WO2023063118A1 - Ｍ２又はｍ２様マクロファージの誘導又は活性化剤、ｍ２又はｍ２様マクロファージの誘導又は活性化方法、真皮の色素沈着を予防及び／又は改善するための組成物、並びに真皮の色素沈着を予防及び／又は改善する方法 - Google Patents

Ｍ２又はｍ２様マクロファージの誘導又は活性化剤、ｍ２又はｍ２様マクロファージの誘導又は活性化方法、真皮の色素沈着を予防及び／又は改善するための組成物、並びに真皮の色素沈着を予防及び／又は改善する方法 Download PDF

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extract
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聡 堀場
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Definitions

  • the present invention provides an agent for inducing or activating M2 or M2-like macrophages, a method for inducing or activating M2 or M2-like macrophages, a composition for preventing and/or improving dermal pigmentation, and dermal pigmentation. It relates to preventive and/or ameliorative methods.
  • the aging phenomenon of human skin can be broadly divided into “natural aging” and “photoaging”.
  • Photoaging is a phenomenon that is recognized site-specifically to light exposure, and is skin-specific.
  • the production of active oxygen and damage to DNA in cells are induced by the effects of UV rays and the like, which is thought to be the cause of phenotypes such as wrinkles and sagging due to damage to dermal fibrous tissue.
  • photoaging of the skin causes phenomena such as reduction of collagen fibers and degeneration of elastin elastic fibers.
  • melanocytes are also damaged, and a large amount of melanin pigment is produced, which causes spots and the like.
  • pigmentation such as spots and dullness is caused by the accumulation of melanin produced by melanocytes in the basal layer of the epidermis.
  • Melanin is normally present in the epidermis and basal layer, but since the epidermis turns over in a relatively early cycle, such melanin is easily excreted.
  • melanin may be present in the dermis layer for reasons such as melanin dropping into the dermis through gaps in the basement membrane. Since the turnover cycle of dermal cells is much slower than that of the epidermis, such melanin is often accumulated without being excreted. For these reasons, amelioration of dermal pigmentation is very difficult.
  • Patent Document 1 discloses a preventive or inhibitor of skin photoaging by preventing inhibition of leukocyte elastase.
  • Patent Document 2 discloses a photoaging inhibitor composition characterized by containing a plant extract of the genus Paphia of the family Amaranthaceae, which has a collagen synthesis-promoting action, and an animal-derived collagen peptide.
  • Non-Patent Document 6 proposes strengthening the basement membrane to prevent melanin from sinking into the dermis.
  • Patent Document 3 discloses an anti-aging cosmetic composition containing a compound that induces autophagy activation along with increased adiponectin expression. It has also been suggested that phagocytosis by macrophages is used to improve dermal pigmentation. In Patent Document 8, dermal blemishes are caused by attracting macrophages to fibroblasts that have taken up melanin that has fallen into the dermis and phagocytizing them. It discloses preventive/improving agents.
  • Macrophages are cells that are localized in various tissues in the body, trigger immune responses against foreign substances and pathogens, and are known to be involved in inflammation. Macrophages are differentiated into M1 type and M2 type from undifferentiated M0 macrophages (hereinafter sometimes abbreviated as M0). M1 macrophages (hereinafter sometimes abbreviated as M1) are known as inflammatory type, and M2 macrophages (hereinafter sometimes abbreviated as M2) are known as repair type (anti-inflammatory type). Imbalance in the balance between M1 macrophages and M2 macrophages has been reported to be associated with diseases such as obesity, type 2 diabetes, and arteriosclerosis (Patent Documents 4-6, Non-Patent Documents 1-5).
  • M1/M2 balance the balance of these M1 macrophages and M2 macrophages
  • regulation especially increasing the ratio of M2 macrophages to M1 macrophages, is particularly important in preventing and improving photoaging and pigmentation in the dermis. Therefore, the present inventors have searched for substances that can prevent and improve photoaging and/or dermal pigmentation using the M1/M2 balance as an index. It was also found that the eucalyptus extract has that effect.
  • An object of the present invention is to provide a new agent or method capable of inducing or activating M2 or M2-like macrophages, which has the effect of preventing and/or improving photoaging and/or dermal pigmentation.
  • the present inventors have extensively searched for an agent for preventing and/or improving photoaging and/or dermal pigmentation, and found that nicotinamide or a mixture of nicotinamide and succinicin extract reduces macrophages to M2. or can be induced or activated into M2-like macrophors. Based on such discoveries, the present invention has been developed. That is, the present invention includes the following aspects.
  • An agent for inducing or activating M2 or M2-like macrophages comprising nicotinamide or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the inducing or activating agent according to item 1 which prevents and/or improves pigmentation in the dermis via the M2 or M2-like macrophages.
  • the inducing or activating agent according to item 1 or 2 which suppresses glycolysis of macrophages.
  • the inducing or activating agent according to any one of items 1 to 3 which promotes aerobic respiration of macrophages.
  • the inducing or activating agent according to any one of Items 1 to 4 further comprising a cakushinin extract.
  • a composition comprising nicotinic acid amide or a pharmaceutically acceptable salt thereof and a cinnamon extract.
  • a method for inducing or activating M2 or M2-like macrophages in a subject in need thereof comprising: A method comprising applying nicotinamide or a pharmaceutically acceptable salt thereof to said subject to induce or activate M2 or M2-like macrophages.
  • the method of item 7, wherein pigmentation in the dermis of the subject is prevented and/or improved via the M2 or M2-like macrophages.
  • the method according to any one of items 7 to 10 further comprising a cakushinin extract.
  • a method for preventing and/or improving dermal pigmentation in a subject in need thereof comprising: A method comprising applying to said subject a composition comprising nic
  • nicotinamide or a pharmaceutically acceptable salt thereof for the manufacture of a composition for inducing or activating M2 or M2-like macrophages.
  • the use according to item 13 which prevents and/or improves pigmentation in the dermis of a subject via the M2 or M2-like macrophages.
  • Use according to any one of items 13 to 16 further comprising a cakushinin extract.
  • M2 or M2-like macrophages which have the effect of preventing and/or improving photoaging and/or dermal pigmentation.
  • FIG. 1a shows a schematic of the induction method from THP-1 to M0, M1 and M2 macrophages.
  • FIG. 1b is a photomicrograph of M0, M1 and M2 macrophages induced from THP-1.
  • the upper diagram of FIG. 1c is a graph showing gene expression levels of cytokines (IL-1beta, TNF-alpha, IL-10) produced by M0, M1 and M2 macrophages induced from THP-1.
  • the lower figure in FIG. 1c is a graph showing the mRNA expression levels of cell surface markers (M1: CD86, M2: CD206) of M1 and M2 macrophages.
  • FIG. 2 shows the expression levels (marker/GAPDH value) of each marker of M1 and M2 when each concentration of Hakushinin extract (0.3 ppm, 1.0 ppm, 3.0 ppm) was added, compared with the control (Hakushinin hydrated It is a graph showing a relative value (%) when no decomposition: control) is taken as 100%.
  • Fig. 1 shows the expression levels (marker/GAPDH value) of each marker of M1 and M2 when each concentration of Hakushinin extract (0.3 ppm, 1.0 ppm, 3.0 ppm) was added, compared with the control (Hakushinin hydrated It is a graph showing a relative value (%) when no decomposition: control) is taken as 100%.
  • FIG. 3a shows that 30 ppm of unhydrolyzed Hakushinin (control) or 1.0 ppm or 3.0 ppm of Hakushinin hydrolyzate was added to immature (M0) THP-1 cells 30 days after addition of melanin. Shows how it looks after a minute.
  • FIG. 3b is an enlarged view of FIG. 3a. Black arrows indicate macrophages taking up melanin.
  • Figure 4 shows the intracellular activities of M0 macrophages, M1 macrophages and M2 macrophages in experiment 4 analyzed using a flux analyzer: (A) oxygen consumption rate (OCR), (B) extracellular acidification rate (ECAR). ) and (C) OCR/ECAR results.
  • OCR oxygen consumption rate
  • ECAR extracellular acidification rate
  • C OCR/ECAR results.
  • FIG. 5 shows the results of analysis using a flux analyzer in Experiment 5 on the effect of the addition of the Hakushinin extract on the intracellular activity of M0 macrophages 48 hours after addition.
  • A Normalized OCR
  • B Basal OCR (OCR value at the third point of A measurement).
  • FIG. 6 shows the results of analysis using a flux analyzer in Experiment 5 of the effect of the addition of the Hakushinin extract on the intracellular activity of M0 macrophages 48 hours after addition.
  • A Normalized OCR
  • FIG. 7 shows the results of analysis using a flux analyzer in Experiment 6 of the influence of typical unsaturated fatty acids contained in the extract of Hakushinin alone on the intracellular activity 48 hours after the addition of M0 macrophages.
  • Basal OCR Basal OCR
  • FIG. 8 shows the results of analysis using a flux analyzer in Experiment 7 of the influence of each component contained in the succinicin extract on the intracellular activity of M0 macrophages 24 hours after addition.
  • A Basal OCR,
  • FIG. 9 shows a schematic of the method of Experiment 8.
  • FIG. 10 shows the results of analysis using a flux analyzer in Experiment 8 on the influence of the extract of Chinese cucumber or each component contained in the extract on the intracellular activity during differentiation of M1 macrophages.
  • Basal OCR Basal OCR
  • B OCR of mitochondrial respiration
  • C OCR/ECAR
  • FIG. 11 shows the results of analysis of the intracellular activity of M0 macrophages 24 hours after addition of nicotinamide in Experiment 9 using a flux analyzer.
  • A Schematic of experiment 9,
  • B Basal OCR
  • C OCR of mitochondrial respiration
  • D OCR/ECAR
  • E normalized ECAR.
  • FIG. 12 outlines the method of Experiment 10.
  • FIG. 12 outlines the method of Experiment 10.
  • FIG. 13 shows the results of analyzing the intracellular activity 24 hours after addition of nicotinamide to M1-differentiating macrophages in Experiment 10 using a flux analyzer.
  • Basal OCR Basal OCR
  • B OCR of mitochondrial respiration
  • C OCR/ECAR
  • D normalized ECAR.
  • FIG. 14 outlines the method of Experiment 11.
  • FIG. 15 shows the results of analyzing the intracellular activity 24 hours after addition of nicotinamide to M2-differentiating macrophages in Experiment 11 using a flux analyzer.
  • C OCR/ECAR
  • D normalized ECAR.
  • FIG. 16 shows the results of analysis of intracellular activity 24 hours after addition of succinicin extract, nicotinic acid amide, or a mixture thereof (Mix) to M0 macrophages in experiment 12 using a flux analyzer.
  • A Schematic of experiment 12,
  • B OCR of mitochondrial respiration.
  • Fig. 17 shows the result of analyzing the intracellular activity of macrophages during M1 differentiation 24 hours after addition of cinnamon extract, nicotinamide, or a mixture thereof (Mix) using a flux analyzer in Experiment 13. indicates (A) Schematic of experiment 13, (B) OCR of mitochondrial respiration, (C) OCR/ECAR. Fig.
  • Macrophages are cells that are localized in various tissues in the body, trigger immune responses against foreign substances and pathogens, and are known to be involved in inflammation. Macrophages are differentiated into M1 type and M2 type from undifferentiated M0 macrophages (hereinafter sometimes abbreviated as M0). M1 macrophages (hereinafter sometimes abbreviated as M1) are known as inflammatory type, and M2 macrophages (hereinafter sometimes abbreviated as M2) are known as repair type (anti-inflammatory type).
  • M1/M2 balance the balance between these M1 macrophages and M2 macrophages
  • M1/M2 balance the balance between these M1 macrophages and M2 macrophages
  • the M1/M2 balance is particularly important in preventing and improving photoaging and pigmentation in the dermis. Therefore, the present inventors used the M1/M2 balance as an index to search for substances that can prevent and improve photoaging and/or dermal pigmentation. or can be activated, leading to the development of the present invention.
  • Hakushinin has been reported to have the effect of acting on fibroblasts to proliferate fibroblasts, promoting the production of collagen and hyaluronic acid, and suppressing the production of melanin (Patent Document 9 and 10).
  • nicotinic acid amide is known to have a blood circulation-promoting action, a rough skin-improving action, a whitening action, and the like (for example, Patent Document 12).
  • succinicin and nicotinamide can induce or activate repair-type M2 macrophages or M2-like macrophages, thereby adjusting/improving the M1/M2 balance. .
  • the present invention provides an agent for inducing or activating M2 or M2-like macrophages, comprising nicotinamide or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the agent for inducing or activating M2 or M2-like macrophages according to the present invention can prevent and/or improve pigmentation in the dermis through M2 or M2-like macrophages induced or activated by the agent. .
