WO2023153876A1 - Cd40l에 특이적으로 결합하는 스테핀 a 단백질 변이체 및 이의 용도 - Google Patents

Cd40l에 특이적으로 결합하는 스테핀 a 단백질 변이체 및 이의 용도 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a stephin A protein variant that specifically binds to CD40L and uses thereof.
  • the immune system is a generic term for a biological network composed of various cells and organs built to protect an organism from invasion from the outside.
  • the immune system operates based on the specific functions of the organs and cells that make up it and the signal transduction and interaction between each cell.
  • the immune system maintains immune homeostasis by maintaining an appropriate balance between immune tolerance, which suppresses and regulates immunity, and immune response, which promotes immunity. Immune tolerance and immune response can be imbalanced due to various causes, and these immune imbalances lead to the occurrence of various diseases.
  • the immune tolerance mechanism when the immune tolerance mechanism is strengthened, the occurrence of cancer or the invasion of external infectious agents can be facilitated, resulting in cancer and infectious diseases, and conversely, when the immune response mechanism is strengthened, autoimmune diseases and allergies It can cause inflammatory diseases such as sexually transmitted diseases.
  • Immune synapses are composed of various cytokines and signaling substances secreted from cells, as well as various co-stimulatory molecules and receptors expressed on the cell surface.
  • interest in immunotherapeutic agents targeting them and regulating the immune response is increasing.
  • Most of the immunotherapeutic agents developed so far are antibody drugs against cytokines or cell surface molecules, but their use is very limited due to lack of efficacy or side effects.
  • CD40 ligand also called CD40L or CD154
  • CD40L is a protein that binds to CD40 of antigen-presenting cells and shows various effects depending on target cells (The Journal of Experimental Medicine. 175 (4): 1091-101).
  • CD40L typically has three binding partners: CD40, ⁇ 5 ⁇ 1 integrin, and ⁇ IIb ⁇ 3, and CD40L acts as a costimulatory molecule and is reported to be particularly important for a subset of T cells called T follicle helper cells (TFH cells) (Journal of Immunology 149 (12): 3817-26).
  • T follicle helper cells T follicle helper cells
  • CD40L is mainly expressed on activated CD4+ T cells, but it is also found in soluble form, and it is also found in T cells, as well as platelets, mast cells, macrophages, basophils, NK cells, B cells, and endothelial cells, such as epithelial cells. It is also reported to be expressed in non-hematopoietic cells (Cellular and Molecular Life Sciences. 58 (1): 4-43).
  • CD40L is classified as a tumor necrosis factor (TNF) superfamily, and as a co-stimulatory factor, CD40/CD40L signaling plays an important role in the activation of T cells and the differentiation and activation of T cell-mediated B cells. do.
  • TNF tumor necrosis factor
  • CD40/CD40L signaling plays an important role in regulating the expression and signaling mechanisms of OX40/OX40L, the same co-stimulatory factor, and through this, the survival of T cells and the growth of memory T cells. participate in development
  • CD40L is reported to play an important role in the interaction between antigen presenting cells (APCs) and T cells.
  • APCs antigen presenting cells
  • CD40L/CD40 acts as a pathogenic factor in autoimmune diseases or inflammatory diseases in which the activation of T cells and B cells has a major effect on pathology.
  • it is a pathogenic factor in various diseases such as type 1 diabetes, thyroiditis, psoriasis, systemic lupus erythematosus (SLE), rheumatoid arthritis (RA), and multiple sclerosis (MS).
  • SLE systemic lupus erythematosus
  • RA rheumatoid arthritis
  • MS multiple sclerosis
  • Various compounds or antibodies targeting CD40L are being developed for the treatment of these diseases (Semin Immunol. 2009;21(5):293-300; Advanced Drug Delivery Reviews Volume 141, 15 February 2019, Pages 92-103). .
  • Affimer® is a small, stable protein molecule engineered based on the in vivo protein Stepin A protein.
  • Affimer® contains two short peptide sequences with random sequences and an N-terminal sequence, through which it can bind to a target substance with high affinity and specificity in a manner similar to a monoclonal antibody.
  • Affimer® exhibits significantly improved binding affinity and specificity compared to free peptide libraries, and exhibits a significantly smaller size and superior stability compared to antibodies, and is receiving very high attention as a next-generation alternative drug platform to replace antibodies (US Patent No. 9447170). , 8853131, etc.).
  • stephin protein a polypeptide that specifically binds to CD40L by engineering it based on the naturally occurring protein, stephin protein, and as a result, stephin capable of binding to CD40L with excellent affinity and specificity.
  • a variant of Stefin A protein was invented, and in particular, it was confirmed that the Stefin A protein variant specifically binding to CD40L showed excellent inhibitory activity against CD40L, and the present invention was completed.
  • An object of the present invention is to provide steppin A protein variants that specifically bind to the CD40L and uses thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a fusion protein comprising a steppin A protein variant that specifically binds to the CD40L.
  • Another object of the present invention is to provide a conjugate comprising a steppin A protein variant that specifically binds to the CD40L.
  • Another object of the present invention is to provide a nucleic acid encoding a steppin A protein variant that specifically binds to the CD40L, a fusion protein or conjugate comprising the same, and a vector containing the nucleic acid.
  • Another object of the present invention is to provide genetically engineered cells into which the nucleic acids and/or vectors are introduced and uses thereof.
  • the present invention provides a Stefin A protein variant that specifically binds to CD40L.
  • the present invention also provides a fusion protein comprising a Stefin A protein variant specifically binding to the CD40L.
  • the present invention also provides a conjugate comprising a Stefin A protein variant specifically binding to the CD40L.
  • the present invention also provides a nucleic acid encoding a Stefin A protein variant specifically binding to the CD40L or a fusion protein containing the same.
  • the present invention also provides a delivery vehicle comprising the nucleic acid.
  • the present invention also provides a genetically engineered cell into which the nucleic acid has been introduced.
  • the present invention also provides the use of the genetically engineered cells for the preparation of Stefin A protein variants, fusion proteins or conjugates.
  • the present invention also provides a method for preparing a Stefin A protein variant, fusion protein or conjugate that specifically binds to CD40L, comprising culturing the genetically engineered cells.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a Stefin A protein variant that specifically binds to the CD40L, a fusion protein, a conjugate, a nucleic acid, and/or a delivery vehicle.
  • the present invention also provides a use of the Stefin A protein variant that specifically binds to CD40L, fusion protein, conjugate, nucleic acid and/or delivery vehicle for the preparation of a pharmaceutical composition.
  • the present invention also provides a method of treatment comprising administering a Stefin A protein variant that specifically binds to the CD40L, a fusion protein, a conjugate, a nucleic acid, and/or a delivery vehicle.
  • Figure 1 shows the direct binding ELISA results of monomeric clones to human CD40L.
  • Figure 2 shows the confirmation of human CD40L expression in HEK293 cells through binding of the monomeric clones by flow cytometry.
  • FIG 3 shows the result of confirming the expression of hCD40L in hCD40L-HEK293 cells (top) compared to the control HEK 293 cells (bottom).
  • Figure 4 shows the binding of clone 230 (SEQ ID NO: 249) to hCD40L-HEK293 cells at different concentrations.
  • Figure 5 shows the dose effect of the stephin A protein variant specifically binding to CD40L of the present invention on the binding block between hCD40L and CD40 through CD40L HEK-BLUE reporter cell analysis.
  • IVFs in-line fusions
  • Figure 7 shows the binding of different clones containing ILF dimer and trimeric constructs to hCD40L using the BIACORETM assay.
  • Figure 8 shows the binding of different clones containing ILF dimer and trimeric constructs to hCD40L by flow cytometry.
  • FIG. 9 shows the dose effect of monomeric, dimeric, and trimeric Stepin A protein variants or their ILFs on hCD40L-CD40 binding block through CD40L HEK-BLUE reporter cell analysis.
  • Figure 10 shows various formats (DT, a trimer with a rigid linker; XT75, a trimer with a rigid linker and an HSA-binding stephin A protein variant; XT76, a tetramer with a rigid linker and an HSA-binding stephin A protein variant).
  • DT a trimer with a rigid linker
  • XT75 a trimer with a rigid linker and an HSA-binding stephin A protein variant
  • XT76 a tetramer with a rigid linker and an HSA-binding stephin A protein variant
  • Figure 11 shows the various formats (DT, trimer with rigid linker; XT75, trimer with rigid linker and HSA-binding stephin A protein variant; XT76, tetramer with rigid linker and HSA-binding stephin A protein variant).
  • the dose effect on the binding block between hCD40L and CD40 was shown through the CD40L HEK-BLUE reporter cell assay.
  • clone-230 XT75 (ILF protein comprising three clone 230 monomers and an HSA-binding stephin A protein variant (HSA AFFIMER®)) and clone-230 XT76 (four clone 230 monomers and HSA-binding stephin A protein).
  • HSA AFFIMER® HSA-binding stephin A protein variant
  • 3t0 Gly XT58 is an ILF protein comprising a non-hCD40L targeting protein trimer and an HSA-binding steppin A protein variant (HSA AFFIMER) connected to each other by a rigid linker.
  • 3t0 Gly XT59 is an ILF protein comprising two non-hCD40L targeting proteins and an HSA-binding steppin A protein variant (HSA AFFIMER) connected to each other by a rigid linker.
  • HSA AFFIMER HSA-binding steppin A protein variant
  • Figure 12A shows Stefin A protein variants that bind bound hCD40L (as measured by anti-cystatin antibody).
  • Figure 12B shows Stefin A protein variants that bind to hCD40L bound in the presence of HSA (as measured with an anti-cystatin antibody).
  • Figure 12C shows a steppin A protein variant that binds hCD40L and HSA bound (measured with an anti-HSA antibody).
  • FIG. 13 shows a schematic diagram of the Haploidentical GVHD Mouse Model.
  • FIG. 14 shows the frequency and interval of administration of anti-CD40L steppin A protein variant (XT54 SEQ ID NO: 729, XT55 SEQ ID NO: 730) in a haploidentical GVHD mouse model.
  • Figure 15 shows the efficacy of anti-CD40L steppin A protein variants (XT54 SEQ ID NO: 729, XT55 SEQ ID NO: 730) in body weight change (top) and GVHD clinical score (bottom) in a haploidentical GVHD mouse model.
  • protein or “polypeptide” refers to a polymer of amino acids of any length.
  • the polymers may be linear or branched, may contain modified amino acids, and may be interrupted by non-amino acids.
  • the protein or polypeptide also includes an amino acid polymer that has been modified naturally or interveningly. Any other manipulation or modification, such as, for example, disulfide bond formation, glycosylation, lipidation, acetylation, phosphorylation, or conjugation with a labeling component.
  • it is used to include polypeptides that include at least one analog of an amino acid (eg, including non-natural amino acids) as well as other modifications known in the art.
  • amino acids and amino acid sequences described herein are the anabolic or catabolic products of naturally occurring amino acids found in proteins, or amino acids containing amino and carboxyl groups, their isomers (e.g., D- or L- isomers).
  • Specific amino acid residues described herein include natural amino acids as well as analogs, derivatives and congeners thereof.
  • steppin A protein variant of the present invention is produced by chemical synthesis, cyanoalanine, canavanine, djenkolic acid, norleucine, 3- Phosphorine (3-phosphoserine), homoserine, dihydroxy-phenylalanine, 5-hydroxytryptophan, 1-methylhistidine, 3-methylhistidine ( 3-methylhistidine), diaminopimelic acid, ornithine, or diaminobutyric acid, but not limited thereto.
  • identity expressed as identical or percent refers to sequences that are identical or have a specific percentage of identity. Conservative amino acid substitutions may not be considered part of sequence identity when comparing and aligning two sequences for maximum correspondence.
  • two nucleic acid or amino acid sequences can be "substantially identical", which means that the two sequences are at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% , 98%, or 99% the same thing.
  • the identity may exist over a length of at least about 10, 20, 40-60, 60-80, 80-100 or more residues.
  • composition of the protein or polypeptide described herein includes not only the amino acid sequence described in this regard, but also a protein in which a portion of the amino acid sequence is substituted through conservative substitution. or polypeptides.
  • “conservative substitution” refers to a modification of a polypeptide that includes substituting one or more amino acids with amino acids having similar biochemical properties that do not result in loss of biological or biochemical function of the corresponding polypeptide.
  • a “conservative amino acid substitution” is a substitution in which an amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a similar side chain.
  • Classes of amino acid residues with similar side chains have been defined in the art and are well known. These classes include amino acids with basic side chains (e.g. lysine, arginine, histidine), amino acids with acidic side chains (e.g. aspartic acid, glutamic acid), and amino acids with uncharged polar side chains (e.g. glycine).
  • amino acids with non-polar side chains e.g., alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan
  • beta-branched side chains and amino acids with aromatic side chains eg, tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine.
  • conservative substitutions in the sequences of the polypeptides and proteins described herein do not result in loss of their function. For example, a stephin A variant that binds specifically to CD40L does not abolish CD40L binding by conservative substitution thereof. Methods for identifying such conservative substitutions are well known in the art.
  • an “isolated” protein, polypeptide, antibody, polynucleotide, vector, cell or composition is a protein, polypeptide, antibody, polynucleotide, vector, cell or composition that is in a form not found in nature.
  • Isolated proteins, polypeptides, antibodies, polynucleotides, vectors, cells or compositions include those purified to the extent that they are no longer in the form found in nature.
  • an isolated protein, polypeptide, antibody, polynucleotide, vector, cell or composition is substantially pure. A substance is considered substantially pure if it is at least 50% pure (i.e. free of contaminants), at least 90% pure, at least 95% pure, at least 98% pure, or at least 99% pure.
  • CD40L 40 ligand is a protein encoded by the CD40L gene in humans, which acts as a ligand for CD40/TNFRSF5 and co-stimulates T cell proliferation and cytokine production.
  • Cross-linking to T cells generates a costimulatory signal that, together with TCR/CD3 ligation and CD28 costimulation, enhances the production of IL4 and IL10.
  • CD40L induces activation of NK-kappa-B, activation of kinases MAPK8 and PAK2 in T cells, and tyrosine phosphorylation of isoform3 of CD28.
  • CD40L also mediates B-cell proliferation in the absence of costimulation as well as the production of IGE in the presence of IL4.
  • B cells can present antigens to TFH cells, and when activated TFH cells recognize peptides presented by B cells, CD40L from T cells binds to CD40 from B cells, triggering B cell activation. T cells also produce IL-4, which directly affects B cells.
  • IL-4 which directly affects B cells.
  • B cells can undergo rapid cell division to form germinal centers where antibody isotype conversion and affinity maturation as well as differentiation into plasma cells and memory B cells occur. The end result is a B cell capable of producing large amounts of specific antibodies against an antigenic target.
  • CD40 or CD154 deficient mice show little class switching or germinal center formation and severely suppressed immune responses.
  • CD40L is also involved in class switching of immunoglobulins.
  • CD40L Activation of endothelial cells by CD40L (eg in activated platelets) induces reactive oxygen species production, chemokine and cytokine production, and expression of adhesion molecules such as E-selectin, ICAM-1 and VCAM-1. This inflammatory response in endothelial cells can promote leukocyte recruitment to the lesion and potentially promote atherogenesis.
  • CD40L has also been reported to be a potential biomarker for atherosclerotic instability.
  • CD40L is generally considered a membrane-bound protein, a native proteolytically cleaved 15-18-kDa soluble form of CD40L with full biological activity has also been reported.
  • CD40L can bind to the receptor CD40 on B cells and dendritic cells to provide important helper T cell signals required for germinal center formation, isotype class switching and immunoglobulin antibody production. Defects in CD40L are responsible for immunoglobulin switch defects characterized by X-linked immunodeficiency with high-IgM (HIGM1), increased IgM concentrations and decreased all other isoforms.
  • CD40L knockout mice fail to develop secondary antibody responses to T cell-dependent antigens and undergo isotype class switching.
  • CD40L can also send signals back to T cells to trigger short-lived T cell proliferation.
  • a role for CD40L in the proliferation of epithelial, fibroblast and smooth muscle cells has also been reported.
  • a Stefin A protein variant capable of binding to CD40L with excellent affinity and specificity was invented.
  • the Stefin A protein variant specifically binding to CD40L exhibits excellent inhibitory activity against CD40L. confirmed that
  • the present invention relates to a Stefin A protein variant that specifically binds to CD40L.
  • Stepfin A protein variant is a scaffold of Stefin A protein, Stefin A protein, for example, mammalian, more preferably human-derived Stefin A protein means a sequence derived from
  • the "Stefin A protein variant” can be used interchangeably with “Stefin A polypeptide variant” or "AFFIMER® protein” in substantially the same meaning.
  • stephin A protein variant that specifically binds to CD40L was developed, and the "stephin A protein variant that specifically binds to CD40L” is an "anti-CD40L steppin A protein variant", "Anti-CD40L Affimer” can be used interchangeably with substantially the same meaning.
  • Step Protein or “Stefin polypeptides” includes a subgroup of proteins in the cystatin superfamily, a family encompassing proteins containing a number of cystatin-like sequences.
  • the steppin subgroup of the cystatin family comprises relatively small (about 100 amino acids) single domain proteins. They do not undergo post-translational modification and have few disulfide bonds, resulting in identical folding structures in a variety of extracellular and intracellular environments.
  • Stephin A protein has been reported as a monomeric, single-chain, single-domain protein composed of 98 amino acids.
  • Avacta developed the Affimer® platform as a protein engineering technique based on the structure of Stefin A. The only known biological activity of cystatins is inhibition of cathepsin activity, which allows thorough testing of residual biological activity of engineered proteins.
  • the term "Stefin A protein variant” refers to a small and highly stable protein as an engineered variant of the constant Stefin protein.
  • the steppin A protein variants of the present invention may present two peptide loops of random sequence and an N-terminal sequence that allow them to bind to a target protein with high affinity and specificity in a manner similar to antibodies. Stabilization of the two peptides by the stephen A protein scaffold limits the possible conformations the peptides can take, increasing binding affinity and specificity compared to a free peptide library.
  • These engineered non-antibody binding proteins are designed to mimic the molecular recognition properties of monoclonal antibodies for a variety of applications.
  • the stephin A protein variant may include, for example, a sequence derived from a stephin A protein that shares substantially the same identity as a stephin A protein wild-type sequence, such as a human stephin A protein.
  • the stephin A protein variants of the present invention have at least, 25%, 35%, 45%, 55% or 60% identity, for example at least 70%, to a sequence corresponding to human stephin A. , at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 92%, at least 94%, at least 95% identity.
  • Such modifications do not adversely affect the scaffold's ability to bind to the desired target (eg, CD40L), and restore biological functions, such as those possessed by wild-type stefin A but abrogated in the mutational changes described herein. may or may not be created.
  • Target protein-specific binding platforms using such steppin A protein variants are disclosed in detail in US Patent Nos. 9447170 and 8853131 and the like.
  • the stephin A protein variant is characterized in that it can bind to the target protein, CD40L, with high affinity and specificity through engineering of the stephin A protein.
  • the steppin A protein variant specifically binding to CD40L may be characterized in that it specifically binds to CD40L and reduces or inhibits the activity of CD40L.
  • CD40L refers to a protein that binds to its receptor, CD40, and is also referred to as “CD154”.
  • CD40L is TNF-Related Activation Protein, TRAP, Tumor Necrosis Factor (Ligand) Superfamily Member, T-B Cell-Activating Molecule, CD40 CD40 Antigen Ligand, T-Cell Antigen Gp39, TNFSF5, HCD40L, CD154, Gp39, Tumor Necrosis Factor (Ligand) Superfamily, Member 5 (Hyper-IgM Syndrome), Tumor Necrosis Factor ( Ligand) Superfamily, Hyper-IgM Syndrome, CD154, CD40LG, HIGM1, T-BAM, IMD3, IGM, and CD40-L may be used interchangeably in substantially the same meaning.
  • TRAP Tumor Necrosis Factor
  • Ligand Tumor Necrosis Factor
  • Human CD40L amino acid and nucleic acid sequences can be found in public databases such as GenBank, UniProt and Swiss-Prot.
  • amino acid sequence of human CD40L is UniProt/Swiss-Prot. Accession no. P29965, and the nucleic acid sequence encoding it is Accession No. It can be found in NM_000074.2.
  • the CD40L includes any native CD40L and mature CD40L produced from the CD40L precursor protein in cells. Unless otherwise indicated, the CD40L includes CD40L that can be obtained from any organism, preferably from an animal, and includes, for example, primates (eg, humans and cynomolgus monkeys) and rodents (eg, mice and rats). CD40L obtainable from the same mammal, but is not limited thereto.
  • the CD40L also includes, but is not limited to, any CD40L protein including, but not limited to, point mutations, fragments, insertions, deletions, and splice variants of full-length wild-type CD40L.
  • the stephin A protein variant may be characterized by having solvent accessible loops derived from wild-type stephin A protein capable of binding to at least one CD40L.
  • the steppin A protein variant may be characterized in that it can bind to CD40L with a Kd value of 1x10 -6 M or less.
  • the stephin A protein variant has a backbone sequence, and at least one of loop 2 and loop 4 is replaced with an alternate loop sequence, (Xaa)n and (Xaa)m, a variant derived from stephin A protein. It can be characterized as being.
  • the steppin A protein variant may be characterized by comprising an amino acid sequence represented by Formula I:
  • the FR1 is at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95% of the amino acid sequence represented by MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEK TGETYGKLEA VQYKTQVX (SEQ ID NO: 1) or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 It may be characterized by comprising an amino acid sequence having % or 100% identity, and in SEQ ID NO: 1, the X may be V;
  • the FR2 is at least 70% (e.g., at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95% or 100%) identity (identity) can be characterized by comprising an amino acid sequence;
  • the FR3 is at least 70% (e.g., at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95% or 100%) of an amino acid sequence having an identity; and
  • Xaa individually at each occurrence, is any amino acid residue; n and m are each independently an integer of 3 to 20.
  • (Xaa)n and (Xaa)m may be characterized in that each independently represents an arbitrary amino acid sequence of 3 to 20.
  • the FR1 may have an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 95%, or 98% homology with SEQ ID NO: 1. In the present invention, the FR1 may have an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 95%, or 98% identity with SEQ ID NO: 1.
  • the FR2 may be characterized by having an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 95%, or 98% homology with SEQ ID NO: 2. In the present invention, the FR2 may be characterized by having an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 95%, or 98% identity with SEQ ID NO: 2.
  • the FR3 may be characterized by having an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 95%, or 98% homology with SEQ ID NO: 3. In the present invention, the FR3 may be characterized by having an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 95%, or 98% identity with SEQ ID NO: 3.
  • the steppin A protein variant may be characterized by comprising an amino acid sequence represented by Formula II (SEQ ID NO: 4):
  • Xaa is individually in each case any amino acid residue; n and m are each independently an integer of 3 to 20.
  • the steppin A protein variant is at least 90% (e.g., at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) of the amino acid represented by SEQ ID NO: 5 below. ) can be characterized by comprising an amino acid sequence having the identity of:
  • Xaa is individually in each case any amino acid residue; n and m are each independently an integer of 3 to 20.
  • Xaa1 may be Gly, Ala, Val, Arg, Lys, Asp or Glu, preferably Gly, Ala, Arg or Lys, more preferably Gly or Arg.
  • the Xaa2 may be Gly, Ala, Val, Ser or Thr, preferably Gly or Ser.
  • Xaa3 may be Arg, Lys, Asn, Gln, Ser or Thr, preferably Arg, Lys, Asn or Gln, more preferably Lys or Asn.
  • Xaa4 may be Gly, Ala, Val, Ser or Thr, preferably Gly or Ser.
  • the Xaa5 may be Ala, Val, Ile, Leu, Gly or Pro, preferably Ile, Leu or Pro, more preferably Leu or Pro.
  • Xaa6 may be Gly, Ala, Val, Asp or Glu, preferably Ala, Val, Asp or Glu, more preferably Ala or Glu.
  • the Xaa7 may be Ala, Val, Ile, Leu, Arg or Lys, preferably Ile, Leu or Arg, more preferably Leu or Arg.
  • n is an integer of 3 to 15, 3 to 12, 3 to 9, 3 to 7, 5 to 7, 5 to 9, 5 to 12, 5 to 15, 7 to 12 or 7 to 9 can be done with
  • m is an integer of 3 to 15, 3 to 12, 3 to 9, 3 to 7, 5 to 7, 5 to 9, 5 to 12, 5 to 15, 7 to 12 or 7 to 9 can be done with
  • each of the Xaa may be independently an amino acid that may be added to a polypeptide when expressed in a prokaryotic or eukaryotic cell, preferably one of 20 naturally occurring amino acids.
  • (Xaa)n is at least 80%, 85%, 90%, 95% or 98% identical to the amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 6 to 125 or to the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 6 to 125. It may be characterized as including a sequence having homology. In the present invention, (Xaa)n is at least 80%, 85%, 90%, 95% or 98% identity with an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 6 to 125 or an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 6 to 125 It can be characterized by comprising a sequence having.
  • (Xaa)m is at least 80%, 85%, 90%, 95% or 98% of an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 126 to 245 or an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 126 to 245 It may be characterized by including sequences having homology.
  • (Xaa)m is at least 80%, 85%, 90%, 95% or 98% identity with an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 126 to 245 or an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 126 to 245 It can be characterized by comprising a sequence having.
  • the steppin A protein variant may be characterized in that it comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 246 to 365.
  • the steppin A protein variant is a sequence having at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% or 98% identity with the amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 246 to 365 It may be characterized by including.
  • nucleic acid is a polynucleotide of any length, and may include DNA, RNA, or a combination of DNA and RNA.
  • the nucleic acid can be characterized as being deoxyribonucleotides, ribonucleotides as well as modified nucleotides or bases, and/or analogues thereof, or any substrate that can be incorporated by DNA or RNA polymerase. .
  • the nucleic acid is RNA, DNA, TNA (threose nucleic acids), GNA (glycol nucleic acids), PNA (peptide nucleic acids), LNA (locked nucleic acids, for example, ⁇ -D-ribo sequences) LNA with a-L-ribo configuration (a diastereomer of LNA), 2'-amino-LNA or 2'-amino-a-LNA with 2'-amino functionalization, ethylene nucleic acid (ENA) ), CeNA (cyclohexenyl nucleic acids), or a hybrid or combination thereof, but is not limited thereto.
  • TNA threose nucleic acids
  • GNA glycol nucleic acids
  • PNA peptide nucleic acids
  • LNA locked nucleic acids, for example, ⁇ -D-ribo sequences LNA with a-L-ribo configuration (a diastereomer of LNA), 2'-amino-LNA or 2'-
  • nucleic acid refers to a nucleic acid sequence encoding a specific protein or polypeptide.
  • sequence of a specific protein or polypeptide is disclosed in the art, methods for designing or deriving a nucleic acid encoding it are well known.
  • the nucleic acid encoding the Stefin A protein variant that specifically binds to CD40L of the present invention is the above-mentioned "Stefin A protein variant that specifically binds to CD40L" It can be easily understood from the description about.
  • the Stefin A protein variant that specifically binds to CD40L is at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90% of a nucleic acid sequence selected from SEQ ID NOs: 366 to 485. , encoded by a nucleic acid comprising a sequence with 95% or 98% identity.
  • a Stefin A protein variant that specifically binds to CD40L is encoded by a nucleic acid comprising a coding sequence that hybridizes to a nucleic acid sequence selected from SEQ ID NOs: 366 to 485.
  • the hybridization may be characterized by, for example, hybridization in the presence of 6X sodium chloride/sodium citrate (SSC) at 45°C and then hybridization at 65°C in 0.2X SSC under washing conditions.
  • SSC sodium chloride/sodium citrate
  • the stephin A protein variant is partially deleted or added (eg, compared to wild-type stephin A protein) to the stephin A protein or variant sequence described in the specification. additions or deletions of about 10 amino acids).
  • the stepin A protein variant has a concentration of about 1 ⁇ M or less, about 100 nM or less, about 40 nM or less, about 20 nM or less, about 10 nM or less, about 1 nM or less, or about 0.1 nM or less to human CD40L. It can be characterized as having a dissociation constant (KD).
  • KD dissociation constant
  • the stephin A protein variant has at least about 10 -3 s -1 , 10 -4 s -1 , or 10 -5 s - 1 , 10 ⁇ 6 s ⁇ 1 , or it may be characterized by having a Koff (off-rate constant) value slower than any one of these.
  • the stephin A protein variant has at least about 10 3 M -1 s -1 , 10 4 M -1 s -1 , 10 5 relative to human CD40L when measured by means such as BIACORETM assay. It may be characterized by having M -1 s -1 , 10 6 M -1 s -1 or a Kon (association constant) value faster than any one of these.
  • the stephin A protein variant has a level of about 1 ⁇ M or less, about 100 nM or less, about 40 nM or less, about 20 nM or less, about 10 nM or less, about 1 ⁇ M or less to human CD40L in a competitive binding assay. It may be characterized as having an IC50 value of 1 nM or less, about 0.1 nM or less.
  • the stepin A protein variant has a melting temperature (Tm, folded state and It can be characterized in that the unfolded state has the same temperature).
  • Tm melting temperature
  • the relative ratio of the folded and unfolded proteins can be measured through various methods known in the art ("Measuring the conformational stability of a protein" in Protein structure: A practical approach 2: 299-321).
  • the stephin A protein variant may be characterized in that it forms a multimer.
  • the steppin A protein variant may be characterized in that it forms a duplex, triplex, quadruplex, pentaplex or more multimers.
  • the multimer may be formed by covalently or non-covalently binding by interaction between amino acid residues of the steppin A protein variant.
  • the multimer may be a fusion protein formed through a fusion domain fused with a steppin A protein variant.
  • the multimer may be formed by in-line fusion of a steppin A protein variant, and the in-line fusion protein in the form of such a multimer is described in detail in the following fusion protein.
  • the present invention relates to a fusion protein comprising a Stefin A protein variant that specifically binds to the CD40L.
  • the present invention relates to a use for preparing a fusion protein of the Stefin A protein variant that specifically binds to the CD40L.
  • the fusion protein may be characterized in that a peptide containing one or more amino acids is added, substituted, and/or deleted to regulate the biological activity of the steppin A protein variant or to add additional biological activity.
  • the stephin A protein variant can regulate binding affinity to CD40L, regulate half-life, regulate stability, regulate cleavage by proteases, regulate dosage, regulate release or bioavailability, promote purification, reduce deamidation, and store stability. It can be fused with other proteins to improve or change the route of administration.
  • the fusion protein in addition to the steppin A protein variant, is a protease cleavage sequence, a reactive functional group, an antibody binding domain, a fusion domain for protein expression and purification (eg, FLAG, poly-His, GST, c-myc, etc.), It may further include, but is not limited to, binding molecules (eg, biotin, etc.), or other therapeutic peptides or proteins.
  • the fusion protein may be characterized in that an additional peptide sequence (fusion domain) is fused to one end and/or the other end of the steppin A protein variant.
  • fusion domain refers to an additional domain or moiety that may be incorporated directly or indirectly by being fused to the steppin A protein variant that specifically binds to CD40L of the present invention.
  • the fusion domain imparts expression characteristics such as secretion from cells, anchoring on the cell surface, or intracellular localization; addition of substrates or other recognition sequences for post-translational modification; generation of aggregated multimeric structures by protein-protein interactions; prolongation or reduction of half-life; or to alter tissue localization, tissue exclusion or other ADME properties, or to add proteins or peptides with other functions, but are not limited thereto.
  • a signal sequence may be included in the fusion protein for transport and secretion of the steppin A protein variant.
  • the fusion protein when the steppin A protein variant is to be expressed in a membrane-anchored form or on the cell surface, the fusion protein may include a transmembrane domain or a signal sequence retained on the cell surface.
  • the signal sequence may be located at the N-terminus of the steppin A protein variant.
  • the signal sequence functions to target and secrete the steppin A protein variant to the endoplasmic reticulum.
  • the signal sequence may be cleaved after being transported to the endoplasmic reticulum, and may be cleaved at a residue in the signal sequence, but is not limited thereto.
  • the signal sequence is about 5 to about 40 amino acids in length (eg, about 5 to about 7, about 7 to about 10, about 10 to about 15, about 15 to about 20, about 20 to about 25 , or about 25 to about 30, about 30 to about 35, or about 35 to about 40 amino acids in length), but is not limited thereto.
  • the signal sequence may be, for example, a native signal peptide derived from humans.
  • the signal sequence may be a non-natural signal peptide.
  • the non-naturally occurring signal peptide may be characterized as, for example, a variant containing one or more substitutions, insertions and/or deletions in a signal peptide derived from a corresponding naturally secreted human protein.
  • the signal sequence is an immunoglobulin (eg, IgG heavy chain or IgG-kappa light chain), cytokine (eg, IL-2 or CD33), plasma albumin, human azurosidin preprotein signal Characterized in that it is a signal peptide derived from a non-igSF protein family, such as a human azurocidin preprotein signal sequence, signal sequences derived from luciferase, trypsinogen, chymotrypsinogen, or other secreted proteins, or variants thereof. It can be, but is not limited thereto.
  • Table 5 lists examples of signal peptides that can be used for secretion of the stephin A protein variant or fusion protein of the present invention, but is not limited thereto.
  • the fusion domain may be fused for isolation and/or purification of the fusion protein.
  • Fusion domains for this use include polyhistidine tag, Strep II tag, streptavidin binding peptide (SBP) tag, calmodulin-binding peptide (CBP) tag, S-tag, HA tag, c-Myc tag, thiourea It may be an affinity tag such as thioredoxin, protein A and protein G, but is not limited thereto.
  • the fusion protein may be characterized in that it includes at least one linker connecting the steppin A protein variant and the fusion domain.
  • the "linker” is the first polypeptide of the fusion protein of the present invention (eg, a steppin A protein variant that specifically binds to CD40L) and the second polypeptide (eg, another steppin A protein variant or fusion domain).
  • the linker may be classified into a flexible linker, a rigid linker, and an in vivo cleavable linker according to the structure.
  • the linker may perform additional functions such as improvement of biological activity, increase of expression yield, and improvement of pharmacokinetic profile, in addition to fusion of the steppin A protein variant of the present invention with a functional domain.
  • the linker does not negatively affect the expression, secretion or functional activity of each domain of the fusion protein.
  • the linker is preferably not immunogenic.
  • the linker may preferably be a GS linker containing glycine and serine residues, but is not limited thereto, and in addition to the glycine-serine linker, the linker may contain threonine and alanine residues. , but is not limited thereto.
  • the linker is, for example, about 1 to 50 amino acids in length, 1 to 22 amino acids in length, 1 to 10 amino acids in length, 1 to 5 amino acids in length, or 1 to 3 amino acids in length. It can be characterized, but is not limited thereto.
  • the linker may include a cleavage site.
  • the linker may be characterized in that it is a flexible linker.
  • the flexible linker is preferably used when the fusion domain coupled to the steppin A protein variant of the present invention requires a certain degree of movement or interaction, but is not limited thereto.
  • examples of the flexible linker are Argos P. (1990) “An investigation of oligopeptides linking domains in protein tertiary structures and possible candidates for general gene fusion” J Mol Biol. 211:943-958, but is not limited thereto.
  • the flexible linker provides flexibility of the fusion protein and mobility of the connected fusion domain. Incorporation of serine or threonine can be characterized to maintain linker stability in aqueous solution.
  • the most commonly used flexible linker is mainly a GS linker, which may be characterized as represented by (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n (SEQ ID NO: 508), but is not limited thereto.
  • n is an integer greater than or equal to 1 and can be optimized for proper distance and interaction of the fusion domains by adjusting the number of repeats of Gly-Gly-Gly-Gly-Ser.
  • the flexible linker may further include amino acids such as Thr, Ala, Lys, and Glu.
  • the linker may be a rigid linker.
  • a flexible linker has the advantage of connecting functional fusion domains and allowing a certain degree of movement, but lack of stiffness of the linker may act as a limiting factor in the specific expression yield or biological activity of a fusion protein.
  • a rigid linker may be used to maintain a fixed distance between each domain of the fusion protein and to maintain independent functions.
  • linkers have an ⁇ -helical structure.
  • the ⁇ -helical structure has a strong and stable structure with intra-segment hydrogen bonds and a tightly packed backbone.
  • stiff ⁇ -helical linkers can be used as rigid spacers between protein domains (George et al. (2002) “An analysis of protein domain linkers: their classification and role in protein folding” Protein Eng. 15( 11):871-9).
  • Rigid linkers generally adopt an ⁇ -helical structure or contain a plurality of Pro residues and exhibit a relatively rigid structure.
  • Rigid linkers can separate functional fusion domains more efficiently than flexible linkers.
  • the length of the linker can be easily optimized by adjusting the number of repeats to achieve an optimal distance between domains.
  • rigid linkers can be used when spatial separation of the domains is important to preserve the stability or bioactivity of the fusion protein.
  • an alpha helix-forming linker having a sequence of (EAAAK)n (SEQ ID NO: 509) is commonly used in the construction of many fusion proteins, and other rigid linkers are examples of (XP)n, where X is any amino acid. and preferably Ala, Lys or Glu, but a Pro-rich sequence, but is not limited thereto.
  • Table 6 lists examples of linkers that can be used for secretion of the stephin A protein variant or fusion protein of the present invention, but is not limited thereto.
  • linkers usable for fusion proteins are as follows, but are not limited thereto:
  • GGSG SEQ ID NO: 519
  • GSGS SEQ ID NO: 520
  • GGGS SEQ ID NO: 521
  • S(GGS)n SEQ ID NO: 522)
  • n is 1 to 7, GRA, poly(Gly), poly(Ala ), GGGSGGG (SEQ ID NO: 523), ESGGGGVT (SEQ ID NO: 524), LESGGGGVT (SEQ ID NO: 525), GRAQVT (SEQ ID NO: 526), WRAQVT (SEQ ID NO: 527), and ARGRAQVT (SEQ ID NO: 528).
  • hinge regions may be regarded as linkers.
  • the fusion protein may be characterized by comprising one or more linker domains selected from the following:
  • flanking polypeptide moiety provided as part of the fusion protein
  • another modification that can be applied to the flanking polypeptide moiety provided as part of the fusion protein is to include one or more sequences as sites for enzymatic post-translational modification. It may be characterized as a domain for modification such as glycosylation, acetylation, acylation, lipid-modification, palmitoylation, addition of palmitate, phosphorylation, glycolipid-binding, etc., but is not limited thereto.
  • the fusion protein may be localized to a specific organ or location within a cell.
  • the fusion protein may be a secreted fusion protein and/or a membrane-anchored fusion protein.
  • the fusion protein may further include one or more fusion domains.
  • the fusion protein may include a fusion domain selected from the group consisting of an antigen binding protein (domain), a cytokine, a half-life extension domain, a growth factor, an enzyme, and a cell penetration domain, It is not limited thereto.
  • the fusion protein may further include a therapeutic peptide or protein.
  • the fusion domain may be characterized in that it further comprises a therapeutic peptide or protein.
  • the "therapeutic peptide or protein” means any peptide or protein having an effect of preventing or treating a specific disease.
  • the therapeutic peptide or protein may be a stephin A protein variant (which may be the same as or different from the steppin A protein variant specifically binding to CD40L of the present invention), in addition to specific diseases in the art It includes, without limitation, peptides and proteins reported to have a preventive or therapeutic effect on
  • the fusion protein may be characterized in that it includes a binding domain (or binding moiety).
  • the fusion protein when it includes a binding domain, it may be characterized as having multiple specificities capable of binding to one or more target molecules together with CD40L.
  • the binding domain is, for example, a stephin A protein variant (which may be the same as or different from the steppin A protein variant specifically binding to CD40L of the present invention), an antibody or a fragment thereof, an antibody-like substance , antigen binding peptides, ligand binding sites of receptors (eg receptor trap polypeptides), receptor-binding ligands (eg cytokines, growth factors), engineered T-cell receptors, and enzymes or catalytic fragments thereof. It may be characterized as being selected, but is not limited thereto.
  • the binding domain is another example, Adnectins / monobody, Affilins, Affibody, Affitin, Anticalin, Atrimers, Avimers, Bicyclic Peptides, C7 Peptide, Centyrin, Carbohydrate-binding module (CBM), Cys-knots, Darpin ), El-tandem, Fynomers, Knottin, Kunitz domains, OBodies, Pronectin, ScFv, Sac7d, Sso7d, Tn3, etc. There is, but is not limited thereto.
  • the fusion domain to be fused to the stephin A protein variant may be the same or a different stephin A protein variant that specifically binds to CD40L, and/or stephin A that specifically binds to another target. It may be a protein variant.
  • the fusion domain when the fusion domain is a stephin A protein variant that specifically binds to CD40L, the two stephin A protein variants included in the fusion protein of the present invention bind to the same or different sites of CD40L.
  • the fusion protein may bind to two sites (biparatopic) or two or more sites (multiparatopic) of CD40L.
  • the term “antibody” includes not only a complete antibody form that specifically binds to a target (antigen), but also an antigen-binding fragment of the antibody molecule.
  • the complete antibody has a structure having two full-length light chains and two full-length heavy chains, and each light chain is connected to the heavy chain by a disulfide bond.
  • the term “heavy chain” refers to a full-length heavy chain comprising a variable region domain VH comprising an amino acid sequence having sufficient variable region sequence for imparting specificity to an antigen and three constant region domains CH1, CH2 and CH3. and fragments thereof.
  • the term "light chain” refers to a full-length light chain and fragments thereof comprising a variable region domain VL and a constant region domain CL comprising an amino acid sequence having a sufficient variable region sequence to impart specificity to an antigen.
  • I mean everything.
  • the whole antibody includes subtypes of IgA, IgD, IgE, IgM and IgG, and in particular, IgG includes IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4.
  • the heavy chain constant region has gamma ( ⁇ ), mu ( ⁇ ), alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ ), and epsilon ( ⁇ ) types, and subclasses include gamma 1 ( ⁇ 1), gamma 2 ( ⁇ 2), and gamma 3 ( ⁇ 3). ), gamma 4 ( ⁇ 4), alpha 1 ( ⁇ 1) and alpha 2 ( ⁇ 2).
  • the constant region of the light chain has kappa ( ⁇ ) and lambda ( ⁇ ) types.
  • An antigen-binding fragment of an antibody or antibody fragment refers to a fragment having an antigen-binding function, and includes Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, and the like.
  • Fab has a structure having variable regions of light and heavy chains, constant regions of light chains, and a first constant region (CH1) of heavy chains, and has one antigen-binding site.
  • Fab' is different from Fab in that it has a hinge-region containing one or more cysteine residues at the C-terminus of the heavy chain CH1 domain.
  • F(ab')2 is produced when a cysteine residue in the hinge region of Fab' forms a disulfide bond.
  • Double-chain Fv two-chain Fv
  • single-chain Fv single-chain Fv
  • scFv single-chain Fv
  • the regions are covalently linked or directly linked at the C-terminus, so that a dimer-like structure can be achieved, such as in double-chain Fv.
  • antibody fragments can be prepared using proteolytic enzymes (for example, Fab can be obtained by restriction digestion of intact antibodies with papain, and F(ab')2 can be obtained by digestion with pepsin), or by genetic recombination technology. can be made using .
  • proteolytic enzymes for example, Fab can be obtained by restriction digestion of intact antibodies with papain, and F(ab')2 can be obtained by digestion with pepsin
  • genetic recombination technology can be made using .
  • Fv fragment is an antibody fragment that contains the complete antibody recognition and binding site. This region is a dimer of one heavy chain variable domain and one light chain variable domain.
  • the “Fab” fragment comprises the variable and constant domains of the light chain and the variable and first constant domains (CH1) of the heavy chain.
  • F(ab')2 antibody fragments generally include a pair of Fab' fragments covalently linked by cysteines in the hinge region present at the C-terminus of the Fab' fragments.
  • a "single-chain Fv (scFv)" antibody fragment is a construct consisting of a single polypeptide chain comprising the VH and VL domains of an antibody.
  • a polypeptide linker may further be included between the VH and VL domains to allow the scFv to form a desired structure for antigen binding.
  • an antibody of the invention is a monoclonal antibody, a multispecific antibody, a human antibody, a humanized antibody, a chimeric antibody, a scFv, a Fab fragment, an F(ab')2 fragment, a disulfide-linked Fvs (sdFv) and anti-idiotypic (anti-Id) antibodies, or epitope-binding fragments of the antibodies, and the like, but are not limited thereto.
  • the heavy chain constant region may be selected from any one isotype of gamma ( ⁇ ), mu ( ⁇ ), alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ ), or epsilon ( ⁇ ).
  • the constant region is gamma 1 (IgG1), gamma 2 (IgG2), gamma 3 (IgG3) or gamma 4 (IgG4).
  • Light chain constant regions can be of the kappa or lambda type.
  • the monoclonal antibody refers to an antibody obtained from a population of substantially homogeneous antibodies, ie, the same thing except for possible naturally occurring mutations that may be present in minor amounts in the individual antibodies comprising the population. Monoclonal antibodies are highly specific, directed against a single antigenic site. In contrast to conventional (polyclonal) antibodies, which typically include different antibodies for different determinants (epitopes), each monoclonal antibody is directed against a single determinant on the antigen.
  • the fusion protein may include an Fc portion of an immunoglobulin.
  • the fusion protein when it includes an Fc portion, it binds to an Fc receptor and activates Fc receptor-positive cells, thereby initiating or increasing the expression of cytokines and/or costimulatory antigens, and antibody-dependent cellular toxicity ( ADCC).
  • ADCC antibody-dependent cellular toxicity
  • the fusion protein when the fusion protein includes a full-length immunoglobulin, the fusion protein may preserve the Fc function of the Fc region of the immunoglobulin.
  • the fusion protein may bind to an Fc receptor of an Fc receptor-positive cell through an Fc region.
  • the fusion protein can activate Fc receptor-positive cells by binding to Fc receptors, and can initiate or increase the expression of cytokines and/or co-stimulatory antigens. Cytokines and/or costimulatory antigens can transmit signals beyond the secondary activation signals required for activation of T cells.
  • the fusion protein by binding the Fc region to other cells expressing Fc receptors present on the surface of effector cells of the immune system, such as immune cells, liver cells and endothelial cells, the fusion protein has an antibody-dependent cytotoxicity (ADCC) function.
  • ADCC antibody-dependent cytotoxicity
  • the Fc region of the fusion protein can have a positive effect on the maintenance of the serum level of the fusion protein apart from Fc-mediated cytotoxicity, which can mean improvement of stability and persistence in the body.
  • the Fc moiety binds to Fc receptors on endothelial cells and phagocytic cells
  • the AFFIMER® agent can be internalized and recycled back into the bloodstream, enhancing its half-life in vivo.
  • the binding domain may be a monoclonal antibody or fragment thereof against at least one autoimmune target (eg, TNFR2 or IL6-R).
  • the fusion protein may include one or more binding domains that bind to a protein upregulated in an autoimmune state (eg, TNFR2 or IL6-R).
  • a protein upregulated in an autoimmune state eg, TNFR2 or IL6-R.
  • the fusion domain may be, for example, an immune checkpoint protein, an immune co-stimulatory receptor, a receptor (or receptor agonist), a cytokine, a growth factor, or a tumor-related antigen, but is not limited thereto.
  • the cytokine is used as a general term for secreted proteins that play an important role in signal transduction between cells.
  • the cytokines include chemokines, interferons, lymphokines, interleukins, tumor necrosis factors, and the like, but are not limited thereto.
  • the growth factor refers to a naturally occurring substance or a variant thereof capable of stimulating cell proliferation, wound healing and/or cell differentiation.
  • the growth factor is GH, EGF, VEGF, FGF, bFGF, HGF, BMPs, M-CSF, G-CSF, GM-CSF, EPO, GDNF, IGF, KGF, BDNF, NGF, PDGF, TPO, TGF etc., but is not limited thereto.
  • the enzyme is used as a generic term for proteins that catalyze biological reactions.
  • the enzyme is ⁇ -chymotrypsin, lysozyme, urate oxidase, acetylcholinesterase, thermomyces lanuginose lipase, glucose oxidase, superoxie dismutase, caspase, ⁇ -glucosidase, Trametes versicolor laccase, alcohol oxidase, Cas9, Cas12, Cas13, Cas14, zinc -finger nuclease, TALLEN, dimethyl sulfoxide, uricase, Agalsidase beta, Agalsidase alfa, Imiglucerase, Taliglucerase alfa, Velaglucerase alfa, Alglucerase, Sebelipase alpha, Laronidase, Idursulfase, Elosulfase alpha, Galsulfase, Al
  • the cell-penetrating peptide refers to a short peptide that promotes cellular uptake and absorption of various molecules.
  • the steppin A protein variant may be absorbed into cells.
  • the cell penetrating peptide includes Tat, Penetrantin, Transporant, Pept1, Pept 2, pVEC, DPV3, DPV6, R8, R9, MPG, MAP, Bip4, C105Y, Melittin, etc., but is not limited thereto.
  • the fusion protein may be fixed to the cell membrane of genetically engineered cells or expressed on the cell surface.
  • the fusion protein when the fusion protein is anchored to a cell membrane or expressed on the cell surface, it may be characterized in that it further comprises a transmembrane domain.
  • transmembrane domain refers to a protein domain that spans the membrane of a cell.
  • the transmembrane domain preferably has an alpha-helical structure, but is not limited thereto.
  • the transmembrane domain is, for example, CD3, CD4, CD5, CD8, CD28, CD99, immunoglobulin (eg IgG1, IgG4, IgD, etc.), PDGFR, transmembrane domain derived from PTGFRN, etc. Or it may be characterized as a variant thereof, but is not limited thereto.
  • the fusion protein may further include a hinge domain in addition to the transmembrane domain.
  • hinge domain refers to a series of amino acid sequences present between the transmembrane domain and the extracellular domain of a membrane-anchored protein.
  • the hinge domain may be characterized in that it is located between the steppin A protein variant specifically binding to CD40L and the transmembrane domain.
  • the hinge domain is derived from, for example, CD3, CD4, CD5, CD8, CD28, CD99, immunoglobulin (eg IgG1, IgG4, IgD, etc.), PDGFR, PTGFRN, etc. It may be characterized as a hinge domain or a variant thereof, but is not limited thereto.
  • the fusion protein may further include a coiled coil domain.
  • coiled coil domain refers to a structural motif of a protein in which 2 to 7 alpha helices are wound like a rope strand.
  • the coiled coil domain may be characterized in that two or three alpha helices are wound.
  • the coiled coil domain is Leucine zipper, foldon, cardiac phospholamban, water-soluble analogue of a membrane phospholamban, COMP (Cartilage oligomeric matrix protein), thrombospondin 3 (thrombospondin 3), thrombospondin 4 (thrombospondin 4), may be characterized as a coiled coil domain derived from VASP (vasodilator-stimulated phhosphoprotein) or a variant thereof, It is not limited thereto.
  • VASP vasodilator-stimulated phhosphoprotein
  • the coiled coil domain may be characterized in that it is located between the steppin A protein variant specifically binding to CD40L and the transmembrane domain.
  • the fusion protein may further include a virus-derived peptide or protein.
  • the virus-derived peptide or protein is, for example, syncytin-1 (syncytin-1), syncytin-2 (syncytin-2), VSVG (vesicular stomatitis virus glycoprotein), Nipah virus F and G proteins of measles virus, F and H proteins of measles virus, F and H proteins of tupaia paramyxovirus, F and G proteins F and H proteins of paramyxovirus, or F and HN proteins, F and G proteins of Hendra virus, F and G proteins of Henipavirus, F and H proteins of Morbilivirus, F and G proteins of respirovirus HN protein, the F and HN proteins of a Sendai virus, the F and HN proteins of a rubulavirus, or the F and HN proteins of an avulavirus, or a variant thereof or a combination thereof It can be
  • the fusion protein may further include an immune regulatory domain or an intracellular signaling domain.
  • the immune regulatory domain or intracellular signaling domain is a domain located in the cytoplasmic direction of a membrane-anchored protein, and refers to a site that activates or suppresses an immune response when a target antigen is bound to the extracellular domain. .
  • the immune regulatory domain or intracellular signaling domain may be characterized in that it is an immune regulatory domain derived from CD3, CD28, CD40L, ICOS, OX40, 4-1BB, TNFR2, etc., but is not limited thereto.
  • the fusion protein may be a chimeric antigen receptor (CAR).
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the steppin A protein variant specifically binding to CD40L may function as an extracellular binding domain.
  • the fusion protein when it is a chimeric antigen receptor, it may further include the above-described transmembrane domain, hinge domain, and intracellular signaling domain, but is not limited thereto, and various It can be easily designed and manufactured by changing the extracellular antigen-binding domain of the chimeric antigen receptor or its analogue to the steppin A protein variant specifically binding to CD40L of the present invention.
  • the fusion protein may further include a localization domain.
  • a localization domain refers to a peptide or protein sequence that functions to localize a protein to a specific organ within a cell or to a specific location within a cell.
  • the localization domain may be an organ-specific localization domain or an intracellular protein localization domain.
  • the localization domain is, for example, VACM-1 / CUL5, CXCR4, VP1, 53BP1, ING4, IER5, ERK5, Hrp1, UL79, EWS, PTHrP, Pho4, and nuclear specific derived from rpL23a, etc. localization domain; mitochondria specific localization domains derived from ATP synthase F1b, cytochrome c oxidase polypeptide VIII, SOD2, citrate synthase, Tu translation elongation factor, etc.; It may be characterized as a peroxisome localization domain derived from PTS1, PTS2, etc., but is not limited thereto.
  • the fusion protein may further include a half-life extension domain.
  • the half-life extension domain refers to a domain or moiety fused for the purpose of extending the half-life of the Stepin
  • a protein variant of the present invention for example, the half-life extension domain is an Fc domain, Fc binding It may be a protein or peptide, albumin (eg, HSA), albumin-binding protein or peptide, transferrin, transferrin-binding protein or peptide, etc., but is not limited thereto.
  • half-life refers to the time required for an active ingredient such as a stephin A protein variant or fusion protein of the present invention to lose half of its pharmacological or physiological activity or concentration.
  • the biological half-life may be influenced by elimination, excretion, degradation (eg enzymatic degradation) of the substance, or absorption and concentration in certain organs or tissues of the body.
  • biological half-life can be evaluated by determining the time it takes for the plasma concentration of a substance to reach half of its steady-state level.
  • the steppin A protein variant or the fusion protein containing the same may not have an appropriate half-life and/or pharmacokinetic profile (PK profile), and the half-life or half-life to further improve the profile (PK profile)
  • PK profile half-life and/or pharmacokinetic profile
  • An extension domain or half-life extension moiety may additionally be included.
  • half-life extension domain or “half-life extension moiety” of the present invention refers to a pharmaceutically acceptable pharmaceutically acceptable compound conjugated or fused directly or indirectly through a linker or the like to extend the half-life of the stephin A protein variant of the present invention. Means a moiety, domain or molecule.
  • the half-life extension domain prevents or alleviates in vivo protein degradation or activity reduction or modification of steppin A protein variants, extends half-life, increases absorption rate, reduces toxicity, improves solubility, reduces protein aggregation, biological activity, and /or may improve or alter pharmacokinetic or biophysical properties such as, but not limited to, increased target selectivity, increased productivity, and reduced immunogenicity.
  • the "half-life extension domain” includes a protein or peptide as well as a non-proteinaceous half-life extension domain.
  • a protein or peptide for example, polyethylene glycol (PEG) or discrete PEG, HES (hydroxyethyl starch), lipids, branched or unbranched acyl groups, branched or unbranched C8 to C30 acyl groups, branched or unbranched alkyl groups, branched or water-soluble polymers such as unbranched C8-C30 alkyl groups; and unstructured polypeptides such as serum albumin, transferrin, adnectins (e.g.
  • PKE adnectin pharmacokinetic extended adnectin
  • PAS polypeptides e.g.
  • it may be a proteinaceous half-life extension domain such as amino acids Pro, Ala and/or Ser
  • the half-life extension domain may be characterized by extending the half-life of the stephin A protein variant of the present invention circulating in the serum of the subject compared to the half-life of the fusion protein not including the domain.
  • the half-life may be extended by about 1.2 times, 1.5 times, 2.0 times, 3.0 times, 4.0 times, 5.0 times or 6.0 times or more, but is not limited thereto.
  • the half-life may be extended to 6 hours or more, 12 hours or more, 24 hours or more, 72 hours or more, 96 hours or more, or 1 week or more after administration, but is not limited thereto.
  • examples of preparing the fusion protein including the half-life extension domain are as follows, but are not limited thereto:
  • a protein variant sequence with an inert polypeptide e.g., XTEN (also known as recombinant PEG or rPEG), HAP (homoamino acid polymer, HAPylation), proline-alanine-serine polymer) (PAS; PASylation), or elastin-like peptide (ELP; ELPylation)
  • inert polypeptide e.g., XTEN (also known as recombinant PEG or rPEG), HAP (homoamino acid polymer, HAPylation), proline-alanine-serine polymer) (PAS; PASylation), or elastin-like peptide (ELP; ELPylation)
  • Fusion techniques with such inactive polypeptides are well known in the art (Schellenberger et al. (2009) “A recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptides and proteins in a tunable manner. Nat Bio
  • a fusion of a negatively charged highly sialylated peptide e.g., a carboxy-terminal peptide [CTP; of chorionic gonadotropin (CG) b-chain], a natural protein such as the human CG b-subunit.
  • CTP carboxy-terminal peptide
  • CG chorionic gonadotropin
  • Half-life extension through polysialylation is well known in the art (Gregoriadis et al. (2005) “Improving the therapeutic efficacy of peptides and proteins: a role for polysialic acids” Int J Pharm. 2005; Reprod. 4304-8.35; and Fares “Half-life extension through O-glycosylation.).
  • Classical genetic fusion to long-lived serum proteins provides an alternative method of half-life extension other than chemical conjugation to PEG or lipids.
  • Antibody Fc domains and human serum albumin have been used as traditional fusion domains for half-life extension.
  • An Fc fusion includes the fusion of a peptide, protein or receptor exodomain to the Fc portion of an antibody.
  • the Fc and albumin fusion protein increases the size of the peptide drug, prolonging the half-life, and utilizes the body's natural recycling mechanism, FcRn (neonatal Fc receptor). The pH-dependent binding of these proteins to FcRn prevents degradation of the fusion proteins in endosomes.
  • a fusion protein in which these proteins are fused may have a half-life of about 3 to 16 days, which is much longer than that of general PEGylated or lipidated peptides. Fusion of antibody Fc domains can improve solubility and stability of peptide or protein drugs.
  • An example of an Fc domain fusion is the GLP receptor agonist dulaglutide.
  • Human serum albumin the same protein utilized by fatty acylated peptides, is another fusion domain used for half-life extension.
  • An example based on the HSA binding platform is the GLP-1 receptor agonist Albiglutide.
  • the main difference between the Fc domain and albumin is that Fc is generally used as a dimer, and HSA is used as a monomer structure.
  • the fusion protein of the steppin A protein variant and the Fc domain of the present invention may be used as a dimer, but is not limited thereto.
  • the fusion protein may include an immunoglobulin Fc domain (Fc domain) or a fragment or variant thereof, for example, a functional Fc region.
  • the Fc region may be characterized in that it is an Fc ⁇ R null-binding Fc region.
  • the fusion protein may be characterized by comprising a steppin A protein variant that binds to at least one CD40L directly or indirectly linked to the Fc region of an immunoglobulin through a peptide backbone.
