CN111621511B - 多蛋白体系的共生产方法、多蛋白体系的循环共生产***及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于蛋白体外合成技术领域，具体涉及一种多蛋白体系的共生产方法、多蛋白体系的循环共生产***及应用。本发明通过将共表达菌株容置于具有三维网络结构的多孔材料中，为不同种共表达菌株提供一个独立生长的环境，起到了空间隔离的作用，避免不同菌群之间的相互作用(尤其是竞争作用)和影响，再在溶菌蛋白的作用下，共表达菌株发生自主裂解释放出其表达的蛋白，形成多蛋白体系，可用于体外合成蛋白质和/或化合物，与现有无细胞蛋白合成***制备方法相比更加简便、快速、高效、成本更低，还可以实现对所生产的多蛋白体系中各种蛋白的含量进行准确调配。

Description

多蛋白体系的共生产方法、多蛋白体系的循环共生产***及 应用
技术领域
本发明属于蛋白体外合成技术领域，具体涉及一种多蛋白体系的共生产方法、多蛋白体系的循环共生产***及应用。
背景技术
细胞是生命活动的基本结构和功能单位，同时也为生化反应提供了场所，有着“细胞工厂”之称。但是，细胞内生化反应网络复杂，人为地改造容易对细胞产生不利或不可预测的影响，最终导致细胞活性降低甚至功能丧失，极大程度上限制了细胞工厂的应用。因此，如何突破细胞工厂的局限是生物合成所面临的巨大挑战。针对细胞工厂的局限，无细胞蛋白合成***(Cell-Free Protein Synthesis,CFPS)提供了很好的解决途径。无细胞蛋白合成***是不依赖于完整的细胞在体外进行蛋白质合成的生物学技术，它以DNA或mRNA为模板，利用细胞提取物中的蛋白合成元件、蛋白折叠因子及其他相关酶系，通过添加氨基酸、tRNA和能量物质等，在体外完成蛋白质合成，模拟生物细胞的生命现象，重现胞内蛋白转录翻译过程，产生的蛋白可用于蛋白质功能检测、结构分析等下游实验。与活细胞体系相比，模块化的无细胞蛋白质合成***反应成分明确简单，组分易操控，实验周期短，为众多生化实验提供了一个开放通用的反应环境。
无细胞蛋白质合成***目前主要分为两种类型：一种是直接来源于细胞裂解物(WCE:Whole-Cell Extracts)，另一种则只含有DNA转录和蛋白质翻译的必需成分，即重组元件蛋白质合成***PURE(Protein synthesis Using Recombinant Elements)。不同于WCE***，PURE***所有添加物完全已知并浓度可控，因而具有多种显著优势：例如低降解酶环境使得mRNA或蛋白质的稳定性得到了极大提高；通过操纵***中的蛋白或底物组分，可以便捷的对要合成的蛋白质进行设计(如非天然氨基酸的***等)，使得***高度模块化并具有灵活性等。
虽然PURE自2002年已经商业化，但其昂贵价格限制了绝大部分实验室的应用。通过传统的方法制备PURE***，需要分别表达并纯化30多种与转录翻译有关的蛋白进行混合配比，目前以NEB(New England Biolab)为代表的大型生物制剂企业仍是采用该种方法进行大量生产，其产品昂贵的价格严重限制了其使用范围和推广范围。2018年有研究者试图通过30多种菌的共同培养到共同纯化来减少工作量，但是由于共培养过程中不同菌株生长速率不同，生长快速的菌株会抢夺营养成为菌群的主导，导致多蛋白体系的最终组分比例与初始菌种接种比例呈现复杂且不可控的关系，这使得单纯利用合成功能菌群无法控制最终多蛋白体系的成分组成，进而导致了PURE***等一系列多蛋白体系的效率的下降。
发明内容
本发明的目的是提供一种多蛋白体系的共生产方法、多蛋白体系的循环共生产***及应用，旨在解决现有无细胞蛋白质合成中存在的效率低、难以控制多蛋白体系中各成分的比例等问题。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明一方面提供了一种多蛋白体系的共生产方法，其包括如下步骤：
提供多种共表达菌株、多孔材料，每种所述共表达菌株分别表达所述多蛋白体系中的一种蛋白以及溶菌蛋白，且不同的所述共表达菌株表达的蛋白各不相同；
将每种所述共表达菌株分别容置于所述多孔材料中，得到多种容置共表达菌株的多孔材料；
将全部的所述容置共表达菌株的多孔材料进行共培养，在所述溶菌蛋白的作用下，所述共表达菌株发生自主裂解，收集所述共表达菌株表达的蛋白，得到所述多蛋白体系；
其中，所述多蛋白体系包括用于蛋白质翻译、能量再生的蛋白质和/或催化合成化合物的酶；
所述多孔材料具有三维网络结构，且所述多孔材料中各孔洞的孔径为1μm-5μm。
本发明另一方面提供一种多蛋白体系的循环共生产***，其包括：
共表达菌株制备单元，用于制备多种共表达菌株，每种所述共表达菌株分别表达所述多蛋白体系中的一种蛋白以及溶菌蛋白，且不同的所述共表达菌株表达的蛋白各不相同；
多孔材料制备单元，用于制备多种容置共表达菌株的多孔材料，每种所述容置共表达菌株的多孔材料分别容置所述多种共表达菌株中的一种，且不同的所述容置共表达菌株的多孔材料容置的共表达菌株各不相同；
培养单元，用于培养所述容置共表达菌株的多孔材料中的共表达菌株；
其中，所述多蛋白体系包括用于蛋白质翻译、能量再生的蛋白质和/或催化合成化合物的酶；
所述多孔材料具有三维网络结构，且所述多孔材料中各孔洞的孔径为1μm-5μm。
本发明再一方面提供上述多蛋白体系的循环共生产***在体外合成蛋白质和/或化合物中的应用。
