CN116963607A - 乳酸菌抑制产甲烷菌生长或减少甲烷排放的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种乳酸细菌菌株用于抑制反刍动物的前胃中产甲烷细菌和/或古细菌的生长、降低瘤胃微生物产生甲烷的能力、降低瘤胃甲烷产生和/或用于改善反刍动物的饲料效率、产乳量和/或体重或身体组成的用途。还提供了反刍动物饲料组合物。

Description

乳酸菌抑制产甲烷菌生长或减少甲烷排放的用途
技术领域
本发明涉及一种乳酸细菌菌株用于抑制反刍动物的前胃中产甲烷细菌和/或古细菌的生长、降低瘤胃微生物体产生甲烷的能力、减少甲烷产生和/或用于改善反刍动物的饲料效率、产乳量和/或体重或身体组成的用途。还提供了反刍动物饲料组合物。
背景技术
甲烷是有效的温室气体，比CO2更有效地吸收红外辐射，并且在20年的时间尺度上具有比其CO2的质量当量大～86倍的升温潜力(IPCC，2014)。虽然甲烷是人为温室气体排放的相对低的比例，但它仍然是气候变化的重要贡献者。
甲烷排放的主要来源是产甲烷细菌和古细菌对有机物的发酵。人为甲烷排放的一个普遍来源是在农业中，其中甲烷是通过反刍动物消化道中的肠发酵和从粪肥中产生的。这些来源占2017(Jackson等人，2020)中总的全球人为甲烷排放的约30％。此外，反刍动物的产甲烷不仅导致温室气体排放，而且对动物也是能量浪费的。长期以来已经认识到反刍动物中的甲烷产生显著影响这些动物将饲料转化为代谢能的效率。由于甲烷代表反刍动物的热量损失为其总热量摄入的约5-10％，因此导致效率降低。
因此，仍然需要可用于抑制反刍动物的前胃中产甲烷细菌和/或古细菌的生长、降低瘤胃微生物体产生甲烷的能力和/或减少反刍动物的甲烷排放的方法和组合物。还需要用于增加反刍动物的饲料效率、增加乳或肉产量和/或增加体重或改善身体组成的方法和组合物。
本发明的目的是以某种方式实现一个或多个这些期望，或至少向公众提供有用的选择。
发明内容
在第一方面，本发明提供了用于抑制反刍动物的前胃中产甲烷细菌和/或古细菌的生长，或用于降低瘤胃微生物体产生甲烷的能力的方法，其中所述方法包括向反刍动物施用有效量的鼠李糖乳杆菌菌株HN001或其衍生物，所述菌株的AGAL保藏号为NM97/09514，日期为1997年8月18日。
在第二方面，本发明提供了一种用于减少反刍动物的瘤胃甲烷产生的方法，其中所述方法包括向所述动物施用有效量的鼠李糖乳杆菌菌株HN001或其衍生物，所述菌株的AGAL保藏号为NM97/09514，日期为1997年8月18日。
在第三方面，本发明提供了一种用于增加反刍动物的饲料效率的方法，其中所述方法包括向所述动物施用有效量的鼠李糖乳杆菌菌株HN001或其衍生物，所述菌株的AGAL保藏号为NM97/09514，日期为1997年8月18日。
在第四方面，本发明提供了用于改善前胃的吸收能力，例如增加挥发性脂肪酸(VFA)的吸收能力的方法，其中所述方法包括向动物施用有效量的鼠李糖乳杆菌菌株HN001或其衍生物，所述菌株的AGAL保藏号为NM97/09514，日期为1997年8月18日。
在第五方面，本发明提供了用于增强反刍动物(例如幼小反刍动物，例如断奶前的幼小反刍动物)的瘤胃或前胃的其它腔室的物理和/或功能发育的方法，其中所述方法包括向动物施用有效量的鼠李糖乳杆菌菌株HN001或其衍生物，所述菌株的AGAL保藏号为NM97/09514，日期为1997年8月18日。
在一个实施方案中，所述方法增强瘤胃的解剖学发育。例如，该方法增强瘤胃上皮的发育和/或肌肉化，例如增加瘤胃块的生长、瘤胃***的生长、***密度(例如背***密度)的增加，和/或动物瘤胃壁的总表面积。
在一个实施方案中，例如与未处理的动物相比，所述方法增加瘤胃重量、瘤胃壁厚度或每cm2瘤胃壁的瘤胃***密度。
在一个实施方案中，所述方法增加瘤胃***长度、宽度和/或表面积。例如，在一些实施方案中，所述方法将瘤胃***长度、宽度和/或表面积增加至未处理动物的至少1.01、1.02、1.03、1.04、1.05、1.06、1.07、1.08、1.09、1.10、1.11、1.12、1.13、1.14、1.15、1.16、1.17、1.18、1.19、1.20、1.22、1.24、1.26、1.28、1.30、1.32、1.34、1.36、1.38或1.40倍。
在一个实施方案中，该方法增强瘤胃的功能实现，或促进前胃的成熟。例如，该方法刺激反刍，增强干物质摄入(DMI)、增强吸收能力和/或促进向成熟生理方向成熟。
在一些实施方案中，所述方法抑制氢养型产甲烷菌在动物的前胃中的生长。在一个实施方案中，所述方法抑制动物前胃中来自甲烷杆菌属的产甲烷菌的生长。
在一些实施方案中，所述鼠李糖乳杆菌HN001或其衍生物以组合物的形式施用，所述组合物为食品、饮料、食品添加剂、饮料添加剂、动物饲料、动物饲料添加剂、动物饲料补充物、膳食补充物、载体、维生素或矿物质预混物、营养产品、肠内喂养产品、可溶物、浆液、补充物、药物、舔块、灌肠剂、片剂、胶囊、小丸或瘤胃内产品，例如大丸剂。
在一些实施方案中，鼠李糖乳杆菌HN001或其衍生物以饮用水、乳、乳粉、乳替代品、乳强化剂、乳清、乳清粉、部分或全混合日粮(TMR)、玉米、大豆、草料、谷物、酒糟、发芽谷物、豆科植物、维生素、氨基酸、矿物质、纤维、饲料、草、干草、稻草、青贮饲料、果仁、叶子、粗粉、可溶物、浆液、补充剂、粉状饲料、粗粉、果浆、蔬菜浆、水果或蔬菜渣、柑橘粗粉、小麦矮秆、玉米芯粗粉、糖蜜、蔗糖、麦芽糖糊精、稻壳、蛭石、沸石或粉碎的石灰石施用。
在一些实施方案中，所述方法包括向所述动物施用鼠李糖乳杆菌HN001，其量为104至1013菌落形成单位/千克干重载体饲料。在一个实施方案中，所述方法包括向动物施用鼠李糖乳杆菌HN001，其量为108至1012菌落形成单位/千克干重载体饲料。
在一些实施方案中，鼠李糖乳杆菌菌株HN001的衍生物是该菌株的细胞裂解物、该菌株的细胞悬浮液、该菌株的代谢物、该菌株的培养上清液或灭活的鼠李糖乳杆菌HN001。
在一些实施方案中，所述方法还包括施用至少一种不同物种或菌株的微生物、抑制产甲烷菌或产甲烷作用的疫苗，和/或产甲烷作用的天然或化学合成的抑制剂和/或产甲烷菌抑制剂。有用的产甲烷抑制剂的示例是溴仿，其通过与产甲烷倒数第二步所需的还原的维生素B12辅因子反应而抑制甲基转移酶的效率来起作用。
在一个实施方案中，所述方法还包括施用至少一种不同物种或菌株的微生物、抑制产甲烷菌或产甲烷作用的疫苗，和/或产甲烷作用的天然或化学合成的抑制剂，和/或靶向非甲烷杆菌属的产甲烷菌的产甲烷菌抑制剂，例如甲基营养型产甲烷菌，如来自甲烷球菌属(Methanosphaera)或马赛甲烷球菌目(Methanomassiliicoccale)的产甲烷菌。
在一些实施方案中，鼠李糖乳杆菌HN001或其衍生物与选自以下的一种或多种试剂分开、同时或顺序施用：一种或多种益生元、一种或多种益生菌、一种或多种后生物、一种或多种膳食纤维来源、一种或多种低聚半乳糖、一种或多种短链低聚半乳糖、一种或多种长链低聚半乳糖、一种或多种低聚果糖、菊粉、一种或多种半乳聚糖、一种或多种果聚糖、乳果糖或其任何两种或更多种的任何混合物。
在一些实施方案中，所述方法另外增强动物的生长或生产力，例如所述方法增加由反刍动物产生的乳和/或乳组分的产量。
在一些实施方案中，所述方法另外增加反刍动物的体重和/或改善身体组成，例如改变肌肉与脂肪的比。
在一些实施方案中，反刍动物是牛、山羊、绵羊、野牛、牦牛、水牛、鹿、骆驼、羊驼、美洲驼、角马、羚羊或野牛。在一个实施方案中，反刍动物是家牛或绵羊。在一个实施方案中，所述反刍动物是家牛。在一个实施方案中，反刍动物是泌乳动物。在另一个实施方案中，反刍动物是断奶前动物，如小牛或羔羊。
在第六方面，本发明提供了一种反刍动物饲料组合物，其用于抑制反刍动物的前胃中产甲烷细菌和/或古细菌的生长、降低瘤胃微生物产生甲烷的能力、降低反刍动物的瘤胃甲烷产生，或提高反刍动物的饲料效率，所述饲料组合物包含鼠李糖乳杆菌菌株HN001或其衍生物，所述菌株的AGAL保藏号为NM97/09514，日期为1997年8月18日。
在一些实施方案中，反刍动物饲料组合物是或包含部分或全部混合日粮(TMR)、玉米、大豆、草料、谷物、酒糟、发芽谷物、豆类、纤维、饲料、草、干草、稻草、青贮饲料、果仁、叶子、粗粉、粉状饲料、舔块或糖蜜。
在一些实施方案中，反刍动物饲料组合物还包含至少一种不同物种或菌株的微生物、抑制产甲烷菌或产甲烷作用的疫苗，和/或产甲烷作用的天然或化学合成的抑制剂和/或产甲烷菌抑制剂，例如溴仿。
在一个实施方案中，所述至少一种不同物种或菌株的微生物、抑制产甲烷菌或产甲烷作用的疫苗，和/或产甲烷作用的天然或化学合成的抑制剂，和/或靶向非甲烷杆菌属的产甲烷菌的产甲烷菌抑制剂，例如甲基营养型产甲烷菌，如来自甲烷球菌属(Methanosphaera)或马赛甲烷球菌目(Methanomassiliicoccale)的产甲烷菌。
在一些实施方案中，反刍动物饲料组合物还包含一种或多种选自以下的试剂：一种或多种益生元、一种或多种益生菌、一种或多种后生物、一种或多种膳食纤维来源、一种或多种低聚半乳糖、一种或多种短链低聚半乳糖、一种或多种长链低聚半乳糖、一种或多种低聚果糖、菊粉、一种或多种半乳聚糖、一种或多种果聚糖、乳果糖或其任何两种或更多种的任何混合物。
在另一方面，本发明提供了抑制反刍动物的前胃中产甲烷细菌和/或古细菌生长和/或降低瘤胃微生物体产生甲烷的能力的方法，所述方法包括向所述动物施用根据第六方面的反刍动物饲料组合物的步骤。
在另一方面，本发明提供了用于减少反刍动物的瘤胃甲烷产生的方法，所述方法包括向所述动物施用根据第六方面的反刍动物饲料组合物的步骤。
在另一方面，本发明提供了增加反刍动物的饲料效率的方法，所述方法包括向所述动物施用根据第六方面的反刍动物饲料组合物的步骤。
在另一方面，本发明提供了用于增强反刍动物的生长和/或生产力的方法，所述方法包括向所述动物施用根据第六方面的反刍动物饲料组合物的步骤。
在另一方面，本发明提供了用于增加由反刍动物生产的乳和/或乳组分的产量的方法，所述方法包括向所述动物施用根据第六方面的反刍动物饲料组合物的步骤。
在另一方面，本发明提供了用于改善反刍动物的体重或身体组成的方法，所述方法包括向所述动物施用根据第六方面的反刍动物饲料组合物的步骤。
在另一方面，本发明提供了鼠李糖乳杆菌菌株HN001或其衍生物用于制备组合物的用途，所述菌株的AGAL保藏号为NM97/09514，日期为1997年8月18日，所述组合物用于抑制反刍动物的前胃中产甲烷细菌和/或古细菌的生长、降低所述瘤胃微生物体产生甲烷的能力、降低反刍动物的瘤胃甲烷产生、增加反刍动物的饲料效率、增强反刍动物的生长和/或生产力、增加由反刍动物产生的乳和/或乳组分的产量，或改善反刍动物的体重和/或身体组成。
在一些实施方案中，所述组合物是或包含根据第六方面的反刍动物饲料组合物。
在另一方面，本发明提供鼠李糖乳杆菌菌株HN001或其衍生物，所述菌株的AGAL保藏号为NM97/09514，日期为1997年8月18日，其用于抑制反刍动物的前胃中产甲烷细菌和/或古细菌的生长、降低所述瘤胃微生物体产生甲烷的能力、降低反刍动物的瘤胃甲烷产生、增加反刍动物的饲料效率、增强反刍动物的生长和/或生产力、增加由反刍动物产生的乳和/或乳组分的产量，或改善反刍动物的体重和/或身体组成。
在另一方面，本发明提供了用于减少反刍动物的甲烷排放的方法，其中所述方法包括向所述动物施用有效量的鼠李糖乳杆菌菌株HN001或其衍生物，所述菌株的AGAL保藏号为NM97/09514，日期为1997年8月18日。
在另一方面，本发明提供了反刍动物饲料组合物，其用于抑制反刍动物的前胃中产甲烷细菌和/或古细菌的生长、降低瘤胃微生物体产生甲烷的能力、降低反刍动物的甲烷排放、增加反刍动物的饲料效率、增强反刍动物的生长和/或生产力、增加由反刍动物产生的乳和/或乳组分的产量，或改善反刍动物的体重和/或身体组成，饲料组合物包含鼠李糖乳杆菌菌株HN001或其衍生物。
在另一方面，本发明提供了用于减少反刍动物的甲烷排放的方法，所述方法包括向所述动物施用根据上述方面的反刍动物饲料组合物的步骤。
