JP4304195B2 - 生物学的粒子をソーティングする装置及び方法 - Google Patents
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Description
上記生物学的粒子からの光を検出する光検出部と、
上記フローに振動を与える振動発生器と、
上記フローとこのフローから分離した液滴を撮像する固定撮影部と、
上記撮影部で撮影された画像を利用して、ブレークオフポイントとこれに最も近い液滴との間に形成された、液滴より小さいサテライトドロップの大きさを検出する手段と、
上記サテライトドロップの大きさに応じて上記振動発生器の振動の大きさを制御する手段を備えた装置を提供することができる。
上記生物学的粒子からの光を検出する工程と、
上記フローに振動を与える工程と、
上記フローとこのフローから分離した液滴を撮像する工程と、
上記撮影された画像を利用して、ブレークオフポイントとこれに最も近い液滴との間に形成された、液滴より小さいサテライトドロップの大きさを検出する工程と、
上記サテライトドロップの大きさに応じて上記振動の大きさを制御する工程を備えた方法を提供することができる。
図1は、フローサイトメータの光学的要素を示す。この図に示すように、フローサイトメータ1は、蛍光染料及び蛍光抗体で染色された生物学的粒子(細胞または染色体)を含む液体(通常、細胞を含む懸濁液とシース液とからなる。)が流れる細い流路を形成する流路ブロック(流路形成部)2(図2参照)を有する。流路ブロック2に形成されている流路3の中を流れるシースフロー(流れ)4に光を照射する照明部5は、複数の励起光源を備えている。これら複数の光源には、異なる波長のレーザ光を発生するレーザ発生器が好適に利用される。例えば、本実施の形態では、3つの励起光源を備えており、第1の光源として波長488nmの第1のレーザ光(アルゴンレーザ)を発生する第1のレーザ発生器6Aが使用され、第2の光源には波長635nmの第2のレーザ光(ヘリウムネオンレーザ)を発生する第2のレーザ発生器6Bが使用され、第3の光源として波長375nmの第3のレーザ光(紫外線レーザ)を発生する第3のレーザ発生器6Cが使用されている。
フローサイトメータの流体力学的要素を説明する。図2は、フローサイトメータ1の層流形成容器40と該容器40の下端部に連結された流路ブロック2を模式的に表した図である。この図に示すように、容器40は、概略、上部の大径筒部41と、下部の小径筒部42と、これらの大径筒部41と小径筒部42を連結するテーパ部43を同心的に備えており、内部に層流形成室44を形成している。容器40の上端部は、シース液供給部45に接続されている。容器40の天井部には容器40の中心軸に沿って伸びる鞘管47が固定されており、生物学的粒子(細胞又は染色体)を含む液体を供給する供給部48に接続された供給管49が鞘管47に挿入されている。鞘管47の内径と供給管49の外径は、鞘管47に対して供給管49が上下に移動できるとともに鞘管47に対して供給管49が若干角度調整できるように決められている。そのため、鞘管47と供給管49との間には隙間が存在するが、この隙間はゴム製のOリング等の適宜シール部材(図示せず)によってシールされている。
このような構成を備えたフローサイトメータ1によれば、図2に示すように、シース液供給部45から供給されたシース液は容器40の内部を下方に向けて移動する。単位時間当たりのシース液の供給量は、容器40の内部をシース液が容器中心軸を中心として層流状態で移動するように決定する。一方、供給部48から供給された懸濁液は、供給管49を介して、層流状態で流れるシース液の中心に供給される。これにより、シース液が懸濁液の周囲を囲む円筒状の層流、すなわち粒子を容器40の中心軸に沿って一つ一つ正確に流すシースフローが形成される。次に、懸濁液とシース液は、容器40のテーパ部43で加速された後、小径筒部42に送られた後、流路ブロック2に入ってテーパ流路3で再び加速されて流路3に入る。
図5は、信号処理部24とソーティング装置90の回路構成を示す。図示するように、信号処理部24は複数のアンプ101を備えており、第1の検出部21と第2の検出部25の光検出器から出力された信号(前方散乱光、側方散乱光、蛍光に対応する信号)がそれぞれ増幅される。増幅された信号は、A/D変換器102でアナログ信号からデジタル信号に変換された後、メモリ103に送信されて記憶される。