本发明提供的多蛋白体系的共生产方法的有益效果在于：通过将表达溶菌蛋白的载体和多种表达蛋白的载体共转入到蛋白表达菌株中，所得共表达菌株表达相应的蛋白及溶菌蛋白，然后将共表达菌株容置于具有三维网络结构的多孔材料中，得到容置共表达菌株的多孔材料。由于多孔材料中交联网络的三维结构限制了细菌尺寸大小物质的运动，而相对于细菌菌体尺寸小很多的蛋白质等，其运动不受多孔材料三维网络的限制，因此将共表达菌株限制在多孔材料的内部生长繁殖，随着共表达菌株的生长，产生的溶菌蛋白作用于共表达菌株，使其发生自主裂解，释放出其表达的蛋白，蛋白的分子直径小于多孔材料各孔洞的孔径，可以经过孔洞离开多孔材料，最终菌体裂解后释放的蛋白通过多孔材料的孔洞进入多孔材料的外部培养环境中，即得到多蛋白体系。本发明提供的多蛋白体系的共生产方法集成了共表达菌株破碎与产物分离这两个步骤，不仅可以实现多种共表达菌株的共同培养并一次性收集获得多种蛋白，而且通过多孔材料容置共表达菌株，可以分别为不同种共表达菌株提供一个独立生长的环境，起到了空间隔离的作用，避免不同菌群之间的相互作用(尤其是竞争作用)和影响；同时，将共表达菌株容置于多孔材料的孔洞中时，由于多孔材料的搭载能力决定了共表达菌株在其中密度的上限，因此可以根据实际需求对容置有不同种共表达菌株的多孔材料的数量进行控制，实现对特定共表达菌株的数量的控制，继而使收获的多蛋白体系中各种蛋白的含量与实际需求一致。最后，本发明提供的多蛋白体系的共生产方法中，由于共表达菌株随着生长密度升高，使菌群表达的群体感应效应分子浓度升高，进而促进表达溶菌蛋白的质粒拷贝数增高，随之表达的溶菌蛋白量增加，菌群开始发生裂解，随着菌群的裂解，菌群密度相应降低，菌群表达的群体感应效应分子浓度降低，表达溶菌蛋白的质粒拷贝数随之感应下降，进而表达的溶菌蛋白量降低，菌群裂解的速度也降低，然后恢复生长，菌群的密度逐渐升高，如此往复，实现多蛋白体系的循环式共生产。
本发明提供的多蛋白体系的循环共生产***的有益效果在于：多蛋白体系的循环共生产***包括共表达菌株制备单元、容置共表达菌株的多孔材料制备单元和培养单元。一方面，共表达菌株制备单元制备多种共表达菌株，由于每种共表达菌株分别表达多蛋白体系中的一种蛋白及溶菌蛋白，在溶菌蛋白的作用下，共表达菌株发生自主裂解，释放出多种蛋白；另一方面，在容置共表达菌株的多孔材料制备单元中，将共表达菌株容置于具有三维网络结构的多孔材料中得到多种容置共表达菌株的多孔材料，多孔材料为不同种共表达菌株提供了独立的生长环境，起到了空间隔离的作用，避免不同菌群之间的相互作用(尤其是竞争作用)和影响；同时，共表达菌株容置于多孔材料的孔洞中，由于多孔材料的搭载能力决定了共表达菌株在其中密度的上限，因此可以根据实际需求对容置有不同种共表达菌株的多孔材料的数量进行控制，实现对特定共表达菌株的数量的控制，继而使收获的多蛋白体系中各种蛋白的含量与实际需求一致；再一方面，由于多孔材料的三维网络结构限制了细菌尺寸大小物质的运动，而相对于细菌菌体尺寸小很多的蛋白质等，其运动不受多孔材料三维网络的限制，因此，通过将共表达菌株限制在多孔材料的内部生长繁殖，随着共表达菌株的生长，产生的溶菌蛋白作用于共表达菌株，使其发生自主裂解，释放出其表达的蛋白，蛋白通过多孔材料的孔洞进入多孔材料的外部培养环境中，得到多蛋白体系。最后一方面，由于共表达菌株的裂解导致其生长密度降低，停止自主裂解并继续生长繁殖，当其生长密度再次达到自主裂解密度时又再次发生自主裂解，如此往复，使多蛋白体系的共生产***实现循环式共生产。
本发明提供的多蛋白体系的循环共生产***将多种共表达菌株分别容置于具有三维网络结构的多孔材料中，得到多种容置共表达菌株的多孔材料，空间隔离多孔材料为不同种共表达菌株提供了一个天然的空间隔离屏障，避免了在共培养过程中不同菌群之间的相互作用(尤其是竞争作用)和影响。与现有制备无细胞蛋白合成***的方法相比，本发明提供的多蛋白体系的循环共生产***集成了共表达菌株破碎与产物分离这两个步骤，不仅更加简便、快速、高效、成本更低，而且还可以实现对所生产的多蛋白体系中各种蛋白的含量进行准确调配。
附图说明
图1为本发明其中一个实施例提供的多蛋白体系的共生产方法的效果示意图；
图2为本发明其中一个实施例提供的壳聚糖微胶囊的剖面电镜图；
图3为本发明其中一个实施例提供的容置有共表达菌株的多孔材料的制备过程示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和技术效果更加清楚，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。结合本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
在本发明的描述中，需要理解的是，本发明实施例中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本发明实施例相关组分的含量按比例放大或缩小均在本发明公开的范围之内。具体地，本发明实施例中所述的重量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。
另外，除非上下文另外明确地使用，否则词的单数形式的表达应被理解为包含该词的复数形式。术语“包括”或“具有”旨在指定特征、数量、步骤、操作、元件、部分或者其组合的存在，但不用于排除存在或可能添加一个或多个其它特征、数量、步骤、操作、元件、部分或者其组合。
