TW201600118A - 表面素於化妝品上之應用 - Google Patents

Abstract

一種由微生物Bacillus subtilus所生產之生物介面活性劑biosurfactant一表面素(surfactin)，該表面素是一個天然環型的脂胜肽，由七個胺基酸形成一個環狀的結構；且該表面素具有皮膚抗老化、抗皺、增加化妝品皮膚穿透力(助滲劑)、起泡劑及乳化劑等功能。

Description

表面素於化妝品上之應用

本發明係關於表面素的應用方法，特別指表面素於化妝品上之應用方法。

1. 人類皮膚結構及其老化因子

皮膚為人體表面主要器官，厚度因部位、年齡及性別會有所不同；且皮膚主要功能為人體第一道屏障，可避免人體內部組織直接受到外在環境因子的損害，如：紫外線照射、溫度變化、濕度變化、懸浮微粒的傷害以及病毒或細菌直接進入人體，因此皮膚容易受到外界因子刺激而啟動老化機制代謝已損傷的細胞。

(1)細胞老化及基因缺損

老化作用從細胞開始逐漸影響至組織與器官，使各部分組織器官結構與功能逐漸衰退。在Leonard Hayflick於1963年之研究中，將凍存之人體分離細胞加以培養進行繼代實驗，發現細胞***一定次數後發生了形變；由結果發現人體細胞有其***上限次數，細胞約***50次後其***速率及外觀皆會改變，產生不規則的***方式，造成粒狀型、扭曲型等不正常之細胞外觀使細胞凋亡；此研究認為生物體生長週期於受精卵時就已決定，事先就已經設定一生物體之生命時鐘，以人類來說，細胞***50次，大約可達120年。由於人體並無端粒酶可將細胞複製時所缺失的片段重新複製，致使經多次細胞複製、***過程中基因受損，而使得細胞週期有其限制，該限制又稱為Glass Ceiling，此一老化為不可逆且無法避免之過程。

(2)紫外線

皮膚與其他器官都會隨著時間而老化，但較不同的地方是皮膚於日常生活中會受到環境因子的刺激，而使皮膚老化較人體其他組織與器官也較為劇烈。在眾多環境老化因子中，以紫外線(ultraviolet，UV)照射最具影 響力；紫外線波長範圍10~400nm，能量範圍為3eV至124eV，依波長可分為三種紫外線階層：(1)長波紫外線(UV-A)，其波長介於315~400nm，可直接穿透地球大氣層照射至地表，並可穿透皮膚真皮層，造成皮膚黑斑、老化及皺紋，其穿透力為三種波長中最強者；(2)中波紫外線(UV-B)波長介於280~315nm，會造成皮膚紅腫、熱、痛，嚴重甚至脫皮或者類似灼傷的症狀，照射至地球時會被平流層中的臭氧層吸收，只有極少部分會通過臭氧層到達地表；(3)短波紫外光(UV-C)波長介於100~280nm，能量最強並有相當危險的傷害能力，但因其波長短會於大氣層被吸收，只有小於總太陽光的0.1%能到達地表，且一般遮蔽防曬及玻璃屏障就可有效阻擋。有研究發現UV-A對於人類皮膚成纖維母細胞中會誘發基質金屬蛋白酶的產生，基質金屬蛋白酶家族會將皮膚膠原蛋白、彈性蛋白及細胞間基質等物質分解，使皮膚進行老化；UV-A會迫使細胞內自由基濃度提高，其濃度過高亦會使細胞提早老化更甚者細胞凋亡。

(3)自由基

自由基(Free radical)理論是目前科學界最為一致認同的老化理論，由1954年美國林肯大學醫學院Denham Harmam M.D.提出但並未受到重視，二十年後自由基理論才逐漸被接受，如今已成為老化理論的主流之一，Denham Harmam並於1995年榮獲提名諾貝爾醫學獎。正常原子是具有成對的電子，而自由基是含有不成對電子的氧原子物質；電子於不成對的狀態下極度不穩定，故自由基會將正常原子的電子移轉，使細胞構成基質發生改變，並造成細胞死亡。

自由基的重要來源除了自身新陳代謝或合成營養素之外，其導致老化來原為環境污染、紫外線、放射線、吸煙、殺蟲劑及許多化學藥品，尤其是環境污染(汽車的廢氣，工廠排放的SO₂)都會增加體內大量有害自由基。

自由基攻擊可分成細胞膜損害及DNA損害。對人類細胞而言，含氧的自由基包括有超氧陰離子O₂-、過氧化氫H₂O₂、氫氧基自由基OH-等，都統稱為活性氧分子；過剩的自由基容易攻擊細胞膜上不飽和脂肪酸。當自由基攻擊細胞膜上不飽和脂肪時，形成脂肪過氧化酶(lipid peroxidase)，並氧化血管內壁低密度膽固醇並且抑制***素合成酶(prostacycline Synthetase)，造成動脈硬化、糖尿病、關節炎、白內障、老化、冠狀動脈疾病等。若自由基深入到細胞核攻擊DNA，使得遺傳訊息改變進而導致癌症；此外，自由基可誘導老化基因並促進老化作用發生，研究指出約80%~90%的老化性、退化性疾病與自由基有關，其中包括癌症、老人癡呆症、帕金森氏症、肌肉營養不良、皮膚黑斑沈積、皺紋生成、黃班、退化心臟病、中風、潰瘍、類風濕性關節炎及多發性硬化等。

細胞對自由基之防禦機制：由細胞合成的各種抗氧化酶，如麩胱甘肽過氧化酵素(glutathione Peroxidase,GPx)、超氧歧化酶(superoxide Dismutase，SOD)等酵素和穀胱甘肽(Glutathione,GSH)，能清除超氧陰離子等體內自然產生的物質；研究報告指出長壽動物體內的SOD含量比較高，而人類是目前所知體內SOD含量最高的動物。年長老化、體質改變、環境因素等，皆可能使體內抗氧化酶出現不足狀況進而導致老化。

(4)發炎反應

發炎反應為當組織受傷或感染時產生的反應。首先肥大細胞(Mast cell)會到達組織，並會附著在內皮細胞釋放出：

(1)組織胺(Histamine)：胺基酸的衍生物，會使微血管(capillary)通透性增加，局部血管擴張，使血漿(plasma)及吞噬細胞等物質能夠通過，並造成癢及過敏反應。

(2)腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF)：細胞素(cytokine)會殺死目標細胞並活化免疫系統，使淋巴細胞加速增殖且阻止病原體的增殖，並可吸引吞噬細胞過來。

(3)***素(Prostaglandin)：使微血管擴張，導至於膨脹壓迫神經末梢引發疼痛，在發炎反應過後會產生膿(pus)，膿由死細胞及體液構成，通常會被巨噬細胞消化。

特定的細胞因子就會活化自身環氧化酵素(cyclooxygenase，COX)，其中包括COX-1及COX-2兩大類。COX會使花生四烯酸大量轉變為PGE 2和PGF 2α等***素。近期研究發現，在 大多數正常組織都沒有發現COX-2的存在，但是確可在各種癌症病人中檢測出來，這顯示了COX-2在腫瘤病患中的重要性。另，COX-2為一誘導酶，其功能為活化巨噬細胞或其他細胞，並充斥於炎症組織。

發炎部位產生熱感，主因為血管擴張素或組織胺被釋放，使得血管擴張及血液流量增加所造成。有些細胞會釋放出IL-17(Interleukin-1 alpha)的炎性細胞因子，或舊稱白細胞介素(Inflammatory cytokines)等物質；用以活化特定白血球白三烯來抵擋致敏原；其中細胞因子還包括趨化因子，該趨化因子會啟動細胞趨化機制以及干擾素，中止宿主細胞進行蛋白質的合成。而生長因子與細胞毒性分子也可能被釋出，進行組織的療癒。上述物質分泌時會使周圍細胞也受到影響，導致細胞間基質流失進而老化。