  • the present invention provides a composition comprising nicotinamide or a pharmaceutically acceptable salt thereof and a cinnamon extract.
  • the present invention provides a method of inducing or activating M2 or M2-like macrophages in a subject in need thereof, comprising: A method is provided comprising applying nicotinamide or a pharmaceutically acceptable salt thereof to said subject to induce or activate M2 or M2-like macrophages.
  • the present invention provides a method for preventing and/or improving dermal pigmentation in a subject in need thereof, comprising: A method is provided comprising applying to said subject a composition comprising nicotinamide or a pharmaceutically acceptable salt thereof and a cinnamon extract.
  • the present invention also provides use of nicotinamide or a pharmaceutically acceptable salt thereof for producing a composition for inducing or activating M2 or M2-like macrophages.
  • the present invention also provides use of nicotinamide or a pharmaceutically acceptable salt thereof and succinicin extract for the manufacture of a composition for preventing and/or improving pigmentation in the dermis.
  • pigmentation refers to pigmentation in the dermis and epidermis, and includes, for example, pigmentation such as melanin due to photoaging, as well as artificially injected pigments (e.g., tattoos and tattoos). .
  • the present invention is effective for both the dermis and epidermis, it is highly expected as a countermeasure against dermal pigmentation in the sense that improvement methods are limited other than phagocytosis by melanophages. By applying the present invention, spots, dullness, dark circles, etc. due to pigmentation are improved.
  • the pigment since the pigment is injected into the dermis layer, it is effective for decolorizing tattoos, etc., which are difficult to remove once the pigment is put in.
  • induction or activation of M2 or M2-like macrophages refers to differentiation of macrophages (e.g., M0 macrophages or M1 macrophages) into M2 macrophages, or macrophages (e.g., M0 macrophages, M1 macrophages or M2 macrophages) were compared to intracellular activities possessed by M2 macrophages (e.g., promotion of aerobic respiration (mitochondrial respiration) and/or suppression of glycolysis (preferably, intracellular activity possessed by M1 macrophages). (case)) to induce or activate.
  • macrophages e.g., M0 macrophages or M1 macrophages
  • macrophages e.g., M0 macrophages, M1 macrophages or M2 macrophages
  • intracellular activities possessed by M2 macrophages e.g., promotion of aerobic respiration (mitochondrial respiration) and/or suppression of glycolysis (preferably,
  • M2 or M2-like macrophages may be to increase the absolute number of M2 or M2-like macrophages, the number of M1 or M1-like macrophages relative to the number of M2 or M2-like macrophages , that is, to decrease the ratio (M1/M2 balance).
  • M2-like macrophages refers to the intracellular activity of M2 macrophages (e.g., promotion of aerobic respiration (mitochondrial respiration) and/or suppression of glycolysis (preferably, intracellular activity of M1 macrophages). A macrophage that exhibits )) when compared to and does not necessarily match the marker of M2 macrophages.
  • M1-like macrophages refer to intracellular activities of M1 macrophages (e.g., suppression of aerobic respiration (mitochondrial respiration) and/or promotion of glycolysis (preferably, intracellular activities of M2 macrophages). When compared)), it refers to the macrophages shown and does not necessarily match the markers of M1 macrophages.
  • M1 macrophages can be measured using markers such as CD86, CD80, and iNOS as indicators.
  • M2 macrophages can be measured using markers such as CD206, CD163, Agr1, and the like, for example.
  • Overall macrophage markers, including M1 and M2, include CD11b, CD68, and the like.
  • M1 and M2 macrophages may be measured by quantifying M1-specific cytokines such as IL-1beta, TNF-alpha and M2-specific cytokines such as IL-10.
  • the marker is not limited to the above markers as long as the marker can measure the M1/M2 balance.
  • the M1/M2 balance may refer to the ratio of the number of M1 macrophages and/or M1-like macrophages to the number of M2 macrophages and/or M2-like macrophages as described above. , may refer to the ratio of the mRNA amount of M1 macrophage markers (eg, CD86, CD80, iNOS, etc.) to the mRNA amount of M2 macrophage markers (eg, CD206, CD163, Agr1, etc.). In photoaged skin, the ratio of M1 is high and the ratio of M2 is low, and it is M2 that has high melanophagocytosis.
  • M1 macrophage markers eg, CD86, CD80, iNOS, etc.
  • M2 macrophage markers eg, CD206, CD163, Agr1, etc.
  • the increase may be, for example, an increase with statistical significance (e.g., Student's t-test) with a significance level of 5%, and/or e.g., 1% or more, 5% or more, 10% or more,
  • the increase may be 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, 100% or more.
  • the adjustment / improvement of the M1 / M2 balance is performed by adjusting the ratio of M2 to M1 (number of M2 / number of M1 and / or mRNA amount of M2 marker / mRNA amount of M1 marker) within a certain range, for example, about It may be 4/6 to about 9/1, about 5/5 to about 8/2, about 5/5 to about 7/3, etc., or it may be close to the above range. It may be maintaining within a range, or maintaining constancy around the above range.
  • the M1/M2 balance may refer to the balance between the intracellular activity of M1 macrophages and the intracellular activity of M2 macrophages, for example, the intracellular activity mainly used by M1 macrophages (e.g. state of glycolysis) and/or an index of intracellular activity (for example, state of aerobic respiration (mitochondrial respiration)) mainly used by M2 macrophages.
  • Intracellular activity can be assessed, for example, by measuring the cellular oxygen consumption rate (OCR value), extracellular acidification rate (ECAR value), or OCR/ECAR value.
  • increasing the ratio of M2 to M1 may refer to increasing intracellular mitochondrial activity primarily used by M2 macrophages, including, for example, M1 macrophages and M2 macrophages.
  • aerobic respiration mitochondrial respiration
  • mitochondrial respiration is elevated in the population (e.g., aerobic respiration (mitochondrial respiration) predominates in a population comprising M1 and M2 macrophages) and/or in a population comprising M1 and M2 macrophages
  • It may refer to a decrease in glycolytic activity, which is anaerobic respiration, e.g., elevated OCR values in a population comprising M1 and M2 macrophages and/or comprising M1 and M2 macrophages.
  • Intracellular activity can be measured by using, for example, an extracellular flux analyzer XFe24 (for 24well) manufactured by Agilent Technologies (formerly Seahorse Bioscience), which is the main energy metabolism pathway of cells, glycolysis, and aerobic respiration by mitochondria. It is possible to non-invasively and highly sensitively measure the state of cells over time, but this device is an example, and intracellular activity can be measured using any device and method for evaluation. Therefore, it is not limited to the use of the device.
  • the ratio of M1 is high and the ratio of M2 is low, and since it is M2 that is more melanophagocytic, the adjustment/improvement of the M1/M2 balance is likely to increase the intracellular activity of M2 relative to M1.
  • the ratio may be, for example, increasing OCR values in a population comprising M1 and M2 macrophages and/or decreasing ECAR values in a population comprising M1 and M2 macrophages.
  • increase or decrease may be, for example, an increase or decrease with a statistically significant difference (e.g., Student's t-test) with a significance level of 5%, and / or, for example, 1% or more, 5% or more, 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, 100% or more increase or It may be a decrease.
  • a statistically significant difference e.g., Student's t-test
  • Hakushinin is a crude drug obtained by drying the seeds of Platycladus orientalis Franco, Thuja orientalis L., and Biota orientalis Endl. of the Cupressaceae family. Although it is preferable to use seed kernels (endosperm portion) as the hakushinin used in the present invention, whole seeds can also be used because active ingredients are contained in whole seeds. Hakushinin may be produced by a conventional method, or a commercially available product may be used.
  • the method for preparing the extract that can be used in the present invention can be produced with reference to known methods (eg, Patent Documents 9 and 10), but is not limited to these.
  • a method for preparing a cinnamon extract that can be used in the present invention a method of subjecting a plant extract obtained by extracting seeds of a plant to alkali treatment (hereinafter referred to as the first method);
  • a method hereinafter referred to as the second method of pulverizing the seeds of A. and maturing them for at least one week at a temperature of 10-35°C and a relative humidity of 20-90%.
  • the extraction solvent used in the first method and the second method may be any volatile solvent that is commonly used for extraction, particularly alcohols such as methanol and ethanol, hydrous alcohols, acetone, ethyl acetate, Polar/nonpolar organic solvents such as hexane and ether can be used alone or in combination, but acetone, ethyl acetate, and hexane are particularly preferred because they are inexpensive and can be easily concentrated under reduced pressure.
  • extraction with supercritical carbon dioxide gas can also be used.
  • an extraction solvent containing a large amount of water is not preferable because extraction of the active ingredient is suppressed.
  • extract for a certain period of time with a solvent that is 1 to 100 times, preferably 1 to 30 times, the mass of the seeds.
  • the seeds to be used can be appropriately pulverized as necessary, but may be used unpulverized if clogging becomes a problem during filtration. It is also possible to repeatedly extract with a small amount of solvent, and a reflux apparatus such as a Soxhlet may be used.
  • extraction can be performed under general conditions of around 40° C. and 20 to 40 MPa.
  • the extracts are hydrolyzed by alkaline treatment.
  • Alkaline treatment is carried out by adding 0.2 to 2 times the volume of concentrated alkaline aqueous solution to the extract after removal of the solvent, thoroughly stirring and mixing, and aging for about 30 minutes to several days.
  • the temperature during mixing is preferably room temperature to 70°C, more preferably 30 to 60°C. It is desirable to appropriately stir during aging so that the hydrophilic component and the lipophilic component do not separate.
  • the concentrated alkaline aqueous solution include aqueous solutions of NaOH, KOH, etc. having a concentration of 1 to 10N.
  • the oily substance will separate.
  • This oily substance has a very high anti-dermal pigmentation effect and is highly safe for the skin.
  • alcohol, acetone, etc. may be added as appropriate after the alkali treatment, and further operations such as decolorization, deodorization, desalting, and distillation may be added thereafter, if necessary.
  • the seeds are moderately pulverized or pressed in the pre-extraction stage, and then aged at around room temperature for a certain period of time.
  • the aging period there is no particular limitation as long as the desired effect can be obtained, but if the aging period is as short as one week or less, it will be difficult to obtain a sufficient whitening effect, and on the other hand if it lasts for several years, it will rot and deteriorate.
  • the problem of oxidative change of smell occurs, which is not preferable.
  • Extraction is performed using the extraction solvent and extraction method described above from the seeds that have matured in this way. After extraction, if necessary, operations such as solvent removal, decolorization, deodorization, and distillation are performed.
  • the extract obtained by pulverizing and ripening such a specific seed has the same anti-dermal pigmentation effect as the above-mentioned alkali-treated extract, but it is highly safe for the skin. show gender.
  • a plant-based, photoaging and/or safe anti-dermal pigmentation effect consisting of an extract prepared by the first method or the second method from the seeds of plants as shown above.
  • An agent for preventing and/or improving dermal pigmentation can be provided, and an external preparation for skin containing the present agent can be provided.
  • Nicotinic acid amide (CAS No. 98-92-0) is an amide compound of nicotinic acid, and is known to have effects such as promoting blood circulation, improving rough skin, and whitening. However, it has now been found by the inventors for the first time that nicotinamide can modulate the M1/M2 balance, eg induce or activate M2 or M2-like macrophages. Nicotinamide or a pharmaceutically acceptable salt used in the present invention may be an extract from a natural product or a product synthesized by a known method. For example, specifically, those listed in the 17th revision of the Japanese Pharmacopoeia can be used.
  • Pharmaceutically acceptable salts are inorganic acid salts such as hydrochlorides, hydrobromides, sulfates, nitrates, phosphates, e.g. acetates, tartrates, citrates, fumarates, maleic acid salts, organic acid salts such as toluenesulfonates and methanesulfonates; metal salts such as sodium salts, potassium salts, calcium salts, aluminum salts such as triethylamine salts, guanidine salts, ammonium salts, hydrazine salts, and quinine salts; , salts with bases such as cinchonine salts, and the like.
  • inorganic acid salts such as hydrochlorides, hydrobromides, sulfates, nitrates, phosphates, e.g. acetates, tartrates, citrates, fumarates, maleic acid salts, organic acid salts such as toluenesul
  • the agent of the present invention may be used in combination with any substance known to adjust/improve the M1/M2 balance, such as the substances described in Patent Documents 4 to 7.
  • the route of administration can also be arbitrarily selected, for example, transdermal administration, oral administration, subcutaneous administration, transmucosal administration, intramuscular administration, etc., and can be administered to a specific site on the skin to prevent and/or improve dermal pigmentation.
