JP5652987B2 - ヒトIgGFcレセプターIIb(FcγRIIb)に結合する物質 - Google Patents
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Description
本発明は、コンフォメーションにより識別するエピトープ(CDEs)を有する新規の免疫原、及び極めて密接に関連したホモログを有するタンパク質を特異的に認識する抗体の産生のための免疫化方法に関する。特に、本発明はFcγRIIb又はFcγRIIaのいずれかに特異的な抗体に関し、かつこれらは自己免疫疾患、感染症、腫瘍及びその他の免疫系が関連する症状の診断及び治療のために有利である。
(a)関心のあるタンパク質を提供、
(b)前記タンパク質上のCDEを同定、
(c)前記CDEの配列を有するペプチドを産生、
(d)前記CDEがその天然のコンフォメーションにあるように前記ペプチドを構造的に安定化。
(a)正確に折りたたまれたFcγRIIb分子又はその一部を、少なくとも一部の細胞外ドメイン(コンフォメーションエピトープ)、そのコンジュゲート体、又はその他の担体分子(例えばKLH、BSA)とのコンジュゲート体を含む免疫原として提供し、
(b)哺乳類を(a)の免疫原で免疫化し、公知の方法により抗体を産生し、
(c)この生じる抗体又はこの抗体を産生する細胞を単離する
ことを含む抗体の産生方法である。
図1:
ヒトFcγRIIb及びFcγRIIaの細胞外ドメインの配列アラインメント。相違するアミノ酸を囲った。
リボン表示におけるFcγRIIbの構造。特有残基を、ボール及び棒で示し、可能性のあるグリコシル化部位をより大きな球として示した。矢印は可能性のある抽出可能な副次構造(エピトープ1及び2)を指し示し、特異的なFcRIIb−抗血清に向けた免疫化プロトコルの改善のために及び引き続きアイソフォームに特異的なモノクローナル抗体の産生のためにハットは人工的に産生されていてよい。
左図:ラジ細胞(FcγRIIb陽性及びFcγRIIa陰性)の、マウスの免疫前血清(マイナス)、免疫化工程後に得られた抗血清(抗血清)及び汎性のFcγRII−mAb AT10(Greenman et al., 1991)を用いたFACS測定の図。右図:U−937細胞(FcγRIIa陽性及びFcγRIIb陰性)に対する蛍光ラベル。この抗血清は、特異的な抗体の存在を示す細胞とわずかに反応するだけである。
通常の血清(ネガティブコントロール)、FcγRIIb−CDE(126〜137)で免疫化したマウスの抗血清、mAb AT10、又は本発明を用いて産生した特異的なモノクローナル抗体GB3のいずれかで、インキュベーションしたヒトの血液のFACS分析。a):細胞の大きさ(FSC−H)及び細分性(SSC−H)の観点における血液試料のドットブロット分析。観察した領域、R1、R2、R3はそれぞれリンパ球(B細胞及びT細胞)、単球及び顆粒球を含む。b)前記細胞の蛍光強度は、リンパ球を代表する領域R1において見出された。汎性のFcγRIIb mAb At10、mAb GB3及び抗血清は、前記FcγRIIb陽性のB細胞を染色したが、FcγRII陰性のT細胞は認識されなかった。c)前記細胞の蛍光強度は、単球/マクロファージを代表する領域R2において見出された。ポジティブコントロールとは対照的にm Ab AT10及び抗血清mAb GB3はFcγRIIa陽性の単球を認識しなかった。d)前記細胞の蛍光強度は、顆粒球を代表する領域R3において見出された。ポジティブコントロールとは対照的にmAb AT10及び抗血清mAb GB3はFcγRIIa陽性の顆粒球を認識しなかった。
クローニングされた抗体GB3の可変領域。囲み枠の領域はCDRsを示す一方で、下線を引いた末端部はプライマーによって導入されるクローニング人為産物のために異なるかもしれない。a)軽鎖の可変領域;b)重鎖の可変領域。
クローニングされた抗体CE5の可変領域。囲み枠の領域はCDRsを示す一方で、下線を引いた末端部はプライマーによって導入されるクローニング人為産物のために異なるかもしれない。a)軽鎖の可変領域;b)重鎖の可変領域。
