KR100749053B1

KR100749053B1 - 무세포 단백질 합성방법

Info

Publication number: KR100749053B1
Application number: KR1020037002765A
Authority: KR
Inventors: 야에타엔도; 다쮸야사와사키; 토미오오가사와라
Original assignee: 셀프리 사이언스 코 엘티디
Priority date: 2000-08-29
Filing date: 2001-08-28
Publication date: 2007-08-13
Also published as: DE60129717D1; EP1316617B1; US6869774B2; CN1449449A; CA2420984A1; WO2002024939A1; CN101092446A; JPWO2002024939A1; ATE368747T1; EP1316617A1; US20030162246A1; AU2001280201B2; JP3768190B2; KR20030031992A; AU8020101A; CN1219888C; EP1316617A4

Abstract

본 발명은 무세포 단백질 합성방법에 있어서, (1) 생체추출물을 함유한 합성반응용액(반응상)과 기질 및 에너지원 공급용액(공급상)을 반투막 등으로 격리시키지 않고 직접 접촉시키고, 접촉계면을 매개로 하여 공급상의 기질 및 에너지원 분자를 자유확산에 의해 반응상으로 연속적으로 공급함과 동시에 반응상에서 생성된 부산물을 공급상으로 제거함으로써 반응지속 시간을 연장시켜 반응효율을 높이는 것, (2) 밀배아 추출물을 함유한 반응용액을 프리인큐베이션(preincubation)한 후에 희석용액을 첨가하여 희석함으로써, 합성반응의 지속시간을 연장시켜 반응효율을 높이는 것, (3) 회분식 방법에 있어서, 합성반응 정지 후의 반응액에 겔(gel)여과 컬럼이나 반투막을 이용하여 단백질 합성에 필요한 아미노산, ATP(adenosine triphosphate), GTP(guanosine triphosphate) 및 크레아틴인산(creatine phosphate) 등의 기질 및 에너지원을 재공급함과 동시에 반응 과정에서 생성된 부산물을 불연속적으로 제거하여 반응의 효율을 높이는 것을 특징으로 하는 것이다.

무세포 단백질 합성방법, 반응상, 공급상, 생체 추출물, 프리인큐베이션, 접촉계면, 희석

Description

무세포 단백질 합성방법 {Methods of synthesizing cell-free protein}

본 발명은 무세포 시스템을 이용하는 단백질의 합성방법에 관한 것이다.

게놈 프로젝트(genome project)의 완료를 눈 앞에 둔 현재, 연구과제의 중심은 유전자 구조해석으로부터 유전자 기능해석으로 급격하게 전개되어 가고 있다. 세포 내에서 단백질은 그들 단독으로 기능하고 있는 것이 아니라 다종다양한 단백질 인자, 핵산, 저분자물질 및 세포막 성분 등과 함께 상호작용함으로써 기능을 발현하고, 상호작용의 총화로서 생물학적 기능이 영위되는 것으로 생각되고 있다.

포스트 게놈 프로젝트(post-genome project)의 중심과제의 하나는 다종다양한 단백질 인자 복합체의 구조와 기능과의 관계를 해석하는 것이다. 이로부터 얻어진 성과는 구조생물학 및 생화학을 비롯한 기초생물학 등의 연구 분야뿐만 아니라, 그 응용으로서의 의학분야에서의 유전자의 번역산물과 질병의 원인과의 관계 해명 및 의약의 개발에 이르는 넓은 분야에 극히 중요한 견해를 제공할 것으로 기대되고 있다.

세포 내에서 높은 효율로 진행되는 단백질 합성반응을 생체 외에서 수행하기 위한 방법으로서, 지금까지는 예를 들어 세포 내에 갖추어져 있는 단백질 번역장치인 리보솜 등을 함유하는 성분을 생물체로부터 추출하고 이 추출액에 번역주형, 기 질이 되는 아미노산, 에너지원, 각종 이온, 완충액 및 그 외의 유효인자를 첨가하여 시험관 내에서 단백질을 합성하는 소위 무세포 단백질 합성 등의 연구가 활발히 이루어져 왔다(특개평6-98790, 특개평6-225783, 특개평7-194, 특개평9-291, 특개평7-147992).

이러한 무세포 단백질 합성을 위한 반응계, 즉 무세포 단백질 합성계에서 사용하는 단백질 합성용의 세포 추출액 또는 생체조직 추출액의 조제에는 대장균, 밀배아, 또는 집토끼의 망상 적혈구 등이 사용되고 있다. 무세포 단백질 합성계는 펩타이드의 합성속도와 번역반응의 정확성의 측면에서 볼 때, 생세포에 필적하는 성능을 갖고 또한 복잡한 화학반응공정이나 번잡한 세포배양공정을 필요로 하지 않는 이점을 갖기 때문에, 현재까지 그 실용적인 시스템의 개발이 이루어져 오고 있다. 그러나, 일반적으로 생물체의 세포로부터 추출한 세포 추출액은 그 단백질 합성능이 매우 불안정하기 때문에 단백질 합성효율이 낮고, 보존 과정에서의 단백질 추출액의 품질저하 또한 현저하였기 때문에, 무세포 단백질 합성계에서 얻어진 합성물의 양은 방사성 동위원소표지 등에 의해 검출가능한 정도로 매우 소량이기 때문에 단백질의 생산수단으로서는 실용성이 없어 널리 이용될 수 없었다.

본 발명자 등은 우선, 종래의 무세포 단백질 합성계의 결점을 해결하는 방법으로서, (1) 무세포 단백질 합성용 세포 추출물 제제와 무세포 단백질 합성방법 및 (2) 범용성 및 고효율 기능을 갖는 주형분자 및 이를 이용하는 무세포 단백질 합성방법을 제공하고 있다(WO00/68412호 공보, WO01/27260호 공보).

또한, 단백질 합성의 효율을 높이기 위하여 무세포 단백질 합성을 연속적으 로 실시하는 장치가 보고되어 있다. 종래의 연속식 무세포 단백질 합성장치로는 한외여과막법, 투석막법 및 수지에 번역주형을 고정화한 칼럼크로마토그래피법 등[Spirin, A., et al., (1993) Methods in Enzymology, 217, 123-142]을 이용한 것을 들 수 있다. 특히, 한외여과막법과 투석막법은 취급이 간단하여 널리 사용되고 있다. 그러나 이들 막을 이용하는 연속법에서는 ① 사용하는 막의 재질강도가 낮은 점; ② 막의 폐색에 의한 막기능의 저하가 발생하는 점; ③ 조작이 복잡하기 때문에 숙련된 기술을 요구하는 점; 등의 해결되어야 할 과제가 남아있다.

또한, 한외여과막법이나 투석막법 등을 이용하여 수동조작으로 이루어지는 연속식 무세포 단백질 합성방법은 소수의 유전자로부터의 단백질 합성에는 이용될 수 있지만, 다수의 유전자를 이용하여 고효율로 단백질을 생산하는 것은 곤란하였다. 그래서, 다수의 유전자를 이용하는 고효율의 단백질 생산을 가능하게 하는 고속처리율(high throughput) 다검체용 전자동 단백질 합성 시스템의 개발을 위하여, 종래의 연속식 무세포 단백질 합성방법의 결점이 해결된 신기술을 개발하는 것이 요구되고 있다.

