WO2021206155A1 - 共重合ポリヒドロキシアルカン酸混合物の製造方法、及び形質転換微生物 - Google Patents

共重合ポリヒドロキシアルカン酸混合物の製造方法、及び形質転換微生物 Download PDF

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WO2021206155A1
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polyhydroxyalkanoic
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尚志 有川
俊輔 佐藤
祥 古舘
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株式会社カネカ
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    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01017—Enoyl-CoA hydratase (4.2.1.17), i.e. crotonase

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a copolymerized polyhydroxyalkanoic acid mixture and a transformed microorganism.
  • PHA Polyhydroxyalkanoic acid
  • PHA is a polyester-type organic polymer produced by a wide range of microorganisms.
  • PHA is a biodegradable thermoplastic polymer and can be produced from renewable resources as a raw material. For these reasons, attempts have been made to industrially produce PHA as an environment-friendly material or a biocompatible material and use it in various industries.
  • PHA poly-3-hydroxybutyric acid
  • 3HB 3-hydroxybutyric acid
  • P (3HB) poly-3-hydroxybutyric acid
  • 3HB 3-hydroxybutyric acid
  • P (3HB) is a thermoplastic polymer and is attracting attention as an environmentally friendly plastic because it is biologically decomposed in the natural environment.
  • P (3HB) has a hard and brittle property due to its high crystallinity, and its practical application range is limited. In order to expand the range of application, it was necessary to impart flexibility to P (3HB).
  • P (3HB-co-3HV) a copolymerized PHA (hereinafter referred to as "P (3HB-co-3HV)”) composed of 3HB and 3-hydroxyvaleric acid (hereinafter referred to as "3HV”) and a method for producing the same have been developed.
  • P (3HB-co-3HV) is more flexible than P (3HB)
  • the change in physical properties is small, and it is particularly required for processing into films, sheets, soft packaging containers and the like. Since it does not improve its flexibility as much, it is used only in a limited field of hard molded products such as shampoo bottles and handles for disposable razors.
  • P (3HB-co-3HH) a copolymerized polyhydroxyalkanoic acid (hereinafter referred to as "P (3HB-co-3HH)”) composed of 3HB and 3-hydroxyhexanoic acid (hereinafter referred to as "3HH”) shall be described.
  • P (3HB-co-3HH) is fermented and produced using a wild strain of Aeromonas caviae isolated from soil and using fatty acids such as oleic acid and palmitic acid as a carbon source. ..
  • P (3HB-co-3HH) is produced from vegetable fats and oils as a raw material, and the 3HH composition ratio of the P (3HB-co-3HH) is improved to a maximum of about 14 mol% (Patent Document 5, Patent Document 5, See Patent Document 6 and Non-Patent Document 1).
  • a gene encoding a ⁇ -ketothiolase enzyme having a thiolysis activity against ⁇ -ketoacyl-CoA having 6 carbon atoms that is, ⁇ -ketohexanoyl-CoA
  • Capriavidus necator having a PHA synthase derived from Aeromonas cavier having a PHA synthase derived from Aeromonas cavier.
  • the 3HH composition ratio of P (3HB-co-3HH) was improved to 20 mol% or more by suppressing the expression of P (3HB-co-3HH) (see Patent Document 7).
  • Non-Patent Document 2 Aeromonas cabier is cultivated using a fatty acid having 12 or more carbon atoms as the sole carbon source to ferment and produce P (3HB-co-3HH) having various 3HH composition ratios. Since the crystallinity of P (3HB-co-3HH) decreases as the 3HH composition ratio increases, the hard and brittle property such as P (3HB) gradually exhibits a flexible property, and the 3HH composition ratio becomes higher. It was revealed that the higher the value, the greater the flexibility of P (3HB-co-3HV). That is, P (3HB-co-3HH) can have a wide range of physical properties applicable from hard polymers to soft polymers by changing the 3HH composition ratio, and therefore can be expected to be applied to a wide range of fields.
  • the melting point of the low melting point component exceeds 100 ° C., so that the PHA mixture is It is presumed that the PHA component having a high 3HH composition ratio of 20 mol% or more is not contained, and the mechanical properties such as tear strength are not sufficient, and there is room for improvement.
  • an object of the present invention is to provide a method for producing a copolymerized polyhydroxyalkanoic acid having both excellent processability and mechanical properties.
  • the present inventor cultivates microorganisms to produce a copolymerized polyhydroxyalkanoic acid mixture containing two kinds of polyhydroxyalkanoic acid fractions having a specific composition. As a result, they have found that a copolymerized polyhydroxyalkanoic acid mixture having both excellent processability and mechanical properties can be obtained, and have completed the present invention.
  • the present invention is a method for producing a copolymerized polyhydroxyalkanoic acid mixture, which comprises a step of culturing a microorganism producing the copolymerized polyhydroxyalkanoic acid mixture, wherein the copolymerized polyhydroxyalkanoic acid mixture is 3 Polyhydroxyalkanoic acid fraction (I) containing a copolymerized polyhydroxyalkanoic acid having a -hydroxybutyric acid structural unit and a 3-hydroxyhexanoic acid structural unit and having an average 3-hydroxyhexanoic acid composition ratio of 20 mol% or more.
  • the copolymerized polyhydroxyalkanoic acid mixture relates to a production method in which the average 3-hydroxyhexanoic acid composition ratio is 22 mol% or less.
  • the weight ratio of the polyhydroxyalkanoic acid fraction (I) in the copolymerized polyhydroxyalkanoic acid mixture is 10 to 90%.
  • the copolymerized polyhydroxyalkanoic acid mixture has an average 3-hydroxycaproic acid composition ratio of 10 to 22 mol%.
  • the microorganism has a gene encoding two types of polyhydroxyalkanoic acid synthases having different polymerization activities for 3-hydroxyhexanoyl-CoA.
  • the amino acid sequences of the two types of polyhydroxyalkanoic acid synthases having different polymerization activities for 3-hydroxyhexanoyl-CoA have a sequence identity of 90% or less.
  • the gene encoding the two types of polyhydroxyalkanoic acid synthases having different polymerization activities for 3-hydroxyhexanoyl-CoA is a wild type derived from Aeromonas cavier having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • a gene (A) encoding a polyhydroxyalkanoic acid synthase having a higher polymerization activity for 3-hydroxyhexanoyl-CoA than the polyhydroxyalkanoic acid synthase, and wild-type polyhydroxyalkanoic acid synthesis derived from the Aeromonas cavier. It is a gene (B) encoding a polyhydroxyalkanoic acid synthase having a lower polymerization activity for 3-hydroxyhexanoyl-CoA than the enzyme.
  • the gene (A) is a polyhydroxyalkanoic acid synthase gene derived from a microorganism of the genus Aeromonas or a mutant thereof.
  • the gene (A) is a gene encoding an amino acid sequence having 99.5 to 100% sequence identity with respect to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
  • the gene (B) is composed of a part of a polyhydroxyalkanoic acid synthase gene derived from a microorganism of the genus Aeromonas and a part of a polyhydroxyalkanoic acid synthase gene derived from a microorganism of the genus Cupriavidus. It was done. More preferably, the gene (B) is a gene encoding an amino acid sequence having 90 to 100% sequence identity with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • the gene (B) is a polyhydroxyalkanoic acid synthase gene derived from a microorganism of the genus Chromobacterium or a mutant thereof. More preferably, the gene (B) is a gene encoding an amino acid sequence having 90 to 100% sequence identity with respect to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5. Preferably, the gene (B) is a polyhydroxyalkanoic acid synthase gene derived from a microorganism of the genus Bacillus or a mutant thereof.
  • the gene (B) is a gene encoding an amino acid sequence having 90 to 100% sequence identity with respect to the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8.
  • the microorganism is a transformed microorganism that has been transformed to increase the supply of 3-hydroxyhexanoyl-CoA for intracellular polyhydroxyalkanoic acid synthase as compared to the wild strain of the microorganism. .. More preferably, the transformed microorganism is transformed so as to suppress the decomposition of intermediate metabolites having 6 carbon atoms in ⁇ -oxidation of fats and oils or fatty acids.
  • the transformed microorganism is transformed so as to suppress the expression of a gene encoding a ⁇ -ketothiolase enzyme having thiolytic activity against ⁇ -ketohexanoyl-CoA, which is ⁇ -ketoacyl-CoA having 6 carbon atoms. It is a thing.
  • the ⁇ -ketothiolase enzyme has an amino acid sequence that exhibits 90-100% sequence identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10.
  • the microorganism is a microorganism having a gene encoding a protein exhibiting R-form-specific enoyl-CoA hydratase activity.
  • a carbon source containing fats and oils or fatty acids is added. More preferably, the carbon source containing the fat or fatty acid is a medium-chain fatty acid having 6 to 12 carbon atoms, or a carbon source containing a glyceride of the medium-chain fatty acid. More preferably, the medium-chain fatty acid is caproic acid.
  • the microorganism belongs to the genus Cupriavidus or is a transformant of a microorganism of the genus Cupriavidus. More preferably, the microorganism is cupriavidus necator or a transformant of cupriavidus necator.
  • the present invention also has a gene encoding two types of polyhydroxyalkanoic acid synthases, which are transformed microorganisms that produce a copolymerized polyhydroxyalkanoic acid mixture and have different polymerization activities for 3-hydroxyhexanoyl-CoA.
  • polyhydroxyalkanoic acid synthases which are transformed microorganisms that produce a copolymerized polyhydroxyalkanoic acid mixture and have different polymerization activities for 3-hydroxyhexanoyl-CoA.
  • it has been transformed so that the supply of 3-hydroxyhexanoyl-CoA for the intracellular polyhydroxyalkanoic acid synthase is increased as compared with the wild strain of the transformed microorganism, and the copolymerized polyhydroxyalkane.
  • the copolymerized polyhydroxyalkanoic acid mixture also relates to a transforming microorganism having an average 3-hydroxyhexanoic acid composition ratio of 22 mol% or less.
  • the present invention it is possible to produce a copolymerized polyhydroxyalkanoic acid mixture having both excellent processability and mechanical properties.
  • the copolymerized polyhydroxyalkanoic acid mixture produced is easy to handle and can be easily industrially isolated and purified from microorganisms.
  • the present invention is a method for producing a copolymerized PHA mixture, which comprises a step of culturing a microorganism producing the copolymerized PHA mixture.
  • the copolymerized PHA mixture contains a copolymerized PHA having 3HB structural units and 3HH structural units, and contains a PHA fraction (I) having an average 3HH composition ratio of 20 mol% or more, and a PHA having 3HB structural units. It is composed of PHA fraction (II) having an average 3HH composition ratio of 0 mol% or more and 15 mol% or less.
  • the copolymerized PHA mixture can be fractionated into the PHA fraction (I) and the PHA fraction (II) by the MIBK fractionation method described later.
  • the PHA fraction (I) is a fraction containing a copolymerized PHA having at least 3HB structural units and 3HH structural units, and may include PHA containing hydroxyalkanoic acid structural units other than 3HB structural units and 3HH structural units. However, preferably, a fraction containing a copolymerized PHA which does not contain a hydroxyalkanoic acid structural unit other than the 3HB structural unit and the 3HH structural unit and has only the 3HB structural unit and the 3HH structural unit, that is, P (3HB-co-3HH). It is a fraction including.
  • the hydroxyalkanoic acid structural units other than the 3HB structural unit and the 3HH structural unit include 3-hydroxypropionic acid, 3HV, 3-hydroxyalkanoic acid having 7 to 16 carbon atoms, 2-hydroxyalkanoic acid having 4 to 16 carbon atoms, and 4 Structural units of hydroxyalkanoic acids such as-hydroxyalkanoic acid (eg 4-hydroxybutyric acid), 5-hydroxyalkanoic acid, 6-hydroxyalkanoic acid (eg 6-hydroxyhexanoic acid), lactic acid include, but are not limited to. ..
  • the average 3HH composition ratio in the PHA fraction (I) is 20 mol% or more, preferably 22 mol% or more, and more preferably 24 mol% or more.
  • the upper limit of the average 3HH composition ratio is not particularly limited, but is preferably 35 mol% or less, more preferably 32 mol% or less, and particularly preferably 30 mol% or less.
  • the PHA fraction (II) is a fraction containing PHA having a 3HB structural unit.
  • the PHA contained in the PHA fraction (II) may be a homopolymer having only 3HB structural units, or a copolymerized PHA having 3HB structural units and other hydroxyalkanoic acid structural units. .. Considering the mechanical properties, a copolymerized PHA having a 3HB structural unit and a hydroxyalkanoic acid structural unit other than this is preferable.
  • copolymerized PHA a copolymerized PHA having a 3HB structural unit and a 3HV structural unit and / or a 3HH structural unit is preferable, and a copolymerized PHA having a 3HB structural unit and a 3HH structural unit is more preferable.
  • Copolymerized PHA having only 3HH structural units, i.e. P (3HB-co-3HH) is more preferred.
  • the average 3HH composition ratio in the PHA fraction (II) is 0 mol% or more and 15 mol% or less.
  • the lower limit of the average 3HH composition ratio is preferably 0.1 mol% or more, more preferably 1 mol% or more, further preferably 2 mol% or more, still more preferably 3 mol% or more.
  • the upper limit of the average 3HH composition ratio is preferably 12 mol% or less, more preferably 10 mol% or less.
  • the weight ratio of the PHA fraction (I) in the copolymerized PHA mixture is preferably 10% to 90%, more preferably 20% to 80%, and particularly preferably 30% to 70%.
  • the weight ratio of the PHA fraction (II) in the copolymerized PHA mixture is preferably 10% to 90%, more preferably 20% to 80%, and particularly preferably 30% to 70%.
  • the average 3HH composition ratio shown by the entire copolymerized PHA mixture is 22 mol% or less.
  • the adhesiveness of the copolymerized PHA mixture becomes high, and unintended formation of agglomerates or formation of agglomerates in the isolation and purification steps of the copolymerized PHA mixture after fermentation and production by microorganisms may occur. Problems such as adhesion or blockage in piping or pump equipment are less likely to occur, and industrial isolation and purification of copolymerized PHA mixtures tends to be difficult.
  • the average 3HH composition ratio of the entire copolymerized PHA mixture is preferably 10 to 22 mol%. , 11-20 mol% is more preferred, 12-18 mol% is even more preferred, and 13-17 mol% is particularly preferred.
  • the copolymerized PHA mixture has a PHA fraction (I) having a high average 3HH composition ratio and a PHA fraction having a low average 3HH composition ratio by a solvent fractionation method utilizing the difference in solubility in methyl isobutyl ketone (MIBK). It can be fractionated into (II).
  • MIBK methyl isobutyl ketone
  • the specific fractionation procedure is described below. First, about 100 mg of the copolymerized PHA mixture is measured in a screw cap test tube, 10 ml of MIBK is added, and the cap is closed. Then, the mixture is heated at 140 ° C. with shaking for about 1 to 3 hours to completely dissolve the copolymerized PHA mixture. After complete dissolution, leave at 25 ° C. for 1 minute to lower the temperature below the boiling point, immediately transfer all the dissolved solutions to a centrifuge tube whose weight has been measured in advance, and close the cap. The capped centrifuge tube is left at 25 ° C. for 15 minutes to precipitate a part of the lysate.
  • the precipitate and the lysate are separated by centrifugation (9000 rpm, 5 minutes), and all the lysates are transferred to a pre-weighed aluminum cup.
  • 10 ml of MIBK is added to the centrifuge tube in which the precipitate remains, mixed with a vortex mixer, centrifuged again (9000 rpm, 5 minutes), and the solution is transferred to an aluminum cup containing the solution.
  • the aluminum cup is heated at 120 ° C. for 30 minutes to volatilize MIBK and precipitate the lysate. Further, the precipitate remaining in the aluminum cup and the precipitate remaining in the centrifuge tube are each vacuum dried at 100 ° C. for 6 hours.
  • the precipitate remaining in the aluminum cup is weighed as the PHA fraction (I), and the precipitate remaining in the centrifuge tube is weighed as the PHA fraction (II). It is confirmed that the difference between the total weight of the PHA fraction (I) and the PHA fraction (II) and the weight of the initially measured copolymerized PHA mixture is within ⁇ 3%.
  • the copolymerized PHA mixture preferably has the highest melting peak temperature of 130 ° C. or higher in the differential scanning calorimetry measured for this mixture. By satisfying this condition, the crystal solidification of the copolymerized PHA mixture can proceed in a short time, and the processability of the copolymerized PHA mixture can be improved.
  • the highest melting peak temperature is preferably 130 to 165 ° C, more preferably 130 to 155 ° C.
  • the highest melting peak temperature exhibited by the copolymerized PHA mixture is obtained by measuring about 2 mg of the copolymerized PHA mixture using a differential scanning calorimetry device and measuring the temperature from ⁇ 30 ° C. to 200 ° C. at a heating rate of 10 ° C./min. In the DSC curve obtained when the temperature is raised to, it is measured as the temperature of the melting peak on the highest temperature side.
  • the copolymerized PHA mixture may have another melting peak in a region lower than this peak, for example, having a melting peak at 100 ° C. or lower. May be.
  • the microorganism used in producing the copolymerized PHA mixture (hereinafter, also referred to as “copolymerized PHA mixture-producing microorganism”) is not particularly limited as long as it is a microorganism capable of fermentatively producing the copolymerized PHA mixture, and PHA is originally used. It may be a wild strain that accumulates in a microbial manner, a mutant strain obtained by artificially mutating such a wild strain, or a foreign PHA synthase gene introduced by a genetic engineering method. Therefore, it may be a strain to which PHA accumulation ability is imparted.
  • the recombinant PHA mixture-producing bacterium or when the bacterium is a transformant, the host of the transformant is not particularly limited, but for example, Ralstonia, Cupriavidus, and the like. Bacteria belonging to the genus Watersia, Aeromonas, Escherichia, Alcaligenes, Pseudomonas and the like are preferred examples.
  • a bacterium belonging to the genus Larstonia the genus Cupriavidus, the genus Aeromonas, the genus Woutersia, still more preferably a bacterium belonging to the genus Capriavidus or the genus Aeromonas, and even more preferably the genus Cupriavidus. It is a bacterium belonging to the above, and particularly preferably Cupriavidus necator.
  • the copolymerized PHA mixture-producing microorganism is a gene encoding two types of PHA synthases having different polymerization activities for 3-hydroxyhexanoyl-CoA so that two types of PHA having different average 3HH composition ratios can be efficiently produced. It is preferable that the microorganism has.
  • 3-Hydroxyhexanoyl-CoA is a precursor of the 3HH structural unit contained in PHA.
  • the mixture can be fermented and produced inside the cells of the microorganism.
  • the microorganism may have at least two genes encoding PHA synthases having different polymerization activities for 3-hydroxyhexanoyl-CoA, as long as the copolymerized PHA mixture can be fermentatively produced. It may have three or more kinds of genes.
  • the two types of PHA synthases having different polymerization activities for 3-hydroxyhexanoyl-CoA are not particularly limited, but the sequence identity of the amino acid sequences between the two types of PHA synthases is preferably 90% or less. .. It is more preferably 80% or less, still more preferably 70% or less. It is generally considered that PHA synthase functions by forming multimers such as dimers. If the sequence homology of the amino acid sequence between the two types of PHA synthases is higher than 90%, it is possible that the two types of PHA synthases form heterodimers and the like, and the copolymerized PHA mixture cannot be produced. Be done.
