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Verfahren zur Gewinnung von Spiramycin II und bzw. oder Spiramycin III
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EMI1.2
<tb>
<tb>
Antibiotikum, <SEP> aus <SEP> Kulturen <SEP> vonStreptomycesProdukt <SEP> DL50 <SEP> (g/kg <SEP> s. <SEP> c.)
<tb> Spiramycin <SEP> I <SEP> 1, <SEP> 01 <SEP>
<tb> Spiramycin <SEP> II <SEP> 1, <SEP> 52 <SEP>
<tb> Spiramycin <SEP> III <SEP> 2, <SEP> 04 <SEP>
<tb>
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Aus Gründen der Bequemlichkeit verwendet man vorzugsweise Essigsäure oder Natriumacetat bzw. propionsäure oder deren Salze oder Propionsäureamid in einer Konzentration zwischen 0, 1 und 30 g je 1 Nährlösung, wobei die optimale Konzentration bei ungefähr 2 - 15 g je Liter liegt.
Je nach Bedarf kann man das Acylierungsmittel gelöst in Wasser oder in einem organischen Lösungmittel, wie beispielsweise Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Äther oder Dichloräthan auf einmal oder in mehreren Partien zusetzen.
Bei Verwendung der üblichen komplexen oder synthetischen Nährmedien verläuft die Fermentation ohne Schwierigkeiten und wird ganz normal durchgeführt.
Wenn die Fermentation in Gegenwart von Spiramycin I durchgeführt wird, sind die verschiedenen Faktoren zu beachten, die die biochemische Acylierung des Spiramycins I zu Spiramycin II oder III begünstigen, und die Kulturbedingungen des S. ambofaciens so zu wählen, dass sowohl eine gunstige Ent- wicklung der Mikroorganismen, als auch Bildung des enzymatischenAcylierungssystems derselben erfolgt.
Zu diesem Zweck kann man S. ambofaciens in einem Kulturmedium züchten, dem zuvor Spiramycin I zugesetzt wurde und das alle zur Ausbildung des enzymatischen Systems und zur Acylierung des Spiramycins I zu Spiramycin II und III erforderlichen Faktoren enthält. Zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens erwies es sich als ganz besonders vorteilhaft, zunächst S. ambofaciens unter solchen Kulturbedingungen zu züchten, dass er das enzymatische Acylierungssytem entwickelt und dann sein Mycel mit Spiramycin I und den zur Umwandlung erforderlichen Acylierungsmitteln sowie Aktivatoren, wie Eisen-, Kobalt- oder Magnesiumsalze, zusammenzubringen.
Zur Erzielung eines zur Umwandlung von Spiramycin I zu Spiramycin II und III leistungsfähigen Mycels ist es besonders vorteilhaft, ein synthetisches Medium zu verwenden, das nur ein Kohlehydrat als Energiequelle, ein Ammoniumsalz als Stickstoffquelle und säurebindende Mittel enthält. Man verwendet vorzugsweise Glukose oder Stärke in Mengen von 1 bis 100 g je 1, wobei das Optimum zwischen 40 und
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kann.
Der pH-Wert der S. ambofaciens-Kultur soll zu Beginn auf einen Wert zwischen 5 und 9, vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,5, eingestellt sein und soll nicht darunter sinken ; es ist daher zweckmässig, dem Kulturmedium rechtzeitig eine angemessene Menge an säurebindenden Mitteln zuzusetzen, um das pH auf dem gewünschten Wert zu halten. Man kann zu diesem Zweck Alkali- oder Erdalkalihydroxyde oder-carbonate in Lösung oder in wässeriger Suspension verwenden, wobei man z. B. unlösliche Erdalkalicarbonate, wie z. B. Calciumcarbonat in Mengen zwischen 1 und 50 g, vorzugsweise ungefähr 25 g je 1, zweckmässig bereits dem Kulturmedium zusetzt.
Zur maximalen Protektion des enzymatischenAcylierungssystem ist es auch erforderlich, S. ambofaciens unter bestimmten Temperaturbedingungen, nämlich zwischen 20 und 350, vorzugsweise jedoch bei 23 - 270, zu züchten.
Die Züchtung des S. ambofaciens kann in jeder üblichen Einrichtung durchgeführt werden, die gleichzeitig eine gute Dispersion der zur Respiration der Streptomyceten erforderlichen Luft und eine gute Homogenisierung der Kultur ermöglicht.
