,2 (s, 3H), 3,65 (m, 2H), 4,04 (d, 1H, J=4Hz), 4,16 (dd, 1H, J=12,4 Hz), 4,60 (d, 1H, J=13Hz), 4,86 (t, 1H, J=12Hz), 4,90 (s, 1H) 5,48 (dd, 1H, J=12,4 Hz), 7,90 (s, 1H), 8,64 (s, 1H) 9,06 (s, 1H). »(KBrJv^, cm'1: 2490,2860,1698,1630,1600,1540,1250,1060. υν(Η20)λιη£ΙΧ, ππι: 390 und 244.

Analyse: Ber. für C=55,89; H=5,93; N=17,78

Gef.: C=55,41; H=5,96; N=16,99. Lösungen der Verbindungen V und VI in entweder Ethylacetat oder N,N-Dimethylformamid-dimethylacetal zeigten beim Stehen bei Zimmertemperatur über mehr als 10 Stunden durch DSC, daß die Verbindung VI (Rf=0,22) in die Verbindung V (Rf=0,16) umgewandelt wurde unter Bildung einer Lösung, in der die Verbindung V in hohem Maße angereichert war.

Die Beispiele 2 bis 7 wurden analog dem Verfahren des Beispiels 1 durchgeführt.

Beispiel 2 7-[(Diisopropylamino)methylen]imino-N^-(diisopropylamino)-methylen-9a-methoxymitosan (Verbindung VII) Eine Suspension von 200 mg (0,6 mM) Mitomycin C in 3 ml Ν,Ν-Diisopropylformamid-diethylacetal wird 15 Stunden unter Rühren bei 53 °C erhitzt. Das Reaktionsgemisch wird in 50 ml Wasser gegossen und dreimal mit je 30 ml Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte werden überNa2S04 getrocknet und eingedampft unter Bildung eines dunkelgrünen Sirups; DSC (Methylenchlorid/Methanol 10:1) zeigt eine grüne Hauptkomponente bei Rf=0,43 mit rascher wandernden (Rf=0,45-0,50) Verunreinigungen. Die Hauptkomponente wird in Form eines dunkelgrünen Feststoffes (156 mg, 46,8 %) durch zwei Flash-Chromatographieverfahren unter Verwendung von Methylenchlorid/Methanol 20:1 als Eluierungsmittel isoliert. NMR (CDCI3, δ): 1,10-1,50 (5 Singletts, 24H) 1,94 (s, 3H), 2,78 (dd, 1H, J=4,2Hz), 3,05 (d, 1H, J=4Hz), 3,22 (s, 3 H), 3,60 (m, 5H),3,75 (dd, lH,J=10,4Hz),4,24 (d, lH,J=12Hz),4,56(t, lH,J=10Hz),4,88 (dd, 1H, J=10, 4Hz), 7,83 (s, 1H), 8,67 (s,lH). IR(KBr)vmax, cm'1: 3320,2990,2940,1680,1630,1600,1550,1235,1060. UV(MeOH)Atnax,nm: 246 und 393.

Analyse: Ber. für G^H^N^: C=62,55; H=7,91; N=15,10 Gef.: C=62,03;H=7,80;N=14,60.

Ms>i£L3. in , 7-[(Dimethylamino)methylen]imino-N-(dimethylamino)-methylen-9a-methoxy-Nla-methylmitosan (Verbindung XIV)