  • the combination of two types of PHA synthases having different polymerization activities for 3-hydroxyhexanoyl-CoA for example, wild-type PHA synthesis derived from Aeromonas cavier having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1
  • Examples thereof include a combination of genes (B) encoding a PHA synthase having low polymerization activity for CoA.
  • Examples of the gene (A) include a polyhydroxyalkanoic acid synthase gene derived from a microorganism of the genus Aeromonas or a variant thereof, and specifically, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 ( Examples thereof include a gene encoding an amino acid sequence having 90 to 100% sequence identity with respect to (amino acid sequence of PHA synthase variant derived from Aeromonas spp.).
  • the sequence identity is preferably 95% or more, more preferably 97% or more, particularly preferably 99% or more, and most preferably 99.5% or more.
  • the gene (B) was composed of a combination of a part of a polyhydroxyalkanoic acid synthase gene derived from a microorganism of the genus Aeromonas and a part of a polyhydroxyalkanoic acid synthase gene derived from a microorganism of the genus Capriavidas.
  • Examples include genes, and specific examples thereof include genes encoding amino acid sequences having 90 to 100% sequence identity with respect to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6.
  • a PHA synthase gene derived from a bacterium belonging to the genus Chromobacterium or a mutant thereof can also be mentioned, and specifically, 90 with respect to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5.
  • examples include genes encoding amino acid sequences having up to 100% sequence identity.
  • a PHA synthase gene derived from a bacterium of the genus Bacillus or a mutant thereof can also be mentioned, and specifically, 90 to 100 with respect to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8.
  • Examples include genes encoding amino acid sequences having% sequence identity.
  • the above-mentioned sequence identity of the gene (B) is preferably 95% or more, more preferably 97% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • the copolymerized PHA mixture-producing microorganism has a 3-hydroxyhexanoyl-for intracellular PHA synthase as compared with a wild strain of the microorganism. It is preferably a transformed microorganism that has been transformed to increase the supply of CoA. Specifically, transformed microorganisms transformed so as to suppress the decomposition of intermediate metabolites having 6 carbon atoms in ⁇ -oxidation of fats and oils or fatty acids are preferable.
  • Examples of the transformed microorganism transformed so as to suppress the decomposition of the intermediate metabolite having 6 carbon atoms in the ⁇ -oxidation of fats and oils or fatty acids include ⁇ -having 6 carbon atoms as described in Patent Document 7, for example.
  • Examples thereof include transformed microorganisms transformed so as to suppress the expression of a gene encoding a ⁇ -ketothiolase enzyme having thiolysis activity against ⁇ -ketohexanoyl-CoA, which is ketoacyl-CoA.
  • a ⁇ -ketothiolase enzyme having an amino acid sequence showing 90 to 100% sequence identity with respect to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10 is encoded.
  • Genes include, but are not limited to.
  • the sequence identity is preferably 95% or more, more preferably 97% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • a method of completely deleting the enzyme gene in a transformed microorganism for example, a method of completely deleting the enzyme gene in a transformed microorganism, or a completely different method such as a drug resistance gene inside the sequence of the enzyme gene.
  • examples thereof include a method of inserting a gene, a method of deleting, substituting, adding or inserting a part of a sequence of the enzyme gene (preferably a region related to enzyme activity).
  • the gene disruption operation includes, for example, a homologous recombination technique using a vector containing a disruption gene or a disruption DNA, a technique using a transposon, and the like.
  • a CRISPR / Cas for example, Cas9 system for disrupting a target gene or a genome editing technique using TALEN (Y. Wang et al., ACS Synth Biol. 2016, 5 (7): 721) -732; Bogdanove and Voicetas, Science, 333: 1843-1846, 2011; Jinek, et al., Science, 337: 816-821,202; Shalem, et al., Science, 343: 84-87, 2014; , Et al., Science, 343: 80-84, 2014) and the like.
  • TALEN Y. Wang et al., ACS Synth Biol. 2016, 5 (7): 721) -732; Bogdanove and Voicetas, Science, 333: 1843-1846, 2011; Jinek, et al., Science, 337: 816-821,202; Shalem, et al., Science, 343: 84-87, 2014; , Et al., Science, 3
  • the guide RNA has a sequence that can bind to a part of the base sequence of the ⁇ -ketothiolase gene to be destroyed, and has a role of transporting Cas9 to the target.
  • mutations such as deletion, substitution, addition, and insertion of the base sequence around the gene may reduce the transcription / translation efficiency of the gene and the stability of mRNA, thereby eliminating or reducing the enzyme activity. can.
  • the copolymerized PHA mixture-producing microorganism may be a microorganism having a gene encoding a protein exhibiting R-form-specific enoyl-CoA hydratase activity in order to efficiently produce a copolymerized PHA mixture having a high average 3HH composition ratio.
  • R-form-specific enoyl-CoA hydratase has the function of converting hexenoyl-CoA to 3-hydroxyhexanoyl-CoA in microbial cells.
  • the microorganism has a gene encoding a protein exhibiting R-form-specific enoyl-CoA hydratase activity, the amount of conversion to 3-hydroxyhexanoyl-CoA is increased, and as a result, the produced copolymerized PHA is increased. It is presumed that the average 3HH composition ratio exhibited by the mixture is increased.
  • the microorganism having a gene encoding a protein exhibiting R-form-specific enoyl-CoA hydratase activity may be a microorganism that originally has the gene, or the foreign gene has been introduced by a genetic engineering technique. It may be a microorganism.
  • Examples of the gene encoding the foreign R-form-specific enoyl-CoA hydratase activity include Aeromonas, which encodes the R-form-specific enoyl-CoA hydratase having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11.
  • Aeromonas which encodes the R-form-specific enoyl-CoA hydratase having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11.
  • a gene derived from caviae a gene derived from capriavidas necatol encoding an R-form-specific enoyl-CoA hydratase having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 13, and an enzyme having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14.
  • the Multifectional protein type 2 (MFE2) gene from Yarrowia lipolytica the MFE2 gene from Drosophylla melanogaster encoding the enzyme having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15, or each of the MFE2 genes set forth in SEQ ID NOs: 11 to 15.
  • the introduced gene may be present on a chromosome possessed by a host microorganism or on DNA such as a plasmid or a megaplasmid. From the viewpoint of retention of the transgene, it is preferably present on the chromosome or megaplasmid possessed by the microorganism, and more preferably on the chromosome possessed by the microorganism.
  • the expression level of the gene is increased by substituting, deleting or adding the base sequence upstream of the gene. You may.
  • a method of locally replacing or inserting an arbitrary DNA on a DNA possessed by a microorganism or a method of deleting an arbitrary site of a DNA possessed by a microorganism is well known to those skilled in the art, and the trait according to the present embodiment. It can be used in the production of converted microorganisms. Although not particularly limited, typical methods include a method utilizing a transposon and a homologous recombination mechanism (Ohman et al., J. Bacteriol., Vol. 162: p. 1068 (1985)), and a homologous recombination mechanism.
  • a method for easily isolating a microbial strain in which a gene has been lost by homologous recombination in the second step as a shoeclaus-added medium-resistant strain (Schweizer, Mol. Microbiol., Vol. 6, p. 1195 (1992); Lenz. Etc., J. Bacteriol., Vol. 176, p. 4385 (1994)) and the like.
  • the method for introducing the vector into cells is not particularly limited, and examples thereof include a calcium chloride method, an electroporation method, a polyethylene glycol method, and a spheroplast method.
  • the promoter for expressing the transgene is not particularly limited. Capriavidas necatol promoter of phaC1 gene, promoter of phaP1 gene, lac promoter derived from Escherichia coli, lacUV5 promoter, trc promoter, tic promoter, tac promoter, or artificially prepared modification from Escherichia coli shown by SEQ ID NO: 16.
  • a lacN17 promoter having a base sequence, an artificially prepared lacN19 promoter having a modified base sequence derived from Escherichia coli represented by SEQ ID NO: 17, and the like can be used.
  • the copolymerized PHA mixture By culturing the copolymerized PHA mixture-producing microorganism, the copolymerized PHA mixture can be accumulated in the microbial cells.
  • a conventional microbial culturing method can be followed, and the culturing may be carried out in a medium in which an appropriate carbon source is present.
  • the medium composition, carbon source addition method, culture scale, aeration and stirring conditions, culture temperature, culture time, and the like are not particularly limited.
  • the carbon source is preferably added to the medium continuously or intermittently.
  • any carbon source can be used as long as the above-mentioned copolymerized PHA mixture-producing microorganism can be assimilated.
  • sugars such as glucose, fructose, shoe cloth, and xylose; palm oil and palm kernel oil (including palm olein, palm double olein, palm kernel oil olein, etc., which are fractions having a low melting point separated from these).
  • copolymerized PHA mixture-producing microorganism can use gases such as carbon dioxide, carbon monoxide, methane, methanol and ethanol, and alcohols, these can also be used as a carbon source.
  • the carbon source preferably contains fats and oils or fatty acids.
  • the fat and oil vegetable oil or fractionated oil thereof is preferable.
  • the chain length of the fat or fatty acid is preferably short
  • the carbon source preferably contains a medium-chain fatty acid having 6 to 12 carbon atoms, or a glyceride of the medium-chain fatty acid, and the carbon source contains caproic acid. Is even more preferable.
  • the number of carbon atoms of the fatty acid contained in the carbon source is 6 to 12, the amount of intermediate metabolite having 6 carbon atoms produced in ⁇ -oxidation increases, and a PHA fraction having a high average 3HH composition ratio can be efficiently obtained. it is conceivable that.
  • the microorganism In the production of the copolymerized PHA mixture, it is preferable to culture the microorganism using a medium containing the carbon source, a nitrogen source which is a nutrient source other than the carbon source, inorganic salts, and other organic nutrient sources.
  • a nitrogen source which is a nutrient source other than the carbon source
  • inorganic salts and other organic nutrient sources.
  • the nitrogen source include, but are not limited to, ammonia; ammonium salts such as ammonium chloride, ammonium sulfate and ammonium phosphate; peptone, meat extract, yeast extract and the like.
  • the inorganic salts include potassium dihydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride and the like.
  • examples of other organic nutrient sources include amino acids such as glycine, alanine, serine, threonine and proline, and vitamins such as vitamin B1, vitamin
  • the copolymerized PHA mixture After culturing the copolymerized PHA mixture-producing microorganism for an appropriate time to accumulate the copolymerized PHA mixture in the microbial cells, the copolymerized PHA mixture is recovered using a well-known method.
  • the recovery method is not particularly limited, but industrially, recovery by separation / purification in an aqueous system having a low environmental load is preferable.
  • a cell crushing solution in which cell components other than PHA are dissolved in water by applying a mechanical shearing force or crushing cells using a surfactant, alkali, enzyme, or the like. can.
  • the copolymerized PHA mixture can be recovered by separating the copolymerized PHA mixture from the aqueous phase by filtration or centrifugation of the cell disruption solution and then drying the mixture.
  • the overall genetic manipulation can be performed as described in, for example, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).
  • enzymes used for genetic manipulation, cloning hosts, etc. can be purchased from market suppliers and used according to the explanation.
  • the enzyme is not particularly limited as long as it can be used for genetic manipulation.
  • Example 1 of microbial strain preparation Preparation of copolymerized PHA mixture-producing microbial strain (1) First, a plasmid for PHA synthase gene disruption was prepared. The production was carried out as follows. By PCR using synthetic oligo DNA, DNA fragments (SEQ ID NO: 18) having base sequences upstream and downstream from the phaC1 structural gene (PHA synthase gene) of Cupriavidus necator H16 strain were obtained.
  • This DNA fragment was digested with the restriction enzyme SwaI, and the obtained DNA fragment was digested with SwaI using the vector pNS2X-sacB and DNA ligase (Ligation High (manufactured by Toyo Boseki Co., Ltd.)) described in JP-A-2007-259708.
  • a plasmid vector pNS2X-sacB + phaC1UD for disrupting the PHA synthase gene was prepared.
  • a PHA synthase gene disrupted strain was prepared as follows. Escherichia coli S17-1 strain (ATCC47055) was transformed with pNS2X-sacB + phaC1UD, a plasmid vector for PHA synthase gene disruption, and the transformed microorganisms obtained thereby were KNK005dZ / trc-J4b / dbktB / dA1528 strain and Nutrient Agar medium (Difco). The mixture was mixed and cultured on (manufactured by the company) to carry out conjugation transfer.
  • the KNK005dZ / trc-J4b / dbktB / dA1528 strain lacks the phaZ1 gene, phaZ2 gene, and phaZ6 gene on the chromosome of the Capriavidas necatol H16 strain, and the PHA synthase gene on the chromosome is derived from Aeromonas cabier.
  • PHA synthase gene variant (gene encoding the PHA synthase having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, that is, the N149S / D171G variant gene) is replaced with an R-form-specific enoyl-CoA hydratase on the chromosome.
  • a plasmid for PHA synthase gene transfer was prepared.
  • the production was carried out as follows. Described in the nucleotide sequences upstream and downstream of the bktB structural gene ( ⁇ -ketothiolase gene) of the capriavidas necatol H16 strain, the lacN19 promoter which is a variant of the lac promoter of Escherichia coli, and SEQ ID NO: 2 by PCR using synthetic oligo DNA.
  • a DNA fragment (SEQ ID NO: 19) having the nucleotide sequence of the gene encoding the PHA synthase having the amino acid sequence of (SEQ ID NO: 19) was obtained.
  • This DNA fragment was digested with the restriction enzyme SwaI, and the obtained DNA fragment was digested with SwaI using the vector pNS2X-sacB and DNA ligase (Ligation High (manufactured by Toyo Boseki Co., Ltd.)) described in JP-A-2007-259708. It was ligated to prepare a plasmid vector pNS2X-sacB + bktbU-lacN19-NSDG-bktbD for introducing a PHA synthase gene.
  • a PHA synthase gene transfer strain was prepared as follows.
  • the plasmid vector pNS2X-sacB + bktbU-lacN19-NSDG-bktb for PHA synthase gene transfer was introduced into the KNK005dZ / dNSDG / trc-J4b / dbktB / dA1528 strain by a method using the same conjugation transmission as described above.
  • a plasmid for PHA synthase gene transfer was prepared. The production was carried out as follows. Described in the nucleotide sequences upstream and downstream of the A1528 structural gene ( ⁇ -ketothiolase gene) of Capriavidas necatol H16 strain, the lacN17 promoter which is a variant of the lac promoter of Escherichia coli, and SEQ ID NO: 6 by PCR using synthetic oligo DNA. A DNA fragment (SEQ ID NO: 20) having the nucleotide sequence of the gene encoding the PHA synthase having the amino acid sequence of (SEQ ID NO: 20) was obtained.
  • This DNA fragment was digested with the restriction enzyme SwaI, and the obtained DNA fragment was digested with SwaI using the vector pNS2X-sacB and DNA ligase (Ligation High (manufactured by Toyo Boseki Co., Ltd.)) described in JP-A-2007-259708.
  • a plasmid vector pNS2X-sacB + A1528U-lacN17-AcNSRe12-A1528D for introducing a PHA synthase gene was prepared.
  • the plasmid vector pNS2X-sacB + A1528U-lacN17-AcNSRe12-A1528D for introducing the PHA synthase gene was transferred to KNK005dZ / dNSDG / trc-J4b / dbktB :: lacN19-NSDG / dA1528 by the same conjugation transmission method as described above. Introduced in. Further, by the same culture as above and selection with Nutrient Agar medium containing 15% shoe cloth, the PHA synthase having the lacN17 promoter and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 at the position where the A1528 gene was originally present on the chromosome.
  • the obtained strain was named KNK005dZ / dNSDG / trc-J4b / dbktB :: lacN19-NSDG / dA1528 :: lacN17-AcNSRe12 strain (hereinafter, may be referred to as a copolymerized PHA mixture-producing microbial strain (1)). ..
  • the copolymerized PHA mixture-producing microorganism strain (1) is derived from the genus Aeromonas having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 by deleting the phaZ1 gene, the phaZ2 gene, and the phaZ6 gene on the chromosome of the Capriavidas necatol H16 strain. And a gene encoding a PHA synthase variant of the above, and a gene encoding a PHA synthase having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 (that is, a part of a polyhydroxyalkanoic acid synthase gene derived from a microorganism of the genus Aeromonas).
  • a gene encoding a PHA synthase which is composed by combining a part of a polyhydroxyalkanoic acid synthase gene derived from a microorganism of the genus Capriavidas) was introduced, and the expression of the R-form-specific enoyl-CoA hydratase gene on the chromosome was introduced. Is fortified, the bktB structural gene ( ⁇ -ketothiolase gene) is deleted, and the A1528 structural gene ( ⁇ -ketothiolase gene) is further deleted.
  • Example 2 of microbial strain preparation Preparation of copolymerized PHA mixture-producing microbial strain (2) First, a plasmid for introducing a PHA synthase gene was prepared. The production was carried out as follows. By PCR using synthetic oligo DNA, PHA having the nucleotide sequences upstream and downstream from the bktB structural gene ( ⁇ -ketothiolase gene) of Capriavidas necatol H16 strain, the lac promoter of Escherichia coli, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. A DNA fragment (SEQ ID NO: 21) having the base sequence of the gene encoding the synthase was obtained.
  • This DNA fragment was digested with the restriction enzyme SwaI, and the obtained DNA fragment was digested with SwaI using the vector pNS2X-sacB and DNA ligase (Ligation High (manufactured by Toyo Boseki Co., Ltd.)) described in JP-A-2007-259708. It was ligated to prepare a plasmid vector pNS2X-sacB + bktbU-lac-NSDG-bktbD for introducing a PHA synthase gene.
  • a PHA synthase gene transfer strain was prepared as follows.
  • the plasmid vector pNS2X-sacB + bktbU-lac-NSDG-bktb for PHA synthase gene transfer was introduced into the KNK005dZ / dNSDG / trc-J4b / dbktB / dA1528 strain by the same conjugation transmission method as described above.
  • the plasmid vector pNS2X-sacB + A1528U-lacN17-AcNSRe12-A1528D for introducing the PHA synthase gene was introduced into the KNK005dZ / dNSDG / trc-J4b / dbktB :: lac-NSDG / dA1528 strain by the same conjugation transmission method as described above. Introduced in. Further, by the same culture as above and selection with Nutrient Agar medium containing 15% shoe cloth, the PHA synthase having the lacN17 promoter and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 at the position where the A1528 gene was originally present on the chromosome.
  • the obtained strain was named KNK005dZ / dNSDG / trc-J4b / dbktB :: lac-NSDG / dA1528 :: lacN17-AcNSRe12 strain (hereinafter, may be referred to as a copolymerized PHA mixture-producing microbial strain (2)). ..
  • the copolymerized PHA mixture-producing microorganism strain (2) is derived from the genus Aeromonas having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 by deleting the phaZ1 gene, the phaZ2 gene, and the phaZ6 gene on the chromosome of the Capriavidas necatol H16 strain. And a gene encoding a PHA synthase variant of the above, and a gene encoding a PHA synthase having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 (that is, a part of a polyhydroxyalkanoic acid synthase gene derived from a microorganism of the genus Aeromonas).