Es wurde gefunden, dass das Acylierungsvermögen des S. ambofaciens vom Alter der Kultur abhängt und zu Beginn der Züchtung praktisch der in der Kultur vorhandenen Mycelmenge proportional ist. Nach einer gewissen Zeit stellt sich ein Maximalwert ein, der bei weiterem Wachstum des Mycels wieder abnimmt. In der Praxis hat sich herausgestellt, dass das Maximum nach 30- bis 150stündiger Kaltur, in den meisten Fällen zwischen 40 und 100 h, erreicht wird, wobei das Optimum wesentlich von den gewählten Kulturbedingungen abhängt.
Die in vorstehender Weise erhaltenen Kulturen von S. ambofaciens oder seiner Mutanten können entweder direkt zur Acylierung des Spiramycins I verwendet werden, indem man ihnen gleichzeitig mit dem zu acylierenden Spiramycin I die Acylierungsmittel und Aktivatoren zusetzt. Man kann auch das Mycel des S. ambofaciens aus der Nährlösung abtrennen und es hierauf in eine entsprechende Lösung, die Spiramycin I, die Acylierungsmittel und die Aktivatoren enthält, einbringen.
Die Menge der dabei gebildeten Acylierungsprodukte des Spiramycin I schwankt, je nach der Art der verwendeten Acylierungsmittel, in beträchtlicher Weise. So werden Propionylreste viel leichter an das Spiramycin I gebunden als Acetylreste. Sind beide Verbindungstypen vorhanden, so findet stets eine bevorzugte Verwertung der Propionylreste unter Überführung des Spiramycin I in das Spiramycin III statt, so dass es möglich ist, die Umwandlung des Spiramycin I zum Spiramycin III durch Zugabe eines Überschusses anpropionylisierungsmitteln spezifisch zu beeinflussen. Daher gelingt auch die spezifische Überführung
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bekannten Mengen der verschiedenen im reinen Zustand isolierten Spiramycine entsprechen, vergleicht.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher.
Beispiel l : Ein 2 1 fassender Erlenmeyerkolben wird mit 250 cm3 einer Nährlösung folgender Zusammensetzung
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<tb>
<tb> Maisquellwasser <SEP> (5cp/o <SEP> Trockenextrakt) <SEP> 40 <SEP> g
<tb> Glukose <SEP> 20 <SEP> g <SEP>
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Magnesiumsulfat <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> 1000 <SEP> cm3,
<tb>
deren pH-Wert mit Natronlauge auf 6, 8 eingestellt und der noch 5 g Calciumcarbonat und 4 cm3 Sojaöl zugesetzt wurden, beschickt und 45 min bei 1200 sterilisiert. Nach Abkühlen beimpft man mit einer Reinkultur von Streptomyces ambofaciens NRRL 2420 und schüttelt 48 h.
Ferner werden Erlenmeyerkolben von 300 cm3 Inhalt mit je 50 cm3 der folgenden Nährlösung
EMI4.2
<tb>
<tb> Maisquellwasser <SEP> (50% <SEP> Trockenextrakt) <SEP> 35 <SEP> g
<tb> Glukose <SEP> 50 <SEP> g <SEP>
<tb> Natriumchlorid <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Monokaliumphosphat <SEP> 2 <SEP> g <SEP>
<tb> Magnesiumsulfat <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> 1000 <SEP> cm3
<tb>
deren pH-Wert mit Natronlauge auf 6,8 eingestellt und 5 g Calciumcarbonat zugesetzt wurde, beschickt und mit Propionamid in den in der folgenden Tabelle angegebenen Mengen versetzt.
Die Erlenmeyerkolben werden 20 min bei 1200 sterilisiert, nach Abkühlen mit 4 cm3 der Kultur aus dem 21 Erlenmeyerkolben beimpft und bei 250 auf einer Schüttelmaschine geschüttelt. Die Bestimmungen und Analysen des Antibiotikums werden am 6., 7. und 8. Tag der Fermentation durchgeführt, um die maximale Aktivität und die Mengenverhältnisse der drei Spiramycine festzustellen.