在另一方面，本发明提供鼠李糖乳杆菌菌株HN001或其衍生物用于制备组合物的用途，所述菌株的AGAL保藏号为NM97/09514，日期为1997年8月18日，所述组合物用于抑制反刍动物的前胃中产甲烷细菌和/或古细菌的生长、降低瘤胃微生物体产生甲烷的能力、降低反刍动物的甲烷排放、增加反刍动物的饲料效率、增加由反刍动物产生的乳和/或乳组分的产量，或改善反刍动物的体重和/或身体组成。
在另一方面，本发明提供了鼠李糖乳杆菌菌株HN001或其衍生物，所述菌株的AGAL保藏号为NM97/09514，日期为1997年8月18日，其用于抑制反刍动物的前胃中产甲烷细菌和/或古细菌的生长、降低瘤胃微生物体产生甲烷的能力、降低反刍动物的甲烷排放、增加反刍动物的饲料效率、增加由反刍动物产生的乳和/或乳组分的产量，或改善反刍动物的体重和/或身体组成。
在另一方面，本发明提供鼠李糖乳杆菌菌株HN001或其衍生物的用途，所述菌株的AGAL保藏号为NM97/09514，日期为1997年8月18日，其用于抑制反刍动物的前胃中产甲烷细菌和/或古细菌的生长、降低瘤胃微生物体产生甲烷的能力、降低反刍动物的瘤胃甲烷产生、增加反刍动物的饲料效率、增加由反刍动物产生的乳和/或乳组分的产量，或改善反刍动物的体重和/或身体组成。
本发明还可以被广泛地描述为包括在本申请的说明书中单独地或共同地提及或指示的零件、元件和特征，以及所述零件、元件或特征中的任何两个或更多个的任何或所有组合，并且其中在此提及了具体的整数，这些具体的整数在本发明所涉及的领域中具有已知的等效物，这些已知的等同物被认为并入本文，就像单独阐述一样。
本文公开的数字范围(例如，1至10)也包括提及该范围内的所有有理数(例如，1、1.1、2、3、3.9、4、5、6、6.5、7、8、9和10)以及该范围内的有理数任何范围(例如，2到8、1.5到5.5和3.1到4.7)，因此，本文明确公开的所有范围的所有子范围特此明确公开。这些仅仅是具体意图的示例，并且在列举的最低值和最高值之间的数值的所有可能的组合被认为以类似的方式在本申请中明确地陈述。
本说明书中使用的术语“包括”意指“至少部分由…组成”。当解释本说明书中包含术语“包括”的每个表述时，还可以存在不同于该术语或由该术语开头的那些特征。相关术语例如“包括(comprise)”和“包括(comprises)”将以相同的方式解释。
在已经参考专利说明书、其他外部文献或其他信息源的本说明书中，这通常是为了提供用于讨论本发明的特征的上下文。除非另外明确说明，否则对此类外部文献的引用不应被解释为承认此类文献或此类信息源在任何权利范围内是现有技术或形成本领域公知常识的一部分。
附图说明
图1.与对照溶液(缓冲液)相比，鼠李糖乳杆菌HN001培养物或上清液(SN)对瘤胃体外实验中pH的影响。
图2.用HN001TM、SN或缓冲液接种的瘤胃体外发酵中测量的主要VFA的比例。
图3.接种HN001TM、SN或缓冲液的瘤胃体外样品中的少量VFA。
图4.接种HN001TM、SN或缓冲液的瘤胃发酵过程中产生的主要VFA的比例(A：乙酸，B：丁酸，C：丙酸)。T测试HN001TM与缓冲液**p＜0.01；***p<0.001；SN与缓冲液p＜0.05，
图5.用HN001TM、SN或缓冲液处理的瘤胃体外发酵物中的乳酸浓度。T测试HN001TM与缓冲液**p＜0.01；***p＜0.001；SN与缓冲液；HN001TM与SN###p＜0.001。
图6.用HN001TM、SN或缓冲液处理的瘤胃体外发酵物中细菌门的相对丰度。T测试与缓冲液*p＜0.05；**p＜0.01。从底部到顶部的堆叠条对应于图例中从左到右的门，即底部条是厚壁菌门，上面的条是拟杆菌门等。
图7.用HN001TM、SN或缓冲液处理的瘤胃体外测定中鉴定的乳杆菌菌株的相对丰度。从底部到顶部的堆叠条对应于图例中从左到右的菌株。
图8.用HN001TM、SN或缓冲液处理的瘤胃体外发酵物中古细菌的多样性和相对丰度。从底部到顶部的堆叠条对应于图例中从左到右的物种。
图9.用HN001TM、SN或缓冲液处理的瘤胃体外测定中0、6和48小时的原生动物物种的多样性和相对丰度。从底部到顶部的堆叠条对应于图例中从左到右的物种。
具体实施方式
本发明基于以下发现：乳酸菌菌株鼠李糖乳杆菌菌株HN001(以前分类为鼠李糖乳杆菌HN001)及其衍生物抑制或压制反刍动物的前胃中产甲烷细菌和/或古细菌的生长和/或降低瘤胃微生物群产甲烷的能力。抑制产甲烷细菌和/或古细菌的生长可减少瘤胃甲烷产生并增加瘤胃和前胃中的挥发性脂肪酸(VFA)，其可充当驱动增加的生长或增加的生产率(如乳或肉产量)的增加的能源，并且可刺激瘤胃发育(如瘤胃***发育)。
因此，在第一方面，本发明提供了用于抑制反刍动物的前胃中产甲烷细菌和/或古细菌的生长，或用于降低瘤胃微生物体产生甲烷的能力的方法，其中所述方法包括向反刍动物施用有效量的鼠李糖乳杆菌菌株HN001或其衍生物，所述菌株的AGAL保藏号为NM97/09514，日期为1997年8月18日。
在第二方面，本发明提供了一种用于减少反刍动物的瘤胃甲烷产生的方法，其中所述方法包括向所述动物施用有效量的鼠李糖乳杆菌菌株HN001或其衍生物，所述菌株的AGAL保藏号为NM97/09514，日期为1997年8月18日。
在第三方面，本发明提供了一种用于增加反刍动物的饲料效率的方法，其中所述方法包括向所述动物施用有效量的鼠李糖乳杆菌菌株HN001或其衍生物，所述菌株的AGAL保藏号为NM97/09514，日期为1997年8月18日。
在第四方面，本发明提供了用于改善前胃的吸收能力，例如增加挥发性脂肪酸(VFA)的吸收能力的方法，其中所述方法包括向动物施用有效量的鼠李糖乳杆菌菌株HN001或其衍生物，所述菌株的AGAL保藏号为NM97/09514，日期为1997年8月18日。
在第五方面，本发明提供了用于增强幼小反刍动物(例如断奶前的幼小反刍动物)的瘤胃的物理和/或功能发育的方法，其中所述方法包括向动物施用有效量的鼠李糖乳杆菌菌株HN001或其衍生物，所述菌株的AGAL保藏号为NM97/09514，日期为1997年8月18日。
在一个实施方案中，本文公开的方法和组合物增强瘤胃的解剖学发育。例如，所述方法和组合物增强瘤胃上皮的发育和/或肌肉化，例如增加瘤胃块的生长、瘤胃***的生长、***密度(例如背***密度)的增加，和/或动物瘤胃壁的总表面积。
在一个实施方案中，本文公开的方法和组合物提高瘤胃重量、瘤胃壁厚或每cm2瘤胃壁的瘤胃***密度。
在一个实施方案中，本文公开的方法和组合物增强瘤胃的功能实现。例如，该方法刺激反刍和/或增强干物质摄入(DMI)。在一个实施方案中，本文公开的方法和组合物增加瘤胃周转率和/或增加瘤胃后消化。不希望受理论束缚，已经假设对于能够在可溶性糖上快速异型发酵生长，产生较少氢(其导致较少的甲烷形成)的微生物选择较高的瘤胃周转率。
术语“施用”是指将有效量的鼠李糖乳杆菌菌株HN001引入反刍动物的前胃中的作用。更具体地，该施用是通过口服途径施用。该施用可特别地通过向动物的饲料或饮料补充该菌株来进行；然后动物摄取补充的饲料或饮料。
术语“有效量”是指与参照相比，足以实现所需效果的鼠李糖乳杆菌菌株HN001的量，所述效果即抑制动物的前胃中产甲烷细菌和/或古细菌的生长、减少动物的甲烷产生或排放，或增加动物的饲料效率。可以在体外或体内测量期望的效果(例如抑制产甲烷细菌和/或古细菌的生长和/或减少甲烷产生或排放)。例如，可以使用本文所述的方法，例如在下面的实施例中，在人造瘤胃***中，例如在T.Hano(1993)J.Gen.Appl.Microbiol.，39，3545中所述的瘤胃***中体外测量所需的效果，或通过体内口服施用给反刍动物。
该有效量可以以一个或多个剂量施用给反刍动物。
术语“减少甲烷产生”，例如“减少动物的甲烷产生”是指通过任何机制和从任何反刍动物相关来源减少甲烷产生。例如，该术语可以指在反刍动物的前胃中产生的甲烷的减少，或者它可以指由反刍动物的粪便产生或排放的甲烷的减少。
预期甲烷产生的减少可能是由于多种机理。这些可包括例如杀死产甲烷菌(即杀菌/杀古细菌效应)、抑制产甲烷菌的生长(即抑菌/抑制古细菌效应)和/或抑制前胃或瘤胃微生物群产生甲烷的能力。抑制前胃或瘤胃微生物群产生甲烷的能力可以通过多种机制，包括例如前胃或瘤胃环境的物理和/或化学变化、微生物群的变化、一种或多种产甲烷途径的抑制，和/或微生物群成员之间的中间物的交叉喂养(或破坏交叉喂养)。
术语“饲料效率”是指动物将饲料营养物转化成乳或乳组分、蛋白质(如肌肉)和/或脂肪的能力。前胃或瘤胃中的微生物发酵产生挥发性脂肪酸(VFA)如乙酸、丙酸和丁酸。这些脂肪酸直接从瘤胃壁吸收并用作奶组分和其它最终消化产物的原料，身体组织消耗的大部分能量用于生产乳或乳组分或肌肉。因此，当提高能量利用时，可以提高乳产量，例如乳产量，和/或乳脂、乳蛋白，和/或乳固体。还可以实现肌肉的增加和/或身体组成的改善，例如改变动物的肌肉/脂肪比。
饲料效率可以通过将动物产乳的重量除以该动物消耗的干物质的重量来计算。因此，当施用相同的营养物输入时，与具有较低饲料效率的动物相比，具有较高饲料效率的动物将产生更多的乳，或具有较高含量的乳组分(例如但不限于脂肪和蛋白质)的乳。饲料效率可以通过以下参数中的任一个通过动物生长的差异来测量：平均每日增重、总增重、饲料转化率，其包括两种饲料：增益和增益：饲料、饲料效率、死亡率和饲料摄入。通过使用能量校正的奶(ECM)产量代替奶的重量，可以将饲料效率标准化以考虑蛋白质和脂肪含量的差异。这可以使用以下公式(Tyrrell和Reid，1965)：ECM＝(12.82×磅脂肪)+(7.13×磅蛋白质)+(0.323×磅奶)计算。
在一个实施方案中，一个反刍动物中的饲料效率增加到一个未处理的动物的饲料效率的至少约1.01×，例如至少约1.02×、1.03×、1.04×、1.05×、1.06×、1.07×、1.08×、1.09×、1.10×、1.12×、1.14×、1.16×、1.18×，例如至少约1.20×。
在一些实施方案中，鼠李糖乳杆菌HN001或其衍生物促进丙酸的产生。与其它挥发性脂肪酸相比，丙酸具有更高的ATP生产效率，因此，由于促进丙酸生产而提高了进料效率。丙酸也是产生葡萄糖的，因此可以促进乳腺中的乳糖合成。
在一些实施方案中，鼠李糖乳杆菌HN001或其衍生物将氢代谢从甲烷形成转移到短链/挥发性脂肪酸(VFA)产生，例如转移到丙酸产生。丙酸盐主要用作反刍动物中的葡萄糖前体，并且更多的丙酸盐形成将可能导致饲料能量的更有效利用。使前胃或瘤胃中的代谢氢远离甲烷并朝向VFA(主要是丙酸盐)的流动最大化将增加反刍动物生产的效率并降低其环境影响，并且将增强瘤胃发育和/或瘤胃***发育。
乙酸盐是乳腺脂质合成的主要底物，以及丁酸盐吸收过程中产生的β-羟基丁酸盐。因此，高乙酸盐发酵模式将提供维持或增加乳脂的底物。
因此，在一些实施方案中，鼠李糖乳杆菌HN001或其衍生物导致乳脂、乳蛋白、总乳体积和/或乳固体的增加，这是由于前胃或瘤胃中VFA增加的结果，其可作为增加的能源驱动增加的产量。
在一些实施方案中，从动物生产的乳和/或乳组分的产量优选增加1.5％或更多，更优选增加3.0％或更多，增加4.5％或更多，或增加6.0％或更多。
预期本发明还可用于延长泌乳反刍动物(例如奶牛)的泌乳周期。奶牛在泌乳期间将其大部分能量引向产乳。长期哺乳后，其身体状况会更差。因此，通常缩短或缩减哺乳期以防止身体状况过度恶化。预期本文公开的方法和反刍动物饲料组合物将增加反刍动物的饲料效率，并因此减少乳产量对身体状况的影响。结果，可以使奶牛持续更长的时间。
还预期本发明还可用于减少或改善由于泌乳引起的身体状况恶化。预期本文公开的方法和反刍动物饲料组合物将增加反刍动物的饲料效率，并因此导致反刍动物在泌乳结束时具有改善的身体状况。例如，当动物进入干燥期时，动物具有较高的身体状况评分(BCS)。结果，反刍动物在反季节期间需要较少的干物质摄入以获得身体状况。或者或另外，本文公开的方法和反刍动物饲料组合物可用于改善泌乳前动物的身体状况。例如，本文公开的方法和组合物可以改善母亲和/或胎儿或新生儿的身体组成。例如，本文公开的方法和组合物可改善出生时新生儿的身体组成和/或体重。