  • a gene encoding a PHA synthase which is composed by combining a part of a polyhydroxyalkanoic acid synthase gene derived from a microorganism of the genus Capriavidas) was introduced, and the expression of the R-form-specific enoyl-CoA hydratase gene on the chromosome was introduced. Is fortified, the bktB structural gene ( ⁇ -ketothiolase gene) is deleted, and the A1528 structural gene ( ⁇ -ketothiolase gene) is further deleted.
  • a plasmid for expressing the PHA synthase gene was prepared. The production was carried out as follows. By PCR using synthetic oligo DNA, a DNA fragment (SEQ ID NO: 22) having the lacN17 promoter, which is a variant of the lac promoter of Escherichia coli, was obtained. This DNA fragment was digested with restriction enzymes EcoRI and MunI, and the obtained DNA fragment was ligated with the plasmid vector pCUP2 described in WO 2007/049716 cleaved with MunI to form pCUP2 downstream of the lacN17 promoter.
  • This DNA fragment was digested with restriction enzymes MunI and SpeI, and the obtained DNA fragment was ligated with pCUP2-lacN17 cleaved with MunI and SpeI to form a PHA synthase gene expression plasmid pCUP2-lacN17-AcNSRe12-NSDG.
  • the plasmid pCUP2-lacN17-AcNSRe12-NSDG for expressing the PHA synthase gene was introduced into the KNK005dZ / dNSDG / trc-J4b / dbktB / dA1528 strain, and pCUP2-lacN17-AcNSRe12-NSDG / KNK005dZ / kNK005dZ A dbktB / dA1528 strain (hereinafter, also referred to as a copolymerized PHA mixture-producing microbial strain (3)) was obtained.
  • the plasmid vector was introduced into cells by the electroporation method as follows.
  • a gene pulsar manufactured by Bio-Rad was used as the gene transfer device, and a gap 0.2 cm also manufactured by Bio-rad was used as the cuvette.
  • 400 ⁇ l of competent cells and 20 ⁇ l of expression vector were injected into the cuvette and set in a pulse device, and an electric pulse was applied under the conditions of a capacitance of 25 ⁇ F, a voltage of 1.5 kV, and a resistance value of 800 ⁇ .
  • the bacterial solution in the cuvette was cultured with shaking in Nutrient Broth medium (manufactured by DIFCO) at 30 ° C.
  • the copolymerized PHA mixture-producing microorganism strain (3) is derived from the genus Aeromonas having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 by deleting the phaZ1 gene, the phaZ2 gene, and the phaZ6 gene on the chromosome of the Capriavidas necatol H16 strain.
  • a gene encoding a PHA synthase variant of the above, and a gene encoding a PHA synthase having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 that is, a part of a polyhydroxyalkanoic acid synthase gene derived from a microorganism of the genus Aeromonas.
  • a gene encoding a PHA synthase, which is composed by combining a part of a polyhydroxyalkanoic acid synthase gene derived from a microorganism of the genus Capriavidas) was introduced, and the expression of the R-form-specific enoyl-CoA hydratase gene on the chromosome was introduced. Is fortified, the bktB structural gene ( ⁇ -ketothiolase gene) is deleted, and the A1528 structural gene ( ⁇ -ketothiolase gene) is further deleted.
  • Example 4 of microbial strain preparation Preparation of copolymerized PHA mixture-producing microbial strain (4) First, a plasmid for introducing a PHA synthase gene was prepared. The production was carried out as follows. PHA synthesis having the nucleotide sequences upstream and downstream of the bktB structural gene ( ⁇ -ketothiolase gene) of Capriavidas necatol H16 strain, the lac promoter of Escherichia coli, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 by PCR using synthetic oligo DNA.
  • a DNA fragment (SEQ ID NO: 24) having the base sequence of the gene encoding the enzyme and the gene encoding the PHA synthase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 was obtained.
  • This DNA fragment was digested with the restriction enzyme SwaI, and the obtained DNA fragment was digested with SwaI using the vector pNS2X-sacB and DNA ligase (Ligation High (manufactured by Toyo Boseki Co., Ltd.)) described in JP-A-2007-259708.
  • a plasmid vector for PHA synthase gene transfer pNS2X-sacB + bktbU-lac-AcNSRe12-NSDG-bktbD, was prepared.
  • a PHA synthase gene transfer strain was prepared as follows.
  • the plasmid vector pNS2X-sacB + bktbU-lac-AcNSRe12-NSDG-bktbD for PHA synthase gene transfer was introduced into the KNK005dZ / dNSDG / trc-J4b / dbktB / dA1528 strain by the same conjugation transmission method as described above.
  • the obtained strain was named KNK005dZ / dNSDG / trc-J4b / dbktB :: lac-AcNSRe12-NSDG / dA1528 strain (hereinafter, may be referred to as a copolymerized PHA mixture-producing microbial strain (4)).
  • the copolymerized PHA mixture-producing microorganism strain (4) is derived from the genus Aeromonas having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 by deleting the phaZ1 gene, the phaZ2 gene, and the phaZ6 gene on the chromosome of the Capriavidas necatol H16 strain.
  • a gene encoding a PHA synthase variant of the above, and a gene encoding a PHA synthase having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 that is, a part of a polyhydroxyalkanoic acid synthase gene derived from a microorganism of the genus Aeromonas.
  • a gene encoding a PHA synthase, which is composed by combining a part of a polyhydroxyalkanoic acid synthase gene derived from a microorganism of the genus Capriavidas) was introduced, and the expression of the R-form-specific enoyl-CoA hydratase gene on the chromosome was introduced. Is fortified, the bktB structural gene ( ⁇ -ketothiolase gene) is deleted, and the A1528 structural gene ( ⁇ -ketothiolase gene) is further deleted.
  • Example 5 of microbial strain preparation Preparation of copolymerized PHA mixture-producing microbial strain (5)
  • a plasmid for expressing the PHA synthase gene was prepared. The production was carried out as follows. By PCR using synthetic oligo DNA, the gene encoding the PHA synthase having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, the gene encoding the PHA synthase having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8, and SEQ ID NO: 3 were obtained.
  • a DNA fragment (SEQ ID NO: 26) having the nucleotide sequence of the gene encoding the PHA synthase having the above amino acid sequence was obtained.
  • the plasmid pCUP2-lacN17-RCYB4-NSDGST for expressing the PHA synthase gene was introduced into the KNK005dZ / dNSDG / trc-J4b / dbktB / dA1528 strain by the electroporation method described in microbial strain preparation example 3, and pCUP2.
  • -LacN17-RCYB4-NSDGST / KNK005dZ / dNSDG / trc-J4b / dbktB / dA1528 strain (hereinafter, may be referred to as a copolymerized PHA mixture-producing microbial strain (5)) was obtained.
  • the copolymerized PHA mixture-producing microorganism strain (5) is derived from the genus Aeromonas having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 by deleting the phaZ1 gene, the phaZ2 gene, and the phaZ6 gene on the chromosome of the Capriavidas necatol H16 strain.
  • a gene encoding a PHA synthase variant of PHA and a gene encoding a PHA synthase derived from the genus Bacillus having the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 were introduced into the R-form-specific enoyl on the chromosome.
  • Example 6 of microbial strain preparation Preparation of copolymerized PHA mixture-producing microbial strain (6)
  • a plasmid for introducing a PHA synthase gene was prepared. The production was carried out as follows. Described in the nucleotide sequences upstream and downstream of the A1528 structural gene ( ⁇ -ketothiolase gene) of Capriavidas necatol H16 strain, the lacN17 promoter which is a variant of the lac promoter of Escherichia coli, and SEQ ID NO: 5 by PCR using synthetic oligo DNA.
  • a DNA fragment (SEQ ID NO: 27) having the nucleotide sequence of the gene encoding the PHA synthase having the amino acid sequence of (SEQ ID NO: 27) was obtained.
  • This DNA fragment was digested with the restriction enzyme SwaI, and the obtained DNA fragment was digested with SwaI using the vector pNS2X-sacB and DNA ligase (Ligation High (manufactured by Toyo Boseki Co., Ltd.)) described in JP-A-2007-259708.
  • a plasmid vector pNS2X-sacB + A1528U-lacN17-CsAG-A1528D for introducing a PHA synthase gene was prepared.
  • the plasmid vector pNS2X-sacB + A1528U-lacN17-CsAG-A1528D for introducing the PHA synthase gene was introduced into the KNK005dZ / dNSDG / trc-J4b / dbktB :: lac-NSDG / dA1528 strain by a method using the same conjugation transmission as described above. Introduced in. Further, by the same culture as above and selection with Nutrient Agar medium containing 15% shoe cloth, the PHA synthase having the lacN17 promoter and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 at the position where the A1528 gene was originally present on the chromosome.
  • the obtained strain was named KNK005dZ / dNSDG / trc-J4b / dbktB :: lac-NSDG / dA1528 :: lacN17-CsAG strain (hereinafter, may be referred to as a copolymerized PHA mixture-producing microbial strain (6)). ..
  • the copolymerized PHA mixture-producing microorganism strain (6) is derived from the genus Aeromonas having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 by deleting the phaZ1 gene, the phaZ2 gene, and the phaZ6 gene on the chromosome of the Capriavidas necatol H16 strain.
  • a gene encoding a PHA synthase variant of PHA and a gene encoding a PHA synthase derived from Chromobacterium having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 were introduced into the R-form-specific enoyl-CoA hydratase on the chromosome. It is a strain in which the expression of the gene is enhanced, the bktB structural gene ( ⁇ -ketothiolase gene) is deleted, and the A1528 structural gene ( ⁇ -ketothiolase gene) is further deleted.
  • P (3HB-co-3HH) -producing microbial strain (1) The KNK005dZ strain (hereinafter, may be referred to as P (3HB-co-3HH) -producing microbial strain (1)) is , PHA synthase gene derived from Aeromonas genus (gene encoding PHA synthase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2) is introduced on the chromosome of Capriavidas necatol H16 strain, and it is a PHA degrading enzyme gene on the chromosome. It is a transformed microorganism lacking the phZ1,2,6 gene. This transformed microorganism can be produced according to the method described in PCT International Publication No. 2014/065253.
  • Example 8 of microbial strain preparation Preparation of P (3HB-co-3HH) -producing microbial strain (2)
  • a plasmid for PHA synthase gene transfer was prepared. The production was carried out as follows. By PCR using synthetic oligo DNA, PHA having the nucleotide sequences upstream and downstream from the phaZ6 structural gene of Capriavidas necatol H16 strain, the lacN17 promoter which is a variant of the lac promoter of Escherichia coli, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • a DNA fragment (SEQ ID NO: 28) having the base sequence of the gene encoding the synthase was obtained.
  • This DNA fragment was digested with the restriction enzyme SwaI, and the obtained DNA fragment was digested with SwaI using the vector pNS2X-sacB and DNA ligase (Ligation High (manufactured by Toyo Boseki Co., Ltd.)) described in JP-A-2007-259708.
  • DNA ligase Ligation High (manufactured by Toyo Boseki Co., Ltd.)
  • JP-A-2007-25978 By ligation, a plasmid vector pNS2X-sacB + phaZ6U-lacN17-NSDG-phaZ6D for introducing a PHA synthase gene was prepared.
  • the plasmid vector pNS2X-sacB + phaZ6U-lacN17-NSDG-phaZ6D for introducing the PHA synthase gene was introduced into the KNK005dZ / trc-J4b / dbktB strain by a method using the same conjugation transmission as described above.
  • the KNK005dZ / trc-J4b / dbktB strain lacks the phaZ1 gene, the phaZ2 gene, and the phaZ6 gene on the chromosome of the Capriavidas necatol H16 strain, and the PHA synthase gene on the chromosome is replaced with the PHA derived from Aeromonas cavier.
  • a variant of the synthase gene (gene encoding the PHA synthase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, that is, the N149S / D171G variant gene), and the R-form-specific enoyl-CoA hydratase gene on the chromosome. It is a strain whose expression is enhanced and the bktB structural gene is deleted, and can be prepared according to the method described in PCT International Publication No. 2019/142845.
  • KNK005dZ was prepared by using the same plasmid vector pNS2X-sacB + phaC1UD for PHA synthase gene disruption as above. It was introduced into the / trc-J4b / dbktB strain. Furthermore, one strain lacking the PHA synthase gene on the chromosome was isolated by the same culture as above and selection with Nutrient Agar medium containing 15% shoe cloth. The obtained strain was named KNK005dZ / dNSDG / trc-J4b / dbktB strain.
  • a plasmid for PHA synthase gene transfer was prepared.
  • the production was carried out as follows. DNA having a base sequence upstream and downstream of the phaC1 structural gene of Capriavidas necatol H16 strain and a base sequence of a gene encoding a PHA synthase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 by PCR using synthetic oligo DNA. A fragment (SEQ ID NO: 29) was obtained.
  • This DNA fragment was digested with the restriction enzyme SwaI, and the obtained DNA fragment was digested with SwaI using the vector pNS2X-sacB and DNA ligase (Ligation High (manufactured by Toyo Boseki Co., Ltd.)) described in JP-A-2007-259708.
  • DNA ligase Ligation High (manufactured by Toyo Boseki Co., Ltd.)
  • JP-A-2007-25978 By ligation, a plasmid vector pNS2X-sacB + phaC1U-NSDGST-phaC1D for introducing a PHA synthase gene was prepared.
  • the plasmid vector pNS2X-sacB + phaC1U-NSDGST-phaC1D for introducing the PHA synthase gene was introduced into the KNK005dZ / dNSDG / trc-J4b / dbktB strain by the same conjugation transmission method as described above. Furthermore, in the same culture as above and selection with Nutrient Agar medium containing 15% shoe cloth, a gene encoding a PHA synthase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 at the position where the phaC1 gene was originally present on the chromosome. One strain into which was introduced was isolated. The obtained strain was named KNK005dZ / NSDGST / trc-J4b / dbktB strain.
  • a plasmid for expressing the PHA synthase gene was prepared.
  • the production was carried out as follows.
  • a DNA fragment (SEQ ID NO: 30) having the base sequence of the gene encoding the PHA synthase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 was obtained.
  • This DNA fragment was digested with restriction enzymes MunI and SpeI, and the obtained DNA fragment was ligated with pCUP2 described in WO 2007/049716 cleaved with MunI and SpeI to obtain pCUP2-NSDGST.
  • a DNA fragment having a trp promoter was obtained by PCR using synthetic oligo DNA.
  • This DNA fragment was digested with the restriction enzyme MunI, and the obtained DNA fragment was ligated by cleaving pCUP2-NSDGST with MunI and the gene encoding the PHA synthase in the direction downstream of the trp promoter.
  • a plasmid pCUP2-trp-NSDGST for expressing the PHA synthase gene was obtained.
  • the plasmid pCUP2-trp-NSDGST for expressing the PHA synthase gene was introduced into the KNK005dZ / NSDGST / trc-J4b / dbktB strain by the electroporation method described in microbial strain preparation example 3, and pCUP2-trp-NSDGST.
  • / KNK005dZ / NSDGST / trc-J4b / dbktB strain (hereinafter, may be referred to as P (3HB-co-3HH) producing microbial strain (3)) was obtained.
  • the P (3HB-co-3HH) -producing microorganism strain (3) lacked the phaZ1 gene, the phaZ2 gene, and the phaZ6 gene on the chromosome of the capriavidas necatol H16 strain, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 was used.
  • the plasmid pCUP2-trp-NSDGST for expressing the PHA synthase gene was introduced into the KNK005dZ / NSDGST / trc-J4b / dbktB / dA1528 strain by the electroporation method described in Example 3 of microbial strain preparation, and pCUP2-trp was introduced.
  • -NSDGST / KNK005dZ / NSDGST / trc-J4b / dbktB / dA1528 strain (hereinafter, may be referred to as P (3HB-co-3HH) producing microbial strain (4)) was obtained.
  • the P (3HB-co-3HH) -producing microorganism strain (4) lacked the phaZ1 gene, the phaZ2 gene, and the phaZ6 gene on the chromosome of the capriavidas necatol H16 strain, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 was used.
  • a gene encoding a PHA synthase variant derived from the genus Aeromonas is introduced, the expression of the R-form-specific enoyl-CoA hydratase gene on the chromosome is enhanced, and the bktB structural gene ( ⁇ -ketothiolase gene) is deleted. Furthermore, it is a strain lacking the A1528 structural gene ( ⁇ -ketothiolase gene).
  • Example 1 PHA production by a copolymerized PHA mixture-producing microbial strain (1)
  • a culture study using a copolymerized PHA mixture-producing microbial strain (1) was carried out under the following conditions.
  • Tanehaha medium 1w / v% Meat-extract, 1w / v% Bacto-Tryptone, 0.2w / v% Yeast-extract, 0.9w / v% Na 2 HPO 4 ⁇ 12H 2 O, 0.15w / V% KH 2 PO 4 , (pH 6.8).
  • composition of the preculture medium 1.1w / v% Na 2 HPO 4 ⁇ 12H 2 O, 0.19w / v% KH 2 PO 4, 1.29w / v% (NH 4) 2 SO 4, 0.1w / v% MgSO 4 ⁇ 7H 2 O , 2.5w / v% palm olein oil, 0.5 v / v% trace metal salt solution (1.6 w in 0.1N HCl / v% FeCl 3 ⁇ 6H 2 O, 1w / v% CaCl 2 ⁇ 2H 2 O , dissolved 0.02w / v% CoCl 2 ⁇ 6H 2 O, 0.016w / v% CuSO 4 ⁇ 5H 2 O, the 0.012w / v% NiCl 2 ⁇ 6H 2 O Things).
  • composition of the PHA production medium 0.385w / v% Na 2 HPO 4 ⁇ 12H 2 O, 0.067w / v% KH 2 PO 4, 0.291w / v% (NH 4) 2 SO 4, 0.1w / v% MgSO 4 ⁇ 7H 2 O , 0.5v / v% trace metal salt solution (1.6 w in 0.1N HCl / v% FeCl 3 ⁇ 6H 2 O, 1w / v% CaCl 2 ⁇ 2H 2 O, 0 .02w / v% CoCl 2 ⁇ 6H 2 O, 0.016w / v% CuSO 4 ⁇ 5H 2 O, 0.012w / v% NiCl 2 ⁇ 6H 2 O those dissolved) and the.
  • the ratio of the amount of PHA accumulated to the dried cells was measured as follows. The cells were recovered from the culture solution by centrifugation, washed with ethanol, lyophilized to obtain dried cells, and weighed. 100 ml of chloroform was added to 1 g of the obtained dried cells, and the mixture was stirred at room temperature for 24 hours to extract PHA (copolymerized PHA mixture) in the cells. The cell residue was filtered off, concentrated with an evaporator until the total volume reached 30 ml, 90 ml of hexane was gradually added, and the mixture was allowed to stand for 1 hour with gentle stirring. The precipitated PHA was filtered off and then vacuum dried at 50 ° C. for 3 hours. The weight of the dried PHA was measured, and the ratio of the accumulated amount of PHA to the amount of dried cells was calculated.