免疫化及びFcγRIIbに特異的な抗体の産生のために使用したグリコペプチドCDE(126〜137)。
特異的な抗マウスFcγRIIb抗体でのSJLマウスの免疫化。SJLjを200μgのMOGで、0日目に免疫化した。抗FcγRII抗体での処置(50μg/週の用量)を5日目に開始した。この臨床スコアを毎日観察し、一群につき8匹のマウスの平均として示す。
実施例1
シクロ−[N−β−(2−アセチルアミノ−デオキシ−2−β−グルコピラノシル)−Asn138,Gly141]−(129−141)−FcγRIIb2,CDE(126−137)の合成。
標準的なアミノ酸誘導体はAlexis(Laeufelfingen, Switzerland)から、Asn(N−β−3,4,6,−トリ−O−アセチル−2−アセチルアミノ−デオキシ−2−β−グルコピラノシル)−OHのフルオレニルメトキシカルボニル誘導体(Fmoc)はMerck-Novabiochem(Darmstadt, Germany)から、及び予備負荷したクロロトリチル樹脂はPepchem(Tuebingen, Germany)からである。試薬及び溶媒は市販で入手可能な最高品質のものであり、更なる精製なしに使用した。分析逆相HPLCを、対称C18カラム(5μM、3.9×150mm、Waters)を用いてWaters装置(Eschborn, Germany)において直線勾配溶出により実施した:(1)0〜100%のA15分間、又は(2)0〜30%のA20分間、50%までのA5分間、及び100%のA更に5分間、(1.5ml/分の流速及び210nmでのUV検出)。この一対の溶出系は(A)アセトニトリル/2%H3PO4(90:10)及び(B)アセトニトリル/2%H3PO4(5:95)。分取逆相HPLCを、Abimed装置(Langenfeld, Germany)で、Nucleosil C18 PPN (5μm, 100Å,10x250mm, Macherey-Nagel, Dueren, Germany)及びアセトニトリロ中の0.08%のトリフルオロ酢酸(TFA)(A)及び水中の0.1%のTFAの勾配を使用して、10ml/分の流量で実施した。2%のAに7分間、40%までのA50分間、及び70%までのA更に5分間。ESI−MSスペクトルをPerkin-Elmer SCIEX API 165 三重四重極スペクトロメーターで記録した。LC−MSを、Nucleosil C18 column (5μm,100Å,1x250mm, Macherey-Nagel)で、水中の0.1%TFA及びアセトニトリル中の0.08%のTFAの線形勾配を用いて(流量:30μl/分;210nmでの検出)実施した。
線形ペプチド前駆体を、手法によりFmoc−Gly−クロロトリチル樹脂(232mg、0.13mmol)で、Fmoc/tert−ブチル(tBu)化学の標準的な方法に従い合成した。前記Fmoc基を、各工程で2回の連続した処理(3及び20分間)により、N−メチルピロリドン(NMP)中の20%のピペリジンで開裂した。Fmoc−Ser(tBu)−OH及びFmoc−Phe−PHに関しては二重カップリング(2×1h)を、NMP中のFmoc−アミノ酸/2−(1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート(HBTU)/N−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)/N,N−ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)(4:4:4:8eq)で適用し、この際前記グリコシル化Asn誘導体を、NMP中のFmoc−アミノ酸(1H−ベンゾトリアゾール−1−イルオキシ)−トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート(PyBOP)/HOBt/DIEA(2:2:2:5eq)を用いて一重カップリングにより導入した。この反応は、カイザー試験により確認して5時間後に完了した。無水酢酸/DIEA(1:1.3eq)でのキャッピング工程を、鎖伸長の前に10分間実施した。残りのアミノ酸誘導体(Argを、Arg−2,2,4,6,7−ペンタメチル−ジヒドロベンゾフラン−5−スルホニル[Pbf]誘導体として導入した)でのアシル化のために、再度二重カップリング(2×1.5h)を、NMP中のFmoc−アミノ酸/HBTU/HOBt/DIEA(6:6:6:12eq)で使用した。