본 발명의 한 태양은, 생체 추출물을 함유하는 합성반응용액(반응상)과 기질 및 에너지원 공급용액(공급상)을 직접적으로 접촉시켜, 양 상의 접촉계면을 통한 자유확산을 통하여 공급상의 기질 및 에너지원 분자를 반응상의 번역반응계로 연속적으로 공급함과 동시에 반응상에서 생성된 부산물을 제거함으로써, 합성반응의 지속시간을 연장하고 합성반응의 효율을 높이는 것을 특징으로 하는 확산연속배치식 에 의한 무세포 단백질 합성방법이다.

본 발명은 상기 무세포 단백질 합성방법에 있어서, 생체 추출물로 밀배아 추출액을 사용하는 것을 특징으로 하는 무세포 단백질 합성방법일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 무세포 단백질 합성방법에 있어서, 생체 추출물로 대장균 추출액을 사용하는 것을 특징으로 하는 무세포 단백질 합성방법일 수 있다.

또한, 상기 무세포 단백질 합성방법에 있어서, 반응상에서 생성된 부산물을 공급상으로 희석시켜 제거하는 것을 특징으로 하는 무세포 단백질 합성방법도 본 발명의 범위에 포함된다.

더욱이, 상기 무세포 단백질 합성방법에 있어서, 반응상과 공급상과의 사이에 형성되는 직접적인 접촉계면이 수직면상에 있는 것을 특징으로 하는 무세포 단백질 합성방법도 본 발명의 범위에 포함된다.

또한, 본 발명의 한 태양은, 밀배아 추출액을 함유한 무세포 단백질 합성반응용액을 프리인큐베이션(preincubation)시킨 후에 기질 및 에너지원 공급용액을 첨가하여 밀배아 추출액을 함유하는 무세포 단백질 합성반응용액을 희석하는 것을 특징으로 하는 무세포 단백질 합성방법이다.

또한, 본 발명의 한 태양은 회분식 무세포 단백질 합성방법에 있어서, 합성반응 정지 후의 반응용액에 겔여과 칼럼 또는 반투막을 이용하여 단백질 합성에 필요한 아미노산, ATP(adenosine triphosphate), GTP(guanine triphosphate) 및 크레아틴인산(creatine phosphate) 등의 원료 및 에너지원을 재공급함과 동시에 반응에서 생성된 부산물을 반응용액으로부터 제거함으로써, 합성반응의 효율을 높이는 것 을 특징으로 하는 무세포 단백질 합성방법이다.

본 발명의 한 태양은 일반적인 무세포 단백질 합성방법에 있어서, 생체 추출물을 함유한 합성반응용액(반응상)과 기질 및 에너지원 공급용액(공급상)을 반투막 또는 한외여과막 등의 격막을 이용하여 격리시키지 않고 직접적으로 접촉시켜, 양 상의 접촉계면을 매개로 하여 이루어지는 자유확산에 의해 공급상의 기질 및 에너지원 분자를 반응상에 연속적으로 공급함과 동시에, 반응상에서 생성된 부산물을 공급상으로 제거시킴으로써 반응지속시간을 연장시키고 이를 통하여 합성반응의 효율을 높이는 것을 특징으로 하는 확산연속회분식 무세포 단백질 합성방법이다.

상기 확산연속회분식 무세포 단백질 합성방법에 있어서, 양상의 계면은 수평면으로 형성되어도 좋고 수직면으로 형성되어도 좋다. 당해 계면을 수평면으로 형성하고자 할 때에는, 예를 들어 반응용기에 우선 반응상을 넣어 하층을 형성시킨 후 공급상을 당해 반응상의 위에 양상의 계면이 교란되지 않도록 천천히 중층시키면 된다(도 1을 참조). 반응용기는 그 형상 및 크기에 따라 양상 사이에서의 용질의 확산속도를 적절한 정도로 유지시킬 수 있는 것이면 좋고, 예를 들어 시험관 또는 멀티웰 마이크로타이타 플레이트 등을 사용할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 합성반응용액(반응상)과 공급용액(공급상)을 중층시킨 후에 이들을 함유한 반응용기에 원심조작을 가함으로써, 양상의 계면을 수직면으로 형성시키는 것도 가능하다.

양상 접촉계면의 면적은 큰 편이 확산에 의한 물질교환율이 높고 단백질 합성효율이 높아진다. 따라서, 반응상에 대한 공급상의 적절한 용량비는 양상의 계 면면적에 따라 달라지게 된다. 반응상에 대한 공급상의 용량비는 특별히 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 계면이 원형이고 그 직경이 7mm인 경우에는 1:4 내지 1:8이 바람직하고, 1:5로 하는 것이 더욱 바람직하다.

상기 반응상을 형성하는 합성반응액은 종래 기지의 회분식 무세포 단백질 합성계에서 사용된 조성에 무세포 단백질 합성반응에 필요한 생체 추출물 및 얻고자 하는 단백질의 합성에 있어서 주형이 되는 mRNA를 더 포함하는 조성으로 구성된다. 생체 추출물은 종래의 무세포 단백질 합성법에서 사용되어 온 공지의 생체 추출물, 예를 들어 밀배아 추출물, 대장균 추출물, 또는 집토끼의 망상 적혈구 추출물 등을 사용할 수 있다. 이들 추출물의 조제는 자체 공지의 방법에 따라서 이루어질 수 있다. 밀배아 추출물은 공지의 간행물[Madin K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2000), 97, 559-564](WO00/68412호 공보)에 기재된 방법으로 조제한 것을 이용하는 것이 바람직하다. 합성반응액은 구체적으로는 예를 들어, 생체 추출물로 밀배아 추출물을 이용하는 경우에는 당해 추출물(농도는, 200 A_260nm units/mL)을 전용량의 48%가 되도록 하고, 아래와 같은 최종농도의 조성[1000 units/mL 리보뉴클레아제 저해제(ribonuclease inhibitor; RNAsin), 30 mM HEPES-KOH(pH 7.6), 95 mM 아세트산칼륨(potassium acetate), 2.65 mM 아세트산마그네슘(magnesium acetate), 2.85 mM 디치오스레이톨(dithiothreitol), 0.5 mg/mL 크레아틴키나아제(creatine kinase), 1.2 mM 아데노신삼인산(adenosine triphosphate; ATP), 0.25 mM 구아노신삼인산(guanosine triphosphate; GTP), 16 mM 크레아틴인산(creatine phosphtae), 0.380 mM 스퍼미딘(spermidine), 20종류의 L형 아미노산(각 0.3 mM), 0.05% NP-40, 600 ㎍/mL mRNA]로 구성된다. 합성반응용액의 조성은 상기조성에 한정되지 않고, 무세포 단백질 합성반응의 효율이 높게 유지될 수 있는 조성이면 이용할 수 있다. 예를 들어, 상기 mRNA 대신 플라스미드(목적유전자를 코딩하는), RNA 폴리머라아제(RNA polymerase) 및 뉴클레오티드류 등을 함유한 전사반응용액에서 mRNA를 합성한 후에, 이어서 겔여과법이나 투석막법 등으로 당해 전사반응용액의 조성을 번역반응에 적용하기 위한 조성을 갖는 용액으로 변환시킨 후, 얻어진 용액을 합성반응용액으로 이용하여도 좋다(하기 참고예 1을 참조).

