JP7140401B2 - ヘキソースの酵素的生成 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年３月１３日出願の米国出願第６２／４７０，６０５号、２０１７年３月１３日出願の米国出願第６２／４７０，６２０号、２０１７年４月５日出願の米国出願第６２／４８２，１４８号、及び２０１７年４月３日出願の米国出願第６２／４８０，７９８号の優先権を主張し、上記出願は、本記載をもってそれらの全体が参照により援用される。
発明の分野
本発明はヘキソースの製造に関する。より詳細には、本発明は、糖（例えば、多糖、オリゴ糖、二糖、スクロース、Ｄ－グルコース、及びＤ－フルクトース）からのＤ－ヘキソース（またはヘキソース）の製造方法であって、フルクトース６－リン酸が１または複数の酵素的ステップによって上記ヘキソースに転化されるステップを含む、上記方法に関する。
背景
ヘキソースは６の炭素原子を有する単糖である。ヘキソースは官能基によって分類することができ、アルドヘキソースは１位にアルデヒドを有し、ケトヘキソースは２位にケトンを有する。アルドヘキソース（またはアルドース）としてはアロース、アルトロース、グルコース、グロース、ガラクトース、イドース、タロース、及びマンノースが挙げられる。ケトヘキソース（またはケトース）としては、プシコース（アルロース）、フルクトース、タガトース、及びソルボースが挙げられる。これらのアルドヘキソース及びケトヘキソースの種々の態様については次の段落で言及する。
例えば、Ｄ－アロース（以下、アロース）は、甘味がスクロースの約８０％である低カロリーの天然甘味料であり、ノンカロリーの甘味料及び増量剤とされる。アロースは特定の低木及び藻類中に少量でしか存在しない、天然起源のヘキソースである。アロースには、凍結保護、抗酸化、抗高血圧、免疫抑制、抗炎症、抗腫瘍、及び抗がん活性などの、いくつかの潜在的な医療及び農業上の利点がある。アロースはまた、食品及び飲料においてスクロースと同様の機能を有している。このように、アロースには明らかに食品及び飲料産業において種々の用途がある。しかし、アロースの販売価格が高いために、その甘味料としての使用は限定されてきた。
現在、アロースは、主としてＤ－プシコースの酵素的異性化によって製造されている（ＷＯ２０１４０６９５３７）。全体として、原料コストが高いこと、Ｄ－プシコースからのアロースの分離にコストを要すること、及び製品の収率が比較的低いこと（約２３％）から、この方法は苦境にある。
アルトロースは別の非天然アルドヘキソースであり、マンノースのＣ－３エピマーである。Ｄ－アルトロース（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－２，３，４，５，６－ペンタヒドロキシヘキサナール）は、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ由来のＬ－フコースイソメラーゼならびにＢａｃｉｌｌｕｓ ｐａｌｌｉｄｕｓ（Ｂ． ｐａｌｌｉｄｕｓ）及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のｄ－アラビノースイソメラーゼ（ｄ－ＡＩ）などのアルドースイソメラーゼを同定、識別、及びキャラクタライズするための基質として用いることができる。最近、生理活性物質として有用な機能を果たすオリゴ糖及び多糖などの糖鎖が、医薬品及び農薬などのファインケミカルの分野で注目されている。現在、上記糖鎖に関する研究の対象は、Ｄ－グルコース、Ｄ－マンノース、及びＤ－ガラクトースなどの自然界に大量に存在し、研究者が容易に入手できる単糖から構成される糖鎖に制限されている。しかしながら、将来、より有用な機能を果たす糖鎖の合成に関する研究において、自然界に存在するもの以外の種々の単糖が求められるようになることが予想される。このような状況下では、処理ステップ数を低減しつつ、入手が困難な希少糖であるＤ－アルトロースを高収率で製造可能な方法を開発することが非常に重要且つ必要である。米国特許第５，４１０，０３８号。
Ｄ－グルコースは、例えば、賦形剤、キレート剤、医薬中間体、ガラス及び金属の洗浄剤、食品添加物として、及び洗剤の添加物として有用である。米国特許第５，２１５，５９１号。
Ｄ－ガラクトース（以下、ガラクトース）は、甘味がスクロースの約３３％である天然甘味料であり、栄養甘味料とされる。ガラクトースは、乳製品、マメ科植物、穀物、ナッツ、塊茎、及び野菜中に存在する天然起源のヘキソースである。ガラクトースは、パン業界で酸味及び酸性度を制限するために用いられる。また、運動サプリメント業界で持久力を高めるためのエネルギー源として用いられる。製薬業界では、ガラクトースはいくつかの医薬の中間体であり、タンパク質治療薬の生物学的生産の最適化における細胞代謝モジュレーターとしても用いられる。更に、ガラクトースは、キュウリ、ニンジン、ジャガイモ、トマトを冒す植物病原体などの特定の植物病原体によって引き起こされる植物病害に対する防除剤として有効であることが明らかになっている。食事に関する関心（例えばビーガニズム）及び健康上の関心（例えばＢＳＥ疾患）に起因して、産業界はガラクトースの非動物性供給源に着目している。このように、ガラクトースは明らかに食品、飲料、運動、農業、及び製薬業界において種々の用途がある。しかし、ガラクトースの販売価格が高いために、その使用は制限されてきた。
ガラクトースは、主としてラクトースの加水分解により製造される（ＷＯ２００５０３９２９９Ａ３）。この方法は、原料コストがより高く、ガラクトースからのグルコースの分離の費用がかかるため、あまり望ましいものではない。あるいは、ガラクトースは、植物系バイオマスの加水分解によって製造することができる（ＷＯ２００５００１１４５Ａ１）。この方法は、バイオマスの加水分解中に放出される他の複数の糖（例えば、キシロース、アラビノース、マンノース、グルコース、ラムノース）からのガラクトースの分離のコストが高く、且つ収率が低い（一般的なバイオマス源の乾燥質量の約４．６％がガラクトース）ことから苦境にある。
イドースは自然界には存在しないが、そのウロン酸であるイズロン酸は重要である。イズロン酸は、グリコサミノグリカンであるデルマタン硫酸及びヘパラン硫酸の成分である。（ｈｔｔｐｓ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｉｄｏｓｅ － ａｃｃｅｓｓｅｄ ３／７／１８）。
タロースは、水に可溶、且つメタノールにわずかに可溶である非天然アルドヘキソースである。タロースはガラクトースのＣ－２エピマーであり、且つマンノースのＣ－４エピマーである。タロースは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａのリボース－５－リン酸イソメラーゼ（複数可）を同定、識別、及びキャラクタライズするための基質として用いることができる。
Ｄ－マンノース（以下、マンノース）は、多くの果実、野菜、植物材料、及び人体中にさえ存在する、中程度の甘さの天然起源の単糖である。マンノースは、複数の健康上の利点及び製薬における用途を有する。例えば、マンノースは、炭水化物欠乏性糖タンパク質症候群１ｂ型、より一般的には***症の治療に用いることができる。更に、マンノースは検証されたプレバイオティクスであり、血糖値を上昇させず、抗炎症特性を示す。更に、マンノースはブタの枝肉の収量を高めることが明らかになっており、スキンケア製品に広く使用されている補助保湿剤である。このように、マンノースは、医薬品、化粧品、飲料、食品、乳製品、製菓、及び家畜業界において種々の用途がある。しかし、マンノースの販売価格が高いために、日用品におけるその使用は制限されてきた。
マンノースは主として植物からの抽出により製造される。一般的な方法としては、酸加水分解、熱加水分解、酵素的加水分解、微生物発酵加水分解、及びそれらの組み合わせが挙げられる。あまり一般的ではない方法としては、化学的及び生物学的変換が挙げられる。全体として、これらの方法は、過酷な条件、高い資本支出、高い原料コスト、コストの高い異性化反応混合物からのマンノースの分離、及び比較的低い製品収率（１５～３５％）により、問題を抱えている。
Ｄ－アルロース（Ｄ－プシコースとしても知られる）（以下、プシコース）は、甘味がスクロースの７０％であるが、カロリーはわずか１０％に過ぎない低カロリーの天然甘味料である。プシコースは小麦及び他の植物中にわずかな量でしか存在しない天然起源のヘキソースである。プシコースは２０１２年に食品医薬品局（ＦＤＡ）によって食品添加物として認可され、ＦＤＡはプシコースを「一般的に安全であると認められている（ＧＲＡＳ）」と指定した。しかし、プシコースの販売価格が高いことから、その甘味料としての使用は制限されてきた。プシコースには無数の健康上の利点がある。すなわち、プシコースは低カロリー（スクロースの１０％）であり、グリセミック指数が１と非常に低く、小腸で完全に吸収されるが代謝されず、尿と糞便中に分泌され、α－アミラーゼ、スクラーゼ、及びマルターゼを阻害することにより血糖を調節するのに役立ち、また、食品及び飲料中においてスクロースと類似の機能を有する。このように、プシコースは明らかに食品及び飲料業界において種々の用途を有する。
現在、プシコースは主としてフルクトースの酵素的異性化によって製造されている（ＷＯ２０１４０４９３７３）。全体として、この方法は、高い原料コスト、コストが高いプシコースのフルクトースからの分離、及び比較的低い製品収率を示す。
フルクトースは、多くの植物中に存在する単純なケトンをもつ単糖であり、グルコースに結合して二糖であるスクロースを形成することが多い。フルクトースは、工業的にはサトウキビ、サトウダイコン、及びトウモロコシから誘導される。フルクトースが食品及び飲料において工業的に使用されている主たる理由は、その低コストに加えて、その相対的な甘味が高いことである。フルクトースは全ての天然起源の炭水化物の中で最も甘い。フルクトースは、製造された甘味料である高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）中にも含まれ、ＨＦＣＳは、コーンシロップを酵素で処理し、グルコースをフルクトースに転化させることによって製造される。（ｈｔｔｐｓ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｆｒｕｃｔｏｓｅ＃Ｐｈｙｓｉｃａｌ＿ａｎｄ＿ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ＿ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ－－ ａｃｃｅｓｓｅｄ ３／７／１８）。
Ｄ－タガトース（以下、タガトース）は、甘味がスクロースの９２％であるが、カロリーがわずか３８％に過ぎない低カロリーの天然甘味料である。タガトースは、果実、カカオ、及び乳製品中にわずかな量でしか存在しない天然起源のヘキソースである。タガトースは、２００３年に食品医薬品局（ＦＤＡ）によって食品添加物として認可され、ＦＤＡはタガトースを「一般的に安全であると認められている（ＧＲＡＳ）」と指定した。しかし、タガトースの販売価格が高いことから、その甘味料としての使用は制限されてきた。タガトースには無数の健康上の利点がある。すなわち、タガトースは非発がん性であり、低カロリーであり、グリセミック指数が３と非常に低く、グルコースのグリセミック指数を２０％減衰させ、平均血糖値を低下させることができ、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールを上昇させることにより、心血管疾患、脳卒中、及び他の血管疾患を予防するのに役立ち、検証されたプレバイオティクス及び抗酸化剤である。Ｌｕ ｅｔ ａｌ．， Ｔａｇａｔｏｓｅ， ａ Ｎｅｗ Ａｎｔｉｄｉａｂｅｔｉｃ ａｎｄ Ｏｂｅｓｉｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｄｒｕｇ， Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｏｂｅｓ． Ｍｅｔａｂ． １０（２）： １０９－３４ （２００８）。このように、タガトースは明らかに、製薬、バイオテクノロジー、学術、食品、飲料、栄養補助食品、及び加工食品業界において種々の用途を有する。
タガトースは、主として、Ｄ－グルコース及びＤ－ガラクトースを生成するラクターゼまたは酸によるラクトースの加水分解によって製造される（ＷＯ２０１１１５０５５６、ＣＮ１０３０２５８９４、ＵＳ５００２６１２、ＵＳ６０５７１３５、及びＵＳ８８０２８４３）。次いで、Ｄ－ガラクトースは、アルカリ条件下で水酸化カルシウムによって化学的に、または中性のｐＨ条件下でＬ－アラビノースイソメラーゼによって酵素的にのいずれかで、Ｄ－タガトースに異性化される。最終製品は、ろ過及びイオン交換クロマトグラフィーの併用によって単離される。この方法は、数基の槽またはバイオリアクター中で行われる。全体として、上記方法は、他の糖（例えば、Ｄ－グルコース、Ｄ－ガラクトース、及び未加水分解ラクトース）の分離のコストが高く、且つ製品収率が低いために不利である。微生物細胞発酵によるいくつかの方法が開発中であるが、それらの方法が、高価な原料（例えば、ガラクチトール及びＤ－プシコース）、低い製品収率、及びコストが高い分離に依存することに起因して、いずれの方法も実用的な代替手段であることを実証するに至っていない。
ソルボース（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－１，３，４，５，６－ペンタヒドロキシヘキサン－２－オン）は、甘味がスクロース（砂糖）と同等のケトヘキソースであり、ブドウにおいて少量自然発生することが分っている植物代謝産物である。Ｄ－ソルボースは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ． Ｌａｃｈｒｙｍａｎｓ及びＲａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍに起因する植物病害の防除剤として有効であると判定されている。米国特許出願公開第２０１６／００３７７６８号。
上述のアルドヘキソース及びアルドケトースなどのヘキソースの高収率での製造のための費用効果の高い合成経路を開発することが求められており、それらの方法の少なくとも１のステップはエネルギー的に有利な化学反応を含む。更に、複数のプロセスステップを１基の槽またはバイオリアクター中で実施することが可能な、及び／またはコストが高い分離ステップを回避もしくは排除する製造方法が求められている。また、リン酸をリサイクルすることが可能である、及び／または添加されるリン酸源としてアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を使用する必要のない、比較的低濃度のリン酸で実施することが可能なヘキソースの製造方法も求められている。また、反応ステップのいずれにおいても、コストの高いニコチンアミドアデノシンジヌクレオチド（ＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ））補酵素の使用を必要としないヘキソース製造経路も求められている。
発明の概要
本明細書に記載の発明は、概括的には、酵素的転化による糖からのヘキソースの製造方法に関する。本発明はまた、本明細書に記載のいずれかの方法により製造されたヘキソースにも関する。
より詳細には、本発明は、アロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、アルトロース、タロース、ソルボース、グロース、及びイドースから選択されるヘキソースの糖からの製造方法であって、イソメラーゼ、エピメラーゼ、及びヘキソース特異的ホスファターゼ、ならびにそれらの混合物からなる群より選択される１種または複数種の酵素で触媒することによって、フルクトース６－リン酸（Ｆ６Ｐ）を上記ヘキソースに転化させることを含む上記方法に関する。
本発明のアロースの製造方法は、
プシコース６－リン酸３－エピメラーゼ（Ｐ６ＰＥ）で触媒することによって上記Ｆ６Ｐをプシコース６－リン酸（Ｐ６Ｐ）に転化させることと、
アロース６－リン酸イソメラーゼ（Ａ６ＰＩ）で触媒することによって上記Ｆ６Ｐをアロース６－リン酸（Ａ６Ｐ）に転化させることと、
アロース６－リン酸ホスファターゼ（Ａ６ＰＰ）で触媒することによって上記Ａ６Ｐをアロースに転化させることと
を含む。
本発明のマンノースの製造方法は、
マンノース６－リン酸イソメラーゼ（Ｍ６ＰＩ）またはホスホグルコース／ホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＧＰＭＩ）で触媒することによって上記Ｆ６Ｐをマンノース６－リン酸（Ｍ６Ｐ）に転化させることと、
マンノース６－リン酸ホスファターゼ（Ｍ６ＰＰ）で触媒することによって上記Ｍ６Ｐをマンノースに転化させることと
を含む。
本発明のガラクトースの製造方法は、
フルクトース６－リン酸４－エピメラーゼ（Ｆ６ＰＥ）で触媒することによって上記Ｆ６Ｐをタガトース６－リン酸（Ｔ６Ｐ）に転化させることと、
ガラクトース６－リン酸イソメラーゼ（Ｇａｌ６ＰＩ）で触媒することによって上記Ｔ６Ｐをガラクトース６－リン酸（Ｇａｌ６Ｐ）に転化させることと、
ガラクトース６－リン酸ホスファターゼ（Ｇａｌ６ＰＰ）で触媒することによって上記Ｇａｌ６Ｐをガラクトースに転化させることと
を含む。
本発明のフルクトースの製造方法は、
フルクトース６－リン酸ホスファターゼ（Ｆ６ＰＰ）で触媒することによって上記Ｆ６Ｐをフルクトースに転化させることを含む。
本発明のアルトロースの製造方法は、
Ｐ６ＰＥで触媒することによって上記Ｆ６ＰをＰ６Ｐに転化させることと、
アルトロース６－リン酸イソメラーゼ（Ａｌｔ６ＰＩ）で触媒することによって上記Ｐ６Ｐをアルトロース６－リン酸（Ａｌｔ６Ｐ）に転化させることと、
アルトロース６－リン酸ホスファターゼ（Ａｌｔ６ＰＰ）で触媒することによって上記生成したＡｌｔ６Ｐをアルトロースに転化させることと
を含む。
本発明のタロースの製造方法は、
Ｆ６ＰＥで触媒することによって上記Ｆ６ＰをＴ６Ｐに転化させることと、
タロース６－リン酸イソメラーゼ（Ｔａｌ６ＰＩ）で触媒することによって上記Ｔ６Ｐをタロース６－リン酸（Ｔａｌ６Ｐ）に転化させることと、
タロース６－リン酸ホスファターゼ（Ｔａｌ６ＰＰ）で触媒することによって上記Ｔａｌ６Ｐをタロースに転化させることと
を含む。
本発明のソルボースの製造方法は、
Ｆ６ＰＥで触媒することによって上記Ｆ６ＰをＴ６Ｐに転化させることと、
ソルボース６－リン酸エピメラーゼ（Ｓ６ＰＥ）で触媒することによって上記Ｔ６Ｐをソルボース６－リン酸（Ｓ６Ｐ）に転化させることと、
ソルボース６－リン酸ホスファターゼ（Ｓ６ＰＰ）で触媒することによって上記Ｓ６Ｐをソルボースに転化させることと
を含む。
本発明のグロースの製造方法は、
Ｆ６ＰＥで触媒することによって上記Ｆ６ＰをＴ６Ｐに転化させることと、
グロース６－リン酸イソメラーゼ（Ｇｕｌ６ＰＩ）で触媒することによって上記Ｓ６Ｐをグロース６－リン酸（Ｇｕｌ６Ｐ）に転化させることと、
グロース６リン酸ホスファターゼ（Ｇｕｌ６ＰＰ）で触媒することによって上記Ｇｕｌ６Ｐをグロースに転化させることと
を含む。
本発明のグロースの製造方法は、
Ｆ６ＰＥで触媒することによって上記Ｆ６ＰをＴ６Ｐに転化させることと、
ソルボース６－リン酸エピメラーゼ（Ｓ６ＰＥ）で触媒することによって上記Ｔ６Ｐをソルボース６－リン酸（Ｓ６Ｐ）に転化させることと、
イドース６－リン酸イソメラーゼ（Ｉ６ＰＩ）で触媒することによって上記Ｓ６Ｐをイドース６－リン酸（Ｉ６Ｐ）に転化させることと、
イドース６－リン酸ホスファターゼ（Ｉ６ＰＰ）で触媒することによって上記Ｉ６Ｐをイドースに転化させることと
を含む。
本発明のヘキソースの製造方法は、ホスホグルコースイソメラーゼ（ＰＧＩ）によって触媒される、グルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）を上記Ｆ６Ｐに転化させるステップを含んでいてもよい。本方法は、ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される、グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）を上記Ｇ６Ｐに転化させるステップも含んでいてよい。更に、本発明の製造方法は、少なくとも１種の酵素によって触媒される、糖を上記Ｇ１Ｐに転化させるステップを更に含んでいてもよく、上記糖は、デンプンまたはその誘導体、セルロースまたはその誘導体、及びスクロースからなる群より選択される。
本発明の製造方法における糖を上記Ｇ１Ｐに転化させる上記ステップにおいて用いられる酵素または複数の酵素は、α－グルカンホスホリラーゼ（αＧＰ）、マルトースホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、セロデキストリンホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、及び／またはセルロースホスホリラーゼ、ならびにそれらの混合物であってよい。上記糖がデンプンまたはデンプン誘導体である場合には、該誘導体は、アミロース、アミロペクチン、可溶性デンプン、アミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトース、及びグルコース、ならびにそれらの混合物からなる群より選択されてもよい。
本発明のいくつかの製造方法は、デンプンをデンプン誘導体に転化させるステップであって、上記デンプン誘導体がデンプンの酵素的加水分解またはデンプンの酸加水分解によって製造される上記ステップを更に含んでいてもよい。また、４－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）を上記方法に添加してもよい。４ＧＴを用いて、分解生成物であるグルコース、マルトース、及びマルトトリオースをより長いマルトオリゴ糖へとリサイクルすることによりヘキソース収率を高めることができ、マルトオリゴ糖をαＧＰにより加リン酸分解で開裂させてＧ１Ｐを生成させることができる。
本方法がデンプン誘導体を用いる場合には、該デンプン誘導体を、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、α－アミラーゼ、またはそれらの組み合わせによって触媒されるデンプンの酵素的加水分解により製造してもよい。
本発明の製造方法はまた、少なくとも１種の酵素によって触媒される、フルクトースを上記Ｆ６Ｐに転化させるステップ及び、任意選択で、少なくとも１種の酵素によって触媒される、スクロースを上記フルクトースに転化させるステップも含んでいてよい。
更に、本発明のヘキソースの製造方法は、少なくとも１種の酵素によって触媒される、グルコースを上記Ｇ６Ｐに転化させるステップ及び、任意選択で、少なくとも１種の酵素によって触媒される、スクロースを上記グルコースに転化させるステップを含んでいてもよい。
本発明のヘキソースの合成方法のそれぞれにおける上記ステップは、約４０℃～約９０℃の範囲の温度及び約５．０～約８．０の範囲のｐＨで実施されてもよい。上記ステップは約８時間～約４８時間実施されてもよい。
本発明の製造方法の上記ステップは単一のバイオリアクター中で実施されてもよい。上記ステップはまた、直列に配置された複数のバイオリアクター中で実施されてもよい。
本発明の酵素的プロセスステップはＡＴＰなし及び／またはＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）なしで実施してもよい。上記ステップは約０．１ｍＭ～約１５０ｍＭの範囲のリン酸濃度で実施してもよい。本発明の製造方法のリン酸化及び脱リン酸化ステップにおいて用いられるリン酸をリサイクルしてもよい。上記製造方法の少なくとも１のステップはエネルギー的に有利な化学反応を含んでいてもよい。
本発明は、これらの方法によって製造されたアロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、アルトロース、タロース、ソルボース、グロース、及びイドースにも関する。
図面の簡単な記述
デンプンまたはその誘導製品をアロースに転化させる酵素的経路を示す概略図である。次の略語、すなわち、ＩＡ：イソアミラーゼ、ＰＡ：プルラナーゼ、αＧＰ：α－グルカンホスホリラーゼまたはデンプンホスホリラーゼ、ＭＰ：マルトースホスホリラーゼ、ＰＧＭ：ホスホグルコムターゼ、ＰＰＧＫ：ポリリン酸グルコキナーゼ、ＰＧＩ：ホスホグルコイソメラーゼ、Ｐ６ＰＥ：プシコース６－リン酸３－エピメラーゼ、Ａ６ＰＩ：アロース６－リン酸イソメラーゼ、Ａ６ＰＰ：アロース６－リン酸ホスファターゼを用いる。 図１－１と同様。
デンプンまたはその誘導製品をマンノースに転化させる酵素的経路を示す概略図である。次の略語、すなわち、ＩＡ：イソアミラーゼ、ＰＡ：プルラナーゼ、αＧＰ：α－グルカンホスホリラーゼまたはデンプンホスホリラーゼ、ＭＰ：マルトースホスホリラーゼ、ＰＧＭ：ホスホグルコムターゼ、ＰＰＧＫ：ポリリン酸グルコキナーゼ、ＰＧＩ：ホスホグルコイソメラーゼ、ＰＧＰＭＩ：二官能性ホスホグルコース／ホスホマンノースイソメラーゼ、Ｍ６ＰＩ：マンノース６－リン酸イソメラーゼ、Ｍ６ＰＰ：マンノース６－リン酸ホスファターゼを用いる。 図２－１と同様。
デンプンまたはその誘導製品をガラクトースに転化させる酵素的経路を示す概略図である。次の略語、すなわち、ＩＡ：イソアミラーゼ、ＰＡ：プルラナーゼ、αＧＰ：α－グルカンホスホリラーゼまたはデンプンホスホリラーゼ、ＭＰ：マルトースホスホリラーゼ、ＰＧＭ：ホスホグルコムターゼ、ＰＰＧＫ：ポリリン酸グルコキナーゼ、ＰＧＩ：ホスホグルコイソメラーゼ、Ｆ６ＰＥ：フルクトース６－リン酸４－エピメラーゼ、Ｇａｌ６ＰＩ：ガラクトース６－リン酸イソメラーゼ、Ｇａｌ６ＰＰ：ガラクトース６－リン酸ホスファターゼを用いる。 図３－１と同様。
デンプンまたはその誘導製品をガラクトースに転化させる酵素的経路を示す概略図である。次の略語、すなわち、ＩＡ：イソアミラーゼ、ＰＡ：プルラナーゼ、αＧＰ：α－グルカンホスホリラーゼまたはデンプンホスホリラーゼ、ＭＰ：マルトースホスホリラーゼ、ＰＧＭ：ホスホグルコムターゼ、ＰＰＧＫ：ポリリン酸グルコキナーゼ、ＰＧＩ：ホスホグルコイソメラーゼ、Ｆ６ＰＰ：フルクトース６－リン酸ホスファターゼを用いる。 図４－１と同様。
スクロースをフルクトースに転化させる酵素的経路を示す概略図である。次の略語、すなわち、ＳＰ：スクロースホスホリラーゼ、ＰＧＭ：ホスホグルコムターゼ、ＰＧＩ：ホスホグルコイソメラーゼ、Ｆ６ＰＰ：フルクトース６－リン酸ホスファターゼを用いる。
デンプンまたはその誘導製品をアルトロースに転化させる酵素的経路を示す概略図である。次の略語、すなわち、ＩＡ：イソアミラーゼ、ＰＡ：プルラナーゼ、αＧＰ：α－グルカンホスホリラーゼまたはデンプンホスホリラーゼ、ＭＰ：マルトースホスホリラーゼ、ＰＧＭ：ホスホグルコムターゼ、ＰＰＧＫ：ポリリン酸グルコキナーゼ、ＰＧＩ：ホスホグルコイソメラーゼ、Ｐ６ＰＥ：プシコース６－リン酸エピメラーゼ、Ａｌｔ６ＰＩ：アルトロース６－リン酸イソメラーゼ、Ａｌｔ６ＰＰ：アルトロース６－リン酸ホスファターゼを用いる。 図６－１と同様。
デンプンまたはその誘導製品をタロースに転化させる酵素的経路を示す概略図である。次の略語、すなわち、ＩＡ：イソアミラーゼ、ＰＡ：プルラナーゼ、αＧＰ：α－グルカンホスホリラーゼまたはデンプンホスホリラーゼ、ＭＰ：マルトースホスホリラーゼ、ＰＧＭ：ホスホグルコムターゼ、ＰＰＧＫ：ポリリン酸グルコキナーゼ、ＰＧＩ：ホスホグルコイソメラーゼ、Ｆ６ＰＥ：フルクトース６－リン酸エピメラーゼ、Ｔａｌ６ＰＩ：タロース６－リン酸イソメラーゼ、Ｔａｌ６ＰＰ：タロース６－リン酸ホスファターゼを用いる。 図７－１と同様。
デンプンまたはその誘導製品をソルボースに転化させる酵素的経路を示す概略図である。次の略語、すなわち、ＩＡ：イソアミラーゼ、ＰＡ：プルラナーゼ、αＧＰ：α－グルカンホスホリラーゼまたはデンプンホスホリラーゼ、ＭＰ：マルトースホスホリラーゼ、ＰＧＭ：ホスホグルコムターゼ、ＰＰＧＫ：ポリリン酸グルコキナーゼ、ＰＧＩ：ホスホグルコイソメラーゼ、Ｆ６ＰＥ：フルクトース６－リン酸エピメラーゼ、Ｓ６ＰＥ：ソルボース６－リン酸エピメラーゼ、Ｓ６ＰＰ：ソルボース６－リン酸ホスファターゼを用いる。 図８－１と同様。
デンプンまたはその誘導製品をグロースに転化させる酵素的経路を示す概略図である。次の略語、すなわち、ＩＡ：イソアミラーゼ、ＰＡ：プルラナーゼ、αＧＰ：α－グルカンホスホリラーゼまたはデンプンホスホリラーゼ、ＭＰ：マルトースホスホリラーゼ、ＰＧＭ：ホスホグルコムターゼ、ＰＰＧＫ：ポリリン酸グルコキナーゼ、ＰＧＩ：ホスホグルコイソメラーゼ、Ｆ６ＰＥ：フルクトース６－リン酸エピメラーゼ、Ｓ６ＰＥ：ソルボース６－リン酸エピメラーゼ、Ｇｕｌ６ＰＩ：グロース６－リン酸イソメラーゼ、Ｇｕｌ６ＰＰ：グロース６－リン酸ホスファターゼを用いる。 図９－１と同様。
デンプンまたはその誘導製品をイドースに転化させる酵素的経路を示す概略図である。次の略語、すなわち、ＩＡ：イソアミラーゼ、ＰＡ：プルラナーゼ、αＧＰ：α－グルカンホスホリラーゼまたはデンプンホスホリラーゼ、ＭＰ：マルトースホスホリラーゼ、ＰＧＭ：ホスホグルコムターゼ、ＰＰＧＫ：ポリリン酸グルコキナーゼ、ＰＧＩ：ホスホグルコイソメラーゼ、Ｆ６ＰＥ：フルクトース６－リン酸エピメラーゼ、Ｓ６ＰＥ：ソルボース６－リン酸エピメラーゼ、Ｉ６ＰＩ：イドース６－リン酸イソメラーゼ、Ｉ６ＰＰ：イドース６－リン酸ホスファターゼを用いる。 図１０－１と同様。
グルコース１－リン酸の別のヘキソースへの転化の生成ギブスエネルギーに基づく、中間体間の反応ギブスエネルギーを示す図である。
発明の記述
本明細書に記載の発明は、ヘキソースを合成するための酵素的経路または製造方法であって、製品収率が高いと共に、生成物の分離コスト及びヘキソースの製造コストを大幅に低減する上記経路または製造方法を提供する。本明細書には、これらの製造方法によって製造されたヘキソースも記載される。
本発明の糖からのヘキソースの製造方法は、
１種または複数種の酵素で触媒することによってフルクトース６－リン酸（Ｆ６Ｐ）を上記ヘキソースに転化させることを含み、
上記ヘキソースは、アロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、アルトロース、タロース、ソルボース、グロース、及びイドースからなる群より選択され、
上記酵素は、イソメラーゼ、エピメラーゼ、及びヘキソース特異的ホスファターゼ、ならびにそれらの混合物からなる群より選択される。
本発明の製造方法の重要な利点の１つは、複数のプロセスステップを単一のバイオリアクターまたは反応槽中で実施することができることである。あるいは、上記複数のステップは、直列に配置された複数のバイオリアクターまたは反応槽中で実施することもできる。
特に全てのプロセスステップが単一のバイオリアクターまたは反応槽中で実施される場合、脱リン酸化ステップ中に生成するリン酸イオンを、次に、糖をＧ１Ｐに転化させる上記プロセスステップにリサイクルすることができる。上記開示する製造方法においてリン酸をリサイクルすることができることにより、非化学量論量のリン酸を用いることが可能になり、これにより反応液中のリン酸濃度が低く保たれる。このことにより、本製造方法の全体的な経路及び全体を通した速度が影響を受けるが、個々の酵素の活性が制限されることはなく、本ヘキソースの製造方法が全体的に効率的になることができる。
例えば、本製造方法のそれぞれにおける反応液中のリン酸濃度は、約０．１ｍＭ～約３００ｍＭ、約０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１ｍＭ～約５０ｍＭ、好ましくは約５ｍＭ～約５０ｍＭ、またはより好ましくは約１０ｍＭ～約５０ｍＭの範囲であってよい。例えば、本製造方法のそれぞれにおける反応液中のリン酸濃度は、約０．１ｍＭ、約０．５ｍＭ、約１ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２ｍＭ、約２．５ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、または約５５ｍＭであってよい。
リン酸濃度が低いことで、総リン酸量が少なくなることにより製造コストが減少し、延いてはリン酸除去のコストが低下する。また、リン酸濃度が低いと高濃度の遊離リン酸によるホスファターゼの阻害も防止され、リン酸による汚染の可能性も低下する。
更に、本明細書に開示の製造方法のそれぞれは、リン酸の供給源としてＡＴＰを添加することなく、すなわちＡＴＰなしで実施することができる。本製造方法のそれぞれは、ＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）についても、これを添加しなければならないということなしに、すなわちＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）なしで実施することができる。他の利点としては、開示するヘキソースの製造方法の少なくとも１のステップが、エネルギー的に有利な化学反応を含むという事実も挙げられる。
糖をＧ１Ｐに転化させるために用いられる上記酵素の例としては、α－グルカンホスホリラーゼ（αＧＰ、ＥＣ ２．４．１．１）、マルトースホスホリラーゼ（ＭＰ、ＥＣ ２．４．１．８）、セロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ、ＥＣ ２．４．１．４９）、セロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ、ＥＣ ２．４．１．２０）、セルロースホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ、ＥＣ ２．４．１．７）、及びそれらの組み合わせが挙げられる。上記酵素または酵素の組み合わせの選択は、本製造方法で用いられる糖に依存する。
Ｇ１Ｐを生成させるために用いられる上記糖は、多糖、オリゴ糖、及び／または二糖であってよい。例えば、上記糖は、デンプン、デンプンの１種もしくは複数種の誘導体、セルロース、セルロースの１種もしくは複数種の誘導体、スクロース、スクロースの１種もしくは複数種の誘導体、またはそれらの組み合わせであってよい。
デンプンは、自然界で最も広く用いられるエネルギー貯蔵化合物であり、ほとんどが植物の種子中に貯蔵されている。天然のデンプンは直鎖状のアミロースと分岐鎖状のアミロペクチンを含有する。デンプン誘導体の例としては、アミロース、アミロペクチン、可溶性デンプン、アミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトース、フルクトース、及びグルコースが挙げられる。セルロース誘導体の例としては、前処理したバイオマス、再生非晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、フルクトース、及びグルコースが挙げられる。スクロース誘導体としてはフルクトース及びグルコースが挙げられる。
デンプン及びその誘導体、セルロース及びその誘導体、ならびにスクロース及びその誘導体からのＦ６Ｐの製造方法は、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１７／０５９２７８号に記載される。
上記デンプンの誘導体は、デンプンの酵素的加水分解、またはデンプンの酸加水分解により製造することができる。詳細には、上記デンプンの酵素的加水分解は、α－１，６－グルコシド結合を加水分解するイソアミラーゼ（ＩＡ、ＥＣ． ３．２．１．６８）、α－１，６－グルコシド結合を加水分解するプルラナーゼ（ＰＡ、ＥＣ． ３．２．１．４１）、短鎖マルトオリゴ糖のグリコシル転移を触媒して、より長鎖のマルトオリゴ糖を生成させる４－α－グルカノトランスフェラーゼ（４ＧＴ、ＥＣ． ２．４．１．２５）、またはα－１，４－グルコシド結合を開裂させるα－アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．１）によって触媒、すなわち促進される。
更に、セルロースの誘導体は、セルラーゼ混合物により触媒されるセルロースの酵素的加水分解、酸、またはバイオマスの前処理により製造することができる。
糖をＧ１Ｐに転化させるために用いられる酵素はαＧＰを含んでいてもよい。このステップにおいては、当該の糖がデンプンを含有する場合、上記Ｇ１ＰはαＧＰによってデンプンから生成し、上記糖が可溶性デンプン、アミロデキストリン、またはマルトデキストリンを含有する場合、上記Ｇ１ＰはαＧＰによって可溶性デンプン、アミロデキストリン、またはマルトデキストリンから生成する。
上記糖がマルトースを含み、上記酵素がマルトースホスホリラーゼを含有する場合、上記Ｇ１Ｐはマルトースホスホリラーゼによってマルトースから生成する。上記糖がスクロースを含み、酵素がスクロースホスホリラーゼを含有する場合、上記Ｇ１Ｐはスクロースホスホリラーゼによってスクロースから生成する。
上記糖がセロビオースを含み、上記酵素がセロビオースホスホリラーゼを含有する場合、上記Ｇ１Ｐはセロビオースホスホリラーゼによってセロビオースから生成することができる。
上記糖がセロデキストリンを含有し、上記酵素がセロデキストリンホスホリラーゼを含む場合、上記Ｇ１Ｐはセロデキストリンホスホリラーゼによってセロデキストリンから生成することができる。
糖をＧ１Ｐに転化させる際に、当該の糖がセルロースを含み、酵素がセルロースホスホリラーゼを含有する場合、上記Ｇ１Ｐはセルロースホスホリラーゼによってセルロースから生成することができる。
本発明によれば、ヘキソースをフルクトースから製造することもできる。例えば、この製造方法は、
ポリリン酸フルクトキナーゼ（ＰＰＦＫ）で触媒することによってフルクトース及びポリリン酸からＦ６Ｐを生成させることと、
Ｆ６ＰＥで触媒することによってＦ６ＰをＴ６Ｐに転化させることと、
Ｔ６ＰＰで触媒することによってＴ６Ｐをタガトースに転化させることと
を含む。上記フルクトースは、例えば、スクロースの酵素的転化によって製造することができる。
ヘキソースはスクロースから製造することができる。この製造方法は、例えば、以下の酵素的ステップ、すなわち、
スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）で触媒することによってスクロース及び遊離リン酸からＧ１Ｐを生成させることと、
ＰＧＭで触媒することによってＧ１ＰをＧ６Ｐに転化させることと、
ＰＧＩで触媒することによってＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させることと、
Ｆ６ＰＥで触媒することによってＦ６ＰをＴ６Ｐに転化させることと、
Ｔ６ＰＰで触媒することによってＴ６Ｐをタガトースに転化させることと
を含むイン・ビトロ合成経路を提供する。
本発明の製造方法において用いられるホスファターゼは上記ヘキソースに特異的である。例えば、アロース６－リン酸はアロース６－リン酸ホスファターゼによってアロースに転化され、マンノース６－リン酸はマンノース６－リン酸ホスファターゼによってマンノースに転化され、ガラクトース６－リン酸はガラクトース６－リン酸ホスファターゼによってガラクトースに転化され、フルクトース６－リン酸はフルクトース６－リン酸ホスファターゼによってフルクトースに転化され、アルトロース６－リン酸はアルトロース６－リン酸ホスファターゼによってアルトロースに転化され、タロース６－リン酸はタロース６－リン酸ホスファターゼによりタロースに転化され、ソルボース６－リン酸はソルボース６－リン酸ホスファターゼによってソルボースに転化され、グロース６－リン酸はグロース６－リン酸ホスファターゼによってグロースに転化され、イドース６－リン酸はイドース６－リン酸ホスファターゼによってイドースに転化される。本明細書では、特異的とは、示されたヘキソースに対して他のヘキソースに対するよりも高い比活性を有することを意味する。例えば、アロース６－リン酸ホスファターゼは、例えばソルボース６－リン酸またはタロース６－リン酸に対するよりも、アロース６－リン酸に対して高い比活性を有する。
上記ヘキソース脱リン酸化ステップ中に生成するリン酸イオンを、次に、スクロースをＧ１Ｐに転化させる上記ステップにリサイクルすることができる。更に、ＰＰＦＫ及びポリリン酸を用いて、ＳＰによるスクロースの加リン酸分解での開裂によって生成するフルクトースからＦ６Ｐを生成させることにより、ヘキソース収率を高めることができる。
ヘキソースの製造方法は、以下のステップ、すなわち、
酵素的加水分解または酸加水分解により多糖及びオリゴ糖からグルコースを生成させることと、
少なくとも１種の酵素で触媒することによってグルコースをＧ６Ｐに転化させることと、
酵素的加水分解または酸加水分解により多糖及びオリゴ糖からフルクトースを生成させることと、
少なくとも１種の酵素で触媒することによってフルクトースをＧ６Ｐに転化させることと
を含んでいてもよい。上記多糖及びオリゴ糖の例は上記に列挙される。Ｇ６Ｐは、ポリリン酸グルコキナーゼにより、グルコース及びポリリン酸ナトリウムから製造することができる。
本発明は、デンプン、セルロース、スクロース、及びそれらの誘導製品中の多糖ならびにオリゴ糖などの糖のヘキソースへの転化方法を提供する。無細胞酵素カクテルを使用して、デンプン、セルロース、スクロース、及びそれらの誘導製品をヘキソースに転化させるための、人工（非天然）のＡＴＰを含まない酵素的経路を提供することができる。
上記に示すように、数種の酵素を用いてデンプンを加水分解し、Ｇ１Ｐ収率を増加させることができる。かかる酵素としては、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、及びα－アミラーゼが挙げられる。コーンスターチはαＧＰの作用を妨げる多くの分枝を含む。イソアミラーゼを用いてデンプンを脱分枝し、直鎖状のアミロデキストリンを生成させることができる。イソアミラーゼで前処理したデンプンによって、最終生成物中のＦ６Ｐ濃度をより高くすることができる。イソアミラーゼ及びプルラナーゼはα－１，６－グリコシド結合を開裂させ、これにより、α－グルカンホスホリラーゼによってデンプンをより完全に分解することが可能になる。α－アミラーゼはα－１，４－グリコシド結合を開裂させることから、α－アミラーゼを用いてデンプンをフラグメントに分解させて、ヘキソースへの転化をより迅速にし、且つ溶解度を高める。
マルトースホスホリラーゼ（ＭＰ）を用いて、分解生成物であるマルトースをＧ１Ｐ及びグルコースへと加リン酸分解で開裂させることによって、ヘキソース収率を増加させることができる。あるいは、４－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）を用いて、分解生成物であるグルコース、マルトース、及びマルトトリオースを、αＧＰにより加リン酸分解で開裂させてＧ１Ｐを生成させることができるより長鎖のマルトオリゴ糖へとリサイクルすることによって、ヘキソース収率を増加させることができる。
更に、セルロースは最も豊富な生物資源であり、植物細胞壁の主要な構成成分である。非食品リグノセルロース系バイオマスは、セルロース、ヘミセルロース、及びリグニン、ならびにその他の微量成分を含有する。Ａｖｉｃｅｌ（微結晶セルロース）、再生非晶性セルロース、バクテリアセルロース、ろ紙などを含む純粋なセルロースは、一連の処理を経て製造することができる。部分的に加水分解されたセルロース基質としては、重合度が７を超える水不溶性セロデキストリン、３～６の重合度の水溶性セロデキストリン、セロビオース、グルコース、及びフルクトースが挙げられる。
セルロース及びその誘導製品を、一連のステップを経てヘキソースに転化させることができる。この製造方法は、以下のステップ、すなわち、
セロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）及びセロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）でそれぞれ触媒することによって、セロデキストリン及びセロビオースならびに遊離リン酸からＧ１Ｐを生成させることと、
ＰＧＭで触媒することによってＧ１ＰをＧ６Ｐに転化させることと、
ＰＧＩで触媒することによってＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させることと
を含むイン・ビトロ合成経路を提供する。この製造方法においては、リン酸イオンはセロデキストリン及びセロビオースをＧ１Ｐに転化させる上記ステップによりリサイクルすることができる。
数種の酵素を用いて、固体セルロースを水溶性セロデキストリン及びセロビオースに加水分解してもよい。かかる酵素としては、エンドグルカナーゼ及びセロビオヒドロラーゼが挙げられるが、β－グルコシダーゼ（セロビアーゼ）は含まれない。
セルロースの加水分解及びＧ１Ｐ生成の前に、セルロース及びバイオマスを前処理して、それらの反応性を高め、セルロース鎖の重合度を低下させてもよい。セルロース及びバイオマスの前処理方法としては、希酸前処理、セルロース溶媒によるリグノセルロース分別、アンモニアによる繊維の膨潤、アンモニア水浸漬、イオン液体処理、及び塩酸、硫酸、リン酸、及びそれらの併用を含む濃酸を使用することによる部分的加水分解が挙げられる。