Bei diesem Beispiel werden 130 mg (0,37 mM) Porfiromycin (N-Methylmitomycin C) als Ausgangsmaterial bei der Reaktion mit 0,8 ml (1,5 mM) Ν,Ν-Dimethylformamid-dimethylacetal unter Verwendung von 10 ml Chloroform und 2 ml Methanol als Reaktionslösungsmittel und bei einer Reaktionsdauer von 50 Minuten bei 50 °C eingesetzt. Nach dem Abdampfen des Reaktionslösungsmittels wird die gewünschte Verbindung in Form eines Sirups erhalten; sie wird durch Flash-Chromatographie unter Verwendung von 20 g Silikagel und Methylenchlorid/ Methanol (20:1) als Eluierungsmittel gereinigt NMR(Pyridin d5,5); 2,22 (bs, 4H), 2,28 (s, 3H), 2,70 (d, 1H, J=4Hz), 2,80 (s, 3H), 2,84 (s, 3H), 2,90 (s, 6H), 3,20 (s, 3H),3,52(dd, 1H,J=2,12Hz),4,10(dd, 1H,J=4, llHz),4,38(d, 1H, J=12Hz),4,92(t, lH,J=llHz),4,96(bs, 1H), 5,46 (dd, 1H, J=4,11Hz), 7,86 (s, 1H), 8,70 (s, 1H).

Rf=0,53, Dünnschichtchromatographie mit 9:1 Methylenchlorid/Methanol. IR(KBr)vmax, cm'1: 2930,1680,1620,1545,1230,1115. -7-

AT 394 853 B UViMeOH^^.nm: 386 und 243

Analyse: Ber.: für C22H3()N605: C=57,60; H=6,55; N=18,33

Gef.: C=57,l 1; H=6,l 1; N=17,99.

Hiebei wird als Nebenprodukt 7-Amino-N^-dimethylaminomethylen-9a-methoxy-Nla-methylenmitosan (Verbindung XV) in 30%-iger Ausbeute, DCS Rf=0,40 (Methylenchlorid/Methanol 9:1) erhalten. NMR (Pyridin d5, δ): 2,02 (s, 3 H), 2,16 (dd, 1H, J=2,5Hz), 2,25 (s, 3H), 2,66 (d, 1H, J=5Hz), 2,76 (s, 3H), 2,86 (s, 3H), 3,18 (s, 3H), 3,51 (dd, 1H, J=2,12Hz), 4,08 (dd, 1H, J=4,10Hz), 4,50 (d, 1H, J=10Hz), 4,90 (t, 1H, J=10Hz), 5,05 (bs), 5,43 (dd, 1H, J=4,10Hz), 8,70 (s, 1H). IR(KBr)vmax, cm'1: 3430,3330,3270,2940,2960,1690,1625,1553,1230,1125. UViMeOH)^, nm: 358,244 und 216.

Analyse: Ber. für C19H25N505: C=56,53; H=6,20; N=17,38 Gef.: C=54,68,H=6,13,N=16,59.

Beispiel 4 9a-Methoxy-7-[(l-piperidinyl)methylen]imino-N -(l-piperidinylmethylen)mitosan (Verbindung IX) 3 ml N-(Diethoxymethyl)piperidin und 200 mg Mitomycin C werden 2,5 Stunden in einer Lösung mit 3 ml Chloroform bei 60 °C reagieren gelassen. Das Produkt wird in 27,6 %-iger Ausbeute erhalten, DSC Rf=0,20 (Methylenchlorid/Methanol 20:1). NMR (Pyridin d5, δ): 1,38 (bs, 12H), 2,20 (s, 3H), 2,80 (bs, 1H), 3,24 (s, 3H), 3,00-3,40 (m, 5H), 3,40-3,80 (m, 5H),4,13 (dd, 1H, J=10,4Hz),4,45 (d, 1H, J=12Hz),4,90 (bs,2H), 5,12 (t, 1H, J=10Hz), 5,56 (dd, 1H, J=10,4Hz), 7,87 (s, 1H), 8,70 (s, 1H). IR(KBr)vmax, cm'1: 3300,2950,2870,1680,1630,1610,1550,1200,1070. UVG^öAmax»nm: 394 und 246·

Analyse: Ber. für C27H36N605: C=61,79; H=6,87; N=16,02 Gef.: C=61,01, H=6,85; N=15,34,

