WO2021237410A1 - 多蛋白体系的共生产方法、多蛋白体系的共生产***及应用 - Google Patents

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WO2021237410A1
WO2021237410A1 PCT/CN2020/092110 CN2020092110W WO2021237410A1 WO 2021237410 A1 WO2021237410 A1 WO 2021237410A1 CN 2020092110 W CN2020092110 W CN 2020092110W WO 2021237410 A1 WO2021237410 A1 WO 2021237410A1
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protein
translation
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expression
factor
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PCT/CN2020/092110
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戴卓君
李鹏程
张曦
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深圳先进技术研究院
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • Multi-protein system symbiosis production method multi-protein system co-production system and application technology field
  • This application relates to the technical field of protein synthesis in vitro, and specifically relates to a co-production method of a multi-protein system, a co-production system of a multi-protein system, and applications. Background technique
  • Cells are the basic structure and functional unit of life activities, and at the same time provide a place for biochemical reactions, and are called "cell factories".
  • the intracellular biochemical reaction network is complex, and artificial modification is likely to have adverse or unpredictable effects on cells, and ultimately lead to reduced cell viability and even loss of function, which greatly limits the application of cell factories. Therefore, how to break through the limitations of cell factories is a huge challenge for biosynthesis. Aiming at the limitations of cell factories, cell-free protein synthesis (CFPS) provides a good solution.
  • CFPS cell-free protein synthesis
  • the cell-free protein synthesis system is a biological technology that does not rely on intact cells for protein synthesis in vitro.
  • DNA or mRNA uses DNA or mRNA as a template and uses protein synthesis elements, protein folding factors and other related enzyme systems in cell extracts. Add amino acids, tRNA and energy substances to complete protein synthesis in vitro, simulate the life phenomenon of biological cells, and reproduce the transcription and translation process of intracellular proteins. The resulting protein can be used in downstream experiments such as protein function testing and structural analysis.
  • the modular cell-free protein synthesis system has clear and simple reaction components, easy control of the components, and short experiment period, providing an open and versatile reaction environment for many biochemical experiments.
  • cell-free protein synthesis systems are mainly divided into two types: one is directly derived from cell lysates (WCE: whole-cell extracts), and the other contains only the necessary for DNA transcription, protein translation and energy regeneration. Ingredients, namely the protein synthesis using recombinant elements PURE (protein synthesis using recombinant elements).
  • PURE protein synthesis using recombinant elements
  • the concentration is controllable, so it has many significant advantages:
  • the low-degrading enzyme environment greatly improves the stability of mRNA or protein;
  • the protein or substrate components can be conveniently designed for the protein to be synthesized (such as the insertion of unnatural amino acids, etc.), making the system highly modular and capable Flexibility etc.
  • One of the objectives of the embodiments of the present application is to provide a method for co-production of a multi-protein system, a co-production system of a multi-protein system, and applications, aiming to solve the large workload and consumption in the synthesis of the existing PURE system. Issues such as time length and high cost. Problem solution technical solution
  • a method for co-production of a multi-protein system which includes the following steps:
  • a vector for expressing a bacteriolytic protein, a vector for multiple expression proteins, and a protein expression strain are provided.
  • Each protein expression vector expresses one protein in a multi-protein system, and different protein expression vectors express different proteins. same;
  • the vector expressing the bacteriolytic protein and the vector expressing each protein are co-transformed into the protein expression strain to obtain multiple co-expression strains;
  • All co-expression strains are co-cultured, and autonomous lysis occurs when the growth density of the co-expression strain reaches the autonomous lysis density, and the respective expressed proteins are released to obtain a polyprotein system;
  • the multi-protein system includes proteins used for protein translation, energy regeneration, and/or enzymes that catalyze the synthesis of compounds.
  • a multi-protein system co-production system which includes:
  • Co-expression strain preparation unit used to prepare a variety of co-expression strains, each co-expression strain expresses a protein and bacteriolytic protein in a multi-protein system, and different co-expression strains express different proteins;
  • Cell culture unit used to cultivate co-expression strains in the co-expression strain unit;
  • the multi-protein system includes proteins used for protein translation, energy regeneration, and/or enzymes that catalyze the synthesis of compounds.
  • the beneficial effects of the co-production method of the multi-protein system are: by co-transferring the vector expressing the lysoprotein and the vector expressing multiple proteins into the protein expression strain, the obtained co-expression strain can be expressed The corresponding protein and bacteriolytic protein, as the co-expression strain grows, the produced bacteriolytic protein acts on the co-expression strain to cause autonomous lysis, release the expressed protein, and form a multi-protein system.
  • the co-production method of the multi-protein system provided in the examples of the application can realize the co-cultivation of multiple co-expression strains and collect multiple proteins at one time, and does not require the steps of mechanically or non-mechanically disrupted protein expression strains, and is applicable The advantages of wide range, simple steps, high efficiency and low cost.
  • the multi-protein system co-production system includes a co-expression strain preparation unit and a cell culture unit.
  • the co-expression strain preparation unit prepares multiple co-expression strains. Since each co-expression strain does not repeatedly express a protein and lysoprotein in the multi-protein system, when multiple co-expression strains are co-cultured in the cell culture unit The bacteriolytic protein will cause the co-expression strain to undergo autonomous lysis, which is beneficial to the stability of the coexistence of strains in the co-expression system (avoid some co-expression strains from robbing all resources due to excessive growth and uninhibited growth).
  • the multi-protein system co-production system provided in the examples of the present application can obtain multiple proteins at one time, and has the advantages of easy control of culture conditions, high production efficiency, and low cost.
  • the beneficial effects of the application of the multi-protein system co-production system in the in vitro synthesis of proteins and/or compounds provided by the examples of the application are: That is, the proteins necessary for the synthesis of proteins and/or compounds in vitro can be collected, and the synthesis of proteins and/or compounds can be performed in vitro without relying on intact cells.
  • the co-production system of the multi-protein system provided in the embodiments of the application is It's easier, faster, more efficient, and lower cost.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of the work flow of a method for co-production of a multi-protein system provided by one of the embodiments of the application;
  • FIG. 2 provides a specific example of this application, the synthetic red fluorescent protein mRFP content and fluorescence signal standard curve when excited at 580nm and emitted at 610nm;
  • FIG. 3 is a specific embodiment provided in this application, the real-time fluorescent signal monitoring result of the synthetic red fluorescent protein mRFP.
  • the weight of related components mentioned in the examples of this application can not only refer to the specific content of each component, but can also represent the weight ratio of each component. Therefore, as long as the content of the relevant components in the embodiments of the application is scaled up or down, it is within the scope of the disclosure of the application.
  • the weight described in the embodiments of the present application may be mass units known in the chemical industry, such as y g, mg, g, and kg.
  • vector includes plasmids, bacteriophages, viruses or other vectors.
  • the embodiments of the present application provide a co-production method of a multi-protein system, which includes the following steps:
  • S1. Provide vectors for expressing bacteriolytic proteins, vectors for multiple expression proteins, and protein expression strains. Each protein-expressing vector expresses one protein in a multi-protein system, and different protein-expressing vectors express proteins Different
  • the multi-protein system includes proteins used for protein translation, energy regeneration, and/or enzymes that catalyze the synthesis of compounds.
  • the beneficial effects of the co-production method of the multi-protein system are: by co-transforming the vector expressing the lysoprotein and the vector expressing multiple proteins into the protein expression strain, the obtained co-expression strain can be expressed The corresponding protein and bacteriolytic protein, as the co-expression strain grows, the produced bacteriolytic protein acts on the co-expression strain to cause autonomous lysis, release the expressed protein, and form a multi-protein system.
  • the co-production method of the multi-protein system can realize the co-cultivation of multiple co-expression strains and collect multiple proteins at one time, and does not require the steps of mechanically or non-mechanically disrupted protein expression strains, and is applicable The advantages of wide range, simple steps, high efficiency and low cost.
