WO2021006604A1 - 신규 융합단백질 및 그의 용도 - Google Patents

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WO2021006604A1
WO2021006604A1 PCT/KR2020/008870 KR2020008870W WO2021006604A1 WO 2021006604 A1 WO2021006604 A1 WO 2021006604A1 KR 2020008870 W KR2020008870 W KR 2020008870W WO 2021006604 A1 WO2021006604 A1 WO 2021006604A1
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amino acid
protein
seq
antibody
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진현탁
최보경
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    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Definitions

  • the present invention relates to a novel fusion protein and its use, and specifically, to a novel fusion protein that can be used in the treatment of autoimmune diseases and its use.
  • Autoimmune reaction is a phenomenon that destroys cellular tissues through various immune reactions by recognizing the cells of our body as foreign substances.
  • Representative autoimmune diseases include rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, psoriasis, inflammatory bowel disease, and multiple sclerosis, and these autoimmune diseases are difficult to treat because the cause is not clear.
  • an autoimmune reaction may occur due to the transplanted organ triggering an immune response. Therefore, development of various immunosuppressants is required to suppress such autoimmune diseases or autoimmune reactions.
  • immunosuppressants include tacrolimus, an inhibitor of calcineurin, mycophenolatemofetil, an inhibitor of gene synthesis, and prednisone, an anti-inflammatory steroid.
  • tacrolimus an inhibitor of calcineurin
  • mycophenolatemofetil an inhibitor of gene synthesis
  • prednisone an anti-inflammatory steroid.
  • these immunosuppressants can cause serious side effects (Kalluri and Hardinger, World J. Translant . 2(4): 51-68 , 2012; Tanabe et al ., Translantation , 93(7): 709). -719, 2012; Zaza et al ., Toxins 6(3): 869-891, 2014).
  • various biological drugs are being developed to replace conventional immunosuppressants or increase the duration of drugs, one of which is costimulation inhibitors.
  • Representative co-stimulatory immune responses include CD28-CD80/CD86, CTLA4-CD80/CD86, CD40-CD40L(CD154), and PD-1/PD-L1, and CTLA4-Fc, anti-CD40 and anti- -CD154 antibody, etc. are being studied as the above-described biologics (Kinnear et al ., Transplantation 95(4): 527-535, 2013; Riella et al ., Am. J. Transplant . 12(10): 2575-2587 , 2012; Hardinger and Brennan, World J. Transplant. 3(4): 68-77, 2013).
  • CD40 is expressed not only in antigen-presenting cells such as B cells, macrophages, dendritic cells, and thymic epithelial cells, but also in normal cells such as epithelial cells and fibroblasts.
  • CD154 also known as CD40L, is primarily expressed in activated T cells and natural killer cells. CD40-CD154 signaling activates B cells and macrophages and indirectly activates T cells, promoting an immune response (Karimi and Pour fathollah, Iran. J. Allergy Asthma Immunol . 11(1): 1-13 , 20012).
  • an anti-CD154 antibody was developed, and the antibody showed a good effect in animal experiments including monkeys.
  • anti-CD154 antibody exhibited a serious side effect of thrombogenesis, and the development of antibody drugs targeting CD154 is currently suspended (Kalunian et al ., Arthritis. Rheum . 46 ( 12): 3251-3258, 2002; Boumpas et al ., Arthritis Rheum . 48(3): 719-727, 2003; Pilat et al., Curr. Opin. Organ Translant. 17: 368-375, 2012).
  • IL-10 is known to have a dual characteristic that also has the opposite effect of immunostimulatory activity.
  • IL-10 stimulates B cell activation, prolongs the survival of B cells, and may contribute to class switching of B cells. It can also stimulate NK cell proliferation and cytokine production, and may act as a growth factor promoting the proliferation of a specific subset of CD8 + T cells (Mosser & Yhang, Immunol. Rev. 226: 205-218, 2009; Cai et al ., Eur. J. Immunol. 29: 2658-2665, 1999; Santin et al ., J. Virol .
  • the antibody has a limitation as a medicine in that it cannot completely overcome the side effects of thrombus formation.
  • the present invention is to solve various problems including the above-described problems, and a novel anti-CD154 capable of exhibiting a therapeutic effect for autoimmune diseases by effectively blocking the function of CD154 while removing the possibility of formation of blood clots when administered in vivo. It aims to provide a fusion protein.
  • the scope of protection of the present invention is not limited to the above purpose.
  • the Fc region is mutated so as not to bind to the Fc gamma receptor
  • a modified Fc region, a fusion protein is provided.
  • an antigen-binding fragment or antibody analog of an antibody that specifically binds to CD154 a) a modified Fc region that has been mutated so as not to bind to the Fc gamma receptor; And c) an IL-10 protein sequentially comprising a fusion protein.
  • a polynucleotide encoding the fusion protein is provided.
  • a vector comprising the polynucleotide is provided.
  • a pharmaceutical composition for immunosuppression comprising the fusion protein as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition for the treatment of autoimmune diseases comprising the fusion protein as an active ingredient.
  • a method for treating an autoimmune disease in an individual by administering a therapeutically effective amount of the fusion protein to a patient suffering from an autoimmune disease.
  • the fusion protein according to an embodiment of the present invention is a safe material that has a very low possibility of clotting, which is a disadvantage of the anti-CD154 antibody of the prior art, and can be used as an immunosuppressant and an autoimmune disease treatment.
  • FIG. 1 is a schematic diagram schematically showing the structure of an antibody (C10M) that specifically binds to CD154 described in WO2016/182335A1 developed by the present inventors.
  • C10M an antibody that specifically binds to CD154 described in WO2016/182335A1 developed by the present inventors.
  • Figure 2 shows the anti-CD154 antibody to which the wild-type IgG1 Fc region is applied (left) and the anti-CD154 chimeric antibody (C10M, right) to which the variant IgG1 Fc region for inhibiting Fc ⁇ RII ⁇ binding described in WO2016/182335A1 is applied to wild-type mice and humans.
  • This is a series of photographs showing the result of staining the blood clots generated after administration to Fc ⁇ RII ⁇ -transgenic mice and counting the number of blood clots.
  • FIG. 3 is a schematic diagram schematically showing the structure of a fusion protein (left: PG-400 and right: PG-410) specifically binding to CD154 according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4A is a photograph showing a result of analyzing a protein in a purification process by SDS-PAGE after temporarily expressing a chimeric hybrid antibody (PG-400-1) according to an embodiment of the present invention in cells
  • FIG. 4B is The chimeric hybrid antibody (PG-400-1) is a photograph showing the result of Western blot analysis using an anti-IgG4 Fc antibody
  • FIG. 4C is a SEC-HPLC analysis performed to measure the purity of the final purified product.
  • FIG. 4D is a photograph showing the results of analyzing the final purified protein by SDS-PAGE after expressing the chimeric hybrid antibody (PG-400-1) from a stable cell line
  • FIG. 4E is a stable cell line It is a chromatogram showing the result of performing SEC-HPLC analysis to confirm the purity of the final protein expressed from.
  • Example 5 is an anti-CD154 chimeric antibody (C10M, right) to which a variant IgG1 Fc region for inhibiting Fc ⁇ RII ⁇ binding described in WO2016/182335A1 is applied and a chimeric hybrid antibody prepared in Example 2 (PG-400-1, left) It is a graph showing the result of analyzing the binding affinity of CD40L with BLI analysis.
  • FIG. 6A is a photograph showing the result of reduced PAGE analysis performed on a cell culture solution after expressing a recombinant humanized anti-CD154 antibody (PG-400-2) according to an embodiment of the present invention in HEK293 cells
  • FIG. 6B is The cell culture solution was purified through Protein A affinity chromatography and gel filtration, and then a photograph showing the result of PAGE analysis under reduced (left) and non-reduced (right) conditions
  • FIG. 6C is an HPLC of purified PG-400-2. It is a chromatogram showing the result of analysis with.
  • FIG. 7A is a photograph showing the result of a reduced PAGE analysis performed on a cell culture solution after expressing the recombinant humanized anti-CD154 antibody (PG-410) according to an embodiment of the present invention in HEK293 cells
  • FIG. 7B is the cell A photograph showing the results of PAGE analysis of the culture medium under reduced (left) and non-reducing (right) conditions after purification through Protein A affinity chromatography and gel filtration
  • FIG. 7C is a result of analyzing purified PG-410 by HPLC. It is a chromatogram representing
  • Figure 8a is a sensogram showing the result of analyzing the binding degree of the recombinant humanized anti-CD154 antibody (PG-400-2) with CD154 according to an embodiment of the present invention by BLI analysis
  • Figure 8b is an embodiment of the present invention This is a sensogram showing the result of analyzing the binding degree of the recombinant humanized anti-CD154 antibody (PG-410) to CD154 according to the example by BLI analysis.
  • FIG. 9A is a schematic diagram schematically showing an experimental schedule for investigating the immunosuppressive activity by IL-10 of a recombinant humanized anti-CD154 antibody (PG-410) according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 9B is a recombinant IL- 10 (left) and a graph showing the results of measuring the expression of TNF ⁇ when the recombinant humanized anti-CD154 antibody (PG-410) according to an embodiment of the present invention was treated with the macrophage line Raw264.7.
  • FIG. 10A is a schematic diagram schematically showing an animal experiment schedule for confirming the effect of GVHD treatment by administration of a recombinant humanized anti-CD154 antibody (PG-410) according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 10B is It is a graph recording the change in body weight over time in the control group and the PG-410 administration group
  • FIG. 10C is a graph recording the survival rate with the passage of time in the control group administered with PBMC and the PG-410 administration group.
  • FIG. 11 is a graph showing the results of measuring the ratio of human CD45 + cell population over time in the control group (vehicle) and the recombinant humanized anti-CD154 antibody (PG-410) administration group according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 12 is a series of sensograms showing the results of BLI analysis comparing the binding affinity of the modified Fc region protein and the control rituximab to Fc gamma receptors I and IIIa according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 13 is a result of comparative analysis of binding affinity for various Fc gamma receptors of a modified Fc region protein and a control rituximab according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 13a is a result of treatment with PBS to confirm a baseline. It is a sensogram showing the result of performing the BLI analysis after, and FIG.
  • FIG. 13B is a result of analyzing the binding affinity of the modified Fc region protein and the control rituximab to Fc gamma receptor IIa according to an embodiment of the present invention by BLI analysis
  • 13C is a sensogram showing the result of analyzing the binding affinity of the modified Fc region protein and the control rituximab with Fc gamma receptor IIb according to an embodiment of the present invention by BLI analysis
  • FIG. 13d is a sensogram showing the result of analyzing the binding affinity of the modified Fc region protein and the control rituximab with the Fc gamma receptor IIIb according to an embodiment of the present invention by BLI analysis.
  • the Fc region is modified so as not to bind to the Fc gamma receptor
  • a fusion protein is provided.
  • the Fab specifically binding to CD154 is a light chain (VL-CL) consisting of an amino acid represented by SEQ ID NO: 2 and a heavy chain VH-CH1 fragment consisting of an amino acid represented by SEQ ID NO: 9;
  • VL-CL light chain
  • VH-CH1 fragment consisting of an amino acid represented by SEQ ID NO: 9
  • it may be composed of a light chain (VL-CL) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and a heavy chain VH-CH1 fragment consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11.
  • the scFv is a light chain variable domain (VL) consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 and a heavy chain variable region (VH) consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 are linked by a linker peptide.
  • VL light chain variable domain
  • VH heavy chain variable region
  • the linker peptide any one of those described below may be used.
  • the Fc gamma receptor may be Fc ⁇ RI, Fc ⁇ RIIA, Fc ⁇ RIIB1, Fc ⁇ RIIB2, Fc ⁇ RIIIA, and/or Fc ⁇ RIIIB.
  • the Fab or scFv specifically binding to CD154, and the Fc region may be linked by a hinge or linker peptide.
  • the hinge may be an IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgD, or a hybrid hinge of at least two or more of them.
  • the hinge may include the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 40 to 42. Any one of the linker peptides may be used as long as the linker peptide does not inhibit the function of the fusion partner of the fusion protein, and preferably any one of those defined below may be used.
  • the Fc region is mutated so as not to substantially bind to the Fc gamma receptor, and any of the conventionally known non-binding variants of the Fc gamma receptor can be used, and IgA, IgG, IgM, IgD or IgE
  • the Fc region of or their domains such as hinge, CH2, CH3 may be a hybrid Fc in which all or part of the mixture, the IgG may be IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4, in particular, Fc gamma receptor (Fc ⁇ Rc) And antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) or complement-dependent cytotoxicity (CDC), which is an effector function of Fc, so that affinity for complement (C1a) is low.
  • ADCC antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity
  • CDC complement-dependent cytotoxicity
  • the hybrid Fc may be those described in Korean Patent Nos. 897938, 1380732, 1380729, etc., and the variant Fc is a modified immunoglobulin Fc protein (NTIG) described in International Patent Application PCT/KR2020/006346 I can.
  • NTIG modified immunoglobulin Fc protein
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or 6, or the 18th amino acid sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or 6 is mutated to T, and the 196th amino acid sequence is mutated to M, and a modified Fc region may be used.
  • the fusion protein may be a form in which an IL-10 protein is added to the C-terminus of the Fc region.
  • the IL-10 protein may be a mature form protein comprising an amino acid sequence 19-178 from which a signal sequence has been removed from the amino acid sequence described in UniProtKB P22301, and isoleucine, which is the 87th amino acid of the mature protein, is alanine. It may be an IL-10 variant protein substituted with, and may be a monomeric IL-10 variant protein in which a linker (spacer) peptide having a length of 6 to 12 aa is inserted between asparagine as the 116th amino acid and lysine as the 117th amino acid. have.
  • an antigen-binding fragment or antibody analog of an antibody that specifically binds to CD154 a) a modified Fc region that has been mutated so as not to bind to the Fc gamma receptor; And c) an IL-10 protein sequentially comprising a fusion protein.
  • the antigen-binding fragment of the antibody may be Fab, F(ab') 2 , Fab', scFv, diabody, triabody, sdAb (single domain antibody), V NAR or V H H
  • the Antibody analogues may be affibody, affilin, affimer, affitin, alphabody, anticalin, avimer, DARPin, Fynomer, Kunitz domain peptide, monobody, repebody, VLR, or nanoCLAMP.
  • the Fc gamma receptor may be Fc ⁇ RI, Fc ⁇ RIIA, Fc ⁇ RIIB1, Fc ⁇ RIIB2, Fc ⁇ RIIIA, and/or Fc ⁇ RIIIB.
  • the hinge may be an IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgD, or a hybrid hinge of at least two or more of them.
  • the hinge may include the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 40 to 42. Any one of the linker peptides may be used as long as the linker peptide does not inhibit the function of the fusion partner of the fusion protein, and preferably any one of those defined below may be used.
  • the Fc region has been mutated so as not to substantially bind to the Fc gamma receptor, and any known Fc gamma receptor non-binding variant can be used, preferably of SEQ ID NO: 5 or 6.
  • An amino acid sequence, or a modified Fc region consisting of mutations in the 18th amino acid sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or 6 to T and the 196th amino acid sequence to M may be used.
  • the IL-10 protein may be a mature form protein comprising an amino acid sequence 19-178 from which a signal sequence has been removed from the amino acid sequence described in UniProtKB P22301, and 87 of the mature protein It may be an IL-10 variant protein in which isoleucine, which is the first amino acid, is substituted with alanine, and a linker (or spacer) peptide having a length of 6 to 12 aa is inserted between asparagine as the 116th amino acid and lysine as the 117th amino acid. It may be an IL-10 variant protein, and may consist of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 8.
  • fusion protein used in the present invention refers to a recombinant protein (recombinant protein) in which two or more proteins or domains responsible for a specific function in the protein are linked so that each protein or domain is responsible for its natural function.
  • a linker peptide having a generally flexible structure may be inserted between the two or more proteins or domains.
  • the linker peptide is AAGSGGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 12), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 17), GGSGG (SEQ ID NO: 17), GGSGGSGGS (SEQ ID NO: 18), GGGSGG (SEQ ID NO: 19), (G 4 S) n (unit: SEQ ID NO: 20, n is an integer of 1 to 10), (GGS) n (n is an integer of 1 to 10), (GS) n (n is an integer of 1 to 10), (GSSGGS) n (unit: SEQ ID NO: 21, n is an integer of 1 to 10), KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO: 22), EGKSSGSGSESKST (SEQ ID NO: 23), GSAGSAAGSGEF (SEQ ID NO: 24), (EAAAK) n (unit: SEQ ID NO: 25, n is an integer of 1 to 10), CRRRRRREAEAC (SEQ ID NO: 26), A (
  • SEQ ID NOs: 40 to 48 are a hinge peptide derived from an antibody or a hybrid hinge peptide in which a hinge and other linker peptides are mixed.