DasN^a-FormylderivatdervorhergehendenSubstanzN^a-Formyl-9a-methoxy-7-[(l-piperidinylmethylen]imino-N^-(l -piperidinylmethylen)mitosan wird in 43 %-iger Ausbeute als Hauptkomponente erhalten; DSC Rf=0,25 (Methylenchlorid/Methanol 20:1). NMR (Pyridin d5, δ): 1,38 (bs, 12H), 2,23 (s, 3H), 3,00-3,40 (m, 4H), 3,23 (s, 3H), 3,40-3,90 (m, 6H) 4,07 (d, 1H, J=4Hz),4,18 (dd, lH,J=ll,4Hz),4,63(d, lH),4,90(t, lH,J=llHz),4,94(bs, lH),5,54(dd, lH,J=ll,4Hz), 7,94 (s, 1H), 8,71 (s, 1H), 9,08 (s, 1H). IR(KBr)vmax, cm'1: 2490,2860,1698,1630,1600,1540,1250,1060. UV(H20)Xmax, nm: 394 und 247.

Analyse: Ber. für C^gH^gNgOg: C=60,08; H=6,52; N=15,2l Gef.: C=59,99; H=6,17; N=15,07.

Beispiel 5: 9a-Methoxy-7-[(l-morpholino)methylen]imino-N-(l-morpholino-methylen)mitosan (Verbindung X)

Eine gerührte Suspension von200 mg (0,6 mM) Mitomycin C in 10 ml Chloroform und 4 ml N-Diethoxymethyl-morpholin wird 42 Stunden bei etwa 53 °C erhitzt. Das Reaktionsgemisch wird im Hochvakuum zu einem Sirup eingeengt. Es wird eine grobe Trennung durch Flash-Chromatographie (Methylenchlorid/Methanol 25:1) durchgeführt, um die grün gefärbten Komponenten von den überschüssigen Reagenzien zu trennen. Die vereinigten grünen -8-

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Komponenten werden in 20 ml Ethylenacetat gelöst und dreimal mit je 20 ml Wasser gewaschen. Die vereinigten Waschflüssigkeiten werden neuerlich dreimal mit je 15 ml Ethy lacetat extrahiert. Alle Ethylacetatfraktionen werden vereinigt, über NajSO^ getrocknet und zu einem dunkelgrünen Sirup eingedampft, dessen DSC (Methylenchlorid/ Methanol 10:1) eine grüne Komponente bei Rf=0,33 mit mehreren grünen Verunreinigungen (RF=0,35-0,40) anzeigt. Nach Flash-Chromatographie wird die gewünschte Verbindung mit Rf=033 (130 mg, 56,8 %) als dunkelgrüner amorpher Feststoff isoliert. NMR(CDC13,5): 1,91 (s,3H),2,80(bs, lH),3,13(d, 1H, J=2Hz), 3,22 (s, 3H), 3,30-3,94 (m, 18H),4,20(d, 1H, J=12Hz), 4,40 (bs, 1H), 4,54 (t, 1H, J=10Hz), 4,88 (dd, 1H, J=10 Hz, 4Hz), 7,74 (s, 1H), 8,51 (s, 1H). »(KBrJVj^, cm'1: 3300,2970,2920,1680,1625,1550,1235,1070. UViMeOH)?^, nm: 386 und 244.

Analyse: Ber. für CogHo^gC^: C=56,78; H=6,06; N=15,90 Gef.: C=53,07; H=6,03; N=1537.

Beispiel .6 7-Amino-N -dimethylaminomethylen-9a-methoxymitosan (Verbindung XVI) 200 mg (0,6 mM) Mitomycin C werden in 10 ml Chloroform und 2 ml Methanol gelöst und 0,64 ml (4,8 mM) NN-Dimethylformamid-dimethylacetal werden hinzugefügt; die Lösung wird 50 Minuten bei etwa 50 °C gerührt Dünnschichtchromatographie (Methylenchlorid/Methanol 90:10) zeigt eine Spurunreagiertes Mitomycin C (Rf=0,22) und zwei neue Komponenten (Rf=0,42 bzw. 0,33) an. Die Lösung wird unter verringertem Druck zu einem Sirup eingeengt, welcher unter Verwendung von Methylenchlorid/Methanol (20:1) als Eluierungsmittel flash-chromatographiert (25 g Silikagel) wird.