  • the weight ratios of the PHA fractions (I) and (II) in the copolymerized PHA mixture were measured as follows. First, the dried PHA was fractionated into a PHA fraction (I) and a PHA fraction (II) by the MIBK fractionation method, and each was weighed. Next, the weight ratio of each fraction to the total weight of the PHA fraction (I) and the PHA fraction (II) was calculated.
  • the average 3HH composition ratio of each of the copolymerized PHA mixture, PHA fraction (I), or PHA fraction (II) was measured as follows. Approximately 20 mg of the dried copolymer PHA mixture, PHA fraction (I), or PHA fraction (II) was added with 1 ml of sulfuric acid-methanol mixture (15:85) and 1 ml of chloroform, sealed, and sealed at 100 ° C. By heating for 140 minutes, methyl ester of PHA decomposition product was obtained. After cooling, 0.5 ml of deionized water was added thereto and mixed well, and then left to stand until the aqueous layer and the organic layer were separated.
  • the monomer unit composition of the PHA decomposition product in the separated organic layer was analyzed by capillary gas chromatography.
  • the gas chromatograph used was Shimadzu GC-17A, and the capillary column used was NEUTRA BOND-1 manufactured by GL Sciences (column length 25 m, column inner diameter 0.25 mm, liquid thickness 0.4 ⁇ m). He was used as the carrier gas, the column inlet pressure was 100 kPa, and 1 ⁇ l of the sample was injected.
  • the temperature conditions the temperature was raised from the initial temperature of 50 to 200 ° C. at a rate of 8 ° C./min, and further raised to 200 to 290 ° C. at a rate of 30 ° C./min. From the peaks obtained by the analysis under the above conditions, the average 3HH composition ratio of the copolymerized PHA mixture, PHA fraction (I), or PHA fraction (II) was calculated.
  • the molten strand-shaped resin composition was discharged from the die and immediately put into a water bath heated to 60 ° C., and the time for crystal solidification was measured. When solidified within 100 seconds, it was evaluated as having good workability ( ⁇ ). Then, the strands crystallized in a water bath were cut with nippers to obtain resin composition pellets.
  • the PHA production culture was carried out as follows. First, the glycerol stock (50 ⁇ l) of the copolymerized PHA mixture-producing microbial strain (1) was inoculated into the seed medium (10 ml) and cultured for 24 hours to perform seed mother culture. Next, the seed mother culture solution was inoculated at 1.0 v / v% into a 3 L jar fermenter (MDL-300 type manufactured by Maruhishi Bioengineer) containing 1.8 L of preculture medium.
  • MDL-300 type manufactured by Maruhishi Bioengineer 3 L jar fermenter
  • the operating conditions were a culture temperature of 30 ° C., a stirring speed of 500 rpm, an aeration rate of 1.8 L / min, and the culture was carried out for 28 hours while controlling the pH between 6.7 and 6.8, and pre-culture was performed.
  • a 14% aqueous solution of ammonium hydroxide was used for pH control.
  • the preculture solution was inoculated at 5.0 v / v% into a 5 L jar fermenter (MDS-U50 type manufactured by Maruhishi Bioengine) containing 2.5 L of PHA production medium.
  • the operating conditions were a culture temperature of 33 ° C., a stirring speed of 420 rpm, an aeration rate of 2.1 L / min, and a pH controlled between 6.7 and 6.8.
  • a 25% aqueous solution of ammonium hydroxide was used for pH control.
  • the carbon source was added intermittently. Palm olein oil was used as the carbon source. Culturing was carried out until the ratio of the accumulated amount of PHA to the amount of dried cells reached 80% or more.
  • Ratio of PHA accumulation to dried cells, copolymerized PHA mixture, PHA fraction (I), or average 3HH composition ratio of PHA fraction (II), weight ratio of PHA fractions (I) and (II), melting Peak temperature, melting enthalpy, processability and Ermendorf tear strength were measured as described above. The results are shown in Table 1.
  • Example 2 PHA production by a copolymerized PHA mixture-producing microbial strain (2)
  • a culture study using a copolymerized PHA mixture-producing microbial strain (2) was carried out under the same conditions as in Example 1.
  • melting Table 1 shows the peak temperature, melting enthalpy, processability, and Ermendorf tear strength.
  • Example 3 PHA production by a copolymerized PHA mixture-producing microbial strain (3)
  • a culture study using a copolymerized PHA mixture-producing microbial strain (3) was carried out under the same conditions as in Example 1.
  • Ratio of PHA accumulation to dried cells, copolymerized PHA mixture, PHA fraction (I), or average 3HH composition ratio of PHA fraction (II), weight ratio of PHA fractions (I) and (II), melting Table 1 shows the peak temperature, melting enthalpy, processability, and Ermendorf tear strength.
  • Example 4 PHA production by a copolymerized PHA mixture-producing microbial strain (4)
  • a culture study using a copolymerized PHA mixture-producing microbial strain (4) was carried out under the same conditions as in Example 1.
  • Ratio of PHA accumulation to dried cells, copolymerized PHA mixture, PHA fraction (I), or average 3HH composition ratio of PHA fraction (II), weight ratio of PHA fractions (I) and (II), melting Table 1 shows the peak temperature, melting enthalpy, processability, and Ermendorf tear strength.
  • Example 5 PHA production by a copolymerized PHA mixture-producing microbial strain (5)
  • a culture study using a copolymerized PHA mixture-producing microbial strain (5) was carried out under the same conditions as in Example 1.
  • Ratio of PHA accumulation to dried cells, copolymerized PHA mixture, PHA fraction (I), or average 3HH composition ratio of PHA fraction (II), weight ratio of PHA fractions (I) and (II), melting Table 1 shows the peak temperature, melting enthalpy, processability, and Ermendorf tear strength.
  • Example 6 PHA production by a copolymerized PHA mixture-producing microbial strain (6)
  • a culture study using a copolymerized PHA mixture-producing microbial strain (6) was carried out under the same conditions as in Example 1.
  • Ratio of PHA accumulation to dried cells, copolymerized PHA mixture, PHA fraction (I), or average 3HH composition ratio of PHA fraction (II), weight ratio of PHA fractions (I) and (II), melting Table 1 shows the peak temperature, melting enthalpy, processability, and Ermendorf tear strength.
  • the accumulated PHA of the P (3HB-co-3HH) -producing microbial strain (1) was P (3HB-co-3HH).
  • the MIBK soluble fraction and the MIBK insoluble fraction refer to the PHA fraction (I) or the fraction obtained by the same method as the PHA fraction (II), respectively.
  • the accumulated PHA of the P (3HB-co-3HH) -producing microbial strain (2) was P (3HB-co-3HH).
  • the MIBK soluble fraction and the MIBK insoluble fraction refer to the PHA fraction (I) or the fraction obtained by the same method as the PHA fraction (II), respectively.
  • the accumulated PHA of the P (3HB-co-3HH) -producing microbial strain (3) was P (3HB-co-3HH).
  • the MIBK soluble fraction and the MIBK insoluble fraction refer to the PHA fraction (I) or the fraction obtained by the same method as the PHA fraction (II), respectively.
  • the accumulated PHA of the P (3HB-co-3HH) -producing microbial strain (4) was P (3HB-co-3HH).
  • the MIBK soluble fraction and the MIBK insoluble fraction refer to the PHA fraction (I) or the fraction obtained by the same method as the PHA fraction (II), respectively.
  • the copolymerized PHA mixtures obtained in Examples 1 to 6 had good processability, high Ermendorf tear strength, and excellent mechanical properties.
  • Comparative Example 1 in which the obtained copolymerized PHA mixture did not contain the PHA fraction (I), the Ermendorf tear strength was low.
  • Comparative Example 2 in which the average 3HH composition ratio of the PHA fraction (I) was not 20 mol% or more, the processability was poor and the Ermendorf tear strength was also low.
  • the average 3HH composition ratio of the copolymerized PHA mixture was not 22 mol% or less, and Comparative Examples 3 and 4 containing no PHA fraction (II) had poor processability.

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Abstract

共重合ポリヒドロキシアルカン酸混合物を製造する方法。共重合ポリヒドロキシアルカン酸混合物を産生する微生物を培養する工程を含む。前記混合物が、３－ヒドロキシ酪酸構造単位及び３－ヒドロキシヘキサン酸構造単位を有する共重合ポリヒドロキシアルカン酸を含み、かつ平均３－ヒドロキシヘキサン酸組成比率が２０モル％以上である画分（Ｉ）、及び、３－ヒドロキシ酪酸構造単位を有するポリヒドロキシアルカン酸を含み、かつ平均３－ヒドロキシヘキサン酸組成比率が０モル％以上１５モル％以下である画分（ＩＩ）を含有する。前記共重合ポリヒドロキシアルカン酸混合物は、平均３－ヒドロキシヘキサン酸組成比率が２２モル％以下である。

Description

共重合ポリヒドロキシアルカン酸混合物の製造方法、及び形質転換微生物
　本発明は、共重合ポリヒドロキシアルカン酸混合物の製造方法、及び形質転換微生物に関する。
　ポリヒドロキシアルカン酸（以下、「ＰＨＡ」と記すこともある。）は、広範な微生物によって生成されるポリエステル型有機ポリマーである。ＰＨＡは生分解性を有する熱可塑性高分子であり、再生可能資源を原料として産生することができる。これらのことから、ＰＨＡを環境調和型素材または生体適合型素材として工業的に生産し、多様な産業へ利用する試みが行われている。
　現在までに、数多くの微生物がエネルギー貯蔵物質としてＰＨＡを菌体内に蓄積することが知られている。ＰＨＡの代表例としては、３－ヒドロキシ酪酸（以下、「３ＨＢ」と記すこともある。）のホモポリマーであるポリ－３－ヒドロキシ酪酸（以下、「Ｐ（３ＨＢ）」と記すこともある。）が挙げられる。Ｐ（３ＨＢ）は熱可塑性高分子であり、自然環境中で生物的に分解されることから、環境に優しいプラスチックとして注目されている。しかし、Ｐ（３ＨＢ）は結晶性が高いために硬くて脆い性質を持っており、実用的には応用範囲が限られている。応用範囲を広げるためには、Ｐ（３ＨＢ）に柔軟性を付与することが必要であった。
　そこで、３ＨＢと３－ヒドロキシ吉草酸（以下、「３ＨＶ」と記す。）とからなる共重合ＰＨＡ（以下、「Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＶ）」と記す。）とその製造方法が開発された（例えば、特許文献１および特許文献２を参照）。Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＶ）は、Ｐ（３ＨＢ）に比べると柔軟性に富むため、幅広い用途に応用できると考えられた。しかしながら、実際にはＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＶ）中の３ＨＶモル分率を増加させてもそれに伴う物性の変化が乏しく、特にフィルムやシート、軟質系包装容器等へ加工するために要求される程には柔軟性が向上しないため、シャンプーボトルや使い捨て剃刀の取手等、硬質成型体の限られた分野にしか利用されていない。
　ＰＨＡの柔軟性を高めるために、３ＨＢと３－ヒドロキシヘキサン酸（以下、「３ＨＨ」と記す。）からなる共重合ポリヒドロキシアルカン酸（以下、「Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）」と記すこともある。）およびその製造方法について研究が行われている（例えば、特許文献３および特許文献４を参照）。これらの報告においてＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）は、土壌より単離されたアエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｃａｖｉａｅ）の野生株を用い、オレイン酸、パルミチン酸等の脂肪酸を炭素源として発酵生産されている。
　また、カプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｎｅｃａｔｏｒ）を宿主とし、アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素を利用して、Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）を高生産する研究も行われている。アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素を有するカプリアビダス・ネカトールに対して、Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子を導入することにより、または、宿主染色体上のＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現量を増加させることにより、植物油脂を原料としてＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）を生産し、該Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）の３ＨＨ組成比率を最大１４ｍｏｌ％程度にまで向上させている（特許文献５、特許文献６および非特許文献１を参照）。
　さらに、アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素を有するカプリアビダス・ネカトールに対して、炭素数６のβ－ケトアシル－ＣｏＡ（すなわち、β－ケトヘキサノイル－ＣｏＡ）に対するチオリシス活性を有するβ－ケトチオラーゼ酵素をコードする遺伝子の発現を抑制することで、Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）の３ＨＨ組成比率を２０ｍｏｌ％以上にまで向上させた例もある（特許文献７を参照）。
　Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）の物性に関する研究も行われている（非特許文献２を参照）。この報告では、炭素数が１２個以上の脂肪酸を唯一の炭素源としてアエロモナス・キャビエを培養して、様々な３ＨＨ組成比率を有するＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）を発酵生産している。Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）は３ＨＨ組成比率の増加にしたがって結晶性が低下するため、Ｐ（３ＨＢ）の様な硬くて脆い性質から次第に柔軟な性質を示すようになり、３ＨＨ組成比率がより高くなるとＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＶ）を上回る柔軟性を示すことが明らかにされた。すなわち、Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）は３ＨＨ組成比率を変えることで、硬質ポリマーから軟質ポリマーまで応用可能な幅広い物性を持たせることができるため、幅広い分野への応用が期待できる。
　一方で、Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）は、３ＨＨ組成比率を上昇させると、結晶性が低下することにより柔軟性は向上するものの、加工特性が低下する傾向がある。例えば、３ＨＨ組成比率を１０モル％程度に向上させたＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）は比較的軟質となるが、射出成形、フィルム成形、ブロー成形、繊維の紡糸、押出発泡、ビーズ発泡などの加工において、結晶化速度が遅いため、生産性が低いという課題があった。この課題を解決するために、前記比較的軟質なＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）と、３ＨＨ組成比率が低く融点の高い（すなわち結晶性の高い）共重合ＰＨＡを同一細胞内で共生産することで、溶融加工性、加工速度を改善するための研究もなされている（特許文献８を参照）。
　しかしながら、特許文献８で記載されているＰＨＡ混合品においては、低融点成分（最も高い３ＨＨ組成比率を有すると考えられるＰＨＡ成分）の融点が１００℃を超えていることから、該ＰＨＡ混合品は、２０モル％以上という３ＨＨ組成比率が高いＰＨＡ成分を含んでいないと推測され、引裂強度等の機械特性が十分でなく、改善の余地があった。
特開昭５７－１５０３９３号公報 特開昭５９－２２０１９２号公報 特開平５－９３０４９号公報 特開平７－２６５０６５号公報 国際公開第２０１１／１０５３７９号 国際公開第２０１５／１１５６１９号 国際公開第２０１９／１４２８４５号 国際公開第２０１７／０５６４４２号