  • a hinge peptide derived from an antibody or a hybrid hinge peptide in which a hinge and other linker peptides are mixed are mixed.
  • antibody used in this document is an immunoglobulin molecule, which is a heterologous tetrameric protein produced by combining two identical heavy chains and two identical light chains, and the variable region (V L ) of the light chain and the heavy chain The antigen-specific binding is performed through an antigen-binding site constituted by the variable region (V H ), thereby inducing an antigen-specific humoral immune response.
  • antigen-binding fragment of antibody used in this document is a fragment that has antigen-binding ability derived from an antibody, and is produced by digestion of an antibody with a protein cleavage enzyme as well as a recombinant method. It includes all of the single-chain fragments produced, including Fab, F(ab') 2 , scFv, diabody, triabody, sdAb, and V H H.
  • Fab as used in this document is a fragment antigen-binding fragment produced by digesting an antibody molecule with papain, a proteolytic enzyme. Two peptides, V H -CH1 and V L -C L As a dimer of, the other fragment produced by papain is referred to as a fragment crystallizable (Fc).
  • F(ab') 2 is a fragment containing an antigen-binding site among fragments produced by cleaving an antibody with a protease, pepsin. The two Fabs are connected by disulfide bonds. Show. Another fragment produced by pepsin is referred to as pFc'.
  • Fab' as used in this document is a molecule having a structure similar to that of Fab produced by separating F(ab') 2 under weak reducing conditions.
  • scFv is an abbreviation of "single chain variable fragment” and is not an actual antibody fragment, but a linker having a size of about 25 aa between the heavy chain variable region (V H ) and light chain variable region (V L ) of the antibody
  • V H heavy chain variable region
  • V L light chain variable region
  • diabody and “triabody” refer to antibody fragments in which two and three scFvs are connected by a linker, respectively.
  • sdAb single domain antibody
  • sdAb single domain antibody
  • V NAR consisting of a variable region fragment of a shark antibody consisting of only a single-chain dimer
  • V H H consisting of a variable region fragment of a camelid antibody.
  • Antibody mimetic used in this document is a monobody, variable lymphocyte receptor (VLR), unlike conventional full-length antibodies in which two heavy chains and two light chains form a quaternary structure of a heterologous tetramer to exert a function. ), etc. It is a concept including a protein having a function similar to that of an antibody produced from a protein scaffold derived from a non-antibody, that is, antigen-binding ability.
  • Such antibody analogs include Affibody derived from the Z domain of protein A (Nygren, PA, FEBS J.
  • a polynucleotide encoding the fusion protein is provided.
  • a recombinant vector comprising the polynucleotide is provided.
  • the polynucleotide may be included in the form of a gene construct operably linked to a regulatory sequence.
  • operably linked to is regulated in such a way that the target nucleic acid sequence (eg, in an in vitro transcription/translation system or in a host cell) can be expressed. It means that it is linked to a sequence.
  • regulatory sequence is meant to include promoters, enhancers and other regulatory elements (eg, polyadenylation signals).
  • the regulatory sequences are those that direct the expression of the nucleic acid of interest in many host cells, and that the nucleic acid of interest can be expressed only in specific tissue cells (e.g., tissue-specific regulatory sequences), and It includes directing expression to be induced by a specific signal (eg, an inducible regulatory sequence).
  • tissue-specific regulatory sequences e.g., tissue-specific regulatory sequences
  • a specific signal eg, an inducible regulatory sequence
  • regulatory sequences that enable expression in eukaryotic and prokaryotic cells are well known to those skilled in the art. As mentioned above, these usually contain regulatory sequences responsible for initiation of transcription and, optionally, a poly-A signal responsible for transcription termination and stabilization of the transcript. Additional regulatory sequences may include, in addition to transcriptional regulators, translation enhancers and/or naturally-combined or heterologous promoter regions.
  • possible regulatory sequences that allow expression in mammalian host cells include CMV-HSV thymidine kinase promoter, SV40, RSV-promoter (Rous sarcoma virus), human kidney element 1 ⁇ -promoter, glucocorticoid-inducible MMTV- Promoter (Moloni mouse tumor virus), a metallothionein-inducible or tetracycline-inducible promoter, or an amplifying agent such as a CMV amplifying agent or an SV40-amplifying agent.
  • neurofibrillation-promoter For expression in neurons, it is contemplated that neurofibrillation-promoter, PGDF-promoter, NSE-promoter, PrP-promoter or thy-1-promoter can be used.
  • Such promoters are known in the art and are described in Charron, J. Biol. Chem. 270: 25739-25745, 1995.
  • a number of promoters have been disclosed including the lac-promoter, the tac-promoter or the trp promoter.
  • the regulatory sequences include transcription termination signals such as SV40-poly-A site or TK-poly-A site downstream of the polynucleotide according to an embodiment of the present invention.
  • suitable expression vectors are known in the art, examples of which are Okayama-Berg cDNA expression vector pcDV1 (Parmacia), pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogene), pSPORT1 (GIBCO BRL), pGX-27 (Patent No.
  • the vector may further comprise a polynucleotide encoding a secretion signal.
  • the secretion signals are well known to those skilled in the art.
  • a leader sequence that can lead the fusion protein to the cell compartment is combined with the coding sequence of the polynucleotide according to an embodiment of the present invention, and preferably the translated protein or its It is a leader sequence that can secrete proteins directly into the periplasm or extracellular media.
  • the vector of the present invention may be prepared by, for example, standard recombinant DNA techniques, and standard recombinant DNA techniques include, for example, ligation of blunt ends and adhesive ends, treatment with restriction enzymes to provide appropriate ends, and inappropriate In order to prevent binding, phosphate group removal by alkaline postage treatment and enzymatic linkage by T4 DNA ligase are included.
  • the vector of the present invention by recombining the DNA encoding the signal peptide obtained by chemical synthesis or gene recombination technology, the mutant IL-10 protein of the present invention, or the DNA encoding the fusion protein containing the same into a vector containing an appropriate regulatory sequence.
  • a vector containing the control sequence can be purchased or manufactured commercially, and in an embodiment of the present invention, a pBispecific backbone vector (Genexine, Inc., Korea) or a pAD15 vector was used as a framework vector.
  • the expression vector may further include a polynucleotide encoding a secretion signal sequence, and the secretion signal sequence induces secretion of a recombinant protein expressed in the cell out of the cell, and a tissue plasminogen activator (tPA) signal sequence, HSV gDs (herpes simplex virus glycoprotein Ds) may be a signal sequence or a growth hormone signal sequence.
  • tPA tissue plasminogen activator
  • the expression vector according to an embodiment of the present invention may be an expression vector capable of expressing the fusion protein in a host cell, and the expression vector is a plasmid vector, a viral vector, a cosmid vector, a phagemid vector, an artificial human It can be any form such as chromosomes.
  • a pharmaceutical composition for immunosuppression comprising the fusion protein as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition for immunosuppression may be used for the treatment of autoimmune diseases or for immunosuppression of patients who have undergone organ transplantation.
  • a pharmaceutical composition for the treatment of autoimmune diseases comprising the fusion protein as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition may further contain a known immunosuppressant component.
  • immunosuppressants include glucocorticoids, cytostatic agents, anti-CD20 antibodies, anti-CD3 antibodies, anti-IL-2 antibodies, immunophilin inhibitors, interferon ⁇ , and oipoids.
  • oipoid TNF ⁇ binding protein
  • macophenolate mycophenolate
  • fingolimod fingolimod
  • myriocin myriocin
  • the glucocorticoid may be prednisone, dexamethasone, or hydrocortisone
  • the cell proliferation inhibitor is nitrogen mustard, nitrosourea, platinum-based complexes (platinum cordination).
  • the immunophilin inhibitor may be cyclosporin, tacrolimus, sirolimus, or everolimus.
  • the autoimmune disease is type 1 diabetes, alopecia areata, anti-phospholipid antibody syndrome, rheumatoid arthritis, psoriasis or psoriatic arthritis, multiple sclerosis (mutiple). scelerosis), systemic lupus erythematosus, inflammatory bowel disease, Addison's disease, Graves' disease, Sj ⁇ gren's syndrome, Guillain-Barre syndrome ( Guillian-Barre syndrome), Hashimoto's thyroiditis, Myasthenia gravis, inflammatory myophathy, autoimmune vasculitis, autoimmune hepatitis, hemorrhagic anemia, May be idiopathic thrombocytopenic purpura, primary biliary cirrhosis, scleroderma, vitiligo, pernicious anemia, or chronic celiac disease have.
  • the composition may include a pharmaceutically acceptable carrier, and may additionally include a pharmaceutically acceptable adjuvant, excipient, or diluent in addition to the carrier.
  • pharmaceutically acceptable refers to a composition that is physiologically acceptable and, when administered to a human, does not usually cause allergic reactions such as gastrointestinal disorders, dizziness, or similar reactions.
  • the carrier, excipient and diluent include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, Polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oils.
  • fillers, anti-aggregating agents, lubricants, wetting agents, flavoring agents, emulsifying agents and preservatives may additionally be included.
  • compositions according to an embodiment of the present invention may be formulated using a method known in the art to enable rapid release, or sustained or delayed release of the active ingredient when administered to a mammal.
  • Formulations include powders, granules, tablets, emulsions, syrups, aerosols, soft or hard gelatin capsules, sterile injectable solutions, and sterile powder forms.
  • composition according to an embodiment of the present invention may be administered by various routes, for example, oral, parenteral, for example, suppository, transdermal, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, intralesional, nasal, intrathecal administration It can be administered, and can also be administered using an implantable device for sustained release or continuous or repeated release.
  • the frequency of administration may be administered once a day or divided into several times a day within a desired range, and the administration period is not particularly limited.
  • composition according to an embodiment of the present invention may be formulated in a suitable form together with a generally used pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include, for example, carriers for parenteral administration such as water, suitable oils, saline, aqueous glucose and glycol, and may further include stabilizers and preservatives. Suitable stabilizers include antioxidants such as sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite or ascorbic acid. Suitable preservatives are benzalkonium chloride, methyl- or propyl-paraben and chlorobutanol.
  • composition according to the present invention is a suspension agent, a solubilizer, a stabilizer, an isotonic agent, a preservative, an adsorption inhibitor, a surfactant, a diluent, an excipient, a pH adjuster, a painless agent, a buffer agent, Antioxidants and the like may be appropriately included.
  • Pharmaceutically acceptable carriers and formulations suitable for the present invention including those exemplified above, are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences, the latest edition.
  • the dosage of the composition to a patient depends on many factors, including the patient's height, body surface area, age, the specific compound administered, sex, time and route of administration, general health, and other drugs administered simultaneously.
  • the pharmaceutically active protein may be administered in an amount of 100 ng/body weight (kg)-10 mg/body weight (kg), more preferably 1 to 500 ⁇ g/kg (body weight). Preferably, it may be administered at 5 to 50 ⁇ g/kg (body weight), and the dosage may be adjusted in consideration of the above factors.
  • a method for treating an autoimmune disease in an individual by administering a therapeutically effective amount of the fusion protein to a patient suffering from an autoimmune disease.
  • the term "therapeutically effective amount” means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is the type and severity of the subject, Age, sex, activity of the drug, sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and rate of excretion, duration of treatment, factors including concurrent drugs and other factors well known in the medical field.
  • the therapeutically effective amount of the composition of the present invention may be 0.1 mg/kg to 1 g/kg, more preferably 1 mg/kg to 500 mg/kg, but the effective dosage may be depending on the age, sex and condition of the patient. Can be adjusted appropriately.
  • the present inventors produced an anti-CD154 antibody in which an Fc ⁇ RII ⁇ binding inhibitor was introduced into the heavy chain CH2 and CH3 domains of an antibody (C10) in which the Fc region of the mouse-derived anti-CD154 antibody described in WO2016/182335A1 was replaced with a human IgG1 Fc region. And named it'C10M' (FIG. 1).
  • 138 ⁇ g of the chimeric antibody C10M prepared as described above was intravenously injected into wild-type mice and transgenic mice transduced with the Fc ⁇ RII ⁇ gene, and 10 minutes later, blood was collected from the orbit and placed in an EDTA tube to perform CBC-platelet analysis, and the experiment After the animals were sacrificed, the lungs were excised to prepare frozen slices, and then tissue staining was performed to count the number of thrombi formations.
  • Example 1 From the results of Example 1, the present inventors designed a fusion protein in which the Fab portion of the C10M antibody was linked to a modified Fc region that does not bind to Fc ⁇ R (Fig. 3), and the modified Fc region is the hinge of IgG1. The part was applied as it is, but a modified Fc region that does not bind to Fc ⁇ R was introduced by introducing a mixed form of IgD and IgG4 CH2 and CH3.
  • the fusion protein is a polynucleotide encoding a hybrid heavy chain in which the heavy chain portion (V H -CH1, SEQ ID NO: 9) of the Fab of the C10M antibody is linked with a modified Fc region (SEQ ID NO: 6) is prepared, and the pBispecific expression vector ( Genexine, Inc.).
  • a polynucleotide encoding a light chain portion (V L -C L , SEQ ID NO: 2) of the Fab of the C10M antibody was inserted into the pBispecific expression vector so that it can be controlled under a dual promoter.
  • the expression vector prepared above was transiently expressed using Thermo Fisher's ExpiCHO kit. Specifically, after mixing the vector construct prepared as described above with the ExpiCHO-S cell and the ExpiFectamine reagent included in the kit, incubating for 1 day in an incubator equipped with 8% CO 2 and 37°C conditions, the temperature was reduced to 32°C. Lowered and cultured until the 7th day.
  • protein A capture purification was performed, and it was confirmed whether the candidate material was purified through PAGE analysis and Western blot analysis under non-reducing and reducing conditions, and formulation was performed with a formulation buffer in consideration of the pI value of the candidate material.
  • the formulated material was quantified using Nano drop and final purity was confirmed using SEC-HPLC.
  • the present inventors named the chimeric antibody produced from the transient expression result as "PG-400-1", and produced a stable cell line capable of stably producing it.
  • the gene construct prepared above was cloned into a pGP30 expression vector through a sub-vector cloning step. Thereafter, the expression vector was transfected into CHO DG44 (from Dr. Chasin, Columbia University, USA) cells using a Neon-transfection system.
  • CHO DG44 from Dr. Chasin, Columbia University, USA
  • MEM ⁇ MEM ⁇ (Gibco, 12561, USA, Cat No.
  • HT+ Gibco, USA, 11067- 030
  • LDC Liting Dilution Cloning; 96 wells, 30 plates
  • Fed-batch culture was performed on the finally obtained cell line in 400 ml of hyCellCHO medium, and Protein A purification was performed on the culture medium obtained on the 15th day of culture to confirm the purified protein.
  • the purified protein was SDS-PAGE and SEC-HPLC. The quantity and purity were analyzed.
  • Fig. 4d it was confirmed that the chimeric antibody produced in the stable cell line was also normally expressed.
  • Figure 4e the chimeric antibody was found to be purified to a very high purity of 99.97% as a result of SEC-HPLC analysis.
  • the present inventors analyzed the binding affinity of the chimeric antibody prepared in Example 2 to hCD40L through biolayer interferometry (BLI) analysis.
  • the present inventors first attached CD40L protein to 96 plates using Dip and Read TM Amine Reactive 2 nd Generation (AR2G) Reagent Kit (forteBio, Cat No. 18-5092). Specifically, after dispensing 200 ⁇ l of DW into a 96-well plate, amine biosensor included in the kit was inserted and hydrated for 10 minutes. Subsequently, 200 ⁇ l of DW was additionally dispensed, EDC:NHS was mixed at 1:1 with 1/20 of the required sample amount, diluted in DW, and 200 ⁇ l each was dispensed into a 96-well plate.
  • AR2G Amine Reactive 2 nd Generation
  • CD40L protein was diluted to 5 ⁇ g/ml in 10 mM acetate pH 6.0 solution, and then 200 ⁇ l was added to the 96-well plate. Thereafter, 200 ⁇ l of 1 M ethanolamine was added to the 96-well plate, and then the Biosensor plate and the sample plate were added to Octet. -Measured by putting it in the K2 device. After the measurement was completed, 200 ⁇ l of 1x Kinetics buffer was added to the sample plate, and a baseline was determined.