在本发明的描述中，术语“和/或”视为具有或不具有另一个的两个指定特征或组分中的每一个的具体公开。因此，如在本文中的短语例如“A和/或B”中所使用的术语“和/或”旨在包括A和B；A或B；A(单独)；和B(单独)。同样地，如在短语例如“A、B和/或C”中所使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
除非本发明另有定义，否则本发明内容中使用的术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。例如，本发明实施例中的细胞与组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸有关的任何术语和技术都是本领域众所周知的和常用的。在任何潜在歧义的情况下，本发明提供的定义优先于任何词典或外部定义。
在本发明的描述中，术语“载体”包括质粒、噬菌体、病毒或其它载体。
本发明实施例提供了一种多蛋白体系的共生产方法，其包括如下步骤：
S1、提供多种共表达菌株、多孔材料，每种共表达菌株分别表达多蛋白体系中的一种蛋白以及溶菌蛋白，且不同的共表达菌株表达的蛋白各不相同；
S2、将每种共表达菌株分别容置于多孔材料中，得到多种容置共表达菌株的多孔材料；
S3、将全部的容置共表达菌株的多孔材料进行共培养，在溶菌蛋白的作用下，共表达菌株发生自主裂解，收集共表达菌株表达的蛋白，得到多蛋白体系；
其中，多蛋白体系包括用于蛋白质翻译、能量再生的蛋白质和/或催化化合物合成的酶；
多孔材料具有三维网络结构，且多孔材料中各孔洞的孔径为1μm-5μm。
现有的菌群制备无细胞蛋白合成***的方法中，在菌群的共培养阶段，由于不同菌群之间会产生复杂的相互作用(尤其是竞争作用)，且各菌群的生长速度各不相同，混合菌群培养时，有的菌群生长的很快，生产了大量的蛋白；有的菌群生长的较慢，生产的蛋白量较少，这将导致混合菌群生产的蛋白组分难以预测，实际收获的蛋白组分与预期的蛋白组分存在较大差别。本发明实施例为了克服该问题，通过将表达溶菌蛋白的质粒和多种表达蛋白的质粒共转入到蛋白表达菌株中，所得共表达菌株表达相应的蛋白及溶菌蛋白，然后将共表达菌株容置于具有三维网络结构的多孔材料中，得到的容置共表达菌株的多孔材料提供了一个空间隔离的作用，由于多孔材料中的三维网络结构限制了细菌尺寸大小的物质运动，而相对于细菌菌体尺寸小很多的蛋白质等，其运动不受多孔材料三维网络的限制，因此，通过将共表达菌株限制在多孔材料的内部生长繁殖，随着共表达菌株的生长，产生的溶菌蛋白作用于共表达菌株，使其发生自主裂解，释放出其表达的蛋白，蛋白通过多孔材料的孔洞进入多孔材料的外部培养环境中，得到多蛋白体系。本发明实施例提供的多蛋白体系的共生产方法集成了共表达菌株破碎与产物分离这两个步骤，不仅可以实现多种共表达菌株的共同培养并一次性收集获得多种蛋白，而且通过多孔材料容置共表达菌株，可以分别为不同种共表达菌株提供一个独立生长的环境，起到了空间隔离的作用，避免不同菌群之间的相互作用(尤其是竞争作用)和影响；同时，将共表达菌株容置于多孔材料的孔洞中时，由于多孔材料的搭载能力决定了共表达菌株在其中密度的上限，因此可以根据实际需求对容置有不同种共表达菌株的多孔材料的数量进行控制，实现对特定共表达菌株的数量的控制，继而使收获的多蛋白体系中各种蛋白的含量与实际需求一致(如图1所示，其中，A表示使用多孔材料将不同种共表达菌株进行空间隔离，将不同种共表达菌株分别限制在各自的多孔材料中生长繁殖；B表示经过多孔材料将不同种共表达菌株进行空间隔离后，避免不同菌群之间的相互作用(尤其是竞争作用)和影响，使多蛋白体系中实际蛋白的组成与理想蛋白组成一致)。最后，本发明实施例提供的多蛋白体系的共生产方法中，由于共表达菌株随着生长密度升高，使菌群表达的群体感应效应分子浓度升高，进而促进表达溶菌蛋白的质粒拷贝数增高，随之表达的溶菌蛋白量增加，菌群开始发生裂解；随着菌群的裂解，菌群密度相应降低，菌群表达的群体感应效应分子浓度也降低，表达溶菌蛋白的质粒拷贝数随之感应下降，继而表达的溶菌蛋白量降低，菌群裂解的速度也降低，然后恢复生长，菌群的密度又逐渐升高。如此往复，实现多蛋白体系的循环式共生产。
具体的，S1中，每种共表达菌株分别表达多蛋白体系中的一种蛋白以及溶菌蛋白，且不同的共表达菌株表达的蛋白各不相同。在一些实施例中，采用如下方法进行共表达菌株的构建：将表达溶菌蛋白的质粒和多种表达蛋白的质粒分别共转入蛋白表达菌株中，得到多种共表达菌株；其中，多种表达蛋白的质粒中，每种质粒不重复地表达多蛋白体系中的一种蛋白。
进一步地，表达溶菌蛋白的载体可用于表达溶菌蛋白。溶菌蛋白是一类通过不同途径抑制宿主细胞的细胞壁合成，或直接破坏宿主细胞的细胞壁的蛋白质。通过将表达溶菌蛋白的载体转入蛋白表达菌株中，随着细菌的生长，表达溶菌蛋白的质粒拷贝数也相应增加，导致溶菌蛋白的表达量升高，进而使共表达菌株发生自主裂解。在一些实施例中，选择表达噬菌体
Figure BDA0002507673860000093
E蛋白的质粒ePop作为表达溶菌蛋白的载体。ePop作为一种工程化的基因线路质粒，其中含有两个主要模块：一个细胞裂解模块：该模块基于来自噬菌体
Figure BDA0002507673860000094
E蛋白的基因。噬菌体
Figure BDA0002507673860000095
只含有10个基因，其溶菌机制是产生单一的E蛋白，E蛋白可以有效抑制肽聚糖合成酶MraY，从而抑制肽聚糖的合成，并且，E蛋白还可以抑制肽聚糖前体物质二氨基庚酸进入细胞壁，进而引起宿主细胞的溶解。另一模块是细胞密度传感模块，该模块基于突变的luxR基因和ColE1来源的、缺少Rom/Rop蛋白复制的基因。因此，使用质粒ePop可以实现编程自主裂解，通过将E蛋白表达模块与细胞密度传感模块偶联，当蛋白表达菌株在培养繁殖中达到一定密度时，表达噬菌体