Die raschere Komponente (Rf=0,42) wird als grüner amorpher Feststoff (60 mg, 22,5 %) isoliert und durch ihr NMR-Spektrum (Pyridin dg) als Verbindung V identifiziert

Die blaue Hauptkomponente (Rf=0,33) wird als amorpher Feststoff (148 mg, 63,3 %) isoliert und als gewünschte Verbindung identifiziert. Durch Ausfällen aus Methylenchlorid und n-Pentan wird eine analytische Probe erhalten. NMR (Pyridin dg, δ): 2,02 (s, 3H), 2,76 (bs, 4H), 2,86 (s, 3H), 3,21 (s, 3H), 3,28 (d, 1H, J=4Hz), 3,62 (dd, 1H, J=2,13Hz) 3,94 (bs), 4,14 (dd, 1H, J=4,12Hz), 436 (d, 1H, J=13Hz), 5,12 (t, 1H, J=10Hz), 532 (dd, 1H, J=4, 10Hz). IR(KBr)vmax, cm-1: 3430,3320,3280,2930,1675,1650,1615,1230,1115. UV(H20)Xmax,nm: 364,244 und 219.

Analyse: Ber. für Cj^NgOg: C=55,48; H=5,91; N=17,98 Gef.: C=54,70; H=6,14; N=17,95.

Beispiel 7 7,9a-Dimethoxy-N -dimethylaminomethylenmitosan (Verbindung XVII)

Das Mitomycin C des Beispiels 1 wird durch 170 gMitomycin A ersetzt und 1 Stunde bei 50 °C mit 0,6 ml Ν,Ν-Dimethylformamiddimethylacetal, gelöst in Chloroform/Methanol (10:1), reagieren gelassen. Man erhält das gewünschte Produkt in 48%-iger Ausbeute, DSC Rf=0,50 (Methylenchlorid/Methanol 9:1). NMR (Pyridin dg, δ): 1,83 (s, 3H), 2,76 (bs, 4H), 2,86 (s, 3H), 3,22 (s, 3H), 3,28 (d, 1H), 3,56 (dd, 1H, J=2,13Hz), 4,02 (s, 3H), 4,10 (dd, 1H, J=4,10 Hz), 434 (d, J=13Hz), 5,10 (t, 1H, J=10Hz), 5,50 (dd, 1H, J=4,10 Hz), 8,67 (s, 1H). IR(KBr)vmax, cm'1: 3300,2930,1675,1655,1625,1500,1235,1120. UV(H20)Xmax,nm: 530,316 und 244.

Analyse: Ber. für C19H24N406: C=56,39; H=5,94; N=13,85 Gef.: C=56,51;H=6,92;N=13,71. -9-

AT 394 853 B

Das Nla-Formylderivat der obzitierten Verbindung, das 7,9a-Dimethoxy-N10-dimethylaminomethylen-Nla-formylmitosan (Verbindung XVIII), wird in 16,5%-iger Ausbeute, DSC Rf=0,61 (Methylenchlorid/Methanol 9:1) erhalten. NMR (Pyridin d5, δ): 1,88 (s, 3H), 2,76 (s, 3H), 2,85 (s, 3H), 3,54 (d, 1H), 3,62 (bs, 1H), 4,05 (s, 3H), 4,05 (bs, 1H),4,14 (dd, 1H,J=4,12Hz),4,40 (d, 1H, J=13Hz),4,86 (t, 1H, J=12Hz), 5,42 (dd, 1H, J=4,12Hz), 8,66 (s, 1H), 9,08 (s, 1H).