ポリリン酸及びポリリン酸グルコキナーゼ（ＰＰＧＫ）を本発明の製造方法に添加し、それにより分解生成物であるグルコースをＧ６Ｐにリン酸化することによって、ヘキソース収率を増加させることができる。
ヘキソースをグルコースから生成させてもよい。このヘキソースの製造方法は、
ポリリン酸グルコキナーゼ（ＰＰＧＫ）で触媒することによってグルコース及びポリリン酸からＧ６Ｐを生成させるステップと、
ＰＧＩで触媒することによってＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させるステップと
を含んでいてもよい。
本発明の製造方法のそれぞれに、ＨＥＰＥＳ、ＰＢＳ、ＢＩＳ－ＴＲＩＳ、ＭＯＰＳ、ＤＩＰＳＯ、Ｔｒｉｚｍａなどの、当技術分野で公知の、任意且つ適宜の生物学的に適合性のある緩衝剤を用いてもよい。本発明の製造方法に用いる反応緩衝液のｐＨは５．０～８．０の範囲であってよい。より好ましくは、上記反応緩衝液のｐＨは約６．０～約７．３の範囲であってよい。例えば、上記反応緩衝液のｐＨは、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、または７．３であってよい。
上記反応緩衝液は金属カチオンも含有していてよい。上記金属イオンの例としては、Ｍｇ２＋及びＺｎ２＋が挙げられる。当技術分野で公知のように、適宜の塩を用いて所望の金属カチオンを導入することができる。
本発明の製造方法のそれぞれにおいて、当該プロセスステップが実施される反応温度は３７～９５℃の範囲であってよい。より好ましくは、上記ステップは約４０℃～約９０℃の範囲の温度で実施してもよい。上記温度は、例えば、約４０℃、約４５℃、５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃、約８０℃、約８５℃、または約９０℃であってよい。上記反応温度は約５０℃であることが好ましい。
開示する製造方法のそれぞれの反応時間は必要に応じて調整してもよく、約８時間～約４８時間の範囲であってよい。例えば、上記反応時間は、約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２２時間、約２４時間、約２６時間、約２８時間、約３０時間、約３２時間、約３４時間、約３６時間、約３８時間、約４０時間、約４２時間、約４４時間、約４６時間、または約４８時間であってよい。上記反応時間は約２４時間であることがより好ましい。
一般的には、開示する製造方法のそれぞれにおいて用いる酵素ユニットの比率は（当該製造方法の触媒反応ステップの数に応じて）１：１～１：１：１：１：１である。製品収率を最適化するために、これらの比率を任意の数の組み合わせで調整してもよい。例えば、３：１：１：１：１の比率を用いて、リン酸化中間体の濃度を最大化することができ、これにより、その下流の反応の活性が増加することとなる。逆に、１：１：１：１：３の比率を用いて、αＧＰに対するリン酸の供給を確実に維持することができ、これにより、α－１，４－グリコシド結合がより効率的に加リン酸分解で開裂することとなる。例えば３：１：１：１：３の酵素の比率を用いて反応速度を更に高めることができる。したがって、以下に説明する他の任意選択の酵素を含む酵素の比率を変化させて、ヘキソース生成の効率を高めることができる。例えば、ある特定の酵素が、他の酵素の量に対して約２倍、３倍、４倍、５倍等の量で存在していてもよい。
本発明の製造方法のそれぞれは、全体の反応に対する非常に有利な平衡定数に起因して、高収率を達成することができる。例えば、図１１は、グルコース１－リン酸のヘキソースへの転化の生成ギブスエネルギーに基づく、中間体間の反応ギブスエネルギーを示す。反応ギブスエネルギーは、ｈｔｔｐ：／／ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｏｒ．ｗｅｉｚｍａｎｎ．ａｃ．ｉｌ／を用いて与えられる。理論的には、出発物質が完全に中間体に転化されるならば、最大で９９％の収率を達成することができる。
本発明の製造方法は低コストの出発物質を使用し、原料及び生成物の分離に関連するコストを削減することにより製造コストを低減する。デンプン、セルロース、スクロース、及びそれらの誘導体は、例えばラクトースよりも安価な原料である。ヘキソースがラクトースから製造される場合、グルコース及び他のヘキソース（複数可）はクロマトグラフィーにより分離され、このことがより高い製造コストに繋がる。
また、本発明に係るホスファターゼによるヘキソースの脱リン酸化のステップは、原料の如何にかかわらず不可逆的なホスファターゼ反応である。したがって、ヘキソースは非常に高い収率で生成し、同時にそれに続く生成物の分離コストを効果的に最小限に抑える。
本発明のいくつかの態様において、Ａ６Ｐ、Ｍ６Ｐ、Ｆ６Ｐ、またはＧａｌ６Ｐをそれらのそれぞれの非リン酸化形態に転化させるホスファターゼは、２価金属補因子、好ましくはマグネシウムを利用する。本発明の更なる態様において、上記ホスファターゼは、
触媒作用のためのロスマン様フォールドドメインと、
更に、基質特異性のためのＣ１またはＣ２キャッピングドメインと、
更に、マグネシウムを配位させるための、第２のＡｓｐが一般的な酸／塩基触媒である上記ロスマン様フォールドの第１のβストランド中のＤｘＤシグネチャーと、
更に、反応中間体の安定性を助長する、上記ロスマン様フォールドの第２のβストランドの末端のＴｈｒまたはＳｅｒと、
更に、反応中間体の安定性を助長する、上記ロスマン様フォールドの第３のβストランドのαヘリックスＣ末端のＮ末端のＬｙｓと、
更に、マグネシウムを配位させるための、上記ロスマン様フォールドの第４のβストランドの末端のＧＤｘｘｘＤ、ＧＤｘｘｘｘＤ、ＤＤ、またはＥＤシグネチャーと
を含有するが、含有することに限定されない。これらの特徴は当技術分野で知られており、例えば、Ｂｕｒｒｏｕｇｈｓ ｅｔ ａｌ．， Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ＨＡＤ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ： Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ａｄａｐｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｃａｔａｌｙｔｉｃ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ａ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｐｈｏｓｐｈｏｅｓｔｅｒａｓｅｓ ａｎｄ Ａｌｌｉｅｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２００６；３６１；１００３－１０３４において言及されている。
細胞による製造方法とは対照的に、本発明は、ヘキソースの無細胞での製造を含み、多くの場合に基質の細胞中への／生成物の細胞外への輸送を減速させる細胞膜を排除することに起因して、比較的に高い反応速度を有する。本発明においてはまた、最終製品が栄養分に富む発酵培地／細胞による代謝産物を含まない。
アロース
本発明の一実施形態は、
プシコース６－リン酸３－エピメラーゼ（Ｐ６ＰＥ）で触媒することによってフルクトース６－リン酸（Ｆ６Ｐ）をプシコース６－リン酸（Ｐ６Ｐ）に転化させることと、
アロース６－リン酸イソメラーゼ（Ａ６ＰＩ）で触媒することによってＰ６Ｐをアロース６－リン酸（Ａ６Ｐ）に転化させることと、
アロース６－リン酸ホスファターゼで触媒することによって上記生成したＡ６Ｐをアロースに転化させることと
を含むアロースの製造方法である。
Ｐ６ＰＥの例としては、ＵＮＩＰＲＯＴ識別番号によって識別される以下のタンパク質、すなわち、Ｄ９ＴＱＪ４、Ａ０Ａ０９０ＩＸＺ８、及びＰ３２７１９が挙げられるが、これらに限定はされない。これらのうち、Ｄ９ＴＱＪ４及びＡ０Ａ０９０ＩＸＺ８は好熱性生物から得られる。Ｐ３２７１９は中温性生物から得られる。Ｐ３２７１９はＡ０Ａ０９０ＩＸＺ８に対して５３％、Ｄ９ＴＱＪ４に対して５５％の同一性を有し、それぞれのタンパク質がＦ６ＰのＡ６Ｐへのエピマー化を触媒する。更に、Ａ０Ａ０９０ＩＸＺ８はＤ９ＴＱＪ４に対して４５％の同一性を有する。逆に、Ｄ９ＴＱＪ４に対する同一性が４５％以下である、ＵＮＩＰＲＯＴ識別番号：Ａ０Ａ１０１Ｄ８２３、Ｒ１ＡＸＤ６、Ａ０Ａ１５０ＬＢＵ８、Ａ０Ａ０２３ＣＱＧ９、及びＨ１ＸＷＹ２で識別される他のエピメラーゼタンパク質は、Ｆ６ＰのＡ６Ｐへのエピマー化を触媒しない。Ｐ６ＰＥの例には、上述のＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤのいずれかに対するアミノ酸配列同一性が少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％である任意の類似体も含まれる。
Ａ６ＰＩの例としては、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｗ４Ｖ２Ｃ８、及び配列番号２に示すアミノ酸配列を有するＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ６７ＬＸ４が挙げられるが、これらに限定はされない。Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｗ４Ｖ２Ｃ８及びＱ６７ＬＸ４は共にＡ６ＰＩ反応を触媒し、５６％のアミノ酸配列同一性を共有する。したがって、Ａ６ＰＩの例には、上述のＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤのいずれかに対するアミノ酸配列同一性が、少なくとも５５％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、または少なくとも９４％、更に最も好ましくは少なくとも９６、９７、９８、９９、または１００％である任意の類似体も含まれる。
Ｐ６ＰをＡ６Ｐに転化させる方法における使用に好適なＡ６ＰＩはロスマン様フォールドを含有する。当技術分野で報告されている中温性Ａ６ＰＩ（Ｍｏｗｂｒａｙ ｅｔ ａｌ．， Ｄ－Ｒｉｂｏｓｅ－５－Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｉｓｏｍｅｒａｓｅ Ｂ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｉｓ Ａｌｓｏ ａ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｄ－Ａｌｌｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｉｓｏｍｅｒａｓｅ， Ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｅｎｚｙｍｅ ｉｓ Ｎｏｔ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２００８；３８２；６６７－６７９）は、本発明において開示する好熱性Ａ６ＰＩと保存残基を共有する。本発明のいくつかの態様において、上記イソメラーゼは、
リン酸結合のための上記ロスマン様フォールドの第１のβストランドのＨｉｓ（中温性残基１０）Ｃ末端と、
更に、これもリン酸結合のための上記ロスマン様フォールドの第５のβストランドのαヘリックスＣ末端のＡｒｇ（中温性残基１３３）Ｃ末端と、
更に、ラクトンを開環させるための活性部位中のＨｉｓ（中温性残基９９）と、
更に、触媒作用をもつ塩基として作用する活性部位中のＣｙｓ（中温性残基６６）と、
更に、触媒作用をもつ酸として作用する活性部位中のＴｈｒ（中温性残基６８）と、
更に、高エネルギー中間体を安定化するための、活性部位の近傍のＧＴＧ疎水性Ｇモチーフ（中温性残基６７～７１）と、
更に、これも高エネルギー中間体を安定化するための、活性部位の近傍のＡｓｎ（中温性残基１００）と
を含有するが、含有することに限定されない。Ａ６ＰＩは、好ましくはこれらの保存残基の全てを含有する。
Ａ６ＰＰの例としては、以下のタンパク質、すなわち、配列番号３に示すアミノ酸配列を有するＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｓ９ＳＤＡ３、配列番号４に示すアミノ酸配列を有するＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ９Ｘ０Ｙ１、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｉ３ＶＴ８１、配列番号６に示すアミノ酸配列を有するＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１３２ＮＦ０６、及び配列番号７に示すアミノ酸配列を有するＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ１Ｃ７Ｇ９が挙げられるが、これらに限定はされない。Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｓ９ＳＤＡ３及びＩ３ＶＴ８１は共にＡ６ＰＰ反応を触媒し、３０％のアミノ酸配列同一性を共有する。したがって、Ａ６ＰＰの例には、上述のＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤのいずれかに対するアミノ酸配列同一性が、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３５％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも４５％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、または少なくとも９４％、更に最も好ましくは少なくとも９６、９７、９８、９９、または１００％である任意の類似体も含まれる。
Ａ６Ｐをアロースに転化させるＡ６ＰＰは、
触媒作用のためのロスマン様フォールドドメインと、
Ｃ１キャッピングドメインと、
上記ロスマン様フォールドの第１のβストランド中のＤｘＤシグネチャーと、
上記ロスマン様フォールドの第２のβストランドの末端のＴｈｒまたはＳｅｒと、
上記ロスマン様フォールドの第３のβストランドのαヘリックスＣ末端のＮ末端のＬｙｓと、
上記ロスマン様フォールドの第４のβストランドの末端のＥＤシグネチャーと
を含有することが好ましい。
本発明のアロースの製造方法はまた、グルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）を酵素的にＦ６Ｐに転化させるステップも含み、このステップはホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）によって触媒される。他の実施形態において、本アロースの製造方法は、グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）をＧ６Ｐに転化させるステップを更に含み、このステップはホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される。更に別の実施形態において、アロースの製造方法はまた、少なくとも１種の酵素によって触媒される、糖を上記Ｇ１Ｐに転化させるステップも含む。
したがって、本発明のアロースの製造方法は、例えば、以下のステップ、すなわち、
（ｉ）１種または複数種の酵素を用いて糖をグルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）に転化させることと、
（ｉｉ）ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ、ＥＣ ５．４．２．２）を用いてＧ１ＰをＧ６Ｐに転化させることと、
（ｉｉｉ）ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ、ＥＣ ５．３．１．９）を用いてＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させることと、
（ｉｖ）Ｐ６ＰＥを介してＦ６ＰをＰ６Ｐに転化させることと、
（ｖ）Ａ６ＰＩを介してＰ６ＰをＡ６Ｐに転化させることと、
（ｖｉ）Ａ６ＰＰを介してＡ６Ｐをアロースに転化させることと
を含んでいてもよい。上記糖がデンプンである場合の本酵素的製造方法の例を図１に示す。
一般的には、開示する製造方法のそれぞれにおいて用いる酵素ユニットの比率は１：１：１：１：１：１（αＧＰ：ＰＧＭ：ＰＧＩ：Ｐ６ＰＥ：Ａ６ＰＩ：Ａ６ＰＰ）である。製品収率を最適化するために、これらの比率を任意の数の組み合わせで調整してもよい。例えば、３：１：１：１：１：１の比率を用いて、リン酸化中間体の濃度を最大化することができ、これにより、その下流の反応の活性が増加することとなる。逆に、１：１：１：１：１：３の比率を用いて、αＧＰに対するリン酸の供給を確実に維持することができ、これにより、α－１，４－グリコシド結合がより効率的に加リン酸分解で開裂することとなる。例えば３：１：１：１：１：３の酵素の比率を用いて反応速度を更に高めることができる。したがって、以下に説明する他の任意選択の酵素を含む酵素の比率を変化させて、アロース生成の効率を高めることができる。例えば、ある特定の酵素が、他の酵素の量に対して約２倍、３倍、４倍、５倍等の量で存在していてもよい。
特に全てのプロセスステップが単一のバイオリアクターまたは反応槽中で実施される場合、Ａ６Ｐの脱リン酸化によって生成するリン酸イオンを、次に、糖をＧ１Ｐに転化させるプロセスステップにリサイクルすることができる。開示する製造方法においてリン酸をリサイクルすることができることにより、非化学量論量のリン酸を用いることが可能になり、これにより反応液中のリン酸濃度が低く保たれる。このことにより、本製造方法の全体的な経路及び全体を通した速度が影響を受けるが、個々の酵素の活性が制限されることはなく、本アロースの製造方法が全体的に効率的になることができる。
例えば、反応液中のリン酸濃度は、約０．１ｍＭ～約３００ｍＭ、約０．１ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１ｍＭ～約５０ｍＭ、好ましくは約５ｍＭ～約５０ｍＭ、またはより好ましくは約１０ｍＭ～約５０ｍＭの範囲であってよい。例えば、上記反応液中のリン酸濃度は、約０．１ｍＭ、約０．５ｍＭ、約１ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２ｍＭ、約２．５ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、または約５５ｍＭであってよい。
リン酸濃度が低いことで、総リン酸量が少なくなることにより製造コストが減少し、延いてはリン酸除去のコストが低下する。また、リン酸濃度が低いと高濃度の遊離リン酸によるＡ６ＰＰの阻害も防止され、リン酸による汚染の可能性も低下する。
更に、本明細書に開示の製造方法は、リン酸の供給源としてＡＴＰを添加することなく、すなわちＡＴＰなしで実施することができる。本製造方法は、ＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）についても、これを添加しなければならないということなしに、すなわちＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）なしで実施することができる。他の利点としては、開示するアロースの製造方法の少なくとも１のステップが、エネルギー的に有利な反応を含むという事実も挙げられる。
アロースをフルクトースから製造することもできる。例えば、この製造方法は、
ポリリン酸フルクトキナーゼ（ＰＰＦＫ）で触媒することによってフルクトース及びポリリン酸からＦ６Ｐを生成させることと、
Ｆ６ＰＥで触媒することによってＦ６ＰをＰ６Ｐに転化させることと、
Ａ６ＰＩで触媒することによってＰ６ＰをＡ６Ｐに転化させることと、
Ａ６ＰＰで触媒することによってＡ６Ｐをアロースに転化させることと
を含む。上記フルクトースは、例えば、スクロースの酵素的転化によって製造することができる。
アロースはスクロースから製造することもできる。この製造方法は、以下の酵素的ステップ、すなわち、
スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）で触媒することによってスクロース及び遊離リン酸からＧ１Ｐを生成させることと、
ＰＧＭで触媒することによってＧ１ＰをＧ６Ｐに転化させることと、
ＰＧＩで触媒することによってＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させることと、
Ｐ６ＰＥで触媒することによってＦ６ＰをＰ６Ｐに転化させることと、
Ａ６ＰＩで触媒することによってＰ６ＰをＡ６Ｐに転化させることと、
Ａ６ＰＰで触媒することによってＡ６Ｐをアロースに転化させることと
を含むイン・ビトロ合成経路を提供する。
Ａ６Ｐがアロースに転化される際に生成するリン酸イオンを、次に、スクロースをＧ１Ｐに転化させるステップにリサイクルすることができる。更に、ＰＰＦＫ及びポリリン酸を用いて、ＳＰによるスクロースの加リン酸分解での開裂によって生成するフルクトースからＦ６Ｐを生成させることにより、アロース収率を高めることができる。
特定の実施形態において、アロースの製造方法は、以下のステップ、すなわち、
酵素的加水分解または酸加水分解により多糖及びオリゴ糖からグルコースを生成させることと、
少なくとも１種の酵素で触媒することによってグルコースをＧ６Ｐに転化させることと、
酵素的加水分解または酸加水分解により多糖及びオリゴ糖からフルクトースを生成させることと、
少なくとも１種の酵素で触媒することによってフルクトースをＦ６Ｐに転化させることと
を含む。上記多糖及びオリゴ糖の例は上記に列挙される。
他の実施形態において、Ｇ６Ｐは、ポリリン酸グルコキナーゼによりグルコース及びポリリン酸ナトリウムから製造される。
数種の酵素を用いてデンプンを加水分解し、Ｇ１Ｐ収率を増加させることができる。かかる酵素としては、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、及びα－アミラーゼが挙げられる。コーンスターチはαＧＰの作用を妨げる多くの分枝を含む。イソアミラーゼを用いてデンプンを脱分枝し、直鎖状のアミロデキストリンを生成させることができる。イソアミラーゼで前処理したデンプンによって、最終生成物中のＦ６Ｐ濃度をより高くすることができる。イソアミラーゼ及びプルラナーゼはα－１，６－グリコシド結合を開裂させ、これにより、α－グルカンホスホリラーゼによってデンプンをより完全に分解することが可能になる。α－アミラーゼはα－１，４－グリコシド結合を開裂させることから、α－アミラーゼを用いてデンプンをフラグメントに分解させて、アロースへの転化をより迅速にし、且つ溶解度を高める。
マルトースホスホリラーゼ（ＭＰ）を用いて、分解生成物であるマルトースをＧ１Ｐ及びグルコースへと加リン酸分解で開裂させることによって、アロース収率を増加させることができる。あるいは、４－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）を用いて、分解生成物であるグルコース、マルトース、及びマルトトリオースを、αＧＰにより加リン酸分解で開裂させてＧ１Ｐを生成させることができるより長鎖のマルトオリゴ糖へとリサイクルすることによって、アロース収率を増加させることができる。
特定の実施形態において、セルロース及びその誘導製品を、一連のステップを経てアロースに転化させることができる。この製造方法は、以下のステップ、すなわち、
セロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）及びセロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）でそれぞれ触媒することによって、セロデキストリン及びセロビオースならびに遊離リン酸からＧ１Ｐを生成させることと、
ＰＧＭで触媒することによってＧ１ＰをＧ６Ｐに転化させることと、
ＰＧＩで触媒することによってＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させることと、
Ｐ６ＰＥで触媒することによってＦ６ＰをＰ６Ｐに転化させることと、
Ａ６ＰＩで触媒することによってＰ６ＰをＡ６Ｐに転化させることと、
Ａ６ＰＰで触媒することによってＡ６Ｐをアロースに転化させることと
を含むイン・ビトロ合成経路を提供する。この製造方法においては、リン酸イオンはセロデキストリン及びセロビオースをＧ１Ｐに転化させる上記ステップによりリサイクルすることができる。
数種の酵素を用いて、固体セルロースを水溶性セロデキストリン及びセロビオースに加水分解してもよい。かかる酵素としては、エンドグルカナーゼ及びセロビオヒドロラーゼが挙げられるが、β－グルコシダーゼ（セロビアーゼ）は含まれない。
いくつかの実施形態において、ポリリン酸及びポリリン酸グルコキナーゼ（ＰＰＧＫ）を本製造方法に添加し、それにより分解生成物であるグルコースをＧ６Ｐにリン酸化することによって、アロースの収率を増加させることができる。
アロースをグルコースから製造してもよい。この製造方法は、
ポリリン酸グルコキナーゼ（ＰＰＧＫ）で触媒することによってグルコース及びポリリン酸からＧ６Ｐを生成させるステップと、
ＰＧＩで触媒することによってＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させるステップと、
Ｐ６ＰＥで触媒することによってＦ６ＰをＰ６Ｐに転化させるステップと、
Ａ６ＰＩで触媒することによってＰ６ＰをＡ６Ｐに転化させるステップと、
Ａ６ＰＰで触媒することによってＡ６Ｐをアロースに転化させるステップと
を含む。
本発明のアロースの製造方法は低コストの出発物質を使用し、原料及び生成物の分離に関連するコストを削減することにより製造コストを低減する。デンプン、セルロース、スクロース、及びいくつかのそれらの誘導体は、例えばフルクトースよりも安価な原料である。アロースがプシコースから製造される場合、収率は本発明の場合よりも低く、アロースをクロマトグラフィーによりプシコースから分離する必要があり、これはより高い製造コストに繋がる。
また、本発明に係るＡ６Ｐをアロースに転化させるステップは、原料の如何にかかわらず不可逆的なホスファターゼ反応である。したがって、アロースは非常に高い収率で生成し、同時にそれに続く生成物の分離コストを効果的に最小限に抑える。
細胞による製造方法とは対照的に、本発明は、アロースの無細胞での製造を含み、多くの場合に基質の細胞中への／生成物の細胞外への輸送を減速させる細胞膜を排除することに起因して、比較的に高い反応速度を有する。本発明においてはまた、最終製品が栄養分に富む発酵培地／細胞による代謝産物を含まない。
本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載のアロースの製造方法によって製造されたアロースである。
アロースの機能はスクロースと類似することから、本発明の方法によって製造されたアロースを任意の飲料または食料品に添加して、所望の甘味を生み出すことができる。
本明細書に開示の製造方法によって製造されたアロースを、強力な甘味料の効果を相乗するために用いてもよい。アロースは、１種または複数種の強力な甘味料と併用する場合、甘味製品の食感、風味、及び後味などの感覚特性を向上させることができる。様々な食品に強力な甘味料などの低カロリー甘味料を使用することは、食品及び飲料の配合処方において通常の事である。しかし、多くの消費者にとって、人工甘味量を用いたダイエットまたは低カロリー型の製品として販売される製品は好ましいものではない。長年にわたり、少量の炭水化物を添加することによってこれらのダイエットまたは低カロリー製品の味覚の送達を改善する試みがなされてきた。本発明の方法によって製造されたアロースは、食品及び飲料配合物の、特にダイエット／低カロリー飲料において、品質を向上させることができるだけでなく、アロースを用いることが強力な甘味料と相乗的に作用し、その結果、アロースを測定されたその甘味の閾値を十分に下回る濃度で添加した場合であっても、アロースが相当な量の強力な甘味料に取って替わることができる場合がある。
本明細書に開示の製造方法によって製造されたアロースを、アイスクリームなどの低カロリー型の食品の製造に、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ Ｂｅｒｔｏｎｉ植物の抽出物などの他の甘味料と併用してもよい。
本明細書に開示の製造方法によって製造されたアロースを、フロスティングとして、Ｄアロースが、スクロースもしくは一般的に使用される他の糖に部分的または完全に取って替わった、予め甘味を付けた即席（ＲＴＥ）朝食用シリアル及び他の食品に用いてもよい。
本明細書に開示の製造方法によって製造されたアロースを、エリトリトールなどの糖アルコール、ならびにフルクトース、スクロース、デキストロース、マルトース、トレハロース、ラムノース、コーンシロップ、及びフルクトオリゴ糖などの相当なカロリー含有量を有する栄養甘味料との併用で、食品及び飲料用の甘味料の一部として用いてもよい。
本明細書に開示の製造方法によって製造されたアロースを、植物病害防除を強化する組成物の一部として用いてもよい。
マンノース
本発明の一実施形態は、
マンノース６－リン酸イソメラーゼ（Ｍ６ＰＩ）で触媒することによってＦ６Ｐをマンノース６－リン酸（Ｍ６Ｐ）に転化させることと、
マンノース６－リン酸ホスファターゼ（Ｍ６ＰＰ）で触媒することによって上記Ｍ６Ｐをマンノースに転化させることと
を含む、マンノースの製造方法である。
Ｍ６ＰＩの例としては、配列番号８に示すアミノ酸配列を有するＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１Ｍ６ＴＬＹ７、配列番号９に示すアミノ酸配列を有するＨ１ＸＱＳ６、配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するＧ２Ｑ９８２、及び配列番号１１に示すアミノ酸配列を有するＦ８Ｆ１Ｚ８が挙げられるが、これらに限定はされない。Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｇ２Ｑ９８２及びＦ８Ｆ１Ｚ８は共にＭ６ＰＩ反応を遂行し、２８％のアミノ酸配列同一性を共有する。したがって、Ｍ６ＰＩの例には、上述のＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤのいずれかに対するアミノ酸配列同一性が、少なくとも２５％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも３５％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも４５％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、または少なくとも９４％、更に最も好ましくは少なくとも９６、９７、９８、９９、または１００％である任意の類似体も含まれる。
Ｆ６ＰをＭ６Ｐに転化させる方法における使用に好適なＭ６ＰＩは、キュピンフォールドに類似する逆平行βストランドのコアを有する２のドメイン及びαヘリックスのみからなる第３のドメインを含有する。Ｍ６ＰＩは、当技術分野において構造をキャラクタライズされており（Ｓａｇｕｒｔｈｉ ｅｔ ａｌ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｍａｎｎｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ｂｏｕｎｄ ｔｏ ｍｅｔａｌ ａｔｏｍｓ ａｎｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ． Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ． ２００９；Ｄ６５；７２４－７３２）、本発明に記載の好熱性Ｍ６ＰＩと保存残基を共有する。本発明のいくつかの態様において、上記イソメラーゼは、
２価金属カチオン、好ましくはＭｇ２＋またはＺｎ２＋と、
更に、金属との結合に用いるためであることが仮説として提案されているＧｌｕ及び２つのＨｉｓ残基（それぞれ、ＰＤＢ ３Ｈ１Ｍ残基１３４、９９、及び２５５）と、
更に、酸／塩基触媒作用のためであることが仮説として提案されているＡｓｐ及びＬｙｓ残基（それぞれ、ＰＤＢ ３Ｈ１Ｍ残基２７０及び１３２）と、
リン酸結合のためであることが仮説として提案されているＬｙｓ、Ｐｒｏ、及びＡｌａ残基（それぞれ、ＰＤＢ ３Ｈ１Ｍ残基１３２、１３３、及び２６７）と
を含有するが、含有することに限定されない。Ｍ６ＰＩは、好ましくはこれらの保存残基の全てを含有する。
Ｍ６ＰＰの例としては、以下のタンパク質、すなわち、配列番号１２に示すアミノ酸配列を有するＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１Ａ６ＤＳＩ３、配列番号１３に示すアミノ酸配列を有するＡ０Ａ１Ｍ４ＵＮ０８、配列番号１４に示すアミノ酸配列を有するＡ０Ａ１Ｎ６ＦＣＷ３が挙げられるが、これらに限定はされない。Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１Ａ６ＤＳＩ３及びＡ０Ａ１Ｎ６ＦＣＷ３は共にＭ６ＰＰ反応を触媒し、３５％のアミノ酸配列同一性を共有する。したがって、Ｍ６ＰＰの例には、上述のＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤのいずれかに対するアミノ酸配列同一性が、少なくとも３５％、より好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも４５％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、または少なくとも９４％、更に最も好ましくは少なくとも９６、９７、９８、９９、または１００％である任意の類似体も含まれる。
Ｍ６Ｐをマンノースに転化させるＭ６ＰＰは、
触媒作用のためのロスマン様フォールドドメインと、
Ｃ１キャッピングドメインと、
上記ロスマン様フォールドの第１のβストランド中のＤｘＤシグネチャーと、
上記ロスマン様フォールドの第２のβストランドの末端のＴｈｒまたはＳｅｒと、
上記ロスマン様フォールドの第３のβストランドのαヘリックスＣ末端のＮ末端のＬｙｓと、
上記ロスマン様フォールドの第４のβストランドの末端のＧＤｘｘｘＤシグネチャーと
を含有することが好ましい。
本発明のマンノースの製造方法はまた、グルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）を酵素的に上記Ｆ６Ｐに転化させるステップも含み、このステップはホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）によって触媒される。他の実施形態において、本マンノースの製造方法は、グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）を上記Ｇ６Ｐに転化させるステップを更に含み、このステップはホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される。更なる実施形態において、本マンノースの製造方法は、上記Ｇ６ＰのＦ６ＰへのＭ６Ｐへの転化を含み、このステップは二官能性ホスホグルコース／ホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＧＰＭＩ）によって触媒される。更に別の実施形態において、マンノースの製造方法は、少なくとも１種の酵素によって触媒される、糖をＧ１Ｐに転化させるステップも含む。
本発明のマンノースの製造方法は、Ｇ６ＰまたはＦ６ＰをＭ６Ｐに転化させるＰＧＰＭＩを用いる。ＰＧＰＭＩの例としては、以下のタンパク質、すなわち、配列番号１５に示すアミノ酸配列を有するＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ７ＣＰＨ７、配列番号１６に示すアミノ酸配列を有するＡ０Ａ０８５Ｌ１７０、及び配列番号１７に示すアミノ酸配列を有するＭ１Ｅ６Ｚ３が挙げられるが、これらに限定はされない。Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０８５Ｌ１７０及びＭ１Ｅ６Ｚ３は共にＰＧＰＭＩ反応を触媒し、２８％のアミノ酸配列同一性を共有する。したがって、ＰＧＰＭＩの例には、上述のＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤのいずれかに対するアミノ酸配列同一性が、少なくとも２５％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも３５％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも４５％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、または少なくとも９４％、更に最も好ましくは少なくとも９６、９７、９８、９９、または１００％である任意の類似体も含まれる。
上記製造方法においてＧ６ＰまたはＦ６ＰをＭ６Ｐに転化させるために用いるのに好適なＰＧＰＭＩは、２のロスマン様フォールドを含有する。ＰＧＰＭＩは、当技術分野において構造をキャラクタライズされており（Ｓｗａｎ ｅｔ ａｌ． Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｓｅ Ｉｓｏｍｅｒａｓｅ （ＰＧＩ）／Ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｓｅ Ｉｓｏｍｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｎ Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ Ｉｓ ａ Ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ＰＧＩ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２００４： ２７９；３９８３８－３９８４５）、本発明に記載の上記好熱性ＰＧＰＭＩと保存残基を共有する。本発明のいくつかの態様において、上記イソメラーゼは、
Ｇｌｙ残基が基質の結合を助長し、Ｓｅｒ残基がリン酸に結合するＧＧＳモチーフ（ＰＤＢ １ＴＺＢ残基４６～４８）と、
更に、リン酸に結合するＳＹＳＧ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＥＴ－疎水性モチーフ（ＰＤＢ １ＴＺＢ残基８７～９６）と、
更に、触媒作用の間に高エネルギー中間体を安定化するＡｒｇ残基（ＰＤＢ １ＴＺＢ残基１３５）と、
更に、Ｇｌｕが活性部位塩基プロトン移動に必須であるＥＮシグネチャー（ＰＤＢ １ＴＺＢ残基２０３～２０４）と、
更に、触媒作用の間にＨｉｓが基質の開環／閉環にとって重要であるＨＮシグネチャー（ＰＤＢ １ＴＺＢ残基２１９～２２０）と、
更に、触媒作用の間に基質の開環／閉環にとって重要である保存Ｌｙｓ残基（ＰＤＢ １ＴＺＢ残基２９８）と
を含有するが、含有することに限定されない。上記保存残基の機能は別個の刊行物（Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｓｅ／Ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｓｅ Ｉｓｏｍｅｒａｓｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ａｒｃｈａｅａ Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ ａｎｄ Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｅｎｚｙｍｅ Ｆａｍｉｌｙ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｓｅ Ｉｓｏｍｅｒａｓｅ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ． Ｊ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２００４；２７９；２２６２－２２７２）において検証されている。ＰＧＰＭＩは好ましくはこれらの保存残基の全てを含有する。
したがって、本発明のマンノースの製造方法は、例えば、以下のステップ、すなわち、
（ｉ）１種または複数種の酵素を用いて糖をグルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）に転化させることと、
（ｉｉ）ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ、ＥＣ ５．４．２．２）を用いてＧ１ＰをＧ６Ｐに転化させることと、
（ｉｉｉ）ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ、ＥＣ ５．３．１．９）を用いてＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させることと、
（ｉｖ）マンノース６－リン酸イソメラーゼ（Ｍ６ＰＩ、ＥＣ ５．３．１．８）を介してＦ６ＰをＭ６Ｐに転化させることと、
（ｖ）二官能性ホスホグルコース／ホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＧＰＭＩ、ＥＣ ５．３．１．８及び５．３．１．９）を介してＧ６ＰをＭ６Ｐに転化させることと、
（ｖｉ）Ｍ６ＰＰを介してＭ６Ｐをマンノースに転化させることと
を含んでいてもよい。上記糖がデンプンである本製造方法の例を図２に示す。
一般的には、開示する製造方法において用いる酵素ユニットの比率は１：１：１：１：１（αＧＰ：ＰＧＭ：ＰＧＩ：Ｍ６ＰＩ：Ｍ６ＰＰ）または１：１：１：１（αＧＰ：ＰＧＭ：ＰＧＰＭＩ：Ｍ６ＰＰ）である。製品収率を最適化するために、これらの比率を任意の数の組み合わせで調整してもよい。例えば、３：１：１：１：１の比率を用いて、リン酸化中間体の濃度を最大化することができ、これにより、その下流の反応の活性が増加することとなる。逆に、１：１：１：１：３の比率を用いて、αＧＰに対するリン酸の供給を確実に維持することができ、これにより、α－１，４－グリコシド結合がより効率的に加リン酸分解で開裂することとなる。例えば３：１：１：１：３の酵素の比率を用いて反応速度を更に高めることができる。したがって、以下に説明する他の任意選択の酵素を含む酵素の比率を変化させて、マンノース生成の効率を高めることができる。例えば、ある特定の酵素が、他の酵素の量に対して約２倍、３倍、４倍、５倍等の量で存在していてもよい。
本製造方法の重要な利点の１つは、複数のプロセスステップを単一のバイオリアクターまたは反応槽中で実施することができることである。あるいは、上記複数のステップは、直列に配置された複数のバイオリアクターまたは反応槽中で実施することもできる。
特に全てのプロセスステップが単一のバイオリアクターまたは反応槽中で実施される場合、Ｍ６Ｐの脱リン酸化ステップによって生成するリン酸イオンを、次に、糖をＧ１Ｐに転化させる上記プロセスステップにリサイクルすることができる。上記開示する製造方法においてリン酸をリサイクルすることができることにより、非化学量論量のリン酸を用いることが可能になり、これにより反応液中のリン酸濃度が低く保たれる。このことにより、本製造方法の全体的な経路及び全体を通した速度が影響を受けるが、個々の酵素の活性が制限されることはなく、本マンノースの製造方法が全体的に効率的になることができる。
例えば、反応液中のリン酸濃度は、約０．１ｍＭ～約３００ｍＭ、約０．１ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１ｍＭ～約５０ｍＭ、好ましくは約５ｍＭ～約５０ｍＭ、またはより好ましくは約１０ｍＭ～約５０ｍＭの範囲であってよい。例えば、上記反応液中のリン酸濃度は、約０．１ｍＭ、約０．５ｍＭ、約１ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２ｍＭ、約２．５ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、または約５５ｍＭであってよい。
したがって、リン酸濃度が低いことで、総リン酸量が少なくなることにより製造コストが減少し、延いてはリン酸除去のコストが低下する。また、リン酸濃度が低いと高濃度の遊離リン酸によるＭ６ＰＰの阻害も防止され、リン酸による汚染の可能性も低下する。