Ｈ．Ａｒｉｋａｗａ，Ｋ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｃｅｌｌ．Ｆａｃｔ．，１５，ｐｐ．１８４　(２０１６) Ｙ．Ｄｏｉ，Ｓ．Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｈ．Ａｂｅ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２８，ｐｐ．４８２２－４８２３（１９９５）
　以上の通り、Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）を用いて良好な加工性と機械特性の双方を満足する成形体を得ることは困難であった。
　本発明は、上記現状に鑑み、優れた加工性と機械特性を両立した共重合ポリヒドロキシアルカン酸を製造する方法を提供することを目的とする。
　本発明者は前記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、微生物を培養して、特定の組成を有する２種類のポリヒドロキシアルカン酸画分を含む共重合ポリヒドロキシアルカン酸混合物を生産させることで、優れた加工性と機械特性を両立した共重合ポリヒドロキシアルカン酸混合物を取得できることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち本発明は、共重合ポリヒドロキシアルカン酸混合物を製造する方法であって、前記共重合ポリヒドロキシアルカン酸混合物を産生する微生物を培養する工程を含み、前記共重合ポリヒドロキシアルカン酸混合物が、３－ヒドロキシ酪酸構造単位及び３－ヒドロキシヘキサン酸構造単位を有する共重合ポリヒドロキシアルカン酸を含み、かつ平均３－ヒドロキシヘキサン酸組成比率が２０モル％以上であるポリヒドロキシアルカン酸画分（Ｉ）、及び、３－ヒドロキシ酪酸構造単位を有するポリヒドロキシアルカン酸を含み、かつ平均３－ヒドロキシヘキサン酸組成比率が０モル％以上１５モル％以下であるポリヒドロキシアルカン酸画分（ＩＩ）を含有し、前記共重合ポリヒドロキシアルカン酸混合物は、平均３－ヒドロキシヘキサン酸組成比率が２２モル％以下である、製造方法に関する。
　好ましくは、前記共重合ポリヒドロキシアルカン酸混合物中の前記ポリヒドロキシアルカン酸画分（Ｉ）の重量割合が１０～９０％である。
　好ましくは、前記共重合ポリヒドロキシアルカン酸混合物は、平均３－ヒドロキシヘキサン酸組成比率が１０～２２モル％である。
　好ましくは、前記微生物は、３－ヒドロキシヘキサノイル－ＣｏＡに対する重合活性が互いに異なる２種類のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素をコードする遺伝子を有する。
　好ましくは、前記３－ヒドロキシヘキサノイル－ＣｏＡに対する重合活性が互いに異なる２種類のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素のアミノ酸配列は、配列同一性が９０％以下である。
　好ましくは、前記３－ヒドロキシヘキサノイル－ＣｏＡに対する重合活性が互いに異なる２種類のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素をコードする遺伝子が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するアエロモナス・キャビエに由来する野生型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素よりも３－ヒドロキシヘキサノイル－ＣｏＡに対する重合活性が高いポリヒドロキシアルカン酸合成酵素をコードする遺伝子（Ａ）、及び、前記アエロモナス・キャビエに由来する野生型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素よりも３－ヒドロキシヘキサノイル－ＣｏＡに対する重合活性が低いポリヒドロキシアルカン酸合成酵素をコードする遺伝子（Ｂ）である。
　好ましくは、前記遺伝子（Ａ）が、アエロモナス属の微生物に由来するポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子又はその変異体である。より好ましくは、前記遺伝子（Ａ）が、配列番号２又は配列番号３で示されるアミノ酸配列に対して９９．５～１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子である。
　好ましくは、前記遺伝子（Ｂ）が、アエロモナス属の微生物に由来するポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子の一部と、カプリアビダス属の微生物に由来するポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子の一部を組み合わせて構成されたものである。より好ましくは、前記遺伝子（Ｂ）が、配列番号６で示されるアミノ酸配列に対して９０～１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子である。
　好ましくは、前記遺伝子（Ｂ）が、クロモバクテリウム属の微生物に由来するポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子又はその変異体である。より好ましくは、前記遺伝子（Ｂ）が、配列番号４又は配列番号５で示されるアミノ酸配列に対して９０～１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子である。
　好ましくは、前記遺伝子（Ｂ）が、バチルス属の微生物に由来するポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子又はその変異体である。より好ましくは、前記遺伝子（Ｂ）が、配列番号７及び配列番号８で示されるアミノ酸配列に対して９０～１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子である。
　好ましくは、前記微生物は、該微生物の野生株と比較して、細胞内のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素に対する３－ヒドロキシヘキサノイル－ＣｏＡの供給が増大するように形質転換された形質転換微生物である。より好ましくは、前記形質転換微生物は、油脂又は脂肪酸のβ酸化における炭素数６の中間代謝物の分解が抑制されるように形質転換されたものである。さらに好ましくは、前記形質転換微生物は、炭素数６のβ－ケトアシル－ＣｏＡであるβ－ケトヘキサノイル－ＣｏＡに対するチオリシス活性を有するβ－ケトチオラーゼ酵素をコードする遺伝子の発現が抑制されるように形質転換されたものである。
　好ましくは、前記β－ケトチオラーゼ酵素は、配列番号９又は配列番号１０で示されるアミノ酸配列に対して９０～１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列を有する。
　好ましくは、前記微生物は、Ｒ体特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ活性を示すタンパク質をコードする遺伝子を有する微生物である。
　好ましくは、前記培養工程において、油脂又は脂肪酸を含む炭素源を添加する。より好ましくは、前記油脂又は脂肪酸を含む炭素源が、炭素数６～１２の中鎖脂肪酸、又は該中鎖脂肪酸のグリセリドを含む炭素源である。さらに好ましくは、前記中鎖脂肪酸が、ヘキサン酸である。
　好ましくは、前記微生物は、カプリアビダス属に属する、またはカプリアビダス属微生物の形質転換体である。より好ましくは、前記微生物は、カプリアビダス・ネカトールである、またはカプリアビダス・ネカトールの形質転換体である。
　また本発明は、共重合ポリヒドロキシアルカン酸混合物を産生する形質転換微生物であって、３－ヒドロキシヘキサノイル－ＣｏＡに対する重合活性が互いに異なる２種類のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素をコードする遺伝子を有し、前記形質転換微生物の野生株と比較して、細胞内のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素に対する３－ヒドロキシヘキサノイル－ＣｏＡの供給が増大するように形質転換されており、前記共重合ポリヒドロキシアルカン酸混合物が、３－ヒドロキシ酪酸構造単位及び３－ヒドロキシヘキサン酸構造単位を有する共重合ポリヒドロキシアルカン酸を含み、かつ平均３－ヒドロキシヘキサン酸組成比率が２０モル％以上であるポリヒドロキシアルカン酸画分（Ｉ）、及び、３－ヒドロキシ酪酸構造単位を有するポリヒドロキシアルカン酸を含み、かつ平均３－ヒドロキシヘキサン酸組成比率が０モル％以上１５モル％以下であるポリヒドロキシアルカン酸画分（ＩＩ）を含有し、前記共重合ポリヒドロキシアルカン酸混合物は、平均３－ヒドロキシヘキサン酸組成比率が２２モル％以下である、形質転換微生物にも関する。
　本発明によると、優れた加工性と機械特性を両立した共重合ポリヒドロキシアルカン酸混合物を製造することができる。本発明の好適な実施形態によると、製造される共重合ポリヒドロキシアルカン酸混合物は、ハンドリングが容易であり、微生物からの工業的な単離及び精製を容易に実施することができる。
　以下に、本発明の実施形態について説明するが、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
　本発明は、共重合ＰＨＡ混合物を製造する方法であって、前記共重合ＰＨＡ混合物を産生する微生物を培養する工程を含む。
　（共重合ＰＨＡ混合物）
　前記共重合ＰＨＡ混合物は、３ＨＢ構造単位及び３ＨＨ構造単位を有する共重合ＰＨＡを含み、かつ平均３ＨＨ組成比率が２０モル％以上であるＰＨＡ画分（Ｉ）と、３ＨＢ構造単位を有するＰＨＡを含み、かつ平均３ＨＨ組成比率が０モル％以上１５モル％以下であるＰＨＡ画分（ＩＩ）から構成されるものである。前記共重合ＰＨＡ混合物は、後述するＭＩＢＫ分画法により、前記ＰＨＡ画分（Ｉ）とＰＨＡ画分（ＩＩ）に分画することができる。
　前記ＰＨＡ画分（Ｉ）は、少なくとも３ＨＢ構造単位及び３ＨＨ構造単位を有する共重合ＰＨＡを含む画分であり、３ＨＢ構造単位及び３ＨＨ構造単位以外のヒドロキシアルカン酸構造単位を含むＰＨＡを含んで良いが、好ましくは３ＨＢ構造単位及び３ＨＨ構造単位以外のヒドロキシアルカン酸構造単位を含まず、３ＨＢ構造単位及び３ＨＨ構造単位のみを有する共重合ＰＨＡを含む画分、即ちＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）を含む画分である。
　３ＨＢ構造単位及び３ＨＨ構造単位以外のヒドロキシアルカン酸構造単位としては、３－ヒドロキシプロピオン酸、３ＨＶ、炭素数７～１６の３－ヒドロキシアルカン酸、炭素数４～１６の２－ヒドロキシアルカン酸、４－ヒドロキシアルカン酸（例えば４－ヒドロキシ酪酸）、５－ヒドロキシアルカン酸、６－ヒドロキシアルカン酸（例えば６－ヒドロキシヘキサン酸）、乳酸などのヒドロキシアルカン酸の構造単位が挙げられるが、これらに限定されない。
　ＰＨＡ画分（Ｉ）における平均３ＨＨ組成比率は、２０モル％以上であり、好ましくは２２モル％以上であり、より好ましくは２４モル％以上である。該平均３ＨＨ組成比率の上限値は、特に限定されないが、好ましくは３５モル％以下であり、より好ましくは３２モル％以下であり、特に好ましくは３０モル％以下である。
　前記ＰＨＡ画分（ＩＩ）は、３ＨＢ構造単位を有するＰＨＡを含む画分である。ＰＨＡ画分（ＩＩ）に含まれるＰＨＡは、３ＨＢ構造単位のみを有する単独重合体であってもよいし、３ＨＢ構造単位とこれ以外のヒドロキシアルカン酸構造単位を有する共重合ＰＨＡであってもよい。機械物性を考慮すると、３ＨＢ構造単位とこれ以外のヒドロキシアルカン酸構造単位を有する共重合ＰＨＡが好ましい。当該共重合ＰＨＡとしては、３ＨＢ構造単位と、３ＨＶ構造単位及び／又は３ＨＨ構造単位とを有する共重合ＰＨＡが好ましく、３ＨＢ構造単位と３ＨＨ構造単位を有する共重合ＰＨＡがより好ましく、３ＨＢ構造単位及び３ＨＨ構造単位のみを有する共重合ＰＨＡ、即ちＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）がさらに好ましい。
　ＰＨＡ画分（ＩＩ）における平均３ＨＨ組成比率は、０モル％以上１５モル％以下である。該平均３ＨＨ組成比率の下限値は０．１モル％以上が好ましく、１モル％以上がより好ましく、２モル％以上がさらに好ましく、３モル％以上がより更に好ましい。該平均３ＨＨ組成比率の上限値は１２モル％以下が好ましく、１０モル％以下がより好ましい。
　前記共重合ＰＨＡ混合物中に前記ＰＨＡ画分（Ｉ）が占める重量割合は、１０％～９０％が好ましく、２０％～８０％がより好ましく、３０％～７０％が特に好ましい。また、前記共重合ＰＨＡ混合物中に前記ＰＨＡ画分（ＩＩ）が占める重量割合は、１０％～９０％が好ましく、２０％～８０％がより好ましく、３０％～７０％が特に好ましい。
　前記共重合ＰＨＡ混合物全体が示す平均３ＨＨ組成比率は、２２モル％以下である。該平均３ＨＨ組成比率が２２モル％を超えると、共重合ＰＨＡ混合物の粘着性が高くなり、微生物による発酵生産後の共重合ＰＨＡ混合物の単離及び精製工程において、意図しない凝集塊の形成や、配管又はポンプ設備内への付着又は閉塞などの問題が生じやすくなくなり、共重合ＰＨＡ混合物の工業的な単離及び精製が困難になる傾向がある。
　該混合物から形成される成形体の機械特性と、該混合物の加工特性や工業的なハンドリング性のバランスを考慮すると、前記共重合ＰＨＡ混合物全体が示す平均３ＨＨ組成比率は１０～２２モル％が好ましく、１１～２０モル％がより好ましく、１２～１８モル％がさらに好ましく、１３～１７モル％が特に好ましい。
　（ＭＩＢＫ分画法）
　前記共重合ＰＨＡ混合物は、メチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ）への溶解度の差を利用した溶媒分画法により、平均３ＨＨ組成比率が高いＰＨＡ画分（Ｉ）と、平均３ＨＨ組成比率が低いＰＨＡ画分（ＩＩ）に分画することができる。ＰＨＡは、３ＨＨ組成比率が高いほどＭＩＢＫへの溶解度が高くなる。そのため、前記共重合ＰＨＡ混合物の全部を高温のＭＩＢＫに溶解させた後、温度を低下させ、３ＨＨ組成比率の低いＰＨＡ成分を析出させることで、前記ＰＨＡ画分（Ｉ）とＰＨＡ画分（ＩＩ）に分画することが可能である。
　具体的な分画手順を以下に記す。まず共重合ＰＨＡ混合物約１００ｍｇをねじ口試験管に測り取り、ＭＩＢＫ１０ｍｌを加えてキャップを閉める。その後、１４０℃で１～３時間程度振り混ぜながら加温し、共重合ＰＨＡ混合物を完全に溶解させる。完全に溶解した後、２５℃で１分間放置して沸点以下に温度を低下させ、速やかに全ての溶解液を、あらかじめ重量を測定した遠沈管へ移し、キャップを閉める。キャップをした遠沈管をさらに２５℃で１５分間放置し、溶解物の一部を析出させる。遠心分離（９０００ｒｐｍ、５分間）により、析出物と溶解液を分離し、溶解液を全て、あらかじめ重量を測定したアルミカップへ移す。析出物の残った遠沈管に、ＭＩＢＫを１０ｍｌ加えてボルテックスミキサーで混合し、再度遠心分離（９０００ｒｐｍ、５分間）を行い、溶液を前記溶解液の入ったアルミカップへ移す。アルミカップを１２０℃で３０分加熱し、ＭＩＢＫを揮発させ、溶解物を析出させる。さらに、アルミカップに残った析出物と、遠沈管に残った析出物をそれぞれ、１００℃で６時間真空乾燥する。アルミカップに残った析出物をＰＨＡ画分（Ｉ）として、また、遠沈管に残った析出物をＰＨＡ画分（ＩＩ）としてそれぞれ秤量する。ＰＨＡ画分（Ｉ）とＰＨＡ画分（ＩＩ）の合計重量と、初めに測定した共重合ＰＨＡ混合物の重量の差が±３％以内であることを確認する。
　（共重合ＰＨＡ混合物が示す融解挙動）
　前記共重合ＰＨＡ混合物は、これについて測定した示差走査熱量分析における最も高い融解ピーク温度が、１３０℃以上であることが好ましい。この条件を満足することにより、共重合ＰＨＡ混合物の結晶固化が短時間で進行することができ、該共重合ＰＨＡ混合物の加工性を良好なものにすることができる。前記最も高い融解ピーク温度は、１３０～１６５℃が好ましく、より好ましくは１３０～１５５℃である。
　前記共重合ＰＨＡ混合物が示す最も高い融解ピーク温度は、示差走査熱量測定装置を用いて、前記共重合ＰＨＡ混合物を約２ｍｇ計量し、１０℃／分の昇温速度にて－３０℃から２００℃まで昇温した時に得られるＤＳＣ曲線において、最も高温側の融解ピークの温度として測定される。
　前記共重合ＰＨＡ混合物は、最も高温側の融解ピークに加えて、このピークよりも低温側の領域において、別の融解ピークを有していてもよく、例えば１００℃以下にも融解ピークを有していてもよい。
　（共重合ＰＨＡ混合物生産微生物）
　前記共重合ＰＨＡ混合物を製造するにあたって使用する微生物（以下、「共重合ＰＨＡ混合物生産微生物」ともいう）は、前記共重合ＰＨＡ混合物を発酵生産可能な微生物であれば特に限定されず、ＰＨＡを本来的に蓄積する野生株であってもよいし、そのような野生株を人工的に突然変異処理して得られる変異株や、あるいは、遺伝子工学的手法により外来のＰＨＡ合成酵素遺伝子を導入することで、ＰＨＡ蓄積能が付与された菌株であってもよい。
　前記共重合ＰＨＡ混合物生産微生物としては、又は、該微生物が形質転換体である場合、該形質転換体の宿主としては、特に限定されないが、例えば、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、カプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属、ワウテルシア（Ｗａｕｔｅｒｓｉａ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属等に属する細菌類が好ましい例として挙げられる。安全性及びＰＨＡ生産性の観点から、より好ましくはラルストニア属、カプリアビダス属、アエロモナス属、ワウテルシア属に属する細菌であり、さらに好ましくはカプリアビダス属又はアエロモナス属に属する細菌であり、さらにより好ましくはカプリアビダス属に属する細菌であり、特に好ましくはカプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｎｅｃａｔｏｒ）である。
　前記共重合ＰＨＡ混合物生産微生物は、平均３ＨＨ組成比率が異なる２種類のＰＨＡをそれぞれ効率よく生産できるよう、３－ヒドロキシヘキサノイル－ＣｏＡに対する重合活性が互いに異なる２種類のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子を有する微生物であることが好ましい。３－ヒドロキシヘキサノイル－ＣｏＡはＰＨＡに含まれる３ＨＨ構造単位の前駆体である。前記微生物が３－ヒドロキシヘキサノイル－ＣｏＡに対する重合活性が互いに異なる２種類のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子を有することで、平均３ＨＨ組成比率が大きく異なる２種類のＰＨＡの混合物、即ち前記共重合ＰＨＡ混合物を当該微生物の細胞内に発酵生産させることができる。前記微生物は、３－ヒドロキシヘキサノイル－ＣｏＡに対する重合活性が互いに異なるＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子を少なくとも２種類有していればよく、前記共重合ＰＨＡ混合物を発酵生産可能である限りは、前記遺伝子を３種類以上有していても良い。
　前記３－ヒドロキシヘキサノイル－ＣｏＡに対する重合活性が互いに異なる２種類のＰＨＡ合成酵素は特に限定されないが、当該２種類のＰＨＡ合成酵素間のアミノ酸配列の配列同一性は９０％以下であることが好ましい。より好ましくは８０％以下であり、さらに好ましくは７０％以下である。一般にＰＨＡ合成酵素はダイマー等の多量体を形成して機能すると考えられている。前記２種類のＰＨＡ合成酵素間のアミノ酸配列の配列相同性が９０％よりも高い場合、当該２種類のＰＨＡ合成酵素がヘテロダイマー等を形成し、前記共重合ＰＨＡ混合物を生産できない可能性が考えられる。
　前記３－ヒドロキシヘキサノイル－ＣｏＡに対する重合活性が互いに異なる２種類のＰＨＡ合成酵素の組合せの具体例としては、例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するアエロモナス・キャビエに由来する野生型ＰＨＡ合成酵素よりも３－ヒドロキシヘキサノイル－ＣｏＡに対する重合活性が高いＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子（Ａ）と、前記アエロモナス・キャビエに由来する野生型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素よりも３－ヒドロキシヘキサノイル－ＣｏＡに対する重合活性が低いＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子（Ｂ）の組合せが挙げられる。
　前記遺伝子（Ａ）としては、例えば、アエロモナス属の微生物に由来するポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子又はその変異体が挙げられ、具体的には、配列番号２又は配列番号３で示されるアミノ酸配列（アエロモナス属細菌に由来するＰＨＡ合成酵素変異体のアミノ酸配列）に対して９０～１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子が挙げられる。前記配列同一性は９５％以上が好ましく、９７％以上がより好ましく、９９％以上が特に好ましく、９９．５％以上が最も好ましい。
　前記遺伝子（Ｂ）としては、アエロモナス属の微生物に由来するポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子の一部と、カプリアビダス属の微生物に由来するポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子の一部を組み合わせて構成された遺伝子が挙げられ、具体的には、配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して９０～１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子が挙げられる。また、前記遺伝子（Ｂ）として、クロモバクテリウム属細菌に由来するＰＨＡ合成酵素遺伝子又はその変異体も挙げられ、具体的には、配列番号４又は配列番号５に記載のアミノ酸配列に対して９０～１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子が挙げられる。あるいは、前記遺伝子（Ｂ）として、バチルス属細菌に由来するＰＨＡ合成酵素遺伝子又はその変異体も挙げられ、具体的には、配列番号７及び配列番号８に記載のアミノ酸配列に対して９０～１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子が挙げられる。前記遺伝子（Ｂ）について上述した各配列同一性は９５％以上が好ましく、９７％以上がより好ましく、９９％以上が特に好ましい。
　前記共重合ＰＨＡ混合物生産微生物は、平均３ＨＨ組成比率が高い共重合ＰＨＡ混合物を効率よく生産するために、該微生物の野生株と比較して、細胞内のＰＨＡ合成酵素に対する３－ヒドロキシヘキサノイル－ＣｏＡの供給が増大するように形質転換された形質転換微生物であることが好ましい。具体的には、油脂又は脂肪酸のβ酸化における炭素数６の中間代謝物の分解が抑制されるように形質転換された形質転換微生物が好ましい。β酸化における炭素数６の中間代謝物の分解が抑制される結果、３－ヒドロキシヘキサノイル－ＣｏＡの供給量が増大し、生産される共重合ＰＨＡ混合物が示す平均３ＨＨ組成比率が高まるものと推測される。
　油脂又は脂肪酸のβ酸化における炭素数６の中間代謝物の分解が抑制されるように形質転換された形質転換微生物としては、例えば特許文献７に記載されているような、炭素数６のβ－ケトアシル－ＣｏＡであるβ－ケトヘキサノイル－ＣｏＡに対するチオリシス活性を有するβ－ケトチオラーゼ酵素をコードする遺伝子の発現が抑制されるように形質転換された形質転換微生物が挙げられる。前記β－ケトチオラーゼ酵素をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号９又は配列番号１０に記載のアミノ酸配列に対して９０～１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列を有するβ－ケトチオラーゼ酵素をコードする遺伝子が挙げられるが、これに限定されない。前記配列同一性は９５％以上が好ましく、９７％以上がより好ましく、９９％以上が特に好ましい。
　β－ケトチオラーゼ酵素をコードする遺伝子の発現を抑制するには、例えば、形質転換微生物において当該酵素遺伝子を完全に欠失させる方法、あるいは、当該酵素遺伝子の配列内部に薬剤耐性遺伝子などの全く別の遺伝子を挿入する方法、あるいは、当該酵素遺伝子の配列の一部（好ましくは、酵素活性に関わる領域）を欠失するか、置換、付加又は挿入する方法等が挙げられる。遺伝子破壊操作は、例えば、破壊用遺伝子もしくは破壊用ＤＮＡを含むベクターを用いる相同組換え技術、トランスポゾンを利用する技術などを含む。あるいは、別の破壊方法として、標的遺伝子を破壊するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）システムやＴＡＬＥＮによるゲノム編集技術（Ｙ．　Ｗａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　ＡＣＳ　Ｓｙｎｔｈ　Ｂｉｏｌ．　２０１６，　５（７）：７２１－７３２；Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ　ａｎｄ　Ｖｏｙｔａｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３３：１８４３－１８４６，２０１１；Ｊｉｎｅｋ，ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７：８１６－８２１，２０１２；Ｓｈａｌｅｍ，ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４３：８４－８７，２０１４；Ｗａｎｇ，ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４３：８０－８４，２０１４）などの公知の技術が挙げられる。例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムでは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は破壊すべきβ－ケトチオラーゼ遺伝子の塩基配列の一部に結合しうる配列を有しており、Ｃａｓ９を標的に運ぶ役割をもつ。また、該当遺伝子周辺の塩基配列の欠失、置換、付加、挿入などの変異により、遺伝子の転写・翻訳効率、ｍＲＮＡの安定性を低下させるなどして、当該酵素活性を消失または低下させることもできる。