  • the BLI Bio-layer interferometry
  • Octet ⁇ K2 device was measured.
  • the antigen-binding site is still a mouse-derived antibody in the human body.
  • the rest of the framework except for the antigenic determinant of Fab which is the antigen-binding fragment of the antibody that is the basis of the present invention, is substituted with the sequence of a human antibody.
  • An antibody was designed, and it was designated as'PG-400-2' (Tables 2 and 3).
  • the C-terminus of the modified Fc has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 terminated with lysine (K) because no other protein is fused to the C-terminus. Used.
  • the present inventors designed to link IL-10 protein, a cytokine having immunosuppressive activity at the C-terminus of the modified Fc region, with a linker peptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, and this was referred to as'PG-410'. Named (Table 2). In the case of PG-410, a deletion type (SEQ ID NO: 5) was used in which the lysine residue at the C-terminus of the Fc region was removed due to the addition of the IL-10 protein to the C-terminus of the Fc region.
  • the present inventors selected the variable region portion of the Fab of the humanized anti-CD154 antibody and then devised an scFv using it, and this was instead of the V H -CH1 portion of the heavy chain construct of the anti-CD154 antibody used in Example 3 above.
  • the anti-CD40L scFv is composed of a light chain variable region (VL)-linker-heavy chain variable region (VH), but it is used because the CD40L binding ability is maintained even when using a VH-linker-VL sequence. Even if it is, it is possible to use various types of linkers.
  • composition of anti-CD154 scFv-modified Fc-IL-10 fusion protein (PG-420) Component Amino acid sequence Sequence number Signal sequence METDTLLLWV LLLWVPGSTG 13 Anti-CD154 scFv V L DIVLTQSPATLSVSPGERATISCRASQRVSSSTYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFATYYCQHSWEIPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSV 14 Linker 1 GSTSGSGKPGSGEGS 39 V H QVQLVQSGAEVVKPGASVKLSCKASGYIFTSYYMYWVKQAPGQGLEWIGEINPSNGDTNFNEKFKSKATLTVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRSDGRNDMDSWGQGTLVTVSS 15 Hinge EPKSCDKTHT CPPCP or EPKSSDKTHT CPPCP 40 or 41 Modified Fc SHTQPLGVFL FPPK
  • Example 5 Production of fusion protein sample
  • the production of the fusion protein in Example 2 was not a humanized antibody, but a chimeric antibody, and it was produced in a small amount on a laboratory scale, and the host cell was a CHO cell and was not derived from human cells.
  • the sugar chain pattern of a protein is different from that of a human protein. Accordingly, the present inventors tried to confirm whether the recombinant humanized antibodies (PG-400 and PG-410) of Example 3 were normally produced by changing the host cell to a human cell, HEK293 cell, and increasing the production scale to 3L. .
  • Example 4 After preparing a polynucleotide encoding each of the heavy and light chains of the PG-400-2 protein designed in Example 4, and inserting it into the N293F Vector system (YBiologics) similarly to Example 2, it was then used in HEK293 cells. Was cotransfected. The cotransfected HEK293 cells were cultured for 6 days at 3L scale at 37° C. 5% CO 2 through a bioreactor (FreeStyle 293 Expression Medium, Gibco), and then protein expression was confirmed by PAGE analysis under reducing conditions. As a result, it was confirmed that the protein was normally produced, as shown in FIG. 6A.
  • the present inventors loaded the cell culture solution onto a column filled with Protein A bead, performed affinity chromatography, washed with a washing buffer (D-PBS, pH 7.4), and then 0.1 mM glycine buffer (pH 3.3). To elute the protein. Then, the protein was further purified through gel filtration using Superdex 200 culumn, running (D-PBS, pH 7.4) and elution buffer (D-PBS, pH 7.4).
  • Protein production and purification were confirmed through PAGE analysis of the final purified protein under reduced and non-reducing conditions. As a result, it was confirmed that it was purified with high purity as shown in FIG.
  • the present inventors put the purified protein in a pre-hydrated regenerated cellulose (RC) tubing, put it in a 2 L beaker containing a formulation buffer (PBS, pH 7.4) suitable for the pI value of the candidate material, and The formulation was carried out by dialysis overnight under temperature conditions. The formulated material was quantified using Nano drop and the final purity was confirmed using SEC-HPLC. As a result, as shown in Table 5 and Figure 6c, the total protein production was 184 mg and the productivity was 61 mg/L, and the purity reached 99.4%, indicating that it was purified with very high purity, and the endotoxin content was It was found to be less than 0.38 EU/mg.
  • RC regenerated cellulose
  • PG-400-2 test sample purification result matter Host cell Culture volume Total amount of protein (mg) Productivity (mg/L) water(%) Endotoxin content (EU/mg) Purification step Formulation buffer PG-400-2 HEK293 3 L 184 61 99.4 ⁇ 0.38 Protein A affinity chromatography-> gel filtration PBS (pH7.4)
  • the humanized anti-CD154 antibody (PG-400-2) according to an embodiment of the present invention can be produced with high purity even if the scale is increased in human cells.
  • the present inventors produced polynucleotides encoding each of the heavy and light chains of the PG-410 protein designed in Example 4, and then cloned them into the N293F Vector system (YBiologics) in the same manner as in Example 5-1. , It was cotransfected into HEK293 cells.
  • PG-410 protein according to an embodiment of the present invention was purified in the same manner as in Example 5-1, except that the cotransfected HEK293 cells were cultured to 2.3 L and the gel filtration step was omitted. .
  • the IL-10-added humanized anti-CD154 antibody (PG-410) according to an embodiment of the present invention does not have a gel filtration step, and the C-terminus of the heavy chain
  • the protein productivity was higher at 128.2 mg/L, although the culture scale was smaller than that of PG-400-2, and the content of endotoxin was also very low at 0.021 EU/mg.
  • the present inventors analyzed whether PG-400-2 and PG-410 designed in Example 4 also specifically bind to CD154 like the fusion protein prepared in Example 2 through Bio-layer interferometry (BLI) analysis. I did.
  • a sample CD154 was diluted to 5 ⁇ g/ml in 10 mM acetic acid solution (pH 6.0), and 200 ⁇ l was dispensed into a 96-well black plate. Then, added in 200 ⁇ l of 1 M ethanolamine in 96-well black plate, by inserting a biosensor plate and the sample plate to the Octet ⁇ K2 BLI analyzer measures the signal given by combining the amine CD154 sensor. When the measurement was completed, the 96-well black sample plate was removed from the measuring device, and then 200 ⁇ l of 1x kinetic buffer was added to measure the baseline.
  • the analyte antibody PG-400-2/PG-410 was sequentially diluted in 1X kinetic buffer so that the concentration was 200-12.5 nM, and 200 ⁇ l was dispensed into a 96-well black plate. Then, the 96-well black plate was inserted into an Octet ® K2 BLI analyzer, and a signal was measured while reacting with CD154.
  • both PG-400 and PG-410 specifically bind to CD154.
  • the K on value is about 4.3 times lower than that of the PG-400, but the K dis value is ⁇ 1E-07, which is high.
  • PG-410 binding to CD154 occurs slightly later than PG-400-2, the dissociation rate after binding is higher than that of PG-410, so the overall binding force is higher than that of PG-410 (3,000 times or more. height).
  • IL-10 of the recombinant humanized antibody (PG-410) in the form of a monomeric IL-10 variant (IL-10Vm) added to the C-terminus of the heavy chain exerts its function The effect on the immune response of cells was investigated.
  • the supernatant of the T75 flask containing the raw 264.7 cells of the macrophage cell line in culture was removed and washed once with PBS. After 3 ml of TrypLE TM Select Enzyme was added, it was incubated for 3-5 minutes in an incubator at 37°C. Subsequently, 10 ml of a new medium was added to the T75 flask, and the cell suspension separated from the plate was placed in a 50 mL centrifuge tube, followed by centrifugation at 1,500 rpm for 5 minutes. Then, the supernatant was removed, and the centrifuge tube was gently blown several times to suspend the cells. Then, after mixing with 5 mL of medium, the cells were counted.
  • a medium was added and diluted so that the cell concentration was 1 ⁇ 10 5 cells/ml, and then 100 ⁇ l was dispensed into a 96-well flat bottom plate. After 10 hours, 50 ⁇ l of PG-410 was sequentially diluted to a final concentration of 1000 to 0.003 nM in a 96-well flat bottom plate. After 20 minutes, 400 ng/ml LPS was treated. Then, incubated for 16 hours in an incubator at 37°C, the supernatant was collected the next day, and then the concentration of TNF ⁇ was measured according to the manufacturer's protocol using a TNF ⁇ ELISA kit (Biolegend) (FIG. 9A). On the other hand, recombinant IL-10 was used as a positive control.
  • the recombinant humanized antibody according to an embodiment of the present invention has a lower immunosuppressive activity about 100 times compared to the recombinant IL-10.
  • Macrophage immunosuppressive activity assay result of PG-410 and IL-10 Treatment concentration 0.0003 0.0013 0.006 0.032 0.16 0.8 4 20 100 IL-10 inhibition rate (%) 10% 17% 39% 55% 64% 70% 71% 73% 73% Treatment concentration (nM) 0.003 0.013 0.06 0.32 1.6 8 40 200 1,000 Inhibition rate of PG-410 (%) 8% 13% 24% 29% 38% 45% 56% 59% 58%
  • the single-dose toxicity test method conducted by Biotoxtech was carried out as follows. Toxicity tests were performed using 5-week-old female ICR mice, and 3 animals were reared per cage under the specified breeding conditions. The acclimatization period was set for 1 week, during which general symptoms were observed, and only healthy animals were used in the test, and food and drinking water were freely consumed. The weights of animals used in the experiment were measured so that the average weight of each group was equalized, and individual identification was marked on the tail of the animals, and an individual identification card was attached to the breeding box.
  • PG-410 was administered intravenously to mice once with sterile physiological saline as a control, and a maximum of 300 mg/kg was administered based on the body weight immediately before administration, and the toxicity test was examined by autopsy.
  • the present inventors investigated whether the recombinant humanized antibody PG-410 according to an embodiment of the present invention can be used for the treatment of graft versus host disease, which is a major side effect occurring during organ transplantation, through an experiment through an animal model.
  • mice 6-week-old male NSG mice were purchased from Orient Bio, and general symptoms were observed every day while undergoing acclimatization for 7 days in the animal room for this test.
  • a review of the test report for pathogens provided by the animal supplier showed no factors that could affect the test.
  • the weights of animals determined to be healthy were ranked and randomly distributed so that the average weight of each group was evenly distributed.
  • the test substance was prepared at 5 mpk (100 ⁇ g/head), and the test substance was administered intravenously to mice before and 28 days after the induction of GVHD using sterile physiological saline as a control.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the group administered with PG-410 did not lose weight, unlike the negative control group, and the survival rate was remarkably higher than that of the negative control group.
  • the blood was washed with FACS buffer, and then centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes. After discarding the supernatant, the formed cell pellet was suspended in 50 ⁇ l FACS buffer diluted with 0.5 ⁇ l aqua fluorescent reactive dye, and reacted at 4° C. for 20 minutes. After washing with FACS buffer and discarding the supernatant, 50 ⁇ l of an antibody mixture (anti-human CD45, anti-mouse CD45) was added to each well, and reacted at room temperature for 20 minutes. Then, it was washed twice with FACS buffer and analyzed using a flow cytometer. The assay was repeated equally on days 14, 21, 28, and 35 of PBMC administration.
  • the modified Fc region protein used in an embodiment of the present invention is a variant designed to remove the binding ability to the Fc gamma receptor. Accordingly, the present inventors attempted to investigate whether the modified Fc region protein used according to an embodiment of the present invention does not actually bind to various Fc gamma receptors.
  • the N-terminus of the modified Fc region protein having the same amino acid sequence as the modified Fc region protein (SEQ ID NO: 5 or 6) applied to the anti-CD154 antibody fusion protein prepared according to an embodiment of the present invention is SEQ ID NO: 49.
  • Various Fc gamma receptors using a GLP-1E-Fc fusion protein (referred to as'PG-11') where the GLP-1 receptor agonist having the described amino acid sequence is linked by a linker peptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 43
  • the binding affinity with was analyzed through BLI analysis.
  • rituximab an IgG1 series recombinant antibody, was used as a control.
  • Rituximab an IgG1-based antibody, specifically binds to Fc ⁇ RI and Fc ⁇ RIIIa, whereas, PG-11, a fusion protein containing NTIG according to an embodiment of the present invention, is these antibody receptors. It was confirmed that it did not specifically bind with.
  • the present inventors compared and analyzed the binding affinity of the GLP-1E-Fc fusion protein and rituximab with Fc ⁇ RIIa, Fc ⁇ RIIb and Fc ⁇ RIIIb according to an embodiment of the present invention.
  • rituximab specifically binds to the three Fc receptors, whereas the fusion protein according to an embodiment of the present invention exhibits very weak binding.
  • modified Fc region protein used in the present invention does not bind to various Fc gamma receptors, unwanted side effects of conventional antibody therapeutics such as ADCC or CDC can be minimized.
  • the recombinant fusion protein according to an embodiment of the present invention may be usefully used in the development of therapeutic agents for autoimmune diseases.

Abstract

본 발명은 신규 융합단백질 및 그의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 CD154에 특이적으로 결합하는 Fab 또는 scFv, 및 Fc 영역을 포함하는 CD154 특이적으로 결합하는 융합단백질에 있어서, 상기 Fc 영역은 Fc 감마 수용체에 결합하지 않도록 변이된 변형 Fc 영역인, CD154 특이적으로 결합하는 융합단백질에 관한 것이다.

Description

신규 융합단백질 및 그의 용도
본 발명은 신규 융합단백질 및 그의 용도에 관한 것으로서, 구체적으로는 자가면역질환의 치료에 사용가능한 신규 융합단백질 및 그의 용도에 관한 것이다.
자가면역반응이란 우리 몸의 세포들을 외부 물질로 인식하여 각종 면역반응을 통해 세포조직을 파괴하는 현상이다. 대표적인 자가면역질환으로는 류마티스성 관절염, 전신 홍반성 루푸스, 건선，염증성 장질환，다발성 경화증 등이 있으며，이러한 자가면역질환들은 그 원인이 명확하지 않아 치료가 어렵다. 또한，자가면역반응은 이식된 장기가 면역 반응을 유발하여 발생할 수도 있다. 따라서，이러한 자가면역질환이나 자가면역반응을 억제하기 위하여 다양한 면역억제제들의 개발이 요구된다.
일반적으로 사용되고 있는 면역억제제로는 칼시뉴린 억제제인 타크로리무스 (tacrolimus), 유전자 합성 억제제인 마이코페노레이트모페틸(mycophenolatemofetil), 항염증 스테로이드인 프레드니손(prednisone) 등이 있다. 그러나，이러한 면역억제제는 장기간 투여되기 때문에 심각한 부작용을 유발할 수 있다(Kalluri and Hardinger, World J. Translant. 2(4): 51-68, 2012； Tanabe et al., Translantation, 93(7): 709-719, 2012； Zaza et al., Toxins 6(3): 869-891, 2014).
이에，종래 면역억제제를 대체하거나 약물의 지속기간을 늘리기 위해 다양 한 생물의약품들이 개발되고 있는데，이 중 하나가 공동자극(costimulation) 억제 제이다. 대표적인 공동자극 면역반응으로는 CD28-CD80/CD86, CTLA4-CD80/CD86, CD40-CD40L(CD154) 및 PD-1/PD-L1 등이 있으며，이의 억제를 위하여 CTLA4-Fc, 항-CD40 및 항-CD154 항체 등이 상술한 생물의약품으로 연구되고 있다(Kinnear et al., Transplantation 95(4): 527-535, 2013; Riella et al., Am. J. Transplant. 12(10): 2575-2587, 2012； Hardinger and Brennan, World J. Transplant. 3(4): 68-77, 2013). 한편， CD40은 B 세포, 대식세포，수지상세포，흉선 상피세포와 같은 항원제시세포뿐만 아니라 상피세포 및 섬유아세포 등의 일반 세포에서도 발현된다. CD40L이라고도 알려진，CD154는 활성화된 T 세포와 자연살해(natural killer) 세포에서 주로 발현이 된다. CD40-CD154 신호전달을 통하여 B 세포와 대식세포가 활성화되고 간접적으로 T 세포도 활성화시켜，면역반응을 촉진시킨다(Karimi and Pour fathollah, Iran. J. Allergy Asthma Immunol. 11(1): 1-13, 20012).