  • the fusion protein may be characterized in that it includes the Fc region of an antibody (which promotes effector functions and pharmacokinetic properties) and a steppin A protein variant that binds to CD40L as part of the same peptide.
  • the immunoglobulin Fc region may also be indirectly linked via a linker to a stepin A protein variant that binds at least one CD40L.
  • linkers are known in the art for use in the fusion proteins of the present invention.
  • the fusion protein including the Fc domain may be used after being dimerized, and may be characterized in that it is used after being homodimerized or heterodimerized.
  • the fusion protein when the fusion protein includes an Fc domain, stability can be improved, and antibody-like properties conferred by the Fc domain can be utilized.
  • the fusion protein when the fusion protein includes an Fc domain, the salvage neonatal FcRn receptor pathway including FcRn-mediated recycling of the fusion protein to the cell surface after endocytosis can proceed. It avoids lysosomal degradation and is released into the bloodstream, prolonging its half-life.
  • the fusion of the Fc domain can be usefully used not only to extend the half-life, but also to isolate and purify the fusion protein of the present invention.
  • the Fc domain may include an antibody constant region other than the first constant region immunoglobulin domain.
  • the Fc domain may include the last two constant region immunoglobulin domains of IgA, IgD and IgG and a flexible hinge N-terminus to these domains.
  • the Fc domain may include a J chain.
  • the Fc domain may include the immunoglobulin domains C ⁇ 2 and C ⁇ 3 and the hinge between C ⁇ 1 and C ⁇ 2.
  • a human IgG heavy chain Fc region is generally defined to include the carboxyl-terminal residue C226 or P230, where amino acids are numbered using Kabat numbering.
  • Fc Fc domain
  • Fc region of the present invention may be used interchangeably, and the Fc domain refers to the above-mentioned regions separately, or as part of an antibody, a fragment thereof, or a fusion protein. can be referred to. Polymorphisms of the Fc domain are reported at various locations and can be used as fusion domains of the fusion proteins of the present invention without limitation.
  • the Fc domain may be characterized as a “functional Fc region”.
  • the functional Fc region refers to an Fc domain or a fragment thereof capable of binding to FcRn.
  • the ability of an Fc region or fragment thereof to bind FcRn can be determined by standard binding assays known in the art.
  • the functional Fc region binds to FcRn, but may be characterized in that it does not have an effector function.
  • the “effector function” may include, for example, C1q binding; complement dependent cytotoxicity (CDC); Fc receptor binding; antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC); phagocytosis; down regulation of cell surface receptors (eg, B cell receptor, etc.); and the like.
  • the effector function can be evaluated using various validation methods known in the art for evaluating it.
  • the Fc domain may be characterized in that it is derived from IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4.
  • the Fc domain may be characterized in that it is derived from an IgG1 immunoglobulin Fc domain, and for example, the Fc domain may be characterized in that it comprises the following sequence:
  • the Fc region included in the fusion protein may include a hinge region.
  • the hinge region may be characterized as comprising the core hinge residues at sequence positions 1-16 of the human IgG1 Fc domain (eg, DKTHTCPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 536)).
  • the fusion protein is characterized in that it forms a multimeric structure (eg, a dimer) in part by cysteine residues at positions 6 and 9 in the hinge region of the human IgG1 immunoglobulin Fc domain sequence.
  • the hinge region may further include residues derived from the CH1 and CH2 regions flanking the core hinge sequence of the IgG immunoglobulin Fc domain sequence.
  • the hinge sequence may comprise or consist of GSTHTCPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 537) or EPKSCDKTHTCPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 538).
  • the hinge region may preferably be characterized in that it comprises one or more substitutions imparting pharmacokinetic, biophysical and/or biological properties.
  • the hinge region may comprise or consist of the following sequence:
  • EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS (SEQ ID NO: 539);
  • EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS (SEQ ID NO: 540);
  • EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO: 541);
  • EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO: 542);
  • the 18th residue P of the human IgG1 immunoglobulin Fc domain sequence may be substituted with S to remove the Fc effector function; Examples of such substitutions are:
  • EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO: 541);
  • DKs at positions 1 and 2 of the human IgG1 immunoglobulin Fc domain may be substituted with GS to remove a potential clip site, and examples of such substitutions are as follows:
  • EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO: 542).
  • the 103rd residue C of the heavy chain constant region (eg, CH1 to CH3) of human IgG may be substituted with S to prevent formation of inappropriate cysteine bonds in the absence of a light chain, such substitution examples include:
  • the sequence is as follows:
  • EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS (SEQ ID NO: 540);
  • EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO: 542).
  • the Fc domain may be a mammalian Fc domain, preferably a human Fc domain.
  • the Fc domain may be characterized in that it is an Fc domain derived from IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4.
  • the Fc domain has at least about 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% sequence identity with the native Fc domain and/or the Fc region of the parent polypeptide. (identity).
  • the Fc domain may have 90% or more sequence identity with the native Fc domain and/or the Fc domain of the parent polypeptide.
  • the Fc domain may include an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 545 to 558 or an Fc domain of SEQ ID NOs: 545 to 558 described in Examples.
  • the C-terminal lysine of the Fc domain should be understood as an optional component for fusion proteins containing the Fc domain.
  • the Fc domain may be characterized by comprising an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 545 to 558.
  • the Fc domain may be characterized by comprising an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 545 to 558 in which lysine present at its C-terminus is omitted.
  • antibody-dependent cytotoxicity means that the cytotoxic effector cells of secreted immunoglobulins bound to Fc receptors (FcRs) present in specific cytotoxic cells specifically target antigen-bearing cells. It means that it binds to show cytotoxicity and kills cells.
  • FcRs Fc receptors
  • the fusion protein may be characterized by having no ADCC and/or complement activation or effector function, or comprising a reduced Fc domain.
  • an Fc domain can be characterized as comprising a naturally inactivated constant region of an IgG2 or IgG4 isotype or a mutated IgG1 constant region.
  • modified Fc domains are described in EP0307434 et al.
  • the Fc domain may include, but is not limited to, substitutions of alanine residues at positions 235 and 237 (EU index numbering).
  • the fusion protein may include an Fc domain that retains some or all of Fc functions (eg, ADCC and/or CDC).
  • the fusion protein may include an Fc domain of human IgG1 or IgG3, but is not limited thereto.
  • the level of effector function of the Fc domain of the present invention can be controlled by known methods.
  • a mutation in the CH2 domain for example, having one or more mutations selected from positions 239, 332, and 330 of CH2 of IgG1, for example, the mutation may be any one or more selected from S239D, I332E, and A330L.
  • the Fc domain may be characterized in that the glycosylation profile is changed so that fucosylation of the Fc region is reduced.
  • the fusion protein may include an albumin sequence or a fragment thereof.
  • the albumin sequence or fragment thereof may be characterized in that it is fused or spliced through incorporation or chemical linkage into a polypeptide sequence containing a steppin A protein variant.
  • albumin, albumin variants or albumin fragments may be characterized as human serum albumin (HSA), variants thereof or fragments thereof.
  • HSA human serum albumin
  • albumin serum proteins other than HSA can be characterized as being derived from, for example, cynomolgus monkey, cow, dog, rabbit and rat, for example, BSA is structurally most similar to HSA. (Kosa et al., (2007) J Pharm Sci. 96(11):3117-24).
  • the albumin may be non-human serum albumin such as cyno serum albumin or bovine serum albumin, but is not limited thereto.
  • Mature HSA of 585 amino acids polypeptide (approximately 67 kDa) with a serum half-life of approximately 20 days is primarily responsible for maintaining colloidal osmotic pressure, blood pH, transport and distribution of numerous endogenous and exogenous ligands.
  • Serum albumin protein has three structurally homologous domains (domains I, II, and III), exhibits a mostly alpha-helical conformation, and is highly stabilized by 17 disulfide bonds.
  • the fusion protein comprises at least one Stefin A protein variant; and mature human serum albumin (eg, SEQ ID NO: 559) or a variant or fragment thereof.
  • the albumin of the fusion protein may be characterized by maintaining a desired level of PK and/or biodistribution characteristics.
  • the albumin sequence may be separated from other flanking sequences of the stepin A protein variant or fusion protein through a linker sequence.
  • albumin or mature albumin in the present invention means human serum albumin.
  • the full-length HSA can be characterized as comprising a signal peptide consisting of 18 amino acids (MKWVTFISLLFLFSSAYS (SEQ ID NO: 486)) followed by a pro-domain sequence consisting of 6 amino acids (RGVFRR (SEQ ID NO: 560)), A total of 24 amino acids described above may be referred to as a pre-pro domain.
  • the fusion protein may be characterized in that it is expressed and secreted by the HSA pre-pro domain.
  • the fusion protein including the stephin A protein variant and HSA may include the signal sequence described in the stephin A protein variant, and may be characterized in that it is expressed and secreted through it.
  • the serum albumin is, for example, a stephin A protein variant or a fusion protein containing the same, such as chemical conjugation through the amino acid side chain, etc., by a bond other than an amide bond, or a stephin A protein variant containing the same. Can be covalently coupled to the fusion protein.
  • the fusion protein may be characterized in that it includes a serum binding domain (or moiety).
  • the serum binding domain may be included as part of a fusion protein sequence, or may be chemically conjugated through another site.
  • the serum binding domain may be characterized in that the albumin binding domain.
  • the albumin contains a plurality of hydrophobic binding pockets, and can naturally serve as a carrier for various ligands such as fatty acids and steroids, and the surface of albumin is negatively charged and exhibits high water solubility.
  • albumin-binding domain refers to any group capable of binding to albumin, and may refer, for example, to a compound having albumin-binding affinity.
  • Albumin can bind endogenous ligands such as fatty acids, as well as interact with exogenous ligands such as warfarin, penicillin and diazepam. The binding between these drugs and albumin is reversible, and the albumin-drug complex can serve as a drug reservoir or drug delivery system that can improve biodistribution and bioavailability of drugs.
  • the chemical modification that can be applied to the fusion protein of the present invention to increase the protein half-life may be characterized by lipidation by covalently binding fatty acids to peptide side chains.
  • This method is well known in the art as a method for extending the half-life of insulin, and may be characterized by reducing renal filtration by increasing the hydrodynamic radius, such as PEGylation.
  • the lipid moiety itself is relatively small and may exhibit half-life extension indirectly by non-covalent association with circulating albumin. Lipidation can reduce the water solubility of the peptide, but this can be controlled through engineering of the linker between the peptide and the fatty acid. Linker engineering and modification of lipids can contribute to an increase in half-life in vivo independent of albumin (Jonassen et al. (2012) Pharm Res. 29(8):2104-14).
  • the albumin-binding domain is albumin-binding (PKE2) adnectins; WO2011140086 “Serum Albumin Binding Molecules”, WO2015143199 “Serum albumin-binding Fibronectin Type III Domains” and WO2017053617 “Fast-off rate serum albumin binding fibronectin type iii domains”), albumin binding domain 3 of Proein G of Streptococcus G148 (ABD3), an albumin binding domain antibody (e.g. GSK2374697, AlbudAb), or an albumin binding nanobody (e.g. For example, ATN103, Ozolralizumab).
  • PKE2 albumin-binding
  • the fusion protein may be characterized in that it includes a steppin A protein variant capable of binding to serum protein. In the present invention, the fusion protein may be characterized in that it includes a steppin A protein variant capable of binding to HSA.
  • At least one of the solvent accessible loops of the stephin A protein variant capable of binding to HSA may be characterized in that it is derived from a wild-type stephin A protein capable of binding to HSA.
  • the steppin A protein variant capable of binding to HSA may be characterized in that it binds to HSA with a Kd of 10 ⁇ 6 M or less.
  • the steppin A protein variant capable of binding to HSA may be characterized in that it binds to HSA with a Kd of 1x10 -9 M to 1x10 -6 M at pH 7.4 to 7.6.
  • the steppin A protein variant capable of binding to HSA may be characterized in that it binds to HSA with a Kd of 1x10 -6 M or less at pH 7.4 to 7.6.
  • the steppin A protein variant capable of binding to HSA may be characterized in that it binds to HSA with a Kd of 1x10 -7 M or less at pH 7.4 to 7.6.
  • the steppin A protein variant capable of binding to HSA may be characterized in that it binds to HSA with a Kd of 1x10 -8 M or less at pH 7.4 to 7.6.
  • the steppin A protein variant capable of binding to HSA may be characterized in that it binds to HSA with a Kd of 1x10 -9 M or less at pH 7.4 to 7.6.
  • the steppin A protein variant capable of binding to HSA may be characterized in that it binds to HSA with a Kd of 1x10 -10 M or less at pH 7.4 to 7.6.
  • the steppin A protein variant capable of binding to HSA may be characterized in that it binds to HSA with a Kd of 1x10 -11 M or less at pH 7.4 to 7.6.
  • the steppin A protein variant capable of binding to HSA may be characterized in that it binds to HSA with a Kd of 1x10 -9 M to 1x10 -6 M at pH 7.4.
  • the steppin A protein variant capable of binding to HSA may be characterized in that it binds to HSA with a Kd of 1x10 -6 M or less at pH 7.4.
  • the steppin A protein variant capable of binding to HSA may be characterized in that it binds to HSA with a Kd of 1x10 -7 M or less at pH 7.4.
  • the steppin A protein variant capable of binding to HSA may be characterized in that it binds to HSA with a Kd of 1x10 -8 M or less at pH 7.4.
  • the steppin A protein variant capable of binding to HSA may be characterized in that it binds to HSA with a Kd of 1x10 -9 M or less at pH 7.4.
  • the steppin A protein variant capable of binding to HSA may be characterized in that it binds to HSA with a Kd of 1x10 -10 M or less at pH 7.4.
  • the steppin A protein variant capable of binding to HSA may be characterized in that it binds to HSA with a Kd of 1x10 -11 M or less at pH 7.4.
  • the stepin A protein variant capable of binding to HSA has a backbone sequence, and at least one of loop 2 and loop 4 is replaced with an alternate loop sequence, (Xaa)n and (Xaa)m, a wild-type human strain. It may be characterized as being a variant derived from the pin A protein.
  • the stephin A protein variant capable of binding to HSA may be characterized by comprising an amino acid sequence represented by Formula I:
  • FR1 is at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95% or 100% of the amino acid sequence represented by MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEK TNETYGKLEA VQYKTQVLA (SEQ ID NO: 1A) an amino acid sequence with identity;
  • FR2 is at least 70% (e.g., at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95% or 100 %) can be characterized by being represented by an amino acid sequence having an identity;
  • the FR3 is at least 70% (e.g., at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95% or 100%) may be characterized by being represented by an amino acid sequence having an identity; and
  • Xaa individually at each occurrence, is any amino acid residue; n and m are each independently an integer of 3 to 20.
  • the FR1 is at least 80%-98%, 82%-98%, 84%-98%, 86%-98%, 88%-98%, 90%-98%, 92% of SEQ ID NO: 1A It can be characterized as a polypeptide having %-98%, 94%-98%, or 96%-98% homology.
  • the FR1 is a polypeptide having at least 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 92%, 94%, 96%, or 98% homology to SEQ ID NO: 1A. that can be characterized.
  • the FR1 may be a polypeptide of SEQ ID NO: 1A.
  • the FR2 may be characterized by having at least 80%-96%, 84%-96%, 88%-96%, or 92%-96% homology with SEQ ID NO: 2.
  • the FR2 may be a polypeptide having at least 880%, 84%, 88%, 92%, or 96% homology to SEQ ID NO: 2.
  • the FR2 may be a polypeptide having at least 80%, 85%, 90%, 95% or 98% identity with SEQ ID NO: 2.
  • the FR3 may be a polypeptide having at least 80%-95%, 85%-95%, or 90%-95% homology with SEQ ID NO: 3.
  • the FR3 may be a polypeptide having at least 80%, 85%, 90%, and 95% homology to SEQ ID NO: 3.
  • the FR3 may be characterized in that the polypeptide of SEQ ID NO: 3.
  • the steppin A protein variant capable of binding to HSA may be characterized by comprising an amino acid sequence represented by Formula II (SEQ ID NO: 4):
  • Xaa is individually in each case any amino acid residue; n and m are each independently an integer of 3 to 20.
  • the steppin A protein variant capable of binding to HSA may be characterized in that it comprises an amino acid sequence represented by Formula III.
  • Xaa is individually in each case any amino acid residue; n and m are each independently an integer of 3 to 20.
  • Xaa1 is Gly, Ala, Val, Arg, Lys, Asp, or Glu
  • Xaa2 is Gly, Ala, Val, Ser or Thr
  • Xaa3 is Arg, Lys, Asn, Gln, Ser, or Thr
  • Xaa4 is Gly, Ala, Val, Ser or Thr
  • Xaa5 is Ala, Val, Ile, Leu, Gly or Pro
  • Xaa6 is Gly, Ala, Val, Asp or Glu
  • Xaa7 may be Ala, Val, Ile, Leu, Arg or Lys.
  • Xaa1 may be Gly, Ala, Arg or Lys. In the present invention, Xaa1 may be Gly or Arg. In the present invention, Xaa2 may be Gly, Ala, Val, Ser or Thr. In the present invention, Xaa2 may be Gly or Ser. In the present invention, Xaa3 may be Arg, Lys, Asn, Gln, Ser, or Thr. In the present invention, Xaa3 may be Arg, Lys, Asn or Gln. In the present invention, Xaa3 may be Lys or Asn. In the present invention, Xaa4 may be Gly, Ala, Val, Ser or Thr.
  • Xaa4 may be Gly or Ser.
  • Xaa5 may be Ala, Val, Ile, Leu, Gly or Pro.
  • Xaa5 may be Ile, Leu or Pro.
  • Xaa5 may be Leu or Pro.
  • Xaa6 may be Gly, Ala, Val, Asp or Glu.
  • Xaa6 may be Ala, Val, Asp or Glu.
  • Xaa6 may be Ala or Glu.
  • Xaa7 may be Ala, Val, Ile, Leu, Arg or Lys.
  • Xaa7 may be Ile, Leu or Arg.
  • Xaa7 may be Leu or Arg.
  • n may be 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20. .
  • n may be 8 to 10, 7 to 11, 6 to 12, 5 to 13, 4 to 14, or 3 to 15.
  • m may be 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20. .
  • m may be 8 to 10, 7 to 11, 6 to 12, 5 to 13, 4 to 14, or 3 to 15.
  • (Xaa)n can be characterized by being represented by formula IV:
  • aa1 is an amino acid having a neutral polar hydrophilic side chain
  • aa2 is an amino acid having a neutral non-polar hydrophobic side chain
  • aa3 is an amino acid having a neutral non-polar hydrophobic side chain
  • aa4 is an amino acid having a neutral polar hydrophilic side chain
  • aa5 is an amino acid having a positively charged polar hydrophilic side chain
  • aa6 is an amino acid with a positively charged polar hydrophilic side chain
  • aa7 is an amino acid having a neutral non-polar hydrophobic side chain
  • aa8 is an amino acid having a neutral non-polar hydrophobic side chain
  • aa9 is an amino acid having a neutral non-polar hydrophobic side chain.
  • (Xaa)m can be characterized by being represented by the formula V:
  • V aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9
  • aa1 is an amino acid having a neutral non-polar hydrophobic side chain
  • aa2 is an amino acid having a positively charged polar hydrophilic side chain
  • aa3 is an amino acid having a neutral non-polar hydrophobic side chain
  • aa4 is an amino acid having a positively charged polar hydrophilic side chain
  • aa5 is an amino acid having a neutral polar hydrophilic side chain
  • aa6 is an amino acid having a neutral polar hydrophilic side chain
  • aa7 is an amino acid with a negatively charged polar hydrophilic side chain
  • aa8 is an amino acid with a positively charged polar hydrophilic side chain
  • aa9 is an amino acid having a neutral non-polar hydrophilic side chain.
  • amino acids having neutral non-polar hydrophilic side chains may include cysteine (Cys) and glycine (Gly).
  • Cys cysteine
  • Gly glycine
  • an amino acid having a neutral non-polar hydrophilic side chain may be Cys.
  • an amino acid having a neutral non-polar hydrophilic side chain may be Gly.
  • amino acids with neutral non-polar hydrophobic side chains are alanine (Ala), isoleucine (Ile), leucine (Leu), methionine (Met), phenylalanine (Phe), proline (Pro), tryptophan (Trp), and valine (Val) can include
  • the amino acid having a neutral non-polar hydrophobic side chain may be Ala.
  • the amino acid having a neutral non-polar hydrophobic side chain may be Ile.
  • the amino acid having a neutral non-polar hydrophobic side chain may be Leu.
  • an amino acid having a neutral non-polar hydrophobic side chain may be Met.
  • amino acids having neutral polar hydrophilic side chains may include asparagine (Asn), glutamine (Gln), serine (Ser), threonine (Thr), and tyrosine (Tyr).
  • the amino acid having a neutral polar hydrophilic side chain may be Asn.
  • the amino acid having a neutral polar hydrophilic side chain may be Gln.
  • an amino acid having a neutral polar hydrophilic side chain may be Ser.
  • an amino acid having a neutral polar hydrophilic side chain may be Thr.
  • an amino acid having a neutral polar hydrophilic side chain may be Tyr.
  • amino acids having positively charged polar hydrophilic side chains may include arginine (Arg), histidine (His), and lysine (Lys).
  • an amino acid having a positively charged polar hydrophilic side chain may be Arg.
  • the amino acid having a positively charged polar hydrophilic side chain may be His.
  • an amino acid having a positively charged polar hydrophilic side chain may be Lys.
  • amino acids with negatively charged polar hydrophilic side chains may include aspartate (Asp) and glutamate (Glu).
  • an amino acid having a negatively charged polar hydrophilic side chain may be Asp.
  • an amino acid having a negatively charged polar hydrophilic side chain may be Glu.
  • (Xaa)n can be characterized by being represented by formula IV:
  • aa1 is an amino acid selected from Asp, Gly, Asn, and Val
  • aa2 is an amino acid selected from Trp, Tyr, His, and Phe
  • aa3 is an amino acid selected from Trp, Tyr, Gly, Trp, and Phe
  • aa4 is an amino acid selected from Gln, Ala, and Pro
  • aa5 is an amino acid selected from Ala, Gln, Glu, Arg, and Ser
  • aa6 is an amino acid selected from Lys, Arg, and Tyr
  • aa7 is an amino acid selected from Trp and Gln
  • aa8 is an amino acid selected from Pro and His
  • aa9 is an amino acid selected from His, Gly, and Gln.
  • aa1 may be Asp. In the present invention, aa1 may be Gly. In the present invention, aa1 may be Asn. In the present invention, aa2 may be Trp. In the present invention, aa2 may be Tyr. In the present invention, aa2 may be His. In the present invention, aa2 may be Phe. In the present invention, aa3 may be Trp. In the present invention, aa3 may be Tyr. In the present invention, aa3 may be Gly. In the present invention, aa3 may be Trp. In the present invention, aa3 may be Phe. In the present invention, aa4 may be Gln.
  • aa4 may be Ala. In the present invention, aa4 may be Pro. In the present invention, aa5 may be Ala. In the present invention, aa5 may be Gln. In the present invention, aa5 may be Glu. In the present invention, aa5 may be Arg. In the present invention, aa5 may be Ser. In the present invention, aa6 may be Lys. In the present invention, aa6 may be Arg. In the present invention, aa6 may be Tyr. In the present invention, aa7 may be Trp. In the present invention, aa7 may be Gln. In the present invention, aa8 may be Pro. In the present invention, aa8 may be His. In the present invention, aa9 may be His. In the present invention, aa9 may be Gly. In the present invention, aa9 may be Gln.
  • (Xaa)m can be characterized by being represented by formula IV:
  • aa1 is an amino acid selected from Tyr, Phe, Trp, and Asn
  • aa2 is Lys, Pro, His, Ala, and Thr
  • aa3 is an amino acid selected from Val, Asn, Gly, Gln, Ala, and Phe
  • aa4 is an amino acid selected from His, Thr, Lys, Trp, Lys, Val, and Arg
  • aa5 is an amino acid selected from Gln, Ser, Gly, Pro, and Asn
  • aa6 is an amino acid selected from Ser, Tyr, Glu, Leu, Lys, and Thr
  • aa7 is an amino acid selected from Ser, Asp, Val, and Lys
  • aa8 is an amino acid selected from Gly, Leu, Ser, Pro, His, Asp, and Arg
  • aa9 is an amino acid selected from Gly, Gln, Glu, and Ala.
  • aa1 may be Tyr. In the present invention, aa1 may be Phe. In the present invention, aa1 may be Trp. In the present invention, aa1 may be Asn. In the present invention, aa2 is Lys. In the present invention, aa2 may be Pro. In the present invention, aa2 may be His. In the present invention, aa2 may be Ala. In the present invention, aa2 may be Thr. In the present invention, aa3 may be Val. In the present invention, aa3 may be Asn. In the present invention, aa3 may be Gly. In the present invention, aa3 may be Gln. In the present invention, aa3 may be Ala.
  • aa3 may be Phe.
  • aa4 may be His.
  • aa4 may be Thr.
  • aa4 may be Lys.
  • aa4 may be Trp.
  • aa4 may be Lys.
  • aa4 may be Val.
  • aa4 may be Arg.
  • aa5 may be Gln.
  • aa5 may be Ser.
  • aa5 may be Gly.
  • aa5 may be Pro.
  • aa5 may be Asn.
  • aa6 may be Ser.
  • aa6 may be Tyr. In the present invention, aa6 may be Glu. In the present invention, aa6 may be Leu. In the present invention, aa6 may be Lys. In the present invention, aa6 may be Thr. In the present invention, aa7 may be Ser. In the present invention, aa7 may be Asp. In the present invention, aa7 may be Val. In the present invention, aa7 may be Lys. In the present invention, aa8 may be Gly. In the present invention, aa8 may be Leu. In the present invention, aa8 may be Ser. In the present invention, aa8 may be Pro. In the present invention, aa8 may be His.
  • aa8 may be Asp. In the present invention, aa8 may be Arg. In the present invention, aa9 may be Gly. In the present invention, aa9 may be Gln. In the present invention, aa9 may be Glu. In the present invention, aa9 may be Ala.
  • (Xaa)n can be characterized by being represented by the formula V:
  • aa1 is an amino acid selected from Trp and Phe; and aa2 is an amino acid selected from Tyr and Phe.
  • aa1 may be Trp.
  • aa1 may be Phe.
  • aa2 may be Tyr.
  • aa2 may be Phe.
  • (Xaa)n can be characterized as represented by Formula VI:
  • aa1 is an amino acid selected from Asp and Gly; aa2 is an amino acid selected from Trp, Tyr, and Phe; aa3 is an amino acid selected from Gln and Ala; aa4 is an amino acid selected from Ala and Ser; and aa5 is an amino acid selected from His and Gly.
  • aa1 may be Asp.
  • aa1 may be Gly.
  • aa2 may be Trp.
  • aa2 may be Tyr.
  • aa2 may be Phe.
  • aa3 may be Gln.
  • aa3 may be Ala.
  • aa4 may be Ala.
  • aa4 may be Ser.
  • aa5 may be His.
  • aa5 may be Gly.
  • (Xaa)n can be characterized by being represented by formula VII:
  • aa1 is an amino acid selected from Gly and Asn
  • aa2 is an amino acid selected from Tyr, Phe, Trp, and His
  • aa3 is an amino acid selected from Trp, Tyr, and Phe
  • aa4 is an amino acid selected from Ala and Gln
  • aa5 is an amino acid selected from Ala, Ser, Gln, and Arg
  • aa6 is an amino acid selected from Lys, Arg, and Tyr.
  • aa1 may be Gly.
  • aa1 may be Asn.
  • aa2 may be Tyr.
  • aa2 may be Phe.
  • aa2 may be Trp.
  • aa2 may be His.
  • aa3 may be Trp.
  • aa3 may be Tyr.
  • aa3 may be Phe.
  • aa4 may be Ala.
  • aa4 may be Gln.
  • aa5 may be Ala.
  • aa5 may be Ser.
  • aa5 may be Gln.
  • aa5 may be Arg.
  • aa6 may be Lys.
  • aa6 may be Arg.
  • aa6 may be Tyr.
  • (Xaa)n can be characterized by being represented by formula VIII:
  • aa1 is an amino acid selected from Tyr, Phe, and His
  • aa2 is an amino acid selected from Trp and Tyr
  • aa3 is an amino acid selected from Ala, Ser, and Arg
  • aa4 is an amino acid selected from Lys and Tyr.
  • aa1 may be Tyr.
  • aa1 may be Phe His.
  • aa1 may be His.
  • aa2 may be Trp.
  • aa2 may be Tyr.
  • aa3 may be Ala.
  • aa3 may be Ser.
  • aa3 may be Arg.
  • aa4 may be Lys.
  • aa4 may be Tyr.
  • (Xaa)n can be characterized by being represented by formula IX:
  • aa1 may be Asp.
  • aa1 may be Asn.
  • aa2 may be Trp.
  • aa2 may be Phe.
  • aa3 may be Trp.
  • aa3 may be Tyr.
  • aa3 may be Phe.
  • aa4 may be Ala.
  • aa4 may be Gln.
  • aa4 may be Arg.
  • aa5 may be Lys.
  • aa5 may be Arg.
  • aa6 may be His.
  • aa6 may be Gly.
  • the steppin A protein variant capable of binding to HSA may be characterized in that it includes any one loop2 amino acid selected from amino acids of SEQ ID NOs: 562 to 614 (Table 8).
  • the steppin A protein variant capable of binding to HSA may be characterized in that it includes any one loop4 amino acid selected from amino acids of SEQ ID NOs: 615 to 667 (Table 8).
  • (Xaa)n may include an amino acid sequence having at least 80% or at least 90% identity with any one of amino acid sequences of SEQ ID NOs: 562 to 614.
  • (Xaa)n may include an amino acid sequence having 80% to 90% identity with any one of amino acid sequences of SEQ ID NOs: 562 to 614.
  • (Xaa)n may be characterized in that it comprises any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 562 to 614.
  • (Xaa)m may include an amino acid sequence having at least 80% or at least 90% identity with any one amino acid sequence of SEQ ID NOs: 615 to 667.
  • (Xaa)m may include an amino acid sequence having 80% to 90% identity with any one amino acid sequence of SEQ ID NOs: 615 to 667.
  • the (Xaa)m may include any one of amino acid sequences from 615 to 667.
  • the steppin A protein variant capable of binding to HSA may be characterized by comprising any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 668 to 674 (Table 9).
  • the steppin A protein variant capable of binding to HSA comprises an amino acid sequence having at least 80% or at least 90% identity with the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 668 to 674 can do.
  • the steppin A protein variant capable of binding to HSA may be characterized in that it comprises an amino acid sequence having 80% to 90% identity with the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 668 to 674. there is.
  • the stephin A protein variant capable of binding to HSA is linked to another molecule (eg, a stephin A protein variant that specifically binds to a therapeutic polypeptide or CD40L of the present invention), and the molecule can prolong the half-life of
  • the steppin A protein variant capable of binding to HSA may be characterized in that it has various binding affinities that cross-react with other species such as, for example, mouse cynomolgus (cyno) monkey.
  • the steppin A protein variant capable of binding to HSA is named the AFFIMER XTTM platform.
  • the stephin A protein variant capable of binding to HSA can extend the half-life of other stephin A protein variants or fusion proteins thereof conjugated in a single gene fusion method in a controlled manner in in vivo pharmacokinetic (PK) studies.
  • the steppin A protein variant capable of binding to HSA (AFFIMER XTTM) can be used to extend the half-life of other peptide or protein therapeutics.
  • the stephin A protein variant capable of binding to HSA is used in vivo for treatment, such as a stephin A protein variant that specifically binds to a molecule, for example, CD40L of the present invention or a fusion protein comprising the same. It can be characterized by increasing the serum half-life of the protein.
  • the stephin A protein variant capable of binding to HSA increases the serum half-life of a molecule, for example, a therapeutic protein such as a stephin A protein variant that specifically binds to CD40L of the present invention or a fusion protein comprising the same.
  • a stephin A protein variant capable of binding to HSA may be characterized by at least a two-fold increase relative to an unlinked molecule.
  • the serum half-life is increased by at least 3 times, at least 4 times, at least 5-fold, at least 6-fold, at least 7-fold, at least 8-fold, at least 9-fold, at least 10-fold, at least 20-fold, or at least 30-fold.
  • the serum half-life is 2 to 5 times, 2 times higher than that of a molecule without the stephin A protein variant binding to HSA. to 10 times, 3 times to 5 times, 3 times to 10 times, 15 times to 5 times, 4 times to 10 times, or 5 times to 10 times.
  • the serum half-life is at least 6 hours, at least 12 hours, at least 24 hours, at least 48 hours, at least 72 hours, at least 96 hours, eg at least one week or more after administration in vivo.
  • the fusion protein has an increased serum half-life compared to the steppin A protein variant that specifically binds to CD40L, and is at least 70%, 75% and 80% of SEQ ID NOs: 667 to 702 (Table 10). , 85%, 90%, 95% or 98% identical (identical) amino acid sequence.
  • the fusion protein has an increased serum half-life compared to the Stephin A protein variant that specifically binds to CD40L, and has SEQ ID NOs: 667-702 (Table 10) and SEQ ID NOs: 703-728 (Table 11). It may be characterized as comprising an amino acid sequence that is at least 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 95% or 98% identical to the sequence.
  • a wide variety of macromolecular polymers and other molecules can be linked to the steppin A protein variants that specifically bind to CD40L of the present invention to modulate biological properties and/or provide new biological properties.
  • the polymer is formed through a naturally encoded amino acid, a non-naturally encoded amino acid, or any functional substituent of a natural or non-natural amino acid, or any substituent or functional group added to a natural or non-natural amino acid. It can be linked to the steppin A protein variant that specifically binds to CD40L of the present invention.
  • the molecular weight of the polymer may be about 100 Da to about 100,000 Da, but is not limited thereto.
  • the molecular weight of the polymer is 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 4 0,000 Da, 1,0 00 Da, 900 Da, 800 Da , 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, and about 100 Da to about 100,000 Da, including, but not limited to, Da.
  • the molecular weight of the polymer is about 100 Da to about 50,000 Da, about 100 Da to about 40,000 Da, about 1,000 Da to about 40,000 Da, about 5,000 Da to about 40,000 Da, or about 10,000 Da to about 40,000 Da It can be characterized as being.
  • PEGylation polysialylation, HESylation, glycosylation, or recombinant PEG analogs fused to flexible and hydrophilic amino acid chains (500 to 600 amino acids) are used.
  • Methods have been developed (Chapman, (2002) Adv Drug Deliv Rev. 54. 531-545; Schlapschy et al., (2007) Prot Eng Des Sel. 20, 273-283; Contermann (2011) Curr Op Biotechnol. 22, 868-876; Jevsevar et al., (2012) Methods Mol Biol. 901, 233-246), etc.).
  • the polymers are, for example, polyalkyl ethers and their alkoxy-capped analogues (eg polyoxyethylene glycol, polyoxyethylene/polypropylene glycol and their methoxy or ethoxy capped analogues, in particular poly oxyethylene glycol (the latter also referred to as polyethylene glycol); dPEG (discrete PEG); polyvinylpyrrolidones; polyvinylalkyl ethers; polyoxazolines, polyalkyl oxazolines and polyhydroxyalkyl oxazolines; polyacrylamides, polyalkyl acrylamides, and polyhydroxyalkyl acrylamides (eg, polyhydroxypropylmethacrylamide and derivatives thereof); polyhydroxyalkyl acrylates; polysialic acids and their analogues; hydrophilic peptide sequences; dextran and dextran derivatives (eg carboxymethyldextran polysaccharides and their derivatives), polysaccharides and
  • chitin and its derivatives e.g. chitosan
  • succinyl chitosan succinyl chitosan, carboxymethylchitin, carboxymethylchitosan
  • hyaluronic acid and its derivatives starches; alginates; chondroitin sulfate; albumin (albumin); pullulan and carboxymethyl pullulan
  • polyaminoacids and derivatives thereof eg, polyglutamic acids, polylysines, polyaspartic acids) acids, polyaspartamides
  • maleic anhydride copolymers e.g., styrene maleic anhydride copolymer, divinylethyl ether maleic anhydride copolymer ( divinylethyl ether maleic anhydride copolymer; polyvinyl alcohols; copolymers thereof; terpolymers thereof; mixtures thereof; and derivatives thereof.
  • the polymer may be characterized in that it is a water-soluble polymer so that the fusion protein does not precipitate in an aqueous environment such as a physiological environment.
  • the water-soluble polymer may have any structure including, but not limited to, linear, forked or branched.
  • the water-soluble polymer may be polyalkylene glycol such as polyethylene glycol (PEG), but may be other water-soluble polymers, but is not limited thereto.
  • PEG polyethylene glycol
  • the polymer may be characterized as being pharmaceutically acceptable.
  • polyethylene glycol PEG
  • PEG polyethylene glycol
  • n 2 to 10,000
  • X is H or a terminal modification such as but not limited to C 1-4 alkyl, a protecting functional group, or a terminal functional group.
  • one end of the PEG may be terminated with hydroxy or methoxy, for example, X may be H or CH3.
  • the other terminus of PEG may be attached to the steppin A protein variant of the present invention via a naturally occurring or non-naturally encoded amino acid.
  • the attachment is via an amide, carbamate, or urea linkage to an amine group (eg, but not limited to, the absilon amine of lysine, or the N-terminus).
  • the polymer may be linked to a thiol group (including but not limited to, a thiol group of cysteine) by a maleimide linkage. This allows substitution of cysteine residues of the steppin A protein variants of the present invention when the polymer is bound to the fusion protein.
  • a protein variant or fusion protein thereof of the present invention can be adjusted to provide or alter pharmacological, pharmacokinetic, or pharmacodynamic properties such as half-life.
  • the steppin A protein variant or fusion protein thereof comprising the polymer is at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 2-fold , 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 11x, 12x, 13x, 14x, 15x, 16x, 17x, 18x, 19x, 20x, 25x can be characterized as a 2x, 30x, 35x, 40x, 50x, or at least 100x increase.
  • a polymer useful for modifying the PK or biological properties of a stephin is one that uses a hydrophilic amino acid polymer functionally similar to PEG as part of the fusion protein of the invention.
  • the fusion protein may include a hydrophilic amino acid polymer.
  • the inherent biodegradability of polypeptides has attracted attention as a potential alternative to PEG.
  • hydrophilic amino acid polymers have precise molecular structures.
  • fusion proteins comprising unstructured domains have the advantage that most of them can be exposed to harsh conditions such as higher temperatures or HPLC purification.
  • XTEN As a non-limiting example of such a polypeptide, XTEN (Amunix) is composed of 864 amino acids consisting of A, E, G, P, S and T (Schellenberger et al. “A recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptides and proteins in a tunable manner” 2009 Nat Biotechnol. 27(12):1186-90).
  • the biodegradability of XTEN is much greater than that of the commonly used 40 KDa PEG and involves an extended half-life.
  • a fusion protein containing XTEN may have a half-life extended by 60 to 130 times compared to a case without XTEN.
  • PAS XL-Protein GmbH
  • PASYlation a biological alternative to PEGylation for extending the plasma half-life of pharmaceutically active proteins
  • the PAS is a random coil polymer composed of a limited set of uncharged amino acids of proline, alanine and serine.
  • PAS is a stephin A protein variant to be made into an inline fusion protein when expressing a stephin A protein variant or a fusion protein that specifically binds to CD40L in the genetically engineered cells of the present invention. or genetically encoded together with a nucleic acid encoding the fusion protein.
  • the fusion protein may be characterized in that any one of the polypeptides of Table 10 below.
  • the nucleic acid encoding the fusion protein may be selected from the nucleic acids provided in Table 11, but is not limited thereto, and amino acids of the steppin A protein specifically binding to CD40L of the present invention. It is obvious that the nucleic acid sequence encoding the fusion protein can be designed and predicted based on the sequence and the nucleic acid sequence encoding the same, along with the polypeptide sequence of the fusion domain included in the fusion protein of the present invention and the nucleic acid sequence encoding the same. can be understood
  • the present invention relates to a conjugate comprising a Stefin A protein variant that specifically binds to the CD40L.
  • the present invention relates to the use of a conjugate of the Stefin A protein variant that specifically binds to the CD40L.
  • conjugate refers to linking two or more compounds together by any linking or linking method known in the art, or joining another compound. means a compound produced by combining or linking two or more compounds.
  • the Stefin A protein variant-conjugate can be broadly understood as including a fusion protein.
  • chemical conjugation other than through formation of a continuous peptide bond through the C-terminus and/or N-terminus of the steppin A protein variant or fusion protein that specifically binds to CD40L of the present invention. It may refer to a conjugate comprising at least one moiety conjugated through.
  • the conjugate may be, for example, one stephin A protein variant-drug conjugate, and the stephin A protein variant-drug conjugate may include at least one pharmacologically active moiety.
  • the conjugate may include at least one functional moiety such as various functional groups, substituents, or moieties.
  • the functional moiety is, for example, a label; dyes; immunoadhesion molecules; radionuclide; cytotoxic compounds; drugs; affinity label; photoaffinity label; reactive compounds; resin; a second protein or polypeptide or polypeptide analog; antibodies or antibody fragments; metal chelating agents; cofactor; fatty acid; carbohydrate; polynucleotide; DNA; RNA; antisense polynucleotides; saccharides; water-soluble dendrimers; cyclodextrin; inhibitory ribonucleic acid; biomaterials; nanoparticles; spin label; fluorophores, metal-containing moieties; radioactive moiety; novel functional groups; functional groups that interact covalently or non-covalently with other molecules; photocaged moiety; an actinic radiation excitable moiety; a photoisomerizable moiety; biot
  • the conjugate may include a functional moiety.
  • the functional moiety may be a detectable label.
  • the detectable label can be a fluorescent label, a radioactive label, an enzymatic label, or any other label known in the art.
  • the functional moiety may be a detectable label that may be incorporated as part of a conjugate for use in medical imaging.
  • medical imaging medical imaging means any technology that can be used to visualize the internal region of the human or animal body for diagnosis, research or treatment purposes.
  • the functional moiety may optionally be a contrast agent for X-ray imaging.
  • Substances useful for enhancing such imaging techniques enable visualization of specific locations, organs or areas of disease within the body and/or provide some improvement in the quality of images produced by the imaging techniques, allowing for improved or easier interpretation.
  • contrast agents may be referred to as contrast agents, and the use of contrast agents facilitates discrimination of certain parts by increasing the contrast between the imaged area and other areas. Accordingly, such a contrast agent is used to include not only agents for improving image quality (eg, MRI, etc.) but also agents as a prerequisite for image generation (eg, nuclear imaging, etc.).
  • agents for improving image quality eg, MRI, etc.
  • agents as a prerequisite for image generation eg, nuclear imaging, etc.
  • the detectable label includes a chelating moiety for chelating a metal, for example, a chelating agent for a radiometal or paramagnetic ion.
  • the detectable label may be a chelating agent for a radionuclide useful for radiation therapy or imaging.
  • the useful radionuclides include gamma-emitters, positron-emitters, Auger electron-emitters, X-ray emitters and fluorescence emitters. -emitters), including therapeutic beta- or alpha-emitters.
  • radionuclides useful as toxins in radiation therapy are: 43 K, 47 Sc, 51 Cr, 57 Co, 58 Co, 59 Fe, 64 Cu, 67 Ga, 67 Cu, 68 Ga, 71 Ge, 75 Br. 121 Sn _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ , 123 I, 125 I, 127 Cs , 128 Ba, 129 Cs, 131 I, 131 Cs, 143 Pr, 153 Sm, 161 Tb, 166 Ho, 169 Eu, 177 Lu, 186 Re, 188 Re, 189 Re, 191 Os, 193 Pt, 194 Ir, 197 Hg, 199 Au, 203 Pb, 211 At, 212 Pb, 212 Bi and 213 Bi.
  • examples of the chelator include 1,4,7-triazacyclononane-N,N',N"-triacetic acid (NOTA) 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N,N',N", N'"-tetraacetic acid (DOTA) 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-N,N',N",N'"-tetraacetic acid (TETA), but not limited thereto.
  • NOTA 1,4,7-triazacyclononane-N,N',N"-triacetic acid
  • DOTA 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N,N',N", N'"-tetraacetic acid
  • TETA 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-N,N',N",N'"-tetraacetic acid
  • detectable isotopes that can be incorporated directly into an amino acid residue of a polypeptide or do not require a chelator include 3 H, 14 C, 32 P, 35 S and 36 Cl; It is not limited.
  • the paramagnetic ion can be usefully used for diagnosis.
  • examples of the paramagnetic ion include chromium (III), manganese (II), iron (III), iron (II), cobalt (II), nickel (II), copper (II), neodymium (III) , samarium(III), ytterbium(III), gadolinium(III), vanadium(II), terbium(III), dysprosium(III), holmium(III), erbium(III), or a combination thereof, but is not limited thereto it is not going to be
  • examples of the fluorescent label include organic dyes (eg, cyanine, fluorescein, rhodamine), rhodamine, Alexa Fluors, Dylight fluors, ATTO dyes, BODIPY dyes, etc.), biological fluorescent substances ( Examples include green fluorescent protein (GFP), R-Phycoerythrin, etc.) and quantum dots, but are not limited thereto.
  • organic dyes eg, cyanine, fluorescein, rhodamine
  • rhodamine Alexa Fluors
  • Dylight fluors e.g., ATTO dyes, BODIPY dyes, etc.
  • biological fluorescent substances examples include green fluorescent protein (GFP), R-Phycoerythrin, etc.
  • quantum dots but are not limited thereto.
  • non-limiting fluorescent compounds that can be used are well known in the art.
  • Cy5 Cy5.5 (also known as Cy5++), Cy2, fluorescein isothiocyanate (FITC), tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC), *phycoerythrin, Cy7, fluorescein (FAM), Cy3, Cy3.5 ( Also known as Cy3++), Texas Red, LightCycler-Red 640, LightCycler Red 705, tetramethylrhodamine (TMR), rhodamine, rhodamine derivative (ROX), hexachlorofluorescein (HEX), rhodamine 6G (R6G), rhoda Min derivative JA133, Alexa fluorescent dyes (e.g., Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 555, and Alexa Fluor 647, etc.), DAPI (4',6-d
  • fluorescent compounds include fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP), enhanced GFP (EGFP), blue fluorescent protein and its derivatives (BFP, EBFP, EBFP2, Azurite, mKalama1), cyan (cyan) fluorescent protein and its derivatives (CFP, ECFP, Cerulean, CyPet) and yellow fluorescent protein and its derivatives (YFP, Citrine, Venus, YPet), but are not limited thereto.
  • GFP green fluorescent protein
  • EGFP enhanced GFP
  • BFP blue fluorescent protein and its derivatives
  • BFP blue fluorescent protein and its derivatives
  • CFP cyan fluorescent protein and its derivatives
  • CFP cyan fluorescent protein and its derivatives
  • CFP cyan fluorescent protein and its derivatives
  • ECFP Cerulean
  • CyPet yellow fluorescent protein and its derivatives
  • YFP Citrine, Venus, YPet
  • the enzyme label includes, for example, horseradish peroxidase (HRP), alkaline phosphatase (AP), glucose oxidase and ⁇ -galactosidase, but is not limited thereto.
  • HRP horseradish peroxidase
  • AP alkaline phosphatase
  • glucose oxidase glucose oxidase
  • ⁇ -galactosidase glucose oxidase
  • the enzyme label includes, for example, horseradish peroxidase (HRP), alkaline phosphatase (AP), glucose oxidase and ⁇ -galactosidase, but is not limited thereto.
  • the label may be a biotin label.
  • the biotin label is generally composed of a biotinyl group, a spacer arm and a reactive group responsible for attachment to the target functional group of the protein.
  • the biotin can be usefully used to attach the labeled protein to another moiety including an avidin moiety.
  • the conjugate may include one or more therapeutic agents.
  • the conjugate may be a steppin A protein variant-drug conjugate.
  • the "therapeutic agent” refers to a substance that can be used to cure, mitigate, treat, or prevent diseases of humans or other animals.
  • Such therapeutic agents may include therapeutic substances recognized by official national institutions including Korea, and may include small molecules, nucleotides, oligopeptides, polypeptides, proteins, etc., but are not limited thereto.
  • examples of therapeutic agents that can be conjugated to the conjugate include cytotoxic agents, anti-metabolites, alkylating agents, antibiotics, growth factors, It may include, but is not limited to, cytokines, anti-angiogenic agents, anti-mitotic agents, toxins, and apoptotic agents. .
  • DNA alkylating agents include DNA alkylating agents, topoisomerase inhibitors, microtubule inhibitors (eg DM1, DM4, MMAF and MMAE), endoplasmic reticulum stress inducing agents ), platinum compounds, antimetabolites, vincalkaloids (taxanes), taxanes, enzyme inhibitors, receptor antagonists, therapeutic antibodies ), tyrosine kinase inhibitors, radiosensitizers, and chemotherapy combinations such as illustration, but are not limited thereto.
  • microtubule inhibitors eg DM1, DM4, MMAF and MMAE
  • endoplasmic reticulum stress inducing agents platinum compounds, antimetabolites, vincalkaloids (taxanes), taxanes, enzyme inhibitors, receptor antagonists, therapeutic antibodies ), tyrosine kinase inhibitors, radiosensitizers, and chemotherapy combinations such as illustration, but are not limited thereto.
  • any method known in the art for conjugation to proteins, such as antibodies and Stephin A protein variants of the present invention, may be used to prepare the conjugates of the present invention.
  • such methods are described in Hunter, et al., (1962) Nature 144:945; David, et al., (1974) Biochemistry 13:1014; Pain, et al., (1981) J. Immunol. Meth. 40:219; and Nygren, J., (1982) Histochem. and Cytochem. 30:407. It is described in the like, but is not limited thereto.
  • conjugated moiety is a peptide or polypeptide
  • it can be chemically cross-linked to the steppin A protein variant of the present invention or included as part of a fusion protein.
  • diptheria toxin-AFFIMER® from Avacta is known.
  • non-peptide moieties can generally be conjugated via chemical conjugation (eg, a functional group on an amino acid side chain or a carboxyl group at the C-terminus or an amino group at the N-terminal end, etc.) to the stephin A protein variant.
  • the conjugated moiety may include at least one moiety that is sensitive to environmental conditions (eg, pH, etc.) regardless of its type.
  • Moieties that are sensitive to the environmental conditions can be characterized by releasing a junction in a target tissue, such as a diseased or protective tissue.
  • the conjugate comprises a linkage (L 1 ) between a substrate recognition sequence (SRS) and a half-life extending moiety, cleavable by a spacer or, for example, an enzyme present in an inflammatory microenvironment. It can be characterized by doing.
  • SRS substrate recognition sequence
  • the spacer may be any molecule, for example, one or more nucleotides, amino acids, or chemical functional groups.
  • the spacer is a peptide linker (eg, two or more amino acids).
  • the spacer may not adversely affect the expression, secretion or biological activity of the polypeptide.
  • the spacer is not antigenic and may not induce an immune response.
  • the immune response includes responses from the innate and/or adaptive immune system.
  • the immune response may be a cell-mediated response and/or a humoral immune response.
  • the immune response can be, for example, a T cell response, a B cell response, a natural killer (NK) cell response, a monocyte response and/or a macrophage response.
  • NK natural killer
  • Other cellular responses are contemplated in the present invention.
  • the linker may be non-protein-coding.
  • L1 is 6-maleimidocaproyl, maleimidopropanoyl, and maleimidomethyl cyclohexane-l-carboxylate, such as hydrocarbon (straight chain or cyclic), or L1 is N-succinimidyl 4-(2-pyridylthio) pentanoate, N-succinimidyl 4 -(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate (N-Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1 carboxylate), N-succinimidyl (4-iodo-acetyl) aminobenzoate ( N-Succinimidyl (4-iodo-acetyl) aminobenzoate).
  • the L1 may be a polyether such as poly(ethylene glycol) or other hydrophilic linker.
  • L1 when the site or residue to which L1 is bonded includes a thiol (eg, a cysteine residue), L1 may be polyethylene glycol bonded to a thiol group through a maleimide moiety.
  • Linkers usable in the present invention are described, for example, in WO2019/236567, incorporated by reference, but are not limited thereto.
  • the L1 may be characterized in that, for example, it is represented by the following formula:
  • p represents an integer of 1 to 100, preferably 6 to 50, more preferably 6 to 12.
  • L 1 is a hydrocarbon moiety bonded to a thiol group through a maleimide moiety
  • L 2 is represented by the following formula can be done with:
  • p is an integer from 1 to 20, preferably from 1 to 4.
  • the conjugate may include a self-immolative linker (L 2 ) between the substrate recognition sequence (SRS) for the enzyme and the drug moiety.
  • L 2 self-immolative linker
  • the self-immolative moiety may be defined as a bifunctional chemical group capable of covalently bonding two spaced apart chemical moieties into a generally stable molecule, from the molecule by enzymatic cleavage. It can be characterized by releasing one of the spaced chemical moieties and, after enzymatic cleavage, spontaneously cleaved from the remainder of the bifunctional chemical group to release the other of the spaced moieties.
  • the self-immolative moiety is covalently bonded to the ligand by an amide bond at one of its ends, either directly or indirectly through a spacer unit, and at the other end a chemically reactive site of the drug moiety. (chemical reactive site, functional group).
  • derivatization of a drug moiety with a self-immolative moiety may pharmacologically inactivate or mask the activity of the drug until the drug is cleaved.
  • the conjugate is generally stable in the circulation, or at least may be stable in the absence of an enzyme capable of cleaving the amide bond between the substrate recognition sequence (enzyme cleavable linker) and the self-immolative moiety.
  • exposure of the steppin A protein variant-drug conjugate to an appropriate enzyme results in cleavage of the amide bond, initiating a spontaneous self-immolative reaction, cleavage and derivatization of the covalent bond between the self-immolative moiety and the drug moiety. release of the free drug moiety in an unmodified or pharmacologically active form.
  • the self-immolative moiety of the conjugate incorporates one or more heteroatoms, and may exhibit improved solubility, improved cleavage rate, and reduced aggregation tendency of the conjugate.
  • the L 2 may be a benzyloxycarbonyl group.
  • the L 2 may be PABC (p-aminobenzyloxycarbonyl).
  • the L 2 may be 2,4-bis (hydroxymethyl) aniline (2,4-bis (hydroxymethyl) aniline).
  • the steppin A protein variant-drug conjugate may employ a heterocyclic self-immolative moiety covalently linked to a therapeutic moiety and a cleavable substrate recognition sequence.
  • the L 2 may be a benzyloxycarbonyl group.
  • L 2 may be of the following formula:
  • R 1 is hydrogen, unsubstituted or substituted C 1-3 alkyl, or unsubstituted or substituted heterocyclyl.
  • the R 1 may be hydrogen.
  • the R 1 may be methyl.
  • L 2 may be characterized in that it is selected from:
  • L 2 may be characterized in that it is selected from:
  • U is O, S or NR 6 ;
  • Q is CR 4 or N
  • V 1 , V 2 and V 3 are independently CR 4 or N, provided that at least one of Q, V 1 and V 2 is N;
  • T is NH, NR 6 , O or S pending in the therapeutic moiety
  • R 5 and R 6 are independently selected from H, C 1 -C 8 alkyl, C 1 -C 8 substituted alkyl, C 2 -C 8 alkenyl, C 2 -C 8 substituted alkenyl, C 2 -C 8 alkynyl, C 2 -C 8 substituted alkynyl, C 6 -C 20 aryl, C 6 -C 20 substituted aryl, C 1 -C 20 heterocycle, and C 1 -C 20 substituted hetero cycle;
  • T when T is NH, it is derived from a primary amine (—NH 2 ) pending in the therapeutic moiety (before coupling to the self-immolative moiety), and when T is N, a secondary It can be understood to be derived from an amine (-NH-). Similarly, when the T is O or S, it is derived from a pending hydroxyl (-OH) or sulfhydryl (-SH) group from the therapeutic moiety, respectively, prior to coupling to the self-immolative moiety.
  • the self-immolative linker L 2 may be p-aminobenzyloxycarbonyl (PABC).
  • the self-immolative linker L 2 may be 2,4-bis(hydroxymethyl)aniline.
  • the present invention relates to a nucleic acid encoding a steppin A protein variant that specifically binds to CD40L, or a fusion protein or conjugate comprising the same.
  • the present invention relates to a vector comprising the nucleic acid.
  • the present invention relates to a delivery vehicle comprising said nucleic acid.
  • the delivery vehicle may be characterized in that it is used for in vivo delivery.
  • the present invention relates to a genetically engineered cell into which the nucleic acid or vector is introduced.
  • the nucleic acid may be delivered in vivo.
  • nucleic acids encoding the steppin A protein variants of the present invention or fusion proteins or conjugates containing the same
  • an alternative approach to delivery of the steppin A protein variant specifically binding to CD40L or a fusion protein or conjugate comprising the same is to leave production of the therapeutic polypeptide to the body itself.
  • a number of clinical studies have reported the usefulness of in vivo gene delivery to cells using various delivery systems.
  • In vivo gene delivery is the administration of a nucleic acid that encodes, but not the steppin A protein variant, to a patient.
  • the patient's body can produce the steppin A protein variant that specifically binds to CD40L of the present invention, or a fusion protein or conjugate containing the same for a long period of time and secrete it systemically or locally depending on the site of production.
  • nucleic acids can provide a labor and cost-effective alternative to conventional production, purification and administration of proteins.
  • Various in vivo antibody expression platforms can be used for delivery of nucleic acids encoding steppin A protein variants, or fusion proteins or conjugates containing the same, including, for example, viral vector naked DNA or RNA.
  • Gene transfer of nucleic acids not only enables cost savings by reducing commodity and production costs, but also reduces the frequency of drug administration.
  • the in vivo production of the steppin A protein variant specifically binding to CD40L of the present invention by expression of a nucleic acid, or a fusion protein or conjugate comprising the same can be used for (i) a wide range of therapeutic or preventive applications at low cost.
  • cell therapeutics genetically engineered with the nucleic acid of the present invention can be produced based on cells harvested from a host (or donor) and administered to a patient.
  • Intramuscular antibody gene administration has been the most widely evaluated (Deal et al. (2015) “Engineering humoral immunity as prophylaxis or therapy” Curr Opin Immunol. 35:113-22.) and an administration method for in vivo delivery of the nucleic acids of the present invention. can be applied as Indeed, due to the unique anatomical, cellular and physiological characteristics of skeletal muscle, a stable environment is provided for the expression and systemic circulation of long-term encoded nucleic acids, and repeated administration is easily possible.
  • Abundant blood vessels provide a system in which the steppin A protein variant specifically binding to CD40L of the present invention expressed and secreted in vivo, or a fusion protein or conjugate containing the same, can be efficiently transported to the circulatory system.
  • the nucleic acid delivered in vivo can be integrated into the host genome, but integration in the host genome is not a prerequisite for achieving long-term protein expression.
  • the liver is another site frequently used for preclinical antibody gene transfer and can usually be transfected via intravenous (i.v.) injection.
  • the liver may be a gene transfer site for vascular secretion and systemic circulation of the steppin A protein variant of the present invention and a fusion protein comprising the same.
  • the liver synthesizes plasma proteins and has various physiological functions, so it may be suitable for the expression of steppin A protein variants and fusion proteins containing the same through delivery of the nucleic acid of the present invention.
  • polycations such as poly-l-lysine and polyethylene-imine can be used to deliver the nucleic acids of the present invention.