側鎖保護した線形ペプチドを樹脂から、前記ペプチド樹脂を5mlのジクロロメタン(DCM)中の1%TFAで3分間処理することで開裂した。この濾過物を、薄層クロマトグラフィー(TLC)(CH3Cl/MeOH/H2O,8:3:1)により、1mlのメタノール中の10%ピリジンの添加の前に分析した。このTFA処理を、前記濾過物に対するTLCコントロールがネガティブになるまで繰り返した(全体で4つの処理)。最後に、前記樹脂をDCM及びトリフルオロエタノールで洗浄し、ペプチド回収を向上させた。このペプチド含有濾過物及び最後の洗浄物を一緒にして、低体積に濃縮した。この残留物をMeOHで希釈し、この生成物を氷冷水で沈殿させた。この粗生成物を濾過により回収し(270mg、80%収率)、分析HPLC(勾配1)及びESI−MSにより特性決定した。75:20の比にある主ピーク(tR 9.5分間;ESI−MS:m/z=2520[M+H]+;Mr 2519.0 C120H188N20O36Sに対し計算)及び副ピーク(tR 9.3分間;ESI−MS:m/z=2478[M−42+H]+)はそれぞれ、期待した生成物及び副生成物に相応することが見出された。この質量差は、1つのアセチル保護基の、Asn(Ac3AcNH−β−Gln)からの欠失のためであった。
骨格環化を、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)中の0.9mMのペプチド濃度で、PyBOP/HOBt/DIEA(1.5:1.5;3.5eq)の存在下で達成した。この塩基を、1時間にわたり一部ずつ添加した。この線形ペプチドから環形への変換は、分析HPLCにより観察され、2.5h後に完了した。この反応混合物を乾燥させ、この残留物を破砕し、氷冷したジエチルエーテルで洗浄して、DMFの痕跡量をTFA開裂の前に除去した。
酸不安定性の側鎖保護基を、前記環式ペプチドを氷冷した10mlのTFA/トリイソプロピルシラン(TISH)/H20(90:5:5)中に溶解することで除去した。2hの振盪後、前記TFAを減圧下で除去し、この油性残留物を、少量のMeOHで希釈し、この粗生成物を氷冷したジエチルエーテルで沈殿させた。この沈殿物を遠心分離により回収し、複数回氷冷したエーテルで洗浄し、最後に水を除いて凍結乾燥させた。前記粗グリコペプチドは、このトリアセチル化の形態に加えLC−MSによればジアセチル誘導体及びモノアセチル誘導体により汚染されているが、これをMeOH中に懸濁し、NaOMeを有する部分量で見かけpH>10に達するまで30分間処理した。前記反応をHPLCにより観察し、3.5時間後に、氷酢酸の添加によりpH<5になるまで急冷した。この混合物を乾燥させ、この固形物をMeOH中に懸濁し、氷冷したジエチルエーテルで再沈殿させた。この沈殿物を濾過により回収し、かつ水を除いて凍結乾燥させた。この粗生成物を分取HPLCにより精製し、この環式グリコペプチドを凍結乾燥物として単離した;収率:20%収率(0.13mmolの開始樹脂負荷に基づいて);HPLC:>95%(tR 勾配2で7.37分間);ESI−MS:m/z=1642.8[M+H]+;M=1641.8Da(C71H108N20O25に対して計算して)。
100μlのヒトの可溶性FcγRIIb(10.6mg/ml)を1490μlの50mMのホウ酸(pH10)及び410μlの前記グリコペプチドCDE(126〜137)(2mg/ml)に添加し、室温で緩やかに撹拌した。100μlの0.3%グルタルアルデヒド溶液をゆっくりと添加し、100μlの1Mグリシンを添加する前にこの全体の混合物をまた2時間RTで撹拌した。この生じるFcγRIIb−CDE(126〜137)をまた30分間攪拌し、次いでPBSで透析し濃縮した。