이에，CD154의 작용을 조절함으로써 면역반응을 억제하기 위하여，항-CD154 항체가 개발되었고，상기 항체는 원숭이를 비롯한 동물실험에서 좋은 효과를 보였 다. 그러나 사람을 대상으로 하는 임상실험 결과，항-CD154 항체는 혈전생성이라 는 심각한 부작용을 나타내어，현재 CD154을 표적으로 하는 항체 의약품 개발은 중단된 상태이다(Kalunian et al., Arthritis. Rheum. 46(12): 3251-3258, 2002; Boumpas et al., Arthritis Rheum. 48(3): 719-727, 2003； Pilat et al., Curr. Opin. Organ Translant. 17: 368-375, 2012).
한편, IL-10은 면역자극 활성이라는 정 반대의 작용도 갖는 이중특성을 갖는 것으로 알려지고 있다. 이와 관련하여 구체적으로 IL-10은 B 세포 활성화를 자극하고, B 세포의 생존을 연장하며, B 세포의 클래스 전환(class switching)에 기여할 수 있다. 또한 NK 세포 증식과 사이토카인 생성을 자극할 수 있으며 CD8+ T 세포의 특정 부분 집단의 증식을 촉진하는 성장인자 역할을 할 수 있다(Mosser & Yhang, Immunol. Rev. 226: 205-218, 2009; Cai et al., Eur. J. Immunol. 29: 2658-2665, 1999; Santin et al., J. Virol. 74: 4729-4737, 2000; Rowbottom et al., Immunol. 160: 3188-3193, 1998). 중요하게도, 인간에서 고용량의(각각 20 및 25 ㎍/kg) IL-10은 IFNγ의 생산을 증가시킬 수 있는 것으로 보고된 바 있다(Lauw et al., J. Immunol., 165: 2783-2789, 2000; Tilg et al., Gut 50: 191-195, 2002).
상기와 같은 혈전 형성의 원인은 항-CD154 항체와 혈소판의 FcγRII와의 결합에 기인한 것으로 알려지고 있다(Shields et al., J. Biol. Chem. 276(9): 6591-6604, 2001). 이런 이유로 본 출원인에 의해 FcγRI 및 FcγRIII와의 결합은 유지하되, FcγRII와의 결합은 차단함으로써 혈전 생성의 부작용이 낮아진 새로운 항-CD154 항체가 개발된 바 있다(WO2016/182335A1).
그러나, 상기 항체는 혈전 형성의 부작용을 완전히 극복하지 못하였다는 측면에서 의약으로서의 한계를 가지고 있는 단점이 있다.
본 발명은 상술한 문제점을 포함하여 여러 가지 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 생체 내 투여 시 혈전 형성 가능성을 제거하면서도 CD154의 기능을 효과적으로 차단함으로써 자가면역질환에 대한 치료효과를 나타낼 수 있는 새로운 항-CD154 융합단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나, 본 발명의 보호범위가 상기 목적으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 인간 CD154에 특이적으로 결합하는 Fab 또는 scFv, 및 Fc 영역을 포함하는 CD154 특이적으로 결합하는 융합단백질에 있어서, 상기 Fc 영역은 Fc 감마 수용체에 결합하지 않도록 변이된 변형 Fc 영역인, 융합단백질이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, a) CD154에 특이적으로 결합하는 항체의 항원-결합 단편 또는 항체 유사체; b) Fc 감마 수용체에 결합하지 않도록 변이된 변형 Fc 영역; 및 c) IL-10 단백질을 순차적으로 포함하는, 융합단백질이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 융합단백질을 유효성분으로 포함하는, 면역억제용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 자가면역 질환 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 상기 융합단백질을 자가면역 질환에 걸린 환자에게 투여하는 상기 개체의 자가면역 질환 치료방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질은 종래 기술의 항-CD154 항체의 단점인 혈전형성 가능성을 매우 낮춘 안전한 물질로서, 면역억제제 및 자가면역질환 치료제로 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명자들이 개발한 WO2016/182335A1에 기재된 CD154에 특이적으로 결합하는 항체(C10M)의 구조를 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 2는 야생형 IgG1 Fc 부위가 적용된 항-CD154 항체(좌측) 및 WO2016/182335A1에 기재되어 있는 FcγRIIα 결합 저해를 위한 변이체 IgG1 Fc 부위가 적용된 항-CD154 키메라 항체(C10M, 우측)를 야생형 마우스 및 인간 FcγRIIα-형질전환 마우스에 투여한 후 생성된 혈전을 염색하고 혈전 수를 계수한 결과를 나타내는 일련의 사진이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 CD154에 특이적으로 결합하는 융합단백질(좌측: PG-400 및 우측: PG-410)의 구조를 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른 키메라 하이브리드 항체(PG-400-1)을 세포에서 일시적으로 발현한 후 정제과정에서의 단백질을 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타내는 사진이고, 도 4b는 상기 키메라 하이브리드 항체(PG-400-1)을 항-IgG4 Fc 항체를 이용하여 웨스턴블랏 분석한 결과를 나타내는 사진이며, 도 4c는 최종 정제된 산물의 순도를 측정하기 위해 SEC-HPLC 분석을 수행한 결과를 나타내는 크로마토그램이며, 도 4d는 상기 키메라 하이브리드 항체(PG-400-1)을 안정적 세포주로부터 발현시킨 후 최종 정제된 단백질을 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타내는 사진이고, 도 4e는 안정적 세포주로부터 발현된 최종 단백질의 순도를 확인하기 위해 SEC-HPLC 분석을 수행한 결과를 나타내는 크로마토그램이다.
도 5는 WO2016/182335A1에 기재되어 있는 FcγRIIα 결합 저해를 위한 변이체 IgG1 Fc 부위가 적용된 항-CD154 키메라 항체(C10M, 우측) 및 실시예 2에서 제조된 키메라 하이브리드 항체(PG-400-1, 좌측)의 CD40L과의 결합 친화도를 BLI 분석으로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 인간화 항-CD154 항체(PG-400-2)를 HEK293 세포에서 발현시킨 후 세포배양액을 대상으로 수행한 환원 PAGE 분석결과를 나타내는 사진이고, 도 6b는 상기 세포배양액을 Protein A 친화성 크로마토그래피 및 겔 여과를 통한 정제 후 환원(좌측) 및 비환원(우측) 조건에서 PAGE 분석한 결과를 나타내는 사진이며, 도 6c는 정제된 PG-400-2를 HPLC로 분석한 결과를 나타내는 크로마토그램이다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 인간화 항-CD154 항체(PG-410)을 HEK293 세포에서 발현시킨 후 세포배양액을 대상으로 수행한 환원 PAGE 분석 결과를 나타내는 사진이고, 도 7b는 상기 세포배양액을 Protein A 친화성 크로마토그래피 및 겔 여과를 통한 정제 후 환원(좌측) 및 비환원(우측) 조건에서 PAGE 분석한 결과를 나타내는 사진이며, 도 7c는 정제된 PG-410을 HPLC로 분석한 결과를 나타내는 크로마토그램이다.
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 인간화 항-CD154 항체(PG-400-2)의 CD154와의 결합 정도를 BLI 분석으로 분석한 결과를 나타내는 센소그램이고, 도 8b는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 인간화 항-CD154 항체(PG-410)의 CD154와의 결합 정도를 BLI 분석으로 분석한 결과를 나타내는 센소그램이다.
도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 인간화 항-CD154 항체(PG-410)의 IL-10에 의한 면역억제 활성을 조사하기 위한 실험 스케쥴을 개략적으로 나타낸 개요도이고, 도 9b는 재조합 IL-10(좌측)과 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 인간화 항-CD154 항체(PG-410)를 대식세포주 Raw264.7에 처리시 TNFα의 발현을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10a는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 인간화 항-CD154 항체(PG-410)의 투여에 의한 GVHD 치료효과를 확인하기 위한 동물실험 스케쥴을 개략적으로 나타낸 개요도이고, 도 10b는 PBMC를 투여한 대조군 및 PG-410 투여군에서의 시간의 경과에 따른 체중의 변화를 기록한 그래프이며, 도 10c는 PBMC를 투여한 대조군 및 PG-410 투여군에서의 시간의 경과에 따른 생존율을 기록한 그래프이다.
도 11는 대조군(vehicle) 및 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 인간화 항-CD154 항체(PG-410) 투여군에서 시간의 경과에 따른 인간 CD45+ 세포집단의 비율을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 변형 Fc 영역 단백질 및 대조군인 리툭시맙의 Fc 감마 수용체 I 및 IIIa와의 결합 친화도를 비교 분석한 BLI 분석 결과를 나타내는 일련의 센소그램이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 변형 Fc 영역 단백질 및 대조군인 리툭시맙의 다양한 Fc 감마 수용체에 대한 결합 친화도를 비교 분석한 결과로서, 도 13a는 기저선을 확인하기 위해 PBS를 처리한 후 BLI 분석을 수행한 결과를 나타내는 센소그램이고, 도 13b는 본 발명의 일 실시예에 따른 변형 Fc 영역 단백질 및 대조군인 리툭시맙의 Fc 감마 수용체 IIa와의 결합 친화도를 BLI 분석으로 분석한 결과를 나타내는 센소그램이며, 도 13c는 본 발명의 일 실시예에 따른 변형 Fc 영역 단백질 및 대조군인 리툭시맙의 Fc 감마 수용체 IIb와의 결합 친화도를 BLI 분석으로 분석한 결과를 나타내는 센소그램이고, 도 13d는 본 발명의 일 실시예에 따른 변형 Fc 영역 단백질 및 대조군인 리툭시맙의 Fc 감마 수용체 IIIb와의 결합 친화도를 BLI 분석으로 분석한 결과를 나타내는 센소그램이다.
본 발명의 일 관점에 따르면, CD154에 특이적으로 결합하는 Fab 또는 scFv, 및 Fc 영역을 포함하는 CD154 특이적으로 결합하는 융합단백질에 있어서, 상기 Fc 영역은 Fc 감마 수용체에 결합하지 않도록 변이된 변형 Fc 영역인, 융합단백질이 제공된다.
상기 융합단백질에 있어서, 상기 CD154에 특이적으로 결합하는 Fab는 서열번호 2로 기재되는 아미노산으로 구성되는 경쇄(VL-CL) 및 서열번호 9로 기재되는 아미노산으로 구성되는 중쇄 VH-CH1 단편; 또는 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 경쇄(VL-CL) 및 서열번호 11로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 VH-CH1 단편으로 구성될 수 있다.
상기 융합단백질에 있어서, 상기 scFv는 서열번호 14로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 가변 도메인(VL) 및 서열번호 15로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 가변 영역(VH)이 링커 펩타이드에 의해 연결된 것일 수 있다. 상기 링커 펩타이드는 후술된 것들 중 어느 하나를 사용할 수 있다.
상기 융합단백질에 있어서, 상기 Fc 감마 수용체는 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB1, FcγRIIB2, FcγRIIIA, 및/또는 FcγRIIIB일 수 있다.
상기 융합단백질에 있어서, 상기 CD154에 특이적으로 결합하는 Fab 또는 scFv, 및 Fc 영역은 힌지 또는 링커 펩타이드에 의해 연결될 수 있다. 상기 힌지는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgD, 또는 이들 중 적어도 둘 이상의 혼합된 하이브리드 힌지일 수 있다. 상기 힌지는 서열번호 40 내지 42 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 링커 펩타이드는 융합 단백질의 융합 파트너의 기능을 저해하지 않는 것이라면 그 어떠한 것이라도 사용될 수 있고, 바람직하게는 하기에 정의된 것들 중 어느 하나를 사용할 수 있다.
상기 융합단백질에 있어서, 상기 Fc 영역은 Fc 감마 수용체와 실질적으로 결합하지 않도록 변이된 것으로서, 종래에 알려진 Fc 감마 수용체 비결합성 변이체라면 그 어떠한 것도 사용이 가능하고, IgA, IgG, IgM, IgD 또는 IgE의 Fc 영역 또는 이들의 도메인들 예컨대 힌지, CH2, CH3의 전부 또는 일부가 혼합된 하이브리드 Fc일 수 있고, 상기 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4일 수 있으며, 특히, Fc 감마 수용체(FcγRc) 및 보체(C1a)에 대한 친화도가 낮도록, Fc의 효과기(effector) 기능인 항체-의존성 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC) 또는 보체-의존성 세포독성(complement-dependent cytotoxicity, CDC)을 담당하는 기능기 부분에 변이가 유도된 변이체 Fc 및/또는 신생아 Fc 수용체(neonatal Fc receptor, FcRn)에 대한 선택적 친화도가 높아서 혈중반감기가 증가될 수 있도록 변이된 변이체 Fc일 수 있다. 이 중, 상기 하이브리드 Fc는 대한민국 특허 제897938호, 제1380732호, 제1380729호 등에 기재된 것을 사용할 수 있고, 상기 변이체 Fc는 국제특허출원 PCT/KR2020/006346에 기재된 변형 면역글로불린 Fc 단백질(NTIG)일 수 있다. 바람직하게는 서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열, 또는 상기 서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열의 18번째 아미노산이 T로, 196번째 아미노산 서열이 M으로 변이된 것으로 구성된, 변형 Fc 영역을 사용할 수 있다.
상기 융합단백질은 상기 Fc 영역의 C-말단에 IL-10 단백질이 부가된 형태일 수 있다.
상기 IL-10 단백질은 UniProtKB P22301에 기재된 아미노산 서열에서 신호서열이 제거된 19-178번째 아미노산 서열을 포함하는 성숙형(mature form) 단백질일 수 있고, 상기 성숙형 단백질의 87번째 아미노산인 이소류신이 알라닌으로 치환된 IL-10 변이체 단백질일 수 있으며, 116번째 아미노산인 아스파라긴 및 117번째 아미노산인 라이신 사이에 6 내지 12 a.a.의 길이를 갖는 링커(스페이서) 펩타이드가 삽입된 단량체성 IL-10 변이체 단백질일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, a) CD154에 특이적으로 결합하는 항체의 항원-결합 단편 또는 항체 유사체; b) Fc 감마 수용체에 결합하지 않도록 변이된 변형 Fc 영역; 및 c) IL-10 단백질을 순차적으로 포함하는, 융합단백질이 제공된다. 상기 융합단백질에 있어서, 상기 항체의 항원-결합 단편은 Fab, F(ab')2, Fab', scFv, diabody, triabody, sdAb(single domain antibody), VNAR 또는 VHH일일 수 있고, 상기 항체 유사체는 affibody, affilin, affimer, affitin, alphabody, anticalin, avimer, DARPin, Fynomer, Kunitz domain peptide, monobody, repebody, VLR, 또는 nanoCLAMP일 수 있다.
상기 융합단백질에 있어서, 상기 Fc 감마 수용체는 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB1, FcγRIIB2, FcγRIIIA, 및/또는 FcγRIIIB일 수 있다.
상기 융합단백질에 있어서, 상기 a) 및 b) 사이, b) 및 c) 사이는 힌지 또는 링커 펩타이드에 의해 연결될 수 있다. 상기 힌지는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgD, 또는 이들 중 적어도 둘 이상의 혼합된 하이브리드 힌지일 수 있다. 상기 힌지는 서열번호 40 내지 42 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 링커 펩타이드는 융합 단백질의 융합 파트너의 기능을 저해하지 않는 것이라면 그 어떠한 것이라도 사용될 수 있고, 바람직하게는 하기에 정의된 것들 중 어느 하나를 사용할 수 있다.
상기 융합단백질에 있어서, 상기 Fc 영역은 Fc 감마 수용체와 실질적으로 결합하지 않도록 변이된 것으로서, 종래에 알려진 Fc 감마 수용체 비결합성 변이체라면 그 어떠한 것도 사용이 가능하고, 바람직하게는 서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열, 또는 상기 서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열의 18번째 아미노산이 T로, 196번째 아미노산 서열이 M으로 변이된 것으로 구성된, 변형 Fc 영역을 사용할 수 있다.