Bespiel 8 7-[l-(Dimethylamino)ethyliden]imino-N -[l-(dimethylamino)-ethyliden]-9a-methoxymitosan (Verbindung ΧΧΠΙ)

Es wird eine Suspension von 600 mg (1,79 mM) Mitomycin C in 2 ml Methanol hergestellt und mit 3 ml Ν,Ν-Dimethylacetamid-dimethylacetal behandelt. Die Suspension wird unter 2-stündigem Rühren bei 75-80 °C erhitzt. Bei dieser Stufe zeigt DSC (C^C^/Methanol 10:1), daß nahezu das gesamte Mitomycin C durch die Reaktion verbraucht worden war. Das Produkt erscheint als grüne Zone. Das Lösungsmittel und die flüchtigen Materialien werden entfernt, indem das Reaktionsgemisch bei vermindertem Druck zur Trockene eingedampft wird, wobei man einen Sirup erhält, welcher in Methylenchlorid gelöst und auf eine Silikagelsäule (40 g Silikagel) aufgebracht wird; die Säule wird mit200 ml 1 %igem Methanol in Methylenchlorid, 200 ml 2%igem Methanol in Methylenchlorid und 400ml 5%igem Methanol in Methylenchlorid entwickelt. Die Fraktionen, welchedie grüne, das Produkt darstellende Zone enthalten, werden vereinigt und zu einem amorphen Feststoff mit einem Gewicht von 110 mg (13% Ausbeute) eingeengt. Dieses Material wird in 2 ml Aceton gelöst und durch Zugabe von Hexan aus der Lösung ausgefällt. Das Produkt wird durch Abfiltrieren gesammelt.

Analyse: Ber. für C23^32^6^5: C=58,46; H=6,83; N=17,79 Gef.: C=58,89; H=6,89; N=17,64. UV (ΜβΟΗ)^^, nm: 235,364 IR(KBr)vmax, cm4: 3440,3295,2925,1770,1660,1620,1580,1550,1300,1055.

Das *H NMR-Spektrum in Pyridin dg stimmt mit der Struktur der Titelverbindung überein.

Beispiel 9 7-[(l-Methyl-2-pyrrolidinyliden)imino-N^-[(l-methyl-2-pyirolidinyliden)amino]9a-metoxymitosan (Verbindung XXV)

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AT 394 853 B 1,5 g (10,3 mM) 2,2-Dimethoxy-1 -methylpyrrolidin (H. Eilingsfeld et al., Angew. Chem. 72,836 (1960)) und 280 mg (0,34 mM) Mitomycin C in 20 ml Methanol werden 5 Stunden bei 55 °C erhitzt Das Reaktionsgemisch wird durch Dünnschichtchromatographie auf einer Aluminiumoxidplatte unter Verwendung von Methylenchlorid/ Methanol 97:3 als Lösungsmittel untersucht. DCS zeigt einen größeren grünen Fleck, welcher das Produkt darstellt, und einen kleineren blauen Fleck, welcher das Mitomycin C-Ausgangsmaterial darstellt. Das Lösungsmittel wird durch Destillation im Vakuum bei 40 °C entfernt, der Rückstand wird in Methylenchlorid gelöst und auf eine 4,5 cm-Säule, die 150 g Aluminiumoxid enthält, geladen. Das Eluieren erfolgt mit 50 ml Methylenchlorid und anschließend mit600 ml 1 %igem Methanol in Methylenchlorid. Die groben Verunreinigungen wurden entfernt, es wurden jedoch keine reinen Fraktionen isoliert. Das vereinigte Eluat wird durch Destillation bei 20 °C zu einem öligen Rückstand eingeengt, welcher offensichtlich etwas 2,2-Dimethoxy-l-methylpyrrolidin enthält

Dieses Material wird neuerlich auf einer Aluminiumoxid-Säule (25 g Aluminiumoxid) chromatographiert, wobei 200 ml Methylenchlorid und daraufhin 100 ml l%iges Methanol in Methylenchlorid verwendet wurde. Dies führt zu einer Entfernung des 2,2-Dimethoxy-1-methylpyrrolidin und man erhält eine Anzahl von Fraktionen, die wenig Verunreinigungen enthalten, und mehrere reine Fraktionen, wie durch DSC (ein grüner Fleck) bestätigt wurde, welche das gewünschte Produkt darstellen; Ausbeute 53 mg.