由上述四點老化成因可得知皮膚老化過程中，因表皮層角質細胞及真皮層纖維母細胞的增生減緩，造成皮膚內真皮層細胞外基質的大分子成分及結構性蛋白發生改變，而導致皮膚的皺褶、皮膚變薄、膚色黯淡、皮膚彈性降低及保濕度降低等老化現象。而紫外線則會誘導皮膚間質蛋白酶生成，該蛋白酶會分解皮膚膠原蛋白及彈性纖維蛋白組織，且紫外線亦會造成細胞內自由基濃度提高，進而導致皮膚產生發炎反應並提前進行老化；另，經紫外線照射過後，皮膚會產生活性氧化物質使細胞膜、結構蛋白、核酸等細胞結構遭到破壞，最終導致皮膚細胞癌化、死亡，並使皮膚基質流失造成外表皺紋累積。

2.人類抗老化蛋白

有研究指出，細胞受到紅酒中的化學物質白藜蘆醇(resveratrol)或熱量限制的刺激時，會啟動sirtuins family使其細胞週期延長。而Sinclair及其MIT Leonard Guarente實驗室發現，酵母菌中一種特殊的Sirtuins蛋白是以二種特定方式影響老化過程，Sirtuins可協助調控細胞中的基因活性並修補DNA中的斷裂。

Philipp Oberdoerffer,Sinclair實驗室，則利用微陣列平台於老鼠細胞中探測酵母菌sirtuin基因並尋找哺乳類動物之sirtuin基因序列；而老鼠研究結果亦證實了在脊椎動物上也有類似於酵母菌中之sirtuin基因。Oberdoerffer則發現，Sirtuin在哺乳類動物系統中的主要功能之一 是監督基因表現的模式；所有基因都會出現在所有細胞中，但於特定時間裡，只有少數幾個基因需要活化，若錯誤基因被活化則會導致細胞損傷進而使其進入細胞凋亡。

Sirtuins會將被抑制表現的基因去乙醯化，使其不受到環境因子破壞，並使受抑制基因維持其關閉狀態，保持細胞基因穩定；Sirtuins可協助保存染色質(chromatin)，將基因與組蛋白(histone)共同收縮及包覆，並使其保持閒置狀態；當DNA因紫外光或自由基而受損時，Sirtuins會於受損處協助DNA修補機制；Sirtuins其保護功能可在基因造成永久性傷害前，將基因與蛋白包覆住以達到保護的效果。若未受Sirtuins保護，組蛋白會開始成鬆散狀，被保存抑制的基因則會重新被啟動，而使基因容易受外界干擾而損傷。

當小鼠老化時，DNA受損速率會增加，此種損害會使基因表現失去管制，染色質不受其控制旋開，此時Sirtuins則會幫助控管全基因組的失控；而在此失控中被活化的基因，有許多是直接與老化顯型有直接關連的基因。

其他研究則發現，未受Sirtuins控管失控之小鼠基因，會持續不斷地在老化的小鼠中出現。Oberdoerffer利用一隻經過基因改造的淋巴瘤小鼠動物模型，當給予小鼠額外的sirtuin基因拷貝，或餵食小鼠sirtuin活化劑(activator)--白藜蘆醇時，發現小鼠的平均壽命會被延長24%~46%。

Leonard Guarente的研究則指出，透過新藥物的使用，隨著時間穩定Sirtuins的重新分配，將會有新的方式來保護細胞避免老化。根據這種特定的機制，雖然DNA損傷會使老化惡化，但起因並非DNA受損本身，而是基因缺乏調控所致；Oberdoerffer研究亦指出，此調控基因活性的過程，稱為外遺傳(Epigenetics，表遺傳)，不同於DNA中的實質突變；而透過對此原理的驗證，發現能夠以刺激Sirtuins的方式逆轉老化。

3. 皮膚穿透加強劑(Transdermal Penetration Enhancers,TPE)

新藥研究需耗費很多金錢及時間，故給藥系統之開發，越來越受重視。 最常見的藥物服用方式，包括口服給藥、皮下組織注射給藥及經皮給藥。口服給藥是一種最常用的給藥方式，藥物在經口服後，通過胃腸粘膜吸收進入血液，達到局部或全身的治療作用。而口服給藥的缺點在於：藥物經體內吸收慢而不規則，使得藥物無法達到治療作用；再者藥物到達血液前要先經過肝臟，使得藥物之藥效受到破壞，也對肝臟造成負擔；有些藥物則因腸內無法吸收或具有刺激性而不能口服；而口服給藥的最大缺點，在於藥物會在體內造成副作用，使得病患會有噁心、嘔吐等身體上的不適應。另一種給藥方式為皮下組織注射法，該方法是將藥物直接注入皮下，經皮下微血管吸收而輸送到全身，其優點在於藥物不會受到胃液和肝臟影響，可以直接進入血管並流經身體各個部位，達到治療目的；皮下組織注射法與口服法相比，大大的提升了給藥的速率，但對於長期依賴注射給藥的病人來說，卻需要長期承受因注射所造成的疼痛負擔。又另一種給藥方式為經皮給藥系統(Transdermal Drug Delivery system,TDDS)，於該系統中藥物是通過皮膚來吸收的；給藥後，藥物會在預定時間內，穿過皮膚角質層，並經微血管滲透吸收後，進入血液循環而產生作用，進而達到全身治療的目的(Saunders et al.,1999)。

經皮給藥治療系統具有的優點包括：生產容易、成本低廉、可以恆定速率進入體內、可於血液中長時間維持穩定的濃度、減少給藥頻率、低毒副作用、避免肝臟的首渡效應、降低藥物代謝、減少用藥的個體差異、提高生體可用率及小劑量即可達到治療的效果等優點。另，經皮給藥適用於年幼、老人或不易服藥之病患；用藥方便，發生問題時能立即移除，停止給藥。由於經皮給藥具有上述之優點，此系統備受矚目；目前經皮給藥的開發研究，已從局部向全身、靶向器官及控釋機制發展，並已應用在臨床上(Shin et al.,2005)。

經皮給藥系統最大的障礙就是皮膚的角質層，角質層(stratum corneum,SC)是皮膚的最上層，由扁平長型的角質細胞組成，角質細胞的四周則環繞著層狀的脂肪(Norlen,2001)；角質層最主要的功能為阻止外界物質進入體內、防止體內水分散失，為皮膚最外層的屏障(Bouwstra et al.,2003)。1973年學者Breathnach等人利用電子顯微鏡發現角質層細胞 間隙充滿了脂肪，開始認為角質層脂肪在皮膚障壁功能上扮演重要的地位(Breathnach et al.,1973)。亦有研究指出，當角質層溫度上升時，角質層細胞間脂肪的流動性增加，皮膚經皮吸收滲透性也隨之增加(Golden et al.,1987)；若將角質層中的脂質去除後，則可明顯增加親水性及兩性藥品對皮膚的滲透性，但對親脂性的藥物不具顯著的影響(Tsai et al.,2001)。

克服經皮吸收的障礙問題，可使用下列三種方法：第一種是物理方法，給予一個外來的能量，使皮膚造成短暫性的孔洞，促進藥物吸收；常見的處理方式有超音波(ultrasound)、電離子透入(iontophoresis)、微型針頭列陣(microneedle array)及熱能量(thermal energy)。第二種則為生化方法，利用合成生物轉化前驅物以及和新陳代謝之抑制劑共同投藥，以增加藥物之吸收。第三種為化學方法，使用微脂粒(liposome)包覆藥物或添加皮膚穿透加強劑(penetration enhancer)，微脂粒是由彎曲的雙層脂質組成，形成親水朝外疏水端在內之雙面親水夾層，可同時作為油性與水性物質的載體，油性藥物可嵌入脂質雙層中，而水性藥物則可包覆在微脂粒的水相中；微脂粒與細胞作用的機制有四種，第一種為膜組成交換(intermembrane transfer)，即微脂粒膜的組成與細胞膜的組成中有一部份互相交換；第二種是吸著(adsorption)，微脂粒附著於細胞膜；第三種方式是膜融合(fusion)，微脂粒與細胞膜融合，將包容物送進細胞內；最後一種是吞食(phagocytosis,endocytosis)，微脂粒被細胞吞食。而皮膚穿透加強劑(penetration enhancer)是指可加速藥物穿透皮膚的速度及含量，但不會對皮膚造成嚴重刺激及傷害的物質(Williams and Barry,1991)；皮膚穿透加強劑主要是作用在角質層的脂質層(intercelluar)，擾亂其規則結構及提高其流動性，並且作用在角蛋白(keratin)上，鬆弛角細胞結構，增加藥物在角質層中的溶解度，達到增加藥物吸收的目的(Walker and Smith,1996)。添加皮膚穿透加強劑是相當具有發展潛力的助滲方法(Saunders et al.,1999)。

