WO2018105932A1 - 해조류 유래 무수갈락토오스의 생산방법 - Google Patents

해조류 유래 무수갈락토오스의 생산방법 Download PDF

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WO2018105932A1
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anhydro
agar
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김경헌
이상현
김동현
윤은주
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고려대학교 산학협력단
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    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing anhydrous galactose derived from seaweeds which improved the production yield of 3,6-anhydr-L-galactose by using microorganisms in agarose or agar acid treatment, neutralization and enzymatic hydrolysis and purification. will be.
  • the major polysaccharide of red algae is agarose, and agarose has 3,6-anhydro-L-galactose (hereinafter referred to as 'AHG') and D-galactose as alpha-1,3-bond and beta-1,4 Bonds are polymers in which alternating bonds are connected.
  • AHG is a multi-functional high value-added material with anti-cariogenic and colorectal cancer prevention functions as well as cosmetic whitening and moisturizing functions. Therefore, a technique for efficiently producing and purifying AHG from agar or agarose, which is a major carbohydrate of red algae, is very important.
  • AHG As a method of producing AHG, first, there is a method of producing AHG by hydrolyzing agarose or agar at a high temperature using a strong acid. This method is inexpensive and simple, but the disadvantage is that the monosaccharides AHG and D-galactose are decomposed into 5-hydroxymethylfurfural (5-HMF; 5-hydroxymethyl furfural) at high temperatures, resulting in lower AHG production yield. Second, there is a method of producing AHG by hydrolyzing agarose or agar at room temperature using an enzyme.
  • 5-HMF 5-hydroxymethylfurfural
  • agarose or agar is decomposed into agarose oligosaccharides (AOSs) using a weak acid such as acetic acid, and then AOSs are decomposed to neoagar through the enzymatic reaction of exo-type beta-agarase II. Produces bios (NAB; neoagarobiose).
  • AOSs agarose oligosaccharides
  • agarotriose is produced as a by-product and in order to decompose it, an additional enzyme introduction called agarolytic beta-galactosidase (ABG) is required. Thereafter, monosaccharides AHG and D-galactose can be obtained through the enzymatic reaction of alpha-neogarobiose hydrolase (NABH).
  • NABH alpha-neogarobiose hydrolase
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing 3,6-anhydro-L-galactose through anaerobic and aerobic culture of microorganisms to agarose or agar after strong acid treatment, neutralization and enzymatic hydrolysis. will be.
  • the present invention uses a strong acid of 0.1 to 5% (w / v) concentration of 80 to 140 °C using agarose or agar of 10 to 37% (w / v) as a substrate on a dry weight basis After reacting for 5 to 500 minutes in a neutralization process, the yield of 5-hydroxymethyl furfural in the reaction product containing agarose is less than 1.5% (w / w) It provides a method for producing agarose, comprising the step of obtaining a reaction product.
  • the present invention also uses a dry weight of 10 to 37% (w / v) of agarose or agar as a substrate and a strong acid at a concentration of 0.1 to 5% (w / v) and 5 to 500 minutes at 80 to 140 ° C. Performing a neutralization process after the reaction to obtain a reaction product containing agarose in which the yield of 5-hydroxymethyl furfural in the reaction product is less than 1.5% (w / w);
  • a method for producing 3,6-anhydro-L-galactose comprising culturing a microorganism having galactose metabolism under the hydrolyzate obtained in the above step, and obtaining 3,6-anhydro-L-galactose from the culture medium thereof.
  • the present invention establishes optimum conditions for producing agarose or agar with high concentration of agarose or agar through strong acid treatment and neutralization, and cultivates microorganisms using enzyme and galactose as a substrate. By obtaining AHG without going through the existing purification process separately, it is possible to reduce the AHG loss, thereby providing the effect of obtaining AHG in high yield.
  • Figure 1 shows a schematic diagram of AHG production and purification process from agarose or agar
  • A is AHG production process diagram using AHG production and microorganisms through conventional enzymatic glycosylation
  • B is AHG production of the present invention It is a process chart.
  • FIG. 2 is a graph showing the degree of liquefaction (A) and TLC analysis of the reactants after acid hydrolysis at 140 ° C. for 10 minutes by treating 0.5% (w / v) strong acid in agarose according to the AHG production process diagram of the present invention. (B) is shown.
  • Figure 3a shows the results of TLC analysis of the reaction obtained after the acid hydrolysis at 110 °C for 10 minutes by treating agarose 0.5%, 1% and 2% (w / v) phosphoric acid according to the AHG production process diagram of the present invention will be.
  • Figure 3b shows the results of GC-TOF / MS analysis of the reaction product obtained by treating the agarose 2% (w / v) phosphoric acid in the hydrochloric acid for 10 minutes at 110 °C according to the AHG production process diagram of the present invention.
  • Figure 4a shows the result of SDS-PAGE analysis of recombinant agar oligosaccharide hydrolase.
  • Figure 4b shows a TLC photograph of the reaction of the agarose and agarose after the acid treatment and neutralization process with the agar oligosaccharide hydrolase.
  • Figure 4c shows the results of GC-TOF / MS analysis of the reaction of the agarose and agarose after the acid treatment and neutralization process with the agar oligosaccharide hydrolase.
  • FIG. 5 is a TLC photograph showing the results of purifying AHG using yeast which is a GRAS microorganism for agar or agar according to the AHG production process diagram of the present invention for each yeast culture time.
  • FIG. 6 shows the timely glycosylation rate after acid hydrolysis at 90 ° C. for 1%, 2% and 3% (w / v) phosphoric acid for 20% (w / w) agar according to the AHG production process diagram of the present invention. will be.
  • Figure 7a shows the results of HPLC analysis of the reactants obtained after acid hydrolysis at 90 ° C. for 1480 (w / v) phosphoric acid in agar according to the AHG production process diagram of the present invention.
  • Figure 7b shows the results of HPLC analysis of the reaction product obtained after acid hydrolysis at 90 ° C. for 2% (w / v) phosphoric acid in agar according to the AHG production process diagram of the present invention.
  • Figure 7c shows the results of HPLC analysis of the reactants obtained after acid hydrolysis at 90 ° C. for 3% (w / v) phosphoric acid in agar according to the AHG production process diagram of the present invention.
  • the present invention uses 10 to 37% (w / v) of agarose or agar on a dry weight basis as a substrate to prepare a strong acid at a concentration of 0.1 to 5% (w / v) at 80 to 140 ° C. for 5 to 500 minutes. Performing a neutralization process after the reaction to obtain a reaction product containing agarose in which the yield of 5-hydroxymethyl furfural in the reaction product is less than 1.5% (w / w). It relates to a method for producing agarose.
  • the present invention is 10 to 37% (w / v) of agarose or agar on a dry weight basis with phosphoric acid at a concentration of 0.1 to 5% (w / v) and 5 to 500 minutes at 80 to 140 °C After reacting for a minute, a neutralization process is performed to obtain a reaction product containing agarose in which the yield of 5-hydroxymethyl furfural in the reaction product is less than 1.5% (w / w). ;
  • a method for producing 3,6-anhydro-L-galactose comprising culturing a microorganism having galactose metabolism under the hydrolyzate obtained in the above step, and obtaining 3,6-anhydro-L-galactose from the culture medium thereof.