  • Transdermal administration may be preferred.
  • transdermal administration may be preferred so that the epidermis and dermis can be reached through the skin.
  • adjustment/improvement of the M1/M2 balance may be, for example, induction of differentiation into M2 macrophages, or any other M1/M2 balance adjustment/improvement method.
  • the agent or composition that can be used in the present invention adjusts/improves the M1/M2 balance, thereby suppressing photoaging and/or dermal pigmentation.
  • the M1/M2 balance adjusting/improving agent, anti-photoaging agent, anti-pigmentation agent, and anti-dermal pigmentation agent of the present invention (hereinafter collectively referred to as "the agent of the present invention") is the above Any one of the active ingredients may be contained alone, or two or more may be contained in any combination and ratio.
  • the agent of the present invention can also be a composition in which the above active ingredients are combined with one or more other ingredients such as excipients, carriers and/or diluents.
  • the composition and form of the composition are arbitrary, and may be appropriately selected according to conditions such as the active ingredient and application.
  • the composition can be produced by a conventional method in a formulation in which other ingredients such as excipients, carriers and/or diluents are appropriately combined according to the dosage form.
  • the agent of the present invention can be used for humans and animals by being blended into cosmetics or the like, or can be administered to humans and animals as a pharmaceutical formulation. In addition, it may be added to various foods, drinks, and feeds to be ingested by humans and animals.
  • the blending amount (dry mass) of the plant body or its extract depends on the type, purpose, form, method of use, etc. , can be determined accordingly. For example, 0.00001% to 50% of nicotinic acid amide or a pharmaceutically acceptable salt and/or a cinnamon extract (on a dry weight basis in the case of extracts or herbal medicines) can be blended in the total amount of the cosmetic.
  • ingredients that are usually used in external skin preparations such as cosmetics, pharmaceuticals, and quasi-drugs, such as antioxidants, oils, and UV protection agents, to the extent that they do not impair the effects of the present invention.
  • surfactants, thickeners, alcohols, powder components, coloring materials, aqueous components, water, various skin nutrients and the like can be appropriately blended as necessary.
  • the external preparation for skin of the present invention can be applied as cosmetics, quasi-drugs, etc., which are applied to the outer skin, particularly preferably as cosmetics, and its dosage form is not limited as long as it can be applied to the skin.
  • Arbitrary formulations such as solution system, solubilization system, emulsification system, powder dispersion system, water-oil two-layer system, water-oil-powder three-layer system, ointment, lotion, gel, and aerosol are applicable.
  • agent of the present invention When the agent of the present invention is used as cosmetics, lotion, emulsion, foundation, lipstick, lip balm, cleansing cream, massage cream, mask, hand cream, hand powder, body shampoo, body lotion, body cream, bath cosmetics, etc. You may use it as a form.
  • the forms that the agents and compositions of the present invention can take are not limited to the dosage forms and forms described above.
  • the agent or composition of the present invention may be used in combination with the device or method of the present invention or other devices or methods.
  • the subject to which the method, device, agent and composition of the present invention are applied is a subject in which skin photoaging and / or pigmentation (e.g., dermal pigmentation) is objectively or subjectively observed, even if it is a subject with pigmentation. It can also be a subject that one wishes to prevent. For example, it may be a subject determined to have an M1/M2 balance. In one embodiment, the subject may be determined to have a high degree of pigmentation (for example, degree of dermal pigmentation) using the M1/M2 balance in the skin as an index.
  • skin photoaging and / or pigmentation e.g., dermal pigmentation
  • it may be a subject determined to have an M1/M2 balance.
  • the subject may be determined to have a high degree of pigmentation (for example, degree of dermal pigmentation) using the M1/M2 balance in the skin as an index.
  • the subject may be concerned with phenotypes specific to photoaging of the skin, such as spots, wrinkles, sagging, etc., or epidermis and pigmentation, such as spots, dullness, bruises, tattoo marks, etc. may be a target of concern. Spots, wrinkles, sagging, dullness, bruises, tattoo marks, etc. can be determined by visual judgment or using known indices.
  • Cosmetic treatments include, but are not particularly limited to, any treatment that is believed to be effective in inhibiting photoaging and/or pigmentation, such as applying cosmetics containing the agent of the present invention or other ingredients.
  • Cosmetics refers to cosmetics that are applied to the skin, such as lotions, milky lotions, serums, creams, foundations, etc., but not limited to these, and is not intended to directly improve skin conditions. However, it is intended to include anything that is applied to the skin, including, for example, sunscreens and the like.
  • the cosmetic treatment may be applying physical stimuli to the skin, such as stretching stimuli, pressing stimuli, massages, and the like.
  • a cosmetic treatment may be a one-time treatment or an ongoing treatment over a period of days to weeks. The cosmetic treatment may be performed privately, or may be performed at a beauty salon, a cosmetics store, a beauty salon, or the like.
  • THP-1 M0, M1 and M2 Differentiation Induction THP-1 M0, M1 and M2 Differentiation Induction
  • THP-1 a human-derived cell line
  • RPMI1640 Nakalai
  • 1 mM Na Pyruvate Nakalai
  • 2 mM L-glutamine Nakalai
  • FBS FBS
  • 100 nM PMA abcam
  • the mRNA of each differentiated or undifferentiated cell is extracted, and realtime PCR is performed by TaqMan Gene expression assay using IL-1beta, TNF-alpha, and IL-10 probes (Applied Biosystems). , the expression level was quantified (Fig. 1c upper panel). Furthermore, using a CD86 antibody (R&D) and a CD206 antibody (BD), PCR was performed in the same manner to quantify the expression level (Fig. 1c, lower figure). Each value was corrected with the expression level of GAPDH mRNA.
  • macrophages differentiated by the above method produce inflammatory cytokines (IL-1beta, TNF-alpha) characteristic of M1 and anti-inflammatory cytokines (IL-10) characteristic of M2, respectively. It was shown to produce Furthermore, these differentiation-induced macrophages showed increased expression of CD86 and CD206, surface markers of M1 and M2 macrophages, respectively. These results confirmed that differentiation induction was successful. Therefore, M1 and M2 macrophages differentiated by the above method and undifferentiated M0 macrophages were used in the following experiments.
  • IL-1beta inflammatory cytokines
  • IL-10 anti-inflammatory cytokines
  • Experiment 2 Search for M1 suppressor/M2 inducer (1) Various M1/M2 markers were used to search for agents that could prevent and/or improve photoaging and/or dermal pigmentation by adjusting or improving the M1/M2 balance, and cakushinin had a strong M2-inducing effect. was found.
  • the extract used here (without hydrolysis or with hydrolysis) was prepared with reference to Japanese Patent No. 4781842 (Patent Document 9) and International Publication No. 2012/0571243 (Patent Document 10). and was prepared by the following procedure. It should be noted that the procedures for preparing the extracts of Chinese cinnamon that can be used in the present invention are not limited to those described below.
  • the THP-1 cells were used in the undifferentiated state of M0 and cultured overnight at 37°C. After that, 3 ppm of unhydrolyzed (without alkali treatment) hakushinin (control) dissolved in a solvent (DMSO), or 0.3 ppm, 1 ppm, or 3 ppm of hakushinin hydrolyzate was added, and the mixture was heated at 37°C. cultured overnight. Cells were harvested and RNA was extracted, the expression levels of CD86, CCR7, TNF-alpha, CD206, CD163, IL-10 and GAPDH were quantified by real-time PCR, and the expression level of each gene was divided by the expression level of GAPDH. bottom.
  • the hakushinin hydrolyzate concentration-dependently reduced the expression levels of the CD86 gene and TNF- ⁇ gene, and increased the expression levels of the CD206 gene and IL-10 gene. From this, it was found that the Hakushinin hydrolyzate has the effect of suppressing M1 induction and promoting M2 induction (Fig. 2).
  • the ratio of M1 increases due to photoaging, and the higher the ratio of M2, the higher the amount of skin collagen and the higher the pigment phagocytosis (Patent Document 11). It is suggested that the pigmentation inhibitory effect is high in the dermis.
  • Experiment 4 Intracellular activity of macrophages
  • the flux analyzer is a device that enables noninvasive and highly sensitive temporal measurement of the state of glycolysis, which is the main energy metabolism pathway of cells, and aerobic respiration by mitochondria.
  • Oligomycin ATP synthase inhibitor
  • FCCP uncoupler
  • rotenone mitochondriachondrial complex I inhibitor
  • antimycin A mitochondriachondrial complex III inhibitor
  • ECAR extracellular acidification rate
  • mitochondrial respiratory activity was high in the order of M2 macrophages, M0 macrophages, and M1 macrophages (Fig. 4).
  • M0, M1, and M2 differentiated from THP-1 were prepared in the same manner as in Experiment 1, and Hakushinin extract (Hakushinin hydrolyzate) (0.3 ppm, 1 ppm) prepared in the same manner as in Experiment 2 was added to M0. or 3 ppm) was added. After 48 hours of incubation, oxygen consumption rate (OCR) was measured with a flux analyzer. Each measured value was corrected by the cell number obtained by counting the cell nuclei stained by adding Hoechst (Fig. 5).
  • OCR oxygen consumption rate
  • Hakushinin extract is known to contain unsaturated fatty acids such as linolenic acid and juniperonic acid, which are ⁇ 3 fatty acids, and linoleic acid, which is ⁇ 6 fatty acid. It has been reported that unsaturated fatty acids (EPA, DHA) act on M1 inflammation-related genes to suppress inflammation (Non-Patent Document 8 (Cell Metab. 2017 Feb 7; 25(2): 412-427). ). Therefore, we investigated the effect of unsaturated fatty acids contained in the extract of Hakushinin on the intracellular activity of macrophages.
  • unsaturated fatty acids such as linolenic acid and juniperonic acid, which are ⁇ 3 fatty acids, and linoleic acid, which is ⁇ 6 fatty acid. It has been reported that unsaturated fatty acids (EPA, DHA) act on M1 inflammation-related genes to suppress inflammation (Non-Patent Document 8 (Cell Metab. 2017 Feb 7; 25(2): 412-4
  • M0 Basal OCR and mitochondrial respiration values were investigated when the incubation time was changed to 24 hours after the addition of the cinnamon extract or unsaturated fatty acids.
  • the experimental method was the same as the method described in Experiment 6, except that the incubation time after the addition of the cinnamon extract or the unsaturated fatty acid was changed to 24 hours.
  • M0 differentiated from THP-1 by the same method as in Experiment 1 was further induced to differentiate into M1. Changes in activity were analyzed using a flux analyzer (Fig. 9).
  • Mitochondrial respiration of macrophages during M1 differentiation was significantly increased by the extract of Hakushinin, but not by the unsaturated fatty acids contained in the extract of Hakushinin alone. It was suggested that there is a possibility that it is a specific effect due to the mixture of various components contained.
  • Experiment 9 Search for M1 suppressor/M2 inducer (2) As shown in Experiment 4 above, repair-type M2 macrophages have higher mitochondrial respiration than undifferentiated M0 macrophages and inflammatory M1 macrophages, and obtain energy through mitochondrial respiration. Inflammatory M1 macrophages depend on glycolysis for energy. Therefore, when searching for substances capable of inducing M2 or M2-like macrophages using intracellular activities (mitochondrial respiration and glycolysis) as indices, it was found that nicotinamide can significantly increase the mitochondrial activity of macrophages. (Fig. 11).
  • M0 was prepared by differentiation induction from THP-1, and nicotinamide (0 mM (control), 0.6 mM or 3.0 mM) was added to M0. After 24 hours of incubation, oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) were measured with a flux analyzer. Each count value was corrected by the cell number obtained by counting the cell nuclei stained by adding Hoechst.
  • OCR oxygen consumption rate
  • ECAR extracellular acidification rate
  • nicotinamide is a substance that can increase the oxygen consumption rate (OCR) that is characteristic of M0 macrophages and M2 or M2-like macrophages.
  • the oxygen consumption rate (OCR value) and the extracellular acidification rate (ECAR value) were measured using a flux analyzer 24 hours after the addition of nicotinamide. was measured.
  • the oxygen consumption rate (OCR value) and the extracellular acidification rate (ECAR value) were measured using a flux analyzer 24 hours after the addition of nicotinamide. was measured.
  • M0 was prepared by differentiation induction from THP-1, and Hakushinin extract (prepared in the same manner as in Experiment 2. 10 ppm), nicotinic acid amide (0.1 mM) or Hakushinin extract was added to M0. A mixture (10 ppm) and nicotinamide (0.1 mM) was added. After 24 hours of incubation, oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) were measured with a flux analyzer. Each count value was corrected by the cell number obtained by counting the cell nuclei stained by adding Hoechst.