EMI4.3
<tb>
<tb>
Gehalt <SEP> des <SEP> Mediums <SEP> Maximale <SEP> antibiotische <SEP> Gewichtsverhältnis <SEP> der <SEP> Spiramycine <SEP> Je,
<tb> an <SEP> Propionamid <SEP> g/l <SEP> Aktivität <SEP> l1g/ml <SEP> I <SEP> II <SEP> III <SEP>
<tb> 0 <SEP> 285 <SEP> 51 <SEP> 26 <SEP> 23
<tb> 1 <SEP> 205 <SEP> 27 <SEP> 18 <SEP> 55
<tb> 2 <SEP> 175 <SEP> 24 <SEP> 10 <SEP> 66
<tb> 4 <SEP> 150 <SEP> 15 <SEP> 7 <SEP> 78
<tb>
Beispiel 2 :
In ein Fermentationsgefäss von 170 1 Inhalt bringt man folgende Nährlösung :
EMI4.4
<tb>
<tb> Maisquellwasser <SEP> (50P/o <SEP> Trockenextrakt) <SEP> 4, <SEP> 800 <SEP> kg
<tb> Glukose <SEP> 2, <SEP> 400 <SEP> kg <SEP>
<tb> Natriumchlorid <SEP> 0,600 <SEP> kg
<tb> Magnesiumsulfat <SEP> 0, <SEP> 120 <SEP> kg
<tb> Leitungswasser <SEP> 1001
<tb>
deren pH-Wert mit Natronlauge auf 6, 8 eingestellt und die mit 0,600 kg Calciumcarbonat und 0, 480 1 SojaÏl versetzt wurde, ein und sterilisiert 45 min bei 1200. Nach Abkühlen auf 250 wird mit 250 cm3 einer Impfkultur von S. ambofaciens beimpft und 25 h unter Belüftung in Bewegung gehalten. Sie dient
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zur Beimpfung der produktionskultur.
Diese wird in einem Fermentationsgefäss von 30 1 Inhalt durchgeführt, das mit folgender Nährlösung beschickt wird :
EMI5.1
<tb>
<tb> Hefeautolysat <SEP> 300 <SEP> g
<tb> Glukose <SEP> 750 <SEP> g <SEP>
<tb> Propionamid <SEP> 30g <SEP>
<tb> Natriumchlorid <SEP> 300 <SEP> g <SEP>
<tb> Magnesiumsulfat <SEP> 15 <SEP> g
<tb> Monokaliumphosphat <SEP> 15 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> 16, <SEP> 5 <SEP> I <SEP>
<tb>
Der PH-Wert wird mit Natronlauge auf 6,5 eingestellt, worauf 75 g Calciumcarbonat sowie 60 cm3 Sojaöl zugesetzt werden.
Dann wird 40 min bei 1200 sterilisiert. NachAbkühlen beträgt das Volumen 151 und der pH-Wert 6, 8.
Das Nährmedium wird dann mit 2 l der Vorkultur aus dem Fermentationsgefäss von 170 1 Inhalt beimpft, mit 550 Umdr/min gerührt, mit 1 m3 Luft/Stunde belüftet und auf 250 gehalten.
Zu Beginn der Fermentation fällt der pH-Wert regelmässig ab und erreicht 5,6 nach etwa 60 h : Diese erste Phase entspricht genau dem Verbrauch der Glukose. Anschliessend steigt der pH-Wert bis zu 90 h langsam (6, 2), dann sehr rasch ; er erreicht nach 100 h den Wert 7. Die antibiotische Aktivität der Gärbrühe beträgt 645 I1g/ml. Das Verhältnis der Gewichtsmengen der drei Spiramycine ist das folgende : I : 12% II : 13% III : 75%.
Eine in gleicher Weise, jedoch ohne Zusatz von Propionamid durchgeführte Fermentation liefert in 120 h eine Gärbrühe mit einer antibiotischen Aktivität von 760 lig/ml mit folgender Verteilung :
I :24%II:53%III:23%.
Beispiel 3 : Die Vorkultur wird wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Die Produktionskultur wird dieses Mal in einem Fermentationsgefäss von 800 1 Inhalt ausgeführt, das mit folgendem Medium beschickt wird :
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<tb>
<tb> Stärke <SEP> 16, <SEP> 000 <SEP> kg <SEP>
<tb> Ammoniumchlorid <SEP> 1, <SEP> 600 <SEP> kg <SEP>
<tb> Propionamid <SEP> l, <SEP> 600 <SEP> kg
<tb> Kaliumchlorid <SEP> 1, <SEP> 200 <SEP> kg <SEP>
<tb> Natriumchlorid <SEP> 6, <SEP> 800 <SEP> kg <SEP>
<tb> Monokaliumphosphat <SEP> 2, <SEP> 000 <SEP> kg <SEP>
<tb> Magnesiumsulfat <SEP> 0, <SEP> 400 <SEP> kg <SEP>
<tb> Citronensäure <SEP> 0, <SEP> 400 <SEP> kg
<tb> Zinksulfat. <SEP> 7 <SEP> H <SEP> 0 <SEP> 40 <SEP> g
<tb> Kobaltchlorid.