L:レーザ集光位置(検出位置)LIP(Laser Intercept Point)からシースフローの下端位置(ブレークオフポイント)BP(Breakoff Point)までの距離
T:粒子が検出位置LIPから下端位置BPまで移動する時間
計算過程1は、粒子が検出位置LIPからブレークオフポイントBPまで移動する時間Tを計算する過程である。この計算過程1では、粒子間隔を十分あけた状態で粒子を流し、遅延時間Δt’を変化させながら、注入電極93に所定の極性(正極性又は負極性)の電荷を注入し、目的の方向に偏向した粒子の数をカウントする。目的の方向に偏向する粒子の数が最も多い状態は遅延時間Δt’が移動時間Tに一致した状態であり、その状態から電荷注入タイミングがずれると液滴及び粒子に電荷が適正に注入されず、目的の方向に偏向されない。したがって、遅延時間Δt’を変化すると、ガウス分布状態の時間遅れ(Δt’)−粒子数(カウントされた粒子数)特性(図示せず)が得られ、ガウス分布のピークに対応する時間遅れΔt’(peak)が移動時間Tに相当し、中央制御部117は時間遅れΔt’(peak)を計算し、これを移動時間Tとして記憶部116に記憶させる。
計算過程2は、検出位置LIPからブレークオフポイントBPの間に存在し得る又は存在する複数の粒子の粒子間平均距離(これは、液滴の間隔に相当する。)λを計算する過程である。図6を参照すると、シースフロー111から形成される液滴133に対応して、シースフロー111には一定の間隔をあけて大径部分と小径部分が交互に形成されており、粒子間距離がシースフローにおける大径部分(又は小径部分)の間隔に対応している。したがって、中央制御部117は、画像データを二値化してシースフロー111を背景の画像から区別する。カメラ112で撮影したシースフロー111の撮影画像を二値化して得られた画像データの編集結果を図7に示す。この図7は、撮影画像の上下方向の各高さ〔y(i)〕を縦軸、横方向の画素数〔x(i)〕を横軸に示している。また、図に示されたY(1)‥Y(4)‥が各大径部の最大径部分(ピーク)の高さを表し、ピーク間の距離(平均距離)が間隔λを表す。
計算過程3は、中央制御部117が、計算された時間Tと間隔λ等を用いて距離LB0を計算する過程である。具体的に、この計算過程3では、上述の式(4)を以下のように変形して得られる式(6)を用いて、距離LB0を計算する
上述のように、式(5)に含まれる時間T、間隔λ及び距離LBは上述のように計算され、ストロボ発光周期tは既知である。したがって、これらの計算された諸数値を用いて、距離LB0が計算される。また、計算された距離LB0、LBを用いて距離Lが計算できる。
粒子のソーティング制御において、液滴制御部110と荷電制御部120は、検出器が粒子を検出したことを示す信号(検出信号)を、信号処理部24から受信する。検出信号を受信すると、液滴制御部110は、ドロップディレイ制御部121を駆動し、記憶されているドロップディレイDDに対応する遅延時間Tの経過後、電荷注入回路91を起動し、液体に電荷を注入する。注入される電荷の極性は、信号処理回路24から出力された信号に基づいて、荷電制御回路120が決定する。そして、荷電制御回路120で決定された極性の電荷が、電荷注入回路91から液体に注入される。したがって、電荷注入直後にシースフロー111から分離される液滴(検出された粒子を含む液滴)は、粒子について検出された生物学的性質に対応した極性の電荷が注入され、電極板94,95の間を通過する際に偏向され、対応する容器(図示せず)に採取される。
フローサイトメータ1で使用するシース液の粘度は環境(例えば、温度)によって変化する。シース液の粘度が変化するとブレークオフポイントBPが上下に移動し、液滴の形成されるタイミングが変化する。したがって、液滴制御部110は、カメラ112の画像を利用して、ブレークオフポイントBPから撮影画像上端までの距離LB *を計算する。この計算は、上述のように、シースフロー111に沿ってその近傍に適当なスケール又はこれに代わる基準寸法物を配置し、カメラ112で撮影された基準寸法物の大きさ(画素数)を基準として計測することができる。具体的には、図10に示すように、液滴制御部110は、列番号iを「1」に設定し(1011)、当該列番号の画素数x(i)が「0」か否か判断する(1012)。画素数x(i)が「0」でない場合、列番号iを更新し(1013)、同様の判断処理(1012)を行う。画素数x(i)が「0」と判断されると、その列番号iをYBP(図8参照)に設定し、このYBPの値と基準寸法物の寸法から比例計算によって距離LB *を計算する。