界面活性劑是一種良好的皮膚穿透加強劑，對生物膜及皮膚都有協助滲透的效果(Lopez et al.,2000)，近年來已經廣泛的應用於藥物穿透(Nokhodchi et al.,2003；Shokri et al.,2001)。2001年Nokhodchi等人的研究指出，界面活性劑烷基硫酸鹽(sodium lauryl sulfate,SLS)、溴化十六烷三 甲基銨(cetyltrimethylammonium bromide,CTAB)及氯化苯二甲烴銨(Benzalkonium Chloride)可促進小鼠皮膚對抗憂鬱藥物Diazepam的吸收(Shokri et al.,2001)。Nokhodchi等人對另一個關於抗憂鬱藥物的研究指出，界面活性劑烷基硫酸鹽(sodium lauryl sulfate,SLS)、溴化十六烷三甲基銨(cetyltrimethylammonium bromide,CTAB)及氯化苯二甲烴銨(Benzalkonium Chloride)可促進小鼠皮膚對抗憂鬱藥物lorazepam的吸收(Nokhodchi et al.,2003)。而表面素對人工合成的細胞膜、原生生物的細胞膜及真核生物的細胞膜具有相當好的親和力(Maget-Dana and Ptak,1995；Sheppard et al.,1991；Tsukagoshi et al.,1970b)；且表面素對和細胞膜的結合是具有高度選擇性的，這是因為表面素對於膽固醇(cholesterol)及磷脂質(phospholipid)的親和力很高，而細胞膜的結構就是以這兩個物質為主(Hosono and Suzuki,1985)。若和化學合成的界面活性劑相比，表面素較溫和，不會對皮膚造成傷害。

一般傳統的方法，藥物或營養活性物質只能滲透入表皮的阻隔層(即角質層)，效果並不顯著(只達到約百分之零點三的成效)；為解決這個問題，有很多經皮吸收技術被研發出來，目的是有效提升養分的滲透能力，使養份穿越皮膚表皮層及真皮層細胞，因此養分輸送方法變成為護膚科技的研究重點之一。

雖然人類皮膚的角質層很薄，其厚度僅為10-25微米，最薄的角質層在上眼皮，僅有6微米厚，但卻相當“堅韌”，是皮膚最重要的保護層。而一般化妝品原料經皮滲入主要是經過3種途徑：1.經汗腺管(sweat duct)；2.直接穿過角質層(stratum corneum)；及3.經過毛囊(hair follicle)。

化妝品原料以黃金為例，現代黃金美容研究證實，黃金具有解毒、鎖靜、潔淨及去皺的功能，使用後可使肌膚重組細胞因數，促進生理機能、新陳代謝、平衡油脂分泌及保持天然水分，並可抵抗外界引起的過敏。而化妝品原料中常用的奈米金，其大小相當於人類毛細孔的200分之一，因此使用含奈米純金微粒護膚品塗於肌膚時，是希望奈米金能效瞬間深入真皮層細胞。

當奈米金進入真皮層後，奈米金可在基因的層次上，調節真皮細胞功能，其中包括促進真皮細胞產生一系列活性物質，包括SOD、金屬硫蛋白、EGF等。由於SOD可清除羥基自由基，金屬硫蛋白又能抵抗皮層細胞受紫外線的損傷，所以奈米金對真皮細胞具有抗衰老的效果。亦有其他研究顯示奈米金能刺激纖維細胞，進而分泌合成新的胞外基質(ECM)，刺激纖維母細胞分泌膠原蛋白，和刺激纖維細胞呈現及分泌表皮生長因子(EGF)，來分化目標細胞特異的角化細胞生長因子(KGF)；同時也就加強了皮膚的緊致度，讓皮膚平滑而充滿彈力，發出閃亮的光輝。

4.生物乳化劑(Bioemulsifier)

表面素除了可作為抗菌肽之外，表面素更扮演了另外一個重要的角色，生物乳化劑(bioemulsifier)。1999年Deleu等人發現在抑制乳析及絮凝作用的測試中，伊枯草桿菌素的效果會較表面素好，在對烷類的乳化效果測試中，表面素對烷類的乳化效果，遠大於伊枯草桿菌素及豐原素，乳化效果最差的是化學合成的陰離子界面活性劑十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate,SDS)。其他研究顯示，添加20mg/l的表面素可增加柴油生物分解性，且更進一步指出pH值會影響表面素對柴油的乳化效力，將pH值調整為7.4時，表面素對柴油的生物分解性最佳。

5. 起泡劑

除了一般界面活性劑具有之乳化能力外，表面素亦具有起泡能力(Razafindralambo et al.,1998)。所謂起泡現象是指，表面素會存在於氣相及液相的界面中，劇烈搖晃使界面活性劑將空氣抓下，形成內含空氣的薄膜(Halling,1981)。Razafindralambo等人亦指出，和伊枯草菌素相比，表面素具有較優異的起泡效果，推測是和兩者之間的結構有關係，表面素屬於陰離子界面活性劑，其脂肪酸碳鏈較短，而伊枯草桿菌素則為非離子界面活性劑，脂肪酸碳鏈較長(Razafindralambo,et al.,1998)。

本發明之目的在提供一種以表面素(surfactin)製備抗老化(或抗皺紋)化妝品組合物的方法，其中該組合物係包含表面素及藥學上可接受之載劑、賦形劑、稀釋劑、輔劑等；其中該表面素為一環脂胜肽分子， 由7個胺基酸組成(L-Aspartic acid，L-leucine，glutamic acid，L-leucine，L-valine與兩個D-leucines)之環狀7肽(heptapeptide)結構。此環化7肽連接一個β-羥基脂肪酸，其中又以異14烷(isoC14)羥基為主(17%~35%)；其中該表面素在脂肪酸末端之脂肪酸分布如下：(1)異C13大於3%；(2)正C13大於0.65%；(3)異C14大於17%；(4)正C14少於41%；及(5)異C15少於11%；其中該脂肪酸末端之脂肪酸分布以下列分布為較佳：(1)異C13大於10%；(2)正C13大於25%；(3)異C14大於35%；(4)正C14少於25%；及(5)異C15少於3%；其中該脂肪酸末端之脂肪酸分布以下列分布為最佳：(1)異C 13為11%；(2)正C13為26%；(3)異C 14為37%；(4)正C14為24%；及(5)異C15為2%；其中該表面素之分子量為1022或1036Da；其中該表面素包含其化學異構物。(參見中華民國專利申請號097137532)。

其中該抗老化(或抗皺紋)化妝品組合物可進一步包含下列至少一者：醇類、酯類、複合多醣體、堅果油及維生素；其中該醇類係包括下列至少一者：C16-18醇、丁二醇、戊二醇、辛二醇、丙三醇、16醇、18醇、22醇及丙二醇；其中該酯類係包括下列至少一者：橄欖油鯨蠟醇酯(OLIVEM 1000)、單硬脂酸甘油酯(GSM)、十四酸異丙酯(IPM)、十六酸異丙酯(IPP)及三酸甘油酯；其中該複合多醣體係包括下列至少一者：漢生膠、銀耳多醣體、葡聚多醣體、狹葉番瀉籽多醣體；其中該堅果油係包括下列至少一者：阿甘油、夏威夷核果油、酪梨油、小麥胚芽油、橄欖油；其中該維生素係包括下列至少一者：維生素A、維生素B、維生素C、維生素E、維生素F、維生素K。

其中該抗老化(或抗皺紋)化妝品組合物係用以促進纖維母細胞之增殖、抗紫外光老化、抗氧化、促進sertuin 1基因的表現、促進膠原蛋白的增生和抑制基質金屬蛋白酶(Matrix metallopeptidase)；其中該基質金屬蛋白酶為基質金屬蛋白酶九型(Matrix metallopeptidase 9)。

