CN115851558B

CN115851558B - 一种新的原核无细胞蛋白质合成***及其应用

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Publication number: CN115851558B
Application number: CN202310171242.6A
Authority: CN
Inventors: 朱柳杨; 张晓立; 毕悦欣; 李华珍; 章家泉
Original assignee: Baikuiri Tianjin Biotechnology Co ltd
Current assignee: Baikuiri Tianjin Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-02-27
Filing date: 2023-02-27
Publication date: 2023-05-30
Anticipated expiration: 2043-02-27
Also published as: CN115851558A

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种原核无细胞蛋白质合成***及其应用。本发明通过优化细胞培养及提取物的制备过程和CFPS反应体系及反应条件开发并建立了以红球菌（Rhodococcus rhodochrous）为底盘菌的无细胞蛋白质合成***；利用该***目标蛋白的表达量较优化之前提升10倍左右。本发明开发的红球菌CFPS***不仅扩展了当前无细胞蛋白质合成（CFPS）***库，同时扩展红球菌体系在合成生物学领域的应用，例如快速蛋白质合成、遗传电路原型和代谢途径构建，快速高效生产有价值的化学品和材料等，红球菌无细胞蛋白质合成***的建立也为功能酶高效筛选平台提供可能性，加速高性能酶筛选。

Description

一种新的原核无细胞蛋白质合成***及其应用

技术领域

发明属于生物技术领域，涉及一种新的原核无细胞蛋白质合成***，包括自身的应用，以及生产方法。

背景技术

无细胞蛋白质合成(CFPS)***使用粗细胞提取物代替完整细胞来完成体外转录和翻译，是蛋白质合成和生物学应用的强大平台。由于无细胞***的开放性，CFPS反应具有许多优点，例如易于操作、高产率和对有毒产物的耐受性。CFPS技术已经应用于各种蛋白质的生产，包括膜蛋白、治疗蛋白、金属酶和非天然氨基酸修饰蛋白。

CFPS***是从不同的原核和真核或生物体（如大肠杆菌、酵母、小麦胚芽和哺乳动物细胞）开发而来的。虽然这些成熟的CFPS***得到了广泛的应用，但它们各有优缺点。例如，在所有报告的无细胞***中，大肠杆菌CFPS的整体生产力目前是最高的（表达蛋白质约为1000µg/mL）；然而，基于大肠杆菌的细胞提取物缺乏翻译后修饰机制（例如糖基化），因此它们不适合表达真核蛋白。

另一方面，真核生物衍生的CFPS***的制备步骤很费力，而且它们的蛋白质产量通常很低（<50µg/mL）。最近，对CFPS技术的兴趣推动了新的无细胞***的开发，其中包括链霉菌属、枯草芽孢杆菌、恶臭假单胞菌和需钠弧菌等。开发新的CFPS***不仅将扩展用于体外蛋白质合成的工具包，更重要的是，这些***可以更好地模拟细胞内源环境以实现高质量的蛋白质表达（例如，增强的溶解度和翻译后修饰）。因此，源自非模型底盘微生物的CFPS***的开发对合成生物学和生物技术领域的特定应用越来越有吸引力。

红球菌是需氧、无孢子的***，广泛分布在各种营养条件。一个显著的特征是，红球菌菌株表现出多样化的代谢活动，使其能够降解和转化不同类型的有机污染物，如短链、长链、卤代烃和众多芳香烃。因此，它们已成功应用于污染土壤、水和空气的生物修复。这一因素也使红球菌成为工业废物或木质纤维素生物质原料的理想平台，以生产有价值的化学品，如生物燃料和羧酸。红球菌已广泛应用于工业生产腈水合酶(NHase)、腈酶和酰胺酶，可以催化丙烯腈转化为丙烯酰胺和丙烯酸铵或芳香族酰胺和杂环酰胺转化为相应的酸。因此，红球菌在制药、环境和工业领域具有相当重要的意义，被认为是制造化学品的微生物平台之一。