  • OCR oxygen consumption rate
  • ECAR extracellular acidification rate
  • a succinicin extract prepared in the same manner as in Experiment 2. 10 ppm), nicotinic acid amide (0.1 mM), or a succinicin extract (10 ppm).
  • Oxygen consumption rate (OCR value) and extracellular acidification rate (ECAR value) were measured using a flux analyzer 24 hours after addition of nicotinamide (0.1 mM) mixture (mix).
  • nicotinamide and succinicin extract induce or activate M2 or M2-like macrophages, and as a result, modulate or improve the balance of M1/M2, thereby preventing photoaging and/or dermal pigmentation. It was suggested that it can be prevented and/or improved.

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Abstract

本発明は、ニコチン酸アミド又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、Ｍ２又はＭ２様マクロファージの誘導又は活性化剤；それを用いるＭ２又はＭ２様マクロファージの誘導又は活性化方法を提供する。

Description

Ｍ２又はＭ２様マクロファージの誘導又は活性化剤、Ｍ２又はＭ２様マクロファージの誘導又は活性化方法、真皮の色素沈着を予防及び／又は改善するための組成物、並びに真皮の色素沈着を予防及び／又は改善する方法
　本発明は、Ｍ２又はＭ２様マクロファージの誘導又は活性化剤、Ｍ２又はＭ２様マクロファージの誘導又は活性化方法、真皮の色素沈着を予防及び／又は改善するための組成物、並びに真皮の色素沈着を予防及び／又は改善する方法に関する。
　ヒト皮膚の老化現象は大きく「自然老化」と「光老化」に分けられる。光老化は露光する部位特異的に認められる現象で、皮膚特異的である。光老化では、ＵＶなどの影響で活性酸素の産生や、細胞のＤＮＡの損傷などが誘発され、皮膚線維組織が損傷し、しわやたるみといった表現型が現れる原因と考えられている。例えば、皮膚光老化によりコラーゲンからなる膠原線維の減少やエラスチンからなる弾性線維の変性といった現象がみられる。また、メラノサイトもダメージを受け、メラニン色素が多く作られてしまい、しみ等を引き起こす原因となる。
　また、しみやくすみをはじめとする色素沈着は、表皮の基底層にあるメラノサイトで作り出されるメラニンが蓄積することにより起こる。メラニンは通常表皮や基底層に存在するが、表皮は比較的早いサイクルでターンオーバーするため、このようなメラニンは排出されやすい。一方、メラニンが基底膜の隙間から真皮に落ちこんでしまう等の理由によりメラニンが真皮層に存在する場合がある。真皮細胞のターンオーバーのサイクルは表皮に比べて非常に遅いため、このようなメラニンは排出されずに蓄積されてしまうことが多い。このような理由により、真皮の色素沈着の改善は非常に困難である。
　抗光老化美容法として、例えば、特許文献１では、白血球エラスターゼの阻害を予防することによる皮膚光老化の予防又は抑制剤を開示する。特許文献２では、コラーゲン合成促進作用を有するヒユ科パフィア属の植物抽出物と動物由来コラーゲンペプチドとを含有することを特徴とする光老化抑制剤組成物を開示する。
　真皮における色素沈着を改善するための美容法として、非特許文献６では、基底膜を強化することによりメラニンの真皮への落ちこみを防止することを提案する。
　また、皮膚の光老化現象において炎症が一因となることも示唆されており、抗炎症剤も多く開発されている。特許文献３では、アディポネクチン発現増加とともにオートファジー活性化を誘導する化合物を含む抗老化用化粧料組成物を開示する。真皮の色素沈着を改善するにはマクロファージによる貪食作用を利用することも示唆されており、特許文献８では、真皮へ落ち込んだメラニンを取り込んだ線維芽細胞にマクロファージを誘引し貪食させることによる真皮シミ予防・改善剤を開示している。
　マクロファージは、体内の様々な組織に局在し、異物や病原体に対する免疫応答を惹起する細胞であり、炎症にも関与することが知られている。マクロファージは、未分化状態のＭ０マクロファージ（以下Ｍ０とする略記することがある）からＭ１タイプとＭ２タイプに分化する。Ｍ１マクロファージ（以下Ｍ１と略記することがある）は炎症型として、Ｍ２マクロファージ（以下Ｍ２とする略記することがある）はリペア型（抗炎症型）として知られている。Ｍ１マクロファージとＭ２マクロファージのバランスの不均衡は、肥満、２型糖尿病、動脈硬化といった疾患と関連することが報告されている（特許文献４～６、非特許文献１～５）。
　以前、本発明者らは、光のあたった皮膚や色素沈着が起こる部位では、特異的にこれらＭ１マクロファージとＭ２マクロファージのバランス（Ｍ１／Ｍ２バランス）が乱れることを発見し、Ｍ１／Ｍ２バランスを調整すること、特にＭ１マクロファージに対するＭ２マクロファージの比率を上昇させることが、真皮における光老化や色素沈着の予防・改善においてとりわけ重要であることを発見した（特許文献１１）。そこで、本発明者らは、Ｍ１／Ｍ２バランスを指標とし、光老化及び／又は真皮色素沈着の予防・改善し得る物質を探索したところ、オトギリソウ抽出物、トラネキサム酸メチルアミド、タイム抽出物、オウバク及びユーカリ抽出物にその効果があることも見出した。
特許第５６５７７２３号公報 特開２０１７－２０３００４号公報 特開２０１８－１７７８０５号公報 特表２０１４－５０４６２９号公報 特開２０１５－１４０３３４号公報 特許第６１７８０８８号公報 特許第６２７３３０４号公報 特開２０１８－０７２０９８号公報 特許第４７８１８４２号公報 国際公開第２０１２／０５７１２３号 国際公開第２０２０／２１３７４３号 特開平３－２０２０７号公報
Journal of the American College of Cardiology， Vol. 62， No. 20， 2013， November 12， 2013:1890-901 Experimental & Molecular Medicine (2014) 46， e70; doi:10.1038/emm.2013.135 NATURE， VOL495， 28 MARCH 2013， pp524-530， doi:10.1038/nature11930 Journal of Investigative Dermatology， 2009 April; 129(4):1016-25. Epub 2008 Oct 9. Stem Cell Research & Therapy (2018) 9:88，https://doi.org/10.1186/s13287-018-0821-5 Fujifilm Research & Development (No.55-2010):pp33-37 Nat Immunol， 2014. 15(9): pp846-855 Cell Metab. 2017 Feb 7;25(2):412-427
　本発明の課題は、光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善する効果を有する、Ｍ２又はＭ２様マクロファージを誘導又は活性化し得る新たな薬剤又は方法を提供することである。
　本発明者らは、光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善するための剤を鋭意探索した結果、ニコチン酸アミド又はニコチン酸アミドとハクシニン抽出物との混合物とが、マクロファージをＭ２又はＭ２様マクロファーへと誘導又は活性化し得ることを見出した。かかる発見に基づき、本発明を開発するに至った。すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
［１］　ニコチン酸アミド又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、Ｍ２又はＭ２様マクロファージの誘導又は活性化剤。
［２］　前記Ｍ２又はＭ２様マクロファージを介して真皮における色素沈着を予防及び／又は改善する、項目１に記載の誘導又は活性化剤。
［３］　マクロファージの解糖系を抑制する、項目１又は２に記載の誘導又は活性化剤。
［４］　マクロファージの好気呼吸を促進する、項目１～３のいずれか１項に記載の誘導又は活性化剤。
［５］　ハクシニン抽出物をさらに含む、項目１～４のいずれか１項に記載の誘導又は活性化剤。
［６］　ニコチン酸アミド又はその薬学的に許容される塩とハクシニン抽出物とを含む、組成物。
［７］　必要とする対象におけるＭ２又はＭ２様マクロファージの誘導又は活性化方法であって、
　前記対象に、ニコチン酸アミド又はその薬学的に許容される塩を適用し、Ｍ２又はＭ２様マクロファージを誘導又は活性化すること
を含む、方法。
［８］　前記Ｍ２又はＭ２様マクロファージを介して、前記対象の真皮における色素沈着を予防及び／又は改善する、項目７に記載の方法。
［９］　マクロファージの解糖系を抑制する、項目７又は８に記載の方法。
［１０］　マクロファージの好気呼吸を促進する、項目７～９のいずれか１項に記載の方法。
［１１］　ハクシニン抽出物をさらに含む、項目７～１０のいずれか１項に記載の方法。
［１２］　必要とする対象における真皮の色素沈着を予防及び／又は改善する方法であって、
　前記対象にニコチン酸アミド又はその薬学的に許容される塩とハクシニン抽出物とを含む組成物を適用すること
を含む、方法。
［１３］　Ｍ２又はＭ２様マクロファージの誘導又は活性化するための組成物の製造のためのニコチン酸アミド又はその薬学的に許容される塩の使用。
［１４］　前記Ｍ２又はＭ２様マクロファージを介して、対象の真皮における色素沈着を予防及び／又は改善する、項目１３に記載の使用。
［１５］　マクロファージの解糖系を抑制する、項目１３又は１４に記載の使用。
［１６］　マクロファージの好気呼吸を促進する、項目１３～１５のいずれか１項に記載の使用。
［１７］　ハクシニン抽出物をさらに含む、項目１３～１６のいずれか１項に記載の使用。
［１８］　真皮における色素沈着を予防及び／又は改善するための組成物の製造のためのニコチン酸アミド又はその薬学的に許容される塩及びハクシニン抽出の使用。
　本発明を適用することにより、光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善することができる効果を有する、Ｍ２又はＭ２様マクロファージを誘導又は活性化し得ることが可能となる。
