WO2021215409A1 - 光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善する剤，それを用いた美容方法，及びその方法に適用するための美容装置 - Google Patents

光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善する剤，それを用いた美容方法，及びその方法に適用するための美容装置 Download PDF

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skin
macrophages
experiment
stimulus
photoaging
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聡 堀場
純一 細井
大悟 井上
健太朗 加治屋
雅哉 ▲高▼木
有宇子 松浦
雅人 飯野
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株式会社 資生堂
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    • A61H7/005—Devices for suction-kneading massage; Devices for massaging the skin by rubbing or brushing not otherwise provided for by rubbing or brushing power-driven, e.g. electrical hand-held

Definitions

  • the present invention relates to an agent that prevents and / or improves photoaging and / or dermal pigmentation, a cosmetological method using the same, and a cosmetological device for applying to the method.
  • the aging phenomenon of human skin can be broadly divided into “natural aging” and “photoaging”.
  • Photoaging is a phenomenon that is observed specifically in the exposed area and is skin-specific.
  • the production of active oxygen and damage to cell DNA are induced by the influence of UV and the like, and it is considered that the skin fibrous tissue is damaged and phenotypes such as wrinkles and sagging appear.
  • skin photoaging causes a decrease in collagen fibers and degeneration of elastic fibers made of elastin.
  • melanocytes are also damaged, and a large amount of melanin pigment is produced, which causes stains and the like.
  • pigmentation such as stains and dullness is caused by the accumulation of melanin produced by melanocytes in the basal layer of the epidermis.
  • Melanin is usually present in the epidermis and basal layer, but since the epidermis turns over in a relatively fast cycle, such melanin is easily excreted.
  • melanin may be present in the dermis layer because melanin falls into the dermis through the gaps in the basement membrane. Since the turnover cycle of dermal cells is much slower than that of the epidermis, such melanin is often accumulated without being excreted. For this reason, it is very difficult to improve dermal pigmentation.
  • Patent Document 1 discloses a preventive or inhibitory agent for skin photoaging by preventing the inhibition of leukocyte elastase.
  • Patent Document 2 discloses a photoaging inhibitor composition containing a plant extract of the genus Amaranthaceae, which has a collagen synthesis promoting action, and an animal-derived collagen peptide.
  • Non-Patent Document 13 proposes to prevent melanin from falling into the dermis by strengthening the basement membrane.
  • Patent Document 3 discloses an anti-aging cosmetic composition containing a compound that induces autophagy activation as well as increased expression of adiponectin. It has also been suggested that the phagocytic action of macrophages is used to improve the pigmentation of the dermis.
  • dermal stains are caused by attracting and phagocytosing macrophages to fibroblasts that have taken up melanin that has fallen into the dermis. Disclose preventive / ameliorating agents.
  • An object of the present invention is to provide an agent for preventing and / or ameliorating photoaging and / or dermal pigmentation, a cosmetological method using the same, and a cosmetological device for applying to the method.
  • the present inventors As a result of diligent search for agents to prevent and / or ameliorate photoaging and / or dermal pigmentation, the present inventors adjusted the M1 / M2 balance of macrophages by the huxinin extract, thereby photoaging and / or photoaging. Alternatively, it has been found to exert an effect of preventing and / or ameliorating dermal pigmentation. Based on this discovery, the present invention has been developed. That is, the present invention includes the following aspects.
  • An agent that prevents and / or improves photoaging and / or dermal pigmentation which contains a hakushinin extract as an active ingredient.
  • the agent according to item 1 which prevents and / or improves photoaging and / or dermal pigmentation by adjusting the M1 / M2 balance.
  • the agent according to item 2 wherein adjusting the M1 / M2 balance is to increase the ratio of M2 to M1.
  • a cosmetological method for preventing and / or ameliorating photoaging and / or dermal pigmentation of a subject A step of applying the agent according to any one of items 1 to 3 to the target skin, Cosmetology methods, including. [5] The cosmetological method further includes a step of applying a weak physical stimulus to the skin, wherein the step of applying the physical stimulus is, for example, for example.
  • the fixed points A and B are arbitrary positions on the epidermis or the matrix to which the epidermis is adhered, and the straight line passing through the fixed points A and B is parallel to the extension direction).
  • (c-1) recovering the subject's skin from the stretched state; And / or (B-2) Pressing the subject's skin by 1 ⁇ m to 1000 ⁇ m; and (c-2) Recovering the subject's skin from the pressed state;
  • the cycle of (b-1) and (c-1) and / or the cycle of (b-2) and (c-2) is carried out at a frequency of 60 Hz or less. 4.
  • the device is The stimulus generator that causes physical stimulus and It is equipped with a stimulus-giving part that gives the physical stimulus generated in the stimulus-generating part to the skin.
  • the device is a device for performing a step of applying a weak physical stimulus to the skin, and the step is described here, for example.
  • the extension rate is calculated by the above equation 1.
  • the beauty device is The stimulus generator that causes physical stimulus and It is equipped with a stimulus-giving part that gives the physical stimulus generated in the stimulus-generating part to the skin.
  • the device is a device for performing a step of applying a weak physical stimulus to the skin
  • FIG. 1a shows the types of macrophage markers used in Experiment 1 as well as the age, skin type, and gender of the subjects.
  • FIG. 1b is a photomicrograph showing macrophages (CD11b: red) and M1 macrophages (CD86: green) in the skin tissues of young and elderly people.
  • FIG. 1c is a photomicrograph showing macrophages (CD11b: red) and M2 macrophages (CD206: green) in the skin tissues of young and elderly people.
  • FIG. 1d is a graph showing the number of M1 and M2 macrophages and the total number of total macrophages in the skin tissues of young and elderly people (cells / mm 2 ).
  • FIG. 1b is a photomicrograph showing macrophages (CD11b: red) and M1 macrophages (CD86: green) in the skin tissues of young and elderly people.
  • FIG. 1c is a photomicrograph showing macrophages (CD11b: red) and M2 macro
  • FIG. 1e left is a photomicrograph showing co-staining of M1 macrophages (CD86: red) or M2 macrophages (CD206: red) and procollagen (green) in the skin tissues of young and elderly people.
  • the rectangles existing in each of the four panels in the figure on the left are enlarged versions of the characteristic parts.
  • the right figure of FIG. 1e is a diagram schematically showing the relationship between M1, M2, fibroblasts, and collagen production / destruction.
  • FIG. 2a outlines the method of Experiment 2.
  • FIG. 2b is a photomicrograph of M0, M1 and M2 macrophages induced by Experiment 2.
  • FIG. 2c is a graph showing the gene expression levels of cytokines (IL-1beta, TNF-alpha, IL-10) produced by M0, M1 and M2 macrophages induced by Experiment 2.
  • the lower figure of FIG. 2c is a graph showing the expression level of mRNA of cell surface markers (M1: CD86, M2: CD206) of M1 and M2 macrophages. It is corrected by the mRNA expression level of GAPDH, and the case of M0 is shown as a relative value (%) as 100%.
  • FIG. 3a outlines the method of Experiment 3.
  • FIG. 3a outlines the method of Experiment 3.
  • FIG. 3a outlines the method of Experiment 3.
  • FIG. 3b shows the amount of procollagen ( ⁇ g / well) in fibroblasts to which the supernatants of M1 and M2 macrophages were added according to Experiment 3.
  • FIG. 3c is a photomicrograph showing collagen (red) and hyaluronic acid (green) in fibroblasts supplemented with supernatants of M1 and M2 macrophages according to Experiment 3.
  • FIG. 3d is a photomicrograph showing ⁇ -galactosidase ( ⁇ -Gal) in fibroblasts supplemented with supernatants of M1 and M2 macrophages according to Experiment 3.
  • FIG. 3e shows the results of the aging-related ⁇ -galactosidase (SA ⁇ -Gal) assay in fibroblasts to which the supernatants of M1 and M2 macrophages were added according to Experiment 3 (left figure: SA ⁇ -gal with respect to the total number of DAPI-positive cells). It is a graph which shows the ratio (%) of positive cells, and the total number of DAPI positive cells per well (right figure).
  • SA ⁇ -Gal aging-related ⁇ -galactosidase
  • FIG. 3f shows each melanogenesis-enhancing factor (HGF, ET1, bFGF, IL-1alpha, SCF) and melanogenesis-suppressing factor (clusterin, DKK1) in fibroblasts to which the supernatants of M1 and M2 macrophages were added according to Experiment 3. It is a graph which shows the mRNA expression level of.
  • FIG. 4a is a photomicrograph showing ⁇ -Gal in young and aged fibroblasts supplemented with supernatants of M1 and M2 macrophages according to Experiment 4.
  • FIG. 4b shows the results of the SA ⁇ -Gal assay (SA ⁇ -gal relative to the total number of DAPI-positive cells) in young (top) and aged fibroblasts (bottom) to which the supernatants of M1 and M2 macrophages were added according to Experiment 4. It is a graph which shows the ratio (%) of positive cells) and the total number of DAPI positive cells per well.
  • FIG. 4c shows the amount of procollagen ( ⁇ g / well) in young and aged fibroblasts to which the supernatants of M1 and M2 macrophages were added according to Experiment 4.
  • FIG. 4d is a photomicrograph showing collagen (red) and DAPI-stained nuclei (blue) in young and aged fibroblasts supplemented with supernatants of M1 and M2 macrophages according to Experiment 3.
  • FIG. 5 is a photomicrograph showing type I collagen (red) and macrophages (CD68: green) in neonatal foreskin-derived fibroblasts to which supernatants of M1 and M2 macrophages were added according to Experiment 5. The upper left photo shows fibroblasts cultured without the addition of macrophage supernatant.
  • FIG. 5 is a photomicrograph showing collagen (red) and DAPI-stained nuclei (blue) in young and aged fibroblasts supplemented with supernatants of M1 and M2 macrophages according to Experiment 3.
  • FIG. 5 is a photomicrograph showing type I collagen (red) and macrophages (CD68: green) in neonatal foreskin-derived fibro
  • FIG. 6 is a photomicrograph showing macrophages (CD68: red) and M1 macrophages (CD86: green) or M2 macrophages (CD206: green) in a 3D model prepared according to Experiment 6.
  • the part indicated by the triangle indicates the part where CD68 and CD86, or CD68 and CD206 are double-stained.
  • FIG. 7 is a photomicrograph showing p21 (red) and DAPI-stained nuclei (blue) in a 3D model prepared according to Experiment 6.
  • FIG. 7 is a photomicrograph showing p21 (red) and DAPI-stained nuclei (blue) in a 3D model prepared according to Experiment 6.
  • FIG. 9 is a graph showing the total number of macrophages, M1 and M2 macrophages in an ex vivo skin model irradiated with a solar simulator according to Experiment 7. The number of cells of each macrophage without irradiation is 100% (left bar: irradiation (-)), and the relative value (%) of the number of cells of each macrophage irradiated with respect to it is the right bar (irradiation (irradiation (-)). +)).
  • FIG. 10 shows the setting of the extension stimulus performed in Experiment 8.
  • FIG. 11 shows the device and skin sample used in Experiment 8.
  • FIG. 12 shows a comparison of the total number of M1 and M2 macrophages and the total number of macrophages when the ex vivo skin model was subjected to the extension stimulus (stretch) and when it was not given (control) according to Experiment 8.
  • the figure on the left is a graph showing the number of macrophages (cells / 1 mm 2 ) per 1 mm 2 of a skin sample.
  • the figure on the right is a graph showing the ratio (%) of each macrophage (M1, M2) to the total number of all macrophages.
  • FIG. 13 shows an example of the apparatus of the present invention.
  • FIG. 13 shows an example of the apparatus of the present invention.
  • FIG. 14a shows the mRNA expression levels of each collagen-degrading enzyme (MMP-1, MMP-2) and inflammatory cytokine (IL-1 ⁇ ) in fibroblasts to which the supernatants of M1 and M2 macrophages were added according to Experiment 9. It is a graph which shows a relative value (%) when the result in is taken as 100%.
  • FIG. 14b shows the mRNA expression levels of each collagen production / maturation factor (COL1A1, COL1A2, HSP47, and ADAMTS-2) in fibroblasts to which the supernatants of M1 and M2 macrophages were added according to Experiment 9 as a result of M1. Is a graph showing a relative value (%) when 100% is taken.
  • FIG. 14b shows the mRNA expression levels of each collagen production / maturation factor (COL1A1, COL1A2, HSP47, and ADAMTS-2) in fibroblasts to which the supernatants of M1 and M2 macrophages
  • FIG. 15a shows the age of each subject who took the sample in Experiment 10 for each of the young and elderly groups.
  • FIG. 15b is a graph showing the number of M1 and M2 macrophages in the skin tissues of young and elderly people (50 ⁇ m from just below the basement membrane) in Experiment 10 (cells / mm 2 ).
  • FIG. 15c is a graph showing the number of M1 and M2 macrophages in the skin tissues of young and elderly people (200 ⁇ m from just below the basement membrane) in Experiment 10 (cells / mm 2 ).
  • FIG. 15b is a graph showing the number of M1 and M2 macrophages in the skin tissues of young and elderly people (50 ⁇ m from just below the basement membrane) in Experiment 10 (cells / mm 2 ).
  • FIG. 15c is a graph showing the number of M1 and M2 macrophages in the skin tissues of young and elderly people (200 ⁇ m from just below the basement membrane) in Experiment 10
  • FIG. 15d is a graph showing the numbers of CD68-negative cells and M1 and M2 macrophages showing 3/4 collagen positive in the skin tissues of young and elderly people in Experiment 10 (cells / mm 2 ).
  • FIG. 16a shows the appearance of fibroblasts, M1 macrophages, and M2 macrophages 24 hours after the addition of melanin in Experiment 11. Cells that phagocytose melanin take a circular shape as shown in the figure on the right.
  • FIG. 16b shows the amount of melanin (melanin / almar blue) per cell taken up by fibroblasts, M1 macrophages, and M2 macrophages 24 hours after the addition of melanin in Experiment 11.
  • FIG. 16a shows the appearance of fibroblasts, M1 macrophages, and M2 macrophages 24 hours after the addition of melanin in Experiment 11.
  • FIG. 16b shows the amount of melanin (melanin / almar blue) per cell taken
  • FIG. 16c shows the state of M1 macrophages and M2 macrophages 5 days after the addition of melanin in Experiment 11.
  • FIG. 17 is a graph showing the numbers of melanin-phagocytic M1 macrophages and M2 macrophages in the dermis layer counted according to Experiment 12 for each age group. The lower part of FIG. 17 shows the numbers of melanin-phagocytic M1 macrophages and M2 macrophages as an average in all subjects.
  • FIG. 18 shows the results of the screening performed in Experiment 13.
  • the bar shows the expression level (marker / GAPDH value) of each marker of M1 and M2 when the haxinin extract (0.3 ppm, 1.0 ppm, 3.0 ppm) of each concentration was added, as a control (no hydrolysis of haxinin).
  • Control is a graph showing a relative value (%) when it is 100%.
  • FIG. 19a shows that in Experiment 14, melanin was added to immature (M0) THP-1 cells to which 3 ppm of unhydrolyzed hakusinin (control) or 1.0 ppm and 3.0 ppm of hakushinin hydrolyzate was added. The state after 30 minutes is shown.
  • FIG. 19b is an enlarged view of FIG. 19a.
  • FIG. 20 shows (A) oxygen consumption rate (OCR) and (B) extracellular acidification rate (ECAR) analyzed by using a flux analyzer for the intracellular activities of M0 macrophages, M1 macrophages and M2 macrophages in Experiment 15. ) And (C) OCR / EPAR results are shown.
  • FIG. 21 shows the results of analysis using a flux analyzer on the effect of the addition of the haxinin extract on the intracellular activity 48 hours after the addition of M0 macrophages in Experiment 16.
  • A Normalized OCR
  • B Basic OCR (A value of OCR at the third point of measurement).
  • FIG. 22 shows the results of analysis of the effect of the addition of the hacksinin extract on the intracellular activity 48 hours after the addition of M0 macrophages in Experiment 16 using a flux analyzer.
  • A Normalized OCR
  • B OCR of mitochondrial respiration (value of difference between A measurement 3rd point and 12th point).
  • FIG. 23 shows the results of analysis of the effect of typical unsaturated fatty acids contained in the hakushinin extract on the intracellular activity 48 hours after the addition of M0 macrophages using a flux analyzer.
  • Basal OCR Basal OCR
  • FIG. 24 shows the results of analysis of the effects of each component contained in the hacksinin extract on the intracellular activity 24 hours after the addition of M0 macrophages in Experiment 18 using a flux analyzer.
  • Basal OCR Basal OCR
  • FIG. 25 outlines the method of Experiment 19.
  • FIG. 26 shows the results of analysis of the effect of each component contained in the huxinin extract or the hacksinin extract on the intracellular activity during M1 macrophage differentiation in Experiment 19 using a flux analyzer.
  • Basal OCR Basal OCR
  • B OCR of mitochondrial respiration
  • C OCR / EPAR.
  • FIG. 27 shows the expression level of SDF-1 ⁇ contained in the supernatant of M1 and M2 macrophages.
  • A Outline of the experiment of Experiment 20,
  • B Amount of SDF-1 ⁇ in the culture supernatant of M1 macrophage or M2 macrophage.
  • FIG. 28 shows the effect on the expression of SDF-1 ⁇ in skin fibroblasts cultured with the addition of M1 or M2 macrophage supernatant in Experiment 21.
  • A Outline of the experiment of Experiment 21,
  • B Amount of SDF-1 ⁇ in fibroblasts 3 days after the addition of the culture supernatant of M1 macrophages or M2 macrophages.
  • Macrophages are cells that are localized in various tissues in the body and elicit an immune response against foreign substances and pathogens, and are known to be involved in inflammation. Macrophages differentiate from undifferentiated M0 macrophages (hereinafter sometimes abbreviated as M0) into M1 type and M2 type. M1 macrophages (hereinafter sometimes abbreviated as M1) are known as an inflammatory type, and M2 macrophages (hereinafter sometimes abbreviated as M2) are known as a repair type (anti-inflammatory type).
  • the present inventors have discovered that the balance between these M1 macrophages and M2 macrophages (M1 / M2 balance) is specifically disturbed in the exposed skin and the site where pigmentation occurs, and adjust the M1 / M2 balance.
  • M1 / M2 balance the balance between these M1 macrophages and M2 macrophages
  • the M1 / M2 balance can be adjusted by applying a specific physical stimulus to the target skin. More specifically, even for photoaged skin or skin with pigmentation, when a weak physical stimulus is applied at a specific extension rate, for example, at a frequency of 60 Hz or less such as 1 Hz or less and 10 Hz or less. , M1 / M2 balance was found to be adjusted / improved.
  • the present invention provides an agent that prevents and / or improves photoaging and / or dermal pigmentation by adjusting the M1 / M2 balance, a cosmetological method using the same, and a cosmetological device for applying to the method.
  • the method of the present invention is a method for the purpose of beauty and may not be treated by a doctor or a medical professional.
  • pigmentation refers to pigmentation in the dermis and epidermis, and includes, for example, pigmentation such as melanin due to photoaging, as well as artificially injected pigments (for example, tattoos and tattoos).
  • pigmentation such as melanin due to photoaging
  • artificially injected pigments for example, tattoos and tattoos.
  • the present invention is effective for both the dermis and the epidermis, it is highly expected as a countermeasure against pigmentation of the dermis in the sense that improvement methods other than phagocytosis by melanophages are limited. By applying the present invention, stains, dullness, dark circles, etc. due to pigmentation are improved. It is also effective for achromatic tattoos and tattoos, which are difficult to erase once the pigment is added because the pigment is injected into the dermis layer.