　前記共重合ＰＨＡ混合物生産微生物は、平均３ＨＨ組成比率が高い共重合ＰＨＡ混合物を効率よく生産するために、Ｒ体特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ活性を示すタンパク質をコードする遺伝子を有する微生物であることが好ましい。Ｒ体特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼは、微生物細胞内においてへキセノイル－ＣｏＡを３－ヒドロキシヘキサノイル－ＣｏＡに変換する機能を有する。このため、前記微生物がＲ体特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ活性を示すタンパク質をコードする遺伝子を有することによって、３－ヒドロキシヘキサノイル－ＣｏＡへの変換量が増大し、結果、生産される共重合ＰＨＡ混合物が示す平均３ＨＨ組成比率が高まるものと推測される。
　前記Ｒ体特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ活性を示すタンパク質をコードする遺伝子を有する微生物は、該遺伝子を本来的に有する微生物であってもよいし、外来の該遺伝子が遺伝子工学的手法により導入された微生物であってもよい。
　前記外来のＲ体特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ活性を持つタンパク質をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有するＲ体特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼをコードするアエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｃａｖｉａｅ）由来の遺伝子、配列番号１２又は配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有するＲ体特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼをコードするカプリアビダス・ネカトール由来の遺伝子、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する酵素をコードするヤロウィア・リポリティカ由来のＭｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｅｎｚｙｍｅ　ｔｙｐｅ　２（ＭＦＥ２）遺伝子、配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有する酵素をコードするドロソフィラ・メラノガスター由来のＭＦＥ２遺伝子、または、配列番号１１～１５に記載の各アミノ酸配列に対して８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有し、且つ、Ｒ体特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ活性を持つタンパク質をコードする遺伝子などが挙げられるが、これらに限定されない。
　また、Ｒ体特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ活性を持つタンパク質をコードする遺伝子の発現を強化するために、例えば国際公開第２０１５／１１５６１９号に記載されるように、当該遺伝子の発現を増強するための発現調節配列（プロモーター配列および／またはＳＤ配列）の改変を行ってもよい。
　共重合ＰＨＡ混合物生産微生物が外来の遺伝子を導入されたものである場合、導入遺伝子は、宿主となる微生物が保有する染色体上、あるいはプラスミド、メガプラスミドなどのＤＮＡ上に存在しても良い。導入遺伝子の保持という観点から、微生物が保有する染色体あるいはメガプラスミド上に存在するのが好ましく、微生物が保有する染色体上に存在するのがより好ましい。また、宿主となる微生物が元来保持している遺伝子の発現量を増加させる場合には、該遺伝子の上流の塩基配列を置換、欠失または付加すること等により、遺伝子の発現量を増加させてもよい。
　微生物が保有するＤＮＡ上に任意のＤＮＡを部位特異的に置換または挿入する方法、あるいは微生物が保有するＤＮＡの任意の部位を欠失させる方法は当業者に周知であり、本実施形態に係る形質転換微生物を製造する際に使用できる。特に限定されないが、代表的な方法としては、トランスポゾンと相同組換えの機構を利用した方法（Ｏｈｍａｎ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ．１６２：ｐ．１０６８（１９８５））、相同組換えの機構によって起こる部位特異的な組み込みと第二段階の相同組換えによる脱落を原理とした方法（Ｎｏｔｉ等，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，ｖｏｌ．１５４，ｐ．１９７（１９８７））、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｓａｃＢ遺伝子を共存させて、第二段階の相同組換えによって遺伝子が脱落した微生物株をシュークロース添加培地耐性株として容易に単離する方法（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．６，ｐ．１１９５（１９９２）；Ｌｅｎｚ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ．１７６，ｐ．４３８５（１９９４））等が挙げられる。また、細胞へのベクターの導入方法としても特に限定されないが、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、スフェロプラスト法等が挙げられる。
　なお、遺伝子クローニングや遺伝子組み換え技術については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９または２００１）などに記載される技術を利用することができる。
　導入遺伝子を発現させるためのプロモーターは特に限定されない。カプリアビダス・ネカトールのｐｈａＣ１遺伝子のプロモーター、ｐｈａＰ１遺伝子のプロモーター、大腸菌に由来するｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔｉｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、あるいは人工的に作製された配列番号１６で示される大腸菌由来の改変塩基配列を有するｌａｃＮ１７プロモーター、人工的に作製された配列番号１７で示される大腸菌由来の改変塩基配列を有するｌａｃＮ１９プロモーター等が使用可能である。
　（微生物の培養）
　前記共重合ＰＨＡ混合物生産微生物を培養することで、微生物細胞内に前記共重合ＰＨＡ混合物を蓄積させることができる。前記共重合ＰＨＡ混合物生産微生物を培養する方法としては、常法の微生物培養法に従うことができ、適切な炭素源が存在する培地中で培養を行なえばよい。培地組成、炭素源の添加方法、培養スケール、通気攪拌条件や、培養温度、培養時間などは特に限定されない。炭素源は、連続的に、または間欠的に培地に添加することが好ましい。
　培養時の炭素源としては、前記共重合ＰＨＡ混合物生産微生物が資化可能であればどのような炭素源でも使用可能である。特に限定されないが、例えば、グルコース、フルクトース、シュークロース、キシロースなどの糖類；パーム油やパーム核油（これらを分別した低融点分画であるパームオレイン、パームダブルオレイン、パーム核油オレインなども含む）、コーン油、やし油、オリーブ油、大豆油、菜種油、ヤトロファ油などの油脂やその分画油類、あるいはその精製副産物；ラウリン酸、オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリンスチン酸などの脂肪酸やそれらの誘導体、あるいはグリセロール等が挙げられる。また、前記共重合ＰＨＡ混合物生産微生物が二酸化炭素、一酸化炭素、メタン、メタノール、エタノールなどのガスやアルコール類を利用可能である場合、これらを炭素源として使用することもできる。
　中でも、炭素源は油脂又は脂肪酸を含むことが好ましい。前記油脂としては、植物油又はその分画油類が好ましい。前記油脂又は脂肪酸の鎖長は短い方が好ましく、前記炭素源は炭素数６～１２の中鎖脂肪酸、又は該中鎖脂肪酸のグリセリドを含むことがより好ましく、前記炭素源はヘキサン酸を含むことがさらに好ましい。炭素源に含まれる脂肪酸の炭素数が６～１２であると、β酸化における炭素数６の中間代謝物の生成量が多くなり、平均３ＨＨ組成比率の高いＰＨＡ画分を効率よく得ることができると考えられる。
　前記共重合ＰＨＡ混合物の製造では、上記炭素源、炭素源以外の栄養源である窒素源、無機塩類、その他の有機栄養源を含む培地を用いて、前記微生物を培養することが好ましい。下記に限定されないが、窒素源としては、例えば、アンモニア；塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩；ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。無機塩類としては、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。その他の有機栄養源としては、例えば、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸、ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。
　前記共重合ＰＨＡ混合物生産微生物の培養を適切な時間行なって微生物細胞内に前記共重合ＰＨＡ混合物を蓄積させた後、周知の方法を用いて前記共重合ＰＨＡ混合物を回収する。回収方法については特に限定されないが、工業的には、環境負荷の低い水系における分離・精製による回収が好ましい。例えば、培養終了後、機械的なせん断力を加えたり、界面活性剤やアルカリ、酵素などを用いて細胞を破砕することで、ＰＨＡ以外の細胞成分が水に溶解した細胞破砕液を得ることができる。前記細胞破砕液の濾過や遠心分離によって前記共重合ＰＨＡ混合物を水相から分離した後、乾燥させることで、前記共重合ＰＨＡ混合物を回収することができる。
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。なお全体的な遺伝子操作は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９））に記載されているように行うことができる。また、遺伝子操作に使用する酵素、クローニング宿主等は、市場の供給者から購入し、その説明に従い使用することができる。なお、酵素としては、遺伝子操作に使用できるものであれば特に限定されない。
　（微生物株作製例１）共重合ＰＨＡ混合物生産微生物株（１）の作製
　まず、ＰＨＡ合成酵素遺伝子破壊用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
　合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株のｐｈａＣ１構造遺伝子（ＰＨＡ合成酵素遺伝子）より上流及び下流の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号１８）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、同じくＳｗａＩ消化した特開２００７－２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ＰＨＡ合成酵素遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｐｈａＣ１ＵＤを作製した。
　次に、ＰＨＡ合成酵素遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｐｈａＣ１ＵＤを用いて、以下のようにしてＰＨＡ合成酵素遺伝子破壊株の作製を行った。
　ＰＨＡ合成酵素遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｐｈａＣ１ＵＤで大腸菌Ｓ１７－１株（ＡＴＣＣ４７０５５）を形質転換し、それによって得た形質転換微生物を、ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ／ｄＡ１５２８株とＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。
　なお、ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ／ｄＡ１５２８株は、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株の染色体上のｐｈａＺ１遺伝子、ｐｈａＺ２遺伝子、及びｐｈａＺ６遺伝子を欠失し、染色体上のＰＨＡ合成酵素遺伝子を、アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子の改変体（配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子、即ちＮ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ変異体遺伝子）に置換し、染色体上のＲ体特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現が強化され、ｂｋｔＢ構造遺伝子を欠失し、さらにＡ１５２８構造遺伝子を欠失した株であり、ＰＣＴ国際公開第２０１９／１４２８４５号に記載の方法に準じて作製することができる。
　得られた培養液を、２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水塩０．２ｇ／Ｌ、りん酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、りん酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）に播種し、寒天培地上で生育してきた菌株を選択して、プラスミドがＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ／ｄＡ１５２８株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株をプラスミドが脱落した株として取得した。さらにＰＣＲおよびＤＮＡシーケンサーによる解析により染色体上のＰＨＡ合成酵素遺伝子を欠失した菌株１株を単離した。この遺伝子破壊株を、ＫＮＫ００５ｄＺ／ｄＮＳＤＧ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ／ｄＡ１５２８株と命名した。
　さらに、ＰＨＡ合成酵素遺伝子導入用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
　合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株のｂｋｔＢ構造遺伝子（β－ケトチオラーゼ遺伝子）より上流及び下流の塩基配列と、大腸菌のｌａｃプロモーター改変体であるｌａｃＮ１９プロモーター、及び配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号１９）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、同じくＳｗａＩ消化した特開２００７－２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ＰＨＡ合成酵素遺伝子導入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｂｋｔｂＵ－ｌａｃＮ１９－ＮＳＤＧ－ｂｋｔｂＤを作製した。
　次に、ＰＨＡ合成酵素遺伝子導入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｂｋｔｂＵ－ｌａｃＮ１９－ＮＳＤＧ－ｂｋｔｂＤを用いて、以下のようにしてＰＨＡ合成酵素遺伝子導入株の作製を行った。
　ＰＨＡ合成酵素遺伝子導入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｂｋｔｂＵ－ｌａｃＮ１９－ＮＳＤＧ－ｂｋｔｂを上記と同様の接合伝達を用いた方法によって、ＫＮＫ００５ｄＺ／ｄＮＳＤＧ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ／ｄＡ１５２８株に導入した。さらに上記と同様の培養及び１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地による選抜で、染色体上の元来ｂｋｔＢ遺伝子が存在した位置にｌａｃＮ１９プロモーター、及び配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入された菌株１株を単離した。得られた菌株をＫＮＫ００５ｄＺ／ｄＮＳＤＧ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ：：ｌａｃＮ１９－ＮＳＤＧ／ｄＡ１５２８株と命名した。
　さらに、ＰＨＡ合成酵素遺伝子導入用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
　合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株のＡ１５２８構造遺伝子（β－ケトチオラーゼ遺伝子）より上流及び下流の塩基配列と、大腸菌のｌａｃプロモーター改変体であるｌａｃＮ１７プロモーター、及び配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号２０）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、同じくＳｗａＩ消化した特開２００７－２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ＰＨＡ合成酵素遺伝子導入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋Ａ１５２８Ｕ－ｌａｃＮ１７－ＡｃＮＳＲｅ１２－Ａ１５２８Ｄを作製した。
　次に、ＰＨＡ合成酵素遺伝子導入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋Ａ１５２８Ｕ－ｌａｃＮ１７－ＡｃＮＳＲｅ１２－Ａ１５２８Ｄを上記と同様の接合伝達を用いた方法によって、ＫＮＫ００５ｄＺ／ｄＮＳＤＧ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ：：ｌａｃＮ１９－ＮＳＤＧ／ｄＡ１５２８株に導入した。さらに上記と同様の培養及び１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地による選抜で、染色体上の元来Ａ１５２８遺伝子が存在した位置にｌａｃＮ１７プロモーター、及び配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入された菌株１株を単離した。得られた菌株をＫＮＫ００５ｄＺ／ｄＮＳＤＧ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ：：ｌａｃＮ１９－ＮＳＤＧ／ｄＡ１５２８：：ｌａｃＮ１７－ＡｃＮＳＲｅ１２株（以下、共重合ＰＨＡ混合物生産微生物株（１）と記すこともある。）と命名した。
　なお、共重合ＰＨＡ混合物生産微生物株（１）は、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株の染色体上のｐｈａＺ１遺伝子、ｐｈａＺ２遺伝子、及びｐｈａＺ６遺伝子を欠失し、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するアエロモナス属由来のＰＨＡ合成酵素変異体をコードする遺伝子と、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子（即ち、アエロモナス属の微生物に由来するポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子の一部とカプリアビダス属の微生物に由来するポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子の一部を組み合わせて構成された、ＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子）が導入され、染色体上のＲ体特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現が強化され、ｂｋｔＢ構造遺伝子（β－ケトチオラーゼ遺伝子）を欠失し、さらにＡ１５２８構造遺伝子（β－ケトチオラーゼ遺伝子）を欠失した株である。
　（微生物株作製例２）共重合ＰＨＡ混合物生産微生物株（２）の作製
　まず、ＰＨＡ合成酵素遺伝子導入用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
　合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株のｂｋｔＢ構造遺伝子（β－ケトチオラーゼ遺伝子）より上流及び下流の塩基配列と、大腸菌のｌａｃプロモーター、及び配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号２１）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、同じくＳｗａＩ消化した特開２００７－２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ＰＨＡ合成酵素遺伝子導入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｂｋｔｂＵ－ｌａｃ－ＮＳＤＧ－ｂｋｔｂＤを作製した。
　次に、ＰＨＡ合成酵素遺伝子導入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｂｋｔｂＵ－ｌａｃ－ＮＳＤＧ－ｂｋｔｂＤを用いて、以下のようにしてＰＨＡ合成酵素遺伝子導入株の作製を行った。
　ＰＨＡ合成酵素遺伝子導入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｂｋｔｂＵ－ｌａｃ－ＮＳＤＧ－ｂｋｔｂを上記と同様の接合伝達を用いた方法によって、ＫＮＫ００５ｄＺ／ｄＮＳＤＧ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ／ｄＡ１５２８株に導入した。さらに上記と同様の培養及び１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地による選抜で、染色体上の元来ｂｋｔＢ遺伝子が存在した位置にｌａｃプロモーター、及び配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入された菌株１株を単離した。得られた菌株をＫＮＫ００５ｄＺ／ｄＮＳＤＧ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ：：ｌａｃ－ＮＳＤＧ／ｄＡ１５２８株と命名した。
　次に、ＰＨＡ合成酵素遺伝子導入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋Ａ１５２８Ｕ－ｌａｃＮ１７－ＡｃＮＳＲｅ１２－Ａ１５２８Ｄを上記と同様の接合伝達を用いた方法によって、ＫＮＫ００５ｄＺ／ｄＮＳＤＧ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ：：ｌａｃ－ＮＳＤＧ／ｄＡ１５２８株に導入した。　さらに上記と同様の培養及び１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地による選抜で、染色体上の元来Ａ１５２８遺伝子が存在した位置にｌａｃＮ１７プロモーター、及び配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入された菌株１株を単離した。得られた菌株をＫＮＫ００５ｄＺ／ｄＮＳＤＧ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ：：ｌａｃ－ＮＳＤＧ／ｄＡ１５２８：：ｌａｃＮ１７－ＡｃＮＳＲｅ１２株（以下、共重合ＰＨＡ混合物生産微生物株（２）と記すこともある。）と命名した。
　なお、共重合ＰＨＡ混合物生産微生物株（２）は、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株の染色体上のｐｈａＺ１遺伝子、ｐｈａＺ２遺伝子、及びｐｈａＺ６遺伝子を欠失し、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するアエロモナス属由来のＰＨＡ合成酵素変異体をコードする遺伝子と、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子（即ち、アエロモナス属の微生物に由来するポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子の一部とカプリアビダス属の微生物に由来するポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子の一部を組み合わせて構成された、ＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子）が導入され、染色体上のＲ体特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現が強化され、ｂｋｔＢ構造遺伝子（β－ケトチオラーゼ遺伝子）を欠失し、さらにＡ１５２８構造遺伝子（β－ケトチオラーゼ遺伝子）を欠失した株である。
　（微生物株作製例３）共重合ＰＨＡ混合物生産微生物株（３）の作製
　まず、ＰＨＡ合成酵素遺伝子発現用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、大腸菌のｌａｃプロモーター改変体であるｌａｃＮ１７プロモーターを有するＤＮＡ断片（配列番号２２）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＭｕｎＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、国際公開２００７／０４９７１６号に記載のプラスミドベクターｐＣＵＰ２をＭｕｎＩで切断したものと連結して、ｌａｃＮ１７プロモーターの下流にｐＣＵＰ２の制限酵素ＳｐｅＩ認識配列が位置する向きに連結されたものを選抜し、ｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７を得た。次に、合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子及び配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号２３）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、ｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７をＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで切断したものと連結して、ＰＨＡ合成酵素遺伝子発現用プラスミドｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ＡｃＮＳＲｅ１２－ＮＳＤＧを得た。