상기 융합단백질에 있어서, 상기 IL-10 단백질은 UniProtKB P22301에 기재된 아미노산 서열에서 신호서열이 제거된 19-178번째 아미노산 서열을 포함하는 성숙형(mature form) 단백질일 수 있고, 상기 성숙형 단백질의 87번째 아미노산인 이소류신이 알라닌으로 치환된 IL-10 변이체 단백질일 수 있으며, 116번째 아미노산인 아스파라긴 및 117번째 아미노산인 라이신 사이에 6 내지 12 a.a.의 길이를 갖는 링커(또는 스페이서) 펩타이드가 삽입된 단량체성 IL-10 변이체 단백질일 수 있으며, 서열번호 7 또는 8로 기재되는 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "융합단백질"은 둘 이상의 단백질 또는 단백질 내 특정 기능을 담당하는 도메인이 각각의 단백질 또는 도메인이 본연의 기능을 담당하도록 연결된 재조합 단백질(recombinant protein)을 의미한다. 상기 둘 이상의 단백질 또는 도메인 사이에는 통상적으로 유연한 구조를 갖는 링커 펩타이드(linker peptide)가 삽입될 수 있다. 상기 링커 펩타이드는 AAGSGGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 12), GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 17), GGSGG(서열번호 17), GGSGGSGGS(서열번호 18), GGGSGG(서열번호 19), (G4S)n(단위체: 서열번호 20, n은 1 내지 10의 정수), (GGS)n(n은 1 내지 10의 정수), (GS)n(n은 1 내지 10의 정수), (GSSGGS)n(단위체: 서열번호 21, n은 1 내지 10의 정수), KESGSVSSEQLAQFRSLD(서열번호 22), EGKSSGSGSESKST(서열번호 23), GSAGSAAGSGEF(서열번호 24), (EAAAK)n(단위체: 서열번호 25, n은 1 내지 10의 정수), CRRRRRREAEAC(서열번호 26), A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A(서열번호 27), GGGGGGGG(서열번호 28), GGGGGG(서열번호 29), AEAAAKEAAAAKA(서열번호 30), PAPAP(서열번호 31), (Ala-Pro)n(n은 1 내지 10의 정수), VSQTSKLTRAETVFPDV(서열번호 32), PLGLWA(서열번호 33), TRHRQPRGWE(서열번호 34), AGNRVRRSVG(서열번호 35), RRRRRRRR(서열번호 36), GFLG(서열번호 37), GSSGGSGSSGGSGGGDEADGSRGSQKAGVDE(서열번호 38), GSTSGSGKPGSGEGS(서열번호 39), EPKSCDKTHTCPPC(서열번호 40), EPKSSDKTHTCPPC(서열번호 41) 및 THTCPPCP(서열번호 42), GGGGSGGGGSGGGGSEKEKEEQEERTHTCPPCP(서열번호 43), RNTGRGGEEKKGSKEKEEQEERETKTPECP(서열번호 44), GGGGSGGGGSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCP(서열번호 45), GSGGGSGTLVTVSSESKYGPPCPPCP(서열번호 46), GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCP(서열번호 47), 및 GGGGSGGGGSGGGGSAKNTTAPATTRNTTRGGEEKKKEKEKEEQEERTHTCPPCP(서열번호 48) 등이 포함될 수 있다. 특히 서열번호 40 내지 48은 항체 유래의 힌지 펩타이드 또는 힌지와 다른 링커 펩타이드가 혼재된 하이브리드 힌지 펩타이드로 CD154에 특이적으로 결합하는 Fab가 Fc 영역과 연결될 때 사용할 경우 항체의 기본적인 구조가 그대로 활용된다는 점에서 유리할 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "항체"는 이뮤노글로불린(immunoglobulin) 분자로서 2 개의 동일한 중쇄 및 2 개의 동일한 경쇄가 결합하여 생성되는 이종 사량체 단백질로 상기 경쇄의 가변지역(VL) 및 상기 중쇄의 가변영역(VH)에 의해 구성되는 항원 인식부위(antigen-binding site)를 통해 항원 특이적 결합을 하며, 이를 통해 항원-특이적 체액성 면역반응(humoral immune response)을 유발한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "항체의 항원-결합 단편(antigen-binding fragment of antibody"은 항체에서 유래한 항원 결합능을 가지고 있는 단편으로서 항체를 단백질 절단효소로 절단하여 생성된 단편은 물론 재조합 방식에 생성된 단일쇄 단편을 모두 포함하는데 이에는 Fab, F(ab')2, scFv, diabody, triabody, sdAb, 및 VHH가 포함된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "Fab"는 항원-결합 항체단편(fragment antigen-binding)으로서 항체 분자를 단백질 분해효소인 파파인으로 절단하여 생성되는 단편으로 VH-CH1 및 VL-CL의 두 펩타이드의 이량체로, 파파인에 의해 생성된 다른 단편은 Fc(fragment crystallizable)라 지칭한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "F(ab')2"는 항체를 단백질 분해효소인 펩신으로 절단하여 생성되는 단편 중 항원결합 부위를 포함하는 단편으로 상기 Fab 두 개가 이황화결합으로 연결된 4량체의 형태를 나타낸다. 펩신에 의해 생성된 다른 단편은 pFc'으로 지칭한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "Fab'"는 상기 F(ab')2를 약한 환원조건에서 분리시킴으로써 생성되는 Fab와 구조가 유사한 분자이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "scFv"는 "single chain variable fragment"의 약어로서 실제 항체의 단편은 아니나, 항체의 중쇄 가변영역(VH)과 경쇄 가변영역(VL)을 약 25 a.a. 크기의 링커 펩타이드로 연결하여 제조한 일종의 융합단백질로서 고유의 항체 단편이 아님에도 불구하고 항원 결합능을 지닌 것으로 알려지고 있다(Glockshuber et al., Biochem. 29(6): 1362-1367, 1990).
본 문서에서 사용되는 용어 "diabody" 및 "triabody"는 각각 두 개 및 세 개의 scFv가 링커에 의해 연결된 형태의 항체 단편을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "sdAb(single domain antibody)"는 나노바디(nanobody)로도 불리우는 항체의 단일 가변영역 단편으로 구성된 항체 단편이다. 주로 중쇄로부터 유래한 sdAb가 사용되나, 경쇄로부터 유래한 단일 가변영역 단편 역시 항원에 대하여 특이적 결합이 되는 것으로 보고되고 있다. 중쇄 및 경쇄로 이루어진 통상의 항체와 달리 단일쇄의 이량체로만 구성되는 상어 항체의 가변영역 단편으로 이루어진 VNAR 및 낙타류 항체의 가변영역 단편으로 이루어진 VHH도 sdAb에 포함된다.
본 문서에서 사용되는 "항체 유사체(antibody mimetic)"는 두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄가 이종 사합체의 4차 구조를 형성하여 기능을 발휘하는 통상의 전장 항체와 달리, monobody, 가변 림프구 수용체(VLR) 등과 같이 비항체 유래의 단백질 스캐폴드로부터 제조되는 항체와 유사한 기능 즉, 항원 결합능을 갖는 단백질을 포함하는 개념이다. 이러한 항체 유사체로는 단백질 A의 Z domain 유래의 Affibody(Nygren, P. A., FEBS J. 275(11): 2668-2676, 2008), Gamma-B crystallin 또는 Ubiquitin 유래의 Affilin(Ebersbach et al., J. Mol. Biol. 372(1): 172-185, 2007), Cystatin 유래의 Affimer(Johnson et al., Anal. Chem. 84(15): 6553-6560, 2012), Sac7d 유래의 Affitin(Krehenbrink et al., J. Mol. Biol. 383 (5): 1058-1068, 2008), Triple helix coiled coil 단백질 유래의 Alphabody(Desmet et al., Nat. Commun. 5: 5237, 2014), lipocalin 유래의 Anticalin(Skerra et al., FEBS J. 275(11): 2677-2683, 2008), 다양한 막 수용체의 도메인 유래의 Avimer(Silverman et al., Nat. Biotechnol. 23(12): 1556-1561, 2005), Ankyrin repeat motif 유래의 DARPin(Stumpp et al., Drug Discov. Today. 13(15-16): 695-701, 2008), Fyn 단백질의 SH3 도메인 유래의 Fynomer(Grabulovski et al., J. Biol. Chem. 282(5): 3196-3204, 2007), 다양한 단백질 저해제의 Kunitz 도메인 유래의 Kunitz domain peptide(Nixon and Wood, Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 9(2): 261-268, 2006), 피브로넥틴의 10번째 제3형 도메인 유래의 monobody(Koide and Koide, Methods Mol. Biol. 352: 95-109, 2007), 탄수화물 결합 모듈 32-2 유래의 nanoCLAMP(Suderman et al., Protein Exp. Purif. 134: 114-124, 2017), 먹장어 유래의 가변 림프구 수용체(variable lymphocyte receptor, VLR)(Boehm et al., Ann. Rev. Immunol. 30: 203-220, 2012), 및 상기 VLR을 기반으로 항원 친화성을 향상시키도록 조작된 repebody(Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109: 3299-3304, 2012) 등이 포함된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터가 제공된다.
상기 재조합 벡터에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 조절서열에 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트 형태로 포함될 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결된(operably linked to)"이란 목적으로 하는 핵산서열(예컨대, 시험관내 전사/번역 시스템에서 또는 숙주세포에서)이 그의 발현이 이루어질 수 있도록 하는 방식으로 상기 조절서열에 연결되어 있다는 것을 의미한다.
상기 "조절서열"이란 용어는 프로모터, 인핸서 및 다른 조절 요소(예, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 의미이다. 조절서열에는 많은 숙주세포에서 목적으로 하는 핵산이 항상적으로 발현될 수 있도록 지시하는 것, 특정한 조직세포에서만 목적으로 하는 핵산이 발현될 수 있도록 지시하는 것(예, 조직특이적 조절서열), 그리고 특정 신호에 의해 발현이 유도되도록 지시하는 것(예, 유도성 조절서열)이 포함된다. 발현벡터의 설계는 형질전환될 숙주세포의 선택 및 원하는 단백질 발현의 수준 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다는 것은 당업자라면 이해할 수 있다. 본 발명의 발현벡터는 숙주 세포에 도입되어 상기 융합단백질을 발현할 수 있다. 상기 진핵세포 및 원핵세포에서 발현을 가능하게 하는 조절서열들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 상술한 바와 같이, 이들은 보통 전사개시를 담당하는 조절서열들 및, 선택적으로 전사물의 전사종결 및 안정화를 담당하는 폴리-A 신호를 포함한다. 추가적인 조절서열들은 전사조절인자 외에도 번역 증진인자 및/또는 천연-조합 또는 이종성 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어 포유류 숙주 세포에서 발현을 가능하게 하는 가능한 조절서열들은 CMV-HSV 티미딘 키나아제 프로모터, SV40, RSV-프로모터(로우스 육종 바이러스), 인간 신장 요소 1α-프로모터, 글루코코르티코이드-유도성 MMTV-프로모터(몰로니 마우스 종양 바이러스), 메탈로티오네인-유도성 또는 테트라사이클린-유도성 프로모터 또는, CMV 증폭제 또는 SV40-증폭제와 같은 증폭제를 포함한다. 신경 세포 내 발현을 위해, 신경미세섬유-프로모터(neurofilament-promoter), PGDF-프로모터, NSE-프로모터, PrP-프로모터 또는 thy-1-프로모터들이 사용될 수 있다는 것이 고려되고 있다. 상기 프로모터들은 당 분야에 알려져 있으며, 문헌(Charron, J. Biol. Chem. 270: 25739-25745, 1995)에 기술되어 있다. 원핵세포내 발현을 위해, lac-프로모터, tac-프로모터 또는 trp 프로모터를 포함하는 다수의 프로모터들이 개시되어 있다. 전사를 개시할 수 있는 인자들 외에, 상기 조절서열들은 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오타이드의 하류(downstream)에 SV40-폴리-A 부위 또는 TK-폴리-A 부위와 같은 전사 종결 신호를 포함할 수도 있다. 본 문서에서, 적당한 발현 벡터들은 당 분야에 알려져 있으며, 그 예로는 오카야마-베르그(Okayama-Berg) cDNA 발현 벡터 pcDV1(Parmacia), pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3(Invitrogene), pSPORT1(GIBCO BRL), pGX-27(특허 제1442254호), pX(Pagano et al., Science 255: 1144-1147, 1992), 효모 2-혼성(two-hybrid) 벡터, 가령 pEG202 및 dpJG4-5(Gyuris et al., Cell 75: 791-803, 1995) 또는 원핵 발현 벡터, 가령 람다 gt11 또는 pGEX(Amersham Pharmacia)가 있다. 본 발명의 핵산 분자들 외에, 벡터는 분비 신호를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있다. 상기 분비신호들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 그리고, 사용된 발현 시스템에 따라, 융합단백질을 세포 구획으로 이끌 수 있는 리더서열(leader sequence)이 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오타이드의 코딩 서열에 조합되며, 바람직하게는 해독된 단백질 또는 이의 단백질을 세포질 주변 또는 세포외 매질로 직접 분비할 수 있는 리더 서열이다.
또한, 본 발명의 벡터는 예를 들면, 표준 재조합 DNA 기술에 의하여 제조될 수 있으며, 표준 재조합 DNA 기술에는 예를 들면, 평활말단 및 접착말단 라이게이션, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 처리, 부적합한 결합을 방지하기 위하여 알칼리 포스테이즈 처리에 의한 인산기 제거 및 T4 DNA 라이게이즈에 의한 효소적 연결 등이 포함된다. 화학적 합성 또는 유전자 재조합 기술에 의하여 얻어진 신호 펩타이드를 코딩하는 DNA, 본 발명의 변이체 IL-10 단백질 또는 이를 포함하는 융합단백질을 암호화하는 DNA를 적절한 조절서열이 포함되어 있는 벡터에 재조합함으로써 본 발명의 벡터가 제조될 수 있다. 상기 조절 서열이 포함되어 있는 벡터는 상업적으로 구입 또는 제조할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 pBispecific backbone vector(Genexine, Inc., 대한민국)또는 pAD15 vector를 골격 벡터로 사용하였다.
상기 발현벡터는 분비 신호서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 분비 신호서열은 세포내에서 발현되는 재조합 단백질의 세포 밖으로의 분비를 유도하며, tPA(tissue plasminogen activator) 신호서열, HSV gDs(단순포진 바이러스 당단백질 Ds) 신호서열 또는 성장호르몬 신호서열일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 발현벡터는 숙주세포에서 상기 융합단백질을 발현하도록 할 수 있는 발현벡터일 수 있으며, 상기 발현벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 코스미드 벡터, 파지미드 벡터, 인공 인간 염색체 등 그 어떠한 형태를 나타내더라도 무방하다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 융합단백질을 유효성분으로 포함하는, 면역억제용 약학적 조성물이 제공된다.
상기 면역억제용 약학적 조성물은 자가면역 질환의 치료나 장기이식을 받은 환자의 면역억제를 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 자가면역 질환 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
상기 약학적 조성물은, 공지의 면역억제제 성분을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 공지의 면역억제제로는 글루코코르티코이드, 세포증식 억제제(cytostatic agent), 항-CD20 항체, 항-CD3 항체, 항-IL-2 항체, 이뮤노필린 저해제(immunophilin inhibitor), 인터페론 β, 오이포이드(oipoid), TNFα결합 단백질, 마코페놀레이트(mycophenolate), 핑골리모드(fingolimod) 또는 미리오신(myriocin)일 수 있다. 상기 글루코코르티코이드는 프레드니손(prednisone), 덱사메타손(dexamethasone), 또는 하이드로코르티손(hydrocortisone)일 수 있고, 상기 세포증식 억제제는 나이트로겐 머스타드(nitrogen mustard), 니트로소우레아(nitrosourea), 백금계 착물(platinum cordination complex), 폴산 유사체(folic acid analogue), 아자티오프린(azathioprine), 머캅토퓨린(mercaptopurine), 플르우로우라실(fluorouracil), 메토트렉세이트(methotrexate), 닥티노마이신(dactinomycin), 안트라사이클린(anthracycline), 미토마이신 C(mitomycin C), 블레오마이신(bleomycin), 또는 미트라마이신(mithramycin)일 수 있다. 상기 이뮤노필린 저해제는 시클로스포린(ciclosporin), 타크롤리무스(tacrolimus), 시롤리무스(sirolimus), 또는 에베롤리무스(everolimus)일 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 자가면역 질환은 제1형 당뇨병, 원형 탈모증(alopecia areata), 항-인산지질 항체 증후군(antiphospholipid antibody syndrome), 류마티스성 관절염, 건선 또는 건선성 관절염, 다발성 경화증(mutiple scelerosis), 전신 홍반 루푸스(systemic lupus erythematosus), 염증성 장질환(inflammatory bowel disease), 애디슨병(Addison's disease), 그레이브병(Graves' disease), 쇼그렌 증후군(Sjㆆgren's syndrome), 길랑-바레 증후군(Guillian-Barre syndrome), 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 중증 근무력증(Myasthenia gravis), 염증성 근육병(inflammatory myophathy), 자가면역성 혈관염(autoimmune vasculitis), 자가면역성 간염(autoimmune hepatitis), 출혈성 빈혈(hemolytic anemia), 특발성 혈소판 감소성 자반(idiopathic thrombocytopenic purpura), 일차성 담즙성 간경화증(primary biliary cirrhosis), 피부경화증(scleroderma), 백반증(vitiligo), 악성 빈혈(pernicious anemia), 또는 만성 소화장애(celiac disease)일 수 있다.