FcγRIIb−CDE(126〜137)での免疫化
メスの六週齢のC57B1/6マウスを腹腔内で、2週間毎に、100μlの完全フロイントアジュバント(CFA、Sigma/Deisenhofen, Germany)中の50μgのFcγRIIb−CDE(126〜137)のエマルションで3回免疫化した。この最後の免疫化後3週間マウスは、50μgのFcγRIIb−CDE(126〜137)でブーストさせた:3日後、脾臓をこの動物から除去し、この抽出した細胞と骨髄腫細胞との融合を、Bazin, 及びLemieux, 1989に従って実施した。
前記ハイブリドーマのFcγRIIb−CDE(126〜137)特異性に関するスクリーニング
ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンの存在下で成長できるクローンを単離し、この上清をELISAアッセイにおいて試験し、その際FcγRIIb−CDE(126〜137)を、マイクロタイタープレート上で1ウェルにつき120ngのsFcγRIIa/bでプレコートした(100μlのPBS中で、20℃、12時間)。このプレートを洗浄し、PBS/T(PBS/0.2%のTween20、30分間)でインキュベートした。100μlのそれぞれのハイブリドーマを、前記ウェルに添加した(100μl、90分間)。このプレートをブロッキングバッファーで、PBS/T中で希釈した100μlのペルオキシダーゼラベル化ヤギ抗マウスIgG+IgM抗体(Dianova, Hamburg/Germany)を添加する前に3回洗浄した。90分間のインキュベーション及びPBS/Tでの引き続く洗浄後、100μlの基質バッファー(0.2Mクエン酸/リン酸バッファー、pH5.2、4mg/mlのo−フェニレンジアミン、0.024%(v/v)の過酸化水素)を前記ウェルに添加した。この反応を50μkの8N硫酸の添加により停止させ、490nmでの吸光度をELISAリーダーで測定した。
特異的な抗マウスFcγRII抗体を用いたSJLマウスの免疫化
SJLマウスを、200μgのMOGで免疫化し、実験的自己免疫脳脊髄炎(EAE)、多発性硬化症の樹立した動物モデルを誘発させた。特異的な抗マウスFcγRII抗体(50μg/週)を用いた一群につき8匹のマウスの予防性の、また同様に治療性の(データ示さず)処置は、この疾病の症状(臨床スコア)を著しく減少させた(0=健康、1=軽い麻痺、2=中間的な麻痺、3=強力に麻痺、4=完全に麻痺、5=死)。この結果は図8に示した。
Claims (28)
- Fcレセプターの天然の環境においてヒトのFcγRIIbに特異的に結合し、配列番号2に従ったFcγRIIbのアミノ酸配列のアミノ酸27〜30を含むコンフォメーションにより識別するエピトープ(CDE)に結合することができ、FcγRIIaに対するよりもFcγRIIbにより高い親和性で結合する抗体又はそのFcγRIIb結合断片であって、前記抗体又はそのFcγRIIb結合断片は、天然のコンフォメーションにおける人工ペプチド又はポリペプチドで動物又はトランスジェニック動物(ヒトを除く)を免疫化することを含む方法により製造され、前記ペプチド又はポリペプチドはFcγRIIbのCDEを含有し、このCDEは環化により構造的に安定化され、かつ配列番号2に従ったFcγRIIbのアミノ酸27〜30を含む、抗体又はそのFcγRIIb結合断片。
- 少なくとも10倍FcγRIIaに対するよりもFcγRIIbにより高い親和性で結合する、請求項1記載の抗体又はそのFcγRIIb結合断片。
- 免疫複合体がFcγRIIbに結合することに干渉しない、請求項1又は2記載の抗体又はそのFcγRIIb結合断片。
- ヒトのFcγRIIbに特異的に架橋することができる、請求項1から3までのいずれか1項記載の抗体又はそのFcγRIIb結合断片。
- 単量体又は多量体の状態で生じる、請求項1から4までのいずれか1項記載の抗体又はそのFcγRIIb結合断片。
- IgG、IgE、IgM又はIgAのクラスである、請求項1から5までのいずれか1項記載の抗体又はそのFcγRIIb結合断片。