  • the present inventors attempt to solve the problems found in the conventionally known AHG production method, first, using a strong acid in the production of AHG, but a minimum concentration of 5-HMF is established to perform agarose or agar pretreatment at a high concentration to high concentration And agarose oligosaccharides, particularly agarose, in high yield were obtained in high yield (see FIG. 1). Second, the obtained high-concentration high yield agarose and agarooligosaccharides are neutralized with strong bases, where the neutralized salts (eg, phosphates) are not removed and the next step, agarose oligosaccharide hydrolase, is buffered. Used as a solution.
  • the neutralized salts eg, phosphates
  • AHG and D-galactose are produced at high concentration by using agaro-oligosaccharide hydrolase that efficiently decomposes agarose.
  • AHG purification uses yeast, a GRAS (Generally Recognized As Safe) microorganism, which is harmless to the human body.
  • AHG and D-galactose which are enzyme products, can be purified as a carbon source during yeast culture, and AHG can be purified by selectively metabolizing galactose (see FIG. 1B).
  • This purification method does not use organic solvents that are harmful to the human body, and there is little AHG amount lost during the purification process, so that purified AHG can be obtained in high yield.
  • a strong acid of 0.1 to 5% (w / v) concentration, more specifically, 0.5 to 3% (w / v) concentration may be used.
  • concentration range it is possible to minimize the production of 5-HMF by agarose or strong acid treatment of agar, and at the same time to produce a high concentration of agarose, it is possible to produce a high yield of AHG.
  • the strong acid treatment for the agarose or agar may be a reaction with a strong acid at a concentration of 0.1 to 5% (w / v) for 5 to 500 minutes at 80 to 140 °C. More specifically, agarose may be used as a substrate to react with a strong acid at a concentration of 0.5 to 2% (w / v) for 5 to 20 minutes at 100 to 140 ° C. More specifically, agar may be used as a substrate to react with a strong acid at a concentration of 1 to 3% (w / v) at 80 to 100 ° C. for 60 to 480 minutes.
  • the strong acid may be phosphoric acid, sulfuric acid, hydrochloric acid, nitric acid, or the like. More specifically, it may be phosphoric acid.
  • Agarose oligosaccharides containing a high concentration of agarose may be produced after the strong acid treatment for the agarose or agar.
  • the agarose or agar content used in the strong acid treatment is 10 to 37% (w / v), more specifically 15 to 31% (w / v), more specifically 16.8 to 30.7% (w /) on a dry weight basis. w) can be used.
  • the liquefaction rate may be 90%, 95%, or 98% or more. If it is out of the above range, the decomposition rate of the substrate may be significantly reduced.
  • a strong base is added to the agarose or agar treated with the strong acid and neutralized to pH 5-7.
  • NaOH, KOH, Ca (OH) 2 or Ba (OH) 2 and the like can be used, but is not limited thereto.
  • the agaro oligosaccharide hydrolase is an enzyme that degrades D-galactose and 3,6-anhydro-L-galactose using agarose as a substrate, and may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. .
  • the agaroligosaccharide hydrolase can be transcribed and translated through DNA segments, ie coding genes, involved in producing a polypeptide comprising an intervening sequence between individual coding segments as well as regions before and after coding regions of the enzyme. For example, it may be transcribed and translated from, but not limited to, the sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
  • amino acid sequences having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, and at least 99% of the amino acid sequences disclosed in Include.
  • the agar oligosaccharide hydrolase is Saccharophagus ( Saccharophagus) degradans ) may be derived from 2-40 T , but is not particularly limited thereto.
  • the agar oligosaccharide hydrolase is Saccharophagus ( Saccharophagus) degradans ) can be isolated and purified from the supernatant of 2-40 T culture, and produced by strains other than Saccharophagus degradans ( Saccharophagus degradans ) 2-40 T using artificial engineering techniques or artificial chemical synthesis. Can be separated.
  • Saccharophagus degradans Saccharophagus degradans
  • E. coli can be transformed to replace the culture supernatant or supernatant of transformed E. coli, but is not particularly limited thereto. According to one embodiment, it can be obtained from E. coli or a culture thereof transformed with a recombinant vector comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
  • the reaction of the agarose and agaro oligosaccharide hydrolase may be carried out for 5 hours to 48 hours at 100 to 300 rpm conditions in a temperature range of 20 to 40 °C. More specifically, it may be carried out for 10 hours to 24 hours in the temperature range of 30 to 40 °C.
  • protein and “polypeptide” are used interchangeably herein.
  • the polypeptide has a certain proportion (eg, 80%, 85%, 90%, 95%, or 99%) of sequence identity with respect to another sequence, when the two sequences are aligned. Comparison of these means that the amino acid residues in this ratio are identical.
  • the alignment and percent homology or identity may be determined by any suitable software program known in the art, such as those described in CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (FM Ausubel et al. (Eds) 1987 Supplement 30 section 7.7.18). Can be determined using Preferred programs include the GCG Pileup program, FASTA (Pearson et al . 1988 Proc . Natl Acad .
  • BLAST BLAST Manual, Altschul et al., Natl. Cent. Biotechnol. Inf., Natl Lib. Med. (NCIB NLM NIH), Bethesda, MD, and Altschul et al. 1997 NAR 25: 3389 -3402).
  • Another preferred alignment program is ALIGN Plus (Scientific and Educational Software, PA), preferably using basic parameters.
  • TFASTA Data Searching Program available from Sequence Software Package Version 6.0 (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.).
  • the term “recombinant” means that the cell, nucleic acid, protein or vector has been modified by introduction of a heterologous nucleic acid or protein or alteration of the original nucleic acid or protein, or The cell refers to a cell derived from such a modified cell. That is, for example, a recombinant cell expresses a gene that is not found within the original (non-recombinant) form of the cell, or alternatively expresses an original gene that is abnormally expressed or not expressed at all upon expression. Expression.
  • nucleic acid encompasses single- or double-stranded DNA, RNA, and chemical variants thereof.
  • Nucleic acid and polynucleotide can be used interchangeably herein. Because the genetic code is degenerate, one or more codons can be used to encode a particular amino acid, and the invention encompasses polynucleotides encoding a particular amino acid sequence.
  • introduction of inserting a nucleic acid sequence into a cell means “transfection” or “transfection” or “transduction” and refers to the integration of the nucleic acid sequence into eukaryotic or prokaryotic cells. Mention is included, wherein the nucleic acid sequence is integrated into the cell's genome (eg, chromosome, plasmid, pigment, or mitochondrial DNA), converted to autonomic replicon, or transiently expressed.
  • the cell's genome eg, chromosome, plasmid, pigment, or mitochondrial DNA
  • agarose is hydrolyzed to D-galactose and AHG by an agaroligosaccharide hydrolase using the agarose as a substrate. If the microorganism having galactose metabolism is incubated under anaerobic or aerobic conditions, galactose is consumed in the microbial culture, and only AHG remains. Therefore, there is no need to go through the additional process of purifying AHG separately from the hydrolyzate including galactose and AHG.
  • the microbial culture medium is removed through centrifugation or filtration without the conventional purification process, and AHG remains in the remaining liquid, thereby obtaining AHG in a high yield.
  • the microorganism with galactose metabolism may be cultured in aerobic or anaerobic conditions. More preferably, it may be cultured under anaerobic conditions, and anaerobic culture conditions, such as culture medium, culture temperature, time, etc., may be carried out within the understanding of those skilled in the art, and are not particularly limited.