  • These polycations form complexes with nucleic acids through charge interactions and assist in the condensation of DNA or RNA into nanoparticles, which serve as substrates for endosome-mediated uptake.
  • cationic nucleic acid complex technologies have been developed into potential clinical products, including complexes with plasmid DNA, oligodeoxynucleotides and various types of synthetic RNA. Modified and unmodified (or “naked”) DNA and RNA have also been shown to mediate successful gene transfer in several circumstances and can also be used as systems for the delivery of encoded nucleic acids.
  • Viral vectors are currently used as a delivery vehicle in most preclinical and clinical gene therapy trials and are used in the first approved gene therapy (Gene Therapy Clinical Trials Worldwide 2017 (abedia.com/wiley/)). A major driver for this is the exceptional efficiency of gene transfer, reflecting natural evolutionary development. Viral vector systems are attractive for gene delivery because viruses, upon infection, evolve the ability to cross cell membranes and deliver the nucleic acids of the invention to target cells. The field of viral vector-mediated antibody gene delivery pioneered by adenoviral systems has made significant progress over the past few decades.
  • Muscle is emerging as the site of administration of choice for extended mAb expression and may be a suitable target tissue for expression of the nucleic acids of the present invention.
  • Non-viral vectors are readily produced and are not reported to induce specific immune responses.
  • Muscle tissue is most often used as a target tissue for transfection because it is well vascularized and easily accessible, and myocytes are long-lived cells.
  • Intramuscular injection of naked plasmid DNA transfects a percentage of myocytes. Using this approach, plasmid DNA encoding cytokines and cytokine/IgG1 chimeric proteins have been introduced in vivo and reported to have a positive effect on (autoimmune) disease outcome.
  • In vivo gene delivery efficiency can also be increased through other techniques, such as improving nucleic acid delivery using chemical carriers (cationic polymers or lipids) or through physical approaches (gene gun delivery or electroporation) (Tranchant et al. al. (2004) “Physicochemical optimization of plasmid delivery by cationic lipids” J. Gene Med., 6 (Suppl. 1):S24-S35; Gene Ther., 9:1647-1652. Electroporation is especially regarded as an interesting technique for nonviral gene delivery. Somiari, et al. (2000) “Theory and in vivo application of electroporative gene delivery” Mol. Ther. 187; and Jaroszeski et al.
  • the encoded nucleic acid can be delivered by a wide range of gene delivery systems commonly used in gene therapy including viral, non-viral or physical. See, for example, Rosenberg et al., Science, 242:1575-1578, 1988, and Wolff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9011-9014 (1989). Discussion of methods and compositions for use in gene therapy include Eck et al., in Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition, Hardman et al., eds., McGraw-Hill, New York, (1996), Chapter 5 , pp. 77-101; Wilson, Clin. Exp. Immunol.
  • Routes of delivery include, for example, systemic administration and in situ administration.
  • gene delivery it must be directed to the specific tissues/cells where it is needed, and the resulting transgene expression must be at a level suitable for the specific application.
  • the promoter is a key cis-acting element in vector genome design that can dictate cell specificity as well as the overall strength of expression.
  • EF1 ⁇ human elongation factor 1 ⁇ -subunit
  • CMV immediate-early cytomegalovirus
  • CBA chicken ⁇ -actin
  • GUSB ⁇ glucuronidase
  • UBC ubiquitin C
  • the size of ⁇ 1.7 kbs compared to CMV ( ⁇ 0.8 kbs) or EF1 ⁇ ( ⁇ 1.2 kbs) may limit its use in vectors with packaging constraints such as AAV, especially when the size of the nucleic acid of the present invention is large. Use may be limited.
  • the GUSB or UBC promoters can provide ubiquitous gene expression with small sizes of 378 bps and 403 bps, respectively, but are relatively weaker than the CMV or CBA promoters. Modifications to constitutive promoters to reduce size without affecting expression have therefore been sought and examples such as CBh ( ⁇ 800 bps) and miniCBA ( ⁇ 800 bps) can promote similar and much higher expression in selected tissues. (Gray et al., Hum Gene Ther. 2011 22:1143-1153).
  • a promoter when the expression of the encoded nucleic acid is to be restricted to a specific cell type within an organ, a promoter can be used to mediate this specificity.
  • the nervous system promoters are used to restrict expression to neurons, astrocytes or oligodendrocytes.
  • the neuron-specific enolase (NSE) promoter induces stronger expression than the ubiquitous promoter.
  • NSE neuron-specific enolase
  • PDGF- ⁇ platelet-derived growth factor B-chain
  • Syn synapsin
  • MeCP2 methyl-CpG binding protein 2
  • GFAP glial fibrillary acidic protein
  • gfaABC(1)D glial fibrillary acidic protein promoter
  • exemplary promoters based on muscle creatine kinase (MCK) and desmin exhibit a high percentage of specificity (with minimal expression in the liver, if desired).
  • the promoter of ⁇ -myosin heavy chain ( ⁇ -MHC; 1.2 kbs) showed significant cardiac specificity compared to other muscle promoters (Lee et al., 2011 J Cardiol. 57(1):115-22).
  • the synthetic MND promoter Li et al., 2010 J Neurosci Methods.
  • promoters to restrict expression to liver hepatocytes only after vector-mediated gene transfer have been shown to reduce transgene-specific immune responses in at-risk systems and even induce immune tolerance to the expressed proteins (Zhang et al. al., 2012 Hum Gene Ther.23(5):460-72).
  • the ⁇ 1-antitrypsin (hAAT; 347 bps) and thyroxine-binding globulin (TBG; ⁇ 400 bps) promoters induce liver-restricted gene expression with minimal invasion to other tissues (Yan et al., 2012 Gene. 506(2) : 289-94;Cunningham et al., 2008 Mol Ther.16(6):1081-8).
  • a mechanism is required to control the duration and amount of encoded nucleic acid expression delivered in vivo, and various inducible promoters are known in the art that can be used for viral vectorization and plasmid DNA-based gene delivery: Fang et al. (2007) Mol Ther. 5(6):1153-9; and Perez et al. (2004) Genet Vaccines Ther. 2(1):2.
  • An example of a regulatable mechanism currently under clinical trials is the ecdysone-based genetic switch activated by small molecule ligands: Cai et al. (2016) Clin Pharmacol Drug Dev. 2016.
  • viral post-transcriptional regulatory elements may be used; These cis-acting elements are required for nuclear export of viral RNA without introns (Huang and Yen, 1994 J Virol. 68(5):3193-9; and 1995 Mol Cell Biol. 15(7):3864- 9).
  • PREs post-transcriptional regulatory elements
  • Examples include Hepatitis B Virus PRE (HPRE, 533 bps) and Woodchuck Hepatitis Virus PRE (WPRE, 600 bps), which in certain cases can increase the expression level of a transferred gene by nearly 10-fold (Donello et al. al., 1998 J Virol. 72(6):5085-92).
  • WPRE was found to increase expression of CMV promoter driven transgenes as well as PPE, PDGF and NSE promoter driven transgene expression. Another effect of WPRE may be to protect against silencing of encoded nucleic acid genes (Paterna et al., 2000 Gene Ther. 7(15):1304-11; Xia et al., 2007 Stem Cells Dev. 2007 Feb; 16(1):167-76).
  • the nucleic acid may include a polyadenylation signal sequence.
  • a polyadenylation signal sequence include the SV40 late or bovine growth hormone polyA (bGHpA) signal sequence as well as the minimal synthetic polyA (SPA) signal (Levitt et al., 1989 Genes Dev. 3(7):1019 -25; Yew et al., 1997 Hum Gene Ther. 1997 8(5):575-84).
  • bGHpA bovine growth hormone polyA
  • SPA minimal synthetic polyA
  • the efficiency of polyadenylation is increased by the SV40 late polyA signal upstream enhancer (USE) located upstream of other polyA signals (Schek et al., 1992 Mol Cell Biol. 12(12):5386-93).
  • the nucleic acid may include SV40 late + 2xUSE polyA signal, but is not limited thereto.
  • the nucleic acid may preferably further include at least one regulatory enhancer in addition to any promoter sequence.
  • the CMV enhancer is upstream of the CMV promoter at -598 to -68 (Boshart et al., 1985 Cell. 41(2):521-30) (-600 bps) and contains a transcriptional binding site.
  • ANF atrial natriuretic factor
  • CC10 club cell 10
  • SP-C surfactant protein C
  • PDGF- ⁇ platelet-derived growth factor- ⁇
  • a CMV enhancer can be included in the construct to increase expression of the same tissue-specific promoter driven transgene.
  • the CMV enhancer is a broadly applicable tool for increasing transgene expression levels by increasing transgene expression under different cell specific promoters and different cell types.
  • Expression of the transgene in muscle e.g., using the CMV enhancer with a muscle-specific promoter in an AAV expression system, can increase the expression level of the protein encoded by the transgene, thus expressing the nucleic acid of the present invention in muscle cells.
  • the nucleic acid may further include at least one intronic sequence. It has been reported that the presence of introns or intervening sequences in mRNA is important for mRNA processing and increased transgene expression in vitro (Huang and Gorman, 1990 Mol Cell Biol.
  • the intron(s) may be located within the nucleic acid sequence encoding the steppin A protein variants of the invention, or fusion proteins or conjugates comprising the same, and/or may be located between the promoter and the transgene.
  • Table 14 compares the various introns placed between promoters and transgenes in mice using AAV2 for liver transgene expression (Wu et al., 2008).
  • the MVM microscopic virus in mice) intron increased transgene expression more than any other intron tested, and was reported to be more than 80-fold higher than in the absence of an intron (Wu et al., 2008).
  • transgene expression was less under the CaMPKII promoter with a chimeric intron (human ⁇ -globin donor and immunoglobulin heavy chain acceptor) between the transgene and polyA signal compared to WPRE.
  • the intron may be an important element included in an expression cassette to increase transgene expression.
  • the vector may be an episomal vector.
  • the vector when the vector is an episomal vector, it may include at least one origin of replication, a minichromosome maintenance element (MME), and/or a nuclear localization element.
  • the episomal vector may include a portion of viral genomic DNA encoding an origin of replication (ori) necessary for the vector to self-replicate and persist in host cells over several generations.
  • the episomal vector may include at least one gene encoding at least one viral protein necessary for replication, for example, a replicator protein.
  • the replicator protein that assists in initiation of replication can be expressed in trans on another vector or another DNA molecule, such as host genomic DNA, in a host cell containing an autonomously replicating episomal expression vector of the invention.
  • expression vectors containing preferably self-replicating episomal LCRs are eukaryotic cells, such as viral oncogenic sequences that may be present in full-length viral genomic DNA molecules or viral genomic DNA encoding core or capsid proteins that produce infectious viral particles. It may not contain viral sequences not necessary for long-term stable maintenance in the host cell.
  • “stable maintenance” refers to the copy number of a vector for 2, 3, 4 or 5 or more generations without significant loss in non-dividing cells or progeny cells of dividing cells in the absence of continuous selection (e.g. : >50%) refers to the ability of a self-replicating episomal expression vector to persist or be maintained. In the present invention, the vector may be maintained over 10 to 15 or more generations.
  • the "transient” or “short term" persistence of a plasmid in the host cell means that the vector cannot be replicated and isolated in a stable manner in the host cell. In this case, the vector is lost after 1-2 generations or exhibits >51% loss of copy number between successive generations.
  • the present invention is not limited to one origin of replication or any one episomal vector, but may include a combination of tissue-restricted regulation of the LCR in an episomal vector. Also referenced herein are WO1998007876 and US Pat. No. 7,790,446.
  • the episomal expression vector is, for example, an Epstein-Barr virus-based self-replicating episomal expression vector (Yates et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3806-3810 (1984)). Yates et al., Nature 313:812-815 (1985) Krysan et al., Mol. Cell. Biol. 9:1026-1033 (1989) James et al. Gene 86: 233-239 (1990); Peterson and Legerski, Gene 107:279-284 (1991) and Pan et al., Som. Cell Molec. Genet.
  • an Epstein-Barr virus-based self-replicating episomal expression vector Yates et al., Nature 313:812-815 (1985) Krysan et al., Mol. Cell. Biol. 9:1026-1033 (1989) James et al. Gene 86: 233-239 (1990); Peterson and Legerski, Gene 107
  • Papilloma virus-based self-replicating episomal expression vectors e.g., bovine papilloma virus and human papilloma virus (Ustav et al., EMBO J. 10: 449-457 (1991); Ustavet al., EMBO J. 10:4231-4329, (1991); Ustav et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the nucleic acid encoding the Stefin A protein variant that specifically binds to CD40L of the present invention or a fusion protein or conjugate containing the same may be provided as a circular or linear nucleic acid.
  • the circular or linear nucleic acid can direct the expression of the coding sequence in a suitable target cell.
  • at least one nucleic acid system for expression can be chimeric, wherein at least one of these components is different from other nucleic acid systems. heterogeneous with respect to at least one of the elements.
  • transduction means allowing a host cell to accept an external gene (nucleic acid or vector) that the host cell does not have.
  • the nucleic acid encoding the Stefin A protein variant that specifically binds to CD40L or a fusion protein or conjugate containing the same is introduced into a host cell using a vector containing the same. can be characterized.
  • vector is a means for expressing a gene of interest in a host cell, and may be a viral vector or a non-viral vector.
  • the viral vector is, for example, an adenoviral vector, a retroviral vector, an adeno-associated viral vector, a retroviral vector (eg, a gamma retrovirus vector), a vaccinia virus (Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy, 10:649-657 (1999) Ridgeway, 467-492 (1988) Baichwal and Sugden, In: Kucherlapati R, ed.
  • the non-viral vector includes naked plasmid DNA (pDNA), linear nucleic acid or linear expression cassette (LEC, plasmid vector (Sambrook et al., 1989) and mini circle (Yew et al. 2000 Mol Ther 1(3), 255-62).
  • pDNA naked plasmid DNA
  • LEC linear nucleic acid or linear expression cassette
  • mini circle Yew et al. 2000 Mol Ther 1(3), 255-62).
  • Components of a vector generally include, but are not limited to, one or more of the following: a signal sequence, an origin of replication, one or more antibiotic resistance marker genes, an enhancer element, a promoter, and a transcription termination sequence.
  • Nucleic acids encoding the steppin A protein variants of the present invention, or fusion proteins or conjugates containing the same, may be operably linked, such as promoters and transcription termination sequences.
  • operably linked means a functional linkage between a nucleic acid expression control sequence (e.g., a promoter, signal sequence, or array of transcriptional regulator binding sites) and another nucleic acid sequence, whereby the control sequence is the other nucleic acid sequence. to regulate transcription and/or translation of a nucleic acid expression control sequence (e.g., a promoter, signal sequence, or array of transcriptional regulator binding sites) and another nucleic acid sequence, whereby the control sequence is the other nucleic acid sequence. to regulate transcription and/or translation of a nucleic acid expression control sequence (e.g., a promoter, signal sequence, or array of transcriptional regulator binding sites) and another nucleic acid sequence, whereby the control sequence is the other nucleic acid sequence. to regulate transcription and/or translation of a nucleic acid expression control sequence (e.g., a promoter, signal sequence, or array of transcriptional regulator binding sites) and another nucleic acid sequence, whereby the control sequence is the other nucleic acid sequence. to regulate transcription and
  • a strong promoter capable of promoting transcription e.g., tac promoter, lac promoter, lacUV5 promoter, lpp promoter, pL ⁇ promoter, pR ⁇ promoter, rac5 promoter, amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter and T7 promoter, etc.
  • a ribosome binding site for initiation of translation e.g., amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter and T7 promoter, etc.
  • a promoter derived from the genome of a mammalian cell eg, metallotionine promoter, ⁇ -actin promoter, human hemoglobin promoter, and human muscle creatine promoter
  • mammalian Promoters derived from animal viruses such as adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus (CMV) promoter, tk promoter from HSV, mouse mammary tumor virus (MMTV) promoter, LTR promoter from HIV , the promoter of Moloney virus, the promoter of Epstein Barr virus (EBV) and the promoter of Rouss sarcoma virus (RSV) can be used, and usually has a polyadenylation sequence as a transcription termination sequence.
  • a mammalian Cell eg, metallotionine promoter, ⁇ -actin promoter, human hemoglobin promoter, and human muscle creatine promoter
  • mammalian Promoters derived from animal viruses such as
  • the promoter may be a eukaryotic promoter, preferably selected from a CMV promoter, a PGK promoter, an EF1 ⁇ promoter, an EFS promoter, a CBh promoter, an MSCV promoter, a SFFV promoter, and a UbC promoter. It may be, and most preferably, it may be characterized in that it is selected from the cytomegalovirus (CMV) promoter, EF1 ⁇ promoter and CBh promoter, but is not limited thereto.
  • CMV cytomegalovirus
  • the promoter may be additionally characterized in that it includes an enhancer sequence, but is not limited thereto.
  • vectors may be fused with other sequences to facilitate purification of antibodies expressed therefrom.
  • Sequences to be fused include, for example, glutathione S-transferase (Pharmacia, USA), maltose binding protein (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) and 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA).
  • the vector may include an antibiotic resistance gene commonly used in the art as a selection marker, for example, ampicillin, gentamycin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin (streptomycin), kanamycin, puromycin, blasticidin, hygromycin, geneticin, neomycin and tetracyclin.
  • antibiotic resistance gene commonly used in the art as a selection marker, for example, ampicillin, gentamycin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin (streptomycin), kanamycin, puromycin, blasticidin, hygromycin, geneticin, neomycin and tetracyclin.
  • resistance genes but are not limited thereto.
  • the nucleic acid encoding the Stefin A protein variant that specifically binds to CD40L or a fusion protein containing the same can be characterized in that it is incorporated into the gene of the host cell. .
  • the nucleic acid encoding the Stefin A protein variant that specifically binds to CD40L or a fusion protein containing the same can be constructed by chemical synthesis using an oligonucleotide synthesizer.
  • Oligonucleotides can be designed by selecting the amino acid sequence of the desired polypeptide and preferred codons in the host cell in which the recombinant polypeptide of interest will be produced. Standard methods can be applied to synthesize polynucleotide sequences encoding the isolated polypeptide of interest. For example, the complete amino acid sequence can be used to construct a reverse translated gene.
  • DNA oligomers can be synthesized that contain a nucleotide sequence encoding a particular isolated polypeptide. For example, several small oligonucleotides encoding portions of the desired polypeptide can be synthesized and then ligated. Individual oligonucleotides usually include 5' or 3' overhangs for complementary assembly.
  • a vector containing the same is widely known in the art. It can be produced by recombinant DNA technology using technology. Expression vectors containing sequences encoding the steppin A protein variants of the present invention or fusion proteins comprising the same and appropriate transcriptional and translational control signals can be constructed using methods well known to those skilled in the art. Such methods include, for example, in vitro recombinant DNA techniques, synthetic techniques, and in vivo genetic recombination.
  • introduction of nucleic acids or vectors into host cells may be performed through various methods known to those skilled in the art.
  • a nucleic acid encoding a Stefin A protein variant that specifically binds to CD40L or a fusion protein containing the same, or a non-viral expression vector containing the same is prepared by conventional techniques (e.g., For example, RNA-mediated gene transfer, electroporation, liposome transfection, and calcium phosphate precipitation) can be delivered and introduced into host cells.
  • conventional techniques e.g., For example, RNA-mediated gene transfer, electroporation, liposome transfection, and calcium phosphate precipitation
  • the gene delivery system of the present invention is constructed based on viral vector construction
  • delivery can be performed by conventional infection methods known in the art. For example, electroporation (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841 (1982); and Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718 (1986) ), gene bombardment in which DNA is loaded onto particles (eg, gold) and penetrated into cells (gene bombardment, Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572 (1990), sonoporation ( sonoporation), magnetofection, hydrodynamic delivery, etc., but are not limited thereto.
  • the nucleic acid or vector may be delivered to a host cell through RNA-mediated gene transfer (mRNA-based therapeutics: developing a new class of drugs” Nat Rev Drug Discov. 13(10):759-80. Pardi et al. 2015 J Control Release 217:345-51; WO2017/162266; Stadler et al. (2017) Nature Medicine 23:815-817; WO/2017/036889; WO2015/034928; WO2015/034925; WO2013/ 151666, etc.).
  • RNA-mediated gene transfer mRNA-based therapeutics: developing a new class of drugs
  • exemplary mRNAs and other nucleic acids are WO2017/049275, WO2016/118724, WO2016/118725, WO2016/011226, WO2015/196128, WO/2015/196130, WO/2015/196118, WO/2015/089511, and the specifications and drawings described in WO2015/105926 and the like.
  • the nucleic acid or vector may be introduced into a host cell through electroporation (Kim et al. Cancer Gene Ther, (2016) 23(10): 341-347, in the present invention, electroporation is See, for example, U.S. Patents 7,245,963; 6,302,874; 5,676,646; 6,241,701; 6,233,482; 6,216,034; 6,208,893; 6,192,270; 6,181,964; 6,150,14 8; 6,120,493; 6,096,020; It is not limited thereto.
  • transformation enhancing formulations may be used for the delivery of the nucleic acid.
  • the nucleic acid is a liposome capable of interacting with the cell membrane and delivering the nucleic acid to the cell via fusion or endocytosis, preferably a cationic liposome ((Wong, T. K. et al., Gene, 10:87( 1980); Nicolau and Sene, Biochim. Biophys.
  • DNA may also be formed in a complex with a polymer (polyplex) or a dendrimer capable of releasing the load directly into the cytoplasm of the cell.
  • exemplary carriers include, but are not limited to, particulates such as poly(lactide-co-glycolide), polyacrylate, lactex, starch, cellulose, and dextran. no.
  • Another exemplary carrier includes supramolecular biovectors comprising a non-liquid hydrophilic core (e.g., a cross-linked polysaccharide or oligosaccharide) and an outer layer comprising an optional amphiphilic compound such as a phospholipid; It is not limited thereto, (see U.S. Patent No. 5,151,254, WO 94/20078, WO/94/23701 and WO 96/06638, etc.).
  • Biodegradable microspheres eg, polylactate polyglycolate
  • suitable biodegradable microspheres for the present invention are US Pat. Nos.
  • Nucleic acids of the present invention can also be introduced into cells by direct microinjection, transient cell permeation (eg, co-administration of inhibitors and/or activators with cell penetrating agents), fusion to membrane translocating peptides, and the like.
  • Lipid-mediated nucleic acid delivery and expression of foreign nucleic acids including mRNA in vitro and in vivo has been very successful.
  • Lipid-based non-viral formulations offer an alternative to viral gene therapy.
  • Current in vivo lipid delivery methods use subcutaneous, intradermal, intratumoral or intracranial injections. Advances in lipid formulations have improved the efficiency of gene delivery in vivo (see WO 98/07408).
  • DOTAP 1,2-bis(oleoyloxy)-3-(trimethyl ammonio)propane
  • DOTAP 1,2-bis(oleoyloxy)-3-(trimethyl ammonio)propane
  • Cationic liposome technology is based on the ability of amphiphilic lipids with a positively charged head group and a hydrophobic lipid tail to form particles that bind to negatively charged DNA or RNA and enter cells, usually by endocytosis. Some cationic liposomes also contain neutral liposomes, which are understood to enhance liposomal uptake by mammalian cells. Similarly, other polycations, such as poly-L-lysine and polyethylene-imine, form complexes with nucleic acids through charge interactions and help condense DNA or RNA into nanoparticles, which serve as substrates for endosome-mediated uptake. do.
  • pDNA plasmid DNA
  • oligodeoxynucleotides oligodeoxynucleotides
  • synthetic RNA oligodeoxynucleotides
  • Encoded nucleic acids of the present invention can be associated with polycationic molecules that serve to enhance uptake into cells. Complexing nucleic acid constructs with polycationic molecules also helps to package the constructs to reduce their size, which is believed to aid cellular uptake. Once inside the endosome, the low pH causes the complex to dissociate and polycationic molecules can disrupt the membrane of the endosome, facilitating the escape of DNA into the cytoplasm before degradation. Existing data show that uptake into SC rather than DC is enhanced when the nucleic acid construct embodiment is complexed with the polycationic molecules polylysine or polyethyleneimine.
  • CPPs cell penetrating peptides
  • examples include polylysine (described above), polyarginine and Tat peptides.
  • Cell penetrating peptides (CPPs) are small peptides that can bind to DNA and, once released, cross cell membranes and facilitate the escape of DNA from endosomes to the cytosol.
  • CPP involves a 27-residue chimeric peptide called MPG, which was shown some time ago to bind ss- and ds-oligonucleotides in a stable manner, consequently protecting nucleic acids from degradation by DNase and It creates non-covalent complexes that efficiently deliver oligonucleotides to cells in vitro (Mahapatro A, et al., J Nanobiotechnol, 2011, 9:55).
  • the non-covalent complex formed small particles of about 150 nm to 1 um when irradiated with different peptide:DNA ratios, 10:1 and 5:1 ratios (150 nm and 1 um, respectively).
  • RNA can also be complexed by these polycationic molecules for in vivo delivery.
  • polycationic molecules include commercially available polycationic polymers as JETPRIME® and In vivo JET (Polypus-transfection, S.A., Illkirch, France).
  • a lipid component comprising a compound of formula I, a phospholipid, a structural lipid and a PEG lipid; and (ii) a method for delivering an mRNA (or other polynucleotide) encoding a stephin A protein variant or a fusion protein or conjugate comprising the same to cells of a patient by administering nanoparticles comprising the mRNA (or other polynucleotide).
  • the administration comprises contacting the mammalian cell with the nanoparticle composition, thereby delivering the mRNA (or other polynucleotide) to the cell.
  • PEG lipids include PEG-modified phosphatidylethanolamines, PEG-modified phosphatidic acids, PEG-modified ceramides, PEG-modified dialkylamines, PEG-modified diacylglycerols and PEG-modified diacylglycerols. It is selected from the group consisting of alkylglycerols.
  • the structural lipid is selected from the group consisting of cholesterol, pecosterol, sitosterol, ergosterol, campesterol, stigmasterol, brassicasterol, tomatidine, ursolic acid and alpha tocopherol. In some embodiments, the structural lipid is cholesterol.
  • the phospholipid may include a moiety selected from the group consisting of: phosphatidyl choline, phosphatidyl ethanolamine, phosphatidyl glycerol, and phosphatidyl serine. (phosphatidyl serine), phosphatidic acid, 2-lysophosphatidyl choline, and sphingomyelin.
  • the phospholipid may include at least one fatty acid moiety selected from the group consisting of: lauric acid, myristic acid, myristoleic acid, Palmitic acid, palmitoleic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid, alpha-linolenic acid, erucic acid acid), arachidic acid, arachidonic acid, phytanoic acid, eicosapentaenoic acid, behenic acid, docosapentaenoic acid ), and docosahexaenoic acid.
  • lauric acid lauric acid
  • myristic acid myristoleic acid
  • Palmitic acid palmitoleic acid
  • stearic acid oleic acid
  • linoleic acid alpha-linolenic acid
  • erucic acid acid erucic acid
  • arachidic acid arachidonic acid
  • phytanoic acid eicosapenta
  • the phospholipid may be selected from the group consisting of: 1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DLPC), 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-phosphocholine (DMPC), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphocholine (DSPC), 1,2-diundecanoyl-sn-glycero-phosphocholine (DUPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC), 1,2-di-0-octadecenyl-sn -glycero-3-phosphocholine (1 8:0 Diether PC), 1-oleoyl-2-cholesterylhem
  • the phospholipid can be DOPE, and the lipid component is about 35 mol% to about 45 mol% of the aforementioned compound, about 10 mol% to about 20 mol% of DOPE, about 38.5 mol% to about 48.5 mol%. mol % structural lipid and about 1.5 mol % PEG lipid.
  • the lipid component may include about 40 mol% of the above compounds, about 15 mol% of phospholipids, about 43.5 mol% of structural lipids and about 1.5 mol% of PEG lipids.
  • the weight/weight ratio of the lipid component to the steppin A protein variant or fusion protein or conjugate encoding mRNA (or other polynucleotide) that specifically binds to CD40L is about 5:1 to about 50:1, or about 10:1 to about 40:1.
  • the average size of the nanoparticle composition may be about 50 nm to about 150 nm, or about 80 nm to about 120 nm.
  • the polydispersity index of the nanoparticle composition may be about 0 to about 0.18, or about 0.13 to about 0.17.
  • the nanoparticle composition may have a zeta potential of about -10 to about +20 mV.
  • the nanoparticle composition may further comprise a cationic and/or ionizable lipid selected from the group consisting of: 3-(didodecylamino)-N1 ,N 1 ,4-tridodecyl-1 -piperazineethanamine (KL1 0), 14,25-ditridecyl-1 5, 1 8,21 ,24-tetraaza-octatriacontane (KL25), 1,2-dilinoleyloxy-N,N-dimethylaminopropane (DLin-DMA), 2,2-dilinoleyl -4-dimethylaminomethyl-[1,3]-dioxolane (DLin-K-DMA), heptatriaconta-6, 9,28,31 -tetraen-1 9-yl 4-(dimethylamino)butanoate (DLin-MC3-DMA), 2,2-dilinoleyl-4-(2-dimethylamin
  • the nucleic acid or vector may be introduced into a host cell by a method such as transformation or transfection.
  • transformation means introducing DNA into a host so that the DNA becomes replicable as an extrachromosomal factor or by completion of chromosomal integration.
  • transfection refers to acceptance of an expression vector by a host cell, whether or not any coding sequences are actually expressed.
  • various techniques commonly used for introducing exogenous nucleic acids (DNA or RNA) into prokaryotic or eukaryotic host cells such as electrophoresis, calcium phosphate precipitation, DEAE-dextran transduction, etc. Speculation or lipofection may be used, but is not limited thereto.
  • the single-celled host has the characteristics of the selected vector, the toxicity of the product encoded by the DNA sequence of the present invention, the secretion properties, the ability to correctly fold the protein, the culture and fermentation requirements, and the product encoded by the DNA sequence of the present invention from the host. It must be selected in consideration of factors such as ease of purification.
  • one skilled in the art can select a variety of vector/expression control sequence/host combinations capable of expressing the DNA sequences of the present invention in fermentation or large-scale animal culture.
  • a screening method for cloning cDNA by expression cloning a binding method, a panning method, a film emulsion method, and the like can be applied.
  • a "transformation enhancer” may be additionally used to increase the efficiency of transformation.
  • the “transformation enhancer” is generally preferably a cationic polymer, and facilitates incorporation of negatively charged nucleic acids or genes into host cells.
  • the transformation enhancing agent may be characterized as being a cationic polymer, and may be, for example, one selected from polybrene, protamine sulfate, and Sirion's Lentiboost, most preferably. It may be characterized in that it is polybrene (polybrene), but is not limited thereto.
  • a stephin A protein variant that specifically binds to CD40L of the present invention and/or a fusion protein or conjugate comprising the same may be prepared by any suitable method known in the art. These methods range from direct protein synthesis methods to introduction and expression of a nucleic acid of the invention into a suitable host.
  • the conjugate comprising the steppin A protein variant specifically binding to CD40L of the present invention includes various modifications such as chemical modification or conjugation, it is isolated from the host cell or chemically synthesized and then chemically or enzymatically further manipulated. It can be.
  • the present invention is specific for CD40L, including the step of culturing the genetically engineered cells to produce a steppin A protein variant that specifically binds to CD40L and / or a fusion protein or conjugate comprising the same. It relates to a stephin A protein variant that binds to and/or a method for producing a fusion protein or conjugate comprising the same.
  • the conjugate when the conjugate includes various modifications such as chemical modification or conjugation, it may be prepared by further manipulation chemically or enzymatically after separation from the host cell or chemical synthesis.
  • the nucleic acid encoding the steppin A protein variant that specifically binds to CD40L and/or a fusion protein or conjugate containing the same can be constructed by chemical synthesis using an oligonucleotide synthesizer.
  • the oligonucleotide may be designed based on the sequence of a desired protein or polypeptide, and codon optimization may be performed to select preferred codons in a host cell. Standard methods can be applied for the synthesis of the nucleic acids of the present invention. For example, a reverse translation gene can be constructed using the complete amino acid sequence.
  • DNA oligomers can be synthesized that contain nucleotide sequences encoding specific isolated polypeptides. For example, several small oligonucleotides encoding portions of the desired polypeptide can be synthesized and then ligated. Individual oligonucleotides may generally contain 5' or 3' overhangs for complementary assembly.
  • a nucleic acid encoding a steppin A protein variant that specifically binds to CD40L of the present invention may be, for example, any one of those listed in Table 4, but is not limited thereto.
  • an expression vector containing it can be constructed using recombinant DNA technology known in the art.
  • Vectors for the production of proteins can be produced by recombinant DNA technology using techniques well known in the art.
  • a person skilled in the art can use a known method to obtain a vector containing a sequence encoding the steppin A protein variant specifically binding to CD40L of the present invention and/or a fusion protein or conjugate comprising the same and appropriate transcriptional and translational control signals. can build.
  • Such methods may include, for example, in vitro recombinant DNA technology, synthetic technology, and in vivo genetic recombination technology, but are not limited thereto (Sambrook et al, 1990, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. and Ausubel et al., eds., 1998, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY).
  • the expression vector can be delivered to the host cell by conventional techniques (e.g., electroporation, liposome transfection, calcium phosphate precipitation, etc.), and the transfected cells are conventionally known in the art.
  • Cultured by the method it is possible to express a steppin A protein variant that specifically binds to CD40L and/or a fusion protein or conjugate comprising the same.
  • expression of a protein may be regulated by a constitutive, inducible or constitutive, specific promoter.
  • the expression vector may include an origin of replication that can be selected based on the type of host cell used.
  • an origin of replication that can be selected based on the type of host cell used.
  • pBR322 Product No. 303-3s, New England Biolabs, Beverly, Mass.
  • SV40 polyoma, adenovirus, vesicular stomatitis virus (VSV) or papillomavirus (HPV, BPV
  • mammalian expression vectors may not require an origin of replication (eg, the SV40 origin of replication may be used as it contains an early promoter).
  • the expression vector may include at least one selectable marker gene, for example, a genetic element encoding a protein necessary for the survival and growth of host cells grown in a selective culture medium.
  • selectable marker genes (a) confer resistance to prokaryotic host cells to antibiotics or other toxins, such as ampicillin, tetracycline or kanamycin; (b) compensate for cellular auxotrophic deficiencies; or (c) may encode related proteins for the supply of important nutrients not obtainable in complex media.
  • a preferred selection marker may be a kanamycin resistance gene, an ampicillin resistance gene, or a tetracycline resistance gene, but is not limited thereto.
  • Neomycin resistance genes can be used for selection in prokaryotic and eukaryotic host cells.
  • Other selection genes can be used to amplify the gene to be expressed. Amplification refers to the process by which genes with high demand for the production of growth-critical proteins are repeated side-by-side within the chromosomes of successive recombinant cell generations.
  • selectable markers for mammalian cells include dihydrofolate reductase (DHFR) and thymidine kinase.
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • thymidine kinase thymidine kinase.
  • Selection pressure is imposed by culturing the transformed cells under conditions in which the concentration of the selection agent in the medium continuously changes, whereby both the selection gene and the DNA encoding the steppin A protein variant of the present invention or a fusion protein or conjugate comprising the same can be amplified, and as a result, an increased amount of protein can be synthesized from the amplified DNA.
  • the expression vector may include at least one ribosome binding site.
  • the ribosome binding site can be transcribed into mRNA containing the coding sequence for the protein.
  • the ribosome binding site may be a Shine-Dalgarno sequence (prokaryotes) or a Kozak sequence (eukaryotes).
  • the binding site may be typically located 3' to the promoter of the polypeptide to be expressed and 5' to the coding sequence.
  • Shine-Dalgarno sequences There are various Shine-Dalgarno sequences, but they are usually polypurines (high A-G content). A number of Shine-Dalgarno sequences have been identified and can be readily synthesized using the methods described above and used in prokaryotic vectors.
  • the expression vector may contain a promoter that is typically recognized by the host organism and is operably linked to a nucleic acid encoding the steppin A protein variant of the present invention or a fusion protein or conjugate comprising the same.
  • Native or heterologous promoters may be used depending on the host cell used for expression and the desired yield.
  • promoters for use with prokaryotic hosts include beta-lactamase and lactose promoter systems; alkaline phosphatase, tryptophan (trp) promoter system; and hybrid promoters such as the tac promoter, and the like.
  • Other known bacterial promoters may also be suitable.
  • the sequences of these promoters have been published and can be linked to the desired nucleic acid sequence(s) using linkers or adapters as desired to provide restriction sites.
  • Promoters for use with yeast hosts are also known in the art.
  • Yeast enhancers can advantageously be used in conjunction with yeast promoters.
  • Promoters suitable for use with mammalian host cells are well known and include polyoma virus, fowlpox virus, adenovirus (eg adenovirus 2), bovine papilloma virus, but is not limited to promoters derived from avian sarcoma virus, cytomegalovirus, retrovirus, hepatitis-B virus, most preferably Simian virus 40 (SV40).
  • Other suitable mammalian promoters include heterologous mammalian promoters such as the heat-shock promoter and actin promoter.
  • Additional promoters that may be used in the present invention include, for example, the SV40 early promoter region (Bernoist and Chambon, Nature, 290:304-310, 1981); CMV promoter; a promoter containing the 3' long terminal repeat of Rous sarcoma virus (Yamamoto et al. (1980), Cell 22: 787-97); herpes thymidine kinase promoter (Wagner et al. (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
  • the regulatory sequence of the metallothionein gene (Brinster et al, Nature, 296; 39-42, 1982); prokaryotic expression vectors such as the beta-lactamase promoter (Villa-Kamaroff, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75; 3727-3731, 1978); or the tac promoter (DeBoer, et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 21-5).
  • transgenic transcriptional control region that exhibits tissue specificity and has been utilized in transgenic animals can also be used: the elastase I gene control region activated in pancreatic acinar cells (Swift et al. (1984), Cell 38 : 639-46; Ornitz et al. (1986), Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald (1987), Hepatology 7: 425-515); the insulin gene control region that is activated in pancreatic beta cells (Hanahan (1985), Nature 315: 115-22); Immunoglobulin gene control regions activated in lymphocytes (Grosschedl et al.
  • Enhancer sequences can be inserted into vectors to increase transcription in eukaryotic host cells.
  • enhancer sequences are known that can be used in mammalian genes (eg globin, elastase, albumin, alpha-feto-protein and insulin).
  • viral enhancers usually viral enhancers are used.
  • the SV40 enhancer, cytomegalovirus early promoter enhancer, polyoma enhancer and adenovirus enhancer are exemplary enhancers for activation of eukaryotic promoters.
  • the enhancer can be spliced into the vector at either the 5' or 3' position of the polypeptide coding region, but is usually located 5' from the promoter.
  • vectors for expressing nucleic acids may include those compatible with bacterial, insect and mammalian host cells.
  • the vector is inter alia, pCRII, pCR3, and pcDNA3.1 (Invitrogen Company, San Diego, Calif.), pBSII (Stratagene Company, La Jolla, Calif.), pET15 (Novagen, Madison, Wis. ), pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.), pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, Calif.), pETL (BlueBacII; Invitrogen), pDSR-alpha (PCT Publication No. WO90/14363), and pFastBacDual (Gibco/BRL). , Grand Island, N.Y.), etc., but are not limited thereto.
  • vectors include, but are not limited to, cosmids, plasmids or modified viruses.
  • the vector must be compatible with the selected host cell.
  • Such vectors include Bluescript® plasmid derivatives (high copy number ColE1 based phagemids, Stratagene Cloning Systems Inc., La Jolla Calif.), PCR cloning plasmids designed to clone Taq-amplified PCR products (e.g. TOPOTM.
  • TA Cloning® Kit PCR2.1 plasmid derivative, Invitrogen, Carlsbad, CA
  • viral vectors such as mammalian, yeast or baculovirus expression systems (pBacPAK plasmid derivative, Clontech, Palo Alto, CA); It is not limited.
  • recombinant molecules such as vectors can be introduced into host cells through transformation, transfection, infection, electroporation or other known techniques.
  • Eukaryotic and prokaryotic host cells including mammalian cells, as hosts for the expression of the steppin A protein of the present invention or fusion proteins or conjugates containing the same are well known in the art and are available from the American Type Culture Collection (ATCC). It includes many immortalized cell lines that can be These are in particular Chinese hamster ovary (CHO) cells, NSO, SP2 cells, HeLa cells, baby hamster kidney (BHK) cells, monkey kidney cells (COS), human hepatocellular carcinoma cells (eg Hep G2), A549 cells, 3T3 cells, HEK-293 cells and many other cell lines.
  • Mammalian host cells include human, mouse, rat, dog, monkey, pig, goat, cow, horse and hamster cells.
  • Cell lines of particular preference can be selected by determining which cell lines have high expression levels.
  • Other cell lines that can be used include insect cell lines such as Sf9 cells, amphibian cells, bacterial cells, plant cells and fungal cells.
  • the fungal cells include yeast and filamentous fungus cells , for example, Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia minuta (Ogataea minuta, Pichia lindneri), Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromy
  • Pichia sp. any Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, any Kluyveromyces sp., Candida albicans, any Aspergillus sp., Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, any Fusarium sp., Yarrowia lipolytica, and Neurospora crassa may be used. However, it is not limited thereto.
  • various host-expression vector systems can be used to express the steppin A protein of the present invention or a fusion protein or conjugate containing the same.
  • the host-expression system represents a vehicle capable of producing and purifying a sequence encoding the steppin A protein of the present invention or a fusion protein or conjugate comprising the same, but is transformed with an appropriate nucleic acid encoding sequence or It also refers to a cell capable of expressing in situ the steppin A protein of the present invention or a fusion protein or conjugate comprising the same when transfected.
  • microorganisms such as bacteria (eg, E. coli and B.
  • subtilis transformed with recombinant bacteriophage DNA, plasmid DNA or cosmid DNA expression vectors comprising the nucleic acid sequences of the present invention
  • yeast eg, Saccharomyces pichia
  • insect cell systems infected with recombinant virus expression vectors (eg, baculovirus) comprising the nucleic acid sequences of the present invention
  • Plant cells infected with recombinant virus expression vectors e.g., cauliflower mosaic virus (CMV) and tobacco mosaic virus (TMV)
  • recombinant plasmid expression vectors e.g., Ti plasmid
  • mammalian cell systems e.g., COS, CHO, BHK, 293, 293T, 3T3 cells, lymphocytes (see U.S. Patent No. 5,807,715), Per C.6 cells (rat retinal cells developed by Crucell))
  • a promoter derived from the genome of a mammalian cell e.g metallothionein promoter
  • a mammalian virus e.g adenovirus late promoter; vaccinia virus 7.5K promoter
  • mammalian cell systems e.g., COS, CHO, BHK, 293, 293T, 3T3 cells, lymphocytes (see U.S. Patent No. 5,807,715), Per C.6 cells (rat retinal cells developed by Crucell)
  • Vectors directing the expression of high-level, easily purified fusion protein products may be desirable when such proteins must be produced in large quantities, for example, for the production of pharmaceutical compositions.
  • Such vectors include, for example, the expression vector pUR278 (Ruther et al. (1983) EMBO J in which the coding region of the steppin A protein variant of the present invention is individually ligated to a vector in frame with the lac Z coding region for the production of a fusion protein). 2:1791-1794); pIN vector (Inouye et al. (1985) Nucleic Acids Res.
  • pGEX vectors can also be used to express foreign polypeptides as fusion proteins with glutathione S-transferase (GST). Generally, these fusion proteins are soluble and can be easily purified from lysed cells by adsorption and binding to matrix glutathione-agarose beads followed by elution in the presence of free glutathione.
  • GST glutathione S-transferase
  • the pGEX vector is designed to contain a thrombin or factor Xa protease cleavage site so that the cloned target gene product can be released at the GST moiety.
  • AcNPV Autographa californica nuclear polyhedrosis virus
  • the virus grows in Spodoptera frugiperda cells.
  • the sequence encoding the steppin A protein of the present invention or a fusion protein or conjugate comprising the same may be individually cloned into a non-essential region of the virus (eg polyhedrin gene) and placed under the control of an AcNPV promoter (eg polyhedrin promoter).
  • a non-essential region of the virus eg polyhedrin gene
  • an AcNPV promoter eg polyhedrin promoter
  • adenovirus In mammalian host cells, a number of viral-based expression systems are available.
  • protein coding sequences can be linked to an adenovirus transcription/translation control complex, such as a late promoter and triple leader sequence.
  • adenovirus transcription/translation control complex such as a late promoter and triple leader sequence.
  • These chimeric genes can then be inserted into the adenovirus genome by in vitro or in vivo recombination. Insertion into non-essential regions of the viral genome (eg regions E1 or E3) results in recombinant viruses that are viable in infected hosts and capable of expressing immunoglobulin molecules.
  • non-essential regions of the viral genome eg regions E1 or E3
  • initiation signals may be required for efficient translation of the inserted nucleic acid sequence. These signals include the ATG initiation codon and adjacent sequences. Also, the initiation codon must be in phase with the reading frame of the desired coding sequence to ensure translation of the entire insert. These exogenous translational control signals and initiation codons can be of various origins, both natural and synthetic. Expression efficiency can be improved by including appropriate transcriptional enhancer elements, transcriptional terminators, etc. (see Bitter et al. (1987 Methods in Enzymol. 153:516-544).
  • host cell strains can be selected that modulate the expression of the inserted sequences or modify and process the gene product in a specific desired manner. These modifications (eg glycosylation) and processing (eg cleavage) of proteins can be important for the function of proteins.
  • Different host cells have characteristic and specific mechanisms for post-translational processing and modification of proteins and gene products. Appropriate cell lines or host systems can be selected to ensure correct modification and processing of the foreign protein expressed.
  • eukaryotic host cells that possess the cellular machinery for proper processing of primary transcription, glycosylation and phosphorylation of the gene product may be used.
  • Such eukaryotic host cells include, for example, CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 293T, 3T3, WI38, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 and T47D, CRL7030 and Hs578Bst, but are not limited thereto. no.
  • Stable expression is contemplated for long-term, high-yield production of recombinant proteins.
  • cell lines that stably express the antibody can be engineered.
  • host cells are transfected with DNA controlled by appropriate expression control elements (e.g., promoters, enhancers, sequences, transcription terminators, polyadenylation sites, etc.) and selectable markers.
  • appropriate expression control elements e.g., promoters, enhancers, sequences, transcription terminators, polyadenylation sites, etc.
  • selectable markers e.g., promoters, enhancers, sequences, transcription terminators, polyadenylation sites, etc.
  • the selectable marker on the recombinant plasmid confers resistance to selection and allows cells to stably integrate the plasmid into their chromosomes and grow to form foci that can be cloned and expanded into cell lines.
  • This method can advantageously be used to engineer cell lines expressing the stephin A protein of the present invention or a fusion protein or conjugate comprising the same.
  • Such engineered cell lines may be particularly useful for screening and evaluating compounds that interact directly or indirectly with a recombinant stephin A protein or a fusion protein or conjugate comprising the same.
  • herpes simplex virus thymidine kinase (Wigler et al. (1977) Cell 11:223-232), hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase Szybalska et al. (1962), Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 48:2026-2034), and adenine phosphoribosyltransferase; Lowy et al.
  • genes can be used in tk-, hgprt- or aprt- cells, respectively, but are not limited thereto.
  • antimetabolite resistance can be used as a basis for selection for the following genes: dhfr conferring resistance to methotrexate (Wigler et al. (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 77:3567 -3570; O'Hare et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 78:1527-1531); gpt, which confers resistance to mycophenolic acid (Mulligan et al.
  • the expression level of the steppin A protein of the present invention or a fusion protein or conjugate containing the same can be increased by vector amplification (see Bebbington and Hentschel, in DNA CLONING, vol. 3. (Academic Press, New York, 1987)).
  • vector amplification see Bebbington and Hentschel, in DNA CLONING, vol. 3. (Academic Press, New York, 1987)
  • an increase in the level of the inhibitor present in the culture of the host cell can increase the copy number of the marker gene.
  • the amplified region is associated with a nucleic acid sequence encoding the stephin A protein or a fusion protein or conjugate containing the same, the production of the stephin A protein or the fusion protein or conjugate containing the same may also increase (Crouse et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 3:257-266).
  • the host cell may be co-transfected with two expression vectors, e.g., a first vector encoding a heavy chain and a second vector encoding a light chain derived polypeptide.
  • two expression vectors e.g., a first vector encoding a heavy chain and a second vector encoding a light chain derived polypeptide.
  • the two vectors may contain identical selectable markers to allow identical expression of heavy and light chain polypeptides.
  • a single vector encoding both heavy and light chain polypeptides may be used.
  • Coding sequences for heavy and light chains may include cDNA or genetic DNA.
  • glycoproteins produced in a particular cell line or transgenic animal may have glycosylation patterns characteristic of glycoproteins produced in the cell line or transgenic animal.
  • the specific glycosylation pattern of a stephin A protein or a fusion protein or conjugate comprising the same may vary depending on the particular cell line or transgenic animal used to produce the protein.
  • a glycosylation pattern comprising only non-fucosylated N-glycans may be advantageous, as for antibodies fucosylation both in vitro and in vivo This is because they have been shown to typically exhibit stronger potency than their tested counterparts. (See, eg, Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278: 3466-3473 (2003); US Pat. Nos. 6,946,292 and 7,214,775).
  • steppin A protein or fusion protein or conjugate comprising the same from a production cell line can be enhanced using a number of known techniques.
  • glutamine synthetase gene expression systems are a common approach to enhance expression under specific conditions.
  • the GS system is described in whole or in part in connection with European Patent Nos. 0216846, 0256055, and 0323997 and European Patent Application No. 89303964.4.
  • mammalian host cells e.g., CHO
  • Such host cells containing the stephin A protein or fusion protein or conjugate comprising the same of the present invention, a nucleic acid or vector encoding the same, as well as the production of the stephin A protein or fusion protein or conjugate comprising the same using such host cells. Expression methods to do so are provided as part of the scope of the present invention.
  • insect cell culture systems eg baculovirus
  • Baculovirus systems for producing heterologous proteins in insect cells are well known to those skilled in the art.
  • the stephin A protein produced by the transformed host cell or a fusion protein or conjugate comprising the same can be purified according to any suitable method.
  • Standard methods include chromatography (eg ion exchange, affinity and sizing column chromatography), centrifugation, differential solubility or other standard techniques for protein purification.
  • Affinity tags such as hexa-histidine, maltose binding domain, influenza coat sequence and glutathione-S-transferase are attached to the protein so that it can be easily purified by passing it through an appropriate affinity column.
  • Isolated proteins can also be physically characterized using techniques such as proteolysis, mass spectrometry (MS), nuclear magnetic resonance (NMR), high performance liquid chromatography (HPLC) and x-ray crystallography.
  • the stephin A protein or fusion protein or conjugate comprising the same produced in bacterial culture is subjected to, for example, initial extraction from a cell pellet followed by at least one concentration, salting-out, aqueous ion exchange or It can be separated by a size exclusion chromatography step.
  • HPLC can be used for final purification steps.
  • Microbial cells used for expression of recombinant proteins may be disrupted by any convenient method including freeze-thaw cycling, sonication, mechanical disruption, or use of cell lysing agents.
  • CD40L/CD40 acts as a pathogenic factor in autoimmune diseases or inflammatory diseases that have a major effect on pathology.
  • it is a pathogenic factor in various diseases such as type 1 diabetes, thyroiditis, psoriasis, systemic lupus erythematosus (SLE), rheumatoid arthritis (RA), and multiple sclerosis (MS).
  • SLE systemic lupus erythematosus
  • RA rheumatoid arthritis
  • MS multiple sclerosis
  • Various compounds or antibodies targeting CD40L are being developed for the treatment of these diseases (Semin Immunol. 2009;21(5):293-300; Advanced Drug Delivery Reviews Volume 141, 15 February 2019, Pages 92-103). .
  • the present invention provides a steppin A protein variant that specifically binds to CD40L, the fusion protein, the conjugate, the nucleic acid, and/or the fusion protein containing the delivery vehicle as an active ingredient, and/or It relates to a pharmaceutical composition containing a conjugate comprising the same.
  • the pharmaceutical composition is characterized in that it is used for the prevention or treatment of various diseases related to CD40L, in particular, diseases known in the art that can achieve preventive or therapeutic effects through targeting to CD40L or inhibition of CD40L. can be done with
  • the present invention is directed to preventing or preventing immune diseases containing the steppin A protein variant, the fusion protein, the conjugate, the nucleic acid, and/or the delivery vehicle as an active ingredient that binds specifically to CD40L. It relates to a pharmaceutical composition for treatment.
  • the present invention relates to the treatment of an immune disease comprising administering to a subject the steppin A protein variant that specifically binds to CD40L, the fusion protein, the conjugate, the nucleic acid, and/or the delivery vehicle. It relates to preventive or therapeutic methods.
  • the present invention relates to the use of the steppin A protein variant, the fusion protein, the conjugate, the nucleic acid, and/or the delivery vehicle that specifically binds to CD40L to prevent or treat immune diseases.
  • the present invention relates to the use of the steppin A protein variant that specifically binds to CD40L, the fusion protein, the conjugate, the nucleic acid, and/or the delivery vehicle for the preparation of a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition may be characterized in that it is for use in preventing or treating immune diseases.
  • prevention of the present invention refers to all activities of inhibiting or delaying the onset of an immune disease by administering the pharmaceutical composition provided in the present invention to a subject who is expected to have the onset of an immune disease.
  • treatment refers to any action that clinically intervenes in order to change the natural process of an individual or cell to be treated, and may be performed while a clinical pathological state is progressing or to prevent it.
  • the desired therapeutic effects include prevention of disease occurrence or recurrence, alleviation of symptoms, inhibition of any direct or indirect pathological consequences of the disease, prevention of metastasis, reduction of the rate of disease progression, alleviation or temporary alleviation of the disease state, and prognosis. improvement is included.
  • the treatment may be interpreted as including all actions of improving the course of the autoimmune disease by administering the pharmaceutical composition of the present invention to a patient suffering from an autoimmune disease, including psoriasis, but in particular, this Not limited.
  • the pharmaceutical composition may be characterized by further comprising one or more pharmaceutically acceptable carriers.
  • compositions of the present invention are commonly used in formulation, and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia gum, calcium phosphate, alginate, gelatin, silicic acid but is not limited to calcium, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, etc. .
  • composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, and the like in addition to the above components.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally, and in the case of parenteral administration, intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, endothelial administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, and intrarectal administration can be administered, etc.
  • oral compositions When administered orally, since proteins or peptides are digested, oral compositions must be formulated to coat the active agent or protect it from degradation in the stomach.
  • the pharmaceutical composition can be administered by any device capable of transporting an active substance to a target cell.
  • a suitable dosage of the composition according to the present invention varies depending on factors such as formulation method, administration method, patient's age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate and reaction sensitivity, usually This allows the skilled physician to readily determine and prescribe dosages effective for the desired treatment or prophylaxis.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to prevent or treat an immune disease.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared in unit dosage form by formulation using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily performed by those skilled in the art. or it may be prepared by incorporating into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, suppository, powder, granule, tablet or capsule, and may additionally contain a dispersing agent or stabilizer.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be administered in parallel or in combination with a known drug or pharmaceutical composition having an effect of preventing, improving or treating symptoms of an immune disease, for example, one or more other immunotherapeutic agents, chemotherapy It can be administered concomitantly with antibiotics, antibody therapeutics, etc.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include disease modifying antirheumatic drugs (DMARDs); Nonsteroidal anti-inflammatory medications (NSAIDs); Corticosteroids; Janus kinase inhibitors; Calcineurin inhibitors; mTOR inhibitor; IMDH inhibitors; And it may be characterized in that it is used in combination with a drug selected from the group consisting of biological agents, but is not limited thereto.
  • DMARDs disease modifying antirheumatic drugs
  • NSAIDs Nonsteroidal anti-inflammatory medications
  • Corticosteroids Corticosteroids
  • Janus kinase inhibitors Janus kinase inhibitors
  • Calcineurin inhibitors Calcineurin inhibitors
  • mTOR inhibitor mTOR inhibitor
  • IMDH inhibitors IMDH inhibitors
  • the disease modifying antirheumatic drugs are, for example, Actarit, Auranofin, Azathioprine, Bucillamine, Cyclophophamide, D-penicillamine, Leflunomide, Lobenzarit disodium, Methotrexate, Minocycline hydrochloride, Mizoribine and Salazosulfapyridine and the like, but are not limited thereto.
  • the nonsteroidal anti-inflammatory medication includes Celecoxib, Diclofenac sodium, Ibuprofen, Ketoprofen, Meloxicam, Naproxen, Piroxicam, etc., but is not limited thereto.
  • the corticosteroids include prednisone (Deltasone, Orasone), budesonide (Entocort EC), prednisolone (Millipred), methylprednisolone, etc., but are not limited thereto.
  • the Janus kinase inhibitors are approved drugs, tofacitinib, Abrocitinib, Baricitinib, Delgocitinib, Fedratinib, Filgotinib, Oclacitinib, Peficitinib, Ruxolitinib, Upadacitinib, drugs under clinical trials, Cerdulatinib, Gandotinib, Lestaurtinib , Momelotinib, Pacritinib, Deucravacitinib, etc., but are not limited thereto.
  • the calcineurin inhibitors include cyclosporine, tacrolimus, etc., but are not limited thereto.
  • the mTOR inhibitor includes sirolimus (Rapamune), everolimus (Afinitor, Zortress), etc., but is not limited thereto.
  • the IMDH inhibitor includes azathioprine (Azasan, Imuran), mycophenolate (CellCept, Myfortic), etc., but is not limited thereto.
  • the biological agents include abatacept, adalimumab, anakinra, certolizumab, etanercept, golimumab, infliximab, ixekizumab, natalizumab, rituximab, secukinumab, tocilizumab, ustekinumab, vedolizumab, basiliximab, daclizumab, etc., but are not limited thereto.
  • the immune disease may be an autoimmune disease or an inflammatory disease.
  • the immune disease is lupus (SLE), lupus nephritis (eg, drug-induced lupus nephritis), immune thrombocytopenia (ITP), rheumatoid arthritis (RA), multiple sclerosis (MS), inflammatory bowel disease ( IBD) (eg, Crohn's disease and colitis/ulcerative colitis), graft-versus-host disease (GvHD) or allograft rejection, transplant/solid organ transplant (SOT), primary biliary cholangitis (PBC), psoriasis, psoriatic arthritis, Collagen-induced arthritis, experimental allergic encephalomyelitis (EAE), oophoritis, allergic rhinitis, asthma, Sjogren's syndrome, atopic eczema, myasthenia gravis, Grave's disease, and/or glomerulosclerosis; , but is not limited thereto.
  • SLE lupus
  • SLE Systemic lupus erythematosus
  • lupus is a chronic autoimmune disease that can cause swelling (inflammation) and pain throughout the body.
  • swelling inflammation
  • pain throughout the body.
  • systemic lupus erythematosus is a chronic autoimmune disease that can cause swelling (inflammation) and pain throughout the body.
  • systemic lupus erythematosus is the most common.
  • Other types of lupus include:
  • Cutaneous lupus erythematosus This type of lupus affects the skin. Qtanus is a term meaning skin. People with cutaneous lupus erythematosus may experience skin problems such as sensitivity to the sun and rashes. Hair loss can also be a symptom of this condition.
  • Drug-induced lupus This lupus is caused by certain medications. A person with drug-induced lupus may have many of the same symptoms as systemic lupus erythematosus, but these are usually temporary.