図１ａは、ＴＨＰ－１からＭ０、Ｍ１及びＭ２マクロファージへの誘導方法の概略を示す。 図１ｂは、ＴＨＰ－１から誘導されたＭ０、Ｍ１及びＭ２マクロファージの顕微鏡写真である。 図１ｃの上図は，ＴＨＰ－１から誘導されたＭ０、Ｍ１及びＭ２マクロファージが産出するサイトカイン（ＩＬ－１ｂｅｔａ，ＴＮＦ－ａｌｐｈａ，ＩＬ－１０）の遺伝子発現量を示すグラフである。図１ｃの下図は，Ｍ１及びＭ２マクロファージの細胞表面マーカー（Ｍ１：ＣＤ８６，Ｍ２：ＣＤ２０６）のｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正し、Ｍ０の場合を１００％とした相対値（％）として示す。 図２は、それぞれ各濃度のハクシニン抽出物（０．３ｐｐｍ，１．０ｐｐｍ，３．０ｐｐｍ）を添加した場合のＭ１とＭ２の各マーカーの発現量（マーカー／ＧＡＰＤＨ値）を、対照（ハクシニン加水分解無：ｃｏｎｔｒｏｌ）を１００％としたとき相対値（％）で示すグラフである。 図３ａは、加水分解をしていないハクシニン（ｃｏｎｔｒｏｌ）３ｐｐｍ又はハクシニン加水分解物を１．０ｐｐｍ、３．０ｐｐｍ添加した未成熟（Ｍ０）の状態のＴＨＰ－１細胞にメラニン添加をしてから３０分後の様子を示す。 図３ｂは、図３ａの拡大図である。黒矢印はメラニンを取り込んでいるマクロファージを示す。 図４は、実験４において、Ｍ０マクロファージ、Ｍ１マクロファージ及びＭ２マクロファージの細胞内活性について、フラックスアナライザーを用いて解析した、（Ａ）酸素消費速度（ＯＣＲ）、（Ｂ）細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）及び、（Ｃ）ＯＣＲ／ＥＣＡＲの結果を示す。 図５は、実験５において、ハクシニン抽出物を添加した場合のＭ０マクロファージの添加４８時間後の細胞内活性への影響をフラックスアナライザーを用いて解析した結果を示す。（Ａ）正規化したＯＣＲ、（Ｂ）Ｂａｓａｌ　ＯＣＲ（Ａ計測３点目のＯＣＲの値）。 図６は、実験５において、ハクシニン抽出物を添加した場合のＭ０マクロファージの添加４８時間後の細胞内活性への影響をフラックスアナライザーを用いて解析した結果を示す。（Ａ）正規化したＯＣＲ、（Ｂ）ミトコンドリア呼吸のＯＣＲ(A計測3点目と12点目の差の値)。 図７は、実験６において、ハクシニン抽出物に含まれる代表的な不飽和脂肪酸単独によるＭ０マクロファージの添加４８時間後の細胞内活性への影響をフラックスアナライザーを用いて解析した結果を示す。（Ａ）Ｂａｓａｌ　ＯＣＲ、（Ｂ）ミトコンドリア呼吸のＯＣＲ。 図８は、実験７において、ハクシニン抽出物に含まれる各成分によるＭ０マクロファージの添加２４時間後の細胞内活性への影響をフラックスアナライザーを用いて解析した結果を示す。（Ａ）Ｂａｓａｌ　ＯＣＲ、（Ｂ）ミトコンドリア呼吸のＯＣＲ。 図９は、実験８の方法の概略を示す。 図１０は、実験８において、ハクシニン抽出物、又はハクシニン抽出物に含まれる各成分によるＭ１マクロファージ分化時の細胞内活性への影響をフラックスアナライザーを用いて解析した結果を示す。（Ａ）Ｂａｓａｌ　ＯＣＲ、（Ｂ）ミトコンドリア呼吸のＯＣＲ、（Ｃ）ＯＣＲ／ＥＣＡＲ。 図１１は、実験９において、Ｍ０マクロファージにニコチン酸アミドを添加して２４時間後の細胞内活性を、フラックスアナライザーを用いて解析した結果を示す。（Ａ）実験９の概略、（Ｂ）Ｂａｓａｌ　ＯＣＲ、（Ｃ）ミトコンドリア呼吸のＯＣＲ、（Ｄ）ＯＣＲ／ＥＣＡＲ、（Ｅ）正規化したＥＣＡＲ。 図１２は、実験１０の方法の概略を示す。 図１３は、実験１０において、Ｍ１分化中のマクロファージにニコチン酸アミドを添加して２４時間後の細胞内活性を、フラックスアナライザーを用いて解析した結果を示す。（Ａ）Ｂａｓａｌ　ＯＣＲ、（Ｂ）ミトコンドリア呼吸のＯＣＲ、（Ｃ）ＯＣＲ／ＥＣＡＲ、（Ｄ）正規化したＥＣＡＲ。 図１４は、実験１１の方法の概略を示す。 図１５は、実験１１において、Ｍ２分化中のマクロファージにニコチン酸アミドを添加して２４時間後の細胞内活性を、フラックスアナライザーを用いて解析した結果を示す。（Ａ）Ｂａｓａｌ　ＯＣＲ、（Ｂ）ミトコンドリア呼吸のＯＣＲ、（Ｃ）ＯＣＲ／ＥＣＡＲ、（Ｄ）正規化したＥＣＡＲ。 図１６は、実験１２において、Ｍ０マクロファージに、ハクシニン抽出物、ニコチン酸アミド又はそれらの混合物（Ｍｉｘ）を添加して２４時間後の細胞内活性を、フラックスアナライザーを用いて解析した結果を示す。（Ａ）実験１２の概略、（Ｂ）ミトコンドリア呼吸のＯＣＲ。 図１７は、実験１３において、Ｍ１分化中のマクロファージに、ハクシニン抽出物、ニコチン酸アミド又はそれらの混合物（Ｍｉｘ）を添加して２４時間後の細胞内活性を、フラックスアナライザーを用いて解析した結果を示す。（Ａ）実験１３の概略、（Ｂ）ミトコンドリア呼吸のＯＣＲ、（Ｃ）ＯＣＲ／ＥＣＡＲ。 図１８は、実験１４において、Ｍ２分化中のマクロファージに、ハクシニン抽出物、ニコチン酸アミド又はそれらの混合物（Ｍｉｘ）を添加して２４時間後の細胞内活性を、フラックスアナライザーを用いて解析した結果を示す。（Ａ）実験１４の概略、（Ｂ）ミトコンドリア呼吸のＯＣＲ。
　マクロファージは、体内の様々な組織に局在し、異物や病原体に対する免疫応答を惹起する細胞であり、炎症にも関与することが知られている。マクロファージは、未分化状態のＭ０マクロファージ（以下Ｍ０とする略記することがある）からＭ１タイプとＭ２タイプに分化する。Ｍ１マクロファージ（以下Ｍ１と略記することがある）は炎症型として、Ｍ２マクロファージ（以下Ｍ２とする略記することがある）はリペア型（抗炎症型）として知られている。
　本発明者らは、以前、光のあたった皮膚や色素沈着が起こる部位では特異的にこれらＭ１マクロファージとＭ２マクロファージのバランス（Ｍ１／Ｍ２バランス）が乱れることを発見し、Ｍ１／Ｍ２バランスを調整することが、真皮における光老化や色素沈着の予防・改善においてとりわけ重要であることを発見した（特許文献１１）。そこで、本発明者らは、Ｍ１／Ｍ２バランスを指標とし、光老化及び／又は真皮色素沈着の予防・改善し得る物質を探索したところ、ニコチン酸アミド及びハクシニンが、Ｍ２又はＭ２様マクロファージを誘導又は活性化し得ることを見出し、本発明を開発するに至った。ハクシニンには、線維芽細胞に作用して線維芽細胞を増殖させたり、コラーゲンやヒアルロン酸の産生を促進させる効果や、メラニン生成を抑制する効果があることが報告されている（特許文献９及び１０）。また、ニコチン酸アミドには、血行促進作用や、肌荒れ改善作用、美白作用等が知られている（例えば、特許文献１２）。しかしながら、ハクシニン及びニコチン酸アミドが、リペア型のＭ２マクロファージ又はＭ２様マクロファージを誘導又は活性化し、それによってＭ１／Ｍ２バランスを調整／改善し得ることは、本発明者らによって今回初めて見出された。
　一実施態様において、本発明は、ニコチン酸アミド又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、Ｍ２又はＭ２様マクロファージの誘導又は活性化剤を提供する。また、本発明にかかるＭ２又はＭ２様マクロファージの誘導又は活性化剤は、当該剤によって誘導された又は活性化されたＭ２又はＭ２様マクロファージを介して真皮における色素沈着を予防及び／又は改善し得る。
　一実施態様において、本発明は、ニコチン酸アミド又はその薬学的に許容される塩とハクシニン抽出物とを含む、組成物が提供される。
　また、一実施態様において、本発明は、必要とする対象におけるＭ２又はＭ２様マクロファージの誘導又は活性化方法であって、
　前記対象に、ニコチン酸アミド又はその薬学的に許容される塩を適用し、Ｍ２又はＭ２様マクロファージを誘導又は活性化すること
を含む、方法を提供する。
　また、一実施態様において、本発明は、必要とする対象における真皮の色素沈着を予防及び／又は改善する方法であって、
　前記対象にニコチン酸アミド又はその薬学的に許容される塩とハクシニン抽出物とを含む組成物を適用すること
を含む、方法を提供する。
　また、本発明は、Ｍ２又はＭ２様マクロファージの誘導又は活性化するための組成物の製造のためのニコチン酸アミド又はその薬学的に許容される塩の使用を提供する。
　また、本発明は、真皮における色素沈着を予防及び／又は改善するための組成物の製造のためのニコチン酸アミド又はその薬学的に許容される塩及びハクシニン抽出の使用を提供する。
　本明細書において、色素沈着とは、真皮および表皮における色素の沈着を指し、例えば、光老化によるメラニン等の色素沈着の他、人為的に注入された色素（例えば、入れ墨やタトゥー）も含まれる。本発明は、真皮および表皮のいずれにも有効であるが、とりわけ、メラノファージによる貪食以外に改善方法が限られているという意味で真皮の色素沈着に対する対策として大きく期待される。本発明の適用により、色素沈着によるしみ、くすみ、くま等が改善され。また、真皮層に色素を注入するため一旦色素を入れてしまうと消すのが困難である入れ墨やタトゥーなどの色消しにも有効である。
　本明細書において、「Ｍ２又はＭ２様マクロファージの誘導又は活性化」とは、マクロファージ（例えば、Ｍ０マクロファージ又はＭ１マクロファージ）をＭ２マクロファージへと分化誘導する、あるいはマクロファージ（例えば、Ｍ０マクロファージ、Ｍ１マクロファージ又はＭ２マクロファージ）の細胞内活性を、Ｍ２マクロファージが有する細胞内活性（例えば、好気呼吸（ミトコンドリア呼吸）の促進及び／又は解糖系の抑制（好ましくは、Ｍ１マクロファージが有する細胞内活性と比較した場合））へと誘導又は活性化することをいう。従って、「Ｍ２又はＭ２様マクロファージの誘導又は活性化」とは、Ｍ２又はＭ２様マクロファージの絶対数を増加させることであってもよく、Ｍ２又はＭ２様マクロファージの数に対するＭ１又はＭ１様マクロファージの数、すなわち、比率（Ｍ１／Ｍ２バランス）を減少させることであってもよい。本明細書において「Ｍ２様マクロファージ」とは、Ｍ２マクロファージが有する細胞内活性（例えば、好気呼吸（ミトコンドリア呼吸）の促進及び／又は解糖系の抑制（好ましくは、Ｍ１マクロファージが有する細胞内活性と比較した場合））を示すマクロファージをいい、必ずしもＭ２マクロファージのマーカーと一致しなくてもよい。
　本明細書において、Ｍ１様マクロファージとは、Ｍ１マクロファージが有する細胞内活性（例えば、好気呼吸（ミトコンドリア呼吸）の抑制及び／又は解糖系の促進（好ましくは、Ｍ２マクロファージが有する細胞内活性と比較した場合））示すマクロファージをいい、必ずしもＭ１マクロファージのマーカーと一致しなくてもよい。
　Ｍ１マクロファージは、例えば、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ｉＮＯＳ等のマーカーを指標として測定され得る。Ｍ２マクロファージは、例えば、ＣＤ２０６、ＣＤ１６３、Ａｇｒ１、等のマーカーを指標として測定され得る。Ｍ１とＭ２を含むマクロファージ全体のマーカーとしては、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６８などが挙げられる。追加的又は代替的に、ＩＬ－１ｂｅｔａ、ＴＮＦ－ａｌｐｈａといったＭ１特異的なサイトカインやＩＬ－１０といったＭ２特異的なサイトカインを定量することによってＭ１及びＭ２マクロファージを測定してもよい。しかしながら、Ｍ１／Ｍ２バランスを測定可能なマーカーであれば、上記マーカーに限定されない。
　本明細書において、Ｍ１／Ｍ２バランスとは、上述のようにＭ１マクロファージ及び／又はＭ１様マクロファージの数と、Ｍ２マクロファージ及び／又はＭ２様マクロファージの数の比率を指すものであってもよく、例えば、Ｍ１マクロファージのマーカー（例えば、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ｉＮＯＳ等）のｍＲＮＡ量とＭ２マクロファージのマーカー（例えば、ＣＤ２０６、ＣＤ１６３、Ａｇｒ１等）のｍＲＮＡ量の比率を指すものであってもよい。光老化状態の皮膚ではＭ１の比率が高くＭ２の比率が低くなり、またメラニン貪食作用が高いのはＭ２であることから、Ｍ１／Ｍ２バランスの調整／改善は、Ｍ１に対するＭ２の比率（Ｍ２の数／Ｍ１の数、及び／又はＭ２マーカーのｍＲＮＡ量／Ｍ１マーカーのｍＲＮＡ量）を上昇させることであってもよい。上昇は、例えば、有意水準を５％とした統計学的有意差（例えばスチューデントのｔ検定）を有する上昇であってもよく、及び／又は、例えば１％以上、５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、１００％以上の上昇であってもよい。あるいは、Ｍ１／Ｍ２バランスの調整／改善は、Ｍ１に対するＭ２の比率（Ｍ２の数／Ｍ１の数、及び／又はＭ２マーカーのｍＲＮＡ量／Ｍ１マーカーのｍＲＮＡ量）を一定の範囲内、例えば、約４／６～約９／１、約５／５～約８／２、約５／５～約７／３等にすることであってもよく、上記範囲に近づけることであってもよく、上記範囲内に維持することであってもよく、上記範囲を中心に恒常性を保つことであってもよい。