本發明進一步提供一種以表面素(surfactin)製備增加皮膚穿透力之組合物的方法，其中該組合物係包含表面素及藥學上可接受之載劑、賦形劑、稀釋劑、輔劑等；其中該表面素為一種環脂胜肽，該表面素 包括連接至β羥基脂肪酸之七胜肽序(L)Glu-(L)Leu-(D)Leu-(L)Val-(L)Asp-(D)Leu-(L)Leu，該表面素在脂肪酸末端之脂肪酸分布如下：(1)異C13大於3%；(2)正C13大於0.65%；(3)異C14大於17%；(4)正C14少於41%；及(5)異C15少於11%；其中該脂肪酸末端之脂肪酸分布以下列分布為較佳：(1)異C13大於10%；(2)正C13大於25%；(3)異C14大於35%；(4)正C14少於25%；及(5)異C15少於3%；其中該脂肪酸末端之脂肪酸分布以下列分布為最佳：(1)異C 13為11%；(2)正C13為26%；(3)異C 14為37%；(4)正C14為24%；及(5)異C15為2%；其中該表面素之分子量為1022或1036Da；其中該表面素包含其化學異構物；其中該增加皮膚穿透力之組合物可進一步包含下列至少一者：醇類、酯類、複合多醣體、堅果油及維生素；其中該醇類係包括下列至少一者：C16-18醇、丁二醇、戊二醇、辛二醇、丙三醇、16醇、18醇、22醇及丙二醇；其中該酯類係包括下列至少一者：橄欖油鯨蠟醇酯(OLIVEM 1000)、單硬脂酸甘油酯(GSM)、十四酸異丙酯(IPM)、十六酸異丙酯(IPP)及三酸甘油酯；其中該複合多醣體係包括下列至少一者：漢生膠、銀耳多醣體、葡聚多醣體、狹葉番瀉籽多醣體；其中該堅果油係包括下列至少一者：阿甘油、夏威夷核果油、酪梨油、小麥胚芽油、橄欖油；其中該維生素係包括下列至少一者：維生素A、維生素B、維生素C、維生素E、維生素F、維生素K。。

其中該增加皮膚穿透力之組合物係用以促進化妝品原料穿透皮膚；其中該化妝品原料為皮質類固醇(dexamethasone)、玻尿酸(hyaluronic acid)、聚麩胺酸(Gamma-polyglutamic acid)和奈米金(gold-nanoparticles)。

本發明更提供一種以表面素(surfactin)製備乳化劑組合物的方法，其中該乳化劑組合物係包含表面素及藥學上可接受之載劑、賦形劑、稀釋劑、輔劑等；其中該表面素為一種環脂胜肽，該表面素包括連接至β羥基脂肪酸之七胜肽序(L)Glu-(L)Leu-(D)Leu-(L)Val-(L)Asp-(D)Leu-(L)Leu，該表面素在脂肪酸末端之脂肪酸分布如下：(1)異C13大於3%；(2)正C13大於0.65%；(3)異C14大於17%；(4)正C14少於41%；及(5)異C15少於11%；其中該脂肪酸末端之脂肪酸分布以下列分布為較佳：(1)異 C13大於10%；(2)正C13大於25%；(3)異C14大於35%；(4)正C14少於25%；及(5)異C15少於3%；其中該脂肪酸末端之脂肪酸分布以下列分布為最佳：(1)異C 13為11%；(2)正C13為26%；(3)異C 14為37%；(4)正C14為24%；及(5)異C15為2%；其中該表面素之分子量為1022或1036Da；其中該表面素包含其化學異構物；其中該乳化劑組合物可進一步包含下列至少一者：脂肪酸甘油酯、脂肪酸山梨醇酐酯、脂肪酸蔗糖酯、脂肪酸丙二醇酯、卵磷脂。

其中該乳化劑組合物係用以增加起泡力、增加乳化作用、增加滑順感；其中該乳化劑組合物係用以增加清潔用品的起泡力，該清潔用品係為洗髮精、洗面乳、洗手乳及沐浴精等；其中該乳化劑組合物係用以增加化妝品的乳化力，該化妝品係為身體乳、面霜、精華液、隔離霜等；其中該乳化劑組合物係用以增加清潔用品的滑順感，該清潔用品係為洗髮精、洗面乳、洗手乳及沐浴精等。

第1圖 不同濃度表面素對於小鼠胚胎纖維母細胞(BALB/3T3 clone A31 Mus musculus embryo fibroblast)之長壽基因(sertuin 1基因)mRNA表現的影響；將小鼠胚胎纖維母細胞培養於不同濃度的表面素(0、25、50、75、100μM)，培養時間為6、12、24、36、48小時。

第2圖 白藜蘆醇(Resveratrol)、五胜肽(Palmitoyl pentapeptide-3)及表面素對細胞增殖的影響；將小鼠胚胎纖維母細胞培養於不同濃度的表面素(0、25、50、75、100μM)、白藜蘆醇(0、5、10、20、30μM)和五胜肽(0、3、5、8、10μM)，培養時間為48小時。

第3圖 表面素抗光老化的作用；不同濃度之表面素對受過紫外光照射後之小鼠胚胎纖維母細胞之存活率的影響；細胞以5J/cm2、10J/cm2及15J/cm2之紫外光照射後，添加25、50、75、100及125μM濃度之表面素，培養24小時後，以MTT法測試細胞活存率。

第4圖 表面素對小鼠胚胎纖維母細胞之抗氧化壓力的保護效果；細胞以 100、150、200及250μM濃度的過氧化氫處理後，再添加0、25、50、75及100μM濃度之表面素，培養24小時，然後以MTT法測試細胞存活率。

第5圖 表面素與五胜肽對小鼠胚胎纖維母細胞之膠原蛋白含量(collagen dose)的影響；其中膠原蛋白含量是以Sircol collagen assay來測量；小鼠胚胎纖維母細胞是以不同濃度之表面素(0、25、50、75、100μM)和五胜肽(0、3、5、8、10μM)培養24小時；PBS：磷酸鹽緩衝溶液；a,b,ab,c,d代表若符號相同則沒有統計上之差異。

第6圖 表面素(SF)與五胜肽(PPP-3)對基質金屬蛋白酶(Matrix metallopeptidase 9)的抑制能力；基質金屬蛋白酶的量是以酵素免疫測定法(ELISA)來測量；小鼠胚胎纖維母細胞分別培養於不同濃度之五胜肽(0、3、5、8及10μM)與表面素(0、25、50、75及100μM)；a,b,c代表若符號相同則沒有統計上之差異。

第7圖 表面素促進皮膚吸收皮質類固醇的測試；實驗分成兩組，控制組以PBS(pH=7.4)100μl混合異硫氰酸(fluorescein isothiocyanate,FITC)標記之皮質類固醇(dexamethasone)，添加於1cm²無菌脫脂棉並以透氣貼布固定於小鼠背部；實驗組為以異硫氰酸標記之皮質類固醇添加0、0.2、0.5、1、2、5%的表面素來處理；實驗結果則以共軛焦顯微鏡觀偵測其螢光亮度；(A)~(F)圖依序為皮質類固醇添加0、0.2、0.5、1、2、5%表面素；SF：表面素。

第8圖 表面素促進皮膚吸收保濕因子玻尿酸(HA)的測試。實驗分成兩組，控制組以PBS(pH=7.4)100μl混合異硫氰酸(fluorescein isothiocyanate,FITC)標記之玻尿酸(hyaluronic acid)，添加於1cm²無菌脫脂棉，並以透氣貼布固定於小鼠背部。實驗組為以異硫氰酸標記之玻尿酸添加0、0.2、0.5、1、2、5%的表面素處理一小時；實驗結果則以共軛焦顯微鏡觀偵測其螢光亮度。(A)~(F)圖依序為玻尿酸添加0、0.2、0.5、1、2、5%的表面素；SF：表面素。

第9圖 表面素促進皮膚吸收保濕因子(γ-GPA)的測試；實驗分成兩組， 控制組以PBS(pH=7.4)100μl混合異硫氰酸(fluorescein isothiocyanate,FITC)標記之γ-GPA，添加於1cm²無菌脫脂棉並以透氣貼布固定於小鼠背部；實驗組以異硫氰酸標記之γ-GPA添加0、1%、2%、5%、10%、15%、20%之表面素處理一小時，實驗結果則以共軛焦顯微鏡觀偵測其螢光亮度；(A)~(G)圖依序為γ-GPA添加0、1%、2%、5%、10%、15%、20%的表面素。

第10圖 表面素具促進奈米金經皮膚吸收的效果；奈米金的量是以螢光顯微鏡來測量；綠色螢光代表奈米金的存在，混合有表面素之奈米金實驗組可以於小鼠(BALB/c)真皮層發現有較多的奈米金；綠色亮點為毛囊自體螢光(hair follicles autofluorescence)；SC surface：角質層(Stratum corneum)表面。