目前尚没有有效的红球菌无细胞蛋白质合成的***。而建立红球菌无细胞蛋白质合成***不仅可扩展当前的CFPS库，还可利用红球菌无细胞蛋白表达体系搭建高通量酶库筛选平台，加快高性能酶筛选，同时该体系的建立可扩展红球菌在合成生物学领域的应用。例如快速蛋白质合成、遗传电路原型和代谢途径构建，快速高效生产有价值的化学品和材料等。如何建立有效的红球菌无细胞蛋白质合成的***是需要解决的问题。

发明内容

无细胞蛋白质合成(CFPS)***是蛋白质合成和生物学应用的强大平台，红球菌在制药、环境和工业领域具有相当重要的意义，被认为是制造化学品的微生物平台之一。虽然已有一些报道的CFPS***，但其蛋白表达量很低，难以实际应用，并且这些***不一定适合红球菌基因的表达。而目前并没有可用的红球菌CFPS***，这限制了红球菌的应用。红球菌存在较厚的细胞壁，且蛋白表达过程中对培养基营养成分要求较高，这都为红球菌CFPS***的开发增加了难度。本发明通过探索研究，其目的是开发一种基于红球菌细胞提取物的CFPS***，提升蛋白表达水平从而扩展当前的CFPS库，进而扩展红球菌在合成生物学领域的应用。例如快速蛋白质合成、遗传电路原型和代谢途径构建，快速高效生产有价值的化学品和材料等。

本发明首先提供一种用于无细胞蛋白质合成***的红球菌细胞提取物的制备方法，其包括如下步骤：

（1）红球菌的培养，采用发酵培养基发酵培养红球菌，其发酵培养基成分如下：葡萄糖 10~50 g、酵母粉 1~10 g、蛋白胨 1~8 g、麦芽提取物 1~8 g、磷酸氢二钾 0.1~1 g、磷酸二氢钾 0.1~1 g、硫酸镁 0.5~3 g、尿素0.5~3 g、水定容至1 L，pH 7.2，115℃ 20min。

（2）菌体收集：当发酵培养到菌体的OD₆₀₀在1.9~3.1收集菌体；并且调整菌体浓度为0.6~0.8 g/mL；

（3）菌体破碎：采用超声破菌，超声条件是功率50%，超声2 s，间隔6 s，共6~8 min，得到细胞提取物；其中，在超声前添加甘油或在超声后添加二硫苏糖醇。

优选地，第（3）步中在超声前加10%甘油，更优选添加量为每1 mL菌液添加10-20uL1M DTT。

本发明提供一种红球菌无细胞蛋白质合成的***，其包括如下成分：

（1）PEG8000的添加量： 1~2% w/v；

（2）红球菌细胞提取物的添加量： 25~33%（v/v）；

（3）DNA模版的添加量：12~18 ng/uL质粒；

（4）RNA酶抑制剂的添加量：0.1~0.2 U/uL；

（5）T7RNA聚合酶的添加量：0.6~0.8 U/uL；

以及ATP、GTP、UTP和CTP，亚叶酸，20种标准氨基酸，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；辅酶A；亚精胺；腐胺；草酸钠；谷氨酸钾；谷氨酸铵；谷氨酸镁；HEPES；磷酸烯醇丙酮酸。

优选地，其中下述成分的添加量至终浓度为：ATP 1.2 mM；GTP、UTP和CTP各0.80-0.90 mM；30-40 μg/mL亚叶酸；2-6 ng/μL质粒；20种标准氨基酸各2.5-3.5 mM；0.30-0.36mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；0.25-0.30 mM 辅酶A；1.0-2.0 mM亚精胺；0.5-1.5 mM腐胺；2-6mM草酸钠；280-300 mM谷氨酸钾；8-12 mM谷氨酸铵；4-8 mM谷氨酸镁；50-60 mM pH 7.2的HEPES；65-70 mM磷酸烯醇丙酮酸。