Figure BDA0002507673860000091
E蛋白的质粒ePop拷贝数增加，E蛋白的表达也更高，进而导致共表达菌株发生自主裂解。需要说明的是，基因线路可根据需要执行的功能调节相应的模块，因此上述选择表达噬菌体
Figure BDA0002507673860000092
E蛋白的质粒ePop的实施例仅为本发明实施例的其中一个选择，即使不使用该基因线路，利用其他可使细胞产生自主裂解或诱导裂解的基因线路；或者可以使蛋白表达菌株在生长密度达到较高时发生自主裂解的技术方案都应属于本发明的保护范围。
多种表达蛋白的质粒用于表达多蛋白体系。在一些实施例中，通过构建多种表达蛋白的载体，且表达蛋白的载体的种类数量与多蛋白体系中蛋白的种类数量相等。其中，每种表达蛋白的载体不重复地表达多蛋白体系中的一种蛋白。
蛋白表达菌株在本发明实施例中用于共表达溶菌蛋白和多蛋白体系中的蛋白，因此，原则上适合共表达溶菌蛋白和其它蛋白表达菌株均适用于本发明。在一些实施例中，为了实现蛋白的稳定生产，选择大肠杆菌菌株作为蛋白表达菌株。具体地，大肠杆菌菌株包括但不限于BL21(DE3)、MC4100、MG1655、NISSLE1917系列的菌株、它们的突变菌株或衍生菌株。
S2中，将共表达菌株容置于具有三维网络结构的多孔材料中，从而得到多种容置共表达菌株的多孔材料。在一些实施例中，多孔材料的结构为包括多个孔洞的海绵状结构和/或包括空心部的空心囊状结构；当多孔材料的结构为海绵状结构时，共表达菌株生长在三维交联结构形成的支架，或容置于海绵状结构的孔洞中，例如海藻酸钠水凝胶胶囊及壳聚糖水凝胶胶囊；当多孔材料的结构为空心囊状结构时，共表达菌株容置于空心囊状结构的空心部内，例如脂质体(liposome)、胶束等。
在一些实施例中，选择壳聚糖微胶囊(如图2所示)和/或海藻酸盐微胶囊作为多孔材料。具体地，壳聚糖微胶囊的制备方法可以由壳聚糖和三聚磷酸盐交联得到；海藻酸盐微胶囊的制备方法可以由海藻酸钠和氯化钙交联得到。由于壳聚糖高分子水溶液的pKa值为6.2-6.8，属于带正电荷的高分子材料，因此，当溶液的pH低于壳聚糖的pKa值时，高分子链带正电，壳聚糖微胶囊发生溶胀；反之壳聚糖微胶囊发生收缩。此外，随着溶液离子强度升高，在电荷屏蔽作用下导致高分子链塌缩，进而壳聚糖微胶囊也发生收缩；反之壳聚糖胶囊发生溶胀。基于上述特性，结合共表达菌株在培养过程中会同步改变培养环境中的pH值以及离子强度，因此当使用壳聚糖微胶囊作为多孔材料时，随着共表达菌株的生长繁殖，壳聚糖微胶囊会发生收缩，为蛋白经过孔洞释放到微胶囊的外部进一步提供了动力，有助于蛋白从微胶囊内部运输到外部。制备壳聚糖微胶囊和/或海藻酸盐微胶囊的方法也可以采用多种方法实现，具体地，可以采用电喷雾法来完成。以多孔材料为壳聚糖微胶囊为例，具体地，将壳聚糖溶液与一种共表达菌株的菌液混合，所得混合物装入注射器中，将注射器放置在配备有注射泵的电喷雾***中，电喷雾***的阳极连接到注射器的针头，阴极连接到装有交联溶液(三聚磷酸盐)的无菌金属接收容器，混合物在高压1kV-5kV、0.25mL/min-2mL/min流速下以喷雾形态进入接收容器与搅拌条件下的交联溶液交联约20min，经离心、洗涤，得到容置有该共表达菌株的壳聚糖微胶囊。
多孔材料中各孔洞的孔径为1μm-5μm，而共表达菌株的细胞直径约为1μm，多孔材料的三维网络结构可以将共表达菌株限制在孔洞内，并限制了共表达菌株的运动；与此同时，该孔径大小允许营养物质(如培养基等)和蛋白质分子的通过，所以当共表达菌株发生自主裂解释放其表达的蛋白时，蛋白可以通过该孔洞离开多孔材料，进入多孔材料外部的培养环境中进而被收集。
多孔材料的直径决定了其大小，也决定了其可容置的共表达菌株的数量。在一些实施例中，多孔材料的直径为50μm-5000μm。在一些实施例中，多孔材料的直径为100μm-800μm。此时，其可容置的共表达菌株数量约为102-103个。
S3中，通过将S2得到的所有容置有共表达菌株的多孔材料进行共培养，当多孔材料内的共表达菌株生长到一定密度时，其表达的溶菌蛋白浓度达到破坏共表达菌株细胞壁的浓度，此时共表达菌株发生自主裂解，将其表达的蛋白释放出来。其中，由于每种共表达菌株分别表达多蛋白体系中的一种蛋白，将所有容置有共表达菌的多孔材料释放的蛋白收集起来，即组成多蛋白体系。
在一些实施例中，可以对共表达菌株发生自主裂解的时机进行控制。具体地，当表达溶菌蛋白的载体为表达噬菌体
Figure BDA0002507673860000111
E蛋白的质粒ePop时，可实现对ePop的基因线路中关于细胞自主裂解模块进行设置，使其在共表达菌株的生长密度达到某个数值时，表达噬菌体
Figure BDA0002507673860000112