  • the vector expressing the bacteriolytic protein can be used to express the bacteriolytic protein.
  • the bacteriolytic protein is a type of protein that inhibits the cell wall synthesis of the host cell through different ways, or directly destroys the cell wall of the host cell.
  • the co-expression strain By transferring the vector expressing bacteriolytic protein into the protein expression strain, as the co-expression strain grows, the copy number of the vector expressing bacteriolytic protein increases and the expression of the bacteriolytic protein increases, thereby causing the co-expression strain to undergo autonomous lysis.
  • the plasmid ePop expressing the phage is selected as the vector for expressing the lysoprotein.
  • ePop contains two main modules: a cell autonomous lysis module : This module is based on the gene from phage 4>X174 E protein.
  • Phage (i>X174 contains only 10 genes, and its lysis mechanism is to produce a single E protein, E protein can effectively inhibit peptidoglycan synthase MraY, thereby inhibiting peptides The synthesis of glycans, and E protein can also inhibit the peptidoglycan precursor substance diaminoheptanoic acid from entering the cell wall, thereby causing the lysis of host cells.
  • the other module is the cell density sensor module, which is based on the mutant luxR gene and ColEl-derived genes lacking Rom/Rop protein replication. Therefore, the use of plasmid ePop can achieve programmed autonomous lysis.
  • the gene circuit is one This kind of adjustable circuit can adjust the corresponding module according to the function that needs to be performed.
  • the above example of selecting the plasmid ePop expressing the phage is only one of the examples of this application, even if the gene is not used
  • the circuit, the use of other gene circuits that can make cells produce autonomous lysis or induce lysis; or the technical solutions that can make the protein-expressing strains undergo autonomous lysis when the growth density reaches a higher level should all fall within the protection scope of this application.
  • E. coli strains are selected as protein expression strains.
  • E. coli strains include, but are not limited to, BL21 (DE3), MC4100, MG1655, NISSLE 1917 series of strains, and their mutant strains or derivative strains.
  • a variety of protein expression vectors are used for protein expression. Among them, these protein-expressing vectors do not repeatedly express a protein in the multi-protein system, so the number of types of protein-expressing vectors is different from that of the multi-protein system. The number of types of protein is equal. After multiple protein expression vectors are respectively transferred to the protein expression strain, the protein expression strain can express the corresponding protein.
  • the co-expression strain can be obtained by co-transferring the vector expressing the bacteriolytic protein and the vector expressing the multi-protein system protein into the protein expression strain, and the co-expression strain expresses the bacteriolytic protein and the multi-protein system protein at the same time.
  • the number of types of co-expression strains obtained is equal to the number of types of protein-expressing vectors, and is also equal to the number of types of proteins in the multi-protein system. Therefore, it is understandable that each co-expression strain is not repeated separately. Express a protein in a multi-protein system.
  • each co-expression strain separately expresses a protein in the polyprotein system, and collects all the proteins released by the autonomous cleavage of all co-expression strains to form a polyprotein system.
  • the timing of autonomous lysis of the co-expression strain can be controlled.
  • the vector expressing the bacteriolytic protein is the expression bacteriophage X174
  • the plasmid ePop of the E protein you can set the cell autonomous lysis module in the gene circuit of the ePop, so that when the growth density of the co-expression strain reaches a certain value, the phage (i>X174 E protein plasmid ePop can be set.
  • the copy number will increase significantly, and more lysoproteins will be expressed, which will promote autonomous lysis of co-expressing strains.
  • the OD value can be determined at regular intervals.
  • the growth density of the co-expression strain reaches the autonomous lysis density, that is, 0D600 is greater than or equal to 0.05, the co-expression strain begins to undergo autonomous lysis.
  • each co-expression strain is cultured separately. By culturing each co-expression strain separately, the co-expression strain can be activated to achieve a better state. At this time, glucose is added to the environment where each co-expression strain is cultured separately to inhibit the spontaneous lysis of the strain, so that the strain can reproduce smoothly to a certain density; then the co-expression strain is inoculated into a co-culture system without adding Glucose makes the autonomous lysis circuit open, and autonomous lysis occurs when the co-cultured strains reach the density of autonomous lysis. Specifically, when glucose is added to inhibit autonomous lysis of co-cultured strains, the final mass of glucose in the culture environment (such as in the culture medium) The product concentration is 0.5%-2%.
  • the multi-protein system includes proteins that synthesize in vitro and/or catalyze the synthesis of compounds.
  • a multi-protein system composed of proteins for protein translation and energy regeneration is the key to achieving protein synthesis in vitro.
  • the proteins necessary for energy regeneration include creatine kinase, myokinase, and nucleoside diphosphate kinase. And pyrophosphatase;
  • the multi-enzyme system composed of enzymes that catalyze the synthesis of compounds can realize the efficient synthesis of multiple target compounds, and is currently used in the fields of biology, chemical engineering, and medical treatment.
  • a polyketide synthase system and/or a non-ribosomal polypeptide synthetase system are selected as the target multi-protein system of the multi-protein system co-production method.
  • polyketides are a large class of natural products produced by bacteria, actinomycetes, fungi or plants, including macrolides, tetracyclines, anthracyclines, polyethers and other compounds. Since these natural products have various activities such as anti-infection, anti-fungal, anti-tumor, and immunosuppressive activities, it is of great significance in the medical field to provide a method for efficiently producing a polyketide synthase system.
  • Non-ribosomal peptide synthase is a special type of enzyme that can utilize amino acids and other compounds (such as salicylic acid and pyridine carboxylic acid) without ribosomes, mRNA as a template, and tRNA as a carrier. Etc.) Synthesis of special peptides. Bacteria and fungi can synthesize penicillin, vancomycin, actinomycin D, bacitracin, cyclosporin A, etc. through the non-ribosomal polypeptide synthetase system in vivo. The efficient production of non-ribosomal polypeptide synthetase system will effectively synthesize the above Pharmaceutical compounds provide more convenient conditions.
  • a recombinant element protein synthesis system is selected as the target multi-protein system for the co-production method of the multi-protein system.
  • the recombination element protein synthesis system is also a kind of multi-protein system, which includes a series of proteins that can be used to synthesize the target protein under in vitro conditions. Different from non-ribosomal polypeptide synthetase, in the process of synthesizing the target protein, the protein synthesis system of the recombination element requires the participation of ribosomes and amino acids. At the same time, it also needs to use mRNA as a template and tRNA as a tool for carrying amino acids.
  • the selection when mRNA is used as a template, the selection includes translation initiation factor 1 (translati onal initiation factor 1, IF1), translational initiation factor 2 (translational initiation factor 2, IF2), and fanci Translational initiation factor 3 factor 3, IF3), translational elongation factor G (EF-G), translational elongation factor Tu (EF_Tu), translational elongation factor Ts (EF_Ts), translation elongation factor 4 (translational elongation factor
  • translation release factor 1 translational release factor 1, RF1
  • translation release factor 2 translation release factor
  • 22 kinds of aminoacyl-tRNA synthetase specifically include: methionyl-tRNA synthetase (Met-tRNA-synthetase), threonyl-tRNA-synthetase (Thr-tRNA-synthetase)
  • Glu-tRNA-synthetase Ala-tRNA-synthetase, Aspartyl-tRNA-synthetase, Asparagus Asn-tRNA-synthetase, Cys-tRNA-s ynthetase, Pro-tRNA-synthetase, Tyrosyl- tRNA synthetase (Tyr-tRNA-synthetase), glutaminyl-tRNA synthetase (Gln-tRNA-syntheta se), histidyl-tRNA synthetase (His-tRNA-synthetase), glycyl-tRNA synthetase A (G ly-tRNA-synthetase -A), Gan aminoacyl -tRNA synthetase B (Gly-tRNA-synthetase
  • the present application provides a multi-protein system co-production system in some embodiments, which includes:
  • the co-expression strain preparation unit is used to prepare a variety of co-expression strains, each co-expression strain expresses one protein and bacteriolytic protein in the multi-protein system, and different co-expression strains express different proteins;
  • cell culture unit for culturing co-expression strains in the co-expression strain unit
  • the multi-protein system includes proteins used for protein translation, energy regeneration, and/or enzymes that catalyze the synthesis of compounds.