更に、本明細書に開示の製造方法は、リン酸の供給源としてＡＴＰを添加することなく、すなわちＡＴＰなしで実施することができる。本製造方法は、ＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）についても、これを添加しなければならないということなしに、すなわちＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）なしで実施することができる。他の利点としては、開示するマンノースの製造方法の少なくとも１のステップが、エネルギー的に有利な反応を含むという事実も挙げられる。
マンノースはフルクトースから製造することもできる。この製造方法は、例えば、
ポリリン酸フルクトキナーゼ（ＰＰＦＫ）で触媒することによってフルクトース及びポリリン酸からＦ６Ｐを生成させることと、
Ｍ６ＰＩで触媒することによってＦ６ＰをＭ６Ｐに転化させることと、
Ｍ６ＰＰで触媒することによってＭ６Ｐをマンノースに転化させることと
を含む。上記フルクトースは、例えば、スクロースの酵素的転化により製造することができる。
マンノースはスクロースから製造することもできる。この製造方法は、以下の酵素的ステップ、すなわち、
スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）で触媒することによってスクロース及び遊離リン酸からＧ１Ｐを生成させることと、
ＰＧＭで触媒することによってＧ１ＰをＧ６Ｐに転化させることと、
ＰＧＩで触媒することによってＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させることと、
Ｍ６ＰＩで触媒することによってＦ６ＰをＭ６Ｐに転化させることと、
Ｍ６ＰＰで触媒することによってＭ６Ｐをマンノースに転化させることと
を含むイン・ビトロ合成経路を提供する。上記のステップにおいて、上記Ｇ６ＰのＦ６ＰへのＭ６Ｐへの転化は、代替手段としてＰＧＰＭＩによって触媒されてもよい。
Ｍ６Ｐがマンノースに転化される際に生成するリン酸イオンを、次に、スクロースをＧ１Ｐに転化させるステップにリサイクルすることができる。更に、ＰＰＦＫ及びポリリン酸を用いて、ＳＰによるスクロースの加リン酸分解での開裂によって生成するフルクトースからＦ６Ｐを生成させることにより、マンノース収率を高めることができる。
いくつかの実施形態において、マンノースの製造方法は、以下のステップ、すなわち、
酵素的加水分解または酸加水分解によって多糖及びオリゴ糖からグルコースを生成させることと、
少なくとも１種の酵素で触媒することによってグルコースをＧ６Ｐに転化させることと、
酵素的加水分解または酸加水分解によって多糖及びオリゴ糖からフルクトースを生成させることと、
少なくとも１種の酵素で触媒することによってフルクトースをＦ６Ｐに転化させることと
を含む。上記多糖及びオリゴ糖の例は上記に列挙される。
他の実施形態において、Ｇ６Ｐは、ポリリン酸グルコキナーゼによりグルコース及びポリリン酸ナトリウムから製造される。
本開示は、デンプン、セルロース、スクロース、及びそれらの誘導製品中の多糖ならびにオリゴ糖などの糖のマンノースへの転化方法を提供する。特定の実施形態において、無細胞酵素カクテルを使用して、デンプン、セルロース、スクロース、及びそれらの誘導製品をマンノースに転化させるための、人工（非天然）のＡＴＰを含まない酵素的経路が提供される。
上記に示すように、数種の酵素を用いてデンプンを加水分解し、Ｇ１Ｐ収率を増加させることができる。かかる酵素としては、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、及びα－アミラーゼが挙げられる。コーンスターチはαＧＰの作用を妨げる多くの分枝を含む。イソアミラーゼを用いてデンプンを脱分枝し、直鎖状のアミロデキストリンを生成させることができる。イソアミラーゼで前処理したデンプンによって、最終生成物中のＦ６Ｐ濃度をより高くすることができる。イソアミラーゼ及びプルラナーゼはα－１，６－グリコシド結合を開裂させ、これにより、α－グルカンホスホリラーゼによってデンプンをより完全に分解することが可能になる。α－アミラーゼはα－１，４－グリコシド結合を開裂させることから、α－アミラーゼを用いてデンプンをフラグメントに分解させて、マンノースへの転化をより迅速にし、且つ溶解度を高める。
マルトースホスホリラーゼ（ＭＰ）を用いて、分解生成物であるマルトースをＧ１Ｐ及びグルコースへと加リン酸分解で開裂させることによって、マンノース収率を増加させることができる。あるいは、４－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）を用いて、分解生成物であるグルコース、マルトース、及びマルトトリオースを、αＧＰにより加リン酸分解で開裂させてＧ１Ｐを生成させることができるより長鎖のマルトオリゴ糖へとリサイクルすることによって、マンノース収率を増加させることができる。
特定の実施形態において、セルロース及びその誘導製品を、一連のステップを経てマンノースに転化させることができる。この製造方法は、以下のステップ、すなわち、
セロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）及びセロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）でそれぞれ触媒することによって、セロデキストリン及びセロビオースならびに遊離リン酸からＧ１Ｐを生成させることと、
ＰＧＭで触媒することによってＧ１ＰをＧ６Ｐに転化させることと、
ＰＧＩで触媒することによってＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させることと、
Ｍ６ＰＩで触媒することによってＦ６ＰをＭ６Ｐに転化させることと、
Ｍ６ＰＰで触媒することによってＭ６Ｐをマンノースに転化させることと
を含むイン・ビトロ合成経路を提供する。あるいは、前述の経路において、上記Ｇ６ＰのＦ６ＰへのＭ６Ｐへの転化をＰＧＰＭＩによって触媒してもよい。この製造方法においては、リン酸イオンはセロデキストリン及びセロビオースをＧ１Ｐに転化させる上記ステップによりリサイクルすることができる。
いくつかの実施形態において、ポリリン酸及びポリリン酸グルコキナーゼ（ＰＰＧＫ）を本製造方法に添加し、それにより分解生成物であるグルコースをＧ６Ｐにリン酸化することによって、マンノースの収率を増加させることができる。
他の実施形態において、マンノースはグルコースから生成させることができる。この製造方法は、
ポリリン酸グルコキナーゼ（ＰＰＧＫ）で触媒することによってグルコース及びポリリン酸からＧ６Ｐを生成させるステップと、
ＰＧＩで触媒することによってＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させるステップと、
Ｍ６ＰＩで触媒することによってＦ６ＰをＭ６Ｐに転化させるステップと、
Ｍ６ＰＰで触媒することによってＭ６Ｐをマンノースに転化させるステップと
を含む。あるいは、上記Ｇ６ＰのＦ６ＰへのＭ６Ｐへの転化は、ＰＧＰＭＩによって触媒されてもよい。
本発明の製造方法は低コストの出発物質を使用し、原料及び生成物の分離に関連するコストを削減することにより製造コストを低減する。デンプン、セルロース、スクロース、及びいくつかのそれらの誘導体は、例えばフルクトースよりも安価な原料である。マンノースがフルクトースから製造される場合、収率は本発明の場合よりも低く、マンノースをクロマトグラフィーによりフルクトースから分離する必要があり、これはより高い製造コストに繋がる。
また、本発明に係るＭ６Ｐをマンノースに転化させるステップは、原料の如何にかかわらず不可逆的なホスファターゼ反応である。したがって、マンノースは非常に高い収率で生成し、同時にそれに続く生成物の分離コストを効果的に最小限に抑える。
細胞による製造方法とは対照的に、本発明は、マンノースの無細胞での製造を含み、多くの場合に基質の細胞中への／生成物の細胞外への輸送を減速させる細胞膜を排除することに起因して、比較的に高い反応速度を有する。本発明においてはまた、最終製品が栄養分に富む発酵培地／細胞による代謝産物を含まない。
本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載のマンノースの製造方法によって製造されたマンノースである。
本明細書に記載の製造方法により製造されたマンノースは、上述のように、医薬品、化粧品、飲料、食品、乳製品、菓子、及び畜産業界における様々な用途に使用することができる。
更に、本明細書に開示される製造方法によって製造されたマンノースは、水素化によりマンニトールに転化させることができる。マンノースの接触水素化は化学量論的収率で起こり、マンニトールを与える。米国特許第５，４６６，７９５号。マンニトールは、無糖チューインガム、菓子、医薬品賦形剤の製造に広く使用されている。しかし、高純度のマンノースの製造を行うことは非常に困難であり、コストが高くなる。同上。したがって、上述の製造方法によって製造されたマンノースは、接触水素化によってマンニトールに転化させることができる。
ガラクトース
本発明の一実施形態は、
フルクトース６－リン酸４－エピメラーゼ（Ｆ６ＰＥ）で触媒することによってフルクトース６－リン酸（Ｆ６Ｐ）をタガトース６－リン酸（Ｔ６Ｐ）に転化させることと、
ガラクトース６－リン酸イソメラーゼ（Ｇａｌ６ＰＩ）で触媒することによってＴ６Ｐをガラクトース６－リン酸（Ｇａｌ６Ｐ）に転化させることと、
ガラクトース６－リン酸ホスファターゼ（Ｇａｌ６ＰＰ）で触媒することによって上記Ｇａｌ６Ｐをガラクトースに転化させることと
を含む、ガラクトースの製造方法である。
Ｆ６ＰＥの例としては、以下のタンパク質、すなわち、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｅ８Ｎ０Ｎ６、Ｅ４ＳＥＨ３、Ｉ０Ｉ５０７、Ｈ１ＸＲＧ１、及びＢ５ＹＢＤ７が挙げられるが、これらに限定はされない。Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｅ８Ｎ０Ｎ６及びＩ０Ｉ５０７は共にＦ６ＰＥ反応を触媒し、２７％のアミノ酸配列同一性を共有する。したがって、Ｆ６ＰＥの例には、上述のＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤのいずれかに対するアミノ酸配列同一性が、少なくとも２５％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも３５％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも４５％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、または少なくとも９４％、更に最も好ましくは少なくとも９６、９７、９８、９９、または１００％である任意の類似体も含まれる。
Ｇａｌ６ＰＩは、２のサブユニット、ＬａｃＡ及びＬａｃＢの多量体として存在する。Ｇａｌ６ＰＩの例としては、以下のタンパク質（ＬａｃＡ／ＬａｃＢ）サブユニット対、すなわち、配列番号１８／配列番号１９に示すアミノ酸配列を有するＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｐ２３４９４／Ｐ２３４９５が挙げられるが、これらに限定はされない。Ｇａｌ６ＰＩの例には、サブユニットＬａｃＡに関する上述のＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤのいずれかに対するアミノ酸配列同一性が、少なくとも２５％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも３５％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも４５％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、または少なくとも９４％、更に最も好ましくは少なくとも９６、９７、９８、９９、または１００％である任意の類似体、及びサブユニットＬａｃＢに関する上述のＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤのいずれかに対するアミノ酸配列同一性が、少なくとも２５％、少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも３５％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも４５％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、または少なくとも９４％、更に最も好ましくは少なくとも９６、９７、９８、９９、または１００％である任意の類似体も含まれる。
Ｔ６ＰをＧａｌ６Ｐに転化させる方法における使用に好適なＧａｌ６ＰＩは、ロスマン様αβαサンドウィッチフォールドを有するサブユニットからなるヘテロ二量体（「Ａ」及び「Ｂ」）を含有する。当技術分野において保存残基が議論されている（Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｄ－Ｇａｌａｃｔｏｓｅ－６－Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｉｓｏｍｅｒａｓｅ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ ｗｉｔｈ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ． ＰＬＯＳ ＯＮＥ． ２０１３；８；ｅ７２９０２）。本発明のいくつかの態様において、上記イソメラーゼヘテロ二量体は、
基質のリン酸基に結合するための、「Ａ」中のＡｒｇ１３０及びＡｒｇ１３４ならびに「Ｂ」中のＨｉｓ９及びＡｒｇ３９と、
更に、基質の開環のための、「Ａ」中のＨｉｓ９６と、
更に、高エネルギー中間体を安定化するための、「Ａ」中のＡｓｎ９７と、
更に、プロトン移動に関与するための、「Ｂ」のＣｙｓ６５及びＴｈｒ６７と
を含有するが、含有することに限定されない。
Ｇａｌ６ＰＰの例としては、配列番号２０に示すアミノ酸配列を有するＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ８Ａ２Ｆ３が挙げられるが、これに限定はされない。Ｇａｌ６ＰＰの例には、上述のＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤのいずれかに対するアミノ酸配列同一性が、少なくとも２５％、少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも３５％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも４５％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、または少なくとも９４％、更に最も好ましくは少なくとも９６、９７、９８、９９、または１００％である任意の類似体も含まれる。
Ｇａｌ６Ｐをガラクトースに転化させるＧａｌ６ＰＰは、
触媒作用のためのロスマン様フォールドドメインと、
Ｃ２キャッピングドメインと、
上記ロスマン様フォールドの第１のβストランド中のＤｘＤシグネチャーと、
上記ロスマン様フォールドの第２のβストランドの末端のＴｈｒまたはＳｅｒと、
上記ロスマン様フォールドの第４のβストランドの末端のＧＤｘｘｘＤシグネチャーと
を含有することが好ましい。
本発明のガラクトースの製造方法はまた、グルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）を酵素的にＦ６Ｐに転化させるステップも含み、このステップはホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）によって触媒される。他の実施形態において、本ガラクトースの製造方法は、グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）を上記Ｇ６Ｐに転化させるステップを更に含み、このステップはホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される。更に別の実施形態において、ガラクトースの製造方法は、少なくとも１種の酵素によって触媒される、糖を上記Ｇ１Ｐに転化させるステップも含む。
したがって、本発明のガラクトースの製造方法は、例えば、以下のステップ、すなわち、
（ｉ）１種または複数種の酵素を用いて糖をグルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）に転化させることと、
（ｉｉ）ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ、ＥＣ ５．４．２．２）を用いてＧ１ＰをＧ６Ｐに転化させることと、
（ｉｉｉ）ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ、ＥＣ ５．３．１．９）を用いてＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させることと、
（ｉｖ）Ｆ６ＰＥを介してＦ６ＰをＴ６Ｐに転化させることと、
（ｖ）Ｇａｌ６ＰＩ（ＥＣ ５．３．１．２６）を介してＴ６ＰをＧａｌ６Ｐに転化させることと、
（ｖｉ）Ｇａｌ６ＰＰを介してＧａｌ６Ｐをガラクトースに転化させることと
を含んでいてもよい。上記糖がデンプンである本製造方法の例を図３に示す。
一般的には、開示する製造方法において用いる酵素ユニットの比率は１：１：１：１：１：１（αＧＰ：ＰＧＭ：ＰＧＩ：Ｆ６ＰＥ：Ｇａｌ６ＰＩ：Ｇａｌ６ＰＰ）である。製品収率を最適化するために、これらの比率を任意の数の組み合わせで調整してもよい。例えば、３：１：１：１：１：１の比率を用いて、リン酸化中間体の濃度を最大化することができ、これにより、その下流の反応の活性が増加することとなる。逆に、１：１：１：１：１：３の比率を用いて、αＧＰに対するリン酸の供給を確実に維持することができ、これにより、α－１，４－グリコシド結合がより効率的に加リン酸分解で開裂することとなる。例えば３：１：１：１：１：３の酵素の比率を用いて反応速度を更に高めることができる。したがって、以下に説明する他の任意選択の酵素を含む酵素の比率を変化させて、ガラクトース生成の効率を高めることができる。例えば、ある特定の酵素が、他の酵素の量に対して約２倍、３倍、４倍、５倍等の量で存在していてもよい。
本製造方法の重要な利点の１つは、複数のプロセスステップを単一のバイオリアクターまたは反応槽中で実施することができることである。あるいは、上記複数のステップは、直列に配置された複数のバイオリアクターまたは反応槽中で実施することもできる。
特に全てのプロセスステップが単一のバイオリアクターまたは反応槽中で実施される場合、Ｇａｌ６Ｐの脱リン酸化によって生成するリン酸イオンを、次に、糖をＧ１Ｐに転化させる上記プロセスステップにリサイクルすることができる。上記開示する製造方法においてリン酸をリサイクルすることができることにより、非化学量論量のリン酸を用いることが可能になり、これにより反応液中のリン酸濃度が低く保たれる。このことにより、本製造方法の全体的な経路及び全体を通した速度が影響を受けるが、個々の酵素の活性が制限されることはなく、本ガラクトースの製造方法が全体的に効率的になることができる。
例えば、反応液中のリン酸濃度は、約０．１ｍＭ～約３００ｍＭ、約０．１ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１ｍＭ～約５０ｍＭ、好ましくは約５ｍＭ～約５０ｍＭ、またはより好ましくは約１０ｍＭ～約５０ｍＭの範囲であってよい。例えば、上記反応液中のリン酸濃度は、約０．１ｍＭ、約０．５ｍＭ、約１ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２ｍＭ、約２．５ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、または約５５ｍＭであってよい。
したがって、リン酸濃度が低いことで、総リン酸量が少なくなることにより製造コストが減少し、延いてはリン酸除去のコストが低下する。また、リン酸濃度が低いと高濃度の遊離リン酸によるＧａｌ６ＰＰの阻害も防止され、リン酸による汚染の可能性も低下する。
更に、本明細書に開示の製造方法は、リン酸の供給源としてＡＴＰを添加することなく、すなわちＡＴＰなしで実施することができる。本製造方法は、ＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）についても、これを添加しなければならないということなしに、すなわちＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）なしで実施することができる。他の利点としては、開示するガラクトースの製造方法の少なくとも１のステップが、エネルギー的に有利な化学反応を含むという事実も挙げられる。
ガラクトースをフルクトースから製造することもできる。例えば、この製造方法は、
ポリリン酸フルクトキナーゼ（ＰＰＦＫ）で触媒することによってフルクトース及びポリリン酸からＦ６Ｐを生成させることと、
Ｆ６ＰＥで触媒することによってＦ６ＰをＴ６Ｐに転化させることと、
Ｇａｌ６ＰＩで触媒することによってＴ６ＰをＧａｌ６Ｐに転化させることと、
Ｇａｌ６ＰＰで触媒することによってＧａｌ６Ｐをガラクトースに転化させることと
を含む。上記フルクトースは、例えば、スクロースの酵素的転化によって製造することができる。
ガラクトースはスクロースから製造することができる。この製造方法は、以下の酵素的ステップ、すなわち、
スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）で触媒することによってスクロース及び遊離リン酸からＧ１Ｐを生成させることと、
ＰＧＭで触媒することによってＧ１ＰをＧ６Ｐに転化させることと、
ＰＧＩで触媒することによってＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させることと、
Ｆ６ＰＥで触媒することによってＦ６ＰをＴ６Ｐに転化させることと、
Ｇａｌ６ＰＩで触媒することによってＴ６ＰをＧａｌ６Ｐに転化させることと、
Ｇａｌ６ＰＰで触媒することによってＧａｌ６Ｐをガラクトースに転化させることと
を含むイン・ビトロ合成経路を提供する。
Ｇａｌ６Ｐがガラクトースに転化される際に生成するリン酸イオンを、次に、スクロースをＧ１Ｐに転化させる上記ステップにリサイクルすることができる。更に、ＰＰＦＫ及びポリリン酸を用いて、ＳＰによるスクロースの加リン酸分解での開裂によって生成するフルクトースからＦ６Ｐを生成させることにより、ガラクトース収率を高めることができる。
いくつかの実施形態において、ガラクトースの製造方法は、以下のステップ、すなわち、
酵素的加水分解または酸加水分解によって多糖及びオリゴ糖からグルコースを生成させることと、
少なくとも１種の酵素で触媒することによってグルコースをＧ６Ｐに転化させることと、
酵素的加水分解または酸加水分解によって多糖及びオリゴ糖からフルクトースを生成させることと、
少なくとも１種の酵素で触媒することによってフルクトースをＦ６Ｐに転化させることと
を含む。上記多糖及びオリゴ糖の例は上記に列挙される。
他の実施形態において、Ｇ６Ｐは、ポリリン酸グルコキナーゼによりグルコース及びポリリン酸ナトリウムから製造される。
本開示は、デンプン、セルロース、スクロース、及びそれらの誘導製品中の多糖ならびにオリゴ糖などの糖のガラクトースへの転化方法を提供する。特定の実施形態において、無細胞酵素カクテルを使用して、デンプン、セルロース、スクロース、及びそれらの誘導製品をガラクトースに転化させるための、人工（非天然）のＡＴＰを含まない酵素的経路が提供される。
上記に示すように、数種の酵素を用いてデンプンを加水分解し、Ｇ１Ｐ収率を増加させることができる。かかる酵素としては、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、及びα－アミラーゼが挙げられる。コーンスターチはαＧＰの作用を妨げる多くの分枝を含む。イソアミラーゼを用いてデンプンを脱分枝し、直鎖状のアミロデキストリンを生成させることができる。イソアミラーゼで前処理したデンプンによって、最終生成物中のＦ６Ｐ濃度をより高くすることができる。イソアミラーゼ及びプルラナーゼはα－１，６－グリコシド結合を開裂させ、これにより、α－グルカンホスホリラーゼによってデンプンをより完全に分解することが可能になる。α－アミラーゼはα－１，４－グリコシド結合を開裂させることから、α－アミラーゼを用いてデンプンをフラグメントに分解させて、ガラクトースへの転化をより迅速にし、且つ溶解度を高める。
マルトースホスホリラーゼ（ＭＰ）を用いて、分解生成物であるマルトースをＧ１Ｐ及びグルコースへと加リン酸分解で開裂させることによって、ガラクトース収率を増加させることができる。あるいは、４－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）を用いて、分解生成物であるグルコース、マルトース、及びマルトトリオースを、αＧＰにより加リン酸分解で開裂させてＧ１Ｐを生成させることができるより長鎖のマルトオリゴ糖へとリサイクルすることによって、ガラクトース収率を増加させることができる。
特定の実施形態において、セルロース及びその誘導製品を、一連のステップを経てガラクトースに転化させることができる。この製造方法は、以下のステップ、すなわち、
セロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）及びセロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）でそれぞれ触媒することによって、セロデキストリン及びセロビオースならびに遊離リン酸からＧ１Ｐを生成させることと、
ＰＧＭで触媒することによってＧ１ＰをＧ６Ｐに転化させることと、
ＰＧＩで触媒することによってＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させることと、
Ｆ６ＰＥで触媒することによってＦ６ＰをＴ６Ｐに転化させることと、
Ｇａｌ６ＰＩで触媒することによってＴ６ＰをＧａｌ６Ｐに転化させることと、
Ｇａｌ６ＰＰで触媒することによってＧａｌ６Ｐをガラクトースに転化させることと
を含むイン・ビトロ合成経路を提供する。この製造方法においては、リン酸イオンはセロデキストリン及びセロビオースをＧ１Ｐに転化させる上記ステップによりリサイクルすることができる。
いくつかの実施形態において、ポリリン酸及びポリリン酸グルコキナーゼ（ＰＰＧＫ）を本製造方法に添加し、それにより分解生成物であるグルコースをＧ６Ｐにリン酸化することによって、ガラクトースの収率を増加させることができる。
他の実施形態において、ガラクトースはグルコースから生成させることができる。この製造方法は、
ポリリン酸グルコキナーゼ（ＰＰＧＫ）で触媒することによってグルコース及びポリリン酸からＧ６Ｐを生成させるステップと、
ＰＧＩで触媒することによってＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させるステップと、
Ｆ６ＰＥで触媒することによってＦ６ＰをＴ６Ｐに転化させるステップと、
Ｇａｌ６ＰＩで触媒することによってＴ６ＰをＧａｌ６Ｐに転化させるステップと、
Ｇａｌ６ＰＰで触媒することによってＧａｌ６Ｐをガラクトースに転化させるステップと
を含む。
本発明の製造方法は低コストの出発物質を使用し、原料及び生成物の分離に関連するコストを削減することにより製造コストを低減する。デンプン、セルロース、スクロース、及びいくつかのそれらの誘導体は、例えばラクトースよりも安価な原料である。ガラクトースがバイオマスまたはラクトースから製造される場合、収率は本発明の場合よりも低く、ガラクトースをクロマトグラフィーにより他の糖から分離する必要があり、これはより高い製造コストに繋がる。更に、本発明者らの製造方法には動物が含まれない。
本発明に係るＧａｌ６Ｐをガラクトースに転化させるステップは、原料の如何にかかわらず不可逆的なホスファターゼ反応である。したがって、ガラクトースは非常に高い収率で生成し、同時にそれに続く生成物の分離コストを効果的に最小限に抑える。
細胞による製造方法とは対照的に、本発明は、ガラクトースの無細胞での製造を含み、多くの場合に基質の細胞中への／生成物の細胞外への輸送を減速させる細胞膜を排除することに起因して、比較的に高い反応速度を有する。本発明においてはまた、最終製品が栄養分に富む発酵培地／細胞による代謝産物を含まない。
本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載のガラクトースの製造方法によって製造されたガラクトースである。
フルクトース
本発明の一実施形態は、フルクトース６－リン酸ホスファターゼ（Ｆ６ＰＰ）で触媒することによってフルクトース６－リン酸（Ｆ６Ｐ）をフルクトースに転化させることを含むフルクトースの製造方法である。
Ｆ６ＰＰの非限定的な例は、配列番号２１に示すアミノ酸配列を有するＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｂ８ＣＷＶ３である。Ｆ６ＰＰの例には、上述のＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤに対するアミノ酸配列同一性が、少なくとも２５％、少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも３５％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも４５％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、または少なくとも９４％、更に最も好ましくは少なくとも９６、９７、９８、９９、または１００％である任意の類似体も含まれる。
Ｆ６Ｐをフルクトースに転化させるＦ６ＰＰは、
触媒作用のためのロスマン様フォールドドメインと、
Ｃ１キャッピングドメインと、
上記ロスマン様フォールドの第１のβストランド中のＤｘＤシグネチャーと、
上記ロスマン様フォールドの第２のβストランドの末端のＴｈｒまたはＳｅｒと、
上記ロスマン様フォールドの第３のβストランドのαヘリックスＣ末端のＮ末端のＬｙｓと、
上記ロスマン様フォールドの第４のβストランドの末端のＥＤシグネチャーと
を含有することが好ましい。
本発明のフルクトースの製造方法はまた、グルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）を酵素的にＦ６Ｐに転化させるステップも含み、このステップはホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）によって触媒される。他の実施形態において、本フルクトースの製造方法は、グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）を上記Ｇ６Ｐに転化させるステップを更に含み、このステップはホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される。更に別の実施形態において、フルクトースの製造方法は、少なくとも１種の酵素によって触媒される、糖を上記Ｇ１Ｐに転化させるステップも含む。
したがって、本発明のフルクトースの製造方法は、例えば、以下のステップ、すなわち、
（ｉ）１種または複数種の酵素を用いて糖をグルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）に転化させることと、
（ｉｉ）ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ、ＥＣ ５．４．２．２）を用いてＧ１ＰをＧ６Ｐに転化させることと、
（ｉｉｉ）ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ、ＥＣ ５．３．１．９）を用いてＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させることと、
（ｉｖ）Ｆ６ＰＰを用いてＦ６Ｐをフルクトースに転化させることと
を含んでいてもよい。
一般的には、開示する製造方法において用いる酵素ユニットの比率は１：１：１：１（αＧＰ：ＰＧＭ：ＰＧＩ：Ｆ６ＰＰ）である。製品収率を最適化するために、これらの比率を任意の数の組み合わせで調整してもよい。例えば、３：１：１：１の比率を用いて、リン酸化中間体の濃度を最大化することができ、これにより、その下流の反応の活性が増加することとなる。逆に、１：１：１：３の比率を用いて、αＧＰに対するリン酸の供給を確実に維持することができ、これにより、α－１，４－グリコシド結合がより効率的に加リン酸分解で開裂することとなる。例えば３：１：１：３の酵素の比率を用いて反応速度を更に高めることができる。したがって、以下に説明する他の任意選択の酵素を含む酵素の比率を変化させて、フルクトース生成の効率を高めることができる。例えば、ある特定の酵素が、他の酵素の量に対して約２倍、３倍、４倍、５倍等の量で存在していてもよい。
本製造方法の重要な利点の１つは、複数のプロセスステップを単一のバイオリアクターまたは反応槽中で実施することができることである。あるいは、上記複数のステップは、直列に配置された複数のバイオリアクターまたは反応槽中で実施することもできる。
特に全てのプロセスステップが単一のバイオリアクターまたは反応槽中で実施される場合、Ｆ６Ｐの脱リン酸化によって生成するリン酸イオンを、次に、糖をＧ１Ｐに転化させる上記プロセスステップにリサイクルすることができる。上記開示する製造方法においてリン酸をリサイクルすることができることにより、非化学量論量のリン酸を用いることが可能になり、これにより反応液中のリン酸濃度が低く保たれる。このことにより、本製造方法の全体的な経路及び全体を通した速度が影響を受けるが、個々の酵素の活性が制限されることはなく、本フルクトースの製造方法が全体的に効率的になることができる。
例えば、反応液中のリン酸濃度は、約０．１ｍＭ～約３００ｍＭ、約０．１ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１ｍＭ～約５０ｍＭ、好ましくは約５ｍＭ～約５０ｍＭ、またはより好ましくは約１０ｍＭ～約５０ｍＭの範囲であってよい。例えば、上記反応液中のリン酸濃度は、約０．１ｍＭ、約０．５ｍＭ、約１ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２ｍＭ、約２．５ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、または約５５ｍＭであってよい。
したがって、リン酸濃度が低いことで、総リン酸量が少なくなることにより製造コストが減少し、延いてはリン酸除去のコストが低下する。また、リン酸濃度が低いと高濃度の遊離リン酸によるＦ６ＰＰの阻害も防止され、リン酸による汚染の可能性も低下する。
更に、本明細書に開示の製造方法は、リン酸の供給源としてＡＴＰを添加することなく、すなわちＡＴＰなしで実施することができる。本製造方法は、ＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）についても、これを添加しなければならないということなしに、すなわちＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）なしで実施することができる。他の利点としては、開示するフルクトースの製造方法の少なくとも１のステップが、エネルギー的に有利な化学反応を含むという事実も挙げられる。
フルクトースをスクロースから、Ｆ６Ｐ中間体を介して製造することもできる。この製造方法は、以下の酵素的ステップ、すなわち、
スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）で触媒することによってスクロース及び遊離リン酸からＧ１Ｐを生成させることと、
ＰＧＭで触媒することによってＧ１ＰをＧ６Ｐに転化させることと、
ＰＧＩで触媒することによってＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させることと、
Ｆ６ＰＰで触媒することによってＦ６Ｐをフルクトースに転化させることと
を含む、イン・ビトロ合成経路を提供する。例示的な酵素経路を図５に示す。
Ｆ６Ｐがフルクトースに転化される際に生成するリン酸イオンを、次に、スクロースをＧ１Ｐに転化させるステップにリサイクルすることができる。更に、ＰＰＦＫ及びポリリン酸を用いて、ＳＰによるスクロースの加リン酸分解での開裂によって生成するフルクトースからＦ６Ｐを生成させることにより、フルクトース収率を高めることができる。
いくつかの実施形態において、フルクトースの製造方法は、以下のステップ、すなわち、
酵素的加水分解または酸加水分解によって多糖及びオリゴ糖からグルコースを生成させることと、
少なくとも１種の酵素で触媒することによってグルコースをＧ６Ｐに転化させることと、
酵素的加水分解または酸加水分解によって多糖及びオリゴ糖からフルクトースを生成させることと、
少なくとも１種の酵素で触媒することによってフルクトースをＦ６Ｐに転化させることと
を含む。上記多糖及びオリゴ糖の例は上記に列挙される。
他の実施形態において、Ｇ６Ｐは、ポリリン酸グルコキナーゼによりグルコース及びポリリン酸ナトリウムから製造される。
本開示は、デンプン、セルロース、スクロース、及びそれらの誘導製品中の多糖ならびにオリゴ糖などの糖のフルクトースへの転化方法を提供する。特定の実施形態において、無細胞酵素カクテルを使用して、デンプン、セルロース、スクロース、及びそれらの誘導製品をフルクトースに転化させるための、人工（非天然）のＡＴＰを含まない酵素的経路が提供される。
上記に示すように、数種の酵素を用いてデンプンを加水分解し、Ｇ１Ｐ収率を増加させることができる。かかる酵素としては、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、及びα－アミラーゼが挙げられる。コーンスターチはαＧＰの作用を妨げる多くの分枝を含む。イソアミラーゼを用いてデンプンを脱分枝し、直鎖状のアミロデキストリンを生成させることができる。イソアミラーゼで前処理したデンプンによって、最終生成物中のＦ６Ｐ濃度をより高くすることができる。イソアミラーゼ及びプルラナーゼはα－１，６－グリコシド結合を開裂させ、これにより、α－グルカンホスホリラーゼによってデンプンをより完全に分解することが可能になる。α－アミラーゼはα－１，４－グリコシド結合を開裂させることから、α－アミラーゼを用いてデンプンをフラグメントに分解させて、フルクトースへの転化をより迅速にし、且つ溶解度を高める。
マルトースホスホリラーゼ（ＭＰ）を用いて、分解生成物であるマルトースをＧ１Ｐ及びグルコースへと加リン酸分解で開裂させることによって、フルクトース収率を増加させることができる。あるいは、４－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）を用いて、分解生成物であるグルコース、マルトース、及びマルトトリオースを、αＧＰにより加リン酸分解で開裂させてＧ１Ｐを生成させることができるより長鎖のマルトオリゴ糖へとリサイクルすることによって、フルクトース収率を増加させることができる。
特定の実施形態において、セルロース及びその誘導製品を、一連のステップを経てフルクトースに転化させることができる。この製造方法は、以下のステップ、すなわち、
セロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）及びセロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）でそれぞれ触媒することによって、セロデキストリン及びセロビオースならびに遊離リン酸からＧ１Ｐを生成させることと、
ＰＧＭで触媒することによってＧ１ＰをＧ６Ｐに転化させることと、
ＰＧＩで触媒することによってＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させることと、
Ｆ６ＰＰで触媒することによってＦ６Ｐをフルクトースに転化させることと
を含むイン・ビトロ合成経路を提供する。この製造方法においては、リン酸イオンはセロデキストリン及びセロビオースをＧ１Ｐに転化させる上記ステップによりリサイクルすることができる。
いくつかの実施形態において、ポリリン酸及びポリリン酸グルコキナーゼ（ＰＰＧＫ）を本製造方法に添加し、それにより分解生成物であるグルコースをＧ６Ｐにリン酸化することによって、フルクトースの収率を増加させることができる。
他の実施形態において、フルクトースはグルコースから生成させることができる。この製造方法は、
ポリリン酸グルコキナーゼ（ＰＰＧＫ）で触媒することによってグルコース及びポリリン酸からＧ６Ｐを生成させるステップと、
ＰＧＩで触媒することによってＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させるステップと、
Ｆ６ＰＰで触媒することによってＦ６Ｐをフルクトースに転化させるステップと
を含む。
本発明の製造方法は低コストの出発物質を使用し、原料及び生成物の分離に関連するコストを削減することにより製造コストを低減する。デンプン、セルロース、スクロース、及びいくつかのそれらの誘導体は、例えばラクトースよりも安価な原料である。フルクトースがバイオマスまたはラクトースから製造される場合、収率は本発明の場合よりも低く、フルクトースをクロマトグラフィーにより他の糖から分離する必要があり、これはより高い製造コストに繋がる。更に、本発明者らの製造方法には動物が含まれない。
本発明に係るＦ６Ｐをフルクトースに転化させるステップは、原料の如何にかかわらず不可逆的なホスファターゼ反応である。したがって、フルクトースは非常に高い収率で生成し、同時にそれに続く生成物の分離コストを効果的に最小限に抑える。
細胞による製造方法とは対照的に、本発明は、フルクトースの無細胞での製造を含み、多くの場合に基質の細胞中への／生成物の細胞外への輸送を減速させる細胞膜を排除することに起因して、比較的に高い反応速度を有する。本発明においてはまた、最終製品が栄養分に富む発酵培地／細胞による代謝産物を含まない。
本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載のフルクトースの製造方法によって製造されたフルクトースである。
アルトロース
本発明の一実施形態は、
プシコース６－リン酸３－エピメラーゼ（Ｐ６ＰＥ）で触媒することによってフルクトース６－リン酸（Ｆ６Ｐ）をプシコース６－リン酸（Ｐ６Ｐ）に転化させることと、
アルトロース６－リン酸イソメラーゼ（Ａｌｔ６ＰＩ）で触媒することによってＰ６Ｐをアルトロース６－リン酸（Ａｌｔ６Ｐ）に転化させることと、
アルトロース６－リン酸ホスファターゼで触媒することによって上記生成したＡｌｔ６Ｐをアルトロースに転化させることと
を含むアルトロースの製造方法である。
本発明のアルトロースの製造方法は、グルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）を上記Ｆ６Ｐに酵素的に転化させるステップも含み、このステップはホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）によって触媒される。他の実施形態において、本アルトロースの製造方法は、グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）を上記Ｇ６Ｐに転化させるステップを更に含み、このステップはホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される。更に別の実施形態において、アルトロースの製造方法は、少なくとも１種の酵素によって触媒される糖を上記Ｇ１Ｐに転化させるステップも含む。
したがって、本発明のアルトロースの製造方法は、例えば、以下のステップ、すなわち、
（ｉ）１種または複数種の酵素を用いて糖をグルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）に転化させることと、
（ｉｉ）ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ、ＥＣ ５．４．２．２）を用いてＧ１ＰをＧ６Ｐに転化させることと、
（ｉｉｉ）ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ、ＥＣ ５．３．１．９）を用いてＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させることと、
（ｉｖ）Ｐ６ＰＥを介してＦ６ＰをＰ６Ｐに転化させることと、
（ｖ）Ａｌｔ６ＰＩを介してＰ６ＰをＡｌｔ６Ｐに転化させることと、
（ｖｉ）Ａｌｔ６ＰＰを介してＡｌｔ６Ｐをアルトロースに転化させることと
を含んでいてもよい。上記糖がデンプンである場合の本酵素的製造方法の例を図１に示す。