E蛋白的质粒ePop的拷贝数会显著增加，进而表达更多的溶菌蛋白，促进共表达菌株发生自主裂解。需要说明的是，上述方法仅提供了一种更加有利于实现控制共表达菌株发生自主裂解的实际的方法，由于共表达菌株自身已经表达溶菌蛋白，因此即使不通过上述设置基因线路的方法，当共表达菌株在培养过程中，所表达的溶菌蛋白达到一定的浓度时，也可以使共表达菌株发生自主裂解。在一些实施例中，将多种容置共表达菌株的多孔材料进行共培养之前，先将每种共表达菌株进行单独培养，然后再分别容置于多孔材料中进行共培养。通过将每种共表达菌株进行单独培养，可以活化共表达菌株，使其达到较佳状态，此时，在每种共表达菌株单独培养的环境中加入葡萄糖，以用于抑制菌株发生自主裂解，从而使菌株可以顺利繁殖到一定的密度；然后将各种共表达菌株分别容置于多孔材料中，对所有容置共表达菌株的多孔材料进行共培养，形成共培养体系，此时不加入葡萄糖，使自主裂解线路打开，因此多孔材料中的共表达菌株在生长达到自主裂解的密度时即发生自主裂解，表达的多种蛋白穿过多孔材料的孔洞，释放到培养环境中。具体地，加入葡萄糖用于抑制共培养菌株发生自主裂解时，葡萄糖在培养环境下(如培养基中)的终质量体积浓度为0.5％-2％。多蛋白体系可以有很多种，其是各代谢途径中所包括的一系列具有催化功能的蛋白的总称。在本发明实施例中，多蛋白体系包括用于蛋白质翻译和能量再生的蛋白质和/或催化合成化合物的酶。其中，用于蛋白质翻译和能量再生的蛋白质组成的多蛋白体系是实现体外合成蛋白质的关键，在本发明实施例中，能量再生所必需的蛋白包括肌酸激酶、肌激酶、二磷酸核苷激酶和焦磷酸酶；催化合成化合物的酶组成的多蛋白体系可以实现多种目标化合物的高效合成，目前在生物、化工、医疗等领域均有应用。
在一些实施例中，选择聚酮化合物合成酶体系和/或非核糖体多肽合成酶体系作为多蛋白体系共生产方法的目标多蛋白体系。其中，聚酮化合物是由细菌、放线菌、真菌或植物产生的一大类天然产物，包括大环内酯类、四环素类、蒽环类、聚醚类等化合物。由于这些天然产物具有抗感染、抗真菌、抗肿瘤、免疫抑制等多种活性，因此提供可高效生产聚酮化合物合成酶体系的方法在医疗领域具有重要意义。催化合成聚酮化合物的酶即为聚酮化合物合成酶(polyketidesynthase,PKS)，具体包括PKS I、PKS II、PKS III。非核糖体多肽合成酶是一类特殊的酶，其可以在没有核糖体、不以mRNA为模板、也不需tRNA为携带工具的情况下，利用氨基酸及其它化合物(如水杨酸、吡啶羧酸等)合成特殊多肽。细菌和真菌体内通过非核糖体多肽合成酶可合成青霉素、万古霉素、放线菌素D、杆菌肽、环孢菌素A等，高效生产非核糖体多肽合成酶体系将为高效合成上述药物化合物提供更便利的条件。
在一些实施例中，选择以重组元件蛋白质合成体系作为多蛋白体系共生产方法的目标多蛋白体系。重组元件蛋白质合成体系也是多蛋白体系中的一种，其包括的一系列蛋白可以在体外条件下用于合成目的蛋白。与非核糖体多肽合成酶体系不同的是，在合成目的蛋白过程中，重组元件蛋白质合成体系需要核糖体和氨基酸的参与，同时还需要以DNA或mRNA作为模板，以tRNA作为携带氨基酸的工具。
在一些实施例中，当以mRNA作为模板时，重组元件蛋白质合成体系包括翻译起始因子1(translational initiation factor1，IF1)、翻译起始因子2(translationalinitiation factor 2，IF2)、翻译起始因子3(translational initiation factor 3，IF3)、翻译延伸因子G(translational elongation factor G，EF-G)、翻译延伸因子Tu(translational elongation factor Tu，EF-Tu)、翻译延伸因子Ts(translationalelongation factor Ts，EF-Ts)、翻译延伸因子4(translational elongation factor 4，EF-4)、翻译释放因子1(translational release factor 1，RF1)、翻译释放因子2(translational release factor 2，RF2)、翻译释放因子3(translational releasefactor 3，RF3)、核糖体循环因子(ribosome recycling factor，RRF)、甲硫氨酰-tRNA甲酰转移酶(Met-tRNA formyltransferase)、22种氨酰-tRNA合成酶、肌酸激酶(creatinekinase，CK)、肌激酶(myokinase)和二磷酸核苷激酶(diphosphonucleotide kinase，NDK)和焦磷酸酶(Pyrophosphatase)作为重组元件蛋白质的组合，通过多蛋白体系的共生产方法进行生产，可以快速高效实现目标蛋白的体外合成。其中，22种氨酰-tRNA合成酶具体包括：甲硫氨酰-tRNA合成酶(Met-tRNA-synthetase)、苏氨酰-tRNA合成酶(Thr-tRNA-synthetase)、谷氨酰-tRNA合成酶(Glu-tRNA-synthetase)、丙氨酰-tRNA合成酶(Ala-tRNA-synthetase)、天冬氨酰-tRNA合成酶(Asp-tRNA-synthetase)、天冬酰胺酰-tRNA合成酶(Asn-tRNA-synthetase)、半胱氨酰-tRNA合成酶(Cys-tRNA-synthetase)、脯氨酰-tRNA合成酶(Pro-tRNA-synthetase)、酪氨酰-tRNA合成酶(Tyr-tRNA-synthetase)、谷氨酰胺酰-tRNA合成酶(Gln-tRNA-synthetase)、组氨酰-tRNA合成酶(His-tRNA-synthetase)、甘氨酰-tRNA合成酶A(Gly-tRNA-synthetase-A)、甘氨酰-tRNA合成酶B(Gly-tRNA-synthetase-B)、缬氨酰-tRNA合成酶(Val-tRNA-synthetase)、赖氨酰-tRNA合成酶(Lys-tRNA-synthetase)、亮氨酰-tRNA合成酶(Leu-tRNA-synthetase)、色氨酰-tRNA合成酶(Trp-tRNA-synthetase)、苯丙氨酰-tRNA合成酶B(Phe-tRNA-B synthetase)、丝氨酰-tRNA合成酶(Ser-tRNA-synthetase)、苯丙氨酰-tRNA合成酶A(Phe-tRNA-A synthetase)、精氨酰-tRNA合成酶(Arg-tRNA synthetase)、异亮氨酰-tRNA合成酶(Ile-tRNA synthetase)。