  • the multi-protein system co-production system includes a co-expression strain preparation unit and a cell culture unit, wherein the co-expression strain preparation unit prepares multiple co-production systems Expression strains, since each co-expression strain does not repeatedly express a protein and lysoprotein in the multi-protein system, therefore, when multiple co-expression strains are co-cultured in the cell culture unit, the lysoprotein will cause the co-expression strain to undergo autonomous lysis ,Release a variety of proteins and realize the co-production of multi-protein systems.
  • the co-production system of the multi-protein system realizes autonomous lysis by editing strains, simplifies the subsequent protein purification steps, and maintains the stability of the flora during the co-cultivation process (avoid some co-expression strains that rob all of them because they grow too fast and are not inhibited. Resources), a variety of proteins can be obtained at one time, with the advantages of easy control of culture conditions, high production efficiency, and low cost.
  • each co-expression strain does not repeatedly express one protein and bacteriolytic protein in the multi-protein system.
  • multiple expression proteins can be constructed first, and each protein expression vector does not repeatedly express one protein in the above-mentioned multi-protein system; by co-transforming these expression vectors and the vectors expressing lysoproteins.
  • the vector expressing lysoprotein can specifically select the plasmid ePop expressing phage 4) X174 E protein.
  • This plasmid also has the function of sensing cell density on the basis of expressing E protein.
  • the co-expressing strain can further promote The copy number of the plasmid increases, which in turn promotes the expression of E protein.
  • the co-expression can also be adjusted The effect of the degree of spontaneous lysis of the strain.
  • a polyketide synthase system and/or a non-ribosomal polypeptide synthetase system are selected as the target polyprotein system of the co-production system. By synthesizing these two polyprotein systems, it is helpful to realize the efficient synthesis of a variety of pharmaceutical compounds.
  • the recombinant element protein synthesis system is selected as the target multi-protein system of the co-production system. By synthesizing recombination element proteins, it helps to achieve efficient synthesis of target proteins in vitro.
  • translation initiation factor 1 when mRNA is used as a template, translation initiation factor 1, translation initiation factor 2, translation initiation factor 3, translation elongation factor G, translation elongation factor Tu, translation elongation factor Ts, Translation elongation factor 4, translation release factor 1, translation release factor 2, translation release factor 3, ribosomal cycle factor, methionyl-tRNA formyl transferase, creatine kinase, myokinase, nucleoside diphosphate kinase, pyrophosphate
  • the combination of enzyme and 22 kinds of aminoacyl-tRNA synthetase is the target multi-protein system of the co-production system of multi-protein system. Through the co-production and synthesis of the above-mentioned protein, the in vitro synthesis of the target protein can be quickly and efficiently achieved.
  • the DNA encoding the target protein when used as a template, it is also necessary to add 17 RNA polymerase to the above-mentioned polyprotein system; when the target protein is some protein that is difficult to synthesize in vitro, it is The addition of disulfide bond isomerase, molecular chaperone proteins, etc. to the multi-protein system can help improve the in vitro synthesis efficiency of such target proteins.
  • the conditions for co-cultivating co-expression strains in the cell culture unit involve various aspects such as culture medium, culture temperature, culture humidity, culture time, auxiliary additives, light conditions and so on.
  • the method of co-cultivating co-expression strains in a cell culture unit is as follows: first pick a single clone of each co-expression strain in an LB medium containing dual resistance to kanamycin and chloramphenicol, And add glucose with a final mass and volume concentration of 2% to inhibit cell lysis, culture at 37° C, 220rpm for 14h-18h, then inoculate and transfer to M9 medium with dual resistance to kanamycin and chloramphenicol After co-cultivation at 37 ° C and 220 rpm for 5-6 hours, IPTG with a final concentration of 0.1 mM was added to induce 3-5 hours. Centrifuge the co-culture, collect the supernatant, and purify to obtain a multi-protein system.
  • glucose is added before co-cultivation of the co-expression strains in the cell culture unit to inhibit autonomous lysis of the co-cultured strains; glucose is not added during the expansion of the culture, so that the autonomous lysis circuit is opened, At this time, when the co-cultured strains reach the density of autonomous lysis, autonomous lysis will occur.
  • the glucose is in a culture environment (For example, in the culture medium), the final mass volume concentration is 0.5%-2%.
  • the co-production system of the multi-protein system may also include a protein purification unit for purifying the multi-protein system released and collected after the co-expression strain is lysed autonomously to remove excess cell debris and impurities protein.
  • the purification method can use common protein purification methods in the art, for example, recombinant protein purification tags such as His tags can be fused during the construction of protein expression vectors to make the subsequent protein purification process faster and more convenient.
  • the His tag is a commonly used tag for protein purification.
  • the protein purification method in the embodiments of the present application can also use any tag suitable for protein purification other than the His tag.
  • the present application provides in some embodiments the application of a multi-protein system co-production system in the synthesis of proteins and/or compounds in vitro.
  • the beneficial effects of the application of the multi-protein system co-production system in the in vitro synthesis of proteins and/or compounds are:
  • the protein and/or compound necessary for synthesizing proteins and/or compounds in vitro can be collected in one step, and the synthesis of proteins and/or compounds can be performed in vitro without relying on intact cells.
  • the co-production system of the multi-protein system is simpler, faster, more efficient and lower in cost.
  • step (3) The 39 mixed proteins obtained in step (3) were dialyzed with a 3.5kDa dialysis bag. After the dialyzed protein was concentrated, ribosomes, energy buffer and a DNA linear template expressing the red fluorescent protein mRFP were added Then, react in a metal bath at 37°C for 4 hours. After the reaction is completed, the reaction system is transferred to Corning Fluorescence Detection 384-well plate, and the fluorescence signal is detected by a microplate reader.
  • the energy buffer consists of potassium L-glutamate, a mixture of 20 amino acids, HEPES-KOH buffer, spermidine, magnesium acetate, creatine phosphate, dithiothreitol, formyl folate, NTPs, IPTG, tRNA , RNase inhibitor, and sterile water.
  • the reaction system was transferred to the Corning Fluorescence Detection 384-well plate and detected by a microplate reader.
  • the fluorescence signal was detected as shown in Table 1: (mRFP excitation: 580nm, emission: 610nm) According to the linear relationship between the fluorescence signal and the content of mRFP, It can be calculated that the in vitro synthesis system can synthesize mRFP protein 1.4ng/ ⁇ L after reacting at 37°C for 4 hours.