  • Neonatal Lupus Neonatal lupus, a rare type of lupus, is found in infants at birth. Children born with neonatal lupus inherit antibodies from their mothers, who may have had lupus during pregnancy or develop the disease later in life. Not all babies born to mothers with lupus will develop lupus.
  • Therapies that can be used in combination with the pharmaceutical composition of the present invention include, for example, steroids (including corticosteroids, prednisone); hydroxychloroquine (Plaquenil®); azathioprine (Imuran®); methotrexate (Rheumatrex®); cyclophosphamide (Cytoxan®) and mycophenolate mofetil (CellCept®); belimumab (Benlysta®); and/or rituximab (Rituxan®), but is not limited thereto.
  • Lupus nephritis develops as a complication of lupus.
  • Lupus nephritis occurs when lupus autoantibodies affect the structures of the kidneys that filter out waste. It causes kidney inflammation and can lead to blood in the urine, protein in the urine, high blood pressure, impaired kidney function, or kidney failure. About half of adults with systemic lupus develop lupus nephritis. Systemic lupus impairs the ability of immune system proteins to filter waste by damaging the kidneys.
  • Rheumatoid arthritis is a type of chronic (ongoing) arthritis that affects joints on both sides of the body, such as the hands, wrists, and knees.
  • the short-term goals of rheumatoid arthritis medications are to reduce joint pain and swelling and improve joint function.
  • the long-term goal is to slow or stop disease progression, especially joint damage.
  • Rheumatoid arthritis is a type of chronic (ongoing) arthritis (causing pain and swelling) that usually occurs symmetrically in joints (both sides of the body, such as the hands, wrists and knees). This involvement of multiple joints helps differentiate rheumatoid arthritis from other types of arthritis.
  • rheumatoid arthritis can sometimes affect the skin, eyes, lungs, heart, blood, nerves or kidneys.
  • Therapies that can be used in combination with the pharmaceutical compositions of the present invention to treat rheumatoid arthritis can include, for example:
  • Anti-inflammatory drugs include ibuprofen (MOTRIN®), naproxen (ALEVE®), Celecoxib, Diclofenac sodium, Ketoprofen, Meloxicam, Piroxicam ), and non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs).
  • COX-2 inhibitors Another type of drug, COX-2 inhibitors, also fall into this drug category and relieve the signs and symptoms of rheumatoid arthritis.
  • COX-2 inhibitor is available in the United States. COX-2 inhibitors are designed to have fewer gastrointestinal bleeding side effects.
  • DMARDs Disease modifying antirheumatic drugs
  • Previous DMARDs include methotrexate (TREXALL®), gold salts, penicillamine (CUPRIMINE®), hydroxychloroquine (PLAQUENIL®), sulfasalazine (AZULFIDINE®), cyclosporine (SANDIMMUNE®), cyclophosphamide ( CYTOXAN®) and leflunomide (ARAVA®).
  • methotrexate cyclosporine, cyclophosphamide, gold salts, and penicillamine are no longer commonly used.
  • biologics In addition to these "traditional" DMARDs, new drugs are being approved. Currently, there are seven classes of drugs, and in some cases there are different classes in each class (some of which, in the anti-TNF class, have been in use since 2000). Collectively, these DMARDs are known by another name, biologics (or bioreactive agents). Compared to traditional DMARDs, these products target molecules that cause inflammation in rheumatoid arthritis. Inflammatory cells in the joints are involved in the pathogenesis of rheumatoid arthritis itself. Biologics reduce the inflammatory process that ultimately causes joint damage seen in rheumatoid arthritis. By attacking cells at a level more specific than inflammation itself, biologics are considered more effective and more specifically targeted.
  • Biologics include etanercept (ENBREL®), infliximab (REMICADE®), adalimumab (HUMIRA®), anakinra (KINARET®), abatacept (ORENCIA®), rituximab (RITUXAN®), certolizumab These include pegol (CIMZIA®), golimumab (SYMPON®), tocilizumab (ACTEMRA®) and tofacitinib (XELJANJ®). Some biologics are used in combination with traditional DMARDs, particularly methotrexate.
  • MS Multiple sclerosis
  • CIS Clinical Isolation Syndrome
  • RRMS Relapsing-remitting MS
  • PPMS Primary Progressive MS
  • SPMS Secondary Progressive MS
  • Therapies that can be used in combination with the pharmaceutical compositions of the present invention include, for example:
  • DMT Disease-modifying therapy
  • Relapse Management Medication If you have severe seizures, your neurologist may recommend high-dose corticosteroids. Medications can quickly reduce inflammation. It slows the damage of the myelin sheath that surrounds nerve cells.
  • IBD Inflammatory Bowel Disease
  • IBD Crohn's disease and ulcerative colitis are the main types of IBD. The types are:
  • Crohn's disease causes pain and swelling in the digestive tract. It can affect everything from the mouth to the anus. It most commonly affects the small and upper part of the large intestine.
  • Ulcerative colitis causes boils and sores (ulcers) in the large intestine (colon and rectum).
  • Microcolitis causes intestinal inflammation that can only be detected under a microscope.
  • Therapies that can be used in combination with the pharmaceutical compositions of the present invention include, for example:
  • aminosalicylates (anti-inflammatory drugs such as sulfasalazine, mesalamine or balsalazide) minimize irritation to the intestines;
  • Antibiotics treat infections and abscesses; Biologics block signals from the immune system that cause inflammation; Corticosteroids such as prednisone suppress the immune system and manage flare-ups; Immunomodulators calm an overactive immune system; antidiarrheal; nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs); Supplements like vitamins and probiotics.
  • GvHD graft-versus-host disease
  • GvHD includes acute graft-versus-host disease (aGvHD); and chronic graft-versus-host disease (cGvHD).
  • Psoriasis is a chronic skin disorder that refers to a skin condition that does not go away. People with psoriasis have thick pink or red patches of skin covered with white or silvery scales. Thick, scaly patches are called plaques. Psoriasis usually starts in early adulthood, but it can start later. Besides red, scaly patches, symptoms of psoriasis include itchy, cracked, dry skin, scaly scalp, sore skin, pitted nails, cracked or brittle nails, and joint pain.
  • Therapies that can be used in combination with the pharmaceutical composition of the present invention include, for example: steroid creams, moisturizers for dry skin, anthralins (drugs that slow skin cell production), medicated lotions for improving scalp psoriasis. , shampoos and bath solutions, vitamin D3 ointments, vitamin A or retinoid creams, phototherapy, PUVA (a treatment that combines a drug called psoralen with a special form of sun exposure), methotrexate, retinoids, cyclosporine, and/or immunotherapy. , but is not limited thereto.
  • Sjogren's syndrome is a lifelong autoimmune disease that reduces the amount of water produced by the sweat glands of the eyes and mouth. It is named after Henrik Sjögren, a Swedish ophthalmologist who first described the condition. Dry mouth and dry eyes are the main symptoms, but most people with these problems do not have Sjögren's syndrome. Dry mouth is also called xerostomia.
  • Sjogren's syndrome There are two forms of Sjogren's syndrome: primary Sjogren's syndrome, which develops on its own and not due to another medical condition, and secondary Sjogren's syndrome, which develops in addition to other autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, lupus, and psoriatic arthritis. .
  • Treatments that can be used in combination with the pharmaceutical composition of the present invention include, for example, dry eye treatment (e.g., artificial tears, prescription eye drops, punctum plugs, surgery, autologous serum eye drops), dry mouth treatment (eg saliva producing drugs), treatment for joint or organ problems (eg pain relievers, antirheumatic drugs, immunosuppressive drugs, steroids, antifungal drugs and treatments for vaginal dryness).
  • dry eye treatment e.g., artificial tears, prescription eye drops, punctum plugs, surgery, autologous serum eye drops
  • dry mouth treatment eg saliva producing drugs
  • treatment for joint or organ problems eg pain relievers, antirheumatic drugs, immunosuppressive drugs, steroids, antifungal drugs and treatments for vaginal dryness.
  • MG Myasthenia gravis
  • MG is a lifelong neuromuscular disease.
  • Myasthenia gravis affects about 20 out of 100,000 people. Experts estimate that between 36,000 and 60,000 Americans suffer from this neuromuscular disease. The actual number of people affected may be higher, as some of the milder patients may not know they have the disease. MG mainly affects women between the ages of 20 and 40 and men between the ages of 50 and 80. About 1 in 10 cases of MG occur in teenagers (adolescent MG). The disease can affect people of all ages but is rare in children.
  • Autoimmune MG is the most common form of this neuromuscular disease. Autoimmune MGs include:
  • Oculotype The muscles that move the eyes and eyelids become weak. Your eyelids may droop or you may not be able to open your eyes. Some people have double vision. Weakness of vision is often the first sign of MG. Nearly half of people with ocular MG evolve systemic forms within 2 years of first symptoms.
  • Muscle weakness affects different body parts, such as the eyes, face, neck, arms, legs, and neck. Difficulty speaking or swallowing, raising arms above head, rising from a sitting position, walking long distances, or climbing stairs may be difficult.
  • Therapies that can be used in combination with the pharmaceutical compositions of the present invention include, for example, drugs, monoclonal antibodies, IV immunoglobulin (IVIG), plasma exchange (plasma exchange), and/or surgery.
  • IVIG IV immunoglobulin
  • plasma exchange plasma exchange
  • Example 1 Screening of anti-CD40L steppin A protein variants in phage display libraries
  • the CD40L binding stephin A protein variants of the present disclosure (hereinafter referred to as anti-CD40L stephin A protein variants) were identified by screening from a library of stephin A protein variants having two random loop sequences, each loop of stephin A. It is displayed in a constant Stephin A protein variant framework framework based on its amino acid sequence and is about 9 amino acids in length. Such screening procedures are well known in the art (see Tiede et al. Protein Eng Des Sel. 2014. 27(5): 145-155 and Hughes et al. Sci Signal. 2018. 10(505): eaaj2005).
  • suspensions of phage expressing the steppin A protein variant were incubated with human CD40L (ACROBiosystems, CDL-H82Q8) or mouse CD40L (ACROBiosystems, CDL-M5248) as required.
  • CD40L was biotinylated and captured alternately on streptavidin and neutravidin beads, otherwise CD40L was passively absorbed to the surface.
  • unbound phage particles were washed, and bound phages were eluted after washing. Elution of the bound phage was performed by incubating the antigen in a low pH solution and then exposing it to a high pH solution and trypsin.
  • the eluted phage particles were used to infect E. coli, and the infected bacteria were cultured under conditions suitable for replication of the bacteriophage. After the bacteriophage particles are released from these infected bacteria, the phage particles are allowed to bind to the target antigen, and the bound phage particles are eluted.
  • the cycle of allowing the eluted phage particles to grow on the bacteria and isolate the released phage particles from the infected bacteria was repeated to enrich the bacteriophage population for phage particles displaying proteins that bind to the target antigen. In this cycle, certain conditions were modified, such as increasing the number of washing steps, reducing the amount of antigen available, or adding blocking agents to select for phage particle display proteins that bind more strongly or specifically to the target antigen. .
  • stephin A protein variants were overexpressed from a phagemid vector, bacterial cells were lysed, and the lysate was used as a substrate in ELISA.
  • human CD40L is immobilized to plates, lysates are added, and a detection antibody specific for the 6xMyc tag expressed on the candidate stephin A protein variant is used to detect the amount of CD40L bound stephin A protein variants on each plate. quantity was measured.
  • Phagemid vectors encoding steppin A protein variants with the highest human CD40L-binding activity were sequenced to confirm the DNA sequences of candidate clones for further development.
  • the loop 2 and loop 4 amino acid sequences of each of these candidate clones are shown in Tables 1 and 2, respectively.
  • Example 2 Screening of anti-CD40L Stepin A protein variants by direct ELISA
  • a binding ELISA was performed to determine the affinity of the different monomeric DAW01 clones for hCD40L. Specifically, the plate was coated with 5 ⁇ g/ml of hCD40L antigen and incubated overnight at 4°C. Plates were washed twice with 150 ⁇ l of wash buffer (PBS, Tween 20 0.1%) in a plate washer and saturated with PBS with casein 5% (Sigma) at room temperature (25 ⁇ 1° C.) for 90 minutes. For binding, each DAW01 clone and rhCD40 Fc were added to the plate from 1 ⁇ M, 1/3 to 300 nM, 1/3, respectively. Plates were washed three times in the same manner as described above.
  • the plate was then washed 3 times as previously described, and substrate (TMB, Pierce Thermo-Scientific) was added to the plate for 10 minutes. The reaction was stopped using an acidic solution and the plate was read at 450 - 630 nm. The results are as shown in Figure 1, and the EC50 values range from 0.67 to 60 nM.
  • Example 3 Screening for anti-CD40L steppin A protein variants in hCD40L-HEK293 cells by flow cytometry
  • hCD40L-HEK-293 cells (Crown Biosciences, C2041) were collected by centrifugation at 300 rpm for 5 minutes. The cells were resuspended in PBS and 200,000 cells were dispensed per well of a round bottom 96 well plate. Cells were washed with PBS.
  • Stepin A protein variants and controls were diluted in duplicate in a staining buffer containing 1% BSA, 0.01% Sodium Azide (NaN3), and 2 mM EDTA in DPBS, added to cells, and stained for about 60 minutes at 4 ⁇ 1 ° C. .
  • Cells were washed and anti-cystatin A (R&D, AF1407) secondary antibody diluted to 0.2 mg/ml in staining buffer was added to the cells and stained at 4 ⁇ 1° C. for about 45 minutes.
  • the cells were washed again, and A488 antigoat (ThermoFisher, A21467) detection antibody was diluted 1:500 in staining buffer and added to the cells for staining (about 30 minutes at 4 ⁇ 1° C.). Finally, cells were washed and live and dead cells were stained using L/D stain Zombie Yellow (Biolegend, 423103) diluted in staining buffer at 4 ⁇ 1°C for 10 minutes.
  • HEK-293 negative cells were also used in the experiment to assess non-specific binding (light grey).
  • HuCD40L HEK293 cells and control HEK293 cells were evaluated for expression of hCD40L using BV711 mAb (clone 24-31). The result is as shown in FIG. 3 .
  • Binding of clone 230 (SEQ ID NO: 249) to hCD40L-HEK293 cells was evaluated at different doses ranging from 0.7 to 500 nM. As shown in Figure 4, the binding of clone 230 was dose-dependent between 0.7-55 nM and reached saturation above 55 nM.
  • HEK-Blue CD40 expressing cells can detect bioactive CD40L through activation of NF- ⁇ B after CD40 stimulation. Activation of the NF- ⁇ B pathway can be determined by measuring the level of secreted embryonic alkaline phosphatase (SEAP) in the cell medium. Assays were performed according to the manufacturer's instructions.
  • SEAP embryonic alkaline phosphatase
  • test medium DMEM High Glucose with Blasticin and Zeocin
  • 20,000 cells were dispensed per well of a 96-well flat bottom tissue culture plate and incubated overnight at 37°C and 5% CO2.
  • 50 ⁇ l of the test medium was removed from the cells and the cells were treated with the addition of 50 ⁇ l 4X dilution of the test group steppin A protein variant or control containing hCD40L (final concentration 0.8 nM). Plates were then incubated for 22 hours at 37°C, 5% CO2.
  • Stephin A protein variants can be designed to assemble into stable multimeric oligomers for increased avidity.
  • the resulting steppin A protein variant is an In Line Fusion (ILF) protein, and as shown in FIG. 6, various linkers (rigid linkers, e.g., SEQ ID NOs: 508, 510-514; or flexible linkers) Reference Example: SEQ ID NOs: 509, 515-518).
  • IVF In Line Fusion
  • Stepin A protein variants (monomer, dimer, trimer) was investigated as described above. The results were as shown in FIG. 7 and showed that the ILF protein had the same or greater binding affinity for the target ligand than the monomeric form. Further analysis of this binding by flow cytometry ( FIG. 8 ) showed that the Stephin A protein variants (monomeric, dimeric and trimeric forms) bind to hCD40L at similar levels to anti-CD40L antibodies.
  • Example 6 Characterization of In Line Fusion (ILF) Stephin A Protein Variants in Trimeric or Tetrameric Configurations Using HSA-Binding Stephin A Protein Variants
  • stephin A protein variants were designed to assemble into stable multimeric oligomers.
  • the resulting Stepin A protein variant is an In Line Fusion (ILF) protein, which has various linkers (see rigid linkers, e.g., SEQ ID NOs: 508, 510-514; or flexible linkers, see e.g., sequences Numbers: 509, 515-518) may be trimers or tetramers.
  • ILF In Line Fusion
  • Stepin A protein variants were tested: Clone-230 DT (trimer with rigid linker), Clone-230 XT75 (trimer with rigid linker and HSA Stepin A protein variant), Clone-230 DS (rigid linker), and Clone-230 XT76 (tetramer with rigid linker and HSA stepin A protein variant).
  • CD40L competition ELISA was performed. Briefly, plates were coated with 1 ⁇ g/ml of rhCD40 Fc and incubated overnight at 4°C. The plate was washed twice with 150 ⁇ l of wash buffer (PBS, Tween 20 0.1%) with a plate washer and saturated with PBS with casein 5% (Sigma) at room temperature (25 ⁇ 1° C.) for 90 minutes. 2x EC80 (1 nM) of human CD40L was combined with the anti-hCD40L monoclonal antibody starting at 10 nM or each test ILF clone. The resulting solution was then mixed and added to the plate. Plates were washed 3 times as previously described.
  • Biotinylated anti-hCD40L polyclonal antibody was then diluted in dilution buffer and added to the plate. Plates were incubated for 90 minutes at room temperature (25 ⁇ 1° C.). The plate was then washed. PolyHRP-streptavidin was then diluted in dilution buffer and added to the plate. Plates were incubated for an additional 90 minutes at room temperature (25 ⁇ 1° C.). Plates were washed 3 times as previously described and substrate (TMB, Pierce Thermo-Scientific) was added to the plate for 10 minutes. The reaction was stopped using an acidic solution and the final percent inhibition was calculated by reading the plate at 450 - 630 nm. The results are shown in FIG. 10 .
  • the CD40L inhibitory activity of the In Line Fusion (ILF) fusion protein containing the stephin A protein variant was evaluated by HEK-Blue assay in the same manner as described in Example 4. The result is as shown in FIG. 11 .
  • hCD40L is used to capture bispecific stephin A protein variants and an anti-HSA antibody is used to detect stephin A protein variants, i.e., to detect HSA-bound stephin A protein variants.
  • an anti-HSA antibody is used to detect stephin A protein variants, i.e., to detect HSA-bound stephin A protein variants.
  • 96 well plates were coated with carbonate buffer containing 0.5 mg/ml of human CD40L. After saturation with 5% casein/PBS buffer, the plates were washed and incubated with dilutions of stephin A protein variants or controls with HSA at a final concentration of 10 ⁇ M for 90 minutes.
  • Example 7 Therapeutic effect of anti-CD40L steppin A protein variants on haploid genotypic GVHD animal models
  • 192 healthy female C57BL/6 mice (6 weeks old) were purchased from Janvier (France) and used for splenocyte extraction for induction of GVHD.
  • Twelve healthy female B6D2F1 mice (6 weeks old) were purchased from Charles River and used for GVHD induction (syngeneic control).
  • 70 healthy female B6D2F1 mice (6 weeks old) were purchased from Charles River and used as donor mice.
  • Stephin A protein variants specifically binding to mouse CD40L were expressed in the form of a trimeric in-line fusion protein (Table 15).
  • the spleens of C57BL/6 and B6D2F1 mice were removed, and splenocytes were extracted and prepared in HBSS buffer. Red blood cells contained in the extracted splenocytes were lysed using a red blood cell lysate (BD Pharma), and then washed and prepared.
  • 64 B6D2F1 mice (G4-G11) were iv injected with 6x10 7 cells/head of splenocytes isolated from the spleen of C57BL/6.
  • Three B6D2F1 (G3) were injected iv with splenocytes isolated from the spleens of C57BL/6 mice at 6x10 7 cells/head.
  • Three B6D2F1 (G2) mice were injected iv with splenocytes isolated from the spleen of the same B6D2F1 mouse at 6x10 7 cells/head (FIG. 13).
  • the animals in this experiment were randomly assigned based on individual body weight for the experiment, and it was confirmed that there was no statistical significance by performing an analysis of variance (ANOVA) for homogeneity between groups.
  • ANOVA analysis of variance
  • the route of administration of the test substance was i.p., i.p.
  • the pH of the formulation was adjusted to 7.3 to 7.4, and the volume was 20 mL/kg.
  • the first administration of the test substance was performed 1 hour after the induction of GVHD, and the administration interval according to the substance to be administered was as follows. Except for the antibody-administered group, the stephin A protein variant-administered group was administered 6 times at 2-day intervals after inducing GVHD, and the MR-1 antibody was administered 3 times at 2-day intervals after inducing GVHD (FIG. 14, Table 16) .
  • the survival and behavior of the animals were observed daily, and clinical measures were recorded daily. Body weight and clinical scores were recorded daily. The clinical score of GVHD was visually observed through the following evaluation form, and the clinical score was evaluated by recording the sum of the observed scores. Statistical significance between each group was performed by ANOVA using GraphPad Prism. Statistical significance between each group was judged to be significant when p value ⁇ 0.05 or less.
  • the average weight change of the experimental animals was monitored throughout the study period. To confirm the change in body weight, the mean weight change (MBWC%) was compared with the change rate based on D18. The average weight change in the G1 group increased by 9.7%, and the average weight change in the G2 group increased by 15.6%. In the G3 group, the GVHD control group, the average weight change decreased by 24.4%.
  • the average weight change of the drug administration group, G4 ⁇ G11 group is as follows:
  • G4 group 1.6% increase, G5 group: 4.1% decrease, G6 group: 14.6% decrease, G7 group: 2.8% increase, G8 group: 6.4% decrease, G9 group: 9.0% decrease, G10 group: 4.4% decrease, G11 Group: With a decrease of 21.7%, the average weight change in the group administered with the steppin A protein variant was better than the G3 group.
  • the GVHD socre did not increase throughout the study period, and in the G5 to G7 groups, it started to increase from 9 to 14 days after the induction of GVHD, and on the 18th day, the end date of the experiment, the level was 0.3 to 1.1 GVHD scores between The clinical scores of the G8-G10 groups began to increase between the 7th and 10th days after inducing GVHD, and showed a GVHD score of 0.3-1.4 on the 18th day, the end of the experiment (FIG. 15).
  • the steppin A protein variant that specifically binds to CD40L of the present invention, and/or a fusion protein or conjugate comprising the same is a non-immunogenic polypeptide, capable of binding to CD40L with high affinity and specificity, and expressing CD40L and CD40L. It is useful for targeting a variety of cells known to In addition, the steppin A protein variant specifically binding to CD40L of the present invention exhibits excellent ability to inhibit CD40L activity, and thus can be usefully used for medical/pharmaceutical purposes for the prevention and treatment of various CD40L-related diseases.

Abstract

본 발명은 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체, 및/또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체는 비면역원성 폴리펩타이드로서, CD40L에 높은 친화도 및 특이도로 결합 가능하여 CD40L 및 CD40L을 발현하는 것으로 알려진 다양한 세포를 표적화 하는데 유용하다. 또한, 본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체는 뛰어난 CD40L 활성 억제 능력을 나타내어, CD40L과 관련한 다양한 질환의 예방 및 치료를 위한 의학적/약학적 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체 및 이의 용도
본 발명은 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체 및 이의 용도에 관한 것이다.
면역체계(Immune system)는 외부로부터의 침입으로부터 유기체를 보호하기 위해 구축된 다양한 세포 및 기관으로 구성되는 생물학적 네트워크를 총칭한다. 면역 시스템은 이를 구성하는 기관 및 세포가 지니고 있는 특이적인 기능 및 각 세포간의 신호전달 및 상호작용을 중심으로 작동한다. 면역 체계는 면역을 억제, 조절하는 면역 관용(tolerance)과 면역을 증진하는 면역 반응(immunity)의 면역작용이 적절한 균형을 이루어 면역 항상성(Immunological homeostatsis)을 유지한다. 면역 관용과 면역 반응은 다양한 원인으로 인해 불균형이 유도될 수 있으며, 이러한 면역의 불균형은 다양한 질병의 발생으로 이어진다. 예를 들어, 면역 관용 기작이 강해지는 경우, 암의 발생 또는 외부 감염원의 침입이 용이하게 되어 암, 감염성 질환 등을 발생시킬 수 있으며, 반대로, 면역 반응 기작이 강해지는 경우, 자가 면역질환 및 알러지성 질환과 같은 염증성 질환을 발생시킬 수 있다.
최근, 면역 체계를 구성하는 면역 세포 간 또는 표적 세포와 면역 세포 사이의 신호전달체계인 면역 시냅스에 관한 연구가 활발히 진행되었다. 면역 시냅스는 세포에서 분비되는 다양한 사이토카인 및 신호전달물질을 비롯하여, 세포 표면에 발현되는 다양한 공동자극분자 및 수용체 등에 의해 구성된다. 면역 체계의 항상성 유지에 관여하는 다양한 인자들이 보고됨에 따라 이를 표적으로 하여 면역 반응을 조절하는 면역 치료제에 관한 관심이 증대되고 있다. 지금까지 개발된 대부분의 면역 치료제는 사이토카인 또는 세포 표면 분자에 대한 항체 의약품이나, 효능 부족 또는 부작용으로 그 사용이 매우 제한된다. 최근 보다 효과적인 면역질환 치료 방법으로 T 세포, NK 세포 등의 분화된 면역 세포 또는 다양한 면역 세포로 분화가능한 줄기세포를 활용한 세포 치료제가 개발되고 있다. CAR-T 또는 CAR-NK와 같이 분화된 면역세포 기반의 세포 치료제는 자가 세포를 이용함으로 인한 높은 비용 및 제한적인 표적에 한계가 있으며, 중간엽 줄기세포는 치료 비용 대비 낮은 치료효과와 명확한 작용기전을 설명하기 어려운 한계가 있다(Blood Cancer J. 11, 69 (2021); World J Stem Cells. 2019;11(4):212-221).
한편, CD40 리간드(CD40L, 또는 CD154로도 명명됨)는 항원제시세포의 CD40에 결합하는 단백질로, 표적세포에 따라 다양한 효과를 나타낸다(The Journal of Experimental Medicine. 175 (4): 1091-101). CD40L은 대표적으로 CD40, α5β1 인테그린 및 αIIbβ3의 세 가지 결합 파트너가 있으며, CD40L은 공동자극 분자로 작용하며 T 여포 보조 세포(TFH 세포)라고 하는 T 세포의 서브셋에 특히 중요한 것으로 보고된다(Journal of Immunology. 149 (12): 3817-26). CD40L은 주로 활성화된 CD4+ T 세포에서 발현되나, 솔루블한 형태로도 발견되며, T 세포뿐만 아니라, 혈소판, 비만세포, 대식세포, 호염기구, NK 세포, B세포 및 내피 세포, 상피세포와 같은 비조혈 세포에서도 발현되는 것으로 보고된다(Cellular and Molecular Life Sciences. 58 (1): 4-43). CD40L은 종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 (tumor necrosis factor(TNF) superfamily)로 분류되며, co-stimulatory factor로서 CD40/CD40L 신호전달은 T 세포의 활성 및 T 세포 매개 B 세포의 분화 및 활성화에 중요한 역할을 수행한다. 뿐만 아니라, CD40/CD40L 신호전달의 자극은 같은 co-stimulatory factor인 OX40/OX40L의 발현 및 신호전달 기전조절에서 중요한 역할을 수행하며, 이를 통해 T 세포의 생존과 기억 T 세포(memory T cell)의 발달에 관여한다.
다양한 면역 항상성 관련 질환에 있어서, CD40L은 항원제시세포 (APC)와 T cell의 상호작용에 중요한 역할을 수행하는 것으로 보고된다. 특히 CD40L/CD40의 상호작용은 T세포 및 B세포의 활성화가 병리에 주요한 영향을 미치는 자가면역질환 또는 염증성 질환의 병원성 인자로 작용한다. 구체적으로, 제1형 당뇨, 갑상선염, 건선, 루푸스 (Systemic Lupus Erythematosus; SLE), 류마티스 관절염 (Rheumatoid Arthritis; RA), 다발성 경화증 (Multiple Sclerosis; MS) 등과 같은 다양한 질환의 병원성 인자이다. 이러한 질환의 치료를 위해 CD40L을 표적으로 하는 다양한 화합물 또는 항체가 개발되고 있다(Semin Immunol. 2009;21(5):293-300; Advanced Drug Delivery Reviews Volume 141, 15 February 2019, Pages 92-103).
Avacta 사(Avacta Life Sciences Limited)에 의해 개발된 Affimer®는 생체 내 단백질인 스테핀 A 단백질을 기반으로 엔지니어링하여 제조된 작고 안정한 단백질 분자이다. Affimer®는 무작위 서열을 갖는 2개의 짧은 펩타이드 서열 및 N-말단 서열을 포함하며, 이를 통해 단일클론 항체와 유사한 방식으로 표적 물질에 높은 친화도 및 특이도로 결합할 수 있다. Affimer®는 자유 펩타이드 라이브러리에 비해 현저히 향상된 결합 친화도 및 특이성을 나타내며, 항체에 비해 현저히 작은 크기와 뛰어난 안정성을 나타내어, 항체를 대체할 차세대 대체 의약 플랫폼으로서 매우 높은 관심을 받고 있다(미국 특허 제9447170호, 제8853131호 등).
이러한 배경기술 아래에서, 본 발명자들은 자연 발생 단백질인 스테핀 단백질을 기반으로 엔지니어링하여, CD40L에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 개발하고자 예의 노력한 결과, CD40L에 뛰어난 친화도 및 특이도로 결합가능한 스테핀 A 단백질(Stefin A protein) 변이체를 발명하였으며, 특히 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체가 CD40L에 대한 뛰어난 억제활성을 나타내는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체 및 이들의 용도를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체를 포함하는 융합단백질을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체를 포함하는 접합체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체, 이를 포함하는 융합단백질 또는 접합체를 암호화하는 핵산 및 상기 핵산을 포함하는 벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 핵산 및/또는 벡터가 도입된 유전자 조작된 세포 및 이의 용도를 제공하는 데 있다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은, CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant)를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant)를 포함하는 융합단백질을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant)를 포함하는 접합체(conjugate)을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant) 또는 이를 포함하는 융합단백질을 암호화하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 핵산을 포함하는 전달 비히클(delivery veihicle)을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 핵산이 도입된 유전자 조작된 세포를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 유전자 조작된 세포의 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant), 융합단백질 또는 접합체의 제조를 위한 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 유전자 조작된 세포를 배양하는 단계를 포함하는 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant), 융합단백질 또는 접합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant), 융합단백질, 접합체, 핵산 및/또는 전달 비히클을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant), 융합단백질, 접합체, 핵산 및/또는 전달 비히클의 약학적 조성물의 제조를 위한 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant), 융합단백질, 접합체, 핵산 및/또는 전달 비히클을 투여하는 단계를 포함하는 치료방법을 제공한다.
도 1은 인간 CD40L에 대한 단량체 클론의 직접 결합 ELISA 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 단량체 클론의 결합을 통해 HEK293 세포에서 인간 CD40L 발현을 확인한 것을 유세포 분석에 의해 나타낸 것이다.
도 3은 대조군 HEK 293 세포(아래)와 비교하여 hCD40L-HEK293 세포(위)의 hCD40L 발현을 확인한 결과이다.
도 4는 상이한 농도에서 hCD40L-HEK293 세포에 대한 클론 230(서열번호: 249)의 결합을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체의 hCD40L과 CD40의 결합 블록에 대한 용량 효과(dose effect)를 CD40L HEK-BLUE 리포터 세포 분석을 통해 나타낸 것이다.
도 6은 CD40L에 대한 결합력(avidity)을 증가시키기 위해 사용된 다양한 인 -라인 퓨전(in line fusion, ILF)을 나타낸 것이다. 각 포맷에서 1 μg (왼쪽) 및 5 μg (오른쪽)의 농도가 시험되었다. 각각 포맷은 겔 상에 표시되었다(예, 단량체, 이량체, 또는 삼량체)
도 7은 BIACORETM 검정을 사용하여 hCD40L에 대한 ILF 이량체 및 삼량체 구조를 포함하는 상이한 클론의 결합을 나타낸 것이다.
도 8은 hCD40L에 대한 ILF 이량체 및 삼량체 구조를 포함하는 상이한 클론의 결합을 유세포 분석에 의해 나타낸 것이다.
도 9는 단량체, 이량체 및 삼량체의 스테핀 A 단백질 변이체 또는 이의 ILF의 hCD40L과 CD40의 결합 블록에 대한 용량 효과(dose effect)를 CD40L HEK-BLUE 리포터 세포 분석을 통해 나타낸 것이다.
도 10은 다양한 포맷(DT, 리지드 링커를 갖는 삼량체; XT75, 리지드 링커 및 HSA 결합 스테핀 A 단백질 변이체를 갖는 삼량체; XT76, 리지드 링커 및 HSA 결합 스테핀 A 단백질 변이체를 갖는 사량체)의 클론의 결합에 대한 경쟁적 ELISA 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 다양한 포맷(DT, 리지드 링커를 갖는 삼량체; XT75, 리지드 링커 및 HSA 결합 스테핀 A 단백질 변이체를 갖는 삼량체; XT76, 리지드 링커 및 HSA 결합 스테핀 A 단백질 변이체를 갖는 사량체)의 hCD40L과 CD40의 결합 블록에 대한 용량 효과(dose effect)를 CD40L HEK-BLUE 리포터 세포 분석을 통해 나타낸 것이다.
도 12는 clone-230 XT75(3개의 clone 230 단량체 및 HSA 결합 스테핀 A 단백질 변이체(HSA AFFIMER®)를 포함하는 ILF 단백질) 및 clone-230 XT76(4개의 clone 230 단량체 및 HSA 결합 스테핀 A 단백질 변이체를 포함하는 ILF 단백질)을 사용하여, hCD40L/HSA bridging ELISAs를 수행한 결과를 나타낸 것이다. 3t0 Gly XT58은 비 hCD40L 표적화 단백질 삼량체와 및 HSA 결합 스테핀 A 단백질 변이체(HSA AFFIMER)를 포함하며 서로 리지드 링커로 연결된 ILF 단백질이다. 3t0 Gly XT59는 두 개의 비 hCD40L 표적화 단백질과 및 HSA 결합 스테핀 A 단백질 변이체(HSA AFFIMER)를 포함하며 서로 리지드 링커로 연결된 ILF 단백질이다. 도 12A는 결합된 hCD40L에 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체를 나타낸다(항-시스타틴 항체로 측정됨). 도 12B는 HSA 존재하에 결합된 hCD40L에 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체를 나타낸다(항-시스타틴 항체로 측정됨). 도 12C는 결합된 hCD40L 및 HSA에 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체를 나타낸다(항-HSA 항체로 측정됨).
도 13은 Haploidentical GVHD Mouse Model의 모식도를 나타낸 것이다.
도 14는 Haploidentical GVHD mouse model에서 항-CD40L 스테핀 A 단백질 변이체(XT54 서열번호: 729, XT55 서열번호: 730)의 투여횟수와 투여간격을 나타낸 것이다.
도 15는 Haploidentical GVHD mouse model을 이용에서 항-CD40L 스테핀 A 단백질 변이체(XT54 서열번호: 729, XT55 서열번호: 730)의 효능을 몸무게 변화(위)와 GVHD clinical score로(아래) 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 용어, “단백질” 또는 “폴리펩타이드”는 모든 길이의 아미노산 중합체를 의미한다. 상기 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비아미노산에 의해 중단될 수 있다. 또한 상기 단백질 또는 폴리펩타이드는 자연적으로 또는 개입에 의해 변형된 아미노산 폴리머를 포함한다. 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 표지 성분과의 접합과 같은 임의의 다른 조작 또는 변형. 예를 들어, 아미노산의 적어도 하나의 유사체(예를 들어, 비천연 아미노산을 포함함) 뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 변형을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 의미로 사용된다.
대부분의 경우, 본 명세서에 기재된 아미노산 및 아미노산 서열은 단백질에서 발견되는 자연 발생 아미노산, 또는 아미노 및 카르복실기를 함유하는 아미노산의 동화 작용 또는 이화작용의 생성물, 이의 이성질체(예를 들어, D- 또는 L- 이성질체)일 수 있다.
본 명세서에서 기재된 특정 아미노산 잔기는 천연 아미노산뿐만 아니라, 이의 유사체(analogs), 유도체(derivatives) 및 동족체(congeners)를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체가 화합적 합성에 의해 생성된 경우, 시아노알라닌(cyanoalanine), 카나바닌(canavanine), 젠콜산(djenkolic acid), 노르류신(norleucine), 3-포스페린(3-phosphoserine), 호모세린(homoserine), 디하이드록시페닐알라닌(dihydroxy-phenylalanine), 5-하이드록시트립토판(5-hydroxytryptophan), 1-메틸히스티딘(1-methylhistidine), 3-메틸히스티딘(3-methylhistidine), 디아미노피멜산(diaminopimelic acid), 오르니틴(ornithine), 또는 디아미노부티르산(diaminobutyric acid)과 같은 아미노산 유사체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에 기재된 아미노산 또는 핵산 서열에서, 동일한(identical) 또는 %로 표시되는 동일성(identity)은 동일하거나 특정 백분율의 일치를 갖는 서열을 의미한다. 최대 일치를 위해 두 서열을 비교 및 정렬하는 경우 보존적 아미노산 치환은 서열 동일성의 일부로 고려하지 않을 수 있다. 본 발명에 있어서, 2개의 핵산 또는 아미노산 서열은 “실질적으로 동일”할 수 있으며, 이는 2개의 서열이 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 것을 의미할 수 있다. 일부 실시예에서 적어도 약 10개, 20개, 40~60개, 60~80개, 80~100개 또는 그 이상의 길이의 잔기에 걸쳐 동일성이 존재할 수 있다.
본 명세서에 기재된 단백질 또는 폴리펩타이드, 예를 들어, 스테핀 A 단백질 변이체, 융합단백질, 융합단백질의 구성은 이와 관련하여 기재된 아미노산 서열뿐만 아니라, 보존적 치환을 통해 상기 아미노산 서열의 일부가 치환된 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 “보존적 치환”이란 1개 이상의 아미노산을 해당 폴리펩타이드의 생물학적 또는 생화학적 기능의 손실을 야기하지 않는 유사한 생화학적 특성을 갖는 아미노산으로 치환하는 것을 포함하는 폴리펩타이드의 변형을 의미한다. “보존적 아미노산 치환”은 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체시키는 치환이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 부류는 해당 기술분야에 규정되어 있으며, 잘 알려져 있다. 이들 부류는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 대전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 글리신, 아스파라진, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비-극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 일반적으로 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드, 단백질의 서열에서의 보존적 치환은 이들의 기능의 손실을 야기하지 않는다. 예를 들어 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 변이체는 이의 보존적 치환에 의해 CD40L과의 결합을 폐지하지 않는다. 이러한 보존적 치환을 확인하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
"단리된(isolated)" 단백질, 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포 또는 조성물은 자연에서 발견되지 않는 형태인 단백질, 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포 또는 조성물이다. 단리된 단백질, 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포 또는 조성물은 더 이상 자연에서 발견되는 형태가 아닌 정도로 정제된 것들을 포함한다. 예를 들어, 단리된 단백질, 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포 또는 조성물은 실질적으로 순수하다. 물질이 적어도 50% 순수(예, 오염물질 없음), 적어도 90% 순수, 적어도 95% 순수, 적어도 98% 순수, 또는 적어도 99% 순수한 경우 물질은 실질적으로 순수한 것으로 간주된다.“CD40L(Cluster of Differentiation 40 ligand)”는 인간의 경우, CD40L 유전자에 의해 암호화되는 단백질로, CD40L은 CD40/TNFRSF5에 대한 리간드로 작용하고, T 세포 증식 및 사이토카인의 생산을 공동자극한다. T 세포에 대한 교차 연결은 TCR/CD3 ligation 및 CD28 공동자극과 함께, IL4 및 IL10의 생산을 향상시키는 공동자극 신호를 생성한다. CD40L은 NK-kappa-B의 활성화를 유도하고, T 세포에서 kinase MAPK8 및 PAK2의 활성화를 유도하며, CD28의 isoform3의 티로신 인산화를 유도한다. 또한, CD40L은 IL4의 존재 아래에서 IGE의 생산뿐만 아니라 공동자극이 없는 경우, B-세포 증식을 매개한다. B세포는 TFH 세포에 항원을 제시할 수 있으며, 활성화된 TFH 세포가 B 세포가 제시한 펩타이드를 인식하면 T 세포의 CD40L이 B 세포의 CD40에 결합하여 B 세포 활성화를 유발한다. T 세포는 또한 B 세포에 직접적으로 영향을 미치는 IL-4를 생성합니다. 이 자극의 결과로 B 세포는 급속한 세포 분열을 거쳐 항체 이소형 전환 및 친화성 성숙뿐만 아니라 형질 세포 및 기억 B 세포로의 분화가 일어나는 배 중심을 형성할 수 있다. 최종 결과는 항원 표적에 대한 특정 항체를 대량 생산할 수 있는 B 세포이다. 이러한 효과에 대한 초기 증거는 CD40 또는 CD154 결핍 마우스에서 클래스 전환 또는 배 중심 형성이 거의 없고 면역 반응이 심각하게 억제된다는 것이다. CD40L은 또한 면역글로불린의 클래스 전환에 관여한다.
CD40L(예: 활성화된 혈소판에서)에 의한 내피 세포의 활성화는 반응성 산소종 생산, 케모카인 및 사이토카인 생산, E-셀렉틴, ICAM-1 및 VCAM-1과 같은 부착 분자의 발현을 유도한다. 내피 세포에서의 이러한 염증 반응은 병변으로의 백혈구 모집을 촉진하고 잠재적으로 죽종형성을 촉진할 수 있다. CD40L은 또한 죽상동맥경화성 불안정성에 대한 잠재적인 바이오마커인 것으로 보고되었다.
상기 CD40L은 일반적으로 막 결합 단백질로 간주되지만 완전한 생물학적 활성을 갖는 천연 단백질 분해 절단 15-18-kDa 가용성 형태의 CD40L도 보고된 바 있다. CD40L은 B 세포 및 수지상 세포의 수용체 CD40에 결합하여 배 중심 형성, 이소타입 클래스 전환 및 면역글로불린 항체 생산에 필요한 중요한 헬퍼 T 세포 신호를 제공할 수 있다. CD40L의 결함은 고-IgM(HIGM1)이 있는 X-연관 면역결핍, IgM 농도 증가 및 기타 모든 이소형의 감소를 특징으로 하는 면역글로불린 스위치 결함의 원인이다. CD40L 녹아웃 마우스는 T 세포 의존성 항원에 대한 2차 항체 반응을 일으키지 못하고 이소형 클래스 전환을 겪는다. CD40L은 또한 신호를 다시 T 세포로 전송하여 단기 T 세포 증식을 유발할 수 있다. 상피, 섬유아세포 및 평활근 세포의 증식에서 CD40L의 역할도 보고된 바 있다.
본 발명에서는 CD40L에 뛰어난 친화도 및 특이도로 결합가능한 스테핀 A 단백질(Stefin A protein) 변이체를 발명하였으며, 특히 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체가 CD40L에 대한 뛰어난 억제활성을 나타내는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant)에 관한 것이다.
CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant)
본 발명의 용어, “스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant)”는 스테핀 A 단백질의 스캐폴드로, 스테핀 A 단백질, 예를 들어 포유동물, 보다 바람직하게는 인간 유래의 스테핀 A 단백질로부터 유래된 서열을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 “스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant)”는 “스테핀 A 폴리펩타이드 변이체” 또는 “AFFIMER® 단백질”과 실질적으로 동일한 의미에서 상호 호환적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체를 개발하였으며, 상기 “CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체”는 “항-CD40L 스테핀 A 단백질 변이체”, “항-CD40L Affimer”와 실질적으로 동일한 의미에서 상호 호환적으로 사용될 수 있다.
“스테핀 단백질(Stefin Protein)” 또는 “스테핀 폴리펩타이드(Stefin polypeptides)” 는 다수의 시스타틴-유사 서열을 포함하는 단백질을 포괄하는 과인 시스타틴 슈퍼패밀리에서 단백질의 서브그룹을 포함한다. 시스타틴 패밀리의 스테핀 하위 그룹은 상대적으로 작은(약 100개 아미노산) 단일 도메인 단백질을 포함한다. 이들은 번역 후 변형이 일어나지 않으며, 이황화 결합이 적어 다양한 세포 외 및 세포 내 환경에서 동일한 접힘 구조를 나타낸다. 스테핀 A 단백질은 98개 아미노산으로 구성된 단일체, 단일 사슬, 단일 도메인 단백질로 보고되었다. Avacta 사는 Stefin A의 구조를 기반으로, 돌연변이를 통한 단백질 엔지니어링 기법으로 Affimer® 플랫폼을 개발하였다. 시스타틴의 유일하게 알려진 생물학적 활성은 카텝신 활성의 억제이며, 이는 조작된 단백질의 잔류 생물학적 활성에 대한 철저한 테스트를 허용한다.
본 발명의 용어, “스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant)”는 상시 스테핀 단백질의 조작된(engineered) 변이체로서, 작고 매우 안정적인 단백질을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체는 항체와 유사한 방식으로 표적 단백질에 높은 친화도 및 특이도로 결합할 수 있도록 하는 무작위 서열의 2개 펩타이드 루프 및 N-말단 서열을 제시할 수 있다. 스테핀 A 단백질 스캐폴드에 의한 두 펩타이드의 안정화는 펩타이드가 취할 수 있는 가능한 형테를 제한하여, 자유 펩타이드 라이브러리에 비해 결합 친화도와 특이성을 증가시킨다. 이러한 조작된 비항체 결합 단백질은 다양한 응용 분야에서, 단일클론항체의 분자인식 특성을 모방하도록 설계되었다. 스테핀 A 단백질 서열의 다른 부분에 대한 추가적 변형이 수행될 수 있으며, 이를 통해 온도, pH에 대한 안정성 증가 등의 특성이 개선될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 예를 들어, 인간 스테핀 A 단백질과 같은 스테핀 A 단백질 야생형 서열과 실질적으로 동일성을 공유하는 스테핀 A 단백질로부터 유래된 서열을 포함할 수 있다. 특히, 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체는 인간 스테핀 A에 상응하는 서열에 대해 적어도, 25%, 35%, 45%, 55% 또는 60%의 동일성(identity), 예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 94%, 적어도 95%의 동일성을 가질 수 있다. 위와 같은 변형은 스캐폴드가 원하는 표적(예, CD40L)에 결합하는 능력에 부정적 영향을 미치지 않으며, 예를 들어 야생형 스테핀 A가 소유하지만 본원에 기술된 돌연변이 변화에서 폐지되는 것과 같은 생물학적 기능을 복원하거나 생성하지 않을 수 있다. 이와 같은 스테핀 A 단백질 변이체를 활용한 표적 단백질 특이적 결합 플랫폼은 미국 특허 제9447170호, 제8853131호 등에 상세히 개시되어 있다.
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 스테핀 A 단백질의 엔지니어링을 통해 표적 단백질인 CD40L에 높은 친화도 및 특이도로 결합가능한 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체는 CD40L에 특이적으로 결합하여, CD40L의 활성을 감소 또는 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어, “CD40L” 또는 “CD40 리간드”는 이의 수용체인 CD40에 결합하는 단백질을 의미하며, “CD154”로도 명명된다. CD40L은 TNF-연관 활성화 단백질(TNF-Related Activation Protein), TRAP, 종양 괴사 인자(리간드) 슈퍼패밀리 멤버(Tumor Necrosis Factor (Ligand) Superfamily Member), T-B 세포 활성화 분자(T-B Cell-Activating Molecule), CD40 항원 리간드(CD40 Antigen Ligand), T 세포 항원 Gp39(T- Cell Antigen Gp39), TNFSF5, HCD40L, CD154, Gp39, 종양 괴사 인자(리간드) 슈퍼패밀리, Member 5 (Hyper-IgM Syndrome), 종양 괴사 인자(리간드) 슈퍼패밀리, Hyper-IgM Syndrome, CD154, CD40LG, HIGM1, T-BAM, IMD3, IGM, 및 CD40-L 등과 실질적으로 동일한 의미에서 상호 호환적으로 사용될 수 있다. 인간 CD40L 아미노산 및 핵산 서열은 GenBank, UniProt 및 Swiss-Prot와 같은 공개 데이터베이스에서 찾을 수 있다. 예를 들어, 인간 CD40L의 아미노산 서열은 UniProt/Swiss-Prot. Accession No. P29965에서 찾을 수 있으며, 이를 암호화하는 핵산 서열은 Accession No. NM_000074.2.에서 찾을 수 있다.
상기 CD40L은 세포에서 CD40L 전구체 단백질로부터 생성되는 임의의 천연 CD40L 및 성숙 CD40L을 포함한다. 상기 CD40L은 달리표시되지 않는 경우, 모든 생물, 바람직하게는 동물로부터 얻을 수 있는 CD40L을 포함하며, 예를 들어, 영장류(예: 인간 및 시노몰구스 원숭이) 및 설치류(예: 마우스 및 래트)와 같은 포유동물로부터 수득 가능한 CD40L을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 CD40L은 또한 돌연변이, 예를 들어 전장 야생형 CD40L의 점 돌연변이, 단편, 삽입, 결실, 및 스플라이스 변이체를 포함하는 임의의 CD40L 단백질을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 적어도 하나의 CD40L에 결합 가능한 야생형 스테핀 A 단백질 유래의 용매 접근 가능한 루프(solvent accessible loops)를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 CD40L에 대해 1x10-6 M이하의 Kd 값으로 결합 가능한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 백본 서열을 갖고, 루프 2 및 루프 4 중 어느 하나 이상이 대체 루프 서열, (Xaa)n 및 (Xaa)m으로 대체된 스테핀 A 단백질 유래의 변이체인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 식 I로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다:
[식 I]
FR1-(Xaa)n-FR2-(Xaa)m-FR3,
여기서, 상기 FR1은 MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEK TGETYGKLEA VQYKTQVX (서열번호 1)로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 서열번호 1에서 상기 X는 V 일 수 있으며;
상기 FR2는 GTNYYIKVRA GDNKYMHLKV FKSL (서열번호 2)로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 70%(예, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%)의 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 특징으로 할 수 있고;
상기 FR3는 EDLVLTGYQV DKNKDDELTG F (서열번호 3)로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 70%(예, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%)의 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며; 및
Xaa는 각각의 경우 개별적으로 임의의 아미노산 잔기이며; n 및 m은 각각 독립적으로 3~20의 정수임.
본 발명에 있어서, (Xaa)n 및 (Xaa)m은 각각 독립적으로 3~20개의 임의의 아미노산 서열인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 FR1은 서열번호 1과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 98%의 상동성(homology)을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 FR1은 서열번호 1과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 98%의 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 FR2는 서열번호 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 98%의 상동성(homology)을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 FR2은 서열번호 2과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 98%의 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 FR3은 서열번호 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 98%의 상동성(homology)을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 FR3은 서열번호 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 98%의 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 식 II(서열번호 4)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다:
[식 II]
MIP-Xaa1-GLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVV-(Xaa)n-Xaa2-TNYYIKVRAGDNKYMHLKVF-Xaa3-Xaa4-Xaa5-(Xaa)m-Xaa6-D-Xaa7-VLTGYQVDKNKDDELTGF(서열번호 4),
여기서, Xaa는 각각의 경우 개별적으로 임의의 아미노산 잔기이며; n 및 m은 각각 독립적으로 3~20의 정수임.
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 하기 서열번호 5로 표시되는 아미노산과 적어도 90%(예, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다:
MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVD-(Xaa)n- GTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSL-(Xaa)m-EDLVLTGYQVDKNKDDELTGF(서열번호 5),
여기서, Xaa는 각각의 경우 개별적으로 임의의 아미노산 잔기이며; n 및 m은 각각 독립적으로 3~20의 정수임.
본 발명에 있어서, 상기 Xaa1은 Gly, Ala, Val, Arg, Lys, Asp 또는 Glu, 바람직하게는 Gly, Ala, Arg 또는 Lys, 더욱 바람직하게는 Gly 또는 Arg인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 Xaa2는 Gly, Ala, Val, Ser 또는 Thr, 바람직하게는 Gly 또는 Ser인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 Xaa3는 Arg, Lys, Asn, Gln, Ser 또는 Thr, 바람직하게는 Arg, Lys, Asn 또는 Gln, 더욱 바람직하게는 Lys 또는 Asn인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 Xaa4는 Gly, Ala, Val, Ser 또는 Thr, 바람직하게는 Gly 또는 Ser인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 Xaa5는 Ala, Val, Ile, Leu, Gly 또는 Pro, 바람직하게는 Ile, Leu 또는 Pro, 더욱 바람직하게는 Leu 또는 Pro인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 Xaa6은 Gly, Ala, Val, Asp 또는 Glu, 바람직하게는 Ala, Val, Asp 또는 Glu, 더욱 바람직하게는 Ala 또는 Glu인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 Xaa7는 Ala, Val, Ile, Leu, Arg 또는 Lys, 바람직하게는 Ile, Leu 또는 Arg, 더욱 바람직하게는 Leu 또는 Arg인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, n은 3 내지 15, 3 내지 12, 3 내지 9, 3 내지 7, 5 내지 7, 5 내지 9, 5 내지 12, 5 내지 15, 7 내지 12 또는 7 내지 9의 정수인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, m은 3 내지 15, 3 내지 12, 3 내지 9, 3 내지 7, 5 내지 7, 5 내지 9, 5 내지 12, 5 내지 15, 7 내지 12 또는 7 내지 9의 정수인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 Xaa는 각각 독립적으로 원핵 또는 진핵 세포에서 발현 시, 폴리펩타이드에 첨가될 수 있는 아미노산, 바람직하게는 20종의 자연 발생 아미노산 중 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 서열 및 식에 있어서, 상기 (Xaa)n은 서열번호 6 내지 125로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열번호 6 내지 125의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 상동성(homology)을 갖는 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 (Xaa)n은 서열번호 6 내지 125 로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열번호 6 내지 125로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 동일성(identity)을 갖는 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
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본 발명의 서열 및 식에 있어서, 상기 (Xaa)m은 서열번호 126 내지 245 로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열번호 126 내지 245로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 상동성(homology)을 갖는 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 (Xaa)m은 서열번호 126 내지 245 로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열번호 126 내지 245로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 동일성(identity)을 갖는 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
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본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 서열번호 246 내지 365로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 서열번호 246 내지 365로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 동일성(identity)을 갖는 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
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CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant)를 암호화하는 핵산
본 발명의 용어, “핵산”은 임의의 길이의 폴리뉴클레오타이드로, DNA, RNA 또는 DNA 및 RNA 조합을 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 핵산은 디옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드 뿐만 아니라 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기, 및/또는 이의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라아제에 의해 혼입될 수 있는 임의의 기질인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 핵산은 RNA, DNA, TNA(Threose nucleic acids), GNA(glycol nucleic acids), PNA(peptide nucleic acids), LNA(locked nucleic acids, 예를 들어, β- D-ribo 배열을 갖는 LNA, a-L-ribo 배열을 갖는 a-LNA(LNA의 부분입체이성질체), 2 '-amino 관능화를 갖는 2'-아미노-LNA 또는 2'-amino- a-LNA), ENA(ethylene nucleic acid), CeNA(cyclohexenyl nucleic acids) 또는 이의 하이브리드 또는 조합일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, “암호화하는 핵산”은 특정 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 의미하는 것이다. 당업계에서 특정 단백질 또는 폴리펩타이드의 서열이 공개된 경우, 이를 암호화하는 핵산을 설계 도는 도출하는 방법이 잘 알려져 있다.
따라서, 본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant)를 암호화하는 핵산은 상기한 “CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant)”에 관한 기재로부터 쉽게 이해될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant)는 서열번호 366 내지 485로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 동일성(identity)을 갖는 서열을 포함하는 핵산에 의해 암호화되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant)는 서열번호 366 내지 485로부터 선택된 핵산 서열에 혼성화하는 암호화 서열을 포함하는 핵산에 의해 암호화되는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 혼성화는 예를 들어, 45℃에서 6X 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC)의 존재에서 혼성화 후 65℃에서 0.2X SSC로 세척조건에서 혼성화 되는 것을 특징으로 할 수 있다.
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본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 상기 기재된 루프 2 및 루프 4의 특징 이외에도 명세서에 기재된 스테핀 A 단백질 또는 이의 변이체 서열에 대한 일부 결실 또는 추가(예를 들어, 야생형 스테핀 A 단백질 대비 약 10개의 아미노산의 추가 또는 결실)를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 인간 CD40L에 대해 약 1μM이하, 약 100 nM 이하, 약 40 nM 이하, 약 20 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 1 nM 이하, 약 0.1 nM 이하의 해리 상수(KD)를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 BIACORE™ assay와 같은 수단에 의해 측정할 때, 인간 CD40L에 대해 적어도 약 10-3 s-1, 10-4 s-1, 또는 10-5 s-1, 10-6s-1 또는 이들 중 어느 하나보다 느린 Koff(off-rate constant) 값을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 BIACORE™ assay와 같은 수단에 의해 측정할 때, 인간 CD40L에 대해 적어도 약 103M-1s-1, 104 M-1s-1, 105 M-1s-1, 106M-1s-1 또는 이들 중 어느 하나보다 빠른 Kon(association constant) 값을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 경쟁적 결합 검정(competitive binding assay)에서 인간 CD40L에 대해 약 1μM이하, 약 100 nM 이하, 약 40 nM 이하, 약 20 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 1 nM 이하, 약 0.1 nM 이하의 IC50값을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 약 65℃ 이상, 약 70℃ 이상, 약 75℃ 이상, 약 80℃ 이상, 또는 약 85℃ 이상, 약 65℃ 이상의 용융온도(Tm, 접힘 상태 및 비접힘 상태가 동일한 온도)를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 접힘 상태 및 비접힘 상태의 단백질의 상대적 비율은 당업계에 알려진 다양한 방법을 통해 측정될 수 있다("Measuring the conformational stability of a protein" in Protein structure: A practical approach 2: 299-321).
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 다중체를 형성하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는, 이중체, 삼중체, 사중체, 오중체 또는 그 이상의 다중체를 형성하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 다중체는 스테핀 A 단백질 변이체의 아미노산 잔기 간의 상호 작용에 의해 공유적 또는 비공유적으로 결합되어 형성될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 다중체는 스테핀 A 단백질 변이체와 융합된 융합 도메인을 통해 형성되는 융합단백질일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 다중체는 스테핀 A 단백질 변이체의 인-라인 융합에 의해 형성되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 이러한 다중체 형태의 인-라인 융합 단백질은 하기 융합 단백질에서 상세히 서술한다.
