WO2022102753A1 - ラクトコッカス・ラクチス、ラクトバチルス属に属する微生物、又はこれらの混合微生物を含有する生菌剤及びその製造方法 - Google Patents

ラクトコッカス・ラクチス、ラクトバチルス属に属する微生物、又はこれらの混合微生物を含有する生菌剤及びその製造方法 Download PDF

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WO2022102753A1
WO2022102753A1 PCT/JP2021/041767 JP2021041767W WO2022102753A1 WO 2022102753 A1 WO2022102753 A1 WO 2022102753A1 JP 2021041767 W JP2021041767 W JP 2021041767W WO 2022102753 A1 WO2022102753 A1 WO 2022102753A1
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WO
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viable
agent
microorganism
agent according
lactobacillus
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PCT/JP2021/041767
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Inventor
まゆみ 前川
章敬 上原
Original Assignee
味の素株式会社
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
    • A23K10/18—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions of live microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/70—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in livestock or poultry

Definitions

  • the present invention relates to a live bacterial agent containing Lactococcus lactis, a microorganism belonging to the genus Lactobacillus, or a mixed microorganism thereof, and a method for producing the same.
  • Lactic acid bacteria have been used in the field of fermented foods for a long time. Going back in history, Louis Pasteur discovered lactic acid bacteria in 1857, after which Ilya Ilyich Mechnikov wrote his book, The Prolongation of Life (non-Life). In Patent Document 1), he advocated the theory of immortality and longevity. With this as an opportunity, the usefulness of lactic acid bacteria has attracted attention in the fields of health food and medicine. Since then, there has been increasing interest in the establishment of lactic acid bacteria in the human intestine and the healthy state of the intestinal flora, and many studies have been conducted on the functions of lactic acid bacteria.
  • Non-Patent Document 2 oligosaccharides selectively used by microorganisms having beneficial effects are called “prebiotics” (Non-Patent Document 2). Furthermore, studies on synergistic effects by combining “probiotics” and “prebiotics” have also been reported (Non-Patent Document 3). As described above, lactic acid bacteria have various physiological functions, have been widely studied in a wide range of applications, have high expectations for industrial use, and many products have been developed. However, the substance itself that induces physiological functions and its mechanism of action have not yet been fully elucidated.
  • lactic acid bacteria is being studied not only in the field of human health and nutrition, but also in livestock animals and pets.
  • the reason is the problem of drug resistance genes caused by antibiotic growth promoter (AGP), which is one of the techniques for improving the productivity of livestock animals.
  • AGP antibiotic growth promoter
  • Antibiotics were originally developed for therapeutic purposes mainly in inhibiting the growth of pathogens, but after that, their uses expanded, and from the latter half of the 1950s, their use for the purpose of promoting the growth of livestock animals became widespread.
  • AGP antibiotic growth promoter
  • Non-Patent Document 4 the Colistin resistance gene, which was used as one of the AGPs, was found in a pig farm in China, and it was found that this gene exists on a mobile plasmid. If AGP continues to be used as it is, drug-resistant bacteria will become a greater risk than cancer in 2050, and if no measures are taken to address this issue, the annual mortality rate will exceed cancer and reach 10 million people. It is predicted that this may reach the limit and pose an international threat (Non-Patent Document 5).
  • regulations on AGP which is also used for therapeutic purposes in each country, and therapeutic drugs common to humans and animals have been tightened.
  • Non-Patent Document 6 There are many studies on probiotics and prebiotics as candidates for alternative materials to AGP (Non-Patent Document 6). Studies using the genus Bacillus (Non-Patent Document 7, Patent Document 1) and studies using lactic acid bacteria (Non-Patent Document 8, Non-Patent Document 9, Patent Document 2) as examples of feeding probiotics to monogastric animals. There is. However, there is still no definitive solution that surpasses the benefits of AGP and meets market expectations. In ruminants, monensin is widely used as an antibiotic. Methane released from ruminants is one of the major greenhouse gases from livestock, and the energy loss of host animals is equivalent to 2-12% of dietary energy, only from the economic point of view of livestock production.
  • Non-Patent Document 10 As a material alternative to monensin, a method of feeding fumaric acid (Patent Document 3) and a method of feeding cysteine (Patent Document 4) are known, but their effects are weak.
  • nisin which is one of the bacteriocins, has an effect of suppressing methane production, but the effect is not sustained because it is decomposed in the rumen by a bacterial protease (Non-Patent Document 11).
  • Non-Patent Document 12 There is also a report suggesting suppression of methane generation using lactic acid bacteria, but it has not yet been embodied as a viable bacterial agent imparted with acid resistance.
  • the active ingredients secreted by lactic acid bacteria include organic acids such as lactic acid and bacteriocins.
  • Bacteriocin is a general term for proteins and peptides that have antibacterial activity mainly against the same species and related species, and nisin and plantaricin are widely used as food preservatives.
  • Antibiotics are persistent substances that are not decomposed by digestive enzymes, but bacteriocins are proteins and are easily decomposed by digestive enzymes.
  • there are many studies on antibacterial activity and antibacterial spectrum of antibiotics and bacteriocins but there are very few reports that these substances have other functions. As a study investigating the possibility of having various functions, a function of enhancing the toughness of the intestinal epithelium has been reported (Patent Document 5).
  • Oligosaccharides have been commercialized as prebiotics, but it is known to promote the growth of so-called "good bacteria” present in the intestinal flora (Non-Patent Document 13). However, the effect on the entire intestinal flora is not large, and the effect of this addition has not been elucidated. One of the reasons is that oligosaccharides are easily metabolized, and even if they have an effective function, they cannot exert the function. On the other hand, by using persistent polysaccharides instead of oligosaccharides, so-called "bad bacteria” such as salmonella, E. coli, and Campylobacter, which are gram-negative bacteria that are not easily decomposed by intestinal bacteria and induce enteritis, are selected.
  • so-called "bad bacteria” such as salmonella, E. coli, and Campylobacter, which are gram-negative bacteria that are not easily decomposed by intestinal bacteria and induce enteritis
  • Patent Document 6 A technique for aggregating and excreting from the intestine has been reported (Patent Document 6). There is no report of a combination of the "bad bacteria” aggregating function due to polysaccharides and the intestinal colonization of "good bacteria” and the function of the active ingredient secreted by "good bacteria”.
  • Non-Patent Document 14 Non-Patent Document 14
  • lipoteichoic acid lipoteichoic acid
  • McPatent Document 15 there is Moonlighting protein as a substance involved in the interaction between the host and bacteria.
  • This protein is a general term for proteins having a plurality of different actions, and one of them is translation growth factor (Translation elongation factor Tu, EF-Tu).
  • Tu Translation elongation factor
  • EF-Tu exists inside the cell, it has also been clarified that it is a factor that partially moves extracellularly and colonizes the mucin layer (Non-Patent Document 16).
  • Non-Patent Document 17 a method of adding silica as a method of imparting acid resistance to microorganisms.
  • the present invention provides the following viable bacterial agent and a method for producing the same.
  • the above-mentioned viable agent 2.
  • the viable agent according to 1 above, wherein the microorganism is Lactococcus lactis.
  • 3. The viable agent according to 2 above, wherein the microorganism is a microorganism that produces Nisin. 4.
  • the viable bacterial agent according to 4 above, wherein the microorganism has a gene for biosynthesizing an intestinal colonization factor. 10. 9. The viable bacterial agent according to 9 above, wherein the intestinal colonization factor is a lectin, lipoteichoic acid, or EF Tu. 11. The viable agent according to any one of 4 to 10 above, wherein the microorganism is Lactbacillus plantarum. 12. The microorganism is at least one selected from the group consisting of Lactococcus lactis FERM BP-8552, Lactobacillus plantarum TUA1478L, Lactobacillus plantarum TUA1490L, and Lactobacillus plantarum TUA2424L, according to the above 1.
  • Viable fungus agent 13. The viable bacterial agent according to any one of 1 to 12 above, wherein the protective agent further comprises glutamine. 14. The viable bacterial agent according to any one of 1 to 13 above, wherein the protective agent further comprises arginine hydrochloride. 15. The viable bacterial agent according to any one of 1 to 14 above, wherein the protective agent further comprises cellulose. 16. The viable bacterial agent according to any one of 1 to 12 above, wherein the protective agent comprises silica, skim milk, sodium glutamate, and glutamine. 17. 16. The viable cell agent according to 16 above, wherein the protective agent contains 1 to 10 parts by mass of silica, 10 to 50 parts by mass of sodium glutamate, and 10 to 50 parts by mass of glutamine with respect to 100 parts by mass of skim milk.
  • the protective agent contains 1 to 10 parts by mass of silica, 10 to 50 parts by mass of sodium glutamate, 10 to 50 parts by mass of glutamine, and 10 to 50 parts by mass of arginine hydrochloride with respect to 100 parts by mass of skim milk. 18.
  • A Microorganisms belonging to the genus Lactococcus lactis, Lactococcus lactis, or a mixture thereof are cultivated.
  • B After completion of the culture, a protective agent containing at least silica and monosodium glutamate is added to the obtained culture and mixed.
  • C A viable bacterial agent is obtained by leaving the obtained mixture to stand and incorporating the protective agent into the cells. Manufacturing method of live bacterial agent. 23. 22. The production method according to 22 above, further comprising a step of spray-drying, freeze-drying, or stirring freeze-drying after the step (c).
  • 24 A method for increasing the body weight-increasing effect and feed efficiency of livestock, which comprises administering the livestock agent according to any one of 1 to 19 to livestock.
  • a viable cell agent capable of delivering viable cells to the intestine while maintaining the viable cell count.
  • FIG. 1 shows the repair rate of barrier function at various concentrations of Quercetin, NisinA and Lactococcus lactis FERM BP-855.
  • FIG. 2 shows a transmission electron micrograph of Lactococcus lactis FERM BP-8552 treated with a protective agent containing silica. The gourd-shaped black shadow present in the center of FIG. 2A shows the bacterial cells themselves.
  • FIG. 2B shows that silicon is present in the cells. Multiple white dots indicate the presence of elemental silicon.
  • FIG. 3 shows the growth rate of Bacillus subtilis (C-3102) and Lactobacillus plantarum strains under acidic conditions.
  • FIG. 4 shows the repair rate of barrier function at various concentrations of Quercetin and Lactobacillus plantarum strains.
  • FIG. 5 shows the bacteriocin biosynthetic genes present in Lactobacillus plantarum strain, TUA1490L, TUA2424L and TUA1478L.
  • FIG. 6 shows a transmission electron micrograph of Lactobacillus plantarum treated with a protective agent containing silica.
  • FIG. 6A shows the whole picture of the bacterial cells.
  • FIG. 6B is a diagram showing the presence or absence of Si in the horizontal direction from the left end to the right end along the arrow of FIG. 6C. Peaks near 40-45 points indicate the presence of Si.
  • FIG. 6C is an enlarged view in the arrow direction of FIG. 6A.
  • FIG. 7 shows the time course of the elution rate of Arabic Gum (AG) from the two-layer coated feed additive under the conditions of gastric juice and intestinal juice.
  • AG Arabic Gum
  • living agent includes living microorganisms that have a beneficial effect on the host when ingested in sufficient amounts.
  • the microorganism contained in the viable agent of the present invention is Lactococcus lactis, a lactic acid bacterium belonging to the genus Lactobacillus, or a mixture thereof.
  • the Lactococcus lactis that can be used in the present invention the FERM BP-8552 strain is preferable because Nisin is highly secreted.
  • the FERM BP-8552 strain was released on November 19, 2003 at the Patent Organism Depositary Center, Industrial Technology Research Institute (1-1-1, Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan, postal code 305-8566, now independent. It has been deposited with the Japan Product Evaluation Technology Infrastructure Organization, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan, postal code 292-0818).
  • the genus Lactobacillus that can be used in the present invention includes Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus agilis, Lactobacillus alactosus, and Lactobacillus.
  • alimentarius Lactobacillus amylophilus, Lactobacillus amylovorans, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus animalis, Lactobacillus animalis, Lactobacillus animalis, Lactobacillus animalis Lactobacillus animalis Lactobacillus animalis Lactobacillus animalis Lactobacillus animalis Lactobacillus bavaricus, Lactobacillus bifermentans, Lactobacillus bifidus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus lactobacillus buch bulgaricus), Lactobacillus catenaforme, Lactobacillus casei, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacill
  • Lactobacillus plantarum is preferable because it has abundant eating experience and the bacteriocin produced by it, Plantaricin, is widely used all over the world.
  • the Lactobacillus plantarum is preferably at least one selected from the group consisting of the TUA1478L strain, the TUA1490L strain (FERM P-21709), and the TUA2424L strain.
  • the TUA2424L strain capable of preventing intestinal inflammation is preferable because of its high acid resistance and ability to harden the membrane of gastrointestinal epithelial cells (synonymous with barrier repair ability).
  • the TUA1478L strain was commissioned by the National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganisms Depositary Center (post code 292-0818, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan).
  • the TUA1490L strain (FERM P-21709) was deposited internationally under the number NITE BP-03351, the accession number NITE BP-03352, and the TUA2424L strain under the accession number NITE BP-03353.
  • the microorganism used in the present invention preferably produces bacteriocin.
  • Bacteriocin is a general term for proteins and peptides produced by bacteria that have antibacterial activity mainly against the same species and related species.
  • Lactococcus lactis those capable of producing nisin, which is a kind of bacteriocin, are preferable.
  • lactobacillus plantarum those capable of producing bacteriocins such as Plantaricin-EF, Plantaricin-JK, Plantaricin-NC8 ⁇ , and Plantaricin-J51 are preferable.
  • TUA1478L strain capable of producing plantaricin-JK, plantaricin-N, plantaricin-A, and plantaricin-EF, plantaricin-NC8 ⁇ , plantaricin-A, and TUA1490L strain capable of producing plantaricin-EF is preferred.
  • pheromones such as plantaricin A and NC8-IF; those capable of producing other peptides such as PlnN and OrfZ2 are also preferable.
  • Lactobacillus plantarum which produces plantaricin A, is preferable because it has a membrane hardening effect.
  • the microorganism contained in the viable agent of the present invention has a gene that biosynthesizes an intestinal colonization factor because it can colonize the intestinal tract and exert an effect for a long period of time.
  • Intestinal colonization factors include lectins, lipoteichoic acid and EF-Tu (Translation elongation factor Tu).
  • EF-Tu Translation elongation factor Tu
  • the present inventors have confirmed that the EF-Tu synthetic gene is present in the TUA1478L strain, the TUA1490L strain, and the TUA2424L strain. Therefore, since these three strains are considered to be colonizable in the intestinal tract, they are proliferative in the intestinal flora and are expected to exert their effects for a longer period of time.
  • the genus Lactobacillus is preferable, Lactobacillus plantarum is more preferable, and Lactobacillus plantarum TUA2424L strain is particularly preferable.
  • the viable agent of the present invention is treated with a protective agent containing at least silica and monosodium glutamate (MSG).
  • MSG monosodium glutamate
  • the acid resistance of the microorganism can be improved.
  • higher acid resistance can be obtained by incorporating silicon atoms into the cells.
  • Monosodium glutamate is also taken up into the cells depending on the treatment conditions.
  • Sodium glutamate is also considered to play a role in suppressing the decrease in the viable cell count during drying.
  • the amounts of silica and monosodium glutamate are not particularly limited as long as they are sufficient to protect the microorganisms.
  • the amount of silica is preferably 0.01 to 5.0 g with respect to 1 g of dried cells, from the viewpoint of intracellular permeation amount, osmotic pressure and the like. When it is 0.1 to 1.0 with respect to 1 g of dried cells, it is more preferable from the viewpoint of stability and economy.