还预期本发明可类似地用于减少或改善其他应激时间的身体状况恶化，例如产犊、干旱或饲料摄入不足。
如上所述，本文公开的方法和组合物增强瘤胃的物理和/或功能发育，特别是在年幼或断奶前反刍动物的早期生活中。瘤胃的发育涉及三个不同的过程：(i)解剖学发育(例如瘤胃块的生长和瘤胃***的生长)，(ii)功能实现(例如发酵能力和酶活性)，和(iii)微生物定殖(细菌、真菌、产甲烷菌和原生动物)。
瘤胃的解剖学发育是发生在以下三个阶段的过程：非反刍(0-3周)、过渡期(3-8周)和反刍(从8周开始)。在过渡阶段，瘤胃吸收表面积(***)的生长和发育对于能够吸收和利用消化终产物，特别是瘤胃挥发性脂肪酸是必需的。挥发性脂肪酸的存在和吸收刺激瘤胃上皮代谢，并且可能是启动瘤胃上皮发育的关键。连续暴露于挥发性脂肪酸保持瘤胃***生长、大小和功能。不同的挥发性脂肪酸不同地刺激这种发育，其中丁酸盐是最具刺激性的，其次是丙酸盐。因此，预期将氢代谢从甲烷形成转移到短链/挥发性脂肪酸(VFA)产生，例如转移到丙酸产生，因此将增强瘤胃上皮生长和发育。
反刍动物
反刍动物是一组具有包括多个隔室的胃的食草动物，其通过在瘤胃中的第一微生物发酵消化它们的食物以形成反刍的食物、反胃和咀嚼反刍的食物，然后吞咽咀嚼的反刍的食物用于进一步消化。该组包括但不限于反刍动物和乳足纲亚目，并且包括几种驯养的家畜。在一个实施方案中，反刍动物是牛、山羊、绵羊、野牛、牦牛、水牛、鹿、骆驼、羊驼、美洲驼、角马、羚羊或野牛。在优选的实施方案中，反刍动物是牛或绵羊。
在一个实施方案中，反刍动物是泌乳动物。在另一个实施方案中，反刍动物是断奶前动物，如小牛或羔羊。
反刍动物胃分为非腺体前胃(瘤胃、网状胃、瓣胃)和末端腺体胃、皱胃。
在一些实施方案中，反刍动物是初生的、新生的或年轻的。例如，在一些实施方案中，反刍动物的年龄为1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月或2个月。
在一些实施方案中，所述鼠李糖乳杆菌HN001或其衍生物在断奶前施用于反刍动物。在一些实施方案中，在断奶后向反刍动物施用鼠李糖乳杆菌HN001或其衍生物。在一些实施方案中，在断奶前和断奶后向反刍动物施用鼠李糖乳杆菌HN001或其衍生物。
例如，鼠李糖乳杆菌HN001或其衍生物在出生的第0天或约第0天，例如出生的第0天、第1天或第2天施用给反刍动物。然后施用可以每天至少一次，例如每天多次，足以获得持久的效果。例如，施用可以从出生起持续2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月、6周、2个月、10周或3个月。
鼠李糖乳杆菌HN001
如本申请人的PCT国际申请PCT/NZ98/00122(作为WO 99/10476公开并以其全文并入本文)中所述，鼠李糖乳杆菌HN001(以前分类为鼠李糖乳杆菌HN001)的冻干培养物1997年8月18日保藏在澳大利亚the Australian Government Analytical Laboratories(AGAL)，The New South Wales Regional Laboratory，1 Suakin Street，Pymble，NSW2073，并被授予保藏号NM97/09514。本布达佩斯条约认可的保藏处现在不再被称为AGAL，而是被称为澳大利亚国家测量研究所(National Measurement Institute of Australia)(NMIA)。鼠李糖乳杆菌HN001的基因组序列可在Genbank以入藏号NZ_ABWJ00000000获得。术语鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)HN001，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrbamnosus)HN001，鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)HN001和HN001TM在本文中可互换使用。HN001TM是Fonterra TM有限公司的商标。
形态特性
鼠李糖乳杆菌HN001的形态学特性描述如下。
当在MRS肉汤中生长时，链中具有正方形末端的短至中等棒，通常为0.7×1.1×2.0-4.0μm。
革兰氏阳性、非活动、非孢子形成、过氧化氢酶阴性兼性厌氧棒，最适生长温度37±1℃，最适pH6.0-6.5。这些是兼性异型发酵细菌，没有气体从葡萄糖产生。
发酵特性
用API 50 CH糖发酵试剂盒测定鼠李糖乳杆菌HN001的碳水化合物发酵模式，产生5757177的分数(基于22种主要糖的分数-参见PCT/NZ98/00122)。
其他表征
鼠李糖乳杆菌HN001的特征还可在于PCT/NZ98/00122中公开的功能属性，包括其粘附于人肠上皮细胞的能力，以及吞噬细胞功能、抗体应答、天然杀伤细胞活性和饮食摄入或体外模型***引起的淋巴细胞增殖的改善。应当理解，本领域技术人员已知和可获得的多种方法可用于确认鼠李糖乳杆菌HN001的身份，其中示例性的方法包括DNA指纹分析、基因组分析、测序和相关的基因组和蛋白质组技术。
鼠李糖乳杆菌HN001及其衍生物
如本文所述，本发明的某些实施方案利用活鼠李糖乳杆菌HN001。在其它实施方案中，使用鼠李糖乳杆菌HN001衍生物。
如本文所用，术语“衍生物”和其语法上的等同物，当关于细菌使用时(包括关于细菌的特定菌株如鼠李糖乳杆菌HN001)涵盖细菌的突变体和同源物或衍生自细菌的突变体和同源物、杀死的或减毒的细菌(例如但不限于热杀死的、裂解的、分级分离的、压力杀死的、辐射的和UV处理的或光处理的细菌)，以及衍生自细菌的材料，包括但不限于细菌细胞壁组合物、细菌细胞裂解物、冻干的细菌、来自细菌的抗产甲烷菌因子、细菌代谢物、细菌细胞悬浮液、细菌培养上清液等，其中衍生物保留抗产甲烷菌活性。还考虑了经工程化以表达一种或多种抗产甲烷因子的转基因微生物。产生此类衍生物的方法，例如但不限于鼠李糖乳杆菌HN001的一种或多种突变体或一种或多种抗产甲烷因子，特别是适于施用给反刍动物的衍生物(例如，在组合物中)是本领域熟知的。
应当理解，方法适用于鉴定鼠李糖乳杆菌HN001，例如上述那些，类似地适用于鉴定鼠李糖乳杆菌HN001的衍生物，包括例如鼠李糖乳杆菌HN001的突变体或同源物，或例如来自鼠李糖乳杆菌HN001的细菌代谢物。
术语“抗产甲烷菌因子”是指负责介导抗产甲烷菌活性的细菌分子，包括但不限于细菌DNA基序、蛋白质、细菌素、细菌素样分子、抗微生物肽、抗生素、抗微生物剂、小分子、多糖或细胞壁组分如脂磷壁酸和肽聚糖，或其任何两种或更多种的混合物。虽然，如上所述，这些分子没有被清楚地鉴定，并且不希望被任何理论所束缚，但是它们的存在可以通过抗产甲烷菌活性的存在来推断。
术语“抗产甲烷菌活性”是指某些微生物抑制产甲烷细菌和/或古细菌生长和/或减少产甲烷细菌和/或古细菌产生甲烷的能力。该能力可限于抑制产甲烷细菌和/或古细菌的某些组的生长和/或产生甲烷的能力，例如抑制氢养型产甲烷菌的生长、抑制氢养型产甲烷菌产生甲烷的能力、抑制甲基营养型产甲烷菌的生长、抑制甲基营养型产甲烷菌产生甲烷的能力、抑制产甲烷菌的某些物种的生长，或抑制产甲烷菌的某些物种产生甲烷的能力。
关于保留抗产甲烷菌活性，是指微生物的衍生物，例如微生物的突变体或同源物或减毒的或杀死的微生物，或细胞培养上清液，仍具有有用的抗产甲烷菌活性，或包含微生物或其衍生物的组合物仍具有有用的抗产甲烷菌活性。虽然还没有清楚地鉴定出负责介导抗产甲烷菌活性的细菌分子，但是已经提出作为可能的候选物的分子包括细菌DNA基序、蛋白质、细菌素、抗生素、表面蛋白质、小有机酸、多糖和细胞壁组分如脂磷壁酸和肽聚糖。已经假定这些与产甲烷菌和/或古细菌的组分相互作用以产生生长抑制作用。优选地，保留的活性是未处理(即，活的或非减毒的)对照的活性的至少约35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99或100％，并且有用的范围可以在这些值中的任一个之间选择(例如，从约35至约100％、从约50至约100％、从约60至约100％、从约70至约100％、从约80至约100％，以及从约90至约100％)。
使用本领域熟知的常规固体底物和液体发酵技术，鼠李糖乳杆菌HN001可以足够量生长以允许如本文所预期的使用。例如，可以使用营养膜或深层培养生长技术，例如在WO99/10476中描述的条件下，大批生产鼠李糖乳杆菌HN001用于配制。简言之，在需氧条件下，在任何对生物体生长满意的温度下进行生长。例如，对于鼠李糖乳杆菌HN001的温度范围优选为30-40℃，优选37℃。生长培养基的pH是微酸性的，优选约6.0-6.5。孵育时间足以使分离株达到稳定生长期。
鼠李糖乳杆菌HN001细胞可通过本领域熟知的方法收获，例如通过常规过滤或沉淀方法(例如离心)或使用旋风分离***干燥收获。鼠李糖乳杆菌HN001细胞可以立即使用或储存，优选冷冻干燥或在-20℃至6℃，优选-4℃冷冻，只要使用标准技术需要。
上清液
本发明的其它实施方案利用来自包含鼠李糖乳杆菌HN001或其衍生物的细胞培养物的上清液。这些实施方案包括制备鼠李糖乳杆菌HN001上清液的方法，所述方法包括培养鼠李糖乳杆菌HN001的细胞，从培养的细胞中分离上清液，从而获得上清液。该方法还能够进一步分离可从上清液中获得的负责介导抗产甲烷菌活性的细菌分子。
本领域技术人员可以理解，可用于本发明的上清液包括来自这种培养物的上清液，和/或这种上清液的浓缩物和/或这种上清液的部分。
本文中的术语“上清液”是指来自细菌培养物的培养基，随后例如通过离心或过滤从该培养基中除去细菌。
用于本发明的上清液可以通过制备鼠李糖乳杆菌HN001上清液的简单方法容易地获得，所述方法包括
a)培养鼠李糖乳杆菌HN001的细胞，和
b)任选地通过各种细胞处理释放活性化合物和/或细胞的细胞外组分，所述细胞处理例如但不限于酸性或碱性修饰、超声处理、去污剂(例如十二烷基硫酸钠(SDS)和/或Triton X)、壁水解酶(例如变溶菌素和/或溶菌酶)、盐和/或醇；
c)从培养的细胞中分离上清液，
从而获得所述上清液。
在该方法的优选实施方案中，将上清液组合物进一步进行干燥步骤以获得干燥的培养产物。
干燥步骤可以方便地为冷冻干燥或喷雾干燥，但可考虑任何适于干燥抗产甲烷因子如细菌素的干燥方法，也包括真空干燥和空气干燥。
尽管还没有详细地表征鼠李糖乳杆菌HN001产生的上清液的含量，但已知某些乳杆菌可产生作为小的热稳定蛋白的细菌素，因此，不希望受理论束缚，预期甚至导致培养物洗脱产物适度加热的干燥方法(包括喷雾干燥)将产生活性组合物，如本文所述的实施方案中所证明。
裂解物
含有裂解细胞内容物的流体称为裂解物。裂解物含有细菌细胞的活性组分，并且可以是粗的，因此含有所有细胞组分，或者部分和/或完全分离成分离的部分，例如细胞外组分、细胞内组分、蛋白质等。
生产细菌细胞裂解物的方法是本领域熟知的。此类方法可包括但不限于机械裂解(诸如机械剪切、研磨、碾磨或超声处理)、酶裂解(诸如通过降解细菌细胞壁的酶)、化学裂解(诸如使用去污剂、变性剂、压力改变和/或渗透压休克)以及上述方法的组合。
因此，本发明的其它实施方案利用鼠李糖乳杆菌HN001或其衍生物的裂解物。
细胞悬浮液
在一些实施方案中，本发明还可以利用包含鼠李糖乳杆菌HN001或其衍生物的细胞悬浮液。
在本文中，术语“细胞悬浮液”涉及在液体(例如液体营养培养基、培养基或盐水溶液)中分散或悬浮的许多鼠李糖乳杆菌HN001或其衍生物。
细胞可以以在适于分散的溶液中的细胞悬浮液的形式存在。细胞悬浮液可以例如通过喷雾、浸渍或任何其它施用方法分散。
细胞可以是有活力的，但悬浮液也可以包含灭活或杀死的细胞或其裂解物。在一个实施方案中，本发明的悬浮液包含活细胞。在另一个实施方案中，本发明的悬浮液包含灭活、杀死或裂解的细胞。
细菌素
细菌素是由细菌产生以抑制其它细菌菌株和物种的抗微生物化合物。