또한, 상기 합성반응용액 조성은 사용하는 생체 추출물의 종류에 따라서 적절히 변경할 수 있다. 생체 추출물로 대장균을 이용하는 경우에는 공지의 간행물[Pratt, J. M., Transcription and Translation(1984), 179-209, Hames, B. D. & Higgins, S. J., eds, IRL Press, Oxford]에 준하여 조제한 대장균 추출물을 사용하고, 동일한 방법에 준하여 조성한 단백질 합성반응용액을 조제하여도 좋다. 예를 들어, 대장균 추출물을 전용량의 50%로 하고, 아래와 같은 최종농도 조성[57 mM HEPES-KOH(pH 8.2), 75 mM 아세트산칼륨, 36 mM 아세트산암모늄, 16 mM 아세트산마그네슘, 1.7 mM 디치오스레이톨, 0.3 U/mL 파이루베이트 키나아제(pyruvate kinase), 0.17 mg/mL 대장균 tRNA혼액, 34 mg/mL L-5-포르밀-5,6,7,8-테트라하이드로엽산(L-5-formyl-5,6,7,8-tetrahydrofolic acid), 6.7 ㎍/mL 플라스미드(목적유전자를 코딩함), 33 ㎍/mL T7 RNA 폴리머라아제(RNA polymerase), 1.2 mM ATP, 각 0.85 mM의 GTP와 UTP(uracil triphosphate)와 CTP(cytosine triphosphate), 56 mM 포스포에놀피루빈산(phosphoenol pyruvate), 20종류의 L형 아미노산(각 0.2 mM)]으로 구성된 전사반응용액을 조제하고, 우선 mRNA를 합성한 후에 이어서 겔여과법이나 투석법 등으로 당해 전사반응용액의 조성을 번역반응에 적합한 조성을 갖는 용액으로 변환시키고, 얻어진 용액을 합성반응용액으로 이용하여도 좋다(하기 참고예 1을 참조). 또한, 대장균 추출액을 이용하는 무세포 단백질 합성계의 경우, 상기와 같이 전사반응용액에서 먼저 mRNA를 합성한 후에 당해 전사반응용액의 위에 공급용액을 중층시켜 정치조건 하에서 번역반응에 적합한 온도로 유지시키면서 단백질 합성반응을 실행하여도 좋다. 합성반응용액의 조성은 상기 조성에 한정되지 않고, 무세포 단백질 합성반응의 효율이 높게 유지될 수 있는 조성이라면 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 전사반응용액 중의 플라스미드(목적 유전자를 코딩함), T7 RNA 폴리머라아제, UTP 및 CTP 대신 별도의 자체 공지의 방법(Gurevich, V. V.,(1996) Methods in Enzymology, 275, 383-397)으로 조제한 목적 유전자를 코딩하는 mRNA를 적절히 첨가하여, 번역반응에 적합한 조성의 합성반응용액을 조제하여도 좋다.

더욱이, 상기의 합성반응액에 이노시톨(inositol), 자일리톨(xlytol) 및/또는 피콜(ficoll) 등의 당알콜을 첨가하여 당해 합성반응액의 점도나 밀도를 높이고, 반응상과 공급상의 2상 간의 혼합속도를 제어함으로써, 단백질 합성반응 재개의 안정화를 도모할 수 있다.

또한, 상기 공급상을 형성하는 공급용액은 기질 및 에너지원, 예를 들어 아미노산, ATP, GTP, 크레아틴인산 및 단백질 합성반응에 필요한 그 외의 이온류 및 완충액 등을 함유한다. 구체적으로는 예를 들어, 밀배아 추출액을 함유하는 상기 단백질 합성반응액을 반응상으로 사용하는 경우에는, 30 mM HEPES-KOH(pH 7.6), 95 mM 아세트산칼륨, 2.65 mM 아세트산마그네슘, 2.85 mM 디치오스레이톨, 1.2 mM ATP, 0.25 mM GTP, 16 mM 크레아틴인산, 0.380 mM 스퍼미딘 및 20종류의 L형 아미노산(각 0.3 mM)의 조성으로 구성된 공급용액을 사용할 수 있다. 또한, 대장균 추출액을 함유하는 상기 단백질 합성반응액을 반응상으로 사용하는 경우에는, 예를 들어 57 mM HEPES-KOH(pH 8.2), 75 mM 아세트산칼륨, 36 mM 아세트산암모늄, 16 mM 아세트산마그네슘, 1.7 mM 디치오스레이톨, 34 mg/mL L-5-포르밀-5,6,7,8-테트라하이드로엽산, 1.2 mM ATP, 0.85 mM GTP와 UTP와 CTP, 56 mM 포르포에놀피루빈산, 20종류의 L형 아미노산(각 0.2 mM)의 조성으로 구성된 공급용액을 사용할 수 있다.

단백질 합성반응은 정치조건 하에서 수행되고 반응은 각종 무세포 단백질 합성법에서 통상적으로 사용되고 있는 적정 반응온도에서 실시된다. 생체 추출물로서 밀배아 추출물을 사용하는 경우에는 20℃에서 30℃, 바람직하게는 26℃가 적합하고, 대장균 추출물을 이용하는 경우에는 30℃에서 37℃, 바람직하게는 30℃가 적합하다.

또한, 본 발명의 한 태양은 밀배아 추출물을 이용하는 무세포 단백질 합성방법에 있어서, 반응용액을 프리인큐베이션(전보온)한 후에 희석용액을 첨가하여 합성반응용액을 희석함으로써, 합성반응의 지속시간을 연장시키고 이를 통하여 단백질 합성효율을 높이는 희석회분식 무세포 단백질 합성방법이다.

희석회분식 무세포 단백질 합성방법에서는, 종래의 회분식 무세포 단백질 합 성반응액, 예를 들어 상기의 조성으로 구성된 합성반응액을 사용하고 우선 15분 내지 30분간 프리인큐베이션시켜 단백질 합성을 수행한다. 그 후, 기질과 에너지원, 예를 들어 아미노산, ATP, GTP, 크레아틴인산 및 단백질 합성반응에 필요한 그 외의 이온류 및 완충액 등을 함유하는 상기 확산연속회분식 단백질 합성방법에서의 공급용액과 동일한 조성의 용액을 첨가하여, 반응액에 함유된 밀배아 추출액을 7% 내지 12% 정도까지 희석한 상태에서 합성반응을 수행한다. 단백질 합성반응의 최적온도는 밀배아 추출물을 이용하는 경우에는 20℃ 내지 30℃, 바람직하게는 26℃이다. 효소나 번역단백질 인자는 일반적으로 저농도에서 안정성이 저하되는 것으로 알려져 있기 때문에, 사전에 합성반응액에 공지의 안정화제, 예를 들어 이노시톨, 자일리톨 또는 피콜 등을 첨가함으로써 합성반응의 효율화를 도모할 수 있다.