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Abstract

提供了多蛋白体系的共生产方法、多蛋白体系的共生产***及应用。具体是，通过将表达溶菌蛋白的载体和多种表达蛋白的载体共转入到蛋白表达菌株中，使所得共表达菌株表达相应的蛋白及溶菌蛋白，随着共表达菌株的生长，产生的溶菌蛋白作用于共表达菌株，使其发生自主裂解，释放出其表达的蛋白，形成多蛋白体系，可用于体外合成蛋白质和/或化合物。

Description

多 蛋 白体 系的 共生 产方 法 、 多蛋白 体系 的共 生产 系 统及 应 用 技术领域
[0001] 本申请涉及蛋白体外合成技术领域， 具体涉及一种多蛋白体系的共生产方法、 多蛋白体系的共生产***及应用。 背景技术
[0002] 细胞是生命活动的基本结构和功能单位， 同时也为生化反应提供了场所， 有着 “细胞工厂” 之称。 但是， 细胞内生化反应网络复杂， 人为地改造容易对细胞 产生不利或不可预测的影响， 最终导致细胞活性降低甚至功能丧失， 极大程度 上限制了细胞工厂的应用。 因此， 如何突破细胞工厂的局限是生物合成所面临 的巨大挑战。 针对细胞工厂的局限， 无细胞蛋白合成*** (cell-free protein synthesis, CFPS)提供了很好的解决途径。 无细胞蛋白合成***是不依赖于完 整的细胞在体外进行蛋白质合成的生物学技术， 它以 DNA或 mRNA为模板， 利用细 胞提取物中的蛋白合成元件、 蛋白折叠因子及其他相关酶系， 通过添加氨基酸 、 tRNA和能量物质等， 在体外完成蛋白质合成， 模拟生物细胞的生命现象， 重 现胞内蛋白转录翻译过程， 产生的蛋白可用于蛋白质功能检测、 结构分析等下 游实验。 与活细胞体系相比， 模块化的无细胞蛋白质合成***反应成分明确简 单， 组分易操控， 实验周期短， 为众多生化实验提供了一个开放通用的反应环 境。
[0003] 无细胞蛋白质合成***目前主要分为两种类型： 一种是直接来源于细胞裂解物 (WCE: whole-cell extracts)， 另一种则只含有 DNA转录、 蛋白质翻译和能量再 生的必需成分， 即重组元件蛋白质合成*** PURE (protein synthesis using recombinant elements) 。 不同于 WCE***， F*URE***所有添加物完全已知并浓 度可控， 因而具有多种显著优势： 例如低降解酶环境使得 mRNA或蛋白质的稳定 性得到了极大提高； 通过操纵***中的蛋白或底物组分， 可以便捷的对要合成 的蛋白质进行设计 (如非天然氨基酸的***等) ， 使得***高度模块化并具有 灵活性等。
[0004] 虽然 HJRE自 2002年已经商业化， 但其昂贵价格限制了在绝大部分实验室的应用 。 通过传统的方法制备 PURE***， 需要分别表达并纯化 30多种与转录、 翻译和 能量重生有关的蛋白， 工作量大， 消耗时间长， 制备成本高， 一般实验室无法 自行制备。 目前以 NEB (New England Biolab) 为代表的大型生物制剂公司仍是 采用该种方法生产 PURE***。 发明概 述 技术问题
[0005] 本申请实施例的目的之一在于： 提供一种多蛋白体系的共生产方法、 多蛋白体 系的共生产***及应用， 旨在解决现有 PURE***合成中存在的工作量大、 耗时 长、 成本高等问题。 问题的解 决方案 技术解决方案
[0006] 为解决上述技术问题， 本申请实施例采用的技术方案是：
[0007] 第一方面， 提供了多蛋白体系的共生产方法， 其包括如下步骤：
[0008] 提供表达溶菌蛋白的载体、 多种表达蛋白的载体及蛋白表达菌株， 每种表达蛋 白的载体分别表达多蛋白体系中的一种蛋白， 且不同的表达蛋白的载体表达的 蛋白各不相同；
[0009] 将表达溶菌蛋白的载体与每种表达蛋白的载体分别共转入到蛋白表达菌株中， 得到多种共表达菌株；
[0010] 将全部的共表达菌株进行共培养， 当共表达菌株的生长密度达到自主裂解密度 时发生自主裂解， 释放出各自表达的蛋白， 得到多蛋白体系；
[0011] 其中， 多蛋白体系包括用于蛋白质翻译、 能量再生的蛋白质和 /或催化合成化 合物的酶。
[0012] 第二方面， 提供了多蛋白体系的共生产***， 其包括：
[0013] 共表达菌株制备单元： 用于制备多种共表达菌株， 每种共表达菌株分别表达多 蛋白体系中的一种蛋白以及溶菌蛋白， 且不同的共表达菌株表达的蛋白各不相 同； [0014] 细胞培养单元： 用于培养共表达菌株单元中的共表达菌株；
[0015] 其中， 多蛋白体系包括用于蛋白质翻译、 能量再生的蛋白质和 /或催化合成化 合物的酶。
[0016] 第三方面， 提供了多蛋白体系的共生产***在体外合成蛋白质和 /或化合物中 的应用。 发明的 有益效果 有益效果
[0017] 本申请实施例提供的多蛋白体系的共生产方法的有益效果在于： 通过将表达溶 菌蛋白的载体和多种表达蛋白的载体共转入到蛋白表达菌株中， 使所得共表达 菌株表达相应的蛋白及溶菌蛋白， 随着共表达菌株的生长， 产生的溶菌蛋白作 用于共表达菌株， 使其发生自主裂解， 释放出其表达的蛋白， 形成多蛋白体系 。 本申请实施例提供的多蛋白体系的共生产方法可以实现多种共表达菌株的共 同培养并一次性收集获得多种蛋白， 且无需对蛋白表达菌株进行机械破碎或非 机械破碎的步骤， 具有适用范围广、 步骤简单、 效率高、 成本低的优点。
[0018] 本申请实施例提供的多蛋白体系的共生产***的有益效果在于： 多蛋白体系的 共生产***包括共表达菌株制备单元和细胞培养单元。 其中， 共表达菌株制备 单元制备多种共表达菌株， 由于每种共表达菌株不重复地表达多蛋白体系中的 一种蛋白及溶菌蛋白， 因此， 多种共表达菌株在细胞培养单元中共培养时， 溶 菌蛋白会致使共表达菌株发生自主裂解， 有利于共表达体系内的菌株共存的稳 定性 （避免部分共表达菌株因为生长过快且不受抑制而抢夺全部资源） ， 同时 ， 通过自主裂解会释放出多蛋白体系中的各种蛋白， 从而实现多蛋白体系的共 生产。 本申请实施例提供的多蛋白体系的共生产***可以一次性得到多种蛋白 ， 具有培养条件易于控制、 生产效率高、 成本低的优点。
[0019] 本申请实施例提供的多蛋白体系的共生产***在体外合成蛋白质和 /或化合物 中的应用的有益效果在于： 多蛋白体系的共生产***通过将多种共表达菌株进 行共培养步骤即可收集得到用于体外合成蛋白质和 /或化合物所必需的蛋白， 可 以不依赖于完整的细胞、 在体外进行蛋白质和 /或化合物的合成。 与现有制备无 细胞蛋白合成***的方法相比， 本申请实施例提供的多蛋白体系的共生产*** 更加简便、 快速、 高效、 成本更低。 对附图 的简要说 明 附图说明
[0020] 图 1为本申请其中一个实施例提供的多蛋白体系的共生产方法的工作流程示意 图；
[0021] 图 2为本申请提供的具体实施例中， 合成红色荧光蛋白 mRFP在 580nm激发、 610n m发射时的含量和荧光信号标准曲线；
[0022] 图 3为本申请提供的具体实施例中， 对合成红色荧光蛋白 mRFP的实时荧光信号 监测结果。 发明实施 例 本发明的实施方 式