  • Table 1 shows the results of confirming the degree of liquefaction, agarose and 5-HMF produced according to hydrolysis conditions.
  • the solubility at 120 ° C., 10 min and 130 ° C., 5 min reaction condition at 0.5% phosphoric acid condition and 110 ° C., 5 min and 120 ° C., 5 min reaction condition at 1% phosphoric acid condition is 18.5-93.8 It did not completely hydrolyze the agarose in%. However, as acid and temperature increased, monosaccharides were over-degraded, resulting in an increase in 5-HMF production. However, as the acid concentration, temperature and reaction time increased, solubility increased and agarose production increased.
  • TLC was loaded on silica gel plates with 1 ⁇ l of enzyme reaction product and developed for 2 hours in a mobile phase mixed with n-butanol, ethanol and water in a 3: 1: 1 volume ratio (v / v / v), followed by 10% Color development was carried out using sulfuric acid and 0.2% 1,3-dihydroxynaphthalein.
  • the derivatization process for GC / TOF-MS analysis is as follows.
  • the pretreatment reaction product was centrifuged at 16,000 ⁇ g for 5 minutes and 20 ⁇ l of supernatant was then dried with a speed bag.
  • 10 ⁇ l of 4% (w / v) O-methylhydroxylamine hydrochloride in pyridine was added to the dried sample for derivatization, followed by reaction at 30 ° C. for 90 minutes, followed by 45 ⁇ l of N-methyl-N- (trimethylsilyl).
  • Trifluoroacetamide was added and reacted at 37 ° C. for 30 minutes.
  • Instrument conditions for analysis are as follows.
  • the column used for analysis was RTX-5Sil MS (30m ⁇ 0.25mm id, 25 ⁇ m film thickness, Resteck), and the column temperature was first maintained at 50 ° C. for 1 minute, and then heated to 20 ° C./min to 330 ° C. for 5 minutes. . 1 ⁇ l of sample was analyzed with a split ratio of 5.
  • HPLC analysis was performed using a KS-802 column (Shoredex) to analyze the sample at a column temperature of 80 ° C. and a flow rate of 0.5 mL / min.
  • the mobile phase used at this time is water.
  • a high DP (Degree of Polymerization) is produced in low phosphoric acid conditions, while agarose, which is DP2, is mainly produced as the acid concentration is increased.
  • agarose which is DP2
  • phosphoric acid 130 ° C., 5 min conditions
  • 2% phosphoric acid 110 ° C., 10 min and 120 ° C., 5 min conditions
  • agarose was most produced at 66.1, 67.0 and 70.0%, respectively (FIG. 3B). Under the conditions, both 5-HMF was also produced as low as 1.2%.
  • Saccharophagus degradans 2-40 T (ATCC 43961) as a template
  • the gene encoding beta-agaroligosaccharide hydrolase was obtained by PCR reaction using the following primers:
  • Reverse primer 5'-ATAGCGGCCGCGCTCCTACTCGAGACAAACTCAGCAAATGC-3 '
  • PCR reaction mixture 100 ⁇ l of PCR reaction mixture was added 250 ⁇ M of dNTP, 20 pmol of primer, 10 ⁇ m of 1.5 mM MgCl 2 , 10 ⁇ l of 10 ⁇ buffer, 100 ng of DNA template, 1 unit of pfu polymerase, and then subjected to initial denaturation at 95 ° C. for 5 minutes, followed by 95 The polymerization process was repeated 25 times at 1 ° C. for 1 minute, annealing at 55 ° C. for 30 seconds, and polymerization at 72 ° C. for 3 minutes.
  • DNA fragments obtained by the PCR reaction were digested with NdeI / NotI restriction enzyme, purified on 1% agarose gel, and ligated to pET21a plasmid digested with the same restriction enzyme to prepare pET21a-Sde_BAga, respectively.
  • Plasmids prepared above were Escherichia coli ( Esherichia) coli ) was introduced into BL21 (DE3). In order to pre-culture recombinant Escherichia coli into which agaro-oligosaccharide hydrolase gene was introduced, it was incubated at 37 ° C. for 9 hours in 10 mL LB broth containing 100 ⁇ g / mL of ampicillin in a 50 mL-conical tube. .
  • the recovered cells were dispersed in 30 mL of Tris buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.4) and cell lysis was performed by using a sonicator. Thereafter, the supernatant was recovered by centrifugation at 16,000 ⁇ g for 10 minutes at 4 ° C.
  • Recombinant enzymes contained in the recovered supernatant were purified using a histrap column (5 mL, GE health care), and then the size of each purified protein was determined using an SDS-PAGE gel (FIG. 4A). Desalting columns were used to remove the salts used for protein purification (Imidazole). The salt was removed from the recombinant protein enzyme concentration was quantified by the BCA assay method.
  • the agar oligosaccharide hydrolase reaction is as follows. After acid-hydrolyzed reactants were neutralized to pH 5-6 using 5M NaOH under the above conditions, the reaction was carried out at 37 ° C. and 200 rpm for 12 hours.
  • reaction product was analyzed by thin layer chromatography (TLC) (FIG. 4B) and GC / TOF-MS and HPLC (FIG. 4C), and TLC, GC / TOF-MS and HPLC analysis conditions of Example 1 were obtained. Conditions were used.
  • the reaction products obtained in Example 3 are AHG and D-galactose, and yeast culture was performed to remove D-galactose.
  • yeast Saccharomyces cerevisiae ) D452-2 strain was used and preculture was carried out for 24 hours at 30 °C, 200 rpm in YPD broth. After incubation, the cell pellet was centrifuged at 6,000 ⁇ g for 10 minutes, and the cell pellet was washed with Tris-HCl buffer (pH 7.4), and then centrifuged again under the same conditions to obtain cell pellets.
  • Saccharomyces cerevisiae is a carbon source of enzyme reaction products containing AHG and D-galactose in a minimum medium containing 3.35 g / L yeast nitrogen base and 0.4 g / L CSM for cultivation.
  • Cell pellets of S. cerevisiae D452-2 were inoculated. After 42 hours of incubation at 30 ° C. and 200 rpm, analysis was performed using TLC and GC-TOF / MS. As a result, all D-galactose disappeared and only AHG remained (FIG. 5). AHG yield was 33.2%. Obtained (Table 2).
  • the present invention had a significantly higher maximum substrate concentration than the existing process.
  • HPLC analysis was performed in the same manner as in Example 1 to analyze the kinds of reaction products corresponding to the above conditions.
  • the agarose concentration was 162.5 g / L at 270 minutes when the agarose concentration was 143.3 g / L and 2% phosphoric acid at 480 minutes.
  • the agarobiose concentration corresponded to 172.7 g / L at 150 minutes. This is a high yield of 64%, 73% and 77%, respectively.
  • the amount of by-product 5-HMF was produced in very small amounts at 4.4 g / L and 3.7 g / L, respectively, at 2% and 3% silver phosphate conditions.
  • the advantage of this is that by acid hydrolysis at a relatively low temperature, there is no need for an expensive high-pressure reactor, and there is an advantage that it is safer in operation.
  • the present invention can be used to prepare high yield of 3,6-anhydro-L-galactose.

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Abstract

본 발명은 해조류 유래 무수갈락토오스의 생산방법에 관한 것으로, 아가로스 또는 아가의 산 처리, 중화 및 효소적 가수분해 후 정제과정에서 미생물을 사용함으로써 3,6-안하이드-L-갈락토오스의 생산 수율을 개선한 효과를 제공한다.