융합 단백질
본 발명은 다른 관점에서, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant)를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant)의 융합단백질의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 상기 스테핀 A 단백질 변이체의 생물학적 활성의 조절 또는 추가적인 생물학적 활성의 추가 등을 위해 하나 이상의 아미노산을 포함하는 펩타이드가 추가, 치환 및/또는 결실된 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 CD40L에 대한 결합 친화도 조절, 반감기 조절, 안정성 조절, 프로테아제에 의한 절단 조절, 용량 조절, 방출 또는 생체 이용률 조절, 정제 촉진, 탈아미드화 감소, 저장 안정성 개선 또는 투여 경로 변경을 위해 다른 단백질과 융합될 수 있다. 예를 들어, 상기 융합 단백질은 스테핀 A 단백질 변이체 외에도 프로테아제 절단서열, 반응성 작용기, 항체 결합 도메인, 단백질 발현 및 정제를 위한 융합 도메인(예, FLAG, poly-His, GST, c-myc 등), 결합 분자(예, 바이오틴 등), 또는 다른 치료용 펩타이드 또는 단백질을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 스테핀 A 단백질 변이체의 한쪽 말단 및/또는 다른 쪽 말단에 추가적인 펩타이드 서열(융합 도메인)이 융합된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어, “융합 도메인”은 본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체에 직/간접거으로 융합되어 포함될 수 있는 추가 도메인 또는 모이어티를 의미한다.
본 발명에 있어서, 예를 들어, 상기 융합 도메인은 세포로부터 분비, 또는 세포 표면에의 고정(anchor), 또는 세포 내 국소화와 같은 발현 특성의 부여; 번역 후 변형을 위한 기질 또는 기타 인식 서열 추가; 단백질-단백질 상호작용에 의해 응집되는 다량체 구조의 생성; 반감기의 연장 또는 감소; 또는 조직 국소화, 조직 배제 또는 기타 ADME 특성의 변경, 또 다른 기능을 갖는 단백질 또는 펩타이드의 추가를 위해 융합될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체의 수송 및 분비를 위해 신호 서열이 융합단백질에 포함될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체가 막 고정형 또는 세포 표면에 발현시키려는 경우, 상기 융합단백질은 막 관통 도메인 또는 세포 표면 보유 신호 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 신호 서열(신호 펩타이드 또는 리더 서열)은 스테핀 A 단백질 변이체의 N-말단에 위치할 수 있다. 상기 신호 서열은 스테핀 A 단백질 변이체를 소포체로 표적화 하며 분비할 수 있도록 기능한다. 일반적으로 상기 신호서열은 소포체로 수송된 뒤 절단될 수 있으며, 신호서열 내의 잔기에서 절단되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 신호 서열은 약 5 내지 40개의 아미노산 길이(예를 들어, 약 5 내지 약 7, 약 7 내지 약 10, 약 10 내지 약 15, 약 15 내지 약 20, 약 20 내지 약 25, 또는 약 25 내지 약 30, 약 30 내지 약 35, 또는 약 35 내지 약 40개의 아미노산 길이)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 신호 서열은 예를 들어 인간으로부터 유래된 천연 신호 펩타이드(native signal peptide)인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 신호 서열은 비-천연 신호 펩타이드인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 비-천연 신호 펩타이드는 예를들어 상응하는 천연 분비형 인간 단백질에서 유래된 신호 펩타이드에서 하나 이상의 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함하는 변이체 인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 신호 서열은 면역 글로불린(예를 들어, IgG 중쇄 또는 IgG-카파 경쇄), 사이토카인(예를 들어, IL-2 또는 CD33), 혈장 알부민, 인간 아주로시딘 전단백질 신호 서열(a human azurocidin preprotein signal sequence), 루시퍼라아제, 트립시노겐, 키모트립시노겔 또는 다른 분비형 단백질에서 유래한 신호 서열과 같은 비-igSF 단백질 패밀리로부터 유래한 신호 펩타이드 또는 이의 변이체인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 하기 표 5는 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체 또는 이의 융합 단백질의 분비를 위해 사용될 수 있는 신호 펩타이드의 예를 나열하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
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또 다른 예를 들어, 상기 융합 도메인은 융합 단밸질의 단리 및/또는 정제를 위해 융합될 수 있다. 이러한 용도를 위한 융합 도메인은 폴리히스티딘 태그, Strep II 태그, 스트렙타비딘 결합 펩타이드(SBP) 태그, 칼모듈린-결합 펩타이드(CBP) 태그, S-태그, HA 태그, c-Myc 태그, 티오레독신(thioredoxin), protein A 및 protein G와 같은 친화성 태그일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 스테핀 A 단백질 변이체와 융합 도메인을 연결하는 적어도 하나의 링커를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 “링커”는 본 발명의 융합 단백질의 제1 폴리펩타이드(예, CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체) 및 제2 폴리펩타이드(예를 들어, 또 다른 스테핀 A 단백질 변이체 또는 융합도메인)의 사이에 삽입된다.
본 발명에 있어서, 상기 링커는 구조에 따라 플렉시블 링커(flexible linker), 리지드 링커(rigid linker) 및 in vivo 절단 가능한 링커(in vivo cleavable linker)로 구분될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 링커는 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체와 기능적 도메인의 융합 이외에도, 생물학적 활성 개선, 발현 수율 증가 및 약동학적 프로파일의 개선과 같은 추가적인 기능을 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 링커는 융합 단백질의 발현, 분비 또는 각 도메인의 기능적 활성에 부정적인 영향을 미치지 않는 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서, 링커는 면역원성을 나타내지 않는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 링커는 바람직하게는 글리신 및 세린 잔기를 포함하는 GS 링커인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 글리신-세린 링커 외에도 상기 링커는 트레오닌 알라닌 잔기를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 링커는 예를 들어, 약 1~50 개의 아미노산 길이, 1-22개 아미노산 길이, 1-10개 아미노산 길이, 1-5개 아미노산 길이, 또는 1-3개 아미노산 길이인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 링커는 절단 부위를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 링커는 플렉시블 링커(flexible linker)인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 플렉시블 링커는 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체와 결합된 융합도메인이 어느 정도의 이동 또는 상호작용을을 요구할 때 사용되는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 상기 플렉시블 링커의 예는 Argos P. (1990) “An investigation of oligopeptides linking domains in protein tertiary structures 및 possible candidates for general gene fusion” J Mol Biol. 211:943-958에 기재되어 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 상기 플렉시블 링커는 융합 단백질의 유연성 및 연결된 융합 도메인의 이동성을 부여한다. 세린 또는 트레오닌의 혼입은 수용액에서 링커의 안정성을 유지시키는 것을 특징으로 할 수 있다. 가장 일반적으로 사용되는 플렉시블 링커는 주로 GS 링커로, (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n (서열번호 508)로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 서열번호 508에서 n은 1 이상의 정수로 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser의 반복 수를 조정함으로써 융합 도메인의 적절한 거리 및 상호작용을 위해 최적화될 수 있다. 상기 플렉시블 링커는 Gly 및 Ser 이외에도, Thr, Ala, Lys, Glu등의 아미노산을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 링커는 리지드 링커(rigid linker)인 것을 특징으로 할 수 있다. 플렉시블 링커는 기능성 융합 도메인을 연결하고 일정 정도의 움직임을 허용하는 이점이 있으나, 링커의 강성 부족은 발현 수율 또는 생물학적 활성과 같은 특정 융합 단백질의 실시예에서는 제한 요인으로 작용할 수 있다. 이때, 융합 단백질의 각 도메인간의 고정된 거리를 유지하고 독립적인 기능을 유지하기 위해 리지드 링커가 사용될 수 있다.
대부분의 천연 링커는 α-나선(α-helical)구조를 갖는다 α-나선 구조는 세그먼트 내의 수소결합 및 밀접하게 팩킹된 백본으로 견고하며 안정적인 구조를 이룬다. 따라서, stiff α-나선 링커는 단백질 도메인 사이의 강성(rigid) 스페이서로서 사용될 수 있다(George et al. (2002) “An analysis of protein domain linkers: their classification 및 role in protein folding” Protein Eng. 15(11):871-9). 일반적으로 리지드 링커는 α-나선 구조를 채택하거나 다수의 Pro 잔기를 포함하여 상대적으로 강성인 구조를 나타낸다. 리지드 링커는 기능성 융합 도메인을 플렉시블 링커에 비해 효율적으로 분리할 수 있다. 링커의 길이는 도메인 간의 최적 거리를 달성하기 위해 반복 수를 조정하여 쉽게 최적화할 수 있다. 결과적으로 도메인의 공간적 분리가 융합 단백질의 안정성 또는 생체 활성을 보존하는 데 중요한 경우 리지드 링커가 사용될 수 있다. 이러한 관점에서, (EAAAK)n(서열번호 509)의 서열을 갖는 알파 나선-형성 링커가 많은 융합 단백질의 구축에 일반적으로 사용되며, 다른 리지드 링커의 예로 (XP)n, 여기서 X는 임의의 아미노산이며 바람직하게는 Ala, Lys 또는 Glu인 Pro-풍부 서열이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 하기 표 6은 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체 또는 이의 융합 단백질의 분비를 위해 사용될 수 있는 링커의 예를 나열하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
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본 발명에 있어서, 융합 단백질에 사용 가능한 또 다른 링커의 예는 다음과 같으나 이에 제한되는 것은 아니다:
SerGly, GGSG (서열번호 519), GSGS (서열번호 520), GGGS (서열번호 521), S(GGS)n (서열번호 522) n은 1 내지 7임, GRA, poly(Gly), poly(Ala), GGGSGGG (서열번호 523), ESGGGGVT (서열번호 524), LESGGGGVT (서열번호 525), GRAQVT (서열번호 526), WRAQVT (서열번호 527), 및 ARGRAQVT (서열번호 528).
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체에 Fc 도메인이 융합되는 경우, 힌지 영역(hinge regions)은 링커로 간주될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 아래에서 선택되는 하나 이상의 링커 도메인을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다:
SGTTSGTTRLLSGHTCFTLTGLLGTLVTMGLLT (SEQ ID NO: 529)
SGTSPGLSAGATVGIMIGVLVGVALI (SEQ ID NO: 530)
SAPVLSAVATVGITIGVLARVALI (SEQ ID NO: 531)
SSPDLSAGTAVSIMIGVLAGMALI (SEQ ID NO: 532)
TLGGNSASYTFVSLLFSAVTLLLLC (SEQ ID NO: 533)
SGTSPGLSAGATVGIMIGVLVGVALI (SEQ ID NO: 534)
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질의 일부로 제공되는 플랭킹 폴리펩타이드 모이어티(Flanking polypeptide moiety)에 적용될 수 있는 또 다른 변형은 효소에 의한 번역 후 변형을 위한 부위로서의 서열을 하나 이상 포함하는 것이다. 이는 글리코실화, 아세틸화, 아실화, 지질-변형, 팔미토일화, 팔미테이트의 첨가, 인산화, 당지질-결합 등의 변형을 위한 도메인인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 세포 내 특정 기관 또는 위치에 국소화 되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 분비형 융합 단백질 및/또는 막 고정형 융합 단백질인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 하나 이상의 융합 도메인을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 항원 결합 단백질(도메인), 사이토카인, 반감기 연장 도메인, 성장인자, 효소, 및 세포 투과 도메인으로 구성된 군에서 선택되는 융합 도메인을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 치료용 펩타이드 또는 단백질을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 도메인은 치료용 펩타이드 또는 단백질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 “치료용 펩타이드 또는 단백질”은 특정 질환의 예방 또는 치료 효과를 갖는 임의의 펩타이드 또는 단백질을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 치료용 펩타이드 또는 단백질은 스테핀 A 단백질 변이체 (본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체와 같거나 다를 수 있음)일 수 있으며, 이외에도 당업계에 특정 질환에 대한 예방 또는 치료 효과를 갖는 것으로 보고된 펩타이드 및 단백질을 제한 없이 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 결합 도메인(또는 결합 모이어티)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질이 결합 도메인을 포함하는 경우, CD40L과 함께 하나 이상의 표적 분자에 결합 가능한 다중 특이성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 결합 도메인은 예를 들어, 스테핀 A 단백질 변이체(본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체와 같거나 다를 수 있음), 항체 또는 이의 단편, 항체 유사 물질, 항원 결합 펩타이드, 수용체의 리간드 결합 부위(예, 수용체 트랩 폴리펩타이드), 수용체-결합 리간드(예, 사이토카인, 성장인자), 엔지니어링된 T-세포 수용체, 및 효소 또는 이의 촉매 단편으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 결합 도메인은 또 다른 예를 들어, 아드넥틴/모노바디(Adnectins/monobody), 아필린(Affilins), 아피바디(Affibody), 아피틴(Affitins), 안티칼린(Anticalin), 안트리머(Atrimers), 아비머(Avimers), 바이사이클릭 펩타이드(Bicyclic peptides), C7 펩타이드, 센타이린(Centyrin), 탄수화물 결합 모듈(Carbohydrate-binding module; CBM), Cys-knots, 다르핀(Darpin), 엘-텐덤(El-tandem), 파이노머(Fynomers), 노틴(Knottin), 쿠니츠도메인(Kunitz domains), O바디(OBodies), 프로넥틴(Pronectin), ScFv, Sac7d, Sso7d, Tn3 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체에 융합되는 융합 도메인은 CD40L에 특이적으로 결합하는 동일한 또는 상이한 스테핀 A 단백질 변이체일 수 있으며, 및/또는 다른 표적에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 도메인이 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체인 경우, 본 발명의 융합 단백질에 포함되는 두 스테핀 A 단백질 변이체는 CD40L의 동일하거나 상이한 부위에 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 CD40L의 2개의 부위(biparatopic) 또는 2개 이상의 부위(multiparatopic)에 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "항체(antibody)"는 표적(항원)에 특이적으로 결합하는 완전한 항체 형태뿐 아니라, 상기 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함된다. 상기 완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어, "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어, "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 상기 전체 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG의 아형(subtype)을 포함하며, 특히 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
항체의 항원 결합 단편 또는 항체 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge-region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 다이설파이드 결합을 이루면서 생성된다.
Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각에 해당한다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고, 단쇄 Fv(single-chain Fv, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용하거나 (예를 들어, 완전한 형태의 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2를 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 이용하여 제작할 수 있다.
"Fv" 단편은 완전한 항체 인식 및 결합 부위를 함유하는 항체 단편이다. 이러한 영역은 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인이 결합된 이량체이다.
"Fab" 단편은 경쇄의 가변 및 불변 도메인과, 중쇄의 가변 및 제1 불변 도메인(CH1)을 포함한다. F(ab')2 항체 단편은 일반적으로 Fab'단편 C-말단에 존재하는 힌지 영역의 시스테인에 의해 공유적으로 연결된 한 쌍의 Fab' 단편을 포함한다.
"단일쇄 Fv (scFv)" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄로 이루어진 구조체이다. scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 폴리펩티드 링커를 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 추가로 포함할 수 있다.
하나의 실시예에서, 본 발명의 항체는 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, scFv, Fab 단편, F(ab')2 단편, 다이설파이드-결합 Fvs (sdFv) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 또는 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변영역은 감마1 (IgG1), 감마 2 (IgG2), 감마 3 (IgG3) 또는 감마 4 (IgG4)이다. 경쇄 불변영역은 카파 또는 람다 형일 수 있다.
상기 단일클론 항체는 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득한 항체, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일한 것을 지칭한다. 단일클론 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원 부위에 대항하여 유도된다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 상이한 항체를 포함하는 통상의 (폴리클로날) 항체와는 대조적으로, 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 면역 글로불린의 Fc 부분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 융합 단백질이 Fc 부분을 포함하는 경우, Fc 수용체에 결합하여 Fc 수용체 양성 세포를 활성화함으로써 사이토카인 및/또는 공동자극 항원의 발현을 개시하거나 증가시킬 수 있으며, 항체 의존성 세포 독성(ADCC)를 유발할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질이 전장 면역 글로불린을 포함하는 경우, 상기 융합단백질은 면역 글로불린의 Fc 영역의 Fc 기능을 보존할 수 있다. 예를 들어, 상기 융합단백질은 Fc 영역을 통해 Fc 수용체 양성 세포의 Fc 수용체에 결합 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 융합단백질은 Fc 수용체에 결합하여 Fc 수용체 양성 세포를 활성 시킬 수 있으며, 사이토카인 및/또는 보조자극 항원의 발현을 개시하거나 증가시킬 수 있다. 사이토카인 및/또는 보조작극 항원은 T 세포의 활성화에 필요한 2차 활성화 신호 이상의 신호를 전달할 수 있다. 본 발명에 있어서, 면역세포, 간 세포 및 내피 세포와 같은 면역계의 이펙터세포의 표면에 존재하는 Fc 수용체를 발현하는 다른 세포에 대한 Fc 영역의 결합으로 상기 융합단백질은 항체 의존성 세포독성(ADCC) 기능을 보유할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합단백질의 Fc 영역은 Fc-매개 세포독성과는 별개로 상기 융합단백질의 혈청 수준의 유지에 긍정적인 영향을 미칠 수 있으며, 이는 체내 안정성 및 지속성의 향상을 의미할 수 있다. 예를 들어, Fc 부분이 내피 세포 및 식세포의 Fc 수용체에 결합할 때 AFFIMER® 제제는 내재화되어 혈류로 다시 재활용되어 체내 반감기를 향상시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 다중 특이적 융합단백질의 다른 예시적인 표적은 면역체크포인트 단백질 및 면역 공동 자극 수용체, 수용체, 사이토카인, 성장인자 또는 종양 관련 항원일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 상기 결합 도메인은 적어도 하나의 자가면역 표적(예를 들어, TNFR2 또는 IL6-R)에 대한 단일클론 항체 또는 이의 단편일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 융합단백질은 자가면역 상태에서 상향조절된 단백질(예를 들어, TNFR2 또는 IL6-R)에 결합하는 하나 이상의 결합 도메인을 포함할 수 있다. 본 발명의 융합단백질의 다양한 형태는 William BA et al. J. Clin. Med. 2019; 8(8): 1261에 상세히 기재되어 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 도메인은 예를 들어, 면역 체크포인트 단백질, 면역 공동자극수용체, 수용체(또는 수용체 작용제), 사이토카인, 성장 인자 또는 종양 관련 항원일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 사이토카인은 세포간의 신호 전달에 중요한 역할을 하는 분비형 단백질을 총칭하는 의미로 사용된다. 예를 들어, 상기 사이토카인은 케모카인, 인터페론, 림포카인, 인터류킨, 종양 괴사 인자 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 성장인자는 세포 증식, 상처의 치유 및/또는 세포 분화를 자극할 수 있는 자연 발생 물질 또는 이의 변이체를 의미한다. 예를 들어 상기 성장인자는 GH, EGF, VEGF, FGF, bFGF, HGF, BMPs, M-CSF, G-CSF, GM-CSF, EPO, GDNF, IGF, KGF, BDNF, NGF, PDGF, TPO, TGF 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 효소는 생물학적 반응을 촉매하는 단백질을 총칭하는 의미로 사용된다. 예를 들어, 상기 효소는 α-chymotrypsin, lysozyme, urate oxidase, acetylcholinesterase, thermomyces lanuginose lipase, glucose oxidase, superoxie dismutase, caspase, β-glucosidase, Trametes versicolor laccase, alcohol oxidase, Cas9, Cas12, Cas13, Cas14, zinc-finger nuclease, TALLEN, dimethyl sulfoxide, uricase, Agalsidase beta, Agalsidase alfa, Imiglucerase, Taliglucerase alfa, Velaglucerase alfa, Alglucerase, Sebelipase alpha, Laronidase, Idursulfase, Elosulfase alpha, Galsulfase, Alglucosidase alpha, 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 투과 펩타이드는 다양한 분자의 세포 섭취 및 흡수를 촉진하는 짧은 펩타이드를 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질이 세포 투과 펩타이드를 포함하는 경우 스테핀 A 단백질 변이체가 세포 내로 흡수되는 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 상기 세포 투과 펩타이드는 Tat, Penetrantin, Transporant, Pept1, Pept 2, pVEC, DPV3, DPV6, R8, R9, MPG, MAP, Bip4, C105Y, Melittin, 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 유전자 조작된 세포의 세포 막에 고정되거나, 세포 표면 발현되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질이 세포 막에 고정되거나, 세포 표면 발현되는 경우, 막 관통 도메인을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 용어, “막 관통 도메인”은 세포의 막에 걸쳐있는 단백질 도메인을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 막 관통 도메인은 알파-나선 구조를 갖는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 막 관통 도메인은 예를 들어, CD3, CD4, CD5, CD8, CD28, CD99, 면역글로불린(예를 들어 IgG1, IgG4, IgD 등), PDGFR, PTGFRN 등으로부터 유래한 막 관통 도메인 또는 이의 변이체인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 막 관통 도메인 외에 힌지 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 용어, “힌지 도메인”은 막 고정 단백질의 막 관통 도메인과 세포 외 도메인 사이에 존재하는 일련의 아미노산 서열을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 힌지 도메인은 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체 및 막 관통 도메인 사이에 위치하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 힌지 도메인은 예를 들어, 예를 들어, CD3, CD4, CD5, CD8, CD28, CD99, 면역글로불린(예를 들어 IgG1, IgG4, IgD 등), PDGFR, PTGFRN 등으로부터 유래한 힌지 도메인 또는 이의 변이체인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 코일드 코일 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 용어, “코일드 코일 도메인(coiled coil domain)”은 2개 내지 7개의 알파 나선이 로프 가닥과 같이 감겨있는 단백질의 구조적 모티프를 의미한다. 바람직하네는 상기 코일드 코일 도메인은 2개 또는 3개의 알파 나선이 감겨있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 코일드 코일 도메인은 류신 지퍼(Leucine zipper), 폴돈(foldon), 심장 포스포람반(Cardiac phospholamban), 막 포스포람반의 수용성 유사체(water-soluble analogue of a membrane phospholamban), COMP(Cartilage oligomeric matrix protein), 트롬보스폰딘 3(thrombospondin 3), 트롬보스폰딘 4(thrombospondin 4), VASP(vasodilator-stimulated phhosphoprotein)에서 유래한 코일드 코일 도메인 또는 이의 변이체인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 코일드 코일 도메인은 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체 및 막 관통 도메인 사이에 위치하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 바이러스 유래 펩타이드 또는 단백질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 바이러스 유래 펩타이드 또는 단백질은 예를 들어, 신사이틴-1(syncytin-1), 신사이틴-2(syncytin-2), VSVG(vesicular stomatitis virus glycoprotein), 니파 바이러스(Nipah virus)의 F 및 G 단백질, 홍역 바이러스(measles virus)의 F 및 H 단백질, 투파이아 파라믹소바이러스(tupaia paramyxovirus)의 F 및 H 단백질, 파라믹소바이러스(paramyxovirus)의 F 및 G 단백질 F 및 H 단백질 또는 F 및 HN 단백질, 헨드라 바이러스(Hendra virus)의 F 및 G 단백질, 헤니파바이러스(Henipavirus)의 F 및 G 단백질, 모르빌리바이러스(Morbilivirus)의 F 및 H 단백질, 레스피로바이러스(respirovirus)의 F 및 HN 단백질, 센다이 바이러스(a Sendai virus)의 F 및 HN 단백질, 루불라바이러스(rubulavirus)의 F 및 HN 단백질, 또는 아불라바이러스(avulavirus)의 F 및 HN 단백질, 또는 이의 변이체 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 면역 조절 도메인 또는 세포 내 신호전달 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 면역 조절 도메인 또는 세포 내 신호전달 도메인은 막 고정 단백질의 세포질 방향에 위치하는 도메인으로서, 세포 외 도메인에 표적 항원이 결합하였을 때, 면역 반응을 활성화 또는 억제시키는 부위를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 면역 조절 도메인 또는 세포 내 신호 전달 도메인은 CD3, CD28, CD40L, ICOS, OX40, 4-1BB, TNFR2 등에서 유래한 면역 조절 도메인인 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 키메릭 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor, CAR)인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질이 키메릭 항원 수용체인 경우, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체는 세포 외 결합 도메인으로 기능하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질이 키메릭 항원 수용체인 경우, 상기한 막 관통 도메인, 힌지 도메인, 세포 내 신호전달 도메인을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업계에 공지되 다양한 키메릭 항원 수용체 또는 이의 유사체의 세포외 항원 결합 도메인을 본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체로 변경하여 쉽게 설계 및 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 국소화 도메인을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질이 세포 내 발현되는 경우, 국소화 도메인을 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명의 용어, “국소화 도메인”은 단백질을 세포 내 특정 기관 또는 세포 내의 특정 위치에 국소화 하도록 기능하는 펩타이드 또는 단백질 서열을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 국소화 도메인은 기관 특이적 국소화 도메인 또는 세포내 단백질 국소화 도메인인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 국소화 도메인은 예를 들어, VACM-1/CUL5, CXCR4, VP1, 53BP1, ING4, IER5, ERK5, Hrp1, UL79, EWS, PTHrP, Pho4, 및 rpL23a등으로부터 유래된 핵 특이적 국소화 도메인; ATP 합성효소 F1b, 사이토크롬 c 옥시다아제 폴리펩타이드 VIII, SOD2, 시트레이트 합성효소, Tu 번역 신장 인자(Tu translation elongation factor) 등으로부터 유래된 미토콘드리아 특이적 국소화 도메인; PTS1, PTS2 등으로부터 유래된 퍼옥시좀 국소화 도메인인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 반감기 연장 도메인(Half-life extension domain)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 반감기 연장 도메인은 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체의 반감기를 연장시키기 위한 목적으로 융합된 도메인 또는 모이어티를 의미하며, 예를 들어, 상기 반감기 연장 도메인은 Fc 도메인, Fc 결합 단백질 또는 펩타이드, 알부민(예, HSA), 알부민 결합 단백질 또는 펩타이드, 트랜스페린, 트랜스 페린 결합 단백질 또는 펩타이드 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
약물 동태학(Pharmacokinetic) 및 ADME(Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion) 특성 엔지니어링된 융합 단백질
본 발명에서 사용된 용어, “반감기”는 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체 또는 융합 단백질과 같은 유효 성분이 약리학적 또는 생리학적 활성 또는 농도의 절반을 잃는 데 걸리는 시간을 의미한다. 생물학적 반감기는 물질의 제거, 배설, 분해(예, 효소적 분해) 또는 신체의 특정 기관 또는 조직에서의 흡수 및 농도에 의해 영향을 받을 수 있다. 본 발명에 있어서, 생물학적 반감기는 물질의 혈장 농도가 정상상태 수준의 절반에 도달하는데 걸리는 시간을 결정함으로써 평가될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체 또는 이를 포함하는 융합 단백질은 적절한 반감기 및/또는 약물 동태학적 프로파일(PK profile)을 갖지 않을 수 있으며, 반감기 또는 프로파일(PK profile)를 보다 개선하기 위한 반감기 연장 도메인(또는 반감기 연장 모이어티)을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 용어, “반감기 연장 도메인” 또는 “반감기 연장 모이어티”는 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체의 반감기 연장을 위해 직접적으로 또는 링커 등을 통해 간접적으로 접합 또는 융합된, 약학적으로 허용되는 모이어티, 도메인 또는 분자를 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 반감기 연장 도메인은 생체내 단백질 분해 또는 스테핀 A 단백질 변이체의 활성 감소 또는 변형을 방지하거나 완화, 반감기 연장, 흡수속도 증가, 독성 감소, 용해도 개선, 단백질 응집 감소, 생물학적 활성 및/또는 표적 선택성 증가, 생산성 증가, 면역원성의 감소와 같은 약동학적 또는 생물물리학적 특성을 개선하거나 변경할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 “반감기 연장 도메인”은 단백질 또는 펩타이드뿐만 아니라, 비 단백질성 반감기 연장 도메인을 포함한다. 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 또는 discrete PEG, HES(hydroxyethyl starch), 지질, 분지형 또는 비분지형 아실기, 분지형 또는 비분지형 C8~C30 아실기, 분지형 또는 비분지형 알킬기, 분지형 또는 비분지형 C8~C30 알킬기와 같은 수용성 폴리머; 및 혈청 알부민(Serum albumin), 트랜스페린, 아드넥틴(예를 들어, 알부민 결합 아드넥틴 또는 약동학 확장 아드넥틴(PKE adnectin)), Fc 도메인, XTEN 및 PAS 폴리펩타이드와 같은 구조화되지 않은 폴리펩타이드(예를 들어, 아미노산 Pro, Ala 및/또는 Ser) 및 이 들의 단편과 같은 단백질성 반감기 연장 도메인일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 반감기 연장 도메인은 이를 포함하지 않는 융합 단백질의 반감기와 비교하여, 대상의 혈청에서 순환되는 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체의 반감기를 연장시키는 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 상기 반감기는 약 1.2배, 1.5배, 2.0배, 3.0배, 4.0배, 5.0배 또는 6.0배 이상 연장될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 상기 반감기는 투여 후 6시간 이상, 12시간 이상, 24시간 이상, 72시간 이상, 96시간 이상 또는 1주 이상 연장될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 반감기 연장 도메인을 포함하는 융합 단백질의 제조 예는 다음과 같으나, 이에 제한되는 것은 아니다:
- 스테핀 A 단백질 변이체 서열과, 자연적으로 긴 반감기 단백질 또는 단백질 도메인의 유전적 융합(예를 들어, Fc 도메인 융합, 트랜스페린 (Tf) 융합, 또는 알부민 융합). 상기 단백질성 반감기 연장 도메인과의 융합 기술은 당업계에 잘 알려져 있다(Beck et al. (2011) “Therapeutic Fc-fusion proteins and peptides as successful alternatives to antibodies. MAbs. 3:1-2; Czajkowsky et al. (2012) “Fc-fusion proteins: new developments and future perspectives. EMBO Mol Med. 4:1015-28; Huang et al. (2009) “Receptor-Fc fusion therapeutics, traps, and Mimetibody technology” Curr Opin Biotechnol. 2009;20:692-9; Keefe et al. (2013) “Transferrin fusion protein therapies: acetylcholine receptor-transferrin fusion protein as a model. In: Schmidt S, editor. Fusion protein technologies for biopharmaceuticals: applications and challenges. Hoboken: Wiley; p. 345-56; Weimer et al. (2013) “Recombinant albumin fusion proteins. In: Schmidt S, editor. Fusion protein technologies for biopharmaceuticals: applications and challenges. Hoboken: Wiley; 2013. p. 297-323; Walker et al. (2013) “Albumin-binding fusion proteins in the development of novel long-acting therapeutics. In: Schmidt S, editor. Fusion protein technologies for biopharmaceuticals: applications and challenges. Hoboken: Wiley; 2013. p. 325-43. 등 참조).
- 스테핀 A 단백질 변이체 서열과, 불활성 폴리펩타이드(inert polypeptide)의 유전적 융합(예를 들어, XTEN(재조합 PEG 또는 rPEG로도 알려짐), HAP(homoamino acid polymer, HAPylation), 프롤린-알라닌-세린 폴리머(PAS; PASylation), 또는 엘라스틴 유사 펩타이드(ELP; ELPylation)). 상기 불활성 폴리펩타이드와 융합 기술은 당업계에 잘 알려져 있다(Schellenberger et al. (2009) “A recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptides 및 proteins in a tunable manner. Nat Biotechnol. 2009;27:1186-90; Schlapschy et al. Fusion of a recombinant antibody fragment with a homo-amino-acid polymer: effects on biophysical properties and prolonged plasma half-life. Protein Eng Des Sel. 2007;20:273-84; Schlapschy (2013) PASylation: a biological alternative 내지 PEGylation for extending the plasma halflife of pharmaceutically active proteins. Protein Eng Des Sel. 26:489-501. Floss et al. (2012) “Elastin-like polypeptides revolutionize recombinant protein expression and their biomedical application. Trends Biotechnol. 28:37-45. Floss et al. “ELP-fusion technology for biopharmaceuticals. In: Schmidt S, editor. Fusion protein technologies for biopharmaceuticals: application and challenges. Hoboken: Wiley; 2013. p. 372-98. 등 참조).
- PEG(PEGylation) 또는 히알루론산(hyaluronic acid)과 같은 화학 모이어티의 반복을 위한 약리학적으로 활성 펩타이드 또는 단백질의 화학적 컨쥬게이션에 의한 유체역학적 반경 증가. 화학적 컨쥬게이션에 의한 유체역학적 반경 증가 기술은 당업계에 잘 알려져 있다(Caliceti et al. (2003) “Pharmacokinetic 및 biodistribution properties of poly(ethylene glycol)-protein conjugates” Adv Drug Delivery Rev. 55:1261-77; Jevsevar et al. (2010) PEGylation of therapeutic proteins. Biotechnol J 5:113-28; Kontermann (2009) “Strategies 내지 extend plasma half-lives of recombinant antibodies” BioDrugs. 23:93-109; Kang et al. (2009) “Emerging PEGylated drugs” Expert Opin Emerg Drugs. 14:363-80; 및 Mero et al. (2013) “Conjugation of hyaluronan 내지 proteins” Carb Polymers. 92:2163-70. 등 참조).
- 폴리시알릴화(polysialylation)에 의한 약리학적으로 활성인 펩타이드 또는 단백질을 융합의 음전하를 현저히 증가; 또는 선택적으로, (b) 음으로 하전된 고도로 시알릴화된 펩타이드의 융합(예를 들어, carboxy-terminal peptide [CTP; of chorionic gonadotropin (CG) b-chain], 인간 CG b-서브유닛과 같은 천연 단백질의 반감기 연장 방법으로 잘 알려져 있음) 폴리시알릴화를 통한 반감기 연장 기술은 당업계에 잘 알려져 있다.(Gregoriadis et al. (2005) “Improving the therapeutic efficacy of peptides and proteins: a role for polysialic acids” Int J Pharm. 2005; 300:125-30; Duijkers et al. “Single dose pharmacokinetics and effects on follicular growth and serum hormones of a long-acting recombinant FSH preparation (FSHCTP) in healthy pituitary- suppressed females” (2002) Hum Reprod. 17:1987-93; 및 Fares et al. “Design of a longacting follitropin agonist by fusing the C-terminal sequence of the chorionic gonadotropin beta subunit to the follitropin beta subunit” (1992) Proc Natl Acad Sci USA. 89:4304-8. 35; and Fares “Half- life extension through O-glycosylation. 등 참조).
- HSA, IgG, 트랜스페린 또는 피브로넥틴과 같은 일반적으로 긴 반감기를 갖는 단백질에 대한 펩타이드 또는 단백질-결합 도메인을 통한 비공유 결합. 이와 같은 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(Andersen et al. (2011) “Extending half-life by indirect targeting of the neonatal Fc receptor (FcRn) using a minimal albumin binding domain” J Biol Chem. 286:5234-41; O’Connor-Semmes et al. (2014) “GSK2374697, a novel albumin-binding domain antibody (albudAb), extends systemic exposure of extendin-4: first study in humans-PK/PD and safety” Clin Pharmacol Ther. 2014;96:704-12. Sockolosky et al. (2014) “Fusion of a short peptide that binds immunoglobulin G to a recombinant protein substantially increases its plasma half-life in mice” PLoS One. 2014;9:e102566. 등 참조).
수명이 긴 혈청 단백질에 대한 고전적인 유전적 융합은 PEG 또는 지질에 대한 화학적 접합과는 다른 반감기 연장의 대안적 방법을 제공한다. 항체 Fc 도메인과 인간 혈청 알부민은 반감기 연장을 위한 전통적인 융합 도메인으로 사용되었다. Fc 융합은 항체의 Fc 부분에 대한 펩타이드, 단백질 또는 수용체 엑소 도메인의 융합을 포함한다. Fc 와 알부민 융합 단백질은 펩타이드 약물의 크기를 증가시켜 반감기를 연장시킬 뿐만 아니라, 신체의 자연적 재활용 메커니즘인 FcRn(neonatal Fc receptor)를 이용한다. FcRn에 대한 이들 단백질의 pH 의존적 결합은 엔도솜에서 융합 단백질의 분해를 방지한다. 이러한 단백질이 융합된 융합 단백질은 약 3~16일 정도의 반감기를 가질 수 있으며, 이는 일반적인 PEG화 또는 지질화 펩타이드의 반감기보다 훨씬 길다. 항체 Fc 도메인의 융합은 펩타이드 또는 단백질 약물의 용해도 및 안정성을 향상시킬 수 있다. Fc 도메인 융합의 예는 GLP 수용체 작용제인 둘라글루타이드(dulaglutide)이다. 인간 혈청 알부민은 지방 아실화 펩타이드에 의해 이용되는 것과 동일한 단백질로 반감기 연장을 위해 사용되는 또 다른 융합 도메인이다. HSA 결합 플랫폼을 기반으로 하는 예는 GLP-1 수용체 작용제인 알비글루타이드(Albiglutide)이다. Fc 도메인과 알부민의 주요 차이점은 Fc는 일반적으로 이량체화 되어 사용되며, HSA는 단량체 구조로 사용된다. 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체 및 Fc 도메인의 융합 단백질은 이량체로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
Fc 도메인의 융합
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 면역글로불린 Fc 도메인(Fc 도메인)또는 이의 단편 또는 변이체, 예를 들어 기능성 Fc 영역을 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 Fc 영역은 FcγR null-binding Fc 영역인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 면역글로불린의 Fc 영역에 펩타이드 백본을 통해 직접적으로 또는 간접적으로 연결된 적어도 하나의 CD40L에 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 항체의 Fc 영역(이펙터 기능 및 약동학적 특성을 촉진함) 및 동일한 펩타이드의 일부로서 CD40L에 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 면역글로불린 Fc 영역은 또한 적어도 하나의 CD40L에 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체에 링커를 통해 간접적으로 연결될 수 있다. 본 발명의 융합 단백질에 사용되기 위한 다양한 링커가 당업계에 공지되어 있다. 본 발명에 있어서, Fc 도메인을 포함하는 융합 단백질은 이량체화 되어 사용될 수 있으며, 동종 이량체 또는 이종 이량체화되어 사용되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질이 Fc 도메인을 포함하는 경우 안정성이 개선될 수 있으며, Fc 영역에 의해 부여되는 항체 유사 특성을 이용할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질이 Fc 도메인을 포함하는 경우, 세포내 이입 후 FcRn 매개된 융합 단백질의 세포 표면으로의 재활용을 포함하는 회수 신생 FcRn 수용체 경로(the salvage neonatal FcRn receptor pathway)가 진행될 수 있으며, 이를 통해 리소좀 분해를 회피하고 혈류로 방출되어 반감기가 연장될 수 있다. Fc 도메인의 융합은 반감기의 연장뿐 아니라, 본 발명의 융합 단백질의 분리 및 정제에도 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 Fc 도메인은 제1 불변 영역 이뮤노글로불린 도메인을 제외한 항체의 불변 영역을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 Fc 도메인은 IgA, IgD 및 IgG의 마지막 두개의 불변 영역 면역 글로불린 도메인 및 이들 도메인에 대한 유연한 힌지 N-말단을 포함할 수 있다. IgA, 및 IgM의 경우 Fc 도메인은 J 사슬을 포함할 수 있다. IgG의 경우, Fc 도메인은 이뮤노 글로불린 도메인 Cγ2 및 Cγ3 및 Cγ1와 Cγ2 사이의 힌지를 포함할 수 있다. Fc 도메인의 경계는 다양할 수 있으나, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 카르복실 말단의 잔기 C226 또는 P230을 포함하도록 정의되며, 여기서 아미노산의 번호는 Kabat 넘버링을 사용한다. 본 발명의 용어, “Fc”, “Fc 도메인” 및 “Fc 영역”은 상호호환적으로 사용될 수 있으며, 상기 Fc 도메인은 상기한 영역을 분리하여 지칭하거나, 항체, 이의 단편, 융합 단백질의 일부로서 지칭될 수 있다. Fc 도메인의 다형성은 다양한 위치에서 보고되며, 제한 없이 본 발명의 융합 단백질의 융합 도메인으로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 Fc 도메인은 “기능성 Fc 영역(functional Fc region)”인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 기능성 Fc 영역은 FcRn에 결합 가능한 Fc 도메인 또는 이의 단편을 의미한다. FcRn에 결합하는 Fc 영역 또는 이의 단편의 능력은 당업계에 공지된 표준 결합 검정에 의해 결정될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 기능성 Fc 영역은 FcRn에 결합하나, 이펙터 기능을 갖지 않는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 “이펙터 기능”은 예를 들어, C1q 결합; 보체 의존적 세포독성(complement dependent cytotoxicity, CDC); Fc 수용체 결합; 항체 의존적 세포 매개 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC); 식균 작용(phagocytosis); 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체 등)의 하향 조절 등을 포함할 수 있다. 상기 이펙터 기능은 이를 평가하기 위한 당업계에 공지된 다양한 검증 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 Fc 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 등으로부터 유래한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 Fc 도메인은 IgG1 면역 글로불린 Fc 도메인으로부터 유래한 것을 특징으로 할 수 있으며, 예를 들어 Fc 도메인은 다음의 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 535).
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질에 포함되는 Fc 영역은 힌지 영역을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 상기 힌지 영역은 인간 IgG1 Fc 도메인의 서열 위치 1~16에 있는 코어 힌지 잔기(예를 들어, DKTHTCPPCPAPELLG (서열번호: 536))를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 부분적으로 인간 IgG1 면역글로불린 Fc 도메인 서열의 힌지 영역 내의 위치 6 및 9에서의 시스테인 잔기에 의해 다량체 구조(예를 들어, 이량체)를 형성하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 힌지 영역은 IgG 면역글로불린 Fc 도메인 서열의 코어 힌지 서열의 측면에 있는 CH1 및 CH2 영역으로부터 유래된 잔기를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 힌지 서열은 GSTHTCPPCPAPELLG(서열 번호 537) 또는 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLG(서열 번호 538)를 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 힌지 영역은 바람직하게는 약동학적, 생물물리학적 및/또는 생물학적 특성을 부여하는 하나 이상의 치환을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 상기 힌지 영역은 다음의 서열을 포함하거나, 이로 구성될 수 있다:
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS (서열번호 539);
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS (서열번호 540);
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS (서열번호 541);
EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (서열번호 542);
DKTHTCPPCPAPELLGGPS (서열번호 543); 및
DKTHTCPPCPAPELLGGSS (서열번호 544).
본 발명에 있어서, 상기 인간 IgG1 면역글로불린 Fc 도메인 서열의 18번째 잔기 P는 Fc 이펙터 기능의 제거를 위해 S로 치환될 수 있고; 이러한 치환예는 다음과 같다:
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS (서열번호 541);
EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (서열번호 542); 및
DKTHTCPPCPAPELLGGSS (서열번호 544).
본 발명에 있어서, 상기 인간 IgG1 면역글로불린 Fc 도메인의 1~2번째 위치의 DK는 잠재적인 클립 부위(Clip site)를 제거하기 위해 GS로 치환될 수 있으며, 이러한 치환예는 다음 서열과 같다:
EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (서열번호 542).
본 발명에 있어서, 인간 IgG의 중쇄 불변 영역(예를 들어, CH1~CH3)의 103번째 잔기 C는 경쇄의 부재 시 부적절한 시스테인 결합의 형성을 방지하기 위해 S로 치환될 수 있으며, 이러한 치환예는 다음 서열과 같다:
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS (서열번호 540),
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS (서열번호 541), 및
EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (서열번호 542).
본 발명에 있어서, 상기 Fc 도메인은 포유동물 유래의 Fc 도메인, 바람직하게는 인간 Fc 도메인 인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 Fc 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 유래의 Fc 도메인인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 Fc 도메인은 천연 Fc 도메인 및/또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역과 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 서열 동일성(identity)을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 Fc 도메인은 천연 Fc 도메인 및/또는 모 폴리펩타이드의 Fc 도메인과 90% 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 Fc 도메인은 서열번호 545 내지 558로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 실시예에 기재된 서열번호 545 내지 558의 Fc 도메인을 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, Fc 도메인의 C-말단의 라이신은 Fc 도메인을 포함하는 융합 단백질에 선택적인 구성으로 이해되어야 한다. 본 발명에 있어서, 상기 Fc 도메인은 서열번호 545 내지 558로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 Fc 도메인은 이의 C-말단에 존재하는 라이신이 생략된 서열번호 545 내지 558로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
Figure PCTKR2023002022-appb-img-000035
Figure PCTKR2023002022-appb-img-000036
본 발명의 용어, “항체 의존적 세포 독성” 또는 “ADCC”는 특정 세포독성 세포에 존재하는 Fc 수용체(FcR)에 결합된 분비형 이뮤노글로불린의 세포독성 이펙터 세포가 항원-보유 표적에 특이적으로 결합하여 세포독성을 나타내어 세포를 사멸시키는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 ADCC 및/또는 보체 활성화 또는 효과기 기능을 갖지 않거나, 감소된 Fc 도메인을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, Fc 도메인은 IgG2 또는 IgG4 이소타입의 자연적으로 비활성화된 불변영역 또는 돌연변이된 IgG1 불변 영역을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이러한 변형 Fc 도메인은 EP0307434등에 기재되어 있다. 예를 들어, 상기 Fc 도메인은 위치 235 및 237(EU 인덱스 넘버링)에서 알라닌 잔기의 치환을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 일부 또는 모두 Fc의 기능(예를 들어, ADCC 및/또는 CDC)을 보유한 Fc 도메인을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 상기 융합 단백질은 인간 IgG1 또는 IgG3의 Fc 도메인을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 Fc 도메인의 이펙터 기능의 수준은 공지된 방법에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, CH2 도메인의 돌연변이, 예를 들어, IgG1의 CH2의 239 및 332 및 330 위치에서 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 가지며, 예를 들어, 상기 돌연변이는 S239D 및 I332E 및 A330L에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 Fc 도메인은 Fc 영역의 푸코실화가 감소되도록 글리코실화 프로파일이 변경된 것을 특징으로 할 수 있다.
알부민 융합
본 발명의 실시예에서, 상기 융합 단백질은 알부민 서열 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 알부민 서열 또는 이의 단편은 스테핀 A 단백질 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 서열로의 혼입 또는 화학적 연결을 통해 융합 또는 접합되는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 알부민, 알부민 변이체 또는 알부민 단편은 인간 혈청 알부민(HSA), 이의 변이체 또는 이의 단편인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, HSA외의 알부민 혈청 단백질은 예를 들어, 시노몰구스 원숭이, 소, 개, 토끼 및 쥐에서 유래한 것을 특징으로 할 수 있으며, 예를 들어, BSA는 HSA와 구조적으로 가장 유사하다(Kosa et al., (2007) J Pharm Sci. 96(11):3117-24). 본 발명에 있어서, 상기 알부민은 시노 혈청 알부민(cyno serum albumin) 또는 소 혈청 알부민과 같은 비인간 혈청 알부민일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
약 20일의 혈청 반감기를 갖는 585개의 아미노산 폴리펩타이드(약 67kDa)의 성숙한 HSA는 주로 콜로이드성 삼투압, 혈액 pH, 수많은 내인성 및 외인성 리간드의 수송 및 분포의 유지를 담당한다. 혈청 알부민 단백질은 3개의 구조적으로 상동의 도메인(도메인 I, II, 및 III)을 가지며, 대부분 알파-나선 형태를 나타내고, 17개의 이황화 결합에 의해 고도로 안정화된다. 본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 적어도 하나의 스테핀 A 단백질 변이체; 및 성숙한 인간 혈청 알부민(예를 들어, 서열번호 559) 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질의 알부민은 원하는 수준의 PK 및/또는 생체 분포 특성을 유지하는 것을 특징으로 할 수 있다.
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL (서열번호 559)
본 발명에 있어서, 상기 알부민 서열은 링커 서열을 통해 스테핀 A 단백질 변이체 또는 융합 단백질의 다른 flanking 서열로부터 분리될 수 있다.
별도로 기재하지 않는 한, 본 발명에서 알부민 또는 성숙 알부민은 인간 혈청 알부민을 의미한다. 그러나, 전장 HSA는 18개의 아미노산으로 구성된 신호 펩타이드(MKWVTFISLLFLFSSAYS (서열번호: 486)) 및 이어지는 6개의 아미노산으로 구성된 프로-도메인 서열 (RGVFRR (서열 번호 560))을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기한 총 24개의 아미노산은 프리-프로 도메인으로 명명될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 HSA 프리-프로 도메인에 의해 발현 및 분비되는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 스테핀 A 단백질 변이체 및 HSA를 포함하는 융합 단백질은 상기 스테핀 A 단백질 변이체에서 기재한 신호 서열을 포함할 수 있으며, 이를 통해 발현 및 분비되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 혈청 알부민은 예를 들어, 스테핀 A 단백질 변이체 또는 이를 포함하는 융합 단백질의 아미노산 측쇄를 통한 화학적 접합 등과 같이, 아미드 결합 이외의 결합에 의해 스테핀 A 단백질 변이체 또는 이를 포함하는 융합 단백질에 공유적으로 커플링될 수 있다.
혈청 결합 도메인
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 혈청 결합 도메인(또는 모이어티)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 혈청 결합 도메인은 융합 단백질 서열의 일부로 포함될 수 있으며, 또는 다른 부위를 통해 화학적으로 접합될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 혈청 결합 도메인은 알부민 결합 도메인인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 알부민은 다수의 소수성 결합 포켓을 포함하며, 자연적으로 지방산, 스테로이드와 같은 다양한 리간드의 운반체 역할을 수행할 수 있으며, 알부민의 표면은 음으로 하전되어 높은 수용성(water soluble)을 나타낸다.
본 발명의 용어, “알부민 결합 도메인”은 알부민에 결합 가능한 임의의 그룹을 의미하며, 예를 들어, 알부민 결합 친화도를 갖는 화합물을 의미할 수 있다. 알부민은 지방산과 같은 내인성 리간드에 결합할 수 있을 뿐만 아니라, 와파린, 페니실린 및 디아제팜과 같은 외인성 리간드와 상호작용할 수 있다. 이러한 약물과 알부민의 결합은 가역적이며, 알부민-약물 복합체는 약물의 생체 분포 및 생체 이용률을 향상시킬 수 있는 약물 저장소 또는 약물 전달체의 역할을 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 단백질 반감기를 증가시키기 위해 본 발명의 융합 단백질에 적용될 수 있는 화학적 변형은 지방산을 펩타이드 측쇄에 공유결합하는 지질화인 것을 특징으로 할 수 있다. 이러한 방법은 인슐린의 반감기 연장 방법으로 당업계에 잘 알려져 있으며, PEG화(PEGylation)와 같이 유체역학적 반경을 증가시켜 신장 여과를 감소시키는 것을 특징으로 할 수 있다. 지질 부분의 자체는 상대적으로 작으며, 순환하는 알부민과의 비공유 결합에 의해 간접적으로 반감기 연장을 나타낼 수 있다. 지질화는 펩타이드의 수용성을 감소시킬 수 있으나, 펩타이드와 지방산 사이의 링커의 엔지니어링을 통해 이를 조절할 수 있다. 링커 엔지니어링 및 지질의 변형은 알부민과 무관하게 생체 내 반감기의 증가에 기여할 수 있다(Jonassen et al. (2012) Pharm Res. 29(8):2104-14).
본 발명에 있어서, 상기 알부민 결합 도메인은 알부민 결합 아드넥틴(albumin-binding (PKE2) adnectins; WO2011140086 “Serum Albumin Binding Molecules”, WO2015143199 “Serum albumin-binding Fibronectin Type III Domains” 및 WO2017053617 “Fast-off rate serum albumin binding fibronectin type iii domains” 참조), 스트렙토코쿠스(Streptococcus) G148의 Proein G의 알부민 결합 도메인 3(ABD3), 알부민 결합 도메인 항체(예를 들어, GSK2374697, AlbudAb), 또는 알부민 결합 나노바디 (예를 들어, ATN103, Ozolralizumab)인 것을 특징으로 할 수 있다.
AFFIMER® XT
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 혈청 단백질에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체(HSA AFFIMER®)의 용매 접근가능한 루프 중 적어도 하나는, HSA에 결합할 수 있도록 하는 야생형 스테핀 A 단백질 로부터 유래하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 10-6M 이하의 Kd로 HSA에 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 pH 7.4 내지 7.6에서 1x10-9 M 내지 1x10-6 M의 Kd로 HSA에 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 pH 7.4 내지 7.6에서 1x10-6M 이하의 Kd로 HSA에 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 pH 7.4 내지 7.6에서 1x10-7M 이하의 Kd로 HSA에 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 pH 7.4 내지 7.6에서 1x10-8M 이하의 Kd로 HSA에 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 pH 7.4 내지 7.6에서 1x10-9M 이하의 Kd로 HSA에 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 pH 7.4 내지 7.6에서 1x10-10M 이하의 Kd로 HSA에 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 pH 7.4 내지 7.6에서 1x10-11M 이하의 Kd로 HSA에 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 pH 7.4에서 1x10-9 M 내지 1x10-6 M의 Kd로 HSA에 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 pH 7.4에서 1x10-6M 이하의 Kd로 HSA에 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 pH 7.4에서 1x10-7M 이하의 Kd로 HSA에 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 pH 7.4에서 1x10-8M 이하의 Kd로 HSA에 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 pH 7.4에서 1x10-9M 이하의 Kd로 HSA에 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 pH 7.4에서 1x10-10M 이하의 Kd로 HSA에 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 pH 7.4에서 1x10-11M 이하의 Kd로 HSA에 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 백본 서열을 갖고, 루프 2 및 루프 4 중 어느 하나 이상이 대체 루프 서열, (Xaa)n 및 (Xaa)m으로 대체된 야생형 인간 스테핀 A 단백질 유래의 변이체인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 식 I로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다:
[식 I]
FR1-(Xaa)n-FR2-(Xaa)m-FR3 (I),
여기서 상기 FR1은 상기 FR1은 MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEK TNETYGKLEA VQYKTQVLA (서열번호 1A)로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열이고; FR2는 GTNYYIKVRA GDNKYMHLKV FKSL (서열번호 2)로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 70%(예, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%)의 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있고;
상기 FR3는 EDLVLTGYQV DKNKDDELTG F (서열번호 3)로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 70%(예, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%)의 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으며; 및
Xaa는 각각의 경우 개별적으로 임의의 아미노산 잔기이며; n 및 m은 각각 독립적으로 3~20의 정수임.
본 발명에 있어서, 상기 FR1은 서열번호 1A와 적어도 80%-98%, 82%-98%, 84%- 98%, 86%-98%, 88%-98%, 90%-98%, 92%-98%, 94%-98%, 또는 96%-98% 상동성을 갖는 폴리펩타이드인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 FR1은 서열번호 1A와 적어도 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 92%, 94%, 96%, 또는 98% 상동성을 갖는 폴리펩타이드인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 FR1은 서열번호 1A의 폴리펩타이드인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 FR2는 서열번호 2와 적어도 80%-96%, 84%-96%, 88%-96%, 또는 92%-96% 상동성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 FR2는 서열번호 2와 적어도 880%, 84%, 88%, 92%, 또는 96% 상동성을 갖는 폴리펩타이드인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 FR2는 서열번호 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 동일성을 갖는 폴리펩타이드인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 FR3는 서열번호 3과 적어도 80%-95%, 85%-95%, 또는 90%-95% 상동성을 갖는 폴리펩타이드인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 FR3는 서열번호 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 상동성을 갖는 폴리펩타이드인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 FR3은 서열번호 3의 폴리펩타이드인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 식 II(서열번호 4)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다:
[식 II]
MIP-Xaa1-GLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVV-(Xaa)n-Xaa2-TNYYIKVRAGDNKYMHLKVF-Xaa3-Xaa4-Xaa5-(Xaa)m-Xaa6-D-Xaa7-VLTGYQVDKNKDDELTGF(서열번호 4),
여기서, Xaa는 각각의 경우 개별적으로 임의의 아미노산 잔기이며; n 및 m은 각각 독립적으로 3~20의 정수임.
본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 식 III으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
[식 III]
MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVD-(Xaa)n- GTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSL-(Xaa)m-EDLVLTGYQVDKNKDDELTGF(서열번호 5),
여기서, Xaa는 각각의 경우 개별적으로 임의의 아미노산 잔기이며; n 및 m은 각각 독립적으로 3~20의 정수임.
본 발명에 있어서, Xaa1은 Gly, Ala, Val, Arg, Lys, Asp, 또는 Glu; Xaa2는 Gly, Ala, Val, Ser 또는 Thr; Xaa3은 Arg, Lys, Asn, Gln, Ser, 또는 Thr; Xaa4는 Gly, Ala, Val, Ser 또는 Thr; Xaa5는 Ala, Val, Ile, Leu, Gly 또는 Pro; Xaa6은 Gly, Ala, Val, Asp 또는 Glu; 및 Xaa7은 Ala, Val, Ile, Leu, Arg 또는 Lys인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, Xaa1은 Gly, Ala, Arg 또는 Lys인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, Xaa1은 Gly 또는 Arg인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, Xaa2는 Gly, Ala, Val, Ser 또는 Thr인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, Xaa2는 Gly 또는 Ser인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, Xaa3은 Arg, Lys, Asn, Gln, Ser, Thr인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, Xaa3은 Arg, Lys, Asn 또는 Gln인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, Xaa3은 Lys 또는 Asn인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, Xaa4은 Gly, Ala, Val, Ser 또는 Thr인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, Xaa4은 Gly 또는 Ser인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, Xaa5은 Ala, Val, Ile, Leu, Gly 또는 Pro인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, Xaa5은 Ile, Leu 또는 Pro인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, Xaa5은 Leu 또는 Pro인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, Xaa6은 Gly, Ala, Val, Asp 또는 Glu인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, Xaa6은 Ala, Val, Asp 또는 Glu인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, Xaa6은 Ala 또는 Glu인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, Xaa7은 Ala, Val, Ile, Leu, Arg 또는 Lys인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, Xaa7은 Ile, Leu 또는 Arg인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, Xaa7은 Leu 또는 Arg인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, n은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, n은 8 내지 10, 7 내지 11, 6 내지 12, 5 내지 13, 4 내지 14, 또는 3 내지 15인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, m은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, m은 8 내지 10, 7 내지 11, 6 내지 12, 5 내지 13, 4 내지 14, 또는 3 내지 15 인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, (Xaa)n 은 식 IV로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다:
[식 IV]
aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9,
여기서, aa1은 중성 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산; aa2은 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산; aa3은 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산; aa4은 중성 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산; aa5은 양으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산; aa6은 양으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산; aa7은 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산; aa8은 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산; 및 aa9은 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산임.
본 발명에 있어서, (Xaa)m은 식 V로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다:
[식 V]
aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9 (V),
여기서, aa1은 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산; aa2은 양으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산; aa3은 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산; aa4은 양으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산; aa5은 중성 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산; aa6은 중성 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산; aa7은 음으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산; aa8은 양으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산; 및 aa9은 중성 비극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산임.
중성 비극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산의 예는 시스테인 (Cys) 및 글리신(Gly)을 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 중성 비극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Cys일 수 있다. 본 발명에 있어서, 중성 비극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Gly일 수 있다.
중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산의 예는 알라닌(Ala), 이소류신 (Ile), 류신 (Leu), 메티오닌 (Met), 페닐알라닌 (Phe), 프롤린 (Pro), 트립토판 (Trp), 및 발린 (Val)을 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Ala일 수 있다. 본 발명에 있어서, 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Ile일 수 있다. 본 발명에 있어서, 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Leu일 수 있다. 본 발명에 있어서, 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Met일 수 있다. 본 발명에 있어서, 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Phe일 수 있다. 본 발명에 있어서, 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Pro일 수 있다. 본 발명에 있어서, 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Trp일 수 있다. 본 발명에 있어서, 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Val일 수 있다.
중성 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산의 예는 아스파라긴(Asn), 글루타민(Gln), 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 및 티로신(Tyr)을 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 중성 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Asn일 수 있다. 본 발명에 있어서, 중성 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Gln일 수 있다. 본 발명에 있어서, 중성 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Ser일 수 있다. 본 발명에 있어서, 중성 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Thr일 수 있다. 본 발명에 있어서, 중성 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Tyr일 수 있다.