  • the amount of sodium glutamate is preferably 0.01 to 10.0 g with respect to 1 g of dried cells, from the viewpoint of intracellular permeation amount, osmotic pressure and the like. The amount is 0.15 g to 3.5 g with respect to 1 g of dried cells, which is more preferable from the viewpoint of stability and economy.
  • the protective agent further contains glutamine because the acid resistance is further improved. Depending on the treatment conditions, glutamine is also taken up into the cells.
  • the amount of glutamine is preferably 0.01 to 2.5 g with respect to 1 g of dried cells, from the viewpoint of intracellular permeation amount, osmotic pressure and the like. The amount is 0.2 to 2.5 g with respect to 1 g of dried cells, which is more preferable from the viewpoint of stability and economy.
  • the protective agent further contains arginine hydrochloride because the acid resistance is further improved. Depending on the treatment conditions, arginine hydrochloride is also taken up into the cells.
  • the amount of arginine hydrochloride is preferably 0.01 to 10.0 g with respect to 1 g of dried cells, from the viewpoint of intracellular permeation amount, osmotic pressure and the like.
  • the amount is 0.1 to 3.5 g with respect to 1 g of dried cells, which is more preferable from the viewpoint of stability and economy.
  • the protective agent further contains cellulose because a dry powder can be prepared more stably.
  • the amount of cellulose is 1 g to 20 g with respect to 1 g of dried cells, it is particularly preferable because a more stable dry powder can be prepared.
  • the protective agent further contains glutamine and arginine hydrochloride because the acid resistance is further improved.
  • a ratio of glutamine to arginine hydrochloride in a weight ratio of 2: 1 to 2: 3 is preferable from the viewpoint of stability and economy.
  • the protective agent further contains glutamine and cellulose because a dry powder can be prepared more stably.
  • the protective agent further contains arginine hydrochloride and cellulose because a dry powder can be prepared more stably.
  • the protective agent further contains skim milk because it can suppress a decrease in the viable cell count during drying.
  • the amount of skim milk is preferably 0.5 g to 20 g with respect to 1 g of dried cells, from the viewpoint of intracellular permeation amount, osmotic pressure and the like. 1 g to 10 g with respect to 1 g of dried cells is more preferable from the viewpoint of stability and economy.
  • the protective agent contains silica, sodium glutamate, glutamine and skim milk, it is preferable from the viewpoint of intracellular permeation amount and osmotic pressure that impart acid resistance.
  • the protective agent consists only of silica, monosodium glutamate, glutamine and skim milk.
  • the protective agent contains 1 to 10 parts by mass of silica, 10 to 50 parts by mass of sodium glutamate, and 10 to 50 parts by mass of glutamine with respect to 100 parts by mass of skim milk, from the viewpoint of stability and economy. Is preferable.
  • the protective agent contains silica, sodium glutamate, glutamine, arginine hydrochloride and skim milk
  • the protective agent consists only of silica, monosodium glutamate, glutamine, arginine hydrochloride and skim milk.
  • the protective agent contains 1 to 10 parts by mass of silica, 10 to 50 parts by mass of sodium glutamate, 10 to 50 parts by mass of glutamine, and 10 to 50 parts by mass of arginine hydrochloride with respect to 100 parts by mass of skim milk.
  • Including is preferable from the viewpoint of stability and economic efficiency.
  • Cellulose can also be used as a protective agent for treating bacterial cells together with silica and monosodium glutamate, and as an excipient, it constitutes a viable bacterial agent together with the dried bacterial cells. May be.
  • the viable bacterial agent of the present invention may contain bacteriocin, polysaccharide, oligosaccharide and the like as further active ingredients.
  • the viable agent of the present invention is in the form of a supplement, feed, etc. for animals other than humans, if the viable agent of the present invention contains bacteriocin and / or polysaccharide, the effect of exterminating bad bacteria of bacteriocin and It is possible to exert a synergistic effect of reducing inflammation induction by improving the intestinal flora through aggregation of bad bacteria.
  • Bacteriocins are classified into two classes, Class I and Class II, according to Paul D. Cotter's classification (Nat. Rev. Microbiol. 2005 Volume3 (10), pp777-88).
  • Examples of the bacteriocin that can be used in the present invention include bacteriocins belonging to ClassI, ClassIIb and ClassIIc. Specifically, at least one selected from the group consisting of nisin, gassericin, plantaricin, and subtilin can be preferably used.
  • each bacteriocin When the name of each bacteriocin is not followed by an alphabet, it means a general term for the bacteriocin (for example, the term “nisin” is a concept including NisinA, NisinZ, etc.). Of these, nisin and plantaricin are preferable because they have abundant eating experience and are widely used all over the world.
  • the antibacterial effect of exterminating bad bacteria is set to about 0.001 to 0.1% by mass with respect to the total mass of the viable bacterial agent. It is preferable from the viewpoint of. 0.01 to 0.05% by mass is more preferable from the viewpoint of stability and economy.
  • polysaccharide that can be used in the present invention those having a property of aggregating Gram-negative bacteria such as Eschericha coli are preferable. Whether or not it has the property of aggregating Gram-negative bacteria can be specified by the method disclosed in International Publication No. 2019/177172. Specifically, purulan, xanthan gum, guar gum, carrageenan, arabic gum, pectin, carboxymethyl cellulose, chondroitin, tara gum, locust bean gum, alginate (sodium salt, potassium salt, calcium salt, or ammonium salt), alginate ester and these. At least one selected from the group consisting of a mixture of the above can be preferably used.
  • arabic gum, pullulan, and xanthan gum are preferable from the viewpoint of cost effectiveness.
  • the content of the polysaccharide is about 10 to 1000 ppm with respect to the feed addition amount of the viable bacterial agent in that a stable body-increasing effect can be exhibited. 10 to 200 ppm is more preferable from the viewpoint of cost effectiveness.
  • the oligosaccharide at least one selected from xylooligosaccharide, fructooligosaccharide, and galactooligosaccharide can be preferably used. Of these, fructooligosaccharides are preferable from the viewpoint of cost effectiveness.
  • the content of the oligosaccharide is about 0.1 to 50% by mass with respect to the total mass of the viable agent from the viewpoint of stability and economy. .. 10 to 20% by mass is more preferable from the viewpoint of cost effectiveness.
  • the viable agent of the present invention includes various antioxidants such as citric acid, ascorbic acid and vitamin E; vitamins such as vitamins A, B1 and B2; minerals such as calcium, magnesium and manganese; flavors and the like. It may contain an ingredient.
  • the content of such an optional component is usually about 0.01 to 10% by mass based on the total mass of the viable agent.
  • the viable bacterial agent of the present invention was obtained by culturing (a) a microorganism belonging to the genus Lactococcus lactis, Lactococcus lactis, or a mixed microorganism thereof, and (b) after completion of the culture. It can be produced by adding and mixing a protective agent containing at least silica and sodium glutamate to the culture, and (c) leaving the obtained mixture to stand to allow the protective agent to be incorporated into the cells.
  • a medium for lactic acid bacteria such as a general MRS medium, GYP medium, BLB medium, or an improved medium thereof can be used.
  • the medium may further contain a safe substance that does not interfere with the growth of the microorganism, but is preferably free of animal-derived materials from the viewpoint of preventing bovine spongiform encephalopathy.
  • the culture conditions are not particularly limited, but for Lactococcus lactis, the temperature is generally preferably 30 to 39 ° C, the pH of the medium is preferably 4.5 to 7.5, and the culture time is preferably 5 to 30 hours.
  • the temperature is generally preferably 35 to 37 ° C.
  • the pH of the medium is preferably 5.5 to 6.5
  • the culture time is preferably 10 to 25 hours. Even under other conditions, it can be carried out in combination with other conditions such as a medium. Culturing should be carried out until a sufficient viable cell count is obtained. As a guide, it is about 10 ⁇ 10 cfu / mL. Whether or not a sufficient viable cell count was obtained can be determined, for example, by confirming that the turbidity of the appropriately serially diluted culture solution at a wavelength of 610 nm is 0.1 or more.
  • the culture cultured in this way can be filtered, centrifuged, or membrane-separated to separate the cells, and the recovered cells can be treated with a protective agent to obtain a viable cell agent.
  • the cultured culture itself can be treated with a protective agent described later to obtain a viable bacterial agent.
  • the conditions for separating the cells from the culture can be appropriately determined by those skilled in the art.
  • the protective agent is added to the culture or the collected cells.
  • the protective agent may be added in a total amount at a time, or may be added in small portions.
  • the protective agent may be added as it is, or may be dissolved or dispersed in water and added in a liquid form. It is preferable to add it in a liquid form because it can be evenly distributed throughout the cells.
  • the protective agent is preferably added in an amount of 1 to 20 g as a solid content with respect to 1 g of dried cells, and more preferably in an amount of 1 to 10 g. After adding the entire amount of the protective agent, stir and mix to bring the protective agent into contact with the cells.
  • the stirring can be performed mildly without foaming.
  • the protective agent can be taken into the cells. That is, in general, when producing a viable cell agent, the viable cell count is obtained by storing the cells at about 10 ° C. during the waiting time until the next drying step is started after the step of fermenting the viable cells. To maintain. At this time, by bringing the cells into contact with the protective agent, the protective agent is taken into the cells, and the cells obtain stronger acid resistance. However, the protective agent is not taken into the cells simply by adding the protective agent.
  • the protective agent was incorporated into the cells by storing the protective agent for several hours, at least for 2 hours or more for amino acids, and for 10 hours or more for Si.
  • the viable cell agent of the present invention can maintain a high viable cell count in the living body to which it is administered. Therefore, if the temperature is 10 ° C., it is preferable to keep the contact for about 10 to 18 hours, and more preferably about 10 to 16 hours.
  • the growth and metabolism of cells and the rate of uptake of protective agents decrease as the temperature drops from the optimum temperature. Therefore, if the storage temperature is lowered to, for example, 4 ° C., it is preferably about 12 to 22 hours, more preferably about 20 hours.
  • the storage temperature is raised to, for example, 20 ° C., it is preferably about 10 to 16 hours, more preferably about 14 hours. From the viewpoint of cost effectiveness, it is particularly preferable to store at 10 ° C. for about 10 to 16 hours. Whether or not the protective agent has been incorporated into the cells can be confirmed by observing with a transmission electron microscope or by measuring the change in the supernatant concentration of the protective agent before and after taking in the protective agent.
  • the cells may be dried. Drying may be carried out by spray drying (Spray Dryer (SD)), freeze drying (Freeze Dry (FD)), stirring freeze drying (Freeze Granulation-Freeze Dry (FG)) or room temperature vacuum drying. It is still better to perform by spray drying, freeze drying, or stirring freeze drying. Of these, freeze-drying is preferable from the viewpoint of cost effectiveness. Stirring freeze-drying is preferable because it can be produced more efficiently.
  • the drying temperature is mainly determined by the type of microorganism, but in the case of Lactococcus lactis, it is preferably ⁇ 20 ° C.
  • the water content of the viable cell agent after drying is preferably 5% by weight or less, more preferably 3% by weight or less. In the present specification, the water content can be measured by drying at 105 ° C. for 240 minutes using a constant temperature dryer and measuring the water content from the weight difference before and after drying.
  • the optional component may be added before the step (c) or in the middle of the step (c). Alternatively, it may be added after the step (c). For example, it may be added separately before and after the step (c). From the viewpoint of cost effectiveness that can simplify the sterilization step of the excipient, it is preferable to add it after the step (c). When the step (d) is carried out, it is preferable to add it after the step (d).
  • an optional component such as an excipient (for example, cellulose
  • the optional component may be added before the step (c) or in the middle of the step (c). Alternatively, it may be added after the step (c). For example, it may be added separately before and after the step (c). From the viewpoint of cost effectiveness that can simplify the sterilization step of the excipient, it is preferable to add it after the step (c).
  • the step (d) is carried out, it is preferable to add it after the step (d).
  • the viable bacterial agent of the present invention can also be administered to humans and animals in the form of supplements. It can also be ingested in yogurt or the like.
  • the above-mentioned microorganism is viable in an amount of 0.1 mg to 10 g, preferably 1 mg to 1 g, per 1 kg of the body weight of the subject to be administered. It is better to include it in the agent.
  • the ingestion amount, use amount or dose of the viable bacterial agent of the present invention at one time is appropriately adjusted according to the body weight of the subject, etc., but the raw material of the present invention is, for example, 3 to 5 g / kg body weight. It is preferable to ingest, use or administer the fungal agent.
  • the daily intake, use or dose of the viable bacterial agent of the present invention also varies depending on the body weight of the subject and the like, but is preferably 18 to 30 g / adult (assuming a body weight of 60 kg), for example.
  • the term "supplement” refers to a supplement taken by humans or animals for the purpose of maintaining, recovering or promoting health, or preventing or ameliorating a disease.
  • Examples of animals that can take the supplement of the present invention include ruminants such as cows, sheep and goats, and monogastric animals such as horses, pigs, chickens, dogs and fish.
  • ruminants such as cows, sheep and goats
  • monogastric animals such as horses, pigs, chickens, dogs and fish.
  • the antibiotic containing the viable bacterial agent of the present invention can avoid the problem of drug-resistant bacteria and can be used safely.
  • the amount of the microorganism is 0.001 g to 1 g per 1 kg of the body weight of the administration subject, preferably 0. It is preferable to include it in the viable cell agent in an amount of 01 g to 1 gcfu.
  • ⁇ Livestock growth promoter> As described in the background technology column, antibiotics have been mainly used as growth promoters for livestock, but in some countries the use is prohibited due to drug-resistant bacteria and environmental pollution. .. Since the viable bacterial agent of the present invention has antibacterial activity, it can also be used as a growth promoting agent for livestock in place of the conventional growth promoting antibiotic for livestock. According to the growth promoter of the present invention, problems such as drug-resistant bacteria and environmental pollution can be avoided. At this time, it is preferable to include the microorganism in the viable cell agent in an amount of 10 ⁇ 7 to 10 ⁇ 10 cfu, preferably 10 ⁇ 8 to 10 ⁇ 9 cfu, per 1 kg of the body weight of the administration target.
  • Lactococcus lactis contained in the viable agent of the present invention produces nisin, which is a kind of bacteriocin.
  • Nisin is known to have a methanogenic inhibitory effect on ruminant lumens (Non-Patent Document 9).
  • the effective dose depends on the type and body weight of the animal, but for example, when administered to cattle, the microorganism is preferably 10 ⁇ 6 to 10 ⁇ 9 cfu, more preferably 10 ⁇ 6 to 10 ⁇ 9 cfu, based on 1 kg of body weight per day. It is 10 ⁇ 7 to 10 ⁇ 8 cfu.
  • the viable bacterial agent of the present invention can be given to animals as it is, or can be given as a feed together with excipients or diluents such as corn, soybean flour, rice bran, fish meal and brewer's yeast.
  • the feed of the present invention may also contain any additives that may be included in the feed. It is appropriate that the feed of the present invention is continuously ingested every day. Examples of animals to which the feed of the present invention can be administered include ruminants such as cows, sheep and goats, and monogastric animals such as horses, pigs, chickens, dogs and fish. It is particularly preferable to feed the feed of the present invention to monogastric animals.
  • the effective dose depends on the type and body weight of the animal, but for example, when administered to chickens, the microorganism is preferably 10 ⁇ 7 to 10 ⁇ 10 cfu, more preferably 10 ⁇ 7 to 10 ⁇ 10 cfu, based on 1 kg of body weight per day. It is 10 ⁇ 8 to 10 ⁇ 9 cfu.
  • Test Example 1 Antibacterial spectrum of Lactococcus lactis, which is a Nisin-producing strain, The antibacterial spectra of the culture supernatants of the reagent products Nisin A and Nisin Z-producing bacteria were compared.