在一些实施例中，当以编码目的蛋白的DNA作为模板时，还需在上述多蛋白体系中添加T7 RNA聚合酶；当目的蛋白是一些体外较难合成的蛋白时，通过在上述多蛋白体系中添加二硫键异构酶和/或分子伴侣蛋白等，有助于提升这类目的蛋白的体外合成效率。
本发明实施例还提供了一种多蛋白体系的循环共生产***，其包括：
共表达菌株制备单元，用于制备多种共表达菌株，每种共表达菌株分别表达多蛋白体系中的一种蛋白以及溶菌蛋白，且不同的共表达菌株表达的蛋白各不相同；
多孔材料制备单元，用于制备多种容置共表达菌株的多孔材料，每种容置共表达菌株的多孔材料分别容置多种共表达菌株中的一种，且不同的容置共表达菌株的多孔材料容置的共表达菌株各不相同；
培养单元，用于培养容置共表达菌株的多孔材料中的共表达菌株；
其中，多蛋白体系包括用于蛋白质翻译、能量再生的蛋白质和/或催化合成化合物的酶；
多孔材料具有三维网络结构，且所述多孔材料中各孔洞的孔径为1μm-5μm。
本发明实施例提供的多蛋白体系的循环共生产***的有益效果在于：多蛋白体系的循环共生产***包括共表达菌株制备单元、多孔材料制备单元和培养单元。一方面，共表达菌株制备单元制备多种共表达菌株，由于每种共表达菌株分别表达多蛋白体系中的一种蛋白及溶菌蛋白，在溶菌蛋白的作用下，共表达菌株发生自主裂解，释放出多种蛋白；另一方面，在多孔材料制备单元中，将共表达菌株容置于具有三维网络结构的多孔材料中得到多种容置共表达菌株的多孔材料，多孔材料为不同种共表达菌株提供了独立的生长环境，起到了空间隔离的作用，避免不同菌群之间的相互作用(尤其是竞争作用)和影响；同时，共表达菌株容置于多孔材料的孔洞中，由于多孔材料的搭载能力决定了共表达菌株在其中密度的上限，因此可以根据实际需求对容置有不同种共表达菌株的多孔材料的数量进行控制，实现对特定共表达菌株的数量的控制，继而使收获的多蛋白体系中各种蛋白的含量与实际需求一致；再一方面，由于多孔材料的三维网络结构限制了细菌尺寸大小的物质运动，而相对于细菌菌体尺寸小很多的蛋白质等，其运动不受多孔材料三维网络的限制，因此，通过将共表达菌株限制在多孔材料的内部生长繁殖，随着共表达菌株的生长，产生的溶菌蛋白作用于共表达菌株，使其发生自主裂解，释放出其表达的蛋白。蛋白通过多孔材料的孔洞进入多孔材料的外部培养环境中，得到多体系。最后一方面，由于共表达菌株的裂解导致其生长密度降低，停止裂解并继续生长繁殖，当其生长密度再次达到自主裂解密度时又再次发生裂解，如此往复，使多蛋白体系的共生产***实现循环式共生产。
共表达菌株制备单元中有多种共表达菌株，且每种共表达菌株分别表达多蛋白体系中的一种蛋白以及溶菌蛋白，且不同的共表达菌株表达的蛋白各不相同。在一些实施例中，可以先构建多种表达蛋白的载体，每种表达蛋白的载体不重复地表达上述多蛋白体系中的一种蛋白；通过将这些表达载体与表达溶菌蛋白的载体分别共转入到蛋白表达菌株中，从而得到多种共表达菌株，每种共表达菌株不重复地表达多蛋白体系中的一种蛋白以及溶菌蛋白。表达溶菌蛋白的载体具体可以选择表达噬菌体
Figure BDA0002507673860000151
E蛋白的质粒ePop，该质粒在表达E蛋白的基础上，还具有感应细胞密度功能，当共表达菌株的生长达到一定密度时，可以进一步促进该质粒的拷贝数增加，进而促进E蛋白的表达量，加速共表达菌株发生自主裂解的同时还可以实现自主裂解时间可控的效果。
在一些实施例中，选择聚酮化合物合成酶体系和/或非核糖体多肽合成酶体系作为多蛋白体系的共生产***的目标多蛋白体系。通过合成这两种多蛋白体系，有助于实现多种药物化合物的高效合成。
在一些实施例中，选择重组元件蛋白质合成体系作为多蛋白体系的共生产***的目标体系。通过制备重组元件蛋白质合成体系，有助于实现目标蛋白质的体外高效合成。
在一些实施例中，当以编码目的蛋白的mRNA为模板时，选择翻译起始因子1、翻译起始因子2、翻译起始因子3、翻译延伸因子G、翻译延伸因子Tu、翻译延伸因子Ts、翻译延伸因子4、翻译释放因子1、翻译释放因子2、翻译释放因子3、核糖体循环因子、甲硫氨酰-tRNA甲酰转移酶、22种氨酰-tRNA合成酶、肌酸激酶、肌激酶、二磷酸核苷激酶和焦磷酸酶的组合作为多蛋白体系的共生产***的目标多蛋白体系。通过表达上述蛋白，可以快速高效实现目标蛋白的体外合成。当以编码目的蛋白的DNA作为模板时，还需在上述多蛋白体系中添加T7 RNA聚合酶；当目的蛋白是一些体外较难合成的蛋白时，通过在上述多蛋白体系中添加二硫键异构酶、分子伴侣蛋白等，有助于提升这类目的蛋白的体外合成效率。
在多孔材料制备单元中，将每种共表达菌株分别容置于具有三维网络结构的多孔材料中，从而得到多种容置共表达菌株的多孔材料。在一些实施例中，多孔材料的结构为包括多个孔洞的海绵状结构和/或包括空心部的空心囊状结构；当多孔材料的结构为海绵状结构时，共表达菌株容置于海绵状结构的孔洞中；当多孔材料的结构为空心囊状结构时，共表达菌株容置于空心囊状结构的空心部内。