[0023] 为了使本申请的目的、 技术方案及优点更加清楚明白， 以下实施例， 对本申请 进行进一步详细说明。 应当理解， 此处所描述的具体实施例仅用以解释本申请 ， 并不用于限定本申请。 结合本申请中的实施例， 本领域普通技术人员在没有 做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例， 都属于本申请保护的范围。 实施例中未注明具体条件者， 按照常规条件或制造商建议的条件进行； 所用试 剂或仪器未注明生产厂商者， 均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0024] 在本申请的描述中， 需要理解的是， 本申请实施例中所提到的相关成分的重量 不仅仅可以指代各组分的具体含量， 也可以表示各组分间重量的比例关系， 因 此， 只要是按照本申请实施例相关组分的含量按比例放大或缩小均在本申请公 开的范围之内。 具体地， 本申请实施例中所述的重量可以是 y g、 mg、 g、 kg等 化工领域公知的质量单位。
[0025] 另外， 除非上下文另外明确地使用， 否则词的单数形式的表达应被理解为包含 该词的复数形式。 术语 “包括”或 “具有” 旨在指定特征、 数量、 步骤、 操作 、 元件、 部分或者其组合的存在， 但不用于排除存在或可能添加一个或多个其 它特征、 数量、 步骤、 操作、 元件、 部分或者其组合。
[0026] 在本申请的描述中， 术语 “和 /或”视为具有或不具有另一个的两个指定特征 或组分中的每一个的具体公开。 因此， 如在本文中的短语例如 “A和 /或 B” 中所 使用的术语“和 /或” 旨在包括 A和 B; A或 B; A（单独）； 和 B（单独）。 同样地， 如 在短语例如 “A、 B和 /或 C” 中所使用的术语 “和 /或” 旨在涵盖以下方面的每一 个： A、 B和 C; A、 BSC; A或 C; A或 B; B或 C; A和 C; A和 B; B和 C; A（单独）； B（ 单独）； 和 C（单独）。
[0027] 除非本申请另有定义， 否则本申请内容中使用的术语应具有本领域普通技术人 员通常理解的含义。 例如， 本申请实施例中的细胞与组织培养、 分子生物学、 免疫学、 微生物学、 遗传学以及蛋白质和核酸有关的任何术语和技术都是本领 域众所周知的和常用的。 在任何潜在歧义的情况下， 本申请提供的定义优先于 任何词典或外部定义。
[0028] 在本申请的描述中， 术语 “载体”包括质粒、 噬菌体、 病毒或其它载体。
[0029] 为了说明本申请所述的技术方案， 以下结合具体实施例进行详细说明。
[0030] 本申请实施例提供一种多蛋白体系的共生产方法， 其包括如下步骤：
[0031] S1、 提供表达溶菌蛋白的载体、 多种表达蛋白的载体及蛋白表达菌株， 每种表 达蛋白的载体分别表达多蛋白体系中的一种蛋白， 且不同的表达蛋白的载体表 达的蛋白各不相同；
[0032] S2、 将表达溶菌蛋白的载体与每种表达蛋白的载体分别共转入到蛋白表达菌株 中， 得到多种共表达菌株；
[0033] S3、 将全部的共表达菌株进行共培养， 当共表达菌株的生长密度达到自主裂解 密度时发生自主裂解， 释放出各自表达的蛋白， 得到多蛋白体系；
[0034] 其中， 多蛋白体系包括用于蛋白质翻译、 能量再生的蛋白质和 /或催化合成化 合物的酶。
[0035] 本申请实施例提供的多蛋白体系的共生产方法的有益效果在于： 通过将表达溶 菌蛋白的载体和多种表达蛋白的载体共转入到蛋白表达菌株中， 使所得共表达 菌株表达相应的蛋白及溶菌蛋白， 随着共表达菌株的生长， 产生的溶菌蛋白作 用于共表达菌株， 使其发生自主裂解， 释放出其表达的蛋白， 形成多蛋白体系 。 本申请实施例提供的多蛋白体系的共生产方法可以实现多种共表达菌株的共 同培养并一次性收集获得多种蛋白， 且无需对蛋白表达菌株进行机械破碎或者 非机械破碎的步骤， 具有适用范围广、 步骤简单、 效率高、 成本低的优点。 [0036] 具体的， S1中， 表达溶菌蛋白的载体可用于表达溶菌蛋白。 溶菌蛋白是一类通 过不同途径抑制宿主细胞的细胞壁合成， 或直接破坏宿主细胞的细胞壁的蛋白 质。 通过将表达溶菌蛋白的载体转入蛋白表达菌株中， 随着共表达菌株的生长 ， 导致表达溶菌蛋白的载体拷贝数增加以及溶菌蛋白表达的升高， 进而使共表 达菌株发生自主裂解。
[0037] 在一些实施例中， 选择表达噬菌体（i> X174 E蛋白的质粒 ePop作为表达溶菌蛋白 的载体。 ePop作为一种工程化的基因线路， 其中含有两个主要模块： 一个细胞 自主裂解模块： 该模块基于来自噬菌体 4> X174 E蛋白的基因。 噬菌体（i> X174只 含有 10个基因， 其溶菌机制是产生单一的 E蛋白， E蛋白可以有效抑制肽聚糖合 成酶 MraY， 从而抑制肽聚糖的合成， 并且， E蛋白还可以抑制肽聚糖前体物质二 氨基庚酸进入细胞壁， 进而引起宿主细胞的溶解。 另一模块是细胞密度传感模 块， 该模块基于突变的 luxR基因和 ColEl来源的、 缺少 Rom/Rop蛋白复制的基因 。 因此， 使用质粒 ePop可以实现编程自主裂解， 通过将基因线路配置为与 E蛋白 表达偶联的细胞密度依赖性线路， 当蛋白表达菌株在培养繁殖中达到一定密度 时， 表达噬菌体（i> X174 E蛋白的质粒 ePop拷贝数会增加， 此时 E蛋白的表达也更 高， 进而导致共表达菌株发生自主裂解。 需要说明的是， 基因线路是一种可以 调节的线路， 可根据需要执行的功能调节相应的模块， 因此上述选择表达噬菌 体（i> X174 E蛋白的质粒 ePop的实施例仅为本申请实施例的其中一个选择， 即使 不使用该基因线路， 利用其他可使细胞产生自主裂解或诱导裂解的基因线路； 或者可以使蛋白表达菌株在生长密度达到较高时发生自主裂解的技术方案都应 属于本申请的保护范围。
[0038] 蛋白表达菌株在本申请实施例中用于共表达溶菌蛋白和多蛋白体系中的蛋白， 因此， 原则上适合共表达溶菌蛋白和其它蛋白表达菌株均适用于本申请。 在一 些实施例中， 为了实现蛋白的稳定生产， 选择大肠杆菌菌株作为蛋白表达菌株 。 具体地， 大肠杆菌菌株包括但不限于 BL21 （DE3） 、 MC4100、 MG1655、 NISSLE 1917系列的菌株、 它们的突变菌株或衍生菌株。
[0039] 多种表达蛋白的载体用于表达蛋白。 其中， 这些表达蛋白的载体分别不重复地 表达多蛋白体系中的一种蛋白， 因此表达蛋白的载体的种类数量与多蛋白体系 中蛋白的种类数量相等。 将多种表达蛋白的载体分别转入蛋白表达菌株后， 可 使蛋白表达菌株表达相应的蛋白。
[0040] S2中， 通过将表达溶菌蛋白的载体与表达多蛋白体系蛋白的载体共转入到蛋白 表达菌株中， 可以得到共表达菌株， 该共表达菌株同时表达溶菌蛋白和多蛋白 体系蛋白。 在该步骤中， 所得共表达菌株的种类数量与表达蛋白的载体的种类 数量相等， 也与多蛋白体系中蛋白的种类数量相等， 因此， 可以理解的是， 每 种共表达菌株也分别不重复地表达多蛋白体系中的一种蛋白。
[0041] S3中， 通过将 S2得到的所有共表达菌株进行共培养， 当菌株生长到相当的密度 时， 其表达的溶菌蛋白的浓度达到破坏共表达菌株的细胞壁的浓度时， 共表达 菌株发生自主裂解， 将其表达的蛋白释放出来。 其中， 每种共表达菌株分别表 达多蛋白体系中的一种蛋白， 将所有共表达菌株发生自主裂解而释放的蛋白收 集起来， 即组成多蛋白体系。