  • M1 macrophages can be measured with markers such as CD86, CD80, and iNOS.
  • M2 macrophages can be measured with markers such as CD206, CD163, Agr1, and the like.
  • markers for the entire macrophage containing M1 and M2 include CD11b and CD68. Additional or alternative, it may be measured by quantifying M1-specific cytokines such as IL-1beta, TNF-alpha and M2-specific cytokines such as IL-10.
  • the marker is not limited to the above marker as long as it can measure the M1 / M2 balance.
  • the M1 / M2 balance may refer to the ratio of the number of M1 macrophages to the number of M2 macrophages, and may refer to the amount of mRNA of a marker of M1 macrophages (for example, CD86, CD80, iNOS, etc.). It may refer to the ratio of the amount of mRNA of M2 macrophage markers (for example, CD206, CD163, Agr1, etc.).
  • the ratio of M1 is high and the ratio of M2 is low, and it is M2 that has a high melanin phagocytosis effect. Therefore, the adjustment / improvement of the M1 / M2 balance is the ratio of M2 to M1 (of M2).
  • the number / number of M1 and / or the amount of mRNA of the M2 marker / the amount of mRNA of the M1 marker may be increased.
  • the increase may be, for example, an increase with a statistically significant difference (eg, Student's t-test) with a significance level of 5%, and / or, for example, 1% or more, 5% or more, 10% or more,
  • the increase may be 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, 100% or more.
  • the adjustment / improvement of the M1 / M2 balance is such that the ratio of M2 to M1 (the number of M2 / the number of M1 and / or the amount of M2 marker mRNA / the amount of M1 marker mRNA) is within a certain range, for example, about. It may be 4/6 to about 9/1, about 5/5 to about 8/2, about 5/5 to about 7/3, etc., or it may be close to the above range, and the above It may be maintained within the range, or homeostasis may be maintained around the above range.
  • the M1 / M2 balance may refer to the balance between the intracellular activity of M1 macrophages and the intracellular activity of M2 macrophages, and for example, the intracellular activity mainly used by M1 macrophages (for example,). It may be expressed using an index of thawing system) and / or an index of intracellular activity (for example, aerobic respiration (mitochondrial respiration) state) mainly used by M2 macrophages.
  • the intracellular activity can be evaluated, for example, by measuring the cell oxygen consumption rate (OCR value), extracellular acidification rate (ECAR value), or OCR / EPAR value.
  • increasing the ratio of M2 to M1 may mean increasing the intracellular mitochondrial activity mainly used by M2 macrophages, and includes, for example, M1 macrophages and M2 macrophages.
  • Aerobic respiration is elevated in the population (eg, aerobic respiration (mitochonal respiration) predominates in the population containing M1 and M2 macrophages) and / or in the population containing M1 and M2 macrophages.
  • For intracellular activity for example, by using an extracellular flux analyzer XFe24 (for 24well) manufactured by Agilent Technologies (formerly Seahose Biosciences), glycolysis, which is the main energy metabolism pathway of cells, and aerobic respiration by mitochondria. The state can be measured over time with non-invasiveness and high sensitivity to cells, but the device is an example, and the intracellular activity can be evaluated by using any device or method. Therefore, it is not limited to the use of the device.
  • the proportion of M1 is high and the proportion of M2 is low, and it is M2 that has a high melanin phagocytosis effect. Therefore, the adjustment / improvement of the M1 / M2 balance is the intracellular activity of M2 with respect to M1.
  • the ratio may be to increase the OCR value in the population containing M1 macrophages and M2 macrophages and / or decrease the EPAR value in the population containing M1 macrophages and M2 macrophages.
  • "increase or decrease” may be, for example, an increase or decrease having a statistically significant difference (eg, Student's t-test) with a significance level of 5%, and / or, for example. 1% or more, 5% or more, 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, 100% or more increase or It may be a decrease.
  • Hakushinin (Kashiwakojin, Hakushijin) is a seed of Oriental Arbor-vitae (Platycladus orientalis Franco, Tuja orientalis L., dried biota orientalis) of the Cupressaceae family.
  • Oriental Arbor-vitae Platinum Arabic-vitae
  • Tuja orientalis L. dried biota orientalis
  • Hakushinin may be produced by a conventional method, or a commercially available product may be used.
  • the method for preparing the hakushinin extract that can be used in the present invention can be produced with reference to known methods (for example, Patent Documents 9 and 10), but is not limited thereto.
  • a method for preparing a hakushinin extract that can be used in the present invention a method of extracting plant seeds and subjecting the plant extract to an alkali treatment (hereinafter referred to as the first method) and a plant.
  • a method hereinafter referred to as a second method in which the seeds of the plant are crushed, aged at a temperature of 10 to 35 ° C. and a relative humidity of 20 to 90% for 1 week or more, and then extracted.
  • the extraction solvent used in the first method and the second method may be any volatile solvent usually used for extraction, and in particular, alcohols such as methanol and ethanol, hydrous alcohols, acetone, ethyl acetate ester, and the like.
  • Alcohols such as methanol and ethanol, hydrous alcohols, acetone, ethyl acetate ester, and the like.
  • Polar / non-polar organic solvents such as hexane and ether can be used alone or in combination, but acetone, ethyl acetate and hexane are particularly preferable because they are inexpensive and can be easily concentrated under reduced pressure.
  • extraction with supercritical carbon dioxide can also be used.
  • an extraction solvent containing a large amount of water is not preferable because the extraction of the active ingredient is suppressed.
  • Extraction is performed for a certain period of time with a solvent having a mass of 1 to 100 times, preferably 1 to 30 times the mass of the seeds.
  • the seeds to be used can be appropriately crushed if necessary, but may be used uncrushed when clogging becomes a problem during filtration. It is also possible to repeatedly extract with a small amount of solvent, and a reflux device such as Soxhlet may be used.
  • a reflux device such as Soxhlet may be used.
  • the extract is hydrolyzed by removing the extraction solvent from these extracts and then treating with alkali.
  • alkali treatment 0.2 to 2 times the volume of a concentrated alkaline aqueous solution is added to the extract after removing the solvent, and the mixture is sufficiently stirred and mixed, and aged for about 30 minutes to several days.
  • the temperature at the time of mixing is preferably in the range of room temperature to 70 ° C, more preferably in the range of 30 to 60 ° C. During aging, it is desirable to stir appropriately so that the hydrophilic component and the lipophilic component do not separate.
  • the concentrated alkaline aqueous solution include an aqueous solution composed of NaOH, KOH and the like having a concentration of 1 to 10 N.
  • the oily substance When the extract hydrolyzed by alkali treatment as described above is further neutralized with an acid to near neutrality, the oily substance is separated.
  • This oily substance has an extremely high anti-dermal pigmentation effect, but is highly safe for the skin.
  • alcohol, acetone and the like may be appropriately added after the alkali treatment, and then decolorization, deodorization, desalting, distillation and the like may be added as necessary.
  • the seeds are appropriately crushed or pressed in the pre-extraction stage and aged as they are at around room temperature for a certain period of time.
  • the aging period is not particularly limited as long as the desired effect can be obtained, but if the aging period is as short as one week or less, it is difficult to obtain a sufficient whitening effect. Oxidative putrefaction problem occurs, which is not preferable.
  • Extraction is performed from the seeds aged in this way using the extraction solvent and extraction method described above. After extraction, operations such as solvent removal, decolorization, deodorization, and distillation are performed as necessary.
  • the extract obtained by crushing and aging such specific seeds and then extracting them has an anti-dermis pigmentation effect similar to the above-mentioned alkali-treated extract, but is highly safe for the skin. Show sex.
  • a safe, plant-based, photoaging and / or excellent anti-dermis pigmentation effect consisting of an extract prepared by the first method or the second method from the seeds of the plant as shown above. It is possible to provide an agent for preventing and / or ameliorating dermal pigmentation, and further, it is possible to provide an external preparation for skin containing this agent.
  • the agent of the present invention may be used in combination with any substance, for example, a known substance known to adjust / improve the M1 / M2 balance, such as the substances described in Patent Documents 4 to 7.
  • the administration route can be arbitrarily selected, for example, transdermal administration, oral administration, subcutaneous administration, transmucosal administration, intramuscular administration, etc., but can be administered to a specific part of the skin to prevent and / or improve dermal pigmentation. Percutaneous administration may be preferred.
  • transdermal administration may be preferable so that the pigmentation can reach the epidermis and dermis from the skin.
  • the adjustment / improvement of the M1 / M2 balance may be, for example, inducing differentiation into M2 macrophages, or may be performed by any other M1 / M2 balance adjustment / improvement method.
  • an agent or composition that can be used in the present invention adjusts / improves the M1 / M2 balance and, as a result, suppresses photoaging and / or dermal pigmentation.
  • the M1 / M2 balance adjusting / improving agent, anti-photoaging agent, pigmentation inhibitor, and anti-dermal pigmentation agent of the present invention (hereinafter, these may be collectively referred to as "the agent of the present invention") are described above. Any one of the active ingredients may be contained alone, or two or more of them may be contained in any combination and ratio.
  • the agent of the present invention may be a composition in which the above-mentioned active ingredient is combined with one or more other ingredients such as excipients, carriers and / or diluents.
  • the composition and form of the composition are arbitrary, and may be appropriately selected according to the conditions such as the active ingredient and the intended use.
  • the composition can be produced by a conventional method with a formulation appropriately combined with an excipient, a carrier and / or a diluent and the like and other components according to the dosage form.
  • the agent of the present invention can be blended in cosmetics or the like and used for humans and animals, or can be administered to humans and animals as a pharmaceutical preparation. In addition, it may be mixed with various foods and drinks and feeds and ingested by humans and animals.
  • the blending amount (dry mass) of the plant or its extract depends on the type, purpose, form, usage, etc. , Can be decided as appropriate. For example, 0.00001% to 50% of hakushinin (in the case of an extract or crude drug, converted to dry mass) can be blended in the total amount of cosmetics.
  • ingredients usually used for skin external preparations such as cosmetics, pharmaceuticals, quasi-drugs, etc., such as antioxidants, oils, UV protective agents, within the range that does not impair the effects of the present invention.
  • ingredients usually used for skin external preparations such as cosmetics, pharmaceuticals, quasi-drugs, etc., such as antioxidants, oils, UV protective agents, within the range that does not impair the effects of the present invention.
  • Surfactants, thickeners, alcohols, powder components, coloring materials, aqueous components, water, various skin nutrients, etc. can be appropriately blended as needed.
  • the external preparation for skin of the present invention can be applied as a cosmetic, a non-medicinal product, etc., which is applied to the outer skin, particularly preferably as a cosmetic, and the dosage form is not limited as long as it can be applied to the skin.
  • Any formulation such as solution system, solubilization system, emulsification system, powder dispersion system, water-oil two-layer system, water-oil-powder three-layer system, ointment, lotion, gel, aerosol, etc. is applied.
  • the agent of the present invention when used as cosmetics, it includes lotions, milky lotions, foundations, lipsticks, lip balms, cleansing creams, massage creams, packs, hand creams, hand powders, body shampoos, body lotions, body creams, bath cosmetics, etc. It may be used as a form.
  • agent and composition of the present invention are not limited to the above-mentioned dosage forms and forms. Further, the agent or composition of the present invention may be used in combination with the apparatus or method of the present invention or other apparatus or method.
  • the subject to which the methods, devices, agents and compositions of the present invention are applied is pigmented, even if skin photoaging and / or pigmentation (eg, dermal pigmentation) is objectively or subjectively observed. It may be the object you want to prevent. For example, it may be an object that is determined to be out of M1 / M2 balance. In one embodiment, the subject may be a subject judged to have a high degree of pigmentation (for example, the degree of dermal pigmentation) using the M1 / M2 balance in the skin as an index. Alternatively, the phenotype specific to photoaging of the skin, for example, spots, wrinkles, sagging, etc.
  • spots, dullness, azaleas, tattoo marks, etc. May be the subject of concern. Spots, wrinkles, sagging, dullness, bruises, tattoo marks, etc. can be determined by visual judgment or by using a known index.
  • the present invention is a cosmetological method for preventing and / or ameliorating photoaging and / or dermal pigmentation of a subject.
  • A To provide a cosmetological method comprising applying to the subject's skin an agent containing a haxinin extract as an active ingredient to prevent and / or ameliorate photoaging and / or dermal pigmentation.
  • a step of applying a weak physical stimulus to the skin for example, a weak physical stimulus such as a stretch stimulus, a pressing stimulus, or a massage. May be achieved by giving to the skin.
  • the step of applying a weak physical stimulus to the skin is to (b-1) stretch the skin to a stretch rate of 0.1% or more and 50.0% or less; and (c-1) from the stretched state.
  • the cycle including recovery may be performed at a frequency of 60 Hz or less.
  • the extension rate is calculated by the above formula 1. Physical stimulation is 0.001% or more and 80.0% or less, 0.01% or more and 60.0% or less, 0.1% or more and 50.0% or less, preferably 0.1% or more and 50.0% or less. It may be done at the extension rate.
  • Extension speed refers to the speed (% / s) until the maximum extension rate (%) is reached in one cycle.
  • the recovery rate refers to the rate (% / s) of returning from the maximum extension rate to the non-extension state.
  • Extension speed / recovery speed is 0.010% / s to 40% / s, 0.05% / s to 30% / s, 0.10% / s to 20% / s, 0.2% / s to It may be carried out at any speed such as 15% / s and 0.3% / s to 10% / s.
  • the extension rate and recovery rate may be the same or different.
  • the step of applying a weak physical stimulus to the skin is (b-2) pressing the target skin by 1 ⁇ m to 1000 ⁇ m; and (c-2) recovering the target skin from the pressed state.
  • the cycle including; may be performed at a frequency of 60 Hz or less.
  • Pressing the skin from 1 ⁇ m to 1000 ⁇ m means pressing the skin to a depth of 1 ⁇ m to 1000 ⁇ m from the outermost surface of the skin.
  • the depth of pressing can be arbitrarily set from 1 ⁇ m to 1000 ⁇ m, 10 ⁇ m to 1000 ⁇ m, 10 ⁇ m to 300 ⁇ m, 10 ⁇ m to 100 ⁇ m, etc. from the outermost surface of the skin.
  • the frequency refers to the number of cycles per second when one cycle is the cycle of recovery from the start of extension or pressing to the non-extension or non-pressing state.
  • One cycle may include maintaining a stretched or pressed state for a period of time and / or resting in a non-extended or non-pressed state. For example, during one cycle, after (b-1) and before (c-1), or after (b-2) and before (c-2), 0 seconds to 30 minutes, 1 second.
  • the frequency may be, for example, 0.0000001 Hz or more and 10 kHz or less, 0.000001 Hz or more and 1 kHz or less, 0.00001 Hz or more and 100 Hz or less, preferably 0.0001 Hz or more and 60 Hz or less, 0.0001 Hz or more and 10 Hz or less.
  • facial equipment, massage equipment, etc. include those using electromagnetic waves having a frequency of about 0.3 to 300 MHz such as RF waves, and those using ultrasonic waves having a frequency of about 1 MHz to 7 MHz. Compared with these frequencies / frequencies, the frequencies adopted by the method / apparatus of the present invention are extremely low. If a strong frequency is applied to the skin like a conventional facial device, there is a risk of adverse effects such as redness, pressure marks, scratches, pain, and inflammation on the skin, but if a frequency like the present invention is adopted, the above risks Is low and allows non-invasive physical stimulation. This is because the present inventors have discovered that if the extension rate and the frequency are too high, the stimulation is too strong, and it is preferable to gently stimulate the skin by adjusting these values to appropriate values.
  • low and medium frequency devices are commercially available as EMS devices, these are designed to act in deep layers such as muscle and subcutaneous fat, and the effect on the skin surface layer as in the present invention is unknown. .. Further, such a device may be accompanied by a tingling stimulus when an electric current is passed even if the frequency is low, which is different from the present invention that gives a gentle stimulus to the skin.
  • the present invention enables a cosmetological method by a simple method of directly giving a stretch stimulus to the skin without applying energy such as ultrasonic waves, electric current, or magnetic field. Further, the extension stimulus having such a frequency is a gentle stimulus, but has an effect of adjusting / improving the M1 / M2 balance as described in the examples. Therefore, the use of the method / apparatus of the present invention is expected to have a preventive and / or ameliorating effect on photoaging and / or dermal pigmentation without adversely affecting the skin.
  • the physical stimulus may be by an instrument such as a facial device, an experimental device, a massage using human hands or instruments, a facial exercise, or may be achieved by contact or non-contact. ..
  • a mechanically generated physical stimulus is applied to the skin by using a device having a stimulus generating part that generates a physical stimulus and a stimulating part that applies the physical stimulus by contact or non-contact.
  • Physical irritation may be achieved, for example, by contact such as pulling, pressing, tapping, kneading, aspirating, and / or applying a shock wave to the skin, for example, with something like ultrasonic waves, air pressure or water pressure. It may be achieved by non-contact such as displacement with.
  • Facial exercises include swelling the cheeks and opening the eyes. Examples of the massage include a massage using an instrument such as a hand or a roller by the subject to be treated or a practitioner such as a cosmetologist. However, it is not limited as long as it is within the range of the physical stimulus of the present invention.
  • Examples of the device that can be used in the present invention include a beauty device provided with a skin contact portion that comes into contact with the user's skin and gives a weak physical stimulus of the present invention.
  • a beauty device provided with a skin contact portion that comes into contact with the user's skin and gives a weak physical stimulus of the present invention.
  • it may be composed of a grip portion and a skin extension portion or a skin pressing portion.
  • the device shown on the left of FIG. 13 is designed so that the skin is stretched at a specific frequency and extension rate when the skin contact portion touches the skin.
  • the device of the present invention includes a power supply, a stimulus generating part, and a skin stimulating part
  • the power source generates an electric signal
  • the stimulus generating part converts the electric signal from the power source into a physical stimulus.
  • the skin stimulating part may receive the physical stimulus generated by the stimulating part and give the physical stimulus to the user's skin.
  • the device shown on the left side of FIG. 13 includes a grip portion, a power source, a control unit that controls physical stimulation, a stimulation generation portion, and a skin contact portion including a skin stimulation portion and a skin fixing portion.
  • the user holds the grip part and puts the skin contact part on the skin, fixes the skin with the skin fixing part, and operates the control part so that the electrical signal from the power supply is physically stimulated by the stimulus generating part.
  • the stimulus generator may be driven by a motor or the like to convert an electrical signal into a physical stimulus.
  • the skin stimulating portion shown on the left side of FIG. 13 gives a stretching stimulus to the skin, but may, for example, give a pressing stimulus to the skin.
  • the device of the present invention may be a cosmetological device including a power supply, a control unit for controlling physical stimulation, a stimulation generating unit, and a skin contact portion including a skin contact surface made of a sheet-like material. good.
  • a skin contact portion of such a beauty device is shown on the right side of FIG.
  • the sheet-like material can carry an electric current and may convert an electrical signal from a power source into a physical stimulus. Examples of such sheet-like materials include Dielectric Elastomer Actuator (DEA), conductive polymer, IPMC, PVC gel, Mc réelle type and the like.
  • DEA Dielectric Elastomer Actuator
  • the power source of the device of the present invention may be an internal power source or an external power source, or may be a rechargeable type. Further, the device of the present invention may, for example, use data stored in a mobile phone, cloud, or the like, or may be remotely operated wirelessly.
  • the physical stimulus may be the one that achieves the stretching of the skin by giving a physical stimulus by contact or non-contact as in the upper surgery.
  • the physical stimulus may be applied in the direction parallel to the skin surface, that is, in the lateral direction, in the direction perpendicular to the skin surface, that is, in the vertical direction, or in any direction such as an oblique direction or a twisting direction. can.