第11圖 表面素之乳化力分析；將不同濃度的表面素溶於pH為6.4、7.4及8.4的緩衝溶液中，取出2ml並添加3ml柴油於試管中，以震盪(vortex)2分鐘，於室溫下靜置24小時後，測量其乳化指數(emulsification index,E₂₄)。

第12圖 表面素之起泡力分析；將不同濃度粗純化表面素溶於pH為7.4的緩衝溶液中，以震盪(vortex)兩分鐘後靜置1小時後，測量其泡沫高度，並計算其最大起泡密度(foam maximum density,MD)。

第13圖 顯示的為表面素濃度和起泡高度之間的關係。

第14圖 表面素濃度與濁度(Turbidity %)之間的關係。

第15圖 稀釋於聚合物和界面活性劑複合物(polymer-surfactant complex)後，含有表面素的洗髮精會有沉澱的產生。

本發明係以下面的實施例予以示範闡明，但本發明不受下述實施例所限制。其中以下各實施例係以具有以下特徵之表面素來實施：該表面素為一種環脂胜肽，且該表面素包括連接至β羥基脂肪酸(beta-hydroxy fatty acid)(連結13~15個碳氫鏈)之七胜肽序(L)Glu-(L)Leu-(D)Leu-(L)Val-(L)Asp-(D)Leu-(L)Leu；其中該脂肪酸之異C14約為37%。

實施例一 表面素對人類皮膚及小鼠胚胎纖維母細胞之抗老 化試驗

實驗材料與方法

1. 實驗細胞株

Human skin fibroblast(CCD-966SK)購自BCRC生物資源保存及研究中心-編號：60153。

2. Mouse BALB/3T3 embryo(BALB/3T3 Clone A31)購自BCRC生物資源保存及研究中心-編號：60009。

3. 實驗動物

由國家實驗動物中心購得單一性別之BALB/cByJNarl品系小白鼠，體重約為200~250公克，飼養條件為人工光照每日12小時、濕度75%和溫度25℃，飼養於含空調設備之海洋大學生命科學動物房，並由專人照顧給予足夠的飼料及飲水。

4. 抗老化基因表現量測試

(1)人類及小鼠基因cDNA序列選殖

本實驗利用TRIzol reagent(Invitrogen,USA)抽取人類皮膚纖維母細胞及小鼠胚胎纖維母細胞之Total RNA，經RNA電泳分析後；利用反轉錄聚合酶連鎖反應(RT-PCR)進行人類皮膚纖維母細胞sirtuin 1、sirtuin 3及小鼠胚胎纖維母細胞sirtuin 1基因序列的選殖；並由基因資料庫(GeneBank)尋找已知之sirtuins基因序列，利用GCG program尋找相似性高的序列，設計一對引子(Primer)，進行聚合酶連鎖反應(Polymerase chain reaction，PCR)；再取一小部分反應產物經由1.2%膠體電泳分析，當出現與預期基因片段大小相符的產物時，將所剩下的產物經由低熔點瓊脂膠體電泳後，將所需膠體的產物由膠體上切下，進行膠體萃取以取得純化的特定大小DNA片段，此純化片段與選殖載體pGEM-T-easy vector(pGEM-T-easy cloning kit,Promega,USA)進行接合反應，再轉型入勝任細胞中；最後經由小量培養後，抽取選殖載體進行定序，將序列資料利用美國生物資訊中心(NCBI)網站之BLAST程式進行比對。經由 以上步驟選殖出正確的部分人類皮膚纖維母細胞sirtuin 1、sirtuin 3及小鼠胚胎纖維母細胞sirtuin 1 cDNA序列的選殖株後，將選殖株再次轉型入勝任細胞中複製，並抽取高純度質體保存，以便進行後續實驗。

(2)細胞Total RNA之萃取

RNA在自然環境中容易受到RNase的分解，所以實驗前必須將所用的器具以高溫滅菌，並在烘箱中烘乾。在操作過程中配戴手套及口罩。取欲進行實驗之細胞實驗組，迅速將800μL TRIzolTM reagent加入培養皿中，再將沖洗下來之細胞液放置於滅菌Tube中，加入所使用TRIzolTM reagent總體積1/5的氯仿(Chloroform)，強力搖晃30秒，於室溫下靜置15分鐘，再於4℃以13200rpm離心15分鐘，將上清液抽出至新的1.5mL微量離心管中。此時RNA會溶於上清液的水層中，將上清液吸入另一個乾淨的1.5mL微量離心管中，加入所使用TRIzolTM reagent體積1/2的異丙醇(Isopropanol)及高鹽溶液(1.2M Sodium Chloride及0.8M Sodium citrate)，均勻搖晃後於-20℃下靜置30分鐘，再於4℃以13200rpm離心15分鐘以沉澱RNA；小心的移除上清液，先加入800μL的100%絕對酒精搖晃沖洗後，於4℃以13200rpm離心10分鐘後，移除100%酒精。小心吸取並移除上清液，以55℃乾燥RNA沉澱物5分鐘。將沉澱物溶解在15μL DEPC水中。置於55℃下10分鐘以溶解RNA，最後儲存在-80℃冷凍冰櫃中備用。

(3)RNA濃度與純度的測量

以分光光度計測量OD260，計算RNA濃度的標準為1 OD260=40μg of RNA/mL，其公式40μg×dilute factor×A260=μg/mL。RNA純度以OD260/OD280的比值為依據，比值介於1.9~2.0之間為純度較高的RNA。

(4)反轉錄(Reverse Transcription，RT)

取5μg之Total RNA於200μL微量離心管中並以DEPC水將 總體積調整至13μL，加入1μL之oligo(dT)18、10mM dNTPs，置於冰上。再加入5×AMV buffer 4μl及AMV 1μl(40units/μL)，均勻混合，於42℃反應60分鐘以合成cDNA，再以70℃作用10分鐘以終止反應。

(5)聚合酶連鎖反應(Polymerase chain reaction，PCR)

將RT做好的cDNA模板(Template)，以Taq polymerase進行聚合酶連鎖反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)擴增分析。取1μL cDNA加入0.5μL的10mM dNTPs、2.5μl的10×PCR buffer、專一性引子(Gene specific primer，GSP)各0.5μL及0.25μL Taq polymerase，並加入二次滅菌水將總體積調整至25μL。將反應管置入PCR反應器(DNA thermal cycler；Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler)中，設定以下條件反應：94℃解離2分鐘；94℃解離30秒；64℃黏合30秒；72℃合成1分鐘；解離、黏合、合成步驟重複30個循環後保存在4℃下。取反應後的PCR產物5~15μL，以1.5%瓊脂膠體進行電泳分析，經溴化乙錠(EtBr)染色10分鐘後，以水退染約10分鐘，置於照相系統Digital Gel Image System擷取影像，並以UN-SCAN-IT gel-Gel Analysis Software Version 6.1定量分析。

(6)即時定量聚合酶連鎖反應(Real-time quantitative PCR)

利用螢光染劑SYBR green I可鑲嵌在DNA雙股凹槽上，經由鹵素燈激發而產生螢光的特性，偵測其螢光值的量。當SYBR green I沒有鑲嵌在雙股DNA上時，螢光背景值非常低；當SYBR green I開始鑲嵌在PCR放大的標的基因片段上時，螢光值訊號也會相對的提高。如無非特異性引子的結合，或Genomic DNA的污染等干擾影響，PCR反應合成標的基因的狀態可區分為的DNA合成為兩倍倍增的幾何級數倍增期(Geometric phase)，與反應物不足，基因合成非兩倍倍增的線性增加期(Linear phase)；以及最後反應物耗盡、失效，達反應終點的高原期(Plateau phase)。因此要偵測標的基因在組織器官的表現量， 必須在PCR反應的幾何級數倍增期定量才具有意義。Real-time quantitative PCR的原理就是利用不同濃度模板在相同PCR反應條件下，含有高濃度模板的反應會較快達到幾何級數倍增期，相對的低濃度的模板則較慢達到，將定義達到幾何級數倍增期中點的臨界PCR循環數目定為CT(Thresholdcycle)，也就是說CT值會隨模板濃度降低而升高。利用不同濃度標準品在同步定量PCR反應的CT值，由軟體計算繪製標準曲線與回歸公式，以內插法換算代測樣品內含有標的基因絕對表現量。同時若要得到Melting Curve，則在標的基因放大循環後進行melting temperature 40℃~99℃的連續螢光偵測，分析melting curve的結果可以瞭解引子是否會自行有互補的現象，或是引子的專一性，以更正確的幫助了解實驗定量的正確性。