상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있고, 상기 담체 외에 약학적으로 허용가능한 보조제, 부형제 또는 희석제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용 가능한"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 약학적 조성물은 포유동물에 투여시, 활성 성분의 신속한 방출, 또는 지속 또는 지연된 방출이 가능하도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 형태를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 예를 들면, 경구, 비경구, 예를 들면 좌제, 경피, 정맥, 복강, 근육내, 병변내, 비강, 척추관내 투여로 투여될 수 있으며, 또한 서방형 또는 연속적 또는 반복적 방출을 위한 이식장치를 사용하여 투여될 수 있다. 투여횟수는 원하는 범위 내에서 하루에 1회, 또는 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 투여 기간도 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 일반적으로 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 또한 본 발명에 따른 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 최신판]에 상세히 기재되어 있다.
상기 조성물의 환자에 대한 투여량은 환자의 신장, 체표면적, 연령, 투여되는 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반적인 건강, 및 동시에 투여되는 다른 약물들을 포함하는 많은 요소들에 따라 다르다. 약학적으로 활성인 단백질은 100 ng/체중(kg) - 10 ㎎/체중(㎏)의 양으로 투여될 수 있고, 더 바람직하게는 1 내지 500 ㎍/kg(체중)으로 투여될 수 있으며, 가장 바람직하게는 5 내지 50 ㎍/kg(체중)으로 투여될 수 있는데, 상기 요소들을 고려하여 투여량이 조절될 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르며, 치료적으로 유효한 양의 상기 융합단백질을 자가면역 질환에 걸린 환자에게 투여하는 상기 개체의 자가면역 질환 치료방법이 제공된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "치료적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 0.1 mg/kg 내지 1 g/kg, 더 바람직하게는 1 mg/kg 내지 500 mg/kg일 수 있으나, 유효 투여량은 환자의 나이, 성별 및 상태에 따라 적절히 조절될 수 있다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속한 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 키메라 항-CD154 항체의 제조
본 발명자들은 WO2016/182335A1에 기재된 mouse 유래의 항-CD154 항체의 Fc 부위를 인간 IgG1 Fc 부위로 치환한 항체(C10)의 중쇄 CH2 및 CH3 도메인에 FcγRIIα 결합 저해 변이체가 도입된 항-CD154 항체를 제조하였고, 이를 'C10M'으로 명명하였다(도 1).
실험예 1: 키메라 항-CD154 항체의 혈전 형성 분석
상기와 같이 제조된 키메라 항체 C10M을 야생형 마우스와 FcγRIIα 유전자가 형질도입된 형질전환 마우스에 138 μg을 정맥주사한 후, 10분 후에 안와에서 채혈하여 EDTA 튜브에 담아 CBC-platelet 분석을 수행하고, 실험동물을 희생시킨 후 폐를 적출하여 동결박편을 제조한 후, 조직염색을 수행함으로써 혈전형성 횟수를 계수하였다.
그 결과, 도 2에서 나타난 바와 같이, 실시예 1의 C10M의 경우 종래 야생형 IgG1 Fc가 적용된 C10에 비해서 FcγRIIα 형질전환 마우스에서의 혈전형성을 현저하게 낮추긴 하였으나, 야생형 마우스에 비해서 발생되는 혈전 대비 FcγRIIα 형질전환 마우스에서 두 배 이상의 혈전이 측정되어, 혈전형성을 완전하게 억제하지는 못하는 것으로 나타났다.
실시예 2: 융합단백질의 제조
상기 실시예 1의 결과로부터 본 발명자들은 상기 C10M 항체의 Fab 부분을, FcγR와 결합을 하지 않는 변형된 Fc 영역에 연결한 융합단백질을 고안하였으며(도 3), 상기 변형된 Fc 영역은 IgG1의 힌지부분은 그대로 적용하되, IgD 및 IgG4의 CH2 및 CH3가 혼합된 형태를 도입함으로써 FcγR와 결합을 하지 않는 변형된 Fc 영역을 도입하였다.
상기 융합단백질은 상기 C10M 항체의 Fab의 중쇄부분(VH-CH1, 서열번호 9)을 변형된 Fc 영역(서열번호 6)과 연결한 하이브리드 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제조하여 이를 pBispecific 발현벡터(Genexine, Inc.)에 삽입하였다. 아울러, 상기 C10M 항체의 Fab의 경쇄부분(VL-CL, 서열번호 2)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 dual promoter하에서 Control될 수 있도록 상기 pBispecific 발현벡터에 삽입하였다.
상기에서 제조된 발현벡터는 Thermo Fisher사의 ExpiCHO kit를 이용하여 일시적 발현을 수행하였다. 구체적으로 ExpiCHO-S cell에 상기와 같이 제조된 벡터 컨스트럭트와 키트 내에 포함되어 있는 ExpiFectamine 시약을 혼합한 후 8% CO2 및 37℃의 조건을 갖춘 배양기에서 1일간 배양 후 온도를 32℃로 낮춰서 7일차까지 배양을 진행하였다.
그런 다음 Protein A 포획 정제를 수행하였고, 비환원 및 환원 조건에서의 PAGE 분석 및 웨스턴 블랏 분석을 통해서 후보물질이 정제되었는지 확인하였으며, 후보 물질의 pI 값을 고려한 제형화 완충액으로 제형화를 수행하였다. 제형화가 완료된 물질을 Nano drop을 이용하여 정량하고 SEC-HPLC를 이용해 최종 순도를 확인하였다.
그 결과, 도 4a 내지 4c에서 나타난 바와 같이, 경쇄 및 중쇄가 정상적으로 발현되었을 뿐만 아니라 비-환원 조건에서 단일 밴드로 나타나 정상적인 이종 사량체를 형성하였음을 알 수 있었다. 아울러 SEC-HPLC 분석 결과 순도는 97.9%로 매우 높게 나타났다.
이에 본 발명자들은 상기 일시적 발현 결과로부터 제조된 상기 키메라 항체를 "PG-400-1"로 명명하고, 이를 안정적으로 생산할 수 있는 안정 세포주(stable cell line)을 제조하였다.
구체적으로, PG-400-1 단백질을 발현하는 Stable cell line을 개발하기 위해서, 상기에서 제조된 유전자 컨스트럭트를 sub-vector cloning 단계를 거쳐 pGP30 발현벡터에 클로닝하였다. 그 후 상기 발현벡터를 CHO DG44(from Dr. Chasin, Columbia University, USA) 세포에 Neon- transfection system을 이용하여 형질감염시켰다. 1차 스크리닝 과정으로 HT(5-hydroxytrypamine)가 없는 10% dFBS(Gibco, USA, 30067-334), MEMα(Gibco, 12561, USA, Cat No. 12561-049), HT+ (Gibco, USA, 11067-030) 배지를 사용하여 HT 선별을 수행하였고, LDC(Limiting Dilution Cloning; 96 wells, 30 plates)를 진행하여 최종 세포주를 확보하였다. 최종 확보된 세포주를 hyCellCHO 배지 400ml에서 Fed-batch 배양 수행하였으며, 배양 15일차에 수득된 배양액에 대해 Protein A 정제를 수행하여 정제된 단백질을 확인하였으며, 정제된 단백질은 SDS-PAGE 및 SEC-HPLC를 통해 양 및 순도를 분석하였다.
그 결과 도 4d에서 나타난 바와 같이, 안정적 세포주에서 생산된 키메라 항체 역시 정상적으로 발현됨을 확인할 수 있었다. 아울러, 상기 키메라 항체는 도 4e에서 나타난 바와 같이, SEC-HPLC 분석 결과 99.97%라는 매우 높은 순도로 정제되었음을 알 수 있었다.
실험예 2: hCD40L 결합 친화도 친화도 분석
본 발명자들은 실시예 2에서 제조된 키메라 항체의 hCD40L과의 결합 친화도를 생물층 간섭계(BLI) 분석을 통해서 분석하였다.
이를 위해 우선 본 발명자들은 Dip and ReadTM Amine Reactive 2nd Generation(AR2G) Reagent Kit(forteBio, Cat No. 18-5092)를 이용하여 96 플레이트에 CD40L 단백질을 부착시켰다. 구체적으로, 96웰 플레이트에 D.W. 200 μl를 분주한 후, 상기 키트에 포함된 amine biosensor를 꽂아 10분 동안 수화시켰다. 이어, D.W. 200 μl를 추가로 분주한 후, 필요한 시료 양의 1/20로 EDC:NHS를 1:1로 혼합한 후, D.W.에 희석하여 96웰 플레이트에 200 μl 씩 분주하였다. 이어, CD40L 단백질을 10 mM acetate pH 6.0 용액에 5 μg/ml이 되도록 희석한 후 상기 96웰 플레이트에 200 μl씩 첨가하였다. 이후, 1 M 에탄올아민을 200 μl 씩 96웰 플레이트에 첨가한 후, Biosensor 플레이트와 샘플 플레이트를 Octet　- K2 기기에 넣고 측정하였다. 측정이 끝난 후 샘플 플레이트에 1x Kinetics 완충액을 200 μl를 첨가한 후, 기저값(baseline)을 정하였다. 이후, 상기 실시예 1 및 2에서 각각 제조된 키메라 항체(C10M) 및 키메라 하이브리드 항체(PG-400)을 다양한 농도(200 pM 내지 12.5 nM)로 1x Kinetic 완충액에 희석한 후 샘플 플레이트에 200 μl로 분주한 후, Octetㄾ K2 기기로 BLI(Bio-layer interferometry)을 측정하였다.
실시예 1 2
평균 KD (nM) < 1E-12 < 1E-12
평균 Kon (1/Ms) 509,500±8,890 807,000±4,250
평균 Kdis (1/s) < 1E-07 < 1E-07
평균 R2 0.96 0.93
그 결과, 도 5 및 표 1에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 실시예 1 및 2에서 각각 제조된 키메라 항체 및 키메라 하이브리드 항체는 측정 기기의 한계로 인해 1.0 pM 이하의 값은 구분이 불가능하였으나, 두 물질 모두 CD40L에 충분히 높은 친화도를 가짐을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 인간화 하이브리드 항체의 제조
본 발명자들은 상기 PG-400-1에 FcγR와 결합을 하지 않는 변형된 Fc 영역을 도입함으로써 종래 인간 항체가 가지고 있는 단점을 충분히 개선했음에도 불구하고 항원 결합 부위가 여전히 마우스 유래 항체라는 점에서 인체 내에서 불필요한 면역반응을 유발할 수 있을 것이라는 판단에 보다 안전한 하이브리드 항체를 제조하기 위해, 본 발명의 기반이 되는 항체의 항원 결합 단편인 Fab의 항원 결정기를 제외한 나머지 프레임워크 부분을 인간 항체의 서열로 치환한 인간화 항체를 고안하였고, 이를 'PG-400-2'로 명명하였다(표 2 및 3). PG-400-1 및 PG-400-2의 경우 모두 C-말단에 다른 단백질이 융합되지 않은 관계로 변형 Fc의 C-말단이 라이신(K)로 종결이 되는 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 것을 사용하였다.
아울러, 본 발명자들은 변형된 Fc 영역의 C-말단에 면역 억제 활성을 갖는 사이토카인인 IL-10 단백질을 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 링커 펩타이드로 연결하도록 고안하였으며, 이를 'PG-410'으로 명명하였다(표 2). 상기 PG-410의 경우 Fc 영역의 C-말단에 IL-10 단백질이 부가되는 관계로 Fc 영역의 C-말단의 라이신 잔기를 제거한 결실형(서열번호 5)을 사용하였다.
인간화 하이브리드 항체(PG-400-2 및 PG-410)의 중쇄 구성
구성요소 아미노산 서열 서열번호
신호서열 MGWSCIILFLVATATGVHS 10
항-CD154 중쇄 VH-CH1 QVQLVQSGAEVVKPGASVKLSCKASGYIFTSYYMYWVKQAPGQGLEWIGEINPSNGDTNFNEKFKSKATLTVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRSDGRNDMDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV 11
힌지 EPKSCDKTHT CPPCP 40
변형 Fc (PG-400-2) SHTQPLGVFL FPPKPKDQLM ISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVLHEAL HNHYTQKSLS LSLG(K) 5(6)
링커 펩타이드(PG-410 only) AAGSGGGGGS GGGGSGGGGS 12
IL-10Vm(PG-410 only) SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDAKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENGGSGGSGGSKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN 7
인간화 하이브리드 항체(PG-400-2 및 PG-410)의 경쇄 구성
구성요소 아미노산 서열 서열번호
신호서열 METDTLLLWVLLLWVPGSTG 13
항-CD154 항체 경쇄 DIVLTQSPATLSVSPGERATISCRASQRVSSSTYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFATYYCQHSWEIPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 4
실시예 4: 항-CD154 scFv-변형 Fc-IL-10 융합단백질의 제조
본 발명자들은 상기 인간화 항-CD154 항체의 Fab 중 가변영역 부분을 선별한 후 이를 이용하여 scFv를 고안하였으며, 이를 상기 실시예 3에서 사용한 항-CD154 항체의 중쇄 컨스트럭트의 VH-CH1 부분 대신에 삽입함으로써 단일쇄 기반의 항체 결합-단편 융합단백질을 고안하였으며, 이를 'PG-420'으로 명명하였다(표 4). 본 실시예에서 상기 항-CD40L scFv는 경쇄 가변영역(VL)-링커-중쇄가변영역(VH)으로 구성되어 있으나, 반대로 VH-링커-VL의 순서로 구성된 것을 사용하더라도 CD40L 결합능이 유지되므로 이를 사용하더라도 무방하고, 링커의 종류 또한 다양한 종류가 사용가능하다.
항-CD154 scFv-변형 Fc-IL-10 융합단백질(PG-420)의 구성
구성요소 아미노산 서열 서열번호
신호서열 METDTLLLWV LLLWVPGSTG 13
항-CD154 scFv VL DIVLTQSPATLSVSPGERATISCRASQRVSSSTYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFATYYCQHSWEIPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSV 14
링커 1 GSTSGSGKPGSGEGS 39
VH QVQLVQSGAEVVKPGASVKLSCKASGYIFTSYYMYWVKQAPGQGLEWIGEINPSNGDTNFNEKFKSKATLTVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRSDGRNDMDSWGQGTLVTVSS 15
힌지 EPKSCDKTHT CPPCP or EPKSSDKTHT CPPCP 40 or 41
변형 Fc SHTQPLGVFL FPPKPKDQLM ISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVLHEAL HNHYTQKSLS LSLG 5
링커 2 AAGSGGGGGS GGGGSGGGGS 12
IL-10Vm SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDAKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENGGSGGSGGSKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN 7
실시예 5: 융합단백질 시료 생산 상기 실시예 2의 융합단백질 생산은 인간화 항체가 아니라 키메라 항체의 생산이었고, 실험실 규모의 소량 생산인데다가, 숙주세포가 CHO 세포로 인간 세포 유래가 아니기 때문에, 생산된 단백질의 당쇄 패턴이 인간 단백질과 상이한 측면이 존재한다. 이에, 본 발명자들은 숙주세포를 인간세포인 HEK293 세포로 변경하고 생산규모를 3L 규모로 늘려서 상기 실시예 3의 재조합 인간화 항체(PG-400 및 PG-410)가 정상적으로 생산이 되는지 여부를 확인하고자 하였다.
5-1: PG-400-2 단백질의 생산
상기 실시예 4에서 고안된 PG-400-2 단백질의 중쇄 및 경쇄를 각각 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제작한 후, 이를 실시예 2와 유사하게 N293F Vector system(와이바이오로직스)에 삽입한 후, 이를 HEK293 세포에 공형질감염하였다. 공형질감염된 HEK293 세포에 대하여 생물반응기를 통해 37℃ 5% CO2 조건에서 3L 규모로 6일간 배양한 후(FreeStyle 293 Expression Medium, Gibco),단백질 발현 여부를 환원조건의 PAGE 분석으로 확인하였다. 그 결과 도 6a에서 확인되는 바와 같이, 정상적으로 단백질이 생산이 됨을 확인할 수 있었다. 이어서, 본 발명자들은 상기 세포배양액을 Protein A bead로 충진된 칼럼에 적재하여 친화성 크로마토그래피를 수행한 후, washing buffer(D-PBS, pH 7.4)로 세척한 다음 0.1 mM glycine buffer(pH 3.3)을 넣어서 단백질을 용출시켰다. 그런 다음, Superdex 200 culumn, running (D-PBS, pH 7.4) 및 elution buffer(D-PBS, pH 7.4)를 이용한 겔 여과를 통하여 단백질을 추가 정제하였다.