  • the number of cycles to perform physical stimulation is not limited. For example, any number of cycles such as 10 to 500 cycles, 20 to 400 cycles, 30 to 300 cycles, 40 to 200 cycles, and 50 to 100 cycles may be performed. For example, as described in Examples, 27 cycles may be sufficient.
  • any number of these cycles may be regarded as one set, and this set may be performed with an arbitrary number of sets, for example, 1 to 100 sets, 2 to 50 sets, or 3 to 10 sets.
  • the time to perform physical stimulation is not limited.
  • the cycle may be repeated with or without a pause time for a certain period of time such as 5 minutes to 3 hours, 10 minutes to 2 hours, and 30 minutes to 1 hour.
  • the time interval between cycles or sets is not limited.
  • the extension or pressing stimulus may be one set or multiple sets alone, with one or more sets daily, 2, 3, 4, 5, 6, 6, and 7. It may be performed once, once every 1, 2, 3, or 4 weeks, etc., continuously or intermittently, regularly or irregularly.
  • the frequency, extension rate, number of cycles, and frequency as described above are not limited.
  • the waveform for physical stimulation can be set arbitrarily, such as a square wave, sine wave, triangle wave, and sawtooth wave.
  • the cosmetic treatment is not particularly limited, but includes any treatment considered to be effective in suppressing photoaging and / or pigmentation, such as application of a cosmetic containing the agent of the present invention or other ingredients.
  • Cosmetics refer to cosmetics applied to the skin, such as lotions, milky lotions, beauty essences, creams, foundations, etc., but are not limited to these, and are not intended to directly improve the skin condition. However, it is intended to include everything that is applied to the skin, including, for example, sunscreens.
  • the cosmetological treatment may be to give the skin a physical stimulus such as a stretching stimulus, a pressing stimulus, or a massage.
  • the cosmetological procedure may be a single procedure or a continuous procedure performed over days to weeks. Cosmetological treatment may be performed individually, or may be performed at a beauty salon, a cosmetics store, an esthetic salon, or the like.
  • Experiment 1 Tissue staining The skin of the outer corners of the eyes derived from Caucasians of young people (20s to 30s) and elderly people (60s to 70s) of the age shown in Fig. 1a was made into frozen sections and thinned. After cutting, the cells were stained with the macrophage markers shown below.
  • Staining of M1 macrophages Double staining was performed with an anti-human CD86 antibody (R & D) derived from goats and an anti-human CD11b antibody (abcam) derived from rabbits (Fig. 1b).
  • FIGS. 1b and 1c The tissue staining of (1) to (3) is shown in FIGS. 1b and 1c, the graph of the counting result is shown in FIG. 1d, and the result of double staining with M1 and M2 macrophage antibody and anti-procollagen antibody is shown on the left side of FIG. 1e.
  • M1 macrophages were abundant, while M2 macrophages were decreased.
  • M1 macrophages were present only around blood vessels in young people, while they were scattered throughout the tissue in elderly people.
  • FIG. 1c M2 macrophages were present throughout the tissue in the young, while the number decreased in the elderly.
  • the total number of macrophages (the number of M1 + the number of M2) did not change between the young and the elderly, and only the M1 / M2 balance changed.
  • the ratio of M2 to M1 (number of M2 / number of M1) is in the range of about 5/5 to about 7/3, while in elderly people, the ratio of M2 to M1 decreases sharply and M1 / The M2 balance was greatly lost, and it was significantly different from that of the younger ones.
  • THP-1 M1 differentiation stimulation experiment of THP-1 Differentiation was induced into M1 and M2 macrophages using THP-1, which is a human-derived cell line, according to the method described in Non-Patent Document 1. Specifically, THP-1 was cultured by adding 1 mM Na Pyruvate (Nakarai), 2 mM L-Glutamine (Nakarai), and 10% FBS to RPMI1640 (Nakarai) by the method shown in FIG. 2a. Then, 100 nM PMA (abcam) was further added and stimulated for 24 hours to differentiate into macrophages.
  • mRNA of each differentiated or undifferentiated cell is extracted, and real-time PCR by TaqMan Gene expression assembly is performed using IL-1beta, TNF-alpha, and IL-10 probes (Applied Biosystems). , The expression level was quantified (Fig. 2c, upper figure). Furthermore, using the same CD86 antibody (R & D) and CD206 antibody (BD) as in Experiment 1, PCR was performed in the same manner to quantify the expression level (Fig. 2c, lower figure). Each value was corrected by the mRNA expression level of GAPDH.
  • the macrophages differentiated by the method described in Experiment 2 have inflammatory cytokines (IL-1beta, TNF-alpha) characteristic of M1 and anti-inflammatory cytokines (IL) characteristic of M2, respectively. It was shown to produce -10). Furthermore, these differentiation-inducing macrophages showed increased expression of CD86 and CD206, which are surface markers of M1 and M2 macrophages, respectively. From these results, it was confirmed that the differentiation induction was successful. Therefore, the M1 and M2 macrophages differentiated by the method of Experiment 2 and the undifferentiated M0 macrophages were used in the following Experiments 3 and 4.
  • Experiment 3 Experiment of adding M1 and M2 macrophage supernatants to fibroblasts (1) As shown in FIG. 3a, THP-1 was differentiated into M1 and M2 in the same manner as in Experiment 2, or in the undifferentiated state of M0, the supernatant was removed, the cells were washed once with PBS, and then the medium was added. Was cultured for 48 hours. Their supernatants containing M1 and M2 secretions such as inflammatory and anti-inflammatory cytokines were added to neonatal fibroblasts. Cells supplemented with RPMI 1640 (Nakarai) were used as controls.
  • fibroblasts were cultured for 72 hours, and the amount of procollagen in the supernatant was quantified by PIP ELISA kit (TAKARA) (Fig. 3b).
  • Cell fractions were stained with rabbit-derived anti-human collagen antibody (CEDERLANE) and biotinylated hyaluronic acid-binding protein (HOKUDO) (Fig. 3c).
  • ⁇ -gal was used as an index of senescence, and the nucleus of the cell was stained with DAPI, and then ⁇ -gal in the cell was stained with the Senescence Detection Kit (abcam) (Fig. 3d), and ⁇ -gal positive cells and ⁇ -gal positive cells and The number of DAPI-positive cells was counted (Fig. 3e).
  • FIGS. 3b to 3f show the results in FIGS. 3b to 3f.
  • FIG. 3b shows the amount of procollagen after adding the supernatant of each macrophage (M1, M2) to fibroblasts and culturing for 72 hours.
  • FIG. 3c shows the localization of collagen and hyaluronic acid in fibroblasts after adding the supernatant of each macrophage (M1, M2) and culturing for 72 hours. From FIGS. 3b and 3c, it can be seen that M1 remarkably suppresses collagen production.
  • FIG. 3d shows the intracellular ⁇ -gal in fibroblasts after adding the supernatant of each macrophage (M1, M2) and culturing for 72 hours. From FIG.
  • FIG. 3d it is suggested that M1 increases ⁇ -gal-positive cells and promotes aging, while M2 suppresses aging.
  • FIG. 3e shows a graph counting the number of ⁇ -gal positive cells and DAPI positive cells. The figure on the right shows the total number of DAPI-positive cells per well. From the right figure of FIG. 3e, it is suggested that M2 not only suppresses cell aging but also promotes cell proliferation. The left figure of FIG. 3e shows the ratio (%) of the number of ⁇ -gal-positive cells to the total number of DAPI-positive cells. M1 has an aging and cell death promoting effect, while M2 has an aging suppressing and cell proliferation effect. Is suggested. Furthermore, as shown in FIG.
  • fibroblasts are known to secrete factors such as SCF and HGF by photostimulation such as UV and cause cell death.
  • fibroblasts act directly or indirectly on melanocytes by secreting factors such as HGF, ET1, bFGF, SCF, and crustin by photostimulation. Produces melanin. Therefore, it is suggested that cell death and melanin production by light stimulation are due to the imbalance of M1 / M2.
  • each macrophage supernatant collected by the same method as in Experiment 3 was collected from neonatal human foreskin-derived fibroblasts (young-derived fibroblasts) and 68-year-old human-derived fibroblasts (old-age-derived fibroblasts). was added to and cultured for 72 hours. Then, ⁇ -gal and DAPI staining were performed in the same manner as in Experiment 3, and the numbers of ⁇ -gal-positive cells and DAPI-positive cells were counted (FIGS. 4a and 4b).
  • the supernatants of M1 and M2 were added to young and old-derived fibroblasts, the fibroblasts were cultured for 72 hours, and the amount of procollagen in the supernatant was measured with PIP ELISA kit (TAKARA). It was quantified (Fig. 4c) and stained with rabbit-derived anti-human collagen antibody (CEDERLANE) and DAPI (Fig. 4d).
  • FIG. 4a shows a ⁇ -gal staining diagram.
  • FIG. 4b shows a graph of the results of the number of ⁇ -gal-positive cells and the total number of cells per well of young-derived fibroblasts and old-age-derived fibroblasts. From the lower figure of FIG. 4a, it was found that the addition of M2 supernatant significantly reduced ⁇ -gal-positive cells and suppressed aging even in aged cells. It was also found from FIG. 4b that M1 promotes aging and M2 suppresses aging regardless of age. This is supported by the result that, as shown in FIGS. 4c and 4d, the amount of collagen produced in the cells to which the M1 supernatant was added was significantly lower than that in the M2 supernatant, regardless of age.
  • Experiment 5 Co-culture experiment of M1 macrophages and M2 macrophages and neonatal sac-derived fibroblasts
  • RPMI1640 Nakarai
  • the amount of collagen produced when neonatal foramen-derived fibroblasts and half the number of M1 or M2 macrophages were cultured in RPMI was stained with rabbit-derived anti-human collagen antibody (CEDERLANE) and compared.
  • the macrophages were visualized by staining with a mouse-derived anti-human CD68 antibody (abcam).
  • the 3D skin model was created as follows. Human dermal fibroblasts (0.2 x 10 6 cells) were seeded in cell culture inserts ( ⁇ 12 mm, average pore size of porous membrane: 0.4 ⁇ m), and 200 ⁇ M magnesium ascorbic acid-2-phosphate (APM), 10%. The medium was changed once every two days using FBS-DMEM, and the cells were cultured for one week. On top of that, the control model was a 0.5% type I collagen-10% FBS-DMEM solution containing human dermal fibroblasts, the M1 model was a M1 model, and the M2 model was a M1 macrophages further differentiated by the method of Experiment 2. Collagen gels were prepared on human dermal fibroblasts by dispensing each of 30,000 M2 macrophages added, and cultured for 1 to 5 days.
  • APM magnesium ascorbic acid-2-phosphate
  • epidermal keratinized cells dispersed in Humania-KG2 (Krabou) medium were seeded on a collagen gel so as to be 5 ⁇ 10 5 cells / well, and Humandia-KG2 and 10% FBS-DMEM were placed outside the insert.
  • the medium mixed at 1: 1 and added with 200 ⁇ M APM was added to the same liquid level as the inside and cultured for 3 days.
  • the medium in the insert or glass ring is removed, and 200 ⁇ M APM is added to the outer skin model medium (10% FBS-DMEM and Human-KG2 EGF (-) are mixed 1: 1 to prepare Ca 1.8 mM).
  • CGS27023A MMP inhibitor
  • 10 ⁇ M BIPBIPU heparanase inhibitor
  • the cultured skin model was fixed with 4% PFA / PBS (Nakarai), and then stained with anti-CD206 antibody (abcam), anti-CD68 antibody (abcam), and anti-CD86 antibody (abcam) in the same manner as in Experiment 1.
  • the presence of M1 and M2 macrophages was confirmed (Fig. 6).
  • the cells were stained with anti-p21 antibody (abcam) and DAPI (VECTOR), and the total number of cells stained with DAPI in each of the epidermal cell layer and the fibroblast layer was taken as the total number of cells, and the anti-p21 antibody was also stained.
  • the number of cells was counted as the number of p21 positive cells.
  • the ratio of the number of p21-positive cells to the total number of cells was calculated by the following formula.
  • Experiment 7 Sunlight irradiation experiment on an ex vivo model using human skin NativeSkin (skin collected from a 38-year-old woman) manufactured by Genoskin Co., Ltd. was cultured for 1 day in the attached culture solution after arrival. The next day, an optical filter was placed in a 1000 W solar simulator manufactured by Oriel, and only UVA and UVB were irradiated at 11.5 J / cm 2 , and the culture was continued with the attached culture solution (irradiation (+)). As a control, a sample not irradiated was used (irradiation (-)). Samples were collected 5 days after irradiation, and M1 macrophages, M2 macrophages, and total macrophages were stained in the same manner as in Experiment 1, and the numbers were counted and graphed.
  • Experiment 8 Stretch stimulation experiment on an ex vivo model using human skin Next, a method for adjusting or improving the M1 / M2 balance was examined.
  • Sample NativeSkin (skin collected from a 38-year-old woman) (6 well size, about 2-2.5 cm in diameter) manufactured by Genoskin was used.
  • Stretching conditions A stretching device having grips for gripping both ends of the skin in the well as shown in FIG. 11 and stretching the skin by pulling the grips was created. The well containing the above tissue piece was placed horizontally, and the grip portion was operated to stretch the skin from both ends, and as shown in FIG.
  • M1 macrophages and M2 macrophages were stained by the same method as in Experiment 1 except that the total macrophages were stained only with the rabbit-derived anti-human CD11b antibody (abcam). , Total macrophages were stained and their numbers were counted. The ratio (%) of each macrophage (M1, M2) to the total number of all macrophages was calculated and graphed.
  • Experiment 9 Effect of M1 and M2 macrophage supernatants on collagen
  • the supernatants of each macrophage were examined in the same manner as in Experiment 3.
  • Real-time PCR was performed using MMP-1, MMP-2, and IL-1 ⁇ probes (Taqman probe manufactured by Applied Biosystems) as indicators of collagen degradation, and the expression levels of each mRNA were quantified (Fig. 14a).
  • Experiment 10 Degradation and production of collagen in an ex vivo model using human skin of young and elderly young (20s to 30s) and elderly (60s to 80s) whites of the age shown in FIG. 15a.
  • Anti-procollagen antibody millipore
  • anti-fragmented collagen AdipoGen
  • Experiment 1 Using the same CD68, CD11b, CD206, and CD86 antibodies, positive cells were counted in the same manner as in Experiment 1.
  • the results are shown in FIGS. 15b, c and d.
  • the proportion of M1 macrophages was higher and the proportion of M2 macrophages was lower in the elderly group than in the young group.
  • the number of macrophages showing 3/4 collagen positive is larger than that of fibroblasts showing 3/4 collagen positive, and 3/4 collagen positive than M1 macrophages showing 3/4 collagen positive.
  • the number of M2 macrophages showing the above tended to be large.
  • Experiment 11 In vitro experiment showing the ability to take up melanin in the dermis THP-1 cells were differentiated into M1 macrophages and M2 macrophages in the same manner as in Experiment 3.
  • M1 macrophage, M2 macrophage, and fibroblast manufactured by Kurabou
  • a melanin solution (Sigma, Melanin-BioReagent, Synthetic, suitable for cell culture) was dissolved in PBS and 0.02% W / V. was adjusted and added. After 24 hours, the cells were washed with PBS and then photographed under a microscope to collect the cells. The number of recovered cells was measured and quantified as follows using Alamar Blue (Life Technologies).
  • the results are shown in FIGS. 16a-c.
  • the unit "melanin / almar blue” in the figure is the intensity ((1)) of the cultured cells stained with alumer blue and the fluorescence of the supernatant measured at 544 nm / 590 nm, and then the cells were lysed and melanin was also lysed. It is a relative value ((2) / (1)) of the intensity ((2)) measured at an absorbance of 475 nm, and indicates the melanin content per cell. From these figures, it was found that M2 phagocytoses a large amount of melanin. This tendency was already seen even after 24 hours, but when the cells were continuously cultured and observed until 5 days later, the difference became clearer (Fig. 16c).
  • Experiment 12 Ex vivo experiment showing the ability to take up melanin in the dermis
  • Experiment 11 revealed that M2 macrophages phagocytose more melanin than fibroblasts and M1 macrophages, so the dermis layer of human skin counted in Experiment 11 was observed ex vivo using LSM880 (manufactured by Karl Zeiss). It was found that melanin was stained black together with M2 macrophages when observed in a bright field, regardless of whether they were old or young, whereas melanin was not present near M1 macrophages. As a result, it was found by ex vivo that M2 macrophages took up more melanin than fibroblasts and M1 macrophages in the dermis, and the number was counted and graphed (Fig. 17).
  • THP-1 cells were used in the undifferentiated state of M0 and cultured at 37 ° C. overnight. Then, add 3 ppm of unhydrolyzed (no alkaline treatment) hakushinin (control) dissolved in a solvent (DMSO), or 0.3 ppm, 1 ppm, or 3 ppm of the hakushinin hydrolyzate, and add 2 at 37 ° C. It was cultured in the evening. The cells were collected and RNA was extracted, the expression levels of CD86, CCR7, TNF-alpha, CD206, CD163, IL-10 and GAPDH were quantified by real time PCR, and the expression levels of each gene were divided by the expression level of GAPDH. bottom.
  • the huxinine hydrolyzate decreased the expression levels of the CD86 gene and the TNF- ⁇ gene and increased the CD206 gene and the IL-10 gene in a concentration-dependent manner. From this, it was found that the huxinine hydrolyzate has an effect of suppressing M1 induction and promoting M2 induction (Fig. 18).
  • Experiment 14 Effect of increasing melanin phagocytosis by hakushinin In immature (M0) THP-1 cells, 3 ppm of hakushinin (control) dissolved in a solvent (DMSO) without hydrolysis (without alkali treatment) or hakushinin water was added. The decomposition product was added so as to be 1.0 ppm and 3.0 ppm. The cells were cultured at 37 ° C., 48 hours later, a melanin solution (Sigma) was added, and the cells were observed under a microscope (Bio Station CT (Nikon)).
  • FIGS. 19a-b The results are shown in FIGS. 19a-b. Thirty minutes after the addition of melanin, macrophages to which huxinin was added began to take up melanin (black arrow in FIG. 19b). After an additional 3 hours, the control still had many cells that did not take up melanin, but in the huxinine hydrolyzate-added sample, all cells took up melanin.
  • Experiment 15 Intracellular activity of macrophages For M0 macrophages, M1 macrophages and M2 macrophages induced to differentiate from THP-1 in the same manner as in Experiment 2, an extracellular flux analyzer XFe24 (for 24well) manufactured by Agilent Technologies (formerly Seahorse Biosciences) ) (Hereinafter referred to as "flux analyzer"), Nat Immunol, 2014. 15 (9): Intracellular activity was measured with reference to pp846-855 (Non-Patent Document 14).
  • the flux analyzer is a device that enables non-invasive and highly sensitive temporal measurement of glycolysis, which is the main energy metabolism pathway of cells, and the state of aerobic respiration by mitochondria.
  • oligomycin ATP synthase inhibitor
  • FCCP uncoupler
  • rotenone mitochondrial complex I inhibitor + antimycin A (mitochondrial complex III inhibitor)
  • Rh + Ant oxygen consumption rate
  • OCR oxygen consumption rate
  • ECAR extracellular acidification rate
  • M0, M1 and M2 differentiated from THP-1 were prepared by the same method as in Experiment 2, and the hakushinin extract (haxinin hydrolyzate) (0.3 ppm, 1 ppm) was prepared in M0 by the same method as in Experiment 13. Or 3 ppm) was added. After incubating for 48 hours, the oxygen consumption rate (OCR) was measured with a flux analyzer. Each measured value was corrected by the number of cells obtained by counting the cell nuclei stained by adding Hoechst (FIG. 21).