상기 희석회분식 단백질 합성법은 밀배아 추출물을 이용하는 무세포 단백질 합성계에서는 매우 유효하지만, 대장균 추출물을 이용하는 계에서는 그 효과가 확인되지 않았다. 이는 밀배아 추출액의 특성에 기인한 것으로 생각된다.

또한, 이 방법에서는 프리인큐베이션이 매우 중요한 공정이고 이 조작을 생략하면 단백질 합성반응의 효율이 저하되기 때문에, 프리인큐베이션 시에 안정한 번역개시복합체가 형성되는 것으로 생각된다. 그러나, 이러한 특이적 현상에 관계하는 분자구조의 실체에 대해서는 금후의 과제로 한다.

또한, 본 발명의 한 태양은 회분식 무세포 단백질 합성방법에 있어서, 합성반응 정지 후의 반응용액에 겔여과 칼럼 또는 반투막을 이용하여 단백질 합성에 필요한 기질이나 에너지원, 예를 들어 아미노산, ATP, GTP 및 크레아틴인산 등의 원 료를 재공급함과 동시에 반응에서 생성된 부산물을 반응용액에서 제거함으로써, 합성반응의 효율화를 높이는 것을 특징으로 하는 무세포 단백질 합성방법이다. 이 방식은 단백질 합성반응과 기질 및 에너지원의 반응액에의 공급 및 부산물의 제거조작이 불연속적인 과정으로 구성된 회분법이고, 기본적으로 Spirin 등의 연속식 무세포 단백질 합성법과는 다른 것이다.

이 불연속 회분식 무세포 단백질 합성반응에서는 반응용기, 예를 들어 시험관 등을 이용하여 종래의 회분식 무세포 단백질 합성반응을 개시하고 합성반응이 정지한 후에 반응액의 온도를 0℃~4℃로 저하시킴으로써 단백질 합성반응을 완전히 정지시켜, 그 반응정지 후의 반응액을 미리 기질 및 에너지원, 예를 들어 아미노산, ATP, GTP 및 크레아틴인산 등을 함유한 용액에서 평형화한 저분자화합물 분리용의 겔여과 입자, 예를 들어 세파덱스(sephadex) G-25 등을 이용하여 크로마토그래피에 건다. 평형화에 이용하는 용액은, 상기 확산연속회분식 단백질 합성방법에서의 공급용액과 동일한 조성의 용액을 사용할 수 있다.

상기 겔여과 조작에 의해서 부산물은 세파덱스 입자에서 제거되고, 덧붙여 신선한 아미노산, ATP, GTP 및 크레아틴인산 등에 교환된 무세포 단백질 합성액이 보이드 분획에서 회수될 수 있다. 회수된 용액을 다시 보온하면 번역반응이 개시되고 단백질 합성반응은 수시간에 걸쳐 진행된다. 합성반응이 다시 정지한 경우에는 다시 상기의 겔여과 조작을 반복한다. 이 방법을 반복함으로써, 통상의 회분식에서는 단시간에 정지하게 되는 합성반응을 장시간 지속시키는 것이 가능해 지고 그 결과 단백질 합성수율이 상승하게 된다.

또한, 상기 불연속 회분식 무세포 단백질 합성방법에 있어서, 기질 및 에너지원 등의 재공급 및 반응부산물의 제거의 수단으로써 상기의 겔여과법 대신 투석법을 사용하여도 동등한 혹은 그 이상의 효과를 얻을 수 있다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 관한 ① 세포 추출액을 함유하는 합성반응액으로 구성된 반응상과 아미노산, ATP, GTP 및 크레아틴인산 등을 함유한 기질 및 에너지 공급용액으로 구성된 공급상을 직접접촉시켜, 양상의 접촉계면을 통한 자유확산에 의하여 공급상의 기질 및 에너지원을 반응상으로 연속적으로 공급함과 동시에, 반응상에서 생성된 부산물을 공급상에서 제거하는 확산연속회분법, ② 밀배아를 이용하는 무세포 단백질 합성계에 있어서, 합성반응용액에 함유하는 세포 추출물 농도를 저하시켜 이용하는 희석회분법, 또한 ③ 단백질 합성반응의 정지 후에 겔여과법 혹은 투석법을 이용하여 단백질 합성에 필요한 아미노산, ATP, GTP 또는 크레아틴인산 등의 기질 및 에너지원을 합성반응용액에 재공급함과 동시에 반응과정에서 생성된 부산물을 불연속적으로 제거하는 불연속 회분법은 종래의 연속회분식 무세포 단백질 합성방법과는 다른 무세포 단백질 합성방법으로서 매우 유효한 것이다. 이들 방법은 각각 단독으로 실시될 수도 있고 조합하여 이용되는 것도 가능하다. 예를 들어, 단백질 합성효율을 향상시키기 위하여 확산연속회분법과 불연속회분법을 또는 희석회분법과 불연속회분법을 조합하여 실시할 수도 있다. 또한, 최초에 첨가한 세포 추출물 혹은 조직 추출물의 농도를 높여 놓은 상태에서, 상기 3종의 방법을 조합하여 실시하는 것도 가능하다.

더욱이, 본 발명에 의해 무세포 단백질 합성반응의 지속시간의 연장이 가능 하게 되고, 이로 인하여 종래의 회분법에 비해 단백질 합성효율이 현저히 향상되고, Spirin 등에 의해 확립된 반투막을 이용하는 연속식 무세포 단백질 합성법[Spirin, A., et al., (1993) Methods in Enzymology, 217, 123-142]과 동등 이상의 성능을 갖는 무세포 단백질 합성방법을 확립할 수 있다.

도 1은 중층방식을 예로 들어 확산연속회분식 무세포 단백질 합성방법을 설명한 도면이다. 도면에서 인출선으로 둘러싸인 부분은 타이타 플레이트의 구멍을 도시한 단면도이다.

도 2는 밀배아 추출액을 이용한 확산연속회분식 무세포 단백질 합성방법에 의한 녹색형광단백질(green fluorescent protein; GFP)의 합성을 나타낸다. 도 2의 (A)는 단백질합성을 ¹⁴C-루이신(leucine)의 수득량을 이용하여 측정한 결과이다. 종축은 단백질 합성량, 횡축은 인큐베이션 시간이다. 종래의 회분식(○-○), 구경 7 mm(큰 □-□), 5 mm(중간 □-□) 또는 3 mm(작은 □-□)의 반응용기를 이용한 확산연속회분식(중층방식)에 의한 단백질합성을 나타낸다. ■-■는 희석회분식을 이용한 단백질의 합성을 나타낸다. 종축은 단백질 합성량을 나타내는 방사능 카운트를 등량의 배아 추출액량에 대하여 나타낸 것이다. 도 2의 (b)는 합성산물의 방사능 사진(autoradiogram)이다.