　本明細書において、Ｍ１／Ｍ２バランスとは、Ｍ１マクロファージの細胞内活性とＭ２マクロファージの細胞内活性のバランスを指すものであってもよく、例えば、Ｍ１マクロファージが主に使う細胞内活性（例えば、解糖系の状態）の指標及び／又は、Ｍ２マクロファージが主に使う細胞内活性（例えば、好気呼吸（ミトコンドリア呼吸）の状態）の指標を用いて表されるものであってもよい。細胞内活性は、例えば、細胞の酸素消費速度（ＯＣＲ値）、細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ値）、又はＯＣＲ／ＥＣＡＲ値を測定することによって評価することができる。本明細書において、「Ｍ１に対するＭ２の比率を上昇させる」とは、Ｍ２マクロファージが主に使う細胞内ミトコンドリア活性が上昇することを指すものであってもよく、例えば、Ｍ１マクロファージ及びＭ２マクロファージを含む集団において好気呼吸（ミトコンドリア呼吸）が上昇する（例えば、Ｍ１マクロファージ及びＭ２マクロファージを含む集団において好気呼吸（ミトコンドリア呼吸）が優位になる）、及び／又は、Ｍ１マクロファージ及びＭ２マクロファージを含む集団において嫌気呼吸である解糖系の活性が低下することを指すものであってもよく、例えば、Ｍ１マクロファージ及びＭ２マクロファージを含む集団においてＯＣＲ値が上昇する、及び／又は、Ｍ１マクロファージ及びＭ２マクロファージを含む集団においてＥＣＡＲ値が低下する、及び／又は、Ｍ１マクロファージ及びＭ２マクロファージを含む集団においてＯＣＲ／ＥＣＡＲ値が上昇することを意味するものであってもよい。細胞内活性は、例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（旧Ｓｅａｈｏｒｓｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）社製の細胞外フラックスアナライザーＸＦｅ２４（２４ｗｅｌｌ用）を用いることによって細胞の主要なエネルギー代謝経路である解糖系、及びミトコンドリアによる好気呼吸の状態を、細胞に対して無侵襲・高感度に経時的計測を行うことができるが、当該装置は例示であり、細胞内活性の測定には任意の装置、方法を用いて評価することができるため、当該装置の利用に限定されない。
　光老化状態の皮膚ではＭ１の比率が高くＭ２の比率が低くなり、またメラニン貪食作用が高いのはＭ２であることから、Ｍ１／Ｍ２バランスの調整／改善は、Ｍ１に対するＭ２の細胞内活性の比率、例えば、Ｍ１マクロファージ及びＭ２マクロファージを含む集団におけるＯＣＲ値を上昇させる、及び／又は、Ｍ１マクロファージ及びＭ２マクロファージを含む集団におけるＥＣＡＲ値を低下させることであってもよい。本明細書において、「上昇又は低下」とは、例えば、有意水準を５％とした統計学的有意差（例えばスチューデントのｔ検定）を有する上昇又は低下であってもよく、及び／又は、例えば１％以上、５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、１００％以上の上昇又は低下であってもよい。
　ハクシニン（柏子仁、ハクシジン）は、ヒノキ科（Ｃｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ）のコノテガシワ（Ｐｌａｔｙｃｌａｄｕｓ　ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ　Ｆｒａｎｃｏ、　Ｔｈｕｊａ　ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ　Ｌ．、　Ｂｉｏｔａ　ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ　Ｅｎｄｌ．）の種子を乾燥させた生薬である。本発明に用いられるハクシニンとしては、種仁（胚乳部分）を使用することが好ましいが、種子全体にも有効成分が含まれているので、種子全体を使用することもできる。ハクシニンは、常法により製造してもよく市販品を用いることもできる。
　本発明に用いられ得るハクシニン抽出物を調製する方法は、公知の方法（例えば、特許文献９及び１０）を参考に製造することができるが、これらに限定される訳ではない。例えば、本発明に用いられ得るハクシニン抽出物の調製方法としては、植物の種子を抽出して得られた植物抽出物にアルカリ処理を施す方法（以下、第１の方法と称する。）、および植物の種子を粉砕し、温度１０～３５℃、相対湿度　２０～９０％で１週間以上熟成した後に抽出する方法（以下、第２の方法と称する。）がある。
　上記第１の方法および第２の方法に用いられる抽出溶媒は、通常抽出に用いられる揮発性溶媒であれば何でもよく、特にメタノール、エタノール等のアルコール類、含水アルコール類、アセトン、酢酸エチルエステル、ヘキサン、エーテル等の極性・非極性有機溶媒を単独あるいは組み合わせて用いることができるが、アセトン、酢酸エチル、ヘキサンは低価格であり、減圧濃縮が容易な点で特に好ましい。その他、超臨界炭酸ガスによる抽出を用いることもできる。これに対し、水を多量に含む抽出溶媒は、活性成分の抽出が抑制されるので好ましくない。
　抽出にあたっては、種子の質量に対し、１～１００倍、好ましくは１～３０倍程度の質量の溶媒で一定期間抽出を行う。用いる種子は必要に応じて適度に粉砕することも可能であるが、ろ過時に目詰まりが問題となる場合等では未粉砕のまま用いても良い。また、少量の溶媒で繰り返し抽出することも可能であり、ソックスレーのような還流装置を用いても良い。超臨界炭酸ガスで抽出する場合は４０℃付近で２０～４０ＭＰａの一般的な条件にて抽出できる。
　第１の方法においては、これらの抽出物から抽出溶媒を除去した後、アルカリ処理することにより、抽出物を加水分解する。アルカリ処理は溶媒除去後の抽出物に対し、０．２～２倍容量の濃アルカリ水溶液を添加した後、充分撹拌混合し、３０分～数日程度熟成をおこなう。混合の際の温度としては、室温～７０℃の範囲が好ましく、３０～６０℃の範囲がさらに好ましい。熟成時には成分親水性成分と親油性成分が分離しないように、適宜撹拌を行うことが望ましい。濃アルカリ水溶液としては、１～１０Ｎの濃度のＮａＯＨ、ＫＯＨなどからなる水溶液が挙げられる。
　上述のようにアルカリ処理して加水分解した抽出物をさらに酸で中性付近まで中和すると油状物質が分離してくる。この油状物質はきわめて高い抗真皮色素沈着作用を奏しながらも、肌に対して高い安全性を示す。油状物質回収促進のために、アルコール、アセトン類などをアルカリ処理後に適宜加えても良く、さらにその後必要に応じて脱色、脱臭、脱塩、蒸留などの操作を加えても良い。
　ハクシニン抽出物を調製する第２の方法によれば、抽出の前段階で種子を適度に粉砕あるいは圧ぺんし、そのまま室温付近で一定期間熟成する。熟成期間については、目的とする効果が得られる範囲であれば特に問わないが、熟成期間が一週間以内と短いと十分な美白効果を得ることが難しく、反対に数年にも及ぶと腐敗や酸化変臭の問題が起こり、好ましくない。また熟成中には必要に応じて、酸化防止剤添加や窒素置換等を行うことにより、変臭を抑制することも可能である。
　このように熟成した種子より、前述した抽出溶媒・抽出法を用いて抽出を行う。抽出後は必要に応じて、溶媒除去・脱色・脱臭・蒸留等の操作を行う。このような特定の種子を粉砕して熟成した後に抽出することにより得られた抽出物は、前述のアルカリ処理した抽出物と同様に抗真皮色素沈着作用を奏しながらも、肌に対して高い安全性を示す。
　本発明においては、上に示したような植物の種子より第１の方法または第２の方法で調製した抽出物よりなる安全で抗真皮色素沈着効果の優れた植物性の、光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善する剤を提供することができ、さらには本剤を配合した皮膚外用剤を提供できる。
　ニコチン酸アミド（ＣＡＳ　Ｎｏ．９８－９２－０）は、ニコチン酸のアミド化合物であり、血行促進作用や、肌荒れ改善作用、美白作用等が知られている。しかしながら、ニコチン酸アミドが、Ｍ１／Ｍ２バランスを調整、例えば、Ｍ２又はＭ２様マクロファージを誘導又は活性化し得ることは、本発明者らによって今回初めて見出された。本発明に用いられるニコチン酸アミド又は薬学的に許容され得る塩は、天然物からの抽出物であっても良いし，公知の方法によって合成した物であっても良い。例えば，具体的には，第１７改正日本薬局方に収載されているものを用いることができる。薬学的に許容され得る塩は、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、例えば酢酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、トルエンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩等の有機酸塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩等の金属塩、例えばトリエチルアミン塩、グアニジン塩、アンモニウム塩、ヒドラジン塩、キニーネ塩、シンコニン塩等の塩基との塩等が挙げられる。
　本発明の剤は、任意の物質、例えば、特許文献４～７等に記載の物質といったＭ１／Ｍ２バランス調整／改善することが知られている公知の物質と組合せて使用してもよい。その投与経路も例えば、経皮投与、経口投与、皮下投与、経粘膜投与、筋肉内投与等任意に選択できるが、真皮の色素沈着を予防及び／又は改善するために皮膚の特定箇所に投与できる経皮投与が好ましい場合もある。また、表皮や真皮に起こる色素沈着は、皮膚から表皮や真皮に到達できるよう経皮投与が好ましい場合もある。また、Ｍ１／Ｍ２バランスの調整／改善は、例えば、Ｍ２マクロファージに分化誘導することであってもよく、その他任意のＭ１／Ｍ２バランス調整／改善法によるものであってもよい。
　例えば、本発明に用いられ得る剤又は組成物は、Ｍ１／Ｍ２バランスを調整／改善し、その結果、光老化及び／又は真皮色素沈着を抑制する。本発明のＭ１／Ｍ２バランス調整／改善剤、抗光老化剤、色素沈着抑制剤、抗真皮色素沈着剤（以降これらを総称して「本発明の剤」という場合がある。）は、上記の有効成分の何れか１種を単独で含有してもよく、２種類以上を任意の組み合わせ及び比率で含有してもよい。
　本発明の剤は、上記の有効成分を、１種又は２種以上の他の成分、例えば賦形剤、担体及び／又は希釈剤等と組み合わせた組成物とすることもできる。組成物の組成や形態は任意であり、有効成分や用途等の条件に応じて適切に選択すればよい。当該組成物は、その剤形に応じ、賦形剤、担体及び／又は希釈剤等及び他の成分と適宜組み合わせた処方で、常法を用いて製造することができる。
　本発明の剤は、化粧品等に配合してヒト及び動物に使用し、或いは医薬製剤としてヒト及び動物に投与することができる。また、各種の飲食品、飼料に配合してヒト及び動物に摂取させてもよい。
　本発明を化粧品、医薬品、医薬部外品等の皮膚外用剤に適用する場合、植物体又はその抽出物の配合量（乾燥質量）は、それらの種類、目的、形態、利用方法などに応じて、適宜決めることができる。例えば、化粧料全量中に、ニコチン酸アミド又は薬学的に許容され得る塩、並びに／あるいはハクシニン抽出物を０．００００１％～５０％（抽出物又は生薬の場合、乾燥質量換算）配合できる。
　上記成分に加えて、さらに必要により、本発明の効果を損なわない範囲内で、通常化粧品、医薬品、医薬部外品等の皮膚外用剤に用いられる成分、例えば酸化防止剤、油分、紫外線防御剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色材、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。
　本発明の皮膚外用剤は、外皮に適用される化粧料、医薬部外品等、特に好適には化粧料として適用可能であり、その剤型も皮膚に適用できるものであれば限定されず、溶液系、可溶化系、乳化系、粉末分散系、水－油二層系、水－油－粉末三層系、軟膏、化粧水、ゲル、エアゾール等、任意の剤型が適用される。
　本発明の剤を化粧品として用いる場合は、化粧水、乳液、ファンデーション、口紅、リップクリーム、クレンジングクリーム、マッサージクリーム、パック、ハンドクリーム、ハンドパウダー、ボディシャンプー、ボディローション、ボディクリーム、浴用化粧品等の形態として用いてもよい。
　しかしながら、本発明の剤および組成物の採り得る形態は、上述の剤型や形態に限定されるものではない。また、本発明の剤又は組成物は、本発明の装置又は方法あるいはその他の装置又は方法等と併用してもよい。