Description

해조류 유래 무수갈락토오스의 생산방법
본 발명은 아가로스 또는 아가의 산 처리, 중화 및 효소적 가수분해 후 정제과정에서 미생물을 사용함으로써 3,6-안하이드-L-갈락토오스의 생산 수율을 개선한 해조류 유래 무수갈락토오스의 생산방법에 관한 것이다.
홍조류를 구성하는 주요한 다당체는 아가로스이며, 아가로스는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(이하 'AHG'라 함)와 D-갈락토오스가 알파-1,3-결합과 베타-1,4-결합이 교차적으로 번갈아 가며 연결되어 있는 중합체이다. 이 중에서도 AHG는 화장품 미백 및 보습 기능성뿐만 아니라 항충치 기능성 및 대장암 예방 기능성을 가진 복합기능성 고부가가치 소재이다. 따라서 홍조류의 주요 탄수화물인 아가 또는 아가로스로부터 AHG를 효율적으로 생산하고 정제하는 기술은 매우 중요하다.
AHG를 생산하는 방법으로, 첫째는, 강산을 이용하여 고온에서 아가로스 또는 아가를 가수분해하여 AHG를 생산하는 방법이 있다. 이 방법은 비용이 저렴하고 간단하지만 높은 온도에서 단당인 AHG와 D-갈락토오스가 5-히드록시메틸퍼퓨랄(5-HMF; 5-hydroxymethyl furfural)로 분해되어 AHG생산 수율이 저하되는 것이 단점이다. 둘째는, 효소를 이용하여 상온에서 아가로스 또는 아가를 가수분해하여 AHG를 생산하는 방법이 있다. 하지만, 이 방법은 아가로스나 아가의 낮은 용해도로 인해 고농도의 반응이 불가하여 생산되는 AHG의 농도가 매우 낮아 분리정제 비용이 증가하며 결과적으로 AHG 생산 수율이 낮다. 셋째는, 아세트산 같은 약산을 이용하여 아가로스나 아가를 아가로올리고당(AOSs)로 분해한 후 AOSs를 엑소-타입 베타-아가라아제(exo-type β-agarase Ⅱ) 효소반응을 통해 네오아가로바이오스(NAB; neoagarobiose)를 생산한다. 그러나 이때 아가로트리오스(agarotriose)가 부산물로 함께 생성이 된다는 단점이 있으며 이를 분해하기 위해서는 아가로라이틱 베타-갈락토시다아제(agarolytic β-galactosidase; ABG)라는 추가적인 효소 도입이 필요하다. 이후 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소(NABH;neoagarobiose hydrolase)의 효소반응을 통해 단당류인 AHG와 D-갈락토오스를 획득할 수 있다. 그러나 이 공정의 첫 단계인 전처리 반응 시 아세트산을 사용하게 되면 이후 중화 과정에서 다량의 염이 생성된다는 문제점이 있다. 또한, 반응을 위한 효소 생산을 위해 별도로 발효를 통해 재조합 효소를 생산해야 하기 때문에 공정이 매우 복잡하고 생산 비용이 높아져 경제성이 훼손된다. 넷째로, 낮은 농도의 중성버퍼를 사용하여 고온(170℃)에서 전처리하는 방법이 있으나 대량생산 시 고온고압 반응기가 요구된다는 문제점이 있다. 또한, 전처리 공정 중에 AHG가 5-HMF로 과분해가 되어 이것이 AHG 생산수율을 떨어뜨린다는 단점이 있다.
본 발명의 목적은 강산 처리 및 중화 과정을 거쳐 아가로스 또는 아가로부터 아가로바이오스를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 강산 처리, 중화 과정 및 효소적 가수분해를 거친 아가로스 또는 아가에 대해 미생물의 혐기 및 호기적 배양을 통해 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 건조중량 기준으로 10 내지 37%(w/v)의 아가로스 또는 아가를 기질로 사용하여 0.1 내지 5%(w/v) 농도의 강산을 80 내지 140℃에서 5분 내지 500분 동안 반응시킨 후 중화 과정을 수행하여 반응 산물 내 5-히드록시메틸퍼퓨랄(5-hydroxymethyl furfural)의 수율이 1.5%(w/w) 미만이 되는 아가로바이오스를 함유하는 반응 산물을 얻는 단계를 포함하는 아가로바이오스의 생산방법을 제공한다.
본 발명은 또한 건조중량 기준으로 10 내지 37%(w/v)의 아가로스 또는 아가를 기질로 사용하여 0.1 내지 5%(w/v) 농도의 강산과 80 내지 140℃에서 5분 내지 500분 동안 반응시킨 후 중화 과정을 수행하여 반응 산물 내 5-히드록시메틸퍼퓨랄(5-hydroxymethyl furfural)의 수율이 1.5%(w/w) 미만이 되는 아가로바이오스를 함유하는 반응 산물을 얻는 단계;
상기 반응 산물과, 아가로바이오스를 기질로 사용하는 아가로올리고당 가수분해효소(agarooligosaccharide hydrolase)를 반응시키는 단계; 및
상기 단계에서 얻은 가수분해산물 하에서 갈락토오스 대사능이 있는 미생물을 배양하고, 이의 배양액에서 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 수득하는 단계를 포함하는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 생산방법을 제공한다.
본 발명은 아가로스 또는 아가에 대해 강산 처리 및 중화 과정을 거쳐 고농도의 아가로바이오스를 생산할 수 있는 최적 조건을 확립하고, 아가로바이오스를 기질로 사용하는 효소 및 갈락토오스를 기질로 사용하는 미생물의 배양을 통해 기존의 정제과정을 별도로 거치지 않고 AHG를 수득하므로 AHG 손실을 줄일 수 있어 AHG를 고수율로 얻을 수 있는 효과를 제공한다.
도 1은 아가로스 또는 아가로부터의 AHG 생산 및 정제 공정 모식도를 도시한 것으로, (A)는 종래의 효소당화를 통한 AHG 생산 및 미생물을 이용한 AHG 정제 공정도이고, (B)는 본 발명의 AHG 생산 공정도이다.
도 2는 본 발명의 AHG 생산 공정도에 따라 아가로스에 0.5%(w/v) 강산을 처리하여 140℃에서 10분 동안 산 가수분해한 후 액화정도(A)를 나타낸 그래프와 반응물의 TLC 분석 결과(B)를 나타낸 것이다.
도 3a는 본 발명의 AHG 생산 공정도에 따라 아가로스에 0.5%, 1% 및 2%(w/v) 인산을 처리하여 110℃에서 10분 동안 산 가수분해한 후 얻은 반응물의 TLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3b는 본 발명의 AHG 생산 공정도에 따라 아가로스에 2%(w/v) 인산을 처리하여 110℃에서 10분 동안 산 가수분해한 후 얻은 반응물의 GC-TOF/MS 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4a는 재조합 아가로올리고당 가수분해효소의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4b는 산 처리 및 중화 과정을 거친 아가 및 아가로스를 상기 아가로올리고당 가수분해효소와 반응시킨 반응물의 TLC 사진도를 나타낸 것이다.