  • NisinA used a reagent manufactured by Sigma-Aldrich (Nisin content 2.5% by mass, balance sodium chloride and denatured milk solids).
  • As the NisinZ-producing bacterium Lactococcus lactis AJ110212 (FERM BP-8552) was used.
  • NisinZ-producing strains were cultured at 30 ° C. at 100 rpm for 20 hours by a conventional method using Lactobacillus MRS medium manufactured by BD Difco.
  • a sufficient amount of cells was obtained from the culture solution by measuring the optical density at a wavelength of 610 nm with a spectrophotometer (Biophoto-recorderTVS062CA manufactured by ADVANTEC) and confirming that it was 0.1 or more after 26-fold dilution. It was judged. Centrifuge the obtained culture solution (6,000 G x 10 min, 4 ° C) to remove the bacterial cell fraction, filter the supernatant fraction (ADVANTEC DISMIC-25CS, 0.20 ⁇ L filter unit), and aseptically. The supernatant was obtained. The following strains were used as the test bacteria. The medium and culture temperature are described in parentheses at the end of the strain.
  • the MRS medium used was Lactobacillus MRS Broth manufactured by Difco
  • the GAM medium and LB medium used were those manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the NB medium used was those manufactured by Difco.
  • Lactobacillus sakei JCM1157 (MRS, 37 °C) Lactobacillus acidophilus JCM1132 (MRS, 37 °C)
  • Lactobacillus salivarius JCM1231 MRS, 37 °C
  • Bifidobacterium thermophilum JCM1207 (GAM, 37 °C)
  • Enterococcus faecalis JCM5803 (MRS, 30 °C) Escherichia coli ATCC700926 (LB, 37 °C)
  • Salmonella enterica IAM1648 (NB, 37 °C) were used.
  • the minimum growth inhibition intensity is qualitative in the size of the inhibition circle using the Spot-on-lawn method described in Mayr-Harting, A. et al., Methods Microbiol. 197 2, 7A, pp315-422. I decided. The results are shown in Table 1. As a result, it was confirmed that there was almost no difference in the antibacterial spectra of the reagent products NisinA and NisinZ-producing bacteria. Therefore, it is considered that NisinZ-producing bacterium Lactococcus lactis FERM BP-8552 can be used as a viable agent.
  • Test Example 2 Membrane fastening test of Lactococcus lactis using Caco-2 cells According to the description of J. Nutr. (2009) volume 139 (5), pp965-974, the membrane fastening ability of the culture supernatant of lactic acid bacteria was increased. evaluated. Nisin A and Quercetin were used as reagent products, and Lactococcus lactis FERM BP-8552, a Nisin Z-producing bacterium, was used as a lactic acid bacterium.
  • Lactic acid bacteria are cultivated in MRS medium at 30 ° C for 20 hours, then the culture solution is centrifuged (6,000 G x 10 min, 4 ° C) to remove the bacterial cell fraction, and the supernatant fraction is filtered (filtered). ADVANTEC DISMIC-25CS, 0.20 ⁇ L filter unit) was used to obtain a sterile supernatant.
  • Caco-2 cells human gastrointestinal epithelial cells (ECACC, Code86010202)
  • DMEM medium 37 ° C.
  • TNF- ⁇ was added to reduce the barrier function of Tight Junction.
  • Example 3 Preparation (culture) of a viable bacterial agent containing Lactococcus lactis Lactococcus lactis FERM BP-8552 was cultured in Lactobacilli MRS Broth medium manufactured by BD Difco as follows, and then pulverized. That is, the main culture (fermenter, 20 L) was carried out through pre-seed culture (Sakaguchi flask, 50 ml) and seed culture (Sakaguchi flask, 1 L). NisinZ-producing bacterium Lactococcus lactis FERM BP-8552 was cultured at 30 ° C. at 100 rpm. The culture should be performed for about 20 hours.
  • the turbidity (Optical density, wavelength 610 nm) is measured with a spectrophotometer UVmini-1240 manufactured by Shimadzu Corporation, and the 26-fold dilution of the culture solution is 0.1 or more. By confirming that, it was judged that a sufficient amount of bacterial cells were obtained.
  • the cell fraction of the culture solution (20 L) was separated by a centrifuge. The centrifuge was carried out using a Beckman Coulter Avanti JE at a temperature of 15 ° C., a centrifugal speed of 6,750 G, and an hour of 15 minutes.
  • the cell fraction of the culture solution (20 L) obtained here was an amount equivalent to 20 g (10 ⁇ 12 cfu / g) as dried cells.
  • (Preparation liquid before powder) 3 g of silica (Carplex CS-7 manufactured by EVONIC), 100 g of Skim milk (manufactured by BD), and 30 g of monosodium glutamate (manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) (0.15 g of silica, 5.0 g of Skim milk, and 5.0 g of dried cells per 1 g of dried cells).
  • Test Example 4 Acid resistance test of live bacterial agent containing Lactococcus lactis (artificial gastric juice treatment) 1 ml of pure water containing 0.2% NaCl and 0.2% pepsin (from Porcine stomach Mucosa, 1: 5,000, 2,500 unit / mg) was adjusted to pH 1.5 to prepare an acid-resistant treatment liquid. Then, 0.02 g of the lactic acid bacterium powder obtained by drying by the FD method in Example 3 was added, and acid resistance treatment was carried out at 37 ° C. for 2 hours.
  • Test Example 5 Incorporation of protective agent into cells Obtained by drying by the FD method in Example 3 by EDX analysis (Energy dispersive X-ray spectroscopy) using a transmission electron microscope (TEM).
  • EDX analysis Energy dispersive X-ray spectroscopy
  • TEM transmission electron microscope
  • the Si element in the cells was analyzed.
  • the TEM image is shown in FIG.
  • the gourd-shaped black shadow present in the center of FIG. 2A shows the bacterial cells themselves.
  • FIG. 2B shows that silicon is present in the cells.
  • Multiple white dots indicate the presence of elemental silicon.
  • the shade of color has nothing to do with the amount of uptake. From this result, it was confirmed that Si, which normally does not exist in the cells, is incorporated into the cells. This phenomenon suggests that the viable bacterial agent of Example 3 may be imparted with acid resistance.
  • Test Example 6 Feeding test of live bacterial agent containing Lactococcus lactis to Salmonella-infected chickens 3.0 x 10 ⁇ 10 cfu (0.63 g) of cells dried by the FD method in Example 3 in a feed matrix of 12 kg having the composition shown in Table 4. ) And 5.63 g of viable cell agent mixed with 5 g of the excipient Cellulose was added to prepare a test feed. The final concentration of viable bacteria in the feed was 3 x 10 ⁇ 6 cfu / g, and after the 1-day-old broiler was introduced into the breeding facility for infection testing (6 birds / repeat, 2 repeats / test plot), Salmonella enterica (SE).
  • SE Salmonella enterica
  • Test Example 7 Growth experiment of Lactobacillus plantarum under acidic conditions (strain selection) Lactobacillus plantarum TUA1478L, TUA1490L, and TUA2424L were statically cultured in MRS medium at 37 ° C. As a control, the Bacillus subtilis C3102 strain used as a viable agent in Patent Document 1 was cultured with shaking (70 rpm) at 30 ° C. using Biophoto-recorder TVS062CA manufactured by ADVANTEC in LB medium.
  • the optical density of each cell was measured with a spectrophotometer at a wavelength of 610 nm, and it was confirmed that it was 0.1 or more after 26-fold dilution, and it was judged that a sufficient amount of cells was obtained. Then, the bacterial cell fraction obtained by centrifugation was suspended in physiological saline prepared at pH 2, and allowed to stand at 37 ° C. for 0.5 hour, 1 hour, 2 hours, 4 hours, and an acid resistance test was carried out. ..
  • Test Example 8 Membrane fastening test of Lactobacillus plantarum using Caco-2 cells According to the description of J. Nutr. (2009) volume 139 (5), pp965-974, the membrane fastening ability of the culture supernatant of lactic acid bacteria was increased. evaluated. Quercetin was used as a reagent product, and Lactobacillus plantarum JCM1057, Lactobacillus plantarum TUA1490L, and TUA2424L, which produce Plantaricin A, were used as lactic acid bacteria.
  • the test substance On the 14th day of culturing, the test substance was added, and after culturing at the same temperature for 24 hours, the transepithelial electrical resistance value TER ( ⁇ * cm2) was measured using Millicell ER S-2 (manufactured by Millipore). , The recovery ratio% of the barrier function was evaluated. The results are shown in FIG.
  • Test Example 9 Confirmation of bacteriocin biosynthetic gene of Lactobacillus plantarum (genome analysis) Whole-genome data of Lactobacillus plantarum TUA1478L, TUA1490L, TUA2424L were acquired. Using the Plantaricin gene cluster (amino acid sequence) of 9 strains registered in NCBI as a query, tBLASTn search was performed on the genomes (base sequences) of Lactobacillus plantarum TUA1478L, TUA1490L, and TUA2424L.
  • NCBI registered strains are Lactobacillus plantarum V90, YM 4-3, YM 5-2, 8P-A3, C11, J51, NC8, PCS20, 423.
  • the homology (% identity) of the alignment region is 90% or more and the ratio of the region length obtained to be aligned (query coverage) in the total length of the query sequence is 90% are extracted.
  • the operon structure was manually organized using information from records with longer alignment regions and higher homology among the 9 strains. The results are shown in FIG.
  • the TUA1478L strain has Plantaricin-JK, Plantaricin-N, Plantaricin-A, and Plantaricin-EF biosynthetic genes
  • the TUA 2424L strain has Plantaricin-EF biosynthetic genes
  • the TUA 1490L strain has Plantaricin-NC8 ⁇ , Plantaricin. It was confirmed that the biosynthetic genes of -A and Plantaricin-EF were present.
  • Test Example 10 Confirmation of adhesion factor EF Tu gene in Mucin layer of Lactobacillus plantarum (genome analysis) Whole-genome data of Lactobacillus plantarum 3 strains TUA1478L, TUA1490L, TUA2424L were obtained. The total length and homology of the Translation elongation factor Tu (EF-Tu) synthetic gene were evaluated for these three strains with reference to the WCFS1 strain registered at NCBI at the following site. That is, a BLAST search was performed on the genome sequences of the three strains using the base sequence of the target gene of the NCBI reference strain as a query, and the region (putative gene region) in which the alignment was obtained was performed on the genome sequences of the three strains.
  • EF-Tu Translation elongation factor Tu
  • Example 11 Preparation (culture) of a viable bacterial agent containing Lactobacillus plantarum Lactobacillus plantarum TUA1478L, TUA1490L, TUA2424L were cultured using BD Difco's Lactobacilli MRS Broth medium as follows, and then pulverized. That is, the main culture (fermenter, 20 L) was carried out through pre-seed culture (falcon tube, 50 ml) and seed culture (medium bottle, 1 L). The culture was carried out at a temperature of 37 ° C. for 20 hours.
  • the cell fraction of the culture solution (20 L) was separated by a centrifuge.
  • the centrifuge was a Beckman Coulter Avanti JE, and the centrifuge was centrifuged at a temperature of 15 ° C., a centrifugal speed of 6,750 G, and an hour of 15 minutes.
  • the cell fraction of the obtained culture solution (20 L) was an amount equivalent to 20 g (10 ⁇ 12 cfu / g) as dried cells.
  • (Preparation liquid before powder) A bacterial cell fraction (equivalent to 20 g as dried cells) was added to 1,000 ml of a protective agent solution in which the amount of the protective agent (unit g) shown in Table A was mixed with water, and the powder prepreparation solution was 1,200 ml. was prepared and allowed to stand in a refrigerator at 4 ° C. for 20 hours.
  • each protective agent component is 0.35 g of silica (Carplex CS-7 manufactured by EVONIC), 5.0 g of Skim milk (manufactured by BD), and 1.5 g of arginine hydrochloride (Ajinomoto Co., Inc.) per 1 g of dried cells. Equivalent to 1.5 g of monosodium glutamate (manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) and 1.0 g of glutamine (manufactured by Ajinomoto Co., Inc.).
  • Pre-powder preparation is sprayed into liquid nitrogen while stirring with a stirrer to form frozen particles, and cellulose equivalent to half the amount of dry substance in the protective agent solution.
  • the powder (Table A) was mixed and pulverized by freezing and vacuum drying. (Evaluation of viable cell count) To measure the viable cell count, 0.02 g of the powder sample obtained by the three powdering methods was suspended in 1 ml of physiological saline, diluted 10-fold with physiological saline, and 0.1 ml of the diluted solution was placed on an MRS agar plate.
  • Test Example 12 Incorporation of a protective agent into the cells Lactobacillus plantarum obtained in Example 11 by EDS (Energy Dispersive X-ray Spectrometer) analysis using a scanning transmission electron microscope (STEM). TUA2424L strain The elements in the cells were analyzed. The results are shown in Figure 6.
  • FIG. 6A shows the whole picture of the bacterial cells. An enlarged view in the direction of the arrow in FIG. 6A is FIG. 6C.
  • FIG. 6B analyzes the presence or absence of Si in the horizontal direction from the left end to the right end along the arrow in FIG. 6C. Peaks near 40-45 points indicate the presence of Si. From this result, it was confirmed that Si was present in a high concentration in the central part of the bacterial cell. This phenomenon suggests that the viable cell agent of Example 11 may be imparted with acid resistance.
  • Test Example 13 Confirmation of acid resistance gene of Lactobacillus plantarum Similar to Example 10, WCFS1 strain registered in NCBI was referred to, and the genes involved in acid resistance Glutamate decarboxylase "gadB" and Glutamine synthetase synthesis were performed for these three strains. The full length and homology of the genes were evaluated. It was confirmed that the above two enzyme synthesis genes were present in the two strains TUA1478L and TUA1490L, and the homology was 99% or more. It was also confirmed that the TUA 2424L strain had a Glutamate decarboxylase synthetic gene and had a homology of 99% or more.
  • Test Example 14 Acid resistance test of live bacterial agent containing Lactobacillus plantarum (artificial gastric juice treatment) 0.2% NaCl and 0.2% pepsin (from Porcine stomach Mucosa, 1: 5,000, 2,500unit / mg) were added to pure water produced using a pure water production device manufactured by Merck Millipore to adjust the pH to 1.5. It was artificial gastric juice.
  • Lactobacillus plantarum was cultured, the cell fraction was separated, and the cells were added to 1000 mL of a protective agent solution prepared by mixing the amount of the protective agent shown in Table B (unit g) below with water.
  • a fraction was added to prepare 1200 mL of a pre-powder preparation solution for Lactobacillus plantarum, and the pre-powder preparation solution was pulverized by the FD method to prepare a viable agent for Lactobacillus plantarum.
  • the concentration of each protective agent component is 0.35 g of silica (Carplex CS-7 manufactured by EVONIC), 5.0 g of Skim milk (manufactured by BD), and 1.5 g of arginine hydrochloride (Ajinomoto Co., Inc.) per 1 g of dried cells. Equivalent to 1.5 g of monosodium glutamate (manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) and 1.0 g of glutamine (manufactured by Ajinomoto Co., Inc.).
  • the viable cell preparation thus prepared was put into the artificial gastric juice, subjected to enzyme treatment at 37 ° C. for 2 to 4 hours, and the viable cell count was measured.
  • the results are shown in Table 9. "+” In the table means that each component is included.
  • “2 to 4 hours” assumes the time from when the viable bacterial agent reaches the stomach of the chicken to when it passes through the intestine.
  • Reference Example 15 Preparation of coated Arabic Gum (Coated-AG)
  • Preparation of additive for coated feed Arabic Gum (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is used as the core material, and rapeseed hydrogenated oil (melting point 67) is used as the coating agent. °C) was used.