- 単鎖抗体、二官能性及び三官能性の抗体、Fab断片、F(ab)2断片、Fv断片及びscv断片から選択される、請求項1から6までのいずれか1項記載の抗体又はそのFcγRIIb結合断片。
- 請求項1から7までのいずれか1項記載の抗体又はそのFcγRIIb結合断片をコードするDNA。
- 請求項8記載のDNAを有する核酸ベクター。
- 請求項9記載のベクターでトランスフェクションした宿主細胞。
- FcγRIIbに特異的に結合する物質を見出すために分子ライブラリー又はゲノムライブラリーをスクリーニングするための、配列番号2に従ったFcγRIIbのアミノ酸27〜30を含む、FcγRIIbのCDEを含有するペプチドの使用であって、前記物質はFcγRIIbのアミノ酸27〜30に特異的に結合する使用。
- ライブラリーがペプチド、有機分子、ペプチドミメティックス又は抗体可変ドメインを含む請求項11記載の使用。
- ヒト細胞上のFcγRIIbに特異的に結合する分子を同定するためにライブラリーをスクリーニングするための請求項11記載の使用。
- ペプチドは環化により構造的に安定化されている請求項11から13までのいずれか1項記載の使用。
- ペプチドが人工の及び/又はグルコシル化したアミノ酸を有する請求項11から13までのいずれか1項記載の使用。
- ペプチドが担体分子にコンジュゲートされている請求項11から13までのいずれか1項記載の使用。
- 天然のコンフォメーションにおける人工ペプチド又はポリペプチドで動物又はトランスジェニック動物(ヒトを除く)を免疫化することを含み、前記ペプチド又はポリペプチドはFcγRIIbのCDEを含有し、このCDEは環化により構造的に安定化され、かつ配列番号2に従ったFcγRIIbのアミノ酸27〜30を含む、請求項1から7までのいずれか1記載の抗体又はそのFcγRIIb結合断片の製造方法。
- ペプチド又はポリペプチドが人工の及び/又はグルコシル化したアミノ酸を有する請求項17記載の方法。
- ペプチド又はポリペプチドが担体分子にコンジュゲートされている、請求項17又は18記載の方法。
- 自己免疫疾患の治療及び/又は診断のために利用できる医薬組成物及び/又は診断組成物であって、請求項1から7までのいずれか1項記載の抗体又はそのFcγRIIb結合断片の有効量及び医薬的に許容可能なキャリアー物質を含む医薬組成物及び/又は診断組成物。
- 自己免疫疾患の検出のための診断キットであって、請求項1から7までのいずれか1項記載の抗体又はそのFcγRIIb結合断片を含む診断キット。
- FcγRIIb/IgG相互作用の抑制剤又は活性化剤の製造のための請求項1から7までのいずれか1項記載の抗体又はそのFcγRIIb結合断片の使用。
- 自己免疫疾患の診断及び/又は治療のための医薬組成物及び/又は診断組成物の製造のための請求項1から7までのいずれか1項記載の抗体又はそのFcγRIIb結合断片の使用。
- 自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、免疫性の血小板減少性紫斑病又は多発性硬化症から選択される、請求項23記載の使用。
- アレルギーの診断及び/又は治療のための医薬組成物及び/又は診断組成物の製造のための、請求項1から7までのいずれか1項記載の抗体又はそのFcγRIIb結合断片の使用。
- 活性化した樹状細胞及び/又はマクロファージに関連した疾病の治療のための医薬組成物及び/又は診断組成物の製造のための、請求項1から7までのいずれか1項記載の抗体又はそのFcγRIIb結合断片の使用。
- 宿主対移植片疾病の治療のための医薬組成物及び/又は診断組成物の製造のための、請求項1から7までのいずれか1項記載の抗体又はそのFcγRIIb結合断片の使用。
- 請求項1から7までのいずれか1項記載の抗体又はそのFcγRIIb結合断片であって、その際これらはこのFc断片において、グリコシル化の修飾及び/又は突然変異により、前記Fcレセプターのサブセットに対する結合を促進すべく改変されている、抗体又はそのFcγRIIb結合断片。
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