在一些实施例中，选择壳聚糖微胶囊(如图2所示)和/或海藻酸盐微胶囊作为多孔材料。其中，壳聚糖微胶囊的制备方法可以由壳聚糖和三聚磷酸盐交联得到；海藻酸盐微胶囊的制备方法可以由海藻酸钠和氯化钙交联得到。由于壳聚糖高分子的pKa值为6.2-6.8，属于带正电荷的高分子材料，因此，当溶液的pH低于壳聚糖的pKa值时，高分子链带正电，壳聚糖微胶囊发生溶胀；反之壳聚糖微胶囊发生收缩。此外，随着溶液离子强度升高，在电荷屏蔽作用下导致高分子链塌缩，进而壳聚糖微胶囊也发生收缩；反之壳聚糖胶囊发生溶胀。基于上述特性，结合共表达菌株在培养过程中会同步改变培养环境中的pH值以及离子强度，因此当使用壳聚糖微胶囊作为多孔材料时，随着共表达菌株的生长繁殖，壳聚糖微胶囊会发生收缩，为蛋白经过孔洞释放到多孔材料的外部进一步提供了动力，有助于蛋白的收集。
多孔材料的直径决定了其大小，也决定了其可容置的共表达菌株的数量。在一些实施例中，多孔材料的直径为50μm-5000μm。多孔材料的直径过大，其可以容置的共表达菌株过多，对共表达菌株数量的控制效果会相对较差；多孔材料的直径过小，则会限制共表达菌株在其内部的繁殖数量，进而影响其表达的蛋白含量。
在一些实施例中，多孔材料的直径为200μm-800μm。此时，其可容置的共表达菌株数量约为102-103个。
在一些实施例中，在培养单元中对多种容置共表达菌株的多孔材料进行共培养的条件测试涉及培养基、培养温度、培养湿度、培养时间、辅助添加物、光照条件等多方面。其中，经过反复多次的实验发现，当培养基为M9和/或LB培养基，可进一步促进壳聚糖微胶囊产生收缩的综合效用。具体地，选择具有卡那霉素和氯霉素双抗性的LB培养基对共表达菌株进行单独培养，事先加入葡萄糖用于抑制菌株发生自主裂解，从而使共表达菌株可以顺利繁殖到一定的密度(OD600≈3-5)；然后将不同种共表达菌株分别容置于多孔材料中，将所得不同种容置有共表达菌株的多孔材料转入具有卡那霉素和氯霉素双抗性、含有终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导剂的M9培养基中，在37℃、200rpm条件下共培养24h后，将共培养物离心、收集上清进行纯化，得到多蛋白体系。
在一些实施例中，多蛋白体系的循环共生产***还可以包括蛋白纯化单元，用于将共表达菌株发生自主裂解后释放并收集的多蛋白体系进行纯化，去除多余的细胞碎片和杂质蛋白。纯化的方法可以采用本领域的常用蛋白纯化方法，也可以在表达蛋白的载体构建时融合重组蛋白纯化标签如His标签，使后续的蛋白纯化过程更加快速方便。His标签可以实现金属螯合亲和层析，是蛋白纯化的常用标签，本发明实施例的蛋白纯化方法也可以采用His标签以外的任何适用于蛋白纯化的标签。
本发明实施例还提供了上述多蛋白体系的循环共生产***在体外合成蛋白质和/或化合物中的应用。
本发明实施例提供的多蛋白体系的循环共生产***将多种共表达菌株分别容置于多孔材料中，得到多种容置共表达菌株的多孔材料，通过空间隔离的方式将不同种共表达菌株隔离，避免不同菌群之间的相互作用(尤其是竞争作用)和影响。与现有无细胞蛋白合成***的制备相比，本发明实施例提供的多蛋白体系的循环共生产***集成了共表达菌株破碎与产物分离这两个步骤，不仅更加简便、快速、高效、成本更低，而且还可以实现对所生产的多蛋白体系中各种蛋白的配比进行准确调配。
为使本发明上述实施细节和操作能清楚地被本领域技术人员理解，以及本发明实施例多蛋白体系的共生产方法、多蛋白体系的循环共生产***及应用的进步性能显著的体现，以下通过具体实施例来举例说明上述技术方案。
实施例
(1)将38种融合了His标签的表达蛋白的质粒分别与表达噬菌体
Figure BDA0002507673860000181
E蛋白的质粒ePop共同转化进入蛋白表达菌株BL21(DE3)中，得到38种共表达菌株；其中，38种表达蛋白的质粒依次单独表达翻译起始因子1、翻译起始因子2、翻译起始因子3、翻译延伸因子G、翻译延伸因子Tu、翻译延伸因子Ts、翻译延伸因子4、翻译释放因子1、翻译释放因子2、翻译释放因子3、核糖体循环因子、甲硫氨酰-tRNA甲酰转移酶和22种氨酰-tRNA合成酶、肌酸激酶、肌激酶、二磷酸核苷激酶和焦磷酸酶；
(2)分别从38种共表达菌株中挑单克隆于8ml LB培养基中(卡那霉素和氯霉素双抗性)，并加入400μL、40wt％的葡萄糖用来抑制细胞的自主裂解，在37℃的摇床中，220rpm分别培养14-18小时；
(3)从步骤(2)所得初步培养后的38种共表达菌株中，分别取5ml菌液离心，用200μL的M9培养基或PBS重悬沉淀菌体，并与5mL、2％的壳聚糖溶液(2g壳聚糖溶解于100mL、1％的冰醋酸中)混合均匀后转移到带有针头的注射器中；将注射器放置在一个装有注射泵的电喷雾***中，电喷雾***的阳极连接到针头，阴极连接到装有交联溶液(5％的三聚磷酸盐)的金属圆盒。将溶液在高压5kV、500μl/min流速下喷洒到搅拌着的交联溶液中，喷洒结束后，继续搅拌交联20-30分钟(如图3所示)，自然沉降微胶囊后，去除上清，用PBS或M9培养基洗涤微胶囊2次，得到38种容置有共表达菌株的壳聚糖微胶囊；
(4)将步骤(3)所得壳聚糖微胶囊与M9培养基(卡那霉素和氯霉素双抗性，加入终浓度为0.1mM的IPTG)按照胶囊体积与培养基体积为1：10的体积比混合，在37℃摇床200rpm进行培养24小时后，500g离心力下，4℃离心20分钟，收取上清过镍柱纯化收集38种混合蛋白；