Analyse: Ber. für C25H32N6O5.0,85 H20: C=58,66; H=6,64; N=16,42

Gef.: C=58,63; H=6,46; N=16,50. UViMeOH)^^, nm: 354,239 IR(KBr)vmax, cm'1: 3300,3220,2940,1660,1620,1550,1290,1055.

Das % NMR Spektrum in Pyridin dj stimmt mit der Struktur der Titelverbindung überein. Beispiel IQ 7-Hydroxy-N -dirnethylaminomethyl-9a-methoxymitosan

Zu einer Lösung von 20 mg 7-Hydroxy-9a-methoxymitosan in 3 ml Methylenchlorid gibt man 1 ml Dimethylfor-mamid-Dimethylacetal und rührt die Lösung 30 Minuten bei etwa 65 °C. Das Fortschreiten der Reaktion wird durch DSC (10:1 CI^C^/MeOH) verfolgt. Das Produkt wird durch Einengen der Mischung unter vermindertem Druck gewonnen und der Rückstand wird über Silikagel chromatographiert, wobei die Titelverbindung erhalten wird.

Wirksamkeit gegen P-388 Murin-Leukämie

Tabelle II enthält die Ergebnisse der Laboratoriumstests mit weiblichen CDFj-Mäusen, welchen intraperitoneal ein Tumor-Impfstoff von 10® Ascites-Zellen von P-388 Murin-Leukämie implantiert wurde und welche mit verschiedenen Dosen von entweder einer Testverbindung der allgemeinen Formel I oder von Mitomycin C behandelt wurden. Die Verbindungen wurden durch intraperitoneale Injektion verabreicht. Für jede Dosierungsmenge wurden Gruppen von sechs Mäusen verwendet und sie wurden mit einer einzigen Dosis der Verbindung an nur einem Tag behandelt. In jede Versuchsreihe wurde eine Gruppe von 10 mit Salzlösung behandelten Kontrollmäusen eingebracht. Die mit Mitomycin C behandelten Gruppen wurden als sichere Kontrolle eingebracht. Es wurde ein 30 Tage-Protokoll verwendet, in welchem die mittlere Überlebenszeit in Tagen, die für jede Gruppe von Mäusen bestimmt wurde, und die Anzahl der Überlebenden am Ende der 30 Tage-Periode notiert wurden. Die Mäuse wurden -11-

AT 394 853 B vor der Behandlung und wiederum am Tage 6 gewogen. Die Massenveränderung wurde als Maß für die Toxizität der Droge genommen. Es wurden Mäuse mit je 20 Gramm Masse verwendet und ein Massenverlust bis zu etwa 2 g wurde nicht als übermäßig angesehen. Die Ergebnisse als % T/C bestimmt, weiche Werte das Verhältnis der mittleren Überlebenszeit der behandelten Gruppe zu der mittleren Überlebenszeit der mit Salzlösung behandelten Kontrollgruppen mal 100 darstellen. Die mit Salzlösung behandelten Kontrolltiere starben im allgemeinen innerhalb von neun Tagen. Die „maximale Wirkung“ in der folgenden Tabelle wird ausgedrückt als % T/C und es wird die Dosis angegeben, die diese Wirkung ergibt. Die Werte in Klammer sind die Werte, die mit Mitomycin C als tatsächliche Kontrallprobebei dem gleichen Versuch erhalten wurden. Es kann so ein Maß für die Wirksamkeit der erfmdungsgemäß hergestellten Substanzen im Vergleich zu Mitomycin C geschätzt werden. Eine minimale Wirkung in Werten von % T/C wird mit 125 angenommen. Die minimal wirksame Dosis, die in der folgenden Tabelle angegeben wird, ist jene Dosis, die ein % T/C von etwa 125 ergibt. Die beiden Werte, die in jedem Fall in der Kolonne der „durchschnittlichen Massenveränderung“ angegeben werden, sind die durchschnittliche Massenveränderung pro Maus bei der maximalen wirksamen Dosis bzw. bei der minimalen wirksamen Dosis.