도 4c는 산 처리 및 중화 과정을 거친 아가 및 아가로스를 상기 아가로올리고당 가수분해효소와 반응시킨 반응물의 GC-TOF/MS 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 AHG 생산 공정도에 따라 아가 또는 아가에 대해 GRAS 미생물인 효모를 이용하여 AHG를 정제한 결과를 효모 배양 시간별로 확인한 TLC 사진도를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 AHG 생산 공정도에 따라 아가 20%(w/w)에 대하여 인산 1%, 2% 및 3%(w/v) 농도로 90℃에서 산 가수분해한 후 시간별 당화율을 나타낸 것이다.
도 7a는 본 발명의 AHG 생산 공정도에 따라 아가에 1%(w/v) 인산을 처리하여 90℃에서 480분 동안 산 가수분해한 후 얻은 반응물의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7b는 본 발명의 AHG 생산 공정도에 따라 아가에 2%(w/v) 인산을 처리하여 90℃에서 480분 동안 산 가수분해한 후 얻은 반응물의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7c는 본 발명의 AHG 생산 공정도에 따라 아가에 3%(w/v) 인산을 처리하여 90℃에서 480분 동안 산 가수분해한 후 얻은 반응물의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 건조중량 기준으로 10 내지 37%(w/v)의 아가로스 또는 아가를 기질로 사용하여 0.1 내지 5%(w/v) 농도의 강산을 80 내지 140℃에서 5분 내지 500분 동안 반응시킨 후 중화 과정을 수행하여 반응 산물 내 5-히드록시메틸퍼퓨랄(5-hydroxymethyl furfural)의 수율이 1.5%(w/w) 미만이 되는 아가로바이오스를 함유하는 반응 산물을 얻는 단계를 포함하는 아가로바이오스의 생산방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 건조중량 기준으로 10 내지 37%(w/v)의 아가로스 또는 아가를 기질로 사용하여 0.1 내지 5%(w/v) 농도의 인산과 80 내지 140℃에서 5분 내지 500분 동안 반응시킨 후 중화 과정을 수행하여 반응 산물 내 5-히드록시메틸퍼퓨랄(5-hydroxymethyl furfural)의 수율이 1.5%(w/w) 미만이 되는 아가로바이오스를 함유하는 반응 산물을 얻는 단계;
상기 반응 산물과, 아가로바이오스를 기질로 사용하는 아가로올리고당 가수분해효소(agarooligosaccharide hydrolase)를 반응시키는 단계; 및
상기 단계에서 얻은 가수분해산물 하에서 갈락토오스 대사능이 있는 미생물을 배양하고, 이의 배양액에서 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 수득하는 단계를 포함하는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 생산방법을 제공한다.
본 발명자들은 종래에 알려진 AHG 생산방법에서 발견되는 문제점을 해결하고자, 첫째, AHG 생산 시 강산을 사용하되 5-HMF가 최소로 생산되는 조건을 확립하여 고농도로 아가로스 또는 아가 전처리 반응을 수행해 높은 농도와 높은 수율로 아가로올리고당, 특히 아가로바이오스를 고수율로 획득하였다(도 1 참조). 둘째, 수득한 고농도 고수율의 아가로바이오스 및 아가로올리고당은 강염기로 중화하고, 이때 중화되어 생성된 염(예를 들어, 인산염)은 제거하지 않고 다음 단계인 아가로올리고당 가수분해효소 반응의 완충용액으로 이용된다. 셋째, 아가로바이오스를 효율적으로 분해하는 아가로올리고당 가수분해효소를 이용하여 고농도로 AHG와 D-갈락토오스를 생산한다. 넷째, AHG 정제 시 인체에 무해한 GRAS(Generally Recognized As Safe) 미생물인 효모를 사용한다. 혐기 또는 호기적 조건에서 효모 배양 시 탄소원으로 효소반응 산물인 AHG와 D-갈락토오스를 공급해주며 이 중에서 갈락토오스만을 선택적으로 대사하게 함으로써 AHG를 정제할 수 있다(도 1B 참조). 이 정제방법은 인체에 유해한 유기용매를 사용하지 않으며, 정제과정 중에 손실되는 AHG 양이 거의 없으므로 정제된 AHG를 고수율로 획득할 수 있다는 장점이 있다.
상기 아가로스 또는 아가의 강산 처리 시 0.1 내지 5%(w/v) 농도, 더 구체적으로, 0.5 내지 3%(w/v) 농도의 강산을 사용할 수 있다. 상기 농도의 범위인 경우, 아가로스 또는 아가의 강산 처리에 의한 5-HMF의 생산을 최소화할 수 있고, 동시에 고농도의 아가로바이오스를 생산하여 고수율의 AHG의 생산이 가능하다.
상기 아가로스 또는 아가에 대한 강산 처리는 0.1 내지 5%(w/v) 농도의 강산과 80 내지 140℃에서 5분 내지 500분 동안 반응시키는 것일 수 있다. 더 구체적으로, 아가로스를 기질로 사용하여 0.5 내지 2%(w/v) 농도의 강산과 100 내지 140℃에서 5분 내지 20분 동안 반응시키는 것일 수 있다. 더 구체적으로, 아가를 기질로 사용하여 1 내지 3%(w/v) 농도의 강산과 80 내지 100℃에서 60분 내지 480분 동안 반응시키는 것일 수 있다.
상기 강산은 인산, 황산, 염산 또는 질산 등일 수 있다. 보다 구체적으로, 인산일 수 있다.
상기 아가로스 또는 아가에 대한 강산 처리 후 고농도의 아가로바이오스를 함유하는 아가로올리고당이 생산될 수 있다.
강산 처리에 사용되는 상기 아가로스 또는 아가의 함량은 건조중량 기준으로 10 내지 37%(w/v), 더 구체적으로 15 내지 31%(w/v), 보다 구체적으로 16.8 내지 30.7%(w/w)으로 사용될 수 있다. 상기 범위 내일 경우 90%, 95%, 또는 98% 이상의 액화율을 나타낼 수 있다. 상기 범위를 벗어나는 경우 기질의 분해율이 현저히 저하될 수 있다.
상기에서 강산 처리된 아가로스 또는 아가에 대해 강염기를 부가하여 pH 5 내지 7이 되도록 중화한다.
상기 강염기로, NaOH, KOH, Ca(OH)2 또는 Ba(OH)2 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한하지는 않는다.
상기 아가로올리고당 가수분해효소는 기질로 아가로바이오스를 사용하여 D-갈락토오스와 3,6-안하이드로-L-갈락토오스로 분해하는 효소로, SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 아가로올리고당 가수분해효소는 효소의 코딩 영역 전 및 후의 영역뿐만 아니라 개별 코딩 분절 사이의 개재 서열이 포함된 폴리펩타이드를 생산하는데 연관된 DNA 분절, 즉 코딩 유전자를 통해 전사 및 번역될 수 있다. 예컨대, SEQ ID NO: 2에 기재된 서열로부터 전사 및 번역될 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 효소의 하나 이상의 치환, 결손, 전위, 첨가 등의 변이 단백질로서 상기 아가로바이오스의 가수분해 활성을 가지는 단백질도 본 발명의 효소의 권리범위에 포함되며, 바람직하게는 SEQ ID NO: 1에 개시된 아미노산 서열과 서열 동일성이 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 및 99% 이상인 아미노산 서열을 포함한다.