<SEP> 6 <SEP> H <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 12 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> 370 <SEP> l <SEP>
<tb>
Der PH-Wert wird durch Zugabe von 1450 cm3 Natronlauge von 360 Be auf 6,7 eingestellt und 2 kg Calciumcarbonat sowie 1600 cm3 Sojaöl zugesetzt. Dann wird unter 40minütigem Durchleiten von Dampf von 1200 sterilisiert. Nach Abkühlen beträgt das Volumen 400 l und der pH-Wert 6,7. Nun wird mit 401 Vorkultur aus dem 170 1 Fermentationsgefäss beimpft, mit 205 Umdr/min gerührt, mit 15 m3 Luft/Stunde belüftet und auf 250 gehalten. Nach 150 h beträgt die antibiotische Aktivität der Gärbrühe maximal 660 lig/ml.
Das Verhältnis der Gewichtsmengen der drei Spiramycine ist das folgende :
I :17%II:8%III:75%.
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Beispiel 4: Ein 2 1 fassender Erlenmeyerkolben wird mit 250 cm3 der folgenden Nährlösung beschickt :
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<tb>
<tb> Maisquellwasser <SEP> (50'lu <SEP> Trockenextrakt) <SEP> 40 <SEP> g
<tb> Stärke <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Magnesiumsulfat <SEP> l <SEP> g <SEP>
<tb> Monokaliumphosphat <SEP> 2 <SEP> g <SEP>
<tb> Leitungswasser <SEP> ad <SEP> 1000 <SEP> cm3
<tb>
Der pH-Wert wird mit Natronlauge auf 6, 8 eingestellt mit 5 g Calciumcarbonat zugesetzt.
Dann wird 45 min bei 1200 sterilisiert und nach Abkühlen mit einer Agar-Kultur von Streptomyces ambofaciens beimpft. Die Kultur wird auf einer Schüttelvorrichtung 48 h bei 250 geschüttelt.
Ausserdem werden 300 cm3 fassende Erlenmeyerkolben mit je 40 cm3 des folgenden Mediums beschickt :
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<tb>
<tb> Maisquellwasser <SEP> (5CJf/o <SEP> Trockenextrakt) <SEP> 45 <SEP> g
<tb> Glukose <SEP> 50 <SEP> g <SEP>
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> ad <SEP> 1000 <SEP> cm3
<tb>
Der pH-Wert wird mit Natronlauge auf 7, 0 eingestellt und 30 min bei 1200 sterilisiert. Nach Abkühlen beimpft man den Inhalt jedes Erlenmeyerkolbens mit 4 cm3 der im vorstehenden beschriebenen Vorkultur und schüttelt auf einer Schüttelvorrichtung bei 250 48 h. Man bringt dann in jeden Erlenmeyerkolben 20 cm3 einer sterilen wässerigen Lösung ein, die 12 g/l reines Spiramycin I in Form der Base und 6 g/l Natriumpropionat enthält. Man schüttelt die Kultur weitere 24 h und vereinigt dann den Inhalt aller Erlenmeyerkolben.
Die chromatographische Analyse der Gärbrühe zeigt, dass diese 2,6 g/l Spiramycin I und 0,28 g/l Spiramycir II und l, 12 g/l Spiramycin III enthält.
Beispiel 5: Man beschickt Erlenmeyerkolben mit 300 cm3 Fassungsvermögen mit je 40 cm3 der folgenden Nährlösung :
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<tb>
<tb> Hefe-Extrakt <SEP> 30 <SEP> g
<tb> Glukose <SEP> 50 <SEP> g <SEP>
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> ad <SEP> 1000 <SEP> cm3
<tb>
sterilisiert und beimpft gemäss Beispiel 4 und setzt nach 48stündiger Kultur jeden Erlenmeyerkolben 20 cm3 einer wässerigen sterilen Lösung, die 12 g/l Spiramycin I in Form der Base und 6 g/l Natriumpropionat enthält, zu.