　本発明の方法、装置、剤及び組成物を適用する対象は、皮膚光老化及び／又は色素沈着（例えば、真皮色素沈着）が客観的又は主観的に認められる対象であっても、色素沈着を予防したいと希望する対象であってもよい。例えば、Ｍ１／Ｍ２バランスが崩れていると判断された対象であってもよい。１実施形態では、皮膚におけるＭ１／Ｍ２バランスを指標として色素沈着度（例えば、真皮色素沈着度）が高いと判断された対象であってもよい。あるいは、皮膚の光老化に特異的な表現型、例えば、しみ、しわ、たるみ等が気になる対象であってもよいし、表皮や色素沈着、例えば、しみ、くすみ、アザ、入れ墨の跡等が気になる対象であってもよい。しみ、しわ、たるみ、くすみ、アザ、入れ墨の跡等は、視感判定や公知の指標を用いることにより決定することができる。
　美容処置としては、特に限定されないが、例えば本発明の剤又はその他の成分を含む化粧料の塗布などの光老化及び／又は色素沈着抑制に有効と考えられている任意の処置が含まれる。化粧料とは、皮膚に適用される化粧料をいい、例えば化粧水、乳液、美容液、クリーム、ファンデーションなどをいうが、これらに限定されず、皮膚状態の改善を直接の目的とするものではないが、皮膚に塗布されるもの全てを含むことを意図し、例えば、日焼け止め剤なども包含するものとする。あるいは、美容処置は、例えば、伸展刺激、押下刺激、マッサージ等の物理刺激を皮膚に与えることであってもよい。美容処置は、一回の処置であってもよいし、数日から数週間にわたって行われる継続的な処置であってもよい。美容処置は個人的に行われてもよいし、美容室や、化粧品の販売店、エステサロンなどで行われてもよい。
　次に実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。
　実験１：ＴＨＰ－１のＭ０、Ｍ１及びＭ２分化誘導実験
　非特許文献１に記載の方法に従い、ヒト由来の株化細胞であるＴＨＰ－１を用いて、Ｍ１、Ｍ２マクロファージへ分化誘導した。具体的には、図１ａに示す方法で、ＴＨＰ－１をＲＰＭＩ１６４０（Ｎａｋａｌａｉ）に１ｍＭ　Ｎａ　Ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｎａｋａｌａｉ）、２ｍＭ　Ｌ　Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｎａｋａｌａｉ）、１０％　ＦＢＳを添加して培養した。その後、１００ｎＭ　ＰＭＡ（ａｂｃａｍ）をさらに加えて２４時間刺激しマクロファージに分化させた。Ｍ１に分化させる際はさらに１００ｎｇ／ｍＬ　ＬＰＳ（ｓｉｇｍａ）と２０ｎｇ／ｍＬ　ＩＦＮγ（Ｒ＆Ｄ）を加えて２４時間刺激し、Ｍ２に分化させる際はさらに２０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－４（Ｒ＆Ｄ）と２０ｎｇ／ｍＬ　ＩＬ１３（Ｒ＆Ｄ）を加えて２４時間刺激した。顕微鏡で観察し、図１ｂに示すように形態が変化したことを確認した。
　また、それぞれの分化後又は未分化の状態のままの細胞のｍＲＮＡを抽出し、ＩＬ－１ｂｅｔａ、ＴＮＦ－ａｌｐｈａ、ＩＬ－１０のプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＴａｑＭａｎ　Ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｓｓａｙによるｒｅａｌｔｉｍｅ　ＰＣＲを行い、発現量を定量した（図１ｃ上図）。更に、ＣＤ８６抗体（Ｒ＆Ｄ）、ＣＤ２０６抗体（ＢＤ）を用い、同様にＰＣＲを行い発現量を定量した（図１ｃ下図）。それぞれの値はＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正した。
　図１ｃに示すように、上記方法により分化させたマクロファージがそれぞれ、Ｍ１に特徴的な炎症性サイトカイン（ＩＬ－１ｂｅｔａ、ＴＮＦ－ａｌｐｈａ）及びＭ２に特徴的な抗炎症性サイトカイン（ＩＬ－１０）を産生することが示された。更に、これらの分化誘導マクロファージがそれぞれＭ１、Ｍ２マクロファージの表面マーカーであるＣＤ８６、ＣＤ２０６発現の増加を示した。これらの結果より、分化誘導が成功したことが確認された。よって、上記方法で分化させたＭ１、Ｍ２マクロファージ及び未分化のＭ０マクロファージを以下の実験で用いた。
　実験２：Ｍ１抑制／Ｍ２誘導剤の探索（１）
　Ｍ１／Ｍ２の各種マーカーを用いて、Ｍ１／Ｍ２バランスを調整又は改善することにより、光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善し得る剤を探索したところハクシニンに強力なＭ２誘導効果が見いだされた。なお、ここで用いたハクシニン抽出物（加水分解無し、又は加水分解あり）は、特許第４７８１８４２号公報（特許文献９）や、国際公開第２０１２／０５７１２４３号（特許文献１０）を参照して調製されたものであり、以下の手順によって調製された。なお、本発明に置いて用いられ得るハクシニン抽出物を調製する手順は以下に記載の手順に限定されないことに留意されたい。
　＜ハクシニン抽出物の調製＞
　ハクシニンの種子（未粉砕、必要に応じて外殻を除去）を５倍量（ｖ／ｗ）のアセトンまたは酢酸エチル（酢エチ）またはヘキサンに浸漬し、室温にて１０日間抽出を行った。ナイロンメッシュ（１００メッシュ）であらかじめ残渣を除き、さらにろ紙にてろ過した。ロータリーエバポレータでろ液から溶媒を除去した後、撹拌羽根で撹拌しながら０．５～１５ＮのＮａＯＨをＮａＯＨとして１００～３００ ｇ/ｌ 抽出物の範囲内で添加した（温度５０℃）。２００ ｒｐｍで撹拌しながら、５時間処理を行った。その後、５Ｎ Ｈ2ＳＯ4を徐々に添加し、撹拌しながらｐＨを１付近まで下げ、分離してくる油状物質を回収した。回収した油状物質に等容量の水を加えて水洗し、不純物・塩・過剰の酸を除去した。油状物質を減圧乾燥し、アルカリ処理物とした（加水分解ありのハクシニン抽出物）。比較対照としては、アルカリ処理前の抽出物を用いた（加水分解なしのハクシニン抽出物）。
　ＴＨＰ－１細胞をＭ０の未分化の状態のまま用い、３７℃で一晩培養した。その後、溶媒（ＤＭＳＯ）で溶解した加水分解無し（アルカリ処理無し）のハクシニン（コントロール）を３ｐｐｍ、又はハクシニン加水分解物を０．３ｐｐｍ、１ｐｐｍ、もしくは３ｐｐｍとなるように添加し、３７℃で二晩培養した。細胞を回収してＲＮＡを抽出し、ＣＤ８６、ＣＣＲ７、ＴＮＦ－ａｌｐｈａ、ＣＤ２０６、ＣＤ１６３、ＩＬ－１０及びＧＡＰＤＨの発現量をｒｅａｌ　ｔｉｍｅ　ＰＣＲで定量し、各遺伝子の発現量をＧＡＰＤＨの発現量で除した。その結果、ハクシニン加水分解物は、濃度依存的に、ＣＤ８６遺伝子、ＴＮＦ－α遺伝子発現量を低下させ、ＣＤ２０６遺伝子、ＩＬ－１０遺伝子を増加させた。このことからハクシニン加水分解物にＭ１誘導抑制かつＭ２誘導促進効果があることがわかった（図２）。
　実験３：ハクシニンによるメラニン貪食能増加効果
　未成熟（Ｍ０）の状態のＴＨＰ－１細胞に、溶媒（ＤＭＳＯ）で溶解した加水分解無し（アルカリ処理無し）のハクシニン（コントロール）を３ｐｐｍ、又はハクシニン加水分解物を１．０ｐｐｍ、３．０ｐｐｍとなるように添加した。３７℃にて培養し、４８時間後にメラニン溶液（Ｓｉｇｍａ社）を添加し、顕微鏡（Ｂｉｏ　Ｓｔａｔｉｏｎ　ＣＴ（Ｎｉｋｏｎ））にて観察した。
　結果を図３ａ～ｂに示す。メラニン添加３０分後ハクシニン添加したマクロファージはメラニンを取り込み始めていた（図３ｂの黒矢印）。さらに３時間後、コントロールはメラニンを取り込んでいない細胞がまだ多く存在するが、ハクシニン加水分解物添加サンプルでは全ての細胞がメラニンを取り込んでいた。
　光老化によりＭ１の割合が増加し、Ｍ２の割合が高いほうが皮膚コラーゲン量が多くなり、色素貪食作用も高くなる傾向があることから（特許文献１１）、Ｍ２誘導剤としてスクリーニングされたハクシニンは、真皮において色素沈着抑制効果が高いことが示唆される。
　実験４：マクロファージの細胞内活性
　実験１と同様の方法でＴＨＰ－１から分化誘導したＭ０マクロファージ、Ｍ１マクロファージ及びＭ２マクロファージについて、Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（旧Ｓｅａｈｏｒｓｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）社製の細胞外フラックスアナライザーＸＦｅ２４（２４ｗｅｌｌ用）（以下、「フラックスアナライザー」という。）を用いて、Ｎａｔ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　２０１４．　１５（９）：　ｐｐ８４６－８５５（非特許文献７）を参考に細胞内活性を計測した。なお、フラックスアナライザーは、細胞の主要なエネルギー代謝経路である解糖、及びミトコンドリアによる好気呼吸の状態を、細胞に対して無侵襲・高感度に経時的計測を可能とする装置である。
　フラックスアナライザーを用いて、オリゴマイシン（ＡＴＰ合成酵素阻害剤）（「Ｏｌｉｇｏ」）、ＦＣＣＰ（脱共役剤）、及びロテノン（ミトコンドリア複合体Ｉ阻害剤）＋アンチマイシンＡ（ミトコンドリア複合体ＩＩＩ阻害剤）（「Ｒｏｔ＋Ａｎｔ」）を所定の時間に添加し、酸素消費速度（ＯＣＲ）と細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）とを計測した。ＥＣＡＲ、ＯＣＲの値は計測後１８．３分後のｂａｓａｌ　ＯＣＲの値、ｂａｓａｌ　ＥＣＡＲの値を用いた。それぞれの計測値は、Ｈｏｅｃｈｓｔを添加して染色された細胞核をカウントして得られた細胞数で補正した。
　その結果、Ｍ２マクロファージ、Ｍ０マクロファージ、Ｍ１マクロファージの順番で、ミトコンドリアによる呼吸活性が高いことが示された（図４）。
　実験５：ハクシニン抽出物によるマクロファージの細胞内活性への影響
　実験１と同様の方法で、ＴＨＰ－１から分化誘導したＭ０、Ｍ１、Ｍ２を準備し、Ｍ０に実験２と同様の方法で調整したハクシニン抽出物（ハクシニン加水分解物）（０．３ｐｐｍ、１ｐｐｍ又は３ｐｐｍ）を添加した。４８時間インキュベートした後に、酸素消費速度（ＯＣＲ）をフラックスアナライザーで計測した。それぞれの計測値は、Ｈｏｅｃｈｓｔを添加して染色された細胞核をカウントして得られた細胞数で補正した（図５）。
　その結果、ハクシニン抽出物を添加することによって、計測開始１８．３分後（３点目の計測値）のＢａｓａｌ　ＯＣＲの値（図５）、及びミトコンドリア呼吸の値（計測開始１８．３分後のＢａｓａｌ　ＯＣＲの値から、計測開始９５．１分後のｎｏｎ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ（ミトコンドリアとは関連のない酸素消費量）を引いた値）（図６）が有意に増加することが明らかとなった。
　実験６：ハクシニン抽出物に含まれる各成分によるマクロファージの細胞内活性への影響（１）
　ハクシニン抽出物には、ω３脂肪酸であるリノレン酸やジュニペロン酸、ω６脂肪酸であるリノール酸等の不飽和脂肪酸が含まれていることが知られている。不飽和脂肪酸（ＥＰＡ、ＤＨＡ）がＭ１の炎症関連遺伝子に作用し、炎症を抑制することが報告されている（非特許文献８（Ｃｅｌｌ　Ｍｅｔａｂ．　２０１７　Ｆｅｂ　７；２５（２）：４１２－４２７）)。そこで、ハクシニン抽出物に含まれる不飽和脂肪酸がマクロファージの細胞内活性へ与える影響について調べた。
　実験１と同様の方法で、ＴＨＰ－１から分化誘導したＭ０、Ｍ２を準備し、Ｍ０にリノール酸、リノレン酸又はジュニペロン酸（３ｐｐｍ）を添加し、４８時間後に、実験１５と同様の方法で酸素消費速度（ＯＣＲ）をフラックスアナライザーで計測した。それぞれの計測値は、Ｈｏｅｃｈｓｔを添加して染色された細胞核をカウントして得られた細胞数で補正した。
　その結果、ハクシニン抽出物に含まれるリノール酸、リノレン酸、ジュニペロン酸の添加によるＭ０マクロファージへのＢａｓａｌ　ＯＣＲ及びミトコンドリア呼吸の値は、溶媒のみ（ＤＭＳＯ）を添加したコントロールとの有意差が認められなかった（図７）。
　実験７：ハクシニン抽出物に含まれる各成分によるマクロファージの細胞内活性への影響（２）