상기 아가로올리고당 가수분해효소는 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans) 2-40T에서 유래한 것일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 아가로올리고당 가수분해효소는 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans) 2-40T 배양물의 상등액으로부터 분리 및 정제할 수 있으며, 유전공학적 재조합 기술을 이용하여 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans) 2-40T 이외 균주 또는 인공적인 화학적 합성법 등에 의하여 생산 및 분리할 수 있다. 재조합 기술을 이용하는 경우, 대장균에 형질전환시켜 형질전환된 대장균의 배양물 상등액 또는 상청액을 대체하여 이용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다. 일 구체예에 따르면, SEQ ID NO: 2에 기재된 염기서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 대장균 또는 이의 배양물로부터 수득될 수 있다.
상기 아가로바이오스와 아가로올리고당 가수분해효소의 반응은 20 내지 40℃의 온도 범위에서 100 내지 300 rpm 조건으로 5시간 내지 48시간 동안 실시할 수 있다. 보다 구체적으로 30 내지 40℃의 온도 범위에서 10시간 내지 24시간 동안 실시할 수 있다.
본 명세서에서 "단백질" 및 "폴리펩타이드"는 본원에서 상호 교환 가능하게 사용된다.
본 발명에서 폴리펩타이드가 또 다른 서열에 대하여 특정 비율(예컨대, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%)의 서열 동일성을 가진다는 것은, 상기 두 서열을 정렬시킬 때, 상기 서열들의 비교시 상기 비율의 아미노산 잔기가 동일함을 의미한다. 상기 정렬 및 백분율 상동성 또는 동일성은, 당업계에 공지된 임의의 적당한 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 문헌[CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel 등 (eds) 1987 Supplement 30 section 7.7.18)]에 기재된 것들을 사용하여 결정할 수 있다. 바람직한 프로그램으로는, GCG Pileup 프로그램, FASTA(Pearson 등 1988 Proc . Natl Acad . Sci USA 85:2444-2448), 및 BLAST(BLAST Manual, Altschul 등, Natl. Cent. Biotechnol. Inf., Natl Lib. Med.(NCIB NLM NIH), Bethesda, MD, 및 Altschul 등 1997 NAR 25:3389-3402)이 있다. 또 다른 바람직한 정렬 프로그램은 ALIGN Plus(Scientific and Educational Software, PA)로서, 바람직하게는 기본 매개변수를 사용하는 것이다. 사용 가능한 또 다른 서열 소프트웨어 프로그램은 Sequence Software Package Version 6.0(Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI)에서 이용 가능한 TFASTA Data Searching Program 이다.
본 발명에서 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터와 관련하여 사용될 때 용어 "재조합"은, 상기 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종 핵산 또는 단백질의 도입 또는 본래적 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 변형되었거나, 또는 상기 세포가 이렇게 변형된 세포로부터 유래한 것을 가리킨다. 즉, 예를 들어, 재조합 세포는 상기 세포의 본래적 (비(非)재조합) 형태 내에서는 발견되지 않는 유전자를 발현하거나 또는, 다르게는 발현 시 비정상적으로 발현되거나 또는 전혀 발현되지 않는 본래적 유전자를 발현한다.
본 명세서에서 "핵산"은 단일가닥 또는 이중가닥의 DNA, RNA, 및 이들의 화학적 변형체를 포괄한다. "핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 본원에서 상호교환 가능하게 사용될 수 있다. 유전 암호가 축퇴되어 있기 때문에, 특정 아미노산을 인코딩하기 위해서 하나 이상의 코돈을 사용할 수 있으며, 본 발명은 특정 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포괄한다.
핵산 서열을 세포 내로 삽입하는 용어 "도입"은 "트랜스펙션(transfection)", 또는 "형질전환" 또는 "형질도입(transduction)"을 의미하며, 핵산 서열의 진핵 또는 원핵 세포 내로의 통합에 대한 언급이 포함되고, 이때 상기 핵산 서열은 세포의 게놈 (예컨대, 염색체, 플라스미드, 색소체, 또는 미토콘드리아 DNA) 내로 통합되어, 자율 레플리콘으로 전환되거나, 또는 일시적으로 발현된다.
본 발명의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 생산방법에 있어서, 상기 아가로바이오스를 기질로 사용하는 아가로올리고당 가수분해효소에 의해 아가로바이오스는 D-갈락토오스와 AHG로 가수분해되고, 여기에 갈락토오스 대사능이 있는 미생물을 혐기 또는 호기 조건에서 배양하는 경우 미생물 배양액에는 갈락토오스가 소비되고, AHG만 남아있게 된다. 따라서, 갈락토오스와 AHG를 포함하는 가수분해산물로부터 AHG를 별도로 정제하는 추가 과정을 거칠 필요가 없는 것이다.
상기 갈락토오스 대사능이 있는 미생물은 락토바실러스 카제이(L. casei) 락토바실러스 애시도필러스(L. acidophilus), 락토바실러스 불가리쿠스(L. bulgaricus), 비피도박테리움 롱굼(B. longum), 비피도박테리움 비피둠(B. bifidum), 액티레귤라리스(Actiregularis) 등의 락토바실러스 및 비피도박테리움을 포함하는 유산균; 바실러스; 스트렙토마이세스; 코리네박테리움; 자이모모나스 모빌리스(Z. mobilis) 등의 자이모모나스; 대장균; 또는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 피키아 파스토리스(P. pastoris) 등의 효모 중 어느 하나일 수 있다. 이들은 앞서 언급한 인체에 무해한 GRAS 미생물로, 갈락토오스를 대사하므로 미생물 배양액에는 미생물과 AHG만 남게 된다.
따라서, 기존의 정제과정 없이 상기의 미생물 배양액을 원심분리 또는 여과 등을 통해 미생물 또는 세포 찌꺼기들을 제거하고 남은 액체 내에는 AHG가 남게 되어 고수율로 AHG를 얻을 수 있다.
상기 갈락토오스 대사능이 있는 미생물은 호기 또는 혐기 조건에서 배양될 수 있다. 보다 바람직하게는, 혐기 조건에서 배양될 수 있으며, 혐기적 배양 조건, 예를 들어, 배양 배지, 배양 온도, 시간 등은 당업자의 이해 범주 내에서 수행될 수 있어 특별히 제한하지는 않는다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> 산 가수분해 조건 확립
강산을 이용하여 아가로스 또는 아가를 가수분해할 경우 AHG 또는 D-갈락토오스가 과분해 되어 5-HMF로 전환된다. 따라서 강산인 인산을 희석한 묽은 인산을 사용하여 마이크로웨이브 다이제스트 시스템(microwave digestion system)에서 산 가수분해를 수행하였다.
묽은 인산의 가수분해 효과를 알아보기 위해, 먼저, 기질 투입량 최적화를 실시하였다. 16.8, 23.8, 30.7 및 36.8%(w/v)에 해당하는 아가로스 기질을 0.5%(w/v) 인산을 이용하여 140℃, 10분 동안 산 가수분해시켰다. 이때, 사용한 아가로스는 건조중량 기준이다. 액화정도(liquefaction)는 처음 투입된 아가로스 무게(g)에서 산 가수분해 후, 12,000×g, 4℃, 30분간 원심 분리한 침천물을 105℃, 12시간 건조시킨 양(g)을 뺀 다음, 처음 투입된 아가로스로 나눈 백분율로 나타냈다.