상기에서 최종 정제된 단백질을 환원 및 비환원 조건의 PAGE 분석을 통하여 단백질 생산 및 정제 여부를 확인하였다. 그 결과 도 6b에서 확인되는 바와 같이, 높은 순도로 정제됨을 확인하였다.
이어, 본 발명자들은 상기 정제된 단백질을 사전에 수화된 재생 셀룰로오스(RC) 튜빙에 넣고, 후보 물질의 pI 값에 맞는 제형화 완충액(PBS, pH 7.4)이 담겨 있는 2 L 비이커에 넣고 4℃의 온도조건에서 밤새 투석하여 제형화를 수행하였다. 제형화가 완료된 물질에 대하여 Nano drop을 이용하여 정량하고 SEC-HPLC를 이용하여 최종 순도를 확인하였다. 그 결과 표 5 및 도 6c에서 확인되는 바와 같이, 총 단백질 생산량은 184 mg으로 생산성은 61 mg/L였으며, 순도는 99.4%에 이르러 매우 고순도로 정제되었음을 알 수 있었으며, 내독소(endotoxin) 함량은 0.38 EU/mg 미만으로 확인되었다.
PG-400-2 시험 시료 정제 결과
물질 숙주세포 배양부피 단백질 총량 (mg) 생산성(mg/L) 순도(%) 내독소 함량(EU/mg) 정제단계 제형화 완충액
PG-400-2 HEK293 3 L 184 61 99.4 < 0.38 Protein A 친화성 크로마토그래피-> 겔 여과 PBS (pH7.4)
따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 인간화 항-CD154 항체(PG-400-2)은 인간세포에서 규모를 늘리더라도 고순도로 생산이 가능함을 확인할 수 있었다.
5-2: PG-410 단백질의 생산
아울러, 본 발명자들은 상기 실시예 4에서 고안된 PG-410 단백질의 중쇄 및 경쇄를 각각 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제작한 후 상기 실시예 5-1과 동일한 방식으로 N293F Vector system(와이바이오로직스)에 클로닝하고, 이를 HEK293 세포에 공형질감염하였다.
공형질감염된 HEK293 세포를 배양규모를 2.3 L로 조정하고, 겔 여과 단계를 생략한 것을 제외하고는 상기 실시예 5-1과 동일한 방법으로 본 발명의 일 실시예에 따른 PG-410 단백질을 정제하였다.
PG-410 시험 시료 정제 결과
물질 숙주세포 배양부피 단백질 총량 (mg) 생산성(mg/L) 순도(%) 내독소 함량(EU/mg) 정제단계 제형화 완충액
PG-410 HEK293 2.3 L 295 128.2 92.6 < 0.021 Protein A 친화성 크로마토그래피 PBS (pH7.4)
그 결과, 표 6 및 도 7a 내지 7c에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 IL-10 부가 인간화 항-CD154 항체(PG-410)은 겔 여과 단계가 없고, 중쇄의 C-말단에 부가적인 단백질(IL-10Vm)이 부가되어 있음에도 불구하고 고순도로 정제가 됨을 확인할 수 있었다. 특히, 단백질 생산성은 배양규모가 PG-400-2에 비해 더 작았음에도 불구하고, 128.2 mg/L로 더 높았고, 내독소의 함량도 0.021 EU/mg으로 매우 낮게 나타났다.
실험예 3: CD154와의 결합 친화도 친화도 분석
본 발명자들은 상기 실시예 4에서 고안된 PG-400-2 및 PG-410 역시 상기 실시예 2에서 제조된 융합단백질과 마찬가지로 CD154에 특이적인 결합을 하는지 여부를 Bio-layer interferometry(BLI) 분석을 통해 분석하였다.
구체적으로, 평편-바닥 96웰 흑색 플레이트에 증류수 200 μl를 분주한 후, 바이오센서 트레이를 상기 흑색 플레이트 위에 올려준 후 아민 바이오센서를 꽂고 10분 동안 수화시켰다. 초기 기저선을 결정하기 위해 새로운 96웰 흑색 시료 플레이트에 증류수 200 μl를 분주하였다. 이어, 필요한 양의 1/20로 EDC:NHS를 1:1로 혼합한 후 증류수에 희석하여 상기 수화된 96웰 흑색 시료 플레이트에 200 μl씩 분주하였다. 시료인 CD154를 10 mM 초산 용액(pH 6.0)에 5 μg/ml이 되도록 희석하여 96웰 흑색 플레이트에 200 μl씩 분주하였다. 그런 다음, 1 M 에탄올아민을 96 웰 흑색 플레이트에 200 μl씩 첨가하고, 바이오센서 플레이트와 시료 플레이트를 Octetㄾ K2 BLI 분석장치에 삽입하고 신호를 측정하면서 아민 센서에 CD154를 결합시켜주었다. 측정이 완료되면 96웰 흑색 시료 플레이트를 측정 장치에서 꺼낸 후, 1x kinetic buffer를 200 μl 추가하여 기저선을 측정하였다. 그런 다음, 분석 대상체 항체인 PG-400-2/PG-410을 농도가 200~12.5 nM이 되도록 1X kinetic buffer에 순차희석한 후 96웰 흑색 플레이트에 200 μl씩 분주하였다. 이어, 상기 96웰 흑색 플레이트를 Octet® K2 BLI 분석장치에 삽입하고 CD154와 반응을 진행하면서 신호를 측정하였다.
PG-400-2 및 PG-410에 대한 BLI 분석 결과
Sample ID PG-400-2 PG-410
KD (nM) 0.36 M < 1E-12
Kon (1/Ms) 8.47E+05 1.96E+05
Kdis (1/s) 3.11E-04 <1E-07
그 결과, 표 7 그리고 도 8a 및 8b에서 확인되는 바와 같이, PG-400 및 PG-410 모두 CD154에 특이적으로 결합하는 것으로 확인되었다. 특히, PG-410의 경우 Kon 값이 PG-400 대비 약 4.3배 정도 낮지만 Kdis 값은 < 1E-07로 높은 특성을 나타냈다. 이는 PG-410이 PG-400-2 대비 CD154에 대한 결합이 다소 늦게 일어나긴 하지만 결합 후 해리 속도는 PG-410에 비해 높은 관계로 전체적인 결합력은 PG-410이 보다 더 높은 것으로 나타났다(3,000배 이상 높음). 그러나, 전체적으로 보아 PG-400-2 및 PG-410 모두 CD154에 특이적으로 결합함을 확인할 수 있었고, PG-410의 경우 결합 후 해리되는 속도가 더 낮은 것이 CD154를 발현하는 타겟 세포에서 IL-10의 효과를 지속하는 데 도움이 될 수 있을 것으로 기대된다.
실험예 4: IL-10에 의한 면역억제 활성 평가
본 발명자들은 단량체성 IL-10 변이체(IL-10Vm)가 중쇄의 C-말단에 부가된 형태의 재조합 인간화 항체(PG-410)의 IL-10이 제 기능을 발휘하는지 여부를 확인하기 위해, 면역세포의 면역반응에 미치는 영향을 조사하였다.
구체적으로, 배양중인 대식세포주 Raw264.7 세포가 들어있는 T75 플라스크의 상등액을 제거해준 후 PBS로 한 차례 세척하였다. TrypLETM Select Enzyme 3 ml을 첨가한 후 37℃ 배양기에서 3-5분 동안 배양하였다. 이어, 새로운 배지 10 ml을 T75 플라스크에 첨가한 뒤 플레이트에서 분리된 세포부유액을 50 mL 원심분리 튜브에 담은 뒤 1,500 rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 그런 다음, 상층액을 제거하고, 원심분리 튜브를 손으로 수차례 약하게 타격하여 세포를 현탁하였다. 이어, 배지 5 mL로 혼합한 뒤 세포를 계수하였다. 세포의 농도가 1X105 cells/ml 이 되도록 배지를 첨가하여 희석한 후 96웰 평편 바닥 플레이트에 100 μl씩 분주하였다. 10시간 경과 후 최종 농도가 1000~0.003 nM이 되도록 순차희석된 PG-410을 96웰 평편 바닥 플레이트에 50 μl씩 처리하였다. 20분 경과 후, LPS 400 ng/ml를 처리하였다. 그런 다음 37℃ 배양기에서 16 시간 동안 배양하고, 다음날 상등액을 모아준 후 TNFα ELISA 키트(Biolegend)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 TNFα의 농도를 측정하였다(도 9a). 한편, 양성대조군으로 재조합 IL-10을 사용하였다.
그 결과, 표 8 및 도 9b에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 인간화 항체는 재조합 IL-10 대비 약 100배 정도 면역억제 활성이 낮았다.
PG-410 및 IL-10의 대식세포 면역억제 활성 분석 결과
처리농도 (nM) 0.0003 0.0013 0.006 0.032 0.16 0.8 4 20 100
IL-10의 저해율(%) 10% 17% 39% 55% 64% 70% 71% 73% 73%
처리농도 (nM) 0.003 0.013 0.06 0.32 1.6 8 40 200 1,000
PG-410의 저해율 (%) 8% 13% 24% 29% 38% 45% 56% 59% 58%
실험예 5: 단회 독성 평가
종래의 재조합 IL-10은 투여농도를 높이거나, 반복 투여시 혈액 내 헤모글로빈 농도가 감소함으로써 빈혈 증상이 나타나고, 혈소판 농도가 감소함에 따라 혈소판 감소증(thromocytopenia)이 나타나는 부작용이 보고된 바 있다(Tilg et al., J. Immunol. 164(4): 2204-2209, 2002; Fedorak et al., Gastroendocrinol. 119(6): 1473-1482, 2000). 이에 본 발명자들은 상기 실시예 4에서 제조된 PG-410을 대상으로 식품의약품안전청고시 제2017-183호(2017년 8월 30일) '비임상 시험관리기준'에 따른 GLP 적용시험을 위해 독성검사를 바이오톡스텍에 의뢰하여 실시하였다.
구체적으로 바이오톡스텍에서 실시하는 단회 투여 독성시험법은 하기와 같이 수행되었다. 5주령의 암컷 ICR 마우스를 사용하여 독성시험을 수행하였으며, 규정된 사육조건에서 케이지 당 3마리씩 사육하였다. 순화기간을 1주일 두고 그 기간 중 일반 증상을 관찰하여 건강한 동물만을 시험에 사용하였고 사료와 음수는 자유섭취하게 하였다. 실험에 사용된 동물의 체중을 측정하여 각 군의 평균체중이 균등하도록 하였고, 개체식별은 동물의 꼬리에 개체표시를 하고, 사육상자에는 개체식별카드를 부착하였다. 시험물질은 멸균 생리식염수를 대조로 하여 PG-410을 마우스에 1회 정맥투여 하였으며, 투여직전의 체중을 기준으로 하여 최대 300 ㎎/㎏을 투여하고 부검하여 독성시험을 검사하였다.
그 결과 시험물질 투여와 관련하여 사망률, 일반증상, 체중변화 및 육안적인 부검소견은 관찰되지 않았다.
실험예 6: 이식편대숙주질환(GVHD) 관련 동물실험
본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 인간화 항체 PG-410이 장기이식시 발생하는 주요 부작용인 이식편대숙주질환의 치료에 사용될 수 있는 지의 여부를 동물모델을 통한 실험을 통해 조사하였다.
이를 위해 구체적으로, 6주령의 수컷 NSG 마우스를 오리엔트바이오에서 구입 후 본 시험을 실시하는 동물실 내에서 7일 동안 순화과정을 거치면서 매일 일반증상을 관찰하였다. 동물 공급처에서 제공한, 시험계의 병원체 검사 성적서를 검토한 결과 시험에 영향을 줄 만한 요인은 없었다. 순화기간 중 건강한 것으로 판정한 동물의 체중을 순위화하였고, 각 군의 평균체중이 균일하게 분포하도록 무작위 분배하였다. 그런 다음, 시험물질을 5 mpk(100 μg/head)로 조제한 뒤 시험물질은 멸균 생리식염수를 대조로 하여 마우스에 GVHD 유도 전, 유도 후 28일째 되는 날에 정맥투여 하였다. 시험물질 투여 다음 날, NSG mouse 20두에 각 두당 1x107 cells의 인간 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 200 μl씩 정맥 투여하였다. PBMC 투여 전과 투여 후, 주 2회 체중을 측정하였다. GVHD 유발 여부는 GVHD의 다섯 가지 의학적 증상인 체중 감소(weight loss), 활동성(activity), 자세(posture), 털 상태(fur texture), 피부 상태(skin integrity)를 통해서 일주일에 두 번씩 평가하였다. 대조군으로는 담체를 사용하였다.
그 결과, 도 10b 및 10c에서 확인되는 바와 같이, PG-410 투여한 그룹은 음성대조군과는 달리 체중감소가 나타나지 않았고, 음성대조군 대비 생존율이 현저하게 높게 나타났다.
PBMC 투여 후 GVHD의 발병과 투여된 PBMC로부터 분화된 인간 CD45+ 백혈구 세포의 비율이 밀접한 관련성이 있는 것으로 보고된 바 있다(Ehx et al., Front Immunol. 9: 1943, 2018). 이에, 음성대조군, 및 PG-410 투여군을 대상으로 인간 PBMC 투여 7일, 14일, 21일, 28일, 35일, 42일에 채혈하여 인간 CD45+ 세포 집단을 유세포 분석으로 분석하였다. 구체적으로, PBMC 투여 7일째(D7)에 확보한 혈액을 96웰 둥근바닥 플레이트에 50 μl씩 분주하였다. 혈액을 FACS 완충액으로 세척한 뒤, 1500 rpm으로 5분 동안 원심분리 하였다. 상층액을 버린 후 형성된 세포 펠렛을 0.5 μl aqua fluorescent reactive dye를 희석한 50 μl FACS 완충액에 현탁시켜 4℃에서 20분 간 반응하였다. FACS 완충액으로 세척하고 상층액을 버린 후 각 웰에 항체 혼합물(anti-human CD45, anti-mouse CD45)를 50 μl씩 넣고, 상온에서 20분 동안 반응하였다. 그리고 나서, FACS 완충액으로 2번 세척한 뒤 유세포분석기를 이용해 분석하였다. 상기 분석을 PBMC 투여 14, 21, 28, 및 35일째에 똑같이 반복 수행하였다.
그 결과, 도 11에서 확인되는 바와 같이, GVHD 발병기전의 중요한 표지인자인 인간 CD45 세포 집단이 음성대조군 대비 PG-410 투여군에서 감소됨을 확인할 수 있었다.
실험예 7: 변형 Fc 영역의 다양한 Fc 감마 수용체와의 결합 친화도 분석
상술한 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에서 사용된 변형 Fc 영역 단백질은 Fc 감마 수용체와의 결합력이 제거되도록 고안된 변이체이다. 이에, 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따라 사용된 상기 변형 Fc 영역 단백질이 실제로 다양한 Fc 감마 수용체와 결합하지 않는지 여부를 조사하고자 하였다.
이를 위해 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 항-CD154 항체 융합단백질에 적용된 변형 Fc 영역 단백질(서열번호 5 또는 6)과 동일한 아미노산 서열을 가진 변형 Fc 영역 단백질의 N-말단에 서열번호 49로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 GLP-1 수용체 작용제가 서열번호 43으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 링커 펩타이드로 연결된 GLP-1E-Fc 융합단백질('PG-11'로 명명함)을 이용하여 다양한 Fc 감마 수용체와의 결합 친화도를 BLI 분석을 통해 분석하였다. 이 때, 대조군으로는 IgG1 계열 재조합 항체인 리툭시맙이 사용되었다. 그 결과, 도 12에서 확인되는 바와 같이, IgG1 계열 항체인 리툭시맙은 FcγRI 및 FcγRIIIa와 특이적 결합을 하는 반면, 본 발명의 일 실시예에 따른 NTIG 포함 융합단백질인 PG-11은 이들 항체 수용체와 특이적 결합을 하지 않는 것으로 확인되었다.