도 3은 밀배아 추출액을 이용한 확산연속회분식 무세포 단백질 합성방법을 이용한 디히드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase; DHFR)의 합성을 나타 낸 것이다. 도 3의 (A)는 단백질 합성을 ¹⁴C-루이신의 수득량을 이용하여 측정한 결과이다. 종래의 회분식(○-○)과 구경 7 mm의 반응용기를 이용한 확산연속회분식(중층방식)에 의한 단백질 합성을 나타낸다(■-■). 종축의 단백질 합성량을 나타내는 방사능 카운트는 등량의 배아 추출액량에 대하여 나타낸 것이다. 도 3의 (B)는 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue)로 염색한 합성산물의 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동도이다.

도 4는 대장균 추출액을 이용한 확산연속회분식 무세포 단백질 합성방법에 의한 GFP 합성을 나타낸다. 도 4의 (A)는 단백질 합성을 ¹⁴C-루이신 수득량을 이용하여 측정한 결과이다. 종래의 회분식(○-○)과 구경 7 mm의 반응용기를 이용한 확산연속회분식(중층방식)에 의한 단백질 합성을 나타낸다(■-■). □-□는 희석회분식 무세포 단백질 합성방법에 의한 단백질 합성을 나타낸다. 종축의 단백질 합성량을 나타내는 방사능 카운트는 등량의 대장균 추출액량에 대하여 나타낸 것이다. 도4의 (B)는 합성산물의 방사능 사진이다.

도 5는 밀배아 추출액을 이용한 불연속 겔여과 회분식 무세포 단백질 합성방법에 의한 GFP 합성을 나타낸다(□-□). 화살표는 반응액에 겔여과 처리를 실시한 시점을 나타낸다. ■-■는 겔여과 처리를 행하지 않은 경우의 결과를 나타낸다.

도 6은 범용성이 있는 플라스미드 pEU1의 구조를 나타낸다.

이하 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명은 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

확산연속회분식 무세포 단백질 합성방법의 일례로서, 도 1에 도시한 중층방식 확산연속회분식에 의해 밀배아 추출물을 이용하여 단백질 합성을 실시하였다.

밀배아 추출물은 공지의 간행물[Madin K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2000), 97, 559-564](WO00/68412호 공보)에 기재된 방법에 준하여 얻었다.

또한, 밀배아 추출물 단백질 합성반응에 있어서의 번역주형이 되는 mRNA의 합성을 위하여 원등(遠藤)이 구축한 범용성이 있는 플라스미드 pEU1(도 1)(WO01/27260호 공보)를 이용하였다. 목적 단백질을 암호화하는 유전자로는 해파리의 녹색형광단백질(GFP) 유전자(gfp 유전자)를 이용하여, 통상의 방법에 따라 상기 플라스미드에 삽입하였다. 얻어진 플라스미드를 HindⅢ으로 절단하여 직쇄형으로 하고 이를 전사주형으로 하여 통상의 방법에 따라 mRNA를 합성하였다. 합성된 mRNA는 5'말단에 이화물질 활성인자 단백질(catabolite activator protein; CAP)을 갖지 않는 비번역배열로서 5' 말단에 AMV-Ω배열을, 3' 말단에 플라스미드 유래의 500 염기를 갖고 있다. 상기 AMV-Ω배열로는 알팔파 모자이크 바이러스(Alfalfa mosaic virus; AMV) mRNA(AMV-mRNA)의 5' 말단의 리더구조와 담배 모자이크 바이러스(tabbaco mosaic virus; TMV) mRNA(TMV-mRNA)의 5' 말단의 Ω서열을 직렬로 결합한 염기서열을 말한다(WO01/27260호 공보). 이들 비번역서열의 부가에 의해 RNA의 안정성이 증강되고, 그 결과 이 mRNA를 이용하는 무세포 단백질 합성효율이 상승한다. 또한, 5' 말단에 이화물질 활성인자 단백질(CAP)을 갖는 mRNA를 이용하여도 하기와 같이 동일한 결과를 얻을 수 있었다.

다음으로, 밀배아 추출물을 전용량의 48%(농도는, 200 A_260nm units/mL)로 하고 아래와 같은 최종 농도 조성[1,000 units/mL 리보뉴클레아제 저해제(ribonuclease inhibitor)(RNAsin, TAKARA사), 30 mM HEPES-KOH(pH 7.6), 95 mM 아세트산칼륨(potassium acetate), 2.65 mM 아세트산마그네슘(magnesium acetate), 2.85 mM 디치오스레이톨(dithiothreitol), 0.5 mg/mL 크레아틴 키나아제(creatine kinase), 1.2 mM 아데노신삼인산(ATP), 0.25 mM 구아닌삼인산(GTP), 16 mM 크레아틴인산(creatine kinase), 0.380 mM 스퍼미딘(spermidine), 20종류의 L형 아미노산(각 0.3 mM), 0.05% NP-40, 60 ㎍/mL mRNA]으로 구성된 단백질 합성반응액을 조제하였다. 단백질 합성량을 측정하기 위하여 상기 단백질 합성반응액 1 mL에 대하여 ¹⁴C-루이신(300 mCi/mmol)을 4 uCi첨가하였다[Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2000), 97, 559-564].

이 단백질 합성반응액을 구경 7 mm, 5 mm 및 3 mm의 반응용기(각각, 마이크로타이타 플레이트, 1.5 mL 용량의 시험관 및 0.2 mL 용량의 시험관)에 넣고, 그 위에 5배 용량의 공급용액[30 mM HEPES-KOH(pH 7.6), 95 mM 아세트산칼륨, 2.65 mM 아세트산마그네슘, 2.85 mM 디치오스레이톨, 1.2 mM ATP, 0.25 mM GTP, 16 mM 크레아틴인산, 0.380 mM 스퍼미딘 및 20종류의 L형 아미노산(0.3 mM)]을 계면이 교란되지 않도록 천천히 중층시키고, 정치조건 하에서 26℃에서 3, 6, 9 및 17시간 인큐베이션하여 단백질 합성반응을 수행하였다. 합성된 단백질량의 측정은 통상의 방 법에 따라 방사성 동위체의 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid) 불용분획에 포획된 양을 지표로 하여 이루어졌고, 합성된 단백질의 확인은 방사능사진을 통하여 통상의 방법에 따라 이루어졌다[Endo, Y. et al., (1992) J. Biotech., 25, 221-230][Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2000) 97, 559-564]. 결과를 도 2의 (A) 및 도 2의 (B)에 도시하였다.

대조로서 종래의 회분식 무세포 단백질 합성방법을 실시하였다. 이 방법에서, mRNA, 밀배아 추출물 및 이들을 함유한 단백질 합성반응액은 상기 확산연속회분식 무세포 단백질 합성방법에서 사용된 것과 동일하지만, 공급용액을 첨가하지 않는 점이 다르다.

도 2의 (A)로부터 명확히 알 수 있는 바와 같이, 종래의 회분식(○-○)에서는 반응개시 1시간 후에 단백질 합성반응이 정지하였다. 이 결과는 공지의 간행물에 나타난 결과[Endo, Y. et al., (1992) J. Biotech., 25, 221-230][Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, 559-564]와 완전히 일치하고 있다.