  • the hakushinin extract contains unsaturated fatty acids such as linolenic acid and juniperonic acid, which are ⁇ 3 fatty acids, and linoleic acid, which is an ⁇ 6 fatty acid. It has been reported that unsaturated fatty acids (EPA, DHA) act on inflammation-related genes in M1 to suppress inflammation (Non-Patent Document 15 (Cell Metab. 2017 Feb 7; 25 (2): 412-427)). ). Therefore, we investigated the effect of unsaturated fatty acids contained in hacksinin extract on the intracellular activity of macrophages.
  • M0 and M2 induced to differentiate from THP-1 were prepared by the same method as in Experiment 2, linoleic acid, linolenic acid or juniperonic acid (3 ppm) was added to M0, and 48 hours later, in the same manner as in Experiment 15.
  • the oxygen consumption rate (OCR) was measured with a flux analyzer. Each measured value was corrected by the number of cells obtained by counting the cell nuclei stained by adding Hoechst.
  • Intracellular when hacksinin extract or unsaturated fatty acid (linoleic acid, linolenic acid, or juniperonic acid) is added in the step of further inducing differentiation of M0 induced from THP-1 by the same method as in Experiment 2. Changes in activity were analyzed using a flux analyzer (FIG. 25).
  • OCR oxygen consumption rate
  • ECAR value extracellular acidification rate
  • the mitochondrial respiration of macrophages during M1 differentiation was significantly increased by the hakushinin extract, but no significant increase was observed with the unsaturated fatty acids contained in the hakushinin extract alone. It was suggested that it may be a specific effect due to the mixing of various components contained.
  • the M2 supernatant contained more SDF-1 ⁇ (CXCL12) than the M1 supernatant (FIG. 27 (B)).
  • RNA-seq reads were mapped to the human genome (hg19) using STAR.
  • the obtained count data was subjected to size correction and log2 conversion between each sample after filtering the low-expressing genes.
  • the log2 (CPM) calculated for each sample by the above method was compared between two groups by quasi-likelihood F-test using glmQLFit and glmQLFTest, which are the functions of edgeR of the R package, and then the Benjamini-Hochberg method.
  • the q-value was calculated by performing multiple comparison test correction in.

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Abstract

本発明は，ハクシニン抽出物を有効成分として含む，光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善する剤を提供する。また，本発明は，対象の皮膚に，光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善する剤を適用する工程，を含む美容方法，及びその方法に適用するための美容装置を提供する。

Description

光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善する剤，それを用いた美容方法，及びその方法に適用するための美容装置
　本発明は，光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善する剤，それを用いた美容方法，及びその方法に適用するための美容装置に関する。
　ヒト皮膚の老化現象は大きく「自然老化」と「光老化」に分けられる。光老化は露光する部位特異的に認められる現象で，皮膚特異的である。光老化では，ＵＶなどの影響で活性酸素の産生や，細胞のＤＮＡの損傷などが誘発され，皮膚線維組織が損傷し，しわやたるみといった表現型が現れる原因と考えられている。例えば，皮膚光老化によりコラーゲンからなる膠原線維の減少やエラスチンからなる弾性線維の変性といった現象がみられる。また，メラノサイトもダメージを受け，メラニン色素が多く作られてしまい，しみ等を引き起こす原因となる。
　また，しみやくすみをはじめとする色素沈着は，表皮の基底層にあるメラノサイトで作り出されるメラニンが蓄積することにより起こる。メラニンは通常表皮や基底層に存在するが，表皮は比較的早いサイクルでターンオーバーするため，このようなメラニンは排出されやすい。一方，メラニンが基底膜の隙間から真皮に落ちこんでしまう等の理由によりメラニンが真皮層に存在する場合がある。真皮細胞のターンオーバーのサイクルは表皮に比べて非常に遅いため，このようなメラニンは排出されずに蓄積されてしまうことが多い。このような理由により，真皮の色素沈着の改善は非常に困難である。
　抗光老化美容法として，例えば，特許文献１では，白血球エラスターゼの阻害を予防することによる皮膚光老化の予防又は抑制剤を開示する。特許文献２では，コラーゲン合成促進作用を有するヒユ科パフィア属の植物抽出物と動物由来コラーゲンペプチドとを含有することを特徴とする光老化抑制剤組成物を開示する。
　真皮における色素沈着を改善するための美容法として，非特許文献１３では，基底膜を強化することによりメラニンの真皮への落ちこみを防止することを提案する。
　また，皮膚の光老化現象において炎症が一因となることも示唆されており，抗炎症剤も多く開発されている。特許文献３では，アディポネクチン発現増加とともにオートファジー活性化を誘導する化合物を含む抗老化用化粧料組成物を開示する。真皮の色素沈着を改善するにはマクロファージによる貪食作用を利用することも示唆されており，特許文献８では，真皮へ落ち込んだメラニンを取り込んだ線維芽細胞にマクロファージを誘引し貪食させることによる真皮シミ予防・改善剤を開示する。
特許第５６５７７２３号公報 特開２０１７－２０３００４号公報 特開２０１８－１７７８０５号公報 特表２０１４－５０４６２９号公報 特開２０１５－１４０３３４号公報 特許第６１７８０８８号公報 特許第６２７３３０４号公報 特開２０１８－０７２０９８号公報 特許第４７８１８４２号公報 国際公開第２０１２／０５７１２３号
Journal of the American College of Cardiology, Vol. 62, No. 20, 2013, November 12, 2013:1890-901 Experimental & Molecular Medicine (2014) 46, e70; doi:10.1038/emm.2013.135 NATURE, VOL495, 28 MARCH 2013, pp524-530, doi:10.1038/nature11930 Journal of Investigative Dermatology, 2009 April; 129(4):1016-25. Epub 2008 Oct 9. Stem Cell Research & Therapy (2018) 9:88，https://doi.org/10.1186/s13287-018-0821-5 Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology 2011 European Academy of Dermatology and Venereology，2012, 26, 1577-1580 British Journal of Dermatology, 2005, 153, pp733-739 Pigment Cell Melanoma Research, Vol. 27, Issue 3, pp502-504 Ann Dermatol Vol. 28, No. 3, pp279-289, 2016 Endocrinology, 2011. 152(10): pp3779-90 British Journal of Dermatology, 2005. 153 Suppl 2: pp37-46 Experimental Dermatology, 2011. 20(11): pp953-5 Fujifilm Research & Development (No.55-2010):pp33-37 Nat Immunol, 2014. 15(9): pp846-855 Cell Metab. 2017 Feb 7;25(2):412-427 Theranostics. 2018 Sep 9;8(17):4620-4632
　本発明の課題は，光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善するための剤，それを用いた美容方法，及びその方法に適用するための美容装置の提供にある。
　本発明者らは，光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善するための剤を鋭意探索した結果，ハクシニン抽出物がマクロファージのＭ１／Ｍ２バランスを調節し，それによって光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善する効果を発揮することを見出した。かかる発見に基づき，本発明を開発するに至った。すなわち，本発明は，以下の態様を含む。
［１］　ハクシニン抽出物を有効成分として含む，光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善する剤。
［２］　Ｍ１／Ｍ２バランスを調整することにより光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善する，項目１に記載の剤。
［３］　Ｍ１／Ｍ２バランスを調整することは，Ｍ１に対するＭ２の比率を上昇させることである，項目２に記載の剤。
［４］　対象の光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善するための美容方法であって，
　（ａ）対象の皮膚に，項目１～３のいずれか一項に記載の剤を適用する工程，
を含む，美容方法。
［５］　前記美容方法は，さらに，前記皮膚に対して微弱な物理刺激を適用する工程を含み，ここで前記物理刺激を適用する工程は，例えば，
　（ｂ－１）前記対象の皮膚を０．１％以上５０．０％以下の伸展率まで伸展することであって，ここで，伸展率は，
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
 （式中，定点ＡおよびＢは，表皮または表皮が接着しているマトリックス上の任意の位置であり，ここで定点ＡとＢを通る直線が伸展方向と平行である）
で算出される；及び
　（ｃ－１）前記対象の皮膚を伸展状態から回復すること；
並びに／又は，
　（ｂ－２）前記対象の皮膚を，１μｍ～１０００μｍ押圧すること；及び
　（ｃ－２）前記対象の皮膚を押圧状態から回復すること；
を含み，ここで前記（ｂ－１）及び（ｃ－１）並びに／又は前記（ｂ－２）及び（ｃ－２）のサイクルが６０Ｈｚ以下の振動数で実施される，
を含む，項目４に記載の美容方法。
［６］　項目５に記載の美容方法に適用するための美容装置であって，
　前記装置は，
　物理刺激を生ずる刺激発生部と，
　刺激発生部で発生した物理刺激を皮膚に付与する刺激付与部とを備え，
　ここで，当該装置は，皮膚に対して微弱な物理刺激を適用する工程を行うための装置であり，ここで当該工程は，例えば，
　（ｉ－１）前記皮膚を０．１％以上５０．０％以下の伸展率まで伸展すること；及び
　（ｉｉ－１）前記皮膚を伸展状態から回復すること；
並びに／又は，
　（ｉ－２）前記皮膚を１μｍ～１０００μｍ押圧すること；及び
　（ｉｉ－２）前記皮膚を押圧状態から回復すること；を含むサイクルを６０Ｈｚ以下の振動数で行うことであり，
　ここで，伸展率は，上記式１により算出される，
前記美容装置。
　本発明を適用することにより，それによってマクロファージのＭ１／Ｍ２バランスを調節し，光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善することができる。
図１ａは，実験１で使用したマクロファージのマーカーの種類，並びに被験者の年齢，スキンタイプ，及び性別を示す。 図１ｂは，若齢者及び高齢者の皮膚組織における，マクロファージ（ＣＤ１１ｂ：赤）及びＭ１マクロファージ（ＣＤ８６：緑）を示す顕微鏡写真である。 図１ｃは，若齢者及び高齢者の皮膚組織における，マクロファージ（ＣＤ１１ｂ：赤）及びＭ２マクロファージ（ＣＤ２０６：緑）を示す顕微鏡写真である。 図１ｄは，若齢者及び高齢者の皮膚組織における，Ｍ１，Ｍ２マクロファージ数及び全マクロファージの総数を示すグラフである（ｃｅｌｌｓ／ｍｍ2）。 図１ｅ左図は，若齢者及び高齢者の皮膚組織における，Ｍ１マクロファージ（ＣＤ８６：赤）又はＭ２マクロファージ（ＣＤ２０６：赤）及びプロコラーゲン（緑）の共染色を示す顕微鏡写真である。左図の４つの各パネル内に存在する長方形は，特徴的な部位を拡大したものである。図１ｅ右図は，Ｍ１，Ｍ２，線維芽細胞，コラーゲン産生／破壊の関係を模式化した図である。 図２ａは，実験２の方法の概略を示す。 図２ｂは，実験２により誘導されたＭ０，Ｍ１及びＭ２マクロファージの顕微鏡写真である。 図２ｃの上図は，実験２により誘導されたＭ０，Ｍ１及びＭ２マクロファージが産出するサイトカイン（ＩＬ－１ｂｅｔａ，ＴＮＦ－ａｌｐｈａ，ＩＬ－１０）の遺伝子発現量を示すグラフである。図２ｃの下図は，Ｍ１及びＭ２マクロファージの細胞表面マーカー（Ｍ１：ＣＤ８６，Ｍ２：ＣＤ２０６）のｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正し，Ｍ０の場合を１００％とした相対値（％）として示す。 図３ａは，実験３の方法の概略を示す。 図３ｂは，実験３に従いＭ１及びＭ２マクロファージの上清を添加した線維芽細胞におけるプロコラーゲン量（μｇ／ｗｅｌｌ）を示す。 図３ｃは，実験３に従いＭ１及びＭ２マクロファージの上清を添加した線維芽細胞におけるコラーゲン（赤）及びヒアルロン酸（緑）を示す顕微鏡写真である。 図３ｄは，実験３に従いＭ１及びＭ２マクロファージの上清を添加した線維芽細胞におけるβ－ガラクトシダーゼ（β－Ｇａｌ）を示す顕微鏡写真である。 図３ｅは，実験３に従いＭ１及びＭ２マクロファージの上清を添加した線維芽細胞における，老化関連β－ガラクトシダーゼ（ＳＡ　β－Ｇａｌ）アッセイの結果（左図：ＤＡＰＩ陽性細胞の総数に対するＳＡ　β－ｇａｌ陽性細胞の割合（％）），及びウェルあたりのＤＡＰＩ陽性細胞の総数（右図）を示すグラフである。 図３ｆは，実験３に従いＭ１及びＭ２マクロファージの上清を添加した線維芽細胞における，各メラノジェネシス亢進因子（ＨＧＦ，ＥＴ１，ｂＦＧＦ，ＩＬ－１ａｌｐｈａ，ＳＣＦ）並びにメラノジェネシス抑制因子（ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ，ＤＫＫ１）のｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。 図４ａは，実験４に従いＭ１及びＭ２マクロファージの上清を添加した若齢及び老齢線維芽細胞におけるβ－Ｇａｌを示す顕微鏡写真である。 図４ｂは，実験４に従いＭ１及びＭ２マクロファージの上清を添加した若齢（上）及び老齢線維芽細胞（下）における，ＳＡ　β－Ｇａｌアッセイの結果（ＤＡＰＩ陽性細胞の総数に対するＳＡ　β－ｇａｌ陽性細胞の割合（％））及びウェルあたりのＤＡＰＩ陽性細胞の総数を示すグラフである。 図４ｃは，実験４に従いＭ１及びＭ２マクロファージの上清を添加した若齢及び老齢線維芽細胞におけるプロコラーゲン量（μｇ／ｗｅｌｌ）を示す。 図４ｄは，実験３に従いＭ１及びＭ２マクロファージの上清を添加した若齢及び老齢線維芽細胞におけるコラーゲン（赤）及びＤＡＰＩにより染色した核（青）を示す顕微鏡写真である。 図５は，実験５に従いＭ１及びＭ２マクロファージの上清を添加した新生児***由来線維芽細胞における，Ｉ型コラーゲン（赤）及びマクロファージ（ＣＤ６８：緑）を示す顕微鏡写真である。左上の写真はマクロファージの上清を添加せず培養した線維芽細胞を示す。 図６は，実験６に従い作成した３Ｄモデルにおけるマクロファージ（ＣＤ６８：赤）およびＭ１マクロファージ（ＣＤ８６：緑）又はＭ２マクロファージ（ＣＤ２０６：緑）を示す顕微鏡写真である。三角で示す部分は，ＣＤ６８およびＣＤ８６，又はＣＤ６８およびＣＤ２０６が二重染色されている部分を示す。 図７は，実験６に従い作成した３Ｄモデルにおけるｐ２１（赤）及びＤＡＰＩにより染色した核（青）を示す顕微鏡写真である。 