Tabelle!!

Hemmung der P-388 Murin-Leukämie

Verbindung ^Beispiel Nr.) Maximale Wirkung %T/C Dosis1 Minimale wirksame Dosis Durchschnittl. Λ Massenverlust V (1) 311 (244) 6.4 (3.2) <0.2 183 (272) 6.4 (3.2) 0.1 VI (1) 233 (244) 6.4 (3.2) <0.2 -0.1, vn (2) 141 (224) 25.6 (3.2) 0.8 -1.2,+0. IX (4) 165 (224) 12.8 (3.2) 0.2 -0.7,+0.8 X (5) 300 (224) 12.8 (3.2) 02 -2.1, keiner XIV (3) 233 (272) 12.8 (3.2) 0.2 -3.8,+0.7 XV (3) 144 (272) 25.6 (3.2) 6.4 -1.4, +0.2 XVI (6) 144 (272) 6.4 (3.2) 3.2 -0.4,-0.3 XVII (7) 144 (272) 0.8 (3.2) 0.02 -0.2,-0.3 XVffl (7) 167 (272) 6.4 (3.2) 0.05 -1.0,+0.3 XXIII (8) 194 (319) 12.8 (3.2) 0.2 -1.2,+0.2 XXV (9) 188 (331) 25.6 (4.8) 0.4 -2.2,+0.1 *mg/kg Körpermasse ^Gramm pro Maus, Tage 1-6, bei den maximalen und bei den minimalen wirksamen Dosen.

Die erfindungsgemäß hergestellten bis-Amidinverbindungen der allgemeinen Formel I, in welcher sowohl A als auch B die Amidinogruppe bedeuten, sind als wirksame Antitumormittel von wesentlichem Interesse. Es wird auf die Daten in der Tabelle für die Verbindungen V, VI, VII, IX, X und XIV verwiesen, welche mit diesem strukturellen Erfordernis übereinstimmen.

Die Tabelle ΙΠ enthält die Ergebnisse der Antitumor-Tests unter Verwendung des B16-Melanoma-Wachstums -12-

Claims (5)