已知乳酸菌(LAB)产生细菌素，并且这些化合物对食品工业具有全球性兴趣，因为它们抑制许多腐败和致病细菌的生长，从而延长食品的保质期和安全性。细菌素通常被认为是窄谱抗生素。此外，尤其是LAB的细菌素显示出极低的人毒性，并且已经在发酵食品中消费用于千年。
如本文公开的实施例中所说明的，已经发现鼠李糖乳杆菌菌株HN001或包含鼠李糖乳杆菌HN001的组合物，并且鼠李糖乳杆菌HN001的培养上清液可用作抗微生物化合物，特别是用于抑制产甲烷细菌的生长和/或抑制产甲烷菌产生甲烷的能力。
在本文中，术语抗微生物化合物利用杀死微生物、损害其存活或抑制其生长的化合物。
抗微生物化合物可以根据它们主要作用的微生物分组。例如，抗菌剂用于对抗细菌，抗真菌剂用于对抗真菌。它们也可以根据它们的功能进行分类。杀死微生物的化合物称为杀微生物的，而仅仅抑制其生长的化合物称为抑制微生物的。
在一个实施方案中，本发明涉及抗微生物化合物，其是杀微生物的。在另一个实施方案中，本发明涉及抗微生物化合物，其是微生物抑制性的。在另一个实施方案中，本发明涉及抗微生物化合物，其为抗菌剂。
反刍动物饲料或载体组合物
可用于本发明的反刍动物饲料组合物可以配制成食品、饮料、食品添加剂、饮料添加剂、动物饲料、动物饲料添加剂、动物饲料补充物、膳食补充物、载体、维生素或矿物质预混物、营养产品、肠内喂养产品、可溶物、浆液、补充物、药物、舔块、灌肠剂、片剂、胶囊、小丸或瘤胃内产品，例如大丸剂。本领域技术人员可以根据该技术和本说明书的教导制备合适的制剂。
组合物可以作为在标准饲料材料如日粮上的顶部敷料施用，或混合到标准饲料材料如日粮中。此外，该菌株可以部分或全部混合日粮(TMR)、颗粒饲料、与液体饲料或饮料混合、与蛋白质预混物混合，或通过维生素和矿物质预混物递送。
在一个实施方案中，可用于本文的组合物包括能够携带细菌或细菌衍生物的任何可食用饲料产品。如在本申请中所使用的，术语“饲料”或“动物饲料”是指被动物消耗并且为动物的饮食贡献能量和/或营养物的材料。动物饲料通常包括许多不同的组分，其可以以例如浓缩物、预混物、联产品或颗粒的形式存在。饲料和饲料组分的示例包括部分或完全混合日粮(TMR)、玉米、大豆、草料、谷物、酒糟、发芽谷物、豆科植物、维生素、氨基酸、矿物质、纤维、饲料、草、干草、稻草、青贮饲料、果仁、叶子、粗粉、可溶物、浆液、补充剂、粉状饲料、粗粉、果浆、蔬菜浆、水果或蔬菜渣、柑橘粗粉、小麦矮秆、玉米芯粗粉和糖蜜。可用作载体的其它组合物包括乳、乳粉、乳替代品、乳强化剂、乳清、乳清粉、蔗糖、麦芽糖糊精、稻壳。
在某些实施方案中，通过使用乳基载体例如热化乳或非乳基载体生长鼠李糖乳杆菌HN001以产生发酵的酸奶型组合物的方法形成进料组合物。产生这种发酵型酸奶型组合物的方法是本领域熟知的，并且可以包括例如使用温水浴或其他加热手段在合适的温度下孵育奶直到达到足够的细胞密度，如超过12小时。在一个实施方案中，温度为25-30℃。任选地，乳可包含促进细菌生长的其它添加剂，例如酵母提取物。在某些实施方案中，该方法在现场进行，例如在要进行益生菌饲料补充的农场进行。发酵型酸奶型组合物可通过口服施用，如通过湿透来施用。在一些实施方案中，发酵型酸奶型组合物以每天1-100ml，诸如每天2-50、5-30或10-20ml的剂量施用。
用于反刍动物的其它合适的饲料制剂描述于E.W.Crampton等人，Applied AnimalNutrition，W.H.Freeman and Company，San Francisco，CA.，1969以及D.C.Church，Livestock Feeds and Feeding，O&B Books，Corvallis，Oreg.，1977，这两篇文献在此引入作为参考。
在一个实施方案中，可用于本发明的组合物包括加入细菌或细菌衍生物的动物食用的任何非饲料载体，如蛭石、沸石或粉碎的石灰石等。
在某些实施方案中，本发明的组合物包含活鼠李糖乳杆菌HN001。制备这种组合物的方法是本领域熟知的。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含一个或多个鼠李糖乳杆菌HN001衍生物。此外，制备这种组合物的方法是本领域公知的，并且可以利用标准的微生物学和药学实践。在一些实施方案中，组合物包含干燥的培养产物，如本文所述的上清液或细胞裂解物。
应当理解，在这样的组合物中可以包括宽范围的添加剂或载体，例如以改善或保持细菌生存力或增加鼠李糖乳杆菌HN001或一种或多种鼠李糖乳杆菌HN001衍生物的抗产甲烷菌活性。例如，可以包括添加剂如表面活性剂、润湿剂、湿润剂、粘着剂、分散剂、稳定剂、渗透剂，和所谓的提高细菌细胞活力、生长、复制和存活能力的应激添加剂(如氯化钾、甘油、氯化钠和葡萄糖)，以及冷冻保护剂如麦芽糖糊精。添加剂还可以包括有助于在长期储存中维持微生物活力的组合物，例如未精炼的玉米油，或在外部含有油和蜡的混合物并且在内部含有水、海藻酸钠和细菌的“转化”乳液。
在一些实施方案中，包封鼠李糖乳杆菌HN001或其衍生物。产生这种包封细菌的方法是本领域熟知的。在一些实施方案中，鼠李糖乳杆菌HN001或其衍生物被包封在脂质体、微泡、微粒或微胶囊等中。此类包封剂可包括天然、半合成或合成聚合物、蜡、脂质、脂肪、脂肪醇、脂肪酸和/或增塑剂，例如藻酸盐、树胶、κ-角叉菜胶、壳聚糖、淀粉、糖、明胶等。
在某些实施方案中，鼠李糖乳杆菌HN001是繁殖上有活力的形式和量。
组合物可包含碳水化合物源，例如二糖，包括例如蔗糖、果糖、葡萄糖或右旋糖。优选地，碳水化合物源是能够被鼠李糖乳杆菌HN001有氧或无氧利用的碳水化合物源。
在这样的实施方案中，所述组合物优选能够支持鼠李糖乳杆菌HN001的生殖活力持续大于约两周，优选大于约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月，更优选大于约6个月，最优选至少约2年至约3年或更长的时间。
在某些实施方案中，配制口服组合物以允许施用有效量的鼠李糖乳杆菌HN001，在摄取时在动物的胃肠道中建立群体。所建立的群体可以是瞬时或永久群体。
虽然考虑了各种施用途径和方法，目前优选口服施用鼠李糖乳杆菌HN001，例如以适于口服施用的组合物的形式。当然可以理解，在某些情况下可以使用或优选其它施用途径和方法。
术语“口服施用”包括口服、含服、肠内、瘤胃内和胃内施用。
理论上，一个菌落形成单位(cfu)应该足以在动物中建立鼠李糖乳杆菌HN001群体，但在实际情况下，需要最少数量的单元来这样做。因此，对于依赖于活的活益生菌群体的治疗机制，施用受试者的单位数将影响功效。
在一个实施方案中，配制用于施用的组合物将足以提供每天至少约6×109cfu鼠李糖乳杆菌HN001，例如每天至少约6×1011鼠李糖乳杆菌HN001。在另一个实施方案中，配制用于施用的组合物将足以提供每天至少约1012鼠李糖乳杆菌HN001。
测定受试者胃肠道中胃肠和/或瘤胃菌群如鼠李糖乳杆菌HN001的存在的方法是本领域公知的，并且本文提供了此类方法的示例。在某些实施方案中，鼠李糖乳杆菌HN001群体的存在可直接确定，例如通过分析获自动物的一种或多种样品并确定所述样品中鼠李糖乳杆菌HN001的存在或量。在其它实施方案中，鼠李糖乳杆菌HN001群体的存在可间接确定，例如通过观察从动物获得的样品中甲烷排放或甲烷产生的减少、氢产生的减少或其它肠和/或瘤胃菌群数量的减少。还设想了这些方法的组合。
可在体外和体内评价根据本发明有用的组合物的功效。参见例如以下示例。简言之，可以测试组合物抑制产甲烷菌和/或古细菌生长的能力，或降低产甲烷菌和/或古细菌产生甲烷的能力。对于体内研究，可以将组合物饲喂给反刍动物或注射到反刍动物中，然后评估其对瘤胃产甲烷细菌和/或古细菌的对甲烷产生的影响。根据结果，可以确定合适的剂量范围和施用途径。
计算适当剂量的方法可取决于组合物中活性剂的性质。例如，当组合物包含活鼠李糖乳杆菌HN001时，剂量可以参考存在的活细菌的数目来计算。例如，如本文实施例所述，剂量可参照每天施用的菌落形成单位(cfu)数或参照每千克干饲料重量的cfu数来确定。
作为一般示例，考虑每天每kg干饲料重量施用约1×106cfu至约1×1012cfu的鼠李糖乳杆菌HN001，优选约1×106cfu至约1×1011cfu/kg/天，约1×106cfu至约1×1010cfu/kg/天，约1×106cfu至约1×109cfu/kg/天，约1×106cfu至约1×108cfu/kg/天，约1×106cfu至约5×107cfu/kg/天，或约1×106cfu至约1×107cfu/kg/天。优选地，考虑每天每kg干饲料重量施用约5×106cfu至约5×108cfu的鼠李糖乳杆菌HN001，优选约5×106cfu至约4×108cfu/kg/天，约5×106cfu至约3×108cfu/kg/天，约5×106cfu至约2×108cfu/kg/天，约5×106cfu至约1×108cfu/kg/天，约5×106cfu至约9×107cfu/kg/天，约5×106cfu至约8×107cfu/kg/天，约5×106cfu至约7×107cfu/kg/天，约5×106cfu至约6×107cfu/kg/天，约5×106cfu至约5×107cfu/kg/天，约5×106cfu至约4×107cfu/kg/天，约5×106cfu至约3×107cfu/kg/天，约5×106cfu至约2×107cfu/kg/天，或约5×106cfu至约1×107cfu/kg/天。
在某些实施方案中，周期性剂量不需要随受试者的体重、干饲料重量或其它特征而变化。在这样的示例中，考虑每天施用约1×106cfu至约1×1013cfu的鼠李糖乳杆菌HN001，优选约1×106cfu至约1×1012cfu/天，约1×106cfu至约1×1011cfu/天，约1×106cfu至约1×1010cfu/天，约1×106cfu至约1×109cfu/天，约1×106cfu至约1×108cfu/天，约1×106cfu至约5×107cfu/天，或约1×106cfu至约1×107cfu/天。
在某些实施方案中，考虑每天每千克体重施用约5×107cfu至约5×1010cfu鼠李糖乳杆菌HN001，优选约5×107cfu至约4×1010cfu/天，约5×107cfu至约3×1010cfu/天，约5×107cfu至约2×1010cfu/天，约5×107cfu至约1×1010cfu/天，约5×107cfu至约9×109cfu/天，约5×107cfu至约8×109cfu/天，约5×107cfu至约7×109cfu/天，约5×107cfu至约6×109cfu/天，约5×107cfu至约5×109cfu/天，约5×107cfu至约4×109cfu/天，约5×107cfu至约3×109cfu/天，约5×107cfu至约2×109cfu/天，或约5×107cfu至约1×109cfu/天。优选地，每天施用1×108×109cfu/kg体重的剂量。
应当理解，在某些实施方案中，所述剂量不需要每天施用。例如，组合物可以配制成每两天、每周两次、每周一次、每两周一次或每月一次施用。或者，在某些实施方案中，组合物可以配制成每天、每次进食或每口施用2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24次。
应当理解，组合物优选配制成允许施用有效剂量的鼠李糖乳杆菌HN001或其一种或多种衍生物。施用的组合物的剂量、施用的时间和一般施用方案在动物之间可以不同，这取决于诸如所选择的施用模式和动物的年龄、性别、体重和物种的变量。此外，如上所述，合适的剂量可取决于组合物中活性剂的性质和配制方式。
此外，组合物的剂量可以随时间变化。例如，在一些实施方案中，初始给药方案之后可以是维持给药方案。应当理解，可能需要更高的剂量以在动物中建立鼠李糖乳杆菌HN001群体，较低剂量可能足以维持所述群体。因此，在一些实施方案中，初始给药方案包括施用比维持给药方案更高的剂量和/或更频繁的剂量。优选地，初始给药方案有效在动物中建立鼠李糖乳杆菌HN001群体，并且优选地维持给药方案有效在动物中维持鼠李糖乳杆菌HN001群体。在一些实施方案中，维持给药方案包括每天、每两天、每周两次、每周、每两周或每月施用一次剂量。