　次に、ＰＨＡ合成酵素遺伝子発現用プラスミドｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ＡｃＮＳＲｅ１２－ＮＳＤＧをＫＮＫ００５ｄＺ／ｄＮＳＤＧ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ／ｄＡ１５２８株に導入し、ｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ＡｃＮＳＲｅ１２－ＮＳＤＧ／ＫＮＫ００５ｄＺ／ｄＮＳＤＧ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ／ｄＡ１５２８株（以下、共重合ＰＨＡ混合物生産微生物株（３）と記すこともある。）を得た。
　プラスミドベクターの細胞への導入は以下のようにエレクトロポレーション法によって行った。遺伝子導入装置はＢｉｏｒａｄ社製のジーンパルサーを用い、キュベットは同じくＢｉｏｒａｄ社製のｇａｐ０．２ｃｍを用いた。キュベットに、コンピテント細胞４００μｌと発現ベクター２０μｌを注入してパルス装置にセットし、静電容量２５μＦ、電圧１．５ｋＶ、抵抗値８００Ωの条件で電気パルスをかけた。パルス後、キュベット内の菌液をＮｕｔｒｉｅｎｔＢｒｏｔｈ培地（ＤＩＦＣＯ社製）で３０℃、３時間振とう培養し、選択プレート（ＮｕｔｒｉｅｎｔＡｇａｒ培地（ＤＩＦＣＯ社製）、カナマイシン１００ｍｇ／Ｌ）で、３０℃にて２日間培養して、生育してきた共重合ＰＨＡ混合物生産微生物株（３）を取得した。
　なお、共重合ＰＨＡ混合物生産微生物株（３）は、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株の染色体上のｐｈａＺ１遺伝子、ｐｈａＺ２遺伝子、及びｐｈａＺ６遺伝子を欠失し、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するアエロモナス属由来のＰＨＡ合成酵素変異体をコードする遺伝子と、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子（即ち、アエロモナス属の微生物に由来するポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子の一部とカプリアビダス属の微生物に由来するポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子の一部を組み合わせて構成された、ＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子）が導入され、染色体上のＲ体特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現が強化され、ｂｋｔＢ構造遺伝子（β－ケトチオラーゼ遺伝子）を欠失し、さらにＡ１５２８構造遺伝子（β－ケトチオラーゼ遺伝子）を欠失した株である。
　（微生物株作製例４）共重合ＰＨＡ混合物生産微生物株（４）の作製
　まず、ＰＨＡ合成酵素遺伝子導入用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
　合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株のｂｋｔＢ構造遺伝子（β－ケトチオラーゼ遺伝子）より上流及び下流の塩基配列と、大腸菌のｌａｃプロモーター、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子、及び配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号２４）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、同じくＳｗａＩ消化した特開２００７－２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ＰＨＡ合成酵素遺伝子導入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｂｋｔｂＵ－ｌａｃ－ＡｃＮＳＲｅ１２－ＮＳＤＧ－ｂｋｔｂＤを作製した。
　次に、ＰＨＡ合成酵素遺伝子導入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｂｋｔｂＵ－ｌａｃ－ＡｃＮＳＲｅ１２－ＮＳＤＧ－ｂｋｔｂＤを用いて、以下のようにしてＰＨＡ合成酵素遺伝子導入株の作製を行った。
　ＰＨＡ合成酵素遺伝子導入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｂｋｔｂＵ－ｌａｃ－ＡｃＮＳＲｅ１２－ＮＳＤＧ－ｂｋｔｂＤを上記と同様の接合伝達を用いた方法によって、ＫＮＫ００５ｄＺ／ｄＮＳＤＧ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ／ｄＡ１５２８株に導入した。さらに上記と同様の培養及び１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地による選抜で、染色体上の元来ｂｋｔＢ遺伝子が存在した位置にｌａｃプロモーター、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子、及び配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入された菌株１株を単離した。得られた菌株をＫＮＫ００５ｄＺ／ｄＮＳＤＧ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ：：ｌａｃ－ＡｃＮＳＲｅ１２－ＮＳＤＧ／ｄＡ１５２８株（以下、共重合ＰＨＡ混合物生産微生物株（４）と記すこともある。）と命名した。
　なお、共重合ＰＨＡ混合物生産微生物株（４）は、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株の染色体上のｐｈａＺ１遺伝子、ｐｈａＺ２遺伝子、及びｐｈａＺ６遺伝子を欠失し、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するアエロモナス属由来のＰＨＡ合成酵素変異体をコードする遺伝子と、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子（即ち、アエロモナス属の微生物に由来するポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子の一部とカプリアビダス属の微生物に由来するポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子の一部を組み合わせて構成された、ＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子）が導入され、染色体上のＲ体特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現が強化され、ｂｋｔＢ構造遺伝子（β－ケトチオラーゼ遺伝子）を欠失し、さらにＡ１５２８構造遺伝子（β－ケトチオラーゼ遺伝子）を欠失した株である。
　（微生物株作製例５）共重合ＰＨＡ混合物生産微生物株（５）の作製
　まず、ＰＨＡ合成酵素遺伝子発現用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子、及び配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号２６）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、ｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７をＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで切断したものと連結して、ＰＨＡ合成酵素遺伝子発現用プラスミドｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ＲＣＹＢ４－ＮＳＤＧＳＴを得た。
　次に、ＰＨＡ合成酵素遺伝子発現用プラスミドｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ＲＣＹＢ４－ＮＳＤＧＳＴを、微生物株作製例３に記載のエレクトロポレーション法によって、ＫＮＫ００５ｄＺ／ｄＮＳＤＧ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ／ｄＡ１５２８株に導入し、ｐＣＵＰ２－ｌａｃＮ１７－ＲＣＹＢ４－ＮＳＤＧＳＴ／ＫＮＫ００５ｄＺ／ｄＮＳＤＧ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ／ｄＡ１５２８株（以下、共重合ＰＨＡ混合物生産微生物株（５）と記すこともある。）を得た。
　なお、共重合ＰＨＡ混合物生産微生物株（５）は、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株の染色体上のｐｈａＺ１遺伝子、ｐｈａＺ２遺伝子、及びｐｈａＺ６遺伝子を欠失し、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するアエロモナス属由来のＰＨＡ合成酵素変異体をコードする遺伝子と、配列番号７及び配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するバチルス属由来のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入され、染色体上のＲ体特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現が強化され、ｂｋｔＢ構造遺伝子（β－ケトチオラーゼ遺伝子）を欠失し、さらにＡ１５２８構造遺伝子（β－ケトチオラーゼ遺伝子）を欠失した株である。
　（微生物株作製例６）共重合ＰＨＡ混合物生産微生物株（６）の作製
　まず、ＰＨＡ合成酵素遺伝子導入用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株のＡ１５２８構造遺伝子（β－ケトチオラーゼ遺伝子）より上流及び下流の塩基配列と、大腸菌のｌａｃプロモーター改変体であるｌａｃＮ１７プロモーター、及び配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号２７）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、同じくＳｗａＩ消化した特開２００７－２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ＰＨＡ合成酵素遺伝子導入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋Ａ１５２８Ｕ－ｌａｃＮ１７－ＣｓＡＧ－Ａ１５２８Ｄを作製した。
　次に、ＰＨＡ合成酵素遺伝子導入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋Ａ１５２８Ｕ－ｌａｃＮ１７－ＣｓＡＧ－Ａ１５２８Ｄを上記と同様の接合伝達を用いた方法によって、ＫＮＫ００５ｄＺ／ｄＮＳＤＧ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ：：ｌａｃ－ＮＳＤＧ／ｄＡ１５２８株に導入した。さらに上記と同様の培養及び１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地による選抜で、染色体上の元来Ａ１５２８遺伝子が存在した位置にｌａｃＮ１７プロモーター、及び配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入された菌株１株を単離した。得られた菌株をＫＮＫ００５ｄＺ／ｄＮＳＤＧ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ：：ｌａｃ－ＮＳＤＧ／ｄＡ１５２８：：ｌａｃＮ１７－ＣｓＡＧ株（以下、共重合ＰＨＡ混合物生産微生物株（６）と記すこともある。）と命名した。
　なお、共重合ＰＨＡ混合物生産微生物株（６）は、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株の染色体上のｐｈａＺ１遺伝子、ｐｈａＺ２遺伝子、及びｐｈａＺ６遺伝子を欠失し、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するアエロモナス属由来のＰＨＡ合成酵素変異体をコードする遺伝子と、配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するクロモバクテリウム属由来のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入され、染色体上のＲ体特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現が強化され、ｂｋｔＢ構造遺伝子（β－ケトチオラーゼ遺伝子）を欠失し、さらにＡ１５２８構造遺伝子（β－ケトチオラーゼ遺伝子）を欠失した株である。
　（微生物株作製例７）Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）生産微生物株（１）の作製
　ＫＮＫ００５ｄＺ株（以下、Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）生産微生物株（１）と記すこともある。）は、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株の染色体上にアエロモナス属由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子（配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子）が導入され、染色体上のＰＨＡ分解酵素遺伝子であるｐｈａＺ１，２，６遺伝子が欠失した形質転換微生物である。この形質転換微生物は、ＰＣＴ国際公開第２０１４／０６５２５３号に記載の方法に準じて作製することができる。
　（微生物株作製例８）Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）生産微生物株（２）の作製
　まず、ＰＨＡ合成酵素遺伝子導入用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
　合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株のｐｈａＺ６構造遺伝子より上流及び下流の塩基配列と、大腸菌のｌａｃプロモーター改変体であるｌａｃＮ１７プロモーター、及び配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号２８）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、同じくＳｗａＩ消化した特開２００７－２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ＰＨＡ合成酵素遺伝子導入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｐｈａＺ６Ｕ－ｌａｃＮ１７－ＮＳＤＧ－ｐｈａＺ６Ｄを作製した。
　次に、ＰＨＡ合成酵素遺伝子導入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｐｈａＺ６Ｕ－ｌａｃＮ１７－ＮＳＤＧ－ｐｈａＺ６Ｄを上記と同様の接合伝達を用いた方法によって、ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ株に導入した。
　なお、ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ株は、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株の染色体上のｐｈａＺ１遺伝子、ｐｈａＺ２遺伝子、及びｐｈａＺ６遺伝子を欠失し、染色体上のＰＨＡ合成酵素遺伝子を、アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子の改変体（配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子、即ちＮ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ変異体遺伝子）に置換し、染色体上のＲ体特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現が強化され、ｂｋｔＢ構造遺伝子を欠失した株であり、ＰＣＴ国際公開第２０１９／１４２８４５号に記載の方法に準じて作製することができる。
　さらに上記と同様の培養及び１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地による選抜で、染色体上の元来ｐｈａＺ６遺伝子が存在した位置にｌａｃＮ１７プロモーター、及び配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入された菌株１株を単離した。得られた菌株をＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／Ｚ６：：ｌａｃＮ１７－ＮＳＤＧ／ｄｂｋｔＢ株（以下、Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）生産微生物株（２）と記すこともある。）と命名した。
　（微生物株作製例９）Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）生産微生物株（３）の作製
　まず、ＰＨＡ合成酵素遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｐｈａＣ１ＵＤを上記と同様の接合伝達を用いた方法によって、ＫＮＫ００５ｄＺ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ株に導入した。
　さらに上記と同様の培養及び１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地による選抜で、染色体上のＰＨＡ合成酵素遺伝子が欠失した菌株１株を単離した。得られた菌株をＫＮＫ００５ｄＺ／ｄＮＳＤＧ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ株と命名した。
　次に、ＰＨＡ合成酵素遺伝子導入用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。
　合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株のｐｈａＣ１構造遺伝子より上流及び下流の塩基配列と、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号２９）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、同じくＳｗａＩ消化した特開２００７－２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ＰＨＡ合成酵素遺伝子導入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｐｈａＣ１Ｕ－ＮＳＤＧＳＴ－ｐｈａＣ１Ｄを作製した。
　次に、ＰＨＡ合成酵素遺伝子導入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｐｈａＣ１Ｕ－ＮＳＤＧＳＴ－ｐｈａＣ１Ｄを上記と同様の接合伝達を用いた方法によって、ＫＮＫ００５ｄＺ／ｄＮＳＤＧ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ株に導入した。
　さらに上記と同様の培養及び１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地による選抜で、染色体上の元来ｐｈａＣ１遺伝子が存在した位置に配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入された菌株１株を単離した。得られた菌株をＫＮＫ００５ｄＺ／ＮＳＤＧＳＴ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ株と命名した。
　次に、ＰＨＡ合成酵素遺伝子発現用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号３０）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、国際公開２００７／０４９７１６号に記載のｐＣＵＰ２をＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで切断したものと連結して、ｐＣＵＰ２－ＮＳＤＧＳＴを得た。次に、合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲによりｔｒｐプロモーターを有するＤＮＡ断片（配列番号３１）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＭｕｎＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、ｐＣＵＰ２－ＮＳＤＧＳＴをＭｕｎＩで切断したものと、ＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子がｔｒｐプロモーターの下流に位置する向きに連結して、ＰＨＡ合成酵素遺伝子発現用プラスミドｐＣＵＰ２－ｔｒｐ－ＮＳＤＧＳＴを得た。
　次に、ＰＨＡ合成酵素遺伝子発現用プラスミドｐＣＵＰ２－ｔｒｐ－ＮＳＤＧＳＴを、微生物株作製例３に記載のエレクトロポレーション法によって、ＫＮＫ００５ｄＺ／ＮＳＤＧＳＴ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ株に導入し、ｐＣＵＰ２－ｔｒｐ－ＮＳＤＧＳＴ／ＫＮＫ００５ｄＺ／ＮＳＤＧＳＴ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ株（以下、Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）生産微生物株（３）と記すこともある。）を得た。
　なお、Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）生産微生物株（３）は、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株の染色体上のｐｈａＺ１遺伝子、ｐｈａＺ２遺伝子、及びｐｈａＺ６遺伝子を欠失し、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するアエロモナス属由来のＰＨＡ合成酵素変異体をコードする遺伝子が導入され、染色体上のＲ体特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現が強化され、ｂｋｔＢ構造遺伝子（β－ケトチオラーゼ遺伝子）を欠失した株である。
　（微生物株作製例１０）Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）生産微生物株（４）の作製
　まず、ＰＨＡ合成酵素遺伝子導入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋ｐｈａＣ１Ｕ－ＮＳＤＧＳＴ－ｐｈａＣ１Ｄを上記と同様の接合伝達を用いた方法によって、ＫＮＫ００５ｄＺ／ｄＮＳＤＧ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ／ｄＡ１５２８株に導入した。
　さらに上記と同様の培養及び１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地による選抜で、染色体上の元来ｐｈａＣ１遺伝子が存在した位置に配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入された菌株１株を単離した。得られた菌株をＫＮＫ００５ｄＺ／ＮＳＤＧＳＴ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ／ｄＡ１５２８株と命名した。
　次に、ＰＨＡ合成酵素遺伝子発現用プラスミドｐＣＵＰ２－ｔｒｐ－ＮＳＤＧＳＴを、微生物株作製例３に記載のエレクトロポレーション法によって、ＫＮＫ００５ｄＺ／ＮＳＤＧＳＴ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ／ｄＡ１５２８株に導入し、ｐＣＵＰ２－ｔｒｐ－ＮＳＤＧＳＴ／ＫＮＫ００５ｄＺ／ＮＳＤＧＳＴ／ｔｒｃ－Ｊ４ｂ／ｄｂｋｔＢ／ｄＡ１５２８株（以下、Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）生産微生物株（４）と記すこともある。）を得た。
　なお、Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）生産微生物株（４）は、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株の染色体上のｐｈａＺ１遺伝子、ｐｈａＺ２遺伝子、及びｐｈａＺ６遺伝子を欠失し、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するアエロモナス属由来のＰＨＡ合成酵素変異体をコードする遺伝子が導入され、染色体上のＲ体特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子の発現が強化され、ｂｋｔＢ構造遺伝子（β－ケトチオラーゼ遺伝子）を欠失し、さらにＡ１５２８構造遺伝子（β－ケトチオラーゼ遺伝子）を欠失した株である。
　（実施例１）共重合ＰＨＡ混合物生産微生物株（１）によるＰＨＡ生産
　下記の条件で共重合ＰＨＡ混合物生産微生物株（１）を用いた培養検討を行なった。
　（培地）
　種母培地の組成は１ｗ／ｖ％　Ｍｅａｔ－ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％　Ｂａｃｔｏ－Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．２ｗ／ｖ％　Ｙｅａｓｔ－ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％　Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％　ＫＨ2ＰＯ4、（ｐＨ６．８）とした。