Man inkubiert die Kultur 3Tage auf einer Schüttelvorrichtung. Nach dieser Zeit wird der Inhalt aller Erlenmeyerkolben vereinigt, die so erhaltene Kulturlösung enthält 2, 1 g/l Spiramycin I und 0, 114 g/l Spiramycin II sowie 1, 786 g/l Spiramycin III.
Beispiel 6 : 300 cm3 fassende Erlenmeyerkolben werden mit 40 cm3 des folgenden Mediums beschickt :
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<tb>
<tb> Ammoniumchlorid <SEP> 6 <SEP> g <SEP>
<tb> Glukose <SEP> 25 <SEP> g <SEP>
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 20g
<tb> Leitungswasser <SEP> ad <SEP> 1000 <SEP> cm3
<tb>
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<Desc/Clms Page number 7>
wässerigen Lösung, die 9 g/l reines Spiramycin I in Form der Base und 21 g/l Propionamid enthält, zugesetzt werden. Nach Beendigung der Fermentation zeigt die chromatographische Analyse, dass 1, 86 g/l Spiramycin I in ein Gemisch aus 551o Spiramycin II und 4fP/o Spiramycin III übergeführt worden sind. Es verbleiben ausserdem 1, 14 g/l Spiramycin I.
Beispiel 7 : Es wird nach Beispiel 6 verfahren, jedoch enthält die zugesetzte Lösung ausserdem 6 g Natriumpropionat/1. Die Papierchromatographie ergibt, dass 0, 96 g/l Spiramycin I zurückbleiben, und
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den sind.
Beispiel 8 : 300 cm3 fassende Erlenmeyerkolben werden mit je 40 cm3 der folgenden Nährlösung beschickt :
EMI7.2
<tb>
<tb> Ammoniumchlorid <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Glukose <SEP> 50 <SEP> g <SEP>
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 25 <SEP> g <SEP>
<tb> Leitungswasser <SEP> ad <SEP> 1000 <SEP> cm3
<tb>
und gemäss Beispiel 5 sterilisiert, beimpft und inkubiert. Nach 48stündiger Kultur versetzt man jeden Erlenmeyerkolben mit 20 cm3 einer sterilen wässerigen Lösung, die 12 g/l reines Spiramycin I in Form der Base und 6 g/l Natriumpropionat enthält. Die Erlenmeyerkolben werden dann in 4 Gruppen aufgeteilt, von denen die erste Gruppe als Kontrolle dient. Zu den drei andern Gruppen setzt man Magnesiumsulfat, Eisen (H)-sulfat bzw.
Kobaltchlorid bis zu einer Konzentration von 1 Millimol/l, bezogen auf das Gesamtvolumen, zu. Nach dreitägiger Inkubation wird der Inhalt aller Erlenmeyerkolben der gleichen Gruppe vereinigt und papierchromatographisch untersucht. Die Analysenergebnisse sind die folgenden :
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<tb>
<tb> Aktivator <SEP> Menge <SEP> an <SEP> umgesetztem <SEP> Mengenverhältnis <SEP> der <SEP> Spiramycine <SEP> in <SEP> %
<tb> Spiramycin <SEP> I <SEP> in <SEP> g/l <SEP> II <SEP> III
<tb> 0 <SEP> 1, <SEP> 88 <SEP> 21 <SEP> 79
<tb> Magnesium <SEP> 2, <SEP> 12 <SEP> 28 <SEP> 72
<tb> Eisen <SEP> 2, <SEP> 32 <SEP> 30 <SEP> 70
<tb> Kobalt <SEP> 2, <SEP> 80 <SEP> 27 <SEP> 73
<tb>
Beispiel 9: 300 cm3 fassende Erlenmeyerkolben werden unter den in Beispiel 8 beschriebenen Be-
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wässerigen Lösung, die 12 g/l reines Spiramycin I in Form der Base und 6 g/l Natriumpropionat enthält.