更优选地，各成分的添加量至终浓度为：ATP 1.2 mM；GTP、UTP和CTP各0.85 mM；34μg/mL亚叶酸；4 ng/μL质粒；0.2 U/uL T7RNA聚合酶；0.1 U/uL RNA酶抑制剂；20种标准氨基酸各3 mM；0.33 mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；0.27 mM 辅酶A；1.5 mM亚精胺；1 mM腐胺；4mM草酸钠；290 mM谷氨酸钾；10 mM谷氨酸铵；6 mM谷氨酸镁；57 mM pH 7.2的HEPES；67 mM磷酸烯醇丙酮酸和33%的红球菌细胞提取物。

进一步优选地，所述红球菌细胞提取物是由所述的方法制备得到；该***（即反应体系）的pH为7.0-7.4。

本发明进而提供一种红球菌无细胞蛋白质合成的方法，其特征在于，采用所述的***于15~20℃下反应20-44h。

本发明也提供所述的***，或所述的方法在无细胞蛋白质合成中的应用。

更具体地，其用于快速蛋白质合成、酶突变库的快速构建、遗传电路原型或代谢途径构建。

本发明通过优化细胞培养及其提取物的制备过程和CFPS反应体系及反应条件开发并建立了以红球菌（Rhodococcusrhodochrous）为底盘菌的无细胞蛋白质合成***；利用该***，目标蛋白的表达量可达300 µg/mL以上。本发明开发的红球菌CFPS***为业内首创，这不仅扩展了当前的CFPS库，还扩展红球菌在合成生物学领域的应用，例如快速蛋白质合成、遗传电路原型和代谢途径构建，快速高效生产有价值的化学品和材料等。

附图说明

图1 红球菌CFPS表达质粒PJL1-eGFP。

图2 CFPS体系照胶仪下显色。注：A实验组；B阴性对照。

图3 CFPS体系照胶仪下显色。注：A优化前CFPS体系、B阴性对照、C优化后CFPS体系、D阴性对照（其中A和B即图2中的A和B，在图3中为了进行直观比较）。

图4 优化前后eGFP表达量对比。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的方法做进一步说明。在实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按照分子生物学领域的常规实验中的条件，或按照质粒、菌株等商品化生产厂商的说明书进行操作。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。

实施例1：报告基因eGFP的重组质粒构建

无细胞蛋白质合成需要一个目标基因来验证体系是否可用，绿色荧光蛋白（eGFP）是一种绿色荧光蛋白，能方便快捷的检测出合成的蛋白浓度，从而对CFPS***做出评价。

根据eGFP序列信息设计引物，以含有eGFP的质粒pET28a为模板，用KOD高保真聚合酶，通过PCR对eGFP进行扩增。PCR程序为：94℃ 120s，98℃ 10s，68℃ 30s，68℃ 10s，18个循环，并对PCR产物进行纯化，纯化产物以及表达载体PJL1经限制性内切酶消化，回收后进行连接反应。连接产物转化至大肠杆菌DH5α，涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB平板进行筛选。挑选阳性转化子，提取质粒后送测序验证，结果显示列正确，获得的重组质粒，如图1所示。

实施例2：红球菌CFPS***优化表达eGFP

一、常规的PANOx-SP体系用于红球菌CFPS表达eGFP

为了初次验证红球菌无细胞蛋白表达***的表达水平，通过以下实验进行验证，具体如下：

1、红球菌细胞培养及其细胞提取物制备：在固体LB培养基上活化红球菌，然后接种活化后单克隆到40 ml LB液体培养基中，28℃，200 rpm过夜培养。接种过夜培养菌液到400 ml 2×YTP培养基中，控制初始OD₆₀₀为0.1~0.5，28℃培养至OD₆₀₀为3.5~4.0时收集菌体，10000 g，4℃离心20 min，弃上清，然后加入25 ml S30 buffer（10 mM Tris(OAc)、1.4mM Mg（OAc）₂、60 mM K（OAc）、2 mM DTT）润洗菌体2次，收集菌体储存于-80℃备用。称取1 g加1 ml预冷的S30 buffer重悬细胞，超声破碎（φ6超声探头，50%功率，超声2 s，停6 s，总时间 4 min），10000 rpm，4℃离心30 min。上清即细胞提取物分装于1.5 mL EP管中，-80℃储存备用。