図８は，実験６に従い作成した３Ｄモデルの各層（左：上層＝表皮細胞層，右：下層＝線維芽細胞層）における全細胞数に対するｐ２１陽性細胞数の割合（％）を示すグラフである。 図９は，実験７に従いソーラーシュミレーターを照射したｅｘ　ｖｉｖｏ皮膚モデルにおけるマクロファージ全体，Ｍ１及びＭ２マクロファージの数を示すグラフである。照射を行わない場合の各マクロファージの細胞数を１００％とし（左側のバー：照射（－）），それに対する照射を行った各マクロファージの細胞数の相対値（％）を右側のバー（照射（＋））に示す。 図１０は，実験８で行った伸展刺激の設定を示す。 図１１は，実験８で使用した装置および皮膚試料を示す。 図１２は，実験８に従いｅｘ　ｖｉｖｏ皮膚モデルに伸展刺激を与えた場合（ｓｔｒｅｔｃｈ）と与えない場合（ｃｏｎｔｒｏｌ）における，Ｍ１，Ｍ２マクロファージ数及び全マクロファージの総数の比較を示す。左図は，皮膚試料１ｍｍ2あたりのマクロファージ数（ｃｅｌｌｓ／１ｍｍ2）を示すグラフである。右図は，全マクロファージの総数に対する各マクロファージ（Ｍ１，Ｍ２）の割合（％）を示すグラフである。 図１３は，本発明の装置の一例を示す。 図１４ａは，実験９に従いＭ１及びＭ２マクロファージの上清を添加した線維芽細胞における各コラーゲン分解酵素（ＭＭＰ－１，ＭＭＰ－２）および炎症性サイトカイン(ＩＬ－１β）のｍＲＮＡ発現量を，Ｍ１での結果を１００％としたとき相対値（％）で示すグラフである。 図１４ｂは，実験９に従いＭ１及びＭ２マクロファージの上清を添加した線維芽細胞における各コラーゲン産生・成熟化因子（ＣＯＬ１Ａ１，ＣＯＬ１Ａ２，ＨＳＰ４７，およびＡＤＡＭＴＳ－２）のｍＲＮＡ発現量を，Ｍ１での結果を１００％としたとき相対値（％）で示すグラフである。 図１５ａは，実験１０におけるサンプルを取得した各被験者の年齢を若齢者及び高齢者群ごとに示す。 図１５ｂは，実験１０における若齢者及び高齢者の皮膚組織（基底膜直下から５０μｍ）における，Ｍ１，Ｍ２マクロファージ数を示すグラフである（ｃｅｌｌｓ／ｍｍ2）。 図１５ｃは，実験１０における若齢者及び高齢者の皮膚組織（基底膜直下から２００μｍ）における，Ｍ１，Ｍ２マクロファージ数を示すグラフである（ｃｅｌｌｓ／ｍｍ2）。 図１５ｄは，実験１０における若齢者及び高齢者の皮膚組織における３／４コラーゲン陽性を示すＣＤ６８陰性細胞，Ｍ１，Ｍ２マクロファージ数を示すグラフである（ｃｅｌｌｓ／ｍｍ2）。 図１６ａは，実験１１において，メラニン添加から２４時間後の線維芽細胞，Ｍ１マクロファージ，およびＭ２マクロファージの様子を示す。メラニンを貪食している細胞は右図で示すような円状の形態をとる。 図１６ｂは，実験１１において，メラニン添加から２４時間後の線維芽細胞，Ｍ１マクロファージ，Ｍ２マクロファージが取り込んだ細胞あたりのメラニン量（ｍｅｌａｎｉｎ／ａｌｍａｒ　ｂｌｕｅ）を示す。 図１６ｃは，実験１１において，メラニン添加から５日後のＭ１マクロファージとＭ２マクロファージの様子を示す。 図１７上は，実験１２に従いカウントした真皮層におけるメラニン貪食Ｍ１マクロファージとＭ２マクロファージの数を各年齢ごとに示すグラフである。図１７下は，メラニン貪食Ｍ１マクロファージとＭ２マクロファージの数を全被験者における平均として示す。 図１８は，実験１３で行ったスクリーニングの結果を示す。バーはそれぞれ各濃度のハクシニン抽出物（０．３ｐｐｍ，１．０ｐｐｍ，３．０ｐｐｍ）を添加した場合のＭ１とＭ２の各マーカーの発現量（マーカー／ＧＡＰＤＨ値）を，対照（ハクシニン加水分解無：ｃｏｎｔｒｏｌ）を１００％としたとき相対値（％）で示すグラフである。 図１９ａは，実験１４において，加水分解をしていないハクシニン（ｃｏｎｔｒｏｌ）３ｐｐｍ又はハクシニン加水分解物を１．０ｐｐｍ，３．０ｐｐｍ添加した未成熟（Ｍ０）の状態のＴＨＰ－１細胞にメラニン添加をしてから３０分後の様子を示す。 図１９ｂは，図１９ａの拡大図である。黒矢印はメラニンを取り込んでいるマクロファージを示す。 図２０は，実験１５において、Ｍ０マクロファージ，Ｍ１マクロファージ及びＭ２マクロファージの細胞内活性について、フラックスアナライザーを用いて解析した、（Ａ）酸素消費速度（ＯＣＲ）、（Ｂ）細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）及び、（Ｃ）ＯＣＲ／ＥＣＡＲの結果を示す。 図２１は，実験１６において、ハクシニン抽出物を添加した場合のＭ０マクロファージの添加４８時間後の細胞内活性への影響をフラックスアナライザーを用いて解析した結果を示す。（Ａ）正規化したＯＣＲ、（Ｂ）Ｂａｓａｌ　ＯＣＲ(A計測3点目のOCRの値)。 図２２は，実験１６において、ハクシニン抽出物を添加した場合のＭ０マクロファージの添加４８時間後の細胞内活性への影響をフラックスアナライザーを用いて解析した結果を示す。（Ａ）正規化したＯＣＲ、（Ｂ）ミトコンドリア呼吸のＯＣＲ(A計測3点目と12点目の差の値)。 図２３は，実験１７において、ハクシニン抽出物に含まれる代表的な不飽和脂肪酸単独によるＭ０マクロファージの添加４８時間後の細胞内活性への影響をフラックスアナライザーを用いて解析した結果を示す。（Ａ）Ｂａｓａｌ　ＯＣＲ、（Ｂ）ミトコンドリア呼吸のＯＣＲ。 図２４は，実験１８において、ハクシニン抽出物に含まれる各成分によるＭ０マクロファージの添加２４時間後の細胞内活性への影響をフラックスアナライザーを用いて解析した結果を示す。（Ａ）Ｂａｓａｌ　ＯＣＲ、（Ｂ）ミトコンドリア呼吸のＯＣＲ。 図２５は，実験１９の方法の概略を示す。 図２６は，実験１９において、ハクシニン抽出物、又はハクシニン抽出物に含まれる各成分によるＭ１マクロファージ分化時の細胞内活性への影響をフラックスアナライザーを用いて解析した結果を示す。（Ａ）Ｂａｓａｌ　ＯＣＲ、（Ｂ）ミトコンドリア呼吸のＯＣＲ、（Ｃ）ＯＣＲ／ＥＣＡＲ。 図２７は，Ｍ１，Ｍ２マクロファージ上清に含まれるＳＤＦ－１αの発現量を示す。（Ａ）実験２０の実験の概要、（Ｂ）Ｍ１マクロファージ又はＭ２マクロファージの培養上清におけるＳＤＦ－１αの量。 図２８は，実験２１において、Ｍ１又はＭ２マクロファージ上清を添加して培養した皮膚線維芽細胞のＳＤＦ－１αの発現への影響を示す。（Ａ）実験２１の実験の概要、（Ｂ）Ｍ１マクロファージ又はＭ２マクロファージの培養上清を加えて培養した添加3日後における線維芽細胞のＳＤＦ－１αの量。
　マクロファージは，体内の様々な組織に局在し，異物や病原体に対する免疫応答を惹起する細胞であり，炎症にも関与することが知られている。マクロファージは，未分化状態のＭ０マクロファージ（以下Ｍ０とする略記することがある）からＭ１タイプとＭ２タイプに分化する。Ｍ１マクロファージ（以下Ｍ１と略記することがある）は炎症型として，Ｍ２マクロファージ（以下Ｍ２とする略記することがある）はリペア型（抗炎症型）として知られている。Ｍ１マクロファージとＭ２マクロファージのバランスの不均衡は，肥満，２型糖尿病，動脈硬化といった疾患と関連することが報告されている（特許文献４～６，非特許文献１～５）。しかしながら，皮膚光老化や色素沈着とＭ１／Ｍ２バランスとの関係については不明であった。
　本発明者らは，光のあたった皮膚や色素沈着が起こる部位では特異的にこれらＭ１マクロファージとＭ２マクロファージのバランス（Ｍ１／Ｍ２バランス）が乱れることを発見し，Ｍ１／Ｍ２バランスを調整することが，真皮における光老化や色素沈着の予防・改善においてとりわけ重要であることを発見した。そこで，本発明者らは，Ｍ１／Ｍ２バランスを指標とし，光老化及び／又は真皮色素沈着の予防・改善し得る物質を探索したところ，ハクシニンがＭ１／Ｍ２バランスを調整することを見出し，これによって皮膚，特に真皮における光老化及び／又色素沈着を予防・改善し得る本発明を開発するに至った。ハクシニンには，線維芽細胞に作用して線維芽細胞を増殖させたり，コラーゲンやヒアルロン酸の産生を促進させる効果や，メラニン生成を抑制する効果があることが報告されている（特許文献９及び１０）。しかしながら，ハクシニンが，Ｍ１／Ｍ２バランスを調整／改善作用を有することは，本発明者らによって今回初めて見出された。
　また，本発明者らは，特定の物理刺激を対象の皮膚に与えることによってもＭ１／Ｍ２バランスを調整し得ることも見出した。より具体的には，光老化した皮膚や色素沈着が起こっている皮膚であっても，特定の伸展率で，例えば１Ｈｚ以下，１０Ｈｚ以下といった６０Ｈｚ以下の振動数で行う微弱な物理刺激を与えると，Ｍ１／Ｍ２バランスが調整／改善されることがわかった。
　よって，本発明は，Ｍ１／Ｍ２バランスを調整することにより光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善する剤，それを用いた美容方法，及びその方法に適用するための美容装置を提供する。本発明の方法は，美容を目的とする方法であり，医師や医療従事者による治療ではない場合がある。
　本明細書において，色素沈着は，真皮および表皮における色素の沈着を指し，例えば，光老化によるメラニン等の色素沈着の他，人為的に注入された色素（例えば，入れ墨やタトゥー）も含まれる。本発明は，真皮および表皮のいずれにも有効であるが，とりわけ，メラノファージによる貪食以外に改善方法が限られているという意味で真皮の色素沈着に対する対策として大きく期待される。本発明の適用により，色素沈着によるしみ，くすみ，くま等が改善され。また，真皮層に色素を注入するため一旦色素を入れてしまうと消すのが困難である入れ墨やタトゥーなどの色消しにも有効である。
　Ｍ１マクロファージは，ＣＤ８６，ＣＤ８０，ｉＮＯＳ等のマーカーで測定できる。Ｍ２マクロファージは，ＣＤ２０６，ＣＤ１６３，Ａｇｒ１，等のマーカーで測定できる。Ｍ１とＭ２を含むマクロファージ全体のマーカーとしては，ＣＤ１１ｂ，ＣＤ６８などが挙げられる。追加的又は代替的に，ＩＬ－１ｂｅｔａ，ＴＮＦ－ａｌｐｈａといったＭ１特異的なサイトカインやＩＬ－１０といったＭ２特異的なサイトカインを定量することによって測定してもよい。しかしながら，Ｍ１／Ｍ２バランスを測定可能なマーカーであれば，上記マーカーに限定されない。
　本明細書において，Ｍ１／Ｍ２バランスとは，Ｍ１マクロファージの数とＭ２マクロファージの数の比率を指すものであってもよく，Ｍ１マクロファージのマーカー（例えば，ＣＤ８６，ＣＤ８０，ｉＮＯＳ等）のｍＲＮＡ量とＭ２マクロファージのマーカー（例えば，ＣＤ２０６，ＣＤ１６３，Ａｇｒ１等）のｍＲＮＡ量の比率を指すものであってもよい。光老化状態の皮膚ではＭ１の比率が高くＭ２の比率が低くなり，またメラニン貪食作用が高いのはＭ２であることから，Ｍ１／Ｍ２バランスの調整／改善は，Ｍ１に対するＭ２の比率（Ｍ２の数／Ｍ１の数，及び／又はＭ２マーカーのｍＲＮＡ量／Ｍ１マーカーのｍＲＮＡ量）を上昇させることであってもよい。上昇は，例えば，有意水準を５％とした統計学的有意差（例えばスチューデントのｔ検定）を有する上昇であってもよく，及び／又は，例えば１％以上，５％以上，１０％以上，２０％以上，３０％以上，４０％以上，５０％以上，６０％以上，７０％以上，８０％以上，９０％以上，１００％以上の上昇であってもよい。あるいは，Ｍ１／Ｍ２バランスの調整／改善は，Ｍ１に対するＭ２の比率（Ｍ２の数／Ｍ１の数，及び／又はＭ２マーカーのｍＲＮＡ量／Ｍ１マーカーのｍＲＮＡ量）を一定の範囲内，例えば，約４／６～約９／１，約５／５～約８／２，約５／５～約７／３等にすることであってもよく，上記範囲に近づけることであってもよく，上記範囲内に維持することであってもよく，上記範囲を中心に恒常性を保つことであってもよい。
　本明細書において，Ｍ１／Ｍ２バランスとは，Ｍ１マクロファージの細胞内活性とＭ２マクロファージの細胞内活性のバランスを指すものであってもよく，例えば、Ｍ１マクロファージが主に使う細胞内活性（例えば、解凍系の状態）の指標及び／又は、Ｍ２マクロファージが主に使う細胞内活性（例えば、好気呼吸（ミトコンドリア呼吸）の状態）の指標を用いて表されるものであってもよい。細胞内活性は、例えば、細胞の酸素消費速度（ＯＣＲ値）、細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ値）、又はＯＣＲ／ＥＣＡＲ値を測定することによって評価することができる。本明細書において、「Ｍ１に対するＭ２の比率を上昇させる」とは、Ｍ２マクロファージが主に使う細胞内ミトコンドリア活性が上昇することを指すものであってもよく、例えば、Ｍ１マクロファージ及びＭ２マクロファージを含む集団において好気呼吸（ミトコンドリア呼吸）が上昇する（例えば、Ｍ１マクロファージ及びＭ２マクロファージを含む集団において好気呼吸（ミトコンドリア呼吸）が優位になる）、及び／又は、Ｍ１マクロファージ及びＭ２マクロファージを含む集団において嫌気呼吸である解糖系の活性が低下することを指すものであってもよく、例えば、Ｍ１マクロファージ及びＭ２マクロファージを含む集団においてＯＣＲ値が上昇する、及び／又は、Ｍ１マクロファージ及びＭ２マクロファージを含む集団においてＥＣＡＲ値が低下する、及び／又は、Ｍ１マクロファージ及びＭ２マクロファージを含む集団においてＯＣＲ／ＥＣＡＲ値が上昇することを意味するものであってもよい。細胞内活性は、例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（旧Ｓｅａｈｏｒｓｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）社製の細胞外フラックスアナライザーＸＦｅ２４（２４ｗｅｌｌ用）を用いることによって細胞の主要なエネルギー代謝経路である解糖系、及びミトコンドリアによる好気呼吸の状態を、細胞に対して無侵襲・高感度に経時的計測を行うことができるが、当該装置は例示であり、細胞内活性の測定には任意の装置、方法を用いて評価することができるため、当該装置の利用に限定されない。
　光老化状態の皮膚ではＭ１の比率が高くＭ２の比率が低くなり，またメラニン貪食作用が高いのはＭ２であることから，Ｍ１／Ｍ２バランスの調整／改善は，Ｍ１に対するＭ２の細胞内活性の比率、例えば、Ｍ１マクロファージ及びＭ２マクロファージを含む集団におけるＯＣＲ値を上昇させる、及び／又は、Ｍ１マクロファージ及びＭ２マクロファージを含む集団におけるＥＣＡＲ値を低下させることであってもよい。本明細書において、「上昇又は低下」とは，例えば，有意水準を５％とした統計学的有意差（例えばスチューデントのｔ検定）を有する上昇又は低下であってもよく，及び／又は，例えば１％以上，５％以上，１０％以上，２０％以上，３０％以上，４０％以上，５０％以上，６０％以上，７０％以上，８０％以上，９０％以上，１００％以上の上昇又は低下であってもよい。
　ハクシニン（柏子仁，ハクシジン）は，ヒノキ科（Ｃｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ）のコノテガシワ（Ｐｌａｔｙｃｌａｄｕｓ　ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ　Ｆｒａｎｃｏ，　Ｔｈｕｊａ　ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ　Ｌ．，　Ｂｉｏｔａ　ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ　Ｅｎｄｌ．）の種子を乾燥させた生薬である。本発明に用いられるハクシニンとしては，種仁（胚乳部分）を使用することが好ましいが，種子全体にも有効成分が含まれているので，種子全体を使用することもできる。ハクシニンは，常法により製造してもよく市販品を用いることもできる。
　本発明に用いられ得るハクシニン抽出物を調製する方法は，公知の方法（例えば，特許文献９及び１０）を参考に製造することができるが，これらに限定される訳ではない。例えば，本発明に用いられ得るハクシニン抽出物の調製方法としては，植物の種子を抽出して得られた植物抽出物にアルカリ処理を施す方法（以下，第１の方法と称する。），および植物の種子を粉砕し，温度１０～３５℃，相対湿度　２０～９０％で１週間以上熟成した後に抽出する方法（以下，第２の方法と称する。）がある。
　上記第１の方法および第２の方法に用いられる抽出溶媒は，通常抽出に用いられる揮発性溶媒であれば何でもよく，特にメタノール，エタノール等のアルコール類，含水アルコール類，アセトン，酢酸エチルエステル，ヘキサン，エーテル等の極性・非極性有機溶媒を単独あるいは組み合わせて用いることができるが，アセトン，酢酸エチル，ヘキサンは低価格であり，減圧濃縮が容易な点で特に好ましい。その他，超臨界炭酸ガスによる抽出を用いることもできる。これに対し，水を多量に含む抽出溶媒は，活性成分の抽出が抑制されるので好ましくない。
　抽出にあたっては，種子の質量に対し，１～１００倍，好ましくは１～３０倍程度の質量の溶媒で一定期間抽出を行う。用いる種子は必要に応じて適度に粉砕することも可能であるが，ろ過時に目詰まりが問題となる場合等では未粉砕のまま用いても良い。また，少量の溶媒で繰り返し抽出することも可能であり，ソックスレーのような還流装置を用いても良い。超臨界炭酸ガスで抽出する場合は４０℃付近で２０～４０ＭＰａの一般的な条件にて抽出できる。
　第１の方法においては，これらの抽出物から抽出溶媒を除去した後，アルカリ処理することにより，抽出物を加水分解する。アルカリ処理は溶媒除去後の抽出物に対し，０．２～２倍容量の濃アルカリ水溶液を添加した後，充分撹拌混合し，３０分～数日程度熟成をおこなう。混合の際の温度としては，室温～７０℃の範囲が好ましく，３０～６０℃の範囲がさらに好ましい。熟成時には成分親水性成分と親油性成分が分離しないように，適宜撹拌を行うことが望ましい。濃アルカリ水溶液としては，１～１０Ｎの濃度のＮａＯＨ，ＫＯＨなどからなる水溶液が挙げられる。
　上述のようにアルカリ処理して加水分解した抽出物をさらに酸で中性付近まで中和すると油状物質が分離してくる。この油状物質はきわめて高い抗真皮色素沈着作用を奏しながらも，肌に対して高い安全性を示す。油状物質回収促進のために，アルコール，アセトン類などをアルカリ処理後に適宜加えても良く，さらにその後必要に応じて脱色，脱臭，脱塩，蒸留などの操作を加えても良い。
　ハクシニン抽出物を調製する第２の方法によれば，抽出の前段階で種子を適度に粉砕あるいは圧ぺんし，そのまま室温付近で一定期間熟成する。熟成期間については，目的とする効果が得られる範囲であれば特に問わないが，熟成期間が一週間以内と短いと十分な美白効果を得ることが難しく，反対に数年にも及ぶと腐敗や酸化変臭の問題が起こり，好ましくない。また熟成中には必要に応じて，酸化防止剤添加や窒素置換等を行うことにより，変臭を抑制することも可能である。
　このように熟成した種子より，前述した抽出溶媒・抽出法を用いて抽出を行う。抽出後は必要に応じて，溶媒除去・脱色・脱臭・蒸留等の操作を行う。このような特定の種子を粉砕して熟成した後に抽出することにより得られた抽出物は，前述のアルカリ処理した抽出物と同様に抗真皮色素沈着作用を奏しながらも，肌に対して高い安全性を示す。
　本発明においては，上に示したような植物の種子より第１の方法または第２の方法で調製した抽出物よりなる安全で抗真皮色素沈着効果の優れた植物性の，光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善する剤を提供することができ，さらには本剤を配合した皮膚外用剤を提供できる。