図6に示すように、シースフロー111から液滴133が分離する際、分離した液滴133とこれに続く分離していない液滴133との間には、粒子を含まない小さな液滴のサテライトドロップ134が発生する。図面では、サテライトドロップ134が液滴133から分離して独立している理想的な状態で示されており、この独立した理想的な状態でシースフロー111に電荷を注入するのが最も好ましい。そこで、液滴制御部110は、カメラ112が撮影した画像を処理した二値画像データからサテライトドロップ134の状態を検出しながら、図6に示すようにサテライトドロップ134が独立した状態が得られるように、振動発生器89に印加する電圧を制御し、振動発生器89が発生する振動の大きさを調整する。
図12は、シース液供給部45と供給部48の詳細を示す。図示するように、シース液供給部45はシース液容器140を備えており、このシース液容器140にシース液141が収容されている。シース液容器140には2本のチューブ142,143が接続されている。チューブ142は、一端がシース液141の上部密閉空間に接続され、他端が圧力源144に接続されている。また、チューブ143は、一端がシース液141に浸けてあり、他端がバッファ容器145に接続されている。バッファ容器145は、シース液容器140の容量よりも遥かに小さな容量の容器であり、シース液容器140からチューブ143を介して供給されたシース液141が収容されている。バッファ容器145はまた、別のチューブ146を介して容器40に接続されている。図示するように、チューブ143、146の一端は、バッファ容器145に収容されているシース液141に浸けられている。
シース液供給部45のシース液容器145と供給部48のサンプル容器148の少なくともいずれか一方は、図13に示す容器を採用するのが好ましい。図13に示す容器155は、外側容器156と内側容器157からなる。外側容器156は、金属又はプラスチックなどの比較的剛性の高い材料で形成されている。内側容器157は、ガラスなどの材料で形成することができる。外側容器156は、内側容器157を収容可能な容器本体158と、容器本体158の上端口部に着脱自在にかつ密閉可能に装着される蓋159からなる。蓋159を容器本体158に取り付ける機構は、通常のねじ構造を用いるのが好ましい。また、蓋159と容器本体158の間をシールするために、図示するように、両者の間にOリング160を配置するのが好ましい。蓋159は、内側容器157に液体(シース液又はサンプル液)を供給し、また収容されている液体を加圧するために、複数のチューブ挿入孔161,162を有し、チューブ挿入孔161,162に挿入されたチューブ163,164の周囲がゴム等の弾性環状部材165,166でシールされている。このような構成の容器をシース液供給容器145やサンプル容器148に使用すれば、比較的剛性の高い材料で形成された外側容器156に囲まれた内部空間に圧力が加えられても、通常は割れ易いプラスチックなどの材料で形成されている内側容器157に亀裂が入っている場合でも、外側容器156の圧力は所定の値に維持されるので、安定してサンプル液が供給できる。また、容器155をサンプル容器に使用する場合、サンプル液に含まれる生物学的粒子が凝集して固まるのを防止するため、周期的に加振して粒子を攪拌する必要がある。この場合、外側容器156は剛性の高い材料で形成されているので、周期的な振動を加えても割れるという問題がない。なお、実施形態では蓋159に孔161,162を設け、これらにチューブ163,164を挿入しているが、蓋159にチューブを貫通した状態で固定し、この貫通チューブの両端(蓋の内側と外側)に別のチューブを接続してもよい。
フローサイトメータ1において、検出装置25の分光フィルタ30A〜30Cには、通常ダイクロックミラーが用いられる。このダイクロックミラーは、一般に、反射率が透過率よりも大きいという特性を有する。例えば、反射率Rは約0.9、透過率は約0.8である。したがって、例えば、図14に示すように、3つの分光フィルタ167,168,169を直列に配置し、各分光フィルタ167,168,169の透過光を検出器FL1〜FL4で検出するとともに分光フィルタを透過した光を下流側へ伝送すると、最後の分光フィルタ169で反射する光の強度と該分光フィルタ169を透過する光の強度はそれぞれ、検出装置25に入射する光の強度を1とした場合、0.576(=0.8×0.8×0.9)、0.512(=0.8×0.8×0.8)まで減少する。これに対し、図15に示すように、分光フィルタ167,168,169の反射光を下流側に伝送すると、最後の分光フィルタ169で反射する光の強度と該分光フィルタ169を透過する光の強度はそれぞれ0.729(=0.9×0.9×0.9)、0.648(=0.9×0.9×0.8)となり、図14に示す配置に比べて光の強度低下が少なく、そのため検出装置25の検出感度が高くなる。