1. AT 394 853 B bei Mäusen. Es wurden BDF j-Mäuse verwendet und mit dem Tumor-Implantat intraperitoneal beimpft. Es wurde ein 60-Tage-Protokoll verwendet Für jede dieser untersuchten Dosierungsmengen wurden Gruppen zu 10 Mäusen verwendet und es wurde die mittlere Überlebenszeit für jede Gruppe bestimmt Kontrolltiere, die in gleicher Weise wie die Testtiere mit dem Injektionsträger und ohne Droge beimpft und behandelt wurden, zeigten eine mittlere Überlebenszeit von 21 Tagen. Die Überlebenszeit in bezug auf jene der Kontrolltiere (% T/C) wurde als Maß für die Wirksamkeit verwendet und es wurden die maximale wirksame Dosis und die minimale wirksame Dosis für jede Testverbindung bestimmt. Die minimale wirksame Dosis wird als jene Dosis definiert, die einen % T/C-Wert von 125 aufweist. Für jede Dosismenge wurden die Testtiere mit der Testverbindung an den Tagen 1, 5 und 9 auf intraperitonealem Wege behandelt. Die durchschnittliche Massenänderung an jenem Tag, an welchem die maximale wirksame Dosis und die minimale wirksame Dosis auftritt, wurde als Maß für die Toxizität verwendet. Ein Massenverlust von 2 g für eine Maus mit einer Masse von 20 g war nicht übermäßig. Tabelle III Hemmung von B16-Melanoma Verbindung Maximale Wirkung Minimale Durchschnittliche Nr. (Beispiel) % T/C Dosis wirksame Dosis Gew.veränd. (Tag) V (1) >298 (256)* 0.8 (3.2)* <0.2 +0.5,-0.2(5) X (5) >295 (198) 2.0 (3.0) <2.0 -0.4,-0.4(6) * Die Werte in Klammem sind Mitomycin C-Kontrollwerte. Aufgrund der hervorragenden Antitumor-Wirksamkeit, die bei experimentellen tierischen Tumoren beobachtet wurde, und der im Vergleich zu Mitomycin C verringerten Toxizität können die Substanzen der allgemeinen Formel I zur Hemmung von Tumoren bei Säugetieren verwendet werden. Zu diesem Zweck werden sie an ein Säugetier, das einen Tumor aufweist, in einer im wesentlichen nicht-toxischen antitumorwirksamen Dosis systemisch verabreicht PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung von neuen Mitosanderivaten der allgemeinen Formel

   in welcher A Amino, Methoxy, Hydroxy, oder eine Gruppe der allgemeinen Formel R R3R4N-C=N- -13- AT 394 853 B B eine Gruppe der allgemeinen Formel 2 R R3R4R-c=N- R* Wasserstoff, Niedrigalkyl oder Formyl und Wasserstoff oder Niedrigalkyl darstellt, und R^ jeweils Niedrigalkyl darstellen oder gemeinsam mit dem Stickstoff, an welchen sie gebunden sind, einen Piperidin- oder Morpholinring bilden oder R^ mit R-* zu einem Pyrrolidinring geschlossen ist, wobei jede der obgenannten Niedrigalkylgruppen 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel

   worin R für 14¾. OCH3 oder OH steht und R^ die oben genannte Bedeutung hat (Mitomycin C, Mitomycin A, 7-Hydroxy-9a-methoxymitosan oder ein N*a-substituiertes Derivat dieser Verbindungen), mit einem Amidacetal der Formel k\ JL. <* η o a o in welcher R , R und R die obige Bedeutung haben und jeder der Substituenten R° unabhängig voneinander für Niederalkyl oder Cycloalkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen steht oder die beiden Substituenten R^ gemeinsam eine Alkylengruppe bilden, die mit den angrenzenden Sauerstoffatomen und dem dazwischenliegenden Kohlenstoffatom eine cyclische Struktur mit 5 bis 6 Ringgliedem bildet, gelöst in einem wasserfreien, mit der Reaktion verträglichen flüssigen organischen Reaktionsmedium, bei 40° bis 65 °C umsetzt, bis sich ein Reaktionsprodukt bildet, in welchem B oder sowohl A als auch B in der allgemeinen Formel (I) für eine Amidinogruppe der allgemeinen Formel R3R4N-c=n- stehen.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als flüssiges organisches Reaktionsmedium einen niedrigen aliphatischen Halogenkohlenwasserstoff einsetzt und zur Herstellung einer Verbindung, in welcher sowohl A als auch B für eine Amidinogruppe stehen, mehr als zwei Molanteile, bezogen auf Mitomycin C, des Amidacetals verwendet
3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Reaktionsmedium Chloroform einsetzt.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Reaktionsmedium eine Mischung eines niedrigen aliphatischen Halogenkohlenwasserstoffes und eines Niederalkanols einsetzt
5. 5. Verfahren nach Ansprach 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Reaktionsmedium eine Mischung von Chloroform und Methanol einsetzt -14-