在一些实施方案中，本文所述方法的效果在施用鼠李糖乳杆菌HN001之后持续。不希望受理论束缚，预期如本文所述施用鼠李糖乳杆菌HN001可导致反刍动物的前胃或瘤胃中的长期或甚至永久性改变。在一些实施方案中，所述效果在最后一次施用鼠李糖乳杆菌HN001后持续2天，例如在最后一次施用鼠李糖乳杆菌HN001后3天、5天、1周、2周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年或7年。在优选的实施方案中，所述效果在动物的生命中持续。
在组合物包含一种或多种鼠李糖乳杆菌HN001衍生物的示例中，剂量可通过参考每天施用的鼠李糖乳杆菌HN001衍生物的量或浓度来计算例如，当细菌失活时，在失活之前计算上述量。对于包含鼠李糖乳杆菌HN001培养上清液的组合物，剂量可参考组合物中存在的鼠李糖乳杆菌HN001培养上清液的浓度来计算。组合物中存在的鼠李糖乳杆菌HN001培养上清液的浓度可以例如基于培养物的cfu计算。例如，相当于1×109cfu/天的培养上清液的剂量可由培养物的总产率和培养上清液的总体积计算。
应当理解，优选的组合物被配制成以方便的形式和量提供有效的剂量。在某些实施方案中，例如但不限于其中周期性剂量不需要随动物的体重或其它特征而变化的那些实施方案，可以将组合物配制成单位剂量。应当理解的是，施用可以包括单一日剂量或适当的多个离散分剂量的施用。例如，可将有效剂量的鼠李糖乳杆菌HN001配制到用于口服施用的饲料中。
然而，作为一般示例，本发明人预期每天施用约1mg至约1000mg的本文有用的组合物，优选约50至约500mg/天，或者约150至约410mg/天或约110至约310mg/天。在一个实施方案中，本发明人预期施用约0.05mg至约250mg/kg体重的本文有用的组合物。
在一个实施方案中，可用于本文的组合物包含至少约0.1、0.2、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99、99.5、99.8或99.9重量％的鼠李糖乳杆菌HN001或其衍生物，基本上由其组成，或由其组成，并且可用的范围可选自任何这些前述值(例如，约0.1至约50％、约0.2至约50％、约0.5至约50％、约1至约50％、约5至约50％、约10至约50％、约15至约50％、约20至约50％、约25至约50％、约30至约50％、约35至约50％、约40至约50％、约45至约50％、约0.1至约60％、约0.2至约60％、约0.5至约60％、约1至约60％、约5至约60％、约10至约60％、约15至约60％、约20至约60％、约25至约60％、约30至约60％、约35至约60％、约40至约60％、约45至约60％、约0.1至约70％、约0.2至约70％、约0.5至约70％、约1至约70％、约5至约70％、约10至约70％、约15至约70％、约20至约70％、约25至约70％、约30至约70％、约35至约70％、约40至约70％、约45至约70％、约0.1至约80％、约0.2至约80％、约0.5至约80％、约1至约80％、约5至约80％、约10至约80％、约15至约80％、约20至约80％、约25至约80％、约30至约80％、约35至约80％、约40至约80％、约45至约80％、约0.1至约90％、约0.2至约90％、约0.5至约90％、约1至约90％、约5至约90％、约10至约90％、约15至约90％、约20至约90％、约25至约90％、约30至约90％、约35至约90％、约40至约90％、约45至约90％、约0.1至约99％、约0.2至约99％、约0.5至约99％、约1至约99％、约5至约99％、约10至约99％、约15至约99％、约20至约99％、约25至约99％、约30至约99％、约35至约99％、约40至约99％和约45至约99％)。
在一个实施方案中，本文可用的组合物包含至少约0.001、0.01、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19克鼠李糖乳杆菌HN001或其衍生物，基本上由其组成，或由其组成，并且可用的范围可选自任何这些前述值(例如，约0.01至约1克、约0.01至约10克、约0.01至约19克、约0.1至约1克、约0.1至约10克、约0.1至约19克、约1至约5克、约1至约10克、约1至约19克、约5至约10克和约5至约19克)。
在某些实施方案中，本文可用的组合物包含至少约104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012或1013鼠李糖乳杆菌HN001菌落形成单位(cfu)/kg组合物干重，或基本上由其组成，或由其组成，并且可用的范围可选自任何这些前述值(例如，约105至约1013cfu、约106至约1012cfu、约107至约1012cfu、约108至约1011cfu、约108至约1010cfu和约108至约109cfu)。
显然，鼠李糖乳杆菌HN001或其一种或多种衍生物在配制用于施用的组合物中的浓度可以小于在配制用于例如分配或储存的组合物中的浓度，并且配制用于储存和随后配制成适于施用的组合物的浓度必须足以使所述用于施用的组合物也充分浓缩，以便能够以有效剂量施用。
可用于本文的组合物可单独使用或与一种或多种其它治疗剂组合使用。治疗剂可以是食品、饮料、食品添加剂、饮料添加剂、食品组分、饮料组分、膳食补充剂、维生素或矿物质预混物、油、油掺合物、富含油的饲料补充剂、营养产品、医疗食品、营养品、药剂或药物。治疗剂可以是益生菌剂或益生菌因子，并且优选有效抑制产甲烷菌和/或古细菌的生长，或减少产甲烷菌和/或古细菌的甲烷产生。在一些实施方案中，所述油、油共混物或富含油的饲料补充剂是棕榈油渣(PKE)和/或PROLIQ。
当与另一种治疗剂组合使用时，可用于本文的组合物和另一种治疗剂的施用可以是同时的或顺序的。同时施用包括施用包含所有组分的单一剂型或基本上同时施用分开的剂型。顺序施用包括根据不同的时间表施用，优选使得在提供可用于本发明的组合物和其它治疗剂的期间存在重叠。其它治疗剂的示例包括至少一种不同物种或菌株的微生物、抑制产甲烷菌或产甲烷作用的疫苗，和/或产甲烷作用的天然或化学合成的抑制剂和/或产甲烷菌抑制剂，例如溴仿。
用于本文的组合物可以分别、同时或依次施用的合适的试剂包括一种或多种益生元试剂，一种或多种益生菌试剂、一种或多种后生物试剂、一种或多种磷脂、一种或多种神经节苷脂、本领域已知的其它合适的试剂及其组合。
通常，术语益生元是指刺激具有生物活性的动物消化***中细菌的生长和/或活性的物质。益生元可以是选择性发酵的成分，其允许胃肠微生物群落的组成和/或活性的特定变化，这赋予宿主健康益处。益生菌通常是指有助于肠道微生物平衡的微生物，而肠道微生物平衡又在维持健康或提供其它生物学活性中起作用。许多种类的乳酸菌(LAB)如乳杆菌和双歧杆菌通常被认为是益生菌，但一些种类的芽孢杆菌和一些酵母也被发现是合适的候选物。后生物是指来自微生物如益生菌的在宿主中具有生物活性的无活力的细菌产物或代谢副产物。
有用的益生元包括低聚半乳糖(GOS)、短链GOS、长链GOS、低聚果糖(FOS)、短链FOS、长链FOS、菊粉、半乳聚糖、果聚糖、乳果糖及其任何两种或更多种的任何混合物。一些益生元由Boehm G和Moro G(Structural and Functional Aspects of Prebiotics Usedin Infant Nutrition，J.Nutr.(2008)138(9)：1818S-1828S)综述，其通过引用并入本文。其它有用的试剂可包括膳食纤维，如完全或部分不溶或不可消化的膳食纤维。
因此，在一个实施方案中，鼠李糖乳杆菌HN001或其衍生物可以与一种或多种选自以下的试剂分开、同时或顺序施用：一种或多种益生菌、一种或多种益生元、一种或多种膳食纤维来源、一种或多种低聚半乳糖、一种或多种短链低聚半乳糖、一种或多种长链低聚半乳糖、一种或多种低聚果糖、一种或多种短链低聚半乳糖、一种或多种长链低聚半乳糖、菊粉、一种或多种半乳聚糖、一种或多种果聚糖、乳果糖，或其任何两种或更多种的任何混合物。
在某些实施方案中，所述组合物包含鼠李糖乳杆菌HN001和一种或多种益生元、一种或多种益生菌，一种或多种后生物、一种或多种膳食纤维来源。在某些实施方案中，益生元包含一种或多种低聚果糖、一种或多种低聚半乳糖、菊粉、一种或多种半乳聚糖、一种或多种果聚糖、乳果糖，或其任何两种或更多种的任何混合物。
不希望受理论束缚，据信共培养和/或共施用两种或更多种乳酸菌菌株，如三种乳酸菌菌株，可降低由于噬菌体感染引起的培养失败的发生率。因此，在某些实施方案中，组合物包含鼠李糖乳杆菌HN001和一种或多种其它乳酸菌菌株，优选两种或多种其它乳酸菌菌株。在其他实施方案中，包含鼠李糖乳杆菌HN001的组合物与包含一种或多种其它乳酸菌菌株，优选两种或多种其它乳酸菌菌株的一种或多种其它组合物同时或依次施用。
应当理解的是，本发明的不同组合物可以被配制以用于施用给特定的反刍动物对象组。例如，适合施用于家牛的组合物的配方可以不同于适合施用于不同反刍动物如绵羊的配方。还应该理解的是，本发明的组合物可以被不同地配制以适于施用给不同年龄的反刍动物。例如，适于施用给小牛或羔羊的组合物的配方可以不同于适于施用给成年母牛或绵羊的配方。在某些实施方案中，第一组合物可以配制用于在初始给药方案中施用于幼年动物，例如断奶前动物，并且第二组合物可以配制用于在维持给药方案中施用于相同动物。在一些实施方案中，第一组合物配制用于断奶前动物，第二组合物配制用于断奶后动物。
鼠李糖乳杆菌HN001的制备
直接饲喂微生物(DFM)和它们在调节瘤胃功能和改善反刍动物性能的方法中的用途是本领域已知的，它们的生产方法也是如此。
简短地说，可以使用常规的液体或固体发酵技术培养鼠李糖乳杆菌HN001。在至少一个实施方案中，菌株在液体营养肉汤中生长至形成最高数量孢子的水平。通过发酵细菌菌株产生该菌株，其可以通过扩大种子培养物开始。这包括重复地和无菌地将培养物转移至越来越大的体积以用作发酵的接种物，其可以在大的不锈钢发酵罐中在含有最佳生长所需的蛋白质、碳水化合物和矿物质的培养基中进行。非限制性示例性介质是MRS或TSB。然而，也可以使用其它介质。在将接种物加入发酵容器后，控制温度和搅拌以允许最大生长。一旦培养物达到最大群体密度，通过从发酵培养基中分离细胞来收获培养物。这通常通过离心进行。
在一个实施方案中，制备鼠李糖乳杆菌HN001菌株，该菌株发酵至1×108CFU/ml至约1×109CFU/ml的水平。离心收集细菌，除去上清液。然后将沉淀的细菌用于生产DFM。在至少一些实施方案中，将沉淀的细菌冷冻干燥，然后用于形成DFM。然而，在使用菌株之前不必冷冻干燥菌株。该菌株也可以与或不与防腐剂一起，以浓缩、未浓缩或稀释的形式使用。
然后可以确定培养物的计数。CFU或菌落形成单位是由标准微生物平板接种方法得到的样品的活细胞计数。该术语来源于这样的事实，即当涂在合适的培养基上时，单个细胞将在琼脂培养基中生长并变成活菌落。
由于多个细胞可产生一个可见的集落，术语集落形成单位是比细胞数目更有用的单位量度。
实施例
1.实施例1-鼠李糖乳杆菌HN001针对指示产甲烷菌菌株的基于平板的筛选
1.1材料和方法
1.1.1产甲烷菌培养
用于接种平板测定的指示产甲烷菌菌株(Methanobrevibacter boviskoreaniJh1)的接种物通过注射器使用厌氧技术在补充有0.2mL 3M甲酸钠，0.2mL 10M乙醇，0.1mL维生素溶液(Janssen等人，1997)和0.1mL辅酶M溶液(Sigma Aldrich，0.1M)的9mL BY介质(Joblin，2005)中生长。将管的顶部空间用加压的无O2的CO2泵送至180kPa，并将管在39℃下孵育而不摇动，直到3至5天后出现可见的浊度。通过用注射器取出顶部空间气体样品并注入配备有热导检测器(TCD)的气相色谱仪(Gc；Aerograph Corporation，USA)并使用氮气作为载气来测量产甲烷菌菌株产生的甲烷。通过用无菌针排气释放管内的气体以防止过度加压。在荧光显微镜下通过湿涂片常规观察培养物，产甲烷菌菌株表现为在紫外(UV)照射下发绿色荧光的短卵形棒。还通过将培养物样品接种到补充有0.1mL 0.5M葡萄糖的9mL BY培养基中并在39℃下孵育一天来检查培养物的污染。如果1天后没有观察到混浊，则认为培养物未被污染。有时通过从产甲烷菌菌株培养物中提取基因组DNA并使用常规细菌16S引物(27f-GAGTTTGATCMTGGCTCAG，1492r-GGYTACCTTGTTACGACTT)和古细菌特异性16S引物(915af-AGGAATTGGCGGGGGAGCAC，1386r-GCGGTGTGTGCAAGGAGC)PCR扩增16SrRNA基因来进行进一步验证。使用具有古细菌引物组的条带的存在和具有细菌引物组的条带的不存在，以及PCR产物的测序结果来验证培养物纯度。