一般的には、開示する製造方法において用いる酵素ユニットの比率は１：１：１：１：１：１（αＧＰ：ＰＧＭ：ＰＧＩ：Ｐ６ＰＥ：Ａｌｔ６ＰＩ：Ａｌｔ６ＰＰ）である。製品収率を最適化するために、これらの比率を任意の数の組み合わせで調整してもよい。例えば、３：１：１：１：１：１の比率を用いて、リン酸化中間体の濃度を最大化することができ、これにより、その下流の反応の活性が増加することとなる。逆に、１：１：１：１：１：３の比率を用いて、αＧＰに対するリン酸の供給を確実に維持することができ、これにより、α－１，４－グリコシド結合がより効率的に加リン酸分解で開裂することとなる。例えば３：１：１：１：１：３の酵素の比率を用いて反応速度を更に高めることができる。したがって、以下に説明する他の任意選択の酵素を含む酵素の比率を変化させて、アルトース生成の効率を高めることができる。例えば、ある特定の酵素が、他の酵素の量に対して約２倍、３倍、４倍、５倍等の量で存在していてもよい。
特に全てのプロセスステップが単一のバイオリアクターまたは反応槽中で実施される場合、Ａｌｔ６Ｐの脱リン酸化によって生成するリン酸イオンを、次に、糖をＧ１Ｐに転化させるプロセスステップにリサイクルすることができる。上記開示する製造方法においてリン酸をリサイクルすることができることにより、非化学量論量のリン酸を用いることが可能になり、これにより反応液中のリン酸濃度が低く保たれる。このことにより、本製造方法の全体的な経路及び全体を通した速度が影響を受けるが、個々の酵素の活性が制限されることはなく、本アルトースの製造方法が全体的に効率的になることができる。
例えば、反応液中のリン酸濃度は、約０．１ｍＭ～約３００ｍＭ、約０．１ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１ｍＭ～約５０ｍＭ、好ましくは約５ｍＭ～約５０ｍＭ、またはより好ましくは約１０ｍＭ～約５０ｍＭの範囲であってよい。例えば、上記反応液中のリン酸濃度は、約０．１ｍＭ、約０．５ｍＭ、約１ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２ｍＭ、約２．５ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、または約５５ｍＭであってよい。
したがって、リン酸濃度が低いことで、総リン酸量が少なくなることにより製造コストが減少し、延いてはリン酸除去のコストが低下する。また、リン酸濃度が低いと高濃度の遊離リン酸によるＡｌｔ６ＰＰの阻害も防止され、リン酸による汚染の可能性も低下する。
更に、本明細書に開示の製造方法は、リン酸の供給源としてＡＴＰを添加することなく、すなわちＡＴＰなしで実施することができる。本製造方法は、ＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）についても、これを添加しなければならないということなしに、すなわちＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）なしで実施することができる。他の利点としては、開示するアルトロースの製造方法の少なくとも１のステップが、エネルギー的に有利な反応を含むという事実も挙げられる。
アルトロースをフルクトースから製造することもできる。例えば、この製造方法は、
ポリリン酸フルクトキナーゼ（ＰＰＦＫ）で触媒することによってフルクトース及びポリリン酸からＦ６Ｐを生成させることと、
Ｐ６ＰＥで触媒することによってＦ６ＰをＰ６Ｐに転化させることと、
Ａｌｔ６ＰＩで触媒することによってＰ６ＰをＡｌｔ６Ｐに転化させることと、
Ａｌｔ６ＰＰで触媒することによってＡｌｔ６Ｐをアルトロースに転化させることと
を含む。上記フルクトースは、例えば、スクロースの酵素的転化によって製造することができる。
アルトロースはスクロースから製造することもできる。この製造方法は、以下の酵素的ステップ、すなわち、
スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）で触媒することによってスクロース及び遊離リン酸からＧ１Ｐを生成させることと、
ＰＧＭで触媒することによってＧ１ＰをＧ６Ｐに転化させることと、
ＰＧＩで触媒することによってＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させることと、
Ｆ６ＰＥで触媒することによってＦ６ＰをＰ６Ｐに転化させることと、
Ａｌｔ６ＰＩで触媒することによってＰ６ＰをＡｌｔ６Ｐに転化させることと、
Ａｌｔ６ＰＰで触媒することによってＡｌｔ６Ｐをアルトロースに転化させることと
を含むイン・ビトロ合成経路を提供する。
Ａｌｔ６Ｐがアルトロースに転化される際に生成するリン酸イオンを、次に、スクロースをＧ１Ｐに転化させるステップにリサイクルすることができる。更に、ＰＰＦＫ及びポリリン酸を用いて、ＳＰによるスクロースの加リン酸分解での開裂によって生成するフルクトースからＦ６Ｐを生成させることにより、アルトロース収率を高めることができる。
特定の実施形態において、アルトロースの製造方法は、以下のステップ、すなわち、
酵素的加水分解または酸加水分解により多糖及びオリゴ糖からグルコースを生成させることと、
少なくとも１種の酵素で触媒することによってグルコースをＧ６Ｐに転化させることと、
酵素的加水分解または酸加水分解により多糖及びオリゴ糖からフルクトースを生成させることと、
少なくとも１種の酵素で触媒することによってフルクトースをＦ６Ｐに転化させることと
を含む。上記多糖及びオリゴ糖の例は上記に列挙される。
他の実施形態において、Ｇ６Ｐは、ポリリン酸グルコキナーゼによりグルコース及びポリリン酸ナトリウムから製造される。
数種の酵素を用いてデンプンを加水分解し、Ｇ１Ｐ収率を増加させることができる。かかる酵素としては、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、及びα－アミラーゼが挙げられる。コーンスターチはαＧＰの作用を妨げる多くの分枝を含む。イソアミラーゼを用いてデンプンを脱分枝し、直鎖状のアミロデキストリンを生成させることができる。イソアミラーゼで前処理したデンプンによって、最終生成物中のＦ６Ｐ濃度をより高くすることができる。イソアミラーゼ及びプルラナーゼはα－１，６－グリコシド結合を開裂させ、これにより、α－グルカンホスホリラーゼによってデンプンをより完全に分解することが可能になる。α－アミラーゼはα－１，４－グリコシド結合を開裂させることから、α－アミラーゼを用いてデンプンをフラグメントに分解させて、アルトロースへの転化をより迅速にし、且つ溶解度を高める。
マルトースホスホリラーゼ（ＭＰ）を用いて、分解生成物であるマルトースをＧ１Ｐ及びグルコースへと加リン酸分解で開裂させることによって、アルトロース収率を増加させることができる。あるいは、４－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）を用いて、分解生成物であるグルコース、マルトース、及びマルトトリオースを、αＧＰにより加リン酸分解で開裂させてＧ１Ｐを生成させることができるより長鎖のマルトオリゴ糖へとリサイクルすることによって、アルトロース収率を増加させることができる。
特定の実施形態において、セルロース及びその誘導製品を、一連のステップを経てアルトロースに転化させることができる。この製造方法は、以下のステップ、すなわち、
セロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）及びセロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）でそれぞれ触媒することによって、セロデキストリン及びセロビオースならびに遊離リン酸からＧ１Ｐを生成させることと、
ＰＧＭで触媒することによってＧ１ＰをＧ６Ｐに転化させることと、
ＰＧＩで触媒することによってＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させることと、
Ｐ６ＰＥで触媒することによってＦ６ＰをＰ６Ｐに転化させることと、
Ａｌｔ６ＰＩで触媒することによってＰ６ＰをＡｌｔ６Ｐに転化させることと、
Ａｌｔ６ＰＰで触媒することによってＡｌｔ６Ｐをアルトロースに転化させることと
を含むイン・ビトロ合成経路を提供する。この製造方法においては、リン酸イオンはセロデキストリン及びセロビオースをＧ１Ｐに転化させる上記ステップによりリサイクルすることができる。
数種の酵素を用いて、固体セルロースを水溶性セロデキストリン及びセロビオースに加水分解してもよい。かかる酵素としては、エンドグルカナーゼ及びセロビオヒドロラーゼが挙げられるが、β－グルコシダーゼ（セロビアーゼ）は含まれない。
いくつかの実施形態において、ポリリン酸及びポリリン酸グルコキナーゼ（ＰＰＧＫ）を本製造方法に添加し、それにより分解生成物であるグルコースをＧ６Ｐにリン酸化することによって、アルトロースの収率を増加させることができる。
アルトロースをグルコースから製造してもよい。この製造方法は、
ポリリン酸グルコキナーゼ（ＰＰＧＫ）で触媒することによってグルコース及びポリリン酸からＧ６Ｐを生成させるステップと、
ＰＧＩで触媒することによってＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させるステップと、
Ｐ６ＰＥで触媒することによってＦ６ＰをＰ６Ｐに転化させるステップと、
Ａ６ＰＩで触媒することによってＰ６ＰをＡｌｔ６Ｐに転化させるステップと、
Ａｌｔ６ＰＰで触媒することによってＡｌｔ６Ｐをアルトロースに転化させるステップと
を含む。
本発明のアルトロースの製造方法は低コストの出発物質を使用し、原料及び生成物の分離に関連するコストを削減することにより製造コストを低減する。デンプン、セルロース、スクロース、及びいくつかのそれらの誘導体は、例えばフルクトースよりも安価な原料である。アルトロースがプシコースから製造される場合、収率は本発明の場合よりも低く、アルトロースをクロマトグラフィーによりプシコースから分離する必要があり、これはより高い製造コストに繋がる。
また、本発明に係るＡｌｔ６Ｐをアルトロースに転化させるステップは、原料の如何にかかわらず不可逆的なホスファターゼ反応である。したがって、アルトロースは非常に高い収率で生成し、同時にそれに続く生成物の分離コストを効果的に最小限に抑える。
細胞による製造方法とは対照的に、本発明は、アルトロースの無細胞での製造を含み、多くの場合に基質の細胞中への／生成物の細胞外への輸送を減速させる細胞膜を排除することに起因して、比較的に高い反応速度を有する。本発明においてはまた、最終製品が栄養分に富む発酵培地／細胞による代謝産物を含まない。
本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載のアルトロースの製造方法によって製造されたアルトロースである。
タロース
本発明の一実施形態は、
フルクトース６－リン酸４－エピメラーゼ（Ｆ６ＰＥ）で触媒することによってフルクトース６－リン酸（Ｆ６Ｐ）をタガトース６－リン酸（Ｔ６Ｐ）に転化させることと、
タロース６－リン酸イソメラーゼ（Ｔａｌ６ＰＩ）で触媒することによってＴ６Ｐをタロース６－リン酸（Ｔａｌ６Ｐ）に転化させることと、
タロース６－リン酸ホスファターゼ（Ｔａｌ６ＰＰ）で触媒することによって上記生成したＴａｌ６Ｐをタロースに転化させることと
を含むタロースの製造方法である。
Ｆ６ＰＥの例としては、以下のタンパク質、すなわち、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｅ８Ｎ０Ｎ６、Ｅ４ＳＥＨ３、Ｉ０Ｉ５０７、Ｈ１ＸＲＧ１、及びＢ５ＹＢＤ７が挙げられるが、これらに限定はされない。Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｅ８Ｎ０Ｎ６及びＩ０Ｉ５０７は共にＦ６ＰＥ反応を触媒し、２７％のアミノ酸配列同一性を共有する。したがって、Ｆ６ＰＥの例には、上述のＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤのいずれかに対するアミノ酸配列同一性が、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％である任意の類似体も含まれる。
本発明のタロースの製造方法は、グルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）を上記Ｆ６Ｐに酵素的に転化させるステップも含み、このステップはホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）によって触媒される。他の実施形態において、本タロースの製造方法は、グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）を上記Ｇ６Ｐに転化させるステップを更に含み、このステップはホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される。更に別の実施形態において、タロースの製造方法は、少なくとも１種の酵素によって触媒される糖を上記Ｇ１Ｐに転化させるステップも含む。
したがって、本発明のタロースの製造方法は、例えば、以下のステップ、すなわち、
（ｉ）１種または複数種の酵素を用いて糖をグルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）に転化させることと、
（ｉｉ）ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ、ＥＣ ５．４．２．２）を用いてＧ１ＰをＧ６Ｐに転化させることと、
（ｉｉｉ）ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ、ＥＣ ５．３．１．９）を用いてＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させることと、
（ｉｖ）Ｐ６ＰＥを介してＦ６ＰをＴ６Ｐに転化させることと、
（ｖ）Ｔａｌ６ＰＩ（ＥＣ ５．３．１．２６）を介してＴ６ＰをＴａｌ６Ｐに転化させることと、
（ｖｉ）Ｔａｌ６ＰＰを介してＴａｌ６Ｐをタロースに転化させることと
を含んでいてもよい。上記糖がデンプンである場合の本製造方法の例を図３に示す。
一般的には、開示する製造方法において用いる酵素ユニットの比率は１：１：１：１：１：１（αＧＰ：ＰＧＭ：ＰＧＩ：Ｆ６ＰＥ：Ｔａｌ６ＰＩ：Ｔａｌ６ＰＰ）である。製品収率を最適化するために、これらの比率を任意の数の組み合わせで調整してもよい。例えば、３：１：１：１：１：１の比率を用いて、リン酸化中間体の濃度を最大化することができ、これにより、その下流の反応の活性が増加することとなる。逆に、１：１：１：１：１：３の比率を用いて、αＧＰに対するリン酸の供給を確実に維持することができ、これにより、α－１，４－グリコシド結合がより効率的に加リン酸分解で開裂することとなる。例えば３：１：１：１：１：３の酵素の比率を用いて反応速度を更に高めることができる。したがって、以下に説明する他の任意選択の酵素を含む酵素の比率を変化させて、タロース生成の効率を高めることができる。例えば、ある特定の酵素が、他の酵素の量に対して約２倍、３倍、４倍、５倍等の量で存在していてもよい。
本製造方法の重要な利点の１つは、複数のプロセスステップを単一のバイオリアクターまたは反応槽中で実施することができることである。あるいは、上記複数のステップは、直列に配置された複数のバイオリアクターまたは反応槽中で実施することもできる。
特に全てのプロセスステップが単一のバイオリアクターまたは反応槽中で実施される場合、Ｔａｌ６Ｐの脱リン酸化によって生成するリン酸イオンを、次に、糖をＧ１Ｐに転化させるプロセスステップにリサイクルすることができる。上記開示する製造方法においてリン酸をリサイクルすることができることにより、非化学量論量のリン酸を用いることが可能になり、これにより反応液中のリン酸濃度が低く保たれる。このことにより、本製造方法の全体的な経路及び全体を通した速度が影響を受けるが、個々の酵素の活性が制限されることはなく、本タロースの製造方法が全体的に効率的になることができる。
例えば、反応液中のリン酸濃度は、約０．１ｍＭ～約３００ｍＭ、約０．１ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１ｍＭ～約５０ｍＭ、好ましくは約５ｍＭ～約５０ｍＭ、またはより好ましくは約１０ｍＭ～約５０ｍＭの範囲であってよい。例えば、上記反応液中のリン酸濃度は、約０．１ｍＭ、約０．５ｍＭ、約１ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２ｍＭ、約２．５ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、または約５５ｍＭであってよい。
したがって、リン酸濃度が低いことで、総リン酸量が少なくなることにより製造コストが減少し、延いてはリン酸除去のコストが低下する。また、リン酸濃度が低いと高濃度の遊離リン酸によるＴａｌ６ＰＰの阻害も防止され、リン酸による汚染の可能性も低下する。
更に、本明細書に開示の製造方法は、リン酸の供給源としてＡＴＰを添加することなく、すなわちＡＴＰなしで実施することができる。本製造方法は、ＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）についても、これを添加しなければならないということなしに、すなわちＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）なしで実施することができる。他の利点としては、開示するタロースの製造方法の少なくとも１のステップが、エネルギー的に有利な反応を含むという事実も挙げられる。
タロースをフルクトースから製造することもできる。例えば、この製造方法は、
ポリリン酸フルクトキナーゼ（ＰＰＦＫ）で触媒することによってフルクトース及びポリリン酸からＦ６Ｐを生成させることと、
Ｐ６ＰＥで触媒することによってＦ６ＰをＰ６Ｐに転化させることと、
Ｔａｌ６ＰＩで触媒することによってＰ６ＰをＴａｌ６Ｐに転化させることと、
Ｔａｌ６ＰＰで触媒することによってＴａｌ６Ｐをタロースに転化させることと
を含む。上記フルクトースは、例えば、スクロースの酵素的転化によって製造することができる。
タロースはスクロースから製造することができる。この製造方法は、以下の酵素的ステップ、すなわち、
スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）で触媒することによってスクロース及び遊離リン酸からＧ１Ｐを生成させることと、
ＰＧＭで触媒することによってＧ１ＰをＧ６Ｐに転化させることと、
ＰＧＩで触媒することによってＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させることと、
Ｆ６ＰＥで触媒することによってＦ６ＰをＴ６Ｐに転化させることと、
Ｔａｌ６ＰＩで触媒することによってＴ６ＰをＴａｌ６Ｐに転化させることと、
Ｔａｌ６ＰＰで触媒することによってＴａｌ６Ｐをタロースに転化させることと
を含むイン・ビトロ合成経路を提供する。
Ｔａｌ６Ｐがタロースに転化される際に生成するリン酸イオンを、次に、スクロースをＧ１Ｐに転化させるステップにリサイクルすることができる。更に、ＰＰＦＫ及びポリリン酸を用いて、ＳＰによるスクロースの加リン酸分解での開裂によって生成するフルクトースからＦ６Ｐを生成させることにより、タロース収率を高めることができる。
いくつかの実施形態において、タロースの製造方法は、以下のステップ、すなわち、
酵素的加水分解または酸加水分解により多糖及びオリゴ糖からグルコースを生成させることと、
少なくとも１種の酵素で触媒することによってグルコースをＧ６Ｐに転化させることと、
酵素的加水分解または酸加水分解により多糖及びオリゴ糖からフルクトースを生成させることと、
少なくとも１種の酵素で触媒することによってフルクトースをＦ６Ｐに転化させることと
を含む。上記多糖及びオリゴ糖の例は上記に列挙される。
他の実施形態において、Ｇ６Ｐは、ポリリン酸グルコキナーゼによりグルコース及びポリリン酸ナトリウムから製造される。
本開示は、デンプン、セルロース、スクロース、及びそれらの誘導製品中の多糖ならびにオリゴ糖などの糖のタロースへの転化方法を提供する。特定の実施形態において、無細胞酵素カクテルを使用して、デンプン、セルロース、スクロース、及びそれらの誘導製品をタロースに転化させるための、人工（非天然）のＡＴＰを含まない酵素的経路が提供される。
上記に示すように、数種の酵素を用いてデンプンを加水分解し、Ｇ１Ｐ収率を増加させることができる。かかる酵素としては、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、及びα－アミラーゼが挙げられる。コーンスターチはαＧＰの作用を妨げる多くの分枝を含む。イソアミラーゼを用いてデンプンを脱分枝し、直鎖状のアミロデキストリンを生成させることができる。イソアミラーゼで前処理したデンプンによって、最終生成物中のＦ６Ｐ濃度をより高くすることができる。イソアミラーゼ及びプルラナーゼはα－１，６－グリコシド結合を開裂させ、これにより、α－グルカンホスホリラーゼによってデンプンをより完全に分解することが可能になる。α－アミラーゼはα－１，４－グリコシド結合を開裂させることから、α－アミラーゼを用いてデンプンをフラグメントに分解させて、タロースへの転化をより迅速にし、且つ溶解度を高める。
マルトースホスホリラーゼ（ＭＰ）を用いて、分解生成物であるマルトースをＧ１Ｐ及びグルコースへと加リン酸分解で開裂させることによって、タロース収率を増加させることができる。あるいは、４－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）を用いて、分解生成物であるグルコース、マルトース、及びマルトトリオースを、αＧＰにより加リン酸分解で開裂させてＧ１Ｐを生成させることができるより長鎖のマルトオリゴ糖へとリサイクルすることによって、タロース収率を増加させることができる。
特定の実施形態において、セルロース及びその誘導製品を、一連のステップを経てタロースに転化させることができる。この製造方法は、以下のステップ、すなわち、
セロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）及びセロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）でそれぞれ触媒することによって、セロデキストリン及びセロビオースならびに遊離リン酸からＧ１Ｐを生成させることと、
ＰＧＭで触媒することによってＧ１ＰをＧ６Ｐに転化させることと、
ＰＧＩで触媒することによってＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させることと、
Ｐ６ＰＥで触媒することによってＦ６ＰをＴ６Ｐに転化させることと、
Ｔａｌ６ＰＩで触媒することによってＴ６ＰをＴａｌ６Ｐに転化させることと、
Ｔａｌ６ＰＰで触媒することによってＴａｌ６Ｐをタロースに転化させることと
を含むイン・ビトロ合成経路を提供する。この製造方法においては、リン酸イオンはセロデキストリン及びセロビオースをＧ１Ｐに転化させる上記ステップによりリサイクルすることができる。
いくつかの実施形態において、ポリリン酸及びポリリン酸グルコキナーゼ（ＰＰＧＫ）を本製造方法に添加し、それにより分解生成物であるグルコースをＧ６Ｐにリン酸化することによって、タロースの収率を増加させることができる。
他の実施形態において、タロースをグルコースから生成させることができる。この製造方法は、
ポリリン酸グルコキナーゼ（ＰＰＧＫ）で触媒することによってグルコース及びポリリン酸からＧ６Ｐを生成させるステップと、
ＰＧＩで触媒することによってＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させるステップと、
Ｐ６ＰＥで触媒することによってＦ６ＰをＴ６Ｐに転化させるステップと、
Ｔａｌ６ＰＩで触媒することによってＴ６ＰをＴａｌ６Ｐに転化させるステップと、
Ｔａｌ６ＰＰで触媒することによってＴａｌ６Ｐをタロースに転化させるステップと
を含む。
本発明の製造方法は低コストの出発物質を使用し、原料及び生成物の分離に関連するコストを削減することにより製造コストを低減する。デンプン、セルロース、スクロース、及びいくつかのそれらの誘導体は、例えばラクトースよりも安価な原料である。タロースがバイオマスまたはラクトースから製造される場合、収率は本発明の場合よりも低く、タロースをクロマトグラフィーにより他の糖から分離する必要があり、これはより高い製造コストに繋がる。更に、本発明者らの製造方法には動物が含まれない。
本発明に係るＴａｌ６Ｐをタロースに転化させるステップは、原料の如何にかかわらず不可逆的なホスファターゼ反応である。したがって、タロースは非常に高い収率で生成し、同時にそれに続く生成物の分離コストを効果的に最小限に抑える。
細胞による製造方法とは対照的に、本発明は、タロースの無細胞での製造を含み、多くの場合に基質の細胞中への／生成物の細胞外への輸送を減速させる細胞膜を排除することに起因して、比較的に高い反応速度を有する。本発明においてはまた、最終製品が栄養分に富む発酵培地／細胞による代謝産物を含まない。
本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載のタロースの製造方法によって製造されたタロースである。
ソルボース
本発明の一実施形態は、
フルクトース６－リン酸４－エピメラーゼ（Ｆ６ＰＥ）で触媒することによってフルクトース６－リン酸（Ｆ６Ｐ）をタガトース６－リン酸（Ｔ６Ｐ）に転化させることと、
ソルボース６－リン酸エピメラーゼ（Ｓ６ＰＥ）で触媒することによってＴ６Ｐをソルボース６－リン酸（Ｓ６Ｐ）に転化させることと、
ソルボース６－リン酸ホスファターゼ（Ｓ６ＰＰ）で触媒することによって上記生成したＳ６Ｐをソルボースに転化させることと
を含むソルボースの製造方法である。
Ｆ６ＰＥの例としては、以下のタンパク質、すなわち、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｅ８Ｎ０Ｎ６、Ｅ４ＳＥＨ３、Ｉ０Ｉ５０７、Ｈ１ＸＲＧ１、及びＢ５ＹＢＤ７が挙げられるが、これらに限定はされない。Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｅ８Ｎ０Ｎ６及びＩ０Ｉ５０７は共にＦ６ＰＥ反応を触媒し、２７％のアミノ酸配列同一性を共有する。したがって、Ｆ６ＰＥの例には、上述のＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤのいずれかに対するアミノ酸配列同一性が、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％である任意の類似体も含まれる。
本発明のソルボースの製造方法は、グルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）を上記Ｆ６Ｐに酵素的に転化させるステップも含み、このステップはホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）によって触媒される。他の実施形態において、本ソルボースの製造方法は、グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）を上記Ｇ６Ｐに転化させるステップを更に含み、このステップはホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される。更に別の実施形態において、ソルボースの製造方法は、少なくとも１種の酵素によって触媒される糖を上記Ｇ１Ｐに転化させるステップも含む。
したがって、本発明のソルボースの製造方法は、例えば、以下のステップ、すなわち、
（ｉ）１種または複数種の酵素を用いて糖をグルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）に転化させることと、
（ｉｉ）ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ、ＥＣ ５．４．２．２）を用いてＧ１ＰをＧ６Ｐに転化させることと、
（ｉｉｉ）ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ、ＥＣ ５．３．１．９）を用いてＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させることと、
（ｉｖ）Ｐ６ＰＥを介してＦ６ＰをＴ６Ｐに転化させることと、
（ｖ）Ｓ６ＰＥ（ＥＣ ５．３．１．２６）を介してＴ６ＰをＳ６Ｐに転化させることと、
（ｖｉ）Ｓ６ＰＰを介してＳ６Ｐをソルボースに転化させることと
を含んでいてもよい。上記糖がデンプンである場合の本製造方法の例を図３に示す。
一般的には、開示する製造方法において用いる酵素ユニットの比率は１：１：１：１：１：１（αＧＰ：ＰＧＭ：ＰＧＩ：Ｆ６ＰＥ：Ｓ６ＰＥ：Ｓ６ＰＰ）である。製品収率を最適化するために、これらの比率を任意の数の組み合わせで調整してもよい。例えば、３：１：１：１：１：１の比率を用いて、リン酸化中間体の濃度を最大化することができ、これにより、その下流の反応の活性が増加することとなる。逆に、１：１：１：１：１：３の比率を用いて、αＧＰに対するリン酸の供給を確実に維持することができ、これにより、α－１，４－グリコシド結合がより効率的に加リン酸分解で開裂することとなる。例えば３：１：１：１：１：３の酵素の比率を用いて反応速度を更に高めることができる。したがって、以下に説明する他の任意選択の酵素を含む酵素の比率を変化させて、ソルボース生成の効率を高めることができる。例えば、ある特定の酵素が、他の酵素の量に対して約２倍、３倍、４倍、５倍等の量で存在していてもよい。
本製造方法の重要な利点の１つは、複数のプロセスステップを単一のバイオリアクターまたは反応槽中で実施することができることである。あるいは、上記複数のステップは、直列に配置された複数のバイオリアクターまたは反応槽中で実施することもできる。
特に全てのプロセスステップが単一のバイオリアクターまたは反応槽中で実施される場合、Ｓ６Ｐの脱リン酸化によって生成するリン酸イオンを、次に、糖をＧ１Ｐに転化させるプロセスステップにリサイクルすることができる。上記開示する製造方法においてリン酸をリサイクルすることができることにより、非化学量論量のリン酸を用いることが可能になり、これにより反応液中のリン酸濃度が低く保たれる。このことにより、本製造方法の全体的な経路及び全体を通した速度が影響を受けるが、個々の酵素の活性が制限されることはなく、本ソルボースの製造方法が全体的に効率的になることができる。
例えば、反応液中のリン酸濃度は、約０．１ｍＭ～約３００ｍＭ、約０．１ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１ｍＭ～約５０ｍＭ、好ましくは約５ｍＭ～約５０ｍＭ、またはより好ましくは約１０ｍＭ～約５０ｍＭの範囲であってよい。例えば、上記反応液中のリン酸濃度は、約０．１ｍＭ、約０．５ｍＭ、約１ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２ｍＭ、約２．５ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、または約５５ｍＭであってよい。
したがって、リン酸濃度が低いことで、総リン酸量が少なくなることにより製造コストが減少し、延いてはリン酸除去のコストが低下する。また、リン酸濃度が低いと高濃度の遊離リン酸によるＳ６ＰＰの阻害も防止され、リン酸による汚染の可能性も低下する。
更に、本明細書に開示の製造方法は、リン酸の供給源としてＡＴＰを添加することなく、すなわちＡＴＰなしで実施することができる。本製造方法は、ＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）についても、これを添加しなければならないということなしに、すなわちＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）なしで実施することができる。他の利点としては、開示するソルボースの製造方法の少なくとも１のステップが、エネルギー的に有利な反応を含むという事実も挙げられる。
ソルボースをフルクトースから製造することもできる。例えば、この製造方法は、
ポリリン酸フルクトキナーゼ（ＰＰＦＫ）で触媒することによってフルクトース及びポリリン酸からＦ６Ｐを生成させることと、
Ｆ６ＰＥで触媒することによってＦ６ＰをＴ６Ｐに転化させることと、
Ｓ６ＰＥで触媒することによってＴ６ＰをＳ６Ｐに転化させることと、
Ｓ６ＰＰで触媒することによってＳ６Ｐをソルボースに転化させることと
を含む。上記フルクトースは、例えば、スクロースの酵素的転化によって製造することができる。
ソルボースはスクロースから製造することができる。この製造方法は、以下の酵素的ステップ、すなわち、
スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）で触媒することによってスクロース及び遊離リン酸からＧ１Ｐを生成させることと、
ＰＧＭで触媒することによってＧ１ＰをＧ６Ｐに転化させることと、
ＰＧＩで触媒することによってＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させることと、
Ｆ６ＰＥで触媒することによってＦ６ＰをＴ６Ｐに転化させることと、
Ｓ６ＰＥで触媒することによってＴ６ＰをＳ６Ｐに転化させることと、
Ｓ６ＰＰで触媒することによってＳ６Ｐをソルボースに転化させることと
を含むイン・ビトロ合成経路を提供する。
Ｓ６Ｐがソルボースに転化される際に生成するリン酸イオンを、次に、スクロースをＧ１Ｐに転化させるステップにリサイクルすることができる。更に、ＰＰＦＫ及びポリリン酸を用いて、ＳＰによるスクロースの加リン酸分解での開裂によって生成するフルクトースからＦ６Ｐを生成させることにより、ソルボース収率を高めることができる。
いくつかの実施形態において、ソルボースの製造方法は、以下のステップ、すなわち、
酵素的加水分解または酸加水分解により多糖及びオリゴ糖からグルコースを生成させることと、
少なくとも１種の酵素で触媒することによってグルコースをＧ６Ｐに転化させることと、
酵素的加水分解または酸加水分解により多糖及びオリゴ糖からフルクトースを生成させることと、
少なくとも１種の酵素で触媒することによってフルクトースをＦ６Ｐに転化させることと
を含む。上記多糖及びオリゴ糖の例は上記に列挙される。
他の実施形態において、Ｇ６Ｐは、ポリリン酸グルコキナーゼによりグルコース及びポリリン酸ナトリウムから製造される。
本開示は、デンプン、セルロース、スクロース、及びそれらの誘導製品中の多糖ならびにオリゴ糖などの糖のソルボースへの転化方法を提供する。特定の実施形態において、無細胞酵素カクテルを使用して、デンプン、セルロース、スクロース、及びそれらの誘導製品をソルボースに転化させるための、人工（非天然）のＡＴＰを含まない酵素的経路が提供される。
上記に示すように、数種の酵素を用いてデンプンを加水分解し、Ｇ１Ｐ収率を増加させることができる。かかる酵素としては、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、及びα－アミラーゼが挙げられる。コーンスターチはαＧＰの作用を妨げる多くの分枝を含む。イソアミラーゼを用いてデンプンを脱分枝し、直鎖状のアミロデキストリンを生成させることができる。イソアミラーゼで前処理したデンプンによって、最終生成物中のＦ６Ｐ濃度をより高くすることができる。イソアミラーゼ及びプルラナーゼはα－１，６－グリコシド結合を開裂させ、これにより、α－グルカンホスホリラーゼによってデンプンをより完全に分解することが可能になる。α－アミラーゼはα－１，４－グリコシド結合を開裂させることから、α－アミラーゼを用いてデンプンをフラグメントに分解させて、ソルボースへの転化をより迅速にし、且つ溶解度を高める。
マルトースホスホリラーゼ（ＭＰ）を用いて、分解生成物であるマルトースをＧ１Ｐ及びグルコースへと加リン酸分解で開裂させることによって、ソルボース収率を増加させることができる。あるいは、４－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）を用いて、分解生成物であるグルコース、マルトース、及びマルトトリオースを、αＧＰにより加リン酸分解で開裂させてＧ１Ｐを生成させることができるより長鎖のマルトオリゴ糖へとリサイクルすることによって、ソルボース収率を増加させることができる。
特定の実施形態において、セルロース及びその誘導製品を、一連のステップを経てソルボースに転化させることができる。この製造方法は、以下のステップ、すなわち、
セロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）及びセロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）でそれぞれ触媒することによって、セロデキストリン及びセロビオースならびに遊離リン酸からＧ１Ｐを生成させることと、
ＰＧＭで触媒することによってＧ１ＰをＧ６Ｐに転化させることと、
ＰＧＩで触媒することによってＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させることと、
Ｆ６ＰＥで触媒することによってＦ６ＰをＴ６Ｐに転化させることと、
Ｓ６ＰＥで触媒することによってＴ６ＰをＳ６Ｐに転化させることと、
Ｓ６ＰＰで触媒することによってＳ６Ｐをソルボースに転化させることと
を含むイン・ビトロ合成経路を提供する。この製造方法においては、リン酸イオンはセロデキストリン及びセロビオースをＧ１Ｐに転化させる上記ステップによりリサイクルすることができる。
いくつかの実施形態において、ポリリン酸及びポリリン酸グルコキナーゼ（ＰＰＧＫ）を本製造方法に添加し、それにより分解生成物であるグルコースをＧ６Ｐにリン酸化することによって、ソルボースの収率を増加させることができる。
他の実施形態において、ソルボースをグルコースから生成させることができる。この製造方法は、
ポリリン酸グルコキナーゼ（ＰＰＧＫ）で触媒することによってグルコース及びポリリン酸からＧ６Ｐを生成させるステップと、
ＰＧＩで触媒することによってＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させるステップと、
Ｐ６ＰＥで触媒することによってＦ６ＰをＴ６Ｐに転化させるステップと、
Ｓ６ＰＥで触媒することによってＴ６ＰをＳ６Ｐに転化させるステップと、
Ｓ６ＰＰで触媒することによってＳ６Ｐをソルボースに転化させるステップと
を含む。
本発明の製造方法は低コストの出発物質を使用し、原料及び生成物の分離に関連するコストを削減することにより製造コストを低減する。デンプン、セルロース、スクロース、及びいくつかのそれらの誘導体は、例えばラクトースよりも安価な原料である。ソルボースがバイオマスまたはラクトースから製造される場合、収率は本発明の場合よりも低く、ソルボースをクロマトグラフィーにより他の糖から分離する必要があり、これはより高い製造コストに繋がる。更に、本発明者らの製造方法には動物が含まれない。
本発明に係るＳ６Ｐをソルボースに転化させるステップは、原料の如何にかかわらず不可逆的なホスファターゼ反応である。したがって、ソルボースは非常に高い収率で生成し、同時にそれに続く生成物の分離コストを効果的に最小限に抑える。
細胞による製造方法とは対照的に、本発明は、ソルボースの無細胞での製造を含み、多くの場合に基質の細胞中への／生成物の細胞外への輸送を減速させる細胞膜を排除することに起因して、比較的に高い反応速度を有する。本発明においてはまた、最終製品が栄養分に富む発酵培地／細胞による代謝産物を含まない。
本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載のソルボースの製造方法によって製造されたソルボースである。
グロース
本発明の一実施形態は、
フルクトース６－リン酸４－エピメラーゼ（Ｆ６ＰＥ）で触媒することによってフルクトース６－リン酸（Ｆ６Ｐ）をタガトース６－リン酸（Ｔ６Ｐ）に転化させることと、
ソルボース６－リン酸エピメラーゼ（Ｓ６ＰＥ）で触媒することによってＴ６Ｐをソルボース６－リン酸（Ｓ６Ｐ）に転化させることと、
グロース６－リン酸イソメラーゼで触媒することによって上記生成したＳ６Ｐをグロース６－リン酸（Ｇｕｌ６Ｐ）に転化させることと、
グロース６－リン酸ホスファターゼ（Ｇｕｌ６ＰＰ）で触媒することによって上記Ｇｕｌ６Ｐをグロースに転化させることと
を含むグロースの製造方法である。
Ｆ６ＰＥの例としては、以下のタンパク質、すなわち、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｅ８Ｎ０Ｎ６、Ｅ４ＳＥＨ３、Ｉ０Ｉ５０７、Ｈ１ＸＲＧ１、及びＢ５ＹＢＤ７が挙げられるが、これらに限定はされない。Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｅ８Ｎ０Ｎ６及びＩ０Ｉ５０７は共にＦ６ＰＥ反応を触媒し、２７％のアミノ酸配列同一性を共有する。したがって、Ｆ６ＰＥの例には、上述のＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤのいずれかに対するアミノ酸配列同一性が、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％である任意の類似体も含まれる。
本発明のグロースの製造方法は、グルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）を上記Ｆ６Ｐに酵素的に転化させるステップも含み、このステップはホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）によって触媒される。他の実施形態において、本グロースの製造方法は、グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）を上記Ｇ６Ｐに転化させるステップを更に含み、このステップはホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される。更に別の実施形態において、グロースの製造方法は、少なくとも１種の酵素によって触媒される糖を上記Ｇ１Ｐに転化させるステップも含む。
したがって、本発明のグロースの製造方法は、例えば、以下のステップ、すなわち、
（ｉ）１種または複数種の酵素を用いて糖をグルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）に転化させることと、
（ｉｉ）ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ、ＥＣ ５．４．２．２）を用いてＧ１ＰをＧ６Ｐに転化させることと、
（ｉｉｉ）ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ、ＥＣ ５．３．１．９）を用いてＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させることと、
（ｉｖ）Ｆ６ＰＥを介してＦ６ＰをＴ６Ｐに転化させることと、
（ｖ）Ｓ６ＰＥ（ＥＣ ５．３．１．２６）を介してＴ６ＰをＳ６Ｐに転化させることと、
（ｖｉ）Ｇｕｌ６ＰＩを介してＳ６ＰをＧｕｌ６Ｐに転化させることと、
（ｖｉｉ）Ｇｕｌ６ＰＰを介してＧｕｌＰをグロースに転化させることと
を含んでいてもよい。
一般的には、開示する製造方法において用いる酵素ユニットの比率は１：１：１：１：１：１：１（αＧＰ：ＰＧＭ：ＰＧＩ：Ｆ６ＰＥ、Ｓ６ＰＥ：Ｇｕｌ６ＰＩ：Ｇｕｌ６ＰＰ）である。製品収率を最適化するために、これらの比率を任意の数の組み合わせで調整してもよい。例えば、３：１：１：１：１：１：１の比率を用いて、リン酸化中間体の濃度を最大化することができ、これにより、その下流の反応の活性が増加することとなる。逆に、１：１：１：１：１：１：３の比率を用いて、αＧＰに対するリン酸の供給を確実に維持することができ、これにより、α－１，４－グリコシド結合がより効率的に加リン酸分解で開裂することとなる。例えば３：１：１：１：１：１：３の酵素の比率を用いて反応速度を更に高めることができる。したがって、以下に説明する他の任意選択の酵素を含む酵素の比率を変化させて、グロース生成の効率を高めることができる。例えば、ある特定の酵素が、他の酵素の量に対して約２倍、３倍、４倍、５倍等の量で存在していてもよい。
本製造方法の重要な利点の１つは、複数のプロセスステップを単一のバイオリアクターまたは反応槽中で実施することができることである。あるいは、上記複数のステップは、直列に配置された複数のバイオリアクターまたは反応槽中で実施することもできる。