그 결과, 도 2A와 같이 16.8-30.7% 기질 투입 시 98% 이상 액화되었지만, 36.8% 기질 투입 조건에서는 액화 정도가 5%로 현저하게 감소하였다. 이는 TLC를 측정한 도 2B에서 볼 수 있듯이 36.8% 기질 투입 조건에서는 아가로스가 제대로 분해되지 않았다. 공정에서 고농도의 기질을 투입하는 것은 최종 산물인 AHG를 최대한 고농도로 생산할 수 있기 때문에 매우 중요하다. 또한, 물, 에너지 및 반응기 크기를 줄일 수 있어 공정비용을 줄일 수 있다. 따라서 가장 높은 기질 투입량인 30.7%을 선정하여 추후 산 가수분해 조건을 확립하였다.
산 가수분해로 효과적인 아가로올리고당, 특히 아가로바이오스를 생산하기 위해, 0.5, 1, 2%(w/v) 인산에 대하여 110, 120, 130, 140℃의 반응온도에서 각각 5분 또는 10분간 가수분해시켰다.
표 1은 가수분해 조건에 따른 액화도, 아가로바이오스 및 5-HMF 생성량을 확인한 결과이다.
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표 1에 나타난 바와 같이, 0.5% 인산 조건에서 120℃, 10분 및 130℃, 5분 반응 조건과 1% 인산 조건에서 110℃, 5분 및 120℃, 5분 반응 조건에서 용해도가 18.5 - 93.8%으로 완전히 아가로스를 가수분해시키지 못하였다. 그러나 산과 온도조건이 높아짐에 따라 단당이 과분해되어 5-HMF 생성량 역시 증가하였다. 하지만, 산 농도, 온도 및 반응시간이 증가함에 따라 용해도가 증가하고 아가로바이오스 생성량도 증가하였다.
위 조건에 해당하는 반응 산물들의 종류를 분석하기 위해 TLC, GC/TOF-MS와 HPLC 분석을 실시하였다.
TLC는 실리카 겔 플레이트에 1㎕의 효소 반응산물을 로딩하고 n-부탄올, 에탄올과 물을 3:1:1의 볼륨비율(v/v/v)로 섞은 이동상에 2시간 동안 전개시킨 뒤 10% 황산과 0.2%의 1,3-디하이드록시나프탈레인을 사용하여 발색시켰다.
GC/TOF-MS 분석을 위한 유도체화 과정은 다음과 같다. 전 처리 반응 산물을 16,000×g에서 5분간 원심분리한 후 20㎕의 상등액을 스피드 백으로 건조시켰다. 유도체화를 위하여 건조시킨 샘플에 10㎕의 4%(w/v) 농도의 O-methylhydroxylamine hydrochloride in pyridine을 넣고 30℃에서 90분간 반응을 시킨 후, 45㎕의 N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide를 넣고 37℃에서 30분간 반응을 시켰다. 분석을 위한 기기 조건은 다음과 같다. 분석 시 사용한 컬럼은 RTX-5Sil MS(30m×0.25mm i.d., 25 μm film thickness, Resteck) 이며 컬럼 온도는 먼저 50℃에서 1분간 유지하고 330℃까지 20℃/min으로 승온시킨 후 5분간 유지하였다. 1㎕의 샘플을 5의 split ratio로 분석하였다.
HPLC 분석은 KS-802컬럼(쇼덱스)을 사용하여 컬럼온도 80℃ 조건 및 0.5 mL/min의 유속으로 샘플을 분석하였다. 이때 사용한 이동상은 물이다.
도 3a와 표 1에서 볼 수 있듯이 낮은 농도의 인산 조건에서는 높은 DP(Degree of Polymerization: 중합도)가 많이 생성되는 반면, 산 농도를 증가할수록 DP2인 아가로바이오스가 주로 생성되는 것을 확인하였으며, 그 중 1% 인산, 130℃, 5분 조건, 2% 인산, 110℃, 10분 및 120℃, 5분 조건에서 아가로바이오스가 각각 66.1, 67.0 및 70.0%로 가장 많이 생성되었고(도 3b), 이 조건에서 5-HMF 역시 둘 다 1.2%로 적게 생성되었다.
<실시예 2> 아가로올리고당 가수분해효소(agarooligosaccharide hydrolase) 클로닝, 발현 및 정제
사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans) 2-40T(ATCC 43961)을 주형으로 하기 프라이머를 사용하여 베타-아가로올리고당 가수분해효소를 코딩하는 유전자를 PCR 반응을 통해 수득하였다:
정방향 프라이머: 5'-ATACATATGAATAGACTTACACTACCGCCTTCTTCTCGT-3';
역방향 프라이머: 5'-ATAGCGGCCGCGCTCCTACTCGAGACAAACTCAGCAAATGC-3'
PCR 반응 혼합물 100㎕는 dNTP 250μM, 프라이머를 각각 20pmol, 1.5mM MgCl2, 10×buffer 10㎕, DNA 주형100ng, pfu 폴리머라제 1 유닛을 첨가하였으며 95℃에서 5분 동안 초기 변성 과정을 거친 다음 95℃에서 1분 동안 변성, 55℃에서 30초 동안 어닐링 및 72℃에서 3분 동안 중합과정을 25회 반복하였다. 상기 PCR 반응으로 수득된 DNA 절편들은 NdeI/NotI 제한효소로 절단하고 1% 아가로스 젤에서 정제하고 동일한 제한효소로 절단한 pET21a 플라스미드에 라이게이션 하여 각각 pET21a-Sde_BAga를 제작하였다.
상기에서 제작한 플라스미드들을 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) BL21(DE3)에 도입하였다. 아가로올리고당 가수분해효소 유전자가 도입된 재조합 대장균을 전배양(pre-culture)하기 위해 50mL-conical tube에 엠피실린(ampicillin) 100㎍/mL가 있는 10mL의 LB broth에서 37℃, 9시간 배양하였다. 그 후, 전 배양액 2mL을 같은 배지 조성의 본 배양액 100mL에 접종한 후, 광학밀도분광기(Optical density spectroscope)을 이용하여 광학밀도 값이 미드익스포넨셜 단계(OD 0.4~0.6)까지 자라면 0.1mM 이소프로필-베타-디-씨오갈락토파이라노사이드(IPTG)를 넣고 30℃에서 16시간 동안 인덕션(induction) 시켰다. 그 후 세포 배양액을 4℃에서 20분간 16,000×g으로 원심분리를 한 뒤 세포를 회수하였다. 회수한 세포는 트리스 버퍼(20mM Tris-HCl, pH 7.4) 30mL에 분산시킨 후 초음파기기(sonicator)를 이용하여 세포를 파쇄(cell lysis)하였다. 이후 4℃에서 10분 동안 16,000×g에서 원심분리 하여 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액에 포함된 재조합 효소를 히스트랩 컬럼(5mL, GE health care)을 사용하여 정제한 뒤, SDS-PAGE 젤을 사용하여 정제된 각각의 단백질의 크기를 확인하였다(도 4a). Desalting 컬럼을 사용하여 단백질 정제에 사용하였던 염(Imidazole)을 제거하였다. 염이 제거된 재조합 단백질 효소는 BCA assay 방법으로 농도를 정량하였다.
<실시예 3> 아가로바이오스를 기질로 아가로올리고당 가수분해효소 반응을 이용한 AHG 생산
상기 실시예 1에서 확립한 조건인 2% 인산, 110℃ 및 10분 반응조건을 이용하여 30.7 wt%(w/v) 농도로 아가로스 및 아가를 반응시켰다(표 2). 사용한 아가로스와 아가는 모두 건조중량 기준이다.