양으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산의 예는 아르기닌 (Arg), 히스티딘 (His), 및 리신 (Lys)을 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 양으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Arg일 수 있다. 본 발명에 있어서, 양으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산은 His일 수 있다. 본 발명에 있어서, 양으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Lys일 수 있다.
음으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산의 예는 아스파테이트 (Asp) 및 글루타메이트 (Glu)를 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 음으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Asp일 수 있다. 본 발명에 있어서, 음으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Glu일 수 있다.
본 발명에 있어서, (Xaa)n은 식 IV로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다:
[식 IV]
aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9 (IV),
여기서, aa1은 Asp, Gly, Asn, 및 Val로부터 선택되는 아미노산; aa2은 Trp, Tyr, His, 및 Phe로부터 선택되는 아미노산; aa3은 Trp, Tyr, Gly, Trp, 및 Phe로부터 선택되는 아미노산; aa4은 Gln, Ala, 및 Pro로부터 선택되는 아미노산; aa5은 Ala, Gln, Glu, Arg, 및 Ser로부터 선택되는 아미노산; aa6은 Lys, Arg, 및 Tyr로부터 선택되는 아미노산; aa7은 Trp 및 Gln로부터 선택되는 아미노산; aa8은 Pro 및 His로부터 선택되는 아미노산; 및/또는 aa9은 His, Gly, 및 Gln로부터 선택되는 아미노산. 본 발명에 있어서, aa1은 Asp일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa1은 Gly일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa1은 Asn일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa2은 Trp일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa2은 Tyr일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa2은 His일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa2은 Phe일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Trp일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Tyr일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Gly일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Trp일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Phe일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa4은 Gln일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa4은 Ala일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa4은 Pro일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa5은 Ala일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa5은 Gln일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa5은 Glu일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa5은 Arg일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa5은 Ser일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa6은 Lys일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa6은 Arg일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa6은 Tyr일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa7은 Trp일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa7은 Gln일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa8은 Pro일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa8은 His일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa9은 His일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa9은 Gly일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa9은 Gln일 수 있다.
본 발명에 있어서, (Xaa)m은 식 IV로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다:
[식 IV]
aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9 (IV),
여기서, aa1은 Tyr, Phe, Trp, 및 Asn로부터 선택되는 아미노산; aa2은 Lys, Pro, His, Ala, 및 Thr; aa3은 Val, Asn, Gly, Gln, Ala, 및 Phe로부터 선택되는 아미노산; aa4은 His, Thr, Lys, Trp, Lys, Val, 및 Arg로부터 선택되는 아미노산; aa5은 Gln, Ser, Gly, Pro, 및 Asn로부터 선택되는 아미노산; aa6은 Ser, Tyr, Glu, Leu, Lys, 및 Thr로부터 선택되는 아미노산; aa7은 Ser, Asp, Val, 및 Lys로부터 선택되는 아미노산; aa8은 Gly, Leu, Ser, Pro, His, Asp, 및 Arg로부터 선택되는 아미노산; 및/또는 aa9은 Gly, Gln, Glu, 및 Ala로부터 선택되는 아미노산임.
본 발명에 있어서, aa1은 Tyr일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa1은 Phe일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa1은 Trp일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa1은 Asn일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa2은 Lys. 본 발명에 있어서, aa2은 Pro일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa2은 His일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa2은 Ala일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa2은 Thr일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Val일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Asn일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Gly일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Gln일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Ala일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Phe일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa4은 His일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa4은 Thr일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa4은 Lys일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa4은 Trp일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa4은 Lys일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa4은 Val일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa4은 Arg일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa5은 Gln일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa5은 Ser일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa5은 Gly일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa5은 Pro일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa5은 Asn일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa6은 Ser일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa6은 Tyr일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa6은 Glu일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa6은 Leu일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa6은 Lys일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa6은 Thr일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa7은 Ser일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa7은 Asp일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa7은 Val일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa7은 Lys일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa8은 Gly일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa8은 Leu일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa8은 Ser일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa8은 Pro일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa8은 His일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa8은 Asp일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa8은 Arg일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa9은 Gly일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa9은 Gln일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa9은 Glu일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa9은 Ala일 수 있다.
본 발명에 있어서, (Xaa)n은 식 V로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다:
[식 V]
Asn-aa1-aa2-Gln-Gln-Arg-Arg-Trp-Pro-Gly (V),
여기서, aa1은 Trp 및 Phe로부터 선택되는 아미노산; 및 aa2은 Tyr 및 Phe로부터 선택되는 아미노산임. 본 발명에 있어서, aa1은 Trp일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa1은 Phe일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa2은 Tyr일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa2은 Phe일 수 있다.
본 발명에 있어서, (Xaa)n은 식 VI로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다:
[식 VI]
aa1-aa2-Trp-aa3-aa4-Lys-Trp-Pro-aa5 (VI),
여기서, aa1은 Asp 및 Gly로부터 선택되는 아미노산; aa2은 Trp, Tyr, 및 Phe로부터 선택되는 아미노산; aa3은 Gln 및 Ala로부터 선택되는 아미노산; aa4은 Ala 및 Ser로부터 선택되는 아미노산; 및 aa5은 His 및 Gly로부터 선택되는 아미노산임. 본 발명에 있어서, aa1은 Asp일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa1은 Gly일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa2은 Trp일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa2은 Tyr일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa2은 Phe일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Gln일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Ala일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa4은 Ala일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa4은 Ser일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa5은 His일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa5은 Gly일 수 있다.
본 발명에 있어서, (Xaa)n은 식 VII로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다:
[식 VII]
aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-Trp-Pro-Gly (VII),
여기서, aa1은 Gly 및 Asn로부터 선택되는 아미노산; aa2은 Tyr, Phe, Trp, 및 His로부터 선택되는 아미노산; aa3은 Trp, Tyr, 및 Phe로부터 선택되는 아미노산; aa4은 Ala 및 Gln로부터 선택되는 아미노산; aa5은 Ala, Ser, Gln, 및 Arg로부터 선택되는 아미노산; 및 aa6은 Lys, Arg, 및 Tyr로부터 선택되는 아미노산임. 본 발명에 있어서, aa1은 Gly일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa1은 Asn일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa2은 Tyr일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa2은 Phe일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa2은 Trp일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa2은 His일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Trp일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Tyr일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Phe일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa4은 Ala일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa4은 Gln일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa5은 Ala일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa5은 Ser일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa5은 Gln일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa5은 Arg일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa6은 Lys일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa6은 Arg일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa6은 Tyr일 수 있다.
본 발명에 있어서, (Xaa)n은 식 VIII로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다:
[식 VIII]
Gly-aa1-aa2-Ala-aa3-aa4-Trp-Pro-Gly (VIII) (SEQ ID NO: 561),
여기서, aa1은 Tyr, Phe, 및 His로부터 선택되는 아미노산; aa2은 Trp 및 Tyr로부터 선택되는 아미노산; aa3은 Ala, Ser, 및 Arg로부터 선택되는 아미노산; 및 aa4은 Lys 및 Tyr로부터 선택되는 아미노산임. 본 발명에 있어서, aa1은 Tyr일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa1은 Phe His일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa1은 His일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa2은 Trp일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa2은 Tyr일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Ala일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Ser일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Arg일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa4은 Lys일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa4은 Tyr일 수 있다.
본 발명에 있어서, (Xaa)n은 식 IX로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다:
[식 IX]
aa1-aa2-aa3-Gln-aa4-aa5-Trp-Pro-aa6 (IX),
여기서, aa1은 Asp 및 Asn로부터 선택되는 아미노산; aa2은 Trp 및 Phe로부터 선택되는 아미노산; aa3은 Trp, Tyr, 및 Phe로부터 선택되는 아미노산; aa4은 Ala, Gln, 및 Arg로부터 선택되는 아미노산; aa5은 Lys 및 Arg로부터 선택되는 아미노산; 및 aa6은 His 및 Gly로부터 선택되는 아미노산임. 본 발명에 있어서, aa1은 Asp일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa1은 Asn일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa2은 Trp일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa2은 Phe일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Trp일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Tyr일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Phe일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa4은 Ala일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa4은 Gln일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa4은 Arg일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa5은 Lys일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa5은 Arg일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa6은 His일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa6은 Gly일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 서열번호 562 내지 614 (표 8)의 아미노산 중 선택되는 어느 하나의 loop2 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 서열번호 615 내지 667 (표 8)의 아미노산 중 선택되는 어느 하나의 loop4 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
Figure PCTKR2023002022-appb-img-000037
Figure PCTKR2023002022-appb-img-000038
본 발명에 있어서, 상기 (Xaa)n는 서열번호 562 내지 614 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80% 또는 적어도 90%의 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 (Xaa)n는 서열번호 562 내지 614 중 어느 하나의 아미노산 서열과 80% 내지 90%의 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 (Xaa)n는 서열번호 562 내지 614 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (Xaa)m는 서열번호 615 내지 667 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80% 또는 적어도 90%의 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 (Xaa)m는 서열번호 615 내지 667 중 어느 하나의 아미노산 서열과 80% 내지 90%의 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 (Xaa)m는 615 내지 667 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 서열번호 668 내지 674 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다(표 9).
Figure PCTKR2023002022-appb-img-000039
본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 서열번호 668 내지 674 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80% 또는 적어도 90%의 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 서열번호 668 내지 674 중 어느 하나의 아미노산 서열과 80% 내지 90%의 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 다른 분자(예를 들어, 치료용 폴리펩타이드 또는 본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체)에 연결되어, 상기 분자의 반감기를 연장시킬 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 예를 들어, 마우스 시노몰구스(cyno) 원숭이와 같은 다른 종과 교차 반응하는 다양한 결합 친화도를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 명세서에서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 AFFIMER XT™ 플랫폼으로 명명된다. 본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 생체내 약동학(PK) 연구에서 제어된 방식으로 단일 유전자 융합 방식으로 접합된 다른 스테핀 A 단백질 변이체 또는 이의 융합 단백질의 반감기를 연장시킬 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체(AFFIMER XT™)는 다른 펩타이드 또는 단백질 치료제의 반감기 연장을 위해 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 생체 내에서, 분자, 예를 들어 본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체 또는 이를 포함하는 융합 단백질과 같은 치료용 단백질의 혈청 반감기를 증가시키는 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 분자, 예를 들어 본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체 또는 이를 포함하는 융합 단백질과 같은 치료용 단백질의 혈청 반감기를 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체가 연결되지 않은 분자에 비해 적어도 2배 증가시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질이 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체를 포함하는 경우 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체가 연결되지 않은 분자에 비해 혈청 반감기를 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 20배, 또는 적어도 30배 증가시키는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질이 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체를 포함하는 경우 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체가 연결되지 않은 분자에 비해 혈청 반감기를 2배 내지 5배, 2배 내지 10배, 3배 내지 5배, 3배 내지 10배, 15배 내지 5배, 4배 내지 10배, 또는 5배 내지 10배 증가시키는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질이 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체를 포함하는 경우 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체가 연결되지 않은 분자에 비해 혈청 반감기를 적어도 6시간, 적어도 12시간, 적어도 24시간, 적어도 48시간, 적어도 72시간, 적어도 96시간, 예를 들어, 적어도 생체 내 투여 후 일주일 이상 증가시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체에 비해 증가된 혈청 반감기를 가지며, 서열번호 667 내지 702(표 10)의 서열과 적어도 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 동일한(identical) 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체에 비해 증가된 혈청 반감기를 가지며, 서열번호 667- 702 (표 10) 및 서열번호 703-728 (표 11)의 서열과 적어도 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 동일한(identical) 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
PEG화, XTEN, PAS 및 기타 중합체
본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체에 매우 다양한 고분자 중합체(macromolecular polymer) 및 기타 분자가 연결되어, 생물학적 특성을 조절하고/하거나 새로운 생물학적 특성을 제공할 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 고분자 중합체는 자연적으로 암호화된 아미노산, 비-자연적으로 암호화된 아미노산, 또는 천연 또는 비천연 아미노산의 임의의 기능적 치환기, 또는 자연적 또는 비자연적 아미노산에 추가된 임의의 치환기 또는 작용기를 통해 본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체에 연결될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 고분자 중합체의 분자량은 약 100Da 내지 약 100,000Da일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 있어서, 상기 고분자 중합체의 분자량은 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, 및 100 Da를 포함하는 약 100Da 내지 약 100,000Da일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 상기 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 50,000 Da, 약 100 Da 내지 약 40,000 Da, 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da, 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da, 또는 약 10,000 Da 내지 약 40,000 Da인 것을 특징으로 할 수 있다.
이를 위해 PEG화(PEGylation), 폴리시알릴화(polysialylation), HES화(HESylation), 글리코실화(glycosylation), 또는 플렉시블하고 친수성의 아미노산 사슬(아미노산 500~600개)에 융합된 재조합 PEG 유사체를 포함하는 방법이 개발되었다 (Chapman, (2002) Adv Drug Deliv Rev. 54. 531-545; Schlapschy et al., (2007) Prot Eng Des Sel. 20, 273-283; Contermann (2011) Curr Op Biotechnol. 22, 868-876; Jevsevar et al., (2012) Methods Mol Biol. 901, 233-246) 등 참조).
본 발명에 있어서, 상기 중합체는 예를 들어, 폴리알킬 에테르 및 이의 알콕시-캡핑된 유사체(예, 폴리옥시에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌/폴리필렌 글리콜 및 이의 메톡시 또는 에톡시 캡핑된 유사체, 특히 폴리옥시에틸렌 글리콜 후자는 폴리에틸렌 글리콜이라고도 명명됨); dPEG(discrete PEG); 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidones); 폴리비닐알킬 에테르(polyvinylalkyl ethers); 폴리옥사졸린(polyoxazolines), 폴리알킬 옥사졸린(polyalkyl oxazolines) 및 폴리하이드록시알킬 옥사졸린(polyhydroxyalkyl oxazolines); 폴리아크릴아마이드(polyacrylamides), 폴리알킬 아크릴아마이드(polyalkyl acrylamides), 및 폴리하이드록시알킬 아크릴아마이드(polyhydroxyalkyl acrylamides)(예, 폴리하이드록시프로필메타크릴아마이드 (polyhydroxypropylmethacrylamide) 및 이의 유도체); 폴리하이드록시알킬 아크릴레이트(polyhydroxyalkyl acrylates); 폴리시알산(polysialic acids) 및 이의 유사체; 친수성 펩타이드 서열(hydrophilic peptide sequences); 덱스트란 및 덱스트란 유도체(예, 카르복시메틸덱스트란 다당체 및 이의 유도체(polysaccharides and their derivatives)), 아미도 덱스트란을 포함하는 다당체 및 이의 유도체(polysaccharides and their derivatives); 셀룰로오스 및 이의 유도체(cellulose and its derivatives, 예, 카르복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose), 하이드록시알킬 셀룰로오스(hydroxyalkyl celluloses); 키틴 및 이의 유도체(chitin and its derivatives, 예, 키토산(chitosan), 숙시닐 키토산(succinyl chitosan), 카르복시메틸키틴(carboxymethylchitin), 카르복시메틸키토산(carboxymethylchitosan)); 히알루론산 및 이의 유도체(hyaluronic acid and its derivatives); 전분(starches); 알지네이트(alginates); 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulfate); 알부민(albumin); 풀루란(pullulan) 및 카르복시메틸 플루란(carboxymethyl pullulan); 폴리아미노산 및 이의 유도체(polyaminoacids and derivatives thereof, 예, 폴리글루탐산(polyglutamic acids), 폴리리신(polylysines), 폴리아스파탐산(polyaspartic acids), 폴리아스파타마이드(polyaspartamides)); 말레산 무수물 공중합체(maleic anhydride copolymers) (예를 들어, 스티렌 말레산 무수물 공중합체(styrene maleic anhydride copolymer), 다이비닐에틸 에테르 말레산 무수물 공중합체(divinylethyl ether maleic anhydride copolymer); 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohols); 이들의 공중합체; 이들의 삼원 공중합체; 이들의 혼합물; 및 이들의 유도체를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 중합체는 융합 단백질이 생리적 환경 등의 수성 환경에서 침전되지 않도록 수용성 중합체인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 수용성 중합체는 선형, 분기형(forked) 또는 분지형을 포함하나, 이에 제한되지 않는 임의의 구조를 가질 수 있다. 일반적으로, 상기 수용성 중합체는 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 같은 폴리 알킬렌글리콜일 수 있으나, 다른 수용성 중합체 일 수 있으며 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, PEG는 본 발명의 일부 실시예에서 사용된다. 본 발명에 있어서, 상기 중합체는 약학적으로 허용가능한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어, “폴리에틸렌글리콜(PEG)” 은 크기나 PEG 말단의 변형 여부에 관계없이, 임의의 폴리에틸렌글리콜 분자를 포괄하는 의미로 광범위하게 사용되며, 다음 식과 같이, 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체에 연결된 것을 특징으로 할 수 있다:
XO―(CH2CH2O)n―CH2CH2― , 또는
XO―(CH2CH2O)n― ,
여기서, n은 2 내지 10,000이고, X는 H 또는 비제한적인 예를 들어, C1-4 알킬, 보호 작용기, 또는 말단 작용기와 같은 말단 변형임.
본 발명에 있어서, 상기 PEG는 한쪽 말단이 히드록시 또는 메톡시로 종결될 수 있으며, 예를 들어, X는 H 또는 CH3인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 화학식에서 말단 “-”로 표시되는, PEG의 다른 말단은 자연 발생 또는 비자연적으로 암호화된 아미노산을 통해 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체에 부착될 수 있다. 예를 들어, 상기 부착은 아마이드(amide), 카르바메이트(carbamate) 또는 유레아(urea) 연결을 통해 아민기(예, 라이신의 앱실론 아민, 또는 N-말단을 포함하나, 이에 제한되지 않음)에 연결될 수 있다. 선택적으로, 상기 중합체는 말레이미드 결합에 의해 티올기(예를 시스테인의 티올기를 포함하나 이에 제한되지 않음)에 연결될 수 있다. 이에 의해 중합체가 융합 단백질에 결합되는 경우 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체의 잔기를 시스테인으로 치환할 수 있다.
본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체 또는 이의 융합 단백질에 연결된 수용성 중합체의 수(예, PEGylation 또는 글리코실레화 정도는 반감기와 같은 약리학적, 약동학적, 약역학적 특성을 제공 또는 변경할 수 있도록 조정될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 중합체를 포함하는 스테핀 A 단백질 변이체 또는 이의 융합 단백질은 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 2배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 50배, 또는 적어도 100배 증가된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체 또는 융합 단백질의 PK 또는 생물학적 특성을 수정하는데 유용한 중합체는 본 발명의 융합 단백질의 일부로서, PEG와 기능적으로 유사한 친수성 아미노산 중합체를 사용하는 것이다. 본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 친수성 아미노산 중합체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 폴리펩타이드의 고유한 생분해성은 PEG에 대한 잠재적인 대안으로 각광받고 있다. 또한, PEG의 다분산성과 대조적으로 친수성 아미노산 중합체는 정확한 분자 구조 갖는다.
융합 도메인의 3차원 접힘을 유지해야하는 HSA 및 Fc 도메인의 융합과 달리, 구조화되지 않은 도메인을 포함하는 융합 단백질은 대부분 더 높은 온도 또는 HPLC 정제와 같은 가혹한 조건에 노출될 수 있다는 장점이 있다.
이러한 폴리펩타이드의 비제한적 예로서, XTEN (Amunix)은 A, E, G, P, S 및 T로 구성되는 864개의 아미노산으로 구성된다(Schellenberger et al. “A recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptides and proteins in a tunable manner” 2009 Nat Biotechnol. 27(12):1186-90 참조). XTEN의 생분해성 특성은 일반적으로 사용되는 40KDa PEG보다 훨씬 크며, 반감기 연장을 수반한다. XTEN을 포함하는 융합 단백질은 XTEN을 포함하지 않는 경우에 비해 반감기를 60배 내지 130배 연장 가능할 수 있다.
상기 폴리펩타이드의 또 다른 예로서, PAS (XL-Protein GmbH)가 있다(Schlapschy et al. “PASYlation: a biological alternative to PEGylation for extending the plasma half-life of pharmaceutically active proteins” 2013 Protein Eng Des Sel. 26(8):489-501 참조). 상기 PAS는 프롤린, 알라닌 및 세린의 비전하성 아미노산으로 구성된 제한적인 세트로 구성된 랜덤 코일 중합체이다. Fc 도메인, HSA 및 XTEN과 마찬가지로 PAS는 본 발명의 유전자 조작된 세포에서 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체 또는 융합 단백질을 발현할 때, 인라인 융합 단백질로 제조되기 위해 스테핀 A 단백질 변이체 또는 융합 단백질을 암호화하는 핵산과 함께 유전적으로 암호화될 수 있다.
인-라인 융합 단백질(In line fusion)
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 하기 표 10의 폴리펩타이드 중 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.
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본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질을 암호화하는 핵산은 표 11에 제공된 핵산에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질의 아미노산 서열 및 이를 암호화하는 핵산 서열과 함께, 본 발명의 융합 단백질에 포함되는 융합 도메인의 폴리펩타이드 서열 및 이를 암호화하는 핵산 서열에 기반하여, 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 설계 및 예측할 수 있음은 자명하게 이해될 수 있다.
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스테핀 A 단백질 변이체-접합체(Stefin A protein variant-Conjugate)
본 발명은 다른 관점에서, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant)를 포함하는 접합체에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant)의 접합체의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.
본 발명의 용어 “접합체(Conjugate)” 또는 “접합(Cojugation)”은 당업계에 공지된 임의의 연결 또는 연결 방법에 의해 2개 이상의 화합물을 함께 연결(linking)하거나, 결합하여(joining) 다른 화합물을 형성하는 것 또는 2개 이상의 화합물을 결합하거나 연결하여 생성되는 화합물을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체-접합체(Stefin A protein variant-Conjugate)는 광범위하게는 융합단백질을 포함하는 의미로 이해될 수 있다. 보다 구체적인예를 들어, 본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체 또는 융합 단백질의 C-말단 및/또는 N-말단을 통한 연속적인 펩티드 결합의 형성을 통한 것 이외의 화학적 접합을 통해 접합된 적어도 하나의 모이어티를 포함하는 접합체를 의미할 수 있다. 상기 접합체는 예를 들어, 하나의 스테핀 A 단백질 변이체-약물 접합체일 수 있으며, 상기 스테핀 A 단백질 변이체-약물 접합체는 적어도 하나의 약리학적 활성을 갖는 모이어티를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 접합체는 다양한 작용기, 치환체 또는 모이어티와 같은 적어도 하나의 기능성 모이어티를 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 기능성 모이어티는 예를 들어, 라벨; 염료; 면역부착 분자(immunoadhesion molecule); 방사성 핵종(radionuclide); 세포독성 화합물(cytotoxic compound); 약(drug); 친화성 라벨; 광친화성 라벨; 반응성 화합물(reactive compound); 수지(resin); 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이트제; 공동인자(cofactor); 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오타이드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오타이드; 당류(saccharide); 수용성 덴드리머(water-soluble dendrimer); 사이클로덱스트린; 억제성 리보핵산(inhibitory ribonucleic acid); 바이오머터리얼(biomaterial); 나노입자; 스핀 라벨(spin label); 형광체(fluorophore), 금속 함유 모이어티(metal-containing moiety); 방사성 모이어티(radioactive moiety); 신규 기능성 작용기(novel functional group); 다른 분자와 공유 또는 비공유적으로 상호작용하는 작용기; 포토케이지 모이어티(photocaged moiety); 화학적 방사선 여기성 모이어티(actinic radiation excitable moiety); 광이성질화성 모이어티(photoisomerizable moiety); 비오틴; 비오틴 유도체(derivative of biotin); 비오틴 유사체(biotin analogue); 중원자를 포함하는 모이어티(moiety incorporating a heavy atom); 화학적으로 절단 가능한 작용기(chemically cleavable group); 광분해성 작용기(photocleavable group); 긴 사이드체인(elongated side chain); 탄소 결합 당(carbon-linked sugar); 산화환원 활성제(redox-active agent); 아미노 티오산(amino thioacid); 독성 모이어티(toxic moiety); 동위원소 표지된 모이어티(isotopically labeled moiety); 생물물리학적 프로브(biophysical probe); 인광성 작용기(phosphorescent group); 화학발광성 작용기(chemiluminescent group); 전자 밀집 작용기(electron dense group); 자성 작용기(magnetic group); 인터칼레이팅 작용기(intercalating group); 발색단(chromophore); 에너지 전달제(energy transfer agent); 생물학적 활성제(biologically active agent); 검출가능한 라벨(detectable label); 소분자(small molecule); 양자점(quantum dot); 나노전달체(nanotransmitter); 방사성뉴클레오타이드(radionucleotide); 방사성전달체(radiotransmitter); 중성자-포획제(neutron-capture agent); 또는 이들의 조합, 또는 임의의 다른 바람직한 화합물 또는 물질을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
- 라벨 및 검출가능한 모이어티(Labels and Detectable Moieties)
본 발명에 있어서, 상기 접합체는 기능성 모이어티를 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 기능성 모이어티는 검출가능한 라벨일 수 있다. 예를 들어, 검출가능한 라벨은 형광 라벨, 방사성 라벨, 효소 라벨 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 라벨일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 기능성 모이어티는 의학적 이미징에 사용하기위한 접합체의 일부로서 포함될 수 있는 검출가능한 라벨일 수 있다. 본 발명의 용어, 의학적 이미징(medical imaging)은 진단, 연구 또는 치료 목적으로 인체 또는 동물 신체의 내부영역을 시각화하는데 사용될 수 있는 모든 기술을 의미한다. 예를 들어, 방사선신티그래피(scintigraphy), 자기공명영상(MRI), 컴퓨터 단층촬영(CT scan), 핵 이미징(nuclear imaging), PET(positron emission comprising a metal tomography) 조영제, 광학 이미징(예, 근적외선 형광(NIRF) 이미징을 포함한 형광 이미징) 생물발광 이미징(bioluminescence imaging) 또는 이의 조합일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 기능성 모이어티는 선택적으로 X-레이 영상화를 위한 조영제일 수 있다. 이러한 이미징 기술의 향상에 유용한 물질은 신체 내 특정 위치, 기관 또는 질병 부위의 시각화를 가능하게 하고/하거나 이미징 기술에 의해 생성된 이미지의 품질을 일부 개선하여, 개선되거나 더욱 쉬운 해석이 가능하도록 한다. 이러한 제제는 조영제로 지칭될 수 있으며, 조영제의 사용은 다른 영역과 이미징 영역 사이의 대비를 증가시킴으로써 특정 부분의 구별을 용의하게 한다. 따라서, 이러한 조영제에는 이미지 품질의 향상을 위한 제제(예, MRI 등)뿐만 아니라 이미지 생성을 위한 전제 조건으로서의 제제(예, 핵 이미징 등)를 포함하는 의미로 사용된다.
본 발명에 있어서, 상기 검출가능한 라벨은 금속을 킬레이트화하기 위한 킬레이트 모이어티, 예를 들어 방사성 금속(radiometal) 또는 상자성 이온(paramagnetic ion)을 위한 킬레이트제를 포함한다. 본 발명에 있어서, 상기 검출가능한 라벨은 방사선 요법 또는 영상화에 유용한 방사성 핵종에 대한 킬레이트제일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 유용한 방사성 핵종은 감마 방사체(gamma-emitters), 양전자 방사체(positron-emitters), Auger 전자 방사체(Auger electron-emitters), X선 방사체(X-ray emitters) 및 형광 방사체(fluorescence-emitters)를 포함하며, 치료용 베타- 또는 알파-방사체를 포함한다. 방사선 요법에서 독소로 유용한 방사성 핵종의 예는 다음과 같다: 43K, 47Sc, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 64Cu, 67Ga, 67Cu, 68Ga, 71Ge, 75Br, 76Br, 77Br, 77As, 81Rb, 90Y, 97Ru, 99mTc, 100Pd, 101Rh, 103Pb, 105Rh, 109Pd, 111Ag, 111In, 113In, 119Sb 121Sn, 123I, 125I, 127Cs, 128Ba, 129Cs, 131I, 131Cs, 143Pr, 153Sm, 161Tb, 166Ho, 169Eu, 177Lu, 186Re, 188Re, 189Re, 191Os, 193Pt, 194Ir, 197Hg, 199Au, 203Pb, 211At, 212Pb, 212Bi 및 213Bi. 킬레이터가 금속을 배위하는 조건은 예를 들어, Gansow et al., 미국 특허 제 4,831,175호, 제4,454,106호 및 제4,472,509호와 같다. 본 발명에 있어서, 상기 킬레이터의 예는 1,4,7-triazacyclononane-N,N',N"-triacetic acid (NOTA) 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N,N',N",N'"-tetraacetic acid (DOTA) 1 ,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-N,N',N",N'"-tetraacetic acid (TETA)등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 폴리펩타이드의 아미노산 잔기에 직접 혼입될 수 있거나, 킬레이터를 필요로하지 않는 또 다른 검출가능한 동위원소는 3H, 14C, 32P, 35S 및 36Cl를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 상자성 이온은 진단에 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 상자성 이온의 예는 크롬(III), 망간(II), 철(III), 철(II), 코발트(II), 니켈(II), 구리(II), 네오디뮴(III), 사마륨(III), 이테르븀(III), 가돌리늄(III), 바나듐(II), 테르븀(III), 디스프로슘(III), 홀뮴(III), 에르븀(III), 또는 이의 조합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 형광라벨의 예에는 유기 염료(예, 시아닌(cyanine), 플루오레세인(fluorescein), 로다민)rhodamine, Alexa Fluors, Dylight fluors, ATTO 염료, BODIPY 염료 등), 생물학적 형광체(예, GFP(green fluorescent protein), R-Phycoerythrin, 등) 및 양자점 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 사용될 수 있는 비제한적 형광 화합물은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Cy5, Cy5.5 (Cy5++로도 알려짐), Cy2, FITC(fluorescein isothiocyanate), TRITC(tetramethylrhodamine isothiocyanate), 피코에리트린(*phycoerythrin), Cy7, FAM(fluorescein), Cy3, Cy3.5 (Cy3++로도 알려짐), Texas Red, LightCycler-Red 640, LightCycler Red 705, TMR(tetramethylrhodamine), 로다민(rhodamine), 로다민 유도체(rhodamine derivative, ROX), HEX(hexachlorofluorescein), R6G(rhodamine 6G), 로다민 유도체 JA133, Alexa 형광 염료 (예, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 555, 및 Alexa Fluor 647 등), DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole), 프로피듐 이오다이드(Propidium iodide), AMCA, 스펙트럼 그린(Spectrum Green), 스펙트럼 오렌지(Spectrum Orange), 스펙트럼 아쿠아(Spectrum Aqua), 리사민(Lissamine), 및 유로피움과 같은 형광 전이 금속 복합체(fluorescent transition metal complexes) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 형광 화합물의 다른 예로는 형광단백질, 예를 들어, GFP (green fluorescent protein), EGFP(enhanced GFP), 청색 형광 단백질 및 이의 유도체 (BFP, EBFP, EBFP2, Azurite, mKalama1), 청록색(cyan) 형광 단백질 및 이의 유도체 (CFP, ECFP, Cerulean, CyPet) 및 노랑 형광 단백질 및 이의 유도체 (YFP, Citrine, Venus, YPet)등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또 다른 형광화합물의 예는 WO2008142571, WO2009056282, WO9922026의 특허문헌에도 상세히 기재되어 있다.
본 발명에 있어서, 상기 효소 라벨은 예를 들어, 양고추냉이 과산화효소(HRP), 알칼리 포스파타아제(AP), 포도당 산화효소 및 β-갈락토시다아제등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 라벨은 비오틴 라벨일 수 있다. 상기 비오틴 라벨은 일반적으로 비오티닐 그룹, 스페이서 암 및 단백질의 표적 작용기에 대한 부착을 담당하는 반응성 그룹으로 구성된다. 상기 비오틴은 표지된 단백질을 아비딘 모이어티를 포함하는 다른 모이어티에 부착시키는 데 유용하게 사용될 수 있다.
- 스테핀 A 단백질 변이체-약물 접합체
본 발명에 있어서, 상기 접합체는 하나 이상의 치료제를 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 접합체는 스테핀 A 단백질 변이체-약물 접합체일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 “치료제”는 인간 또는 다른 동물의 질병을 회복(cure), 완화(mitigation), 처치(treatment) 또는 예방하는데 사용될 수 있는 물질을 의미한다. 이러한 치료제는 한국을 비롯한 공식 국가기관에 의해 인정되는 치료용 물질이 포함될 수 있으며, 소분자, 뉴클레오타이드, 올리코펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 상기 접합체에 접합될 수 있는 치료제의 예에는 세포독성제(cytotoxic agents), 항대사제(anti-metabolites), 알킬화제(alkylating agents), 항생제(antibiotics), 성장인자(growth factor), 사이토카인(cytokines), 항혈관신생제(anti-angiogenic agents), 항유사분열제(anti-mitotic agents), 독소(toxins), 세포사멸제(apoptotic agents) 등이 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 구체적인 예를 들어 DNA 알킬화제(DNA alkylating agents), 토포아이소머라아제 억제제(topoisomerase inhibitors), 미세소관 억제제(microtubule inhibitors, 예, DM1, DM4, MMAF and MMAE), 소포체 스트레스 유도제(endoplasmic reticulum stress inducing agents), 백금 화합물(platinum compounds), 항대사물질(antimetabolites), 빈칼칼로이드(vincalkaloids, taxanes), 탁산(epothilones), 효소억제제(enzyme inhibitors), 수용체 길항제(receptor antagonists), 치료용 항체(therapeutic antibodies), 티로신 키나아제 억제제(tyrosine kinase inhibitors), 방사선 감작제(radiosensitizers), 및 일러스트레이션과 같은 화학요법 병용 요법 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 접합체를 제조하기 위해 항체 및 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체와 같은 단백질에 접합을 위한 당업계에 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 방법은 Hunter, et al., (1962) Nature 144:945; David, et al., (1974) Biochemistry 13:1014; Pain, et al., (1981) J. Immunol. Meth. 40:219; 및 Nygren, J., (1982) Histochem. and Cytochem. 30:407. 등에 기재되어 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 펩타이드, 폴리펩타이드 및 유기/무기 모이어티를 항체 및 단백질에 접합시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 이를 사용하여 본 발명의 접합체를 쉽게 개조할 수 있다. 예를 들어, 접합된 모이어티가 펩타이드 또는 폴리펩타이드인 경우, 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체에 화학적으로 가교될 수 있거나, 융합단백질의 일부로 포함될 수 있다. 이러한 예로서, Avacta 사의 diptheria toxin-AFFIMER®가 공지된 바 있다. 비 펩타이드 모이어티의 경우, 일반적으로 스테핀 A 단백질 변이체에 대한 화학적 컨쥬게이션(예, 아미노산 측쇄 상의 작용기 또는 C-말단의 카르복실기 또는 N-말단 말단의 아미노기 등)을 통해 접합될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 접합된 모이어티는 그 종류에 관계없이 환경 조건(예, pH 등)에 민감성인 적어도 하나의 모이어티를 포함할 수 있다. 상기 환경 조건에 민감성인 모이어티는 질병 조직 또는 보호 조직과 같은 표적 조직에서 접합 부분을 방출하는 것을 특징으로 할 수 있다.
스페이서(Spacer)
본 발명에 있어서, 상기 접합체는 스페이서 또는 예를 들어, 염증성 미세환경에 존재하는 효소에 의해 절단가능한, 기질 인식 서열(substrate recognition sequence, SRS) 및 반감기 연장 모이어티 사이의 결합(L1)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 스페이서는 임의의 분자, 예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오티드, 아미노산, 화학적 작용기일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 스페이서는 펩타이드 링커(예를 들어, 2개 이상의 아미노산)이다. 본 발명에 있어서, 상기 스페이서는 폴리펩티드의 발현, 분비 또는 생체 활성에 악영향을 미치지 않을 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 스페이서는 항원성이 아니며 면역 반응을 유도하지 않을 수 있다. 상기 면역 반응은 선천 면역 체계 및/또는 적응 면역 체계로부터의 반응을 포함한다. 따라서, 상기 면역 반응은 세포-매개 반응 및/또는 체액성 면역 반응일 수 있다. 상기 면역 반응은 예를 들어 T 세포 반응, B 세포 반응, 자연 살해(NK) 세포 반응, 단핵구 반응 및/또는 대식세포 반응일 수 있다. 본 발명에 있어서 다른 세포 반응이 고려될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 링커는 비-단백질-암호화(non-protein-coding)일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 L1은 6-말레이미도카프로일(6-maleimidocaproyl), 말레이미도프로파노일(maleimidopropanoyl) 및 말레이미도메틸 사이클로핵산-1-카르복실레이트(maleimidomethyl cyclohexane-l-carboxylate)와 같은 탄화수소(직쇄 또는 고리형)이거나, 또는 상기 L1은 N-숙시니미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트(N-Succinimidyl 4-(2-pyridylthio) pentanoate), N-숙시니미딜 4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카르복실레이트(N- Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1 carboxylate), N-숙시니미딜 (4-아이오도-아세틸) 아미노벤조네이트(N-Succinimidyl (4-iodo-acetyl) aminobenzoate)일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 L1은 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 다른 친수성 링커와 같은 폴리에테르일 수 있다. 예를 들어, 상기 L1이 결합하는 부위 또는 잔기가 티올(예: 시스테인 잔기)을 포함하는 경우 L1은 말레이미드 모이어티를 통해 티올 그룹에 결합된 폴리에틸렌 글리콜일 수 있다. 본 발명에 사용가능한 링커는 예를 들어 참조로 포함된 WO2019/236567에 기재되어 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 L1는 예를 들어, 하기 화학식으로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다:
Figure PCTKR2023002022-appb-img-000060
여기서, p는 1 내지 100, 바람직하게는 6 내지 50, 보다 바람직하게는 6 내지 12의 정수를 나타냄.
본 발명에 있어서, 상기 L1이 결합하는 부위 또는 잔기가 티올을 포함하고, L1이 말레이미드 모이어티를 통해 티올기에 결합된 탄화수소 모이어티인 경우, 상기 L2는 하기 화학식으로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다:
Figure PCTKR2023002022-appb-img-000061
여기서, p는 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 4의 정수임.
자가-희생 링커(Self-Immolative Linkers)
본 발명에 있어서, 상기 접합체는 효소에 대한 기질 인식 서열(SRS) 및 약물 모이어티 사이에 자가-희생 링커(L2)를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 자가-희생 모이어티는 두 개의 이격된 화학적 모이어티가 일반적으로 안정한 분자로 공유 결합가능한 이기작용성 화학적 그룹(bifunctional chemical group)로 정의될 수 있으며, 효소 절단에 의해 분자로부터 이격된 화학적 모이어티를 중 하나를 방출하고, 효소절단 후 이기작용성 화학 그룹의 나머지로부터 자발적으로 절단되어 상기 이격된 잔기 중 다른 하나를 방출하는 것을 특징으로 할 수 있다. 따라서, 본 발명에 있어서, 상기 자기-희생 모이어티는 이의 말단 중 하나에서, 직접적으로 또는 스페이서 유닛을 통해 간접적으로, 아마이드 결합에 의해 리간드에 공유결합되고, 다른 말단에서 약물 모이어티의 화학 반응성 부위(chemical reactive site, Functional group)에 공유결합될 수 있다. 본 발명에 있어서, 자가-희생 모이어티에 의한 약물 모이어티의 유도체화는 약물이 절단될 때까지 약물을 약리학적으로 활성을 감소시키거나 활성을 차폐할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 접합체는 일반적으로 순환계에서 안정하거나, 또는 적어도 기질 인식 서열(효소 절단가능한 링커)와 자가-희생 모이어티 사이의 아마이드 결합을 절단할 수 있는 효소가 없는 경우 안정할 수 있다. 본 발명에 있어서, 스테핀 A 단백질 변이체-약물 접합체가 적절한 효소에 노출되면 아마이드 결합이 절단되어, 자발적인 자가 희생 반응을 개시하며, 자가-희생 모이어티와 약물 모이어티의 공유결합의 절단 및 유도체화 되지 않은 형태 또는 약리학적 활성 형태의 자유 약물 모이어티의 방출을 유도할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 접합체의 자가-희생 모이어티는 하나 이상의 이종 원자를 통합하며, 향상된 용해도, 절단속도의 개선 및 접합체의 응집 경향 감소효과를 나타낼 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 L2는 벤질옥시카르보닐기(benzyloxycarbonyl group)일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 자가-희생 링커 L2는 ㅡNHㅡ(CH2)4-C(=O)- 또는 ㅡNHㅡ(CH2)3-C(=O)- 일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 L2는 PABC(p-aminobenzyloxycarbonyl)일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 L2는 2,4-비스(하이드록시메틸)아닐린(2,4-bis(hydroxymethyl)aniline)일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체-약물 접합체는 치료 모이어티 및 절단가능한 기질 인식 서열에 공유 결합된 헤테로사이클릭 자가-희생 모이어티를 채용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 L2는 벤질옥시카르보닐기(benzyloxycarbonyl group)일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 L2는 하기 화학식일 수 있다:
Figure PCTKR2023002022-appb-img-000062
여기서, 상기 R1은 수소, 비치환 또는 치환된 C1-3 알킬, 또는 비치환 또는 치환된 헤테로사이클릴임. 본 발명에 있어서, 상기 R1은 수소일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 R1은 메틸일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 L2는 하기로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다:
Figure PCTKR2023002022-appb-img-000063
본 발명에 있어서, 상기 L2는 하기로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다:
Figure PCTKR2023002022-appb-img-000064
여기서, U 는 O, S 또는 NR6이며;
Q는 CR4　또는 N 이고;
V1, V2　및 V3　는 독립적으로 CR4　또는 N이며, 단, 상기 Q, V1, V2　중 적어도 하나는 N이고;
T 는 상기 치료 모이어티에서 계류 중인 NH, NR6, O 또는 S이며;
R1, R2, R3　및 R4　는 독립적으로 다음으로부터 선택되고, H, F, Cl, Br, I, OH, ―N(R5)2, ―N(R5)3　+, C1-C8　알킬할라이드(C1-C8 alkylhalide), 카르복실레이트(carboxylate), 설페이트(sulfate), 설파메이트(sulfamate), 설포네이트(sulfonate), ―SO2R5, ―S(=O)R5, ―SR5, ―SO2N(R5)2, ―C(=O)R5, ―CO2R5, ―C(=O)N(R5)2, ―CN, ―N3, ―NO2, C1-C8　알콕시, C1-C8　할로치환된 알킬(C1-C8　halosubstituted alkyl), 폴리에틸렌옥시(polyethyleneoxy), 포스포네이트(phosphonate), 포스페이트(phosphate), C1-C8　알킬, C1-C8　치환된 알킬, C2-C8　알케닐, C2-C8　치환된 알케닐, C2-C8　알키닐(alkynyl), C2-C8　치환된 알키닐, C6-C20　아릴, C6-C20　치환된 아릴, C1-C20　헤테로사이클, 및 C1-C20　치환된 헤테로사이클; 또는 R2 및 R3이 함께 결합되어 카르보닐(=O)을 형성하거나, 탄소 수 3~7의 스피로 탄소환 고리(spiro carbocyclic ring)를 형성함; 및
R5　및 R6　는 독립적으로 다음으로부터 선택되며, H, C1-C8　알킬, C1-C8치환된 알킬, C2-C8　알케닐, C2-C8　치환된 알케닐, C2-C8 알키닐, C2-C8　치환된 알키닐, C6-C20　아릴, C6-C20　치환된 아릴, C1-C20　헤테로사이클, 및 C1-C20　치환된 헤테로사이클;
여기서, C1-C8　치환된 알킬, C2-C8　치환된 알케닐, C2-C8치환된 알키닐, C6-C20　치환된 아릴, 및 C2-C20 치환된 헤테로사이클은 독립적으로 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로부터 치환됨. F, Cl, Br, I, OH, ―N(R5)2, ―N(R5)3 +, C1-C8　알킬할라이드(C1-C8　 alkylhalide), 카르복실레이트, 설페이트, 설파메이트, 설포네이트, C1-C8　알킬설포네이트, C1-C8　알킬아미노, 4-디알킬아미노피리디늄(4-dialkylaminopyridinium), C1-C8　알킬하이드록실, C1-C8　알킬티올, ―SO2R5, ―S(=O)R5, ―SR5, ―SO2N(R5)2, ―C(=O)R5, ―CO2R5, ―C(=O)N(R5)2, ―CN, ―N3, ―NO2, C1-C8　알콕시, C1-C8　트리플로로알킬, C1-C8　알킬, C3-C12　카보사이클(C3-C12　carbocycle), C6-C20　아릴, C2-C20　헤테로사이클, 폴리에틸렌옥시(polyethyleneoxy), 포스포네이트 및 포스페이트.
본 발명에 있어서, 상기 T가 NH인 경우, 이는 치료 모이어티(자가 희생 모이어티에 커플링되기 전)에 계류 중인 1차 아민(-NH2)으로부터 유도되고, 상기 T가 N인 경우, 2차 아민(-NH-)으로부터 유도되는 것으로 이해될 수 있다. 유사하게, 상기 T가 O 또는 S인 경우, 이는 자가 희생 모이어티에 커플링되기 전에 치료 모이어티로부터 계류 중인 하이드록실(-OH) 또는 설프하이드릴(-SH) 그룹으로부터 각각 유도된다.
본 발명에 있어서, 자가-희생 링커 L2는 -NH-(CH2)4-C(=O)- 또는 -NH-(CH2)3-C(=O)-일 수 있다.
본 발명에 있어서, 자가-희생 링커 L2는 PABC(p-aminobenzyloxycarbonyl)일 수 있다.
본 발명에 있어서, 자가-희생 링커 L2는 2,4-비스(하이드록시메틸)아닐린(2,4-bis(hydroxymethyl)aniline)일 수 있다.
본 발명에 기재된 스테핀 A 단백질 변이체-약물 접합체에 사용되기 위해 쉽게 적용가능한 자가-희생 링커의 다른 예는 예를 들어, 미국 특허 제7,754,681호, WO2012/074693; US 9,089,614; WO2019236567A; EP 1,732,607; WO 2015/038426A1, Walther et al. “Prodrugs in medicinal chemistry and enzyme prodrug therapies” Adv Drug Deliv Rev. 2017 Sep 1; 118:65-77; and Tranoy-Opalinski et al.“Design of self- immolative linkers for tumor-activated prodrug therapy”, Anticancer Agents Med Chem. 2008 Aug;8(6):6l8-37; 등에 교시되어 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 기재된 스테핀 A 단백질 변이체-약물 접합체에 사용되기 위해 쉽게 적용가능한 자가-희생 링커의 또 다른 예는 국제공개공보 WO 2019/236567에 기재되어 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체, 또는 이를 포함하는 융합단백질 또는 접합체를 암호화하는 핵산에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 핵산을 포함하는 전달 비히클에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 전달 비히클은 in vivo에 전달을 위해 사용되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서 상기 핵산 또는 벡터가 도입된 유전자 조작된 세포에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산은 In vivo 전달되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체, 또는 이를 포함하는 융합단백질 또는 접합체를 암호화하는 핵산의 in vivo 전달
본 발명에 있어서, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체 또는 이를 포함하는 융합단백질, 접합체의 전달에 대한 대안적 접근법은 치료용 폴리펩티드의 생산을 신체 자체에 맡기는 것이다. 다수의 임상 연구에서 다양한 전달 시스템을 사용하여 세포로의 생체 내 유전자 전달의 유용성이 보고된 바 있다. 생체 내 유전자 전달은 환자에게 스테핀 A 단백질 변이체가 아닌 이를 암호화하는 핵산을 투여하는 것이다. 이를 통해 환자의 신체는 장기간 동안 본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체, 또는 이를 포함하는 융합단백질 또는 접합체를 생산하고 생산 부위에 따라 전신적으로 또는 국소적으로 분비할 수 있다. 유전자 기반으로 암호화된 핵산은 단백질의 기존 생산, 정제 및 투여에 대한 노동 및 비용 효율적인 대안을 제시할 수 있다. 스테핀 A 단백질 변이체, 또는 이를 포함하는 융합단백질 또는 접합체를 암호화하는 핵산의 전달을 위해 다양한 생체 내 항체 발현 플랫폼이 사용될 수 있으며, 예를 들어, 바이러스 벡터 네이키드 DNA 또는 RNA 등이 포함된다. 핵산의 유전자 전달은 상품 및 생산 비용을 줄임으로써 비용 절감을 가능하게 할 뿐만 아니라 약물 투여 빈도를 줄일 수도 있다. 전반적으로, 핵산의 발현에 의한 본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체, 또는 이를 포함하는 융합단백질 또는 접합체의 생체내 생산은 (i) 저비용으로 광범위한 치료 또는 예방 용도로의 작용, (ii) 선진국 및 개발도상국에서의 접근성 향성 및 (iii) 보다 효과적이고 저렴한 치료 방법으로서의 장접을 갖는다. 생체 내 유전자 전달 외에도, 숙주(또는 기증자)로부터 수확된 세포를 기반으로 본 발명의 핵산으로 유전자 조작된 세포 치료제를 생산하고 환자에게 투여할 수 있다.
근육내 항체 유전자 투여는 가장 널리 평가되었으며(Deal et al. (2015) “Engineering humoral immunity as prophylaxis or therapy” Curr Opin Immunol. 35:113-22.) 본 발명의 핵산의 생체 내 전달을 위한 투여 방법으로 적용될 수 있다. 실제로, 골격근의 고유한 해부학적, 세포적 및 생리학적 특성으로 인해 long-term 암호화된 핵산의 발현 및 전신 순환을 위한 안정적인 환경이 제공되며, 쉽게 반복 투여가 가능하다. 풍부한 혈관은 생체 내에서 발현 및 분비된 본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체, 또는 이를 포함하는 융합단백질 또는 접합체가 순환계로 효율적으로 수송될 수 있는 시스템을 제공한다. 본 발명에 있어서, 생체 내 전달된 핵산은 숙주 게놈에 통합될 수 있으나, 숙주 게놈에서의 통합은 장기간 단백질의 발현을 달성하기 위한 전제 조건이 아니다. 간은 전임상 항체 유전자 전달에 자주 사용되는 또 다른 부위이며 일반적으로 정맥(i.v.) 주사를 통해 형질감염될 수 있다. 간은 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체 및 이를 포함하는 융합단백질의 혈관 분비 및 전신 순환을 위한 유전자 전달 부위일 수 있다. 간은 혈장 단백질을 합성하며, 다양한 생리기능을 가져 본 발명의 핵산의 전달을 통한 스테핀 A 단백질 변이체 및 이를 포함하는 융합단백질의 발현에 적합할 수 있다.
유전자 치료의 성공은 주로 비바이러스 및 바이러스 유전자 전달 벡터의 개선에 의해 주도되었다. 일련의 물리적 및 화학적 비바이러스 방법이 DNA와 mRNA를 포유류 세포로 전달하는 데 사용되었으며 이들 중 상당 수는 생체 외 및 생체 내에서 유전자 치료를 위한 임상 단계 기술로 개발되어 본 발명의 핵산을 사용한 유전자 치료에 쉽게 적용 가능하다. 양전하를 띤 머리 그룹과 소수성 지질 꼬리를 가진 양친매성 지질이 음전하를 띤 DNA 또는 RNA에 결합하고 일반적으로 세포내이입에 의해 세포로 들어가는 입자를 형성하는 능력을 갖는 양이온성 리포솜 기술을 사용할 수 있다. 일부 양이온성 리포좀은 또한 중성 공지질(neutral co-lipid)을 함유하고 있는데, 이는 포유동물 세포에 의한 흡수를 향상시키는 것으로 이해된다. (Felgner et al. (1987) Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. MNAS 84:7413-7417; San et al. (1983) “Safety and short-term toxicity of a novel cationic lipid formulaion for human gene therapy” Hum. Gene Ther. 4:781-788; Xu et al. (1996) “Mechanism of DNA release from cationic liposome/DNA complexes used in cell transfection” Biochemistry 35:5616-5623; and Legendre et al. (1992) “Delivery of plasmid DNA into mammalian cell lines using pH-sensitive liposomes: comparison with cationic liposomes” Pharm. Res. 9, 1235-1242. 참조).
유사하게, 폴리-l-리신 및 폴리에틸렌-이민과 같은 다른 폴리양이온은 본 발명의 핵산을 전달하는 데 사용될 수 있다. 이러한 폴리양이온은 전하 상호작용을 통해 핵산과 복합체를 이루고 DNA 또는 RNA가 나노입자로 응축되는 것을 도와주며, 나노입자는 엔도솜 매개 흡수를 위한 기질이 된다. 플라스미드 DNA, 올리고데옥시뉴클레오티드 및 다양한 형태의 합성 RNA와의 복합체를 포함하여 이러한 양이온성 핵산 복합체 기술 중 몇 가지가 잠재적인 임상 제품으로 개발되었다. 변형된(Modified) 및 변형되지 않은(Unmodified, 또는 "네이키드") DNA 및 RNA는 또한 여러 상황에서 성공적인 유전자 전달을 매개하는 것으로 나타났으며 암호화된 핵산의 전달을 위한 시스템으로도 사용될 수 있다. 여기에는 직접 근육 주사에 의한 플라스미드 DNA의 사용이 포함된다. 예를 들어, Rodrigo et al. (2012) “De novo automated design of small RNA circuits for engineering synthetic riboregulation in living cells” PNAS 109:15271-15276; Oishi et al. (2005) “Smart polyion complex micelles for targeted intracellular delivery of PEGylated antisense oligonucleotides containing acid-labile linkages” Chembiochem. 6:718-725; Bhatt et al. (2015) “Microbeads mediated oral plasmid DNA delivery using polymethacrylate vectors: an effectual groundwork for colorectal cancer” Drug Deliv. 22:849-861; Ulmer et al. (1994) Protective immunity by intramuscular injection of low doses of influenza virus DNA vaccines” Vaccine 12: 1541-1544; and Heinzerling et al. (2005) 등이 참조된다.
바이러스 벡터는 현재 대부분의 전임상 및 임상 유전자 치료 시험에서 전달 수단으로 사용되며 최초로 승인된 유전자 치료에서 사용된다(Gene Therapy Clinical Trials Worldwide 2017 (abedia.com/wiley/)). 이에 대한 주요 동인은 자연적인 진화 발달을 반영하는 탁월한 유전자 전달 효율성이다. 바이러스 벡터 시스템은 바이러스가 감염에 의해 세포막을 통과하는 능력을 진화시켜 본 발명의 핵산을 표적 세포에 전달하기 때문에 유전자 전달에 매력적이다. 아데노바이러스 시스템에 의해 개척된 바이러스 벡터 매개 항체 유전자 전달 분야는 지난 수십 년 동안 상당한 발전을 이루었다. 성공적으로 평가된 무수히 많은 투여 경로, 전임상 모델 및 질병 적응증은 항체 유전자 전달 능력을 완전히 보여주며, 이를 통해 숙련된 기술자는 항체 유전자 전달 시스템을 본 발명의 핵산의 생체 내 전달을 위한 기술로 쉽게 선별하고 적용시킬 수 있다. 근육은 연장된 mAb 발현을 위한 선택 투여 부위로 떠오르고 있으며, 본 발명의 핵산의 발현을 위한 적합한 표적 조직이 될 수 있다.
본 발명의 핵산의 생체 내 유전자 전달은 발현 플라스미드와 같은 비바이러스 벡터를 사용하여 달성할 수도 있다. 비바이러스 벡터는 쉽게 생성되며 특정 면역 반응을 유도하지 않는 것으로 보고된다. 근육 조직은 혈관이 잘 형성되어 있으며 쉽게 접근할 수 있고, 근세포는 수명이 긴 세포이기 때문에 형질감염을 위한 표적 조직으로 가장 자주 사용된다. 네이키드 플라스미드 DNA를 근육 내 주사하면 일정 비율의 근세포가 형질감염된다. 이러한 접근법을 사용하여 사이토카인 및 사이토카인/IgG1 키메라 단백질을 암호화하는 플라스미드 DNA가 생체 내에서 도입되었으며 (자가 면역) 질병 결과에 긍정적인 영향을 미친 것으로 보고되었다.
일부 경우에, 유전자 전달 및 발현 수준의 향상을 나타내는 혈관 내 전달을 통한 형질 감염 효율을 증가시키기 위해 정맥에 짧은 기간의 일시적 고압을 유도할 수 있다. 이러한 일시적인 혈관 압력의 증가는 국소 흡수를 촉진할 수 있으며, 이를 위한 특수 혈압 커프가 보고된 바 있다(Zhang et al. (2001) “Efficient expression of naked DNA delivered intraarterially to limb muscles of nonhuman primates” Hum. Gene Ther., 12:427-438).
생체 내 유전자 전달 효율은 화학적 운반체(양이온성 중합체 또는 지질)를 사용하거나 물리적 접근 방식(유전자총 전달 또는 전기천공법)을 통해 핵산 전달을 개선하는 것과 같은 다른 기술을 통해서도 증가될 수 있다(Tranchant et al. (2004) “Physicochemical optimization of plasmid delivery by cationic lipids” J. Gene Med., 6 (Suppl. 1):S24-S35; and Niidome et al. (2002) “Gene therapy progress and prospects: nonviral vectors” Gene Ther., 9:1647-1652. Electroporation is especially regarded as an interesting technique for nonviral gene delivery. Somiari, et al. (2000) “Theory and in vivo application of electroporative gene delivery” Mol. Ther. 2:178-187; and Jaroszeski et al. (1999) “In vivo gene delivery by electroporation” Adv. Drug Delivery Rev., 35:131-137). 전기천공을 사용하면 펄스 전류가 국소 조직 영역에 적용되어 세포 투과성을 향상시켜 막을 통한 유전자 전달을 가능하게 한다. 연구에 따르면 전기천공을 사용한 생체 내 유전자 전달은 전기천공법이 없는 것보다 적어도 10-100배 더 효율적일 수 있다(예, Aihara et al. (1998) “Gene transfer into muscle by electroporation in vivo” Nat. Biotechnol. 16:867-870; Mir, et al. (1999) “High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses” PNAS 96:4262-4267; Rizzuto, et al. (1999) “Efficient and regulated erythropoietin production by naked DNA injection and muscle electroporation” PNAS 96: 6417-6422; and Mathiesen (1999) “Electropermeabilization of skeletal muscle enhances gene transfer in vivo” Gene Ther., 6:508-514.).
본 발명에 있어서, 상기 암호화된 핵산은 바이러스, 비바이러스 또는 물리적을 포함한 유전자 치료에 일반적으로 사용되는 광범위한 유전자 전달 시스템에 의해 전달될 수 있다. 예를 들어, Rosenberg et al., Science, 242:1575-1578, 1988, and Wolff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9011-9014 (1989). Discussion of methods and compositions for use in gene therapy include Eck et al., in Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition, Hardman et al., eds., McGraw-Hill, New York, (1996), Chapter 5, pp. 77-101; Wilson, Clin. Exp. Immunol. 107 (Suppl. 1):31-32, 1997; Wivel et al., Hematology/Oncology Clinics of North America, Gene Therapy, S. L. Eck, ed., 12(3):483-501, 1998; Romano et al., Stem Cells, 18:19-39, 2000, 및 미국 특허 제6,080,728호 참조.