1.1.2受试菌株的制备
鼠李糖乳杆菌HN001的培养物和对照菌株(L.plantarn ATCC 8014，L.bulgaricusATCC 11842)在39℃下在MRS肉汤(Sigma-Aldrich)中生长过夜。测量每种培养物在600nm处的光密度(OD600)，并且将每种的样品通过MRS培养基连续稀释，并将稀释物铺在MRS琼脂板上以测定活菌数。对于待测试的每种细菌培养物，使用装配有21G针的5mL一次性注射器从管中厌氧去除3mL过夜培养物，以及从培养物顶部空间去除1mL CO2。注射器上用过的针头用Millex 33mm过滤器(0.22μm；Merck Millipore)代替，并连接新的21G针头。将1mL的CO2推出过滤器和新的针，用来自顶部空间的CO2冲洗它们，使它们厌氧。然后将针***无菌的CO2冲洗的Hungate管中，并将培养物滤液通过过滤器推入管中。制备后，将Hungate管中的滤液置于厌氧室中。如表1所示，在厌氧室中组装所有测定组分。然后将多孔96孔板与Anaeropack-Anaero厌氧气体发生器一起置于AnaeroPack 2.5L矩形广口瓶中。将盖子密封，将广口瓶从厌氧室中取出并在39℃下孵育。每天通过透明的广口瓶观察板，并且当产甲烷菌菌株对照具有可见的浊度时，将板从广口瓶中取出并在SpectraMax读板仪中振荡5秒后记录光密度(OD600)。减去培养基对照孔的吸光度读数作为背景，并计算相对于阳性生长对照孔，由滤液样品引起的产甲烷菌菌株生长的抑制％。
表1.用于的产甲烷菌生物测定的板设置。
1.2结果
鼠李糖乳杆菌HN001培养物在MRS肉汤中生长良好，生长16小时后OD600达到4.97。来自将所述培养物的稀释物铺板到MRS板上的活菌计数指示4.8×109CFU·mL-1的培养物。这些生长参数与对照菌株L.plantarum 8014和L.bulgaricus 11842相似，尽管L.plantarum 8014具有较低的活菌计数。将来自测试菌株的滤液包括在产甲烷菌生物测定中，将板在39℃下孵育5天，然后从罐中取出并记录孔的OD600。将测试孔的读数与没有任何处理的产甲烷菌菌株的读数进行比较，生长抑制％示于表2中。
表2.鼠李糖乳杆菌HN001培养物滤液针对指示产甲烷菌菌株的筛选。
*由每次处理16个孔的OD600读数的平均值计算抑制％。
鼠李糖乳杆菌HN001滤液显著降低产甲烷菌菌株的生长，平均降低近23％。该生长抑制高于任一对照菌株L.plantarum8014或L.bulgaricus 11842所见，其分别使生长减少约9％或没有效果。鼠李糖乳杆菌HN001滤液显示出约25％的4μM乳链菌肽对照处理的抑制活性。
1.3讨论
用M.boviskoreani JH1作为指示菌株是因为Methanobrevibacter spp.在多个反刍动物物种中构成瘤胃中的大部分产甲烷菌。在测试鼠李糖乳杆菌HN001的培养上清液中观察到的产甲烷菌抑制活性大于两种对照菌株所观察到的抑制。
1.4结论
在基于平板的测定中筛选鼠李糖乳杆菌HN001培养上清液证实了指示产甲烷菌菌株的抑制。与对照LAB菌株相比，该抑制活性大于用L.plantarum 8014或L.bulgaricus11842观察到的，但小于纯化的乳链菌肽对照。
2.实施例2-鼠李糖乳杆菌HN001细菌素提取物和培养上清液针对指示产甲烷菌菌株的基于平板的筛选。
2.1材料和方法
2.1.1产甲烷菌培养物
根据实施例1的1.1.1项制备指示产甲烷菌菌株的培养物。
2.1.2鼠李糖乳杆菌HN001的细胞和上清液样品
鼠李糖乳杆菌HN001的细胞和上清液样品源自在标准生产条件下～5,000L的商业生产运行。使用四个样品，包括：
样品1.鼠李糖乳杆菌HN001细胞样品，未洗涤的，冻干的，低pH提取物。
样品2.鼠李糖乳杆菌HN001上清液样品，在50℃下蒸发，35％固体，～8×浓缩。
样品3.鼠李糖乳杆菌HN001上清液样品，在50℃下蒸发，45％+固体；～11×浓缩。
样品4.鼠李糖乳杆菌HN001上清液样品，冷冻干燥。
将这些样品在20℃下冷冻保存直至需要。在生物测定之前，将细胞样品(样品1)以5％(wt/vol)再悬浮于0.9％NaCl，pH6.8中，并且使用以下2.1.3中描述的细菌素提取方法进行处理，产生在-20℃下冷冻储存直至使用的提取物。还将蒸发的上清液样品(样品2和3)和冷冻干燥的上清液样品(样品4)以5％(wt/vol)再悬浮于0.9％NaCl，pH6.8中，并使用10mL注射器通过Millex-GP 0.22μm 25mm直径无菌过滤器(Millipore，Merck，Sigma-Aldrich NZ)过滤到无菌N2冲洗的Hungate管中。用无菌N2流进一步冲洗Hungate管的顶部空间30分钟以从样品中除去痕量的O2。
用鼠李糖乳杆菌HN001上清液进行热处理，其产生另外三种样品，如下：
样品5.鼠李糖乳杆菌HN001上清液样品，以72℃/15秒加热。
样品6.鼠李糖乳杆菌HN001上清液样品，以75℃/4min加热。
样品7.鼠李糖乳杆菌HN001上清液样品，以100℃/4min加热。
热处理后，如上所述将样品通过0.22μm过滤器过滤到无菌N2冲洗的Hungate管中，顶部空间用无菌N2的流冲洗。将样品储存在-20℃下直至在指示产甲烷菌生物测定中筛选。
2.1.3细菌素提取
将重悬的培养物转移至15mL Falcon管中，并用6M氢氧化钠将pH调节至约6.8。将pH调节的培养物样品在70℃下孵育45分钟，然后在4℃下以2600x g离心15分钟。倒出上清液，将细胞沉淀重悬于8mL0.9％NaCl，pH2中。检查重悬的沉淀的pH，如果需要，用1M HCl将最终pH调节至2。将细胞在4℃下孵育2小时，同时在振荡平台上缓慢搅拌。然后将细胞在4℃下以2600xg离心15分钟，并将上清液收集到新鲜的15mL Falcon管中。上清液的pH用1M氢氧化钠调节至6.8。在无菌条件下，使用10mL注射器，将pH调节的上清液通过Millex-GP 0.22μm 25mm直径无菌过滤器(Millipore，Merck，Sigma-Aldrich NZ)过滤到无菌N2冲洗的Hungate管中。将过滤的上清液在20℃下冷冻直至使用。
2.1.4产甲烷菌生物测定
将在厌氧条件下包含在Hungate管中的细菌素提取物置于厌氧室中并使其解冻。加入除细菌素提取物之外的所有测定组分，并在厌氧室内的无菌Hungate管中以表3中所示的比例混合，然后分配到含有细菌素提取物的多孔96孔板的孔中。最初的生物测定试验使用磷酸盐缓冲液，然而发现这产生沉淀，可能是由于鼠李糖乳杆菌HN001培养基中的CaCl2与磷酸盐缓冲液反应形成不溶性磷酸钙沉淀。或者，在生物测定中用3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS，90mM pH7.0)代替磷酸盐缓冲液。
然后将所述板与Anaeropack-Anaero厌氧气体发生器一起置于AnaeroPack 2.5L矩形罐中。将盖子密封，将广口瓶从厌氧室中取出并在39℃下孵育。每天通过透明的广口瓶观察板，并且当产甲烷菌菌株对照具有可见的浊度时，将板从广口瓶中取出，并且在SpectraMax读板仪中振荡5秒后在600nm(OD600)下记录每个孔的光密度。减去培养基对照孔的吸光度读数作为背景，计算相对于阳性生长对照孔(仅含有缓冲液)由细菌素提取物样品引起的指示产甲烷菌菌株的生长抑制％。
表3.用于产甲烷菌生物测定的微量滴定板设置。
2.2结果
在加入到MOPS缓冲液修饰的指示产甲烷菌测定之前，允许鼠李糖乳杆菌HN001细胞细菌素提取物和从商业生产过程制备的上清液样品解冻。鼠李糖乳杆菌HN001样品在初始测定中给出具有大标准偏差的结果，并且重复测定以获得更好的再现性(表4)。
表4.针对指示产甲烷菌菌株测试的鼠李糖乳杆菌HN001样品。
*来自细胞样品(1)的细菌素提取物表示为具有0.9％氯化钠的指示产甲烷菌菌株的生长％；上清液样品(2-7)表示为指示产甲烷菌菌株在MRS+NH4乳酸盐(具有用氢氧化铵中和的4％乳酸的MRS培养基)中的生长％，用作对照以模拟来自商业生产运行的培养上清液组成。
2.3结论
与乳链菌肽对照一样，两个鼠李糖乳杆菌HN001细胞细菌素提取物和上清液样品显示出对指示产甲烷菌菌株生长的强烈抑制。此外，在冷冻干燥以及加热上清液后保留上清液样品的抑制活性。基于这些结果，申请人认为HN001抑制活性耐受与加工相关的常见条件，例如喷雾干燥。
3.实施例3-用于测试鼠李糖乳杆菌HN001对模拟瘤胃微生物群落的作用的瘤胃体外模型
3.1材料和方法
3.1.1用于测试的鼠李糖乳杆菌HN001培养物和上清液的制备
将鼠李糖乳杆菌HN001接种到含有5mL厌氧MRS培养基(Sigma-Aldrich)的7个Hungate管中，并在39℃下孵育16小时(直至培养物达到稳定期)。将所有培养物汇集到250mL CO2冲洗的血清瓶中。将合并培养物的等分试样(1mL)加入到9mL无菌MRS培养基中以测量其OD600。将培养混合物的其它等分试样(0.5mL)一式三份接种到4.5mL无菌厌氧缓冲液中，在CO2下连续10倍稀释，并接种到MRS平板上，以测定原始培养物的菌落形成单位(CFU·mL-1)数。剩余培养物的一半用于一组瘤胃体外发酵(鼠李糖乳杆菌HN001培养物)，另一半过滤(微孔孔径0.22μm)并将滤液置于新的无菌厌氧血清瓶中(鼠李糖乳杆菌HN001上清液处理，SN)。厌氧磷酸盐缓冲液(0.46M K2HPO4；0.54M KH2PO4，pH7)用作无处理对照(缓冲液)。
3.1.2瘤胃液制备和体外发酵建立
为了在体外发酵容器中接种瘤胃，从6头瘤胃喂养的弗利斯氏母牛收集新鲜瘤胃内容物。在挤压通过一层干酪包布之后，合并来自两只动物的所得瘤胃液(约150mL瘤胃液)，得到3个生物复制品。将混合瘤胃液的等分试样(12.5mL)加入到250mL血清瓶中的0.5mg干草和36.5mL厌氧磷酸盐缓冲液中。在用丁基橡胶塞封闭血清瓶之前，加入缓冲液、鼠李糖乳杆菌HN001或SN的处理物(1mL)，得到含有25％瘤胃液(v/v)的50mL最终发酵体积。处理瓶和对照瓶的实验布局示于表5中。
表5.对于每个重复，接种鼠李糖乳杆菌HN001培养物或上清液(SN)或对照溶液(缓冲液)的瓶的数目，用于挥发性脂肪酸(VFA)/DNA取样和分析。
3.1.3 VFA样品收集和分析
在0、2、6、12、24、48小时从瓶收集样品用于VFA分析。在每个时间点，收集3mL等分试样，并测量它们的pH。将样品分成0.9mL用于DNA分析的子样品和1.8mL用于VFA和非VFA分析(包括乳酸)。将VFA样品在4℃下以21,000×g离心10分钟，并除去0.9mL上清液并加入到0.1mL内标(20mM 2-乙基丁酸盐/20％磷酸)中，混合并在-20℃下冷冻直至分析。解冻并在4℃以21，000×g再离心10分钟后，收集0.9mL用于衍生化用于非VFA分析，而样品的其余部分直接通过GC分析。
3.1.4 DNA样品收集和分析
以与VFA样品相同的时间间隔收集DNA样品，并立即在-20℃冷冻直至DNA提取。使用珠粒振荡/苯酚氯仿法(Rius等人，2012)提取DNA，并将其用于PCR反应中以产生具有细菌、古细菌和原生动物特异性条形码化测序引物的16S核糖体RNA基因扩增子(Kittelmann和Janssen，2011)。将扩增子纯化、标准化、合并并通过Illumina MiSeq测序仪测序。对测序结果进行质量控制和过滤，并使用具有瘤胃特异性16S rRNA基因序列的Silva数据库通过QIIME分析过滤的序列。以99％相似性挑选操作分类单位(OTU)并制表。