2、按照常规PANOx-SP体系搭建红球菌CFPS反应体系，具体成分如下：1.2 mM ATP；GTP、UTP和CTP各0.85 mM；34 μg/mL亚叶酸；4 ng/μL质粒;0.2 U/uL T7RNA聚合酶;0.1 U/uL RNA酶抑制剂；20种标准氨基酸各3 mM；0.33 mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）；0.27 mM辅酶A（CoA）；1.5 mM亚精胺；1 mM腐胺；4 mM草酸钠；290 mM谷氨酸钾；10 mM谷氨酸铵；6 mM谷氨酸镁；57 mM pH 7.2的HEPES；67 mM磷酸烯醇丙酮酸(PEP）和33%的细胞提取物，30℃下孵育20 h，实时观察蛋白表达情况。

3、eGFP定性与定量检测：首先用核酸胶照胶仪观察反应体系是否显示绿色，定性判断eGFP是否表达；然后取10μl反应体系，加入90μl 50mM HEPES，混匀后取80μl至96孔黑色酶标板中，酶标仪荧光检测eGFP蛋白的吸光值，使用eGFP标品建立荧光值和蛋白浓度关系的标准曲线，对CFPS反应中eGFP蛋白浓度进行量化。

实验结果如图2所示，在核酸胶照胶仪下肉眼几乎看不到反应体系有绿色荧光蛋白表达；经酶标仪检测计算浓度，如表1所示只有30 ug/mL，表达水平较低。

表1：常规的PANOx-SP***红球菌CFPS蛋白表达情况

二、红球菌CFPS***优化

按照常规PANOx-SP体系搭建的红球菌CFPS反应体系蛋白表达水平较低，无法满足无细胞体系对蛋白评估的需求。为了提高红球菌CFPS的可用性，需对无细胞体系中的关键因素如：细胞培养，细胞提取物制备过程，反应体系和反应条件等进行优化，提升无细胞体系蛋白表达水平。具体如下：

1、反应体系和反应条件优化：

（1）PEG8000的添加量：由于无细胞提取物比细胞内的细胞质环境要稀疏得多（20-30倍)，所以需要添加拥挤剂模拟细胞内环境。CFPS中常用的拥挤剂是聚乙二醇（PEG），各种分子量的PEG被添加到CFPS中，但其特性会随着分子量的变化而变化。PEG8000常被用来模拟大分子拥挤，本发明通过向CFPS体系中添加PEG8000，其他条件不变同实施例2，eGFP表达量有显著提高，具体结果见表2。结果说明PEG8000是影响红球菌CFPS蛋白表达水平的一个重要因素，但是，随着PEG8000浓度的增加，反而对蛋白表达水平影响比较大，从现有数据来看，最有效的浓度范围是1~2% w/v。

表2：PEG8000添加量优化蛋白表达情况

（2）细胞提取物的添加量：细胞提取物中含有蛋白质合成所需的RNA聚合酶、核糖体、酰胺-tRNA合成酶、翻译起始和延伸因子等一系列重要的物质，而细胞提取物的添加量将直接影响以上活性成分的浓度。本发明对细胞提取物的添加量进行了优化，其他条件同上述第一点。具体结果见表3，可以发现细胞提取物的添加量并不是越多越好，确定最佳添加量为25~33%（v/v）。

表3：细胞提取物添加量优化蛋白表达情况

（3）DNA模版（PJL1-eGFP）的添加量：无细胞合成反应是一个十分复杂的***，DNA模版的量非常重要，决定了后期蛋白的表达水平。本发明针对DNA模版终浓度进行了优化，其他条件同上述第一点。具体结果见表4，随着DNA模板量的增加，表达水平呈递增趋势，但是添加到一定浓度蛋白表达水平并没有持续增长，说明可能还有其他制约因素，目前基于此体系我们确定最佳模板浓度为12~18 ng/uL质粒。