[0042] 在一些实施例中， 可以对共表达菌株发生自主裂解的时机进行控制。 具体地， 当表达溶菌蛋白的载体为表达噬菌体 X174
E蛋白的质粒 ePop时， 可通过对 ePop的基因线路中关于细胞自主裂解模块进行设 置， 使其在共表达菌株的生长密度达到某个数值时， 表达噬菌体（i> X174 E蛋白 的质粒 ePop的拷贝数会显著增加， 进而表达更多的溶菌蛋白， 促进共表达菌株 发生自主裂解。
[0043] 在一些实施例中， 在共表达菌株培养过程中， 可每隔一段时间对其进行 0D值的 测定。 当共表达菌株的生长密度达到自主裂解密度， 即 0D600大于等于 0. 05时， 共表达菌株开始发生自主裂解。
[0044] 在一些实施例中， 将多种共表达菌株进行共培养之前， 先将每种共表达菌株进 行单独培养。 通过将每种共表达菌株单独培养， 可以活化共表达菌株， 使其达 到较佳状态。 此时， 在每种共表达菌株单独培养的环境中加入葡萄糖， 以用于 抑制菌株发生自主裂解， 从而使菌株可以顺利繁殖到一定的密度； 然后将共表 达菌株接种成为共培养体系， 不加入葡萄糖， 使自主裂解线路打开， 此时共培 养菌株达到自主裂解的密度时即发生自主裂解。 具体地， 加入葡萄糖用于抑制 共培养菌株发生自主裂解时， 葡萄糖在培养环境下 （如培养基中） 的终质量体 积浓度为 0. 5%-2%。
[0045] 多蛋白体系可以有很多种， 其是各代谢途径中所包括的一系列具有催化功能的 蛋白的总称。 在本申请实施例中， 多蛋白体系包括蛋白质体外合成和 /或催化合 成化合物的蛋白。 其中， 用于蛋白质翻译和能量再生的蛋白质组成的多蛋白体 系是实现体外合成蛋白质的关键， 在本申请实施例中， 能量再生所必需的蛋白 包括肌酸激酶、 肌激酶、 二磷酸核苷激酶和焦磷酸酶； 催化合成化合物的酶组 成的多酶体系可以实现多种目标化合物的高效合成， 目前在生物、 化工、 医疗 等领域均有应用。
[0046] 在一些实施例中， 选择聚酮化合物合成酶体系和 /或非核糖体多肽合成酶体系 作为多蛋白体系共生产方法的目标多蛋白体系。 其中， 聚酮化合物是由细菌、 放线菌、 真菌或植物产生的一大类天然产物， 包括大环内酯类、 四环素类、 蒽 环类、 聚醚类等化合物。 由于这些天然产物具有抗感染、 抗真菌、 抗肿瘤、 免 疫抑制等多种活性， 因此提供可高效生产聚酮化合物合成酶体系的方法在医疗 领域具有重要意义。 催化合成聚酮化合物的酶即为聚酮化合物合成酶 (polyket idesynthase, PKS) ， 具体包括 PKS I、 PKS II、 PKS III。 非核糖体多肽合成 酶是一类特殊的酶， 其可以在没有核糖体、 不以 mRNA为模板、 也不需 tRNA为携 带工具的情况下， 利用氨基酸及其它化合物 (如水杨酸、 吡啶羧酸等) 合成特 殊多肽。 细菌和真菌体内通过非核糖体多肽合成酶体系可合成青霉素、 万古霉 素、 放线菌素 D、 杆菌肽、 环孢菌素 A等， 高效生产非核糖体多肽合成酶体系将 为高效合成上述药物化合物提供更便利的条件。
[0047] 在一些实施例中， 选择以重组元件蛋白质合成体系作为多蛋白体系共生产方法 的目标多蛋白体系。 重组元件蛋白质合成体系也是多蛋白体系中的一种， 其包 括的一系列蛋白可以在体外条件下用于合成目的蛋白。 与非核糖体多肽合成酶 不同的是， 在合成目的蛋白过程中， 重组元件蛋白质合成体系需要核糖体和氨 基酸的参与， 同时还需要以 mRNA作为模板， 以 tRNA作为携带氨基酸的工具。
[0048] 在一些实施例中， 当以 mRNA作为模板时， 选择包括翻译起始因子 1 (translati onal initiation factorl, IF1 ) 、 番西译起始因子 2 (translational initiation factor 2， IF2) 、 番西译起始因子 3 (translational initiation factor 3， IF3) 、 翻译延伸因子 G (translational elongation factor G， EF-G) 、 翻译延伸因子 Tu (translational elongation factor Tu， EF_Tu ) 、 翻译延伸因子 Ts (translational elongation factor Ts， EF_Ts) 、 翻译 延伸因子 4 (translational elongation factor
4， EF-4) 、 翻译释放因子 1 (translational release factor 1， RF1) 、 翻译 释放因子 2 (translational release factor
2， RF2) 、 翻译释放因子 3 (translational release factor 3， RF3) 、 核糖 体循环因子 (ribosome recycling factor， RRF) 、 甲硫氨酰 -tRNA甲酰转移酶 (Met-tRNA formyl transferase) > 肌酸激酶 (creatine kinase， CK) 、 肌激 酶 (myokinase) 和二磷酸核苷激酶 (diphosphonucleotide kinase， NDK) 、 焦磷酸酶 (Pyrophosphatase) 和 22种氨酰 -tRNA合成酶作为重组元件蛋白质体 系的组合， 通过多蛋白体系的共生产方法进行生产得到， 可以快速高效实现目 标蛋白的体外合成。 其中， 22种氨酰 -tRNA合成酶具体包括： 甲硫氨酰 -tRNA合 成酶 (Met-tRNA-synthetase) 、 苏氨酰 -tRNA合成酶 (Thr-tRNA-synthetase)
、 谷氨酰 -tRNA合成酶 (Glu-tRNA-synthetase) 、 丙氨酰 -tRNA合成酶 (Ala-tR NA-synthetase) 、 天冬氨酰 -tRNA合成酶 (Asp-tRNA-synthetase) 、 天冬酰胺 酰 -tRNA合成酶 (Asn-tRNA-synthetase) 、 半脱氨酰 -tRNA合成酶 (Cys-tRNA-s ynthetase) 、 膳氨酰 -tRNA合成酶 (Pro-tRNA-synthetase) 、 酪氨酰 -tRNA合 成酶 (Tyr-tRNA-synthetase) 、 谷氨酰胺酰 -tRNA合成酶 (Gln-tRNA-syntheta se) 、 组氨酰 -tRNA合成酶 (His-tRNA-synthetase) 、 甘氨酰 -tRNA合成酶 A (G ly-tRNA-synthetase-A) 、 甘氨酰 -tRNA合成酶 B (Gly-tRNA-synthetase-B) 、 缴氨酰 _tRNA合成酶 (Val-tRNA-synthetase) 、 赖氨酰 -tRNA合成酶 (Lys-tRNA -synthetase) 、 亮氨酰 -tRNA合成酶 (Leu-tRNA-synthetase) 、 色氨酰 -tRNA 合成酶 (Trp-tRNA-synthetase) 、 苯丙氨酰 -tRNA合成酶 B (Phe-tRNA-B synthetase) 、 丝氨酰 -tRNA合成酶 (Ser-tRNA-synthetase) 、 苯丙氨酰 -tRNA 合成酶 A (Phe-tRNA- A synthetase) 、 精氨酰 -tRNA合成酶 (Arg-tRNA synthetase) 、 异亮氨酰 -tRNA合成酶 ( Ile-tRNA synthetase) D [0049] 在一些实施例中， 当以编码目的蛋白的 DNA作为模板时， 还需在上述多蛋白体 系中添加 17 RNA聚合酶； 当目的蛋白是一些体外较难合成的蛋白时， 通过在上 述多蛋白体系中添加二硫键异构酶和 /或分子伴侣蛋白， 有助于提升这类目的蛋 白的体外合成效率。