  • a coated feed additive was obtained by spraying a predetermined amount of a coating agent liquefied by heating to a temperature higher than the melting point onto the powdered or granulated core. In this coating, 75 parts by mass of the core was coated with 25 parts by mass of hydrogenated rapeseed oil.
  • Reference example 16 Enteric solubility test of Coated-AG (Artificial gastric juice treatment) 0.2% NaCl and 0.2% pepsin (from Porcine stomach Mucosa, 1: 5,000, 2,500unit / mg) were added to pure water produced using a pure water production device manufactured by Merck Millipore, adjusted to pH 2, and then a reference example.
  • the coated feed additive (core is Arabic Gum) prepared in No. 15 was added and subjected to enzyme treatment at 37 ° C. for 2 hours. In addition, "2 hours” assumes the time from when the feed reaches the stomach of the chicken to when it passes through.
  • Test Example 17 Feeding test of live bacterial agent containing Lactobacillus plantarum to Salmonella-infected chickens
  • the live bacterial agent prepared by powdering by the FG method in Example 11 was put into a feed matrix having the composition shown in Table 4 and live bacteria.
  • a test feed was prepared by adding the agent so that the concentration of the agent was 1.0 x 10 ⁇ 6 cfu / g.
  • Salmonella enterica (SE) was orally administered to the 2-day-old broiler, and the test feed was fed for 21 days.
  • the body-increasing effect and feed efficiency of Salmonella enterica were evaluated. The effect was weak when the viable bacterial agent was used alone, but the body-building effect was enhanced when used in combination with Coated-AG.
  • Reference Example 18 Donation test of Coated-NisinA and Coated pullulan to Salmonella-infected chickens (preparation of Coated-NisinA and Coated pullulan) Nisin A (a reagent manufactured by Sigma-Aldrich (Nisin content 2.5% by mass, balance sodium chloride and denatured milk solids) was used as the core, and rapeseed hardening oil (melting point 67 ° C.) and natural resin Shellac were used as the coating agent.
  • a coated feed additive was obtained by spraying a powdered or granulated core with a predetermined amount of a coating agent liquefied by heating to a temperature higher than the melting point. The coating was applied to 77 parts by mass of the core.
  • Reference example 19 Lactobacillus plantarum TUA2424L cells were cultured at 37 ° C. using MRS medium. After culturing, centrifugation (6000 rpm, 10 min) was performed using a centrifuge SS-1500X (Sakuma Seisakusho), and the supernatant fraction was removed to obtain a bacterial cell fraction. After dispersion in physiological saline in which MSG 3% was dissolved, the cells were left to stand so that the amount of dried cells was 10 g / L. Table 12 shows the amount of glutamic acid (Glu) uptake for each elapsed time under each condition of temperature (10, 20, 30 ° C.) and glucose (Glc, 0.6%) addition.
  • Glu glutamic acid
  • the amount of Glu uptake was calculated according to the following formula after measuring the glutamic acid concentration in the supernatant for each elapsed time as described below. That is, the supernatant fraction obtained by centrifuging (6000 rpm, 10 min) with a centrifuge SS-1500X (Sakuma Seisakusho) was diluted 50-fold with pure water and manufactured by Oji Measuring Instruments Co., Ltd. The measurement was performed using the offline biosensor BF-7D, and the glutamate concentration in the supernatant fraction was calculated from the dilution ratio to obtain the glutamate concentration for each elapsed time.
  • A Glu concentration g / L (0 hours)-Glu concentration g / L (each elapsed time)
  • B bacterial cell mass 10 g / L From Table 12, it was found that the amount of glutamic acid taken up during low-temperature storage was large, and the amount of glutamic acid taken up by the culture medium containing glucose and having active metabolism was large.

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Abstract

本発明により、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、ラクトバチルス（Lactbacillus）属に属する微生物、又はこれらの混合微生物を含む生菌剤であって、前記微生物が、少なくともシリカ及びグルタミン酸ナトリウムを含む保護剤で処理されてなる前記生菌剤を提供する。

Description

ラクトコッカス・ラクチス、ラクトバチルス属に属する微生物、又はこれらの混合微生物を含有する生菌剤及びその製造方法
　本発明は、ラクトコッカス・ラクチス、ラクトバチルス属に属する微生物、又はこれらの混合微生物を含有する生菌剤、及びその製造方法に関する。
　乳酸菌は、古くから、発酵食品分野で利用されてきた。歴史を遡ると、1857年にルイ・パスツール（Louis Pasteur）が乳酸菌を発見、その後、イリヤ・イリイチ・メチニコフ（Ilya Ilyich Mechnikov）が、その著作「長寿の研究（The Prolongation of Life）」（非特許文献１）で、不老長寿説を唱えた。これが契機となり、健康食や医学分野において乳酸菌の有用性が注目されることとなった。それ以降、ヒトの腸内に、乳酸菌が定着し、腸内菌叢を健全な状態することに関心が高まり、乳酸菌のもつ機能について、多くの研究が実施されてきた。具体的には、整腸作用をはじめとして、有害微生物からの感染防御作用、ヒトに対する免疫賦活作用、抗アレルギー作用、血圧調製作用、過敏性腸炎とストレス対策、抗腫瘍性などの研究が盛んに行われ、乳酸菌には多様な生理機能があることが明らかにされてきた。その中で、「プロバイオティクス（Probiotics）」の概念が生まれてきた。これは、抗生物質（Antibiotics）に対比する概念として、ヒトの腸内菌叢のバランスを改善することで、ヒトの健康に良い効果をもたらす微生物を含む食品添加物と定義され、欧州をはじめとして、世界中で、ヨーグルト等の商品が普及されている。さらに、腸内菌叢のなかで、有益な作用をもたらす微生物に選択的に利用されるオリゴ糖は「プレバイオティクス（Prebiotics）」と呼ばれている（非特許文献２」）。さらに「プロバイオティクス」と「プレバイオティクス」との組合せによる相乗効果の検討も報告されている（非特許文献３）。このように、乳酸菌には多様な生理機能があり、応用範囲も幅広く研究され、産業利用への期待値は高く、数多くの商品が開発されてきた。しかしながら、今なお、生理機能を誘導する物質本体やその作用機序については、充分に解明されていない。
　ヒトの健康栄養領域にかぎらず、畜産動物やペットにも、乳酸菌の利用が検討されている。その理由は、畜産動物の生産性を改善する技術の１つである成長促進用抗生物質（antibiotic growth promoter, AGP）に起因する薬剤耐性遺伝子の問題である。抗生物質は、元来、病原菌の増殖を阻害することを中心に治療用途として開発されたが、その後、用途が拡大し、1950年代後半からは畜産動物の成長促進目的での利用が普及した。一方、薬剤耐性生菌の問題や環境汚染の観点から、2006年に欧州で成長促進用としての利用が禁止された。2016年、AGPの1つとして利用されていたColistin耐性遺伝子が中国の養豚場で見つかり、この遺伝子が可動性plasmid上に存在することが判明した（非特許文献４）。このままAGPを利用し続けると、2050年には、薬剤耐性菌はガン以上に巨大なリスクとなり、この課題に対してなにも対策を取らなければ、年間死亡率はガンを超えて1000万人に達する可能性があり、国際的な脅威となることが予見されている（非特許文献５）。これに伴い、各国でも治療用途にも利用されているAGPや、ヒト・動物共通の治療薬は、規制強化されている。
　AGPを代替する素材の候補として、プロバイオティクスやプレバイオティクスの研究が多数ある（非特許文献６）。単胃動物にプロバイオティクスを給与する例として、Bacillus属をもちいた研究（非特許文献７, 特許文献１）や乳酸菌をもちいた研究（非特許文献８、非特許文献９, 特許文献２）がある。しかしながら、AGPの効果を凌駕し、市場の期待に応える決定的な解決策は、いまだに存在しない。また反芻動物では、抗生物質としてモネンシンが幅広く利用されている。反芻動物から放出されるメタンは、畜産に起因する主要な温室効果ガスの1つであり、宿主動物のエネルギー損失は食事エネルギーの2～12％に相当し、家畜生産の経済的観点からだけでなく、環境的観点からも腸内メタン生成の削減が必要である。そのため、モネンシンは、牛の飼料効率を改善するための飼料添加物として利用され、かたルーメンのメタン生成を軽減することが報告されている（非特許文献１０）。モネンシンを代替する素材として、フマル酸を給与する方法（特許文献３）やシステインを給与する方法（特許文献４）などが知られているが、その効果は弱い。また、Bacteriocinの一つであるナイシン(Nisin)はメタン生成の抑制効果があるが、細菌プロテアーゼによりルーメン内で分解されるため、その効果は持続しない（非特許文献１１）。また乳酸菌を用いて、メタン発生抑制を示唆する報告があるが、耐酸性を付与した生菌剤としていまだ具現化されていない（非特許文献１２）。
　乳酸菌の分泌する有効成分には、乳酸等の有機酸やバクテリオシンがある。バクテリオシンはおもに同種や類縁種に対する抗菌活性をもった蛋白質やペプチドの総称で、ナイシン（Nisin）やプランタリシン（Plantaricin）は、食品保存料として広く利用されている。抗生物質は、消化酵素で分解されない難分解性物質であるが、バクテリオシンは蛋白質であるため消化酵素で 容易に分解される。一般的に、抗生物質やバクテリオシンは、抗菌活性や抗菌スペクトルの研究は多数あるが、これらの物質が他の機能を有している報告は極めて少ない。多様な機能を有している可能性を調べた研究として、腸管上皮膜の堅牢性を高める機能等が報告されている（特許文献５)。
　プレバイオティクスとして、オリゴ糖が商品化されているが、腸内菌叢に存在する、所謂、「善玉菌」の増殖を促進することは知られている（非特許文献１３）。しかしながら、腸内菌叢全体での影響は大きくなく、本添加効果については、解明されていない。その理由の１つは、オリゴ糖が容易に代謝されるため、有効な機能があっても、その機能を発揮することができないことにある。一方、オリゴ糖ではなく、難分解性の多糖を用いることで、容易に腸内細菌に分解されず、腸炎を誘引するグラム陰性細菌SalmonellaやE.coli、Campylobacter等の所謂「悪玉菌」を選択的に凝集し、腸内から排出させる技術が報告されている（特許文献６）。多糖による「悪玉菌」凝集化機能と「善玉菌」を腸管定着させ、「善玉菌」の分泌する有効成分を機能させる組合せは報告例がない。
　乳酸菌が腸管にどのように定着しているのかについても、これまで多くの研究が実施されてきた。腸粘膜に細胞表層のレクチンを介して付着する機構（非特許文献１４）やリポテイコ酸が付着に関与していることを示唆する報告がある（非特許文献１５）。また、宿主と細菌の相互作用にかかわる物質にMoonlighting protein がある。この蛋白質は、異なる複数の作用を有する蛋白質の総称であるが、その１つに、翻訳成長因子(Translation elongation factor Tu, EF-Tu)がある。EF-Tuは、細胞内に存在するが、一部、細胞外に移動し、ムチン層に定着する因子となることも明らかになってきた（非特許文献１６）。
　プロバイオティクスとして、ヨーグルトのような健康食品を利用する場合、耐酸性能が重要な要因なる。2時間以上、ｐH2の環境下で存在した場合、生菌数が激減する。一方、Bacillus　subtilisのような芽胞形成菌を利用した商品も多数存在する。芽胞の形態は、耐酸性を有している一方、芽胞が発芽するまでに長時間を要するため、腸管到達時には芽胞の状態で存在し、充分な機能を発揮することなく、糞便として排出されることが多い。このような観点から、微生物に耐酸性を付与させる方法として、シリカを添加する方法（非特許文献１７）がある。しかし、この文献には、Bacillus属に限定してSiが菌体内の細胞表層に局在化することで、耐酸性が付与することが報告されているが、他の微生物に関する報告はない。また、Glutamate decarboxylase (GadB)やGlutamine synthetase(GS)といった菌体内に存在するアミノ酸変換酵素により耐酸性が向上するとの報告もあるが（非特許文献１８）、菌体外からグルタミン酸（Glu）やその塩、グルタミン（Gln）を与えることで耐酸性が付与されるとの報告はない。
特公平３－７９９８８号公報 ＵＳ２０１７／００２０９３５Ａ１ 特開平11－46694号公報 特開平７－３２２８２８号公報 国際公開第２０１９／１７７１７１号 国際公開第２０１９／１７７１７２号