表4：模板终浓度优化蛋白表达情况

（4）RNA酶抑制剂的添加量：RNA酶抑制剂是一种抑制RNA酶十分有效的蛋白。在整个无细胞合成反应中，加入的模版是DNA，需要在反应中转录生成mRNA，但是如果在反应中有RNA酶的存在，mRNA会被迅速降解，会导致后期蛋白无法合成；由于自然界RNA酶广泛存在，无法避免在实验中会有RNA酶的污染，所以必须在反应体系中加入RNA酶抑制剂，但是由于RNA酶抑制剂十分昂贵，并且加量过可能会抑制细胞体系蛋白质的合成。因此本发明对RNA酶抑制剂的浓度进行了优化，其他条件同上述第一点。具体结果见表5，由结果可知，随着RNA酶抑制剂浓度的增加，蛋白表达有提升，但不显著，添加过量的确会抑制蛋白质的合成，降低蛋白表达水平；基于上述结果RNA酶抑制剂最佳添加浓度为0.1~0.2 U/uL。

表5：RNA酶抑制剂终浓度优化蛋白表达情况

（5）T7RNA聚合酶的添加量：由于PJL1载体上的启动子为T7启动子，在蛋白质合成过程中需要T7RNA聚合酶，而红球菌细胞提取物无T7RNA聚合酶，因此体系中需额外补加。T7RNA聚合酶的量会影响转录效率。本发明对T7RNA聚合酶添加量进行了优化，设置4个不同的浓度，其他条件同上述第一点。具体结果见表6，结果可知随着T7RNA聚合酶浓度的增加，蛋白表达水平逐渐提升，在此实验基础上，T7RNA聚合酶添加浓度为0.6~0.8 U/uL。

表6：T7RNA聚合酶终浓度优化蛋白表达情况

（6）反应温度：不同底盘菌的最适蛋白表达温度不同，不同酶的最适表达温度也不同。本发明对反应温度进行优化，其他条件同上述第一点，实验共设置4个温度。结果发现蛋白低温表达比高温表达产量要高，实验确定红球菌CFPS表达eGFP最适温度范围为15~20℃。

表7：反应温度优化蛋白表达情况

（7）反应时间：蛋白表达量会随着反应时间的延长逐渐增加，在实施例2的条件下，对比了反应不同时间蛋白表达量，结果发现反应44h比反应20 h蛋白浓度提升不明显，基于此实验结果，为了提高效率，确定适宜反应时间为约20 h。

表8：反应时间优化蛋白表达情况

2、细胞提取物制备过程优化：

细胞提取物中含有蛋白质合成所需的RNA聚合酶、核糖体、酰胺-tRNA合成酶、翻译起始和延伸因子等一系列重要的物质，因此，菌体培养及细胞提取物的制备过程尤为重要。本发明对培养基、收菌OD₆₀₀、超声时间、超声前菌浓、添加蛋白保护剂等做了***的优化。

（1）培养基：在细胞生长过程中，培养基的成分及含量对细胞生长有重要的影响，进而影响后期无细胞合成中制备的细胞提取物的质量。目前报道的细菌细胞提取物CFPS细胞培养基主要为2×YTP培养基。本发明共优化了3种培养基，分别为2×YTP培养基(表9-2)、TB培养基(表9-3)和发酵培养基(表9-1)，其他条件同上述第一点。结果如表10所示，其中显示TB培养基蛋白表达量和2×YTP差别不明显，而发酵培养基蛋白表达量明显提高，可能是培养基中盐离子、尿素、麦芽提取物起的作用，根据此实验结果，确定事宜培养基为发酵培养基。

表9-1：发酵培养基配方

表9-2：2×YTP培养基配方

表9-3：TB培养基配方

表10：培养基优化蛋白表达情况

（2）收菌OD₆₀₀：在细胞生长过程中，细胞生长状况会影响细胞内核糖体的含量，进而影响后期蛋白合成速率及表达量。细胞在对数中期的生长状态是最好的，其中有大量蛋白合成所需的核糖体，氨基酸延伸因子等一系列重要的物质，而衡量细胞生长状态的一个重要指标是OD₆₀₀。本发明对收菌OD₆₀₀进行了优化，其他条件同上述第一点。结果如表11所示，其中显示OD₆₀₀在1.9~3.1时蛋白表达量明显高于3.8~5.6，此结果说明收菌OD₆₀₀是一个重要因素，培养时要注意跟测OD₆₀₀，防止菌体过量生长，根据此实验结果，确定适宜收菌OD₆₀₀为1.9~3.1。