전달 경로는 예를 들어 전신 투여 및 in situ 투여를 포함한다. 효과적인 유전자 전달을 위해서는 필요한 특정 조직/세포로 향해야 하며, 결과로 생성되는 도입유전자 발현은 특정 용도에 적합한 수준이어야 한다. 프로모터는 세포 특이성뿐만 아니라 발현의 전반적인 강도를 지시할 수 있는 벡터 게놈 디자인 내의 주요한 시스 작용 요소(cis-acting element)이다.
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Figure PCTKR2023002022-appb-img-000066
Figure PCTKR2023002022-appb-img-000067
본 발명에 있어서, 모든 세포 유형에서 암호화된 핵산의 유비쿼터스 발현이 바람직할 수 있다. EF1α(Human elongation factor 1α-subunit), CMV(Immediate-early cytomegalovirus), CBA(chicken β-actin) 및 이의 유도체 CAG, GUSB(β glucuronidase) 또는 유비퀴틴 C(UBC)와 같은 구성적 프로모터는 대부분의 조직에서 암호화된 핵산의 발현을 촉진하는 데 사용된다. 일반적으로 CBA와 CAG는 구성적 프로모터 중에서 더 강한 발현을 촉진한다. 그러나 CMV(~0.8kbs) 또는 EF1α(~1.2kbs)와 비교하여 ~1.7kbs의 크기는 AAV와 같은 패키징 제약이 있는 벡터에서의 사용을 제한할 수 있으며, 특히 본 발명의 핵산의 크기가 큰 경우 사용이 제한될 수 있다. GUSB 또는 UBC 프로모터는 각각 378 bps 및 403 bps의 작은 크기로 유비쿼터스 유전자 발현을 제공할 수 있지만 CMV 또는 CBA 프로모터보다 비교적 약하다. 따라서 발현에 영향을 미치지 않으면서 크기를 줄이기 위한 구성적 프로모터에 대한 변형이 추구되었으며 CBh(~800bps) 및 miniCBA(~800bps)와 같은 예는 선택된 조직에서 유사하고 훨씬 더 높은 발현을 촉진할 수 있다(Gray et al., Hum Gene Ther. 2011 22:1143-1153).
본 발명에 있어서, 상기 암호화된 핵산의 발현이 기관 내의 특정 세포 유형으로 제한되어야 하는 경우, 프로모터를 사용하여 이 특이성을 매개할 수 있다. 예를 들어, 신경계 내에서 프로모터는 뉴런, 성상세포 또는 희소돌기아교세포에 대한 발현을 제한하는 데 사용된다. 뉴런에서 뉴런 특이적 에놀라제(NSE) 프로모터는 유비쿼터스 프로모터보다 더 강력한 발현을 유도한다. 또한 혈소판 유래 성장 인자 B-사슬(PDGF-β), 시냅신(Syn) 및 메틸-CpG 결합 단백질 2(MeCP2) 프로모터는 NSE보다 낮은 수준에서 뉴런 특이적 발현을 유도할 수 있다. 성상 세포에서 신경교 섬유성 산성 단백질(GFAP, 2.2kbs) 프로모터의 680bps 길이 단축 버전[gfaABC(1)D]은 GFAP 프로모터와 동일한 성상 세포 특이성을 가진 더 높은 수준의 발현을 부여할 수 있다. 발현을 신경아교세포로 제한하는 미엘린 염기성 단백질(MBP) 프로모터의 선택으로 희소돌기아교세포를 표적으로 발현을 부여할 수 있으나 1.9kbs의 크기와 낮은 발현 수준으로 인해 사용이 제한됩니다.
골격근 세포에서 본 발명의 핵산을 발현하는 경우, 근육 크레아틴 키나제(MCK) 및 desmin(1.7kbs)에 기반한 예시적인 프로모터는 높은 비율의 특이성을 나타낸다(원하는 경우 간에서 최소 발현됨). α-미오신 중쇄의 프로모터(α-MHC; 1.2kbs)는 다른 근육 프로모터와 비교하여 상당한 심장 특이성을 보였다(Lee et al., 2011 J Cardiol. 57(1):115-22). 조혈 줄기 세포에서 합성 MND 프로모터(Li et al., 2010 J Neurosci Methods. 189(1):56-64) 및 2AUCOE (ubiquitous chromatin opening element)에 함유된 프로모터는 각각 EF1α 및 CMV 프로모터와 비교할 때 모든 세포 계통에서 더 높은 트랜스진 발현을 유도하는 것으로 나타났다 (Zhang et al., 2007 Blood. 110(5):1448-57; Koldej 2013 Hum Gene Ther Clin Dev. 24(2):77-85; Dighe et al., 2007 Blood. 110(5):1448-57; al., 2014 PLoS One.9(8): e104805.). 반대로, 벡터 매개 유전자 전달 후 발현을 간 간세포로만 제한하기 위해 프로모터를 사용하는 것은 위험이 있는 시스템에서 트랜스유전자 특이적 면역 반응을 감소시키고 심지어 발현된 단백질에 대한 면역 내성을 유도하는 것으로 나타났다 (Zhang et al., 2012 Hum Gene Ther. 23(5):460-72). α1-항트립신(hAAT; 347bps) 및 티록신 결합 글로불린(TBG; ~400bps) 프로모터는 다른 조직에 대한 침입을 최소화하면서 간으로 제한된 유전자 발현을 유도한다(Yan et al., 2012 Gene. 506(2): 289-94; Cunningham et al., 2008 Mol Ther.16(6):1081-8).
본 발명에 있어서, 생체 내 전달된 암호화된 핵산 발현의 기간 및 양을 제어하기 위한 메커니즘이 요구되며, 당업계에 바이러스 벡터화 및 플라스미드 DNA 기반 유전자 전달에 사용할 수 있는 다양한 유도성 프로모터가 공지되어 있다: Fang et al. (2007) Mol Ther. 5(6):1153-9; and Perez et al. (2004) Genet Vaccines Ther. 2(1):2. 현재 임상 시험 중인 조절 가능한 메커니즘의 예는 소분자 리간드에 의해 활성화되는 엑디손 기반 유전자 스위치이다: Cai et al. (2016) Clin Pharmacol Drug Dev. 2016.
본 발명의 핵산의 생체 내 전달 및 발현에 있어서, 바이러스 전사후 조절 요소(PRE)가 사용될 수 있다; 이러한 cis-작용 요소는 인트론 없는 바이러스 RNA의 핵 탈출(export)에 요구된다(Huang and Yen, 1994 J Virol. 68(5):3193-9; 및 1995 Mol Cell Biol. 15(7):3864-9). 예를 들어, HPRE(B형 간염 바이러스 PRE, 533bps) 및 WPRE(Woodchuck Hepatitis Virus PRE, 600bps)를 포함하며, 이는 특정 경우에 전달된 유전자의 발현 수준을 거의 10배까지 증가시킬 수 있다(Donello et al., 1998 J Virol. 72(6):5085-92). 추가적으로, 렌티바이러스 및 AAV 벡터를 사용할 때, WPRE는 CMV 프로모터 구동 트랜스진의 발현을 증가시킬 뿐만 아니라 PPE, PDGF 및 NSE 프로모터 구동 트랜스진 발현을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. WPRE의 또 다른 효과는 암호화된 핵산 유전자의 침묵으로부터 보호하는 것일 수 있다(Paterna et al., 2000 Gene Ther. 7(15):1304-11; Xia et al., 2007 Stem Cells Dev. 2007 Feb;16(1):167-76).
암호화된 핵산의 전사체의 폴리아데닐화는 또한 핵 탈출, 번역 및 mRNA 안정성에 중요할 수 있다. 따라서, 본 발명에 있어서, 상기 핵산은 폴리아데닐화 신호 서열을 포함할 수 있다. 유전자 발현 및 mRNA 안정성에 대한 다양한 polyA 신호의 영향을 결정한 다양한 연구가 공지되어 있다. 예시적인 폴리아데닐화 신호 서열은 SV40 후기 또는 소 성장 호르몬 폴리A(bGHpA) 신호 서열뿐만 아니라 최소 합성 폴리A(SPA) 신호를 포함한다(Levitt et al., 1989 Genes Dev. 3(7):1019-25; Yew et al. ., 1997 Hum Gene Ther. 1997 8(5):575-84). 폴리아데닐화의 효율은 다른 polyA 신호의 상류에 위치한 SV40 후기 polyA 신호 상류 인핸서(USE)에 의해 증가된다(Schek et al., 1992 Mol Cell Biol. 12(12):5386-93). 본 발명에 있어서, 예를 들어, 상기 핵산은 SV40 late + 2xUSE polyA 신호를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
Figure PCTKR2023002022-appb-img-000068
본 발명에 있어서, 상기 핵산은 바람직하게는 임의의 프로모터 서열에 더하여 적어도 하나의 조절 인핸서(regulatory enhancers)를 추가로 포함할 수 있다. CMV 인핸서는 -598 내지 -68에서 CMV 프로모터의 업스트림이고(Boshart et al., 1985 Cell. 41(2):521-30)(~600bps) 전사 결합 부위를 함유한다. 본 발명에 있어서, 예를 들어, ANF (atrial natriuretic factor) 프로모터, CC10 (club cell 10) 프로모터, SP-C (surfactant protein C) 프로모터, 또는 PDGF-β (platelet-derived growth factor-β) 프로모터와 같은 조직 특이적 프로모터 구동 트랜스진 발현을 증가시키기 위해 CMV 인핸서가 컨스트럭트에 포함될 수 있다. 전체적으로, CMV 인핸서는 상이한 세포 특이적 프로모터 및 상이한 세포 유형 하에서 도입유전자 발현을 증가시켜 도입유전자 발현 수준을 증가시키는 데 광범위하게 적용할 수 있는 도구이다. 근육에서, 예를 들어 AAV 발현 시스템에서 근육 특이적 프로모터와 함께 CMV 인핸서를 사용하는 이식유전자 발현은 이식유전자에 의해 암호화된 단백질의 발현 수준을 증가시킬 수 있으므로, 본 발명의 핵산을 근육세포에서 발현하는데 특히 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 핵산은 적어도 하나의 인트론 서열을 추가로 포함할 수 있다. mRNA에서 인트론 또는 개재 서열의 존재는 시험관 내에서 mRNA 프로세싱 및 증가된 도입유전자 발현에 중요하다고 보고된 바 있다(Huang and Gorman, 1990 Mol Cell Biol. 10(4):1805-10; Niwa et al., 1990 Genes Dev. 4(9):1552-9). 인트론(들)은 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체, 또는 이를 포함하는 융합단백질 또는 접합체를 암호화하는 핵산 서열 내에 위치할 수 있고/있거나 프로모터와 이식유전자 사이에 위치할 수도 있다. 표 14는 간 트랜스진 발현에 대해 AAV2를 사용하는 마우스에서 프로모터와 트랜스진 사이에 배치된 다양한 인트론을 비교한 것이다(Wu et al., 2008). MVM(생쥐의 미세 바이러스) 인트론은 테스트된 다른 어떤 인트론보다 더 많이 이식유전자 발현을 증가시켰으며, 인트론이 없는 경우보다 80배 이상 증가한 것으로 보고되었다(Wu et al., 2008). 그러나, AAV 발현 카세트를 사용하는 배양된 뉴런에서, 도입유전자 발현은 WPRE와 비교하여 도입유전자와 polyA 신호 사이에 키메라 인트론(human β-globin donor and immunoglobulin heavy chain acceptor)이 있는 CaMPKII 프로모터 하에서 더 적게 나타났다(Choi et al., 2014). 본 발명에 있어서, 상기 인트론은 이식유전자 발현을 증가시키기 위해 발현 카세트에 포함되는 중요한 요소가 될 수 있다.
Figure PCTKR2023002022-appb-img-000069
본 발명에 있어서, 상기 벡터는 에피솜 벡터일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 벡터가 에피솜 벡터인 경우, 적어도 하나의 복제 원점, 미니염색체 유지 요소(MME) 및/또는 핵 국소화 요소를 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 에피솜 벡터는 벡터가 자가-복제되고, 여러 세대에 걸쳐 숙주 세포에서 지속되는 데 필요한 복제 원점(ori)을 암호화하는 바이러스 게놈 DNA의 일부를 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 에피솜 벡터는 복제에 필요한 적어도 하나의 바이러스 단백질, 예를 들어 복제자 단백질(replicator protein)을 암호화하는 적어도 하나의 유전자를 포함할 수 있다. 선택적으로, 상기 복제 개시를 돕는 복제자 단백질은 본 발명의 자가 복제 에피솜 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포에서 또 다른 벡터 또는 숙주 게놈 DNA와 같은 또 다른 DNA 분자 상에서 트랜스로 발현될 수 있다. 본 발명에 있어서, 바람직하게는 자기 복제 에피솜 LCR 함유 발현 벡터는 감염성 바이러스 입자를 생성하는 코어 또는 캡시드 단백질을 암호화하는 바이러스 게놈 DNA 또는 전장 바이러스 게놈 DNA 분자에 존재할 수 있는 바이러스 온코제닉 서열과 같은 진핵 숙주 세포에서 장기간 안정적인 유지에 필요하지 않은 바이러스 서열을 함유하지 않을 수 있다. 본 발명에 있어서, “안정적인 유지”는 2, 3, 4 또는 5세대 또는 그 이상의 세대에 대한 벡터의 복제 수에서 비분열 세포 또는 연속 선택이 없을 때 분열하는 세포의 자손 세포에서 상당한 손실 없이 (예: >50%) 지속되거나 유지되는 자가-복제 에피솜 발현 벡터의 능력을 지칭한다. 본 발명에 있어서, 상기 벡터는 10 내지 15 또는 그 이상의 세대에 걸쳐 유지될 수 있다. 대조적으로 숙주세포에서 플라스미드의 “일시적(transient)” 또는 “단기(short term)” 지속성은 벡터가 숙주세포에서 안정적인 방식으로 복제 및 분리될 수 없음을 의미한다. 이 경우, 벡터는 1~2세대 후에 손실되거나 연속적인 세대 사이에 복제 수의 >51% 손실을 나타낸다.
본 발명에 있어서, 유용한 몇 가지 대표적인 자기 복제, LCR 함유, 에피솜 벡터가 아래에서 추가로 설명된다. 자가 복제 기능은 Wohlgeuth et al., 1996, Gene Therapy 3:503; Vos et al., 1995, Jour. Cell. Biol., Supp. 21A, 433; 및 Sun et al., 1994, Nature Genetics 8:33 등에서 서술된 것과 같이, 대안적으로 적어도 하나의 포유동물 서열에 의해 제공될 수 있으며, 선택적으로 핵 유지(nuclear retention) 필요할 수 있는 적어도 하나의 서열과 조합될 수 있다. 자가 복제 기능을 제공하기 위한 포유류, 특히 인간 서열 사용의 이점은 독성 또는 발암 특성을 가질 수 있는 외래 활성화 인자가 필요하지 않다는 것이다. 통상의 기술자는 본 발명이 하나의 복제 원점 또는 임의의 하나의 에피솜 벡터에 제한되지 않고, 에피솜 벡터에서 LCR의 조직 제한된 조절의 조합을 포함할 수 있음을 이해할 수 있다. 또한, 본 발명에서 WO1998007876 및 미국 특허 제7,790,446호가 참조된다.
본 발명에 있어서, 상기 에피솜 발현 벡터는 예를 들어, Epstein-Barr 바이러스 기반 자가 복제 에피솜 발현 벡터(Yates et. al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 81:3806-3810 (1984); Yates et al., Nature 313:812-815 (1985); Krysan et al., Mol . Cell . Biol . 9:1026-1033 (1989); James et al. Gene 86: 233-239 (1990), Peterson and Legerski, Gene 107:279-284 (1991); and Pan et al., Som . Cell Molec. Genet . 18:163-177 (1992)); 파필로마 바이러스 기반 자가 복제 에피솜 발현 벡터(예를 들어, 소 파필로마 바이러스 및 인간 파필로마 바이러스((Ustav et al., EMBO J. 10: 449-457 (1991); Ustavet al., EMBO J . 10:4231-4329, (1991); Ustav et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90: 898-902 (1993))); 또는 파포바이러스 기반 자가 복제 에피솜 발현 벡터(Papovavirus-Based, Self-Replicating, Episomal Expression Vectors, De Benedetti and Rhoads, Nucleic Acids Res . 19:1925 (1991), as can a 3.2 kb fragment of the BK virus (Cooper and Miron, Human Gene Therapy 4:557 (1993))일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant) 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체를 암호화하는 핵산은 원형 또는 선형 핵산으로 제공될 수 있다. 상기 원형 또는 선형 핵산은 적절한 표적 세포에서 암호화 서열의 발현을 지시할 수 있다, 본 발명에 있어서, 상기 발현을 위한 적어도 하나의 핵산 시느템은 키메라일 수 있으며, 이는 이러한 구성요소중 적어도 하나가 다른 요소중 적어도 하나와 관련하여 이종임을 의미한다.
핵산(또는 벡터)의 도입 방법
본 발명의 용어, “도입”은 숙주세포가 갖지 않는 외부 유전자(핵산 또는 벡터)을 숙주세포가 수용하도록 하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant) 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체를 암호화하는 핵산은 이를 포함하는 벡터를 사용하여 숙주세포에 도입되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어, “벡터”는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로, 바이러스벡터 또는 비 바이러스성 벡터일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 예를 들어, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터(예, 감마레트로 바이러스 벡터), 백시니아 바이러스 (Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy, 10:649-657(1999); Ridgeway, 467-492(1988); Baichwal and Sugden, In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, 117-148(1986) and Coupar et al., Gene, 68:1-10(1988)), 렌티바이러스 (Wang G. et al., J. Clin. Invest., 104(11):R55-62(1999)), 단순 헤르페스 바이러스 (Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 92:1411-1415(1995)), 폭스바이러스 (GCE, NJL, Krupa M, Esteban M., Curr Gene Ther 8(2):97-120(2008)), 레오바이러스, 홍역 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스 및 폴리오바이러스와 같은 바이러스 유래 벡터 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 비 바이러스성 벡터는 네이키드 플라스미드 DNA(pDNA), 선형 핵산 또는 선형 발현 카세트(linear expression cassette, LEC, 플라스미드 벡터(Sambrook et al., 1989) 및 미니 서클(Yew et al. 2000 Mol Ther 1(3), 255-62)과 같은 비-바이러스성 벡터를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
벡터의 성분으로는 일반적으로 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 원점, 하나 이상의 항생제 내성 마커 유전자, 증강인자 요소, 프로모터, 전사 종결 서열. 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체, 또는 이를 포함하는 융합단백질 또는 접합체를 암호화하는 핵산은 프로모터 및 전사 종결 서열 등과 같이 작동적으로 연결될 수 있다.
"작동적으로 연결"은 핵산 발현조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 따라 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 또한, 예를 들어, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명에 있어서, 상기 프로모터는 진핵 프로모터인 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 CMV 프로모터, PGK 프로모터, EF1α 프로모터, EFS 프로모터, CBh 프로모터, MSCV 프로모터, SFFV 프로모터, 및 UbC 프로모터로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 가장 바람직하게는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, EF1α 프로모터 및 CBh 프로모터로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 프로모터는 인핸서(enhancer) 서열을 포함하는 것을 추가적인 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
경우에 따라서, 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.
상기 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린(ampicillin), 겐타마이신(gentamycin), 카베니실린(carbenicillin), 클로람페니콜(chloramphenicol), 스트렙토마이신(streptomycin), 카나마이신(kanamycin), 푸로마이신(puromycin), 블라스티시딘(blasticidin), 하이그로마이신(hygromycin), 게네티신(geneticin), 네오마이신(neomycin) 및 테트라사이클린(tetracyclin)에 대한 내성 유전자가 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant) 또는 이를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산은 숙주세포의 유전자 내로 혼입되어 도입되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant) 또는 이를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산은 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용한 화학적 합성에 의해 작제될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 원하는 폴리펩타이드의 아미노산 서열 및 관심 재조합 폴리펩타이드가 생성될 숙주세포에서 선호되는 코돈을 선택하여 설계될 수 있다. 표준 방법을 적용하여 분리된 관심 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 합성할 수 있다. 예를 들어, 완전한 아미노산 서열을 사용하여 역번역된 유전자를 구성할 수 있다. 또한, 특정 단리된 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 올리고머가 합성될 수 있다. 예를 들어, 원하는 폴리펩타이드의 일부를 암호화하는 여러 개의 작은 올리고뉴클레오타이드를 합성한 다음 결찰할 수 있다. 개별 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 상보적 조립을 위한 5' 또는 3' 돌출부를 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant) 또는 이를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열이 수득되면, 이를 포함하는 벡터는 당업계에 널리 공지된 기술을 사용하는 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다. 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체 또는 이를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 서열 및 적절한 전사 및 번역 제어 신호를 함유하는 발현 벡터를 구축할 수 있다. 이러한 방법에는 예를 들어 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 유전자 재조합이 포함된다. (예를 들어 Sambrook et al, 1990, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 및 Ausubel et al. eds., 1998, CURRENT PROTOCOLS IN 분자 생물학, John Wiley & Sons, NY).
본 발명에 있어서, 숙주세포로의 핵산 또는 벡터의 도입은 당업자에게 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant) 또는 이를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 또는 이를 포함하는 비-바이러스성 발현 벡터는 통상적인 기술(예를 들어, RNA 매개 유전자 전달, 전기천공, 리포솜 형질감염 및 인산칼슘 침전)에 의해 숙주세포로 전달 및 도입될 수 있다.
본 발명의 유전자 전달 시스템이 바이러스 벡터 구축을 기반으로 구축되는 경우, 당업계에 공지된 통상적인 감염 방법으로 전달이 수행될 수 있다. 예를 들어, 전기천공(electroporation; Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982); and Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718(1986)), DNA를 입자(예, 금)에 로드하고 세포내로 침투시키는 유전자 충격(gene bombardment, Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572 (1990), 소노포레이션(sonoporation), 자기감염(magnetofection), 유체역학적 전달(hydrodynamic delivery) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 또는 벡터는 RNA 매개 유전자 전달을 통해 숙주세포로 전달될 수 있다(mRNA-based therapeutics: developing a new class of drugs” Nat Rev Drug Discov. 13(10):759-80.; Pardi et al. 2015 J Control Release 217:345-51; WO2017/162266; Stadler et al. (2017) Nature Medicine 23:815-817; WO/2017/036889; WO2015/034928; WO2015/034925; WO2013/151666 등 참조). 본 발명에 있어서, 예시적인 mRNA 및 다른 핵산은 WO2017/049275, WO2016/118724, WO2016/118725, WO2016/011226, WO2015/196128, WO/2015/196130, WO/2015/196118, WO/2015/089511, 및 WO2015/105926등에 기재된 명세서 및 도면을 참조한다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 또는 벡터는 전기천공을 통해 숙주세포에 도입될 수 있다(Kim et al. Cancer Gene Ther, (2016) 23(10): 341-347, 본 발명에 있어서, 전기천공은 예를 들어 미국 특허 제7,245,963호; 제6,302,874호; 제5,676,646호; 제6,241,701호; 제6,233,482호; 제6,216,034호; 제6,208,893호; 제6,192,270호; 제6,181,964호; 제6,150,148호; 제6,120,493호; 제6,096,020호; 제6,068,650호; 및 제5,702,359호; 국제 공개공보 WO/2017/106795, WO/2016/161201, WO/2016/154473, WO/2016/112359 및 WO/2014/066655 등에 기재된 방법을 참조하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산의 전달을 위해 형질전환 강화 제형(Transfection Enhancing Formulations)이 사용될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 핵산은 세포막과 상호작용할 수 있고 융합하거나 세포내이입을 거쳐 핵산을 세포로 전달할 수 있는 리포좀 바람직하게는 양이온성 리포좀((Wong, T. K. et al., Gene, 10:87(1980); Nicolau and Sene, Biochim. Biophys. Acta, 21:185-190 (1982); and Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176 (1987))), 또는 폴리머좀(합성 리포좀)에 캡슐화 될 수 있다. 본 발명에 있어서, DNA는 또한 중합체(폴리플렉스) 또는 세포의 세포질로 부하를 직접 방출할 수 있는 덴드리머와의 복합체로 형성될 수 있다. 예시적인 담체로서, 폴리(락타이드-코-클리콜라이드) (poly(lactide-co-glycolide)), 폴리아크릴레이트, 락텍스, 전분, 셀룰로오스, 덱스트란 등의 미립자를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 또 다른 예시적인 담체로서, 비액체 친수성 코어(예를 들어, 가교된 다당체 또는 올리고당) 및 임의의 인지질과 같은 양친매성 화합물을 포함하는 외부 레이어를 포함하는 초분자 바이오벡터(supramolecular biovectors)가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다 , (미국 특허 제5,151,254호, WO 94/20078, WO/94/23701 및 WO 96/06638 등 참조). 생분해성 마이크로스피어(예를 들어, 폴리락테이트 폴리글리콜레이트)는 조성물을 위한 담체로 사용될 수 있다. 본 발명에 있어서, 적합한 생분해성 마이크로스피어의 예는 미국 특허 제4,897,268호, 제5,075,109호, 제5,928,647호, 제5,811,128호, 제5,820,883호, 제5,853,763호, 제5,814,344호, 제5,407,609호 및 제5,942,252호와 같다. WO/99 40934 및 이에 인용된 참고문헌에 기재된 변형된 헤파티티스 B 코어 단백질 담체 시스템(Modified hepatitis B core protein carrier system)또한 유용하게 응용될 수 있다. 또 다른 예시적인 담체/전달 시스템은 미국 특허 제5,928,647호에 기술된 것과 같은 미립자-단백질 복합체를 포함하는 담체를 사용하며, 이는 본 발명의 핵산을 전달하는 데 사용될 때 추가 이점을 가질 수 있다.생분해성 고분자 나노입자는 세포로의 비바이러스성 핵산 전달을 촉진할 수 있다. 작고(약 200nm), 양전하를 띄는(약 10mV) 입자는 양이온성, 가수분해가능한 poly(beta-amino esters) 및 플라스미드 DNA의 자가조립에 의해 형성된다.
본 발명의 핵산은 또한 직접적인 미세주사, 일시적 세포투과(예를 들어, 억제인자 및/또는 활성인자와 세포 투과제의 동시투여), 막전좌 펩타이드로의 융합 등에 의해 세포에 도입될 수 있다.
in vitro 및 in vivo에서 mRNA를 포함하는 외래 핵산의 지질-매개 핵산 전달 및 발현은 매우 성공적이었다. 지질 기반 비바이러스 제형은 바이러스 유전자 요법에 대한 대안을 제공한다. 현재 생체 내 지질 전달 방법은 피하, 피내, 종양내 또는 두개내 주사를 사용한다. 지질 제제의 발전으로 생체 내 유전자 전달 효율이 개선되었다(WO 98/07408 참조). 예를 들어, 1,2-비스(올레오일옥시)-3-(트리메틸 암모니오)프로판(DOTAP)과 콜레스테롤의 등몰비로 구성된 지질 제제는 전신 생체 내 유전자 전달을 상당히 향상시킬 수 있다. DOTAP:콜레스테롤 지질 제형은 "샌드위치 리포솜(sandwich liposome)"이라는 독특한 구조를 형성합니다. 이 제형은 함입된 이중층 또는 '꽃병(vase)' 구조 사이에 DNA를 "샌드위치(sandwich)"하는 것으로 보고되었다. 이러한 지질 구조는 양성 p, 콜레스테롤에 의한 콜로이드 안정화, 2차원 핵산 패킹 및 증가된 혈청 안정성을 포함하는 장점을 갖는다.
양이온성 리포솜 기술은 양전하를 띤 헤드 그룹과 소수성 지질 꼬리를 갖는 양친매성 지질이 음전하를 띤 DNA 또는 RNA에 결합하고 일반적으로 엔도사이토시스에 의해 세포로 들어가는 입자를 형성하는 능력을 기반으로 한다. 일부 양이온성 리포좀은 또한 중성 공지질을 함유하고 있는데, 이는 포유동물 세포에 의한 리포좀 흡수를 향상시키는 것으로 이해된다. 유사하게, 폴리-L-리신 및 폴리에틸렌-이민과 같은 다른 폴리양이온은 전하 상호작용을 통해 핵산과 복합체를 형성하고 DNA 또는 RNA가 나노입자로 응축되는 것을 돕고, 이는 엔도솜 매개 흡수를 위한 기질이 된다. 이러한 양이온성-핵산 복합 기술 중 몇 가지는 플라스미드 DNA(pDNA), 올리고데옥시뉴클레오티드 및 다양한 형태의 합성 RNA와의 복합물을 포함하여 잠재적인 임상 제품으로 개발되었으며 본 발명의 암호화된 핵산 전달 시스템의 일부로 사용될 수 있다.
본 발명의 암호화된 핵산은 세포로의 흡수를 향상시키는 역할을 하는 다가양이온성 분자와 회합될 수 있다. 다가양이온성 분자로 핵산 구성물을 복합화하는 것은 또한 그 크기가 감소되도록 구성물을 패키징하는 데 도움이 되며, 이는 세포 흡수를 돕는 것으로 여겨진다. 일단 엔도솜에 들어가면 낮은 pH로 인해 복합체가 해리되고 다중양이온성 분자가 엔도솜의 막을 파괴하여 DNA가 분해되기 전에 세포질로 탈출하는 것을 촉진할 수 있다. 기존의 데이터는 핵산 구조물 실시예가 다가양이온성 분자인 폴리리신 또는 폴리에틸렌이민과 복합화될 때 DC보다 SC로의 흡수가 향상되었음을 보여준다. 핵산 작제물과의 복합화에 유용한 다가양이온성 분자의 한 예는 세포 침투 펩티드(CPP)를 포함하고, 예는 폴리라이신(상기 기술됨), 폴리아르기닌 및 Tat 펩티드를 포함한다. 세포 침투 펩타이드(CPP)는 DNA에 결합할 수 있는 작은 펩타이드로 일단 방출되면 세포막을 통과하여 엔도솜에서 세포질로 DNA의 탈출을 촉진한다. CPP의 또 다른 예는 MPG라고 하는 27개 잔기 키메라 펩타이드와 관련이 있으며, 얼마 전에 안정한 방식으로 ss- 및 ds-올리고뉴클레오티드에 결합하는 것으로 나타났으며, 결과적으로 DNase에 의한 분해로부터 핵산을 보호하고 체외에서 세포에 올리고뉴클레오티드를 효과적으로 전달하는 비공유 결합 복합체를 생성한다 (Mahapatro A, et al., J Nanobiotechnol, 2011, 9:55). 상기 비공유 결합 복합체는 상이한 펩티드:DNA 비율, 10:1 및 5:1 비율(각각 150nm 및 1um)을 조사할 때 약 150nm 내지 1um의 작은 입자를 형성하였다. 또 다른 CPP는 변형된 테트라펩타이드 TL-GCP(modified tetrapeptide [tetralysine containing guanidinocarbonylpyrrole (GCP) groups]과 관련되며, 이는 6.2kb 플라스미드 DNA에 높은 친화도로 결합하여 700-900nm의 양전하 응집체를 생성하는 것으로 보고되었다 (Li et al., Agnew Chem Int Ed Enl 2015; 54(10):2941-4). RNA는 또한 생체내 전달을 위해 이러한 다중양이온성 분자에 의해 복합체화될 수 있다. 본 발명에 기술된 핵산 작제물과 착화될 수 있는 다가양이온성 분자의 다른 예는 JETPRIME® 및 In vivo JET(Polypus-transfection, S.A., Illkirch, France)로 상업적으로 입수 가능한 다가양이온성 중합체를 포함한다.
본 발명에 있어서, (i) 화학식 I의 화합물, 인지질, 구조적 지질(structural lipid) 및 PEG 지질을 포함하는 지질 성분; 및 (ii) mRNA(또는 다른 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 나노입자를 투여하여 스테핀 A 단백질 변이체 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체를 인코딩하는 mRNA(또는 다른 폴리뉴클레오티드)를 환자의 세포에 전달하는 방법을 고려하며, 상기 투여는 상기 투여는 상기 포유동물 세포를 상기 나노입자 조성물과 접촉시키는 것을 포함하며, 이로써 상기 mRNA(또는 다른 폴리뉴클레오티드)가 상기 세포로 전달된다.
예를 들어, 본 발명에 있어서, PEG 지질은 PEG-변형 포스파티딜에탄올아민, PEG-변형 포스파티드 산, PEG-변형 세라마이드, PEG-변형 디알킬아민, PEG-변형 디아실글리세롤 및 PEG-변형 디알킬글리세롤로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예를 들어, 본 발명에 있어서, 구조적 지질은 콜레스테롤, 페코스테롤, 시토스테롤, 에르고스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 브라시카스테롤, 토마티딘, 우르솔산 및 알파토코페롤로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시예에서, 구조적 지질은 콜레스테롤이다.
예를 들어, 본 발명에 있어서, 상기 인지질은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 모이어티를 포함할 수 있다: 포스파티딜 콜린(phosphatidyl choline), 포스파티딜 에탄올아민(phosphatidyl ethanolamine), 포스파티딜 글리세롤(phosphatidyl glycerol), 포스파티딜 세린(phosphatidyl serine), 포스파티드산(phosphatidic acid), 2-리소포스파티딜 콜린(2-lysophosphatidyl choline), 및 스핑고미엘린(sphingomyelin). 본 발명에 있어서, 상기 인지질은 다음으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 지방산 모이어티를 포함할 수 있다: 라우르산(lauric acid), 미리스트산(myristic acid), 미리스톨레산(myristoleic acid), 팔미트산(palmitic acid), 팔미톨레산(palmitoleic acid), 스테아르산(stearic acid), 올레산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid), 알파-리놀레산(alpha-linolenic acid), 에루크산(erucic acid), 아라키드산(arachidic acid), 아라키돈산(arachidonic acid), 피타노산(phytanoic acid), 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid), 베헨산(behenic acid), 도코사펜타엔산(docosapentaenoic acid), 및 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid). 예를 들어, 본 발명에 있어서, 상기 인지질은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다: 1 ,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DLPC), 1 ,2-dimyristoyl-sn-glycero-phosphocholine (DMPC), 1 ,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1 ,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC), 1 ,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), 1 ,2-diundecanoyl-sn-glycero-phosphocholine (DUPC), 1 -palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC), 1 ,2-di-0-octadecenyl-sn-glycero-3-phosphocholine (1 8:0 Diether PC), 1 -oleoyl-2-cholesterylhemisuccinoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (OChemsPC), 1 -hexadecyl-sn-glycero-3-phosphocholine (C16 Lyso PC), 1 ,2-dilinolenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 ,2-diarachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 ,2-didocosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,1 ,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanola mine (DOPE), 1 ,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ME 1 6.0 PE), 1 ,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1 ,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1 ,2-dilinolenoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1 ,2-diarachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1 ,2-didocosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1 ,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1 -glycerol) sodium salt (DOPG), 및 스핑고미엘린. 본 발명에 있어서, 상기 인지질은 DOPE 또는 DSPC일 수 있다.
추가적인 예를 들어, 상기 인지질은 DOPE일 수 있고, 상기 지질 성분은 약 35 mol% 내지 약 45 mol%의 상기한 화합물, 약 10 mol% 내지 약 20 mol%의 DOPE, 약 38.5 mol% 내지 약 48.5 mol%의 구조적 지질 및 약 1.5 mol%의 PEG 지질을 포함할 수 있다. 상기 지질성분은 약 40mol%의 상기한 화합물, 약 15 mol%의 인지질, 약 43.5 mol%의 구조적 지질 및 약 1.5 mol%의 PEG 지질을 포함할 수 있다
본 발명에 있어서, 지질 성분 대 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체 또는 융합 단백질 또는 접합체 코딩 mRNA(또는 다른 폴리뉴클레오티드)의 중량/중량비는 약 5:1 내지 약 50:1, 또는 약 10:1 내지 약 40:1일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 나노입자 조성물의 평균 크기는 약 50 nm 내지 약 150 nm, 또는 약 80 nm 내지 약 120 nm 일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 나노입자 조성물의 다분산 지수는 약 0 내지 약 0.18, 또는 약 0.13 내지 약 0.17 일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 나노입자 조성물은 약 -10 내지 약 +20 mV의 제타 전위를 가질 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 나노입자 조성물은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 양이온성 및/또는 이온화가능한 지질을 추가로 포함할 수 있다: 3-(didodecylamino)-N1 ,N 1 ,4-tridodecyl-1 -piperazineethanamine (KL1 0), 14,25-ditridecyl-1 5, 1 8,21 ,24-tetraaza-octatriacontane (KL25), 1,2-dilinoleyloxy-N,N-dimethylaminopropane (DLin-DMA), 2,2-dilinoleyl-4-dimethylaminomethyl-[1 ,3]-dioxolane (DLin-K-DMA), heptatriaconta-6, 9,28,31 -tetraen-1 9-yl 4-(dimethylamino)butanoate (DLin-MC3-DMA), 2,2-dilinoleyl-4-(2-dimethylaminoethyl)-[1 ,3]-dioxolane (DLin-KC2-DMA), 1 ,2-dioleyloxy-N,N-dimethylaminopropane (DODMA), and (2R)-2-({8-[(3P)-cholest-5-en-3-yloxy]octyl}oxy)-N,N-dimethyl-3-[(9Z,1 2Z)-octadeca-9, 12-dien-1 -yl oxy]propan-1 -amine (Octyl-CLinDMA (2R)).
상기 핵산 또는 벡터는 형질전환 또는 형질감염 등의 방법으로 숙주세포에 도입될 수 있다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질감염"은 임의의 암호화 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다. 상기 벡터를 도입하기 위해, 원핵 또는 진핵 숙주세포 내로 외인성 핵산(DNA 또는 RNA)을 도입하는 데에 통상 사용되는 여러 종류의 다양한 기술, 예를 들어 전기 영동법, 인산칼슘 침전법, DEAE-덱스트란 트랜스펙션 또는 리포펙션(lipofection) 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 암호화되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절 가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 암호화되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 암호화되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다. 발현클로닝에 의해 cDNA를 클로닝 하려고 할 때의 스크리닝법으로서 바인딩법(binding법), 페닝법(panning법), 필름 에멀션법(film emulsion 법)등이 적용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 형질전환의 효율을 높이기 위해 “형질전환 강화제”가 추가로 사용될 수 있다. 상기 “형질전환 강화제”는 일반적으로 양이온성 폴리머인 것이 바람직하며, 음전하를 띄는 핵산 또는 유전자가 숙주 세포에 혼입되기 쉽도록 한다.
본 발명에 있어서, 상기 형질전환 강화제는 양이온성 폴리머인 것을 특징으로 할 수 있으며, 예를 들어, 폴리브렌(polybrene), 프로타민 설페이트(protamine sulfate) 및 Sirion사의 Lentiboost로부터 선택되는 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 폴리브렌(polybrene)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
발현 방법 및 시스템
본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체 및/또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법은 직접적인 단백질 합성 방법에서, 본 발명의 핵산을 적합한 숙주에 도입하고 발현시키는 것까지 다양하다. 본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체를 포함하는 접합체가 화학적 변형 또는 접합과 같은 다양한 변형을 포함하는 경우, 숙주세포로부터 분리 또는 화학적 합성 후 화학적 또는 효소적으로 추가 조작되어 제조될 수 있다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 상기 유전자 조작된 세포를 배양하여 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체 및/또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체를 생산하는 단계를 포함하는 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체 및/또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 접합체가 화학적 변형 또는 접합과 같은 다양한 변형을 포함하는 경우, 숙주세포로부터 분리 또는 화학적 합성 후 화학적 또는 효소적으로 추가 조작되어 제조될 수 있다.
단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 숙주 세포로 도입 및 발현하여, 제조하는 방법은 예를 들어, WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 및 WO 2009/068627 등에 기재된 것을 참조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체 및/또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체를 암호화하는 핵산은 올리고뉴클레오타이드 합성기기를 사용한 화학적 합성에 의해 구축될 수 있다. 상기 올리고 뉴클레오타이드는 원하는 단백질 또는 폴리펩타이드의 서열에 기초하여 설계될 수 있고, 숙주세포에서 선호되는 코돈을 선택하는 코돈 최적화를 수행할 수 있다. 본 발명의 핵산의 합성을 위해 표준 방법이 적용될 수 있다. 예를 들어, 완전한 아미노산 서열을 사용하여 역번역 유전자를 구성할 수 있다. 또한, 분리된 특정 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 올리고머를 합성할 수 있다. 예를 들어, 원하는 폴리펩티드의 일부를 코딩하는 여러 개의 작은 올리고뉴클레오티드를 합성한 다음 결찰할 수 있다. 개별 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 보완 조립을 위해 5' 또는 3' 오버행을 포함할 수 있다.
본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체를 암호화하는 핵산은 예를 들어, 표 4에 기재된 것 중 어느 하나 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체를 암호화하는 핵산을 기반으로 당업계에 알려진 재조합 DNA 기술을 사용하여, 이를 포함하는 발현 벡터를 구축할 수 있다. 단백질의 생산을 위한 벡터는 당업계에 잘 알려진 기술을 사용하여 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 통상의 기술자는 공지된 방법을 사용하여 본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체 및/또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체를 암호화 하는 서열 및 적절한 전사 및 번역 제어 신호를 포함하는 벡터를 구축할 수 있다. 이러한 방법에는 예를 들어 시험관 내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체 내 유전자 재조합 기술 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다(Sambrook et al, 1990, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. and Ausubel et al. eds., 1998, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY 참조).
본 발명에 있어서, 발현 벡터는 통상적인 기술(예를 들어, 전기천공법, 리포솜 형질감염 및 인산 칼슘 침전등)에 의해 숙주세포로 전달될 수 있으며, 형질감염된 세포는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 배양되어, CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체 및/또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체를 발현할 수 있다. 본 발명에 있어서, 단백질의 발현은 구성적, 유도적 또는 조직적, 특이적 프로모터에 의해 조절될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 발현 벡터는 사용되는 숙주세포의 유형에 기초하여 선택될 수 있는 복제 원점을 포함할 수 있다. 예를 들어, pBR322 (Product No. 303-3s, New England Biolabs, Beverly, Mass.)는 대부분의 그람 음성 박테리아에 유용한 반면, SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV(vesicular stomatitus virus) 또는 파필로마바이러스(HPV, BPV)는 포유류 세포에서 벡터를 클로닝하기에 유용하게 사용된다. 일반적으로 포유류 발현 벡터에는 복제원점이 필요하지 않을 수 잇다(예를 들어, SV40 복제원점은 초기 프로모터를 포함하므로 사용될 수 있음).
본 발명에 있어서, 상기 발현 벡터는 적어도 하나의 선택 가능한 마커 유전자, 예를 들어, 선택 배양 배지에서 성장한 숙주 세포의 생존 및 성장에 필요한 단백질을 암호화하는 유전적 요소를 포함할 수 있다. 전형적인 선별 마커 유전자는 (a) 원핵 숙주 세포에 대한 항생제 또는 기타 독소, 예를 들어 암피실린, 테트라사이클린 또는 카나마이신에 대한 내성 부여; (b) 세포의 영양요구 결핍 보완; 또는 (c) 복합 배지에서 얻을 수 없는 중요한 영양소의 공급을 위해 관련 단백질을 암호화할 수 있다. 본 발명에 있어서, 바람직한 선별 마커는 카나마이신 내성 유전자 암피실린 내성 유전자 또는 테트라사이클린 내성 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 네오마이신 내성 유전자는 원핵 및 진핵 숙주 세포에서의 선택을 위해 사용될 수 있다. 다른 선별 유전자를 사용하여 발현될 유전자를 증폭할 수 있다. 증폭은 성장에 중요한 단백질 생산에 큰 수요가 있는 유전자가 연속적인 재조합 세포 세대의 염색체 내에서 나란히 반복되는 과정을 의미한다. 포유동물 세포에 대한 선별가능한 마커의 예는 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 및 티미딘 키나제를 포함한다. 포유동물 세포 형질전환체는 벡터에 존재하는 마커 덕분에 형질전환체만이 생존하도록 고유하게 적응되는 선택 압력하에 놓여진다. 선택 압력은 배지 내 선택제의 농도가 연속적으로 변화하는 조건 하에서 형질전환된 세포를 배양함으로써 부과되며, 이로써 선택 유전자 및 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체를 암호화하는 DNA 모두가 증폭될 수 있고, 그 결과 증폭된 DNA로부터 증가된 양의 단백질이 합성될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 발현 벡터는 적어도 하나의 리보솜 결합 부위를 포함할 수 있다. 상기 리보솜 결합 부위는 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 mRNA로 전사될 수 있다. 예를 들어, 상기 리보솜 결합 부위는 Shine-Dalgarno 서열(원핵생물) 또는 Kozak 서열(진핵생물)일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 결합 부위는 들은 전형적으로 발현될 폴리펩티드의 프로모터에 대해 3' 방향 및 암호화 서열에 대해 5' 방향에 위치할 수 있다. 다양한 Shine-Dalgarno 시퀀스가 있으나, 일반적으로 폴리퓨린(A-G 함량이 높음)이다. 많은 Shine-Dalgarno 서열이 확인되었으며, 상기 설명한 방법을 사용하여 쉽게 합성할 수 있고 원핵 벡터에서 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 발현 벡터는 전형적으로 숙주 유기체에 의해 인식되고 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유할 수 있다. 발현에 사용되는 숙주 세포 및 원하는 수율에 따라 천연 또는 이종 프로모터가 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 원핵 숙주와 함께 사용하기 위한 프로모터는 베타-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템; 알카라인 포스파타제, 트립토판(trp) 프로모터 시스템; 및 tac 프로모터와 같은 하이브리드 프로모터 등이 포함된다. 이외의 또 다른 알려진 박테리아 프로모터도 적합할 수 있다. 이러한 프로모터의 서열은 공개되었고 제한 부위를 제공하기 위해 원하는 대로 링커 또는 어댑터를 사용하여 원하는 핵산 서열(들)에 연결될 수 있다.
효모 숙주와 함께 사용하기 위한 프로모터도 당업계에 공지되어 있다. 효모 인핸서는 효모 프로모터와 함께 유리하게 사용될 수 있다. 포유동물 숙주 세포와 함께 사용하기에 적합한 프로모터는 잘 알려져 있으며 폴리오마 바이러스(polyoma virus), 플로우폭스 바이러스(fowlpox virus), 아데노바이러스(예: 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스(bovine papilloma virus), 조류 육종 바이러스(avian sarcoma virus), 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, hepatitis-B 바이러스, 가장 바람직하게는 Simian 바이러스 40(SV40)에서 유래한 프로모터를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 다른 적합한 포유동물 프로모터는 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 heat-shock 프로모터 및 액틴 프로모터를 포함한다.
본 발명에서 사용될 수 있는 추가 프로모터는 예를 들어, SV40 초기 프로모터 영역 (Bernoist and Chambon, Nature, 290:304-310, 1981); CMV 프로모터; Rous sarcoma 바이러스의 3’ 장 말단 반복을 포함하는 프로모터 (Yamamoto et al. (1980), Cell 22: 787-97); 헤르페스 타이미딘 카이나아제 프로모터 (herpes thymidine kinase promoter, Wagner et al. (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1444-5); 메탈로티오닌 유전자의 조절 서열 (Brinster et al, Nature, 296; 39-42, 1982); 베타-락타마제 프로모터와 같은 원핵 발현 벡터 (Villa-Kamaroff, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75; 3727-3731, 1978); 또는 tac 프로모터 (DeBoer, et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 21-5)를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 조직 특이성을 나타내고 트랜스제닉 동물에서 활용된 도물 전사 제어영역도 사용될 수 있다: 췌장 선포 세포(pancreatic acinar cells)에서 활성화되는 엘라스타제 I 유전자 제어 영역 (Swift et al. (1984), Cell 38: 639-46; Ornitz et al. (1986), Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald (1987), Hepatology 7: 425-515); 췌장 베타 세포에서 활성화되는 인슐린 유전자 제어 영역 (Hanahan (1985), Nature 315: 115-22); 림프 세포에서 활성화되는 면역 글로불린 유전자 제어 영역 (Grosschedl et al. (1984), Cell 38; 647-58; Adames et al. (1985), Nature 318; 533-8; Alexander et al. (1987), Mol. Cell. Biol. 7: 1436-44); 고환, 유방, 림프구 및 비만 세포에서 활성화되는 마우스 유방 종양 바이러스 제어 영역 (Leder et al. (1986), Cell 45: 485-95), 간에서 활성화되는 알부민 유전자 제어 영역 (Pinkert et al. (1987), Genes and Devel. 1: 268-76); 간에서 활성화되는 알파태아단백 유전자 제어 영역 (Krumlauf et al. (1985), MoI. Cell. Biol. 5: 1639-48; Hammer et al. (1987), Science, 235: 53-8); 간에서 활성화되는 알파 1-항트립신 유전자 제어 영역 (Kelsey et al. (1987), Genes and Devel. 1: 161-71); 골수 세포에서 활성화되는 베타-글로빈 유전자 제어 영역 (Mogram et al., Nature, 315 338-340, 1985; Kollias et al. (1986), Cell 46: 89-94); 뇌의 희소돌기아교세포에서 활성화되는 미엘린 염기성 단백질 유전자 제어 영역 (Readhead et al. (1987), Cell, 48: 703-12); 골격근에서 활성화되는 미오신 경쇄-2 유전자 제어 영역 (Sani (1985), Nature, 314: 283-6); 및 및 시상 하부에서 활성화되는 성선 자극 방출 호르몬 유전자 제어 영역 (Mason et al. (1986), Science 234: 1372-8)ㅇ,ㄹ 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
인핸서 서열은 진핵 숙주 세포에서 전사를 증가시키기 위해 벡터에 삽입될 수 있다. 포유류 유전자에서 사용할 수 있는 여러 인핸서 서열이 알려져 있다(예: 글로빈, 엘라스타제, 알부민, 알파-페토-단백질 및 인슐린). 그러나 일반적으로 바이러스의 인핸서가 사용된다. SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서는 진핵 프로모터의 활성화를 위한 예시적인 인핸서이다.
인핸서는 폴리펩티드 코딩 영역의 5’ 또는 3’ 위치에서 벡터에 스플라이싱될 수 있지만, 일반적으로 프로모터로부터 5’ 방향에 위치한다.
본 발명에 있어서, 핵산을 발현하기 위한 벡터는 박테리아, 곤충 및 포유류 숙주 세포와 호환되는 것을 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 벡터는 inter alia, pCRII, pCR3, 및 pcDNA3.1 (Invitrogen Company, San Diego, Calif.), pBSII (Stratagene Company, La Jolla, Calif.), pET15 (Novagen, Madison, Wis.), pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.), pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, Calif.), pETL (BlueBacII; Invitrogen), pDSR- alpha (PCT Publication No. WO90/14363) 및 pFastBacDual (Gibco/BRL, Grand Island, N.Y.)등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 가능한 추가 벡터에는 코스미드, 플라스미드 또는 변형된 바이러스가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 다만 벡터는 선택한 숙주 세포와 호환되어야 한다. 그러한 벡터는 Bluescript® 플라스미드 유도체(고카피수 ColE1 기반 파지미드, Stratagene Cloning Systems Inc., La Jolla Calif.), Taq-증폭 PCR 생성물을 클로닝하기 위해 설계된 PCR 클로닝 플라스미드(예, TOPO™. TA Cloning® Kit, PCR2.1 플라스미드 유도체, Invitrogen, Carlsbad, CA)와 같은 플라스미드, 및 포유동물, 효모 또는 바쿨로바이러스 발현 시스템(pBacPAK 플라스미드 유도체, Clontech, Palo Alto, CA)과 같은 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 벡터와 같은 재조합 분자는 형질전환, 형질감염, 감염, 전기천공 또는 기타 알려진 기술을 통해 숙주 세포에 도입될 수 있다.
본 발명의 스테핀 A 단백질 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체의 발현을 위한 숙주로서 포유동물 세포를 포함하는 진핵 및 원핵 숙주 세포는 당업계에 잘 알려져 있으며, American Type Culture Collection(ATCC)에서 입수할 수 있는 많은 불멸화 세포주를 포함한다. 이들은 특히 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, NSO, SP2 세포, HeLa 세포, 아기 햄스터 신장(BHK) 세포, 원숭이 신장 세포(COS), 인간 간세포 암종 세포(예: Hep G2), A549 세포, 3T3 세포, HEK-293 세포 및 다수의 다른 세포주를 포함할 수 있다. 포유동물 숙주 세포는 인간, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 돼지, 염소, 소, 말 및 햄스터 세포를 포함한다. 어떤 세포주가 높은 발현 수준을 갖는지 결정함으로써 특정 선호도의 세포주가 선택될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 세포주로는 Sf9 세포와 같은 곤충 세포주, 양서류 세포, 박테리아 세포, 식물 세포 및 진균 세포가 사용될 수 있다. 상기 진균세포에는 효모 및 사상균 세포(filamentous fungus cells)가 포함되며, 예를 들어, Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia minuta (Ogataea minuta, Pichia lindneri), Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum, Physcomitrella patens 및 Neurospora crassa. Pichia sp., 임의의 Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, 임의의 Kluyveromyces sp., Candida albicans, 임의의 Aspergillus sp., Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, 임의의 Fusarium sp., Yarrowia lipolytica, 및 Neurospora crassa 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 다양한 숙주-발현 벡터 시스템을 이용하여 본 발명의 스테핀 A 단백질 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체를 발현할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 숙주-발현 시스템은 본 발명의 스테핀 A 단백질 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체를 암호화하는 서열을 생산하고 정제될 수 있는 비히클을 나타내지만, 적절한 핵산 암호화 서열로 형질전환되거나 형질감염될 때 본 발명의 스테핀 A 단백질 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체를 in situ에서 발현할 수 있는 세포를 나타내기도 한다. 여기에는 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아(예: E. coli 및 B. subtilis)와 같은 미생물; 본 발명의 핵산 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모(예를 들어, Saccharomyces pichia); 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 배큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터(예: 콜리플라워 모자이크 바이러스(CMV) 및 담배 모자이크 바이러스(TMV))로 감염되거나, 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예: Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유류 세포의 게놈에서 유래한 프로모터(예: 메탈로티오네인 프로모터) 를 포함하는 재조합 발현 구조체, 또는 포유동물 바이러스(예: 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)에서 유래된 프로모터를 포함하는 포유동물 세포 시스템(예를 들어, COS, CHO, BHK, 293, 293T, 3T3 세포, 림프 세포(미국 특허 제5,807,715호 참조), Per C.6 세포(Crucell에서 개발한 래트 망막 세포)))를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
박테리아 시스템에서 발현되는 단백질의 용도에 따라, 다수의 발현 벡터가 유리하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 약제학적 조성물의 생성을 위해 이러한 단백질을 대량으로 생산해야 하는 경우, 쉽게 정제되는 높은 수준의 융합 단백질 생성물의 발현을 지시하는 벡터가 바람직할 수 있다. 이러한 벡터는 예를 들어, 융합단백질의 생성을 위해 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체 코딩 영역이 lac Z 코딩 영역과 프레임 내 벡터에 개별적으로 결찰된 발현 벡터 pUR278 (Ruther et al. (1983) EMBO J. 2:1791-1794); pIN 벡터 (Inouye et al. (1985) Nucleic Acids Res. 13:3101-3110; Van Heeke et al. (1989) J. Biol. Chem. 24:5503-5509); 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. pGEX 벡터는 또한 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)와의 융합 단백질로서 외래 폴리펩티드를 발현하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이며 매트릭스 글루타티온-아가로스 비드에 대한 흡착 및 결합에 이어 유리 글루타티온의 존재 하에서 용리에 의해 용해된 세포로부터 쉽게 정제될 수 있다. pGEX 벡터는 클로닝된 표적 유전자 산물이 GST 모이어티에서 방출될 수 있도록 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 설계되었다.
곤충 시스템에서 AcNPV(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)는 외래 유전자를 발현하는 벡터로 사용된다. 바이러스는 Spodoptera frugiperda 세포에서 자란다. 본 발명의 스테핀 A 단백질 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체를 암호화하는 서열은 바이러스의 비필수 영역(예: 폴리헤드린 유전자)에 개별적으로 클로닝되고 AcNPV 프로모터(예: 폴리헤드린 프로모터)의 제어하에 놓일 수 있다.
포유동물 숙주 세포에서, 다수의 바이러스 기반 발현 시스템이 이용될 수 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터로 사용되는 경우, 단백질 암호화 서열은 아데노바이러스 전사/번역 제어 복합체, 예를 들어 후기 프로모터 및 삼중 리더 서열에 연결될 수 있다. 이러한 키메라 유전자는 이어서 in vitro 또는 in vivo 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈의 비필수 영역(예: 영역 E1 또는 E3)에 삽입하면 감염된 숙주에서 생존 가능하고 면역글로불린 분자를 발현할 수 있는 재조합 바이러스가 생성된다. (예를 들어, Logan et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 81:3655-3659 참조). 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역을 위해 특정 개시 신호가 필요할 수 있다. 이러한 신호에는 ATG 개시 코돈 및 인접 서열이 포함된다. 또한 개시 코돈은 전체 삽입물의 번역을 보장하기 위해 원하는 코딩 서열의 판독 프레임과 동상이어야 한다. 이러한 외인성 번역 제어 신호 및 개시 코돈은 천연 및 합성 모두에서 다양한 기원을 가질 수 있다. 발현 효율은 적절한 전사 인핸서 요소, 전사 종결자 등을 포함함으로써 향상될 수 있다(Bitter et al.(1987 Methods in Enzymol. 153:516-544 참조).
또한, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 원하는 특정 방식으로 유전자 산물을 변형 및 가공하는 숙주 세포 균주를 선택할 수 있다. 단백질의 이러한 변형(예: 글리코실화) 및 가공(예: 절단)은 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 서로 다른 숙주 세포는 번역 후 처리 및 단백질 및 유전자 산물의 변형을 위한 특징적이고 특정한 메커니즘을 가지고 있다. 적절한 세포주 또는 숙주 시스템을 선택하여 발현된 외래 단백질의 올바른 변형 및 처리를 보장할 수 있다. 이를 위해, 유전자 산물의 1차 전사, 글리코실화 및 인산화의 적절한 처리를 위한 세포 기구를 소유한 진핵 숙주 세포가 사용될 수 있다. 이러한 진핵 숙주 세포는 예를 들어, CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 293T, 3T3, WI38, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 및 T47D, CRL7030 및 Hs578Bst 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
재조합 단백질의 장기간 고수율 생산을 위해 안정적인 발현이 고려된다. 예를 들어, 항체를 안정적으로 발현하는 세포주가 조작될 수 있다. 바이러스 복제 기점을 포함하는 발현 벡터를 사용하는 대신, 숙주 세포는 적절한 발현 제어 요소(예: 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택 가능한 마커에 의해 제어되는 DNA로 형질전환될 수 있다. 외래 DNA 도입 후, 조작된 세포는 농축 배지에서 1-2일 동안 성장하도록 허용될 수 있으며, 그런 다음 선택 배지로 전환된다. 재조합 플라스미드의 선택 가능한 마커는 선택에 대한 저항성을 부여하고 세포가 플라스미드를 염색체에 안정적으로 통합하고 성장하여 세포주로 클로닝 및 확장될 수 있는 초점을 형성하도록 한다. 이 방법은 본 발명의 스테핀 A 단백질 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체를 발현하는 세포주를 조작하는 데 유리하게 사용될 수 있다. 이러한 조작된 세포주는 재조합 스테핀 A 단백질 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체와 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 화합물의 스크리닝 및 평가에 특히 유용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 다양한 선택 시스템이 사용될 수 있다. 예를 들어, 헤르페스 심플렉스 바이러스 타이미딘 카이나아제(herpes simplex virus thymidine kinase; Wigler et al. (1977) Cell 11:223-232), 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실 전이효소 (hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase; Szybalska et al. (1962), Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 48:2026-2034), 및 아데닌 포스포리보실 전이효소 (adenine phosphoribosyltransferase; Lowy et al. (1980), Cell 22:817-823) 유전자가 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt- 세포에 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 항대사물질 저항성은 다음 유전자에 대한 선택의 기초로 사용될 수 있다: 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr (Wigler et al. (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 77:3567-3570; O'Hare et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 78:1527-1531); 마이코페놀산에 대한 저항성을 부여하는 gpt (Mulligan et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 78:2072-2076); 아미노글루코사이드 G-418에 저항성을 부여하는 neo(Tachibana et al. (1991) Cytotechnology 6(3):219-226; Tolstoshev (1993) Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan (1993) Science 260:926-932; 및 Morgan et al. (1993) Ann. Rev. Biochem. 62:191-217). 사용될 수 있는 재조합 DNA 기술 분야에서 일반적으로 알려진 방법은 Ausubel et al. (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY; and in Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds), 1994, CURRENT PROTOCOLS IN HUMAN GENETICS, John Wiley & Sons, NY.; Colbere-Garapin et al. (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14에 기재되어 있음; 및 하이그로마이신에 저항성을 부여하는 hygro (Santerre et al. (1984) Gene 30:147-156).