　本発明の剤は，任意の物質，例えば，特許文献４～７等に記載の物質といったＭ１／Ｍ２バランス調整／改善することが知られている公知の物質と組合せて使用してもよい。その投与経路も例えば，経皮投与，経口投与，皮下投与，経粘膜投与，筋肉内投与等任意に選択できるが，真皮の色素沈着を予防及び／又は改善するために皮膚の特定箇所に投与できる経皮投与が好ましい場合もある。また，表皮や真皮に起こる色素沈着は，皮膚から表皮や真皮に到達できるよう経皮投与が好ましい場合もある。また，Ｍ１／Ｍ２バランスの調整／改善は，例えば，Ｍ２マクロファージに分化誘導することであってもよく，その他任意のＭ１／Ｍ２バランス調整／改善法によるものであってもよい。
　例えば，本発明に用いられ得る剤又は組成物は，Ｍ１／Ｍ２バランスを調整／改善し，その結果，光老化及び／又は真皮色素沈着を抑制する。本発明のＭ１／Ｍ２バランス調整／改善剤，抗光老化剤，色素沈着抑制剤，抗真皮色素沈着剤（以降これらを総称して「本発明の剤」という場合がある。）は，上記の有効成分の何れか１種を単独で含有してもよく，２種類以上を任意の組み合わせ及び比率で含有してもよい。
　本発明の剤は，上記の有効成分を，１種又は２種以上の他の成分，例えば賦形剤，担体及び／又は希釈剤等と組み合わせた組成物とすることもできる。組成物の組成や形態は任意であり，有効成分や用途等の条件に応じて適切に選択すればよい。当該組成物は，その剤形に応じ，賦形剤，担体及び／又は希釈剤等及び他の成分と適宜組み合わせた処方で，常法を用いて製造することができる。
　本発明の剤は，化粧品等に配合してヒト及び動物に使用し，或いは医薬製剤としてヒト及び動物に投与することができる。また，各種の飲食品，飼料に配合してヒト及び動物に摂取させてもよい。
　本発明を化粧品，医薬品，医薬部外品等の皮膚外用剤に適用する場合，植物体又はその抽出物の配合量（乾燥質量）は，それらの種類，目的，形態，利用方法などに応じて，適宜決めることができる。例えば，化粧料全量中に，ハクシニンを０．００００１％～５０％（抽出物又は生薬の場合，乾燥質量換算）配合できる。
　上記成分に加えて，さらに必要により，本発明の効果を損なわない範囲内で，通常化粧品，医薬品，医薬部外品等の皮膚外用剤に用いられる成分，例えば酸化防止剤，油分，紫外線防御剤，界面活性剤，増粘剤，アルコール類，粉末成分，色材，水性成分，水，各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。
　本発明の皮膚外用剤は，外皮に適用される化粧料，医薬部外品等，特に好適には化粧料として適用可能であり，その剤型も皮膚に適用できるものであれば限定されず，溶液系，可溶化系，乳化系，粉末分散系，水－油二層系，水－油－粉末三層系，軟膏，化粧水，ゲル，エアゾール等，任意の剤型が適用される。
　本発明の剤を化粧品として用いる場合は，化粧水，乳液，ファンデーション，口紅，リップクリーム，クレンジングクリーム，マッサージクリーム，パック，ハンドクリーム，ハンドパウダー，ボディシャンプー，ボディローション，ボディクリーム，浴用化粧品等の形態として用いてもよい。
　しかしながら，本発明の剤および組成物の採り得る形態は，上述の剤型や形態に限定されるものではない。また，本発明の剤又は組成物は，本発明の装置又は方法あるいはその他の装置又は方法等と併用してもよい。
　本発明の方法，装置，剤及び組成物を適用する対象は，皮膚光老化及び／又は色素沈着（例えば，真皮色素沈着）が客観的又は主観的に認められる対象であっても，色素沈着を予防したいと希望する対象であってもよい。例えば，Ｍ１／Ｍ２バランスが崩れていると判断された対象であってもよい。１実施形態では，皮膚におけるＭ１／Ｍ２バランスを指標として色素沈着度（例えば，真皮色素沈着度）が高いと判断された対象であってもよい。あるいは，皮膚の光老化に特異的な表現型，例えば，しみ，しわ，たるみ等が気になる対象であってもよいし，表皮や色素沈着，例えば，しみ，くすみ，アザ，入れ墨の跡等が気になる対象であってもよい。しみ，しわ，たるみ，くすみ，アザ，入れ墨の跡等は，視感判定や公知の指標を用いることにより決定することができる。
　一実施態様において，本発明は，対象の光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善するための美容方法であって，
　（ａ）対象の皮膚に，ハクシニン抽出物を有効成分として含む，光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善する剤を適用する工程，を含む，美容方法を提供する。
　一実施態様における本発明の美容方法は，上記工程（ａ）に加え，さらに，皮膚に対して微弱な物理刺激を適用する工程，例えば，伸展刺激，押下刺激，又はマッサージ等の微弱な物理刺激を皮膚に与えることによって達成されてもよい。例えば，皮膚に対して微弱な物理刺激を適用する工程は，（ｂ－１）皮膚を０．１％以上５０．０％以下の伸展率まで伸展すること；及び（ｃ－１）伸展状態から回復すること；を含むサイクルを６０Ｈｚ以下の振動数で行うことであってもよい。
　伸展率は，上記式１により算出される。物理刺激は，０．００１％以上８０．０以下，０．０１％以上６０．０％以下，０．１％以上５０．０％以下，好ましくは，０．１％以上５０．０％以下の伸展率で行ってもよい。例えば，０．１％以上１．０％以下，０．１％以上５．０％以下，０．１％以上１０．０％以下，０．１％以上２０．０％以下，０．１％以上３０．０％以下，１．０％以上５．０％以下，１．０％以上１０．０％以下，１．０％以上２０．０％以下，１．０％以上３０．０％以下，１．０％以上５０．０％以下，１０．０％以上２０．０％以下，１０．０％以上３０．０％以下，等任意の範囲の伸展率が採用できる。
　伸展速度は，１サイクル中で最大伸展率（％）に達するまでの速度（％／ｓ）を指す。回復速度は，最大伸展率から非伸展状態に戻る速度（％／ｓ）を指す。伸展速度・回復速度は，０．０１０％／ｓ～４０％／ｓ，０．０５％／ｓ～３０％／ｓ，０．１０％／ｓ～２０％／ｓ，０．２％／ｓ～１５％／ｓ，０．３％／ｓ～１０％／ｓなど任意の速度で行ってもよい。伸展速度と回復速度は同じでも異なっていてもよい。
　例えば，皮膚に対して微弱な物理刺激を適用する工程は，（ｂ－２）前記対象の皮膚を１μｍ～１０００μｍ押圧すること；及び（ｃ－２）前記対象の皮膚を押圧状態から回復させること；を含むサイクルを６０Ｈｚ以下の振動数で行うことであってもよい。
　「皮膚を１μｍ～１０００μｍ押圧する」とは，皮膚の最表面から１μｍ～１０００μｍの深度まで皮膚を押圧することを指す。押圧の深度は，皮膚の最表面から１μｍ～１０００μｍ，１０μｍ～１０００μｍ，１０μｍ～３００μｍ，１０μｍ～１００μｍ等任意に設定可能である。
　振動数は，伸展又は押圧開始から非伸展又は非押圧状態まで回復するサイクルを１サイクルとした場合の１秒あたりのサイクル数を指す。１サイクルには，一定の時間，伸展又は押圧状態を維持すること及び／又は非伸展又は非押圧状態で休止することを含めてもよい。例えば，１サイクル中に，（ｂ－１）の後かつ（ｃ－１）の前に，あるいは（ｂ－２）の後かつ（ｃ－２）の前に，０秒～３０分間，１秒～２０分間，５秒～１０分間，又は１０秒～５分間伸展又は押圧状態を保持すること；及び／又は（ｃ－１）の後かつ次のサイクルの（ｂ－１）の前に，あるいは（ｂ－２）の後かつ（ｃ－２）の前に，０秒～３０秒間，０秒～２０秒間，０秒～１０秒間，１秒～１０秒間，１秒～２０秒間，１秒～１０秒間非伸展又は非押圧状態で休止すること，を更に含んでもよい。振動数は，例えば，０．００００００１Ｈｚ以上１０ｋＨｚ以下，０．０００００１Ｈｚ以上１ｋＨｚ以下，０．００００１Ｈｚ以上１００Ｈｚ以下，好ましくは，０．０００１Ｈｚ以上６０Ｈｚ以下，０．０００１Ｈｚ以上１０Ｈｚ以下であってもよい。例えば，０．００１Ｈｚ以上６０Ｈｚ以下，０．０１Ｈｚ以上６０Ｈｚ以下，０．００１Ｈｚ以上１０Ｈｚ以下，０．０１Ｈｚ以上１０Ｈｚ以下，０．１Ｈｚ以上６０Ｈｚ以下，０．１Ｈｚ以上１０Ｈｚ以下，０．５Ｈｚ以上６０Ｈｚ以下，０．５Ｈｚ以上５０Ｈｚ以下，０．５Ｈｚ以上１０Ｈｚ以下，０．５Ｈｚ以上５Ｈｚ以下，０．５Ｈｚ以上１Ｈｚ以下，０．００１Ｈｚ以上０．０１Ｈｚ以下，０．００１Ｈｚ以上０．１Ｈｚ以下，０．００１Ｈｚ以上１Ｈｚ以下，０．０１Ｈｚ以上１Ｈｚ以下，０．１Ｈｚ以上１Ｈｚ以下，１Ｈｚ以上６０Ｈｚ以下，１Ｈｚ以上１０Ｈｚ以下，１Ｈｚ以上５Ｈｚ以下，等任意の範囲の振動数が採用できる。
　市販の美顔器，マッサージ機器等には，ＲＦ波といった０．３～３００ＭＨｚ程度の周波数を有する電磁波を用いるものや，１ＭＨｚから７ＭＨｚ程度の周波数を有する超音波を用いるものなどがある。これらの周波数／振動数と比べ，本発明の方法／装置が採用する振動数は極めて低い。従来の美顔器等のように皮膚に強い振動数を与えると皮膚に赤み，圧力痕，傷，痛み，炎症といった悪影響を与えるリスクがあるが，本発明のような振動数を採用すると上述のリスクが低く非侵襲的な物理刺激が可能になる。本発明者らにより，伸展率および振動数が高すぎると刺激が強すぎるため，これらの値を適正値に調節することにより皮膚を優しく刺激するほうが好ましいことが発見されたためである。
　また，従来，当該分野において一般的に利用されているモーター等の機構を利用する美容機器類ではそのモーターの機械的機構から６０Ｈｚを超える振動数しか選択できないことが当業者の技術常識であった。従来技術における美容機器類の限界である「６０Ｈｚ」以下の振動数，例えば，６０Ｈｚ以下，１０Ｈｚ以下，１Ｈｚ以下といった本発明のような振動数を採用するには，特別な機械を作成する必要性が求められていた。更には，このような低い振動数では，本発明の効果を奏するには「弱すぎる」という固定概念もあり，これまで検討がほとんどされていなかった。しかしながら，本発明者らは，従来の技術常識から考えると非常に低い振動数を用いて実際に皮膚に物理刺激を与えてみたところ，驚くべきことに，このような低い振動数の優しい刺激でも良好な効果が奏された。
　ＥＭＳ機器等では低中周波の装置も市販されているものの，これらは特に筋肉や皮下脂肪等の深い層で作用させるように設計されており，本願発明のような皮膚表層に対する影響は不明である。また，このような装置は周波数が低くても電流を流す際にビリビリとした刺激を伴うこともあり，皮膚に優しい刺激を与える本願発明とは異なる。一方，本発明は，超音波や電流，磁場といったエネルギーを加えず，直接皮膚に伸展刺激を与えるという簡便な方法による美容法が可能である。更に，このような振動数を有する伸展刺激は，優しい刺激でありながら，実施例に記載のようにＭ１／Ｍ２バランスの調整／改善作用を奏する。よって，本発明の方法／装置を使用すると，皮膚に悪影響を与えず，光老化及び／又は真皮色素沈着の予防及び／又は改善効果が期待される。
　物理刺激は，美顔器などの器具，実験的な装置，ヒトの手や器具を用いたマッサージ，顔面のエクササイズによるものであってもよく，接触又は非接触により達成されるものであってもよい。一態様では，物理刺激を生ずる刺激発生部と，物理刺激を接触又は非接触により付与する刺激付与部を備えた機器を用いて，皮膚に対して機械的に発生された物理刺激を付与することができる。物理刺激は，例えば，皮膚を引張，押圧，叩く，揉む，吸引するといった接触によって達成されてもよく，及び／又は，例えば，超音波や空気圧または水圧のようなもので皮膚に衝撃波をあたえることで変位させるといった非接触により達成されてもよい。顔面のエクササイズとしては，頬を膨らませることや，目を見開くことなどが行うことができる。マッサージとしては，施術を受ける対象自身又は美容部員などの施術者による手やローラー等の器具を用いたマッサージが挙げられる。しかしながら，本発明の物理刺激の範囲内であれば限定されない。
　本発明に用いられ得る装置として，例えば，使用者の皮膚に接触し本発明の微弱な物理刺激を付与する皮膚接触部を備える美容装置が挙げられる。例えば，把持部及び皮膚伸展部又は皮膚押圧部から構成されるものであってもよい。例えば，図１３左に記載の装置は，皮膚接触部が皮膚に触れることにより，皮膚を特定の振動数および伸展率にて伸展するように設計されている。
　また，例えば，本発明の装置は，電源と，刺激発生部と，皮膚刺激部を備え，電源は電気信号を発生し，刺激発生部は，電源からの電気信号を物理的な刺激に変換して物理刺激を発生し，皮膚刺激部は，刺激発生部で発生された物理刺激を受け取り使用者の皮膚に物理刺激を与えるものであってもよい。
　例えば，図１３左に示す装置は，把持部と，電源と，物理的な刺激を制御する制御部と，刺激発生部と，皮膚刺激部と皮膚固定部を含む皮膚接触部とを備える。使用者が把持部を持って皮膚接触部を皮膚に当て，皮膚固定部により皮膚を固定するようにし，制御部を操作することにより電源からの電気的な信号が刺激発生部により物理的な刺激に変換され，物理刺激が皮膚刺激部に伝わり，皮膚が皮膚固定部に固定されつつ皮膚刺激部により特定の振動数および伸展率にて伸展されるように設計されている。例えば，刺激発生部はモーターなどにより駆動され電気信号を物理刺激に変換するものであってもよい。また，図１３左に記載の皮膚刺激部は，皮膚に伸展刺激を与えるものであるが，例えば，皮膚に押圧刺激を与えるものであってもよい。
　あるいは，本発明の装置は，電源と，物理的な刺激を制御する制御部と，刺激発生部と，シート状の材料からなる皮膚接触面を含む皮膚接触部とを備える美容装置であってもよい。例として，図１３右にこのような美容装置の皮膚接触部を示す。シート状の材料は，電流を流すことが可能で，電源からの電気的な信号を物理的な刺激に変換するものであってもよい。そのようなシート状の材料としては，Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ　Ｅｌａｓｔｏｍｅｒ　Ａｃｔｕａｔｏｒ（ＤＥＡ），導電ポリマー，ＩＰＭＣ，ＰＶＣゲル，Ｍｃｋｉｎｎｅｎ型などが挙げられる。
　本発明の装置の電源は，内部電源又は外部電源であってもよく，充電式であってもよい。また，本発明の装置は，例えば，携帯電話やクラウドなどに保存されているデータを用いるものであっても，ワイヤレスでリモート操作されるものであってもよい。
　物理刺激は，上術のような接触又は非接触による物理的な刺激を与えることにより皮膚の伸展を達成するものであってもよい。物理刺激は，皮膚表面に対し平行方向，すなわち横方向に加えてもよいし，皮膚表面に対し垂直方向，すなわち縦方向に加えてもよいし，あるいは斜め方向，ねじれ方向等任意の方向が採用できる。
　物理刺激を行うサイクル数は限定されない。例えば，１０～５００サイクル，２０～４００サイクル，３０～３００サイクル，４０～２００サイクル，５０～１００サイクルといった任意の数のサイクル行なってもよい。例えば，実施例に記載のように，２７サイクル行えば十分な場合もある。
　さらに，これらの任意の数のサイクルを１セットとし，このセットを任意の数のセット，例えば，１～１００セット，２～５０セット，又は３～１０セット行ってもよい。
　物理刺激を行う時間も限定されない。例えば，休止時間を設けて又は設けずにサイクルを繰り返し５分～３時間，１０分～２時間，３０分～１時間といった一定時間行ってもよい。
　サイクル間又はセット間の時間間隔も限定されない。例えば，伸展又は押圧刺激は，１セット又は複数セットを単独で行うものであってもよく，１又は複数のセットを毎日，２日，３日，４日，５日，６日，７日に１回，１，２，３，４週間に１回等，連続的又は断続的に定期的又は不定期的に行うものであってもよい。
　しかしながら，皮膚抗光老化及び／又は色素沈着抑制作用を発揮するのに十分な刺激が達成されれば上記のような振動数，伸展率，サイクル数，頻度に限定されない。物理刺激を行う波形も，矩形波，正弦波，三角波，のこぎり波等任意に設定できる。
　美容処置としては，特に限定されないが，例えば本発明の剤又はその他の成分を含む化粧料の塗布などの光老化及び／又は色素沈着抑制に有効と考えられている任意の処置が含まれる。化粧料とは，皮膚に適用される化粧料をいい，例えば化粧水，乳液，美容液，クリーム，ファンデーションなどをいうが，これらに限定されず，皮膚状態の改善を直接の目的とするものではないが，皮膚に塗布されるもの全てを含むことを意図し，例えば，日焼け止め剤なども包含するものとする。あるいは，美容処置は，例えば，伸展刺激，押下刺激，マッサージ等の物理刺激を皮膚に与えることであってもよい。美容処置は，一回の処置であってもよいし，数日から数週間にわたって行われる継続的な処置であってもよい。美容処置は個人的に行われてもよいし，美容室や，化粧品の販売店，エステサロンなどで行われてもよい。
　次に実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。なお，本発明はこれにより限定されるものではない。
　実験１：組織染色
　図１ａに示す年齢の若齢者（２０代～３０代）及び光老化が起こっている高齢者（６０代～７０代）の白人由来の目尻の皮膚を凍結切片にし，薄切後，以下に示すマクロファージのマーカーで染色した。
（１）Ｍ１マクロファージの染色：ヤギ由来の抗ヒトＣＤ８６抗体（Ｒ＆Ｄ）とウサギ由来の抗ヒトＣＤ１１ｂ抗体（ａｂｃａｍ）で二重染色を行った（図１ｂ）。
（２）Ｍ２マクロファージの染色：マウス由来の抗ヒトＣＤ２０６抗体（ＢＤ）又はマウス由来抗ヒトＣＤ１６３抗体（Ｌｅｉｃａ）とウサギ由来の抗ヒトＣＤ１１ｂ抗体（ａｂｃａｍ）で二重染色を行った（図１ｃ）。
（３）総マクロファージの染色：マウス由来の抗ヒトＣＤ６８抗体（ａｂｃａｍ）とウサギ由来の抗ヒトＣＤ１１ｂ抗体（ａｂｃａｍ）で二重染色を行った。
　表皮直下２００μｍまでの（１）～（３）の抗体二重に陽性の細胞を各マクロファージとして計数した（図１ｄ）。また，Ｍ１，Ｍ２マクロファージとコラーゲン産生との関わりを検討する目的で，ヤギ由来の抗ヒトＣＤ８６抗体（Ｒ＆Ｄ）とラット由来の抗プロコラーゲン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ），又はマウス由来抗ヒトＣＤ２０６抗体（ＢＤ）とラット由来の抗プロコラーゲン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で二重染色した（図１ｅ左）。
　（１）～（３）の組織染色を図１ｂ，ｃに，計数結果のグラフを図１ｄに，Ｍ１，Ｍ２マクロファージ抗体と抗プロコラーゲン抗体で二重染色した結果を図１ｅ左に示す。図１ｂ，ｃ，ｄに示すように，光老化が起こっている高齢者では，Ｍ１マクロファージが多く見られる一方，Ｍ２マクロファージは減少していた。より具体的には，図１ｂに示すように，若齢者では血管周辺のみにＭ１マクロファージが存在する一方，高齢者では組織全体的に散在していた。また，図１ｃに示すように，若齢者ではＭ２マクロファージが組織全体に存在する一方，高齢者ではその数が減少していた。更に，図１ｄに示すように，若齢者と高齢者間で，マクロファージの総数（Ｍ１の数＋Ｍ２の数）は変化せず，Ｍ１／Ｍ２バランスのみが変化していた。若齢者では，Ｍ１に対するＭ２の比率（Ｍ２の数／Ｍ１の数）が約５／５～約７／３の範囲内にある一方，高齢者ではＭ１に対するＭ２の比率が激しく減少しＭ１／Ｍ２バランスが大きく崩れ，若齢者のものとは著しく異なっていた。