Jeder Erlenmeyerkolben der zweiten Gruppe erhält 20 cm3 der gleichen Lösung, der jedoch noch 30 g/l Natriumchlorid zugesetzt sind. Jede Gruppe Erlenmeyerkolben wird wie oben beschrieben behandelt. Die chromatographische Analyse zeigt folgendes Ergebnis :
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<tb>
<tb> NaCl <SEP> g/l <SEP> Menge <SEP> an <SEP> umgesetztem <SEP> Mengenverhältnis <SEP> der <SEP> Spiramycine <SEP> in'10
<tb> Spiramycin <SEP> 1 <SEP> in <SEP> g/l <SEP> II <SEP> III
<tb> 0 <SEP> 1,88 <SEP> 21 <SEP> 79
<tb> 10 <SEP> 2,60 <SEP> 23 <SEP> 77
<tb>
Beispiel 10 : 300 cm3 fassende Erlenmeyerkolben werden mit je 50 cm3 folgender Nährlösung beschickt :
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<tb>
<tb> Ammoniumchlorid <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Glukose <SEP> 50 <SEP> g <SEP>
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 25 <SEP> g <SEP>
<tb> Leitungswasser <SEP> ad <SEP> 1000 <SEP> cm3
<tb>
Die Erlenmeyerkolben werden unter den in Beispiel 5 beschriebenen Bedingungen sterilisiert, beimpft und inkubiert.
Nach 52stündiger Kultur wird jeder Erlenmeyerkolben mit 1 cm3 einer ISoigen Natriumpropionatlösung versetzt. Dann werden die Erlenmeyerkolben in zwei Gruppen geteilt. Jeder Kolben der ersten Gruppe wird mit 2 cm3 einer 15% igen Lösung von reinem Spiramycin I in Form der Base in Methanol versetzt.
In jeden Kolben der zweiten Gruppe bringt man eine Lösung der gleichen Konzentration, jedoch in Aceton ein. Man inkubiert die Kultur 62 h auf einer Schüttelvorrichtung. Der Inhalt aller Erlenmeyerkolben der gleichen Gruppe wird vereinigt und chromatographiert, wobei sich folgendes ergibt :
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<tb>
<tb> Lösungsmittel <SEP> Menge <SEP> an <SEP> umgesetztem <SEP> Mengenverhältnis <SEP> der <SEP> Spiramycine <SEP> in <SEP> 0/0
<tb> Spiramycin <SEP> I <SEP> in <SEP> g/l <SEP> II <SEP> III <SEP>
<tb> Methanol <SEP> 3, <SEP> 48 <SEP> 24 <SEP> 76
<tb> Aceton <SEP> 3, <SEP> 36 <SEP> 27 <SEP> 73
<tb>
EMI8.3
ten Vorkultur beimpft. Dann wird der Inhalt der Erlenmeyerkolben in drei Gruppen geteilt und auf einer Schüttelvorrichtung bei 250 48 bzw. 72 oder 96 h inkubiert.
Jedem Erlenmeyerkolben der drei Gruppen werden nach der angegebenen Zeit 2 cm3 einer zuigen Lösung von reinem Spiramycin I in Form der Base in Methanol und 1 cm3 einer 15% eigen wässerigen Natriumpropionatlösung zugesetzt und die Kultur nach Zugabe des Spiramycins 3 Tage lang fortgesetzt.
Der Inhalt der Erlenmeyerkolben der gleichen Gruppe wird papierchromatographisch untersucht, wobei folgende Resultate erhalten werden :
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<tb>
<tb> Zeitpunkt <SEP> der <SEP> Zugabe <SEP> von <SEP> Menge <SEP> an <SEP> umgesetztem <SEP> Mengenverhältnis <SEP> der <SEP> Spiramycine <SEP> in <SEP> 0/0
<tb> Spiramycin <SEP> nach <SEP> Stunden <SEP> Spiramycin <SEP> I <SEP> in <SEP> g/l <SEP> II <SEP> III
<tb> 48 <SEP> 3, <SEP> 00 <SEP> 16 <SEP> 84
<tb> 72 <SEP> 3, <SEP> 06 <SEP> 18 <SEP> 82
<tb> 96 <SEP> 1,62 <SEP> 28 <SEP> 72
<tb>
EMI8.5
EMI8.6
<tb>
<tb> Ammoniumnitrat <SEP> 13 <SEP> g
<tb> Glukose <SEP> 50 <SEP> g <SEP>
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> ad <SEP> 1000 <SEP> cm3
<tb>
Die Erlenmeyerkolben werden 30 min bei 1200 sterilisiert, abgekühlt und mit 5 cm3 einer Impfkultur,
deren Herstellung in Beispiel 4 beschrieben ist, beimpft. Nach dreitägiger Züchtung bei 250 auf einer Schüttelvorrichtung bringt man in jeden Erlenmeyerkolben 5 cm3 einer wässerigen Lösung mit einem Gehalt von 100 g/l. reinem Spiramycin I in Form der Base, 38 g/l Propionsäure und 10 g/l Kobaltchloridhexahydrat ein, deren pH-Wert durch Zugabe von Natronlauge auf. 6, 5 eingestellt worden war. Man setzt die Züchtung noch weitere 3 Tage fort und analysiert den Inhalt der Erlenmeyerkolben durch Papierchro-