　前培養培地の組成は１．１ｗ／ｖ％　Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％ＫＨ2ＰＯ4、１．２９ｗ／ｖ％（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．１ｗ／ｖ％　ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、２．５ｗ／ｖ％　パームオレインオイル、０．５ｖ／ｖ％　微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％　ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ、１ｗ／ｖ％　ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％　ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％　ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％　ＮｉＣｌ2・６Ｈ2Ｏを溶かしたもの）とした。
　ＰＨＡ生産培地の組成は０．３８５ｗ／ｖ％　Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ、０．０６７ｗ／ｖ％　ＫＨ2ＰＯ4、０．２９１ｗ／ｖ％（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．１ｗ／ｖ％　ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．５ｖ／ｖ％　微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％　ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ、１ｗ／ｖ％　ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％　ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％　ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％　ＮｉＣｌ2・６Ｈ2Ｏを溶かしたもの）とした。
　（ＰＨＡ蓄積量割合の測定方法）
　乾燥菌体に対するＰＨＡ蓄積量の割合は次のように測定した。遠心分離によって培養液から菌体を回収、エタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体を取得し、重量を測定した。得られた乾燥菌体１ｇに１００ｍｌのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のＰＨＡ（共重合ＰＨＡ混合物）を抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が３０ｍｌになるまで濃縮後、９０ｍｌのヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、１時間放置した。析出したＰＨＡをろ別後、５０℃で３時間真空乾燥した。乾燥ＰＨＡの重量を測定し、乾燥菌体量に対してＰＨＡ蓄積量が占める割合を算出した。
　（ＰＨＡ画分（Ｉ）及び（ＩＩ）の重量割合の測定方法）
　共重合ＰＨＡ混合物中におけるＰＨＡ画分（Ｉ）及び（ＩＩ）の重量割合は次のように測定した。まず、乾燥ＰＨＡを、前記ＭＩＢＫ分画法によって、ＰＨＡ画分（Ｉ）とＰＨＡ画分（ＩＩ）に分画し、それぞれを秤量した。次に、ＰＨＡ画分（Ｉ）及びＰＨＡ画分（ＩＩ）の合計重量に対する各画分の重量割合を算出した。
　（平均３ＨＨ組成比率の測定方法）
　共重合ＰＨＡ混合物、ＰＨＡ画分（Ｉ）、又はＰＨＡ画分（ＩＩ）それぞれの平均３ＨＨ組成比率は次のように測定した。乾燥させた共重合ＰＨＡ混合物、ＰＨＡ画分（Ｉ）、又はＰＨＡ画分（ＩＩ）約２０ｍｇに１ｍｌの硫酸－メタノール混液（１５：８５）と１ｍｌのクロロホルムを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱することでＰＨＡ分解物のメチルエステルを得た。冷却後、これに０．５ｍｌの脱イオン水を加えてよく混合した後、水層と有機層が分離するまで放置した。その後、分取した有機層中のＰＨＡ分解物のモノマー単位組成をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析した。ガスクロマトグラフは島津製作所ＧＣ－１７Ａ、キャピラリーカラムはＧＬサイエンス社製ＮＥＵＴＲＡ　ＢＯＮＤ－１（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚０．４μｍ）を用いた。キャリアガスとしてＨｅを用い、カラム入口圧１００ｋＰａとし、サンプルは１μｌを注入した。温度条件は、初発温度５０～２００℃まで８℃／分の速度で昇温し、さらに２００～２９０℃まで３０℃／分の速度で昇温した。上記条件での分析によって得られたピークから、共重合ＰＨＡ混合物、ＰＨＡ画分（Ｉ）、又はＰＨＡ画分（ＩＩ）の平均３ＨＨ組成比率を算出した。
　（共重合ＰＨＡ混合物の融解ピーク温度の測定方法）
　示差走査熱量測定装置（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製ＤＳＣ８５００）を用いて、共重合ＰＨＡ混合物を約２ｍｇ計量し、１０℃／分の昇温速度にて－３０℃から２００℃まで昇温した時に得られるＤＳＣ曲線において検出された、融解エンタルピーが０．５Ｊ／ｇ以上である融解ピークの温度を求めた。
　（共重合ＰＨＡ混合物の加工性評価とペレット作製）
　共重合ＰＨＡ混合物を４．５ｇ、添加剤としてペンタエリスリトール（三菱化学社製：ノイライザーＰ）０．０４５ｇ、ベヘン酸アミド（日本精化社製：ＢＮＴ－２２Ｈ）０．０２２５ｇ、エルカ酸アミド（日本精化社製：ニュートロン－Ｓ）０．０２２５ｇを小型混練機（ＤＳＭ社製：ＤＳＭ　Ｘｐｌｏｒｅ　５　モデル２００５）へ投入し、バレル温度１７０℃、スクリュー回転数１００ｒｐｍの条件で５分間混練した。混練終了後にダイより溶融状態のストランド状樹脂組成物を排出し、直ちに６０℃に加温したウォーターバス中に投入し、結晶固化する時間を測定した。１００秒以内に固化した場合、加工性が良好（○）と評価した。
　その後、ウォーターバス中で結晶固化したストランドをニッパーで裁断し、樹脂組成物ペレットとした。
　（引裂強度の評価）
　２ｍｍ厚のＳＵＳ板（３０ｃｍ×３５ｃｍ）の上に、片面離型処理したＰＥＴフィルム（厚み５０μｍ）の離型面をＳＵＳ板に対して反対向けに設置し、前記ＰＥＴフィルム上に樹脂組成物ペレットを１．３ｇ置いた。さらに、前記樹脂組成物ペレットを囲うようにスペーサーとして７０μｍのシムプレートを設置した。その後、前記樹脂組成物ペレットを挟むように前記ＳＵＳ板と同様の板を被せ、１６０℃に加熱したプレス機（株式会社神藤金属工業所製：圧縮成形機ＮＳＦ－５０）の加熱プレス板上に設置し、５分間予熱した。予熱後、２分間の時間をかけながら徐々に５ＭＰａまで加圧した後、２分間圧力を保持した。プレス完了後、およそ２０℃に冷却された冷却板上で室温まで冷却し、約５０μｍ厚のフィルムを得た。このフィルムを室温２３℃、湿度５０％の環境中で１週間養生し、フィルムサンプルとした。
　ＪＩＳ　Ｐ－８１１６に規定された標準エルメンドルフ引裂試験機に準拠する機能と構造を有する軽荷重引裂度試験機（熊谷理機工業株式会社製：ＮＯ．２０３７特殊仕様機）によって測定される値をフィルムの厚さで除し、フィルムサンプルのエルメンドルフ引裂強度とした。
　（ＰＨＡ生産培養）
　ＰＨＡ生産培養は次のように行った。まず、共重合ＰＨＡ混合物生産微生物株（１）のグリセロールストック（５０μｌ）を種母培地（１０ｍｌ）に接種して２４時間培養し種母培養を行なった。次に種母培養液を、１．８Ｌの前培養培地を入れた３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ－３００型）に１．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３０℃、攪拌速度５００ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７～６．８の間でコントロールしながら２８時間培養し、前培養を行なった。ｐＨコントロールには１４％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。
　次に、前培養液を、２．５ＬのＰＨＡ生産培地を入れた５Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＳ－Ｕ５０型）に５．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３３℃、攪拌速度４２０ｒｐｍ、通気量２．１Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７～６．８の間でコントロールした。ｐＨコントロールには２５％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。炭素源は断続的に添加した。炭素源としてはパームオレインオイルを使用した。培養は、乾燥菌体量に対するＰＨＡ蓄積量の割合が８０％以上に達するまで行った。乾燥菌体に対するＰＨＡ蓄積量の割合、共重合ＰＨＡ混合物、ＰＨＡ画分（Ｉ）、又はＰＨＡ画分（ＩＩ）の平均３ＨＨ組成比率、ＰＨＡ画分（Ｉ）及び（ＩＩ）の重量割合、融解ピーク温度及び融解エンタルピー、加工性、エルメンドルフ引裂強度は前述のように測定した。結果を表１に示す。
　（実施例２）共重合ＰＨＡ混合物生産微生物株（２）によるＰＨＡ生産
　実施例１と同様の条件で共重合ＰＨＡ混合物生産微生物株（２）を用いた培養検討を行なった。乾燥菌体に対するＰＨＡ蓄積量の割合、共重合ＰＨＡ混合物、ＰＨＡ画分（Ｉ）、又はＰＨＡ画分（ＩＩ）の平均３ＨＨ組成比率、ＰＨＡ画分（Ｉ）及び（ＩＩ）の重量割合、融解ピーク温度及び融解エンタルピー、加工性、エルメンドルフ引裂強度を表１に示す。
　（実施例３）共重合ＰＨＡ混合物生産微生物株（３）によるＰＨＡ生産
　実施例１と同様の条件で共重合ＰＨＡ混合物生産微生物株（３）を用いた培養検討を行なった。乾燥菌体に対するＰＨＡ蓄積量の割合、共重合ＰＨＡ混合物、ＰＨＡ画分（Ｉ）、又はＰＨＡ画分（ＩＩ）の平均３ＨＨ組成比率、ＰＨＡ画分（Ｉ）及び（ＩＩ）の重量割合、融解ピーク温度及び融解エンタルピー、加工性、エルメンドルフ引裂強度を表１に示す。
　（実施例４）共重合ＰＨＡ混合物生産微生物株（４）によるＰＨＡ生産
　実施例１と同様の条件で共重合ＰＨＡ混合物生産微生物株（４）を用いた培養検討を行なった。乾燥菌体に対するＰＨＡ蓄積量の割合、共重合ＰＨＡ混合物、ＰＨＡ画分（Ｉ）、又はＰＨＡ画分（ＩＩ）の平均３ＨＨ組成比率、ＰＨＡ画分（Ｉ）及び（ＩＩ）の重量割合、融解ピーク温度及び融解エンタルピー、加工性、エルメンドルフ引裂強度を表１に示す。
　（実施例５）共重合ＰＨＡ混合物生産微生物株（５）によるＰＨＡ生産
　実施例１と同様の条件で共重合ＰＨＡ混合物生産微生物株（５）を用いた培養検討を行なった。乾燥菌体に対するＰＨＡ蓄積量の割合、共重合ＰＨＡ混合物、ＰＨＡ画分（Ｉ）、又はＰＨＡ画分（ＩＩ）の平均３ＨＨ組成比率、ＰＨＡ画分（Ｉ）及び（ＩＩ）の重量割合、融解ピーク温度及び融解エンタルピー、加工性、エルメンドルフ引裂強度を表１に示す。
　（実施例６）共重合ＰＨＡ混合物生産微生物株（６）によるＰＨＡ生産
　実施例１と同様の条件で共重合ＰＨＡ混合物生産微生物株（６）を用いた培養検討を行なった。乾燥菌体に対するＰＨＡ蓄積量の割合、共重合ＰＨＡ混合物、ＰＨＡ画分（Ｉ）、又はＰＨＡ画分（ＩＩ）の平均３ＨＨ組成比率、ＰＨＡ画分（Ｉ）及び（ＩＩ）の重量割合、融解ピーク温度及び融解エンタルピー、加工性、エルメンドルフ引裂強度を表１に示す。
　（比較例１）Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）生産微生物株（１）によるＰＨＡ生産
　実施例１と同様の条件でＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）生産微生物株（１）を用いた培養検討を行なった。乾燥菌体に対するＰＨＡ蓄積量の割合、Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）、ＭＩＢＫ可溶性画分、又はＭＩＢＫ不溶性画分の平均３ＨＨ組成比率、ＭＩＢＫ可溶性画分及びＭＩＢＫ不溶性画分の重量割合、融解ピーク温度及び融解エンタルピー、加工性、エルメンドルフ引裂強度を表１に示す。なお、各分析には共重合ＰＨＡ混合物に代えてＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）生産微生物株（１）の蓄積したＰＨＡを用いた。Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）生産微生物株（１）の蓄積したＰＨＡは、Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）であった。ＭＩＢＫ可溶性画分、及びＭＩＢＫ不溶性画分は、それぞれＰＨＡ画分（Ｉ）、又はＰＨＡ画分（ＩＩ）と同様の方法で得られた画分を指す。
　（比較例２）Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）生産微生物株（２）によるＰＨＡ生産
　実施例１と同様の条件でＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）生産微生物株（２）を用いた培養検討を行なった。乾燥菌体に対するＰＨＡ蓄積量の割合、Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）、ＭＩＢＫ可溶性画分、又はＭＩＢＫ不溶性画分の平均３ＨＨ組成比率、ＭＩＢＫ可溶性画分及びＭＩＢＫ不溶性画分の重量割合、融解ピーク温度及び融解エンタルピー、加工性、エルメンドルフ引裂強度を表１に示す。なお、各分析には共重合ＰＨＡ混合物に代えてＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）生産微生物株（２）の蓄積したＰＨＡを用いた。Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）生産微生物株（２）の蓄積したＰＨＡは、Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）であった。ＭＩＢＫ可溶性画分、及びＭＩＢＫ不溶性画分は、それぞれＰＨＡ画分（Ｉ）、又はＰＨＡ画分（ＩＩ）と同様の方法で得られた画分を指す。
　（比較例３）Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）生産微生物株（３）によるＰＨＡ生産
　実施例１と同様の条件でＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）生産微生物株（３）を用いた培養検討を行なった。乾燥菌体に対するＰＨＡ蓄積量の割合、Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）、ＭＩＢＫ可溶性画分、又はＭＩＢＫ不溶性画分の平均３ＨＨ組成比率、ＭＩＢＫ可溶性画分及びＭＩＢＫ不溶性画分の重量割合、融解ピーク温度及び融解エンタルピー、加工性、エルメンドルフ引裂強度を表１に示す。なお、各分析には共重合ＰＨＡ混合物に代えてＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）生産微生物株（３）の蓄積したＰＨＡを用いた。Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）生産微生物株（３）の蓄積したＰＨＡは、Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）であった。ＭＩＢＫ可溶性画分、及びＭＩＢＫ不溶性画分は、それぞれＰＨＡ画分（Ｉ）、又はＰＨＡ画分（ＩＩ）と同様の方法で得られた画分を指す。
　（比較例４）Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）生産微生物株（４）によるＰＨＡ生産
　実施例１と同様の条件でＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）生産微生物株（４）を用いた培養検討を行なった。乾燥菌体に対するＰＨＡ蓄積量の割合、Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）、ＭＩＢＫ可溶性画分、又はＭＩＢＫ不溶性画分の平均３ＨＨ組成比率、ＭＩＢＫ可溶性画分及びＭＩＢＫ不溶性画分の重量割合、融解ピーク温度及び融解エンタルピー、加工性、エルメンドルフ引裂強度を表１に示す。なお、各分析には共重合ＰＨＡ混合物に代えてＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）生産微生物株（４）の蓄積したＰＨＡを用いた。Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）生産微生物株（４）の蓄積したＰＨＡは、Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）であった。ＭＩＢＫ可溶性画分、及びＭＩＢＫ不溶性画分は、それぞれＰＨＡ画分（Ｉ）、又はＰＨＡ画分（ＩＩ）と同様の方法で得られた画分を指す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 表１より、実施例１～６で得られた共重合ＰＨＡ混合物は、加工性が良好で、エルメンドルフ引裂強度が高く、機械特性に優れたものであった。一方、得られた共重合ＰＨＡ混合物がＰＨＡ画分（Ｉ）を含まない比較例１では、エルメンドルフ引裂強度が低い値であった。ＰＨＡ画分（Ｉ）の平均３ＨＨ組成比率が２０モル％以上ではなかった比較例２では、加工性が不良で、また、エルメンドルフ引裂強度も低い値であった。共重合ＰＨＡ混合物の平均３ＨＨ組成比率が２２モル％以下ではなく、また、ＰＨＡ画分（ＩＩ）を含まない比較例３及び４では、加工性が不良であった。

Claims (25)

  1. 　共重合ポリヒドロキシアルカン酸混合物を製造する方法であって、
    　前記共重合ポリヒドロキシアルカン酸混合物を産生する微生物を培養する工程を含み、
    　前記共重合ポリヒドロキシアルカン酸混合物が、
    　３－ヒドロキシ酪酸構造単位及び３－ヒドロキシヘキサン酸構造単位を有する共重合ポリヒドロキシアルカン酸を含み、かつ平均３－ヒドロキシヘキサン酸組成比率が２０モル％以上であるポリヒドロキシアルカン酸画分（Ｉ）、及び、
    　３－ヒドロキシ酪酸構造単位を有するポリヒドロキシアルカン酸を含み、かつ平均３－ヒドロキシヘキサン酸組成比率が０モル％以上１５モル％以下であるポリヒドロキシアルカン酸画分（ＩＩ）を含有し、
    　前記共重合ポリヒドロキシアルカン酸混合物は、平均３－ヒドロキシヘキサン酸組成比率が２２モル％以下である、製造方法。
  2. 　前記共重合ポリヒドロキシアルカン酸混合物中の前記ポリヒドロキシアルカン酸画分（Ｉ）の重量割合が１０～９０％である、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記共重合ポリヒドロキシアルカン酸混合物は、平均３－ヒドロキシヘキサン酸組成比率が１０～２２モル％である、請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. 　前記微生物は、３－ヒドロキシヘキサノイル－ＣｏＡに対する重合活性が互いに異なる２種類のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素をコードする遺伝子を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の製造方法。
  5. 　前記３－ヒドロキシヘキサノイル－ＣｏＡに対する重合活性が互いに異なる２種類のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素のアミノ酸配列は、配列同一性が９０％以下である、請求項４に記載の製造方法。
  6. 　前記３－ヒドロキシヘキサノイル－ＣｏＡに対する重合活性が互いに異なる２種類のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素をコードする遺伝子が、
    　配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するアエロモナス・キャビエに由来する野生型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素よりも３－ヒドロキシヘキサノイル－ＣｏＡに対する重合活性が高いポリヒドロキシアルカン酸合成酵素をコードする遺伝子（Ａ）、及び、
    　前記アエロモナス・キャビエに由来する野生型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素よりも３－ヒドロキシヘキサノイル－ＣｏＡに対する重合活性が低いポリヒドロキシアルカン酸合成酵素をコードする遺伝子（Ｂ）である、請求項４又は５に記載の製造方法。
  7. 　前記遺伝子（Ａ）が、アエロモナス属の微生物に由来するポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子又はその変異体である、請求項６に記載の製造方法。
  8. 　前記遺伝子（Ａ）が、配列番号２又は配列番号３で示されるアミノ酸配列に対して９９．５～１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子である、請求項７に記載の製造方法。
  9. 　前記遺伝子（Ｂ）が、アエロモナス属の微生物に由来するポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子の一部と、カプリアビダス属の微生物に由来するポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子の一部を組み合わせて構成されたものである、請求項６～８のいずれか１項に記載の製造方法。
  10. 　前記遺伝子（Ｂ）が、配列番号６で示されるアミノ酸配列に対して９０～１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子である、請求項９に記載の製造方法。
  11. 　前記遺伝子（Ｂ）が、クロモバクテリウム属の微生物に由来するポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子又はその変異体である、請求項６～８のいずれか１項に記載の製造方法。
  12. 　前記遺伝子（Ｂ）が、配列番号４又は配列番号５で示されるアミノ酸配列に対して９０～１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子である、請求項１１に記載の製造方法。
  13. 　前記遺伝子（Ｂ）が、バチルス属の微生物に由来するポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子又はその変異体である、請求項６～８のいずれか１項に記載の製造方法。
  14. 　前記遺伝子（Ｂ）が、配列番号７及び配列番号８で示されるアミノ酸配列に対して９０～１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子である、請求項１３に記載の製造方法。
  15. 　前記微生物は、該微生物の野生株と比較して、細胞内のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素に対する３－ヒドロキシヘキサノイル－ＣｏＡの供給が増大するように形質転換された形質転換微生物である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の製造方法。
  16. 　前記形質転換微生物は、油脂又は脂肪酸のβ酸化における炭素数６の中間代謝物の分解が抑制されるように形質転換されたものである、請求項１５に記載の製造方法。
  17. 　前記形質転換微生物は、炭素数６のβ－ケトアシル－ＣｏＡであるβ－ケトヘキサノイル－ＣｏＡに対するチオリシス活性を有するβ－ケトチオラーゼ酵素をコードする遺伝子の発現が抑制されるように形質転換されたものである、請求項１６に記載の製造方法。
  18. 　前記β－ケトチオラーゼ酵素は、配列番号９又は配列番号１０で示されるアミノ酸配列に対して９０～１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列を有する、請求項１７に記載の製造方法。
  19. 　前記微生物は、Ｒ体特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ活性を示すタンパク質をコードする遺伝子を有する微生物である、請求項１～１８のいずれか１項に記載の製造方法。
  20. 　前記培養工程において、油脂又は脂肪酸を含む炭素源を添加する、請求項１～１９のいずれか１項に記載の製造方法。
  21. 　前記油脂又は脂肪酸を含む炭素源が、炭素数６～１２の中鎖脂肪酸、又は該中鎖脂肪酸のグリセリドを含む炭素源である、請求項２０に記載の製造方法。
  22. 　前記中鎖脂肪酸が、ヘキサン酸である、請求項２１に記載の製造方法。
  23. 　前記微生物は、カプリアビダス属に属する、またはカプリアビダス属微生物の形質転換体である、請求項１～２２のいずれか１項に記載の製造方法。
  24. 　前記微生物は、カプリアビダス・ネカトールである、またはカプリアビダス・ネカトールの形質転換体である、請求項２３に記載の製造方法。
  25. 　共重合ポリヒドロキシアルカン酸混合物を産生する形質転換微生物であって、
    　３－ヒドロキシヘキサノイル－ＣｏＡに対する重合活性が互いに異なる２種類のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素をコードする遺伝子を有し、
    　前記形質転換微生物の野生株と比較して、細胞内のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素に対する３－ヒドロキシヘキサノイル－ＣｏＡの供給が増大するように形質転換されており、
    　前記共重合ポリヒドロキシアルカン酸混合物が、
    　３－ヒドロキシ酪酸構造単位及び３－ヒドロキシヘキサン酸構造単位を有する共重合ポリヒドロキシアルカン酸を含み、かつ平均３－ヒドロキシヘキサン酸組成比率が２０モル％以上であるポリヒドロキシアルカン酸画分（Ｉ）、及び、
    　３－ヒドロキシ酪酸構造単位を有するポリヒドロキシアルカン酸を含み、かつ平均３－ヒドロキシヘキサン酸組成比率が０モル％以上１５モル％以下であるポリヒドロキシアルカン酸画分（ＩＩ）を含有し、
    　前記共重合ポリヒドロキシアルカン酸混合物は、平均３－ヒドロキシヘキサン酸組成比率が２２モル％以下である、形質転換微生物。
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