　更には，図１ｅ左上の２枚の写真のように，若齢者・高齢者にかかわらず，Ｍ１マクロファージとプロコラーゲンとの位置はずれている一方，左下の２枚の写真のようにＭ２マクロファージとプロコラーゲンでは位置の一致が見られた。このことから，図１ｅ右図の模式図で示すような，Ｍ１がコラーゲンの破壊を促進し，Ｍ２がコラーゲン生成を促進するように線維芽細胞に作用している可能性が示唆される。
　実験２：ＴＨＰ－１のＭ１，Ｍ２分化刺激実験
　非特許文献１に記載の方法に従い，ヒト由来の株化細胞であるＴＨＰ－１を用いて，Ｍ１，Ｍ２マクロファージへ分化誘導した。具体的には，図２ａに示す方法で，ＴＨＰ－１をＲＰＭＩ１６４０（Ｎａｋａｌａｉ）に１ｍＭ　Ｎａ　Ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｎａｋａｌａｉ），２ｍＭ　Ｌ　Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｎａｋａｌａｉ），１０％　ＦＢＳを添加して培養した。その後，１００ｎＭ　ＰＭＡ（ａｂｃａｍ）をさらに加えて２４時間刺激しマクロファージに分化させた。Ｍ１に分化させる際はさらに１００ｎｇ／ｍＬ　ＬＰＳ（ｓｉｇｍａ）と２０ｎｇ／ｍＬ　ＩＦＮγ（Ｒ＆Ｄ）を加えて２４時間刺激し，Ｍ２に分化させる際はさらに２０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－４（Ｒ＆Ｄ）と２０ｎｇ／ｍＬ　ＩＬ１３（Ｒ＆Ｄ）を加えて２４時間刺激した。顕微鏡で観察し，図２ｂに示すように形態が変化したことを確認した。
　また，それぞれの分化後又は未分化の状態のままの細胞のｍＲＮＡを抽出し，ＩＬ－１ｂｅｔａ，ＴＮＦ－ａｌｐｈａ，ＩＬ－１０のプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＴａｑＭａｎ　Ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｓｓａｙによるｒｅａｌｔｉｍｅ　ＰＣＲを行い，発現量を定量した（図２ｃ上図）。更に，実験１と同じＣＤ８６抗体（Ｒ＆Ｄ），ＣＤ２０６抗体（ＢＤ）を用い，同様にＰＣＲを行い発現量を定量した（図２ｃ下図）。それぞれの値はＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正した。
　図２ｃに示すように，実験２に記載の方法により分化させたマクロファージがそれぞれ，Ｍ１に特徴的な炎症性サイトカイン（ＩＬ－１ｂｅｔａ，ＴＮＦ－ａｌｐｈａ）及びＭ２に特徴的な抗炎症性サイトカイン（ＩＬ－１０）を産生することが示された。更に，これらの分化誘導マクロファージがそれぞれＭ１，Ｍ２マクロファージの表面マーカーであるＣＤ８６，ＣＤ２０６発現の増加を示した。これらの結果より，分化誘導が成功したことが確認された。よって，実験２の方法で分化させたＭ１，Ｍ２マクロファージ及び未分化のＭ０マクロファージを以下の実験３，４で用いた。
　実験３：Ｍ１，Ｍ２マクロファージ上清の線維芽細胞への添加実験（１）
　図３ａに示すように，実験２と同様の方法でＴＨＰ－１をＭ１，Ｍ２に分化後又はＭ０の未分化の状態のまま，上清を除き，ＰＢＳで１度洗浄した後，培地を加えて４８時間培養した。炎症性・抗炎症性サイトカインといったＭ１，Ｍ２の分泌物を含むそれらの上清を新生児由来線維芽細胞に添加した。対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）としてＲＰＭＩ１６４０（Ｎａｋａｌａｉ）を添加した細胞を用いた。上清の添加後，線維芽細胞を７２時間培養し，上清中のプロコラーゲン量をＰＩＰ　ＥＬＩＳＡ　ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ）で定量した（図３ｂ）。細胞画分はウサギ由来の抗ヒトコラーゲン抗体（ＣＥＤＥＲＬＡＮＥ）とビオチン化ヒアルロン酸結合タンパク（ＨＯＫＵＤＯ）で染色した（図３ｃ）。さらに，β－ｇａｌを老化指標として用い，細胞の核をＤＡＰＩで染めた後，細胞内のβ－ｇａｌをＳｅｎｅｓｃｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ａｂｃａｍ）を用いて染色し（図３ｄ），β－ｇａｌ陽性細胞及びＤＡＰＩ陽性細胞の数を計数した（図３ｅ）。
　更に，Ｍ１マクロファージ，Ｍ２マクロファージのメラニン産生への寄与度を検討するために，上記と同様にそれぞれのマクロファージの上清を線維芽細胞に添加して培養した。その後，線維芽細胞を回収してｍＲＮＡを回収し，ＨＧＦ，ＥＴ１，ｂＦＧＦ，ＩＬ－１ａｌｐｈａ，ＳＣＦ，ｃｌｕｓｔｅｒｉｎのプローブを用いてｒｅａｌ　ｔｉｍｅ　ＰＣＲを行いそれぞれのｍＲＮＡ発現量を定量した（図３ｆ）。
　結果を図３ｂ～３ｆに示す。図３ｂは，各マクロファージ（Ｍ１，Ｍ２）の上清を線維芽細胞に添加して７２時間培養した後のプロコラーゲン量を示す。図３ｃは，各マクロファージ（Ｍ１，Ｍ２）の上清を添加して７２時間培養した後の線維芽細胞におけるコラーゲン及びヒアルロン酸の局在を示す。図３ｂ，ｃより，Ｍ１は顕著にコラーゲン産生を抑制することがわかる。図３ｄは，各マクロファージ（Ｍ１，Ｍ２）の上清を添加して７２時間培養した後の線維芽細胞における細胞内β－ｇａｌを示す。図３ｄより，Ｍ１ではβ－ｇａｌ陽性細胞が増え老化を促進する一方，Ｍ２は老化を抑制することが示唆される。図３ｅは，β－ｇａｌ陽性細胞及びＤＡＰＩ陽性細胞の数を計数したグラフを示す。右図はウェルあたりのＤＡＰＩ陽性細胞の総数を示す。図３ｅ右図より，Ｍ２は細胞の老化を抑制するのみならず，細胞の増殖を促進することが示唆される。図３ｅ左図は，ＤＡＰＩ陽性細胞総数あたりのβ－ｇａｌ陽性細胞の数の割合（％）を示し，Ｍ１は老化及び細胞死促進作用がある一方，Ｍ２は老化抑制及び細胞増殖作用があることが示唆される。更に，図３ｆに示すように，メラノジェネシス関連因子のｍＲＮＡ発現はＭ１によりメラニン産生を増加する方向に作用する一方，Ｍ２によりメラニン産生を抑制する方向に作用したこともわかった。非特許文献６に報告されるように，線維芽細胞は，ＵＶ等の光刺激によりＳＣＦ，ＨＧＦ等の因子を分泌し細胞死を引き起こすことが知られている。また，非特許文献７～９に報告されるように，線維芽細胞は，光刺激によりＨＧＦ，ＥＴ１，ｂＦＧＦ，ＳＣＦ，ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ等の因子を分泌することによりメラノサイトに直接的又は間接的に作用してメラニンを産生する。よって，光刺激による細胞死やメラニン産生は，Ｍ１／Ｍ２のバランスの崩れによるものであることが示唆される。
　実験４：Ｍ１，Ｍ２マクロファージ上清の若齢及び老齢線維芽細胞への添加実験
　次に，Ｍ２マクロファージの抗老化効果が老化した線維芽細胞にも有用か，つまり，若返り効果があるか，を確認する目的で，Ｍ１，Ｍ２マクロファージ上清を若齢及び老齢細胞に添加し，線維芽細胞の年齢の違いによるマクロファージ上清の効果の違いを検討した。
　具体的には，実験３と同じ方法で収集したそれぞれのマクロファージ上清を，新生児ヒト***由来線維芽細胞（若齢由来線維芽細胞）と６８歳ヒト由来線維芽細胞（老齢由来線維芽細胞）に添加し，７２時間培養した。その後，実験３と同様の方法でβ－ｇａｌ及びＤＡＰＩ染色を行い，β－ｇａｌ陽性細胞及びＤＡＰＩ陽性細胞の数を計数した（図４ａ，４ｂ）。更に，実験３と同様にＭ１，Ｍ２の上清を若齢および老齢由来線維芽細胞に添加し，線維芽細胞を７２時間培養し，上清中のプロコラーゲン量をＰＩＰ　ＥＬＩＳＡ　ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ）で定量し（図４ｃ），ウサギ由来抗ヒトコラーゲン抗体（ＣＥＤＥＲＬＡＮＥ）とＤＡＰＩで染色した（図４ｄ）。
　図４ａは，β－ｇａｌの染色図を示す。図４ｂは若齢由来線維芽細胞および老齢由来線維芽細胞のβ－ｇａｌ陽性細胞数及びウェルあたりの細胞総数の結果をグラフ化したものを示す。図４ａ下図より，老齢細胞であっても，Ｍ２上清を添加することによりβ－ｇａｌ陽性細胞が著しく減少し老化が抑制されたことがわかった。また，図４ｂより，年齢にかかわらず，Ｍ１により老化が促進され，Ｍ２により老化が抑制されることもわかった。このことは，図４ｃ，ｄに示されるように，年齢にかかわらず，Ｍ１上清を添加した細胞では，Ｍ２上清に比べて顕著にコラーゲン産生量が低いという結果によっても支持される。
　実験５：Ｍ１マクロファージ，Ｍ２マクロファージと新生児***由来線維芽細胞との共培養実験
　新生児***由来芽細胞と同数のＭ１又はＭ２マクロファージ（実験２の方法で作成）をＲＰＭＩ１６４０（Ｎａｋａｌａｉ）で培養した時と新生児***由来線維芽細胞とその半分の数のＭ１又はＭ２マクロファージをＲＰＭＩで培養した時に産生されるコラーゲン量をウサギ由来抗ヒトコラーゲン抗体（ＣＥＤＥＲＬＡＮＥ）で染色し比較した。同時にマウス由来抗ヒトＣＤ６８抗体（ａｂｃａｍ）でも染色し，マクロファージを可視化した。
　結果を図５に示す。新生児***由来芽細胞でも，Ｍ１上清を添加するとコラーゲンが減少される一方，Ｍ２を添加するとコラーゲンが多く見られた。つまり，若齢細胞であっても，Ｍ１／Ｍ２バランスが崩れるとコラーゲンに影響を及ぼすことがわかった。
　実験６：３Ｄ皮膚モデルを用いたＭ１／Ｍ２バランスの崩れによる影響
　Ｍ１／Ｍ２マクロファージが表皮細胞や線維芽細胞へ及ぼす影響を検討するために，以下の表に記載のような３層構造からなる三種類の３Ｄ皮膚モデルを作成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 　３Ｄ皮膚モデルの作成は次のように行った。セルカルチャーインサート（φ１２ｍｍ，多孔膜の平均孔径：０．４μｍ）にヒト真皮線維芽細胞（０．２×１０6個）を播種し，２００μＭ　アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム（ＡＰＭ），１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭを用いて２日に１回培地交換して１週間培養した。その上に，対照モデルにはヒト真皮線維芽細胞を含んだ０．５％Ｉ型コラーゲン－１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭ溶液，Ｍ１モデル，Ｍ２モデルにはさらに実験２の方法で分化させたＭ１マクロファージ，Ｍ２マクロファージをそれぞれ３０，０００細胞添加したものをそれぞれ分注して，ヒト真皮線維芽細胞の上にコラーゲンゲルを作製し，１～５日間培養した。
　さらにＨｕｍｅｄｉａ－ＫＧ２（クラボウ）培地中に分散した表皮角化細胞を５×１０5個／ウェルとなるようにコラーゲンゲルの上に播種し，インサート外にＨｕｍｅｄｉａ－ＫＧ２と１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭを１：１で混合し２００μＭ　ＡＰＭを添加した培地を内側と同じ液面高さまで添加して３日間培養した。
　その後，インサートまたはガラスリング内の培地を取り除き，外側に皮膚モデル用培地（１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭとＨｕｍｅｄｉａ－ＫＧ２　ＥＧＦ（－）を１：１で混合してＣａ　１．８ｍＭに調製）に２００μＭ　ＡＰＭ，１０μＭ　Ｎ－ヒドロキシ－２－［［（４－メトキシフェニル）スルホニル］３－ピコリル）アミノ］－３－メチルブタンアミド塩酸塩（ＣＧＳ２７０２３Ａ（ＭＭＰ阻害剤）），１０μＭ　ＢＩＰＢＩＰＵ（ヘパラナーゼ阻害剤）をインサートの底面の高さまで添加して，インサート内部を空気に曝した状態で気液境界培養を行った。２～３日に１回培地交換して２週間培養した。
　培養を終えた皮膚モデルを４％　ＰＦＡ／ＰＢＳ（Ｎａｋａｒａｉ）で固定後，実験１と同様の方法で抗ＣＤ２０６抗体（ａｂｃａｍ），抗ＣＤ６８抗体（ａｂｃａｍ），抗ＣＤ８６抗体（ａｂｃａｍ）で染色し，Ｍ１，Ｍ２マクロファージの存在を確認した（図６）。その後，抗ｐ２１抗体（ａｂｃａｍ），ＤＡＰＩ（ＶＥＣＴＯＲ）で染色し，表皮細胞層および線維芽細胞層それぞれにおいてＤＡＰＩで染色された細胞の数を全細胞数とし，そのうち抗ｐ２１抗体にも染色された細胞の数をｐ２１陽性細胞数として計数した。全細胞数に対するｐ２１陽性細胞数の割合を以下の式により求めた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
　結果を図７，８に示す。これらの図に示すように，中間層に接している上層の表皮細胞層および下層の線維芽細胞層のいずれでも対照モデル（ｃｏｎｔ）に対し，Ｍ１モデル（Ｍ１）ではｐ２１陽性細胞が増加し，一方Ｍ２モデル（Ｍ２）では減少していた。この傾向は，単層培養物を用いた実験３と一致していた。従って，ヒト皮膚により近い３Ｄ皮膚モデルにおいても，Ｍ１マクロファージは老化及び細胞死促進作用がある一方，Ｍ２マクロファージは老化及び細胞死抑制作用があることが示唆される。
　実験７：ヒト皮膚を用いたｅｘ　ｖｉｖｏモデルへの太陽光照射実験
　Ｇｅｎｏｓｋｉｎ社製ＮａｔｉｖｅＳｋｉｎ（３８歳女性から採取後の皮膚）を到着後付属の培養液で１日培養した。翌日にＯｒｉｅｌ社製１０００Ｗソーラーシミュレーターに光学フィルターを入れて，ＵＶＡとＵＶＢのみを１１．５　Ｊ／ｃｍ2照射し，付属の培養液で培養を続けた（照射（＋））。対照として照射を行わない試料を用いた（照射（－））。照射５日後サンプルを回収し，実験１と同様にＭ１マクロファージ，Ｍ２マクロファージ，総マクロファージを染色し，その数を数えてグラフとした。
　結果を図９に示す。ソーラーシミュレーターを照射すると，Ｍ１数は最も増加した。一方，Ｍ２数の増加はＭ１の場合に比べて非常に小さかった。つまり，光刺激により，Ｍ１／Ｍ２のバランスが崩れＭ１の比率が増加することがわかった。
　実験８：ヒト皮膚を用いたｅｘ　ｖｉｖｏモデルへの伸展刺激実験
　次に，Ｍ１／Ｍ２バランスを調整又は改善する方法について検討した。
　試料：Ｇｅｎｏｓｋｉｎ社製ＮａｔｉｖｅＳｋｉｎ（３８歳女性から採取後の皮膚）（６ｗｅｌｌ　ｓｉｚｅ，直径約２～２．５ｃｍ）を使用した。
　伸展条件：図１１に示すようなウェル内の皮膚の両端を把持する把持部を有し，把持部を引っ張ることにより皮膚を伸展させる伸展器具を作成した。上記組織片が入ったウェルを水平に設置し，把持部を操作して両端から皮膚を伸展させ図１０に示すように１０％の伸展率となる伸展を１０％／ｓの速度で行い，１０％／ｓの回復速度にて試料を元の非伸展状態に戻した。これを１サイクルとし，合計９０サイクルを３０分間かけて行った。この９０サイクルを１セットとし，セット間に３０分～１時間の休止時間を設けて合計３セット（合計２７０サイクル）を３時間かけて行った。対照として伸展刺激を行わない試料を用いた（ｃｏｎｔｒｏｌ）。
　観察方法：伸展刺激を与えた又は与えない皮膚試料について，総マクロファージの染色をウサギ由来の抗ヒトＣＤ１１ｂ抗体（ａｂｃａｍ）のみで染色した以外は実験１と同様の方法で，にＭ１マクロファージ，Ｍ２マクロファージ，総マクロファージを染色し，その数を計数した。全マクロファージの総数に対する各マクロファージ（Ｍ１，Ｍ２）の割合（％）を求めてグラフとした。
　結果を図１２に示す。対照に比べ，伸展刺激を与えた試料では，マクロファージの総数とＭ１の数はあまり変化がなかったが，Ｍ２の数は非常に増加した。つまり，伸展刺激により，Ｍ１／Ｍ２のバランスが改善することがわかった。
　実験９：Ｍ１，Ｍ２マクロファージ上清のコラーゲンに対する影響
　実験３に加えて，Ｍ１マクロファージ，Ｍ２マクロファージのコラーゲン分解への寄与度を検討するために，実験３と同様の方法でそれぞれのマクロファージの上清を線維芽細胞に添加して培養し，７２時間後ｍＲＮＡを回収した。コラーゲン分解の指標としてＭＭＰ－１，ＭＭＰ－２，およびＩＬ－１βのプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｏｓｙｓｔｅｍｓ社製Ｔａｑｍａｎ　ｐｒｏｂｅ）を用いてｒｅａｌ　ｔｉｍｅ　ＰＣＲを行いそれぞれのｍＲＮＡ発現量を定量した（図１４ａ）。
　更に，Ｍ１マクロファージ，Ｍ２マクロファージのコラーゲン産生・成熟化への寄与度を検討するために，実験３と同様の方法でそれぞれのマクロファージの上清を線維芽細胞に添加して培養し，７２時間後ｍＲＮＡを回収した。コラーゲン産生・成熟化の指標としてＣＯＬ１Ａ１，ＣＯＬ１Ａ２，ＨＳＰ４７，およびＡＤＡＭＴＳ－２のプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｏｓｙｓｔｅｍｓ社製Ｔａｑｍａｎ　ｐｒｏｂｅ）を用いてｒｅａｌ　ｔｉｍｅ　ＰＣＲを行いそれぞれのｍＲＮＡ発現量を定量した（図１４ｂ）。
　図１４ａ，ｂより，Ｍ１はコラーゲン分解に寄与する一方，Ｍ２はコラーゲン産生・成熟化に寄与することが確認された。
　実験１０：若年及び高齢者のヒト皮膚を用いたｅｘ　ｖｉｖｏモデルにおけるコラーゲンの分解及び産生
　図１５ａに示す年齢の若齢者（２０代～３０代）と高齢者（６０代～８０代）の白人由来のこめかみの皮膚を実験１と同様に凍結切片にし，薄切後，３／４側のコラーゲン切断断片を染色する抗プロコラーゲン抗体（ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ），抗断片化コラーゲン（ＡｄｉｐｏＧｅｎ），並びに実験１と同じＣＤ６８，ＣＤ１１ｂ，ＣＤ２０６，ＣＤ８６抗体を用い，実験１と同様の方法で陽性細胞をカウントした。
　結果を図１５ｂ，ｃ，ｄに示す。若年群に比べて高齢群ではＭ１マクロファージの割合が高くＭ２マクロファージの割合が低くなっていた。しかしながら，年齢にかかわらず，３／４コラーゲン陽性を示す線維芽細胞に比べて３／４コラーゲン陽性を示すマクロファージの数が多く，さらに３／４コラーゲン陽性を示すＭ１マクロファージよりも３／４コラーゲン陽性を示すＭ２マクロファージ数が多い傾向にあった。
　実験１１：真皮におけるメラニンの取り込み能力を示すｉｎ　ｖｉｔｒｏ実験
　実験３と同様の方法でＴＨＰ－１細胞をＭ１マクロファージとＭ２マクロファージに分化させた。分化したそれぞれのＭ１マクロファージ，Ｍ２マクロファージ，および線維芽細胞（クラボウ社製）に，メラニン溶液（Ｓｉｇｍａ社，Ｍｅｌａｎｉｎ－ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔ，　Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ，　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｆｏｒ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ）をＰＢＳに溶解し０．０２％　Ｗ／Ｖに調整し添加した。２４時間後に細胞をＰＢＳで洗浄後，顕微鏡で撮影し，細胞を回収した。回収した細胞の細胞数をアラマーブルー（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で，メラニン量を下記のように計測し，定量した。