3.2结果
3.2.1瘤胃体外pH
在体外孵育过程中观察到pH值的降低，与正常发酵和短链脂肪酸的积累一致。与缓冲液对照相比，鼠李糖乳杆菌HN001或SN的添加都诱导pH降低(p<0.01)。该差异在孵育开始后2小时出现，并持续至测定结束(图1)。pH从0至48小时的总体降低表示约0.3个pH单位，在孵育24小时后观察到处理和对照之间的最大差异为0.1。
3.2.2鼠李糖乳杆菌HN001对瘤胃体外VFA和乳酸产生的影响
瘤胃体外发酵中产生的VFA总量在孵育期间增加，表明通过接种物中瘤胃微生物的活性发酵底物(表6)。在6小时和24小时之间，与仅接受缓冲液的瓶相比，在接种鼠李糖乳杆菌HN001或SN的瓶中测量到更高量的VFA。
表6.用鼠李糖乳杆菌HN001、SN或缓冲液接种瘤胃体外发酵期间总VFA产量。
T-测试鼠李糖乳杆菌HN001/SN对缓冲液***p＜0.001。
乙酸是所有发酵产生的主要VFA，随后是丙酸和丁酸(图2)。次要VFA的比例如图3所示。在孵育期间，所有体外发酵在0至6小时之间显示出乙酸比例的降低和丁酸比例的增加。6小时后，VFA的比例保持稳定，直到发酵结束。丙酸的比例在6小时时显示轻微增加，并且保持稳定直至48小时(图4)。与缓冲液对照相比，添加鼠李糖乳杆菌HN001或SN在2小时时诱导乙酸的轻微增加，然后从4小时到48小时减少乙酸产生(图4)。同时，在接受鼠李糖乳杆菌HN001或SN的发酵中，丁酸的比例从6小时直至实验结束都增加。与缓冲液相比，鼠李糖乳杆菌HN001培养物和上清液处理的丙酸水平仅在发酵2小时时轻微(但显着)降低(p＝0.012缓冲液对鼠李糖乳杆菌HN001；p＝0.0009缓冲液对SN)。
与缓冲液对照相比，鼠李糖乳杆菌HN001和SN瓶在孵育2小时时乙酸/丙酸(A：P)比增加(表7)。在6小时时，HN001组的A∶P比降低，但在SN和缓冲液对照之间没有观察到差异。
表7.接种鼠李糖乳杆菌HN001、SN或缓冲液的瘤胃体外瓶上清液中乙酸/丙酸比。
T-测试鼠李糖乳杆菌HN001对缓冲液；*p＜0.05；sN对缓冲液；
乳酸是来自乳酸菌(LAB)的主要发酵产物并且可以在瘤胃中产生。在瘤胃体外发酵中，在接受鼠李糖乳杆菌HN001或sN的瓶中0小时观察到乳酸为～1mM，这是由于在用作接种物和上清液来源的鼠李糖乳杆菌培养物中产生的乳酸(～46.5mM)的存在。然而，在鼠李糖乳杆菌HN001或SN瓶中的乳酸浓度在发酵2小时后增加到～2.5-3mM，表明在这些发酵过程中产生了乳酸。乳酸从6小时开始迅速消失，表明其随后被瘤胃微生物代谢。
3.2.3瘤胃微生物群落组成
3.2.3.1.细菌
在门水平，无论处理如何，厚壁菌门和拟杆菌门是瘤胃体外样品中鉴定的主要门(图6)。这两门之间的平衡在发酵过程中发生变化；在6小时(p＜0.01)和48小时厚壁菌门占优势，而在12小时拟杆菌占优势。鼠李糖乳杆菌HN001和SN对厚壁菌门和拟杆菌门比例具有相同的影响，在孵育2小时后，与缓冲液对照组相比，导致厚壁菌门比例增加(p＜0.01)和拟杆菌门减少(p＜0.05)。在6小时时，将该平衡反转；与缓冲液对照相比，在鼠李糖乳杆菌HN001和SN组中厚壁菌门变得较不丰富(鼠李糖乳杆菌HN001，p＜0.05；SN，p＜0.01)，而拟杆菌门增加(鼠李糖乳杆菌HN001，p＜0.01；SN，p＜0.05)。鼠李糖乳杆菌HN001或SN的加入也影响其它门，如候选SR1(在6小时减少(p＜0.01)，在24小时增加(p＜0.05))，而变形菌门、软壁菌门和疣微菌门在24小时都增加(p＜0.05)。
属级分析表明，普雷沃氏菌属、瘤胃球菌属和属于Christensensenelace科和理研菌科的属以及拟杆菌目在瘤胃体外样品中占主要地位。Shannon多样性分析证明鼠李糖乳杆菌HN001和SN对瘤胃细菌群落的影响(表8)。如图6中所述，与缓冲液对照相比，鼠李糖乳杆菌HN001和SN组在2小时和24小时时发生这种多样性富集。
表8.属级细菌多样性的香农多样性分析。
T测试对缓冲液*p＜0.05
添加到瘤胃体外发酵中的鼠李糖乳杆菌HN001接种物的存活计数为1010CFU·mL-1。如所预期的，与SN和缓冲液对照组相比，鼠李糖乳杆菌HN001组中与乳杆菌属相关的细菌显著增加，除了在12小时。基于16S rRNA基因序列进一步鉴定乳杆菌菌种证实了鼠李糖乳杆菌HN001处理中总乳杆菌的增加主要是由于鼠李糖乳杆菌(图7)。在整个实验中，HN001组中的鼠李糖乳杆菌的比例显著高于缓冲液和SN组。与缓冲液和SN组相比，鼠李糖乳杆菌HN001组中的玉米乳杆菌菌株RIA 482也显著增加(图7)。
3.2.3.2.古细菌
古细菌多样性的分析表明，在6小时和24小时时，该界的组成发生了重要变化(图8)。Mbb.ruminantium和Mbb.gottschalkii是在发酵期间在瘤胃体外样品中检测到的主要古细菌(图8)。与缓冲液相比，在孵育6小时后，接种鼠李糖乳杆菌HN001培养物或上清液的两组的香农多样性指数更高(表9)。对于鼠李糖乳杆菌HN001和SN组，与缓冲液相比，Mbb.boviskoreani、Mbb.gottschalkii、Mbb.ruminantium和Mbb.smithii在648小时内显著降低(表10-13)。在孵育6和12小时后，鼠李糖乳杆菌HN001(p＜0.05)和SN(p＜0.01)组的Mbb.boviskoreani明显较低。
表9.进化枝级古细菌的香农多样性分析。
T测试HN001/SN对缓冲液*p＜0.05***p＜0.001
表10.在瘤胃体外发酵中的Mbb.boviskoreani的相对丰度。
T测试HN001/SN对缓冲液*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001
表11.体外发酵瘤胃中Mbb.gottschalkii的相对丰度。
T测试HN001/SN对缓冲液*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001
表12.瘤胃体外发酵中Mbb.ruminantium的相对丰度。
T测试HN001/SN对缓冲液*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001
表13.瘤胃体外发酵中Mbb.smithii的相对丰度。
T测试HN001/SN对缓冲液*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001
3.2.3.3.原生动物
在样品中鉴定的主要原生动物是Epidinium和Ostracodinium。原生动物群落分析揭示了孵育6和48小时后多样性的变化(图9)。香农多样性指数分析证明缓冲液对照和鼠李糖乳杆菌HN001培养组在6小时时有单一的显著差异(表14)，同时接种鼠李糖乳杆菌HN001的样品中的多样性增加。在6小时，与缓冲液相比，用鼠李糖乳杆菌HN001处理的原生动物物种Polyplastron multivesiculatum和Eremoplastron dilobum显著更低(p＜0.05)。与细菌或古细菌相比，原生动物似乎较少受鼠李糖乳杆菌HN001或SN接种的影响。
表14.原生动物的香农多样性分析。
T测试对缓冲液*p＜0.05。
3.3讨论
乳酸菌(LAB)是哺乳动物肠道的天然居民，并且对于其在乳制品和肉制品中的用途是公知的(Kroeckel，2006；Ljungh和2006；Zafiriadis，2015)。实验室可能通过多种机制影响瘤胃生态***；LAB产生有机酸、过氧化氢、非核糖体合成肽和细菌素(Cotter等，2013；Mangoni和Shai，2011)，均能够改变微生物群落。接种到青贮饲料中或直接添加到饲料中的LAB可产生对其它微生物具有活性的这些特定抗微生物化合物。
还报道了在家畜饲料中使用细菌素以增强宿主的生长潜力(Yang等，2014)。向青贮饲料中添加细菌素被认为能够使瘤胃中的分解纤维素的细菌变得更占优势(Capper等人，2009)。细菌素具有许多优于其它抗微生物剂的优点，包括靶标特异性(Lohans和Vederas，2012)，遗传操作的适应性(Perez等人，2014)和在人类消费的食物中安全使用的长期历史(Kalmokoff等人，1996)。Callaway等人(1997)发现添加到苜蓿干草中的乳链菌肽(＞1μM)降低了乙酸盐与丙酸盐产量的比，这与甲烷产生的减少一致。瘤胃来源的细菌素的示例是bovicin HC5，其由Streptococcus bovis HC5产生，分离自牛瘤胃。在混合瘤胃体外测定中发现该细菌素使甲烷产生减少50％，并且瘤胃产甲烷菌在其存在下转移4次后不对细菌素产生抗性(Lee等人，2002)。Renuka等人(2013)评价了片球菌素对体外甲烷产生和干物质消化率的影响，并报道了片球菌素P1和P2导致低水平的甲烷产生(分别为4.81％和5.08％)，在活性细菌素和对照组之间报道了显著差异。
进行瘤胃体外测定以观察鼠李糖乳杆菌HN001和SN在模拟瘤胃发酵条件下对微生物活性的影响。该分析证明，向模拟的瘤胃生态***中加入鼠李糖乳杆菌HN001或SN在孵育6小时后诱导VFA和乳酸浓度的显著变化。总VFA增加，丁酸增加，而乙酸减少。瘤胃体外试验中微生物群落的分析清楚地证明了响应于鼠李糖乳杆菌HN001和SN处理的细菌和古细菌群体的变化，这更可能解释了观察到的代谢变化。
可预测地，在鼠李糖乳杆菌HN001在0小时样品中富集了Lacticaseibacillusspp.(具体地，鼠李糖乳杆菌HN001)，这与添加到体外瘤胃中的接种物比例(1010CFU·mL-1)相对应。该富集在2小时也增加，表明鼠李糖乳杆菌HN001在接种后在瘤胃样条件下生长。此外，乳酸浓度从0小时时的～1mM(由于从接种物中携带过量的乳酸)增加至2小时时的～3mM，表明鼠李糖乳杆菌菌株HN001或其它瘤胃LAB(例如链球菌和毛螺菌科)具有代谢活性，在瘤胃发酵中产生额外的乳酸。尽管在瘤胃环境中对可溶性糖有强烈的竞争，鼠李糖乳杆菌HN001菌株能够存活，并保持可检测直至24小时(总细菌的0.23％)，并且是在瘤胃中体外占优势的乳杆菌菌株。这种在模拟的瘤胃环境中持续和有活性的能力表明鼠李糖乳杆菌HN001可以在瘤胃中建立一个存活的种群，至少在短期内。
在古细菌群落中观察到的主要变化是氢营养型产甲烷菌Mbb.boviskoreani、Mbb.gottschalkii、Mbb.ruminantium和Mbb.smithii的6至48小时的大量减少。因为Mbb.gottschalkii和Mbb.ruminantium一起构成瘤胃中古细菌群落的～75％(Doyle等，2019)，在这些进化枝中观察到的大的减少是特别显著的。
还应当注意的是，瘤胃体外测定是封闭***，并且随着时间的推移可能变得营养受限。因此，0-12小时的时间点可以更准确地反映体内情况，因为动物通常将在24小时内摄取更多的食物和液体。
3.4结论
鼠李糖乳杆菌HN001和SN的瘤胃体外测定证明了对发酵终产物和对细菌和古细菌群落的影响。总之，结果显示鼠李糖乳杆菌HN001对瘤胃产甲烷菌具有特异性抑制作用，并导致由鼠李糖乳杆菌HN001产生并分泌到培养物上清液中的一种或多种化合物(如细菌素)介导的瘤胃微生物组的显著改变。鉴定了响应HN001和SN的挥发性脂肪酸和总VFA的显著增加。这表明氢代谢从甲烷形成向短链/挥发性脂肪酸(VFA)产生的转移和/或由于瘤胃微生物组的改变而破坏微生物组的成员之间的中间体的交叉进料。从甲烷形成到短链/挥发性脂肪酸(VFA)生产的氢代谢。总VFA和丁酸的显著增加表明动物饲料效率也可能得到改善。
4.示例4-农场细胞培养
4.1材料和方法
将鼠李糖乳杆菌HN001TM和乳酸乳杆菌乳脂亚种cremoris 2566的培养物的混合物加入到含有和不含酵母提取物(YE)的热能化乳中，并使用保持在25℃或30℃的水浴孵育12小时。测量活细胞计数。