한편, 구경 7 mm의 반응용기(계면의 면적은 0.385 cm²)를 이용한 중층방식(큰 □-□)에서는 반응개시 후 17시간에 이르러도 합성반응이 계속되고, 그 합성량은 종래의 회분법을 이용한 경우의 9배 이상에 달하였다. 더욱이 크기가 다른 반응용기를 이용하여 그 합성반응에 미치는 반응상과 공급상간의 계면면적의 영향을 조사한 결과, 반응개시 9시간 후의 합성효율은 구경 7 mm의 반응용기를 이용한 경우와 비교하여, 구경 5 mm의 반응용기(계면면적은 0.196 cm²)(중간 □-□)에서는 91%, 또한 구경 3 mm의 반응용기(계면면적은 0.071 cm²)(작은 □-□)에서는 75%이었다.

또한, 도 2의 (B)에 나타낸 방사능 사진은 종래의 회분법 및 확산연속회분식에서 합성된 단백질의 합성반응시간 경과와 합성산물의 분자량 및 합성량에 대해서, 도 2의 (A)에 나타낸 ¹⁴C-루이신 수득량의 측정에 의한 단백질 합성량의 검토에 의해 얻어진 실험결과를 완전히 지지하는 것이었다. 도 2의 (B)에서 확산연속회분식은 중층방식으로 표시되어 있다. 또한, 확산연속회분식에 의한 단백질 합성결과는 구경 7 mm의 반응용기를 사용한 경우의 결과만을 도시하였다.

또한, 이 방법에 있어서 하기 참고예 1에 나타낸 전사·번역 일체형 단백질합성법으로 mRNA를 전사방응용액에서 합성한 후에, 이어서 겔여과법이나 투석법 등으로 당해 전사반응용액의 조성을 번역반응에 적절한 조성을 갖는 용액으로 변환하고, 얻어진 용액을 합성반응용액으로 이용하여 상기와 같이 단백질 합성을 수행한 경우에도 동일한 결과를 얻을 수 있었다.

이상의 결과로부터 ① 밀배아 추출물을 이용하는 확산연속회분식 단백질 합성방법이 종래의 회분법에 비교하여 현저히 합성효율이 높은 것, ② 그 합성효율은 반응상과 공급상 간의 계면면적이 클수록 우수하다는 것이 명백하게 되었다. 또한, 이 방법에 의한 합성 수득량의 상승이 합성반응시간의 지속에 의한 것으로 판명되었다.

실시예2

희석회분식 무세포 단백질 합성방법의 일 예로서, 실시예 1에서 조제한 밀배아 추출물 및 GFP를 코딩하는 mRNA를 함유한 단백질 합성반응액을 이용하여 종래의회분식에서 26℃에서 15분간 프리인큐베이션시킨 후, 5배 용량의 희석용액을 첨가한 후, 정치조건 하에서 다시 26℃에서 3, 6 및 9시간 인큐베이션시켜 단백질 합성반응을 실시하였다. 희석용액은, 실시예 1에서 조제한 공급용액과 동일한 조성의 용액을 이용하였다. 합성된 단백질의 측정은 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였으며, 그 결과를 도 2의 (A)(■-■) 및 도 2의 (B)에 도시하였다.

도 2의 (A)로부터 명백히 알 수 있는 바와 같이 1시간이면 합성반응이 정지되는 종래의 회분식(○-○)과 비교하여, 희석회분식에서 무세포 단백질 합성을 실시하면 반응개시 6시간까지는 합성반응의 지속이 직선의 형태로 나타났다(■-■).

또한 도 2의 (B)에 나타낸 방사능 사진은 도 2의 (A)에 나타낸 ¹⁴C-루이신 수득량의 측정에 의한 단백질 합성량의 검토에 의하여 얻어진 실험결과를 완벽히 지지하는 것이었다.

이 희석회분식 무세포 단백질 합성방법은 실시예 1에 나타낸 확산연속회분식에 의해서는 합성효율이 열등한 반면, 단백질 합성량은 종래의 회분법에 비하여 약 3배로 유의적으로 높은 합성효율을 나타내었다.

또한, 이 방법에 있어서도 하기 참고예 1에 나타낸 전사·번역 일체형 단백질 합성법을 이용하여 mRNA를 전사반응용액에서 합성한 후에, 겔여과법이나 투석법 등으로 당해 전사방응용액의 조성을 번역반응에 적합한 조성을 갖는 용액으로 변환 하고, 얻어진 용액을 합성반응용액으로 이용하여 상기와 같은 단백질 합성을 수행한 경우에 동일한 결과를 얻을 수 있었다.

또한, 상기 희석회분식 무세포 단백질 합성방법에 있어서, 프리인큐베이션 반응조작을 생략한 경우에는 상기와 같은 현저한 합성반응의 지속현상은 볼 수 없었다. 더욱이, 대장균 추출액을 이용한 무세포 단백질 합성계에서는 희석회분식의 효과는 확인되지 않았다.

이상, 밀배아 추출물을 이용한 무세포 단백질 합성계에서는 희석회분식 무세포 단백질 합성방법도 유효한 단백질 합성수단이라는 것이 실증되었다.

실시예 3

확산연속 회분식 무세포 단백질 합성방법에 있어서, 실시예 1에서 이루어진 GFP의 합성 이외에도 대장균 유래의 디히드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase; DHFR)를 합성할 수 있는 것을 실증하고, 이 방법이 일반적인 단백질 분자물질의 합성에 유효하다는 사실을 확인하였다.

mRNA가 DHFR을 코딩하는 mRNA인 점 이외에는 실시예 1과 동일한 조성의 단백질 합성반응액을 이용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 단백질 합성을 수행하고, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 합성된 단백질량의 측정은 통상적인 방법에 따라서 방사성 동위체의 트리클로로아세트산 불용분획에서의 수득량을 지표로 이용하고, 합성된 단백질의 확인은 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동법에 의한 분리와 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue; CBB)를 이용한 염색을 통하여 이루어졌다[Endo, Y. et al., (1992) J. Biotech., 25, 221-230][Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2000) 97, 559-564].

도 3의 (A)에 나타낸 바와 같이 DHFR 합성에 있어서도, 확산연속회분식 무세포 단백질 합성방법(■-■)의 합성반응시간은 종래의 회분법(○-○)에 비하여 유의적으로 지속되었다. SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동법에 의한 합성반응의 시간경과와 합성산물량의 분석결과[도 3의 (B), 화살표는 DHFR의 쿠마시 브릴리언트 블루에 의한 염색밴드를 나타낸다]는 도 3의 (A)에 나타낸 결과를 완벽히 지지하는 것이었다. 합성 DHFR의 밴드 염색강도를 측정함으로써, 확산연속회분식 무세포 단백질 합성방법에 의한 8시간의 반응에서 반응용량 1 mL 당 0.9 mg의 DHFR을 합성할 수 있다는 것이 판명되었다.

실시예 4

확산연속회분식 무세포 단백질 합성방법이 어떠한 생물종을 이용하여 조제한 세포추출액을 이용하는 무세포 단백질 합성계에 있어서도 보편적으로 유효하다는 점을 대장균 추출액을 사용하여 실증하였다.