特に全てのプロセスステップが単一のバイオリアクターまたは反応槽中で実施される場合、Ｓ６Ｐの脱リン酸化によって生成するリン酸イオンを、次に、糖をＧ１Ｐに転化させるプロセスステップにリサイクルすることができる。上記開示する製造方法においてリン酸をリサイクルすることができることにより、非化学量論量のリン酸を用いることが可能になり、これにより反応液中のリン酸濃度が低く保たれる。このことにより、本製造方法の全体的な経路及び全体を通した速度が影響を受けるが、個々の酵素の活性が制限されることはなく、本グロースの製造方法が全体的に効率的になることができる。
例えば、反応液中のリン酸濃度は、約０．１ｍＭ～約３００ｍＭ、約０．１ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１ｍＭ～約５０ｍＭ、好ましくは約５ｍＭ～約５０ｍＭ、またはより好ましくは約１０ｍＭ～約５０ｍＭの範囲であってよい。例えば、上記反応液中のリン酸濃度は、約０．１ｍＭ、約０．５ｍＭ、約１ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２ｍＭ、約２．５ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、または約５５ｍＭであってよい。
したがって、リン酸濃度が低いことで、総リン酸量が少なくなることにより製造コストが減少し、延いてはリン酸除去のコストが低下する。また、リン酸濃度が低いと高濃度の遊離リン酸によるＳ６ＰＰの阻害も防止され、リン酸による汚染の可能性も低下する。
更に、本明細書に開示の製造方法は、リン酸の供給源としてＡＴＰを添加することなく、すなわちＡＴＰなしで実施することができる。本製造方法は、ＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）についても、これを添加しなければならないということなしに、すなわちＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）なしで実施することができる。他の利点としては、開示するグロースの製造方法の少なくとも１のステップが、エネルギー的に有利な反応を含むという事実も挙げられる。
グロースをフルクトースから製造することもできる。例えば、この製造方法は、
ポリリン酸フルクトキナーゼ（ＰＰＦＫ）で触媒することによってフルクトース及びポリリン酸からＦ６Ｐを生成させることと、
Ｆ６ＰＥで触媒することによってＦ６ＰをＴ６Ｐに転化させることと、
Ｓ６ＰＥで触媒することによってＴ６ＰをＳ６Ｐに転化させることと、
Ｇｕｌ６ＰＩで触媒することによってＳ６ＰをＧｕｌ６Ｐに転化させることと、
Ｇｕｌ６ＰＰで触媒することによってＧｕｌ６Ｐをグロースに転化させることと
を含む。上記フルクトースは、例えば、スクロースの酵素的転化によって製造することができる。
グロースはスクロースから製造することができる。この製造方法は、以下の酵素的ステップ、すなわち、
スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）で触媒することによってスクロース及び遊離リン酸からＧ１Ｐを生成させることと、
ＰＧＭで触媒することによってＧ１ＰをＧ６Ｐに転化させることと、
ＰＧＩで触媒することによってＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させることと、
Ｆ６ＰＥで触媒することによってＦ６ＰをＴ６Ｐに転化させることと、
Ｓ６ＰＥで触媒することによってＴ６ＰをＳ６Ｐに転化させることと、
Ｇｕｌ６ＰＩで触媒することによってＳ６ＰをＧｕｌ６Ｐに転化させることと、
Ｇｕｌ６ＰＰで触媒することによってＧｕｌ６Ｐをグロースに転化させることと
を含むイン・ビトロ合成経路を提供する。
Ｓ６Ｐがソルボースに転化される際に生成するリン酸イオンを、次に、スクロースをＧ１Ｐに転化させるステップにリサイクルすることができる。更に、ＰＰＦＫ及びポリリン酸を用いて、ＳＰによるスクロースの加リン酸分解での開裂によって生成するフルクトースからＦ６Ｐを生成させることにより、グロース収率を高めることができる。
いくつかの実施形態において、グロースの製造方法は、以下のステップ、すなわち、
酵素的加水分解または酸加水分解により多糖及びオリゴ糖からグルコースを生成させることと、
少なくとも１種の酵素で触媒することによってグルコースをＧ６Ｐに転化させることと、
酵素的加水分解または酸加水分解により多糖及びオリゴ糖からフルクトースを生成させることと、
少なくとも１種の酵素で触媒することによってフルクトースをＦ６Ｐに転化させることと
を含む。上記多糖及びオリゴ糖の例は上記に列挙される。
他の実施形態において、Ｇ６Ｐは、ポリリン酸グルコキナーゼによりグルコース及びポリリン酸ナトリウムから製造される。
本開示は、デンプン、セルロース、スクロース、及びそれらの誘導製品中の多糖ならびにオリゴ糖などの糖のグロースへの転化方法を提供する。特定の実施形態において、無細胞酵素カクテルを使用して、デンプン、セルロース、スクロース、及びそれらの誘導製品をグロースに転化させるための、人工（非天然）のＡＴＰを含まない酵素的経路が提供される。
上記に示すように、数種の酵素を用いてデンプンを加水分解し、Ｇ１Ｐ収率を増加させることができる。かかる酵素としては、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、及びα－アミラーゼが挙げられる。コーンスターチはαＧＰの作用を妨げる多くの分枝を含む。イソアミラーゼを用いてデンプンを脱分枝し、直鎖状のアミロデキストリンを生成させることができる。イソアミラーゼで前処理したデンプンによって、最終生成物中のＦ６Ｐ濃度をより高くすることができる。イソアミラーゼ及びプルラナーゼはα－１，６－グリコシド結合を開裂させ、これにより、α－グルカンホスホリラーゼによってデンプンをより完全に分解することが可能になる。α－アミラーゼはα－１，４－グリコシド結合を開裂させることから、α－アミラーゼを用いてデンプンをフラグメントに分解させて、グロースへの転化をより迅速にし、且つ溶解度を高める。
マルトースホスホリラーゼ（ＭＰ）を用いて、分解生成物であるマルトースをＧ１Ｐ及びグルコースへと加リン酸分解で開裂させることによって、グロース収率を増加させることができる。あるいは、４－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）を用いて、分解生成物であるグルコース、マルトース、及びマルトトリオースを、αＧＰにより加リン酸分解で開裂させてＧ１Ｐを生成させることができるより長鎖のマルトオリゴ糖へとリサイクルすることによって、グロース収率を増加させることができる。
特定の実施形態において、セルロース及びその誘導製品を、一連のステップを経てグロースに転化させることができる。この製造方法は、以下のステップ、すなわち、
セロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）及びセロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）でそれぞれ触媒することによって、セロデキストリン及びセロビオースならびに遊離リン酸からＧ１Ｐを生成させることと、
ＰＧＭで触媒することによってＧ１ＰをＧ６Ｐに転化させることと、
ＰＧＩで触媒することによってＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させることと、
Ｆ６ＰＥで触媒することによってＦ６ＰをＴ６Ｐに転化させることと、
Ｓ６ＰＥで触媒することによってＴ６ＰをＳ６Ｐに転化させることと、
Ｓ６ＰＰで触媒することによってＳ６Ｐをソルボースに転化させることと
を含むイン・ビトロ合成経路を提供する。この製造方法においては、リン酸イオンはセロデキストリン及びセロビオースをＧ１Ｐに転化させる上記ステップによりリサイクルすることができる。
いくつかの実施形態において、ポリリン酸及びポリリン酸グルコキナーゼ（ＰＰＧＫ）を本製造方法に添加し、それにより分解生成物であるグルコースをＧ６Ｐにリン酸化することによって、グロースの収率を増加させることができる。
他の実施形態において、グロースをグルコースから生成させることができる。この製造方法は、
ポリリン酸グルコキナーゼ（ＰＰＧＫ）で触媒することによってグルコース及びポリリン酸からＧ６Ｐを生成させるステップと、
ＰＧＩで触媒することによってＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させるステップと、
Ｆ６ＰＥで触媒することによってＦ６ＰをＴ６Ｐに転化させるステップと、
Ｓ６ＰＥで触媒することによってＴ６ＰをＳ６Ｐに転化させるステップと、
Ｇｕｌ６ＰＩで触媒することによってＳ６ＰをＧｕｌ６Ｐに転化させるステップと、
Ｇｕｌ６ＰＰで触媒することによってＧｕｌ６Ｐをグロースに転化させるステップと
を含む。
本発明の製造方法は低コストの出発物質を使用し、原料及び生成物の分離に関連するコストを削減することにより製造コストを低減する。デンプン、セルロース、スクロース、及びいくつかのそれらの誘導体は、例えばラクトースよりも安価な原料である。グロースがバイオマスまたはラクトースから製造される場合、収率は本発明の場合よりも低く、グロースをクロマトグラフィーにより他の糖から分離する必要があり、これはより高い製造コストに繋がる。更に、本発明者らの製造方法には動物が含まれない。
本発明に係るＳ６Ｐをグロースに転化させるステップは、原料の如何にかかわらず不可逆的なホスファターゼ反応である。したがって、グロースは非常に高い収率で生成し、同時にそれに続く生成物の分離コストを効果的に最小限に抑える。
細胞による製造方法とは対照的に、本発明は、グロースの無細胞での製造を含み、多くの場合に基質の細胞中への／生成物の細胞外への輸送を減速させる細胞膜を排除することに起因して、比較的に高い反応速度を有する。本発明においてはまた、最終製品が栄養分に富む発酵培地／細胞による代謝産物を含まない。
本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載のグロースの製造方法によって製造されたグロースである。
イドース
本発明の一実施形態は、
フルクトース６－リン酸４－エピメラーゼ（Ｆ６ＰＥ）で触媒することによってフルクトース６－リン酸（Ｆ６Ｐ）をタガトース６－リン酸（Ｔ６Ｐ）に転化させることと、
ソルボース６－リン酸エピメラーゼ（Ｓ６ＰＥ）で触媒することによってＴ６Ｐをソルボース６－リン酸（Ｓ６Ｐ）に転化させることと、
イドース６－リン酸イソメラーゼで触媒することによって上記生成したＳ６Ｐをイドース６－リン酸（Ｉ６Ｐ）に転化させることと、
イドース６－リン酸ホスファターゼ（Ｉ６ＰＰ）で触媒することによって上記Ｉ６Ｐをイドースに転化させることと
を含むイドースの製造方法である。
Ｆ６ＰＥの例としては、以下のタンパク質、すなわち、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｅ８Ｎ０Ｎ６、Ｅ４ＳＥＨ３、Ｉ０Ｉ５０７、Ｈ１ＸＲＧ１、及びＢ５ＹＢＤ７が挙げられるが、これらに限定はされない。Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｅ８Ｎ０Ｎ６及びＩ０Ｉ５０７は共にＦ６ＰＥ反応を触媒し、２７％のアミノ酸配列同一性を共有する。したがって、Ｆ６ＰＥの例には、上述のＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤのいずれかに対するアミノ酸配列同一性が、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％である任意の類似体も含まれる。
本発明のイドースの製造方法は、グルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）を上記Ｆ６Ｐに酵素的に転化させるステップも含み、このステップはホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）によって触媒される。他の実施形態において、本イドースの製造方法は、グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）を上記Ｇ６Ｐに転化させるステップを更に含み、このステップはホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される。更に別の実施形態において、イドースの製造方法は、少なくとも１種の酵素によって触媒される糖を上記Ｇ１Ｐに転化させるステップも含む。
したがって、本発明のイドースの製造方法は、例えば、以下のステップ、すなわち、
（ｉ）１種または複数種の酵素を用いて糖をグルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）に転化させることと、
（ｉｉ）ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ、ＥＣ ５．４．２．２）を用いてＧ１ＰをＧ６Ｐに転化させることと、
（ｉｉｉ）ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ、ＥＣ ５．３．１．９）を用いてＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させることと、
（ｉｖ）Ｆ６ＰＥを介してＦ６ＰをＴ６Ｐに転化させることと、
（ｖ）Ｓ６ＰＥ（ＥＣ ５．３．１．２６）を介してＴ６ＰをＳ６Ｐに転化させることと、
（ｖｉ）Ｉ６ＰＩを介してＳ６ＰをＩ６Ｐに転化させることと、
（ｖｉｉ）Ｉ６ＰＰを介してＩ６Ｐをイドースに転化させることと
を含んでいてもよい。
一般的には、開示する製造方法において用いる酵素ユニットの比率は１：１：１：１：１：１：１（αＧＰ：ＰＧＭ：ＰＧＩ：Ｆ６ＰＥ：Ｓ６ＰＥ：Ｉ６ＰＩ：Ｉ６ＰＰ）である。製品収率を最適化するために、これらの比率を任意の数の組み合わせで調整してもよい。例えば、３：１：１：１：１：１：１の比率を用いて、リン酸化中間体の濃度を最大化することができ、これにより、その下流の反応の活性が増加することとなる。逆に、１：１：１：１：１：１：３の比率を用いて、αＧＰに対するリン酸の供給を確実に維持することができ、これにより、α－１，４－グリコシド結合がより効率的に加リン酸分解で開裂することとなる。例えば３：１：１：１：１：１：３の酵素の比率を用いて反応速度を更に高めることができる。したがって、以下に説明する他の任意選択の酵素を含む酵素の比率を変化させて、イドース生成の効率を高めることができる。例えば、ある特定の酵素が、他の酵素の量に対して約２倍、３倍、４倍、５倍等の量で存在していてもよい。
本製造方法の重要な利点の１つは、複数のプロセスステップを単一のバイオリアクターまたは反応槽中で実施することができることである。あるいは、上記複数のステップは、直列に配置された複数のバイオリアクターまたは反応槽中で実施することもできる。
特に全てのプロセスステップが単一のバイオリアクターまたは反応槽中で実施される場合、Ｓ６Ｐの脱リン酸化によって生成するリン酸イオンを、次に、糖をＧ１Ｐに転化させるプロセスステップにリサイクルすることができる。上記開示する製造方法においてリン酸をリサイクルすることができることにより、非化学量論量のリン酸を用いることが可能になり、これにより反応液中のリン酸濃度が低く保たれる。このことにより、本製造方法の全体的な経路及び全体を通した速度が影響を受けるが、個々の酵素の活性が制限されることはなく、本イドースの製造方法が全体的に効率的になることができる。
例えば、反応液中のリン酸濃度は、約０．１ｍＭ～約３００ｍＭ、約０．１ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１ｍＭ～約５０ｍＭ、好ましくは約５ｍＭ～約５０ｍＭ、またはより好ましくは約１０ｍＭ～約５０ｍＭの範囲であってよい。例えば、上記反応液中のリン酸濃度は、約０．１ｍＭ、約０．５ｍＭ、約１ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２ｍＭ、約２．５ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、または約５５ｍＭであってよい。
したがって、リン酸濃度が低いことで、総リン酸量が少なくなることにより製造コストが減少し、延いてはリン酸除去のコストが低下する。また、リン酸濃度が低いと高濃度の遊離リン酸によるＳ６ＰＰの阻害も防止され、リン酸による汚染の可能性も低下する。
更に、本明細書に開示の製造方法は、リン酸の供給源としてＡＴＰを添加することなく、すなわちＡＴＰなしで実施することができる。本製造方法は、ＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）についても、これを添加しなければならないということなしに、すなわちＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）なしで実施することができる。他の利点としては、開示するイドースの製造方法の少なくとも１のステップが、エネルギー的に有利な反応を含むという事実も挙げられる。
イドースをフルクトースから製造することもできる。例えば、この製造方法は、
ポリリン酸フルクトキナーゼ（ＰＰＦＫ）で触媒することによってフルクトース及びポリリン酸からＦ６Ｐを生成させることと、
Ｆ６ＰＥで触媒することによってＦ６ＰをＴ６Ｐに転化させることと、
Ｓ６ＰＥで触媒することによってＴ６ＰをＳ６Ｐに転化させることと、
Ｉ６ＰＩで触媒することによってＳ６ＰをＩ６Ｐに転化させることと、
Ｉ６ＰＰで触媒することによってＩ６Ｐをイドースに転化させることと
を含む。上記フルクトースは、例えば、スクロースの酵素的転化によって製造することができる。
イドースはスクロースから製造することができる。この製造方法は、以下の酵素的ステップ、すなわち、
スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）で触媒することによってスクロース及び遊離リン酸からＧ１Ｐを生成させることと、
ＰＧＭで触媒することによってＧ１ＰをＧ６Ｐに転化させることと、
ＰＧＩで触媒することによってＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させることと、
Ｆ６ＰＥで触媒することによってＦ６ＰをＴ６Ｐに転化させることと、
Ｓ６ＰＥで触媒することによってＴ６ＰをＳ６Ｐに転化させることと、
Ｉ６ＰＩで触媒することによってＳ６ＰをＩ６Ｐに転化させることと、
Ｉ６ＰＰで触媒することによってＩ６Ｐをイドースに転化させることと
を含むイン・ビトロ合成経路を提供する。
Ｓ６Ｐがソルボースに転化される際に生成するリン酸イオンを、次に、スクロースをＧ１Ｐに転化させるステップにリサイクルすることができる。更に、ＰＰＦＫ及びポリリン酸を用いて、ＳＰによるスクロースの加リン酸分解での開裂によって生成するフルクトースからＦ６Ｐを生成させることにより、イドース収率を高めることができる。
いくつかの実施形態において、イドースの製造方法は、以下のステップ、すなわち、
酵素的加水分解または酸加水分解により多糖及びオリゴ糖からグルコースを生成させることと、
少なくとも１種の酵素で触媒することによってグルコースをＧ６Ｐに転化させることと、
酵素的加水分解または酸加水分解により多糖及びオリゴ糖からフルクトースを生成させることと、
少なくとも１種の酵素で触媒することによってフルクトースをＦ６Ｐに転化させることと
を含む。上記多糖及びオリゴ糖の例は上記に列挙される。
他の実施形態において、Ｇ６Ｐは、ポリリン酸グルコキナーゼによりグルコース及びポリリン酸ナトリウムから製造される。
本開示は、デンプン、セルロース、スクロース、及びそれらの誘導製品中の多糖ならびにオリゴ糖などの糖のイドースへの転化方法を提供する。特定の実施形態において、無細胞酵素カクテルを使用して、デンプン、セルロース、スクロース、及びそれらの誘導製品をイドースに転化させるための、人工（非天然）のＡＴＰを含まない酵素的経路が提供される。
上記に示すように、数種の酵素を用いてデンプンを加水分解し、Ｇ１Ｐ収率を増加させることができる。かかる酵素としては、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、及びα－アミラーゼが挙げられる。コーンスターチはαＧＰの作用を妨げる多くの分枝を含む。イソアミラーゼを用いてデンプンを脱分枝し、直鎖状のアミロデキストリンを生成させることができる。イソアミラーゼで前処理したデンプンによって、最終生成物中のＦ６Ｐ濃度をより高くすることができる。イソアミラーゼ及びプルラナーゼはα－１，６－グリコシド結合を開裂させ、これにより、α－グルカンホスホリラーゼによってデンプンをより完全に分解することが可能になる。α－アミラーゼはα－１，４－グリコシド結合を開裂させることから、α－アミラーゼを用いてデンプンをフラグメントに分解させて、イドースへの転化をより迅速にし、且つ溶解度を高める。
マルトースホスホリラーゼ（ＭＰ）を用いて、分解生成物であるマルトースをＧ１Ｐ及びグルコースへと加リン酸分解で開裂させることによって、イドース収率を増加させることができる。あるいは、４－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）を用いて、分解生成物であるグルコース、マルトース、及びマルトトリオースを、αＧＰにより加リン酸分解で開裂させてＧ１Ｐを生成させることができるより長鎖のマルトオリゴ糖へとリサイクルすることによって、イドース収率を増加させることができる。
特定の実施形態において、セルロース及びその誘導製品を、一連のステップを経てイドースに転化させることができる。この製造方法は、以下のステップ、すなわち、
セロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）及びセロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）でそれぞれ触媒することによって、セロデキストリン及びセロビオースならびに遊離リン酸からＧ１Ｐを生成させることと、
ＰＧＭで触媒することによってＧ１ＰをＧ６Ｐに転化させることと、
ＰＧＩで触媒することによってＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させることと、
Ｆ６ＰＥで触媒することによってＦ６ＰをＴ６Ｐに転化させることと、
Ｓ６ＰＥで触媒することによってＴ６ＰをＳ６Ｐに転化させることと、
Ｓ６ＰＰで触媒することによってＳ６Ｐをソルボースに転化させることと
を含むイン・ビトロ合成経路を提供する。この製造方法においては、リン酸イオンはセロデキストリン及びセロビオースをＧ１Ｐに転化させる上記ステップによりリサイクルすることができる。
いくつかの実施形態において、ポリリン酸及びポリリン酸グルコキナーゼ（ＰＰＧＫ）を本製造方法に添加し、それにより分解生成物であるグルコースをＧ６Ｐにリン酸化することによって、イドースの収率を増加させることができる。
他の実施形態において、イドースをグルコースから生成させることができる。この製造方法は、
ポリリン酸グルコキナーゼ（ＰＰＧＫ）で触媒することによってグルコース及びポリリン酸からＧ６Ｐを生成させるステップと、
ＰＧＩで触媒することによってＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させるステップと、
Ｆ６ＰＥで触媒することによってＦ６ＰをＴ６Ｐに転化させるステップと、
Ｓ６ＰＥで触媒することによってＴ６ＰをＳ６Ｐに転化させるステップと、
Ｉ６ＰＩで触媒することによってＳ６ＰをＩ６Ｐに転化させるステップと、
Ｉ６ＰＰで触媒することによってＩ６Ｐをイドースに転化させるステップと
を含む。
本発明の製造方法は低コストの出発物質を使用し、原料及び生成物の分離に関連するコストを削減することにより製造コストを低減する。デンプン、セルロース、スクロース、及びいくつかのそれらの誘導体は、例えばラクトースよりも安価な原料である。イドースがバイオマスまたはラクトースから製造される場合、収率は本発明の場合よりも低く、イドースをクロマトグラフィーにより他の糖から分離する必要があり、これはより高い製造コストに繋がる。更に、本発明者らの製造方法には動物が含まれない。
本発明に係るＳ６Ｐをイドースに転化させるステップは、原料の如何にかかわらず不可逆的なホスファターゼ反応である。したがって、イドースは非常に高い収率で生成し、同時にそれに続く生成物の分離コストを効果的に最小限に抑える。
細胞による製造方法とは対照的に、本発明は、イドースの無細胞での製造を含み、多くの場合に基質の細胞中への／生成物の細胞外への輸送を減速させる細胞膜を排除することに起因して、比較的に高い反応速度を有する。本発明においてはまた、最終製品が栄養分に富む発酵培地／細胞による代謝産物を含まない。
本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載のイドースの製造方法によって製造されたイドースである。
タガトース
タガトースの製造方法は、
エピメラーゼで触媒することによってＦ６ＰをＴ６Ｐに転化させることと、
ホスファターゼで触媒することによって上記Ｔ６Ｐをタガトースに転化させることと
を含む。
Ｆ６ＰをＴ６Ｐに転化させる方法における使用に好適なエピメラーゼとしてはＦ６ＰＥが挙げられる。Ｆ６ＰＥの例としては、以下のタンパク質、すなわち、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｅ８Ｎ０Ｎ６、Ｅ４ＳＥＨ３、Ｉ０Ｉ５０７、Ｈ１ＸＲＧ１、及びＢ５ＹＢＤ７が挙げられるが、これらに限定はされない。Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｅ８Ｎ０Ｎ６及びＩ０Ｉ５０７は共にＦ６ＰＥ反応を触媒し、２７％のアミノ酸配列同一性を共有する。したがって、Ｆ６ＰＥの例には、上述のＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤのいずれかに対するアミノ酸配列同一性が、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％である任意の類似体も含まれる。
製造方法において、Ｔ６Ｐをタガトース（Ｄ－タガトース）に転化させるホスファターゼ、Ｔ６ＰＰを用いてもよい。Ｔ６ＰＰの例としては、以下のタンパク質、すなわち、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｏ２９８０５、Ｄ２ＲＨＶ２、及びＦ２ＫＭＫ２が挙げられるが、これらに限定はされない。Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｏ２９８０５及びＦ２ＫＭＫ２は共にＦ６ＰＥ反応を触媒し、６７％のアミノ酸配列同一性を共有する。したがって、Ｔ６ＰＰの例には、上述のＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤのいずれかに対するアミノ酸配列同一性が、少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更に最も好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である任意の類似体も含まれる。
タガトースの製造方法は、グルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）を上記Ｆ６Ｐに酵素的に転化させるステップも含み、このステップはホスホグルコースイソメラーゼ（ＰＧＩ）によって触媒される。本タガトースの製造方法は、グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）を上記Ｇ６Ｐに転化させるステップを更に含み、このステップはホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される。更に、タガトースの製造方法は、少なくとも１種の酵素によって触媒される糖を上記Ｇ１Ｐに転化させるステップも含む。
したがって、タガトースの製造方法は、例えば、以下のステップ、すなわち、
（ｉ）１種または複数種の酵素を用いて糖をグルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）に転化させることと、
（ｉｉ）ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ、ＥＣ ５．４．２．２）を用いてＧ１ＰをＧ６Ｐに転化させることと、
（ｉｉｉ）ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ、ＥＣ ５．３．１．９）を用いてＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させることと、
（ｉｖ）フルクトース６－リン酸エピメラーゼ（Ｆ６ＰＥ）を介してＦ６ＰをＴ６Ｐに転化させることと、
（ｖ）タガトース６－リン酸ホスファターゼ（Ｔ６ＰＰ）を介してＴ６Ｐをタガトースに転化させることと
を含む。
一般的には、本製造方法において用いる酵素ユニットの比率は１：１：１：１：１（αＧＰ：ＰＧＭ：ＰＧＩ：Ｆ６ＰＥ：Ｔ６ＰＰ）である。製品収率を最適化するために、これらの比率を任意の数の組み合わせで調整してもよい。例えば、３：１：１：１：１の比率を用いて、リン酸化中間体の濃度を最大化することができ、これにより、その下流の反応の活性が増加することとなる。逆に、１：１：１：１：３の比率を用いて、αＧＰに対するリン酸の供給を確実に維持することができ、これにより、α－１，４－グリコシド結合がより効率的に加リン酸分解で開裂することとなる。例えば３：１：１：１：３の酵素の比率を用いて反応速度を更に高めることができる。したがって、以下に説明する他の任意選択の酵素を含む酵素の比率を変化させて、タガトース生成の効率を高めることができる。例えば、ある特定の酵素が、他の酵素の量に対して約２倍、３倍、４倍、５倍等の量で存在していてもよい。
タガトースをフルクトースから製造することもできる。例えば、この製造方法は、
ポリリン酸フルクトキナーゼ（ＰＰＦＫ）で触媒することによってフルクトース及びポリリン酸からＦ６Ｐを生成させることと、
Ｆ６ＰＥで触媒することによってＦ６ＰをＴ６Ｐに転化させることと、
Ｔ６ＰＰで触媒することによってＴ６Ｐをタガトースに転化させることと
を含む。上記フルクトースは、例えば、スクロースの酵素的転化によって製造することができる。
タガトースはスクロースから製造することができる。この製造方法は、以下の酵素的ステップ、すなわち、
スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）で触媒することによってスクロース及び遊離リン酸からＧ１Ｐを生成させることと、
ＰＧＭで触媒することによってＧ１ＰをＧ６Ｐに転化させることと、
ＰＧＩで触媒することによってＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させることと、
Ｆ６ＰＥで触媒することによってＦ６ＰをＴ６Ｐに転化させることと、
Ｔ６ＰＰで触媒することによってＴ６Ｐをタガトースに転化させることと
を含むイン・ビトロ合成経路を提供する。
Ｔ６Ｐがタガトースに転化される際に生成するリン酸イオンを、次に、スクロースをＧ１Ｐに転化させるステップにリサイクルすることができる。更に、ＰＰＦＫ及びポリリン酸を用いて、ＳＰによるスクロースの加リン酸分解での開裂によって生成するフルクトースからＦ６Ｐを生成させることにより、タガトース収率を高めることができる。
タガトースの製造方法は、以下のステップ、すなわち、
酵素的加水分解または酸加水分解により多糖及びオリゴ糖からグルコースを生成させることと、
少なくとも１種の酵素で触媒することによってグルコースをＧ６Ｐに転化させることと、
酵素的加水分解または酸加水分解により多糖及びオリゴ糖からフルクトースを生成させることと、
少なくとも１種の酵素で触媒することによってフルクトースをＧ６Ｐに転化させることと
を含む。上記多糖及びオリゴ糖の例は上記に列挙される。
セルロース及びその誘導製品を、一連のステップを経てタガトースに転化させることができる。この製造方法は、以下のステップ、すなわち、
セロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）及びセロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）でそれぞれ触媒することによって、セロデキストリン及びセロビオースならびに遊離リン酸からＧ１Ｐを生成させることと、
ＰＧＭで触媒することによってＧ１ＰをＧ６Ｐに転化させることと、
ＰＧＩで触媒することによってＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させることと、
Ｆ６ＰＥで触媒することによってＦ６ＰをＴ６Ｐに転化させることと、
Ｔ６ＰＰで触媒することによってＴ６Ｐをタガトースに転化させることと
を含む。この製造方法においては、リン酸イオンはセロデキストリン及びセロビオースをＧ１Ｐに転化させる上記ステップによりリサイクルすることができる。
タガトースをグルコースから生成させることができる。この製造方法は、
ポリリン酸グルコキナーゼ（ＰＰＧＫ）で触媒することによってグルコース及びポリリン酸からＧ６Ｐを生成させるステップと、
ＰＧＩで触媒することによってＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させるステップと、
Ｆ６ＰＥで触媒することによってＦ６ＰをＴ６Ｐに転化させるステップと、
Ｔ６ＰＰで触媒することによってＴ６Ｐをタガトースに転化させるステップと
を含む。
プシコース
プシコースの製造方法は、
エピメラーゼ（例えば、プシコース６－リン酸３－エピメラーゼ、Ｐ６ＰＥ）で触媒することによってフルクトース６－リン酸（Ｆ６Ｐ）をプシコース６－リン酸（Ｐ６Ｐ）に転化させることと、
ホスファターゼ（例えば、プシコース６－リン酸ホスファターゼ、Ｐ６ＰＰ）で触媒することによって上記生成したＰ６Ｐをプシコースに転化させることと
を含む。
Ｐ６ＰＥの例としては、以下のタンパク質、すなわち、ＵＮＩＰＲＯＴ識別番号Ｄ９ＴＱＪ４、Ａ０Ａ０９０ＩＸＺ８、及びＰ３２７１９が挙げられるが、これらに限定はされない。Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０９０ＩＸＺ８及びＤ９ＴＱＪ４は共にＰ６ＰＥ反応を触媒し、４５％のアミノ酸配列同一性を共有する。したがって、Ｐ６ＰＥの例には、上述のＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤのいずれかに対するアミノ酸配列同一性が、少なくとも４５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更に最も好ましくはまたは少なくとも９６、９７、９８、９９、または１００％である任意の類似体も含まれる。
Ｐ６ＰＰの例としては、以下のタンパク質、すなわち、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ３ＤＣ２１、Ｑ５ＬＧＲ４、及びＱ８９ＺＲ１が挙げられるが、これらに限定はされない。Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ３ＤＣ２１及びＱ８９ＺＲ１は共にＰ６ＰＰ反応を触媒し、４５％のアミノ酸配列同一性を共有する。したがって、Ｐ６ＰＰの例には、上述のＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤのいずれかに対するアミノ酸配列同一性が、少なくとも４５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更に最も好ましくはまたは少なくとも９６、９７、９８、９９、または１００％である任意の類似体も含まれる。
プシコースの製造方法は、グルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）を上記Ｆ６Ｐに酵素的に転化させるステップも含み、このステップはホスホグルコースイソメラーゼ（ＰＧＩ）によって触媒される。本プシコースの製造方法は、グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）を上記Ｇ６Ｐに転化させるステップを更に含み、このステップはホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される。更に、プシコースの製造方法は、少なくとも１種の酵素によって触媒される糖を上記Ｇ１Ｐに転化させるステップも含む。
したがって、プシコースの製造方法は、例えば、以下のステップ、すなわち、
（ｉ）１種または複数種の酵素を用いて糖をグルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）に転化させることと、
（ｉｉ）ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ、ＥＣ ５．４．２．２）を用いてＧ１ＰをＧ６Ｐに転化させることと、
（ｉｉｉ）ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ、ＥＣ ５．３．１．９）を用いてＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させることと、
（ｉｖ）プシコース６－リン酸エピメラーゼ（Ｐ６ＰＥ）を介してＦ６ＰをＰ６Ｐに転化させることと、
（ｖ）プシコース６－リン酸ホスファターゼ（Ｐ６ＰＰ）を介してＰ６Ｐをプシコースに転化させることと
を含む。
一般的には、本製造方法において用いる酵素ユニットの比率は１：１：１：１：１（αＧＰ：ＰＧＭ：ＰＧＩ：Ｐ６ＰＥ：Ｐ６ＰＰ）である。製品収率を最適化するために、これらの比率を任意の数の組み合わせで調整してもよい。例えば、３：１：１：１：１の比率を用いて、リン酸化中間体の濃度を最大化することができ、これにより、その下流の反応の活性が増加することとなる。逆に、１：１：１：１：３の比率を用いて、αＧＰに対するリン酸の供給を確実に維持することができ、これにより、α－１，４－グリコシド結合がより効率的に加リン酸分解で開裂することとなる。例えば３：１：１：１：３の酵素の比率を用いて反応速度を更に高めることができる。したがって、以下に説明する他の任意選択の酵素を含む酵素の比率を変化させて、タガトース生成の効率を高めることができる。例えば、ある特定の酵素が、他の酵素の量に対して約２倍、３倍、４倍、５倍等の量で存在していてもよい。
プシコースをフルクトースから製造することもできる。例えば、この製造方法は、
ポリリン酸フルクトキナーゼ（ＰＰＦＫ）で触媒することによってフルクトース及びポリリン酸からＦ６Ｐを生成させることと、
Ｐ６ＰＥで触媒することによってＦ６ＰをＰ６Ｐに転化させることと、
Ｐ６ＰＰで触媒することによってＰ６Ｐをプシコースに転化させることと
を含む。上記フルクトースは、例えば、スクロースの酵素的転化によって製造することができる。
プシコースはスクロースから製造することができる。この製造方法は、以下の酵素的ステップ、すなわち、
スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）で触媒することによってスクロース及び遊離リン酸からＧ１Ｐを生成させることと、
ＰＧＭで触媒することによってＧ１ＰをＧ６Ｐに転化させることと、
ＰＧＩで触媒することによってＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させることと、
Ｐ６ＰＥで触媒することによってＦ６ＰをＰ６Ｐに転化させることと、
Ｐ６ＰＰで触媒することによってＰ６Ｐをプシコースに転化させることと
を含む。
Ｐ６Ｐがプシコースに転化される際に生成するリン酸イオンを、次に、スクロースをＧ１Ｐに転化させるステップにリサイクルすることができる。更に、ＰＰＦＫ及びポリリン酸を用いて、ＳＰによるスクロースの加リン酸分解での開裂によって生成するフルクトースからＦ６Ｐを生成させることにより、プシコース収率を高めることができる。
プシコースの製造方法は、以下のステップ、すなわち、
酵素的加水分解または酸加水分解により多糖及びオリゴ糖からグルコースを生成させることと、
少なくとも１種の酵素で触媒することによってグルコースをＧ６Ｐに転化させることと、
酵素的加水分解または酸加水分解により多糖及びオリゴ糖からフルクトースを生成させることと、
少なくとも１種の酵素で触媒することによってフルクトースをＧ６Ｐに転化させることと
を含む。上記多糖及びオリゴ糖の例は上記に列挙される。
セルロース及びその誘導製品を、一連のステップを経てプシコースに転化させることができる。この製造方法は、以下のステップ、すなわち、
セロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）及びセロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）でそれぞれ触媒することによって、セロデキストリン及びセロビオースならびに遊離リン酸からＧ１Ｐを生成させることと、
ＰＧＭで触媒することによってＧ１ＰをＧ６Ｐに転化させることと、
ＰＧＩで触媒することによってＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させることと、
Ｐ６ＰＥで触媒することによってＦ６ＰをＰ６Ｐに転化させることと、
Ｐ６ＰＰで触媒することによってＰ６Ｐをプシコースに転化させることと
を含む。この製造方法においては、リン酸イオンはセロデキストリン及びセロビオースをＧ１Ｐに転化させる上記ステップによりリサイクルすることができる。
プシコースをグルコースから生成させることができる。この製造方法は、
ポリリン酸グルコキナーゼ（ＰＰＧＫ）で触媒することによってグルコース及びポリリン酸からＧ６Ｐを生成させるステップと、
ＰＧＩで触媒することによってＧ６ＰをＦ６Ｐに転化させるステップと、
Ｐ６ＰＥで触媒することによってＦ６ＰをＰ６Ｐに転化させることと、
Ｐ６ＰＰで触媒することによってＰ６Ｐをプシコースに転化させるステップと
を含む。
実施例
材料及び方法
化学薬品
別段の注記がない限り、コーンスターチ、可溶性デンプン、マルトデキストリン、グルコース、ろ紙を含む全ての化学薬品は試薬グレードまたはそれ以上のグレードであり、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）またはＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ， ＰＡ， ＵＳＡ）から購入した。制限酵素、Ｔ４リガーゼ、及びＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ， ＭＡ， ＵＳＡ）から購入した。オリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ， ＩＡ， ＵＳＡ）またはＥｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ， ＡＬ， ＵＳＡ）のいずれかが合成した。酵素の精製に使用した再生非晶性セルロースは、Ｙｅ ｅｔ ａｌ．， Ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｆａｍｉｌｙ ９ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｕｌｅ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ ｃｅｌｌｏｄｅｘｔｒｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｏｎ ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１１；９２：５５１－５６０に記載のように、Ａｖｉｃｅｌ ＰＨ１０５（ＦＭＣ ＢｉｏＰｏｌｙｍｅｒ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡ， ＵＳＡ）から、これを溶解及び再生することによって調製した。ＤＮＡ操作のための宿主細胞としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｓｉｇ１０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）を用い、組換えタンパク質発現のための宿主細胞としてＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）を用いた。１００ｍｇＬ－１のアンピシリンまたは５０ｍｇＬ－１のカナマイシンのいずれかを含むＺＹＭ－５０５２培地を、Ｅ． ｃｏｌｉ細胞増殖及び組換えタンパク質発現に用いた。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ由来のセルラーゼ（カタログ番号：Ｃ２７３０）及びプルラナーゼ（カタログ番号：Ｐ１０６７）をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）から購入し、且つＮｏｖｏｚｙｍｅｓ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ， ＮＣ， ＵＳＡ）が製造した。マルトースホスホリラーゼ（カタログ番号：Ｍ８２８４）をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