4.2结果
鼠李糖乳杆菌HN001TM能够在热化乳培养基中在25℃或30℃下良好生长，在与L.lactis subsp.cremoris 2566的组合培养中实现超过5×108个细胞/g的活细胞计数(表15)。酵母提取物(YE)的加入轻微地增加了鼠李糖乳杆菌HN001TM的活细胞计数。
表15.活细胞计数。
4.3结论
该实施例显示鼠李糖乳杆菌HN001TM可使用适合农场应用的热能化乳培养基培养至高细胞密度。
本发明的优选实施例仅通过示例的方式进行了描述，并且在不脱离本发明的范围的情况下可以对其进行修改。
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工业实用性
本发明涉及益生菌，特别是鼠李糖乳杆菌菌株HN001或其衍生物的用途，并且特别是抑制产甲烷细菌在反刍动物的前胃中生长和/或降低瘤胃微生物产生甲烷的能力和/或降低反刍动物的甲烷产生和/或增加反刍动物的饲料效率、产乳量和/或体重或身体组成的用途。还提供了使用鼠李糖乳杆菌菌株HN001或其衍生物的方法和包含其的反刍动物饲料组合物。

Claims (42)

1.一种在反刍动物的前胃中抑制产甲烷细菌和/或古细菌生长的方法，其中所述方法包括向反刍动物施用有效量的鼠李糖乳杆菌菌株HN001或其衍生物，所述菌株的AGAL保藏号为NM97/09514，日期为1997年8月18日。
2.一种用于减少反刍动物的瘤胃甲烷产生的方法，其中所述方法包括向所述动物施用有效量的鼠李糖乳杆菌菌株HN001或其衍生物，所述菌株的AGAL保藏号为NM97/09514，日期为1997年8月18日。
3.一种用于增加反刍动物的饲料效率的方法，其中所述方法包括向所述动物施用有效量的鼠李糖乳杆菌菌株HN001或其衍生物，所述菌株的AGAL保藏号为NM97/09514，日期为1997年8月18日。
4.一种降低瘤胃微生物体产生甲烷的能力的方法，其中所述方法包括向所述动物施用有效量的鼠李糖乳杆菌菌株HN001或其衍生物，所述菌株的AGAL保藏号为NM97/09514，日期为1997年8月18日。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法抑制所述动物的前胃中的氢营养产甲烷菌，优选来自甲烷杆菌属的产甲烷菌的生长。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中鼠李糖乳杆菌HN001或其衍生物以组合物的形式施用，所述组合物为食品、饮料、食品添加剂、饮料添加剂、动物饲料、动物饲料添加剂、动物饲料补充物、膳食补充物、载体、维生素或矿物质预混物、营养产品、肠内喂养产品、可溶物、浆液、补充物、药物、舔块、灌肠剂、片剂、胶囊、小丸或瘤胃内产品，例如大丸剂，或其中所述鼠李糖乳杆菌HN001被包封在例如脂质体、微泡、微粒或微胶囊中。
7.根据权利要求6所述的方法，其中鼠李糖乳杆菌HN001或其衍生物以饮用水、乳、乳粉、乳替代品、乳强化剂、乳清、乳清粉、部分或全混合日粮(TMR)、玉米、大豆、草料、谷物、酒糟、发芽谷物、豆科植物、维生素、氨基酸、矿物质、纤维、饲料、草、干草、稻草、青贮饲料、果仁、叶子、粗粉、可溶物、浆液、补充剂、粉状饲料、粗粉、果浆、蔬菜浆、水果或蔬菜渣、柑橘粗粉、小麦矮秆、玉米芯粗粉、糖蜜、蔗糖、麦芽糖糊精、稻壳、蛭石、沸石或粉碎的石灰石施用。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述动物施用鼠李糖乳杆菌HN001，其量为104至1013菌落形成单位/千克干重载体饲料，104至1010菌落形成单位/千克动物体重/天，或104至1013菌落形成单位/天。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述方法包括施用动物鼠李糖乳杆菌HN001，其量为108至1012菌落形成单位/千克干重载体饲料，105至108菌落形成单位/千克动物体重/天，或106至1013菌落形成单位/天。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中鼠李糖乳杆菌HN001的衍生物是所述菌株的细胞裂解物、所述菌株的细胞悬浮液、所述菌株的代谢物、所述菌株的培养上清液或灭活的鼠李糖乳杆菌HN001。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括进一步施用至少一种不同物种或菌株的微生物、抑制产甲烷菌或产甲烷作用的疫苗，和/或产甲烷作用的天然或化学合成的抑制剂和/或产甲烷菌抑制剂，例如溴仿。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述鼠李糖乳杆菌HN001或其衍生物与选自以下的一种或多种试剂分开、同时或顺序施用：一种或多种益生元、一种或多种益生菌、一种或多种后生物、一种或多种膳食纤维来源、一种或多种低聚半乳糖、一种或多种短链低聚半乳糖、一种或多种长链低聚半乳糖、一种或多种低聚果糖、菊粉、一种或多种半乳聚糖、一种或多种果聚糖、乳果糖或其任何两种或更多种的任何混合物。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述方法增强反刍动物的生长或生产力。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述方法增加由反刍动物产生的乳和/或乳组分的产量。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述方法增加由反刍动物产生的乳中乳脂、乳蛋白或乳固体的产量。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述方法另外改善反刍动物的体重和/或身体组成。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述反刍动物是牛、山羊、绵羊、野牛、牦牛、水牛、鹿、骆驼、羊驼、美洲驼、角马、羚羊或野牛。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述反刍动物是家牛或绵羊。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述反刍动物是家牛。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述反刍动物是泌乳动物。
21.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述反刍动物是断奶前动物，例如小牛或羔羊。
22.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述反刍动物是断奶后动物。
23.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述鼠李糖乳杆菌HN001在断奶前和断奶后施用于反刍动物。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述施用是对断奶前动物施用，并且其中对所述反刍动物的前胃中产甲烷细菌和/或古细菌的生长的抑制、所述反刍动物的甲烷产生的减少和/或所述反刍动物中提高的饲料效率在断奶后持续。
25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在最后一次施用鼠李糖乳杆菌HN001后，抑制所述反刍动物的前胃中的产甲烷细菌和/或古细菌的生长、减少所述反刍动物的甲烷产量和/或增加所述反刍动物的饲料效率持续至少2天、3天、5天、1周、2周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年或7年。
26.根据权利要求25所述的方法，其中在反刍动物的前胃中抑制产甲烷细菌和/或古细菌的生长、减少所述反刍动物的甲烷产生和/或增加所述反刍动物的饲料效率持续所述反刍动物的生命。
27.一种反刍动物饲料组合物，其用于抑制反刍动物的前胃中产甲烷细菌和/或古细菌的生长、降低所述瘤胃微生物体产生甲烷的能力、降低反刍动物的瘤胃甲烷产生、增加反刍动物的饲料效率、增强反刍动物的生长和/或生产力、增加由反刍动物产生的乳和/或乳组分的产量，或改善反刍动物的体重和/或身体组成，饲料组合物包含鼠李糖乳杆菌菌株HN001或其衍生物。
28.根据权利要求27所述的反刍动物饲料组合物，其中所述饲料组合物是发酵型酸奶型组合物，并且其中所述发酵型酸奶型组合物是通过使用乳基载体或非乳基载体生长鼠李糖乳杆菌HN001的方法形成。
29.根据权利要求27所述的反刍动物饲料组合物，其是或包含部分或全部混合日粮(TMR)、玉米、大豆、草料、谷物、酒糟、发芽谷物、豆类、纤维、饲料、草、干草、稻草、青贮饲料、果仁、叶子、粗粉、粉状饲料、舔块或糖蜜。
30.根据权利要求27-29中任一项所述的反刍动物饲料组合物，其还包含至少一种不同物种或菌株的微生物、抑制产甲烷菌或产甲烷作用的疫苗，和/或产甲烷作用的天然或化学合成的抑制剂和/或产甲烷抑制剂，例如溴仿。
31.根据权利要求2730中任一项所述的反刍动物饲料组合物，其还包含一种或多种选自以下的试剂：一种或多种益生元、一种或多种益生菌、一种或多种后生物、一种或多种膳食纤维来源、一种或多种低聚半乳糖、一种或多种短链低聚半乳糖、一种或多种长链低聚半乳糖、一种或多种低聚果糖、菊粉、一种或多种半乳聚糖、一种或多种果聚糖、乳果糖或其任何两种或更多种的任何混合物。
32.根据权利要求2731中任一项所述的反刍动物饲料组合物，其中鼠李糖乳杆菌菌株HN001的衍生物是所述菌株的细胞裂解物、所述菌株的细胞悬浮液、所述菌株的代谢物、所述菌株的培养上清液或灭活的鼠李糖乳杆菌HN001。
33.一种用于抑制反刍动物的前胃中产甲烷细菌和/或古细菌生长的方法，所述方法包括向所述动物施用根据权利要求27至32中任一项所述的反刍动物饲料组合物的步骤。
34.一种减少反刍动物瘤胃甲烷产生的方法，所述方法包括向所述动物施用根据权利要求2732中任一项所述的反刍动物饲料组合物的步骤。
35.一种提高反刍动物饲料效率的方法，所述方法包括向所述动物施用根据权利要求27-32中任一项所述的反刍动物饲料组合物的步骤。
36.一种用于增强反刍动物的生长和/或生产力的方法，所述方法包括向所述动物施用根据权利要求27至32中任一项所述的反刍动物饲料组合物的步骤。
37.一种用于增加由反刍动物产生的乳和/或乳组分的产量的方法，所述方法包括向所述动物施用根据权利要求27至32中任一项所述的反刍动物饲料组合物的步骤。
38.一种用于改善反刍动物的体重和/或身体组成的方法，所述方法包括向所述动物施用根据权利要求27至32中任一项所述的反刍动物饲料组合物的步骤。
39.一种降低反刍动物的瘤胃微生物体产生甲烷的能力的方法，所述方法包括向所述动物施用根据权利要求2732中任一项所述的反刍动物饲料组合物的步骤。
40.一种鼠李糖乳杆菌菌株HN001或其衍生物用于制备组合物的用途，所述菌株的AGAL保藏号为NM97/09514，日期为1997年8月18日，所述组合物用于抑制反刍动物的前胃中产甲烷细菌和/或古细菌的生长、减少反刍动物的瘤胃甲烷产生、增加反刍动物的饲料效率、增加由反刍动物产生的乳和/或乳组分的产量，或改善反刍动物的体重和/或身体组成。
41.根据权利要求40所述的用途，其中所述组合物包含根据权利要求27-32中任一项所述的反刍动物饲料组合物。
42.一种鼠李糖乳杆菌菌株HN001或其衍生物，所述菌株的AGAL保藏号为NM97/09514，日期为1997年8月18日，其用于抑制反刍动物的前胃中产甲烷细菌和/或古细菌的生长、降低瘤胃微生物体产生甲烷的能力、降低反刍动物的瘤胃甲烷产生、增加反刍动物的饲料效率、增加由反刍动物产生的乳和/或乳组分的产量，或改善反刍动物的体重和/或身体组成。
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