대장균 추출액은 공지의 간행물[Pratt, J. M., Transcription and Translation(1984), 179-209, Hames, B. D. & Higgins, S. J., eds, IRL Press, Oxford]에 준하여 조제하였다. 또한 본 실시예에서는 mRNA를 전사·번역 일체형 무세포 단백질 합성계(참고예 1을 참조)에서 우선 합성하여, 당해 mRNA를 함유하는 전사반응용액을 겔여과법에 의해 번역반응에 적합한 반응용액조성으로 변환한 후에 반응용기에 넣고, 실시예 1과 동일하게 공급액을 중층시켜 정치조건 하에서 30℃에서 단백질 합성반응을 수행하였다.

우선, 대장균 추출액을 전용량의 50%가 되도록 하고, 아래와 같은 최종 농도조성 즉, 57 mM HEPES-KOH(pH 8.2), 75 mM 아세트산칼륨, 36 mM 아세트산암모늄, 16 mM 아세트산마그네슘, 1.7 mM 디치오스레이톨, 0.3 U/mL 파이루베이트 키나아제, 0.17 mg/mL 대장균 tRNA 혼액, 34 mg/mL L-5-포르밀-5,6,7,8-테트라하이드로엽산(L-5-formyl-5,6,7,8-tetrahydrofolic acid), 33 ㎍/mL T7 RNA 폴리머라아제, 1.2 mM ATP, 0.85 mM GTP와 UTP와 CTP, 56 mM 포스포에놀피루빈산, 20종류의 L형 아미노산(각 0.2 mM)로 구성된 대장균 무세포 단백질 합성반응액을 조제하고, 30℃에서 90분간 인큐베이션시켜 mRNA를 합성하였다. 이어서, 겔여과법에 의해 상기 반응액 조성을 번역반응에 적합한 조성으로 변환한 후, 이 용액 25 ㎕를 반응용기(구경 7 mm 마이크로타이타 플레이트)에 옮겨 하기 조성의 공급용액을 천천히 중층시키고 30℃에서 단백질 합성을 실시하였다. 단백질 합성을 아미노산의 수득량을 지표로 하여 측정한 경우에는 ¹⁴C-루이신(300 mCi/mmol)을 상기 반응용액에 1 mL에 대하여 4 uCi 첨가하였다.

mRNA의 전사주형이 되는 플라스미드는 목천(木川) 등의 보고하고 있는 T7-파지프로모터서열을 갖는 pK7-RAS[Kigawa, T., et al., (1995) J. Biomol. NMR, 6, 129-134]를 토대로 하여, RAS 유전자를 해파리의 GFP 유전자에 끼워넣은 것을 이용하였다.

대장균 무세포 단백질 합성계에서 이용한 공급용액조성은 최종농도 57 mM HEPES-KOH(pH 8.2), 75 mM 아세트산칼륨, 36 mM 아세트산암모늄, 16 mM 아세트산마 그네슘, 1.7 mM 디치오스레이톨, 34 mg/mL L-5-포르밀-5,6,7,8-테트라하이드로엽산(L-5-formyl-5,6,7,8-tetrahydrofolic acid), 1.2 mM ATP, 0.85 mM GTP와 UTP와 CTP, 56 mM 포스포에놀피루빈산, 20종류의 L형 아미노산(각 0.2 mM)로 구성된다. 단백질 합성을 아미노산의 수득량을 지표로 하여 측정한 경우에는 ¹⁴C-루이신을 반응용액 1 mL에 대하여 4 uCi 첨가하였다.

도 4의 (A)에 ¹⁴C-루이신 수득량을 이용하여 단백질 합성을 측정한 결과를 나타내었다. GFP 합성반응은 종래의 회분법(○-○)에서는 반응개시 후 3시간이 지나면 반응이 완전히 정지하였지만, 확산연속회분식 무세포 단백질 합성방법(■-■)에서는 반응개시 후 17시간까지 지속되었다. 아미노산의 수득량으로부터 합성단백질량을 계산하였더니, 확산연속회분식 무세포 단백질 합성방법에 의한 합성량은 회분법에 의한 경우의 4배 이상에 달하였다. 도 4의 (B)에 나타낸 방사능 사진에 의한 합성반응의 시간경과와 합성산물의 분자량 및 합성량의 분석결과는 도 4의 (A)의 결과를 완벽히 지지하는 것이었다. 반면, 상기 단백질 합성반응용액(반응상)에 상기 공급용액(공급상)을 중층시킨 직후에 양상을 보르텍스 믹서(vortex mixer)에서 혼합하는 대조실험에서는 종래의 회분법에 비하여 유의적으로 단백질 합성이 저하하였다.

이 실험은 김에 의해 보고되어 있는 공지의 사실[Kim, D. M., (1996) Eur. J. Biochem. 239, 881-886], 즉 대장균 무세포 단백질 합성계에 있어서는 반응용액 중의 세포 추출액을 고농도로 하는 것이 합성의 효율화에 중요하다는 결과와 완전히 일치하고 있다. 이 결과는 확산연속회분식에서 볼 수 있는 단백질 합성반응 지속시간의 연장현상이 단순히 반응용액 중의 단백질 합성에 필요한 성분, 예를 들어 리보솜 등의 농도 저하로 인한 반응속도의 저하에 기인한 것이 아니고, 확산연속회분식 무세포 단백질 합성방법이 갖는 특성이라는 것을 명확히 나타내고 있다.

더욱이, 대장균 추출액을 이용하여 전사·번역 일체형 무세포 단백질 합성계(참고예 1을 참조)에서 우선 mRNA를 합성한 후에, 실시예 1과 동일하게 반응용액 상에 공급용액을 중층시켜 정치조건 하에서 30℃에서 단백질 합성반응을 실시하여도, 상기와 동일한 결과를 얻을 수 있었다.

실시예 5

아래에, 겔여과법을 이용한 불연속회분식을 이용하고 밀배아 추출물을 원료로 하는 무세포 단백질 합성방법의 예를 설명한다. 우선 실시예 1에서 조제한 것과 동일한 단백질 합성용액을 통상의 소형 시험관 혹은 96공 타이터플레이트에 넣고, 정치조건 하에서 26℃에서 통상의 방법에 따라 반응시켰다. 이 반응조건 하에서는 단백질 합성은 수 시간, 예를 들어 용량의 48%의 밀배아 추출액을 함유하는 반응액의 경우에는 반응개시 후 1시간이면 합성반응은 완전히 정지한다. 이는 단백질에서의 아미노산 수득량의 측정 및 자당 밀도구배 원심법에 의한 폴리리보솜 해석으로부터 확인할 수 있다[Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2000) 97, 559-564]. 상기 합성반응이 정지한 반응용액을 겔여과시킨 후, 미리 기질이나 에너지원, 예를 들어 아미노산, ATP, GTP, 단백합성반응에 필요한 그 외의 이온류와 완충액을 함유 한 공급용액에서 평형화시켜 둔 세파덱스 G-25칼럼을 이용하여 겔여과한 후, 다시 26℃에서 단백질 합성을 실시하였다. 당해 공급용액은 실시예 1에서 이용한 공급용액과 동일한 조성이다.