イリヤ・イリイチ・メチニコフ著、平野威馬雄訳、「長寿の研究（The Prolongation of Life）」、2006年、幸書房 日本乳酸菌学会編、「乳酸菌とビフィズス菌のサイエンス」、2010年、京都大学学術出版会 Journal of Nutritional Science (2013) v2 pp1-10 Lancet Infect Dis (2016) vol.16 pp.161-165 AMR Review (chaired by Jim O'Neill, Review on Antimicrobial Resistance) May 2016 Gut Pathog (2018) pp10-21 Journal of Applied Poultry Research (2000) vol.9(2) pp149-15 Poultry Science (2012) vol.91 pp1286-1291 Poultry Science (2014) vol.93(12) p3002 J. Anim. Sci. (1998) vol.76 pp906-914 FEMS Microbiol Ecol. (2002) vol.42(3) pp339-345 Asian-Australasian Journal of Animal Sciences (2010) vol.23(6) pp700-707 J.Daily Sci. Vol.64 (1981) pp185-192 Biosci.Biotechnol.Biochem. (1994) vol.58 (10) pp1851-1854 Appl.Environ.Microbiol., (1999) vol.65 (3) pp1071-1077 Infect Immun (2004) vol.72(4) pp2160-2169 Journal of Bacteriology (2010) pp111-116 Food Microbiology (2014) vol.42 pp172-180 J. Gen. Appl. Microbiol (2008) vol.54 pp9-24
　したがって、本発明は、生菌数が維持された状態で、生菌を、胃を通過して腸まで送達することができる生菌剤を提供することを課題とする。本発明はまた、そのような生菌剤の製造方法を提供することを課題とする。
　本発明により、以下の生菌剤及びその製造方法を提供する。
１．ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、ラクトバチルス（Lactbacillus）属に属する微生物、又はこれらの混合微生物を含む生菌剤であって、前記微生物が、少なくともシリカ及びグルタミン酸ナトリウムを含む保護剤で処理されてなる前記生菌剤。
２．微生物が、ラクトコッカス ラクチス（Lactococcus lactis）である前記１に記載の生菌剤。
３．微生物が、Nisinを産生する微生物である前記２に記載の生菌剤。
４．微生物が、ラクトバチルス属（Lactbacillus）に属する微生物である前記１に記載の生菌剤。 
５．微生物が、バクテリオシンを産生する微生物である前記４に記載の生菌剤。
６．微生物が、腸管上皮膜の堅牢性を強化する物質を産生する微生物である前記４又は５に記載の生菌剤。 
７．腸管上皮膜の堅牢性を強化する物質が、バクテリオシン又はフェロモンである前記６に記載の生菌剤
８．腸管上皮膜の堅牢性を強化する物質が、プランタリシン(Plantaricin)である前記６に記載の生菌剤。
９．微生物が、腸管定着因子を生合成する遺伝子を有する前記４に記載の生菌剤。  
１０．腸管定着因子が、レクチン、リポテイコ酸、又はEFTuである前記９に記載の生菌剤。
１１．微生物が、ラクトバチルス プランタム（Lactbacillus plantarum）である前記４～１０のいずれかに記載の生菌剤。
１２．前記微生物が、ラクトコッカス・ラクチス　ＦＥＲＭ　ＢＰ－８５５２、ラクトバチルス・プランタラム　ＴＵＡ１４７８Ｌ、ラクトバチルス・プランタラム　ＴＵＡ１４９０Ｌ、及びラクトバチルス・プランタラム　ＴＵＡ２４２４Ｌからなる群から選ばれる少なくとも１種である、前記１に記載の生菌剤。
１３．保護剤が、さらに、グルタミンを含む、前記１～１２のいずれかに記載の生菌剤。
１４．保護剤が、さらに、アルギニン塩酸塩を含む、前記１～１３のいずれかに項記載の生菌剤。
１５．保護剤が、さらに、セルロースを含む、前記１～１４のいずれかに記載の生菌剤。
１６．保護剤が、シリカ、スキムミルク、グルタミン酸ナトリウム、及びグルタミンを含む、前記１～１２のいずれかに記載の生菌剤。
１７．保護剤が、スキムミルク１００質量部に対し、シリカを１～１０質量部、グルタミン酸ナトリウムを１０～５０質量部、及びグルタミンを１０～５０質量部を含む、前記１６に記載の生菌剤。
１８．保護剤が、シリカ、スキムミルク、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン及びアルギニン塩酸塩を含む、前記１～１２のいずれかに記載の生菌剤。
１９．保護剤が、スキムミルク１００質量部に対し、シリカを１～１０質量部、グルタミン酸ナトリウムを１０～５０質量部、グルタミンを１０～５０質量部、及びアルギニン塩酸塩を１０～５０質量部を含む、前記１８に記載の生菌剤。
２０．前記１～１９のいずれかに記載の生菌剤を含む、サプリメント。
２１．前記１～１９のいずれかに記載の生菌剤を含む、飼料。
２２．（ａ）ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、ラクトバチルス・（Lactbacillus）属に属する微生物、又はこれらの混合微生物を培養し、
　（ｂ）培養終了後、得られた培養物に、少なくともシリカ及びグルタミン酸ナトリウムを含む保護剤を添加して混合し、
　（ｃ）得られた混合物を放置して保護剤を菌体内に取り込ませることにより生菌剤を得る、
生菌剤の製造方法。
２３．工程（ｃ）の後、噴霧乾燥、凍結乾燥、又は撹拌凍結乾燥により乾燥する工程をさらに含む、前記２２に記載の製造方法。
２４．前記１～１９のいずれかに記載の生菌剤を家畜に投与することを含む、家畜の増体効果および飼料効率を増大する方法。
　本発明によれば、生菌数が維持された状態で生菌を腸まで送達することができる生菌剤を提供することができる。
図１は、Quercetin, NisinA およびLactococcus lactis FERM BP-855の種々の濃度におけるバリア機能の修復率を示す。 図２は、シリカを含む保護剤で処理したLactococcus lactis FERM BP-8552の透過型電子顕微鏡写真を示す。図２Ａの中央に存在するひょうたん型の黒色の影が菌体そのものを示す。 図２Ｂは、ケイ素が菌体内に存在することを示す。白色の複数の点がケイ素元素の存在を示す。 図３は、Bacillus subtilis (C-3102), Lactobacillus plantarum株の酸性下での生育率を示す。 図４は、QuercetinおよびLactobacillus plantarum株の種々の濃度におけるバリア機能の修復率を示す。 図５は、Lactobacillus plantarum株, TUA1490L, TUA2424LおよびTUA1478Lに存在するバクテリオシン生合成遺伝子を示す。 図６は、シリカを含む保護剤で処理したLactobacillus plantarumの透過型電子顕微鏡写真を示す。図６Ａは、菌体の全体像を示す。 図６Ｂは、図６Ｃの矢印に沿って左端から右端まで水平方向にＳｉの存否を分析した図である。４０～４５ポイント付近のピークがＳｉの存在を示す。 図６Ｃは、図６Ａの矢印方向の拡大図である。 図７は、胃液及び腸液条件下での、２層被覆型飼料用添加剤からのArabic Gum（ＡＧ）の溶出率の経時変化を示す。
〔生菌剤〕
　本明細書における「生菌剤」は、十分量を摂取したときに宿主に有益な作用をもたらす生きた微生物を含む。
＜微生物＞
　本発明の生菌剤に含まれる微生物は、ラクトコッカス・ラクチス、ラクトバチルス属の乳酸菌、又はこれらの混合物である。
　本発明で用いることのできるラクトコッカス・ラクチスとしては、Nisinを高分泌に生産するため、ＦＥＲＭ　ＢＰ－８５５２株が好ましい。なお、ＦＥＲＭ　ＢＰ－８５５２株は、２００３年１１月１９日に独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１－１－１、郵便番号３０５－８５６６，現、独立行政法人 製品評価技術基盤機構、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８、郵便番号２９２－０８１８）に寄託されている。
　本発明で用いることのできるラクトバチルス属としては、ラクトバチルス・アシッドフィラス(Lactobacillus acidophilus)、ラクトバチルス・アジリス(Lactobacillus agilis)、ラクトバチルス・アラクトサス(Lactobacillus alactosus)、ラクトバチルス・アリメンタリウス(Lactobacillus alimentarius)、ラクトバチルス・アミロフィラス(Lactobacillus amylophilus)、ラクトバチルス・アミロボランス(Lactobacillus amylovorans)、ラクトバチルス・アミロボルス(Lactobacillus amylovorus)、ラクトバチルス・アニマリス(Lactobacillus animalis)、ラクトバチルス・バタタス(Lactobacillus batatas)、ラクトバチルス・ババリカス(Lactobacillus bavaricus)、ラクトバチルス・ビファメンタス(Lactobacillus bifermentans)、ラクトバチルス・ビフィズス(Lactobacillus bifidus)、ラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)、ラクトバチルス・ブンチネリ(Lactobacillus buchnerii)、ラクトバチルス・ブルガリカス(Lactobacillus bulgaricus)、ラクトバチルス・キャンテナフォルメ(Lactobacillus catenaforme)、ラクトバチルス・カセイ(Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・セロビオスス(Lactobacillus cellobiosus)、ラクトバチルス・コリノイデス(Lactobacillus collinoides)、ラクトバチルス・コンフスス(Lactobacillus confusus)、ラクトバチルス・コプロフィルス(Lactobacillus coprophilus)、ラクトバチルス・コリニフォルミス(Lactobacillus coryniformis)、ラクトバチルス・コリノイデス(Lactobacillus corynoides)、ラクトバチルス・クリスパタス(Lactobacillus crispatus)、ラクトバチルス・クルヴァトゥス(Lactobacillus curvatus)、デルブリュック-デルブルエキ(Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・デシデオサス(Lactobacillus desideosus)、ラクトバチルス・ダイバージェンス(Lactobacillus divergens)、ラクトバチルス・エンテリイ(Lactobacillus enterii)、ラクトバチルス・ファルシミニス(Lactobacillus farciminis)、ラクトバチルス・フェルメンタム(Lactobacillus fermentum)、ラクトバチルス・フリジダス(Lactobacillus frigidus)、ラクトバチルス・フルクティヴォランス(Lactobacillus fructivorans)、ラクトバチルス・ゲッセリ(Lactobacillus gasseri)、ラクトバチルス・ハロトレランス(Lactobacillus halotolerans)、ラクトバチルス・ヘルヴェティクス(Lactobacillus helveticus)、ラクトバチルス・ヘテロヒオキー(Lactobacillus heterohiochii)、ラクトバチルス・ヒルガルディ(Lactobacillus hilgardii）、ラクトバチルス・ホルドニアエ(Lactobacillus hordniae)、ラクトバチルス・イヌリヌス(Lactobacillus inulinus)、ラクトバチルス・イエンセニイ(Lactobacillus jensenii)、ラクトバチルス・ユグリティ(Lactobacillus jugurti)、ラクトバチルス・カンドレリ(Lactobacillus kandleri)、ラクトバチルス・ケフィア(Lactobacillus kefir)、ラクトバチルス・ラクティス(Lactobacillus lactis）ラクトバチルス・ライヒナマニ(Lactobacillus leichmannii)、ラクトバチルス・リンドネリ(Lactobacillus lindneri)、ラクトバチルス・マレフェルメンタンス(Lactobacillus malefermentans)、ラクトバチルス・マリ(Lactobacillus mali)、ラクトバチルス・マルタロミカス(Lactobacillus maltaromicus)、ラクトバチルス・マイナー(Lactobacillus minor)、ラクトバチルス・ミナタス(Lactobacillus minutus)、ラクトバチルス・ノビリス(Lactobacillus nobilis)、ラクトバチルス・ムリナス(Lactobacillus murinus)、ラクトバチルス・ペントサス(Lactobacillus pentosus)、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)、ラクトバチルス・プスエドプランタラム(Lactobacillus pseudoplantarum)、ラクトバチルス・レウテリ(Lactobacillus reuteri)、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・ロゴサエ(Lactobacillus rogosae)、ラクトバチルス・トレランス(Lactobacillus tolerance)、ラクトバチルス・トルクエンス(Lactobacillus torquens)、ラクトバチルス・ルミニス(Lactobacillus ruminis)、ラクトバシラス-サケ(Lactobacillus sake)、ラクトバチルス・サリヴァリゥス(Lactobacillus salivarius)、ラクトバチルス・サンフランシスコ(Lactobacillus sanfrancisco)、ラクトバチルス・シャーペアエ(Lactobacillus sharpeae)、ラクトバチルス・トリコデス(Lactobacillus trichodes)、ラクトバチルス・バクチノステルカス(Lactobacillus vaccinostercus)、ラクトバチルス・ヴィリデセンス(Lactobacillus viridescens)、ラクトバチルス・ヴィトゥリニス(Lactobacillus vitulinus)、ラクトバチルス・キシロサス(Lactobacillus xylosus)、ラクトバチルス・ヤマナシエンシス(Lactobacillus yamanashiensis)、ラクトバチルス・ザアエ(Lactobacillus zeae)等があげられる。このうち、ラクトバチルス・プランタラムは食経験が豊富であり、それが産生するバクテリオシンであるプランタリシン（Plantaricin）は世界中で広く利用されているので、好ましい。
　ラクトバチルス・プランタラムとしては、ＴＵＡ１４７８Ｌ株、ＴＵＡ１４９０Ｌ株（ＦＥＲＭ　Ｐ－２１７０９）、及びＴＵＡ２４２４Ｌ株からなる群から選ばれる少なくとも１種であるのが好ましい。このうち、耐酸性能および消化管上皮細胞の膜を堅牢化する能力（バリア修復能と同義）が高いことから、腸内炎症を予防可能なＴＵＡ２４２４Ｌ株が好ましい。なお、２０２０年１２月２４日に、独立行政法人 製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター（郵便番号２９２－０８１８、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）により、ＴＵＡ１４７８Ｌ株は受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３３５１で、ＴＵＡ１４９０Ｌ株（ＦＥＲＭ　Ｐ－２１７０９）は受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３３５２で、ＴＵＡ２４２４Ｌ株は受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３３５３で、それぞれ国際寄託された。
　本発明で用いる微生物が、バクテリオシンを産生するのが好ましい。バクテリオシンは、細菌類が産生する、おもに同種や類縁種に対する抗菌活性をもったタンパク質やペプチドの総称である。
　ラクトコッカス・ラクチスとしては、バクテリオシンの一種であるナイシン（Nisin）を産生できるものが好ましい。
　ラクトバチルス・プランタラムとしては、プランタリシン（Plantaricin）－ＥＦ，プランタリシン－ＪＫ，プランタリシン－ＮＣ８αβ、プランタリシン－Ｊ５１等のバクテリオシンを産生できるものが好ましい。なかでも、プランタリシン－ＪＫ、プランタリシン－Ｎ、プランタリシン－Ａ、およびプランタリシン－ＥＦを産生できるＴＵＡ１４７８Ｌ株、プランタリシン－ＮＣ８αβ、プランタリシン－Ａ、およびプランタリシン－ＥＦを産生できるＴＵＡ１４９０Ｌ株、及びプランタリシン－ＥＦを産生できるＴＵＡ２４２４Ｌ株が好ましい。