본 발명의 스테핀 A 단백질 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가될 수 있다(Bebbington 및 Hentschel, in DNA CLONING, 3권. (Academic Press, New York, 1987) 참조). 스테핀 A 단백질 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체를 발현하는 벡터 시스템의 마커가 증폭될 때 숙주 세포의 배양물에 존재하는 억제제 수준의 증가는 마커 유전자의 복제 수를 증가시킬 수 있다. 증폭된 영역이 스테핀 A 단백질 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체를 암호화하는 핵산 서열과 연관되기 때문에, 스테핀 A 단백질 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체의 생산 또한 증가할 수 있다(Crouse et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 3:257-266).
본 발명의 융합단백질이 항체 융합체 또는 기타 다중단백질 복합체인 경우, 숙주 세포는 2 개의 발현 벡터, 예를 들어 중쇄를 인코딩하는 첫 번째 벡터와 경쇄 유도된 폴리펩티드를 인코딩하는 두 번째 벡터로 동시 형질감염될 수 있다. 상기 2개의 발현 벡터 중 어느 하나 또는 둘 다 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체 암호화 서열을 포함할 수 있다. 2개의 벡터는 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드의 동일한 발현을 가능하게 하는 동일한 선별 마커를 함유할 수 있다. 대안적으로, 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 모두를 암호화하는 단일 벡터가 사용될 수 있다. 그러한 상황에서 경쇄는 과도한 독성을 갖는 자유 중쇄를 피하기 위해 중쇄 앞에 위치해야 한다(Proudfoot (1986) Nature 322:562-565; Kohler (1980) ) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 77:2197-2199). 중쇄 및 경쇄에 대한 코딩 서열은 cDNA 또는 유전성 DNA를 포함할 수 있다.
일반적으로, 특정 세포주 또는 트랜스제닉 동물에서 생성된 당단백질은 세포주 또는 트랜스제닉 동물에서 생성된 당단백질에 특징적인 글리코실화 패턴을 가질 수 있다. 따라서 스테핀 A 단백질 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체의 특정 글리코실화 패턴은 단백질을 생산하는 데 사용되는 특정 세포주 또는 트랜스제닉 동물에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체-항체 융합 단백질의 일부 실시예에서, 푸코실화되지 않은 N-글리칸만을 포함하는 글리코실화 패턴이 유리할 수 있는데, 이는 항체의 경우 시험관내 및 생체내 모두에서 푸코실화된 대응물보다 전형적으로 더 강력한 효능을 나타내는 것으로 나타났기 때문이다. (예를 들어, Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278: 3466-3473 (2003); 미국 특허 제6,946,292호 및 제7,214,775호 참조).
또한, 생산 세포주로부터의 스테핀 A 단백질 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체의 발현은 다수의 공지된 기술을 사용하여 강화될 수 있다. 예를 들어, 글루타민 합성 효소 유전자 발현 시스템(GS 시스템)은 특정 조건에서 발현을 향상시키기 위한 일반적인 접근 방식이다. GS 시스템은 유럽 특허 제0216846호, 제0256055호, 및 제0323997호 및 유럽 특허 출원 번호 제89303964.4호와 관련하여 전체적으로 또는 부분적으로 기재된다. 따라서, 본 발명에 있어서, 포유동물 숙주 세포(예를 들어, CHO)는 글루타민 신테타제 유전자가 결여되어 있고 배지에서 글루타민의 부재 하에 성장하지만, 면역글로불린 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 글루타민 신테타제 유전자를 포함하며 이는 숙주 세포의 유전자 부족을 보완할 수 있다. 본 발명의 스테핀 A 단백질 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체, 이를 암호화하는 핵산 또는 벡터를 함유하는 이러한 숙주 세포뿐만 아니라 이러한 숙주 세포를 사용하여 스테핀 A 단백질 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체를 생산하기 위한 발현 방법은 본 발명의 범위의 일부로 제공된다.
곤충 세포 배양 시스템(예: 바쿨로바이러스)에서 재조합 단백질의 발현은 또한 올바르게 폴딩되고 생물학적으로 기능하는 단백질을 생산하기 위한 강력한 방법을 제공한다. 곤충 세포에서 이종 단백질을 생산하기 위한 배큘로바이러스 시스템은 당업자에게 잘 알려져 있다.
형질전환된 숙주 세포에 의해 생성된 스테핀 A 단백질 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체는 임의의 적합한 방법에 따라 정제될 수 있다. 표준 방법에는 크로마토그래피(예: 이온 교환, 친화성 및 사이징 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등 용해도 또는 단백질 정제를 위한 기타 표준 기술이 포함된다. 헥사-히스티딘, 말토오스 결합 도메인, 인플루엔자 코트 서열 및 글루타티온-S-트랜스퍼라아제와 같은 친화성 태그를 단백질에 부착하여 적절한 친화성 컬럼을 통과시켜 쉽게 정제할 수 있다. 단리된 단백질은 또한 단백질분해, 질량분석법(MS), 핵자기공명(NMR), 고성능액체크로마토그래피(HPLC) 및 x선 결정학과 같은 기술을 사용하여 물리적으로 특성화할 수 있다.
본 발명에 있어서, 박테리아 배양물에서 생성된 스테핀 A 단백질 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체는 예를 들어 세포 펠릿으로부터 초기 추출에 이어 적어도 하나의 농축, 염석(salting-out), 수성 이온 교환 또는 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해 분리될 수 있다. HPLC는 최종 정제 단계에 사용할 수 있다. 재조합 단백질의 발현에 사용되는 미생물 세포는 동결-해동 순환, 초음파 처리, 기계적 파괴 또는 세포 용해제의 사용을 포함하는 임의의 편리한 방법에 의해 파쇄될 수 있다.
용도
용도 - 의약용도(방법, 약학적 조성물 등)
특히 CD40L/CD40의 상호작용에 의한 T세포 및 B세포의 활성화가 병리에 주요한 영향을 미치는 자가면역질환 또는 염증성 질환의 병원성 인자로 작용한다는 점은 당업계에 잘 알려져 있다. 구체적으로, 제1형 당뇨, 갑상선염, 건선, 루푸스 (Systemic Lupus Erythematosus; SLE), 류마티스 관절염 (Rheumatoid Arthritis; RA), 다발성 경화증 (Multiple Sclerosis; MS) 등과 같은 다양한 질환의 병원성 인자이다. 이러한 질환의 치료를 위해 CD40L을 표적으로 하는 다양한 화합물 또는 항체가 개발되고 있다(Semin Immunol. 2009;21(5):293-300; Advanced Drug Delivery Reviews Volume 141, 15 February 2019, Pages 92-103).
본 발명의 실시예에서는 이식편대 숙주병(GVHD)을 갖는 동물 모델에서, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체를 투여하는 경우, 현저한 치료효과를 나타내는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체, 상기 융합 단백질, 상기 접합체, 상기 핵산, 및/또는 상기 전달 비히클을 유효성분으로 함유하는 융합 단백질, 및/또는 이를 포함하는 접합체를 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 CD40L과 관련한 다양한 질환, 특히 CD40L에 대한 표적화 또는 CD40L의 억제를 통해 예방 또는 치료효과를 달성할 수 있는 당업계에 알려진 질환의 예방 또는 치료에 사용되는 것을 특징으로 할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체, 상기 융합 단백질, 상기 접합체, 상기 핵산, 및/또는 상기 전달 비히클을 유효성분으로 함유하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체, 상기 융합 단백질, 상기 접합체, 상기 핵산, 및/또는 상기 전달 비히클을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체, 상기 융합 단백질, 상기 접합체, 상기 핵산, 및/또는 상기 전달 비히클의 면역질환의 예방 또는 치료용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체, 상기 융합 단백질, 상기 접합체, 상기 핵산, 및/또는 상기 전달 비히클의 약학 조성물의 제조 용도에 관한 것이다. 본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 면역질환의 예방 또는 치료용도인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어 "예방"이란, 면역질환의 발병이 예상되는 개체에게 본 발명에서 제공하는 약학적 조성물을 투여하여 상기 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어 "치료"란, 치료하고자 하는 개개인 또는 세포의 천연과정을 변경시키기 위해 임상적으로 개입하는 모든 행위를 의미하는데, 임상 병리 상태가 진행되는 동안 또는 이를 예방하기 위해 수행될 수 있다. 목적하는 치료 효과에는 질병의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 완화, 질병에 따른 모든 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 저해, 전이의 예방, 질병 진행속도의 감소, 질병 상태의 경감 또는 일시적인 완화 및 예후의 개선이 포함된다. 본 발명의 목적상 상기 치료는 건선을 비롯한 자가면역질환이 발병된 환자에게 본 발명의 약학적 조성물을 투여하여 상기 자가면역질환의 경과를 호전시키는 모든 행위를 포함하는 것으로 해석될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제형화 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여 등으로 투여할 수 있다.
경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 명세서에서 용어 "약학적 유효량"은 면역질환의 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 면역질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 의약품 또는 약학 조성물과 병행 또는 병용하여 투여할 수 있으며, 예를 들어, 하나 이상의 다른 면역요법제, 화학요법제, 항체치료제 등과 병용 투여될 수 있다.
구체적인 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 질병 완화 항류마티스 약물(Disease modifying antirheumatic drugs, DMARDs); 비스테로이드성 소염진통제(Nonsteroidal anti-inflammatory medication, NSAID); 코르티코스테로이드(Corticosteroids); 야누스 키나아제 억제제(Janus kinase inhibitors); 칼시뉴린 억제제(Calcineurin inhibitors); mTOR 억제제; IMDH 억제제; 및 생물학적 제제로 구성된 군에서 선택되는 약물과 조합하여 사용되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 질병 완화 항류마티스 약물(Disease modifying antirheumatic drugs, DMARDs)은 예를 들어, Actarit, Auranofin, Azathioprine, Bucillamine, Cyclophophamide, D-penicillamine, Leflunomide, Lobenzarit disodium, Methotrexate, Minocycline hydrochloride, Mizoribine 및 Salazosulfapyridine 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 비스테로이드성 소염진통제(Nonsteroidal anti-inflammatory medication, NSAID)는 Celecoxib, Diclofenac sodium, Ibuprofen, Ketoprofen, Meloxicam, Naproxen, Piroxicam 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 코르티코스테로이드(Corticosteroids)는 prednisone (Deltasone, Orasone), budesonide (Entocort EC), prednisolone (Millipred), methylprednisolone 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 야누스 키나아제 억제제(Janus kinase inhibitors)는 승인된 약물로, tofacitinib, Abrocitinib, Baricitinib, Delgocitinib, Fedratinib, Filgotinib, Oclacitinib, Peficitinib, Ruxolitinib, Upadacitinib, 임상 중인 약물로, Cerdulatinib, Gandotinib, Lestaurtinib, Momelotinib, Pacritinib, Deucravacitinib 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 칼시뉴린 억제제(Calcineurin inhibitors)는 cyclosporine, tacrolimus 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 mTOR 억제제는 sirolimus (Rapamune), everolimus (Afinitor, Zortress) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 IMDH 억제제는 azathioprine (Azasan, Imuran), mycophenolate (CellCept, Myfortic) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 생물학적 제제는 abatacept, adalimumab, anakinra, certolizumab, etanercept, golimumab, infliximab, ixekizumab, natalizumab, rituximab, secukinumab, tocilizumab, ustekinumab, vedolizumab, basiliximab, daclizumab 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 면역질환은 자가면역질환 또는 염증성 질환인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 면역질환은 루푸스(SLE), 루푸스 신염(예를 들어, 약물 유발 루푸스 신염), 면역 혈소판 감소증(ITP), 류마티스 관절염(RA), 다발성 경화증(MS), 염증성 장 질환(IBD)(예: 크론병 및 대장염/궤양성 대장염), 이식편대숙주질환(GvHD) 또는 동종이식 거부, 이식/고체장기이식(SOT), 원발성 담즙성 담관염(PBC), 건선, 건선성 관절염, 콜라겐-유발 관절염, 실험적 알레르기성 뇌척수염(EAE), 난소염, 알레르기성 비염, 천식, 쇼그렌 증후군, 아토피성 습진, 중증 근무력증, 그레이브 질병 및/또는 사구체 경화증으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
루푸스
루푸스라고 하는 전신성 홍반성 루푸스(SLE)는 전신에 부종(염증)과 통증을 유발할 수 있는 만성 자가면역질환이다. 루푸스에는 여러 가지 유형이 있으며, 전신성 홍반성 루푸스가 가장 흔하다. 다른 유형의 루푸스는 다음과 같다:
피부 홍반성 루푸스: 이 유형의 루푸스는 피부에 영향을 미친다. 큐타너스는 피부를 의미하는 용어이다. 피부 홍반성 루푸스가 있는 사람은 태양에 대한 민감성 및 발진과 같은 피부 문제를 경험할 수 있다. 탈모 역시 이 질환의 증상일 수 있다.
약물 유발 루푸스: 이러한 루푸스는 특정 약물에 의해 발생한다. 약물 유발성 루푸스가 있는 사람은 전신성 홍반성 루푸스와 동일한 증상을 많이 가질 수 있지만 일반적으로 일시적이다.
신생아 루푸스: 드문 유형의 루푸스인 신생아 루푸스는 출생시 유아에서 발견되는 질환이다. 신생아 루푸스를 가지고 태어난 어린이는 어머니로부터 항체를 물려받으며, 산모는 임신 당시 루푸스를 앓았거나 나중에 이 질환을 앓을 수 있다. 루푸스가 있는 산모에게서 태어난 모든 아기가 루푸스에 걸리는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물과 조합하여 사용될 수 있는 요법은 예를 들어 스테로이드 (코르티코스테로이드, 프레드니손 포함); 하이드록시클로로퀸 (Plaquenil®); 아자티오프린 (Imuran®); 메토트렉세이트 (Rheumatrex®); 사이클로포스파미드 (Cytoxan®) 및 미코페놀레이트 모페틸 (CellCept®); 벨리무맙 (Benlysta®); 및/또는 리툭시맙 (Rituxan®)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
루푸스 신염
루푸스 신염은 루푸스의 합병증으로 발병한다. 루푸스 신염은 루푸스 자가항체가 노폐물을 걸러내는 신장의 구조에 영향을 미칠 때 발생한다. 이는 신장 염증을 일으키고 소변의 혈액, 소변의 단백질, 고혈압, 신장 기능 장애 또는 신부전으로 이어질 수 있다. 전신성 루푸스가 있는 성인의 절반 정도에서 루푸스 신염이 발생한다. 전신성 루푸스는 면역계 단백질이 신장을 손상시켜 노폐물을 걸러내는 능력을 손상시킨다.
류마티스 관절염
류마티스 관절염은 손, 손목 및 무릎과 같은 신체의 양쪽 관절에서 발생하는 만성 (진행 중인) 관절염의 한 유형이다. 류마티스 관절염 약물의 단기 목표는 관절 통증과 부종을 줄이고 관절 기능을 개선하는 것이다. 장기 목표는 질병 진행, 특히 관절 손상을 늦추거나 멈추는 것이다.
관절염은 관절의 염증을 설명하는 일반적인 용어이다. 류마티스 관절염은 일반적으로 관절 (손, 손목 및 무릎과 같은 신체의 양쪽)에서 대칭적으로 발생하는 만성 (진행 중인) 관절염 (통증 및 붓기 유발)의 일종이다. 여러 관절의 이러한 침범은 류마티스 관절염을 다른 유형의 관절염과 구별하는 데 도움이 된다.
관절에 영향을 주는 것 외에도 류마티스 관절염은 때때로 피부, 눈, 폐, 심장, 혈액, 신경 또는 신장에 영향을 줄 수 있다.
류마티스 관절염을 치료하기 위해 본 발명의 약학적 조성물과 조합하여 사용될 수 있는 요법은 예를 들어 다음을 포함할 수 있다:
진통소염제: 이러한 제품에는 이부프로펜(MOTRIN®), 나프록센(ALEVE®), 셀레콕십(Celecoxib), 디클로페낙 나트륨(Diclofenac sodium), 케토프로펜(Ketoprofen), 멜록시캄(Meloxicam),피록시캄(Piroxicam)과 같은 비스테로이드성 항염증제(NSAIDs)가 포함된다. 또 다른 유형의 약물인 COX-2 억제제도 이 약물 범주에 속하며 류마티스 관절염의 징후와 증상을 완화한다. COX-2 억제제 중 하나인 세레콕시브(CELEBREX®)는 미국에서 사용 가능하다. COX-2 억제제는 위장 출혈 부작용이 적도록 설계되었다.
질병완화 항류마티스 약물(disease modifying antirheumatic drugs, DMARDs): 다른 NSAIDs와 달리 DMARDs는 실질적으로 면역 체계를 수정하여 질병 진행을 늦출 수 있다. 이전의 DMARDs에는 메토트렉세이트(TREXALL®), 금제제 (gold salts), 페니실라민(CUPRIMINE®), 하이드록시클로로퀸(PLAQUENIL®), 설파살라진(AZULFIDINE®), 사이클로스포린(SANDIMMUNE®), 사이클로포스파미드(CYTOXAN®) 및 레플루노마이드(ARAVA®)가 포함된다. 현재는, 메토트렉세이트, 레플루노마이드, 하이드록시클로로퀸과 설파살라진이 가장 흔하게 사용된다 (사이클로스포린, 사이클로포스파미드, 금염, 페니실라민은 더 이상 일반적으로 사용되지 않는다).
생물학적 제제. 이러한 "전통적인" DMARDs 외에도, 새로운 약물이 승인되고 있다. 현재는, 7가지 종류의 약물이 있으며, 경우에 따라 각 분류에 서로 다른 종류들이 있다 (그 중 일부는, 항-TNF 계열로 2000년부터 사용되어 왔다.). 집합적으로, 이러한 DMARDs는 다른 이름인 생물학적 제제 (또는 생물학적 반응제)로 알려져 있다. 전통적인 DMARDs와 비교하여 이들 제품은 류마티스 관절염에서 염증을 일으키는 분자를 표적으로 한다. 관절의 염증 세포는 류마티스 관절염 자체의 발병에 관여한다. 생물학적 제제는 류마티스 관절염에서 볼 수 있는 관절 손상을 궁극적으로 유발하는 염증 과정을 줄인다. 염증 자체보다 구체적인 수준에서 세포를 공격함으로써 생물학적 제제는 보다 효과적이고 보다 구체적으로 표적화되는 것으로 간주된다. 생물학적 제제에는 에타너셉트(ENBREL®), 인플릭시맙(REMICADE®), 아달리무맙(HUMIRA®), 아나킨라(KINARET®), 아바타셉트(ORENCIA®), 리툭시맙(RITUXAN®), 세르톨리주맙 페골(CIMZIA®), 골리무맙(SYMPON®), 토실리주맙(ACTEMRA®) 및 토파시티닙(XELJANJ®)이 포함된다. 일부 생물학적 제제는 전통적인 DMARDs, 특히 메토트렉세이트와 병용하여 사용된다.
다발성 경화증
다발성 경화증(MS)은 자가면역질환이다. 이러한 조건에서 면역 체계는 실수로 건강한 세포를 공격한다. 다발성 경화증 환자에서 면역 체계는 뇌와 척수의 신경을 둘러싸고 있는 보호막인 미엘린(myelin) 세포를 공격한다. 미엘린이 손상되면 뇌에서 신체의 다른 부분으로 보내는 신경 신호가 차단된다. 손상은 뇌, 척수 및 눈에 영향을 미치는 증상을 유발할 수 있다.
다발성 경화증에는 네 가지 유형이 있다.
임상적 단독증후군(CIS): MS 증상의 첫 번째 증상이 있을 때, 의료 서비스 제공자는 주로 CIS로 이를 분류한다. CIS가 있는 모든 사람이 다발성 경화증으로 진행되는 것은 아니다.
재발-완화형 MS(RRMS): 이는 다발성 경화증의 가장 흔한 형태이다. RRMS가 있는 사람들은 새로운 또는 악화되는 증상의 발적--재발 또는 악화라고도 하는--이 있다. 완화 기간이 계속된다 (증상이 안정되거나 사라질 때).
원발성 진행성 MS(PPMS): PPMS로 진단받은 사람들은 재발하거나 완화되지 않고 서서히 점진적으로 악화되는 증상을 가진다.
이차 진행성 MS(SPMS): 대부분의 경우에는, 원래 RRMS로 진단된 사람들이 결국 SPMS로 진행된다. 이차-진행성 다발성 경화증의 경우, 계속해서 신경 손상이 축적된다. 증상이 점차 악화된다. 일부 재발이나 발적 (증상이 증가할 때)을 경험할 수 있지만, 그 후에는 더 이상 완화 기간이 없다 (증상이 안정되거나 사라질 때).
본 발명의 약학적 조성물과 병용하여 사용될 수 있는 치료법은 다음을 포함한다, 예를 들어:
질병-수정 요법(DMT): 여러 약물이 장기 MS 치료에 대한 FDA 승인을 받았다. 이러한 약물은 재발 (발적 또는 발작이라고도 함)을 줄이는 데 도움이 된다. 그들은 질병의 진행을 늦춰준다. 그리고 뇌와 척수에 새로운 병변이 형성되는 것을 방지할 수 있다.
재발 관리 약물치료: 심한 발작이 있는 경우, 신경과 전문의는 고용량의 코르티코스테로이드를 권장할 수 있다. 약물은 염증을 빠르게 줄일 수 있다. 신경 세포를 둘러싸고 있는 수초의 손상을 느리게 한다.
신체 재활치료: 다발성 경화증은 신체 기능에 영향을 줄 수 있다. 신체적으로 건강하고 강한 상태를 유지하면 이동성을 유지하는 데 도움이 된다.
정신 건강 상담: 만성 질환에 대처하는 것은 정서적으로 어려울 수 있다. MS는 때때로 기분과 기억에 영향을 줄 수 있다. 신경심리학자와 협력하거나 다른 정서적 지원을 받는 것은 질병 관리에 필수적인 부분이다.
염증성 장질환
염증성 장 질환(Inflammatory Bowel Disease, IBD)은 장의 만성 염증(통증 및 부기)을 유발하는 장애 그룹이다.
크론병과 궤양성 대장염은 IBD의 주요 유형이다. 유형은 다음과 같다:
크론병은 소화관에 통증과 부기를 유발한다. 입에서 항문까지 모든 부분에 영향을 줄 수 있다. 가장 흔하게 소장과 대장의 상부에 영향을 미친다.
궤양성 대장염은 대장(결장 및 직장)에 종기와 상처(궤양)를 유발한다.
미세대장염은 현미경으로만 감지할 수 있는 장 염증을 유발한다.
본 발명의 약학적 조성물과 병용하여 사용될 수 있는 치료법은 다음을 포함한다, 예를 들어:
아미노살리실레이트(설파살라진, 메살라민 또는 발사라자이드와 같은 항염증제)가 내장에 대한 자극을 최소화하고; 항생제는 감염과 농양을 치료한다; 생물학적 제제는 염증을 유발하는 면역계의 신호를 차단한다; 프레드니손과 같은 코르티코스테로이드는 면역 체계를 억제하고 발적을 관리한다; 면역조절제는 과민성 면역 체계를 진정시킨다; 지사제; 비스테로이드성 항염증제(NSAIDs); 비타민 및 프로바이오틱스와 같은 보충제.
이식편대숙주질환(GvHD)
이식편대숙주질환(GvHD)은 동종 이식 후 발생할 수 있는 질환이다. GvHD에서는 기증된 골수나 말초혈액줄기세포가 수혜자의 몸을 이물질로 보고 기증된 세포/골수가 몸을 공격한다.
GvHD에는 급성 이식편대숙주질환 (aGvHD); 및 만성 이식편대숙주질환 (cGvHD)이 포함될 수 있다.
건선
건선은 사라지지 않는 피부 질환을 의미하는 만성 피부 장애이다. 건선이 있는 사람은 흰색 또는 은빛 비늘로 덮인 두꺼운 분홍색 또는 붉은색 피부 패치가 있다. 두꺼운 비늘 모양의 패치를 플라크라고 한다. 건선은 일반적으로 성인 초기에 시작되지만 나중에 시작될 수도 있다. 붉고 비늘 모양의 패치 외에도 건선의 증상에는 가려움, 갈라짐, 건조한 피부, 비늘 모양의 두피, 피부 통증, 움푹 들어간 손톱, 금이 가거나 부서지기 쉬운 손톱, 관절 통증이 있다.
본 발명의 약학적 조성물과 병용하여 사용될 수 있는 치료법은 다음을 포함한다, 예를 들어: 스테로이드 크림, 건성 피부용 보습제, 안트랄린 (피부 세포 생성을 늦추는 약물), 두피 건선을 개선하기 위한 약용 로션, 샴푸 및 목욕 용액, 비타민 D3 연고, 비타민 A 또는 레티노이드 크림, 광선 요법, PUVA (소랄렌이라는 약물과 특수한 형태의 자외선 노출을 결합한 치료), 메토트렉세이트, 레티노이드, 사이클로스포린 및/또는 면역 요법이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
쇼그렌 증후군
쇼그렌 증후군은 눈과 입의 땀샘에서 생성되는 수분의 양을 감소시키는 평생 지속되는 자가면역질환이다. 이 질환을 처음 기술한 스웨덴 안과 의사인 헨리크 쇼그렌의 이름을 따서 명명되었다. 구강 건조와 안구 건조가 주요 증상이지만, 이러한 문제를 가진 대부분의 사람들이 쇼그렌 증후군인 것은 아니다. 건조한 구강은 구강건조증이라고도 한다.
쇼그렌 증후군에는 두 가지 형태가 있다: 원발성 쇼그렌 증후군, 다른 건강 상태 때문이 아니라 자체적으로 발생하는 것, 및 이차 쇼그렌 증후군, 류마티스 관절염, 루푸스 및 건선성 관절염과 같은 다른 자가면역질환이 추가로 발생하는 것.
본 발명의 약학적 조성물과 병용하여 사용될 수 있는 치료법은 다음을 포함한다, 예를 들어, 안구 건조 치료 (예: 인공 눈물, 처방 안약, 눈물점마개, 수술, 자가혈청 점안액), 구강 건조 치료 (예: 타액 생성제), 관절 또는 장기 문제에 대한 치료 (예: 진통제, 항류마티스제, 면역억제제, 스테로이드제, 항진균제 및 질건조증 치료제).
중증 근무력증
중증 근무력증(MG)은 자가면역질환으로 신체의 면역 체계가 실수로 자신의 부분을 공격한다. MG는 신경과 근육 (신경근육접합부) 간의 신호전달에 영향을 준다.
중증 근무력증을 앓는 환자는 자발적으로 근육을 제어하는 능력을 잃는다. 그들은 다양한 중증도의 근육 약화와 피로를 경험한다. 눈, 얼굴, 목, 팔다리의 근육을 움직이지 못할 수도 있다. MG는 평생 지속되는 신경근 질환이다.
중증 근무력증은 100,000명 중 약 20명에게 영향을 미친다. 전문가들은 36,000~60,000명의 미국인이 이 신경근 질환을 앓고 있다고 추정한다. 경증 환자 중 일부는 자신이 질병에 걸렸다는 사실을 모를 수 있으므로 영향을 받는 실제 사람의 수는 더 많을 수 있다. MG는 주로 20~40세의 여성과 50~80세의 남성에게 영향을 미친다. MG의 약 10건 중 1건은 십대에서 발생한다 (청소년 MG). 이 질병은 모든 연령대의 사람들에게 영향을 미칠 수 있지만 어린이에게는 드물다.
자가면역 MG는 이 신경근 질환의 가장 흔한 형태이다. 자가면역 MG는 다음과 같다:
안구형: 눈과 눈꺼풀을 움직이는 근육이 약해진다. 눈꺼풀이 처지거나 눈을 뜨지 못할 수 있다. 어떤 사람들은 복시를 가지고 있다. 시력 약화는 종종 MG의 첫번째 징후이다. 안구형 MG가 있는 사람의 거의 절반이 첫 증상 후 2년 이내에 전신형 형태로 진화한다.
전신형: 근육 약화는 눈과 얼굴, 목, 팔, 다리 및 목과 같은 다른 신체 부위에 영향을 미친다. 말하거나 삼키기, 팔을 머리 위로 들기, 앉은 자세에서 일어서기, 먼 거리 걷기, 계단 오르기 등이 어려울 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물과 병용하여 사용될 수 있는 치료법은 다음을 포함한다, 예를 들어, 약물, 단일클론 항체, IV 면역글로불린(IVIG), 혈장 교환(혈장교환술), 및/또는 수술.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 파지 디스플레이 라이브러리에서 항-CD40L 스테핀 A 단백질 변이체 선별
후보 클론 식별
본 개시내용의 CD40L 결합 스테핀 A 단백질 변이체(이하, 항-CD40L 스테핀 A 단백질 변이체)는 두 개의 무작위 루프 서열을 갖는 스테핀 A 단백질 변이체 라이브러리에서 선별하여 식별되었으며, 각 루프는 스테핀 A의 아미노산 서열을 기반으로 일정한 스테핀 A 단백질 변이체 프레임워크 골격에 디스플레이되며, 약 9개의 아미노산 길이를 갖는다. 이러한 선별 절차는 당업계에 잘 알려져 있다(Tiede et al. Protein Eng Des Sel. 2014. 27(5): 145-155 and Hughes et al. Sci Signal. 2018. 10(505): eaaj2005 참조). 이러한 절차에 따라, 스테핀 A 단백질 변이체(AFFIMER®)을 발현하는 파지의 현탁액을 필요에 따라 인간 CD40L (ACROBiosystems, CDL-H82Q8) 또는 마우스 CD40L (ACROBiosystems, CDL-M5248)과 함께 배양하였다. 어떤 경우에는 CD40L을 비오틴화하여 스트렙타비딘과 뉴트라비딘 비드에 교대로 캡처하였고, 그렇지 않은 경우 CD40L이 표면에 수동적으로 흡수되었다. 그 다음 결합되지 않은 파지 입자는 세척하고, 세척 후 결합된 파지를 용출하였다. 결합된 파지의 용출은 항원을 낮은 pH 용액에서 배양한 후 높은 pH 용액과 트립신에 노출시켜 배양함으로써 수행되었다. 그 다음, 용출된 파지 입자는 대장균(E. coli)을 감염시키는 데 사용하였으며, 감염된 박테리아는 박테리오파지의 복제에 적합한 조건에서 배양되었다. 이들 감염된 박테리아로부터 박테리오파지 입자가 방출된 후, 파지 입자가 표적 항원에 결합하도록 하고, 결합된 파지 입자를 용출하였다. 용출된 파지 입자를 박테리아에 증식시키고, 감염된 박테리아에서 방출된 파지 입자를 분리하도록 하는 사이클을 반복하여 표적 항원에 결합하는 단백질을 디스플레이하는 파지 입자에 대한 박테리오파지 개체군을 풍부하게 하였다. 이 사이클에서 표적 항원에 더 강하거나 특이적으로 결합하는 파지 입자 디스플레이 단백질을 선별하기 위해 세척 단계의 수를 늘리거나, 사용 가능한 항원의 양을 줄이거나, 차단제를 추가하는 것과 같은 특정 조건이 수정되었다.
파지 디스플레이 라이브러리 선별 및 증폭을 여러 차례 수행한 후, 파지에 의해 발현된 단백질은 효소결합 면역흡착 분석법 (ELISA)을 통해 발현 및 스크리닝되었다. 구체적으로, 스테핀 A 단백질 변이체는 파지미드 벡터로부터 과발현되었고, 박테리아 세포는 용해되었으며, 용해물은 ELISA에서 기질로 사용되었다. ELISA에서, 인간 CD40L을 플레이트에 고정(immobilized)시키고, 용해물을 첨가하여, 후보 스테핀 A 단백질 변이체에 발현되는 6xMyc tag에 특이적인 검출 항체를 사용하여 각 플레이트에서 CD40L 결합 스테핀 A 단백질 변이체의 양을 측정하였다. 인간 CD40L 결합 활성이 가장 우수한 스테핀 A 단백질 변이체를 암호화하는 파지미드 벡터는 추가 개발을 위한 후보 클론의 DNA 서열을 확인하기 위하여 서열분석하였다. 이들 후보 클론 각각의 루프 2 및 루프 4 아미노산 서열은 각각 표 1과 표 2에 제시되어 있다.
실시예 2: 직접 ELISA에 의한 항-CD40L 스테핀 A 단백질 변이체의 스크리닝
hCD40L에 대한 서로 다른 단량체 DAW01 클론의 친화력을 측정하기 위해 결합 ELISA를 수행하였다. 구체적으로, 플레이트를 5 μg/ml의 hCD40L 항원으로 코팅하고 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 플레이트를 플레이트 세척기로 150μl의 세척 완충액(PBS, Tween 20 0.1%)으로 2회 세척하고 카제인 5% (Sigma)의 PBS로 실온(25±1℃)에서 90분 동안 포화 상태로 만들었다. 결합을 위해 각 DAW01 클론과 rhCD40 Fc를 각각 1μM, 3분의 1부터 300 nM, 3분의 1을 플레이트에 추가하였다. 플레이트는 앞서 설명한 것과 같은 방법으로 3회 세척하였다. 그 다음 플레이트에 항-인간 CD40 비오티닐화된 폴리클로날 항체를 첨가하고, 90분간 배양하였다. 그런 다음, 시스타틴 A 비오티닐화된 폴리클로날 항체 (BAF1407)를 희석 완충액 (PBS, 1% 카제인, 0.01% Tween 20)에 0.05μg/ml의 농도로 희석하고 플레이트를 실온(25±1℃)에서 90분간 배양하였다. 그 다음 폴리HRP-streptavidin을 희석 완충액에 희석하고 플레이트를 실온(25±1℃)에서 90분 동안 배양하였다. 그런 다음 플레이트를 앞서 설명한 바와 같이 3회 세척하고, 기질(TMB, Pierce Thermo-Scientific)을 플레이트에 10분 동안 첨가하였다. 이 반응은 산성 용액을 사용하여 중지시키고, 플레이트를 450 - 630 nm에서 판독하였다. 그 결과는 도 1에 도시된 것과 같으며, EC50 값은 0.67에서 60 nM 사이의 범위이다.
실시예 3: 유세포 분석에 의한 hCD40L-HEK293 세포에서의 항-CD40L 스테핀 A 단백질 변이체 스크리닝
세포 표면에 발현된 hCD40L에 대한 DAW01 단량체 스테핀 A 단백질 변이체의 결합 수용력을 조사하기 위해, 유세포 분석 세포 결합 분석법을 수행하였다. 간략하게, hCD40L-HEK-293 세포(Crown Biosciences, C2041)를 300rpm에서 5분 동안 원심분리하여 수집하였다. 세포를 PBS에 재현탁시키고 round bottom 96 well 플레이트의 각 well 당 200,000개의 세포를 분주하였다. 세포는 PBS로 세척하였다. 스테핀 A 단백질 변이체와 대조군은 duplicate로 DPBS에 1% BSA, 0.01% Sodium Azide (NaN3), 2 mM EDTA를 포함하는 염색 완충액에 희석하고 세포에 첨가하여 4 ±1℃에서 약 60분 동안 염색하였다. 세포를 세척하고 항-시스타틴 A (R&D, AF1407) 이차 항체를 염색 완충액에 0.2 mg/ml로 희석하고 세포에 첨가하여 4 ±1℃에서 약 45분 동안 염색하였다. 세포를 다시 세척하고 A488 antigoat (ThermoFisher, A21467) 검출 항체를 염색 완충액에 1:500으로 희석하고 세포에 추가하여 염색하였다 (4±1℃에서 약 30분). 마지막으로, 세포를 세척하고 염색 완충액에 희석한 L/D stain Zombie Yellow (Biolegend, 423103)를 사용하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 4±1℃에서 10분 동안 염색하였다. 세포를 다시 세척하고 각 well에 고정 완충액(R&D)을 4 ±1℃에서 10분 동안 첨가한 다음 EDTA (Lonza)가 포함된 PBS를 첨가한 후 유세포 분석기(Guava 12 HT, Millipore)에서 플레이트를 판독하였다. 죽은 세포는 제외하고, 녹색 형광 채널(488 nm/525/30)을 획득하였다. 결과는 Incyte를 사용하여 분석되었고 데이터는 GraphPad를 사용하여 점도표로 표시하였다. 1 μM에서의 결과의 한 예시를 도 2에 나타내었다. 스테핀 A 단백질 변이체는 hCD40L-HEK293 세포에 특이적으로 결합하는 것으로 나타났다 (진한 회색). HEK-293 음성 세포도 비특이적 결합 (밝은 회색)을 평가하기 위해 실험에 사용되었다. HuCD40L HEK293 세포와 대조군 HEK293 세포를 BV711 mAb (클론 24-31)를 사용하여 hCD40L의 발현을 평가하였다. 그 결과는 도 3에 도시된 것과 같다. hCD40L-HEK293 세포에 대한 클론 230 (서열 번호: 249)의 결합은 0.7에서 500 nM 범위의 서로 다른 투여량 (dose)에서 평가하였다. 클론 230의 결합은 도 4에서 보이는 바와 같이 0.7-55 nM 사이에서는 투여량-의존적이고 55 nM 이상에서는 포화도에 도달한 것으로 나타났다.
실시예 4: CD40-HEK Blue 리포터 분석법에서의 항-CD40L 스테핀 A 단백질 변이체 스크리닝
HEK-Blue CD40 발현 세포(Invivogen)는 CD40 자극 후 NF-κB의 활성화를 통해 생체활성 CD40L을 검출할 수 있다. NF-κB 경로의 활성화는 세포 배지에서 분비 배아 알칼리성 phosphatase (secreted embryonic alkaline phosphatase, SEAP)의 수준을 측정함으로써 결정할 수 있다. 분석법은 제조업체의 설명에 따라 수행하였다.
간략하게, 세포를 시험 배지 (Blasticin와 Zeocin이 포함된 DMEM High glucose)에 담아 96-well flat bottom 조직 배양 플레이트의 각 well 당 20,000개 세포를 분주하여 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 동안 배양시켰다. 그 다음 세포에서 50μl의 시험 배지를 제거하고 hCD40L (최종 농도 0.8 nM)이 들어있는 시험군 스테핀 A 단백질 변이체 또는 대조군의 50 μl 4X 희석액을 첨가하여 세포에 처리하였다. 그런 다음 플레이트는 37℃, 5% CO2에서 22시간 동안 배양하였다. 그 다음 날, 상층액을 수집하고 각 well의 30 μl씩과 HEK-Blue 검출 시약(Invivogen) 200 μl을 혼합하여 SEAP 활성을 검출하였다. 이 혼합물을 37℃에서 배양하고 모든 색상 변화를 주기적으로 모니터링하였다. Pherastar 플레이트 판독기를 사용하여 3시간 동안 흡광도(640 nm)를 측정했다. 그 데이터를 점도표로 표시하였다. 그 다음 IC50은 OD=f(log 농도)로서 비선형 4-매개변수 보간 곡선 (interpolated non-linear four-parameters curve)을 사용하여 계산하였다. 이 분석법의 양성 대조군으로는 임상 등급의 모노클로널 항-hCD40L 항체인 5C8을 사용하였다. 계산된 IC50의 범위는 11.6에서 100 nM의 범위였다 (예: 클론 230(서열번호: 249) 및 클론 248(서열번호: 267)). 이 결과의 한 예시는 도 5에 도시된 것과 같다.
실시예 5: hCD40L에 대한 결합력 증가를 위한 이량체 또는 삼량체 구성의 스테핀 A 단백질 변이체 포맷팅(Formatting)
스테핀 A 단백질 변이체는 결합력 증가를 위해 안정적인 다량체 올리고머로 조립되도록 설계할 수 있다. 생성된 스테핀 A 단백질 변이체는 In Line Fusion (ILF) 단백질로, 도 6과 같이 다양한 링커(리지드링커(rigid linkers) 참조 예: 서열 번호:508, 510-514; 또는 플랙서블 링커(flexible linker) 참조 예: 서열 번호:509, 515-518)를 가진 이량체 또는 삼량체일 수 있다.
상이한 스테핀 A 단백질 변이체(단량체, 이량체, 삼량체)과 hCD40L의 결합을 상기 기재된 바와 같이 조사하였다. 그 결과는 도 7에 도시된 것과 같으며 ILF 단백질이 표적 리간드에 대해 단량체 형태보다 같거나 더 큰 결합 친화도를 가지는 것으로 나타났다. 유세포 분석기로 이 결합을 추가 분석하였고 (도 8), 스테핀 A 단백질 변이체 (단량체, 이량체와 삼량체 형태)가 항-CD40L 항체와 유사한 수준으로 hCD40L에 결합하는 것을 보여주었다.
다른 형식들도 상기 설명한 대로 HEK-Blue 세포-기반 분석법을 사용하여 스크리닝하였다. 그 결과는 도 9에 나타내었고, 클론 230 DJ 형식(삼량체)이 5.99 nM의 EC50으로 가장 우수함을 보여주었다.
실시예 6: HSA 결합 스테핀 A 단백질 변이체를 사용한 삼량체 또는 사량체 구성의 In Line Fusion (ILF) 스테핀 A 단백질 변이체 특성분석
추가 실험에서, 스테핀 A 단백질 변이체는 안정적인 다량체 올리고머로 조립되도록 설계되었다. 생성된 스테핀 A 단백질 변이체는 In Line Fusion (ILF) 단백질로, 다양한 링커(리지드링커(rigid linkers) 참조 예: 서열 번호:508, 510-514; 또는 플랙서블 링커(flexible linker) 참조 예: 서열 번호:509, 515-518)를 가진 삼량체 또는 사량체일 수 있다. 4개의 스테핀 A 단백질 변이체를 시험하였다: 클론-230 DT (리지드 링커를 가진 삼량체), 클론-230 XT75 (리지드 링커와 HSA 스테핀 A 단백질 변이체가 있는 삼량체), 클론-230 DS (리지드 링커가 있는 사량체), 및 클론-230 XT76 (리지드 링커와 HSA 스테핀 A 단백질 변이체가 있는 사량체).
다양한 형식의 결합력을 평가하기 위해, CD40L 경쟁 ELISA를 수행하였다. 간략하게, 플레이트를 1 μg/ml의 rhCD40 Fc로 코팅하고 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 플레이트 세척기로 플레이트를 150 μl의 세척 완충액(PBS, Tween 20 0.1%)으로 2회 세척하고 카제인 5% (Sigma)의 PBS로 실온(25±1℃)에서 90분 동안 포화 상태로 만들었다. 2x EC80 (1 nM)의 인간 CD40L을 10 nM부터 시작하는 항-hCD40L 모노클로날 항체 또는 각 시험 ILF 클론과 결합시켰다. 그 다음 생성된 용액을 혼합하여 플레이트에 첨가하였다. 플레이트는 앞서 설명한 바와 같이 3회 세척하였다. 그 다음 비오티닐화된 항-hCD40L 폴리클로날 항체를 희석 완충액에 희석하고 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 실온(25±1℃)에서 90분간 배양하였다. 그런 다음 플레이트를 세척하였다. 그 다음 폴리HRP-streptavidin을 희석 완충액에 희석하고 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 실온(25±1℃)에서 추가적으로 90분간 배양하였다. 플레이트를 앞서 설명한 바와 같이 3회 세척하고, 기질(TMB, Pierce Thermo-Scientific)을 플레이트에 10분 동안 첨가하였다. 이 반응은 산성 용액을 사용하여 중지시키고, 플레이트를 450 - 630 nm에서 판독하여 최종 억제 백분율을 계산하였다. 그 결과는 도 10과 같다.
스테핀 A 단백질 변이체를 포함하는 In Line Fusion (ILF) 융합단백질의 CD40L 저해활성을 실시예 4에 기재된 것과 동일한 방법으로 HEK-Blue assay를 통해 평가하였다. 그 결과는 도 11에 도시된 것과 같다.
서로 다른 ILF 단백질이 두 표적(인간 CD40L 및 HSA)을 동시에 결합할 수 있음을 입증하기 위해, 브릿지 ELISA (bridging ELISA)를 수행하였다. 이 분석법에서는 hCD40L을 사용하여 이중특이적 스테핀 A 단백질 변이체를 포착하고 항-HSA 항체를 사용하여 스테핀 A 단백질 변이체를 검출하여, 즉, HSA-결합 스테핀 A 단백질 변이체를 검출하도록 한다. 간략하게, 96 well 플레이트에 0.5 mg/ml의 인간 CD40L이 들어있는 carbonate 완충액을 코팅하였다. 5% 카제인/PBS 완충액으로 포화시킨 후, 플레이트를 세척하고 스테핀 A 단백질 변이체 또는 대조군의 희석액을 HSA와 함께 최종 농도 10 μM로 90분 동안 배양하였다. 그 다음 플레이트를 세척하고, 비오티닐화된 폴리클로날 항체와 항-HSA(HRP-conjugated) (Abcam)를 90분 동안 첨가하였다. 마지막 세척 단계 후, 실험의 개발을 위해 TMB를 추가하고 플레이트를 450 nm에서 판독하였다. 그 다음 EC50은 비선형 4-매개변수 보간 표준 곡선 (interpolated non-linear four-parameters standard curve)을 사용하여 계산하였다 (도 12). 대조군 실험에서, 스테핀 A 단백질 변이체의 스테핀 A 프레임워크에 결합한 항-시스타틴 항체가 HSA의 부재(도 12A) 또는 존재(도 12B) 하에 항-HSA 항체 대신 첨가되었고, 스테핀 A 단백질 변이체가 두 조건 모두에서 hCD40L에 결합한다는 것을 입증하였다. 브릿지 ELISA 데이터는 HSA의 참여도가 테스트한 두 스테핀 A 단백질 변이체 형식 중 어느 것에도 CD40L 결합에 영향을 미치지 않음을 보여주었다.
실시예 7: 반수체 유전형 GVHD 동물 모델에 대한 항-CD40L 스테핀 A 단백질 변이체의 치료효과
실시예 7-1: 실험방법
192마리의 건강한 암컷 C57BL/6 마우스 (6주령)를 Janvier (프랑스)에서 구입하여 GVHD 유도를 위한 splenocyte 적출에 사용하였다. 12마리의 건강한 암컷 B6D2F1 마우스 (6주령)을 Charles River에서 구입하여 GVHD 유도 (syngeneic control)에 사용하였다. 70마리의 건강한 암컷 B6D2F1 마우스 (6주령)을 Charles River에서 구입하여 공여자 마우스로 사용하였다.
마우스 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체는 삼량체의 인-라인 융합 단백질(In line fusion)형태로 발현되었다(표 15).
Figure PCTKR2023002022-appb-img-000070
C57BL/6 및 B6D2F1 마우스의 비장을 적출하여, 비장세포를 추출하여 HBSS 완충액에 제조하였다. 추출된 비장세포에 함유된 적혈구는 적혈구 용해액 (BD Pharma)을 이용하여 용해시킨 후 세척하여 제조하였다. 64마리 (G4~G11)의 B6D2F1 마우스는 C57BL/6의 비장으로 부터 분리된 비장세포를 6x107 cells/head로 i.v 주입하였다. 3마리의 B6D2F1 (G3)는 C57BL/6 마우스의 비장으로부터 분리된 비장세포를 6x107 cell/head로 i.v. 주입하였다. 3마리의 B6D2F1 (G2)는 동일한 B6D2F1 마우스의 비장으로부터 분리된 비장세포를 6x107 cells/head로 i.v. 주입하였다(도 13).
본 실험의 동물들은 실험을 위하여 개별 체중을 기준으로 무작위 배정을 진행하였고, 그룹간의 균질성은 분산분석 (ANOVA)을 진행하여 통계적 유의성이 없음을 확인하였다.
시험물질의 투여경로는 i.p.로 진행하였고, i.p. 투여를 위하여 제형의 pH는 7.3~7.4로 맞췄으며, 부피는 20 mL/kg로 진행하였다. 시험동물에 투여된 투여물질종류, 투여물질의 양은 table과 같이 진행하였다. 시험물질의 투여는 GVHD 유발 후 1시간 후에 1차 투여를 진행하였으며, 투여 물질에 따른 투여 간격은 다음과 같이 진행하였다. 항체 투여군을 제외한 스테핀 A 단백질 변이체 투여군은 GVHD 유도 후 2일 간격으로 6회 투여를 진행하였고, MR-1 항체 는 GVHD 유도 후 2일 간격으로 3회 투여를 진행하였다(도 14, 표 16). 동물의 생존, 행동을 매일 관측하였으며, 임상 조치에 대한 사항을 매일 기록하였다. 체중 및 clinical score는 매일 기록하였다. GVHD의 clinical score는 다음과 같은 평가 양식을 통하여 육안으로 관찰하고, 관찰된 점수의 합을 기록하여 clinical score를 평가하였다. 각 그룹간의 통계학적 유의성은 GraphPad Prism을 이용하여 ANOVA 를 진행하였다. 각 그룹간의 통계학적 유의성은 p value <0.05 이하인 경우 유의한 것으로 판단하였다.
Figure PCTKR2023002022-appb-img-000071
실시예 12-2: 결과
무작위 배정 후 동물군의 전체 평균은 21.5g이었으며, 체중 범위는 18.8g ~ 23.8g의 분포를 보였다. 통계적 분석 결과 그룹간에 유의한 차이는 보이지 않았다. 실험동물의 체중 변화는 연구기간 전반에 걸쳐 모니터링을 진행하였다. 체중 변화를 확인하기 위하여, 평균 체중 변화 (MBWC%)는 D18일을 기준으로 변화율을 비교하였다. G1 그룹의 평균 체중 변화는 9.7%로 증가하였으며, G2 그룹의 평균 체중 변화는 15.6%로 증가하였다. GVHD control 그룹인 G3 그룹은 평균 체중 변화가 24.4%로 감소하는 경향을 확인하였다. 약물 투여 그룹인 G4 ~ G11 그룹의 평균 체중 변화는 다음과 같다:
G4 그룹: 1.6% 증가, G5 그룹: 4.1% 감소, G6 그룹: 14.6% 감소, G7 그룹: 2.8% 증가, G8 그룹: 6.4% 감소, G9 그룹: 9.0% 감소, G10 그룹: 4.4% 감소, G11 그룹: 21.7% 감소로, 스테핀 A 단백질 변이체를 투여한 그룹에서 G3 그룹 대비 평균 체중 변화가 양호한 상태를 보였다.
개별 동물에 대한 clinical score의 변화는 신체, 피부, 털 및 이동성 기준을 포함한 점수표를 이용하여 기록하였다. G1 및 G2 그룹의 평균 GVHD 점수는 연구기간 전반에 걸쳐 증가하지 않는 것을 확인하였다. G3 그룹은 D15일에서 증가하기 시작하여, D18에 평균점수 8.0을 기록하였다. G4 그룹은 G1 및 G2 그룹과 유사하게 연구 기간 전반에 걸쳐 GVHD socre가 증가하지 않았고, G5 ~ G7 그룹은 GVHD 유도 후 9일에서 14일에 증가하기 시작하여, 실험 종료일인 18일차에는 0.3 ~ 1.1 사이의 GVHD 스코어를 나타내었다. G8 ~ G10 그룹의 clinical score는 GVHD 유도 후 7일 과 10일 사이에 증가하기 시작하여, 실험종료일인 18일차에는 0.3 ~ 1.4의 GVHD 스코어를 나타내었다(도 15).
이를 고려할 때, 스테핀 A 단백질 변이체에 의한 치료효과는 GVHD control 대비 통계적으로 유의하게 억제되어 있음을 확인할 수 있었다.
본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체, 및/또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체는 비면역원성 폴리펩타이드로서, CD40L에 높은 친화도 및 특이도로 결합 가능하여 CD40L 및 CD40L을 발현하는 것으로 알려진 다양한 세포를 표적화 하는데 유용하다. 또한, 본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체는 뛰어난 CD40L 활성 억제 능력을 나타내어, CD40L과 관련한 다양한 질환의 예방 및 치료를 위한 의학적/약학적 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (42)

  1. CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant).
  2. 제1항에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 CD40L에 1×10-6M 이하의 Kd 값을 나타내는 것을 특징으로 하는 스테핀 A 단백질 변이체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 다음의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 100%의 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 스테핀 A 단백질 변이체:
    MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVV-(Xaa)n-GTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSL-(Xaa)m-EDLVLTGYQVDKNKDDELTGF
    여기서, Xaa는 각각 독립적인 아미노산 잔기이고, n 및 m은 각각 독립적으로 3 내지 20의 정수임.
  4. 제1항에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 서열번호 246 내지 365로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 스테핀 A 단백질 변이체.
  5. 제3항에 있어서, 상기 (Xaa)n은 서열번호 6 내지 125로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 75%, 적어도 85% 또는 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 스테핀 A 단백질 변이체.
  6. 제3항에 있어서, 상기 (Xaa)n은 서열번호 6 내지 125로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 스테핀 A 단백질 변이체.
  7. 제3항에 있어서, 상기 (Xaa)m은 서열번호 126 내지 245로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 75% 또는 적어도 85% 의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 스테핀 A 단백질 변이체.
  8. 제3항에 있어서, 상기 (Xaa)m은 서열번호 126 내지 245로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 스테핀 A 단백질 변이체.
  9. 제1항에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 신호 펩타이드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 스테핀 A 단백질 변이체.
  10. 제1항의 스테핀 A 단백질 변이체를 포함하는 융합단백질.
  11. 제10항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 681, 691, 694 또는 695의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
  12. 제10항에 있어서, 상기 융합 단백질은 스테핀 A 단백질 변이체의 삼중체 또는 사중체이고, 삼중체 또는 사중체는 스테핀 A 단백질 변이체가 링커에 의해 연결된 것을 특징으로 하는 융합단백질.
  13. 제12항에 있어서, 상기 링커는 리지드 링커(rigid linker) 또는 플렉시블 링커(flexible linker)인 것을 특징으로 하는 융합단백질.
  14. 제12항에 있어서, 상기 링커는 서열번호 508 내지 534로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
  15. 제14항에 있어서, 상기 링커는 (EAAAK)n을 포함하는 펩타이드 링커이고, 상기 n은 1 내지 6의 정수인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  16. 제10항에 있어서, 상기 융합 단백질은 결합 도메인, 사이토카인, 반감기 연장 도메인, 성장인자, 효소, 및 세포 투과 도메인으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  17. 제10항에 있어서, 상기 융합 단백질은 막 관통 도메인, 힌지 도메인, 코일드 코일 도메인, 바이러스 유래 도메인, 세포 내 신호전달 도메인 및 국소화 도메인으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  18. 제10항에 있어서, 상기 융합 단백질은 치료용 또는 진단용 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  19. 제18항에 있어서, 상기 치료용 모이어티는 치료용 단백질인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  20. 제19항에 있어서, 상기 치료용 단백질은 항체인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  21. 제18항에 있어서, 상기 진단용 모이어티는 형광 단백질인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  22. 제18항에 있어서, 상기 치료용 또는 진단용 모이어티는 링커에 의해 연결된 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  23. 제10항에 있어서, 상기 융합 단백질은 반감기 연장 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  24. 제23항에 있어서, 상기 반감기 연장 모이어티는 항체 Fc 도메인, 인간 혈청 알부민, 및 혈청 결합 단백질로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 융합 닽백질.
  25. 제23항에 있어서, 상기 반감기 연장 모이어티는 1×10-6M 이하의 Kd 값으로 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체 인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  26. 제1항의 스테핀 A 단백질 변이체를 포함하는 접합체(Conjugate).
  27. 제26항에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 약물과 접합된 것을 특징으로 하는 접합체.
  28. 제1항의 스테핀 A 단백질 변이체 또는 제10항의 융합단백질을 암호화하는 핵산.
  29. 제28항에 있어서, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 하는 핵산.
  30. 제29항에 있어서, 상기 RNA는 mRNA인 것을 특징으로 하는 핵산.
  31. 제28항의 핵산을 포함하는 전달 비히클.
  32. 제31항에 있어서, 상기 전달 비히클은 바이러스성 전달 비히클 또는 비바이러스성 전달 비히클인 것을 특징으로 하는 전달 비히클.
  33. 제32항에 있어서, 상기 바이러스성 전달 비히클은 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 아데노연관 바이러스(AAV) 벡터인 것을 특징으로 하는 전달 비히클.
  34. 제32항에 있어서, 상기 비 바이러스성 전달 비히클은 리포좀 또는 지질 나노입자인 것을 특징으로 하는 전달 비히클.
  35. 제34항에 있어서, 상기 지질 나노입자는 양이온성 지질 나노입자인 것을 특징으로 하는 전달 비히클.
  36. 제28항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  37. 제36항에 있어서, 상기 발현 벡터는 플라스미드 또는 미니서클인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  38. 제28항의 핵산이 도입된 유전자 조작된 세포.
  39. 제38항의 유전자 조작된 세포를 배양하여 스테핀 A 단백질 변이체 또는 융합단백질을 생산하는 단계; 및
    생산된 스테핀 A 단백질 변이체 또는 융합단백질을 수득하는 단계를 포함하는 스테핀 A 단백질 변이체 또는 융합단백질의 제조방법.
  40. 제1항의 스테핀 A 단백질 변이체, 제10항의 융합단백질, 제26항의 접합체, 제1항의 스테핀 A 단백질 변이체 또는 제10항의 융합단백질을 암호화하는 핵산 및 상기 핵산을 포함하는 전달 비히클로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물.
  41. 제40항에 있어서, 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  42. 제41항에 있어서, 상기 면역질환은 루푸스(SLE), 루푸스 신염, 면역 혈소판 감소증(ITP), 류마티스 관절염(RA), 다발성 경화증(MS), 염증성 장 질환(IBD, 이식편대숙주질환(GvHD) 또는 동종이식 거부, 이식/고체장기이식(SOT), 원발성 담즙성 담관염(PBC), 건선, 건선성 관절염, 콜라겐-유발 관절염, 난소염, 알레르기성 비염, 천식, 쇼그렌 증후군, 아토피성 습진, 중증 근무력증, 그레이브 질병 및 사구체 경화증으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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