아가로올리고당 가수분해효소 반응은 조건은 다음과 같다. 위의 조건으로 산 가수분해 시킨 반응물을 5M NaOH를 이용하여 pH5-6으로 중화한 후, 37℃, 200 rpm 조건에서 12시간 동안 반응을 실시하였다.
효소 반응 후 반응 산물은 thin layer chromatography(TLC)(도 4b)및 GC/TOF-MS와 HPLC(도 4c)를 통해 분석하였으며, TLC, GC/TOF-MS와 HPLC 분석 조건은 상기 실시예 1의 조건을 사용하였다.
도 4b 및 4c에서 나타낸 바와 같이, 아가로바이오스는 아가로올리고당 가수분해효소에 의해 AHG와 D-갈락토오스가 생성되는 것을 확인하였다. 이때 투입한 아가로스(g) 대비 수득된 AHG의 수율은 43.3% 였다.
<실시예 4> 효모를 이용한 AHG 정제
실시예 3에서 획득한 반응 산물은 AHG와 D-갈락토오스이며, 이 중에서 D-갈락토오스를 제거하기 위하여 효모 배양을 실시하였다. 효모는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) D452-2 균주를 사용하였으며 전배양은 YPD broth에서 30℃, 200 rpm에서 24시간 동안 실시하였다. 배양 후 세포 펠렛을 6,000×g에서 10분간 원심분리를 통해 얻고 세포 펠렛은 Tris-HCl buffer(pH 7.4)를 사용하여 세척한 후 다시 한번 같은 조건에서 원심분리하여 세포 펠렛을 얻었다.
배양을 위해 3.35g/L의 이스트 나이트로젠 베이스(yeast nitrogen base) 및 0.4g/L의 CSM을 함유한 최소배지에 AHG와 D-갈락토오스가 있는 효소반응산물을 탄소원으로 하여 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae) D452-2의 세포 펠렛을 접종하였다. 30℃, 200rpm에서 42시간 배양 후 TLC 및 GC-TOF/MS를 이용하여 분석한 결과, D-갈락토오스는 모두 없어지고 AHG만 남은 것을 확인하였으며(도 5), AHG 수율을 계산한 결과 33.2%를 얻었다(표 2).
<실시예 5> 기존 당화 공정별 수율 비교
본 발명에 따른 당화 공정과 종래 당화 공정별 단당수율 및 최대 기질 농도를 비교하였다. 그 결과는 표 3에 기재하였다.
Figure PCTKR2017013493-appb-T000003
표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명은 기존 공정에 비해 최대 기질 농도가 현저히 높았다.
<실시예 6> 아가의 산 가수분해 조건 확립
기질로 20%(w/w)의 아가를 사용하는 것을 제외하고 상기 실시예 1과 같은 방법으로 1, 2, 3%(w/v) 인산에 대하여 90℃의 반응온도에서 480분(8시간) 간 가수분해시켰다.
도 6에 나타난 바와 같이, 시간이 지남에 따라 각 조건에서 당화율이 증가하였다.
위 조건에 해당하는 반응 산물들의 종류를 분석하기 위해 상기 실시예 1과 같은 방법으로 HPLC 분석을 실시하였다.
도 7a-c에 나타난 바와 같이, 1% 인산을 사용했을 때는 480분에 아가로바이오스의 농도가 143.3 g/L, 2% 인산 조건일 때, 270분에 아가로바이오스 농도가 162.5 g/L, 3% 인산일 때, 150분에 아가로바이오스 농도가 172.7 g/L에 상응하였다. 이는 넣어준 아가에 대비 각각 64%, 73% 및 77%에 해당하는 높은 수율이다. 부산물인 5-HMF의 양은 2% 및 3% 인산은 조건에서 각각 4.4 g/L 및 3.7 g/L으로 매우 적은 양이 생성되었다. 이것의 장점은 비교적 낮은 온도에서 산 가수분해를 함으로써, 비싼 고압반응기가 필요가 없으며, 작업 시 보다 안전하다는 장점이 있다.
본 발명은 고수율의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 제조에 사용할 수 있다.

Claims (13)

  1. 건조중량 기준으로 10 내지 37%(w/v)의 아가로스 또는 아가를 기질로 사용하여 0.1 내지 5%(w/v) 농도의 강산을 80 내지 140℃에서 5분 내지 500분 동안 반응시킨 후 중화 과정을 수행하여 반응 산물 내 5-히드록시메틸퍼퓨랄(5-hydroxymethyl furfural)의 수율이 1.5%(w/w) 미만이 되는 아가로바이오스를 함유하는 반응 산물을 얻는 단계를 포함하는 아가로바이오스의 생산방법.
  2. 제1항에 있어서,
    강산은 인산, 황산, 염산 및 질산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 아가로바이오스의 생산방법.
  3. 제1항에 있어서,
    중화 과정은 강산 처리된 아가로스 또는 아가에 강염기를 부가하여 pH 5 내지 7로 조정하는 것인, 아가로바이오스의 생산방법.
  4. 제3항에 있어서,
    강염기는 NaOH, KOH, Ca(OH)2 및 Ba(OH)2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 아가로바이오스의 생산방법.
  5. 건조중량 기준으로 10 내지 37%(w/v)의 아가로스 또는 아가를 기질로 사용하여 0.1 내지 5%(w/v) 농도의 강산과 80 내지 140℃에서 5분 내지 500분 동안 반응시킨 후 중화 과정을 수행하여 반응 산물 내 5-히드록시메틸퍼퓨랄(5-hydroxymethyl furfural)의 수율이 1.5%(w/w) 미만이 되는 아가로바이오스를 함유하는 반응 산물을 얻는 단계;
    상기 반응 산물과, 아가로바이오스를 기질로 사용하는 아가로올리고당 가수분해효소(agarooligosaccharide hydrolase)를 반응시키는 단계; 및
    상기 단계에서 얻은 가수분해산물 하에서 갈락토오스 대사능이 있는 미생물을 배양하고, 이의 배양액에서 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 수득하는 단계를 포함하는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 생산방법.
  6. 제5항에 있어서,
    강산은 인산, 황산, 염산 및 질산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 생산방법.
  7. 제5항에 있어서,
    중화 과정은 강산 처리된 아가로스 또는 아가에 강염기를 부가하여 pH 5 내지 7로 조정하는 것인, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 생산방법.
  8. 제6항에 있어서,
    강염기는 NaOH, KOH, Ca(OH)2 및 Ba(OH)2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 생산방법.
  9. 제5항에 있어서,
    아가로올리고당 가수분해효소는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 생산방법.
  10. 제5항에 있어서,
    반응 산물과 아가로올리고당 가수분해효소의 반응은 20 내지 40℃의 온도 범위에서 100 내지 300 rpm 조건으로 5시간 내지 48시간 동안 수행되는, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 생산방법.
  11. 제5항에 있어서,
    갈락토오스 대사능이 있는 미생물은 락토바실러스, 비피도박테리움, 바실러스, 스트렙토마이세스, 코리네박테리움, 자이모모나스, 대장균 또는 효모 중 어느 하나인, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 생산방법.
  12. 제5항에 있어서,
    갈락토오스 대사능이 있는 미생물은 혐기 조건에서 배양하는, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 생산방법.
  13. 제5항에 있어서,
    3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 수득하는 단계는 미생물 배양액을 원심분리 또는 여과하여 얻는 것인, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 생산방법.
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