　本発明で用いる微生物としては、プランタリシンＡ，ＮＣ８-ＩＦ等のフェロモン；ＰｌｎＮ、ＯｒｆＺ２等の他のペプチドを産生することができるものもまた好ましい。このうち、膜堅牢化作用を有するので、プランタリシンＡを産生するラクトバチルス・プランタラムが好ましい。
　本発明の生菌剤に含まれる微生物が、腸管定着因子を生合成する遺伝子を有すると、腸管内に定着して長期間効果を発揮できるので好ましい。腸管定着因子としては、レクチン、リポテイコ酸及びＥＦ－Ｔｕ（翻訳成長因子(Translation elongation factor Tu)）があげられる。
　後述するとおり、本発明者らは、ＴＵＡ１４７８Ｌ株、ＴＵＡ１４９０Ｌ株、及びＴＵＡ２４２４Ｌ株にはＥＦ－Ｔｕ合成遺伝子が存在することを確認した。したがって、これら３株は、腸管に定着可能であると考えられることから、腸内菌叢において増殖可能であり、より長期間効果を発揮すると思われる。
　本発明の生菌剤に用いる微生物としては、ラクトバチルス属が好ましく、ラクトバチルス・プランタラムがより好ましく、ラクトバチルス・プランタラム　ＴＵＡ２４２４Ｌ株が特に好ましい。
＜保護剤＞
　本発明の生菌剤は、少なくとも、シリカとグルタミン酸ナトリウム（ＭＳＧ）とを含む保護剤により処理されている。この保護剤で前記微生物を処理することにより、微生物の耐酸性を向上させることができる。特に、処理条件により、菌体内にケイ素原子が取り込まれることにより、より高い耐酸性を得ることができる。グルタミン酸ナトリウムもまた、処理条件により、菌体内に取り込まれる。グルタミン酸ナトリウムは、乾燥時の生菌数減少を抑制するという役割も果たすと考えられる。
　シリカ及びグルタミン酸ナトリウムの量は、微生物を保護するのに十分量であれば特に限定されない。例えば、シリカの量は、乾燥菌体１ｇに対して、０．０１～５．０ｇであると、細胞内透過量および浸透圧等の観点で好ましい。乾燥菌体１ｇに対して、０．１～１．０であると、安定性および経済性の観点でより好ましい。グルタミン酸ナトリウムの量は、乾燥菌体１ｇに対して、０．０１～１０．０ｇであると、細胞内透過量、および浸透圧等の観点で好ましい。乾燥菌体１ｇに対して、０．１５ｇ～３．５ｇであると、安定性および経済性の観点でより好ましい。
　保護剤が、さらにグルタミンを含むと、さらに耐酸性が向上するので好ましい。処理条件により、グルタミンも菌体内に取り込まれる。グルタミンの量は、乾燥菌体１ｇに対して、０．０１～２．５ｇであると、細胞内透過量および浸透圧等の観点で好ましい。乾燥菌体１ｇに対して、０．２～２．５ｇであると、安定性および経済性の観点でより好ましい。
　保護剤が、さらにアルギニン塩酸塩を含むと、さらに耐酸性が向上するので好ましい。処理条件によっては、アルギニン塩酸塩も菌体内に取り込まれる。アルギニン塩酸塩の量は、乾燥菌体１ｇに対して、０．０１～１０．０ｇであると、細胞内透過量および浸透圧等の観点で好ましい。乾燥菌体１ｇに対して、０．１～３．５ｇであると、安定性および経済性の観点でより好ましい。
　保護剤が、さらにセルロースを含むと、より安定して乾燥粉体を調製できるので好ましい。セルロースの量は、乾燥菌体１ｇに対して、１ｇ～２０ｇであると、特により安定して乾燥粉体を調製できるので好ましい。
　保護剤が、さらにグルタミンとアルギニン塩酸塩とを含むと、さらに特に耐酸性が向上するので好ましい。グルタミンとアルギニン塩酸塩とを、重量比にして、２：１～２：３の割合にすると、安定性および経済性の観点で好ましい。
　保護剤が、さらにグルタミンとセルロースとを含むと、より安定して乾燥粉体を調製できるので好ましい。
　保護剤が、さらにアルギニン塩酸塩とセルロースとを含むと、より安定して乾燥粉体を調製できるので好ましい。
　保護剤が、さらにスキムミルクを含むと、乾燥時の生菌数減少を抑制できるので好ましい。スキムミルクの量は、乾燥菌体１ｇに対して、０．５ｇ～２０ｇであると、細胞内透過量および浸透圧等の観点で好ましい。乾燥菌体１ｇに対して、１ｇ～１０ｇであると、安定性および経済性の観点でより好ましい。
　保護剤が、シリカ、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン及びスキムミルクを含むと、耐酸性を付与する細胞内透過量および浸透圧等の観点で好ましい。特に、保護剤が、シリカ、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン及びスキムミルクのみからなるのが好ましい。このとき、保護剤が、スキムミルク１００質量部に対し、シリカを１～１０質量部、グルタミン酸ナトリウムを１０～５０質量部、及びグルタミンを１０～５０質量部を含むと、安定性および経済性の観点で好ましい。
　保護剤が、シリカ、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン、アルギニン塩酸塩及びスキムミルクを含むと、より耐酸性を付与する細胞内透過量および浸透圧等の観点で好ましい。特に、保護剤が、シリカ、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン、アルギニン塩酸塩及びスキムミルクのみからなるのが好ましい。このとき、保護剤が、スキムミルク１００質量部に対し、シリカを１～１０質量部、グルタミン酸ナトリウムを１０～５０質量部、グルタミンを１０～５０質量部、及びアルギニン塩酸塩を１０～５０質量部を含むと、安定性および経済性の観点で好ましい。
　なお、セルロースは、保護剤として、シリカ及びグルタミン酸ナトリウムと一緒に菌体を処理するのに使用することもできるし、賦形剤として、乾燥後の菌体と一緒にして生菌剤を構成してもよい。
＜更なる有効成分＞
　本発明の生菌剤は、前記微生物に加え、更なる有効成分として、バクテリオシン、多糖、オリゴ糖等を含んでもよい。本発明の生菌剤を、ヒトを除く動物用のサプリメントや飼料等の形態とする場合、本発明の生菌剤がバクテリオシン及び／又は多糖を含むと、バクテリオシンの悪玉菌駆除効果、および悪玉菌凝集を介する腸内菌叢改善による炎症誘導低減効果の相乗効果を発揮できる。本発明の生菌剤を、ヒトや動物用のサプリメント等の形態とする場合、本発明の生菌剤がオリゴ糖を含むと、善玉菌の増加による腸内菌叢を改善することができる。
　バクテリオシンは、Paul D. Cotterの分類（Nat. Rev. Microbiol. 2005 Volume3 (10), pp777-88）によると、ClassIとClassIIとの２つのクラスに分類されている。本発明で用いることができるバクテリオシンとしては、ClassI、ClassIIb及びClassIIcに属するバクテリオシンがあげられる。具体的には、ナイシン（Nisin）、ガセリシン（Gassericin）、プランタリシン（Plantaricin）、及びサブチリン（Subtilin）からなる群から選ばれる少なくとも１種を好適に用いることができる。なお、各バクテリオシンの名前の後ろにアルファベットが附されていない場合、そのバクテリオシンの総称を意味する（例えば、用語「ナイシン」は、NisinA, NisinZ等を包含する概念である）。このうち、食経験が豊富であり、世界中で広く利用されているので、ナイシン、プランタリシンが好ましい。
　本発明の生菌剤がバクテリオシンを含む場合、バクテリオシンの含有量を、生菌剤の全質量に対して、０．００１～０．１質量％程度とすると、悪玉菌を駆除する抗菌効果の観点で好ましい。０．０１～０．０５質量％が、安定性および経済性の観点でより好ましい。
　本発明で用いることができる多糖としては、Eschericha coli等のグラム陰性細菌を凝集させる性質を有するものが好ましい。グラム陰性細菌を凝集させる性質を有するか否かは、国際公開第２０１９／１７７１７２号に開示の方法により特定することができる。具体的には、プルラン、キサンタンガム、グアーガム、カラギーナン、アラビックガム、ペクチン、カルボキシメチルセルロース、コンドロイチン、タラガム、ローカストビーンガム、アルギン酸塩（ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、又はアンモニウム塩）、アルギン酸エステル及びこれらの混合物からなる群から選ばれる少なくとも１種を好適に用いることができる。このうち、費用対効果の観点で、アラビックガム、プルラン、キサンタンガムが好ましい。
　本発明の生菌剤が多糖を含む場合、多糖の含有量を、生菌剤の飼料添加量に対して、１０～１０００ｐｐｍ程度とすると、安定した増体効果発揮できる点で好ましい。１０～２００ｐｐｍがより費用対効果の観点で好ましい。
　オリゴ糖としては、キシロオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖から選ばれる少なくとも１種を好適に用いることができる。このうち、費用対効果の観点で、フラクトオリゴ糖が好ましい。
　本発明の生菌剤がオリゴ糖を含む場合、オリゴ糖の含有量を、生菌剤の全質量に対して、０．１～５０質量％程度とすると、安定性および経済性の観点で好ましい。１０～２０質量％がより費用対効果の観点で好ましい。
＜任意成分＞
　本発明の生菌剤は、酸化防止剤、例えば、クエン酸、アスコルビン酸、ビタミンＥ；ビタミン類、例えば、ビタミンＡ、Ｂ１、Ｂ２；ミネラル類、例えば、カルシウム、マグネシウム、マンガン；フレーバー等の各種成分を含んでもよい。このような任意成分の含有量は、生菌剤の全質量を基準にして、通常、０．０１～１０質量％程度である。
〔生菌剤の製造方法〕
　本発明の生菌剤は、（ａ）ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、ラクトバチルス・（Lactbacillus）属に属する微生物、又はこれらの混合微生物を培養し、（ｂ）培養終了後、得られた培養物に、少なくともシリカ及びグルタミン酸ナトリウムを含む保護剤を添加して混合し、（ｃ）得られた混合物を放置して保護剤を菌体内に取り込ませることにより製造することができる。
＜（ａ）培養＞
　本発明において使用する微生物の培養には、一般的なＭＲＳ培地、ＧＹＰ培地、ＢＬＢ培地等の乳酸菌用培地やこれらの改良培地を用いることができる。培地は、前記微生物の増殖を妨げない安全な物質をさらに含んでもよいが、牛海綿状脳症予防の観点から、動物由来材料を含まないのが好ましい。
　培養条件は特に限定されないが、ラクトコッカス・ラクチスについては、一般に、温度は３０～３９℃が好ましく、培地のｐＨは４．５～７．５が好ましく、培養時間は５～３０時間が好ましい。ラクトバチルス属については、一般に、温度は３５～３７℃が好ましく、培地のｐＨは５．５～６．５が好ましく、培養時間は１０～２５時間が好ましい。これ以外の条件でも、培地等他の条件を組み合わせて実施することができる。培養は、十分な生菌数が得られるまで行うのが良い。目安としては、１０＾１０ｃｆｕ／ｍＬ程度である。十分な生菌数が得られたかどうかは、例えば、適当に段階希釈した培養液の波長６１０ｎｍにおける濁度が０．１以上となることを確認することにより、判断できる。
＜菌体回収＞
　このようにして培養した培養物を、ろ過や遠心分離、膜分離に掛けて、菌体を分離し、回収した菌体を保護剤で処理して生菌剤とすることもできるし、上で培養した培養物そのものを、後述する保護剤で処理して生菌剤とすることができる。培養物から菌体を分離するための条件は、当業者であれば適宜決定することができる。
＜（ｂ）保護剤の添加及び混合＞
　培養を止めてから、前記保護剤を、培養物又は回収した菌体に添加する。保護剤は、一度に全量を添加してもよいし、少しずつ分けて添加してもよい。保護剤は、そのままの形態で添加してもよいし、水に溶解ないし分散させて液状の形態で添加してもよい。液状の形態で添加する方が、菌体全体にまんべんなく行き渡らせることができるので好ましい。例えば、保護剤を、乾燥菌体１ｇに対して、固形分として１～２０ｇとなる量で添加するのが好ましく、１～１０ｇとなる量で添加するのがより好ましい。
　保護剤を全量添加後、撹拌混合し、菌体に保護剤を接触させる。撹拌は、バッチ式の場合、例えば少なくとも２時間、回転数１０～２００ｒｐｍで、連続式の場合、例えば少なくとも１時間、回転数５０～１００ｒｐｍで行うと、泡立ちせず、マイルドに攪拌できる。
＜（ｃ）保護剤の菌体内への取り込み＞
　工程（ｂ）の後、菌体と保護剤との混合物を所定時間放置する。これにより、保護剤を菌体内に取り込むことができる。すなわち、一般的に、生菌剤を製造するとき、生菌を発酵させる工程に続いて次の乾燥工程を開始するまでの待ち時間には菌体を１０℃程度で保存することにより生菌数を維持する。このとき、菌体を保護剤と接触させることにより、菌体内に保護剤が取り込まれ、菌体はより強い耐酸性を得る。ただし、保護剤を添加しただけでは、保護剤は菌体内に取り込まれない。保護剤を添加した後、数時間、少なくともアミノ酸は２時間以上、Siは１０時間以上保存することで菌体内に保護剤が取り込まれることが分かった。その結果、本発明の生菌剤は、それが投与された生体内で、生菌数を高く維持することができる。したがって、１０℃であれば１０～１８時間程度接触させておくのが好ましく、１０～１６時間程度がより好ましい。菌体の増殖や代謝、保護剤の取り込み速度は、最適温度から下がるにつれて低下する。そのため、保存温度を例えば４℃に下げるのであれば１２～２２時間程度が好ましく、２０時間程度がより好ましい。逆に保存温度を例えば２０℃に上げるのであれば１０～１６時間程度が好ましく、１４時間程度がより好ましい。費用対効果の観点から、１０℃で１０～１６時間程度保管するのが特に好ましい。菌体内に保護剤が取り込まれたか否かは、透過型電子顕微鏡で観察したり、保護剤取込前後の保護剤の上清濃度の変化を測定したりすることにより確認することができる。
＜（ｄ）乾燥＞
　菌体と保護剤とを接触させた後、菌体を乾燥してもよい。乾燥は、噴霧乾燥（Spray Dryer（SD））、凍結乾燥（Freeze Dry（FD））、撹拌凍結乾燥（Freeze Granulation- Freeze Dry（FG））又は常温真空乾燥により行うのが良い。噴霧乾燥、凍結乾燥、又は撹拌凍結乾燥により行うのがなお良い。なかでも、凍結乾燥は、費用対効果の観点で好ましい。撹拌凍結乾燥は、より効率的に製造できる点で好ましい。
　乾燥温度は、主に微生物の種類によって決められるが、ラクトコッカス・ラクチスの場合、－２０℃～＋２５℃が好ましく、ラクトバチルス属の場合、－２０℃～＋３０℃が好ましい。
　乾燥後の生菌剤の水分含量が、５重量％以下であることが好ましく、３重量％以下がより好ましい。なお、本明細書において、水分含量は、恒温乾燥器を用いて１０５℃で２４０分間乾燥させ、乾燥前後の重量差から水分含量を測定することができる。
＜（ｅ）任意成分添加＞
　本発明の生菌剤が賦形剤（例えばセルロース）等の任意成分を含む場合、任意成分は、工程（ｃ）の前に添加してもよいし、工程（ｃ）の途中で添加してもよいし、工程（ｃ）の後に添加してもよい。例えば、工程（ｃ）の前と後とに分けて添加してもよい。賦形剤の殺菌工程を簡素化できる費用対効果の観点で、工程（ｃ）の後に添加するのが好ましい。工程（ｄ）を行う場合、工程（ｄ）の後に添加するのがよい。
〔用途〕
＜サプリメント＞
　本発明の生菌剤は、サプリメントの形態でヒトや動物に投与することもできる。ヨーグルト等に含ませて摂取することもできる。１０＾１０ｃｆｕ／ｇの生菌数がある生菌剤の場合は、前記微生物を、投与対象の体重１ｋｇ当たり、０．１ｍｇ～１０ｇとなる量で、好ましくは１ｍｇ～１ｇとなる量で生菌剤に含ませるのがよい。本発明の生菌剤の１回あたりの摂取量、使用量又は投与量は、対象の体重等に応じて適宜調整されるが、例えば、３～５ｇ／ｋｇ体重となるよう、本発明の生菌剤を摂取、使用又は投与するのが好ましい。本発明の生菌剤の一日当たりの摂取量、使用量又は投与量もまた、対象の体重等により異なるが、例えば、１８～３０ｇ／成人（体重６０ｋｇとして）であることが好ましい。
　なお、本明細書において、「サプリメント」とは、健康の保持、回復又は増進、あるいは病気の予防又は改善などを目的として、ヒト又は動物が摂取するものを指す。
　本発明のサプリメントを摂取できる動物としては、牛、羊、山羊等の反芻動物、馬、豚、鶏、犬、魚等の単胃動物があげられる。
＜抗生物質＞
　本発明の生菌剤は抗菌活性を有するので、抗生物質として使用することもできる。本発明の生菌剤を含む抗生物質は、薬剤耐性菌の問題を回避することができ、安全に使用できる。１０＾１０ｃｆｕ／ｇの生菌数がある生菌剤の場合は、投与対象の体重１ｋｇ当たり、前記微生物を、投与対象の体重１ｋｇ当たり、０．００１ｇ～１ｇとなる量で、好ましくは０．０１ｇ～１ｇｃｆｕとなる量で生菌剤に含ませるのがよい。
＜家畜の成長促進剤＞
　背景技術の欄に記載したとおり、従来、家畜の成長促進剤としては、主に抗生物質が使用されて来たが、薬剤耐性菌や環境汚染の観点から、利用が禁止されている国もある。本発明の生菌剤は、抗菌活性を有するので、従来の家畜の成長促進用抗生物質に代わる、家畜の成長促進用剤としても使用することができる。本発明の成長促進剤によれば、薬剤耐性菌や環境汚染といった問題を回避することができる。このとき、前記微生物を、投与対象の体重１ｋｇ当たり、１０＾７～１０＾１０ｃｆｕとなる量で、好ましくは１０＾８～１０＾９ｃｆｕとなる量で生菌剤に含ませるのがよい。
＜反芻動物のルーメンにおけるメタン生成抑制＞
　本発明の生菌剤に含まれるラクトコッカス・ラクチスは、バクテリオシンの一種であるナイシンを生成する。ナイシンは、反芻動物のルーメンにおいてメタン生成抑制効果があることが知られている（非特許文献９）。ラクトバチルス属の微生物、特にラクトバチルス・プランタラムは、バクテリオシンの一種であるプランタリシンを生成する。したがって、本発明の生菌剤は、反芻動物のルーメンにおけるメタン発生抑制剤としても使用することができる。