　メラニンの定量：
それぞれの細胞の培地（マクロファージ：ＲＰＭＩ１６４０，　線維芽細胞：１ＤＭＥＭ）で１：１０に調整したアラマーブルーを添加後，３７℃で３０分間培養した。その後，その上清を１００ｕｌ／ｗｅｌｌ回収し，ｅｘｃｉｔｅｍｅｎｔ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ：５４４ｎｍ／５９０ｎｍで蛍光をＡｓｃｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ社）で計測した。計測後，ＰＢＳで洗浄し，１Ｍ　ＮａＯＨを添加後室温で３時間インキュベートし，完全に融解した。この細胞溶液をＯＤ４７５にてＰＯＷＥＲＳＣＡＮ　ＨＴ（ＤＳ　ＰＨＡＲＭＡ　ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ）を用いて計測した。
　結果を図１６ａ～ｃに示す。図中の単位「ｍｅｌａｎｉｎ／ａｌｍａｒ　ｂｌｕｅ」は，培養細胞をアラマーブルーで染色し上清を蛍光を５４４ｎｍ／５９０ｎｍで計測した強度（（１））と，その後細胞を溶解しメラニンも溶解させたものを吸光度４７５ｎｍで計測した強度（（２））の相対値（（２）／（１））であり，細胞あたりのメラニン含有量を示す。これらの図より，Ｍ２が非常に多くのメラニンを貪食していることがわかった。この傾向は２４時間後でも既に見られたが，５日後まで細胞の培養を続けて観察したところ，その差はより明確となった（図１６ｃ）。
　実験１２：真皮におけるメラニンの取り込み能力を示すＥｘ　ｖｉｖｏの実験
　実験１１によってＭ２マクロファージが線維芽細胞やＭ１マクロファージよりも多くのメラニンを貪食することがわかったため，実験１１でカウントしたヒト皮膚の真皮層を，ＬＳＭ８８０（カールツァイス社製）を用いてｅｘ　ｖｉｖｏで観察した。高齢でも若齢でも，明視野で観察した時にＭ２マクロファージはメラニンが黒く一緒に染まるのに対し，Ｍ１マクロファージの近くにはメラニンが存在しないことがわかった。これにより，真皮においてＭ２マクロファージが線維芽細胞やＭ１マクロファージより多くのメラニンをとりこんでいることがｅｘ　ｖｉｖｏでわかり，その数をカウントしグラフ化した（図１７）。
　図１７より，老齢でも若年でもメラニンを取り込んでいるＭ２マクロファージの数がＭ１マクロファージの数より多く，この傾向には年齢差があまりみられなかった。この結果より，真皮のメラニンを取り込むのはＭ２マクロファージであるため，Ｍ２マクロファージの割合を増やしてＭ１／Ｍ２バランスを整えれば光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善できることが示唆される。
　実験１３：Ｍ１抑制／Ｍ２誘導剤の探索
　図１８に記載の各種マーカーを用いて，Ｍ１／Ｍ２バランスを調整又は改善することにより，光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善し得る剤を探索したところハクシニンに強力なＭ２誘導効果が見いだされた。なお，ここで用いたハクシニン抽出物（加水分解無し，又は加水分解あり）は，特許第４７８１８４２号公報（特許文献９）や，国際公開第２０１２／０５７１２４３号（特許文献１０）を参照して調製されたものであり，以下の手順によって調製された。なお，本発明に置いて用いられ得るハクシニン抽出物を調製する手順は以下に記載の手順に限定されないことに留意されたい。
　＜ハクシニン抽出物の調製＞
　ハクシニンの種子（未粉砕，必要に応じて外殻を除去）を５倍量（ｖ／ｗ）のアセトンまたは酢酸エチル（酢エチ）またはヘキサンに浸漬し，室温にて１０日間抽出を行った。ナイロンメッシュ（１００メッシュ）であらかじめ残渣を除き，さらにろ紙にてろ過した。ロータリーエバポレータでろ液から溶媒を除去した後，撹拌羽根で撹拌しながら０．５～１５ＮのＮａＯＨをＮａＯＨとして１００～３００ ｇ/ｌ 抽出物の範囲内で添加した（温度５０℃）。２００ ｒｐｍで撹拌しながら，５時間処理を行った。その後，５Ｎ Ｈ2ＳＯ4を徐々に添加し，撹拌しながらｐＨを１付近まで下げ，分離してくる油状物質を回収した。回収した油状物質に等容量の水を加えて水洗し，不純物・塩・過剰の酸を除去した。油状物質を減圧乾燥し，アルカリ処理物とした（加水分解ありのハクシニン抽出物）。比較対照としては，アルカリ処理前の抽出物を用いた（加水分解なしのハクシニン抽出物）。
　ＴＨＰ－１細胞をＭ０の未分化の状態のまま用い，３７℃で一晩培養した。その後，溶媒（ＤＭＳＯ）で溶解した加水分解無し（アルカリ処理無し）のハクシニン（コントロール）を３ｐｐｍ，又はハクシニン加水分解物を０．３ｐｐｍ，１ｐｐｍ，もしくは３ｐｐｍとなるように添加し，３７℃で二晩培養した。細胞を回収してＲＮＡを抽出し，ＣＤ８６，ＣＣＲ７，ＴＮＦ－ａｌｐｈａ，ＣＤ２０６，ＣＤ１６３，ＩＬ－１０及びＧＡＰＤＨの発現量をｒｅａｌ　ｔｉｍｅ　ＰＣＲで定量し，各遺伝子の発現量をＧＡＰＤＨの発現量で除した。その結果，ハクシニン加水分解物は，濃度依存的に，ＣＤ８６遺伝子，ＴＮＦ－α遺伝子発現量を低下させ，ＣＤ２０６遺伝子，ＩＬ－１０遺伝子を増加させた。このことからハクシニン加水分解物にＭ１誘導抑制かつＭ２誘導促進効果があることがわかった（図１８）。
　実験１４：ハクシニンによるメラニン貪食能増加効果
　未成熟（Ｍ０）の状態のＴＨＰ－１細胞に，溶媒（ＤＭＳＯ）で溶解した加水分解無し（アルカリ処理無し）のハクシニン（コントロール）を３ｐｐｍ，又はハクシニン加水分解物を１．０ｐｐｍ，３．０ｐｐｍとなるように添加した。３７℃にて培養し，４８時間後にメラニン溶液（Ｓｉｇｍａ社）を添加し，顕微鏡（Ｂｉｏ　Ｓｔａｔｉｏｎ　ＣＴ（Ｎｉｋｏｎ））にて観察した。
　結果を図１９ａ～ｂに示す。メラニン添加３０分後ハクシニン添加したマクロファージはメラニンを取り込み始めていた（図１９ｂの黒矢印）。さらに３時間後，コントロールはメラニンを取り込んでいない細胞がまだ多く存在するが，ハクシニン加水分解物添加サンプルでは全ての細胞がメラニンを取り込んでいた。
　光老化によりＭ１の割合が増加することが示され（実験７），Ｍ２の割合が高いほうが皮膚コラーゲン量が多くなり（実験９，１０）色素貪食作用も高くなる（実験１１，１２）傾向が示されたため，Ｍ２誘導剤としてスクリーニングされたハクシニン，並びにＭ１／Ｍ２バランス改善作用のある本発明の微弱な物理刺激は，真皮において色素沈着抑制効果が高いことが示唆される。
　実験１５：マクロファージの細胞内活性
　実験２と同様の方法でＴＨＰ－１から分化誘導したＭ０マクロファージ，Ｍ１マクロファージ及びＭ２マクロファージについて、Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（旧Ｓｅａｈｏｒｓｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）社製の細胞外フラックスアナライザーＸＦｅ２４（２４ｗｅｌｌ用）（以下、「フラックスアナライザー」という。）を用いて、Ｎａｔ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，　２０１４．　１５（９）：　ｐｐ８４６－８５５（非特許文献１４）を参考に細胞内活性を計測した。なお、フラックスアナライザーは、細胞の主要なエネルギー代謝経路である解糖、及びミトコンドリアによる好気呼吸の状態を、細胞に対して無侵襲・高感度に経時的計測を可能とする装置である。
　フラックスアナライザーを用いて、オリゴマイシン（ＡＴＰ合成酵素阻害剤）（「Ｏｌｉｇｏ」）、ＦＣＣＰ（脱共役剤）、及びロテノン（ミトコンドリア複合体Ｉ阻害剤）＋アンチマイシンＡ（ミトコンドリア複合体ＩＩＩ阻害剤）（「Ｒｏｔ＋Ａｎｔ」）を所定の時間に添加し、酸素消費速度（ＯＣＲ）と細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）とを計測した。ＥＣＡＲ，ＯＣＲの値は計測後１８．３分後のｂａｓａｌ　ＯＣＲの値、ｂａｓａｌ　ＥＣＡＲの値を用いた。それぞれの計測値は、Ｈｏｅｃｈｓｔを添加して染色された細胞核をカウントして得られた細胞数で補正した。
　その結果、Ｍ２マクロファージ、Ｍ０マクロファージ、Ｍ１マクロファージの順番で、ミトコンドリアによる呼吸活性が高いことが示された（図２０）。
　実験１６：ハクシニン抽出物によるマクロファージの細胞内活性への影響
　実験２と同様の方法で、ＴＨＰ－１から分化誘導したＭ０、Ｍ１、Ｍ２を準備し、Ｍ０に実験１３と同様の方法で調整したハクシニン抽出物（ハクシニン加水分解物）（０．３ｐｐｍ、１ｐｐｍ又は３ｐｐｍ）を添加した。４８時間インキュベートした後に、酸素消費速度（ＯＣＲ）をフラックスアナライザーで計測した。それぞれの計測値は、Ｈｏｅｃｈｓｔを添加して染色された細胞核をカウントして得られた細胞数で補正した（図２１）。
　その結果、ハクシニン抽出物を添加することによって、計測開始１８．３分後（３点目の計測値）のＢａｓａｌ　ＯＣＲの値（図２１）、及びミトコンドリア呼吸の値（計測開始１８．３分後のＢａｓａｌ　ＯＣＲの値から、計測開始９５．１分後のｎｏｎ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ（ミトコンドリアとは関連のない酸素消費量）を引いた値）（図２２）が有意に増加することが明らかとなった。
　実験１７：ハクシニン抽出物に含まれる各成分によるマクロファージの細胞内活性への影響（１）
　ハクシニン抽出物には、ω３脂肪酸であるリノレン酸やジュニペロン酸、ω６脂肪酸であるリノール酸等の不飽和脂肪酸が含まれていることが知られている。不飽和脂肪酸（ＥＰＡ、ＤＨＡ）がＭ１の炎症関連遺伝子に作用し、炎症を抑制することが報告されている（非特許文献１５（Ｃｅｌｌ　Ｍｅｔａｂ．　２０１７　Ｆｅｂ　７；２５（２）：４１２－４２７）)。そこで、ハクシニン抽出物に含まれる不飽和脂肪酸がマクロファージの細胞内活性へ与える影響について調べた。
　実験２と同様の方法で、ＴＨＰ－１から分化誘導したＭ０、Ｍ２を準備し、Ｍ０にリノール酸、リノレン酸又はジュニペロン酸（３ｐｐｍ）を添加し、４８時間後に、実験１５と同様の方法で酸素消費速度（ＯＣＲ）をフラックスアナライザーで計測した。それぞれの計測値は、Ｈｏｅｃｈｓｔを添加して染色された細胞核をカウントして得られた細胞数で補正した。
　その結果、ハクシニン抽出物に含まれるリノール酸、リノレン酸、ジュニペロン酸の添加によるＭ０マクロファージへのＢａｓａｌ　ＯＣＲ及びミトコンドリア呼吸の値は、溶媒のみ（ＤＭＳＯ）を添加したコントロールとの有意差が認められなかった（図２３）。
　実験１８：ハクシニン抽出物に含まれる各成分によるマクロファージの細胞内活性への影響（２）
　ハクシニン抽出物、又は不飽和脂肪酸を添加した後のインキュベート時間を２４時間に変更した場合のＭ０のＢａｓａｌ　ＯＣＲ及びミトコンドリア呼吸の値を調べた。実験方法は、ハクシニン抽出物又は不飽和脂肪酸を添加後のインキュベート時間を２４時間に変更した以外は、実験１７に記載の方法と同じ方法を実施した。
　その結果、ハクシニン抽出物及び各不飽和脂肪酸を添加後２４時間では、Ｂａｓａｌ　ＯＣＲ及びミトコンドリア呼吸の値の増加は観察されなかった（図２４）。
　実験１９：ハクシニン抽出物に含まれる各成分によるＭ１分化中のマクロファージの細胞内活性への影響
　実験２と同様の方法でＴＨＰ－１から分化誘導したＭ０を、さらにＭ１に分化誘導する工程においてハクシニン抽出物又は不飽和脂肪酸（リノール酸、リノレン酸、又はジュニペロン酸）を添加した場合の細胞内活性の変化をフラックスアナライザーを用いて解析した（図２５）。
　ＴＨＰ－１から分化誘導したＭ０をさらにＭ１に分化誘導する時に、ハクシニン抽出物、又は不飽和脂肪酸を添加して２４時間後にフラックスアナライザーを用いて、図１５の方法と同様に酸素消費速度（ＯＣＲ値）と細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ値）とを計測した。
　その結果、Ｂａｓａｌ　ＯＣＲ及びミトコンドリア呼吸は、ハクシニン抽出物を添加した場合のみ、有意な上昇が認められた（図２６（Ａ）及び（Ｂ））。強い抗炎症作用が報告されているリノレン酸のみ、ＥＣＡＲ値の強い抑制効果が観察され、その結果、ＯＣＲ／ＥＣＡＲ値の上昇が認められた。
　Ｍ１分化中のマクロファージのミトコンドリア呼吸はハクシニン抽出物によって有意に上昇したが、ハクシニン抽出物に含まれる不飽和脂肪酸単独では有意な上昇は認められず、ミトコンドリア呼吸の上昇という効果は、ハクシニン抽出物に含まれる各種成分の混合による特異的な効果である可能性が示唆された。
　実験２０：Ｍ１，Ｍ２マクロファージ上清に含まれるＳＤＦ－１αの確認
　皮膚のシミ部位の下部に存在する線維芽細胞においてＳＤＦ－１α（ＣＸＣＬ１２）の発現量が低下することから、ＳＤＦ－１量の低下が皮膚のシミ生成に関連する可能性が報告されている（非特許文献１６（Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ．　２０１８　Ｓｅｐ　９；８（１７）：４６２０－４６３２））。そこで、Ｍ１／Ｍ２マクロファージ自身のＳＤＦ－１α（ＣＸＣＬ１２）の発現量について調べた。
　実験２と同様の方法でＴＨＰ－１をＭ１，Ｍ２に分化後、上清を除き，ＰＢＳで１度洗浄した後，ＲＰＭＩ（０．５％ＦＢＳ）を加えて２４時間培養し、上清中のＳＤＦ－１α（ＣＸＣＬ１２）の量をサイトカインアレイイ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ）によって調べた（図２７（Ａ））。
　その結果、Ｍ２上清は、Ｍ１上清に比べて多くのＳＤＦ－１α（ＣＸＣＬ１２）が含まれていることが明らかとなった（図２７（Ｂ））。
　実験２１：Ｍ１，Ｍ２マクロファージ上清の線維芽細胞への添加実験（２）
　Ｍ１，Ｍ２マクロファージが生成する因子が、線維芽細胞のおけるＳＤＦ－１α（ＣＸＣＬ１２）の発現に与える影響を調べた（図２８（Ａ））。
　実験２と同様の方法でＴＨＰ－１をＭ１，Ｍ２に分化後、上清を除き，ＰＢＳで１度洗浄した後，ＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ，　５００μＭアスコルビン酸含有）を加えて４８時間培養した。炎症性・抗炎症性サイトカインといったＭ１，Ｍ２の分泌物を含むそれらの上清を皮膚線維芽細胞に添加した。対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）としてＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ，　５００μＭアスコルビン酸含有）を添加した細胞を用いた。上清の添加後，線維芽細胞を７２時間培養した。その後、線維芽細胞を回収してｍＲＮＡを回収し，ＲＮＡ－ｓｅｑにてＳＤＦ－１α（ＣＸＣＬ１２）の発現量を解析した（図２８（Ａ））。
　ＲＮＡ－ｓｅｑのリードをＳＴＡＲを使用してヒトゲノム（ｈｇ１９）にマッピングした。得られたカウントデータについて，低発現遺伝子のフィルタリング後にそれぞれのサンプル間のサイズ補正およびｌｏｇ２変換を行なった。以上の方法でサンプル毎に算出したｌｏｇ２（ＣＰＭ）について，ＲパッケージのｅｄｇｅＲの機能であるｇｌｍＱＬＦｉｔとｇｌｍＱＬＦＴｅｓｔを用いて、ｑｕａｓｉ－ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ　Ｆ－ｔｅｓｔで２群間比較を行った後、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法で多重比較検定補正を行なってｑ－ｖａｌｕｅを算出した。
　その結果、Ｍ１上清を添加した線維芽細胞は、ＳＤＦ－１ａ発現量が顕著に減少することが明らかとなった（図２８（Ｂ））。
　以上の結果により，Ｍ１／Ｍ２のバランスを調整又は改善することにより，光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善できることが示唆される。Ｍ１／Ｍ２のバランスの調整又は改善は，伸展刺激や押圧刺激を与えることや，ハクシニン等を適用することにより達成され，ひいては光老化及び／又は真皮色素沈着の予防及び／又は改善が期待される。

Claims (6)

  1. 　ハクシニン抽出物を有効成分として含む，光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善する剤。
  2. 　Ｍ１／Ｍ２バランスを調整することにより光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善する，請求項１に記載の剤。
  3. 　Ｍ１／Ｍ２バランスを調整することは，Ｍ１に対するＭ２の比率を上昇させることである，請求項２に記載の剤。
  4. 　対象の光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善するための美容方法であって，
    　（ａ）対象の皮膚に，請求項１～３のいずれか一項に記載の剤を適用する工程，
    を含む，美容方法。
  5. 　前記美容方法は，さらに，前記皮膚に対して微弱な物理刺激を適用する工程を含み，ここで前記物理刺激を適用する工程は，例えば，
    　（ｂ－１）前記対象の皮膚を０．１％以上５０．０％以下の伸展率まで伸展することであって，ここで，伸展率は，
    Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
     （式中，定点ＡおよびＢは，表皮または表皮が接着しているマトリックス上の任意の位置であり，ここで定点ＡとＢを通る直線が伸展方向と平行である）
    で算出される；及び
    　（ｃ－１）前記対象の皮膚を伸展状態から回復すること；
    並びに／又は，
    　（ｂ－２）前記対象の皮膚を，１μｍ～１０００μｍ押圧すること；及び
    　（ｃ－２）前記対象の皮膚を押圧状態から回復すること；
    を含み，
    ここで前記（ｂ－１）及び（ｃ－１）並びに／又は前記（ｂ－２）及び（ｃ－２）のサイクルが６０Ｈｚ以下の振動数で実施される，
    を含む，請求項４に記載の美容方法。
  6. 　請求項５に記載の美容方法に適用するための美容装置であって，
    　前記装置は，
    　物理刺激を生ずる刺激発生部と，
    　刺激発生部で発生した物理刺激を皮膚に付与する刺激付与部とを備え，
    　ここで，当該装置は，皮膚に対して微弱な物理刺激を適用する工程を行うための装置であり，ここで当該工程は，例えば，
    　（ｉ－１）前記皮膚を０．１％以上５０．０％以下の伸展率まで伸展すること；及び
    　（ｉｉ－１）前記皮膚を伸展状態から回復すること；
    並びに／又は，
    　（ｉ－２）前記皮膚を１μｍ～１０００μｍ押圧すること；及び
    　（ｉｉ－２）前記皮膚を押圧状態から回復すること；を含むサイクルを６０Ｈｚ以下の振動数で行うことであり，
    　ここで，伸展率は，上記式１により算出される，
    前記美容装置。
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