將96 well PCR plate放置在4℃預冷的96 well PCR plate專用冰盒上，分別加入10μL SYBR green、各4μL之Real-time PCR專一性引子(表一)，最後加入2μL之RT產物作為PCR反應之模板，貼上96 well PCR plate專用膜後置於4℃離心機中以1500rpm離心3分鐘，將樣品離心至PCR plate底部。將PCR plate置入即時定量PCR反應器中(Roche lightcycler 480 Real time PCR)中，設定以下反應條件：熱啟動(Hot start)反應以95℃反應5分鐘；擴增反應(Amplification)以95℃解離30秒、60℃黏合30秒，進行40個循環；並連續偵測螢光值，以判斷擴增的產物是否皆為相同的解離溫度。完成反應後將反應數據以Roche軟體進行分析。實驗所得之數據，以SPSS軟體，運用單變量分析(One-way analysis of variance)，依Duncan’s Multiple Range Test比較各因子間顯著差異程度(p<0.05)，所得數據以平均值±標準偏差(Mean±SD)表示。

表一Real-time PCR專一性引子

結果表面素促進小鼠胚胎纖維母細胞之長壽基因(sertuin 1基因)表現和增殖

由第1圖可知，表面素可以促進小鼠胚胎纖維母細胞之長壽基因(sertuin 1基因)的表現；當給予小鼠胚胎纖維母細胞不同濃度之表面素時，不同濃度的表面素對於sertuin 1基因的表現，具有不同之效果；當給予小鼠胚胎纖維母細胞表面素6小時後，50μM、75μM的表面素具有促進sertuin 1基因表現之效果；當給予小鼠胚胎纖維母細胞表面素12小時後，25μM的表面素具有促進sertuin 1基因表現之效果；當給予小鼠胚胎纖維母細胞表面素36時後，50μM、100μM的表面素具有促進sertuin 1基因表現之效果；當給予小鼠胚胎纖維母細胞表面素48後，50μM的表面素具有促進sertuin 1基因表現之效果。其中50μM的表面素對於促進sertuin 1基因的表現，具有最好的效果。

第2圖為白藜蘆醇(Resveratrol)、五胜肽(Palmitoyl pentapeptide-3)及表面素對小鼠胚胎纖維母細胞之增殖的影響；由第2圖可以得知表面素具有促進小鼠胚胎纖維母細胞增殖的效果，且以75μM的表面素促進細胞增殖 的效果最佳，50μM的表面素促進細胞增殖的效果次佳。另，表面素促進細胞增殖的效果亦較白藜蘆醇和五胜肽佳。

實施例二 表面素具有抗光老化與抗氧化作用

1. 表面素具有抗光老化修護功能

將細胞分盤後，培養4小時使其固定於培養皿後，以UV-A波長之紫外線燈管作為光緊迫來源，於紫外光雜交箱中對實驗細胞照射其能量濃度為0J/cm²、10J/cm²及15J/cm²，照射後添加25、50、75、100及125μM濃度之表面素，培養24小時後，以MTT法測試細胞活存率。

由第3圖可知，表面素具有抗光老化修護功能；當給予小鼠胚胎纖維母細胞照射10J/cm²之紫外光後，25、50、75、100及125μM濃度之表面素皆具有增加細胞存活率的效果，且以75μM濃度之表面素效果最佳；當給予小鼠胚胎纖維母細胞照射15J/cm²之紫外光後，25、50、75、及100μM濃度之表面素皆具有增加細胞存活率的效果，且以50μM濃度之表面素效果最佳。

2. 表面素具有抗氧化修護功能

將小鼠胚胎纖維母細胞分盤後，培養4小時使其固定於培養皿後，以過氧化氫作為氧化緊迫來源；細胞以100、150、200及250μM濃度的過氧化氫處理後，再添加25、50、75及100μM濃度之表面素，培養24小時，然後以MTT法測試細胞活存率。

由第4圖可知，表面素可以增加以過氧化氫處理過之小鼠胚胎纖維母細胞的存活率。其中25、50、75μM濃度之表面素皆有良好之效果，而75μM濃度之表面素的效果最為顯著。

實施例三 表面素對小鼠胚胎纖維母細胞之膠原蛋白增長效果

1.膠原蛋白濃度分析

使用膠原蛋白濃度分析套組(Sircol^TM soluble collagen assay kit)分析培養基中膠原蛋白總濃度。分析方法簡述如下：

取待分析樣品與不同濃度之標準品0.1mL置於1.5mL離心管。加入1mL dye reagent，以震盪混合器振盪35min。離心12000rpm 10min，倒去上清液。小心的以吸水紙除去離心管邊緣的殘留液，勿碰觸沉澱物。加入1mL Alkali reagent溶解沉澱物，呈色穩定後取出0.2mL置入96孔盤，以ELISA reader讀取吸光值570nm。

2. 表面素具有增加小鼠胚胎纖維母細胞之膠原蛋白的效果

由第5圖可知，表面素可以增加小鼠胚胎纖維母細胞之膠原蛋白的增生；與給予磷酸鹽緩衝溶液(Phosphate buffered saline,PBS)培養之對照組相比較，25、50、75及100μM之表面素對於增加細胞內之膠原蛋白，皆有很好的效果，而其中以100μM的效果最佳。而五胜肽(Palmitoyl pentapeptide-3,PPP-3)亦能夠增加細胞內之膠原蛋白含量，但其效果與表面素相比較，表面素之效果似乎較好。

實施例四 表面素具有抑制基質金屬蛋白酶(Matrix metallopeptidase 9)的效果

1. 基質金屬蛋白酶(Matrix metallopeptidase 9)抑制效果測定

將小鼠胚胎纖維母細胞培養分盤後，加入商用活性抗皺物質3、5、8及10μM Palmitoyl pentapeptide-3)與加入25、50、75及100μM表面素進行比較，分析方式為以Abnova MMP-9(Mouse)ELISA Kit和ELISA Reader進行細胞中基質金屬蛋白酶九型的濃度分析。

2. 表面素具有抑制基質金屬蛋白酶的效果

由第6圖可知，50、75及100μM的表面素具有抑制基質金屬蛋白酶的效果；且以50μM的表面素抑制效果最佳。

實施例五 表面素促進化妝品原料皮膚穿透

1. 實驗方法

實驗進行前，先進行背部剃毛的動作。將6-8週小白鼠以麻醉劑舒泰(Zoletil)進行腹腔注射將麻醉，使動物躺平後，用電動剃毛刀輕柔地將背部的毛剃除，以脫毛膏去除剩餘體毛。並將動物安置在有保暖燈的籠子(cage)中，並且給予飲水照顧。實驗前，以舒泰(Zoletil)將小白鼠進行麻醉。實驗分成兩組，控制組以PBS(pH=7.4)100μl混合異硫氰酸(fluorescein isothiocyanate,FITC)標記之玻尿酸(hyaluronic acid)或皮質類固醇(dexamethasone)，添加於1cm²無菌脫脂棉並以透氣貼布固定於小鼠背部。實驗組則以玻尿酸或皮質類固醇各添加0.2、0.5、1、2、5% surfactin處理。

處理一小時後將小鼠以CO₂窒息法犧牲小鼠，以酒精將皮膚上殘留的藥品清理，剪下小鼠背部皮膚，以Optimum cutting temperature compound(O.C.T)(SAKURA®,Japen)包埋後進行冷凍切片(CM-2000,Leica,Germany)。

2. 表面素可促進皮質類固醇穿透皮膚

由第7圖可知，表面素可促進皮質類固醇穿透皮膚；藉由觀察螢光的強度，可以知道各實驗組中皮質類固醇穿透皮膚的量；螢光強度越強者，代表其穿透皮膚的皮質類固醇量越多；其中第7圖中之(B)、(C)、(D)、(E)可觀察到較對照組(A)多的螢光；也就是說，0.2、0.5、1、2%的表面素可以增加皮質類固醇穿透皮膚的量。