　有効投与量は、動物の種類や体重等に依存するが、例えば、牛へ投与する場合、１日あたり体重１ｋｇに対して、前記微生物が、好ましくは１０＾６～１０＾９ｃｆｕ、より好ましくは１０＾７～１０＾８ｃｆｕである。
＜飼料＞
　本発明の生菌剤は、動物にそのまま与えることもできるし、トウモロコシ、大豆粉、米ぬか、魚粉、ビール酵母等の賦形剤ないし希釈剤と一緒にして飼料として与えることもできる。本発明の飼料はまた、飼料に含まれ得る任意の添加剤を含んでもよい。本発明の飼料は、毎日連続して摂取するのが適当である。
　本発明の飼料を投与できる動物としては、牛、羊、山羊等の反芻動物、馬、豚、鶏、犬、魚等の単胃動物があげられる。本発明の飼料を、単胃動物に与えるのが特に好ましい。
　有効投与量は、動物の種類や体重等に依存するが、例えば、鶏へ投与する場合、１日あたり体重１ｋｇに対して、前記微生物が、好ましくは１０＾７～１０＾１０ｃｆｕ、より好ましくは１０＾８～１０＾９ｃｆｕである。
試験例１：Nisin生産菌株であるLactococcus lactisの抗菌スペクトル
　試薬品NisinAおよびNisinZ生産菌の培養上清液の抗菌スペクトルを比較した。NisinAは、Sigma-Aldrich社製の試薬（Nisin含量2.5質量%, balance sodium chloride and denatured milk solids) を使用した。またNisinZ生産菌は、Lactococcus lactis AJ110212 (FERM BP-8552)を用いた。BD Difco 社製のLactobacilli MRS 培地を用いて、NisinZ生産菌株を、常法により30℃において100rpmにて20時間、培養した。培養液は、分光光度計（ADVANTEC社製Biophoto-recorderTVS062CA）にて波長610nmにてOptical densityを測定、26倍希釈で0.1以上となることを確認することにより、十分量の菌体が得られたと判断した。得られた培養液を遠心分離（6,000G x10min, 4℃）にて、菌体画分を除去し、上清画分をフィルター濾過（ADVANTEC社DISMIC-25CS、0.20 μLフィルターユニット）して、無菌上清液を取得した。
　検定菌は、以下の菌株を利用した。培地、培養温度は菌株の末尾のカッコ内に記載した。MRS培地はDifco 社製のLactobacilli MRS Brothを、GAM 培地及びLB培地は、日水製薬社製のものを、NB培地はDifco社製のものを用いた。検定菌はLactobacillus sakei JCM1157（MRS,37℃）、Lactobacillus acidophilus JCM1132（MRS,37℃）、Lactobacillus salivarius JCM1231（MRS,37℃）、Bifidobacterium thermophilum JCM1207（GAM,37℃）、Bacteroides fragilis JCM11019（GAM,37℃）、Clostridium perfringens ATCC10873（GAM,37℃）、Enterococcus faecalis JCM5803（MRS,30℃）、Escherichia coli ATCC700926 (LB, 37℃)、Salmonella enterica IAM1648（NB，37℃）を用いた。最小生育阻止強度は、Mayr-Harting, A. et al., Methods Microbiol. 197 2, 7A, pp315-422に記載のSpot-on-lawn methodを用いて、阻止円の大きさにて、定性的に判断した。結果を表１に示した。この結果、試薬品NisinAとNisinZ生産菌の抗菌スペクトルに殆ど差がないことが確認された。よって、NisinZ生産菌 Lactococcus lactis FERM BP-8552 は、生菌剤として用いることができると考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
試験例２：Caco-2細胞を用いたLactococcus lactis の膜堅牢化試験
　J.Nutr.(2009) volume 139(5), pp965-974の記載に従って、乳酸菌の培養上清液を膜堅牢化能を評価した。試薬品としてNisinAおよびQuercetin、並びに乳酸菌としてNisinZ生産菌Lactococcus lactis FERM BP-8552を用いた。乳酸菌はMRS培地にて30℃で20時間、静置培養後、培養液を遠心分離（6,000G x10mi n, 4℃）にて、菌体画分を除去し、上清画分をフィルター濾過（ADVANTEC社DISMIC-25CS、0.20 μLフィルターユニット）して、無菌上清液を取得した。
　Caco-2 細胞（ヒト消化管上皮細胞（ECACC、Code86010202））を、二層式のTranswell システムに播種し，37℃においてDMEM培地で培養した。培養12日目に、TNF-αを添加し、Tight Junctionのバリア機能を低下させた。培養14日目に、試験物質を添加し、同じ温度において24時間培養後、Millicell ER S-2(Millipore社製)を用いて、経上皮電気抵抗値TER(Ω*cm2)を測定することにより、バリア機能の修復(recovery ratio%)を評価した。結果を図１に示した。この結果からも、Lactococcus lactis FERM BP-8552 は、生菌剤として用いることができると考えられる。
実施例３：Lactococcus lactis を含む生菌剤の調製
（培養）
　Lactococcus lactis FERM BP-8552は、以下のように、BD Difco 社製Lactobacilli MRS Broth培地を用いて、培養し、その後に粉体化した。すなわち、プレシード培養（坂口フラスコ, 50ml）およびシード培養(坂口フラスコ, 1L)を経て、メイン培養(発酵槽、20L)を実施した。NisinZ生産菌Lactococcus lactis FERM BP-8552を、30℃において100rpmにて培養した。培養は、20時間を目安とし、培養終了時は、島津製作所社製の分光光度計UVmini-1240にて濁度(Optical density、波長 610nm)を測定し、培養液の26倍希釈が、0.1以上となることを確認することにより、十分量の菌体が得られたと判断した。
（菌体画分の分離）
　培養液（20L）を遠心分離機にて菌体画分を分離した。遠心機は、ベックマン・コールターAvanti J-Eを用い、温度15℃、遠心速度6,750G, 時間15分で実施した。ここで得られた培養液（20L）の菌体画分は、乾燥菌体として、20ｇ相当量（10^12 cfu/g）であった。
（粉体前調製液）
　シリカ 3ｇ（EVONIC社製Carplex CS-7）、Skim milk 100ｇ(BD社製)、及びグルタミン酸ナトリウム30ｇ (味の素株式会社製)（乾燥菌体１ｇに対し、シリカ 0.15ｇ、Skim milk 5．0ｇ、及びグルタミン酸ナトリウム1．5ｇに相当）を水に混合した保護剤液1,000mlを調製し、これに菌体画分を添加して粉体前調製液1,200mlを調製して、4℃の冷蔵庫内で20時間静置した。
（粉体化）
　以下の3つの方法で、実施した。
・Spray Dryer（SD）による粉体化：粉体前調製液に1/2量相当のセルロースパウダーを賦形剤として混合し、入口温度84℃、出口温度54℃にてスプレー・ドライヤーにて水分を除去し、粉体を調製した。
・Freeze Dry（FD）による粉体化：常法により、20時間、凍結減圧乾燥機を用いて、粉体前調製液から水分を除去し、粉体を調製した。
・Freeze Grunulation- Freeze Dry（FG）による粉体化：粉体前調製液をスターラーで攪拌しながら液体窒素中へ噴霧し、凍結粒子化し、粉体前調製液の乾物質量の1/2量相当のセルロースパウダーを混合し、凍結減圧乾燥にて粉体化した。
（生菌数評価）
　生菌数の測定は、３つの粉体化方法により得られた粉体サンプル0.01ｇを生理食塩水１mlに懸濁し、順次、生理食塩水で10倍希釈し、希釈液0.1 mlをMRS寒天プレートに塗抹し、37℃で、24時間培養し、生成したコロニー数から、colony formed unit (cfu) /g を測定することにより行った。結果を表２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
試験例４：Lactococcus lactis を含む生菌剤の耐酸性試験
（人工胃液処理）
　0.2% NaClおよび0.2% pepsin（from Porcine stomach Mucosa, 1:5,000, 2,500unit/mg）を含む純水１mlをpH1.5に調整して、耐酸性処理液を調製した。その後、実施例３においてFD法により乾燥して得られた乳酸菌粉体0.02ｇを加えて、37℃で２時間の耐酸性処理を実施した。
　生菌数の測定は、耐酸性処理サンプルを遠心分離後、沈殿画分に生理食塩水１mlを加えて懸濁し、順次、生理食塩水で10倍希釈し、希釈液0.1 mlをMRS寒天プレートに塗抹し、30℃で、24時間培養し、生成したコロニー数から、colony formed unit (cfu) /g を測定することにより行った。
　抗菌活性は、検定菌としてLactobacillus sakei JCM1157を用い、実施例１に記載した抗菌活性を評価する方法により評価した。阻止円の大きさにて、定性的に判断した。結果を表３に示した。
　この結果、保護剤としてシリカ及びグルタミン酸ナトリウムを添加することで、生菌数が高く維持され、また抗菌活性も高く維持されることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
試験例５：保護剤の菌体内への取り込み
　透過型電子顕微鏡（Transmission Electron Microscope, TEM）を用いたEDX解析（Energy dispersive X-ray spectroscopy）によって、実施例３においてFD法により乾燥して得られた菌体内のSi元素を分析した。TEM画像を図２に示した。図２Ａの中央に存在するひょうたん型の黒色の影が菌体そのものを示す。図２Ｂは、ケイ素が菌体内に存在することを示す。白色の複数の点がケイ素元素の存在を示す。なお、色の濃淡は、取り込み量とは関係がない。この結果から、通常は菌体内に存在しないSiが菌体内部に取り込まれていることが確認された。この現象により、実施例３の生菌剤に耐酸性が付与されている可能性が示唆された。
試験例６：サルモネラ感染鶏へのLactococcus lactis を含む生菌剤の給与試験
　表４に示す組成の飼料マトリックス12kgに、実施例３でFD法により乾燥した菌体3.0 x 10^10 cfu (0.63g) と賦形剤Cellulose 5gとを混ぜ合わせた生菌剤5.63ｇを添加することにより、試験飼料を作製した。飼料中の生菌数の最終濃度は3 x 10^6 cfu/g とし、１日齢ブロイラーを感染試験用飼育設備へ導入後(6羽/反復、2反復/試験区)、Salmonella enterica(SE)を２日齢ブロイラーに経口投与し、試験飼料を21日間給与し、トリの増体効果（Body Weight Gain；BWG）及び飼料効率（Feed Conversion Ratio；FCR = Feed/BWG）を評価した。結果は、無添加区を１００として示した。結果を表５に示す。 
　2週齢までは、生菌剤を給与することによるトリの増体効果が観察されたが、それ以降は、効果が観られなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
試験例７：酸性条件下でのLactobacillus plantarumの生育実験（菌株選定）
　Lactobacillus plantarum TUA1478L, TUA1490L, およびTUA2424LをMRS培地にて、37℃で静置培養した。また対照として、特許文献１において生菌剤として利用されているBacillus subtilis C3102株をLB培地にて、ADVANTEC社製Biophoto-recorderTVS062CAを用いて、30℃で、振盪培養（70rpm）した。各菌体は培養終了後、分光光度計にて、波長 610nmにてOptical densityを測定、26倍希釈で0.1以上となることを確認することにより、十分量の菌体が得られたと判断した。その後、遠心分離して得られた菌体画分をpH2に調製した生理食塩水中に懸濁し、0.5時間、1時間、2時間、４時間、３７℃で静置し、耐酸性試験を実施した。その後、遠心分離にて、菌体回収後、上述の培地および培養方法で、ADVANTEC社製Biophoto-recorderTVS062CAを用いて、波長６１０ｎｍにおいて濁度を測定することにより、生育率を評価した。結果は、図３に示した。以上のように、特許文献１において生菌剤として利用されているBacillus subtilis C3102株に比べ、Lactobacillus plantarumの3株は、耐酸性が強く、かつ生育が早いことが確認された。
試験例８：Caco-2細胞を用いたLactobacillus plantarumの膜堅牢化試験
　J.Nutr.(2009) volume 139(5), pp965-974の記載に従って、乳酸菌の培養上清液を膜堅牢化能を評価した。試薬品としてQuercetin、乳酸菌として、Plantaricin Aを産生するLactobacillus plantarum JCM1057、Lactobacillus plantarum TUA1490L, およびTUA2424L を用いた。
　MRS培地にて37℃で20時間、静置培養後、培養液を遠心分離（6,000G x10mi n, 4℃）にて、菌体画分を除去し、上清画分をフィルター濾過（ADVANTEC社DISMIC-25CS、0.20 μLフィルターユニット）して、無菌上清液を取得した。Caco-2 細胞（ヒト消化管上皮細胞（ECACC、Code86010202））を、二層式のTranswell システムに播種し，37℃においてDMEM培地で培養した。培養12日目に、TNF-αを添加し、Tight Junctionのバリア機能を低下させた。培養14日目に、試験物質を添加し、同じ温度において24時間培養後、Millicell ER S-2(Millipore社製)を用いて、経上皮電気抵抗値TER(Ω*cm2)を測定することにより、バリア機能の修復(recovery ratio%)を評価した。結果を図４に示した。
試験例９：Lactobacillus plantarumのバクテリオシン生合成遺伝子の確認（ゲノム解析）
　Lactobacillus plantarum TUA1478L, TUA1490L, TUA2424Lの全ゲノムデータを取得した。
　NCBIに登録されている9株のPlantaricin遺伝子群（アミノ酸配列）をクエリとして、Lactobacillus plantarum TUA1478L, TUA1490L, TUA2424Lのゲノム（塩基配列）に対するtBLASTn検索を実施した。参照したNCBI登録株は、Lactobacillus plantarum V90、YM 4-3、YM 5-2、8P-A3、C11、J51、NC8、PCS20、423である。本検索により、アライメント領域の相同性（% identity）が90%以上、かつ、クエリ配列の全長の中でアライメントが得られた領域長の割合（query coverage）が90%であるレコードを抽出し、各遺伝子について、9株の中でアライメント領域がより長く、相同性も高いレコードの情報を用いて、マニュアル作業でオペロン構造を整理した。その結果を図５に示した。TUA1478L 株にはPlantaricin-JK、Plantaricin-N、Plantaricin-A、およびPlantaricin-EFの生合成遺伝子が、TUA 2424L株にはPlantaricin-EFの生合成遺伝子が、 TUA 1490L株にはPlantaricin-NC8αβ、Plantaricin-A、およびPlantaricin-EFの生合成遺伝子が存在することを確認した。
試験例10：Lactobacillus plantarum のMucin層の接着因子EFTu遺伝子の確認（ゲノム解析）
　Lactobacillus plantarum　3株　TUA1478L, TUA1490L, TUA2424Lの全ゲノムデータを取得した。下記のサイトにてNCBI登録されているWCFS1株を参考にし、これら３株について、Translation elongation factor Tu(EF-Tu)合成遺伝子の全長、相同性を評価した。すなわち、3株のゲノム配列に対して、NCBI参照株の対象遺伝子の塩基配列をクエリとしたBLAST検索を実施し、3株のゲノム配列上で、アライメントが得られた領域（推定遺伝子領域）の塩基配列を抽出した。得られた推定遺伝子の塩基配列について、EMBOSS(Needle)を用いてNCBI参照株の遺伝子配列とのアライメントを作成し、相同性を算出した。その結果、3株には、Mucin層の接着因子であるEF-Tu合成遺伝子が存在し、相同性が99％以上あることを確認した。結果を表６に示した。これらの結果から、上記Lactobacillus plantarum３株は腸管に定着可能であると考えられる。
　NCBI登録参照株 : Lactobacillus plantarum WCFS1
　URL : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000203855.3
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
実施例11：Lactobacillus plantarumを含む生菌剤の調製
（培養）