(5)将步骤(4)所得38种混合蛋白用3.5kDa的透析袋进行透析浓缩，浓缩后的混合蛋白加入核糖体、能量缓冲液和表达红色荧光蛋白mRFP的DNA模板，在37℃金属浴中反应4小时。检测到有荧光信号(mRFP激发：580nm，发射：610nm，如表1所示)；其中，能量缓冲液由L-谷氨酸钾、20种氨基酸混合物、HEPES-KOH缓冲液、亚精胺、乙酸镁、磷酸肌酸、二硫苏糖醇、甲酰叶酸、NTPs、IPTG、tRNA、T7 RNA聚合酶、RNA酶抑制剂、无菌水配制而成。
表1荧光检测结果
Figure BDA0002507673860000201
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (13)

1.一种多蛋白体系的共生产方法，其特征在于，包括如下步骤：
提供多种共表达菌株、多孔材料，每种所述共表达菌株分别表达所述多蛋白体系中的一种蛋白以及溶菌蛋白，且不同的所述共表达菌株表达的蛋白各不相同；
将每种所述共表达菌株分别容置于所述多孔材料中，得到多种容置共表达菌株的多孔材料；
将全部的所述容置共表达菌株的多孔材料进行共培养，在所述溶菌蛋白的作用下，所述共表达菌株发生自主裂解，收集所述共表达菌株表达的蛋白，得到所述多蛋白体系；
其中，所述多蛋白体系包括用于蛋白质翻译、能量再生的蛋白质和/或催化合成化合物的酶；
所述多孔材料具有三维网络结构，且所述多孔材料中各孔洞的孔径为1μm -5μm。
2.根据权利要求1所述多蛋白体系的共生产方法，其特征在于，所述多孔材料的结构为包括多个孔洞的海绵状结构和/或包括空心部的空心囊状结构；当所述多孔材料的结构为海绵状结构时，所述共表达菌株容置于所述海绵状结构的所述孔洞中；当所述多孔材料的结构为空心囊状结构时，所述共表达菌株容置于所述空心囊状结构的所述空心部内。
3.根据权利要求2所述多蛋白体系的共生产方法，其特征在于，所述多孔材料选自壳聚糖微胶囊、海藻酸盐微胶囊、脂质体、胶束中的至少一种；和/或
所述多孔材料的直径为50μm-5000μm。
4.根据权利要求1-3任意一项所述多蛋白体系的共生产方法，其特征在于，所述多蛋白体系选自聚酮化合物合成酶体系、非核糖体多肽合成酶体系、重组元件蛋白质合成体系中的至少一种。
5.根据权利要求4所述多蛋白体系的共生产方法，其特征在于，所述重组元件蛋白质合成体系包括翻译起始因子1、翻译起始因子2、翻译起始因子3、翻译延伸因子G、翻译延伸因子Tu、翻译延伸因子Ts、翻译延伸因子4、翻译释放因子1、翻译释放因子2、翻译释放因子3、核糖体循环因子、甲硫氨酰-tRNA甲酰转移酶、22种氨酰-tRNA合成酶、肌酸激酶、肌激酶、二磷酸核苷激酶和焦磷酸酶。
6.根据权利要求5所述多蛋白体系的共生产方法，其特征在于，所述重组元件蛋白质合成***还包括T7 RNA聚合酶、二硫键异构酶、分子伴侣蛋白中的至少一种。
7.一种用于权利要求1-6任一项所述多蛋白体系的共生产方法的多蛋白体系的循环共生产***，其特征在于，包括：
共表达菌株制备单元，包括多种共表达菌株，用于制备多种共表达菌株，每种所述共表达菌株分别表达所述多蛋白体系中的一种蛋白以及溶菌蛋白，且不同的所述共表达菌株表达的蛋白各不相同；
多孔材料制备单元，包括所述共表达菌株制备单元所含的所述多种共表达菌株和用于多种容置共表达菌株的多孔材料，用于制备所述多种容置共表达菌株的多孔材料，每种所述容置共表达菌株的多孔材料孔洞中分别容置所述多种共表达菌株中的一种，且不同的所述容置共表达菌株的多孔材料容置的共表达菌株各不相同；在所述溶菌蛋白的作用下，所述共表达菌株发生自主裂解；
培养单元，用于培养所述容置共表达菌株的多孔材料中的共表达菌株；
其中，所述多蛋白体系包括用于蛋白质翻译、能量再生的蛋白质和/或催化合成化合物的酶；
所述多孔材料具有三维网络结构，且所述多孔材料中各孔洞的孔径为1μm -5μm。
8.根据权利要求7所述多蛋白体系的循环共生产***，其特征在于，所述多孔材料的结构为包括多个孔洞的海绵状结构和/或包括空心部的空心囊状结构；当所述多孔材料的结构为海绵状结构时，所述共表达菌株容置于所述海绵状结构的所述孔洞中；当所述多孔材料的结构为空心囊状结构时，所述共表达菌株容置于所述空心囊状结构的所述空心部内。
9.根据权利要求8所述多蛋白体系的循环共生产***，其特征在于，所述多孔材料选自壳聚糖微胶囊、海藻酸盐微胶囊、脂质体、胶束中的至少一种；和/或
所述多孔材料的直径为50μm-5000μm。
10.根据权利要求7-9任意一项所述多蛋白体系的循环共生产***，其特征在于，所述多蛋白体系选自聚酮化合物合成酶体系、非核糖体多肽合成酶体系、重组元件蛋白质合成体系中的至少一种。
11.根据权利要求10所述多蛋白体系的循环共生产***，其特征在于，所述重组元件蛋白质合成体系包括翻译起始因子1、翻译起始因子2、翻译起始因子3、翻译延伸因子G、翻译延伸因子Tu、翻译延伸因子Ts、翻译延伸因子4、翻译释放因子1、翻译释放因子2、翻译释放因子3、核糖体循环因子、甲硫氨酰-tRNA甲酰转移酶、22种氨酰-tRNA合成酶、肌酸激酶、肌激酶、二磷酸核苷激酶和焦磷酸酶。
12.根据权利要求11所述多蛋白体系的循环共生产***，其特征在于，所述重组元件蛋白质体系还包括T7 RNA聚合酶、二硫键异构酶、分子伴侣蛋白中的至少一种。
13.权利要求7-12任意一项所述多蛋白体系的循环共生产***在体外合成蛋白质和/或化合物中的应用。
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