더 나아가, 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 GLP-1E-Fc 융합단백질과 리툭시맙의 FcγRIIa, FcγRIIb 및 FcγRIIIb와의 결합 친화도를 비교분석하였다. 그 결과, 도 13a 내지 13d에서 확인되는 바와 같이, 리툭시맙은 상기 세 가지 Fc 수용체와 특이적 결합을 하는 것으로 확인된 반면, 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질은 매우 약한 결합을 나타냈으며, sensogram의 형태를 볼 때, 이는 비-특이적 결합인 것으로 판단된다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서 사용된 변형 Fc 영역 단백질은 다양한 Fc 감마 수용체와 결합하지 않기 때문에, ADCC나 CDC와 같은 종래 항체 치료제의 원하지 않은 부작용을 최소화할 수 있다.
본 발명은 상술한 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 융합단백질은 자가면역 질환의 치료제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (26)

  1. 인간 CD154에 특이적으로 결합하는 Fab 또는 scFv, 및 Fc 영역을 포함하는 CD154 특이적으로 결합하는 융합단백질에 있어서,
    상기 Fc 영역은 Fc 감마 수용체에 결합하지 않도록 변이된 변형 Fc 영역인, CD154에 특이적으로 결합하는 융합단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 인간 CD154에 특이적으로 결합하는 Fab는 서열번호 2로 기재되는 아미노산으로 구성되는 경쇄 및 서열번호 9로 기재되는 아미노산으로 구성되는 중쇄 VH-CH1 단편; 또는
    서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 및 서열번호 11로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 VH-CH1 단편으로 구성되는, CD154에 특이적으로 결합하는 융합단백질.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 scFv는 서열번호 14로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 가변 도메인(VL) 및 서열번호 15로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 가변 영역이 링커 펩타이드에 의해 연결된 것인, CD154에 특이적으로 결합하는 융합단백질.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 Fc 감마 수용체는 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB1, FcγRIIB2, FcγRIIIA, 및/또는 FcγRIIIB인, CD154에 특이적으로 결합하는 융합단백질.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 인간 CD154에 특이적으로 결합하는 Fab 또는 scFv, 및 Fc 영역은 항체 유래의 힌지 또는 링커 펩타이드에 의해 연결되는, CD154에 특이적으로 결합하는 융합단백질.
  6. 제1항에 있어서,
    서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 Ig 중쇄 펩타이드 및 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 Ig 경쇄 펩타이드; 또는
    서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 Ig 중쇄 펩타이드 및 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 Ig 경쇄 펩타이드로 구성되는, CD154에 특이적으로 결합하는 융합단백질.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 Fc 영역은 서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열로 구성되는, CD154에 특이적으로 결합하는 융합단백질.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 Fc 영역은 서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열의 18번째 아미노산 서열이 T로, 196번째 아미노산 서열이 M으로 변이된 것인, CD154에 특이적으로 결합하는 융합단백질.
  9. 제1항에 있어서,
    Fc 영역의 C-말단에 IL-10 단백질이 부가되는, CD154에 특이적으로 결합하는 융합단백질.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 IL-10 단백질은 인간 IL-10 단백질의 성숙형 형태(mature form) 기준으로 87번째 아미노산인 이소류신이 알라닌으로 치환된 IL-10 변이체 단백질인, CD154에 특이적으로 결합하는 융합단백질.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 IL-10 단백질은 인간 IL-10 단백질의 성숙형 형태(mature form) 기준으로 116번째 아미노산인 아스파라긴 및 117번째 아미노산인 라이신 사이에 6 내지 12 a.a.의 길이를 갖는 펩타이드가 삽입된 단량체성 IL-10 변이체 단백질인, CD154에 특이적으로 결합하는 융합단백질.
  12. a) CD154에 특이적으로 결합하는 항체의 항원-결합 단편 또는 항체 유사체;
    b) Fc 감마 수용체에 결합하지 않도록 변이된 변형 Fc 영역; 및
    c) IL-10 단백질을 순차적으로 포함하는, CD154에 특이적으로 결합하는 융합단백질.
  13. 제12항에 있어서,
    a) 및 b) 및/또는 b) 및 c) 사이에는 독립적으로 적어도 하나 이상의 링커 펩타이드가 포함되는, CD154에 특이적으로 결합하는 융합단백질.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 a) 및 b) 사이의 링커 펩타이드는 항체 유래의 힌지인, CD154에 특이적으로 결합하는 융합단백질.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 항체의 항원-결합 단편은 Fab, F(ab')2, Fab', scFv, diabody, triabody, sdAb(single domain antibody), VNAR 또는 VHH인, CD154에 특이적으로 결합하는 융합단백질.
  16. 제12항에 있어서,
    상기 항체 유사체는 affibody, affilin, affimer, affitin, alphabody, anticalin, avimer, DARPin, Fynomer, Kunitz domain peptide, monobody, repebody, VLR, 또는 nanoCLAMP인, CD154에 특이적으로 결합하는 융합단백질.
  17. 제12항에 있어서,
    상기 Fc 영역은 서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열로 구성되는, CD154에 특이적으로 결합하는 융합단백질.
  18. 제12항에 있어서,
    상기 Fc 영역은 서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열의 18번째 아미노산 서열이 T로, 196번째 아미노산 서열이 M으로 변이된 것인, CD154에 특이적으로 결합하는 융합단백질.
  19. 제12항에 있어서,
    상기 IL-10 단백질은 인간 IL-10 단백질의 성숙형 형태(mature form) 기준으로 87번째 아미노산인 이소류신이 알라닌으로 치환된 IL-10 변이체 단백질인, CD154에 특이적으로 결합하는 융합단백질.
  20. 제12항에 있어서,
    상기 IL-10 단백질은 인간 IL-10 단백질의 성숙형 형태(mature form) 기준으로 116번째 아미노산인 아스파라긴 및 117번째 아미노산인 라이신 사이에 6 내지 10 a.a.의 길이를 갖는 펩타이드가 삽입된 단량체성 IL-10 변이체 단백질인, CD154에 특이적으로 결합하는 융합단백질.
  21. 제12항 내지 제20항 중 어느 한 항의 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
  22. 제21항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  23. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 융합단백질을 유효성분으로 포함하는, 면역억제용 약학적 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 장기이식 환자의 면역억제에 사용되는, 약학적 조성물.
  25. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 융합단백질을 유효성분으로 포함하는, 자가면역 질환 치료용 약학적 조성물.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 자가면역 질환은 제1형 당뇨병, 원형 탈모증(alopecia areata), 항-인산지질 항체 증후군(antiphospholipid antibody syndrome), 류마티스성 관절염, 건선 또는 건선성 관절염, 다발성 경화증(multiple scelerosis), 전신 홍반 루푸스(systemic lupus erythematosus), 염증성 장질환(inflammatory bowel disease), 애디슨병(Addison's disease), 그레이브병(Graves' disease), 쇼그렌 증후군(Sjㆆgren's syndrome), 길랑-바레 증후군(Guillian-Barre syndrome), 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 중증 근무력증(Myasthenia gravis), 염증성 근육병(inflammatory myophathy), 자가면역성 혈관염(autoimmune vasculitis), 자가면역성 간염(autoimmune hepatitis), 출혈성 빈혈(hemolytic anemia), 특발성 혈소판감소성 자반(idiopathic thrombocytopenic purpura), 일차성 담즙성 간경화증(primary biliary cirrhosis), 피부경화증(scleroderma), 백반증(vitiligo), 악성 빈혈(pernicious anemia), 또는 만성 소화장애(celiac disease)인, 약학적 조성물.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11773176B2 (en) 2020-01-24 2023-10-03 Aprilbio Co., Ltd. Multispecific antibodies, compositions comprising the same, and vectors and uses thereof

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023153876A1 (ko) * 2022-02-10 2023-08-17 주식회사 아피셀테라퓨틱스 Cd40l에 특이적으로 결합하는 스테핀 a 단백질 변이체 및 이의 용도

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100897938B1 (ko) 2007-05-30 2009-05-18 주식회사 제넥신 면역글로불린 융합 단백질
US20130136734A1 (en) * 2011-04-04 2013-05-30 The Trustees Of Dartmouth College ANTI-CD154 ANTIBODIES HAVING IMPAIRED FcR BINDING AND/OR COMPLEMENT BINDING PROPERTIES AND RELATED THERAPIES
KR101442254B1 (ko) 2008-02-22 2014-09-24 포항공과대학교 산학협력단 최적의 진핵 세포 발현 벡터의 개발
US20150056182A1 (en) * 2011-11-30 2015-02-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Drug containing carrier into cell for forming immune complex
WO2016182335A1 (ko) 2015-05-11 2016-11-17 주식회사 프로젠 Cd154에 특이적으로 결합하는 항체
KR20170000346A (ko) * 2015-06-23 2017-01-02 서울대학교산학협력단 Cd154 결합 폴리펩타이드 및 그 용도
KR20180095719A (ko) * 2016-01-11 2018-08-27 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 키메라 단백질 및 면역요법 방법

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0815788D0 (en) * 2008-08-29 2008-10-08 Isis Innovation Therapeutic antibodies
NO2344540T3 (ko) * 2008-10-02 2018-04-28
US9028826B2 (en) * 2011-04-04 2015-05-12 The Trustees Of Dartmouth College Methods of immune therapy with anti-CD154 antibodies having impaired FcR binding and/or complement binding properties
GB201107170D0 (en) * 2011-04-28 2011-06-15 Clark Michael Binding molecules with biased recognition
AR088455A1 (es) * 2011-10-13 2014-06-11 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos que antagonizan cd40l
BR112015002085A2 (pt) * 2012-08-08 2017-12-19 Roche Glycart Ag proteína, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, método para produzir a proteína, composição farmacêutica, uso da proteína, método de tratamento e invenção
US11267868B2 (en) * 2013-04-02 2022-03-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fc region variant
RU2016135788A (ru) * 2014-02-06 2018-03-07 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Иммуноконъюгаты интерлейкина 10
MA41459A (fr) * 2015-02-03 2017-12-12 Als Therapy Development Inst Anticorps anti-cd40l et méthodes pour traiter des maladies ou des troubles liés aux cd40l
ES2944982T3 (es) * 2015-08-05 2023-06-27 Janssen Biotech Inc Anticuerpos anti-CD154 y métodos para utilizarlos
BR112018072953A2 (pt) * 2016-05-13 2019-02-19 Medimmune, Llc polipeptídeos de fusão de cd40l-fc e métodos de uso dos mesmos
CN107082812B (zh) * 2017-03-29 2018-11-13 上海科医联创生物科技有限公司 一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白及其应用
KR20180119135A (ko) * 2017-04-24 2018-11-01 주식회사 제넥신 4-1bbl 변이체 및 이를 포함하는 융합 단백질
EP3995508A4 (en) * 2019-05-14 2023-09-27 Progen Co., Ltd. NOVEL MODIFIED IMMUNOGLOBULIN FC FUSION PROTEIN AND USE THEREOF

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100897938B1 (ko) 2007-05-30 2009-05-18 주식회사 제넥신 면역글로불린 융합 단백질
KR101380729B1 (ko) 2007-05-30 2014-04-10 포항공과대학교 산학협력단 면역글로불린 융합 단백질
KR101380732B1 (ko) 2007-05-30 2014-04-10 포항공과대학교 산학협력단 면역글로불린 융합 단백질
KR101442254B1 (ko) 2008-02-22 2014-09-24 포항공과대학교 산학협력단 최적의 진핵 세포 발현 벡터의 개발
US20130136734A1 (en) * 2011-04-04 2013-05-30 The Trustees Of Dartmouth College ANTI-CD154 ANTIBODIES HAVING IMPAIRED FcR BINDING AND/OR COMPLEMENT BINDING PROPERTIES AND RELATED THERAPIES
US20150056182A1 (en) * 2011-11-30 2015-02-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Drug containing carrier into cell for forming immune complex
WO2016182335A1 (ko) 2015-05-11 2016-11-17 주식회사 프로젠 Cd154에 특이적으로 결합하는 항체
KR20160132694A (ko) * 2015-05-11 2016-11-21 주식회사 프로젠 Cd154에 특이적으로 결합하는 항체
KR20170000346A (ko) * 2015-06-23 2017-01-02 서울대학교산학협력단 Cd154 결합 폴리펩타이드 및 그 용도
KR20180095719A (ko) * 2016-01-11 2018-08-27 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 키메라 단백질 및 면역요법 방법

Non-Patent Citations (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BOEHM ET AL., ANN. REV. IMMUNOL., vol. 30, 2012, pages 203 - 220
BOUMPAS ET AL., ARTHRITIS RHEUM, vol. 48, no. 3, 2003, pages 719 - 727
CAI ET AL., EUR. J. IMMUNOL., vol. 29, 1999, pages 2658 - 2665
CHARRON, J. BIOL. CHEM., vol. 270, 1995, pages 25739 - 25745
DESMET ET AL., NAT. COMMUN., vol. 5, 2014, pages 5237
EBERSBACH ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 372, no. 1, 2007, pages 172 - 185
EHX ET AL., FRONT. IMMUNOL., vol. 9, 2018, pages 1943
FEDORAK ET AL., GASTROENDOCRINOL, vol. 119, no. 6, 2000, pages 1473 - 1482
GLOCKSHUBER ET AL., BIOCHEM, vol. 29, no. 6, 1990, pages 1362 - 1367
GRABULOVSKI ET AL., J. BIOL. CHEM., vol. 282, no. 5, 2007, pages 3196 - 3204
GYURIS ET AL., CELL, vol. 75, 1995, pages 791 - 803
HARDINGERBRENNAN, WORLD J. TRANSPLANT., vol. 3, no. 4, 2013, pages 68 - 77
JOHNSON ET AL., ANAL. CHEM., vol. 84, no. 15, 2012, pages 6553 - 6560
KALLURIHARDINGER, WORLD J. TRANSLANT., vol. 2, no. 4, 2012, pages 51 - 68
KALUNIAN ET AL., ARTHRITIS. RHEUM., vol. 46, no. 12, 2002, pages 3251 - 3258
KARIMIPOUR FATHOLLAH, IRAN. J. ALLERGY ASTHMA IMMUNOL., vol. 11, no. 1, 2012, pages 1 - 13
KINNEAR ET AL., TRANSPLANTATION, vol. 95, no. 4, 2013, pages 527 - 535
KOIDEKOIDE, METHODS MOL. BIOL., vol. 352, 2007, pages 95 - 109
KREHENBRINK ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 383, no. 5, 2008, pages 1058 - 1068
LAUW ET AL., J. IMMUNOL., vol. 165, 2000, pages 2783 - 2789
LEE ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 109, 2012, pages 3299 - 3304
MOSSERYHANG, IMMUNOL. REV., vol. 226, 2009, pages 205 - 218
NIXONWOOD, CURR. OPIN. DRUG DISCOV. DEV., vol. 9, no. 2, 2006, pages 261 - 268
PAGANO ET AL., SCIENCE, vol. 255, 1992, pages 1144 - 1147
PILAT ET AL., CURR. OPIN. ORGAN TRANSLANT., vol. 17, 2012, pages 368 - 375
RIELLA ET AL., AM. J. TRANSPLANT., vol. 12, no. 10, 2012, pages 2575 - 2587
ROWBOTTOM ET AL., IMMUNOL, vol. 160, 1998, pages 3188 - 3193
SANTIN ET AL., J. VIROL., vol. 74, 2000, pages 4729 - 4737
See also references of EP3998282A4
SHIELDS ET AL., J. BIOL. CHEM., vol. 276, no. 9, 2001, pages 6591 - 6604
SILVERMAN ET AL., NAT. BIOTECHNOL., vol. 23, no. 12, 2005, pages 1556 - 1561
SKERRA ET AL., FEBS J, vol. 275, no. 11, 2008, pages 2677 - 2683
STUMPP ET AL., DRUGDISCOV. TODAY., vol. 13, no. 15-16, 2008, pages 695 - 701
SUDERMAN ET AL., PROTEIN EXP. PURIF., vol. 134, 2017, pages 114 - 124
TANABE ET AL., TRANSLANTATION, vol. 93, no. 7, 2012, pages 709 - 719
TILG ET AL., GUT, vol. 50, 2002, pages 191 - 195
TILG ET AL., J. IMMUNOL., vol. 164, no. 4, 2002, pages 2204 - 2209
ZAZA ET AL., TOXINS, vol. 6, no. 3, 2014, pages 869 - 891

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11773176B2 (en) 2020-01-24 2023-10-03 Aprilbio Co., Ltd. Multispecific antibodies, compositions comprising the same, and vectors and uses thereof

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