　Lactobacillus plantarum TUA1478L, TUA1490L, TUA2424Lは、以下のように、BD Difco 社製Lactobacilli MRS Broth培地を用いて、培養し、その後に粉体化した。すなわち、プレシード培養（ファルコンチューブ,50ml）およびシード培養(メジウム瓶, 1L)を経て、メイン培養(発酵槽、20L)を実施した。培養は、温度37℃で静置にて20時間、行った。培養終了時は、島津製作所社製の分光光度計UVmini-1240にて濁度(Optical density、波長 610nm)を測定し、培養液の51倍希釈液が0.18以上となることを確認することにより、十分量の菌体が得られたと判断した。
（菌体画分の分離）
　培養液（20L）を遠心分離機にて菌体画分を分離した。遠心機は、ベックマン・コールターAvanti J-Eを用い、温度15℃、遠心速度6,750G, 時間15分で遠心分離した。得られた培養液（20L）の菌体画分は、乾燥菌体として、20ｇ相当量（10^12 cfu/g）であった。
（粉体前調製液）
　表Ａに示した量の保護剤（単位ｇ）を水に混合した保護剤液1,000mlに、菌体画分（乾燥菌体として、20ｇ相当量）を添加して粉体前調製液1,200mlを調製して、4℃の冷蔵庫内で20時間静置した。なお、各保護剤成分の濃度は、乾燥菌体１ｇに対し、シリカ 0.３５ｇ（EVONIC社製Carplex CS-7）、Skim milk 5.0ｇ(BD社製)、アルギニン塩酸塩１．５g(味の素株式会社製)、グルタミン酸ナトリウム1.5ｇ (味の素株式会社製)およびグルタミン１．０ｇ(味の素株式会社製)に相当する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 （粉体化）
　以下の3つの方法で、実施した。
・Spray Dryer（SD）による粉体化：入り口の温度84℃、出口温度54℃にてスプレー・ドライヤーにて粉体前調製液から水分を除去し、粉体を調製した。
・Freeze Dry（FD）による粉体化：粉体前調製液に保護剤液中固形分の1/2量相当（表Ａ）のセルロースパウダーを賦形剤として混合し、常法により、20時間、凍結減圧乾燥機を用いて、水分を除去し、粉体を調製した。
・Freeze Grunulation- Freeze Dry（FG）による粉体化：粉体前調製液をスターラーで攪拌しながら液体窒素中へ噴霧し、凍結粒子化し、保護剤液の乾物質量の1/2量相当のセルロースパウダー（表Ａ）を混合し、凍結減圧乾燥にて粉体化した。
（生菌数評価）
　生菌数の測定は、３つの粉体化方法により得られた粉体サンプル0.02ｇを生理食塩水１mlに懸濁し、順次、生理食塩水10倍希釈し、希釈液0.1 mlをMRS寒天プレートに塗抹し、37℃で、24時間培養し、生成したコロニー数 から、colony formed unit (cfu) /g を測定することにより行った。結果を表７に示す。なお、表中の「+」は、Skim milkからシリカについては、各成分を含むことを意味し、セルロースについては、各保護剤の残部を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
試験例12：保護剤検討の菌体内への取り込み
　走査透過電子顕微鏡(Scanning Transmission Electron Microscope, STEM)を用いたEDS(Energy Dispersive X-ray Spectrometer)解析にて、実施例１１において得られたLactobacillus plantarum TUA2424L株菌体内の元素を分析した。結果を図6に示す。図６Ａは、菌体の全体像を示す。図６Ａの矢印方向の拡大図が、図６Ｃである。図６Ｃの矢印に沿って左端から右端まで水平方向にＳｉの存否を分析したのが図６Ｂである。４０～４５ポイント付近のピークがＳｉの存在を示す。この結果から、菌体中央部にSiが高濃度で存在する事を確認した。この現象により、実施例１１の生菌剤に耐酸性が付与されている可能性が示唆された。
試験例13：Lactobacillus plantarumの酸耐性遺伝子の確認
　実施例10と同様に、NCBI登録されているWCFS1株を参考にし、これら３株について、耐酸性に関与する遺伝子Glutamate decarboxylase "gadB"およびGlutamine synthetase合成遺伝子の全長、相同性を評価した。TUA1478L, TUA1490Lの２株には、上記の２つの酵素合成遺伝子が存在し、相同性が99％以上であることを確認した。またTUA 2424L株は、Glutamate decarboxylase合成遺伝子が存在し、相同性が99％以上であることを確認した。一方、Glutamine synthetaseについては、TUA 2424L株のゲノムにおいて、コンティグ末端で当該遺伝子の後半約410bpの相同配列が検出された。結果を表８に示す。当該遺伝子の前半約940bpは、本件の全ゲノムシーケンス解析において塩基配列が決定されていない領域（コンティグ間のギャップ領域）に含まれる可能性が示唆され、Glutamine synthetase遺伝子の全長配列を確認することはできなかった。これらの結果から、TUA1478L, TUA1490L、TUA 2424Lの3株は耐酸性機能として遺伝子が付与されていると考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
試験例14：Lactobacillus plantarumを含む生菌剤の耐酸性試験
（人工胃液処理）
　Merck Millipore社製の純水製造装置を用いて製造した純水に、0.2% NaClおよび0.2% pepsin（from Porcine stomach Mucosa, 1:5,000, 2,500unit/mg）を加え、pH1.5に調整し、人口胃液とした。
　実施例１１と同様にして、Lactobacillus plantarum を培養し、菌体画分を分離し、下記表Ｂ（単位ｇ）に記載の量の保護剤を水に混合した保護剤液１０００ｍＬに、前記菌体画分を添加して、Lactobacillus plantarum の粉体前調製液１２００ｍＬを調製し、その粉体前調製液をＦＤ法で粉体化することにより、Lactobacillus plantarum の生菌剤を調製した。なお、各保護剤成分の濃度は、乾燥菌体１ｇに対し、シリカ 0.３５ｇ（EVONIC社製Carplex CS-7）、Skim milk 5.0ｇ(BD社製)、アルギニン塩酸塩１．５g(味の素株式会社製)、グルタミン酸ナトリウム1.5ｇ (味の素株式会社製)およびグルタミン１．０ｇ(味の素株式社製)に相当する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　このようにして調製した生菌剤を、前記人口胃液に投入し、37℃で２～４時間の酵素処理を行い、生菌数を測定した。結果を表９に示す。表中の「+」は、各成分を含むことを意味する。なお、「２～４時間」は、生菌剤が鶏の胃に到達してから腸を通過するまでの時間を想定している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
参考例15：コーティングしたArabic Gum(Coated-AG)の調製
　被覆型飼料用添加剤の調製コア材として、Arabic Gum（和光純薬社製）を使用し、被覆剤として、菜種硬化油（融点67℃）を使用した。粉末ないし顆粒状にしたコアに、融点より高い温度に加熱することにより液状とした被覆剤の所定量を噴霧することにより、被覆型飼料用添加剤を得た。本コーティングでは、コア７５質量部に対して菜種硬化油２５質量部を被覆した。 
参考例16：Coated-AGの腸溶性試験 
（人工胃液処理）
　Merck Millipore社製の純水製造装置を用いて製造した純水に、0.2% NaClおよび0.2% pepsin（from Porcine stomach Mucosa ,1:5,000, 2,500unit/mg）を加え、pH2に調整後、参考例１５で調製した被覆型飼料用添加剤（コアはArabic Gum）を投入し、37℃で２時間酵素処理を行った。なお、「２時間」は、飼料が鶏の胃に到達してから通過するまでの時間を想定している。 
（人工腸液処理）
　人工胃液処理後、0.2% trypsin（from Porcine Pancreas, 1:5,000, 4,500unit/mg）を加え、pH6に調整後、37℃で２時間酵素処理を行った。なお、「２時間」は、飼料が鶏の腸に到達してから通過するまでの時間を想定している。両処理工程のサンプルは、上清画分を抽出し、ゲルろ過クロマトグラフィー（Shodex社製カラムOHpak SB-803HQ）を用いて、示差屈折率検出器（島津製作所製 RID-20A）にて測定し、溶出率を算出した。また、両処理におけるpH調整剤として塩酸及び水酸化ナトリウムを使用した。結果を図7に示す。この結果から、Arabic Gumを菜種硬化油層でコーティングすることにより、トリの腸管での徐放性を満足することが分かった。
試験例17：サルモネラ感染鶏へのLactobacillus plantarumを含む生菌剤の給与試験
　実施例11でＦＧ法により粉体化して調製した生菌剤を、表４に示す組成の飼料マトリックス中に、生菌剤濃度が1.0 x 10^6 cfu/gとなるように添加することにより、試験飼料を作製した。１日齢ブロイラーを感染試験用飼育設備へ導入後(6羽/反復、2反復/試験区)、Salmonella enterica(SE)を２日齢ブロイラーに経口投与し、試験飼料を21日間給与し、トリの増体効果及び飼料効率を評価した。生菌剤を単独で使用した場合の効果は弱いが、Coated-AGとの併用で増体効果が増強された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
参考例18：サルモネラ感染鶏へのCoated-NisinAおよびCoatedプルランの供与試験
（Coated-NisinAおよびCoatedプルランの調製）
　コアとしてNisinA（Sigma-Aldrich社製の試薬（Nisin含量2.5質量%, balance sodium chloride and denatured milk solids)を使用し、被覆剤として、菜種硬化油（融点67℃）及び天然樹脂Shellacを使用した。粉末ないし顆粒状にしたコアに、融点より高い温度に加熱することにより液状とした被覆剤の所定量を噴霧することにより、被覆型飼料用添加剤を得た。コーティングは、コア７７質量部に対して、第一層（内側層）としてShellacを５質量部、第２層(外側層)として菜種硬化油を１７質量部噴霧することにより行った。同様に、コアとしてプルラン(Carbosynth Limited社製)を用いて、参考例15と同様に被覆型飼料用添加剤を得た。各々得られたサンプルを参考例16と同様に、腸溶性試験を実施した。Arabic Gumと同様、本法でコーティングすることにより、トリの腸管での徐放性を満足することが分かった。
（トリにおけるサルモネラ感染試験）
　Coated-NisinAを単独、またはCoated-プルランと組合せ、飼料マトリックス中に、各コア剤の添加量が１０ｐｐｍとなるように添加した飼料を作製した。0日齢ブロイラーを感染試験用飼育設備へ導入後(2反復/試験区、6羽/反復)、Salmonella enterica（SE）を10^7個/羽、ゾンデで２日齢ブロイラーのそ嚢（そのう）内へ投与し、試験飼料を21日間給与し、増体効果及び飼料効率を評価した。表11に結果を示した。その結果、Coated-ナイシン区およびCoated-ナイシン＋Coated-プルラン区ともに、増体効果（BWG）および飼料効率（FCR）改善効果を示した。実施例１７の結果と対比すると、ProbioticsもしくはProbiotics酸性物質であるNisinの単独よりも多糖であるArabic Gum もしくはPullulanとの併用の方が増体効果があることが示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
参考例１９（冷蔵保存工程）
　Lactobacillus plantarum TUA2424L菌体を、MRS培地を用いて、37℃で培養した。培養後、遠心分離機SS-1500X（佐久間製作所）を用いて、遠心分離（6000rpm, 10min）を行い、上清画分を除去し、菌体画分を得た。乾燥菌体量が10ｇ/L となるように、MSG3%を溶解した生理食塩水に分散後に放置した。温度（10、20、30℃）、グルコース（Glc、0.6%）添加の有無の各条件における経過時間ごとのグルタミン酸（Glu）取り込み量を表１２に示した。
　Glu取り込み量は、下記の要領で経過時間ごとの上清中のグルタミン酸濃度を測定したのちに、下式にしたがって算出した。すなわち、遠心分離機SS-1500X（佐久間製作所）にて遠心分離（6000rpm, 10min）を行って得た上清画分を純水にて50倍希釈して、王子計測機器（株）社製のオフラインバイオセンサーBF-7Dを用いて測定し、希釈倍率から上清画分中のグルタミン酸濃度を算出して、経過時間ごとのグルタミン酸濃度とした。

　　　　Glu取り込み量（菌体当たり、%, g/g）= A/B ×　100

A＝Glu濃度 g/L（０時間）-Glu濃度 g/L（各経過時間）
B＝菌体量 10 g/L

　表１２より低温保存時のグルタミン酸取込量が多く、またグルコースを含んで代謝の活発な培養液のグルタミン酸取込量が多いことが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014

Claims (24)

  1. 　ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、ラクトバチルス（Lactbacillus）属に属する微生物、又はこれらの混合微生物を含む生菌剤であって、前記微生物が、少なくともシリカ及びグルタミン酸ナトリウムを含む保護剤で処理されてなる前記生菌剤。
  2. 　微生物が、ラクトコッカス ラクチス（Lactococcus lactis）である請求項１記載の生菌剤。
  3. 　微生物が、Nisinを産生する微生物である請求項２記載の生菌剤。
  4. 　微生物が、ラクトバチルス属（Lactbacillus）に属する微生物である請求項１記載の生菌剤。 
  5. 　微生物が、バクテリオシンを産生する微生物である請求項４記載の生菌剤。
  6. 　微生物が、腸管上皮膜の堅牢性を強化する物質を産生する微生物である請求項４又は５記載の生菌剤。 
  7. 　腸管上皮膜の堅牢性を強化する物質が、バクテリオシン又はフェロモンである請求項６記載の生菌剤
  8. 　腸管上皮膜の堅牢性を強化する物質が、プランタリシン(Plantaricin)である請求項６記載の生菌剤。
  9. 　微生物が、腸管定着因子を生合成する遺伝子を有する請求項４記載の生菌剤。  
  10. 　腸管定着因子が、レクチン、リポテイコ酸、又はEFTuである請求項９記載の生菌剤。
  11. 　微生物が、ラクトバチルス プランタム（Lactbacillus plantarum）である請求項４～１０のいずれか１項記載の生菌剤。
  12. 　前記微生物が、ラクトコッカス・ラクチス　ＦＥＲＭ　ＢＰ－８５５２、ラクトバチルス・プランタラム　ＴＵＡ１４７８Ｌ、ラクトバチルス・プランタラム　ＴＵＡ１４９０Ｌ、及びラクトバチルス・プランタラム　ＴＵＡ２４２４Ｌからなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１記載の生菌剤。
  13. 　保護剤が、さらに、グルタミンを含む、請求項１～１２のいずれか１項記載の生菌剤。
  14. 　保護剤が、さらに、アルギニン塩酸塩を含む、請求項１～１３のいずれか１項記載の生菌剤。
  15. 　保護剤が、さらに、セルロースを含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の生菌剤。
  16. 　保護剤が、シリカ、スキムミルク、グルタミン酸ナトリウム、及びグルタミンを含む、請求項１～１２のいずれか１項記載の生菌剤。
  17. 　保護剤が、スキムミルク１００質量部に対し、シリカを１～１０質量部、グルタミン酸ナトリウムを１０～５０質量部、及びグルタミンを１０～５０質量部を含む、請求項１６に記載の生菌剤。
  18. 　保護剤が、シリカ、スキムミルク、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン及びアルギニン塩酸塩を含む、請求項１～１２のいずれか１項記載の生菌剤。
  19. 　保護剤が、スキムミルク１００質量部に対し、シリカを１～１０質量部、グルタミン酸ナトリウムを１０～５０質量部、グルタミンを１０～５０質量部、及びアルギニン塩酸塩を１０～５０質量部を含む、請求項１８に記載の生菌剤。
  20. 　請求項１～１９のいずれか１項記載の生菌剤を含む、サプリメント。
  21. 　請求項１～１９のいずれか１項記載の生菌剤を含む、飼料。
  22. 　（ａ）ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、ラクトバチルス・（Lactbacillus）属に属する微生物、又はこれらの混合微生物を培養し、
    　（ｂ）培養終了後、得られた培養物に、少なくともシリカ及びグルタミン酸ナトリウムを含む保護剤を添加して混合し、
    　（ｃ）得られた混合物を放置して保護剤を菌体内に取り込ませることにより生菌剤を得る、
    生菌剤の製造方法。
  23. 　工程（ｃ）の後、噴霧乾燥、凍結乾燥、又は撹拌凍結乾燥により乾燥する工程（ｄ）をさらに含む、請求項２２記載の製造方法。
  24. 　請求項１～１９のいずれか１項記載の生菌剤を家畜に投与することを含む、家畜の増体効果および飼料効率を増大する方法。
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