도 5에서 ¹⁴C-루이신 수득량의 결과가 나타내는 바와 같이, 종래의 회분식에서는 반응개시 후 1시간이면 완전히 합성반응이 정지하였다(■-■). 그러나, 반응개시 3시간 후에 상기와 같이 겔여과 조작을 수행하고(도 5에 화살표로 나타내었다), 인큐베이션시켰더니 재차 단백질 합성반응이 개시되었다(□-□). 또한, ¹⁴C-루이신 수확의 속도구배가 반응개시 초기의 속도구배와 거의 동일하기 때문에, 겔여과 후의 단백질 합성효율은 반응초기에 비하여 저하하지 않는 것으로 판명되었다.

또한, 이 방법에 있어서도 하기 참고예 1에 나타낸 전사·번역 일체형 단백질 합성법을 이용하여 mRNA를 전사반응용액에서 합성한 후, 겔여과법이나 투석법 등으로 당해 전사반응액의 조성을 번역반응에 적합한 조성을 갖는 용액으로 변환하고, 얻어진 용액을 합성반응용액으로 이용하여 상기와 같은 방법으로 단백질 합성을 실시한 경우에 동일한 결과를 얻을 수 있었다.

밀배아 추출액을 이용하는 상기 무세포 단백질 합성계는 극히 안정적[Endo, Y. et al., (1992) J. Biotech., 25, 221-230][Proc. Natl. Acac. Sci. USA(2000) 97, 559-564]이기 때문에, 이러한 겔여과 조작을 반복함으로써 반응시간을 장시간에 걸쳐 지속시키는 것이 가능하다. 따라서, 상기 불연속 회분식 무세포 단백질 합성방법은 예를 들어 밀배아를 이용한 무세포 단백질 합성계에서 고효율 단백질 합성방법으로서 유용한 것이다.

참고예 1

전사·번역 일체형 단백질 합성법에 의해, mRNA를 전사반응용액에서 합성한 후에 이어서 겔여과법이나 투석법 등으로 당해 전사반응용액의 조성을 번역반응에 적절한 조성을 갖는 용액으로 변환시키고, 얻어진 용액을 합성반응용액으로 사용할 수 있다.

우선, 반응용기로 겔여과필터를 장착시킨 스핀컬럼을 이용하여 동 용기 내에 주형 DNA, 4종류의 기질 리보뉴클레오티드-5'-3인산, 또한 필요에 따라서 CAP 분자, RNA 폴리머라아제, 스퍼미딘, 마그네슘이온 및 적당한 완충액 등으로 구성된 전사반응용액[80 mM HEPES-KOH(pH 7.6), 16 mM 아세트산마그네슘, 2 mM 스퍼미딘, 10 mM 디치오스레이톨, 2.5 mM ATP, 2.5 mM GTP, 2.5 mM CTP, 2.5 mM UTP, 1 U/㎕ 리보뉴클레아제 저해제, 3 U/㎕ SP6 RNA 폴리머라아제(TAKARA사)]을 첨가한다. 상기의 전사반응용액으로부터 주형 DNA, RNA 폴리머라아제 및 리보뉴클레아제 저해제를 제거한 용액을 별도로 조제하여 투석외액으로 이용하여 mRNA의 투석식 연속합성을 수행한다.

mRNA 합성 후에 스핀칼럼을 저속원심하고, 실시예 1에 기재된 단백질 합성용액(mRNA는 함유하지 않는다)을 이용하여 겔여과 조작을 하고 상기 전사반응용액을 번역반응에 적합한 단백질 합성용액으로 변환한다.

본 발명에 관한 상기 무세포 단백질 합성방법은, 반투막을 이용한 한외여과막법이나 투석막법, 또한 수지에 번역주형을 고정화한 칼럼 크로마토그래피법[Spirin, A., et al.,(1993) Methods in Enzymology, 217, 123-142]의 복잡한 수법을 이용하는 것이 아니라, 종래부터의 회분식에서 3종류의 합성반응의 효율화 기술을 각각 도입함으로써, 어떠한 수단에 의해서도 조직·세포 추출물을 이용하는 무세포계에서의 단백질의 합성을 고효율로 수행하는 것이 가능하게 한 것이다.

상기 본 발명에 관한 무세포 단백질 합성방법은 종래 실시되고 있는 막을 이용하는 연속식 무세포 단백질 합성법이 갖는 막 재질의 낮은 강도, 공극의 폐색으로 인한 막기능의 저하 및 조작의 번잡성 등의 결점을 갖지 않기 때문에 종래의 방법과 비교하여 현저히 높은 효율로 단백질 합성이 가능하다. 따라서, 상기 본 발명에 관한 기술은 금후의 게놈 프로젝트 완료와 함께 제공될 방대한 수의 유전자에 대한 기능해석 및 구조해석의 기반이 되는 유전자산물(단백질) 생산의 자동화를 위한 기본요소기술이 될 수 있다. 특히, 다검체용 전자동 무세포 단백질 합성 로봇 개발 등 무세포 단백질 합성 시스템의 자동화를 위한 요소 기술로서 불가결한 것이라고 할 수 있다.

Claims

밀배아 추출액, 대장균 추출액 또는 집토끼의 망상 적혈구 추출물 중 어느 하나를 함유하는 합성반응용액(반응상)과 기질 및 에너지원 공급용액(공급상)을 직접 접촉시켜 접촉계면을 매개로 하여 공급상의 기질 및 에너지원을 자유확산에 의해 반응상으로 연속적으로 공급하고,

상기 반응상에서 생성된 부산물은 공급상으로 이동하여 희석되어 제거됨을 특징으로 하는 확산연속 회분식에 의한 무세포 단백질 합성방법.
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제 1항에 있어서, 반응상과 공급상의 사이에 형성된 직접적인 접촉계면이 수직면상에 있는 것을 특징으로 하는 무세포 단백질 합성방법.
제1항에 있어서, 상기 무세포 단백질 합성반응용액은 밀배아 추출액을 포함하는 경우 상기 반응용액을 26℃에서 15분 ~ 30분간 프리인큐베이션한 후에 기질 및 에너지원 공급용액을 첨가하여 반응용액에 포함된 밀배아 추출액을 7~12%로 희석시켜 합성반응을 실시하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 무세포 단백질 합성방법.
i) 회분식 무세포 단백질 합성방법을 이용하여 단백질 합성반응을 개시하고,

ii) 합성반응 정지 후의 반응용액을 겔여과칼럼 또는 반투막에 통과시켜 합성반응에서 생성된 부산물을 제거하고,

iii) 단백질 합성에 필요한 아미노산, 아데노신삼인산(adenosine triphosphate; ATP), 구아닌삼인산(guanine triphosphate; GTP) 및 크레아틴인산(creatine phosphate)을 포함하는 원료 및 에너지원 용액을 상기 반응용액에 재공급하고,

iv) 회분식 무세포 단백질 합성방법을 이용하여 iii) 단계의 반응용액의 단백질 합성을 다시 개시하고, 및

v) 상기 ii) 내지 iv) 단계를 1회 이상 반복하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 회분식 무세포 단백질 합성방법.