[0050] 第二方面， 本申请在一些实施例中提供了多蛋白体系的共生产***， 其包括：
[0051] 共表达菌株制备单元， 用于制备多种共表达菌株， 每种共表达菌株分别表达多 蛋白体系中的一种蛋白以及溶菌蛋白， 且不同的共表达菌株表达的蛋白各不相 同；
[0052] 细胞培养单元， 用于培养共表达菌株单元中的共表达菌株；
[0053] 其中， 多蛋白体系包括用于蛋白质翻译、 能量再生的蛋白质和 /或催化合成化 合物的酶。
[0054] 本申请实施例提供的多蛋白体系的共生产***的有益效果在于： 多蛋白体系的 共生产***包括共表达菌株制备单元和细胞培养单元， 其中， 共表达菌株制备 单元制备多种共表达菌株， 由于每种共表达菌株不重复地表达多蛋白体系中的 一种蛋白及溶菌蛋白， 因此， 多种共表达菌株在细胞培养单元中共培养时， 溶 菌蛋白会致使共表达菌株发生自主裂解， 释放出多种蛋白， 实现多蛋白体系的 共生产。 多蛋白体系的共生产***通过编辑菌株实现自主裂解， 简化后续的蛋 白纯化步骤， 并且在共培养过程中维持菌群的稳定性 （避免部分共表达菌株因 为生长过快且不受抑制而抢夺全部资源） ， 可以一次性得到多种蛋白， 具有培 养条件易于控制、 生产效率高、 成本低的优点。
[0055] 共表达菌株制备单元中有多种共表达菌株， 且每种共表达菌株不重复地表达多 蛋白体系中的一种蛋白以及溶菌蛋白。 在一些实施例中， 可以先构建多种表达 蛋白的载体， 每种表达蛋白的载体不重复地表达上述多蛋白体系中的一种蛋白 ; 通过将这些表达载体与表达溶菌蛋白的载体分别共转入到蛋白表达菌株中， 从而得到多种共表达菌株， 每种共表达菌株不重复地表达多蛋白体系中的一种 蛋白以及溶菌蛋白。 表达溶菌蛋白的载体具体可以选择表达噬菌体 4）X174 E蛋 白的质粒 ePop， 该质粒在表达 E蛋白的基础上， 还具有感应细胞密度功能， 当共 表达菌株的生长达到一定密度时， 可以进一步促进该质粒的拷贝数增加， 进而 促进 E蛋白的表达。 同时， 通过加入不同浓度的葡萄糖， 还可以实现调节共表达 菌株自主裂解程度的效果。
[0056] 在一些实施例中， 选择聚酮化合物合成酶体系和 /或非核糖体多肽合成酶体系 作为共生产***的目标多蛋白体系。 通过合成这两种多蛋白体系， 有助于实现 多种药物化合物的高效合成。
[0057] 在一些实施例中， 选择重组元件蛋白质合成体系作为共生产***的目标多蛋白 体系。 通过合成重组元件蛋白质， 有助于实现目标蛋白质的体外高效合成。
[0058] 在一些实施例中， 当以 mRNA作为模板时， 选择翻译起始因子 1、 翻译起始因子 2 、 翻译起始因子 3、 翻译延伸因子 G、 翻译延伸因子 Tu、 翻译延伸因子 Ts、 翻译 延伸因子 4、 翻译释放因子 1、 翻译释放因子 2、 翻译释放因子 3、 核糖体循环因 子、 甲硫氨酰 -tRNA甲酰转移酶、 肌酸激酶、 肌激酶、 二磷酸核苷激酶、 焦磷酸 酶和 22种氨酰 -tRNA合成酶组合作为多蛋白体系的共生产***的目标多蛋白体系 。 通过共生产合成上述蛋白， 可以快速高效实现目标蛋白的体外合成。
[0059] 在一些实施例中， 当以编码目的蛋白的 DNA作为模板时， 还需在上述多蛋白体 系中添加 17 RNA聚合酶； 当目的蛋白是一些体外较难合成的蛋白时， 通过在上 述多蛋白体系中添加二硫键异构酶、 分子伴侣蛋白等， 有助于提升这类目的蛋 白的体外合成效率。
[0060] 在细胞培养单元中对共表达菌株进行共培养的条件涉及培养基、 培养温度、 培 养湿度、 培养时间、 辅助添加物、 光照条件等多方面。 在一些实施例中， 在细 胞培养单元中对共表达菌株进行共培养方法为： 先挑取每种共表达菌株的单克 隆在含有卡那霉素和氯霉素双抗性的 LB培养基， 并加入终质量体积浓度为 2%的 葡萄糖抑制细胞裂解， 在 37°C、 220rpm条件下培养 14h-18h， 然后再接种转入具 有卡那霉素和氯霉素双抗性的 M9培养基中， 在 37°C、 220rpm条件下共培养 5-6小 时后加入终浓度为 0. ImM的 IPTG诱导 3-5小时。 将共培养物离心、 收集上清， 纯 化得到多蛋白体系。
[0061] 在一些实施例中， 在细胞培养单元中对共表达菌株进行共培养之前事先加入葡 萄糖用于抑制共培养菌株发生自主裂解； 在扩大培养时则不加入葡萄糖， 使自 主裂解线路打开， 此时共培养菌株达到自主裂解的密度时即发生自主裂解。 具 体地， 加入葡萄糖用于抑制共培养菌株发生自主裂解时， 葡萄糖在培养环境下 (如培养基中) 的终质量体积浓度为 0. 5%-2%。
[0062] 在一些实施例中， 多蛋白体系的共生产***还可以包括蛋白纯化单元， 用于将 共表达菌株发生自主裂解后释放并收集的多蛋白体系进行纯化， 去除多余的细 胞碎片和杂质蛋白。 纯化的方法可以采用本领域的常用蛋白纯化方法， 如可以 在表达蛋白的载体构建时融合重组蛋白纯化标签如 His标签， 使后续的蛋白纯化 过程更加快速方便。 His标签作为金属螯合亲和层析的纯化标签， 是蛋白纯化的 常用标签， 本申请实施例的蛋白纯化方法也可以采用 His标签以外的任何适用于 蛋白纯化的标签。
[0063] 第三方面， 本申请在一些实施例中提供了多蛋白体系的共生产***在体外合成 蛋白质和 /或化合物中的应用。
[0064] 本申请实施例提供的多蛋白体系的共生产***在体外合成蛋白质和 /或化合物 中的应用的有益效果在于： 多蛋白体系的共生产***通过将多种共表达菌株进 行共培养步骤即可一步收集得到用于体外合成蛋白质和 /或化合物所必需的蛋白 ， 可以不依赖于完整的细胞、 在体外进行蛋白质和 /或化合物的合成。 与现有无 细胞蛋白合成***制备方法相比， 多蛋白体系的共生产***更加简便、 快速、 高效、 成本更低。
[0065] 下面结合具体实施例进行说明。
[0066] 实施例 1
[0067] ( 1 ) 将 39种融合了 His标签的表达蛋白的质粒分别与表达噬菌体 i> X174 E蛋白 的质粒 ePop共同转化进入蛋白表达菌株 BL21 (DE3) 中， 得到 39种共表达菌株； 其中， 39种表达蛋白的质粒依次单独表达翻译起始因子 1、 翻译起始因子 2、 翻 译起始因子 3、 翻译延伸因子 G、 翻译延伸因子 Tu、 翻译延伸因子 Ts、 翻译延伸 因子 4、 翻译释放因子 1、 翻译释放因子 2、 翻译释放因子 3、 核糖体循环因子、 甲硫氨酰 -tRNA甲酰转移酶、 肌酸激酶、 肌激酶和二磷酸核苷激酶、 焦磷酸酶、 T7 RNA 聚合酶和 22种氨酰 -tRNA合成酶；
[0068] (2) 分别从 39种共表达菌株中挑单克隆于 4ml LB培养基中 (卡那霉素和氯霉 素双抗性) ， 并加入 200 y l、 40wt%的葡萄糖用来抑制细胞的自主裂解， 在 37°C 的摇床中， 220rpm分别培养 14-18小时； [0069] （3） 将步骤 （2） 所得共表达菌株菌液与 M9培养基（卡那霉素和氯霉素双抗性） 按照 1: 100的体积比接种， 在 37°C摇床 220rpm进行扩大培养至 0D600=0. 6-0. 8之 间， 加入终浓度为 0. ImM 的 IPTG进行诱导， 再继续培养诱导 3-5小时后 4°C离心 ， 收取上清过镍柱纯化收集 39种混合蛋白；