組換え酵素の製造及び精製
タンパク質発現プラスミドを保有するＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を、１００ｍｇＬ－１のアンピシリンまたは５０ｍｇＬ－１のカナマイシンのいずれかを含有する１００ｍＬのＺＹＭ－５０５２培地と共に、１Ｌの三角フラスコ中でインキュベートした。細胞を２２０ｒｐｍで回転振とうしながら３７℃で１６～２４時間増殖させた。この細胞を１２℃での遠心分離により回収し、５０ｍＭのＮａＣｌ及び５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する２０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．５）（熱沈殿及びセルロース結合モジュール）または３００ｍＭのＮａＣｌ及び５ｍＭのイミダゾール（Ｎｉ精製）を含有する２０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．５）のいずれかで１回洗浄した。この細胞ペレットを同一の緩衝液中に再懸濁し、超音波処理（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ Ｍｏｄｅｌ ５００；５秒間パルスをオンし、１０秒間オフ、５０％の振幅で合計２１分間）により溶解した。遠心分離後、上清中の目的のタンパク質を精製した。
３種の手法を用いて種々の組換えタンパク質を精製した。Ｈｉｓタグ付きタンパク質はＮｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ， ＭＡ， ＵＳＡ）により精製した。セルロース結合モジュール（ＣＢＭ）及び自己開裂インテインを含有する融合タンパク質は、大表面積の再生非晶性セルロースへの高親和性吸着により精製した。超耐熱性酵素は７０～９５℃で５～３０分間の熱沈殿を用いて精製した。ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって上記組換えタンパク質の純度を調べた。
使用した酵素及びそれらの活性アッセイ
Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ由来のα－グルカンホスホリラーゼ（αＧＰ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｇ４ＦＥＨ８）を用いた。１ｍＭのＭｇＣｌ２及び３０ｍＭのマルトデキストリンを含有する５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中、５０℃で活性をアッセイした。Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２濃縮器（１０，０００ ＭＷＣＯ）（Ｖｉｖａｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｉｎｃ．， Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ， ＭＡ， ＵＳＡ）を用いた酵素のろ過により反応を停止させた。２５Ｕ／ｍＬのホスホグルコムターゼを添加したグルコースヘキソキナーゼ／Ｇ６ＰＤＨアッセイキット（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号ＧＡＨＫ２０－１ＫＴ）を用いてグルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）を測定した。ユニット（Ｕ）はμｍ／分として記述する。
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来のホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ６８ＢＪ６）を用いた。５ｍＭのＭｇＣｌ２及び５ｍＭのＧ１Ｐを含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中、５０℃で活性を測定した。Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２濃縮器（１０，０００ ＭＷＣＯ）を用いた酵素のろ過により反応を停止させた。ヘキソキナーゼ／Ｇ６ＰＤＨアッセイキット（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号ＧＡＨＫ２０－１ＫＴ）を用いて、生成物であるグルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）を測定した。
２種の異なる供給源、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ由来（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ３ＤＢＸ９）及びＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ５ＳＬＬ６）のホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）を用いた。５ｍＭのＭｇＣｌ２及び１０ｍＭのＧ６Ｐを含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中、５０℃で活性を測定した。Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２濃縮器（１０，０００ ＭＷＣＯ）を用いた酵素のろ過により反応を停止させた。フルクトース６－リン酸キナーゼ（Ｆ６ＰＫ）／ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＫ）／乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤ）共役酵素アッセイを用いて、生成物であるフルクトース６－リン酸（Ｆ６Ｐ）を測定し、該測定において、３４０ｎｍの吸光度の減少がＦ６Ｐの生成を示す。この２００μＬの反応液は、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＧ６Ｐ、１．５ｍＭのＡＴＰ、１．５ｍＭのホスホエノールピルビン酸、２００μΜのＮＡＤＨ、０．１ＵのＰＧＩ、５ＵのＰＫ、及び５ＵのＬＤを含有していた。
Ｃ． ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ由来の組換えセロデキストリンホスホリラーゼ及びセロビオースホスホリラーゼは、Ｙｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｈｉｇｈ－ｙｉｅｌｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｆｒｏｍ ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ ｗａｔｅｒ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｃｋｔａｉｌｓ． ＣｈｅｍＳｕｓＣｈｅｍ ２００９；２：１４９－１５２に記載されている。それらの活性を記載されたようにしてアッセイした。
Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ ＹＸ由来の組換えポリリン酸グルコキナーゼは、Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｌｕｃｏｋｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ ＹＸ： ｇｌｕｃｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｗｉｔｈｏｕｔ ＡＴＰ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１２；９３：１１０９－１１１７に記載されている。その活性を記載されたようにしてアッセイした。
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ由来の組換えイソアミラーゼは、Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｐｏｗｅｒ ｏｕｔｐｕｔ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｂｉｏｂａｔｔｅｒｙ ｔｒｅａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ｉｓｏａｍｙｌａｓｅ ｆｒｏｍ ａｎ ａｒｃｈａｅｏｎ Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ． Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１５；５：１３１８４に記載されている。その活性を記載されたようにしてアッセイした。
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来の組換え４－α－グルカノールトランスフェラーゼは、Ｊｅｏｎ ｅｔ ａｌ． ４－α－Ｇｌｕｃａｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ Ａｒｃｈａｅｏｎ Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ Ｌｉｔｏｒａｌｉｓ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９９７；２４８：１７１－１７８に記載されている。その活性を記載されたようにして測定した。
Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ由来のスクロースホスホリラーゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ９ＴＴ０９）を用いた（Ｖｅｒｈａｅｇｈｅ ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｑｕｅｓｔ ｆｏｒ ａ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ｓｕｃｒｏｓｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｒｅｖｅａｌｓ ｓｕｃｒｏｓｅ ６’－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ． Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１４ Ａｕｇ；９８（１６）：７０２７－３７）。その活性を、１０ｍＭのスクロース及び１２ｍＭの有機リン酸を含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中で測定した。グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）を、α－グルカンホスホリラーゼと同様に、２５Ｕ／ｍＬのホスホグルコムターゼを添加したグルコースヘキソキナーゼ／Ｇ６ＰＤＨアッセイキットを用いて測定した。
Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ由来のプシコース６－リン酸３－エピメラーゼ（Ｐ６ＰＥ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ９ＴＱＪ４）を用いた。５ｍＭのＭｇＣｌ２、５００μΜのＣｏＣｌ２、１Ｕ／ｍＬのＰ６ＰＰ、及び１０ｍＭのＦ６Ｐを含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中、５０℃で活性を測定した。Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２濃縮器（１０，０００ ＭＷＣＯ）を用いた酵素のろ過により反応を停止させた。プシコース６－リン酸ホスファターゼを用い、遊離リン酸の放出を検出して、生成物であるプシコース６－リン酸（Ｐ６Ｐ）を測定した。遊離リン酸の放出を検出するために、０．１Ｍの酢酸亜鉛及び２ｍＭのモリブデン酸アンモニウム（ｐＨ５）を含有する５００μＬの溶液を５０μＬの反応液に添加した。この溶液を混合し、続いて１２５μｌの５％アスコルビン酸（ｐＨ５）を添加した。この溶液を混合し、次いで３０℃で２０分間インキュベートした。８５０ｎｍでの吸光度を読み取って、遊離リン酸の放出を測定した。次いで、Ａｇｉｌｅｎｔ ＨｉＰｌｅｘ Ｈカラムを用いたＨＰＬＣによりプシコースを確認した（０．６ｍＬ／分の５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４及び６５℃で試料及び対照を測定）。
配列番号１に示すアミノ酸配列を有する、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ由来のアロース６－リン酸イソメラーゼ（Ａ６ＰＩ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｗ４Ｖ２Ｃ８）を用いた。５ｍＭのＭｇＣｌ２、５００μＭのＣｏＣｌ２、１Ｕ／ｍＬのＰ６ＰＥ、１Ｕ／ｍＬのＡ６ＰＰ、及び１０ｍＭのＦ６Ｐを含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中、５０℃で活性を測定した。Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２濃縮器（１０，０００ ＭＷＣＯ）を用いた酵素のろ過により反応を停止させた。アロース６－リン酸ホスファターゼを用い、Ｐ６ＰＥについて説明したように、遊離リン酸の放出を検出して、生成物であるアロース６－リン酸（Ａ６Ｐ）を測定した。プシコースと同様にして、ＨＰＬＣによりアロースを確認した。別のＡ６ＰＩ、例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する、Ｓｙｍｂｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ由来のＡ６ＰＩ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ６７ＬＸ４）を用いてもよい。
配列番号３に示すアミノ酸配列を有する、Ｒｕｂｅｌｌｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ由来のアロース６－リン酸ホスファターゼ（Ａ６ＰＰ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｓ９ＳＤＡ３）を用いた。５ｍＭのＭｇＣｌ２、５００μＭのＣｏＣｌ２、１Ｕ／ｍＬのＰ６ＰＥ、１Ｕ／ｍＬのＡ６ＰＩ、及び１０ｍＭのＦ６Ｐを含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中、５０℃で活性を測定した。Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２濃縮器（１０，０００ ＭＷＣＯ）を用いた酵素のろ過により反応を停止させた。Ｐ６ＰＥについて説明したように、遊離リン酸の放出を検出することによって、生成物であるアロースを測定した。プシコースと同様にして、ＨＰＬＣによりアロースを確認した。他のＡ６ＰＰ、例えば、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ由来のＡ６ＰＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ９Ｘ０Ｙ１）、配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ由来のＡ６ＰＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｉ３ＶＴ８１）、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ由来のＡ６ＰＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１３２ＮＦ０６）、及び配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する、Ｓｐｈａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＡ６ＰＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ１Ｃ７Ｇ９）を用いてもよい。
配列番号８に示すアミノ酸配列を有する、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ由来のマンノース６－リン酸イソメラーゼ（Ｍ６ＰＩ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１Ｍ６ＴＬＹ７）を用いた。５ｍＭのＭｇＣｌ２、１Ｕ／ｍＬのＰＧＩ、１Ｕ／ｍＬのＭ６ＰＰ、及び１０ｍＭのＦ６Ｐを含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中、５０℃で活性を測定した。Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２濃縮器（１０，０００ ＭＷＣＯ）を用いた酵素のろ過により反応を停止させた。マンノース６－リン酸ホスファターゼ（Ｍ６ＰＰ）を用い、Ｐ６ＰＥについて説明したように、遊離リン酸の放出を検出して、生成物であるマンノース６－リン酸（Ｍ６Ｐ）を測定した。プシコースと同様にして、ＨＰＬＣによりマンノースを確認した。他のＭ６ＰＩ、例えば、配列番号９に示すアミノ酸配列を有する、Ｃａｌｄｉｔｈｒｉｘ ａｂｙｓｓｉ由来のＭ６ＰＩ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｈ１ＸＱＳ６）、配列番号１０に示すアミノ酸配列を有する、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ由来のＭ６ＰＩ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｇ２Ｑ９８２）、及び配列番号１１に示すアミノ酸配列を有する、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｃａｌｄａｒｉｕｍ由来のＭ６ＰＩ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｆ８Ｆ１Ｚ８）を用いてもよい。
配列番号１２に示すアミノ酸配列を有する、Ｔｅｐｉｄｉｍｏｎａｓ ｆｏｎｔｉｃａｌｄｉ由来のマンノース６－リン酸ホスファターゼ（Ｍ６ＰＰ）（ＵｎｉｐｒｏｔＩＤ Ａ０Ａ１Ａ６ＤＳＩ３）を用いた。５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び１０ｍＭのマンノース６－リン酸を含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中、５０℃で活性を測定した。Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２濃縮器（１０，０００ ＭＷＣＯ）を用いた酵素のろ過により反応を停止させた。Ｐ６ＰＥについて説明したように、遊離リン酸の放出を検出することによって、生成物であるマンノースを測定した。プシコースと同様にして、ＨＰＬＣによりマンノースを確認した。他のＭ６ＰＰ、例えば、配列番号１３に示すアミノ酸配列を有する、Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ由来のＭ６ＰＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１Ｍ４ＵＮ０８）、及び配列番号１４に示すアミノ酸配列を有する、Ｓｕｌｆｕｒｉｖｉｒｇａ ｃａｌｄｉｃｕｒａｌｉｉ由来のＭ６ＰＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１Ｎ６ＦＣＷ３）を用いてもよい。
配列番号１５に示すアミノ酸配列を有する、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｔｈｅｒｍｕｓ ｌｉｐｏｃａｌｉｄｕｓ由来の二官能性ホスホグルコース／ホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＧＰＭＩ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ７ＣＰＨ７）を用いた。５ｍＭのＭｇＣｌ２、１Ｕ／ｍＬのＭ６ＰＰ、及び１０ｍＭのＧ６Ｐを含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中、５０℃で活性を測定した。Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２濃縮器（１０，０００ ＭＷＣＯ）を用いた酵素のろ過により反応を停止させた。Ｍ６ＰＰを用い、Ｐ６ＰＥについて説明したように、遊離リン酸の放出を検出して、生成物であるＭ６Ｐを測定した。プシコースと同様にして、ＨＰＬＣによりマンノースを確認した。他のＰＧＰＭＩ、例えば、配列番号１６に示すアミノ酸配列を有する、Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ由来のＰＧＰＭＩ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０８５Ｌ１７０）、及び配列番号１７に示すアミノ酸配列を有する、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂｉｕｍ ｎａｒｕｇｅｎｓｅ由来のＰＧＰＭＩ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｍ１Ｅ６Ｚ３）を用いてもよい。
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ由来のガラクトース６－リン酸イソメラーゼ（Ｇａｌ６ＰＩ）（偏性二量体；それぞれ配列番号１８及び１９に示すアミノ酸配列を有するＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｐ２３４９４及びＰ２３４９５）を用いる（ｖａｎ Ｒｏｏｉｊｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ， ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｔａｇａｔｏｓｅ ６－Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｐａｔｈｗａｙ Ｇｅｎｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｌａｃｔｏｓｅ Ｏｐｅｒｏｎ ｏｆ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ Ｚａｃｔｉｓ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９１；２６６：７１７６－７１８１）。５ｍＭのＭｇＣｌ２、１Ｕ／ｍＬのフルクトース６－リン酸４－エピメラーゼ（Ｆ６ＰＥ）、１Ｕ／ｍＬのガラクトース６－リン酸ホスファターゼ（Ｇａｌ６ＰＰ）、及び１０ｍＭのフルクトース６リン酸を含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中、３７℃で活性を測定する。Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２濃縮器（１０，０００ ＭＷＣＯ）を用いた酵素のろ過により反応を停止させる。Ｇａｌ６ＰＰを用い、Ｐ６ＰＥについて説明したように、遊離リン酸の放出を検出して、生成物であるガラクトース６－リン酸（ｇａｌ６Ｐ）を測定する。プシコースと同様にして、ＨＰＬＣによりガラクトースを確認する。
配列番号２０に示すアミノ酸配列を有する、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ由来のガラクトース６－リン酸ホスファターゼ（Ｇａｌ６ＰＰ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ８Ａ２Ｆ３）を用いた。５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び１０ｍＭのガラクトース６－リン酸を含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中、５０℃で活性を測定した。Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２濃縮器（１０，０００ ＭＷＣＯ）を用いた酵素のろ過により反応を停止させた。Ｐ６ＰＥについて説明したように、遊離リン酸の放出を検出することによって、生成物であるガラクトースを測定した。プシコースと同様にして、ＨＰＬＣによりガラクトースを確認した。
配列番号２１に示すアミノ酸配列を有する、Ｈａｌｏｔｈｅｒｍｏｔｈｒｉｘ ｏｒｅｎｉｉ由来のフルクトース６－リン酸ホスファターゼ（Ｆ６ＰＰ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｂ８ＣＷＶ３）を用いた。５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び１０ｍＭのフルクトース６－リン酸を含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中、５０℃で活性を測定した。Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２濃縮器（１０，０００ ＭＷＣＯ）を用いた酵素のろ過により反応を停止させた。Ｐ６ＰＥについて説明したように、遊離リン酸の放出を検出することによって、生成物であるフルクトースを測定した。プシコースと同様にして、ＨＰＬＣによりフルクトースを確認した。
Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｇｉｄｉｓ由来のタガトース６－リン酸ホスファターゼ（Ｔ６ＰＰ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０７５ＷＢ８７）を用いた。５ｍＭのＭｇＣｌ２及び１０ｍＭのＴ６Ｐを含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中、５０℃で活性を測定した。Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２濃縮器（１０，０００ ＭＷＣＯ）を用いた酵素のろ過により反応を停止させた。Ｆ６ＰＥについて説明したように、遊離リン酸の放出を検出することによって、タガトースの生成を測定した。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ由来のプシコース６－リン酸ホスファターゼ（Ｐ６ＰＰ）（ＵＮＩＰＲＯＴ ＩＤ Ａ３ＤＣ２１）を用いた。５ｍＭのＭｇＣｌ２、８０μＭのＣｏＣｌ２、１Ｕ／ｍＬのＰ６ＰＥ、及び１０ｍＭのＦ６Ｐを含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中、５０℃で活性を測定した。Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２濃縮器（１０，０００ ＭＷＣＯ）を用いた酵素のろ過により反応を停止させた。Ｐ６ＰＥについて説明したように、遊離リン酸の放出を検出することによって、生成物であるプシコースを測定した。
以下のそれぞれの実施例で用いる酵素ユニットは、所望により反応時間を調整するために増減させてもよい。例えば、実施例９を２４時間ではなく８時間で実施したい場合、当該酵素の単位を約３倍に増加させることとなる。逆に、実施例９を２４時間ではなく４８時間で実施したい場合には、当該酵素ユニットを約１／２に減少させることができる。これらの実施例は、酵素ユニットの量を使用して、一定の生産性を維持しながら反応時間を増減させる方法を例示する。
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実施例１
デンプンからのフルクトース６－リン酸の酵素的生合成の技術的実現可能性を検証するために、３種の酵素、すなわち、Ｔ． ｍａｒｉｔｉｍａ由来のα－グルカンホスホリラーゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｇ４ＦＥＨ８）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来のホスホグルコムターゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ６８ＢＪ６）、及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ由来のホスホグルコイソメラーゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ３ＤＢＸ９）を組み換えにより発現させた。上記組換えタンパク質をＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）中で過剰発現させ、上述のようにして精製した。
１０ｇ／Ｌの可溶性デンプン、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＺｎＣｌ２、０．０１ＵのαＧＰ、０．０１ＵのＰＧＭ、及び０．０１ＵのＰＧＩを含有する０．２０ｍＬの反応混合物を、５０℃で２４時間インキュベートした。Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２濃縮器（１０，０００ ＭＷＣＯ）を用いた酵素のろ過により反応を停止させた。フルクトース６－リン酸キナーゼ（Ｆ６ＰＫ）／ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＫ）／乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤ）共役酵素アッセイを用いて、生成物であるフルクトース６－リン酸（Ｆ６Ｐ）を測定し、該測定においては、上記に説明したように、３４０ｎｍの吸光度の減少がＦ６Ｐの生成を示す。２４時間後のＦ６Ｐの最終濃度は３．６ｇ／Ｌであった。
実施例２
実施例１におけるものと（反応温度以外）同様の試験を４０～８０℃で実施した。１０ｇ／Ｌの可溶性デンプンから、４０時間の反応後に、４０℃で０．９ｇ／ＬのＦ６Ｐ、８０℃で３．６ｇ／ＬのＦ６Ｐが生成することがわかった。これらの結果は、この酵素の組み合わせに関しては、反応温度を高めるとＦ６Ｐ収率が増加するが、温度が高過ぎると一部の酵素活性が損なわれる可能性があることを示唆している。
実施例３
８０℃で、約１：１：１のαＧＰ：ＰＧＭ：ＰＧＩの酵素比によって迅速にＦ６Ｐが生成することが見出された。反応時間が十分に長かった場合には、酵素比は最終的なＦ６Ｐ濃度に大きく影響しなかったことが注目された。ただし、酵素比は反応速度及び当該システムに使用する酵素の総コストに影響を及ぼす。
実施例４
１０ｇ／Ｌのマルトデキストリン、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＺｎＣｌ２、０．０１ＵのαＧＰ、０．０１ＵのＰＧＭ、及び０．０１ＵのＰＧＩを含有する０．２０ｍＬの反応混合物を、５０℃で２４時間インキュベートした。Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２濃縮器（１０，０００ ＭＷＣＯ）を用いた酵素のろ過により反応を停止させた。フルクトース６－リン酸キナーゼ（Ｆ６ＰＫ）／ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＫ）／乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤ）共役酵素アッセイを用いて、生成物であるフルクトース６－リン酸（Ｆ６Ｐ）を測定し、該測定においては、上記に説明したように、３４０ｎｍの吸光度の減少がＦ６Ｐの生成を示す。２４時間後のＦ６Ｐの最終濃度は３．６ｇ／Ｌであった。
実施例５
ＡｖｉｃｅｌからのＦ６Ｐの製造を試験するために、Ｓｉｇｍａセルラーゼを用い、５０℃でセルロースを加水分解した。市販のセルラーゼからβ－グルコシダーゼを除去するために、１０ろ紙分解ユニット／ｍＬのセルラーゼを氷水浴中で１０ｇ／ＬのＡｖｉｃｅｌと１０分間混合した。４℃で遠心分離した後、β－グルコシダーゼを含有する上清をデカントした。エンドグルカナーゼ及びセロビオヒドロラーゼを含有するセルラーゼと結合したＡｖｉｃｅｌをクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）中に再懸濁し、５０℃で３日間加水分解した。このセルロース加水分解物を、１０ｍＭのリン酸、５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び０．５ｍＭのＺｎＣｌ２を含有する１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中で、５Ｕ／ｍＬのセロデキストリンホスホリラーゼ、５Ｕ／Ｌのセロビオースホスホリラーゼ、５Ｕ／ｍＬのαＧＰ、５Ｕ／ｍＬのＰＧＭ、及び５Ｕ／ｍＬのＰＧＩと混合した。反応を６０℃で７２時間行い、高濃度のＦ６Ｐを認めた（少量のグルコースが存在し、セロビオースは存在せず）。Ｆ６Ｐを上述の共役酵素アッセイを用いて検出した。グルコースを上述のヘキソキナーゼ／Ｇ６ＰＤＨアッセイキットを用いて検出した。
実施例６
ＡｖｉｃｅｌからのＦ６Ｐ収率を増加させるために、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ａ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｓｗｅｌｌｉｎｇ ｔｏ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ ｏ－ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ： ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｒｏｍ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ． Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００６；７：６４４－６４８に記載されるようにして、Ａｖｉｃｅｌを濃リン酸で前処理して、非晶性セルロース（ＲＡＣ）を生成させた。市販のセルラーゼからβ－グルコシダーゼを除去するために、１０ろ紙分解ユニット／ｍＬのセルラーゼを氷水浴中で１０ｇ／ＬのＲＡＣと５分間混合した。４℃で遠心分離した後、β－グルコシダーゼを含有する上清をデカントした。エンドグルカナーゼ及びセロビオヒドロラーゼを含有するセルラーゼと結合したＲＡＣをクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）中に再懸濁し、５０℃で１２時間加水分解した。このＲＡＣ加水分解物を、１０ｍＭのリン酸、５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び０．５ｍＭのＺｎＣｌ２を含有する１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中で、５Ｕ／ｍＬのセロデキストリンホスホリラーゼ、５Ｕ／Ｌのセロビオースホスホリラーゼ、５Ｕ／ｍＬのαＧＰ、５Ｕ／ｍＬのＰＧＭ、及び５Ｕ／ｍＬのＰＧＩと混合した。反応を６０℃で７２時間行った。グルコースをＦ６Ｐに転化させるための酵素は添加しなかったため、高濃度のＦ６Ｐ及びグルコースが回収された。Ｆ６Ｐを上述の共役酵素アッセイを用いて検出した。グルコースを上述のヘキソキナーゼ／Ｇ６ＰＤＨアッセイキットを用いて検出した。
実施例７
ＲＡＣからのＦ６Ｐ収率を更に増加させるために、ポリリン酸グルコキナーゼ及びポリリン酸を添加した。市販のセルラーゼからβ－グルコシダーゼを除去するために、１０ろ紙分解ユニット／ｍＬのセルラーゼを氷水浴中で１０ｇ／ＬのＲＡＣと５分間混合した。４℃で遠心分離した後、β－グルコシダーゼを含有する上清をデカントした。エンドグルカナーゼ及びセロビオヒドロラーゼを含有するセルラーゼと結合したＲＡＣをクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）中に再懸濁し、５０℃で１２時間インキュベートして加水分解させた。このＲＡＣ加水分解物を、５０ｍＭのポリリン酸、１０ｍＭのリン酸、５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び０．５ｍＭのＺｎＣｌ２を含有する１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中で、５Ｕ／ｍＬのポリリン酸グルコキナーゼ、５Ｕ／ｍＬのセロデキストリンホスホリラーゼ、５Ｕ／Ｌのセロビオースホスホリラーゼ、５Ｕ／ｍＬのαＧＰ、５Ｕ／ｍＬのＰＧＭ、及び５Ｕ／ｍＬのＰＧＩと混合した。反応を５０℃で７２時間行った。Ｆ６Ｐが高濃度で認められ、この段階で存在するグルコースは少量に過ぎなかった。Ｆ６Ｐを上述の共役酵素アッセイを用いて検出した。グルコースを上述のヘキソキナーゼ／Ｇ６ＰＤＨアッセイキットを用いて検出した。
実施例８
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の濃度範囲を判定するために、５０ｇ／Ｌのマルトデキストリン、６．２５ｍＭ、１２．５ｍＭ、２５ｍＭ、３７．５ｍＭ、または５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ＵのαＧＰ、０．１ＵのＰＧＭ、及び０．１ＵのＰＧＩを含有する０．２０ｍＬの反応混合物を５０℃で６時間インキュベートした。反応時間を短時間にして、確実に反応が完結に至らないようにしたため、効率の差異を明確に確認できる。Ｆ６Ｐの生成量を、フルクトース６－リン酸キナーゼ（Ｆ６ＰＫ）／ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＫ）／乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤ）共役酵素アッセイを用いて定量し、該測定においては、３４０ｎｍの吸光度の減少がＦ６Ｐの生成を示す。６．２５ｍＭ、１２．５ｍＭ、２５ｍＭ、３７．５ｍＭ、または５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）のいずれかを含有する反応液に対して、それぞれ４．５ｇ／Ｌ、５．１ｇ／Ｌ、５．６ｇ／Ｌ、４．８ｇ／Ｌ、または４．９ｇ／ＬのＦ６Ｐの収量が得られた（表１）。これらの結果は、これらの特定の反応条件に対しては、２５ｍＭの濃度のＰＢＳ（ｐＨ７．２）が理想的であったことを示している。ｐＨ７．２で６．２５ｍＭのＰＢＳを用いる場合であっても、リン酸のリサイクルに起因して、顕著なターンオーバーが生じることに留意することが重要である。このことは、開示するリン酸をリサイクルする方法が、工業レベルの容積生産性（例えば、２００～３００ｇ／Ｌのマルトデキストリン）においてさえ、リン酸濃度を低く保つことができることを示している。
Figure 0007140401000001
実施例９
上記カスケード反応のｐＨ範囲を判定するために、５０ｇ／Ｌのマルトデキストリン、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、または７．３）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０２ＵのαＧＰ、０．０２ＵのＰＧＭ、及び０．０２ＵのＰＧＩを含有する０．２０ｍＬの反応混合物を５０℃で１６時間インキュベートした。ユニットを少量にして、確実に反応が完結に至らないようにしたため、効率の差異を明確に確認できる。Ｆ６Ｐの生成量を実施例１２と同様にして定量した。ｐＨ６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、または７．３の、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水を含有する反応液に対して、それぞれ４．０ｇ／Ｌ、４．１ｇ／Ｌ、４．２ｇ／Ｌ、４．１ｇ／Ｌ、４．４ｇ／Ｌ、４．１ｇ／Ｌ、３．８ｇ／Ｌ、または４．０ｇ／ＬのＦ６Ｐの収量が得られた（表２）。これらの結果は、本システムは広いｐＨ範囲にわたって機能はするが、これらの特定の反応条件に対しては、６．８のｐＨが理想的であったことを示している。
Figure 0007140401000002
アロース
実施例１０
Ｆ６Ｐからのアロースの製造を検証するために、５ｍＭのＭｇＣｌ２及び５００μΜのＣｏＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中で、１０ｇ／ＬのＦ６Ｐを１Ｕ／ｍＬのＰ６ＰＥ、１Ｕ／ｍＬのＡ６ＰＩ、及び１Ｕ／ｍＬのＡ６ＰＰと混合した。この反応液を５０℃で３時間インキュベートした。Ｆ６Ｐのアロースへの転化を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｈｉ－Ｐｌｅｘ Ｈカラム及び屈折率検出器を使用したＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズ）によって確認した。上記試料及び対照を、５ｍＭのＨ２ＳＯ４中、０．６ｍＬ／分及び６５℃で測定した。
実施例１１
マルトデキストリンからのアロースの製造を検証するために、２０ｇ／Ｌのマルトデキストリン、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５００μΜのＣｏＣｌ２、０．０５ＵのαＧＰ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＰ６ＰＥ、０．０５ＵのＡ６ＰＩ、及び０．０５ＵのＡ６ＰＰを含有する０．２０ｍＬの反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートした。Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２濃縮器（１０，０００ ＭＷＣＯ）を用いた酵素のろ過により反応を停止させた。アロースを実施例１０に記載したＨＰＬＣによって確認した。
実施例１２
２００ｇ／Ｌのマルトデキストリン、１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び０．１ｇ／Ｌのイソアミラーゼを含有する反応混合物を８０℃で２４時間インキュベートした。これを用いて、２０ｇ／Ｌのイソアミラーゼ処理マルトデキストリン、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５００μΜのＣｏＣｌ２、０．０５ＵのαＧＰ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＰ６ＰＥ、０．０５ＵのＡ６ＰＩ、及び０．０５ＵのＡ６ＰＰを含有する別の反応混合物をつくり、これを５０℃で２４時間インキュベートした。アロースの生成を実施例１０の場合と同様にして確認した。
実施例１３
マルトデキストリンからのアロース収率を更に増加させるために、０．０５Ｕの４－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）を実施例１１に記載の反応液に添加した。
２０ｇ／Ｌのイソアミラーゼ処理マルトデキストリン（実施例１２を参照のこと）、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５００μΜのＣｏＣｌ２、０．０５ＵのαＧＰ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＰ６ＰＥ、０．０５ＵのＡ６ＰＩ、０．０５ＵのＡ６ＰＰ、及び０．０５Ｕの４ＧＴを含有する０．２ｍＬの反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートした。アロースの生成を実施例１０の場合と同様にして確認した。