2:流路形成部材(流路ブロック)
4:シースフロー
5:照明部
6:第1のレーザ発生器
7:第2のレーザ発生器
8:第1のレーザ光
9:光ファイバ
11:集光レンズ
12:第2のレーザ光
13:光ファイバ
14:ビームエキスパンダ
15:集光レンズ
21:第1の検出部
22:集光レンズ
23:光検出器
24:信号処理部
25:第2の検出器
90:ソーティング装置
110:液滴制御部
112:固定カメラ
113:ストロボ
114:ビデオデジタイザ
117:中央制御部
118:振動発生器駆動部
119:ストロボ駆動部
120:荷電制御部
121:ドロップディレイ制御部
133:液滴
134:サテライトドロップ
Claims (11)
- 生物学的粒子を含む液体のフローに光を当て、該生物学的粒子からの光を検出して、該生物学的粒子の生物学的情報を取得する装置であって、
上記生物学的粒子からの光を検出する光検出部と、
上記フローに振動を与える振動発生器と、
上記フローとこのフローから分離した液滴を撮像する固定撮影部と、
上記撮影部で撮影された画像を利用して、ブレークオフポイントとこれに最も近い液滴との間に形成された、液滴より小さいサテライトドロップの大きさを検出する手段と、
上記サテライトドロップの大きさに応じて上記振動発生器の振動の大きさを制御する手段を備えたことを特徴とする装置。 - 請求項1に記載の装置であって、
上記検出手段は、サテライトドロップのフロー方向に沿った長さを検出することを特徴とする装置。 - 請求項2に記載の装置であって、
上記制御手段は、検出された長さに応じて上記振動の大きさを制御することを特徴とする装置。 - 請求項2に記載の装置であって、
上記制御手段は、サテライトドロップの長さが一定となるように、検出された長さに応じて上記振動発生器に印加する電圧を制御することにより上記振動の大きさを制御することを特徴とする装置。 - 請求項1に記載の装置であって、
上記制御手段は、上記振動発生器に印加する電圧を制御することにより上記フローに与える振動の大きさを制御することを特徴とする装置。 - 請求項1に記載の装置であって、
上記生物学的粒子を所定の間隔をあけて配置した液体のフローを形成する流路形成部と、
上記流路形成部を含む層流形成容器と、
上記層流形成容器に供給されるサンプル液を収容する第1の容器と、
上記層流形成容器に供給されるシース液を収容する第2の容器と、
第1の容器に第1の圧力を供給する第1の圧力源と、
第2の容器に第2の圧力を供給する第2の圧力源と、
上記第1および第2の容器と連通し、第1の圧力が第2の圧力より所定の圧力差だけ大きくなるように第1の圧力を調整する圧力制御部とを備えたことを特徴とする装置。 - 生物学的粒子を含む液体のフローに光を当て、該生物学的粒子からの光を検出する方法であって、
上記生物学的粒子からの光を検出する工程と、
上記フローに振動を与える工程と、
上記フローとこのフローから分離した液滴を撮像する工程と、
上記撮影された画像を利用して、ブレークオフポイントとこれに最も近い液滴との間に形成された、液滴より小さいサテライトドロップの大きさを検出する工程と、
上記サテライトドロップの大きさに応じて上記振動の大きさを制御する工程を備えたことを特徴とする方法。 - 請求項7に記載の方法であって、
サテライトドロップのフロー方向に沿った長さを検出する工程を備えたことを特徴とする方法。 - 請求項7に記載の方法であって、
上記制御工程は、検出された長さに応じて上記振動の大きさを制御することを特徴とする方法。 - 請求項8に記載の方法であって、
上記制御工程は、サテライトドロップの長さが一定となるように、検出された長さに応じて上記振動発生器に印加する電圧を制御することにより上記振動の大きさを制御することを特徴とする方法。 - 請求項7に記載の方法であって、
上記制御工程は、上記振動発生器に印加する電圧を制御することにより上記振動の大きさを制御することを特徴とする方法。
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