3. 表面素促進皮膚吸收保濕因子玻尿酸(HA)

由第8圖可知，表面素可促進皮膚吸收玻尿酸；螢光強度越強者，代表其穿透皮膚的玻尿酸量越多；其中以第8圖中之(A)所觀察到的螢光強度最強；意即1%的表面素促進皮膚吸收保濕因子玻尿酸的效果最佳。

4. 表面素促進皮膚吸收保濕因子聚麩胺酸(Gamma-polyglutamic acid,γ-GPA)

由第9圖可知，表面素可促進皮膚吸收保濕因子(γ-GPA)；螢光強度越強者，代表皮膚吸收的聚麩胺酸量越多；其中第9圖中之(B)、(C)、(D)、(E)、(F)、(G)皆可觀察到較對照組(A)多的螢光；也就是說，1、2、5、10、10、15、20%的表面素皆可以增加皮膚吸收聚麩胺酸的量。

5.表面素促進奈米金(gold-nanoparticles,2nm)經由皮膚的吸收

當我們使用奈米金與表面素混合塗抹於老鼠表皮後，經一段時間，摘取皮膚進行冷凍切片，由於奈米金可自行發光，因此可直接以光學顯微鏡觀察奈米金在皮膚表皮層與真皮層之螢光含量。結果顯示使用傳統工藝乳化得到的護膚品膏體，其內部結構為膠團狀或膠束狀，因此不利於皮膚吸收奈米金，奈米金僅在表皮層被發現。而於添加12.5ppm表面素後，可顯著促進奈米金經由皮膚吸收的效果(第10圖)。

由以上研究結果可知，本案表面素可以取代化學合成的界面活性劑，廣泛應用於經皮給藥系統。

實施例六 表面素乳化力分析

乳化指數為界面活性劑的重要指標之一，本發明參考Cooper等人所使用的方法，測量界面活性劑對柴油的乳化指數。將不同濃度粗純化表面素溶於pH為6.4、7.4及8.4的緩衝溶液中，取出2ml並添加3ml柴油於試管中，以震盪(vortex)2分鐘，於室溫下靜置24小時，測量乳化層高度與溶液總高度之比值乘上100%即為該待測液之乳化指數。油品乳化能力之大小以乳化指數(emulsification index,E₂₄)表示之，其中E₂₄的公式如下所列：

由第11圖可知表面素於pH=7.4時，具有較佳的乳化力，且當表面素於 pH=7.4和160μg/ml濃度時，具有最佳之乳化力。

實施例七 表面素可作為起泡劑

1. 起泡力分析

界面活性劑具有低起泡性的特性，本發明即為測試粗純化的表面素是否具起泡性。參考Razafindralambo等人所使用的方法，將不同濃度粗純化表面素溶於pH為7.4的緩衝溶液中，以震盪(vortex)兩分鐘後靜置1小時，測量其泡沫高度。起泡力以最大起泡密度(foam maximum density,MD)表示，將總液體高度除以最大起泡高度即可得到最大起泡密度。

2. 表面素可作為起泡劑

表面素具有許多生物特性，包含一般界面活性劑皆有的起泡及乳化能力(Razafindralambo et al.,1998)。所謂起泡現象是指，表面素會存在於氣相及液相的界面中，劇烈搖晃使界面活性劑將空氣抓下，形成內含空氣的薄膜(Halling,1981)。本發明測試Bacillus subtilis TH生產的表面素是否具有起泡之活性，結果顯示加入大於150μg的表面素於緩衝液中，MD值沒有明顯下降，最低MD值為1.23(見第12圖)；推測可能是添加於去離子水中的表面素濃度已達臨界微胞濃度(Critical micelle concentration,CMC)，表面素形成微胞狀，只剩下單體在溶液中作用。第13圖顯示的為表面素濃度和起泡高度之間的關係。Razafindralambo等人指出，表面素最低MD值可達0.10，和伊枯草菌素相比，表面素具有較優異的起泡效果，推測是和兩者之間的結構有關係，表面素屬於陰離子界面活性劑，且其脂肪酸碳鏈較短，而伊枯草桿菌素則為非離子界面活性劑，脂肪酸碳鏈較長(Razafindralambo et al.,1998)。Bacillus subtilis TH生產的表面素具有起泡能力，可當應用於清潔劑、洗髮精、洗手乳等個人保養品。

實施例八 表面素作為滑順劑

表面素於沖洗時會表現出色的滑順感(Flushing will show good sense of smooth)，而在低濃度的情況下，會產生液滴(corecervate)現象。

1. 表面素可降低濁度

(1)把洗髮精的相對濃度調整為0.01-1.0相對濃度=洗髮精原液(g)/(洗髮精原液(g)+水(g))

(2)測定(1)溶液420ml中的透過率(%、温度40℃)、簡單地表示它的濁度(Turbidity)(%)=100-透過率(%)

由第14圖可知，與清潔用品中常用的乳化劑-月桂醇聚醚硫酸酯鈉鹽(sodium laureth sulfate)相比較，本案之表面素更能夠降低洗髮精的濁度，意即增加洗髮精的滑順感。

2. 表面素會產生液滴(corecervate)現象

表面素於沖洗時會表現出色的滑順感(sense of smooth)，而在低濃度的情況下，會產生液滴(corecervate)現象。

由第15圖可以知道，在稀釋於聚合物和界面活性劑複合物(polymer-surfactant complex)後-意即液滴(corecervate)現象，含有表面素的洗髮精會有沉澱的產生；因此而減少了摩擦感(friction sensitivity)，增加滑順感(sense of smooth)。

上述實施例及圖式僅為本發明之較佳實施例而已，當不能以之限定本發明實施之範圍，即大凡依本發明申請專利範圍所作之均等變化與修飾，皆應屬本發明專利涵蓋之範圍內。

<110> 優茂國際股份有限公司

<120> 表面素於化妝品上之應用

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 枯草桿菌(Bacillus subtilus)

<400> 1(L)Glu-(L)Leu-(D)Leu-(L)Val-(L)Asp-(D)Leu-(L)Leu 7

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Mouse RSP 16-F

<400> 2

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Mouse RSP 16-R

<400> 3

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Mouse SIT1-F

<400> 4

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Mouse SIT1-R

<400> 5

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Human-GAPDH-F

<400> 6

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Human-GAPDH-R

<400> 7

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Human-SIT1-F

<400> 8

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Human-SIT1-R

<400> 9

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Human-SIT3-F

<400> 10

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Human-SIT3-R

<400> 11

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> T7

<400> 12

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SP6*

<400> 13

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Oligo d(T)*

<400> 14

Claims (43)