実施例１４
マルトデキストリンからのアロース収率を更に増加させるために、０．０５Ｕのマルトースホスホリラーゼを、実施例１１に記載の反応液に添加する。
実施例１５
マルトデキストリンからのアロース収率を更に増加させるために、０．０５Ｕのポリリン酸グルコキナーゼ及び７５ｍＭのポリリン酸を実施例１１に記載の反応液に添加する。
実施例１６
フルクトースからアロースを製造するために、１０ｇ／Ｌのフルクトース、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）、７５ｍＭのポリリン酸、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５００μΜのＣｏＣｌ２、０．０５Ｕのフルクトースポリリン酸キナーゼ、０．０５ＵのＰ６ＰＥ、０．０５ＵのＡ６ＰＩ、及び０．０５ＵのＡ６ＰＰを含有する反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートする。アロースの生成量を実施例１０の場合と同様にして定量する。
実施例１７
グルコースからアロースを製造するために、１０ｇ／Ｌのグルコース、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）、７５ｍＭのポリリン酸、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５００μΜのＣｏＣｌ２、０．０５Ｕのグルコースポリリン酸キナーゼ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＰ６ＰＥ、０．０５ＵのＡ６ＰＩ、及び０．０５ＵのＡ６ＰＰを含有する反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートする。アロースの生成量を実施例１０の場合と同様にして定量する。
実施例１８
スクロースからアロースを製造するために、１０ｇ／Ｌのスクロース、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．０）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５００μΜのＣｏＣｌ２、０．０５Ｕのスクロースホスホリラーゼ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＰ６ＰＥ、０．０５ＵのＡ６ＰＩ、及び０．０５ＵのＡ６ＰＰを含有する反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートする。アロースの生成量を実施例１０の場合と同様にして定量する。
実施例１９
スクロースからのアロースの収率を更に増加させるために、７５ｍＭのポリリン酸及び０．０５Ｕのポリリン酸フルクトキナーゼを実施例１８の反応混合物に添加する。アロースの生成量を実施例１０の場合と同様にして定量する。
マンノース
実施例２０
Ｆ６Ｐからのマンノースの製造を検証するために、５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中で、１０ｇ／ＬのＦ６Ｐを１Ｕ／ｍＬのＭ６ＰＩ／ＰＧＰＭＩ、及び１Ｕ／ｍＬのＭ６ＰＰと混合した。この反応液を５０℃で３時間インキュベートした。Ｆ６Ｐのマンノースへの転化を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｈｉ－Ｐｌｅｘ Ｈカラム及び屈折率検出器を使用したＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズ）によって確認した。上記試料及び対照を、５ｍＭのＨ２ＳＯ４中、０．６ｍＬ／分及び６５℃で測定した。
実施例２１
マルトデキストリンからのマンノースの製造を検証するために、２０ｇ／Ｌのマルトデキストリン、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５ＵのαＧＰ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＭ６ＰＩ／ＰＧＰＭＩ（ＰＧＰＭＩの場合ＰＧＩは不要）、及び０．０５ＵのＭ６ＰＰを含有する０．２０ｍＬの反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートした。Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２濃縮器（１０，０００ ＭＷＣＯ）を用いた酵素のろ過により反応を停止させた。マンノースを実施例２０に記載したＨＰＬＣによって確認した。
実施例２２
２００ｇ／Ｌのマルトデキストリン、１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び０．１ｇ／Ｌのイソアミラーゼを含有する反応混合物を８０℃で２４時間インキュベートした。これを用いて、２０ｇ／Ｌのイソアミラーゼ処理マルトデキストリン、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５ＵのαＧＰ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＭ６ＰＩ／ＰＧＰＭＩ（ＰＧＰＭＩの場合ＰＧＩは不要）、及び０．０５ＵのＭ６ＰＰを含有する別の反応混合物をつくり、これを５０℃で２４時間インキュベートした。マンノースの生成を実施例２０の場合と同様にして確認した。
実施例２３
マルトデキストリンからのマンノース収率を更に増加させるために、０．０５Ｕの４－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）を実施例２１に記載の反応液に添加した。
２０ｇ／Ｌのイソアミラーゼ処理マルトデキストリン（実施例２２を参照のこと）、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５ＵのαＧＰ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＭ６ＰＩ／ＰＧＰＭＩ（ＰＧＰＭＩの場合ＰＧＩは不要）、０．０５ＵのＭ６ＰＰ、及び０．０５Ｕの４ＧＴを含有する０．２ｍＬの反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートした。マンノースの生成を実施例２０の場合と同様にして確認した。
実施例２４
マルトデキストリンからのマンノース収率を更に増加させるために、０．０５Ｕのマルトースホスホリラーゼを実施例２１に記載の反応液に添加する。
実施例２５
マルトデキストリンからのマンノース収率を更に増加させるために、０．０５Ｕのポリリン酸グルコキナーゼ及び７５ｍＭのポリリン酸を実施例２１に記載の反応液に添加する。
実施例２６
フルクトースからマンノースを製造するために、１０ｇ／Ｌのフルクトース、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）、７５ｍＭのポリリン酸、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５Ｕのフルクトースポリリン酸キナーゼ、０．０５ＵのＭ６ＰＩ／ＰＧＰＭＩ（ＰＧＰＭＩの場合ＰＧＩは不要）、及び０．０５ＵのＭ６ＰＰを含有する反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートする。マンノースの生成量を実施例２０の場合と同様にして定量する。
実施例２７
グルコースからマンノースを製造するために、１０ｇ／Ｌのグルコース、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）、７５ｍＭのポリリン酸、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５Ｕのグルコースポリリン酸キナーゼ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＭ６ＰＩ／ＰＧＰＭＩ（ＰＧＰＭＩの場合ＰＧＩは不要）、及び０．０５ＵのＭ６ＰＰを含有する反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートする。マンノースの生成量を実施例２０の場合と同様にして定量する。
実施例２８
スクロースからマンノースを製造するために、１０ｇ／Ｌのスクロース、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．０）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５Ｕのスクロースホスホリラーゼ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＭ６ＰＩ／ＰＧＰＭＩ（ＰＧＰＭＩの場合ＰＧＩは不要）、及び０．０５ＵのＭ６ＰＰを含有する反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートする。マンノースの生成量を実施例２０の場合と同様にして定量する。
実施例２９
スクロースからのマンノースの収率を更に増加させるために、７５ｍＭのポリリン酸及び０．０５Ｕのポリリン酸フルクトキナーゼを実施例２８の反応混合物に添加する。マンノースの生成量を実施例２０の場合と同様にして定量する。
ガラクトース
実施例３０
Ｆ６Ｐからのガラクトースの製造を検証するために、５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中で、１０ｇ／ＬのＦ６Ｐを１Ｕ／ｍＬのＧａｌ６ＰＩ、及び１Ｕ／ｍＬのＧａｌ６ＰＰと混合する。この反応液を３７℃で３時間インキュベートする。Ｆ６Ｐのガラクトースへの転化を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｈｉ－Ｐｌｅｘ Ｈカラム及び屈折率検出器を使用したＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズ）によって確認する。上記試料及び対照を、５ｍＭのＨ２ＳＯ４中、０．６ｍＬ／分及び６５℃で測定する。
実施例３１
マルトデキストリンからのガラクトースの製造を検証するために、２０ｇ／Ｌのマルトデキストリン、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５ＵのαＧＰ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＧａｌ６ＰＩ、及び０．０５ＵのＧａｌ６ＰＰを含有する０．２０ｍＬの反応混合物を３７℃で２４時間インキュベートする。Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２濃縮器（１０，０００ ＭＷＣＯ）を用いた酵素のろ過により反応を停止させる。ガラクトースを実施例３０に記載したＨＰＬＣによって確認する。
実施例３２
２００ｇ／Ｌのマルトデキストリン、１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び０．１ｇ／Ｌのイソアミラーゼを含有する反応混合物を８０℃で２４時間インキュベートする。これを用いて、２０ｇ／Ｌのイソアミラーゼ処理マルトデキストリン、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５ＵのαＧＰ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＧａｌ６ＰＩ、及び０．０５ＵのＧａｌ６ＰＰを含有する別の反応混合物をつくり、これを３７℃で２４時間インキュベートする。ガラクトースの生成を実施例３０の場合と同様にして確認する。
実施例３３
マルトデキストリンからのガラクトース収率を更に増加させるために、０．０５Ｕの４－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）を実施例３１に記載の反応液に添加する。
２０ｇ／Ｌのイソアミラーゼ処理マルトデキストリン（実施例１２を参照のこと）、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５ＵのαＧＰ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＧａｌ６ＰＩ、０．０５ＵのＧａｌ６ＰＰ、及び０．０５Ｕの４ＧＴを含有する０．２ｍＬの反応混合物を３７℃で２４時間インキュベートする。ガラクトースの生成を実施例３０の場合と同様にして確認する。
実施例３４
マルトデキストリンからのガラクトース収率を更に増加させるために、０．０５Ｕのマルトースホスホリラーゼを実施例３１に記載の反応液に添加する。
実施例３５
マルトデキストリンからのガラクトース収率を更に増加させるために、０．０５Ｕのポリリン酸グルコキナーゼ及び７５ｍＭのポリリン酸を実施例３１に記載の反応液に添加する。
実施例３６
フルクトースからガラクトースを製造するために、１０ｇ／Ｌのフルクトース、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）、７５ｍＭのポリリン酸、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５Ｕのフルクトースポリリン酸キナーゼ、０．０５ＵのＧａｌ６ＰＩ、及び０．０５ＵのＧａｌ６ＰＰを含有する反応混合物を３７℃で２４時間インキュベートする。ガラクトースの生成量を実施例３０の場合と同様にして定量する。
実施例３７
グルコースからガラクトースを製造するために、１０ｇ／Ｌのグルコース、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）、７５ｍＭのポリリン酸、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５Ｕのグルコースポリリン酸キナーゼ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＧａｌ６ＰＩ、及び０．０５ＵのＧａｌ６ＰＰを含有する反応混合物を３７℃で２４時間インキュベートする。ガラクトースの生成量を実施例３０の場合と同様にして定量する。
実施例３８
スクロースからガラクトースを製造するために、１０ｇ／Ｌのスクロース、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．０）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５Ｕのスクロースホスホリラーゼ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＧａｌ６ＰＩ、及び０．０５ＵのＧａｌ６ＰＰを含有する反応混合物を３７℃で２４時間インキュベートする。ガラクトースの生成量を実施例３０の場合と同様にして定量する。
実施例３９
スクロースからのガラクトースの収率を更に増加させるために、７５ｍＭのポリリン酸及び０．０５Ｕのポリリン酸フルクトキナーゼを実施例３８の反応混合物に添加する。ガラクトースの生成量を実施例３０の場合と同様にして定量する。
実施例４０
Ｇａｌ６Ｐからのガラクトースの製造を検証するために、５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中で、１０ｇ／ＬのＧａｌ６Ｐを１Ｕ／ｍＬのＧａｌ６ＰＰと混合した。この反応液を５０℃で１時間インキュベートした。Ｇａｌ６Ｐのガラクトースへの転化を遊離リン酸の検出によって確認する。遊離リン酸の放出を検出するために、０．１Ｍの酢酸亜鉛及び２ｍＭのモリブデン酸アンモニウムを含有する５００μＬの溶液（ｐＨ５）を５０μＬの反応液に添加した。この溶液を混合し、続いて１２５μｌの５％アスコルビン酸（ｐＨ５）を添加した。この溶液を混合し、次いで３０℃で２０分間インキュベートした。８５０ｎｍでの吸光度を読み取って、遊離リン酸の放出を測定した。
フルクトース
実施例４１
Ｆ６Ｐからのフルクトースの製造を検証するために、５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中で、１０ｇ／ＬのＦ６Ｐを１Ｕ／ｍＬのＦ６ＰＰと混合した。この反応液を５０℃で３時間インキュベートした。Ｆ６Ｐのフルクトースへの転化を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｈｉ－Ｐｌｅｘ Ｈカラム及び屈折率検出器を使用したＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズ）によって確認した。上記試料及び対照を、５ｍＭのＨ２ＳＯ４中、０．６ｍＬ／分及び６５℃で測定した。
実施例４２
マルトデキストリンからのフルクトースの製造を検証するために、２０ｇ／Ｌのマルトデキストリン、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５ＵのαＧＰ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、及び０．０５ＵのＦ６ＰＰを含有する０．２０ｍＬの反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートした。Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２濃縮器（１０，０００ ＭＷＣＯ）を用いた酵素のろ過により反応を停止させた。フルクトースを実施例４１に記載したＨＰＬＣによって確認した。
実施例４３
２００ｇ／Ｌのマルトデキストリン、１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び０．１ｇ／Ｌのイソアミラーゼを含有する反応混合物を８０℃で２４時間インキュベートした。これを用いて、２０ｇ／Ｌのイソアミラーゼ処理マルトデキストリン、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５ＵのαＧＰ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、及び０．０５ＵのＦ６ＰＰを含有する別の反応混合物をつくり、これを５０℃で２４時間インキュベートした。フルクトースの生成を実施例４１の場合と同様にして確認した。
実施例４４
マルトデキストリンからのフルクトース収率を更に増加させるために、０．０５Ｕの４－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）を実施例４２に記載の反応液に添加した。
２０ｇ／Ｌのイソアミラーゼ処理マルトデキストリン（実施例１２を参照のこと）、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５ＵのαＧＰ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＦ６ＰＰ、及び０．０５Ｕの４ＧＴを含有する０．２ｍＬの反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートした。フルクトースの生成を実施例４１の場合と同様にして確認した。
実施例４５
マルトデキストリンからのフルクトース収率を更に増加させるために、０．０５Ｕのマルトースホスホリラーゼを実施例４２に記載の反応液に添加する。
実施例４６
マルトデキストリンからのフルクトース収率を更に増加させるために、０．０５Ｕのポリリン酸グルコキナーゼ及び７５ｍＭのポリリン酸を実施例４２に記載の反応液に添加する。
実施例４７
グルコースからフルクトースを製造するために、１０ｇ／Ｌのグルコース、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）、７５ｍＭのポリリン酸、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５Ｕのグルコースポリリン酸キナーゼ、０．０５ＵのＰＧＩ、及び０．０５ＵのＦ６ＰＰを含有する反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートする。フルクトースの生成量を実施例４１の場合と同様にして定量する。
実施例４８
スクロースからフルクトースを製造するために、１０ｇ／Ｌのスクロース、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．０）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５Ｕのスクロースホスホリラーゼ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、及び０．０５ＵのＦ６ＰＰを含有する反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートした。フルクトースの生成量を実施例４１の場合と同様にして定量した。
アルトロース
実施例４９
Ｆ６Ｐからのアルトロースの製造を検証するために、５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中で、１０ｇ／ＬのＦ６Ｐを１Ｕ／ｍＬのＰ６ＰＥ、１Ｕ／ｍＬのアルトロース６－リン酸イソメラーゼ（Ａｌｔ６ＰＩ）、及び１Ｕ／ｍＬのアルトロース６－リン酸ホスファターゼ（Ａｌｔ６ＰＰ）と混合する。この反応液を５０℃で３時間インキュベートする。Ｆ６Ｐのアルトロースへの転化を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｈｉ－Ｐｌｅｘ Ｈカラム及び屈折率検出器を使用したＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズ）によって確認する。上記試料及び対照を、５ｍＭのＨ２ＳＯ４中、０．６ｍＬ／分及び６５℃で測定する。
実施例５０
マルトデキストリンからのアルトロースの製造を検証するために、２０ｇ／Ｌのマルトデキストリン、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５ＵのαＧＰ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＰ６ＰＥ、０．０５ＵのＡｌｔ６ＰＩ、及び０．０５ＵのＡｌｔ６ＰＰを含有する０．２０ｍＬの反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートする。Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２濃縮器（１０，０００ ＭＷＣＯ）を用いた酵素のろ過により反応を停止する。アルトロースを実施例４９に記載したＨＰＬＣによって確認する。
実施例５１
２００ｇ／Ｌのマルトデキストリン、１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び０．１ｇ／Ｌのイソアミラーゼを含有する反応混合物を８０℃で２４時間インキュベートする。これを用いて、２０ｇ／Ｌのイソアミラーゼ処理マルトデキストリン、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５ＵのαＧＰ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＰ６ＰＥ、０．０５ＵのＡｌｔ６ＰＩ、及び０．０５ＵのＡｌｔ６ＰＰを含有する別の反応混合物をつくり、これを５０℃で２４時間インキュベートする。アルトロースの生成を実施例４９の場合と同様にして確認する。
実施例５２
マルトデキストリンからのアルトロース収率を更に増加させるために、０．０５Ｕの４－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）を実施例５０に記載の反応液に添加する。
２０ｇ／Ｌのイソアミラーゼ処理マルトデキストリン（実施例５０を参照のこと）、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５ＵのαＧＰ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＰ６ＰＥ、０．０５ＵのＡｌｔ６ＰＩ、０．０５ＵのＡｌｔ６ＰＰ、及び０．０５Ｕの４ＧＴを含有する０．２ｍＬの反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートする。アルトロースの生成を実施例４９の場合と同様にして確認する。
実施例５３
マルトデキストリンからのアルトロース収率を更に増加させるために、０．０５Ｕのマルトースホスホリラーゼを実施例５０に記載の反応液に添加する。
実施例５４
マルトデキストリンからのアルトロース収率を更に増加させるために、０．０５Ｕのポリリン酸グルコキナーゼ及び７５ｍＭのポリリン酸を実施例５０に記載の反応液に添加する。
実施例５５
フルクトースからアルトロースを製造するために、１０ｇ／Ｌのフルクトース、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）、７５ｍＭのポリリン酸、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５Ｕのフルクトースポリリン酸キナーゼ、０．０５ＵのＰ６ＰＥ、０．０５ＵのＡｌｔ６ＰＩ、及び０．０５ＵのＡｌｔ６ＰＰを含有する反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートする。アルトロースの生成量を実施例４９の場合と同様にして定量する。
実施例５６
グルコースからアルトロースを製造するために、１０ｇ／Ｌのグルコース、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）、７５ｍＭのポリリン酸、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５Ｕのグルコースポリリン酸キナーゼ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＰ６ＰＥ、０．０５ＵのＡｌｔ６ＰＩ、及び０．０５ＵのＡｌｔ６ＰＰを含有する反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートする。アルトロースの生成量を実施例４９の場合と同様にして定量する。
実施例５７
スクロースからアルトロースを製造するために、１０ｇ／Ｌのスクロース、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．０）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５Ｕのスクロースホスホリラーゼ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＰ６ＰＥ、０．０５ＵのＡｌｔ６ＰＩ、及び０．０５ＵのＡｌｔ６ＰＰを含有する反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートする。アルトロースの生成量を実施例４９の場合と同様にして定量する。
実施例５８
スクロースからのアルトースの収率を更に増加させるために、７５ｍＭのポリリン酸及び０．０５Ｕのポリリン酸フルクトキナーゼを実施例５６の反応混合物に添加する。アルトースの生成量を実施例４９の場合と同様にして定量する。
タロース
実施例５９
Ｆ６Ｐからのタロースの製造を検証するために、５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中で、１０ｇ／ＬのＦ６Ｐを１Ｕ／ｍＬのＦ６ＰＥ、１Ｕ／ｍＬのタロース６－リン酸イソメラーゼ（Ｔａｌ６ＰＩ）、及び１Ｕ／ｍＬのタロース６－リン酸ホスファターゼ（Ｔａｌ６ＰＰ）と混合する。この反応液を５０℃で３時間インキュベートする。Ｆ６Ｐのタロースへの転化を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｈｉ－Ｐｌｅｘ Ｈカラム及び屈折率検出器を使用したＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズ）によって確認する。上記試料及び対照を、５ｍＭのＨ２ＳＯ４中、０．６ｍＬ／分及び６５℃で測定する。
実施例６０
マルトデキストリンからのタロースの製造を検証するために、２０ｇ／Ｌのマルトデキストリン、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５ＵのαＧＰ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＦ６ＰＥ、０．０５ＵのＴａｌ６ＰＩ、及び０．０５ＵのＴａｌ６ＰＰを含有する０．２０ｍＬの反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートする。Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２濃縮器（１０，０００ ＭＷＣＯ）を用いた酵素のろ過により反応を停止させる。タロースを実施例５９に記載したＨＰＬＣによって確認する。
実施例６１
２００ｇ／Ｌのマルトデキストリン、１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び０．１ｇ／Ｌのイソアミラーゼを含有する反応混合物を８０℃で２４時間インキュベートする。これを用いて、２０ｇ／Ｌのイソアミラーゼ処理マルトデキストリン、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５ＵのαＧＰ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＦ６ＰＥ、０．０５ＵのＴａｌ６ＰＩ、及び０．０５ＵのＴａｌ６ＰＰを含有する別の反応混合物をつくり、これを５０℃で２４時間インキュベートする。タロースの生成を実施例５９の場合と同様にして確認する。
実施例６２
マルトデキストリンからのタロース収率を更に増加させるために、０．０５Ｕの４－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）を実施例６０に記載の反応液に添加する。
２０ｇ／Ｌのイソアミラーゼ処理マルトデキストリン（実施例６０を参照のこと）、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５ＵのαＧＰ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＦ６ＰＥ、０．０５ＵのＴａｌ６ＰＩ、０．０５ＵのＴａｌ６ＰＰ、及び０．０５Ｕの４ＧＴを含有する０．２ｍＬの反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートする。タロースの生成を実施例５９の場合と同様にして確認する。
実施例６３
マルトデキストリンからのタロース収率を更に増加させるために、０．０５Ｕのマルトースホスホリラーゼを実施例５９に記載の反応液に添加する。
実施例６４
マルトデキストリンからのタロース収率を更に増加させるために、０．０５Ｕのポリリン酸グルコキナーゼ及び７５ｍＭのポリリン酸を実施例６０に記載の反応液に添加する。
実施例６５
フルクトースからタロースを製造するために、１０ｇ／Ｌのフルクトース、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）、７５ｍＭのポリリン酸、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５Ｕのフルクトースポリリン酸キナーゼ、０．０５ＵのＦ６ＰＥ、０．０５ＵのＴａｌ６ＰＩ、及び０．０５ＵのＴａｌ６ＰＰを含有する反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートする。タロースの生成量を実施例５９の場合と同様にして定量する。
実施例６６
グルコースからタロースを製造するために、１０ｇ／Ｌのグルコース、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）、７５ｍＭのポリリン酸、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５Ｕのグルコースポリリン酸キナーゼ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＦ６ＰＥ、０．０５ＵのＴａｌ６ＰＩ、及び０．０５ＵのＴａｌ６ＰＰを含有する反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートする。タロースの生成量を実施例５９の場合と同様にして定量する。
実施例６７
スクロースからタロースを製造するために、１０ｇ／Ｌのスクロース、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．０）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５Ｕのスクロースホスホリラーゼ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＦ６ＰＥ、０．０５ＵのＴａｌ６ＰＩ、及び０．０５ＵのＴａｌ６ＰＰを含有する反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートする。タロースの生成量を実施例５９の場合と同様にして定量する。
実施例６８
スクロースからのタロースの収率を更に増加させるために、７５ｍＭのポリリン酸及び０．０５Ｕのポリリン酸フルクトキナーゼを実施例６６の反応混合物に添加する。タロースの生成量を実施例５９の場合と同様にして定量する。
ソルボース
実施例６９
Ｆ６Ｐからのソルボースの製造を検証するために、５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中で、１０ｇ／ＬのＦ６Ｐを１Ｕ／ｍＬのＦ６ＰＥ、１Ｕ／ｍＬのソルボース６－リン酸３－エピメラーゼ（Ｓ６ＰＥ）、及び１Ｕ／ｍＬのソルボース６－リン酸ホスファターゼ（Ｓ６ＰＰ）と混合する。この反応液を５０℃で３時間インキュベートする。Ｆ６Ｐのソルボースへの転化を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｈｉ－Ｐｌｅｘ Ｈカラム及び屈折率検出器を使用したＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズ）によって確認する。上記試料及び対照を、５ｍＭのＨ２ＳＯ４中、０．６ｍＬ／分及び６５℃で測定する。
実施例７０
マルトデキストリンからのソルボースの製造を検証するために、２０ｇ／Ｌのマルトデキストリン、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５ＵのαＧＰ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＦ６ＰＥ、０．０５ＵのＳ６ＰＥ、及び０．０５ＵのＳ６ＰＰを含有する０．２０ｍＬの反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートする。Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２濃縮器（１０，０００ ＭＷＣＯ）を用いた酵素のろ過により反応を停止させる。ソルボースを実施例６８に記載したＨＰＬＣによって確認する。
実施例７１
２００ｇ／Ｌのマルトデキストリン、１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び０．１ｇ／Ｌのイソアミラーゼを含有する反応混合物を８０℃で２４時間インキュベートする。これを用いて、２０ｇ／Ｌのイソアミラーゼ処理マルトデキストリン、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５ＵのαＧＰ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＦ６ＰＥ、０．０５ＵのＳ６ＰＥ、及び０．０５ＵのＳ６ＰＰを含有する別の反応混合物をつくり、これを５０℃で２４時間インキュベートする。ソルボースの生成を実施例６９の場合と同様にして確認する。
実施例７２
マルトデキストリンからのソルボース収率を更に増加させるために、０．０５Ｕの４－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）を実施例７０に記載の反応液に添加する。
２０ｇ／Ｌのイソアミラーゼ処理マルトデキストリン（実施例７０を参照のこと）、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５ＵのαＧＰ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＦ６ＰＥ、０．０５ＵのＳ６ＰＥ、０．０５ＵのＳ６ＰＰ、及び０．０５Ｕの４ＧＴを含有する０．２ｍＬの反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートする。ソルボースの生成を実施例６９の場合と同様にして確認する。
実施例７３
マルトデキストリンからのソルボース収率を更に増加させるために、０．０５Ｕのマルトースホスホリラーゼを実施例７０に記載の反応液に添加する。
実施例７４
マルトデキストリンからのソルボース収率を更に増加させるために、０．０５Ｕのポリリン酸グルコキナーゼ及び７５ｍＭのポリリン酸を実施例６９に記載の反応液に添加する。
実施例７５
フルクトースからソルボースを製造するために、１０ｇ／Ｌのフルクトース、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）、７５ｍＭのポリリン酸、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５Ｕのフルクトースポリリン酸キナーゼ、０．０５ＵのＦ６ＰＥ、０．０５ＵのＳ６ＰＥ、及び０．０５ＵのＳ６ＰＰを含有する反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートする。ソルボースの生成量を実施例６９の場合と同様にして定量する。
実施例７６
グルコースからソルボースを製造するために、１０ｇ／Ｌのグルコース、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）、７５ｍＭのポリリン酸、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５Ｕのグルコースポリリン酸キナーゼ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＦ６ＰＥ、０．０５ＵのＳ６ＰＥ、及び０．０５ＵのＳ６ＰＰを含有する反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートする。ソルボースの生成量を実施例６９の場合と同様にして定量する。
実施例７７
スクロースからソルボースを製造するために、１０ｇ／Ｌのスクロース、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．０）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５Ｕのスクロースホスホリラーゼ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＦ６ＰＥ、０．０５ＵのＳ６ＰＥ、及び０．０５ＵのＳ６ＰＰを含有する反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートする。ソルボースの生成量を実施例６９の場合と同様にして定量する。
実施例７８
スクロースからのソルボースの収率を更に増加させるために、７５ｍＭのポリリン酸及び０．０５Ｕのポリリン酸フルクトキナーゼを実施例７６の反応混合物に添加する。ソルボースの生成量を実施例６９の場合と同様にして定量する。
グロース
実施例７９
Ｆ６Ｐからのグロースの製造を検証するために、５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中で、１０ｇ／ＬのＦ６Ｐを１Ｕ／ｍＬのＦ６ＰＥ、１Ｕ／ｍＬのＳ６ＰＥ、１Ｕ／ｍＬのグロース６－リン酸イソメラーゼ（Ｇｕｌ６ＰＩ）、及び１Ｕ／ｍＬのグロース６－リン酸ホスファターゼ（Ｇｕｌ６ＰＰ）と混合する。この反応液を５０℃で３時間インキュベートする。Ｆ６Ｐのグロースへの転化を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｈｉ－Ｐｌｅｘ Ｈカラム及び屈折率検出器を使用したＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズ）によって確認する。上記試料及び対照を、５ｍＭのＨ２ＳＯ４中、０．６ｍＬ／分及び６５℃で測定する。
実施例８０
マルトデキストリンからのグロースの製造を検証するために、２０ｇ／Ｌのマルトデキストリン、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５ＵのαＧＰ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＦ６ＰＥ、０．０５ＵのＳ６ＰＥ、０．０５ＵのＧｕｌ６ＰＩ、及び０．０５ＵのＧｕｌ６ＰＰを含有する０．２０ｍＬの反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートする。Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２濃縮器（１０，０００ ＭＷＣＯ）を用いた酵素のろ過により反応を停止させる。グロースを実施例７９に記載したＨＰＬＣによって確認する。
実施例８１
２００ｇ／Ｌのマルトデキストリン、１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び０．１ｇ／Ｌのイソアミラーゼを含有する反応混合物を８０℃で２４時間インキュベートする。これを用いて、２０ｇ／Ｌのイソアミラーゼ処理マルトデキストリン、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５ＵのαＧＰ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＦ６ＰＥ、０．０５ＵのＳ６ＰＥ、０．０５ＵのＧｕｌ６ＰＩ、及び０．０５ＵのＧｕｌ６ＰＰを含有する別の反応混合物をつくり、これを５０℃で２４時間インキュベートする。グロースの生成を実施例７９の場合と同様にして確認する。
実施例８２
マルトデキストリンからのグロース収率を更に増加させるために、０．０５Ｕの４－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）を実施例８０に記載の反応液に添加する。
２０ｇ／Ｌのイソアミラーゼ処理マルトデキストリン（実施例８０を参照のこと）、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５ＵのαＧＰ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＦ６ＰＥ、０．０５ＵのＳ６ＰＥ、０．０５ＵのＧｕｌ６ＰＩ、０．０５ＵのＧｕｌ６ＰＰ、及び０．０５Ｕの４ＧＴを含有する０．２ｍＬの反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートする。グロースの生成を実施例７９の場合と同様にして確認する。
実施例８３
マルトデキストリンからのグロース収率を更に増加させるために、０．０５Ｕのマルトースホスホリラーゼを実施例８０に記載の反応液に添加する。
実施例８４
マルトデキストリンからのグロース収率を更に増加させるために、０．０５Ｕのポリリン酸グルコキナーゼ及び７５ｍＭのポリリン酸を実施例８０に記載の反応液に添加する。
実施例８５
フルクトースからグロースを製造するために、１０ｇ／Ｌのフルクトース、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）、７５ｍＭのポリリン酸、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５Ｕのフルクトースポリリン酸キナーゼ、０．０５ＵのＦ６ＰＥ、０．０５ＵのＳ６ＰＥ、０．０５ＵのＧｕｌ６ＰＩ、及び０．０５ＵのＧｕｌ６ＰＰを含有する反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートする。グロースの生成量を実施例７９の場合と同様にして定量する。
実施例８６