　ハクシニン抽出物、又は不飽和脂肪酸を添加した後のインキュベート時間を２４時間に変更した場合のＭ０のＢａｓａｌ　ＯＣＲ及びミトコンドリア呼吸の値を調べた。実験方法は、ハクシニン抽出物又は不飽和脂肪酸を添加後のインキュベート時間を２４時間に変更した以外は、実験６に記載の方法と同じ方法を実施した。
　その結果、ハクシニン抽出物及び各不飽和脂肪酸を添加後２４時間では、Ｂａｓａｌ　ＯＣＲ及びミトコンドリア呼吸の値の増加は観察されなかった（図８）。
　実験８：ハクシニン抽出物に含まれる各成分によるＭ１分化中のマクロファージの細胞内活性への影響
　実験１と同様の方法でＴＨＰ－１から分化誘導したＭ０を、さらにＭ１に分化誘導する工程においてハクシニン抽出物又は不飽和脂肪酸（リノール酸、リノレン酸、又はジュニペロン酸）を添加した場合の細胞内活性の変化をフラックスアナライザーを用いて解析した（図９）。
　ＴＨＰ－１から分化誘導したＭ０をさらにＭ１に分化誘導する時に、ハクシニン抽出物、又は不飽和脂肪酸を添加して２４時間後にフラックスアナライザーを用いて、酸素消費速度（ＯＣＲ値）と細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ値）とを計測した。
　その結果、Ｂａｓａｌ　ＯＣＲ及びミトコンドリア呼吸は、ハクシニン抽出物を添加した場合のみ、有意な上昇が認められた（図１０（Ａ）及び（Ｂ））。強い抗炎症作用が報告されているリノレン酸のみ、ＥＣＡＲ値の強い抑制効果が観察され、その結果、ＯＣＲ／ＥＣＡＲ値の上昇が認められた。
　Ｍ１分化中のマクロファージのミトコンドリア呼吸はハクシニン抽出物によって有意に上昇したが、ハクシニン抽出物に含まれる不飽和脂肪酸単独では有意な上昇は認められず、ミトコンドリア呼吸の上昇という効果は、ハクシニン抽出物に含まれる各種成分の混合による特異的な効果である可能性が示唆された。
　実験９：Ｍ１抑制／Ｍ２誘導剤の探索（２）
　上記実験４においても示されたように、リペア型のＭ２マクロファージは、未分化状態のＭ０マクロファージ及び炎症型のＭ１マクロファージに比べて、ミトコンドリア呼吸が高く、エネルギーをミトコンドリア呼吸で得ている一方で、炎症型のＭ１マクロファージは、解糖系に依存してエネルギーを得ている。従って、細胞内活性（ミトコンドリア呼吸及び解糖系）を指標として、Ｍ２又はＭ２様マクロファージを誘導し得る物質を探索したところ、ニコチン酸アミドが、マクロファージのミトコンドリア活性を有意に上昇させ得ることを見出した（図１１）。
　具体的には、実験１と同様の方法で、ＴＨＰ－１から分化誘導したＭ０を準備し、Ｍ０にニコチン酸アミド（０ｍＭ（ｃｏｎｔｒｏｌ）、０．６ｍＭ又は３．０ｍＭ）を添加した。２４時間インキュベートした後に、酸素消費速度（ＯＣＲ）及び細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）をフラックスアナライザーで計測した。それぞれの計測値は、Ｈｏｅｃｈｓｔを添加して染色された細胞核をカウントして得られた細胞数で補正した。
　その結果、ニコチン酸アミドを添加することによって、計測開始１８．３分後のＢａｓａｌ　ＯＣＲの値（図１１（Ｂ））及びＯＣＲ／ＥＣＡＲ値（図１１（Ｄ））が有意に上昇し、ミトコンドリア呼吸の値（計測開始１８．３分後のＢａｓａｌ　ＯＣＲの値から、計測開始９５．１分後のｎｏｎ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ（ミトコンドリアとは関連のない酸素消費量）を引いた値）（図１１（Ｃ））が増加傾向にあることが明らかとなった。
　以上より、ニコチン酸アミドは、Ｍ０マクロファージをＭ２又はＭ２様マクロファージが特徴とする酸素消費速度（ＯＣＲ）を上昇させ得る物質であることが明らかとなった。
　実験１０：ニコチン酸アミドによるＭ１分化中のマクロファージの細胞内活性への影響
　実験１と同様の方法でＴＨＰ－１から分化誘導したＭ０を、さらにＭ１に分化誘導する工程においてニコチン酸アミドを添加した場合の細胞内活性の変化をフラックスアナライザーを用いて解析した（図１２、図１３）。
　ＴＨＰ－１から分化誘導したＭ０をさらにＭ１に分化誘導する時に、ニコチン酸アミドを添加して２４時間後にフラックスアナライザーを用いて、酸素消費速度（ＯＣＲ値）と細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ値）とを計測した。
　その結果、Ｍ１に分化誘導中にニコチン酸アミドを添加すると、ＥＣＡＲ値の抑制効果が観察され（図１３（Ｄ））、その結果、ＯＣＲ／ＥＣＡＲ値の上昇が認められた（図１３（Ｃ））。
　実験１１：ニコチン酸アミドによるＭ２分化中のマクロファージの細胞内活性への影響
　実験１と同様の方法でＴＨＰ－１から分化誘導したＭ０を、さらにＭ２に分化誘導する工程においてニコチン酸アミドを添加した場合の細胞内活性の変化をフラックスアナライザーを用いて解析した（図１４、図１５）。
　ＴＨＰ－１から分化誘導したＭ０をさらにＭ２に分化誘導する時に、ニコチン酸アミドを添加して２４時間後にフラックスアナライザーを用いて、酸素消費速度（ＯＣＲ値）と細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ値）とを計測した。
　その結果、Ｍ２に分化誘導中にニコチン酸アミドを添加すると、ＥＣＡＲ値の抑制効果が観察され（図１５（Ｄ））、その結果、ＯＣＲ／ＥＣＡＲ値の上昇が認められた（図１５（Ｃ））。
　実験１２：ニコチン酸アミド及びハクシニン抽出物によるＭ０マクロファージの細胞内活性への影響
　実験１と同様の方法で、ＴＨＰ－１から分化誘導したＭ０を準備し、Ｍ０に、ハクシニン抽出物（実験２と同様の方法で調整。１０ｐｐｍ）、ニコチン酸アミド（０．１ｍＭ）又はハクシニン抽出物（１０ｐｐｍ）とニコチン酸アミド（０．１ｍＭ）の混合物（ｍｉｘ）を添加した。２４時間インキュベートした後に、酸素消費速度（ＯＣＲ）及び細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）をフラックスアナライザーで計測した。それぞれの計測値は、Ｈｏｅｃｈｓｔを添加して染色された細胞核をカウントして得られた細胞数で補正した。
　その結果、２４時間の添加ではその効果を発揮しないハクシニン抽出物（１０ｐｐｍ）及びニコチン酸アミド（０．１ｍＭ）は、それらを混合して添加することによって相乗効果を発揮し、Ｍ０マクロファージのＯＣＲ値を有意に増加させることが明らかとなった（図１６（Ｂ））。
　実験１３：ニコチン酸アミド及びハクシニン抽出物によるＭ１分化中のマクロファージの細胞内活性への影響
　実験１と同様の方法でＴＨＰ－１から分化誘導したＭ０を、さらにＭ１に分化誘導する工程において、ハクシニン抽出物、ニコチン酸アミド又はハクシニン抽出物とニコチン酸アミドの混合物（ｍｉｘ）を添加した場合の細胞内活性の変化を、フラックスアナライザーを用いて解析した（図１７）。
　ＴＨＰ－１から分化誘導したＭ０をさらにＭ１に分化誘導する時に、ハクシニン抽出物（実験２と同様の方法で調整。１０ｐｐｍ）、ニコチン酸アミド（０．１ｍＭ）、又はハクシニン抽出物（１０ｐｐｍ）とニコチン酸アミド（０．１ｍＭ）の混合物（ｍｉｘ）を添加して２４時間後にフラックスアナライザーを用いて、酸素消費速度（ＯＣＲ値）と細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ値）とを計測した。
　その結果、Ｍ１に分化誘導中にニコチン酸アミドを添加すると、２４時間の添加ではその効果を発揮しないハクシニン抽出物（１０ｐｐｍ）及びニコチン酸アミド（０．１ｍＭ）は、それらを混合して添加することによって相乗効果を発揮し、Ｍ１に分化誘導時のマクロファージのＯＣＲ値を増加させ、また、ＥＣＡＲ値を減少させて、ＯＣＲ／ＥＣＡＲ値を増加させることが明らかとなった（図１７（Ｂ）、（Ｃ））。
　実験１４：ニコチン酸アミドによるＭ２分化中のマクロファージの細胞内活性への影響
　実験１と同様の方法でＴＨＰ－１から分化誘導したＭ０を、さらにＭ２に分化誘導する工程において、ハクシニン抽出物、ニコチン酸アミド又はハクシニン抽出物とニコチン酸アミドの混合物（ｍｉｘ）を添加した場合の細胞内活性の変化を、フラックスアナライザーを用いて解析した（図１８）。
　ＴＨＰ－１から分化誘導したＭ０をさらにＭ２に分化誘導する時に、ハクシニン抽出物（実験２と同様の方法で調整。１０ｐｐｍ）、ニコチン酸アミド（０．１ｍＭ）、又はハクシニン抽出物（１０ｐｐｍ）とニコチン酸アミド（０．１ｍＭ）の混合物（ｍｉｘ）を添加して２４時間後にフラックスアナライザーを用いて、酸素消費速度（ＯＣＲ値）と細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ値）とを計測した。
　その結果、Ｍ２に分化誘導中にニコチン酸アミドを添加すると、２４時間の添加ではその効果を発揮しないハクシニン抽出物（１０ｐｐｍ）及びニコチン酸アミド（０．１ｍＭ）は、それらを混合して添加することによって相乗効果を発揮し、Ｍ２に分化誘導時のマクロファージのＯＣＲ値を増加させることが明らかとなった（図１８（Ｂ））。
　以上の結果により、ニコチン酸アミド及びハクシニン抽出物は、Ｍ２又はＭ２様マクロファージを誘導又は活性化し、その結果、Ｍ１／Ｍ２のバランスを調整又は改善することにより、光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善できることが示唆された。

Claims (18)

  1. 　ニコチン酸アミド又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、Ｍ２又はＭ２様マクロファージの誘導又は活性化剤。
  2. 　前記Ｍ２又はＭ２様マクロファージを介して真皮における色素沈着を予防及び／又は改善する、請求項１に記載の誘導又は活性化剤。
  3. 　マクロファージの解糖系を抑制する、請求項１又は２に記載の誘導又は活性化剤。
  4. 　マクロファージの好気呼吸を促進する、請求項１～３のいずれか１項に記載の誘導又は活性化剤。
  5. 　ハクシニン抽出物をさらに含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の誘導又は活性化剤。
  6. 　ニコチン酸アミド又はその薬学的に許容される塩とハクシニン抽出物とを含む、組成物。
  7. 　必要とする対象におけるＭ２又はＭ２様マクロファージの誘導又は活性化方法であって、
    　前記対象に、ニコチン酸アミド又はその薬学的に許容される塩を適用し、Ｍ２又はＭ２様マクロファージを誘導又は活性化すること
    を含む、方法。
  8. 　前記Ｍ２又はＭ２様マクロファージを介して、前記対象の真皮における色素沈着を予防及び／又は改善する、請求項７に記載の方法。
  9. 　マクロファージの解糖系を抑制する、請求項７又は８に記載の方法。
  10. 　マクロファージの好気呼吸を促進する、請求項７～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 　ハクシニン抽出物をさらに含む、請求項７～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 　必要とする対象における真皮の色素沈着を予防及び／又は改善する方法であって、
    　前記対象にニコチン酸アミド又はその薬学的に許容される塩とハクシニン抽出物とを含む組成物を適用すること
    を含む、方法。
  13. 　Ｍ２又はＭ２様マクロファージの誘導又は活性化するための組成物の製造のためのニコチン酸アミド又はその薬学的に許容される塩の使用。
  14. 　前記Ｍ２又はＭ２様マクロファージを介して、対象の真皮における色素沈着を予防及び／又は改善する、請求項１３に記載の使用。
  15. 　マクロファージの解糖系を抑制する、請求項１３又は１４に記載の使用。
  16. 　マクロファージの好気呼吸を促進する、請求項１３～１５のいずれか１項に記載の使用。
  17. 　ハクシニン抽出物をさらに含む、請求項１３～１６のいずれか１項に記載の使用。
  18. 　真皮における色素沈着を予防及び／又は改善するための組成物の製造のためのニコチン酸アミド又はその薬学的に許容される塩及びハクシニン抽出の使用。
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