[0070] （4） 将步骤 （3） 所得 39种混合蛋白用 3. 5kDa的透析袋进行透析， 透析后的蛋 白进行浓缩后加入核糖体、 能量缓冲液和表达红色荧光蛋白 mRFP的 DNA线性模板 后， 在 37°C金属浴中反应 4小时。 反应完毕后， 将反应体系转移至康宁荧光检测 384孔板里， 利用酶标仪检测荧光信号。 其中， 能量缓冲液由 L-谷氨酸钾、 20种 氨基酸混合物、 HEPES-K0H缓冲液、 亚精胺、 醋酸镁、 磷酸肌酸、 二硫苏糖醇、 甲酰叶酸、 NTPs、 IPTG, tRNA、 RNA酶抑制剂、 无菌水配制而成。
[0071] 通过图 2可以看出， 在 580nm激发和 610nm发射的情况下， mRFP的含量和检测到 的荧光信号呈线性关系。 将重组元件蛋白合成***中的转录翻译元件、 能量再 生***、 底物、 无机盐、 核糖体等配成反应混合物， 两个重复反应中加入 mRFP 的 DNA线性模板， 阴性对照中不加入 mRFP的 DNA线性模板， 将反应体系加入到 康宁荧光检测 384孔板中， 设置孵育温度 37°C， 实时监测在 580nm激发和 610nm发 射下的荧光信号， 反应过程中荧光信号在持续增强， 指示 2个重复反应中 mRFP的 体外合成均在发生 （图 3） 。 将反应体系加入到 0. 2mL PCR管中， 一管加入 mRFP 的 DNA线性模板， 一管不加 mRFP的 DNA线性模板作为阴性对照， 在 37°C金属浴 中反应 4小时， 反应完毕后， 将反应体系转移至康宁荧光检测 384孔板里， 利用 酶标仪进行检测， 检测到有荧光信号如表 1所示： （mRFP 激发： 580nm， 发射： 610nm） 根据荧光信号和 mRFP 含量的线性关系， 可计算 出该体外合成***在 37 °C反应 4小时后， 可合成 mRFP蛋白 1. 4ng/ y L。
[0072] 表 1 合成红色荧光蛋白 mRFP的终点荧光检测结果 [] [表 1]
Figure imgf000016_0001
[0073] 以上仅为本申请的可选实施例而已， 并不用于限制本申请。 对于本领域的技术 人员来说， 本申请可以有各种更改和变化。 凡在本申请的精神和原则之内， 所 作的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本申请的权利要求范围之内。

Claims

权利 要 求 书
[权利要求 1] 一种多蛋白体系的共生产方法， 其特征在于， 包括如下步骤： 提供表达溶菌蛋白的载体、 多种表达蛋白的载体及蛋白表达菌株， 每 种所述表达蛋白的载体分别表达所述多蛋白体系中的一种蛋白， 且不 同的所述表达蛋白的载体表达的蛋白各不相同； 将所述表达溶菌蛋白的载体与每种所述表达蛋白的载体分别共转入到 所述蛋白表达菌株中， 得到多种共表达菌株； 将全部的所述共表达菌株进行共培养， 当所述共表达菌株的生长密度 达到自主裂解密度时发生自主裂解， 释放出各自表达的蛋白， 得到所 述多蛋白体系； 其中， 所述多蛋白体系包括用于蛋白质翻译、 能量再生的蛋白质和 / 或催化合成化合物的酶。
[权利要求 2] 根据权利要求 1所述多蛋白体系的共生产方法， 其特征在于， 所述多 蛋白体系选自聚酮化合物合成酶体系、 非核糖体多肽合成酶体系、 重 组元件蛋白质合成体系中的至少一种。
[权利要求 3] 根据权利要求 2所述多蛋白体系的共生产方法， 其特征在于， 所述重 组元件蛋白质体系包括翻译起始因子 1、 翻译起始因子 2、 翻译起始因 子 3、 翻译延伸因子 G、 翻译延伸因子 Tu、 翻译延伸因子 Ts、 翻译延伸 因子 4、 翻译释放因子 1、 翻译释放因子 2、 翻译释放因子 3、 核糖体循 环因子、 甲硫氨酰 -tRNA甲酰转移酶、 肌酸激酶、 肌激酶、 二磷酸核 苷激酶、 焦磷酸酶和 22种氨酰 -tRNA合成酶。
[权利要求 4] 根据权利要求 3所述多蛋白体系的共生产方法， 其特征在于， 所述重 组元件蛋白质合成体系还包括 17 RNA聚合酶、 二硫键异构酶、 分子伴 侣蛋白中的至少一种。
[权利要求 5] 根据权利要求 1所述多蛋白体系的共生产方法， 其特征在于， 所述表 达溶菌蛋白的载体为表达噬菌体 4) X174 E蛋白的质粒 ePop。
[权利要求 6] 根据权利要求 1-5任意一项所述多蛋白体系的共生产方法， 其特征在 于， 所述蛋白表达菌株为大肠杆菌、 大肠杆菌突变菌或大肠杆菌衍生 菌。
[权利要求 7] 根据权利要求 1-5任意一项所述多蛋白体系的共生产方法， 其特征在 于， 所述共表达菌株发生自主裂解的生长密度为 0D值大于等于 0. 05。
[权利要求 8] 根据权利要求 1-5任意一项所述多蛋白体系的共生产方法， 其特征在 于， 在将所述多种共表达菌株进行共培养之前， 先对所述共表达菌株 分别进行单独培养， 用于活化所述共表达菌株。
[权利要求 9] 根据权利要求 8任意一项所述多蛋白体系的共生产方法， 其特征在于 ， 对所述共表达菌株分别进行单独培养时， 添加有终质量体积浓度为 0. 5%-2%的葡萄糖。
[权利要求 10] 一种多蛋白体系的共生产***， 其特征在于， 包括： 共表达菌株制备单元， 用于制备多种共表达菌株， 每种所述共表达菌 株表达所述多蛋白体系中的一种蛋白以及溶菌蛋白， 且不同的所述共 表达菌株表达的蛋白各不相同； 细胞培养单元， 用于培养所述共表达菌株单元中的共表达菌株； 其中， 所述多蛋白体系包括用于蛋白质翻译、 能量再生的蛋白质和 / 或催化合成化合物的酶。
[权利要求 11] 根据权利要求 10所述多蛋白体系的共生产***， 其特征在于， 所述多 蛋白体系选自聚酮化合物合成酶体系、 非核糖体多肽合成酶体系、 重 组元件蛋白质体系中的至少一种。
[权利要求 12] 根据权利要求 11所述多蛋白体系的共生产***， 其特征在于， 所述重 组元件蛋白质体系包括翻译起始因子 1、 翻译起始因子 2、 翻译起始因 子 3、 翻译延伸因子 G、 翻译延伸因子 Tu、 翻译延伸因子 Ts、 翻译延伸 因子 4、 翻译释放因子 1、 翻译释放因子 2、 翻译释放因子 3、 核糖体循 环因子、 甲硫氨酰 -tRNA甲酰转移酶、 肌酸激酶、 肌激酶、 二磷酸核 苷激酶、 焦磷酸酶和 22种氨酰 -tRNA合成酶。
[权利要求 13] 根据权利要求 12所述多蛋白体系的共生产***， 其特征在于， 所述重 组元件蛋白质体系还包括 17 RNA聚合酶、 二硫键异构酶、 分子伴侣蛋 白中的至少一种。 ［权利要求 14］ 根据权利要求 10-13任意一项所述多蛋白体系的共生产***， 其特征 在于， 所述溶菌蛋白为噬菌体 4) X174 E蛋白。
［权利要求 15］ 根据权利要求 10-13任意一项所述多蛋白体系的共生产***， 其特征 在于， 所述共表达菌株为大肠杆菌、 大肠杆菌突变菌或大肠杆菌衍生 菌。
［权利要求 16］ 权利要求 10-13任意一项所述多蛋白体系的共生产***在体外合成蛋 白质和 /或化合物中的应用。
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