表11：收菌OD优化蛋白表达情况

（3）超声时间：如何将红球菌细胞内蛋白合成所需物质释放出来是一个很重要的影响因素，所以超声破碎时的能量参数极其关键。红球菌属于***，有较厚的细胞壁，如果超声能量不够，红球菌不能完全的破碎时，会导致细胞内所需的物质不能完全释放进而影响最后的结果，但是如果超声能量过高，会将释放出的核糖体、能量等一系列蛋白合成所需的物质破坏掉。本发明对超声时间进行了优化，其他条件同上述第一点。结果如表12所示，其中显示：6min之前，随着超声时间的延长，蛋白表达量越来越高，6min以后，超声时间延长，蛋白表达量略有降低，这与理论分析一致，确定最好的超声条件是功率50%，超声2 s，间隔6 s，共6~8 min。

表12：超声时间优化蛋白表达情况

（4）超声前菌体浓度：除了超声能量外，超声前的菌泥浓度也直接影响了超声效果。本发明对超声前菌浓进行了优化，其他条件同上述第一点。结果如表13所示，其中显示菌体浓度0.6~0.8 g/mL略高于1g/mL，但是提高不明显，但是为了节省成本，确定最优浓度为0.6~0.8 g/mL。

表13：超声前菌泥浓度优化蛋白表达情况

（5）蛋白保护剂：超声过程会破坏蛋白质合成相关的酶的结构，导致酶活降低或彻底失活，从而影响蛋白表达量。为了稳定蛋白结构，减少酶活损失，本发明在超声前添加甘油或在超声后添加二硫苏糖醇，其他条件同上述第一点。结果如表14所示，其中显示1 mL菌液超声后添加15 uL 1 M DTT蛋白表达量提高不明显，可能是体系中的DTT已足量，而超声前添加100 uL甘油蛋白表达量明显提高，可能是甘油对蛋白起了保护作用，确定超声前在1mL菌液中添加100 uL甘油。

表14：添加蛋白保护剂优化蛋白表达情况

实施例3 利用优化后的红球菌CFPS验证eGFP表达水平

（1）优化后红球菌细胞培养及提取物制备条件：在固体LB培养基上活化红球菌，然后接种活化后单克隆到40 ml LB液体培养基中，28℃，200 rpm过夜培养。接种过夜培养菌液到400 ml 发酵培养基（表9-1）中，控制初始OD₆₀₀为0.1~0.5，28℃培养至OD₆₀₀为1.9~3.1时收集菌体，10000 g，4℃离心20 min，弃上清，然后加入25 ml S30 buffer（10 mM Tris(OAc)、1.4 mM Mg（OAc）₂、60 mM K（OAc）、2 mM DTT）润洗菌体2次，收集菌体储存于-80℃备用。称0.6~0.8 g取加1 ml预冷的S30 buffer和0.1 mL甘油重悬细胞，超声破碎（φ6超声探头，50%功率，超声2 s，停6 s，总时间 6~8 min），10000 rpm，4℃离心30 min。上清分装于1.5 mL EP管中，-80℃储存备用。

（2）优化后红球菌CFPS反应体系和反应条件：1.2 mM ATP；GTP、UTP 和 CTP各0.85mM ；34 μg/mL 亚叶酸；12~18 ng/μL质粒;0.6~0.8 U/uLT7RNA聚合酶;0.1~0.2 U/uL RNA酶抑制剂；20种标准氨基酸各3 mM;0.33 mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）；0.27 mM 辅酶A（CoA）；1.5 mM 亚精胺；1 mM腐胺；4 mM 草酸钠；290 mM 谷氨酸钾；10 mM 谷氨酸铵；6 mM谷氨酸镁；57 mM HEPES；1~2% PEG8000pH 7.2；67 mM磷酸烯醇丙酮酸(PEP）和25~33%（v/v）的细胞提取物，15~20℃下孵育约20 h。