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Beispiel 13 : 300 cm3 fassende Erlenmeyerkolbenwerden mit je 50 cm3 folgender Nährlösung beschickt :
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<tb>
<tb> Ammoniumnitrat <SEP> 20g
<tb> Stärke <SEP> 60g
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 25g
<tb> Leitungswasser <SEP> ad <SEP> 1000 <SEP> cm3
<tb>
Die Erlenmeyerkolben werden unter den in Beispiel 5 beschriebenen Bedingungen sterilisiert, beimpft und inkubiert. Nach 96stündiger Kultur versetzt man jeden Kolben mit 5 cm3 einer wässerigen Lösung, die 140 g/l rohes Spiramycin in Form der Base (59% Spiramycin I, 27% Spiramycin II, 14% Spiramycin III), 56 g/l Propionsäure und 0, 5 g/l Kobaltchlorid-hexahydrat enthält und mit Natronlauge auf PH 6,5 eingestellt wurde und setzt die Züchtung noch 3 Tage fort.
Die chromatographische Untersuchung ergibt, dass von den 8, 26 g/l des eingesetzten Spiramycin I 6, 30 g/1 zu einem Gemisch aus 13% SpiramycinIIund 87Vlo Spiramycin III umgesetzt wurden.
Beispiel 14 : Zwei 300 cm3 fassende Erlenmeyerkolben werden mit je 50 cm3 folgender Nährlösung beschickt :
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<tb>
<tb> Ammoniumchlorid <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Glukose <SEP> 50 <SEP> g <SEP>
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> ad <SEP> 1000 <SEP> cm3
<tb>
Die Erlenmeyerkolben werden unter den in Beispiel 5 beschriebenen Bedingungen sterilisiert, beimpft und inkubiert. Nach 72 h Züchtung wird der Inhalt der Erlenmeyerkolben zentrifugiert und die überstehende Flussigkeit entfernt.
Die Hälfte des Zentrifugates wird in einen Erlenmeyerkolben von 300 cm3 Inhalt in 50 cm einer wässerigen Lösung suspendiert, die 6 g/l reines Spiramycin I in Form der Base, 2,3 gel Propionsäure und 1 g/l Kobaltchlorid-hexahydrat enthält und durch Zugabe von Natronlauge auf 6, 5 eingestellt wurde. Die andere Hälfte des Zentrifugierrùckstandes wird in 50 cm3 einer wässerigen Lösung der gleichen Zusammensetzung, die jedoch ausserdem 10 g/l Glukose enthält, suspendiert.
Die beiden die Mycelsuspension enthaltenden Erlenmeyerkolben werden auf einer Schüttelvorrich- tung 2 Tage bei 250 inkubiert. Nach dieser Zeit wird der Inhalt jedes Kolbens durch Chromatographie analysiert. Die Ergebnisse der Umwandlung sind die folgenden :
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<tb>
<tb> Menge <SEP> an <SEP> umgesetztem <SEP> Mengenverhältnis <SEP> der <SEP> Spiramycine <SEP> in <SEP> o
<tb> Spiramycin <SEP> I <SEP> in <SEP> g/l <SEP> II <SEP> III
<tb> Ohne <SEP> Glukose <SEP> 2, <SEP> 22 <SEP> 14 <SEP> 86
<tb> mit <SEP> Glukose <SEP> 3, <SEP> 70 <SEP> 14 <SEP> 86 <SEP>
<tb>
Beispiel 15 : Ein 300 cm3 fassender Erlenmeyerkolben wird mit 50 cm3 folgender Nährlösung beschickt :
EMI9.4
<tb>
<tb> Ammoniumchlorid <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> Glukose <SEP> 50 <SEP> g <SEP>
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> ad <SEP> 1000 <SEP> cm3
<tb>
Der Erlenmeyerkolben wird unter den in Beispiel 5 beschriebenen Bedingungen sterilisiert, beimpft und inkubiert. Nach 72 h Züchtung wird der Inhalt des Kolbens zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit entfernt. Das Zentrifugat wird in einen Erlenmeyerkolben von 300 cm3 Inhalt in 50 cm3 einer Pufferlösung von PH = 4 suspendiert, die 9, 85 g Eisessig und 4, 9 g Natriumacetat je 1 sowie 6, 45 g/l rei-
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EMI10.1
Schüttelvorrichtung bei 250 inkubiert und der Inhalt des Kolbens papierchromatographisch untersucht.
