JP5839854B2 - 微生物の培養方法 - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Pは圧力(単位atm)、yは酸素モル分率(%)、Qは通気量(L/min)、Vは液量(m3)、Tは気体温度(K)である。また、「i」は培養槽の入り口における値を示し、「o」は培養槽の出口における値を示す。7.317は60min/h、気体定数R=0.082、及び、酸素モル分率の百分率表記からの換算定数である。
実験にはKNK−005株(米国特許US7384766参照)を用いた。
10Lジャーの攪拌数を430rpmにした以外は比較例1と同じ方法にて、培養を行なった。尚、該培養条件の水系における酸素移動速度は80molO2/m3/hであった。結果を表1に示した。
10Lジャーの攪拌数を550rpmにした以外は比較例1と同じ方法にて、培養を行なった。尚、該培養条件の水系における酸素移動速度は110molO2/m3/hであった。結果を表1に示した。
10Lジャーの攪拌数を630rpmにした以外は比較例1と同じ方法にて、培養を行なった。尚、該培養条件の水系における酸素移動速度は150molO2/m3/hであった。結果を表1に示した。
KNK−631株の作製
<遺伝子挿入用プラスミドベクターの作製>
挿入用DNAとしてA. caviaeのphaCのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるDNAを次のように作製した。A. caviaeのゲノムDNAをテンプレートとして配列番号1および配列番号2で示されるプライマーを用いて、PCRを行った。PCRは(1)98℃で2分、(2)98℃で15秒、60℃で30秒、68℃で20秒を25サイクル繰り返し、ポリメラーゼはKOD−plus−(TOYOBO製)を用いた。PCRで得たDNA断片を末端リン酸化およびEcoRI消化した。このDNA断片をPAc−5P+Ecoとした。 次に、特開2008-029218号公報[0038]に記載のKNK−005AS株の染色体DNAのbktB遺伝子の開始コドン直前をDNA挿入部位と設定し、以下の手順で該遺伝子の開始コドンより上流側の塩基配列からなるDNAを作製した。
次に、KNK−005AS株を親株としてbAO/pBlu/SacB−Kmを用いてbktB遺伝子の開始コドン直前にphaCのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるDNAが挿入された菌株を作製した。遺伝子挿入用プラスミドbAO/pBlu/SacB−Kmで大腸菌S17−1株(ATCC47005)を形質転換した。得られた形質転換体をKNK−005AS株とNutrient Agar培地(Difco社製)上で混合培養して接合伝達を行った。250mg/Lのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地(クエン酸ナトリウム2g/L、塩化ナトリウム5g/L、硫酸マグネシウム・7水和物0.2g/L、リン酸二水素アンモニウム1g/L、リン酸水素二カリウム1g/L、寒天15g/L、pH6.8)上で生育してきた菌株を選択して、プラスミドがKNK−005AS株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をNutrient Broth培地(Difco社製)で2世代培養した後、15%のシュークロースを含むNutrient Agar培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株を選択して2回目の組換えが生じた株を取得した。さらにPCRによる解析により所望の遺伝子挿入株を単離した。
クロトニル−CoAを、3HHモノマーの前駆体であるブチリル−CoAに変換する酵素をコードするccr遺伝子を、ストレプトマイセス・シンナモネンシス(Streptomyces cinnamonensis)Okami株(DSM 1042)の染色体DNAからクローニングした。配列番号7及び配列番号8記載のDNAをプライマーとしPCRを行った。その条件は(1)98℃で2分、(2)94℃で10秒、55℃で20秒、68℃で90秒を25サイクル繰り返し、ポリメラーゼはKOD−plus−を用いた。PCRで増幅した断片を精製後、制限酵素BamHI及びAflIIで切断した。EE32d13断片(J. Bacteriol., 179, 4821 (1997))を、pUC19ベクターのEcoRI部位にサブクローニングし、このプラスミドをBglIIとAflIIで切断し、BamHI及びAflII断片としたccr遺伝子と断片を置換することによってccr発現ユニットを構築した。
配列番号9を含むphaC発現ユニットをSpeI断片として調製した。特開2007-228894号公報[0031]に記載のHG::PRe−N149S/D171G−T/pBluを鋳型とし、配列番号10と配列番号11に示すプライマーとしてPCRを行った。その条件は(1)98℃で2分、(2)94℃で10秒、55℃で30秒、68℃で2分を25サイクル繰り返し、ポリメラーゼはKOD−plus−を用いた。PCRで増幅した断片を精製後、制限酵素SpeIで切断して発現ユニットを調製した。
発現ベクターpCUP2−631は以下のようにして構築した。
pCUP2−631ベクターの細胞への導入は以下のように電気導入によって行った。遺伝子導入装置はBio−rad社製のジーンパルサーを用い、キュベットは同じくBio−rad社製のgap0.2cmを用いた。キュベットに、Pac−bktB/AS株のコンピテント細胞400μlと発現ベクター20μlを注入してパルス装置にセットし、静電容量25μF、電圧1.5kV、抵抗値800Ωの条件で電気パルスをかけた。パルス後、キュベット内の菌液をNutrient Broth培地(DIFCO社製)で30℃、3時間振とう培養し、選択プレート(Nutrient Agar培地(DIFCO社製)、カナマイシン100mg/L)で、30℃にて2日間培養して、生育してきた形質転換体KNK―631株を取得した。
実験にKNK−631株を用いた以外は比較例1と同じ方法にて、培養を行なった。
実験にKNK−631株を用いた以外は実施例3と同じ方法にて、培養を行なった。
Claims (5)
- 少なくとも3−ヒドロキシ酪酸と3−ヒドロキシへキサン酸を含むモノマーユニットを重合して得られるポリヒドロキシアルカン酸の微生物による生産方法であって、構成脂肪酸としてラウリン酸を41重量%以上含有する油脂、及び/又は脂肪酸を炭素源とし、酸素移動速度が110molO 2 /m 3 /h以上となるように調整して微生物を培養することを特徴とし、前記微生物が、配列番号12で表されるアミノ酸配列をコードするポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子、又は、該アミノ酸配列対して90%以上の配列同一性を有し、且つ、ポリヒドロキシアルカン酸重合活性を有するポリペプチドをコードするポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が組み込まれた、Cupriavidus属の微生物である、ポリヒドロキシアルカン酸の微生物による生産方法。
- 前記ポリヒドロキシアルカン酸中の3HH組成比率が6mol%以上であることを特徴とする請求項1の生産方法。
- 前記炭素源がパーム核油、ヤシ油、及びこれらの油脂を分別して得られる分別油脂、脂肪酸の群から選ばれる少なくとも1種の油脂、及び/又は脂肪酸である請求項1の生産方法。
- 前記微生物がCupriavidus necatorである請求項1に記載の生産方法。
- 前記ポリヒドロキシアルカン酸が、P(3HB−co−3HH)である請求項1に記載の生産方法。
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