グルコースからグロースを製造するために、１０ｇ／Ｌのグルコース、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）、７５ｍＭのポリリン酸、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５Ｕのグルコースポリリン酸キナーゼ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＦ６ＰＥ、０．０５ＵのＳ６ＰＥ、０．０５ＵのＧｕｌ６ＰＩ、及び０．０５ＵのＧｕｌ６ＰＰを含有する反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートする。グロースの生成量を実施例７９の場合と同様にして定量する。
実施例８７
スクロースからグロースを製造するために、１０ｇ／Ｌのスクロース、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．０）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５Ｕのスクロースホスホリラーゼ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＦ６ＰＥ、０．０５ＵのＳ６ＰＥ、０．０５ＵのＧｕｌ６ＰＩ、及び０．０５ＵのＧｕｌ６ＰＰを含有する反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートする。グロースの生成量を実施例７９の場合と同様にして定量する。
実施例８８
スクロースからのグロースの収率を更に増加させるために、７５ｍＭのポリリン酸及び０．０５Ｕのポリリン酸フルクトキナーゼを実施例８６の反応混合物に添加する。グロースの生成量を実施例７９の場合と同様にして定量する。
イドース
実施例８９
Ｆ６Ｐからのイドースの製造を検証するために、５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中で、１０ｇ／ＬのＦ６Ｐを１Ｕ／ｍＬのＦ６ＰＥ、１Ｕ／ｍＬのＳ６ＰＥ、１Ｕ／ｍＬのイドース６－リン酸イソメラーゼ（Ｉ６ＰＩ）、及び１Ｕ／ｍＬのイドース６－リン酸ホスファターゼ（Ｉ６ＰＰ）と混合する。この反応液を５０℃で３時間インキュベートする。Ｆ６Ｐのイドースへの転化を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｈｉ－Ｐｌｅｘ Ｈカラム及び屈折率検出器を使用したＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズ）によって確認する。上記試料及び対照を、５ｍＭのＨ２ＳＯ４中、０．６ｍＬ／分及び６５℃で測定する。
実施例９０
マルトデキストリンからのイドースの製造を検証するために、２０ｇ／Ｌのマルトデキストリン、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５ＵのαＧＰ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＦ６ＰＥ、０．０５ＵのＳ６ＰＥ、０．０５ＵのＩ６ＰＩ、及び０．０５ＵのＩ６ＰＰを含有する０．２０ｍＬの反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートする。Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２濃縮器（１０，０００ ＭＷＣＯ）を用いた酵素のろ過により反応を停止させる。イドースを実施例８９に記載したＨＰＬＣによって確認する。
実施例９１
２００ｇ／Ｌのマルトデキストリン、１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び０．１ｇ／Ｌのイソアミラーゼを含有する反応混合物を８０℃で２４時間インキュベートする。これを用いて、２０ｇ／Ｌのイソアミラーゼ処理マルトデキストリン、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５ＵのαＧＰ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＦ６ＰＥ、０．０５ＵのＳ６ＰＥ、０．０５ＵのＩ６ＰＩ、及び０．０５ＵのＩ６ＰＰを含有する別の反応混合物をつくり、これを５０℃で２４時間インキュベートする。イドースの生成を実施例８９の場合と同様にして確認する。
実施例９２
マルトデキストリンからのイドース収率を更に増加させるために、０．０５Ｕの４－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）を実施例９０に記載の反応液に添加する。
２０ｇ／Ｌのイソアミラーゼ処理マルトデキストリン（実施例９０を参照のこと）、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５ＵのαＧＰ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＦ６ＰＥ、０．０５ＵのＳ６ＰＥ、０．０５ＵのＩ６ＰＩ、０．０５ＵのＩ６ＰＰ、及び０．０５Ｕの４ＧＴを含有する０．２ｍＬの反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートする。イドースの生成を実施例８９の場合と同様にして確認する。
実施例９３
マルトデキストリンからのイドース収率を更に増加させるために、０．０５Ｕのマルトースホスホリラーゼを実施例９０に記載の反応液に添加する。
実施例９４
マルトデキストリンからのイドース収率を更に増加させるために、０．０５Ｕのポリリン酸グルコキナーゼ及び７５ｍＭのポリリン酸を実施例９０に記載の反応液に添加する。
実施例９５
フルクトースからイドースを製造するために、１０ｇ／Ｌのフルクトース、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）、７５ｍＭのポリリン酸、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５Ｕのフルクトースポリリン酸キナーゼ、０．０５ＵのＦ６ＰＥ、０．０５ＵのＳ６ＰＥ、０．０５ＵのＩ６ＰＩ、及び０．０５ＵのＩ６ＰＰを含有する反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートする。イドースの生成量を実施例８９の場合と同様にして定量する。
実施例９６
グルコースからイドースを製造するために、１０ｇ／Ｌのグルコース、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）、７５ｍＭのポリリン酸、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５Ｕのグルコースポリリン酸キナーゼ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＦ６ＰＥ、０．０５ＵのＳ６ＰＥ、０．０５ＵのＩ６ＰＩ、及び０．０５ＵのＩ６ＰＰを含有する反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートする。イドースの生成量を実施例８９の場合と同様にして定量する。
実施例９７
スクロースからイドースを製造するために、１０ｇ／Ｌのスクロース、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．０）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５Ｕのスクロースホスホリラーゼ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＦ６ＰＥ、０．０５ＵのＳ６ＰＥ、０．０５ＵのＩ６ＰＩ、及び０．０５ＵのＩ６ＰＰを含有する反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートする。イドースの生成量を実施例８９の場合と同様にして定量する。
実施例９８
スクロースからのイドースの収率を更に増加させるために、７５ｍＭのポリリン酸及び０．０５Ｕのポリリン酸フルクトキナーゼを実施例９６の反応混合物に添加する。イドースの生成量を実施例８９の場合と同様にして定量する。
タガトース
実施例９９
Ｆ６Ｐからのタガトースの製造を検証するために、５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中で、２ｇ／ＬのＦ６Ｐを１Ｕ／ｍＬのフルクトース６－リン酸エピメラーゼ（Ｆ６ＰＥ）及び１Ｕ／ｍＬのタガトース６－リン酸ホスファターゼ（Ｔ６ＰＰ）と混合した。この反応液を５０℃で１６時間インキュベートした。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｈｉ－Ｐｌｅｘ Ｈカラム及び屈折率検出器を使用したＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズ）によって、Ｆ６Ｐのタガトースへの１００％転化を確認する。上記試料を、５ｍＭのＨ２ＳＯ４中、０．６ｍＬ／分で測定した。
実施例１００
マルトデキストリンからのタガトースの製造を検証するために、２０ｇ／Ｌのマルトデキストリン、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５ＵのαＧＰ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＦ６ＰＥ、及び０．０５ＵのＴ６ＰＰを含有する０．２０ｍＬの反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートした。Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２濃縮器（１０，０００ ＭＷＣＯ）を用いた酵素のろ過により反応を停止させた。屈折率検出器及びＡｇｉｌｅｎｔ Ｈｉ－Ｐｌｅｘ Ｈカラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＨＰＬＣを用いてタガトースを検出及び定量した。移動相は５ｍＭのＨ２ＳＯ４であり、該移動相は０．６ｍＬ／分で流通させた。９．２ｇ／Ｌの収量のタガトースが得られた。これは、イソアミラーゼまたは４－グルカントランスフェラーゼなどの酵素の非存在下でのマルトデキストリンの分解の制限に起因して、理論収量の９２％に等しい。種々の濃度のタガトースの標準試料を用いて、本発明者らによる実験の収量を定量した。
実施例１０１
２００ｇ／Ｌのマルトデキストリン、１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び０．１ｇ／Ｌのイソアミラーゼを含有する反応混合物を８０℃で２４時間インキュベートした。これを用いて、２０ｇ／Ｌのイソアミラーゼ処理マルトデキストリン、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５ＵのαＧＰ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＦ６ＰＥ、及び０．０５ＵのＴ６ＰＰを含有する別の反応混合物をつくり、これを５０℃で２４時間インキュベートした。タガトースの生成量を実施例９９の場合と同様にして定量した。イソアミラーゼによるマルトデキストリンの前処理により、タガトースの収量は１６ｇ／Ｌへと増加した。これは理論収量の８０％に等しい。
実施例１０２
マルトデキストリンからのタガトース収率を更に増加させるために、０．０５Ｕの４－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）を実施例１００に記載の反応液に添加した。
２０ｇ／Ｌのイソアミラーゼ処理マルトデキストリン（実施例９を参照のこと）、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５ＵのαＧＰ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＦ６ＰＥ、０．０５ＵのＴ６ＰＰ、及び０．０５Ｕの４ＧＴを含有する０．２ｍＬの反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートした。タガトースの生成量を実施例９の場合と同様にして定量した。ＩＡ処理マルトデキストリンへの４ＧＴの添加により、タガトースの収量は１７．７ｇ／Ｌへと増加した。これは理論収量の８８．５％に等しい。
実施例１０３
５０ｇ／Ｌのイソアミラーゼ処理マルトデキストリン（実施例９９を参照のこと）、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ＵのαＧＰ、１０ＵのＰＧＭ、１０ＵのＰＧＩ、１０ＵのＦ６ＰＥ、及び１０ＵのＴ６ＰＰを含有する２０ｍＬの反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートした。タガトースの生成量を実施例８の場合と同様にして定量した。タガトースの収量は、２０ｍＬスケール且つ５０ｇ／Ｌのマルトデキストリンにおいて３７．６ｇ／Ｌであった。これは理論収量の７５％に等しい。これらの結果は、より大きな反応液量にスケールアップしても、収量の顕著な低下が生じることはないことを示している。
実施例１０４
マルトデキストリンからのタガトース収率を更に増加させるために、０．０５Ｕのマルトースホスホリラーゼを実施例１００に記載の反応液に添加する。
実施例１０５
マルトデキストリンからのタガトース収率を更に増加させるために、０．０５Ｕのポリリン酸グルコキナーゼ及び７５ｍＭのポリリン酸を実施例９９に記載の反応液に添加する。
実施例１０６
フルクトースからタガトースを製造するために、１０ｇ／Ｌのフルクトース、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）、７５ｍＭのポリリン酸、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５Ｕのフルクトースポリリン酸キナーゼ、０．０５ＵのＦ６ＰＥ、及び０．０５ＵのＴ６ＰＰを含有する反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートする。タガトースの生成量を実施例１００の場合と同様にして定量する。
実施例１０７
グルコースからタガトースを製造するために、１０ｇ／Ｌのグルコース、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）、７５ｍＭのポリリン酸、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５Ｕのグルコースポリリン酸キナーゼ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＦ６ＰＥ、及び０．０５ＵのＴ６ＰＰを含有する反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートする。タガトースの生成量を実施例１００の場合と同様にして定量する。
実施例１０８
スクロースからタガトースを製造するために、１０ｇ／Ｌのスクロース、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．０）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５Ｕのスクロースホスホリラーゼ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＦ６ＰＥ、及び０．０５ＵのＴ６ＰＰを含有する反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートする。タガトースの生成量を実施例１００の場合と同様にして定量する。
実施例１０９
スクロースからのタガトースの収率を更に増加させるために、７５ｍＭのポリリン酸及び０．０５Ｕのポリリン酸フルクトキナーゼを実施例１５の反応混合物に添加する。タガトースの生成量を実施例１００の場合と同様にして定量する。
プシコース
実施例１１０
Ｆ６Ｐからのプシコースの製造を検証するために、５ｍＭのＭｇＣｌ２及び８０μＭのＣｏＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中で、２ｇ／ＬのＦ６Ｐを１Ｕ／ｍＬのＰ６ＰＥ及び１Ｕ／ｍＬのＰ６ＰＰと混合した。この反応液を５０℃で６時間インキュベートした。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｈｉ－Ｐｌｅｘ Ｈカラム及び屈折率検出器を使用したＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズ）によって、Ｆ６Ｐのプシコースへの９９％転化を確認した。上記試料を、５ｍＭのＨ２ＳＯ４中、０．６ｍＬ／分で測定した。
実施例１１１
マルトデキストリンからのプシコースの製造を検証するために、２０ｇ／Ｌのマルトデキストリン、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、８０μＭのＣｏＣｌ２、０．０５ＵのαＧＰ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＰ６ＰＥ、及び０．０５ＵのＰ６ＰＰを含有する０．２０ｍＬの反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートする。Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２濃縮器（１０，０００ ＭＷＣＯ）を用いた酵素のろ過により反応を停止させる。屈折率検出器及びＡｇｉｌｅｎｔ Ｈｉ－Ｐｌｅｘ Ｈカラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＨＰＬＣを用いてプシコースを検出及び定量する。移動相は５ｍＭのＨ２ＳＯ４であり、該移動相は０．６ｍＬ／分で流通させる。種々の濃度のプシコースの標準試料を用いて、本発明者らによる実験の収量を定量した。
実施例１１２
２００ｇ／Ｌのマルトデキストリン、１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、８０μＭのＣｏＣｌ２、及び０．１ｇ／Ｌのイソアミラーゼを含有する反応混合物を８０℃で２４時間インキュベートする。これを用いて、２０ｇ／Ｌのイソアミラーゼ処理マルトデキストリン、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５ＵのαＧＰ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＰ６ＰＥ、及び０．０５ＵのＰ６ＰＰを含有する別の反応混合物をつくり、これを５０℃で２４時間インキュベートする。プシコースの生成量を実施例１１１の場合と同様にして定量する。
実施例１１３
２００ｇ／Ｌのマルトデキストリン、１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び１：２００希釈のＮｏｖｏｚｙｍｅｓ Ｄ６プルラナーゼを含有する反応混合物を５０℃で４時間インキュベートする。これを用いて、２０ｇ／Ｌのプルラナーゼ処理マルトデキストリン、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、８０μＭのＣｏＣｌ２、０．０５ＵのαＧＰ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＰ６ＰＥ、及び０．０５ＵのＰ６ＰＰを含有する別の反応混合物をつくり、これを５０℃で２４時間インキュベートする。プシコースの生成量を実施例１１１の場合と同様にして定量する。
実施例１１４
マルトデキストリンからのプシコース収率を更に増加させるために、０．０５Ｕの４－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）を実施例１１１に記載の反応液に添加する。
２０ｇ／Ｌのイソアミラーゼ処理マルトデキストリン（実施例９を参照のこと）、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、８０μＭのＣｏＣｌ２、０．０５ＵのαＧＰ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＰ６ＰＥ、０．０５ＵのＰ６ＰＰ、及び０．０５Ｕの４ＧＴを含有する０．２ｍＬの反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートする。プシコースの生成量を実施例１１１の場合と同様にして定量する。
実施例１１５
スケールアップを検討するために、５０ｇ／Ｌのイソアミラーゼ処理マルトデキストリン（実施例１０を参照のこと）、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、８０μＭのＣｏＣｌ２、１０ＵのαＧＰ、１０ＵのＰＧＭ、１０ＵのＰＧＩ、１０ＵのＰ６ＰＥ、及び１０ＵのＰ６ＰＰを含有する２０ｍＬの反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートする。プシコースの生成量を実施例１１１の場合と同様にして定量した。
実施例１１６
マルトデキストリンからのプシコース収率を更に増加させるために、０．０５Ｕのマルトースホスホリラーゼを実施例１１０に記載の反応液に添加する。
実施例１１７
マルトデキストリンからのプシコース収率を更に増加させるために、０．０５Ｕのポリリン酸グルコキナーゼ及び７５ｍＭのポリリン酸を実施例１１１に記載の反応液に添加する。
実施例１１８
フルクトースからプシコースを製造するために、１０ｇ／Ｌのフルクトース、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）、７５ｍＭのポリリン酸、５ｍＭのＭｇＣｌ２、８０μＭのＣｏＣｌ２、０．０５Ｕのフルクトースポリリン酸キナーゼ、０．０５ＵのＰ６ＰＥ、及び０．０５ＵのＰ６ＰＰを含有する反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートする。プシコースの生成量を実施例１１１の場合と同様にして定量する。
実施例１１９
グルコースからプシコースを製造するために、１０ｇ／Ｌのグルコース、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）、７５ｍＭのポリリン酸、５ｍＭのＭｇＣｌ２、８０μＭのＣｏＣｌ２、０．０５Ｕのグルコースポリリン酸キナーゼ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＰ６ＰＥ、及び０．０５ＵのＰ６ＰＰを含有する反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートする。プシコースの生成量を実施例１１１の場合と同様にして定量する。
実施例１２０
スクロースからプシコースを製造するために、１０ｇ／Ｌのスクロース、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．０）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、８０μＭのＣｏＣｌ２、０．０５Ｕのスクロースホスホリラーゼ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＰ６ＰＥ、及び０．０５ＵのＰ６ＰＰを含有する反応混合物を５０℃で２４時間インキュベートする。プシコースの生成量を実施例１１１の場合と同様にして定量する。
実施例１２１
スクロースからのプシコースの収率を更に増加させるために、７５ｍＭのポリリン酸及び０．０５Ｕのポリリン酸フルクトキナーゼを実施例２０の反応混合物に添加する。プシコースの生成量を実施例１１１の場合と同様にして定量する。
本発明は、実質的に本明細書に上述したならびに実施例及び図面に関する全ての実施形態ならびに変化形を包含する。本明細書には本発明の様々な実施形態が開示されるが、当業者の通常の一般知識に従って、本発明の範囲内で改変及び変更を行うことができる。
本発明に関連して、以下の内容を更に開示する。
［１］
糖からのヘキソースの製造方法であって、
１種または複数種の酵素で触媒することによってフルクトース６－リン酸（Ｆ６Ｐ）を前記ヘキソースに転化させることを含み、
前記ヘキソースが、アロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、アルトロース、タロース、ソルボース、グロース、及びイドースからなる群より選択され、
前記酵素が、イソメラーゼ、エピメラーゼ、及びヘキソース特異的ホスファターゼ、ならびにそれらの混合物からなる群より選択される
前記方法。
［２］
前記ヘキソースがアロースであり、
プシコース６－リン酸３－エピメラーゼ（Ｐ６ＰＥ）で触媒することによって前記Ｆ６Ｐをプシコース６－リン酸（Ｐ６Ｐ）に転化させることと、
アロース６－リン酸イソメラーゼ（Ａ６ＰＩ）で触媒することによって前記Ｐ６Ｐをアロース６－リン酸（Ａ６Ｐ）に転化させることと、
アロース６－リン酸ホスファターゼ（Ａ６ＰＰ）で触媒することによって前記Ａ６Ｐをアロースに転化させることと
を含む、［１］に記載の方法。
［３］
前記ヘキソースがマンノースであり、
マンノース６－リン酸イソメラーゼ（Ｍ６ＰＩ）またはホスホグルコース／ホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＧＰＭＩ）で触媒することによって前記Ｆ６Ｐをマンノース６－リン酸（Ｍ６Ｐ）に転化させることと、
マンノース６－リン酸ホスファターゼ（Ｍ６ＰＰ）で触媒することによって前記Ｍ６Ｐをマンノースに転化させることと
を含む、［１］に記載の方法。
［４］
前記ヘキソースがガラクトースであり、
フルクトース６－リン酸４－エピメラーゼ（Ｆ６ＰＥ）で触媒することによって前記Ｆ６Ｐをタガトース６－リン酸（Ｔ６Ｐ）に転化させることと、
ガラクトース６－リン酸イソメラーゼ（Ｇａｌ６ＰＩ）で触媒することによって前記Ｔ６Ｐをガラクトース６－リン酸（Ｇａｌ６Ｐ）に転化させることと、
ガラクトース６－リン酸ホスファターゼ（Ｇａｌ６ＰＰ）で触媒することによって前記Ｇａｌ６Ｐをガラクトースに転化させることと
を含む、［１］に記載の方法。
［５］
前記ヘキソースがフルクトースであり、
フルクトース６－リン酸ホスファターゼ（Ｆ６ＰＰ）で触媒することによって前記Ｆ６Ｐをフルクトースに転化させることを含む、［１］に記載の方法。
［６］
前記ヘキソースがアルトロースであり、
プシコース６－リン酸３－エピメラーゼ（Ｐ６ＰＥ）で触媒することによって前記Ｆ６Ｐをプシコース６－リン酸（Ｐ６Ｐ）に転化させることと、
アルトロース６－リン酸イソメラーゼ（Ａｌｔ６ＰＩ）で触媒することによって前記Ｐ６Ｐをアルトロース６－リン酸（Ａｌｔ６Ｐ）に転化させることと、
アルトロース６－リン酸ホスファターゼ（Ａｌｔ６ＰＰ）で触媒することによって生成した前記Ａｌｔ６Ｐをアルトロースに転化させることと
を含む、［１］に記載の方法。
［７］
前記ヘキソースがタロースであり、
フルクトース６－リン酸４－エピメラーゼ（Ｆ６ＰＥ）で触媒することによって前記Ｆ６Ｐをタガトース６－リン酸（Ｔ６Ｐ）に転化させることと、
タロース６－リン酸イソメラーゼ（Ｔａｌ６ＰＩ）で触媒することによって前記Ｔ６Ｐをタロース６－リン酸（Ｔａｌ６Ｐ）に転化させることと、
タロース６－リン酸ホスファターゼ（Ｔａｌ６ＰＰ）で触媒することによって前記Ｔａｌ６Ｐをタロースに転化させることと
を含む、［１］に記載の方法。
［８］
前記ヘキソースがソルボースであり、
フルクトース６－リン酸４－エピメラーゼ（Ｆ６ＰＥ）で触媒することによって前記Ｆ６Ｐをタガトース６－リン酸（Ｔ６Ｐ）に転化させることと、
ソルボース６－リン酸エピメラーゼ（Ｓ６ＰＥ）で触媒することによって前記Ｔ６Ｐをソルボース６－リン酸（Ｓ６Ｐ）に転化させることと、
ソルボース６－リン酸ホスファターゼ（Ｓ６ＰＰ）で触媒することによって前記Ｓ６Ｐをソルボースに転化させることと
を含む、［１］に記載の方法。
［９］
前記ヘキソースがグロースであり、
フルクトース６－リン酸４－エピメラーゼ（Ｆ６ＰＥ）で触媒することによって前記Ｆ６Ｐをタガトース６－リン酸（Ｔ６Ｐ）に転化させることと、
ソルボース６－リン酸エピメラーゼ（Ｓ６ＰＥ）で触媒することによって前記Ｔ６Ｐをソルボース６－リン酸（Ｓ６Ｐ）に転化させることと、
グロース６－リン酸イソメラーゼ（Ｇｕｌ６ＰＩ）で触媒することによって前記Ｓ６Ｐをグロース６－リン酸（Ｇｕｌ６Ｐ）に転化させることと、
グロース６リン酸ホスファターゼ（Ｇｕｌ６ＰＰ）で触媒することによって前記Ｇｕｌ６Ｐをグロースに転化させることと
を含む、［１］に記載の方法。
［１０］
前記ヘキソースがイドースであり、
フルクトース６－リン酸４－エピメラーゼ（Ｆ６ＰＥ）で触媒することによって前記Ｆ６Ｐをタガトース６－リン酸（Ｔ６Ｐ）に転化させることと、
ソルボース６－リン酸エピメラーゼ（Ｓ６ＰＥ）で触媒することによって前記Ｔ６Ｐをソルボース６－リン酸（Ｓ６Ｐ）に転化させることと、
イドース６－リン酸イソメラーゼ（Ｉ６ＰＩ）で触媒することによって前記Ｓ６Ｐをイドース６－リン酸（Ｉ６Ｐ）に転化させることと、
イドース６－リン酸ホスファターゼ（Ｉ６ＰＰ）で触媒することによって前記Ｉ６Ｐをイドースに転化させることと
を含む、［１］に記載の方法。
［１１］
グルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）を前記Ｆ６Ｐに転化させるステップを更に含み、前記ステップがホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）によって触媒される、［１］～［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］
グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）を前記Ｇ６Ｐに転化させるステップを更に含み、前記ステップがホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される、［１１］に記載の方法。
［１３］
糖を前記Ｇ１Ｐに転化させるステップを更に含み、前記ステップが少なくとも１種の酵素によって触媒され、前記糖が、デンプンまたはその誘導体、及びスクロースからなる群より選択される、［１２］に記載の方法。
［１４］
糖を前記Ｇ１Ｐに転化させる前記ステップにおける前記少なくとも１種の酵素が、α－グルカンホスホリラーゼ（αＧＰ）、マルトースホスホリラーゼ、及びスクロースホスホリラーゼ、ならびにそれらの混合物からなる群より選択される、［１３］に記載の方法。
［１５］
前記糖が、アミロース、アミロペクチン、可溶性デンプン、アミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトース、及びグルコース、ならびにそれらの混合物からなる群より選択されるデンプンまたはその誘導体である、［１３］または［１４］に記載の方法。
［１６］
デンプンを、デンプンの酵素的加水分解またはデンプンの酸加水分解によって製造されるデンプン誘導体に転化させるステップを更に含む、［１５］に記載の方法。
［１７］
４－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）が前記方法に添加される、［１５］または［１６］に記載の方法。
［１８］
前記デンプン誘導体が、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、α－アミラーゼ、またはそれらの組み合わせによって触媒されるデンプンの酵素的加水分解により製造される、［１３］～［１７］のいずれかに記載の方法。
［１９］
前記Ａ６ＰＩが、配列番号１または２との少なくとも５５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記Ａ６ＰＩが前記Ｐ６ＰのＡ６Ｐへの転化を触媒する、［２］に記載の方法。
［２０］
前記Ａ６ＰＩが、
触媒作用のためのロスマン様フォールドであって、
前記ロスマン様フォールドの第１のβストランドのＨｉｓ Ｃ末端と、
前記ロスマン様フォールドの第５のβストランドのαヘリックスＣ末端のＡｒｇ Ｃ末端と、
活性部位中のＨｉｓと、
Ｃｙｓと、
前記活性部位中のＴｈｒと、
前記活性部位近傍のＧＴＧ疎水性Ｇモチーフと、
前記活性部位近傍のＡｓｎと
を有する前記ロスマン様フォールドを含有する、［１９］に記載の方法。
［２１］
前記Ａ６ＰＰが、配列番号３～７のいずれか１との少なくとも３０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記Ａ６ＰＰが前記Ａ６Ｐのアロースへの転化を触媒する、［２］、［１９］、及び［２０］のいずれかに記載の方法。
［２２］
前記Ａ６ＰＰが、
触媒作用のためのロスマン様フォールドドメインと、
Ｃ１キャッピングドメインと、
前記ロスマン様フォールドの第１のβストランド中のＤｘＤシグネチャーと、
前記ロスマン様フォールドの第２のβストランドの末端のＴｈｒまたはＳｅｒと、
前記ロスマン様フォールドの第３のβストランドのαヘリックスＣ末端のＮ末端のＬｙｓと、
前記ロスマン様フォールドの第４のβストランドの末端のＥＤシグネチャーと
を含有する、［２１］に記載の方法。
［２３］
前記Ｍ６ＰＩが、配列番号８～１１のいずれか１との少なくとも２５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記Ｍ６ＰＩが前記Ｆ６ＰのＭ６Ｐへの転化を触媒する、［３］に記載の方法。
［２４］
前記Ｍ６ＰＩが、キュピンフォールドに類似する逆平行βストランドのコアを有する２のドメイン及びαヘリックスのみからなる第３のドメイン、ならびに２価金属カチオンを含有する、［２３］に記載の方法。
［２５］
前記ＰＧＰＭＩが、配列番号１５～１７のいずれか１との少なくとも２５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記ＰＧＰＭＩが前記Ｆ６ＰのＭ６Ｐへの転化を触媒する、［３］、［２３］、または［２４］のいずれかに記載の方法。
［２６］
前記ＰＧＰＭＩが、
２のロスマン様フォールドと、
ＧＧＳモチーフと、
ＳＹＳＧ－Ｘ－Ｔ－Ｘ－ＥＴ－疎水性モチーフと、
Ｇｌｕが存在することにより活性部位塩基プロトン移動が起こるＥＮシグネチャーと、
ＨＩＳが存在することにより触媒反応中に基質の開環／閉環が起こるＨＮシグネチャーと
を含有する、［２５］に記載の方法。
［２７］
前記Ｍ６ＰＰが、配列番号１２～１４のいずれか１との少なくとも３０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記Ｍ６ＰＰが前記Ｍ６Ｐのマンノースへの転化を触媒する、［３］及び［２３］～［２６］のいずれかに記載の方法。
［２８］
前記Ｍ６ＰＰが、
触媒作用のためのロスマン様フォールドドメインと、
Ｃ１キャッピングドメインと、
前記ロスマン様フォールドの第１のβストランド中のＤｘＤシグネチャーと、
前記ロスマン様フォールドの第２のβストランドの末端のＴｈｒまたはＳｅｒと、
前記ロスマン様フォールドの第３のβストランドのαヘリックスＣ末端のＮ末端のＬｙｓと、
前記ロスマン様フォールドの第４のβストランドの末端のＧＤｘｘｘＤシグネチャーと
を含有する、［２７］に記載の方法。
［２９］
前記Ｆ６ＰＰが、配列番号２１との少なくとも２５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記Ｆ６ＰＰが前記Ｆ６Ｐのフルクトースへの転化を触媒する、［５］に記載の方法。
［３０］
前記Ｆ６ＰＰが、
触媒作用のためのロスマン様フォールドドメインと、
Ｃ１キャッピングドメインと、
前記ロスマン様フォールドの第１のβストランド中のＤｘＤシグネチャーと、
前記ロスマン様フォールドの第２のβストランドの末端のＴｈｒまたはＳｅｒと、
前記ロスマン様フォールドの第３のβストランドのαヘリックスＣ末端のＮ末端のＬｙｓと、
前記ロスマン様フォールドの第４のβストランドの末端のＥＤシグネチャーと
を含有する、［３３］に記載の方法。
［３１］
前記Ｇａｌ６ＰＩが２のサブユニットＬａｃ Ａ及びＬａｃ Ｂの多量体であり、
前記Ｌａｃ Ａが、配列番号１８との少なくとも２５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記Ｌａｃ Ｂが、配列番号１９との少なくとも２５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記Ｇａｌ６ＰＩが前記Ｔ６ＰのＧａｌ６Ｐへの転化を触媒する、
［４］に記載の方法。
［３２］
前記Ｇａｌ６ＰＩが、ヘテロ二量体（「Ａ」及び「Ｂ」）であって、
ロスマン様αβαサンドウィッチフォールドと、
基質のリン酸基を結合させるための、「Ａ」中のＡｒｇ１３０及びＡｒｇ１３４ならびに「Ｂ」中のＨｉｓ９及びＡｒｇ３９と、
基質の開環のための「Ａ」中のＨｉｓ９６と、
高エネルギーの中間体を安定化するための、「Ａ」中のＡｓｎ９７と、
プロトン移動に関与するための、「Ｂ」中のＣｙｓ６５及びＴｈｒ６７と
を有するサブユニットからなる前記ヘテロ二量体を含有する、［３１］に記載の方法。
［３３］
前記Ｇａｌ６ＰＰが、配列番号２０との少なくとも２５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記Ｇａｌ６ＰＰが前記Ｇａｌ６Ｐのガラクトースへの転化を触媒する、
［４］、［３１］、及び［３２］のいずれかに記載の方法。
［３４］
前記Ｇａｌ６ＰＰが、
触媒作用のためのロスマン様フォールドドメインと、
Ｃ２キャッピングドメインと、
前記ロスマン様フォールドの第１のβストランド中のＤｘＤシグネチャーと、
前記ロスマン様フォールドの第２のβストランドの末端のＴｈｒまたはＳｅｒと、
前記ロスマン様フォールドの第４のβストランドの末端のＧＤｘｘｘＤシグネチャーと
を含有する、［３３］に記載の方法。
［３５］
前記ヘキソースがフルクトースであり、
前記糖がスクロースであり、
前記少なくとも１種の酵素がスクロースホスホリラーゼである、
［１４］に記載の方法。
［３６］
ＰＧＰＭＩによって触媒される前記Ｇ６ＰのＦ６Ｐへの転化を更に含み、ＰＧＰＭＩによってＦ６ＰがＭ６Ｐに転化される、［３］及び［２３］～［２８］のいずれかに記載の方法。
［３７］
プロセスステップが、約４０℃～約７０℃の範囲の温度で、約５．０～約８．０の範囲のｐＨで、及び／または約８時間～約４８時間実施される、［１］～［３６］のいずれかに記載の方法。
［３８］
プロセスステップが単一のバイオリアクターまたは直列に配置された複数のバイオリアクター中で実施される、［１］～［３７］のいずれかに記載の方法。
［３９］
プロセスステップが、ＡＴＰなし、ＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）なし、約０．１ｍＭ～約１５０ｍＭのリン酸濃度で実施され、前記リン酸がリサイクルされ、及び／または前記プロセスステップの少なくとも１がエネルギー的に有利な化学反応を含む、［１］～［３８］のいずれかに記載の方法。
［４０］
［１］～［３９］のいずれかに記載の方法により製造されたヘキソースであって、アロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、アルトロース、タロース、ソルボース、グロース、及びイドースからなる群より選択される前記ヘキソース。

Claims (16)

  1. 糖からのアロースの製造方法であって、
    プシコース６－リン酸３－エピメラーゼ（Ｐ６ＰＥ）で触媒することによってフルクトース６－リン酸（Ｆ６Ｐ）をプシコース６－リン酸（Ｐ６Ｐ）に転化させることと、
    アロース６－リン酸イソメラーゼ（Ａ６ＰＩ）で触媒することによって前記Ｐ６Ｐをアロース６－リン酸（Ａ６Ｐ）に転化させることと、
    アロース６－リン酸ホスファターゼ（Ａ６ＰＰ）で触媒することによって前記Ａ６Ｐをアロースに転化させることと
    を含む、前記方法。
  2. グルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）を前記Ｆ６Ｐに転化させるステップを更に含み、前記ステップがホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）によって触媒される、請求項１に記載の方法。
  3. グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）を前記Ｇ６Ｐに転化させるステップを更に含み、前記ステップがホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される、請求項２に記載の方法。
  4. 糖を前記Ｇ１Ｐに転化させるステップを更に含み、前記ステップが少なくとも１種の酵素によって触媒され、前記糖が、デンプンまたはその誘導体、及びスクロースからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
  5. 糖を前記Ｇ１Ｐに転化させる前記ステップにおける前記少なくとも１種の酵素が、α－グルカンホスホリラーゼ（αＧＰ）、マルトースホスホリラーゼ、及びスクロースホスホリラーゼ、ならびにそれらの混合物からなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
  6. 前記糖が、アミロース、アミロペクチン、可溶性デンプン、アミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトース、及びグルコース、ならびにそれらの混合物からなる群より選択されるデンプンまたはその誘導体である、請求項４に記載の方法。
  7. デンプンを、デンプンの酵素的加水分解またはデンプンの酸加水分解によって製造されるデンプン誘導体に転化させるステップを更に含む、請求項６に記載の方法。
  8. ４－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）が前記方法に添加される、請求項６に記載の方法。
  9. 前記デンプン誘導体が、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、α－アミラーゼ、またはそれらの組み合わせによって触媒されるデンプンの酵素的加水分解により製造される、請求項４に記載の方法。
  10. 前記Ａ６ＰＩが、配列番号１または２との少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
    前記Ａ６ＰＩが前記Ｐ６ＰのＡ６Ｐへの転化を触媒する、請求項１に記載の方法。
  11. 前記Ａ６ＰＩが、
    触媒作用のためのロスマン様フォールドであって、
    前記ロスマン様フォールドの第１のβストランドのＨｉｓ Ｃ末端と、
    前記ロスマン様フォールドの第５のβストランドのαヘリックスＣ末端のＡｒｇ Ｃ末端と、
    活性部位中のＨｉｓと、
    Ｃｙｓと、
    前記活性部位中のＴｈｒと、
    前記活性部位近傍のＧＴＧ疎水性Ｇモチーフと、
    前記活性部位近傍のＡｓｎと
    を有する前記ロスマン様フォールドを含有する、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記Ａ６ＰＰが、配列番号３～７のいずれか１との少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
    前記Ａ６ＰＰが前記Ａ６Ｐのアロースへの転化を触媒する、請求項１に記載の方法。
  13. 前記Ａ６ＰＰが、
    触媒作用のためのロスマン様フォールドドメインと、
    Ｃ１キャッピングドメインと、
    前記ロスマン様フォールドの第１のβストランド中のＤｘＤシグネチャーと、
    前記ロスマン様フォールドの第２のβストランドの末端のＴｈｒまたはＳｅｒと、
    前記ロスマン様フォールドの第３のβストランドのαヘリックスＣ末端のＮ末端のＬｙｓと、
    前記ロスマン様フォールドの第４のβストランドの末端のＥＤシグネチャーと
    を含有する、請求項１２に記載の方法。
  14. プロセスステップが、４０℃～９０℃の範囲の温度で、５．０～８．０の範囲のｐＨで、及び／または８時間～４８時間実施される、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. プロセスステップが単一のバイオリアクターまたは直列に配置された複数のバイオリアクター中で実施される、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
  16. プロセスステップが、ＡＴＰなし、ＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）なし、０．１ｍＭ～１５０ｍＭのリン酸濃度で実施され、前記リン酸がリサイクルされ、及び／または前記プロセスステップの少なくとも１がエネルギー的に有利な化学反応を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
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