按照上述红球菌CFPS体系表达eGFP并检测表达量，实验结果如图3，通过核酸照胶仪肉眼可见优化后的反应体系有很强的荧光亮度，优化前体系几乎无绿色荧光，而优化后体系显示明显绿色荧光，说明eGFP表达量明显提高。酶标仪检测荧光值并计算eGFP浓度，体系优化前后对比如图4所示，最优条件下，CFPS的eGFP表达量为322 ug/mL，跟初始值相比提高了约10倍，经三次重复实验验证，CFPS的eGFP表达量均在为300 ug/mL以上，说明此方法可重复。

Claims

1.一种红球菌无细胞蛋白质合成的***，其特征在于，包括如下成分：

（1）PEG8000的添加量： 1~2% w/v；

（2）红球菌细胞提取物的添加量： 25~33%v/v；

（3）DNA模版的添加量：12~18 ng/uL质粒；

（4）RNA酶抑制剂的添加量：0.1~0.2 U/uL；

（5）T7RNA聚合酶的添加量：0.6~0.8 U/uL；

以及ATP、GTP、UTP和CTP，亚叶酸，20种标准氨基酸，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；辅酶A；亚精胺；腐胺；草酸钠；谷氨酸钾；谷氨酸铵；谷氨酸镁；HEPES；磷酸烯醇丙酮酸；

所述红球菌细胞提取物是由下述的方法制备得到：

（1）红球菌的培养，采用发酵培养基发酵培养红球菌，其发酵培养基成分如下：葡萄糖10~50 g、酵母粉 1~10 g、蛋白胨 1~8 g、麦芽提取物 1~8 g、磷酸氢二钾 0.1~1 g、磷酸二氢钾 0.1~1 g、硫酸镁 0.5~3 g、尿素0.5~3 g、水定容至1 L，pH 7.2，115℃ 20 min；

2.如权利要求1所述的红球菌无细胞蛋白质合成的***，其特征在于，在所述第（3）步中，在超声前添加的甘油是指在超声前添加10%甘油。

3.如权利要求1所述的***，其特征在于，其中下述成分的添加量至终浓度为：ATP 1.2mM；GTP、UTP和CTP各0.80-0.90 mM；30-40 μg/mL亚叶酸；20种标准氨基酸各2.5-3.5 mM；0.30-0.36 mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；0.25-0.30 mM; 辅酶A；1.0-2.0 mM亚精胺；0.5-1.5mM腐胺；2-6 mM草酸钠；280-300 mM谷氨酸钾；8-12 mM谷氨酸铵；4-8 mM谷氨酸镁；50-60mM pH 7.2的HEPES；65-70 mM磷酸烯醇丙酮酸。

4.如权利要求1所述的***，其特征在于，各成分的添加量至终浓度为： ATP 1.2 mM；GTP、UTP和CTP各0.85 mM；34μg/mL亚叶酸；PEG8000 1% w/v；12 ng/μL 质粒；0.8 U/uLT7RNA聚合酶；0.2 U/uL RNA酶抑制剂；20种标准氨基酸各3 mM；0.33 mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；0.27 mM；辅酶A；1.5 mM亚精胺；1 mM腐胺；4 mM草酸钠；290 mM谷氨酸钾；10 mM谷氨酸铵；6 mM谷氨酸镁；57 mM pH 7.2的HEPES；67 mM磷酸烯醇丙酮酸和33%的红球菌细胞提取物。

5.如权利要求1至4任一项所述的***，其特征在于，所述***的pH为7.0-7.4。

6.一种红球菌无细胞蛋白质合成的方法，其特征在于，采用如权利要求1至5任一项所述的***于15~20℃下反应20-44h。

7.如权利要求1至5任一项所述的***，或如权利要求6所述的方法在无细胞蛋白质合成中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，其用于快速蛋白质合成、酶突变库的快速构建、遗传电路原型或代谢途径构建。