2, 40 g/l Spiramycin I wurden in ein Gemisch aus 90% Spiramycin II und 10% Spiramycin III übergeführt.
Beispiel 16 : In ein Fermentationsgefäss von 170 1 Inhalt bringt man nacheinander folgende Bestandteile ein :
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<tb>
<tb> Maisquellwasser <SEP> (5fY1/o <SEP> Trockenextrakt) <SEP> 4800 <SEP> g
<tb> Stärke <SEP> 2400 <SEP> g <SEP>
<tb> Natriumchlorid <SEP> 600 <SEP> g
<tb> Magnesiumsulfat <SEP> 120 <SEP> g
<tb> Monokaliumphosphat <SEP> 240 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> 1001
<tb>
Der pH-Wert wird mit 750 cm3 40% figer Natronlauge auf 6,7 eingestellt und noch 600 g Calciumcar- bonat, 60 cm3 Sojaöl und 60 cm3 eines Antischaummittels aufSiliconbasis zugesetzt, worauf 40 min durch Durchleiten von Dampf bei 1220 sterilisiert wird und das Endvolumen 120 1 beträgt.
Nach Abkühlen auf 250 wird mit 250 cm3 einer gemäss Beispiel 4 hergestellten Impfkultur beimpft und mit 350 Umdr/min gerührt und mit 5 m3/StundeLuft belüftet. Nach 23 h Züchtung ist eine reichliche Entwicklung des Mycels eingetreten.
Des weiteren beschickt man ein Fermentationsgefäss von 30 l Inhalt mit 150 g Ammoniumchlorid, 750 g Glukosehydrat und 14 1 Leitungswasser und sterilisiert 40 min bei 1220. Nach Abkühlen und Einstellen auf 250 versetzt man mit 375 g Calciumcarbonat in steriler Suspension in 2 1 Wasser, wodurch das Volumen 15 1 beträgt. Das pH weist dann einen Wert von 7,5 auf.
Man beimpft mit 1, 5 1 der im vorstehenden beschriebenen und 23 h alten Vorkultur aus dem 170 l fassenden Fermentationsgefäss, rührt 48 h mit 550 Umdr/min und belüftet mit 1 m3 Luft/Stunde. Der PHWert der Kultur beträgt dann 6,5. Man versetzt nun mit einer wässerigen Lösung, die aus folgenden Bestandteilen zusammengesetzt ist :
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<tb>
<tb> Spiramycin-Base <SEP> (65% <SEP> Spiramycin <SEP> I,
<tb> 231o <SEP> Spiramycin <SEP> II, <SEP> 121o <SEP> Spiramycin <SEP> III) <SEP> 150 <SEP> g
<tb> Natriumpropionat <SEP> 19 <SEP> g
<tb> Ko <SEP> baltchlorid <SEP> - <SEP> hexahydrat <SEP> 17 <SEP> g <SEP>
<tb> n-Propionsäure <SEP> 300 <SEP> cm3
<tb> destilliertes <SEP> Wasser <SEP> 1000 <SEP> cm3
<tb>
und führt die Züchtung unter den gleichen Verfahrensbedingungen 90 h fort.
Man erhält 13,75 1 Gärbrühe, deren papierchromatographische Untersuchung zeigt, dass das gesamte Spiramycin I in ein Gemisch aus 290/o Spiramycin II und 71% Spiramycin III übergeführt worden ist. Die Extraktion der Gärbrühe liefert eine Ausbeute von 122 g Spiramycinbase, die aus 25% Spiramycin II und 75% Spiramycin III besteht.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Gewinnung von Spiramycin II und bzw. oder Spiramycin III durch Fermentation von S. ambofaciens in einem üblichen Nährmedium, dadurch gekennzeichnet, dass man dem Kulturmedium, das gegebenenfalls Spiramycin I enthalt, Essigsäure bzw. Propionsäure oder deren Salze, Ester, Amide bzw. solche höhere Homologen der genannten Verbindungen, die von S. ambofaciens zu den entsprechenden Acetyl- oder propionylverbindungen abgebaut werden, zusetzt.