1. 一種以表面素(surfactin)製備抗老化化妝品組合物的方法，其中該組合物係包含表面素及藥學上可接受之載劑、賦形劑、稀釋劑、輔劑等。
2. 如申請專利範圍第1項之以表面素製備抗老化化妝品組合物的方法，其中該表面素為一種環脂胜肽，該表面素包括連接至β羥基脂肪酸之七胜肽序列(L)Glu-(L)Leu-(D)Leu-(L)Val-(L)Asp-(D)Leu-(L)Leu，該表面素在脂肪酸末端之脂肪酸分布如下：(1)異C13大於3%；(2)正C13大於0.65%；(3)異C14大於17%；(4)正C14少於41%；及(5)異C15少於11%。
3. 如申請專利範圍第2項之以表面素製備抗老化化妝品組合物的方法，其中該脂肪酸末端之脂肪酸分布如下：(1)異C13大於10%；(2)正C13大於25%；(3)異C14大於35%；(4)正C14少於25%；及(5)異C15少於3%。
4. 如申請專利範圍第3項之以表面素製備抗老化化妝品組合物的方法，其中該脂肪酸末端之脂肪酸分布如下：(1)異C 13為11%；(2)正C13為26%；(3)異C 14為37%；(4)正C14為24%；及(5)異C15為2%。
5. 如申請專利範圍第1項之以表面素製備抗老化化妝品組合物的方法，其中該表面素之分子量為1022或1036Da。
6. 如申請專利範圍第1項之以表面素製備抗老化化妝品組合物的方法，其中該表面素包含其化學異構物。
7. 如申請專利範圍第1項之以表面素製備抗老化化妝品組合物的方法，其中該抗老化化妝品組合物可進一步包含下列至少一者：醇類、酯類、複合多醣體、堅果油及維生素。
8. 如申請專利範圍第7項之以表面素製備抗老化化妝品組合物的方法，其中該醇類係包括下列至少一者：C16-18醇、丁二醇、戊二醇、辛二醇、丙三醇、16醇、18醇、22醇及丙二醇。
9. 如申請專利範圍第7項之以表面素製備抗老化化妝品組合物的方法，其中該酯類係包括下列至少一者：橄欖油鯨蠟醇酯(OLIVEM 1000)、單硬脂酸甘油酯(GSM)、十四酸異丙酯(IPM)、十六酸異丙酯(IPP)及三酸甘油酯。
10. 如申請專利範圍第7項之以表面素製備抗老化化妝品組合物的方法，其中該複合多醣體係包括下列至少一者：漢生膠、銀耳多醣體、葡聚多醣體、狹葉番瀉籽多醣體。
11. 如申請專利範圍第7項之以表面素製備抗老化化妝品組合物的方法，其中該堅果油係包括下列至少一者：阿甘油、夏威夷核果油、酪梨油、小麥胚芽油、橄欖油。
12. 如申請專利範圍第7項之以表面素製備抗老化化妝品組合物的方法，其中該維生素係包括下列至少一者：維生素A、維生素B、維生素C、 維生素E、維生素F、維生素K。
13. 如申請專利範圍第1項之以表面素製備抗老化化妝品組合物的方法，其中該抗老化化妝品組合物係用以促進纖維母細胞之增殖、膠原蛋白的增生或sertuin 1基因的表現。
14. 如申請專利範圍第1項之以表面素製備抗老化化妝品組合物的方法，其中該抗老化化妝品組合物係用以抗紫外光老化或抗氧化。
15. 如申請專利範圍第1項之以表面素製備抗老化化妝品組合物的方法，其中該抗老化化妝品組合物係用以抑制基質金屬蛋白酶(Matrix metallopeptidase)。
16. 如申請專利範圍第15項之以表面素製備抗老化化妝品組合物的方法，其中該基質金屬蛋白酶為基質金屬蛋白酶九型(Matrix metallopeptidase 9)。
17. 一種以表面素(surfactin)製備增加皮膚穿透力之組合物的方法，其中該組合物係包含表面素及藥學上可接受之載劑、賦形劑、稀釋劑、輔劑等。
18. 如申請專利範圍第17項之以表面素製備增加皮膚穿透力之組合物的方法，其中該表面素為一種環脂胜肽，該表面素包括連接至β羥基脂肪酸之七胜肽序列(L)Glu-(L)Leu-(D)Leu-(L)Val-(L)Asp-(D)Leu-(L)Leu，該表面素在脂肪酸末端之脂肪酸分布如下：(1)異C13大於3%；(2)正C13大於0.65%；(6)異C14大於17%；(7)正C14少於41%；及 (8)異C15少於11%。
19. 如申請專利範圍第18項之以表面素製備增加皮膚穿透力之組合物的方法，其中該脂肪酸末端之脂肪酸分布如下：(1)異C13大於10%；(2)正C13大於25%；(3)異C14大於35%；(4)正C14少於25%；及(5)異C15少於3%。
20. 如申請專利範圍第19項之以表面素製備增加皮膚穿透力之組合物的方法，其中該脂肪酸末端之脂肪酸分布如下：(1)異C 13為11%；(2)正C13為26%；(3)異C 14為37%；(4)正C14為24%；及(5)異C15為2%。
21. 如申請專利範圍第17項之以表面素製備增加皮膚穿透力之組合物的方法，其中該表面素之分子量為1022或1036Da。
22. 如申請專利範圍第17項之以表面素製備增加皮膚穿透力之組合物的方法，其中該表面素包含其化學異構物。
23. 如申請專利範圍第17項之以表面素製備增加皮膚穿透力之組合物的方法，其中該增加皮膚穿透力之組合物可進一步包含下列至少一者：醇類、酯類、複合多醣體、堅果油及維生素。
24. 如申請專利範圍第23項之以表面素製備增加皮膚穿透力之組合物的方法，其中該醇類係包括下列至少一者：C16-18醇、丁二醇、戊二醇、辛二醇、丙三醇、16醇、18醇、22醇及丙二醇。
25. 如申請專利範圍第23項之以表面素製備增加皮膚穿透力之組合物的方法，其中該酯類係包括下列至少一者：橄欖油鯨蠟醇酯(OLIVEM 1000)、單硬脂酸甘油酯(GSM)、十四酸異丙酯(IPM)、十六酸異丙酯(IPP)及三酸甘油酯。
26. 如申請專利範圍第23項之以表面素製備增加皮膚穿透力之組合物的方法，其中該複合多醣體係包括下列至少一者：漢生膠、銀耳多醣體、葡聚多醣體、狹葉番瀉籽多醣體。
27. 如申請專利範圍第23項之以表面素製備增加皮膚穿透力之組合物的方法，其中該堅果油係包括下列至少一者：阿甘油、夏威夷核果油、酪梨油、小麥胚芽油、橄欖油。
28. 如申請專利範圍第23項之以表面素製備增加皮膚穿透力之組合物的方法，其中該維生素係包括下列至少一者：維生素A、維生素B、維生素C、維生素E、維生素F、維生素K。
29. 如申請專利範圍第17項之以表面素製備增加皮膚穿透力之組合物的方法，其中該組合物係用以促進化妝品原料穿透皮膚。
30. 如申請專利範圍第29項之以表面素製備增加皮膚穿透力之組合物的方法，其中該化妝品原料為皮質類固醇(dexamethasone)。
31. 如申請專利範圍第29項之以表面素製備增加皮膚穿透力之組合物的方法，其中該化妝品原料為玻尿酸(hyaluronic acid)。
32. 如申請專利範圍第29項之以表面素製備增加皮膚穿透力之組合物的方法，其中該化妝品原料為聚麩胺酸(Gamma-polyglutamic acid)。
33. 如申請專利範圍第29項之以表面素製備增加皮膚穿透力之組合物的方 法，其中該化妝品原料為奈米金(gold-nanoparticles)。
34. 一種以表面素(surfactin)製備乳化劑組合物的方法，其中該組合物係包含表面素及藥學上可接受之載劑、賦形劑、稀釋劑、輔劑等。
35. 如申請專利範圍第34項之以表面素製備乳化劑組合物的方法，其中該表面素為一種環脂胜肽，該表面素包括連接至β羥基脂肪酸之七胜肽序列(L)Glu-(L)Leu-(D)Leu-(L)Val-(L)Asp-(D)Leu-(L)Leu，該表面素在脂肪酸末端之脂肪酸分布如下：(1)異C13大於3%；(2)正C13大於0.65%；(9)異C14大於17%；(10)正C14少於41%；及(11)異C15少於11%。
36. 如申請專利範圍第35項之以表面素製備乳化劑組合物的方法，其中該脂肪酸末端之脂肪酸分布如下：(1)異C13大於10%；(2)正C13大於25%；(3)異C14大於35%；(4)正C14少於25%；及(5)異C15少於3%。
37. 如申請專利範圍第36項之以表面素製備乳化劑組合物的方法，其中該脂肪酸末端之脂肪酸分布如下：(1)異C 13為11%；(2)正C13為26%；(3)異C 14為37%；(4)正C14為24%；及(5)異C15為2%。
38. 如申請專利範圍第34項之以表面素製備乳化劑組合物的方法，其中該表面素之分子量為1022或1036Da。
39. 如申請專利範圍第34項之以表面素製備乳化劑組合物的方法，其中該表面素包含其化學異構物。
40. 如申請專利範圍第34項之以表面素製備乳化劑組合物的方法，其中該乳化劑組合物可進一步包含下列至少一者：脂肪酸甘油酯、脂肪酸山梨醇酐酯、脂肪酸蔗糖酯、脂肪酸丙二醇酯、卵磷脂。
41. 如申請專利範圍第34項之以表面素製備乳化劑組合物的方法，其中該乳化劑組合物係用以增加起泡力。
42. 如申請專利範圍第34項之以表面素製備乳化劑組合物的方法，其中該乳化劑組合物係用以增加乳化作用。
43. 如申請專利範圍第34項之以表面素製備乳化劑組合物的方法，其中該乳化劑組合物係用以增加滑順感。